DE68929466T2

DE68929466T2 - Menschlicher rezeptor c3b/c4b (cr1)

Info

Publication number: DE68929466T2
Application number: DE68929466T
Authority: DE
Inventors: T. Douglas FEARON; B. Lloyd KLICKSTEIN; W. Winnie WONG; R. Gerald CARSON; F. Michael CONCINO; H. Stephen IP; C. Savvas MAKRIDES; C. Henry MARSH
Original assignee: Brigham and Womens Hospital Inc; Johns Hopkins University; Avant Immunotherapeutics Inc
Current assignee: Brigham and Womens Hospital Inc; Johns Hopkins University; Celldex Therapeutics Inc
Priority date: 1988-04-01
Filing date: 1989-03-31
Publication date: 2004-04-01
Anticipated expiration: 2009-04-01
Also published as: NO315944B1; CN1053265A; ZA892397B; IL89790A0; ES2014593A6; CN1053924C; ZA907693B; EP0411031B1; FI115528B; CA1341443C; AU3539489A; NO20000827D0; ATE240973T1; IL89790A; JPH04501502A; EP0411031A4; NO20000827L; JP3484189B2; DE68929466D1; FI106316B

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Nucleinsäuremolekül, welches eine Nucleotidsequenz umfasst, die ein Polypeptid codiert, dem eine Transmembrandomäne fehlt und das eine Komplement-regulatorische Aktivität von CR1 besitzt, wobei besagte Nucleotidsequenz ausgewählt ist aus:

(a) einer im Wesentlichen in 1 beschriebenen Nucleotidsequenz von Nucleotidnummer 28 bis Nucleotidnummer 5943, die ein lösliches CR1- Polypeptid kodiert, und
(b) einer Nucleotidsequenz, die in Bezug auf (a) degeneriert ist, oder einem Fragment besagter Nucleotidsequenzen von (a) oder (b), das ein Polypeptid codiert, dem eine Transmembrandomäne fehlt und das eine Komplement-regulatorische Aktivität von CR1 besitzt.

Die Erfindung betrifft ebenfalls die sCR1 Nucleinsäuresequenzen und Fragmente davon, 70 Nucleotide umfassend, und ihre codierten Peptide oder Proteine, die 24 Aminosäuren umfassen. Die Erfindung betrifft ferner die Expression des sCR1-Proteins und Fragmente davon. Die sCR1 Nucleinsäuren und Proteine werden in der Diagnose oder Therapie von Funktionsstörungen, die die Aktivität des Komplementsystems betreffen, und bei verschiedenen entzündlichen und immunologischen Störungen verwendet.
2. Hintergrund der Erfindung
2.1. Das Komplementsystem
Das Komplementsystem ist eine Gruppe von Proteinen, die etwa 10% der Globuline im normalen Serum des Menschen ausmachen (Hood, L. E., et al., 1984, Immunology, 2. Auflage, The Benjamin/Cummings Publishing Co., Menlo Park, Kalifornien, Seite 339). Komplement (K) spielt eine wichtige Rolle in der Vermittlung von immunologischen und allergischen Reaktionen (Rapp, H. J. und Borso, T. 1970, Molecular Basis of Complement Action, Appelton-Century-Crofts (Meredith), New York). Die Aktivierung von Komplement-Komponenten führt zur Bildung einer Gruppe von Faktoren, einschließlich chemotaktischer Peptide, die die mit komplementabhängigen Erkrankungen assoziierten Entzündungen vermitteln. Die sequenzielle Aktivierung der Komplementkaskade kann über den klassischen Reaktionsweg ablaufen, Antigen-Antikörper-Komplexe einbeziehend, oder über einen alternativen Reaktionsweg, der die Erkennung von bestimmten Zellwand-Polysacchariden einbezieht. Die Aktivitäten, die von aktivierten Komplementproteinen vermittelt werden, schließen die Lyse von Zielzellen, Chemotaxis, Opsonisierung, die Stimulation von Gefäß -und anderen glatten Muskelzellen und funktionelle Fehlentwicklungen, wie die Degranulation von Mastzellen, gesteigerte Permeabilität der kleinen Blutgefäße, gerichtete Migration von Leukozyten und die Aktivierung von B-Lymphozyten und Makrophagen ein (Eisen, H. N., 1974, Immunology, Harper & Row Publishers, Inc. Hagerstown, Maryland; Seite 512).
Während der proteolytischen Kaskadeschritte werden biologisch aktive Peptid-Fragmente, wie die Anaphylatoxine C3a, C4a und C5a (siehe WHO Scientific Group, 1977, WHO Tech. Rep. Ser. 606: 5 und darin zitierte Referenzen) aus den dritten, vierten und fünften nativen Komplement-Komponenten freigesetzt (Hugli, T. E., 1981, CRC Crit. Rev. Immunol. 1: 321; Bult, H. and Herman, A. G. 1983, Agents Actions 13: 405).
2.2. Der C3b/C4b Komplementrezeptor (CR1)
Der humane C3b/C4b Rezeptor, CR1 genannt, kommt auf Erythrozyten, Monozyten/Makrophagen, Granulozyten, B-Zellen, einigen T-Zellen, follikulär-dendritischen Zellen der Milz und glomerulären Podozyten vor (Fearon, D. T., 1980, J. Exp. Med. 152: 20; Wilson, J. G., et al., 1983, J. Immunol. 131: 684; Reyes, M. et al., 1985, J. Immunol. 135: 2687; Gelfand, M. C., et al., 1976, N. Engl. J. Med. 295: 10; Kazatchkine, M. D., et al., 1982, Clin. Immunol. Immunopathol. 27: 170). CR1 bindet speziell C3b, C4b und iC3b. Es wurde eine lösliche Form des Rezeptors im Plasma gefunden, der Ligand-Bindungsaktivität besitzt und das gleiche Molekulargewicht wie membran-assoziiertes CR1 hat (Yoon, S. H. und Fearon, D. T., 1985, J. Immunol. 134: 3332). CR1 bindet C3b und C4b, die kovalent an Immunkomplexe und andere Komplement-Aktivatoren gebunden sind, und die Auswirkungen dieser Interaktionen sind abhängig von dem den Rezeptor tragenden Zelltyp (Fearon, D. T: und Wong, W. W., 1983, Ann. Rev. Immunol. 1: 243). CR1 auf Erythrozyten bindet Immunkomplexe für den Transport zur Leber (Cornacoff, J. B., et al., 1983, J. Clin. Invest. 71: 236; Medof M. E., et al., 1982, J. Exp. Med. 156: 1739) CR1 auf Neutrophilen und Monozyten internalisiert gebundene Komplexe, entweder über adsorptive Endozytose durch umhüllte Vertiefungen an der Membran („coated pits") (Fearon, D. T, et al., 1981, J. Exp. Med. 153: 1615; Abrahamason, D. R. und Fearon, D. T., 1983, Lab. Invest. 48: 162) oder über Phagozytose nach der Aktivierung des Rezeptors durch Phorbolester, chemotaktische Peptide, oder durch Proteine, die in der extrazellulären Matrix vorhanden sind, wie Fibronektin und Laminin (Newman, S. L., et al., 1980, J. Immunol. 125: 2236; Wright, S. D. und Silverstein, S. C., 1982, J. Exp. Med. 156: 1149; Wright, S. D., et al., 1983, J. Exp. Med. 158: 1338). Phosphorylierung von CR1 kann eine Rolle beim Erwerb von phagozytotischer Aktivität spielen (Changelian, P. S. und Fearon, D. T., 1986, J. Exp. Med. 163: 101).
Die Funktion von CR1 auf B-Lymphozyten ist weniger definiert, obwohl die Behandlung von diesen Zellen mit Antikörpern gegen CR1 ihre Antwort auf suboptimale Dosen von Phytolacca-Mitogen („pokeweed togen") steigert (Daha, M. R. et al., 1983, Immunobiol. 164: 227 (Abstr.)). CR1 auf follikulär-dendritischen Zellen kann für eine antigenpräsentierende Rolle dienlich sein (Klaus, G. G. B., et al., 1980, Immunol. Rev. 53: 3).
CR1 kann auch die C3/C5 Konvertasen des klassischen und des alternativen Reaktionsweges inhibieren und als Cofaktor für die Spaltung von C3b und C4b durch Faktor I dienen, was darauf hinweist, dass CR1 zusätzlich zur Rezeptorfunktion auch Komplementregulatorische Funktion besitzt (Fearon, D. T:, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76: 5867; Iida, K. und Nussenzweig, V., 1981, J. Exp. Med. 153: 1138). Im alternativen Reaktionsweg der Komplementaktivierung ist der bimolekulare Komplex C3b, Bb ein C3 aktivierendes Enzym (Konvertase). CR1 (und Faktor H, bei höheren Konzentrationen) kann an C3b binden und kann auch die Dissoziation von C3b, Bb fördern. Darüber hinaus macht die Bildung von C3b, CR1 (und C3b, H) C3b empfänglich für eine irreversible, proteolytische Inaktivierung durch Faktor I, was in der Bildung von inaktiviertem C3b resultiert (iC3b). Im klassischen Reaktionsweg der Komplement-Aktivierung ist der Komplex C4b, 2a die C3-Konvertase. CR1 (und C4-bindendes Protein, C4bp, bei höheren Konzentrationen) kann an C4b binden und kann auch die Dissoziation von C4b, 2a fördern. Die Bindung macht C4b für eine irreversible, proteolytische Inaktivierung durch Faktor I durch die Spaltung von C4c und C4d empfänglich (inaktivierte Komplement Proteine).
CR1 ist ein Glykoprotein, das aus einer Polypeptidkette besteht. Vier allotypische Formen von CR1 sind gefunden worden, die sich durch Erweiterungen von -40000–50000 Dalton Molekulargewicht unterscheiden. Die zwei häufigsten Formen, Allotyp F und S, auch als A und B Allotyp bezeichnet, haben ein Molekulargewicht von 250000 und 290000 Dalton (Dykman, T. R., et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80: 1698; Wong, W. W., et al., 1983, J. Clin. Invest. 72: 685) und zwei seltenere Formen haben Molekülgewichte von 210000 und > 290000 Dalton (Dykman, T. R., et al., 1984, J. Exp. Med. 159: 691; Dykman, T. R., et al., 1985, J. Immunol. 134: 1787). Diese Unterschiede repräsentieren offenbar Variationen in der Polypeptidkette von CR1, eher als im Glycosylierungsstatus, da diese durch die Behandlung des gereinigten Rezeptorproteins mit Endoglycosidase F nicht beseitigt wurden (Wong, W. W., et al., 1983, J. Clin. Invest. 72: 685), und diese auch beobachtet wurden, wenn Rezeptor-Allotypen, in Gegenwart von Tunicamycin, biosynthetisiert wurden (Lublin, D. M., et al., 1986, J. Biol. Chem. 261: 5736). Alle vier CR1-Allotypen haben C3b-Bindungsaktivität (Dykman, T. R., et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80: 1698; Wong, W. W., et al., 1983, J. Clin. Invest. 72: 685; Dykman, T. R., et al., 1984, J. Exp. Med. 159: 691; Dykman, T. R., et al., 1985, J. Immunol. 134: 1787).
Es wurde gezeigt, dass zwei nicht überlappende Restriktionsfragmente von CR1-cDNA unter hoch stringenten Bedingungen kreuz-hybridisieren (Wong, W. W., et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82: 7711). Beide cDNA-Sonden hybridisierten auch mit mehreren Restriktionsfragmenten genomischer DNA, von denen die meisten ähnlich waren für beide Sonden (s. o.). Die Existenz repetitiver, codierender Sequenzen in CR1 wurde durch Sequenzvergleiche bestätigt (Klickstein, L. B., et al., 1985, Complement 2: 44 (Abstr.)). Zusätzlich wurde durch die Demonstration einer Kreuz-Hybridisierung einer genomischen Sonde, der codierende Sequenzen für einige genomische Restriktionsfragmente fehlten, gezeigt, dass das CR1-Gen repetitive intervenierende Sequenzen besitzt (Wong, W. W., et al. 1986, J. Exp. Med. 164: 1531). Weiterhin hatte die DNA eines Individuums mit dem größeren S-Allotyp, verglichen mit der DNA eines Individuums mit dem F-Allotyp, ein zusätzliches Restriktionsfragment, das mit dieser genomischen Sonde hybridisierte und damit nahe legt, dass Duplikation genomischer Sequenzen in Verbindung mit dem CR1 Allel höheren Molekulargewichtes aufgetreten ist (s. o.).
Es wurde gezeigt, dass CR1 eine Homologie zu Komplementrezeptor Typ 2 aufweist (CR2) (Weis, J. J., et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83: 5639–5643).
2.3 Abnormitäten von CR1 in humanen Erkrankungen
Es wurde von Untersuchern aus verschiedenen geografischen Regionen, einschließlich Japan (Miyakawa et al., 1981, Lancet 2: 493–497; Minota et al., 1984, Arthr. Rheum. 27: 1329–1335), den Vereinigten Staaten (Iida et al., 1982, J. Exp. Med. 155: 1427-1438; Wilson et al., 1982, N. Engl. J. Med. 307: 981–986.) und Europa (Walport et al., 1985, Clin. Exp. Immunol. 59: 547; Jouvin et al., 1986, Complement 3: 88–96; Holme et al., 1986, Clin. Exp. Immunol. 63: 41–48) über verminderte Expression von CR1 auf Erythrozyten von Patienten mit systemischem Lupus erythemathodes (SLE) berichtet. Als Gruppe genommen haben die Patienten eine durchschnittliche Anzahl von Rezeptoren/Zelle, die ca. 50–60% der normalen Population ausmacht. Ein früher Bericht wies darauf hin, dass die Anzahl an CR1 auf Erythrozyten invers mit der Krankheitsaktivität variierte, wobei die niedrigsten Zahlen während den Perioden mit den stärksten Manifestationen von SLE auftraten, und die höchsten Zahlen im selben Patient während der Remissionsphasen beobachtet wurden (Iida et al., 1982, J. Exp. Med. 155: 1427–1438). Es wurde auch gefunden, dass die Zahl an CR1 invers mit dem Gehalt an Immunkomplexen im Serum korreliert, mit dem Serumgehalt an C3d und mit der Mengen an Erythrozyten-gebundenem C3dg, was vielleicht die Aufnahme von Komplementaktivierenden Immunkomplexen und die Deposition auf dem Erythrozyten als „innocent bystander" reflektiert (Ross et al., 1985, J. Immunol. 135: 2005–2014; Holme et al., 1986, Clin. Exp. Immunol. 63: 41–48; Walport et al., 1985, Clin. Exp. Immunol. 59: 547). Es wurde ein SLE-Patient mit einem Auto-Antikörper gegen CR1 gefunden, der kein CR1 auf Erythrozyten hat (Wilson et al., 1985, J. Clin. Invest. 76: 182–190). Verminderte Titer des Auto-CR1-Antikörpers gingen mit der Besserung des klinischen Zustandes des Patienten einher und mit einer partiellen Umkehrung der Rezeptor-Abnormalität. Anti-CR1-Antikörper wurden in zwei weiteren SLE-Patienten nachgewiesen (Cook et al., 1986, Clin. Immunol. Immunopathol. 38: 135–138). Kürzlich wurde durch das Beobachten des raschen Verlustes an Rezeptor von transfusionierten Erythrozyten der erworbene Verlust an CR1 auf Erythrozyten, im Umfeld von aktivem SLE und hämolytischer Anämie, nachgewiesen (Walport et al., 1987, Clin. Exp. Immunol. 69: 501–507).
Der relative Verlust an CR1 auf Erythrozyten wurde auch bei Patienten mit Human Immunodeficiency Virus (HIV) Infektionen (Tausk, F. A:, et al., 1986, J. Clin. Invest. 78: 977–982) und mit Lepra lepromatosa (Tausk, F. A., et al., 1985, J. Invest. Dermat. 85: 58s-61s) beobachtet.
Abnormitäten der Komplement-Rezeptorexpression bei SLE sind nicht auf CR1 auf Erythrozyten begrenzt. Man hat gezeigt, das relative Defizienzen an gesamtem zellulärem CR1 auf Neutrophilen und CR1 auf Plasmamembranen von B-Lymphozyten bei SLE-Patienten vorkommen (Wilson et al., 1986, Arthr. Rheum. 29: 739–747).
In Patienten mit Typ IV SLE-Nephritis ist das gesamte nachweisbare CR1-Antigen von Podozyten verloren, wohingegen bei weniger ernsten Formen der SLE-Nephritis und in Nicht-SLE-Formen der proliferativen Nephritis, eingeschlossen der membranproliferartiven Glomerulonephritis Typ I und II, die CR1-Expression auf glomerulären Podozyten sich nicht von Gesunden unterscheidet (Kazatchkine et al., 1982, J. Clin. Invest. 69: 900–912; Emancipator et al., 1983, Clin. Immunol, Immunpathol. 27: 170– 175). Dennoch haben Patienten mit Typ IV SLE-Nephritis nicht weniger CR1 auf Erythrozyten als SLE-Patienten mit anderen Formen an renalem Lupus oder ohne Nephritis haben (Jouvin et al., 1986, Complement 3: 88–96).
In vivo reguliert Komplement-Aktivierung die CR1-Expression auf der Plasmamembran von Neutrophilen hoch (Lee, J., et al., 1984, Clin. Exp. Immunol. 56: 205– 214; Moore, F. D., Jr., et al., 1986, N. Engl. J. Med. 314: 948–953).
3. Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft das C3b/C4b Rezeptorgen (CR1), das ein lösliches CR1-Polypeptid (sCR1) codiert und im Anspruch 1 definiert ist, und das von diesem codierte Protein. Die Erfindung betrifft auch sCR1-Nucleinsäuresequenzen und Fragmente davon, die 70 Nucleotide umfassen, und ihre codierten Peptide oder Proteine, die 24 Aminosäuren umfassen. Die Erfindung betrifft ferner die Expression des sCR1-Proteins und Fragmente davon. Die erfindungsgemäßen Gene und Proteine werden in der Diagnose und Therapie von Funktionsstörungen, die die Aktivität des Komplementsystems betreffen, und bei verschiedenen entzündlichen und immunologischen Störungen verwendet.
In spezifischen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, detailliert in den Beispiel-Abschnitten unten beschrieben, werden die Klonierung, die Nucleotidsequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz einer Volllängen-CR1-cDNA und Fragmenten davon, beschrieben. Die Expression des CR1-Proteins und von Fragmenten davon wird ebenfalls beschrieben. Die Expression des CR1-Proteins und dessen Fragmente, die Bindungsstellen für C3b und/oder C4b enthalten und die Faktor I-Cofaktoraktivität aufweisen, wird erhalten.
Auch ist die Produktion und Reinigung von löslichen CR1-Molekülen, welche Moleküle sich als therapeutisch nützlich für die Behandlung von entzündlichen Reaktionen gezeigt haben und welche zur Reduktion des Ausmaßes von myokardialen Infarkten und zur Verhütung von Reperfusion-Verletzungen nützlich sind, in den Beispielen unten beschrieben.
3.1. Definitionen

Ad2 MLP =: Adenovirus 2 Haupt-Spät Promotor ("major late promoter")
C =: Komplement
C3 (ma) =: Methylamin-behandeltes C3
C4bp =: C4-bindendes Protein
CMV =: Zytomegalovirus
CR1 =: Komplement Rezeptor Typ 1, der C3b/C4b-Rezeptor
CR2 =: Komplement-Rezeptor, Typ 2
DCFDA =: Dichlorofluoresceindiacetat
HPLC =: Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie
iC3b =: inaktiviertes C3b
LHR =: langes homologes) Repeat (Sequenz)
mAb =: monoklonaler Antikörper
PAGE =: Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese
RPAR =: Reverse passive Arthus-Reaktion
SCR =: kurzer) Konsensus-Sequenz oder Repeat (short consensus
: repeat)
sCR1 =: lösliches CR1-Molekül

4. Beschreibung der Figuren
1. Nucleotide und Aminosäuresequenz des gesamten CR1 Kodierungsabschnittes. Die Sequenz beginnt mit dem ersten Nucleotid, das dem Oktamer EcoRI-Linker in Klon λT109.1 folgt. Nucleotid Nummer 1531 dieser Sequenz ist das erste Nucleotid 5 von Nucleotid Nummer 1 der Sequenz, die in 3 dargestellt wird. Der Strang, der der mRNA entspricht ist, mit der abgeleiteten Aminosäuresequenz darunter gezeigt. Die vermeintliche Signalsequenz, die von den Nucleotidnummern 28–150 codiert wird, ist eingeklammert.
2. Restriktionskarte der humanen CR1 cDNA über einen Bereich von 5,5 Kb. Der schwarze Balken zeigt die cDNA an, Restriktions-Schnittstellen sind H, HindIII; B, BamHI; R, EcoRI; P, PstI; A, Apal; S, SacI; G, BgII; K, KpnI. Die cDNA-Klone, von denen die Sequenz abgeleitet wurde, sind unter der Karte gezeigt. Die Pfeile zeigen die Richtung und den Umfang der Sequenzanalyse unter Verwendung des Dideoxynukleotid-Kettenabbruchverfahrens. Basierend auf Restriktionskarten und überlappender Sequenzidentität wurden die cDNA-Klone orientiert.
3. Nucleotidsequenz der humanen CR1 cDNA über einen Bereich von 5,5 kb. Der Strang, der der mRNA entspricht, ist gezeigt (entsprechend der Basennummer 1532 aus 1) und Base Nummer 1 ist die erste Base nach dem EcoRI Linker im am weitesten 5' lokalisierten Klon. Das Stop-Codon ist unterstrichen. Die 110-bp Sequenz in der Box wurde zwischen Nucleotid 147 und 148 gefunden (Pfeil) und scheint einen Anteil einer intervenierenden Sequenz zu repräsentieren.
4. Dot Matrix-Analyse der 5,5 kb Nucleotidsequenz der humanen CR1-cDNA. Ein Punkt wurde gezeichnet, wenn wenigstens 40 bp von 90 bp übereinstimmten. Die dunkle Linie, die das Quadrat diagonal halbiert, zeigt die Identität der Sequenz mit sich selbst. Die zwei zusätzlichen parallelen dunklen Linien, 1,35 und 2,7 kb von der Identitätslinie entfernt, repräsentieren zwei direkte lange homologe Tandem-Wiederholungen („tandem repeats"; LHRs) von jeweils 1,35 kb. Die sechs, helleren, gestrichelten Linien zwischen den zwei LHRs entsprechen kurzen Konsensus-Sequenz von 0,2 kb. Die kurzen Konsensus-Wiederholungen („repeats"; SCRs) erstrecken sich über 0,4 kb jenseits der langen homologen Repeats (LHRs).
5. Die abgeleitete Aminosäuresequenz des humanen CR1. Jeder Aminosäurerest ist im Ein-Buchstaben Code dargestellt (Lehnfinger, A. L., 1975, Biochemistry, Auflage, Worth Publishers, Inc. New York, Seite 72). Die Aminosäurereste in den LHRs wurden zur Illustration ihrer Homologie gegeneinander ausgerichtet. Alle Reste in LHR-B sind gezeigt, und nur ein Rest wird von LHR-C und LHR-D gezeigt, wo ein Unterschied zu LHR-B vorliegt. Ein Hydropathie-Profil wurde unter dem COOH-Ende des Proteins ausgerichtet, um die mutmaßliche Transmembranregion zu illustrieren. Ein Abschnitt von vier positiv geladenen Resten direkt hinter der hydrophoben Sequenz ist überstrichen. Die sechs Aminosäuren umfassende Sequenz mit 67% Homologie zu der Phosphorylierungsstelle von Proteinkinase C im epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor ist unterstrichen. Ein schematisches Diagramm des CR1-Proteins ist über der Sequenz gezeigt. (TM) transmembrane Region, (Cyt) zytoplasmatische Region, (3'UT) 3'nicht translatierte Sequenz.
6. (A) Ausrichtung der SCRs von CR1. Die Wiederholungen („repeats") sind von 1–23 vom NH₂-Ende zum COOH-Ende durchnummeriert. Leerfelder wurden eingefügt, um die Ausrichtung zu maximieren. Die Boxen repräsentieren invariante Reste und die vertikalen Pfeile zeigen die Positionen der konservierten Aminosäuren. Ein Rest wurde als konserviert erachtet, wenn der Rest, oder eine konservierte Substitution, mindestens in der Hälfte der SCRs auftrat. Der horizontale Pfeil zeigt ein SCR, der auch vom genomischen CR1-Klon 2.38 sequenziert wurde und von einem einzelnen Exon codiert wird.
(B) Restriktionskarte, Sequenzierungs-Strategie und partielle Sequenz des genomischen Klons λ2.38. Die Restriktions-Schnittstellen sind: (B) BamHI, (S) SacI, (E) EcoRV, (K) KpnI, (P) PstI. Der horizontale Pfeil zeigt die Richtung und den Umfang der Sequenzierung an, der vertikale Pfeil zeigt die Exon-Intron-Grenzen.
7. Ausrichtung der Konsensus-Sequenz der SCRs von Proteinen, die bekanntermaßen diese Struktur haben. Leerstellen wurden zur Maximierung der Ausrichtung eingefügt. Ein Rest wird wie in 5 als konserviert erachtet, mit Ausnahme der Proteine, die nur ein oder zwei SCRs besitzen, in denen ein Rest konserviert ist, wenn er in mindestens der Hälfte der anderen Proteine vorkommt. Die Bindestriche entsprechen nicht konservierten Positionen. Die unterstrichenen Abschnitte von CR2 und C2b zeigen an, dass keine Sequenzinformation für diese Proteine in dieser Region bisher publiziert wurde. Die Boxen zeigen die Invarianten Halb-Cystine an. Die Nummer rechts der Sequenz repräsentiert die Zahl der SCRs, die zur Generierung der Konsensus-Sequenz verwendet wurden. Die Protein-Abkürzungen und die Referenzen für die Sequenzdaten, die zur Festlegung der Konsensus-Sequenz verwendet wurden, sind: (CR1) Komplement Rezeptor Typ I, (H) Faktor H (Kristensen, T., et al., 1986, J. Immunol. 136: 3407), (C4bp) C4-bindendes Protein (Chung, L. P., et al., 1985, Biochem. J. 230: 133), (CR2) Komplement Rezeptor Typ 2 (Weis, J. J., et al., 1986, Proc. Natl. Acad- Sci U.S.A. 83: 5639), (Ba) proteolytisches Fragment von Faktor B (Morley, B. J. und Campbell, R. D., 1984, EMBO 7. 3: 153), (C2b) proteolytisches Fragment von C2 (Gagnon, J., 1984, Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 306: 301), (C1r) r-Untereinheit von C1 (Leytus, S. P., et al., 1986, Biochemistry 25: 4855), (XIIIb) b-Untereinheit von Faktor XIII (Ichinose, A., et al., 1986, Biochemistry, 25: 4633), (β2GP1) β2 Glykoprotein I (Lozier, J., et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81: 3640), (Hap) Haptoglobin (Kurosky, A., et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 77: 3388), (IL-2-R) der Interleukin-2-Rezeptor (Leonard, W. J., et al., 1985, Science 230: 633). Der Stern zeigt an, dass eine unvollständige Sequenz zur Verfügung steht.
8. Schematisches Diagramm der vorgeschlagenen Struktur von humanen CR1. Die COOH-terminale zytoplasmatische Region ist auf der rechten Seite der Lipid-Doppelschicht. 30 SCRs sind auf der extrazellulären Seite der Plasmamembran linear angeordnet. Die Klammern zeigen die LHRs an. Die Einfügung ist eine Vergrößerung einer einzelnen SCR, um die dreifach-Schleifen-Struktur zu illustrieren.
9. Restriktionskarte des Inserts des Plasmids, pBSABCD, das humanen CR1 codiert. Angezeigt in der Box sind, die codierende Sequenz enthaltende Region skizzierend, die 9 Fragmente aus acht cDNA-Klonen, die ligiert wurden, um das CR1-Konstrukt zu bilden. Die Klammern bestimmen die Positionen von LHR-A, -B, -C, und -D. Die Linien unter der Box repräsentieren die Positionen der neu isolierten 5'cDNA-Klone. Die Restriktions-Schnittstellen sind: A, ApaI; B, BamHI; G, BglII; H, HindIII; K, KpnI; M, BspMII; P, PstI; R, EcoRI; und S, SacI.
10. Die abgeleitete Aminosäuresequenz des 5'cDNA Klons, die die sieben SCRs von LHR-A codiert, und die Ausrichtung dieser Sequenz mit den entsprechenden SCRs von LHR-B, -C und -D. Die vier Cysteine, die in jedem SCR konserviert sind, sind unterstrichen. Ein Rest von LHR-B, -C und -D wird nur gezeigt, wo eine Abweichung zu LHR-A vorliegt.
11. Restriktionskarten der Expressions-Plasmide, piABCD und pMTABCD. Pm_MT und p_CMV repräsentieren den murinen Metallothionein-Promotor und den mittleren, frühen Promotor des Zytomegalovirus.
12. Analyse der mit piABCD (Feld a und b) und mit CDM8-Vektor alleine transfizierten COS-Zellen (Feld c und d), die indirekt mit YZ1 anti-CR1 monoklonalem Antikörper und Fluorescein-markiertem Ziege anti-Maus (Fab')₂ Fragmenten gefärbt wurden, mittels Phasenkontrast- und Immunfluoreszenz-Mikroskopie (Feld a und c bzw. Feld b und d).
13. Analyse der C3b-und C4b-Bindung an COS-Zellen, die rekombinantes CR1 exprimieren. COS-Zellen, die mit piABCD (Feld a und c) oder mit CDM8 Vektor alleine (Feld b und d) transfiziert wurden, wurden mit EAC4b (lim), 3b (Feld a und b) oder mit EAC4b (Feld c und d) inkubiert und auf die Bildung von Rosetten über Phasenkontrast-Mikroskopie untersucht.
14. SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (PAGE)-Analyse von rekombinantem CR1, der von transfizierten COS-Zellen exprimiert wurde. COS-Zellen, die mit dem CDM8 Vektor alleine transfiziert wurden (Spur 1 und 4) und COS-Zellen, die mit piABCD transfiziert wurden (Spur 2 und 5) und Erythrozyten eines Spenders, der die F und S Allotypen von CR1 exprimiert (Spur 3 und 6) wurden oberflächenmarkiert mit ¹²⁵I. Detergenz-Lysate der Zellen wurden sequenziell mit Sepharose-UPC10 (Spuren 1–3) und mit Sepharose-YZ1 (Spuren 4–6) immunadsorbiert und die Eluate über SDS-PAGE unter nicht reduzierenden Bedingungen analysiert und autoradiographiert.
15. Aufspaltung von ¹²⁵I-C3(ma) durch Faktor I, in Gegenwart von immuno-immobilisiertem rekombinantem CR1. Abgeglichene Proben von ¹²⁵I-C3(ma) wurden mit Faktor I behandelt, in der Gegenwart von Faktor H (Spur 1), Sepharose-UPC10, vorinkubiert mit dem Lysat aus CDM8-Vektor (alleine) transfizierten COS-Zellen (Spur 2), Sepharose-UPC10, vorinkubiert mit dem Lysat aus piABCD-transfizierten COS-Zellen (Spur 3), Sepharose-YZ1, vorinkubiert mit dem Lysat aus CDM8-transfizierten COS-Zellen (Spur 4), und 6 μl (Spur 5), 12 μl (Spur 6) und 25 μl (Spur 7) Sepharose-YZ1, die mit dem Lysat aus piABCD-transfizierten COS-Zellen vorinkubiert worden war. Proben von ¹²⁵I markiertem C3(ma) wurden auch in Abwesenheit von Faktor I mit 25 μl Sepharose-YZ1 behandelt, welches mit dem Lysat aus piABCD-transfizierten COS-Zellen vorinkubiert worden war (Spur 8). Nach Reduktion wurden ¹²⁵I-C3(ma) über SDS-PAGE und Autoradiographie analysiert.
16. Die cDNA-Konstrukte, die die CR1-Deletionsmutanten codieren. Die Positionen der cDNA Segmente, die für die vier LHRs codieren, sind durch die Klammern über dem Gesamtlängen-Konstrukt für piABCD gezeigt, über dem die Restriktions-Schnittstellen abgebildet sind, die zur Präparation der Deletionsmutanten verwendet wurden. Die cDNA Restriktionsfragmente, die in jedem der Mutanten zurückgeblieben, sind durch die massiven Linien angezeigt. Die Restriktions-Schnittstellen sind: A, ApaI; B, BsmI; E, BstEII; und P, PstI.
17. Vergleich der rekombinanten Deletionsmutanten von CR1 mit den Wildtyp F und S Allotypen von CR1. Detergenz-Lysate von ¹²⁵I-Oberflächen markierten Erythrozyten (Spur 1 und 7) und COS-Zellen, transfiziert mit CDM8-Vektor alleine (Spur 2 und 8), piABCD (Spur 3 und 9), piBCD (Spur 4 und 10), piCD (Spur 5 und 11), und piD (Spur 6 und 12), wurden mit Sepharose-UPC10 anti-Levan Antikörper (Spuren 1–6), Sepharose-YZ-1 anti-CR1 monoklonalem Antikörper (Spuren 7–11) und Kaninchen anti-CR1 Antikörper und Sepharose-Protein A (Spur 12) immunpräzipitiert. Die Eluate wurden einem SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen unterzogen und autoradiographiert.
18. Aufspaltung von ¹²⁵I-C3(ma) durch Faktor I, in der Gegenwart von COS-Zellen, die Gesamtlängen-CR1 und Deletionsmutanten von CR1 exprimieren. Abgeglichene Proben von ¹²⁵I markiertem C3(ma) wurden mit COS-Zellen inkubiert, die mit dem CDM8-Vektor alleine (Spur 1 und 7), piABCD (Spur 2 und 8), piAD (Spur 3 und 9), piBD (Spur 4 und 10), piCD (Spur 5 und 11) und piD (Spur 6 und 12) transfiziert wurden, in Abwesenheit (Spuren 1–6) oder in Gegenwart (Spuren 7–12) von Faktor I. Proben von ¹²⁵I markiertem C3(ma) wurden auch mit Faktor H und Faktor I (Spur 13) und mit Faktor I alleine (Spur 14) inkubiert. Nach Reduktion wurde ¹²⁵I-C3(ma) über SDS-PAGE und Autoradiographie analysiert.
19. Ein schematisches Modell, das die Typen von SCRs, die jedes LHR von CR1 umfassen, darstellt, und die vorhergesagten Stellen, welche die Spezifität des Rezeptors für C3b und C4b ausmachen. Die sekundären Bindungsspezifitäten sind in Klammer dargestellt.
20. Ein schematisches Diagramm, das die DNA-Regionen darstellt, die im löslichen CR1-DNA-Konstrukt verbleiben. Die Regionen der volllängen-CR1-cDNA sind durch die Boxen oberhalb der Figur angezeigt.
21. Ein schematisches Diagramm, das die Hauptelemente der pTCS-Serie von Expressions-Vektoren darstellt.
22. Ein Diagramm des Expressionsvektors pTCSgpt. Die Polyadenylierungsstelle stammt aus der murinen Ig-Kappa-Sequenz (NBRF Nuklein Datenbank Zugang # Kcms, bp 1306–1714), die Ad2 MLP und die dreigeteilten Regionen sind vpn der Ad2-Sequenz (NBRF Nuklein Datenbank Zugang # Gdad2, bp5791–6069); der SV40 frühe Promotor ist aus dem SV40 Genom (NBRF Nuklein Datenbank Zugang # GSV40W). Das gpt Gen, das Ampicillin Gen und den bakterielle Replikationsursprung sind aus dem Vektor pSV2gpt (ATCC Zugangsnummer 37125).
23. 4–20% SDS-PAGE von sCR1, welches über Antikörper-Affinität gereinigt wurde. Nicht reduzierende (Spuren 1, 2 und 3) und reduzierende (Spuren 4, 5 und 6) Bedingungen. Spuren 1 und 3: Molekulargewichts-Marker; Spüren 3 und 5: Zellkultur-Überstände, Ausgangsmaterial; Spuren 4 und 6: durch Antikörper-Affinitäts-Chromatographie gereinigtes sCR1.
24. Elutionsprofil einer Kationen-Austausch-HPLC. Eluiertes Protein wurde durch Absorption bei 280 nm überwacht (y-Achse). Die Absoption sowohl des Durchflusses (0–100 Minuten) als auch des eluierten sCR1 (150–165 Minuten) waren beide außerhalb des Messbereiches. Die x-Achse repräsentiert die Elutionszeit in Minuten.
25. 4–20% Gradienten SDS-PAGE von Kationen und Anionen-Austausch-HPLC gereinigtem sCR1. Die SDS-Polyacrylamid-Gele liefen unter nicht reduzierenden Bedingungen. Spur 1, ein Aliquot des Bioreaktor-Überstandes; Spur 2, ein Aliquot des Bioreaktor-Überstandes, der gegen den Kationen-HPLC Start-Puffer dialysiert wurde; Spur 3, ein Aliquot des eluierten sCR1 Peaks von einer Kationen-Austausch-HPLC-Säule; Spur 4, eine Aliquot des sCR1 Peaks von der Kationen-Austausch-HPLC-Säule, in den Startpuffer der Anionen-HPLC umdialysiert; Spur 5 und 6, Aliquots von zwei verschiedenen Fraktionen des eluierten sCR1 aus der Anionen-HPLC.
26. C5a-Induktion eines oxidativen Burst in humanen Neutrophilen. Im Anschluss an einen oxidativen Burst durch C5a induziert, wurde DCFDA oxidiert und stark fluoreszierend. Die Fluoreszenz-Intensität, bestimmt über Durchflusszytometrie, ist auf der x-Achse gemessen und die Anzahl der Zellen auf der y-Achse. Feld a, Profile und Gate für die Zellen; Feld b, 0 Minuten nach der Zugabe von C5b; Feld c, 1 Minute; Feld d, 2 Minuten, Feld e, 3 Minuten, Feld f, 4 Minuten, Feld g, 20 Minuten. Diese DCFDA-Untersuchung ergibt eine empfindliche Indikation von C5a.
27. Aktivierung von humanem Komplement in Gegenwart von sCR1 zeigt reduzierte Aktivität von C5a in der DCFDA-Untersuchung. Feld a, unstimulierte Zellen, Feld b, die Kontrolle ohne sCR1 zeigt ein hohes Maß an Fluoreszenz; Feld c, DCFDA-Untersuchung in Gegenwart von sCR1 zeigt eine Reduktion an der Fluoreszenz-Intensität von 75%. Auf der y-Achse ist die Zellzahl angezeigt, auf der x-Achse die Fluoreszenz-Intensität.
28. Inhibition der C5a und C3a Produktion im humanen Serum durch sCR1 im klassischen Reaktionsweg. Ähnliche Profile wurden entweder für Antikörper-Affinitäts gereinigtes oder für HPLC gereinigtes sCR1 beobachtet.
29. Inhibition der Komplement-vermittelten Hämolyse durch rekombinantes sCr1. Ähnliche Profile wurden für Antikörper-Affinitäts gereinigtes oder für HPLC gereinigtes sCR1 beobachtet.
30. Übersichts-Morphologie von RPAR in sCR1-behandelten (links) oder unbehandelten (recht) Ratten. (a) beide Ratten erhielten eine intravenöse Ovalbumin-Injektion, der eine intradermale Injektion eines Gemisches mit entweder sCR1 (linke Ratte) oder PBS (rechte Ratte) mit Anti-Ovalbumin folgte, unvermischt (linke Seite); Anti-Ovalbumin, ½ Verdünnung (Mitte) oder Kaninchen-IgG (rechte Seite). Die Injektionen wurden in Duplikaten durchgeführt. Die oberen und unteren Reihen ergaben identische Resultate. Die Ratte, die sCR1 erhielt, zeigte kaum sichtbare Veränderungen, während die unbehandelte Ratte die volle Symptomatik von RPAR entwickelte. (b) die dermale Oberfläche der Hautbiopsie von (a). Die Biopsie der unbehandelten Ratte (rechts) entwickelte eine eindeutig sichtbare Läsion, während die Biopsie der sCR1-behandelten Ratte eine normale Morphologie zeigte.
31. Licht-Mikroskopie der Hautbiopsien von sCR1-behandelten (a) und unbehandelten (b) Ratten.
(a) Perivaskuläre Anreicherung von polymorphkernigen und mononucleären Zellen wurden beobachtet, jedoch keine extensive Infiltration von Neutrophilen oder Extravasation von Erythrozyten wurde gesehen. (b) Extensive Infiltration von polymorphkernigen Zellen und Extravasation von Erythrozyten wurde identifiziert.
5. Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft das C3b/C4b Rezeptor(CR1)Gen, das ein lösliches CR1-Polypeptid codiert und in Anspruch 1 definiert ist, und dessen codiertes Protein. Die Erfindung betrifft auch die sCR1 Nucleinsäure-Sequenzen und Fragmente davon, 70 Nucleotide umfassend, und von diesen codierten Peptide oder Proteine, die 24 Aminosäuren umfassen. Die Erfindung betrifft ferner die Expression des sCR1-Proteins und Fragmente davon. Solche sCR1-Sequenzen und Proteine sind wertvoll bei der Diagnose oder Therapie von entzündlichen und immunologischen Funktionsstörungen und bei Störungen, die die Aktivität des Komplementsystems betreffen.
Die Erfindung betrifft auch die Expression, Reinigung und Verwendungen von löslichen CR1-Molekülen. Somit wie hier verwendet soll der Begriff „lösliche CR1-Moleküle" Teile des CR1-Proteins bezeichnen, die, im Gegensatz zum nativen CR1-Protein, nicht auf der Zelloberfläche als Membranproteine exprimiert sind, und denen im Wesentlichen eine Transmembranregion fehlt. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die löslichen CR1-Moleküle von einer Zelle sezerniert, in der sie exprimiert werden.
In bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, detailliert im Beispiel-Abschnitt unten beschrieben, sind die Klonierung und die vollständige Nucleotid- und abgeleitete Aminosäuresequenz der Volllängen-CR1-cDNA und von Fragmenten davon und die Expression der codierten sCR1-Produkte beschrieben. Die Expression von sCR1 und von Fragmenten davon, mit Bindungsstellen für C3b und/oder C4b, welche Faktor I Cofaktoraktivität inhibieren, ist ebenfalls beschrieben. Die Erfindung ist weiterhin durch die Produktion und Reinigung von löslichen, verkürzten CR1-Molekülen illustriert. In spezifischen Beispielen wird gezeigt, dass diese Moleküle therapeutisch nützlich sind, um Entzündungen zu reduzieren, um die Größe myokardialer Infarkte zu reduzieren und um Reperfusions-Verletzung zu verhüten.
5.1. Isolation des CR1-Gens
Die komplette Kodierungssequenz des CR1-Gens und dessen abgeleitete Aminosäuresequenz sind in 1 dargestellt.
Jede humane Zelle kann potenziell als Nucleinsäure-Quelle für die molekulare Klonierung des CR1-Gens dienen. Die Isolation des CR1-Gens bezieht die Isolation der DNA-Sequenzen mit ein, die ein Protein codieren, das CR1-assoziierte Struktur oder Eigenschaften aufweist, z. B.. Bindung von C3b oder von C4b oder von Immunkomplexen, Modulierung von Phagozytose, Immunstimulation oder Proliferation und Regulation von Komplement. Die DNA kann man durch Standard-Verfahren erhalten, wie sie im Stand der Technik für klonierte DNA bekannt sind (z. B.. eine DNA-„Bibliothek"), durch chemische Synthese, durch cDNA-Klonierung oder durch das Klonieren von genomischer DNA oder von Fragmenten davon, oder von den erwünschten humanen Zellen gereinigt. (Siehe, z. B.. Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York; Glover, D. M.. (ed.), 1985, DNA Cloning: A Practical Approach, MRL Press, Ltd., Oxford, U. K., Band I, II). Zellen, die als Quelle für Nucleinsäure für die cDNA-Klonierung des CR1-Gens dienen können, beinhalten, aber sind nicht limitiert auf Monozyten/Makrophagen, Granulozyten, B-Zellen, T-Zellen, follikulärdendritische Zellen der Milz, und glomeruläre Podozyten. Klone, die von genomischer DNA abgeleitet wurden, können regulatorische und Intron DNA-Abschnitte enthalten, zusätzlich zu den codierenden Abschnitten; Klone, die von cDNA abgeleitet wurden, werden nur Exon-Sequenzen enthalten. Was auch immer die Quelle ist, das CR1-Gen soll zur Propagation des Gens molekular in einen geeigneten Vektor kloniert sein.
Beim molelularen Klonieren des Gens von genomischer DNA werden DNA-Fragmente generiert, von denen einige das erwünschte CR1-Gen codieren werden. Die DNA kann durch Verwendung verschiedener Restriktionsenzyme an spezifischen Stellen gespalten werden. Alternativ kann man DNAse in Gegenwart von Mangan zur Fragmentierung der DNA benutzen, oder die DNA kann physikalischen Scherkräften ausgesetzt werden, wie z. B... Ultraschall. Die linearen DNA-Fragmente können dann entsprechend ihrer Länge mit Standardverfahren separiert werden, einschließlich, aber nicht limitiert auf, mittels Agarose- und Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese und Säulenchromatographie.
Sobald die DNA-Fragmente generiert sind, kann die Identifikation der spezifischen DNA-Fragmente, die das CR1-Gen enthalten, auf verschiedenen Wegen durchgeführt werden. Zum Beispiel, wenn eine Menge eines CR1-Gens oder seiner spezifischen RNA, oder ein Fragment davon erhältlich ist und gereinigt und markiert werden kann, dann können die generierten DNA-Fragmente über eine Nucleinsäure-Hybridisierung mit der markierten Sonde überprüft werden (Benton, W. und Davis, R., 1977, Science 196: 180; Grunstein, M. und Hogness, D., 1975, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 72: 3961). Die DNA-Fragmente, die eine beträchtliche Homologie zu der Sonde aufweisen, werden hybridisieren. Wenn eine gereinigte, CR1-spezifische Sonde nicht erhältlich ist, können CR1-angereicherte Nucleinsäure-Fraktionen als Sonde verwendet werden, als initiales Selektionsverfahren. Zum Beispiel kann eine Sonde verwendet werden, die aus B-Zell cDNA besteht, von der mRNAs, die von Fibroblasten exprimiert werden, subtrahiert wurden. Es ist auch möglich, das entsprechende Fragment durch restriktionsenzymatischen Verdau und durch Vergleich der Fragmentgrößen mit den zu erwartenden, entsprechend einer bekannten Restriktionskarte, wenn eine solche erhältlich ist, zu identifizieren. Weitere Selektion auf Basis der Eigenschaften des Gens oder der physikalischen, chemischen oder immunologischen Eigenschaften seines exprimierten Produktes, wie später beschrieben, können nach der initialen Selektion verwendet werden.
Das CR1-Gen kann auch über mRNA-Selektion identifiziert werden, indem eine Nucleinsäure-Hybridisierung mit anschließender in vitro Translation durchgeführt wird. In diesem Verfahren werden Fragmente zur Isolation von komplementären mRNAs durch Hybridisierung verwendet. Solche DNA-Fragmente können erhältliche, gereinigte CR1 DNA, oder DNA, die für CR1-Sequenzen angereichert wurde, repräsentieren.
Immunopräzipitations-Analyse oder funktionelle Untersuchungen (z. B.., für C3b oder C4b-Bindung, oder die Förderung von Phagozytose oder Immunstimulation, oder Komplement-Regulation, etc.) des in vitro-Translationsproduktes von den isolierten mRNAs identifiziert die mRNA und damit auch die komplementären DNA-Fragmente, die die CR1-Sequenzen enthalten. Zusätzlich können spezifische mRNAs durch Adsorption von aus Zellen isolierten Polysomen an immobilisierte Antikörper, die spezifisch gegen CR1 gerichtet sind, selektiert werden. Eine radioaktiv markierte CR1-cDNA kann unter Verwendung der selektierten mRNA (von den adsorbierten Polysomen) als Vorlage synthetisiert werden. Die radioaktiv markierte mRNA oder cDNA kann dann als Sonde zur Identifikation der CR1-DNA-Fragmente aus anderen DNA-Fragmenten verwendet werden.
Alternativen zum Isolieren der CR1 genomischen DNA schließt das chemische Synthetisieren der Gensequenz aus bekannten Sequenzen oder das Herstellen von cDNA von der mRNA, die das CR1-Gen codiert, ein, ist aber nicht limitiert dadurch. Zum Beispiel, wie oben beschrieben, kann RNA für cDNA-Klonierung des CR1 Gens aus Zellen isoliert werden, einschließlich, aber nicht limitiert dadurch, wie Monozyten/Makrophagen, Granulozyten, B-Zellen, T-Zellen, dendritischen Zellen und Podozyten. In einer bevorzugten Ausführungsform können Tonsillarzellen als Quelle für mRNA zur cDNA-Klonierung dienen (siehe Abschnitt 6.1.2, unten). Andere Verfahren sind möglich und in den Schutzbereich der Erfindung eingeschlossen.
Das identifizierte und isolierte Gen kann dann in einen angemessenen Klonierungs-Vektor inseriert werden. Eine große Anzahl an Vektor-Wirt Systemen, bekannt im Stand der Technik, können verwendet werden. Mögliche Vektoren schließen ein, aber sind nicht limitiert dadurch, Plasmide oder modifizierte Viren, aber das Vektorsystem muss mit der Wirtszelle, die verwendet wird, kompatibel sein. Solche Vektoren schließen ein, aber sind nicht limitiert dadurch, Bakteriophagen, wie zum Beispiel Lambda-Derivate oder Plasmide wie zum Beispiel pBR322 oder pUC-Plasmide oder CDM8-Plasmide (Seed, B., 1987, Nature 329: 840–842) oder Derivate. Rekombinante Moleküle können in Wirtszellen durch Transformation, Transfektion, Infektion oder Elektroporation etc. eingeführt werden.
In einem alternativen Verfahren kann das CR1-Gen, nach der Insertion in einen geeigneten Klonierungs-Vektor durch einen „shot gun" Ansatz identifiziert und isoliert werden. Eine Anreicherung für das CR1-Gen, z. B. durch Größenfraktionierung, kann vor der Insertion in den Klonierungs-Vektor durchgeführt werden.
Das CR1-Gen wird in einen Klonierungs-Vektor eingeführt, der zum Transformieren, Transfizieren oder Infizieren von geeigneten Wirtszellen verwendet wird, sodass viele Kopien der Gensequenzen generiert werden. In einer speziellen Ausführungsform kann der Klonierungs-Vektor der CDM8- Vektor sein, der dazu verwendet werden kann, um Expression in einer Säugetier-Wirtszelle zu gewährleisten. Die Insertion in einen Klonierungs-Vektor kann zum Beispiel dadurch erreicht werden, dass man das DNA-Fragment in einen Klonierungs-Vektor ligiert, der komplementäre kohäsive Enden aufweist. Allerdings, wenn die zur Fragmentierung der DNA verwendeten komplementären Restriktionsstellen nicht im Klonierungs-Vektor vorhanden sind, können die Enden der DNA-Moleküle enzymatisch modifiziert werden. Alternativ kann jede erwünschte Restriktionsstelle über Ligation von Nucleotidsequenzen („Linker") an die DNA-Enden produziert werden. Diese ligierten Linker können spezifische, chemisch synthetisierte Oligonucleotide umfassen, die Erkennungssequenzen von Restriktions-Endonucleasen codieren. In einem alternativen Verfahren können der gespaltene Vektor und das CR1-Gen über homopolymere Anhänge modifiziert werden.
Die Identifikation des klonierten CR1-Gens kann über eine Reihe von Methoden durchgeführt werden, basierend auf den Eigenschaften der DNA selbst, oder alternativ auf den physikalischen, immunologischen oder funktionellen Eigenschaften des codierten Proteins. Zum Beispiel kann die DNA selbst durch Plaque- oder Kolonie-Nucleinsäure-Hybridisierung mit markierten Sonden detektiert werden (Benton, W. und Davis, R., 1977, Science 196: 180; Grunstein, M. und Hohnes, D., 1975, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72: 3961). Alternativ kann das Vorhandensein des CR1-Gens durch Untersuchungen detektiert werden, die auf den Eigenschaften des exprimierten Produktes basieren. Zum Beispiel können cDNA-Klone oder DNA-Klone, die die entsprechenden mRNAs hybrid-selektieren, ausgewählt werden, welche ein Protein produzieren, das zum Beispiel ein ähnliches oder identisches elektrophoretisches Migrationsverhalten, isoelektrisches Fokussierungsverhalten, ähnliche proteolytische Verdauungskarten, C3b und /oder C4b und/oder Immunkomplex-Bindungsaktivität, Komplement-regulatorische Aktivität, Effekte auf Phagozytose oder Immunstimulation, oder antigene Eigenschaften, wie sie für CR1 bekannt sind, besitzt. Durch Verwendung eines Antikörpers gegen CR1 kann das CR1-Protein, durch die Bindung von markiertem Antikörper an die mutmaßlich CR1-produzierenden Klone, in einem ELISA („enzyme-linked immunoabsorbent assay")-artigen Verfahren, identifiziert werden.
In speziellen Ausführungsformen ermöglicht die Transformation von Wirtszellen mit rekombinanten DNA-Molekülen, die das isolierte sCR1-Gen, cDNA oder synthetisierte DNA-Sequenzen einbauen, die Generierung von mehrfachen Kopien des Gens. Somit kann das Gen in großen Mengen durch Züchtung der Transformanten, durch Isolierung der rekombinanten DNA-Moleküle aus den Transformanten und, wenn nötig, durch Wiedergewinnen des eingeführten Gens aus der isolierten rekombinanten DNA erhalten werden.
In einer besonderen Ausführungsform können sCR1-cDNA Klone in einem CDM8-Vektor in COS (Affen-Niere), für die großtechnische Expression unter Kontrolle des Cytomegalovirus-Promotors, transfiziert werden (siehe Abschnitt 8, unten).
Wenn das endgültige Ziel die Einführung des Gens in Virus-Expressionsvektoren wie Vaccina-Virus oder Adenovirus ist, kann das rekombinante DNA-Molekül, welches das sCR1-Gen inkorporiert, so modifiziert werden, dass das Gen von Virus-Sequenzen flankiert ist, die die genetische Rekombination in mit dem Virus infizierten Zellen erlaubt, sodass das Gen in das virale Genom eingeführt werden kann.
Nachdem der die sCR1-DNA enthaltende Klon identifiziert, kultiviert und „geerntet" worden ist, kann dessen Insert, wie in Abschnitt 5.4.1 unten beschrieben, charakterisiert werden.
Wenn die genetische Struktur des sCR1-Gens bekannt ist, ist es möglich, die Struktur für eine optimale Verwendung in der vorliegenden Erfindung zu manipulieren. Zum Beispiel kann Promotor-DNA 5' von der sCR1-Kodierungssequenz zusätzlich zu oder als Ersatz des nativen Promotors ligiert werden, um eine gesteigerte Expression des Proteins zu gewährleisten. Expressionsvektoren, die sCR1-Deletionsmutanten exprimieren, können auch hergestellt werden, um die Expression definierter Fragmente der sCR1-Sequenz zu gewährleisten (siehe Beispiel-Abschnitte unten). In einer besonderen Ausführungsform können Deletionsmutanten konstruiert werden, die Fragmente des sCR1-Proteins codieren, die die gewünschte Bindungsaktivität für C3b und/oder C4b aufweisen (siehe Abschnitt 9 unten), zum Beispiel LHR-A für die C4b-Bindung oder LHR-C für die C3b-Bindung.
Es kann ein Expressionsvektor zur Produktion eines löslichen CR1-Moleküles verwendet werden, der ein sCR1-Molekül mit einer Deletion der Transmembranregion codiert (siehe Beispiel-Abschnitte 11–14 unten). Viele Manipulationen sind möglich und in den Schutzbereich der vorliegenden Endung eingeschlossen.
5.2. Expression des klonierten CR1-Gens
Die Nucleotidsequenz, die für das sCR1-Protein oder für einen Teil davon codiert (1), kann in einen geeigneten Vektor eingeführt werden; das ist z. B. ein Vektor, der die benötigten Elemente für Transkription und Translation der eingeführten Protein codierenden Sequenz besitzt. Die notwendigen Signale für Transkription und Translation können auch von dem nativen CR1-Gen und/oder seinen flankierenden Regionen bereitgestellt werden. Eine Vielzahl von Wirt-Vektor-Systemen kann zur Expression der Protein-codierenden Sequenz verwendet werden. Diese schließen ein, aber sind nicht limitiert auf Säugetierzellsysteme, die mit Virus infiziert sind (zum Beispiel Vaccina-Virus, Adenovirus, etc.); Insektenzellen-Systeme, die mit Virus infiziert sind (zum Beispiel Baculovirus); Mikroorganismen wie Hefe, die Hefe-Vektoren enthalten, oder Bakterien, die mit Bakteriophagen-DNA, Plasmid-DNA oder Cosmid-DNA transformiert sind. Die Expressions-Elementen dieser Vektoren variieren in Stärke und Spezifitäten. Abhängig vom verwendeten Wirts-Vektorsystem kann irgendeines einer Zahl von geeigneten Transkriptions- und Translations-Elementen verwendet werden. Beispielsweise, wenn in Säugetier-Zellsystemen kloniert wird, können Promotoren, die aus dem Genom von Säugerzellen oder von darin wachsenden Viren isoliert wurden, verwendet werden (zum Beispiel Adenovirus, Simianvirus-40, Cytomegalovirus). Es können auch Promotoren verwendet werden, die aus rekombinanter DNA oder über synthetische Techniken produziert wurden, um die Transkription der eingeführten Sequenzen zu gewährleisten.
Spezifische Initiationssignale werden ebenfalls zur effizienten Translation der eingeführten Protein-Kodierungssequenzen benötigt. Diese Signale schließen das ATG-Initiations-Codon und benachbarte Sequenzen mit ein. In Fällen, in denen das gesamte CR1-Gen, einschließlich eigenem Start-Codon und benachbarter Sequenzen, in einen geeigneten Expressions-Vektor eingeführt wurde, müssen keine zusätzlichen Translations-Kontrollsignale nötig sein. Jedoch in Fällen, in denen nur ein Teil der CR1-Kodierungssequenz eingeführt wurde, müssen exogene Translations-Kontrollsignale, einschließlich des ATG-Start-Codons, zur Verfügung gestellt werden. Weiterhin muss das Initiationscodon in Phase mit dem Leserahmen der Protein-Kodierungssequenz sein, um die Translation des gesamten Inserts zu gewährleisten. Diese exogenen Translations-Kontrollsignale und Initiationscodons können von unterschiedlicher Herkunft sein, sowohl von natürlicher als auch synthetischer Herkunft.
Jedes der kürzlich beschriebenen Verfahren zur Einführung von DNA-Fragmenten in einen Vektor kann zur Konstruktion eines Expressionsvektors verwendet werden, der ein chimäres Gen, bestehend aus angemessenen Transkriptions/Translations-Kontrollsignalen und Protein-Kodierungssequenz, enthält. Diese Verfahren können in vitro rekombinante DNA und Synthese-Techniken und in vivo Rekombinationen (genetische Rekombinationen) einschließen.
Ein lösliches CR1-Molekül kann durch die Verwendung von rekombinanten Techniken zur Entfernung der DNA-Sequenz, die für die CR1-Transmembranregion codiert, hergestellt werden (siehe Abschnitte 11–14 unten). Wie unten gezeigt, ist die Möglichkeit, ein lösliches CR1-Molekül zu exprimieren, nicht auf eine bestimmte genetische Modifikation der CR1-Nucleinsäuresequenz limitiert; so lange die Nucleinsäuresequenz, die einen substanziellen Teil der CR1-Transmembranregion codiert, entfernt ist, können lösliche CR1-Konstrukte erhalten werden.
Expressionsvektoren, die sCR1-Gen-Inserts enthalten, können über drei generelle Ansätze identifizier werden. (a) DNA-DNA-Hybridisierung, (b) Vorhandensein oder Fehlen von „Marker"-Gen-Funktionen und (c) Expression der eingeführten Sequenzen. Im ersten Ansatz kann das Vorhandensein eines Fremdgens, eingeführt in einen Expressionsvektor, durch DNA-DNA-Hybridisierung nachgewiesen werden, unter Verwendung von Sonden, die zum eingeführten sCR1-Gen homologe Sequenzen beinhalten. Im zweiten Ansatz kann das rekombinante Vektor/Wirtssystem durch das Vorhandensein oder das Fehlen bestimmter „Marker"-Genfunktionen Identifiziert und selektiert werden (zum Beispiel Thymidinkinase-Aktivität, Resistenz für Antibiotika, Transformations-Phänotyp, Formation von Okklusionskörpern in Baculovirus, etc.), die durch die Einführung des Fremdgens in den Vektor verursacht werden. Zum Beispiel können Rekombinante, die das sCR1-Insert enthalten, über das Fehlen der Markergenfunktion identifiziert werden, wenn das sCR1-Gen innerhalb der Markergensequenz des Vektors eingeführt wurde. Im dritten Ansatz können rekombinante Expressionsvektoren über das Testen des Fremdgen-Produktes, das durch die Rekombinante exprimiert wird, Identifiziert werden. Solche Untersuchungen können auf den physikalischen, immunologischen oder funktionellen Eigenschaften des Genproduktes basieren.
Sobald ein bestimmtes rekombinantes DNA-Molekül identifiziert und isoliert ist können verschiedene im Stand der Technik bekannte Verfahren zur Vermehrung des DNA-Moleküls verwendet werden. Sobald ein geeignetes Wirtssystem und die Wachstumsbedingungen dafür etabliert sind, können rekombinante Expressionsvektoren propagiert und auf Menge produziert werden.
In einer bestimmten Ausführungsform, detailliert beschrieben im Beispielabschnitt der vorliegenden Erfindung, können CDM8-Vektoren mit einem sCR1cDNA-Insert in COS-Zellen transfiziert werden, in denen das sCR1-Insert exprimiert wird, um das sCR1-Protein zu produzieren. In anderen bestimmten Ausführungsformen, detailliert beschrieben im Beispielabschnitt unten, können CDM8-Vektoren mit einem sCR1-cDNA-Insert, das teilweise der sCR1-Kodierungsregion entspricht, in COS-Zellen transfiziert werden, in denen sCR1 oder ein Fragment davon exprimiert wird. Gemäß einem anderen Beispiel unten, können verkürzte, lösliche CR1-Moleküle in Sängerzellen durch Verwendung von Expressionsvektoren, wie die in Abschnitt 11.3.1 beschriebenen pTCS-Vektoren, exprimiert werden. Wie kürzlich erklärt, können die Expressionsvektoren, die verwendet werden, die folgenden Vektoren oder Derivate davon beinhalten, sind aber nicht limitiert auf diese: humane oder tierische Viren wie Vaccina-Virus oder Adenovirus; Insekten-Viren wie Baculoviren, Hefevektoren, Bakteriophagen-Vektoren (z. B... Lambda) und Plasmid- und Cosmid-DNA-Vektoren, um lediglich einige zu nennen.
Zusätzlich kann ein Wirtszell-Stamm gewählt werden, der die Expression der eingeführten Sequenzen moduliert oder der das chimäre Genprodukt modifiziert und in der speziell gewünschten Weise prozessiert. Die Expression von bestimmten Promotoren kann in der Gegenwart von bestimmten Inducern gesteigert sein; so kann die Expression von genetisch hergestelltem CR1-Protein kontrolliert werden. Weiterhin haben verschiedene Wirtszellen charakteristische und spezielle Mechanismen für die Translation und für das posttranslationale Prozessieren und Modifizieren von Proteinen. Entsprechende Zelllinien oder Wirtssysteme können gewählt werden, um die gewünschte Modifikation und Prozessierung des exprimierten, heterologen Proteins sicher zu stellen. Zum Beispiel kann in einer Ausführungsform die Expression in einem bakteriellen System verwendet werden, um ein nicht glycosyliertes CR1-Protein, mit der abgeleiteten Aminosäuresequenz aus 1, zu produzieren. Expression in Hefe produziert ein glycosyliertes Produkt. In einer anderen Ausführungsform können Säuger-COS-Zellen verwendet werden, um die „native" Glycosylierung des heterologen CR1-Proteins sicher zu stellen. Außerdem können unterschiedliche Vektor/Wirts-Expressionssysteme Prozessierungsreaktionen beeinflussen, wie zum Beispiel die proteolytischen Spaltungen in unterschiedlichen Ausmaßen. Viele solcher verschieden prozessierten sCR1-Proteine können produziert werden und sind in den Schutzbereich der vorliegenden Erfindung eingeschlossen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann die großtechnische Produktion von löslichen CR1-Molekülen durchgeführt werden, wie unten in Abschnitt 12.1 und folgenden beschrieben.
5.3 Identifikation und Reinigung des exprimierten Genproduktes
Sobald eine Rekombinante, die das sCR1-Gen exprimiert, identifiziert ist, sollte das Genprodukt analysiert werden. Dies kann über eine Untersuchung, die auf den physikalischen, immunologischen oder funktionellen Eigenschaften des Produktes basiert, erreicht werden.
Die sCR1-Proteine können durch Standardverfahren isoliert und gereinigt werden, eingeschlossen sind Chromatographie (zum Beispiel Ionen-Austausch, Affinität, Säulen-Chromatographie nach Größe und HPLC, Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie), Zentrifugation, unterschiedliche Löslichkeiten oder über jede andere Standardtechnik zur Reinigung von Proteinen.
In einem bevorzugten Aspekt der Erfindung, detailliert beschrieben in den Beispielen unten, können große Mengen an löslichem CR1 über ein HPLC einbeziehendes Verfahren gereinigt werden (siehe Abschnitt 12.2 und folgende). Wie unten beschrieben, kann die großtechnische Produktion von gereinigtem sCR1 dadurch erreicht werden, dass ein Expressionssystem verwendet wird, das lösliches CR1 als Ausgangsmaterial produziert und so die Notwendigkeit, membran-gebundenes CR1 mit Detergenz zu solubilisieren, eliminiert. Die Reduzierung der Konzentration an fetalem Kälberserum in den Bioreaktor-Kulturen und/oder die Verwendung von alternativen Kulturmedien in diesen Kulturen eliminiert den Bedarf, hohe Konzentrationen an fremden Proteinen aus dem löslichen, CR1-enthaltenden Ausgangsmaterial, während der nachfolgenden Reinigung entfernen zu müssen. Entweder Kationen-HPLC oder eine Kombination von Kationen-HPLC, gefolgt von einer Anionen-Austausch-HPLC, kann für die Reinigung in diesem bevorzugten Aspekt verwendet werden. Im Wesentlichen reines, lösliches CR1 mit hoher Ausbeute kann so in nur einem oder zwei Schritten erreicht werden.
Alternativ kann, sobald ein sCR1-Protein, das von einer Rekombinanten produziert und identifiziert wurde, die Aminosäuresequenz des Proteins von der Nucleotidsequenz des in dem Rekombinanten enthaltenen chimären Gens abgeleitet werden. Als Ergebnis kann das Protein mit chemischen Standardverfahren, bekannt im Stand der Technik, synthetisiert werden (zum Beispiel siehe Hunkapiller, M., et al., 1984, Nature 310: 105–111).
In besonderen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind solche sCR1-Proteine eingeschlossen, (aber nicht limitiert darauf und egal ob durch rekombinante DNA-Techniken oder durch chemisch-synthetische Verfahren produziert), die als primäre Aminosäuresequenz die Sequenz, die im Wesentlichen in 1 dargestellt ist, oder Teile davon, aufweisen, einschließlich veränderter Sequenzen, in welchen funktionell äquivalente Aminosäurereste gegen Reste innerhalb der Sequenz substituiert sind, was zu einem stillen Austausch führt. Zum Beispiel kann/können ein oder mehrere Aminosäurerest(e) innerhalb der Sequenz durch eine andere Aminosäure ähnlicher Polarität ersetzt werden, die als funktionelles Äquivalent fungiert und zu einer stillen Abänderung führt. Nichtkonservative Substitutionen können auch zu funktionell äquivalenten Proteinen führen.
In einer Ausführungsform können Substituenten für eine Aminosäure innerhalb der sCR1-Sequenz aus anderen Mitgliedern der Klasse, zu der die Aminosäure gehört, ausgewählt werden. Zum Beispiel schließen die nichtpolaren (hydrophoben) Aminosäuren Alanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan und Methionin ein. Die polaren, neutralen Aminosäuren schließen Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Tyrosin, Asparagin und Glutamin ein. Die positiv geladenen (basischen) Aminosäuren schließen Arginin, Lysin und Histidin ein. Die negativ geladenen (sauren) Aminosäuren schließen Asparaginsäure und Glutaminsäure ein. Ebenso eingeschlossen in den Schutzbereich der Erfindung sind CR1-Proteine, die nach oder während der Translation unterschiedlich modifiziert sind, zum Beispiel durch Glycosylierung oder durch proteolytische Spaltung, etc.
In einem Beispiel der Erfindung, wie unten beschrieben, wurde gezeigt, dass kloniertes, rekombinantes CR1, das von transfizierten Zellen exprimiert wurde, über SDS-PAGE nicht vom F-Allotyp der Erythrozyten unterschieden werden kann (14), dass es die Fähigkeit besitzt, die Bindung von entweder C4b oder C3b tragenden Schafs-Erythrozyten zu vermitteln, dass es fähig ist, die Liganden-Spezifität von CR1 zu reproduzieren (13), und dass es Faktor I-Cofaktoraktivität für die Abspaltung des Alpha-Polypeptides von C3(ma) zeigt (15).
5.4. Struktur des CR1-Gens und Proteins
Die Struktur des CR1-Gens und Proteins kann über verschiedene Verfahren (bekannt im Stand der Technik) analysiert werden, eingeschlossen, aber nicht limitiert, auf die unten beschriebenen.
5.4.1. Genetische Analyse
Klonierte DNA oder cDNA, die dem CR1-Gen entspricht, kann über Verfahren einschließlich Southern-Hybridisierung (Southern, E. M., 1975, J. Mol. Biol. 98: 503–517), Northern-Hybridisierung (siehe zum Beispiel Freeman et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 80: 4094–4098), Restriktions-Endonucleasen-Kartierung (Maniatis, T., 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harro Laboratory, Cold Spring Harro, New York) und durch DNA-Sequenzanalyse analysiert werden, ist aber nicht auf diese Verfahren limitiert. Die Stringenz der Hybridisierungs-Bedingungen für Southern und Northern-Hybridisierung können manipuliert werden, um den Nachweis der Nucleinsäuren mit dem erwünschten Grad an Verwandtheit zu der verwendeten spezifischen Sonde sicher zu stellen. Zum Beispiel kann eine Sonde, die CR1-Sequenzen enthält, die LHR-B und LHR-C codieren, zur Hybridisierung unter niedriger Stringenz verwendet werden, um CR2-Nucleinsäure-Sequenzen zu detektieren.
Restriktions-Endonucleasen-Kartierung kann zur groben Festlegung der genetischen Struktur des CR1-Gens verwendet werden. In einer besonderen Ausführungsform kann die Spaltung mit Restriktionsenzymen verwendet werden, um die Restriktionskarte, die in 2 unten gezeigt ist, abzuleiten. Von Restriktions-Endonuclease-Spaltung abgeleitete Restriktionskarten können durch DNA-Sequenzanalyse bestätigt werden.
DNA-Sequenzanalyse kann mit jeder Technik, die im Stand der Technik bekannt ist, durchgeführt werden, eingeschlossen, aber nicht limitiert auf das Verfahren von Maxan und Gilbert (1980, Meth. Enzymol. 65: 499–560), das Sanger Dideoxy-Verfahren (Sanger, F., et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74: 5463) oder die Verwendung eines automatisierten DNA-Sequenzers (z. B... von Applied Biosystems, Foster City, CA.). Die cDNA-Sequenz des CR1-Gens umfasst die Sequenz, die im Wesentlichen in 1 dargestellt ist, und in den Abschnitten 6 und 7 unten beschrieben ist.
5.4.2. Protein-Analyse
Die Aminosäuresequenz des CR1-Proteins kann durch Deduktion von der DNA-Sequenz oder alternativ durch direktes Sequenzieren des Proteins, z. B. mit einem automatisierten Aminosäure-Sequenzer, abgeleitet werden. Die Aminosäuresesequenz eines repräsentativen CR1-Proteins umfasst die Sequenz, die im Wesentlichen in 1 dargestellt ist, und detailliert in Abschnitt 6 unten beschrieben wird. Wie unten beschrieben, ist die gesamte Kodierungssequenz vom F-Allotyp CR1 kloniert worden und, nach Abspaltung des Signalpeptides von 41 Aminosäuren, enthielt der reife Rezeptor 1998 Aminosäuren, eingeschlossen einer extrazellulären Domäne von 1930 Aminosäuren, die 30 SCRS bildet, 28 davon sind in LHRs-A,-B,-C und -D (10), eine einzelne membranüberbrückende Domäne von 25 Aminosäuren und eine relativ kurze zytoplasmatische Domäne von 43 Aminosäuren organisiert.
Unter den C3b/C4b bindenden Proteinen, die mehrfach SCRs enthalten, ist CR1 dadurch einmalig, das es Gruppen von SCRs Besitz, die zu LHRs organisiert sind. Ein Vergleich der vier LHRs von CR1 zeigt, dass jedes LHR eine Zusammensetzung aus vier Typen von SCRs darstellt: Typ a, b, c und d (19). Zum Beispiel sind die Sequenzen von SCR-1 und -2 von LHR-A nur 62%, 62% und 57% identisch zu den beiden ersten SCRs von LHR-B, -C und -D. Aber SCR-3 bis SCR-7 unterscheiden sich von den entsprechenden SCRs von LHR-B nur an einer einzigen Position und SCR-3 und -4 unterscheiden sich von denen aus LHR-C nur an drei Positionen (10). Somit sind einige der Typ "a" SCRs aus LHR-A auch in LHR-B und -C vorhanden. Die beiden ersten SCRs aus LHR-B, die sich von denen aus LHR-A unterscheiden, sind 99% identisch mit den entsprechenden SCRs aus LHR-C, sodass LHR-B und -C die Typ "b" SCRs an diesen Positionen teilen. Die fünfte, sechste und siebte SCR von LHR-C sind nur 77% identisch zu den Typ "a" SCRs in LHR-A und -B an diesen Positionen und werden als Typ "c" SCRs angesehen. Die ersten vier SCRs von LHR-D sind relativ einmalig und sind Typ „d", während die fünfte bis zur siebten SCR annährend 93% identisch zu den Typ "c" SCRs in LHR-C sind.
Die CR1-Proteinsequenz kann durch eine Hydrophilie-Analyse weiter charakterisiert werden (Hopp, T. und Woods, K., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78: 3824). Ein Hydrophilie-Profil kann zur Identifikation von hydrophoben und hydrophilen Regionen des CR1-Proteins und der entsprechenden Regionen der Gensequenz, die diese Regionen codieren, verwendet werden. Ein Hydrophilie-Profil des COOH-Endes des CR1-Proteins ist in 5 dargestellt.
Sekundärstruktur-Analyse kann auch durchgeführt werden (Chou, P. und Fasman, G., 1974, Biochemistry 13: 222), um die Regionen aus CR1 vorherzusagen, die spezifische Sekundärstrukturen annehmen.
Andere Verfahren zur Struktur-Analyse können ebenfalls verwendet werden. Diese schließen ein, sind aber nicht limitiert auf Röntgen-Kristallographie (Engstom, A., 1074, Biochem. Exp. Biol. 11: 7–13) und Computer-Modellierung (Fletterick, R. und Zoller, M. (Hrsg.), 1986, Computer Graphics and Molecular Modeling, in Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Habor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York).
5.5. sCR1-verwandte Derivate, Analoga und Peptide
Die Produktion und Verwendung von Derivaten, Analoga und Peptiden, die zu sCR1 verwandt sind, wird auch anvisiert und ist in den Schutzbereich der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Solche Derivate, Analoga oder Peptide, die die erwünschte Immunogenität oder Antigenität besitzen, können zum Beispiel in Immununtersuchungen, zur Immunisierung oder therapeutisch, etc., verwendet werden. Solche Moleküle, die eine erwünschte Eigenschaft von sCR1 beibehalten, zum Beispiel die Bindung von C3b oder C4b, die Regulation der Komplement-Aktivität oder die Förderung einer Immunstimulation oder Phagozytose, etc. können als Inducer einer solcher Eigenschaft verwendet werden.
Die sCR1-verwandten Derivate, Analoga oder Peptide der Erfindung können mit verschiedenen Verfahren, bekannt im Stand der Technik, produziert werden. Manipulationen, die zu deren Produktion beitragen, können auf Gen- oder Protein-Ebene erfolgen. Zum Beispiel kann das klonierte sCR1-Gen durch jede der zahlreichen Strategien, bekannt im Stand der Technik, modifiziert werden (Maniatis, T., 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York). Die sCR1-Sequenz kann an geeigneten Stellen mittels Restriktions-Endonuclease(n) gespalten werden, gefolgt von weiteren enzymatischen Modifikationen, wenn erwünscht, isoliert und in vitro ligiert werden (siehe Abschnitt 8 unten). Bei der Produktion des Gens, das ein sCR1 verwandtes Derivat, Analogon oder Peptid codiert, soll darauf geachtet werden, dass gewährleistet ist, dass das modifizierte Gen im selben Translations-Leserahmen wie sCR1 verbleibt, und dass die Gen-Region, in der die erwünschte sCR1 spezifische Aktivität codiert ist, nicht von translationalen Stop-Signalen unterbrochen ist.
Zusätzlich kann das sCR1-Gen in vitro oder in vivo mutiert werden, um Translation, Initiation und/oder Terminationssequenzen zu erzeugen und/oder zu zerstören, oder um Variationen in Kodierungsregionen zu erzeugen, und/oder um neue Restriktions-Endonuclease Schnittstellen zu bilden oder bestehende zu zerstören, um die weitere in vitro-Modifikation zu erleichtern. Jede im Stand der Technik bekannte Mutagenesetechnik kann verwendet werden, einschließlich, aber nicht limitiert auf in vitro Schnittstellen-ausgerichtete Mutagenese (Hutchinson, C., et al., 1978, J. Biol. Chem. 253: 6551), die Verwendung von TAB®-Linkern (Pharmacia), etc.
Manipulationen der sCR1-Sequenz können auch auf Proteinebene durchgeführt werden.
Jede der zahlreichen chemischen Modifikationen kann mittels bekannter Techniken durchgeführt werden, einschließlich, aber nicht limitiert auf die spezifische chemische Spaltung mittels Cyanbromid, Trypsin, Chymotrypsin, Papain, V6-Protease, NABH₄; Acetylierung; Formylierung, Oxidation, Reduktion; metabolische Synthese in der Gegenwart von Tunicamycin; etc.
Zusätzlich können Analoga und Peptide, die mit sCR1 verwandt sind, chemisch synthetisiert werden. Zum Beispiel kann durch Verwendung eines Peptid-Generators ein Peptid synthetisiert werden, das einem Teil von sCR1 entspricht und die erwünschte Aktivität vermittelt (zum Beispiel C3b und/oder C4b-Bindung, Immun-Stimulation, Komplement-Regulation, etc.).
5.6. Verwendung von CR1
5.6.1. Untersuchungen und Diagnose
sCR1-Proteine, Analoga, Derivate und Untersequenzen davon haben Verwendung in Untersuchungen und Diagnostika. Die erfindungsgemäßen Moleküle, welche die erwünschten sCR1-Eigenschaften oder Funktion zeigen, können zur Untersuchung dieser Eigenschaften oder Funktion verwendet werden. Zum Beispiel können sCR1-Proteine oder Fragmente davon, welche Bindung von C3b und/oder C4b in freier oder komplexer Form aufweisen, in Untersuchungen zum Messen der Menge dieser Substanzen in einer Probe, zum Beispiel der Körperflüssigkeit eines Patienten, verwendet werden.
In einer besonderen Ausführungsform können sCR1 oder eine sCR1-Deletionsmutante, die auf der Zelloberfläche exprimiert wird (zum Beispiel die unten in Abschnitt 8 beschriebenen) und die die Fähigkeit zur C3b- (siehe zum Beispiel Tabelle II, Abschnitt 9 unten), iC3b- oder C4b-Bindung (siehe zum Beispiel Tabelle II) aufweist, in Untersuchungen zum Messen von C3b-, iC3b- oder C4b-Konzentrationen in einer Probe verwendet werden. In einer anderen Ausführungsform kann ein sCR1-Protein oder ein Fragment davon verwendet werden, das durch rekombinante DNA-Technologie konstruiert wurde und dem eine Transmembransequenz fehlt, wodurch es sekretiert wird.
In einer besonderen Ausführungsform kann eine solche Messung von C3b und/oder C4b auf Komplement-Aktivität hindeuten und kann bei der Diagnose von entzündlichen Erkrankungen und bei Funktionsstörungen des Immunsystems nützlich sein. Solche Funktionsstörungen beinhalten, aber sind nicht limitiert auf Gewebezerstörung, verursacht durch Verbrennung- oder myocardialen Infarkt-induziertes Trauma, akute respiratorische Insuffizienz (Schocklunge), Autoimmun-Erkrankungen wie rheumatoide Arthritis, systemischen Lupus erythematodes und andere Erkrankungen oder Funktionsstörungen, die mit unerwünschter oder unangebrachte Komplement-Aktivität einhergehen (siehe zum Beispiel Miescher, P. A. und Müller-Eberhard, H. J., Hrsg., 1976, Text Book of Immunpathology, 2. Ausgabe, Band I und II, Grune and Stratton, New York; Sandberg, A. L., 1981, in Cellular Funktions in Immunity and Inflammation, Oppenheim, J. J. et al., Hrsg., Elsevier/North Holland, New York, Seite 373; Conrow, R. B. et al., 1980, J. Med.
Chem. 23: 242; Regal, J. F. und Pickering, R. H., 1983, Int. J. Immunopharmacol. 5: 71; Jacobs, H. S., 1980, Arch. Pathol. Lab. Med. 104: 617).
Das sCR1-Protein und die Fragmente davon, die ein Epitop enthalten, haben Verwendungen in Untersuchungen, die Immuntests einschließen, aber nicht darauf beschränkt sind. Die Immuntests, die verwendet werden können, schließen ein, sind aber nicht limitiert auf kompetitive und nichtkompetitive Untersuchungssysteme, die Techniken wie Radioimmunoassays, ELISA („enzyme linked immunosorbent assay"), „Sandwich"-Immunoassays, Precipitin-Reaktionen, Gel-Diffusion Precipitin-Reaktionen, Immunodiffusions-Assays, Agglutinations-Assays, Komplement-Fixierungs-Assays, immunoradiometrischen Assays, Fluoreszenz-Immunoassays, Protein A-Immunoassays und Immunoelektrophorese-Assays einschließen, um lediglich einige zu nennen.
sCR1-Gene und verwandte Nucleinsäuresequenzen und Untersequenzen können in Hybridisierungs-Assays verwendet werden. Solche Hybridisierungs-Assays können zur Überwachung von entzündlichen oder Immunantworten, die mit CR1-Expression assoziiert sind, zur Diagnose bestimmter Krankheitsstadien, die mit Veränderungen in der CR1-Expression assoziiert sind, zur Ermittlung des CR1-Allotyps eines Patienten und zur Detektion des Vorhandenseins und/oder der Expression des CR1-Gens und verwandter Gene (zum Beispiel CR2) verwendet werden.
5.6.2. Therapie
Das sCR1-Protein und Fragmente, Derivate und Analoga davon können in der Modulation von CR1 vermittelten Funktionen therapeutisch nützlich sein. Solche Funktionen schließen ein, sind aber nicht limitiert auf Bindung von C3b und/oder C4b, in freier oder in komplexer Form, Förderung von Phagozytose, Komplementregulation, Immun-Stimulation, etc. Effektive Dosen des sCR1-Proteins und verwandter Moleküle der Erfindung haben therapeutischen Wert für viele Erkrankungen oder Funktionsstörungen, die mit solchen Funktionen assoziiert sind, wie Immun- oder entzündliche Erkrankungen (zum Beispiel solche, die oben in Abschnitt 5.6.1 beschrieben sind). Zum Beispiel können sCR1 oder Fragmente davon und verwandte Moleküle, die die erwünschte Aktivität aufweisen, durch ihre Fähigkeit als Faktor I-Cofaktor zu agieren, die irreversible Inaktivierung von Komplement-Komponenten C3b oder C4b fördern (Fearon, D. T:, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76: 5867; Iida, K. und Nussenzweig, V. 1981, J. Exp. Med. 153: 1138) und/oder durch die Fähigkeit, die alternativen oder die klassischen C3- oder C5-Convertasen zu inhibieren, therapeutische Verwendung bei der Inhibition von Komplement haben.
Es kann ein Expressionsvektor konstruiert werden, der ein CR1-Molekül codiert, welches keine Transmembranregion besitzt (zum Beispiel durch eine Deletion carboxyterminal zu Arginin, codiert durch die C-terminalste SCR), was zur Herstellung eines löslichen CR1-Fragments führt. In einer Ausführungsform kann ein solches Fragment die Fähigkeit beibehalten, C3b und/oder C4b in freien oder in komplexen Formen zu binden. In einer besonderen Ausführungsform kann ein solches lösliches sCR1-Protein nicht länger eine Faktor I-Cofaktoraktivität aufweisen. Das lösliche CR1-Produkt kann einem Patienten in vivo verabreicht werden, sodass das lösliche CR1 wirksam die Bindung von C3b und/oder C4b an das native Zelloberflächen-CR1 kompetitiert, damit Zelloberflächen-CR1 die Faktor I-Cofaktoraktivität blockiert und die Komplement-Aktivität steigert.
Nachdem C3b kovalent an Partikel und lösliche Immunkomplexe gebunden wurde, hat die Inaktivierung von C3b durch die proteolytische Prozessierung in iC3b und C3dg zwei biologische Folgen: die Verhinderung exzessiver Aktivierung des Komplement-Systems über den Amplifikations-Reaktionsweg und die Bildung von Liganden, die andere Rezeptoren als CR1 verbinden können. Das iC3b-Fragment kann Faktor B nicht binden, sodass die Umwandlung in diesen Zustand zusätzliche Komplement-Aktivierung über die Amplifikations-Schleife des alternativen Reaktionsweges blockiert. Dennoch kann iC3b von CR1 und CR3, den beiden Komplementrezeptoren, die Phagozytose durch myelomonozytische Zellen vermitteln, gebunden werden. Somit ist die primäre biologische Konsequenz der Umwandlung von C3b zu iC3b der Stillstand der Komplement-Aktivierung, ohne mit der CR1- und CR3-vermittelten Beseitigung des C3-besetzten Komplexes zu interferieren. Dagegen erzeugt die zusätzliche Konversion von iC3b zu C3dg ein Fragment, das nur mit CR2 und nicht mit CR1 und CR3 interagiert. Dieser Umstand limitiert die Komplement-abhängige Bindung des C3dg-tragenden Komplexes zu CR2 exprimierende Zelltypen, welche B-Lymphozyten, follikulär-dendritische Zellen und vielleicht Epithelzellen der Dermis einschließen, und vermindert oder schließt Interaktionen mit phagozytotischen Zelltypen aus. Die biologische Konsequenz dieses veränderten Musters an zellulärer Assoziation wäre ein Targeting der C3dg-tragenden Komplexe an Zellen, die in die afferente Phase der Immunantwort involviert sind, eher als an Zellen, die in die Beseitigung und dem Abbau von Partikeln und Komplexen einbezogen sind. Daher können sCR1 Moleküle nicht nur zur Beeinflussung des Ausscheidungsprozesses therapeutisch verwendet werden, sondern auch für das Targeting von Komplexen zu CR2-tragenden Zelltypen, die an Antigenpräsentation und Antikörperproduktion beteiligt sind.
In einer alternativen Ausführungsform kann ein sCR1-Protein oder ein Fragment davon, welches C3b oder C4b binden kann, und/oder das die Fähigkeit zur Inhibition der alternativen oder klassischen C3- oder C5-Convertase beibehält, oder das Faktor I-Cofaktoraktivität beibehält, zur Förderung der Komplement-Inaktivierung verwendet werden. In einer solchen Ausführungsform kann das sCR1-Protein oder ein Fragment davon für die Behandlung von Funktionsstörungen, die unerwünschte oder unangebrachte Komplement-Aktivität einschließen, von Nutzen sein (zum Beispiel Schocklunge, Gewebeschädigung, verursacht durch Verbrennungen oder ischämische Herzerkrankungen, Autoimmun-Erkrankungen, entzündliche Erkrankungen, etc).
In einer spezifischen Ausführungsform, wie detailliert in den Beispielen in Abschnitten 11–14 unten beschrieben, kann ein lösliches CR1-Molekül exprimiert werden, das eine erwünschte funktionelle Aktivität beibehält, wie zum Beispiel durch die Fähigkeit, die klassische Komplement-vermittelte Hämolyse zu inhibieren, die klassische C5a-Produktion, die klassische C3a-Produktion oder neutrophilen oxidativen Burst in vitro gezeigt wurde. In einer besonderen Ausführungsform kann ein solches lösliches CR1-Molekül dazu verwendet werden, Entzündungen und deren schädliche Effekte zu reduzieren oder myokardiale Infarkt-Ausmaße zu reduzieren oder Reperfusions-Verletzungen zu verhindern, etc. Solche für die in vivo -Therapie nützlichen sCR1-Moleküle können in verschiedenen im Stande der Technik bekannte Modell-Systemen getestet werden, die die reverse passive Arthus-Reaktion (siehe Abschnitt 14.1) und ein Ratten-Modell für den myokardialen Infarkt (siehe Abschnitt 14.3) einschließen, aber nicht darauf beschränken.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung kann ein Fragment von sCR1 oder ein Analogon oder ein Derivat davon, von dem gezeigt wurde, dass es eine erwünschte CR1-Eigenschaft oder Funktion inhibiert, dazu verwendet werden, Krankheiten oder Funktionsstörungen, die mit dieser Funktion assoziiert sind, zu verhindern oder zu behandeln.
Verschiedene Verabreichungssysteme sind bekannt und können für die Verabreichung von sCR1 und verwandten Molekülen verwendet werden, zum Beispiel die Einkapselung in Liposome, die Expression durch hämatopoetische Stammzellvermehrung in der Gentherapie, etc. Andere Verfahren der Einführung schließen intradermale, intramuskuläre, intraperitoneale, intravenöse, subkutane und intranasale und orale Routen ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
6. Beispiel: Klonierung und Sequenzieren des humanen C3b/C4b-Rezeptors (CR1)
In den Beispielen, die hier detailliert sind, beschreiben wir die Klonierung und die Nucleotidsequenz von 5,5 Kilobasenpaaren (kb) der CR1-Kodierungsregion (Klickstein, L. B. et al., 1987, J. Exp. Med. 165: 1095–1112).
Zehn überlappende CR1-cDNA Klone, die 5,5 kb überspannen, wurden von einer Tonsillen-Bibliothek isoliert und im Ganzen oder in Teilen sequenziert. Ein einzelner langer offener Leserahmen, der am 5' Ende der Klone beginnt und 4,7 kb stromabwärts mit einem Stop-Codon endet, wurde identifiziert. Diese Sequenz repräsentiert ~80% der geschätzten 6 kb Kodierungssequenz des F-Allotyps von CR1. Drei Tandems, direkte lange homologe Wiederholungen („long homologous repeats" (LHRs)) von 450 Aminosäuren wurden identifiziert. Analyse der Sequenz tryptischer Peptide lieferte einen Hinweis auf einen vierten LHR im F-Allotyp von CR1. Die Aminosäure-Identität unter den LHRs reichte von 70% zwischen dem ersten und dritten Repeat bis zu 99% zwischen dem NH₂-terminalen 250 Aminosäuren des ersten und zweiten Repeats. Jede LHR umfasst sieben „kurze Konsensus-Wiederholungen" (SCRs) von 60–70 Aminosäuren, die den SCRs von anderen C3/C4 bindenden Proteinen ähneln, wie dem Komplement-Rezeptor-Typ 2, Faktor B und H, C4-bindendes Protein und C2. Zwei zusätzliche SCRs fügen die LHRs zu einer einzelnen membranübergreifenden Domäne von 25 Aminosäuren zusammen: Somit enthält der F-Allotyp von CR1 vermutlich wenigstens 30 SCRs, von denen 23 sequenziert worden sind. Für jedes SCR wird vorhergesagt, dass dieses eine dreifache „Loop-Struktur" ausbildet, in der die vier konservierten Halbcystine Disulfidbrücken bilden. Die lineare Aneinanderreihung von 30 SCRs als halbstarre Struktur würde 1140 Angström aus der Plasmamembran herausragen und kann die Interaktion von CR1 mit C3b und C4b, die in den Zwischenräumen von Immunkomplexen und mikrobiellen Zellwänden lokalisiert sind, erleichtern. Die COOHterminale zytoplasmatische Domäne von 43 Aminosäureresten enthält eine sechs Aminosäuren lange Sequenz, die homolog zu jener Sequenz im epidermalen Wachstumsfaktor- Rezeptor ist, die durch Proteinkinase C phosphoryliert wird.
6.1. Material und Methoden
6.1.1 Isolation und Sequenz der CR1 tryptischen Peptide
CR1 wurde von gewaschenen humanen Erythrozyten-Membranen durch sequenzielle Affinitäts-Chromatographie mit Matrex Red A und YZ-1 monoklonalen Antikörpern gereinigt (Wong, W. W:, et al., 1985, J. Immunol. Methods 82: 303). Tryptische Peptide wurden durch sequenzielle Gradienten- und isokratischer reverser-Phasen-HPLC („high performance liquid chromatography") wie beschrieben präpariert und isoliert (Wong, W: W:, et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82: 7711). Eine tryptische Peptidanalyse wurde mit einem 470A Protein-Sequenzer (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) durchgeführt und die Analyse jedes Abbau-Zyklus wurde unter Verwendung eines 120 PTH-Aminosäure-Analysators ausgeführt (Applied Biosystems, Inc.).
6.1.2. Isolation von cDNA-Klonen und genomischen Klonen
Eine cDNA-Bibliothek wurde in λgt11 von humaner Tonsillen poly(A)+ RNA wie beschrieben angefertigt (Wong, W. W:, et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82: 7711). Über RNA-blot-Hybridisierung zeigte sich der Tonsillen-Donor homozygot für das F-Allel von CR1 (id.). Die cDNA wurde in einem Agarose-Gel so ausgewählt, dass sie vor dem Klonierungs-Schritt die Fraktionen von 2 bis 7 kb einschloss. Der ursprüngliche Umfang der Bibliothek war 4,5 × 10⁶ Rekombinante pro 100 ng cDNA und die Bibliothek wurde in Escherichia coli Stamm Y1088 amplifiziert. Die Bibliothek wurde durchsucht (Maniatis, T., et al., 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harro Laboratory, Cold Spring Harro, New York) und zwar mit CR1-, CR1-1- (ATTC Zugangsnummer 57330; (E. coli enthaltendes CR1-1-Plasmid), 57331 (gereinigte CR1-1 DNA)) und CR1-2-Sonden (Wong, W. W., et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82: 7711), die mittels Nick-Translation zu einer spezifischen Aktivität von 2–8 × 10⁸ cpm/μg radioaktiv markiert worden sind. Die Hybridisierung wurde in 50% Formamid, 5x SSC (1x SSC: 15 mM Natriumcitrat, 150 mM Natriumchlorid) bei 43°C durchgeführt und die Filter wurden bei 60°C in 0,2x SSC gewaschen, Bedingungen, unter denen CR2-cDNA-Klone nicht detektierbar sind (Weiss, J. J., et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83: 5639). Positive Klone wurden zweifach Plaquegereinigt, bevor eine Restriktions-Kartierung und DNA-Sequenzanalyse durchgeführt wurde.
Es wurde eine genomische Bibliothek mit 15–20 kb Fragmenten in EMBL-3 erstellt, die durch partiellen Verdau von humaner Leukozyten-DNA mit Sau3AI hergestellt wurden. Der ursprüngliche Umfang war 1,2 × 10⁶, und die Bibliothek wurde in E. coli Stamm p2392 amplifiziert. Die Bibliothek wurde ebenfalls mit den cDNA-Sonden CR1-1 und CR1-2 durchsucht (Wong, W. W:, et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82: 7711).
6.1.3. DNA-Sequenz-Analyse
Es wurden Restriktionsfragmente der cDNA-Klone in M13mp18 oder M13mp19 subkloniert und über das Dideoxynucleotid-Ketten-Terminations-Verfahren sequenziert (Sanger, F., et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74: 5463). Manche Klone wurden im Ganzen oder zum Teil sequenziert, indem zuerst geordnete Deletionsmutanten unter Verwendung von Exonuclease III hergestellt wurden (Henikoff, S., 1984, Gene 28: 351). Jede Region wurde auf beiden Strängen sequenziert und in den meisten Fällen wurde jede Region in M13 Subklone sequenziert, die von zwei unabhängig isolierten cDNA-Klonen konstruiert wurden (2). Sequenzdaten wurden mit dem University of Wisconsin Genetics Computer Group-Paket analysiert (Madison, WI).
6.2. Ergebnisse
6.2.1. Nucleotid-Sequenz des CR1-Gens
Es wurde eine größenselektionierte Tonsillen cDNA-Bibliothek mit den CR1-1 und CR1-2-Sonden durchsucht, die aus dem CR1-cDNA-Klon λT8.3 erhalten wurden (Wong, W:W:, et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82: 7711). Fünfzehn positive Phagen wurden aus 1,5 × 106 Rekombinanten identifiziert und 13 davon repräsentierten eindeutige Klone. Für zehn Klone wurden Restriktionskarten erstellt und diese wurden im Ganzen oder zu Teilen über das Dideoxynucloetid-Ketten-Abbruch-Verfahren sequenziert. Die cDNA-Klone wurden, basierend auf überlappender Sequenzidentität, miteinander verbunden (2), was eine 5,5 kb lange Sequenz ergab (3). Ein einzelner langer offener Leserrahmen wurde identifiziert, der am 5' Ende der cDNA-Klone beginnt und sich 4,7 kb stromabwärts bis zu einem Stop-Codon erstreckt. Basierend auf ein geschätztes Molekulargewicht von 222.000 Dalton des nicht glykosilierten Rezeptors (Wong, W. W., et al., 1983, J. Clin. Invest. 72: 685) wird erwartet, dass die Kodierungssequenz für CR1 in dieser Bibliothek 6 kb lang ist. Somit erstrecken sich diese Klone über ~80% der geschätzten Kodierungssequenz.
Die Klone T49.1 und T55.1 enthalten Kodierungssequenzen an ihren 5'-Enden, was anzeigt, dass zusätzliche 5' codierende und nicht codierende Sequenzen zu identifizieren verbleiben. In der 3' Region enthalten die überlappenden Klone T8.2, T43.1 und T87.1 die transmembranen und zytoplasmatischen Regionen, die durch eine identische Sequenz in jedem Klon codiert sind. Der sich am längsten 3'-erstreckende Klon, T8.2, enthält 807 by nicht translatierter Sequenz ohne eine poly(A) Sequenz. Klone T8.3 enthält eine 91-bp Deletion der Nucleotide 1406–1497 und Klon T40.1 enthält eine 9 by Deletion der Nucleotide 1498–1507, relativ zu den Sequenzen, die in den Klonen T6.1 und T55.1 gefunden wurden. Diese Deletionen sind in Regionen aufgetreten, die Sequenzhomologie zu 5'Splice-Seiten aufweisen und können Splicingfehler in der mRNA repräsentieren. Klone T49.1 und T55.1 enthalten ein 110 by Insert zwischen den Nucleotiden 147 und 148 des offenen Leserahmens (3). Diese Sequenz wird als Teil eines Introns beurteilt, weil sie nicht mit Blots von Tonsillen-poly(A)⁺ RNA hybridisierte, sie eine 5' Splice-Seite enthält (Breathnach, R., et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. 75: 4853) (3), sie von cDNA-Sequenzen in CR1-genomischen Klonen flankiert ist und sie den Leserahmen verschiebt. Klon T9.4 enthält 0,88 kb intervenierende Sequenz am 3' Ende, die nicht mit Blots von Tonsillen-poly(A)⁺ RNA hybridisiert.
6.2.2 Analyse der Nucleotid- und Aminosäuresequenz von CR1
Dot-Matrix-Analyse der Nucleotidsequenz von CR1 (3) ergab zwei Typen von internen Homologien (4). Der erste Typ der internen Homologie ist durch die fetten, ununterbrochenen Linien repräsentiert, die das Vorhandensein von drei Tandem-, direkten, hoch homologen Wiederholungen von 1,35 kb anzeigen. Diese Nucleotidsequenzen codieren die langen, homologen Wiederholungen („repeats (LHRs)) von CR1. Der zweite Typ von Wiederholungen ist durch die unterbrochenen parallelen Linien repräsentiert, die Regionen niedrigerer Homologie anzeigen. Diese Sequenzen treten alle 190–210 Nucleotide auf und codieren die „kurze Konsensus-Wiederholungen" („short consensus repeats", SCRs) von CR1.
Die Aminosäuresequenz, die von der cDNA Sequenz abgeleitet wurde, ist in 5 gezeigt, und die drei LHRs, bezeichnet als LHR-B, LHR-C und LHR-D, sind gegeneinander ausgerichtet, um ihre Homologie aufzuzeigen. LHR-B erstreckt sich von Aminosäurerest 1 bis Aminosäurerest 438, LHR-C entspricht den Aminosäureresten 439–891 und LHR-D erstreckt sich von Aminosäurerest 892 bis 1341. Aminosäurereste 451–694 von LHR-C sind 99% identisch zu den Aminosäureresten 1–244 von LHR-B, aber nur 61% identisch zu den entsprechenden Aminosäureresten von LHR-D. Dagegen sind die Aminosäurereste 695–891 von LHR-C 91% identisch zu den Aminosäureresten 1148–1341 von LHR-D, aber nur 76% identisch zu der entsprechenden Region of LHR-B. Somit erscheint LHR-C ein Hybrid zu sein, das Sequenzen, die stark homolog zur ersten Hälfte von LHR-B und zur zweiten Hälfte von LHR-D erscheinen, umfasst. LHRs werden gfolgen zwei SCRs, die nicht wiederholt sind, ein hydrophobes Segment von 25 Aminosäureresten und einer 43 Amiosäure langen COOH-terminalen Region ohne Sequenz-Homologie zu den SCRs (5).
Die 5' liegenden 1,3 kb der CR1-Kodierungssequenz zeigen ein viertes LHR, LHR-A (siehe 1 oben und Abschnitt 7 unten). Diese Folgerung wurde unterstützt durch die Analyse der tryptischen Peptide von Erythrozyten-CR1. Zehn tryptische Peptide haben identische Sequenzen zu den Aminosäure-Sequenzen, die von den cDNA-Klonen abgeleitet wurden (Tabelle I).
Tabelle I CR1-tryptische Peptide, die in der abgeleiteten Aminosäure Sequenz gefunden wurden*
Jede LHR umfasst sieben 60–70 Aminosäure SCRs, die die Familie von C3 und C4-bindenden Proteinen (C4bp) charakterisieren (6A). Maximale Homologie zwischen den 23 SCRs des CR1 wurde durch die Einführung von Platzhaltern in die Aufreihung der Sequenzen beobachtet (6A). Alles in allem sind 29 der durchschnittlich 65 Aminosäuren-Reste in jeder Wiederholung („repeat") konserviert. Es gibt sechs Aminosäurereste, die in allen SCRs vorkommen: Die vier Halb-Cystine (6A), die in ähnlichen relativen Positionen auftreten, was nahe legt, dass jedes in einer wichtigen Disulfidbindung involviert sein kann, und das Tryptophan und das zweite Glycin nach dem zweiten Halb-Cystin (6A). Sekundärstrukturanalyse der Sequenz zwischen den Invarianten Halb-Cystinen unter Verwendung des Algorithmus von Chou und Fasman (Chou, P. Y., and Fasman, G. D., 1974, Biochemistry 13: 222) sagt mit hoher Wahrscheinlichkeit β-Faltblatt-Formation und mit niedriger Wahrscheinlichkeit α-Helix-Formation voraus. Sequenzanalyse von zwei genomischen CR1-Klonen, 2.38 (6B) und 2.46 zeigt, dass SCR-14 (6A) durch ein einzelnes Exon codiert wird und dass der COOH-Terminus von SCR-23 einem Exonende entspricht. Somit können die SCRs von CR1 durch separate Exons codiert sein, wie es für die SCRs von Faktor B (Campbell, R. D. und Bentley, D. R., 1985, Immunol. Rev. 87.19) und für die SCRs des IL-2-Rezeptor gezeigt worden ist (Leonard, W. J., et al., 1985, Science 230: 630).
Die Konsensussequenz der CR1-SCRs wird mit den SCRs von anderen Mitgliedern der Superfamilie verglichen, die diese charakteristische Struktur besitzen ( 7). Diese Mitglieder schließen nicht nur Proteine ein, die C3b/C4b Bindungsfunktion besitzen, wie CR2 (Weis, J. J., et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83: 5639), C4bp (Chung, L. P., et al., 1985, Biochem. J. 230: 133), Faktor H (Kristensen, T., et al., 1986, J. Immunol. 136: 3407), Factor B (Morley, B. J. and Campbell, R. D., 1984, EMBO J. 3: 153; Mole, J. E., et al., 1984, J. Biol. Chem. 259: 3407) und C2 (Bentley, D. R. and Porter, R. R., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81: 1212; Gagnon, J., 1984, Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 306: 301), sondern auch die Proteine, von denen nicht bekannt ist, dass sie solche Funktion haben, wie der Interleukin-2-Rezeptor (Leonard, W. J., et al., 1985, Science 230: 630), β₂-Glykoprotein I (Lozier, J., et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81: 3640), C1r (Leytus, S. P., et al., 1986, Biochemistry 25: 4855), die Haptoglobin α-Kette (Kurosky, A., et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 77: 3388) und Faktor XIIIb (Ichinose, A., et al., 1986, Biochemistry 25: 4633). Die Halb-Cystin-Reste sind invariant in den SCRs aller Proteine, mit Ausnahme von Haptoglobin, dem das dritte Halb-Cystin fehlt. Das Tryptophan ist ebenfalls invariant, mit Ausnahme des fünften SCR in β₂-Glykoprotein I und zwei der Wiederholungen in Faktor XIIIb. Andere Aminosäurereste, die konserviert sind, aber nicht in jedem SCR vorkommen, neigen sich um die Halb-Cystine anzuhäufen. Es gibt nur eine einzige freie Thiol-Gruppe in Faktor B und C2 (Christie, D. L. and Gagnon, J., 1982, Biochem. J. 201: 555; Parkes, C., et al., 1983, Biochem. J. 213: 201), und in den SCRs von β₂-Glykoprotein I ist das erste Halb-Cystin über eine Disulfidbindung mit dem dritten und das zweite mit dem vierten verbunden (Lozier, J., et al., 198–4, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81: 3640).
In der abgeleiteten Aminosäuresequenz von CR1 existieren 17 potenzielle Stellen für N-verknüpfte Oligosaccharide und alle liegen in der extrazellulären Region ( 6A). Molekulargewichtsunterschiede zwischen CR1, das in Gegenwart und Abwesenheit von Tunicamycin synthetisiert wurde (Lublin, D. M., et al., 1986, J. Biol. Chem. 261: 5736), und die Analyse des Glukosamingehaltes (Sim, R. B., 1985, Biochem. J. 232: 883), legen das Vorhandensein von nur 6–8 N-verknüpften Oligosaccharid-Komplexen nahe, was zeigt, dass nicht alle potenziellen Stellen genutzt werden. Zum Beispiel wurde das Asparagin an Aminosäureposition 263 der abgeleiteten Aminosäure-Sequenz (5) im Peptid 41c identifiziert, was das Fehlen einer Glycosylierung an dieser Stelle zeigt. Dagegen entspricht die nicht identifizierte Aminosäure im Peptid 34b vermutlich einem glycosylierten Asparagin an Aminosäureposition 395.
Die einzigen nicht repetitiven CR1-Sequenzen, die in den 5,5 kb cDNA identifiziert wurden, sind in der COOH-terminalen Region lokalisiert. Eine Sekundärstruktur-Analyse dieser Region identifizier ein einzelnes 25 Aminosäurereste langes putatives membranumspannendes Segment, das starken hydrophoben Charakter besitzt und ein hohes Potenzial für α-Helix-Formation aufweist (5). Dieser Sequenz folgen unmittelbar vier positiv geladenen Aminosäurereste, was charakteristisch für viele Membranproteine ist. Die angenommene zytoplasmatische Region von CR1 umfasst 43 Aminosäurereste und enthält eine sechs Aminosäurereste lange Sequenz, VHPRTL, die homolog zur Sequenz VRKRTL, einer Proteinkinase-C-Phosphorylierungsstelle im epidermalen Wachstunsfaktor (EGF)-Rezeptor und dem erbB Onkogen-Produkt, ist (Hunter, T., et al., 1984, Nature 311: 480; Davis, R. J. and Czech, M. P., 1985, Proc. Natl: Acad. Sci. U.S.A. 82: 1974). Es gibt keine Tyrosinreste in der zytoplasmatischen Region von Tonsillen-CR1.
6.3. Diskussion
Annähernd 80% der Primärstruktur des F-Allotyps von CR1 ist durch Sequenzierung überlappender cDNA-Klone erhalten worden. Das ungewöhnlichste strukturelle Merkmal von CR1, das in dieser Analyse beobachtet wurde, ist das Vorhandensein von Tandem-, direkten LHRs von 450 Aminosäuren, von welchen von vier vorhergesagt wird, dass sie im F-Allotyp von CR1, der eine geschätzte Polypeptidkettenlänge von 2000 Aminosäuren aufweist (Wong, W. W., et al., 1983, J. Clin. Invest. 72: 685; Sim, R. B., 1985, Biochem. J. 232: 883), vorkommen. Drei der LHRs sind geklont und sequenziert worden, während ein Hinweis für die Existenz eines vierten LHRs durch die Analyse der tryptischen Peptide geliefert wurde. Jedes LHR beinhaltet sieben SCRs, die die grundlegenden strukturellen Elemente anderer C3/C4-bindenden Proteine sind. Die Konservierung der vier Halb-Cystine pro SCR, die mögliche Einbindung des ersten und dritten bzw. des zweiten und vierten Halb-Cystins in Disulfidbindungen (Lozier, J., et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81: 3640) und das Vorhandensein von konservierten Aminosäuren wie Prolin, Glycin und Asparagin, die häufig in β-Faltblatt-Strukturen gefunden werden (Rose, G. D., et al., 1985, Adv. Protein Chem. 37: 1), führen zu dem Vorschlag, dass ein SCR eine dreifache Schleifen-Struktur bildet, die durch Disulfidbindungen aufrechterhalten wird. Die Rolle der Halb-Cystin-Aminosäuren wird durch den Befund unterstützt, dass mild mit Trypsin behandeltes CR1 (Sim, R. B., 1985, Biochem. J. 232: 883) und Faktor H (Sim, R. B. and DiScipio, R. G., 1982, Biochem. J. 205: 285), wenn sie über eine SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (PAGE) unter nicht reduzierenden Bedingungen aufgetrennt werden, als intakte Moleküle und als vielfache tryptische Fragmente nach einer Reduktion migrieren Es wird vorausgesagt, dass diese tandemartig angeordneten, wiederholten SCRs eine gestreckte Struktur bilden (8), wie es für den Faktor H und für jede Untereinheit des humanen C4bp vorgeschlagen worden ist (Sim, R. B. and DiScipio, R. G., 1982, Biochem. J. 205: 285; Whaley, K. and Ruddy, S., 1976, J. Exp. Med. 144: 1147; Dahlback, B., et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80: 3461). Elektronenmikroskopische Studien der Untereinheiten von C4bp haben Dimensionen von 300 × 30 Angström angezeigt (Dahlback, B., et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80: 3461). Da jede Untereinheit aus acht SCRs (Chung, L. P., et al., 1985, Biochem. J. 230: 133) gebildet wird, wird ein einzelnes SCR mit 38 × 30 Angström kalkuliert. In der Annahme, dass die SCRs von CR1 ähnliche Dimensionen haben und dass der F-Allotyp 30 SCRs besitzt, kann sich der Rezeptor bis zu 1140 Angström von der Zellmembran erstrecken.
Übereinstimmend mit dieser Voraussage der CR1-Struktur ist der frühere Befund, dass ferritinmarkierte Antikörper, häufig 500 Angström von der äußeren Schicht der Plasmamembran an CR1 auf Neutrophilen gebunden haben (Abrahamson, D. R. and Fearon, D. T., 1983, Lab. Invest. 48: 162). Solch eine ausgestreckte Struktur von CR1 würde die Interaktion von rezeptortragenden Zellen mit C3b, das kovalent an relativ unzugänglichen Stellen der Immunkomplexe und der mikrobiellen Zelloberflächen gebunden ist, erleichtern.
Der Befund, dass das SCR das wesentliche und vielleicht das einzige, extrazytoplasmatische Element von CR1 ist, liefert strukturellen Hinweis für eine enge Beziehung zwischen dem Rezeptor und Faktor H und C4bp, zwei Plasmaproteien, die exklusiv oder überwiegend aus SCRs zusammengesetzt sind (Chung, L. P., et al., 1985, Biochem. J. 230: 133; Kristensen, T., et al., 1986, J. Immunol. 136: 3407). CR1 wurde zunächst als ein Erythrozytenmembranprotein isoliert, das nach Detergenz-Solubilisation Faktor-H ähnliche Aktivität besitzt (Fearon, D. T., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76: 5867), und es wurde danach gefunden, dass es die regulatorischen Funktionen von Protein-H und C4bp besitzt, wenn es sich auf der Plasmamembran befindet (Iida, K. and Nussenzweig, V., 1981, J. Exp. Med. 153: 1138). Bei der Analyse vererbter struktureller Polymorphismen von CR1, Faktor-H und C4bp wurde gezeigt das die Gene, die diese drei Proteine codieren, verknüpft sind (de Cordoba, R., et al., 1985, J. Exp. Med. 161: 1189), und es wurde kürzlich durch in situ-Hybridisierung und durch die Analyse von somatischen Zell-Hybriden gezeigt, dass die Position für diese Verknüpfungsgruppe und für den strukturell verwandten CR2-Rezeptor auf dem langen Arm des Chromosoms 1, Band q32, liegt (Weis, J. H., et al., 1987, J. Immunol. 138: 312). Vor der vorliegenden Studie war eine signifikante Ähnlichkeit in ihren Aminosäurezusammensetzungen der einzige Hinweis für eine strukturelle Verbindung zwischen diesen Proteinen (Wong, W. W., et al., 1985, J. Immunol. Methods 82: 303). Daher stellt der vorliegende Befund von wenigstens 23 SCRs in CR1 die direkte und formale Demonstration einer strukturellen Verbindung des Rezeptors mit Faktor H und C4bp (Chung, L. P., et al., 1985, Biochem. J. 230: 133; Kristensen, T., et al., 1986, J. Immunol. 136: 3407), mit Proteinen ähnlicher Funktion und mit den Ba- und C2b-Fragmenten von Faktor B und C2 (Morley, B. J. and Campbell, R. D., 1984, EMBO J. 3: 153; Mole, J. E., et al., 1984, J. Biol. Chem. 259: 3407; Bentley, D. R. and Porter, R. R., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81: 1212; Gagnon, J., 1984, Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 306: 301) und Komponenten, die enzymatische Komplexe mit C3b und C4b bilden, dar. Jedoch ist SCR auch in einigen, Nicht-Komplement-Proteinen gefunden worden (Campbell, R. D., and Bentley, D. R., 1985, Immunol. Rev. 87: 19; Lozier, J., et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81: 3640; Leytus, S. P., et al., 1986, Biochemistry 25: 4855; Kurosky, A., et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77: 3388; Ichinose, A., et al., 1986, Biochemistry 25: 4633) (Figur. 7), was zeigt, dass es nicht notwendigerweise eine C3/C4-bindende Struktur repräsentiert.
Unter den Proteinen, die SCRs besitzen, ist CR1 dadurch einzigartig, dass es diese grundlegende Struktur und genetische Einheit in eine strukturelle Einheit höherer Ordnung, im LHR, organisiert hat. Die Analyse eines mit der Expression des S-Allotyps assoziierten 14,5 kb BamHI-Fragmentes von genomischer DNA, hat suggeriert, dass wenigstens eine sich wiederholende, genomische Einheit in CR1 ein erweitertes Segment von DNA ist, welche die Exons, die wenigstens fünf SCRs codieren und deren flankierende Introns enthält (Wong, W. W., et al., 1986, J. Exp. Med. 164: 1531). Diese Studien haben ebenfalls vorgeschlagen, dass das S-Allel eine zusätzliche Kopie dieser genomischen Einheit enthält, verglichen mit Anzahl, die im F-Allel vorhanden ist. Diese Beobachtung, kombiniert mit einer tryptischen Peptid-Karten-Studie (Nickells, M. W., et al., 1986, Mol. Immunol. 23: 661) und dem vorliegenden Befund, dass ein LHR ein Peptid von ~40–50 kD ist, erlaubt uns die Anwesenheit eines zusätzlichen LHR im S-Allotyp (290 kD), verglichen zu der Schätzung von vier LHRs im F-Allotyp (250.000 Dalton Molekulargewicht), vorherzusagen.
Außer Beweise für Duplikationsereignisse zu liefern, wird durch die Sequenzen der LHRs ebenfalls vorgeschlagen, dass Konversionsereignisse innerhalb des CR1-Gens stattgefunden haben. LHR-B und -D sind über ihre Gesamtlänge 67% identisch zueinander, während LHR-C zu 99%, bezüglich der vier SCRs am NH₂-Terminus, identisch zu LHR-B ist und zu 91%, bezüglich der drei COOH-terminalen SCRs, zu LHR-D identisch ist. Diese Organisation kann nicht durch einen einzelnes rekombinatorisches Ereignis zwischen identischen elterlichen Allelen bei der Entstehung dieses Hybrid-LHRs entstanden sein. Eher kann dieser Hybrid-LHR durch Genkonversion entstanden sein (Atchison, M. and Adesnik, M., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83: 2300), bei der Sequenzen in einem LHR-C-Vorläufer durch in LHR-B oder LHR-D vorkommende Sequenzen ersetzt wurden. Die nahezu vollständige Identität und die präzise Anordnung homologer Sequenzen in diesen LHRs (5) können ebenfalls durch einen Genkonversion einschließenden Mechanismus erhalten worden sein. Durch Analyse des Ausmaßes an Homologie zwischen intervenierenden Sequenzen jener Segmente des CR1-Gens, die die LHRs codieren, sollte entschieden werden können, ob Genkonversion oder auf funktionellen Zwängen basierende Selektion die Sequenz-Divergenz streng beschränkt haben.
Obwohl gemäß einer früheren Studie vorgeschlagen wurde, dass CR1 monovalent ist (Wilson, J. G., et al., 1982, N. Engl. J. Med. 307: 981), kann jedes LHR eine C3b/C4b-Einfachbindungsdomäne repräsentieren, was den Rezeptor multivalent machen und zum Binden von Komplexen befähigen würde, die eine Vielzahl von C3b und C4b-Molekülen tragen. Alternativ dazu können verschiedene LHRs für die Bindung von C3b und C4b verantwortlich sein (siehe Abschnitt 9 unten) und eine strukturelle Basis für die Kombination aus Faktor-H und C4bp-Aktivitäten in CR1 liefern. Schließlich können die LHRs von CR1 strukturelle Domänen repräsentieren, die dazu dienen, CR1 aus der Plasmamembran herausragen zu lassen, wie durch das vorgeschlagene Modell (8) angeregt wurde, und SCRs in der NH₂-terminalen Region binden C3b und C4b, wie es für Faktor H gefunden worden ist (Sim, R. B. and DiScipio, R. G., 1982, Biochem. J. 205: 285; Alsenz, J., et al., 1984, Biochem. J. 224: 389).
Die Aktivierung von Proteinkinase C durch Phorbolester induziert die Phosphorylierung von CR1 in Neutrophilen, Monozyten und Eosinophilen (Changelian, P. S. und Fearon, D. T., 1986, J. Exp. Med. 163: 101) und die zytoplasmatische Domäne von CR1 von 43 Aminosäuren besitzt eine Sequenz, die homolog zu einer Stelle ist, die im epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor durch Protein Kinase C phosphoryliert wird (Hunger, T., et al., 1984, Nature 311: 480; Davis, R. J. und Czech, M. P., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82: 1974). Jedoch ist diese zytoplasmatische Sequenz, die in drei unabhängigen Klonen der Tonsillen-Bibliothek gefunden wurde, sehr wahrscheinlich die von B-Zell-CR1, das nach Aktivierung von Protein Kinase C nicht phosphoryliert wird (Changelian, P. S. and Fearon, D. T., 1986, J. Exp. Med. 163: 101).
7. Beispiel: CR15'-cDNA-Sequenzen enthalten eine vierte lange homologe Sequenzwiederholung
sDie Analyse einer partiellen cDNA-Sequenz von CR1 offenbarte eine Struktur, in der drei LHRs (long homologous repeats) – LHR-B, LHR-C und LHR-D – von je 450 Aminosäuren jeweils aus sieben kurzen Konsensus-Wiederholungen (short consensus repeats, SCRs) von 65 Aminosäuren zusammengesetzt sind, die charakteristisch für C3/C4 bindende Proteine sind (siehe Abschnitt 6, oben). In den hier dargestellten Beispielen beschreiben wir die Klonierung und die Nucleotidsequenz eines vierten, amino-terminalen LHR, LHR-A (Klickstein, L. B., et al., 1987, Complement 4: 180), durch die Sequenzierung von 5'cDNA-Klonen. Eine Analyse von LHR-A zeigte, dass es in den fünf 3' SCRs zu 99% homolog zu LHR-B, in den zwei 5' SCRs aber nur zu 61% homolog zu LHR-B ist.
7.1. Material und Methoden
7.1.1. Konstruktion einer cDNA-Bibliothek
Eine auf einem selektiven Primer basierende cDNA-Bibliothek, λHH, wurde aus 3 μg Poly (A)⁺ RNA hergestellt, welche gemäß der Beschreibung aus DMSO-induzierten Zellen isoliert wurde (Chirgwin, J. M. et al., 1979, Biochemistry 18: 5290; Aviv, H. und Leder, P., 1972, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 69: 1408; Ausubel, F. M., et al., 1987, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York), wobei die folgenden methodischen Modifikationen verwendet wurden. LK35.1, ein 35-mer Oligonucleotid, 5'-TGAAGTCATC ACAGGATTTC ACTTCACATG TGGGG-3', wurde anstelle von Oligo(dT)_12-18 verwendet and 40 μCi α³²P-dCTP wurden während der Synthese des Zweitstranges zugegeben. Ein Drittel der cDNA wurde in λgt11 kloniert und eine cDNA-Bibliothek aus humaner Tonsillen-poly(A)⁺RNA hergestellt, wie in Abschnitt 6.1.2., oben, beschrieben. Dabei wurden 750.000 unabhängige Rekominanten erhalten.
7.1.2. Isolation von Klonen, Sonden und DNA-Sequenz-Analyse
Für die Analyse der cDNA-Bibliotheken wurden folgende Sonden verwendet: CR1-1 (Wong, W. W., et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82: 7711) (ATCC- Zugangsnummer 57331), CR-2 (Wong, W. W. et al., s. oben), CR1-4 (Wong, W. W. et al., 1986, J. Exp. Med. 164: 1531) und CR1-18, ein 252 Basenpaare langes Sau3AI-Fragment aus dem 0.5 kb EcoRI-Fragment von cDNA-Klon λH3.1, das den Nucleotiden 101–352 in 1 entspricht. Unter Bedingungen hoher Stringenz hybridisiert CR1-18 nur mit cDNA-Klonen, die entweder das NH₂-terminate SCR von LHR-A oder das Signal-Peptid codieren. Die Inserts der cDNA-Klone wurden über die Dideoxynucleotid-Technik sequenziert (Sauger, F., et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74: 5463), nachdem die Fragmente in M13mp18 und M13mp19 subkloniert worden waren (Yanisch-Perron, C. et al., 1985, Gene 28: 351).
7.2. Ergebnisse
Eine auf einem spezifischen Primer basierende λgt11 cDNA-Bibliothek, λHH, die 7,5 × 10⁵ Rekombinanten enthielt, wurde mit cDNA präpariert, die aus poly(A)⁺-RNA aus DMSO induzierten HL-60 Zellen synthetisiert wurde. Diese Zellen exprimieren ausschließlich den F-Allotyp von CR1 (Lublin, D. M., et al., 1986, J. Biol. Chem. 261: 5736), für den vorhergesagt wird, dass er vier LHRs besitzt (Lapata, M. A., et al., 1984, Nucl. Acids Res. 12: 5707). Der Primer LK35.1 war ein antisense 35-mer entsprechend den Nucleotiden 896–930 der partiellen cDNA-Sequenz von CR1 gemäß 3. Es wurde gezeigt, dass dieses Oligonucleotid unter Bedingungen der reversen Transkription mit LHR-B, LHR-C und LHR-D hybridisiert. Es wurden zweihundertfünfzig positive Klone in einer Plattenkultur von 3,8 × 10⁵ nicht amplifizierten rekombinanten Phagen identifiziert, wobei mit einer Mischung der CR1-cDNA-Sonden CR1-1 und CR1-4 durchsucht wurde. Achtunddreißig positive Klone wurden ausgewählt und als Plaques gereinigt. Southern-Blots von EcoRI-verdauter DNA dieser Klone wurde mit dem 23-mer Oligonucleotid KS23.1, 5'-CTGAGCGTAC CCAAAGGGAC AAG-3', entsprechend den Nucleotiden 763–785 der partiellen CR1-cDNA-Sequenz aus 3, durchsucht. Diese Sonde hybridisierte unter Bedingungen hoher Stringenz nur an einer einzelnen Stelle in der für LHR-B codierenden Sequenz, aber nicht mit Sequenzen, die für LHR-C oder LHR-D codieren. Das Insert von Klon λH7.1 (9) enthielt drei EcoRI-Fragmente von 1,0 kb, 0,9 kb und 0,4 kb wobei die zwei größeren Fragmente mit KS23.1 hybridisierten, was zeigte, dass dieser Klon Sequenzen enthielt, die für das 3' 5/7 von LHR-A und das gesamte LHR-B codieren. Dieser Befund bestätigte, dass LHR-A in hohem Maße homolog zu LHR-B ist. Klon λH3.1 (9) enthielt ein einzelnes KS23.1-positives EcoRI-Fragment von 1,0 kb und ein 5'–0,5 kb-Fragment, das bei hoher Stringenz schwach mit CR1-4 hybridisierte. Es wurde angenommen, dass dieser Klon die zusätzlichen LHR-A komplettierenden 5'Sequenzen, einschließlich der SCRs 1 und 2 und 0,1 kb der stromaufwärts gelegenen Sequenz enthielt. Keiner der restlichen 36 Klone, von denen alle mit CR1-1 hybridisierten, wurde mit der Sonde CR1-18 nachgewiesen, einem 252 by Sau3AI-Fragment aus dem 0,5 kb EcoRI-Fragment von Klon λH3.1, welches nicht mit LHR-B, -C oder -D codierenden Sequenzen hybridisiert.
Die DNA-Sequenzanalyse von λH3.1 zeigte, dass sich das offene Leseraster zum 5'-Ende der cDNA fortsetzte, was zeigt, dass der Klon sich nicht bis zur Translations-Startstelle erstreckt. Daher wurden die cDNA-Bibliotheken λHH und λS2T erneut mit der Sonde CR1-18 durchsucht, um in jeder Bibliothek einen Klon, nämlich λH10.3 bzw. λT109.1, zu identifizieren. Die EcoRI-Fragmente derjenigen Klone, die mit CR1-18 hybridisierten, wurden sequenziert, ebenso auch die Inserts der Klone λH3.1 und λH7.1. Die zusammengesetzte Sequenz ist in 1 derart präsentiert, dass das Nucleotid, das in 1 auf die Nucleotidnummer 1531 folgt, das Nucleotid #1 in 3 darstellt. Die überlappenden Sequenzen der cDNA-Klone aus der HL-60- und den Tonsillen-Bibliotheken sind identisch.
Direkt stromaufwärts von LHR-A enthalten die Klone λH10.3 und λT109.1 identische putative, hydrophobe Leitsequenzen (Von Heijne, G., 1986, Nucl. Acids Res. 14: 4683), die 41 Aminosäuren codieren, einschließlich eines ATG, das zu der als eukaryotische Translations-Initiationsstelle vorgeschlagenen Konsensus-Sequenz NNA/GNNATGG (Kozak, M., 1986, Cell 44: 283) passt (Figur. 10). Ein zweites ATG, sechs Codons stromaufwärts vom gewählten ATG und gerade stromabwärts von einem im Leserahmen liegenden Stop-Codon gelegen, passt nur schlecht zu dieser Konsensus-Sequenz. Die ersten drei Aminosäuren dieser Leitsequenz für CR1, MGA, sind die gleichen wie die für CR2 beschriebenen. Die Sequenzen dieser zwei Klone weichen stromaufwärts vom ATG voneinander ab und man nimmt an, dass die Sequenz von Klon λ10.3 einen Teil einer dazwischen liegenden Sequenz repräsentiert, wie es für andere CR1-cDNA Klone in Abschnitt 6, oben, beschrieben worden ist.
Die Spaltung durch Signal-Peptidase wird zwischen Glycin-46 und Glutamin-47 vorausgesagt (Von Heijne, G., 1986, Nucl. Acids Res. 14: 4683), was suggeriert, dass der blockierte NH₂-Terminus von CR1 (Wong., W. W., et al., 1985, J. Immunol. Methods 82: 303; Holeis, V. M., et al., 1986, Complement 3: 63) durch das Vorhandensein eines Pyrrolidonamids begründet sein kann. Die beiden ersten in diesen Klonen enthaltenen SCRs des NH₂-terminalen LHR-A sind nur zu 61% identisch gegenüber der entsprechenden Region von LHR-B, wohingegen die SCRs 3–7 von LHR-A zu 99% identisch gegenüber den entsprechenden SCRs von LHR-B sind (10). Der Vergleich von LHR-A mit LHR-C zeigt, dass nur das dritte und vierte SCR von jedem hochgradig homolog sind (99% Identität). LHR-A und -D besitzen nur 68% Gesamt-Identität, mit einer maximalen Identität von 81% zwischen dem jeweils sechsten SCR jeder LHR. So zeigt die Vervollständigung der 5'cDNA-Sequenz von CR1, dass der F-Allotyp aus 2039 Aminosäuren besteht, einschließlich eines Signalpeptides von 41 Aminosäuren, vier LHRs bestehend aus jeweils 7 SCRs, zwei zusätzlichen COOH-terminalen SCRs, einer 25 Aminosäure-Reste langen Transmembranregion und einer 43 Aminosäure langen zytoplasmatischen Domäne. Es existieren 25 mögliche N-verknüpfte Glycosylierungsstellen.
7.3. Diskussion
Die Primärstrukturen des NH₂-Terminus und des Signal-Peptids des F-Allotyps von CR1 sind über die Isolierung und Sequenzierung der 5'cDNA-Klone abgeleitet worden. Die hoch repetitive Natur der CR1-Sequenz machte die Entwicklung einer geeigneten Strategie zur Präparation und Identifikation von cDNA-Klonen, die diese Region des Rezeptors codieren, schwierig. Es wurde eine cDNA-Bibliothek unter Verwendung eines 35-mer Oligonucleotid-Primers hergestellt, der bekanntermaßen unter Bedingungen der Reversen Transkription mit LHR-B, -C und -D hybridisiert; es wurde die Möglichkeit in Betracht gezogen, dass dieser Primer auch mit LHR-A hybridisieren kann, welches als hoch homolog zu LHR-B vorausgesagt wurde (siehe Abschnitt 6, oben). Geeignete cDNA-Klone wurden durch Verwendung eines anderen Oligonucleotides, KS23.1, identifiziert, welches unter stringenten Bedingungen nur mit LHR-B hybridisiert, und daher die Wahrscheinlichkeit, 5'-Klone zu finden, erhöhte. Zwei Klone wurden gefunden, die nahezu alle restlichen Sequenzen von CR1 beinhalteten, und ein Sau3AI-Fragment von einem von diesen, CR1-18, das eine ausreichend einmalige Sequenz besitzt, um seine Verwendung zur Identifizierung der verbliebenen 5'-Klone zu erlauben (9 und 10).
Eine 250 bp-Sonde aus der 5'-Region von LHR-A, CR1-18, hybridisierte nicht nur mit CR1-Transkripten von 7,9 und 9,2 kb, sondern unter stringenten Bedingungen auch mit einem 2 kb langen Transkript aus humaner Tonsillen-RNA. Diese kreuz-hybridisierende mRNA wurde bei CR1-cDNA-Sonden von anderen LHRs nicht beobachtet, ebensowenig in Northern-Blots von RNA aus Dimethylsulfoxid induzierten HL-60 Zellen und HSB-2 T lymphoblastoiden Zellen. Demnach enthält CR1 Sequenzen mit Homologie zu zwei weiteren B-Zell-Proteinen, von denen eines durch die neu erkannte mRNA codiert wird, und CR2.
8. Beispiel: Expression von rekombinantem humanem CR1
Wie oben beschrieben, sind humane CR1-cDNA-Klone isoliert worden, die eine Länge von 7,0 kb umspannen und ein offenes Leseraster enthalten, das 2039 Aminosäuren codiert (1). Die vorgeschlagene Vorläufer-Form des Rezeptors beinhaltet ein Signal-Peptid von 41 Aminosäuren, vier lange homologe Sequenzwiederholungen (LHRs) von 450 Aminosäuren, von denen jedes LHR aus 7 kurzen Konsensus-Wiederholungen (SCRs) zusammengesetzt ist, zwei COOH-terminale SCRs von 65 Aminosäuren, eine 25 Aminosäuren lange Transmembrandomäne und eine 43 Aminosäure lange zytoplasmatische Domäne. Somit enthält der CR1 F-Allotyp 30 SCRs. Das NH₂-terminale LHR, LHR-A (siehe Abschnitt 7, oben) ist zu 61% identisch zu der entsprechenden Region von LHR-B im Bereich der ersten beiden SCRs und zu 99% identisch in den fünf COOH-terminalen SCRs. Restriktionsfragmente von acht CR1 cDNA-Klonen wurden geschnitten, um ein Konstrukt über die volle Länge von 6.9 kb zu bilden und dieses stromabwärts eines Metallothionein-Promotors der Maus oder eines Zytomegalievirus-Promotors anzuordnen und in L-Zellen (Maus) oder in COS-Zellen (Affe) zu transfizieren. Rekombinantes Zelloberflächen-CR1 wurde über indirekten Radioimmuno-Assay und Immunfluoreszenz nachgewiesen. Es wurde kein Antigen auf Zellen nachgewiesen, die nur mit dem parentalen Vektor (CR1^–) transfiziert worden waren. Immunpräzipitation von transfizierten, mit ¹²⁵I Oberflächen-markierten COS-Zellen (Affe) mittels monoklonalem anti-CR1 Antikörper und Analyse über eine nicht reduzierende Natrium-Dodecyl-Sulfat (SDS) Polyacrylamid Gel-Elektrophorese lieferte eine Bande von 190.000 Dalton Molekulargewicht, die mit dem F-Allotyp aus humanen Erythrozythen comigrierte. Die Expression von rekombinantem CR1-Antigen des korrekten Molekulargewichtes (Klickstein, L. B., et al., 1988, FASEB J. 2: A1833) lieferte den Beweis, dass die cDNA die vollständige kodierende Sequenz von humanem CR1 enthielt.
8.1. Konstruktion des Plasmids pBSABCD, das die vollständige CR1 kodierende Sequenz enthält
Wir beschreiben hier die Konstruktion des Plasmids pBSABCD, eines Vektors, der das CR1-Protein in voller Länge (SCRs 1–30) codiert.
Das 2,3 kb lange Insert des cDNA-Klons λT8.2 (Klickstein, L. B., et al., 1987, J. Exp. Med. 165: 1095; siehe Abschnitt 6, oben) wurde als EcoRI-Fragment in pUC18 subkloniert, und zwar so, dass das 5'-Ende proximal zur HindIII-Restriktionsstelle im Polylinker des Plasmids liegt. Dieses Plasmid wurde p188.2 genannt. p188.2 wurde mit ApaI und HindIII geschnitten, und das große 4,7 kb Fragment, das CR1-Sequenzen von SCR 26 bis zur 3'-untranslatierten Region plus Vektor-Sequenzen enthielt, wurde über ein Gel gereinigt.
Das Insert von cDNA-Klon λT50.1 (Klickstein, L. B., et al., 1987, J. Exp. Med. 165: 1095; siehe Abschnitt 6, oben), wurde als EcoRI-Fragment in M13mp18 subkloniert. Dieser Phage wurde 18R50.1 genannt. DNA von der replikativen Form dieses Klons wurde mit HindIII und ApaI geschnitten, und das 1,45 kb Fragment, das die CR1 SCRs 18–25 enthielt, wurde isoliert, mit dem 4,7 kb Fragment von p188.2 ligiert und die Ligation in E. coli DH5α transformiert. Dieses Plasmid wurde p8.250.1 genannt.
Die 0,75 kb und die 0,93 kb EcoRI-Fragmente von cDNA-Klon λT8.3 (Wong, W. W., et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 22: 7711) wurden in Plasmid pBR327 subkloniert. Diese Subklone wurden pCR1-1 beziehungsweise pCR1-2 genannt und enthielten die SCRs 11–14 beziehungsweise die SCRs 17–21. Von jedem wurden die EcoRI-Inserts isoliert. Das 0,75 kb pCR1-1-Fragment wurde mit SmaI verdaut, und der Verdau wurde mit pUC18 DNA ligiert, die zuvor mit EcoRI und SmaI geschnitten worden war. Es wurde ein Subklon, p181-1.1, mit einem den SCRs 12–14 entsprechenden 0,5 kb Insert isoliert. Das 0,93 kb-Fragment von pCR1-2 wurde mit HindIII verdaut und mit pUCl9 ligiert, der zuvor mit EcoRI und HindIII geschnitten worden war, und ein Subklon, p191-2.1, wurde isoliert, der ein 0,27 kb Insert mit SCR 17 enthielt.
Der cDNA-Klon λT6.1 (siehe Abschnitt 6, oben; Klickstein, L. B., et al., 1987, J. Exp. Med. 165: 1095; Wong, W. W., et al., 1987, J. Exp. Med. 164: 1531) wurde mit EcoRI verdaut, und das 0,37 kb-Fragment, das den SCRs 15 und 16 von CR1 entsprach, in pBR322 subkloniert. Dieser Klon wurde pCR1-4 genannt. Klon p181-1.1 wurde mit EcoRI und ScaI geschnitten und das 1,4 kb-Fragment isoliert. Der Klon p191-2.1 (Klickstein, L. B., et al., 1987, J. Exp. Med. 165: 1095; siehe Abschnitt 6 oben) wurde mit EcoRI und ScaI geschnitten und das 2,0 kb-Fragment isoliert, mit dem 1,4 kb-Fragment aus p181-1.1 ligiert und die Ligationsmischung in E. coli DH5α transformiert. Das daraus resultierende Plasmid wurde p1-11-2 genannt. Das Plasmid p1-11-2 wurde mit EcoRI verdaut und das 0,37 kb-Fragment des Inserts aus pCR1-4 durch Ligation eingesetzt. Das resultierende Plasmid wurde zur Transformation von E. coli DH5α verwendet.
Ein Subklon wurde ausgewählt, der ein 0,39 kb-BamHI-HindIII-Fragment enthielt. Dieses Plasmid wurde p142 genannt und enthielt die CR1 SCRs 12–17. Das 3,5 kb EcoRI-HindIII-Insert-Fragment von p8.250.1 wurde in pGEM3b transferiert. Dieses Plasmid wurde pG8.250.1 genannt. Das 1,2 kb HindIII-Fragment aus p142 wurde gereinigt und mit pG8.250.1 ligiert, welches zuvor mit HindIII geschnitten worden war. Ein Subklon wurde ausgewählt, der ein 2,4 kb PstI-ApaI-Insert enthielt, und somit die korrekte Orientierung gewährleistete. Dieses Plasmid wurde pCD genannt und enthielt CR1-Sequenzen von SCR 12 bis zum 3'-Ende.
Der cDNA-Klon λ5'7.1 (Klickstein, L. B., et al., Sept. 1987, Complement 4: 180; siehe Abschnitt 7, oben) wurde mit PstI geschnitten und das 1,35 kb Fragment, das den SCRs 6–12 entsprach, isoliert und mit PstI-geschnittenem pCD ligiert. Die Mischung wurde transformiert und ein Subklon ausgewählt, der HindIII-Fragmente von 1,35 kb und 1,1 kb enthielt. Dieser Klon wurde pBCD genannt.
Der cDNA-Klon λ5'3.1 (Klickstein, L. B., et al., 1987, Complement 4: 180; siehe Abschnitt 7, oben) wurde mit EcoRI verdaut und der Verdau mit EcoRI-geschnittenem pUC18 ligiert. Es wurde ein Subklon p3.11-1 isoliert, der ein 1,0 kb Insert enthielt, das den SCRs 3–7 entsprach; dieses Insert wurde über ein Gel gereinigt. Der cDNA-Klon λ5'10.3 (Klickstein, L. B., et al., 1987, Complement 4: 180; siehe Abschnitt 7, oben) wurde mir EcoRI geschnitten und das 0,63 kb Insert, das die SCRs 1 und 2 enthielt, wurde in pUC18 subkloniert. Dieser Klon wurde p 10.3.5 genannt. Plasmid p 10.3.5 wurde partiell mit EcoRI verdaut, und ein 3,4 kb-Fragment, das dem linearen Plasmid entsprach, wurde isoliert und mit dem 1 kb-Fragment von p3.11-1 ligiert. Es wurde ein Subklon, pLA, ausgewählt, der ein 1,3 kb PstI-Fragment in der richtigen Orientierung und an der korrekten Insertionsstelle enthielt.
Der cDNA-Klon λT109.4 (Klickstein, L. B., et al., 1987, Complement 4: 180; siehe Abschnitt 7, oben) wurde mit EcoRI verdaut und in pUC 18 subkloniert. Es wurde ein Subklon ausgewählt, der ein 0,55 kb EcoRI-Fragment enthielt, das der 5'-untranslatierten Region bis zur Leitsequenz und den SCRs 1 und 2 entsprach. Das Plasmid p 109.4 wurde mit PstI und BspMII geschnitten und ein 3,0 kb-Fragment, das den Vektor, die Leitsequenz und SCR1 enthielt, wurde isoliert. Das Fragment wurde mit einem 0,81 kb PstI-BspMII-Fragment aus pLA ligiert, das die SCRs 2–5 enthielt. Dieses neue Plasmid wurde pNLA genannt. Das Plasmid pNLA wurde partiell mit EcoRI und vollständig mit PstI verdaut, und ein 1,1 kb EcoR1-PstI-Fragment, das CR1-Sequenzen von der Leitsequenz bis zu SCR 5 enthielt, wurde isoliert und mit pBluescript KS+ (Stratagene, San Diego, CA) ligiert, um eine XhoI-Restriktionsstelle an der 5'-Seite der cDNA einzuführen. Dieses Plasmid wurde pXLA genannt.
Das Plasmid pBCD wurde mit EcoRV geschnitten und dann partiell mit PstI verdaut, und ein 6,0 kb PstI-EcoRV-Fragment, das die CR1-Sequenz von SCR 6 bis zur 3'untranslatierten Region enthielt, wurde isoliert und mit PstI + SmaI verdautem pXLA ligiert. Das resultierende bakterielle Expressions-Plasmid, welches die vollständige für CR1 kodierende cDNA-Sequenz enthält, wurde pBSABCD genannt.
8.2. Konstruktion und Test des Plasmids piABCD, einem Säuger-Expressions-Vektor, der die vollständige kodierende Sequenz von CR1 enthält
Das pBSABCD-Plasmid wurde mit XhoI und NotI verdaut und das Insert stromabwärts des CMV-Promotors in das 4,4 kb Fragment des Expressions-Vektors CDM8 (Seed, B., 1987, Nature 329: 840–842) ligiert, der ebenfalls mit diesen Restriktions-Enzymen geschnitten worden war. Das resultierende Konstrukt wurde piABCD genannt (11). Alternativ wurde das 6,9 kb XhoI-NotI-Fragment stromabwärts des Metallothionein-Promotors in den Expressions-Vektor pMT.neo1 ligiert, der ebenso mit diesen Restriktions-Enzymen geschnitten worden war. Das resultierende Konstrukt wurde pMTABCD genannt (11).
Schafs-Erythrozyten, die mittels Kaninchen-Antikörper (EA) und limitierten Mengen an C4b [EAC4b (lim)] und 12.000 cpm ¹²⁵I-C3b pro Zelle [EAC4b (lim), 3b] sensibilisiert sind, wurden durch schrittweise Behandlung von EAC4b(lim) (Diamedix) mit C1, C2 und ¹²⁵I-C3 hergestellt, gefolgt von einer Inkubation für 60 Minuten bei 37°C in Gelatine-Veronal-gepufferter Saline mit 40 mM EDTA. Alternativ wurde Methylaminbehandeltes C3 [C3 (ma)] kovalent an Schafs-Erythrozyten gebunden, die mit 3-(2-pyridyldithio)-Propionsäure-N-Hydroxysuccinimid-Ester (Sigma) behandelt worden waren (Lambris, J. D., et al., 1983, J. Immunol. Methods 65: 277). EAC4b wurden mittels gereinigtem C4 hergestellt (Hammer, C. H., et al., 1981, J. Biol. Chem. 256: 3995).
Sowohl piABCD als auch pMTABCD wurden mit dem DEAE (Diethylaminoethyl)-Dextran-Verfahren in COS (Affen)-Zellen transfiziert. Rekombinantes CR1 wurde auf der Oberfläche der transfizierten Zellen mit Immunfluoreszenz unter Verwendung des monoklonalen anti-CR1 Antikörpers YZ-1 detektiert; außerdem durch Immunpräzipitation von ¹²⁵I-markierten Zellen, gefolgt von einer nicht reduzierenden SDS-PAGE, die ein Protein zeigte, welches eine identische Mobilität wie CR1 zeigte, das aus humanen Erythrozyten eines für den F-Allotyp (Wong, W. W., et al., 1983, J. Clin. Invest. 72: 685) homozygoten Donors immunpräzipitiert worden war; sowie durch die Bildung von Rosetten mit C3b beschichteten Schafs-Erythrozyten, (Fearon, D. T., 1980, J. Exp. Med. 152: 20). Die identischen elektrophoretischen Mobilitäten von nativen und rekombinanten CR1-Proteinen bestätigten, dass der CR1-F-Allotyp die SCRs 1–30 enthält.
Zusätzlich wurden murine L-Zellen mit dem DEAE-Dextran-Verfahren cotransfiziert (Ausubel, F. M., et al., 1987, Current Protocols in Molecular Biology, Seidman, J. G. und Struhl, K., Hrsg., John Wiley & Sons, New York; Seed, B., 1987, Nature 329: 840). Die Co-Transfektion erfolgte im Duplikat mit 0,2 oder 4 μg entweder des Plasmids piABCD oder pMTABCD und 2 μg von pXGHS, einem Reporter-Plasmid, das die Expression von Wachstumshormon steuert (Selden, R. F., et al., 1986, Mol. Cell. Biol. 6: 3173). Die Zellen wurden nach 2 Tagen geerntet und auf die Expression von CR1 durch Bindung des monoklonalen anti-CR1 Antikörpers YZ1 getestet. Es gab eine Dosis-Wirkungs-Beziehung zwischen rekombinanter Plasmid-DNA und der Expression des CR1-Antigens (Tabelle II).
Tabelle II Dosis-Wirkung von rekombinantem CR1 und humanem Wachstumshormon in cotransfizierten L-Zellen
Das Plasmid piABCD steuerte die Expression von annähernd dreifach mehr CR1-Antigen als pMTABCD. Die Konzentration an Wachstumshormon im Kulturmedium variierte – mit Ausnahme von Platte 5 – um weniger als das Zweifache. Zusätzliche Experimente zeigten, dass piABCD in COS-Zellen die transiente Expression von dreifach mehr CR1-Antigen als in L-Zellen bewirkte.
CR1-Antigen kam in Anhäufungen („Clustern") auf der Oberfläche von transfizierten COS-Zellen vor, wenn die mit YZ1 anti-CR1 mAK markierten Zellen über indirekte Immunfluoreszenz untersucht wurden (12). Diese Verteilung von rekombinantem CR1 auf den COS-Zellen ähnelt der Verteilung von Wildtyp-CR1 auf humanen Leukozyten (Fearon et al., 1981, J. Exp. Med. 153: 1615).
Das Molekulargewicht des rekombinanten CR1 wurde über Oberflächen-Iodierung von mit piABCD transfizierten COS-Zellen, Immunpräzipitation der Zell-Lysate mit Sepharose-YZ1, SDS-PAGE und Autoradiographie bestimmt. Das rekombinante CR1 hatte ein Molekulargewicht von 190.00 (nicht reduziert), welches dem des F-Allotyps entspricht und geringer ist als das Molekulargewicht des S-Allotyps von Erythrozyten-CR1 (14).
Die C3b-und C4b-Bindungs-Funktion des rekombinanten CR1 wurde durch die Bildung von Rosetten zwischen den transfizierten COS-Zellen und EAC4b oder EAC4b(lim), 3b getestet. In 31 separaten Transfektionen banden 5–50% der mit dem Plasmid piABCD transfizierten COS-Zellen fünf oder mehr EAC4b oder EAC4b(lim), 3b (13). Die CR1-exprimierenden COS-Zellen bildeten keine Rosetten mit EAC4b(lim), 3bi, obwohl dieses Zwischenprodukt mit Raji B-lymphoblastoiden Zellen, die CR2 exprimieren, Rosetten bildete.
8.3. Expression von CR1-Fragmenten
Es wurden gemäss der unten angeführten Beschreibung Expressionsvektoren konstruiert, die Teile der CR1 kodierenden Sequenz enthalten (Deletionsmutanten); dabei wurde bestätigt, dass diese ihre entsprechenden CR1-Inserts exprimierten, wenn sie in COS-Zellen transformiert wurden. Die CR1-Fragmente wurden als Zell-Oberflächen-Proteine exprimiert.
8.3.1. Konstruktion der Deletionsmutanten piBCD, piABD, piACD, piAD, piBD, piCD und piD
Die Konstruktion dieser Deletionsmutanten wurde durchgeführt, indem die Anwesenheit einer einzelnen BsmI-Restriktionsstelle in einer homologen Position nahe dem Amino-Terminus einer jeden der vier langen homologen Sequenzwiederholungen (LHRs) von CR1 und das Fehlen von BsmI-Restriktionsstellen irgendwo sonst in der CR1-cDNA und im Bluescript-Vektor (Stratagene, San Diego , CA) genutzt wurden.
Zehn Mikrogramm des Plasmids pBSABCD wurden partiell mit 50 Einheiten des Restriktionsenzyms BsmI für 45 Minuten verdaut und der Verdau durch Agarose-Gel-Elektrophorese fraktioniert. Es wurden DNA-Fragmente von 8,55 kb, 7,20 kb und 5,85 kb gereinigt, die linearen Segmenten des parentalen Plasmids entsprachen, denen jeweils ein, zwei oder drei LHRs fehlten. Jedes dieser drei Fragmente wurde mit sich selbst ligiert und die Ligationen separat zur Transformation kompetenter E. coli-DH5α auf Amipicillin-Resistenz verwendet.
Das 8,55 kb-Fragment wurde als Ergebnis der Spaltung von pBSABCD an zwei benachbarten BsmI-Restriktionsstellen generiert, es gibt daher nach der Ligation drei mögliche Plasmid-Produkte, pBCD, pACD oder pABD, wobei die Großbuchstaben die im Plasmid verbleibenden LHRs repräsentieren. Diese waren durch Restriktions-Kartierung mit SmaI unterscheidbar. DNA wurde von 12 Kolonien präpariert, mit SmaI verdaut und mittels Agarose-Gel-Elektrophorese separiert. Fünf Klone hatten zwei SmaI-Fragmente von 2,5 kb und 6,1 kb, entsprechend der Deletion der kodierenden Sequenz von LHR-A und repräsentierten daher pBCD. Drei Klone hatten ein einzelnes lineares Fragment von 8,5 kb, das pACD entsprach. Vier Klone hatten zwei SmaI-Fragmente von 1,2 kb und 7,4 kb, was für die Deletion der codierenden Sequenz von LHR-C erwartet wurde und ergaben pABD. Das 5,6 kb Insert von jedem dieser drei Konstrukte wurde nach Doppelverdau mit XhoI und NotI über ein Gel gereinigt und in den Expressionsvektor CDM8 ligiert, der nach Verdau mit denselben Restriktionsenzymen ebenfalls per Gel gereinigt worden war. E. coli DK1/P3 wurde mit den Ligations-Ansätzen transformiert und DNA von jeweils fünf Kolonien präpariert. Die Anwesenheit des deletierten CR1-cDNA-Inserts im Expressionsvektor wurde in jedem Fall über einen SacI-Verdau gezeigt, der die zwei erwarteten Fragmente von 4,20 kb und 5,75 kb anzeigte. Diese Plasmide wurden piBCD, piACD und piABD genannt.
Das 7,20 kb Fragment aus dem partiellen Verdau von pBSABCD war das Ergebnis des BsmI-Verdaus an drei benachbarten Restriktionsstellen oder, entsprechend im Fall des großen Fragments, an zwei Stellen mit einer einzelnen ungeschnittenen Restriktionsstelle zwischen diesen, weshalb zwei mögliche Produkte nach der Transformation zugänglich waren, nämlich pAD und pCD. Diese wurden durch Doppelverdau mit XhoI und PstI unterschieden, der im Fall von pAD zwei Fragmente von 1,0 kb und 6,2 kb und im Fall von pCD ein lineares Fragment von 7,2 kb ergab. Das 4,2 kb Insert aus jedem dieser Plasmide wurde nach Doppelverdau mit XhoI und NotI per Gel gereinigt und wie oben in CDM8 subkloniert. Die Anwesenheit der deletierten CR1-cDNA im Expressionsvektor wurde durch Doppelverdau mit PstI und Bg1II gezeigt. Der Klon piAD wies Fragmente von 2,4 kb und 6,2 kb auf, während piCD ein einzelnes Fragment von 8,6 kb aufwies.
Das 5,85 kb Fragment aus dem BsmI-Verdau von pBSABCD stellt ein Produkt eines vollständigen Verdaus dar und ein einzelner Klon, pD, wurde nach Transformation von E. coli DH5α erhalten. Dies wurde über einen Doppelverdau mit HindIII und Bg1II bestätigt, der die erwarteten Fragmente von 3,7 kb und 2,2 kb ergab. Das 2,9 kb Insert des Klons wurde nach einem Doppelverdau mit XhoI und NotI per Gel gereinigt und wie oben in den Expressionsvektor ligiert. Der HindIII-Verdau des sich ergebenden Klons piD lieferte das erwartete 7,3 kb-Fragment, ein Doppelverdau mit XhoI + Bg1II ergab Fragmente von 2,2 kb und 5,1 kb und ein SacI-Verdau resultierte in den erwarteten Fragmenten von 1,5 kb und 5,8 kb.
Das Plasmid pBD wurde durch partiellen BsmI Verdau von pBCD präpariert. Das lineare Fragment von 7,2 kb, entsprechend der Spaltung zweier benachbarter BsmI-Restriktionsstellen, wurde per Gel gereinigt, wie oben mit sich selbst ligiert und in E. coli DH5α zur Ampicillin-Resistenz transformiert. pBD wurde über das Vorliegen von zwei Fragmenten von 1,2 kb und 6,0 kb nach SmaI-Verdau identifiziert. Das 4,2 kb-Insert wurde nach einem Doppelverdau mit XhoI und NotI wie oben in CDM8 transferiert. Der Klon piBD wurde durch Beobachtung der erwarteten 0,8 kb und 7,8 kb-Fragmente nach HindIII-Verdau bestätigt.
COS-Zellen, die piABCD, piBCD, piCD beziehungsweise piD-Konstrukte transient exprimieren, wurden mit ¹²⁵Iod Oberflächen-markiert und mit anti-CR1 Antikörper immunpräzipitiert. Bei einer der Reduzierung folgenden SDS-PAGE co-migrierte das Produkt des piABCD-Konstruktes mit dem F-Allotyp von CR1, während die Deletionsmutanten schrittweise Verminderungen um etwa 45.000 Dalton zeigten, darauf hindeutend, dass entweder ein, zwei oder drei LHRs deletiert wurden (17).
8.3.2. Konstruktion der Deletionsmutanten niP1, piE1, piE2, piE-2, piU1, niU-2 und piA/D
Das Plasmid piABCD wurde vollständig mit BstEII verdaut und die beiden Fragmente von 1,35 kb (ein Doppelfragment) und 8,6 kb wurden aus dem Gel isoliert, gemischt und ligiert und E. coli DK1/P3 wurde auf Resistenz gegen Ampicillin und Tetracyclin transformiert. Die Kolonien wurden über Hybridisierung mit CR1-cDNA-Sonde CR1-4 durchsucht (siehe Abschnitt 8.1, oben) und stark positive Klone wurden herausgegriffen und weitergehend über einen SmaI-Verdau getestet. piE1 wurde über das Vorhandensein von zwei Fragmenten von 2,7 kb und 7,3 kb identifiziert, während piE2 durch ein einziges lineares Fragment von 10,0 kb identifiziert wurde. piE-2 wurde als schwach CR1-4 positiver Klon identifiziert, der ein einzelnes 8,6 kb langes SmaI Fragment enthielt.
Das Plasmid piP1 wurde durch vollständigen Verdau von piABCD mit PstI und Gel-Reinigung des großen 10,0 kb-Fragments gewonnen. Dieses Fragment wurde ligiert und E.coli DK1/P3 mit diesem Ligations-Ansatz transformiert. Das daraus resultierende Plasmid, piP1, enthielt ein einzelnes 10,0 kb großes SmaI-Fragment.
Die Plasmide piU1 und piU-2 wurden präpariert, indem zuerst der dem Stamm GM271/P3 mit dem Plasmid pXLA transformiert und DNA isoliert wurde. Diese DNA wurde mit StuI und NotI doppelverdaut und das 3,3 kb Fragment gelgereinigt. Das Plasmid pBSABCD wurde partiell mit NsiI verdaut und die resultierenden vier Basenpaare langen 3'-Überhänge durch Behandlung mit dem Klenow-Fragment aus E. coli DNA-Polymerase I entfernt. Dann wurde die DNA mit NotI vollständig verdaut und Fragmente von 5,4 kb und 4,0 kb wurden gelgereinigt. Diese wurden mit dem 3,3 kb Stuf-NotI-Fragment aus pXLA ligiert, und der Ligationsansatz wurde zur Transformation von E.coli DH5α auf Ampicillin-Resistenz verwendet. Die Kolonien wurden durch Hybridisierung mit der CR1-cDNA-Sonde CR1-4 getestet, und positive Klone durch Restriktions-Verdau mit HindIII weitergehend untersucht, welcher für pU1 drei Fragmente von 0,8 kb, 1,3 kb und 6,5 kb, und für pU-2 zwei Fragmente von 0,8 kb und 6,5 kb ergab. Der durch Stuf zu stumpfen Enden begradigte NsiI-Verdau wurde durch DNA-Sequenzierung dieser Plasmide als im Leseraster liegend bestätigt. Die Inserts von pU1 und pU-2, 5,6 kb beziehungsweise 4,2 kb, wurden nach Doppelverdau mit XhoI und NotI gelgereinigt und wie oben beschrieben mit dem Expressionsvektor CDM8 ligiert. Die Strukturen der Klone piU1 und piU-2 wurden über Restriktions-Verdau mit XhoI + PstI bestätigt und lieferten für piU1 die erwarteten Fragmente von 1,2 kb und 8,8 kb und für piU-2 ein lineares Fragment von 8,7 kb.
Das Plasmid piA/D wurde präpariert, indem zuerst piABCD mit PstI vollständig verdaut wurde. Der PstI-Verdau wurde dann partiell mit ApaI verdaut und die 3'-Überhänge mit dem Klenow-Fragment von E. coli DNA-Polymerase I entfernt. Die DNA wurde anschließend durch Agarose-Gel-Elektrophorese aufgetrennt und das 7,5 kb Fragment isoliert, ligiert und zur Transformation von E. coli DK1/P3 auf Ampicillin- und Tetracyclin-Resistenz verwendet. Das Konstrukt wurde durch einen Doppelverdau mit KpnI und SacI bestätigt, der die erwarteten vier Fragmente von 0,8 kb, 1,5 kb, 1,7 kb und 3,3 kb ergab.
9. Beispiel: Identifizierung der C3b- und C4b-Bindenden-Domänen
9.1. Assays und Ergebnisse
Die Plasmide piABCD, piAD, piCD und piD, welche jeweils die LHR(s) enthalten, die durch die Großbuchstaben ihrer Namen bezeichnet sind, wurden in COS-Zellen transformiert, die dann in Tests verwendet wurden, um die Fähigkeit ihrer codierten CR1-Fragmente zur Bindung von C3b oder C4b zu beurteilen. Die Bindungs-Assays wurden durchgeführt, indem die Bildung von Erythrozyten-Rossetten beobachtet wurde, die aus der Bindung von C3b- oder C4b-beschichteten roten Blutkörperchen durch COS-Zellen resultiert, wobei letztere ein vollständiges CR1-Molekül oder eine CR1-Deletionsmutante auf ihrer Zelloberfläche exprimieren (transiente Expression). Transfizierte Zellen (1–4 × 10⁶/ml) wurden mit C3-oder C4-tragenden Erythrozyten (2–6 × 10⁸/ml) in 0,02 ml für 60 Minuten bei 20°C inkubiert. Der Prozentsatz an Rosetten bildenden transfizierten Zellen wurde mikroskopisch ausgewertet, wobei eine transfizierte Zelle als Rosette gewertet wurde, wenn mindestens fünf zusammenhängende Erythrozyten vorlagen. Die Ergebnisse sind in Tabelle III dargestellt.
Tabelle III Bildung von Rosetten zwischen COS-ZeII-Transfektanten, die rekombinante Formen von CR1 eximimieren, und Schafs-Erythrozyten, die C3 (ma) oder C4 (ma) tragen % an Transfektanten, die Rosetten bilden % an Transfektanten, die mit anti-CR1 fluoreszieren
In jedem von drei unabhängigen Experimenten war der Anteil der das piABCD-Konstrukt voller Länge exprimierenden COS-Zellen, die Rosetten mit EC3 (ma) bildeten, ähnlich gegenüber der Fraktion, die detektierbaren rekombinanten Rezeptor aufwiesen, wie mittels Immunfluoreszenz unter Verwendung entweder von YZ1-monoklonalem anti-CR1-Antikörper oder Kaninchen anti-CR1-Antiserum nachgewiesen wurde (Tabelle III). Im Gegensatz dazu bildeten Zellen, die piD exprimierten, keine Rosetten, was zeigt, dass eine C-Bindungstelle (bzw. C-Bindungstellen) innerhalb von LHR-A, -B oder -C liegen muß oder deren Anwesenheit benötigt. Eine Bindungsstelle wurde sowohl in LHR-B als auch LHR-C nachgewiesen, indem gezeigt wurde, dass Zellen, die entweder die piBD- oder die piCD-Konstrukte exprimierten, Rosetten mit EC (ma) bildeten. Zellen, die piAD, piAD oder piE-2 exprimierten, besaßen keine gleichwertige C-Bindungsfunktion. Da sich das piE-2-Konstrukt von piCD nur dadurch unterscheidet, dass es SCR-1 und SCR-2 aus LHR-A anstelle der beiden ersten SCRs von LHR-C besitzt, muss die Funktion der C-Bindungstelle in LHR-C diese NH₂-terminalen SCRs erfordern.
Der Anteil der die piABCD Rekombinante voller Länge exprimierenden COS-Zellen, welche Rosetten mit EC4(ma) bildeten, war niedriger als die Fraktion, die mit EC (ma) Rosetten bildete, was möglicherweise eine geringere Anzahl an C4 (ma) pro Erythrozyt (siehe Tabelle III) oder weniger C4-Bindungsstellen pro Rezeptor widerspiegelt. Deletionsmutanten, die das gesamte LHR-A oder Teile von LHR-A oder die Konstrukte piAD, piAD und piE-2 besitzen, banden EC4 (ma) besser als die Deletionsmutanten piBD und piCD; piD fehlte diese Funktion. Demnach liegt die C4-Bindungstelle von CR1 hauptsächlich in LHR-A, obwohl sekundäre Bindungsstellen auch in LHR-B und -C vorhanden sein können. Die verbesserte Fähigkeit des piE-2 Konstruktes relativ zum piCD-Konstrukt Rosetten zu bilden, weist darauf hin, dass SCR-1 und SCR-2 aus LHR-A an der C4-Bindungstelle beteiligt sind.
Der Radioimmuno-Assay der Bindung des monoklonalen YZ1 anti-CR1-Antikörpers zeigte eine signifikante Aufnahme durch die COS-Zellen, die piABCD, piAD, piBD und piCD-Konstrukte exprimieren (Tabelle IV). Zellen, die mit piD oder piAD transfiziert wurden (wobei letzteres aus den fünf NH₂-terminalen SCRs von LHR-A und den drei COOH-terminalen SCRs von LHR-D zusammengesetzt ist) banden den YZ1 anti-CR1 Antikörper nicht, obwohl die Produkte dieser Konstrukte polyklonales anti-CR1-Antiserum banden (Tabelle IV). Demnach wiederholt sich das YZ1-Epitop in LHR-A, -B und -C, während es in den NH₂-terminalen SCRs von LHR-A nicht vorhanden und in LHR-D nicht vorhanden oder nicht zugänglich ist.
Tabelle IV Bindung von monoklonalem und polyklonalem anti-CR1 Antikörper an COS-Zell-Transfektanten, die rekombinante Formen von CR1 exprimieren
9.2. Diskussion
Die konservierte BsmI-Restriktionsstelle, die in der Mitte der kodierenden Sequenz des ersten SCR in jedem LHR gefunden wurde, erlaubte die Konstruktion einer Reihe von Deletionsmutanten, die den Begrenzungen der LHRs weitgehend entsprachen und das offene Leseraster und die passenden Positionen der vier Cysteine, die für die vermuteten Disulfidbrücken-Bindungen notwendig sind, beibehielten (16). Der Vergleich der C3 (ma)- und C4 (ma)-Bindungsfunktionen dieser Deletionsmutanten unterschied nicht nur die LHRs, die diese Spezifität aufweisen, sondern auch die SCRs, die bei der Festlegung der Liganden-Spezifität entscheidend sind. Die Fähigkeit der piAD-, piAD- und piE-2-Formen des Rezeptors, nicht jedoch der piD-Form, die Bildung von Rosetten zwischen den transfizierten COS-Zellen und EC4 (ma) zu vermitteln, zeigte somit, dass die zwei NH₂-terminalen SCRs von LHR-A eine Bindungsstelle für die Interaktion mit diesem Komplement-Protein enthalten (Tabelle III). Diese Stelle war nur für C4 (ma) relativ spezifisch, da piAD und piAD exprimierende Transfektanten auch zur Bindung von EC3 (ma) befähigt waren (Tabelle III). Die C3 (ma)-Bindungsfunktion der durch die Konstrukte piBD und piCD codierten Rezeptoren – dargestellt durch Rosetten-Assay und Faktor I-Cofaktorfunktion für die Spaltung von C3 (ma) (Tabelle III, 18) – zeigte die Anwesenheit von für C3 (ma) spezifischen Bindungsstellen in den ersten beiden SCRs dieser LHRs an. Diese Stellen waren auch zur Interaktion mit C4(ma) befähigt (Tabelle III). Demnach gibt es bevorzugte, aber überlappende, C4- und C3- Bindungsaktivitäten in LHR-A, -B und -C.
Alternativ dazu könnte die Fähigkeit der die piBD und piCD-Konstrukte exprimierenden COS-Zellen, den EC4(ma) zu binden, durch den Transfer von Nucleotiden, welche die 36 NH₂-terminalen Aminosäuren von SCR-1 aus LHR-A bis LHR-B und LHR-C codieren, durch die Ligation der BsmI-Fragmente begründet worden sein. Jedoch verleihen diese 36 Aminosäuren alleine dem piD-Produkt keine C4-Rosettierungs-Funktion. Wir können eine sekundäre Funktion von LHR-D in diesen Reaktionen nicht ausschließen, da dieser LHR in allen Konstrukten, die auf ihre Funktion getestet wurden, vorhanden war. Das Auffinden von drei unterschiedlichen Liganden-Erkennungsstellen in CR1, zwei für C3b und eine für C4b (19), zeigt, dass jedes Rezeptormolekül befähigt sein kann, trotz einer relativ niedrigen Affinität für monovalente Liganden (Arnaout, M. A., et al., 1983, Immunology 48: 229) effektiv Komplexe mit mehreren C4b- und C3b- Molekülen zu binden. Dieser Befund liefert ebenfalls eine Erklärung für die Unfähigkeit von löslichem C4b, die Bildung von Rosetten zwischen C3b-tragenden Erythrozyten und einer humanen lymphoblastoiden B-Zell-Linie zu inhibieren (Gaither, T. A., et al., 1983, J. Immunol. 131: 899). Mögliche Liganden, an die CR1 besonders angepasst ist, könnten die molekularen Komplexe C4b/C3b und C3b/C3b sein, die während der Aktivierung des klassischen bzw. alternativen Reaktionswegs gebildet werden. Da unterschiedliche Bindungsstellen in drei von vier LHRs existieren, könnten die strukturellen Allotypen von CR1, die sich durch die Anzahl ihrer LHRs unterscheiden, signifikante funktionelle Unterschiede aufweisen, die durch Variationen in der Anzahl von Liganden-Bindungsstellen begründet sind. Obwohl in vitro-Studien keine unterschiedlichen Bindungs-Aktivitäten der F-, S- und F'-Allotypen (beziehungsweise A, B und C) angezeigt haben, könnte der kleinere F'-Allotyp, der vermutlich nur drei LHRs besitzt, eine eingeschränkte Fähigkeit zur Klärung von Immunkomplexen besitzen. Es wurde berichtet, dass der F'-Allotyp möglicherweise mit systemischem Lupus erythematodes assoziiert ist (van Dyne, S., et al., 1987, Clin. Exp. Immunol. 68: 570).
10. Beispiel: Nachweis der Faktor I-Cofaktoraktivität
Es wurde gezeigt, dass rekombinantes CR1-Protein und bestimmte Fragmente davon sowohl in an Zell-Oberflächen gebundener Form als auch in löslicher Form C3b Faktor I-Cofaktoraktivität besitzen.
Assays für Faktor I-Cofaktoraktivität wurden unter Modifikation eines publizierten Verfahrens durchgeführt (Fearon, D. T., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76: 5867).
Zum Test der Faktor I-Cofaktoraktivität von solubilisiertem CR1 und dessen Fragmenten, wurden Zelloberflächen-CR1-Protein und Fragmente von CR1 mit Nonidet P-40 solubilisiert und das Lysat mit an Sepharose-Kügelchen (Sepharose-Beads) gekoppeltem monoklonalen anti-CR1 Antikörper YZ-1 immunpräzipitiert. Detergens-Lysate von 1 × 10⁶ transfizierten COS-Zellen wurden sequentiell mit Sepharose-UPC10 anti-levan und Sepharose-YZ-1 immunpräzipitiert. Das Immunpräzipitat wurden dann auf Faktor I-Cofaktoraktivität untersucht, indem die gewaschenen Beads für 60 Minuten bei 37°C mit 0,5 μg ¹²⁵I-C3 (ma) und 200 ng Faktor I in 0,05 ml PBS, 0,5% NP-40 inkubiert wurden. Nach der Inkubation wurde der Überstand, der das radioaktiv-markierte C3 (ma) enthielt, über eine SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese und Autoradiographie analysiert. Die Faktor I-Cofaktoraktivität wurde durch im Autoradiogramm auftretende Formen der C3 (ma) Alpha-Kette mit niedrigerem Molekulargewicht angezeigt, die aus der proteolytischen Spaltung durch Faktor I resultieren.
Zum Test der Faktor I-Cofaktoraktivität von Zelloberflächen-gebundenem CR1 und Fragmenten von CR1 wurden transfizierte COS-Zellen, die einen CR1-Expressionsvektor enthielten (piABCD, piAD, piBD, piCD oder piD, wie oben beschrieben) mit 0,5 μg ¹²⁵I-C3 (ma) und 0,2 μg Faktor I inkubiert (Fearon, D. T., 1977, J. Immunol. 119: 1248) und wie oben beschrieben analysiert.
Die Faktor I-Cofaktoraktivität von rekombinantem Zelloberflächengebundenem CR1 ist in 15 dargestellt. Faktor I spaltete die alpha-Kette von C3 (ma) nur bei Gegenwart von immun-immobilisiertem, rekombinantem CR1 oder Faktor H in Fragmente des Molekulargewichts 76.000 und 46.000 (15). Die Regionen, die Banden im Autoradiogramm entsprachen, wurden aus dem Gel ausgeschnitten und auf ¹²⁵I getestet, um die Menge an gespaltener alpha-Kette zu bestimmen. In Gegenwart von Faktor H wurden 91% der Alpha-Kette gespalten, während in der Gegenwart steigender Mengen von rekombinantem CR1 Anteile von 26%, 41% bzw. 55% gespalten wurden. Obwohl die nur mit dem CDM8-Vektor transfizierten COS-Zellen etwas endogene Faktor I-Cofaktoraktivität enthielten, war ein Anstieg dieser Funktion bei COS-Zellen, die mit piABCD, piBD und piCD transfiziert worden waren, offensichtlich (18). Bei mit piAD- oder piD-transfizierten COS-Zellen war keine gesteigerte Spaltung von ¹²⁵I-C3 (ma) erkennbar. So hatten unter diesen Konstrukten nur die Deletionsmutanten piBD und piCD, die COS-Zellen eine Fähigkeit zur C3-Bindung verleihen, auch eine Faktor I-Cofaktoraktivität zur Spaltung von C3.
Die Ergebnisse der Assays zur Faktor I-Cofaktoraktivität von sowohl Zelloberflächen- gebundenen als auch solubilisierten CR1-Formen und Fragmente hiervon, ist in Tabelle V dargestellt.
Tabelle V Faktor I-Cofaktoraktivität von Zelloberflächen-gebundenen und solubilisierten Formen von CR1 und CR1-Fragmenten
Wie in Tabelle V gezeigt, erzeugte die Expression von piABCD (ein vollständiges CR1-Protein codierend), piBD (LHR-B und -D codierend) oder piCD (LHR-C und -D codierend) ein CR1-Produkt mit C3b Faktor I-Cofaktoraktivität. Somit liefern die Daten aus Tabelle V einen Hinweis, dass das CR1-Protein oder ein Fragment davon die Komplement-Inaktivierung fördern können.
11. Beispiel: Expression des rekombinanten löslichen CR1
Die CR1-cDNA wurde mittels rekombinanter DNA-Verfahren so modifiziert, dass eine lösliche Form (sCR1) von CR1 oder CR1-Fragmenten produziert wurde. Die sCR1-Konstrukte wurden in einem Säuger-System exprimiert, bei dem das exprimierte Protein von den Zellen sekretiert wurde. Große Mengen des löslichen Proteins wurden produziert, die im Gegensatz zur Membran-gebundenen Form von CR1-Proteinen nicht solubilisiert werden mussten, um sie in Lösung zu bringen.
11.1. Material und Methoden
11.1.1. Enzym-Verdaue
Alle Restriktionsenzym-Verdaue, Linker-Ligationen, T4 DNA-Ligase- und E. coli DNA-Polymerase-Reaktionen wurden gemäß den Empfehlungen des Herstellers durchgeführt (New England Biolabs, Inc., Beverley, MA). E. coli DH1 oder DH5α wurden mittels des Verfahrens von Morrison, D. A., 1979, Meth. Enzymol 68: 326–331 kompetent gemacht. Kompetente Bakterienzellen wurden gemäß der Beschreibung von Maniatis, T., et al., 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, mit DNA transformiert. Plasmide wurden durch alkalische Lyse oder durch das „Kochverfahren" („boiling method") (Maniatis, T., et al., siehe oben) gereinigt.
11.1.2. DNA-Fragment Isolierung
DNA-Fragmente wurden wie folgt aus Agarose (BioRad, Richmond, CA)-Gelen gereinigt. Die entsprechende DNA-Bande wurde mit einer Klinge aus dem Gel herausgeschnitten, die Agarosescheibe auf ein Stück Parafilm gelegt, in sehr kleine Teile zerschnitten und auf ein neues Stück Parafilm überführt. Die Agarosestücke wurden aufgebrochen und die Agarose in ein 1,5 ml Röhrchen überführt. Ein entsprechendes Volumen an Phenol (hochreines Phenol, BRL, Gaithersburg, MD) wurde zugegeben, die Mischung gevortext, dann bei –70°C 10 Minuten lang gefroren und 10 Minuten zentrifugiert. Die wässrige Phase wurde weiterhin zweimal mit Phenol/Chloroform (1 : 1) und zweimal mit Chloroform extrahiert. Die DNA wurde anschließend mit Ethanol präzipitiert, das Pellet gewaschen, im Vakuum getrocknet und in 10 mM Tris-HCl, pH 7,0, 1 mM EDTA, resuspendiert.
DNA-Fragmente wurden wie folgt aus bei niedriger Temperatur schmelzender Agarose (FMC, Corp., Rockland, ME), isoliert. Die entsprechende DNA-Bande wurde aus dem Agarose-Gel herausgeschnitten, in ein 1,5 ml Röhrchen gegeben und bei 65°C für 15 Minuten geschmolzen. Das verflüssigte Gel wurde mit Phenol, enthaltend 0,1% Natrium-Dodecyl-Sulfat (hochreines SDS, BRL, Gaithersburg, MD) extrahiert. Die wässrige Phase wurde weiterhin einmal mit Phenol-SDS und zweimal mit Chloroform extrahiert. Dann wurde die DNA mittels Ethanol in 2,0 M NH₄-Acetat präzipitiert, getrocknet, und in Wasser resuspendiert.
11.1.3. Transfektion in Säuger-Zellen
Die Transfektion von DNAs in Säugerzellen wurde über CaPO₄-Präzipitation und das „Glycerin-Schock-Verfahren" von Graham und van der Eb (1973, Virology 52: 456– 467) durchgeführt. DUX B11 CHO-Zellen wurden nach 4–6 Stunden dauernder Inkubation mit der DNA-Calciumphosphat-Präparation einem Schock durch Glycerin unterzogen, indem das Wachstumsmedium abgesogen und 5 ml eines 20%igen Glycerin-DMEM-Mediums für 1 Minute zugegeben wurden. Die Zellen wurden anschließend zweimal in komplettem alpha-MEM gewaschen und in diesem Medium für 48 Stunden inkubiert.
11.1.4. Zellkultur der CHO-Transfektanten
DUX B11 CHO-Zell-Transfektanten wurden in DHFR (Dihydrofolatreduktase)-Selektionsmedium gezüchtet, das aus alpha-MEM-Medium (Gibco) ohne Nucleoside, supplementiert mit 10% dialysiertem fetalem Kälberserum (Gibco) und 4 mM L-Glutamin besteht. Die Amplifikation wurde unter Zellwachstum bei steigenden Konzentrationen von Methotrexat (Sigma, #A6770, Amethopterin) durchgeführt (Kaufman, R. J., et al., 1985, Molec. Cell Biol. 5: 1750–1759).
11.1.5. ELISA zur Detektion des löslichen CR1-Spiegels
11.1.5.1. CR1-Standards
Detergens-Lysate Hämoglobin-freier roter Blutzellen (RBC, red blood cell), hiernach bezeichnet als „Ghosts" (leere Membranen von RBCs), wurden als CR1-Standard im ELISA (enzymgebundener Immunadsorptions-Test) verwendet. Die Ghosts wurden wie kürzlich beschrieben präpariert (Wong, W. W. und Fearon D. T., 1987, Meth. Enzymol 150: 579–585). Dazu wurde abgelaufenes Vollblut vom Roten Kreuz bezogen. Die roten Blutkörperchen wurden dreimal in PBS gewaschen und dann in einem sechsfachen Volumen eines hypotonischen Lysepuffers (10 mM Tris pH 8, 0,1 mM PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid), 0,1 mM TPCK (Tosylamid-phenylethylchlormethylketon), Aprotonin, 2 mM EDTA) lysiert. Die Ghosts wurden einige Male in Lysepuffer gewaschen, in einem Hämozytometer gezählt, aliquotiert und bei –70°C bis zur Verwendung eingefroren. Für den CR1-ELISA wurden die Ghosts auf eine Konzentration von 1,6 × 10⁸ Ghosts/ml in Solubilisierungs-Puffer (10 mM Tris pH 8, 50 mM KCl, 0,2% NP40, 0,3% DOC, 6,2 mM PMSF, 0,2 mM Iodacetamid, Aprotonin, 0,1 mM TPCK, 2 mM EDTA, 0,2% NaN₃) verdünnt und dann schrittweise auf 2,5 × 10⁶ Ghosts/ml zur Verwendung als Standard im ELISA weiter verdünnt. Die Absorption bei 490 nm wurde graphisch aufgetragen und jeder unbekannte Proben-Durchlauf dem Graphen gegenübergestellt, um die Ghost-Equivalente/ml zu ermitteln.
11.1.5.2. CR1-ELISA
Immulon-II-Platten wurden pro Vertiefung mit 100 μl einer 0,4 μg/ml Konzentration an anti-CR1 monoklonalem Antikörper (Klon J3D3, AMAC IOT 17) (Cook, J., et al., 1985, Molec. Immunol. 22: 531–538) in PBS beschichtet und über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Antikörper-Lösung wurde anschließend verworfen und die Platten geblockt, indem pro Vertiefung 3O0 μl eines Blockierungs-Puffers (1,0% BSA in PBS) zugegeben wurden, gefolgt von einer Inkubation von 2 Stunden bei 37°C. Nach dem Blocken wurden die Platten entweder direkt verwendet oder bis zur Verwendung bei 4°C gelagert.
Die Platten wurden dreimal mit PBS, enthaltend 0,05% Tween-20, gewaschen. Von den Proben wurden pro Vertiefung 100 μl, jeweils in Duplikaten, verwendet und für 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Wenn notwendig, wurden die Proben in Solubilisierungs-Puffer verdünnt. Standard-RBC-Ghosts wurden bei jeder Platte einbezogen. Nach der Proben-Inkubation wurden die Platten dreimal gewaschen, ein Konjugat (Wilson, M. B. und NaKane, P. K., 1978, Immunofluorescence and Related Staining Techniques, North Holland Biomedical Press, pp. 215–224) aus Meerrettich-Peroxidase (horseradish peroxidase, HRP) und dem monoklonalen Antikörper YZ1 (Changelian, P. S., et al., 1985, J. Immunol 184: 1851– 1858) 1: 8000 in 50% FCS und 50% Blockierungs-Puffer verdünnt und pro Vertiefung 100 μl zugegeben. Nach einer Inkubation von 2 Stunden bei 37°C wurden die Platten erneut dreimal mit PBS, enthaltend 0,05% Tween-20, gewaschen. Dann wurden pro Vertiefung 100 μl des Substrates Orthophenylendiamin (OPD) der Konzentration 0,2% in Substrat-Puffer (0,36% Zitronensäure H₂O, 1,74% NaHP₂O₄ × 7H₂O, 0,1% Thimerosal, 0,4% H₂O₂, pH 6,3) zugegeben. Die Reaktion wurde nach 20 Minuten bei Raumtemperatur gestoppt, indem pro Vertiefung 50 μl 2N H₂SO₄ zugegeben wurden. Die Absorption wurde bei 490 nm gemessen.
11.2. Genetische Modifikation der CR1-Kodierungssequenz
Die CR1-cDNA setzt sich aus ungefähr 6951 Nucleotid-Basenpaaren zusammen (1, Abschnitte 6 und 7, oben). Das Translations-Stop-Signal der nativen cDNA ist an Basenpaar 6145 lokalisiert. Das Protein stellt ein Membran-gebundenes Rezeptormolekül dar, welches aus vier langen homologen Sequenzwiederholungen (LHRs) aufgebaut ist, die exponiert auf der Außenseite der Zellmembran liegen, und einer Membrandurchspannenden Domäne von ungefähr 25 Aminosäuren, gefolgt von einer sich in das Zytoplasma erstreckenden carboxy-terminalen Region. Diese zytoplasmatische Domäne besteht aus dreiundvierzig Aminosäuren. Die von uns verwendete Strategie zur Produktion löslicher CR1-Moleküle (sCR1) basiert auf der Entfernung der Transmembranregion, die ein Protein in der Zellmembran verankert, um dann die verkürzten Konstrukte als sekretierte Polypetide zu exprimieren.
11.2.1. Konstruktion von pBSCR1c
Plasmid pBSABCD (Beispiel 8, siehe oben) enthält die CR1-cDNA von Nucleotid 1 bis 6860 und besitzt keine der untranslatierten Sequenzen 3' der EcoRV-Restriktionsstelle bei Nucleotid 6860. CR1-cDNA besitzt eine einzige BaII-Restriktions-Endonuclease-Schnittstelle bei Basenpaar 5914, neunundzwanzig Basenpaare entfernt vom Start der Transmembrandomäne. pBSABCD wurde zuerst mit BaII verdaut, um ein lineares Molekül mit glatten Enden zu erhalten und wurde dann unter Verwendung von T4 DNA-Ligase mit einem synthetischen Oligonucleotid, bestehend aus zwei komplementären, 38 Nucleotiden langen Strängen der folgenden Sequenz, ligiert:
Das daraus resultierende Molekül hatte eine wieder hergestellte BaII-Schnittstelle und eine veränderte Sequenz, die die native Sequenz von CR1 bis zu und einschließlich des Alanin-Restes an der Startstelle der Transmembrandomäne nachbildete. Zusätzlich ist ein Translations-Stop-Signal direkt hinter dem Alanin eingeführt worden (in Kleinbuchstaben und unterstrichen, siehe oben), gefolgt von einer XhoI-Restriktionsstelle, um das Subklonieren der veränderten cDNA zu erleichtern.
Der XhoI-Verdau dieses Plasmids (bezeichnet als pBSCR1c) schneidet das cDNA-Insert (bezeichnet als sCR1c) heraus, indem dieser an der mittels des Oligonucleotids eingeführten XhoI-Schnittstelle in der cDNA und an der XhoI-Schnittstelle in der pBSKS+® multiplen Klonierungsstelle am 5' Ende der CR1-cDNA schneidet. pBSCR1c enthält die folgenden C-terminalen Sequenzen:
11.2.2. Konstruktion von nBSCR1s
Ein zweites sCR1-Konstrukt, dem eine Transmembranregion fehlt, wurde folgendermaßen konstruiert. pBSABCD wurde mit SacI verdaut, das an der einzigen SacI-Schnittstelle bei Nucleotid-Basenpaar 5485 in der CR1-cDNA und an der SacI-Schnittstelle in der multiplen Klonierungsstelle des Wirts-Plasmids, die am 3'-Ende der CR1-cDNA lokalisiert ist, schneidet. Dieser Verdau führt zur Entfernung von 1375 Nucleotiden DNA-Sequenz vom 3'-Ende der cDNA. Dieses Fragment wurde anschließend elektrophoretisch entfernt. Die exponierten Enden des resultierenden Plasmids, das die verbleibende sCR1cDNA enthält, wurden mit T4 DNA-Polymerase in glatte Enden umgewandelt und eine Ligation über glatte Enden durchgeführt. Der universelle Translationsterminator von Pharmacia (Katalog #27-4890-01, Pharmacia, Inc., Piscataway, NJ), ein selbstkomplementäres Oligomer, das Translations-Stop-Signale in allen drei Leserastern enthält, wurde ebenfalls in die Ligation eingeschlossen. Bei der Ligation lieferte das inserierte Oligomer ein neues Translations-Stop-Signal für die sCR1-cDNA.
11.2.3. Konstruktion von pBM-CR1c
pBMT3X ist ein eukaryotischer Expressions-Vektor (Krystal, M., et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 2709–2713), der das humane Metallothionein-1A-Gen enthält, das Zellen eine Resistenz gegen erhöhte Mengen an Schwermetallen wie Cadmium verleiht. Der Vektor enthält außerdem das Maus Metallothionein-1-Gen, das eine konstruierte XhoI-Schnittstelle enthält, die dem Start-Codon des Mt-1-Proteins vorangeht. Die XhoI-Schnittstelle wird als Insertionsstelle zur Expression von Genen unter der Kontrolle des Maus-Mt-I-Promotors verwendet.
Das sCR1c-Insert (annähernd 5,9 kb) wurde mittels XhoI aus pBSCR1c ausgeschnitten und dann in die einzige XhoI-Schnittstelle des Vektors pBMT3X ligiert. Die korrekte Orientierung des sCR1c-Inserts in pBMT3X wurde durch Restriktions-Verdau ermittelt (Maniatis, T., et al., 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York). Das resultierende Plasmid wurde pBM-CR1c genannt.
11.2.4. Konstruktion der Deletionsmutanten pT-CR1c1, tiT-CR1c2, pT-CR1c3, pT-CR1c4 und pT-CR1c5
Außerdem wurden verschiedene Deletionsmutanten konstruiert, die spezifisch Abschnitte der sCR1-cDNA deletierten (20). Jeder Deletionsmutanten fehlte die Transmembran- Region der vollständigen cDNA, so dass die Expression der Mutanten lösliche Polypeptide liefern würde.
11.2.4.1. pT-CR1c1
pBSCR1c wurde mit SmaI verdaut, was in zwei Fragmenten der Größe 2.56 kb und 7.3 kb resultierte. Diese Fragmente wurden durch Agarose-Gel-Elektrophorese aufgetrennt und das 7.3 kb Fragment gereinigt und mit sich selbst religiert. Zellen von E. coli DH5α wurden kompetent gemacht (Morrison, D. A., 1979, Meth. Enzymol. 68: 326–331) und dann mit der Ligationsmischung transformiert. Das resultierende Plasmid wurde pBL-CR1c1 genannt. Dieses Konstrukt deletierte 38% von LHR-B, 100% von LHR-C und 51% von LHR-D des CR1c-Inserts. Zusätzlich führte es die SmaI-Schnittstelle an der Verbindungsstelle 2335/4894 by wieder ein und behielt das korrekte Translationsraster bei. pBL-CR1c1 wurde mit XhoI verdaut und das CR1-Insert vom pBluescript®-Vektor getrennt. Das isolierte CR1-Fragment wurde dann in die einzige XhoI-Schnittstelle des Expressionsvektors pTCSgpt eingesetzt, um das Plasmid pT-CR1c1 zu erzeugen.
11.2.4.2. pT-CR1c2
pBSCR1c wurde mit ClaI und BaII verdaut, was in zwei Fragmenten der Größe 3,96 kb und 5,9 kb resultierte. Diese Fragmente wurden aus einem Agarose-Gel gereinigt. Plasmid pBR322 wurde mit CIaI und BaII verdaut und das 2,9 kb pBR322-Fragment wurde gereinigt und mit dem 5,9 kb Fragment von pBSCR1c ligiert. E. coli DH5α-Zellen wurden mit der Ligationsmischung transformiert; das resultierende Plasmid wurde pBR8.8 genannt. Dieses Plasmid wurde mit XbaI verdaut, was zwei Fragmente der Größe 7,45 kb und 1,35 kb generierte. Das 7,45 kb Fragment wurde aus einem Agarose-Gel gereinigt und mit sich selbst religiert. Das resultierende Plasmid pBR7.45 wurde mit ClaI und BaII verdaut und das isolierte 4,5 kb Fragment, das die sCR1-cDNA enthielt, wurde mit dem 3,96 kb-Fragment von pBSCR1c ligiert, was in Plasmid pBL-CR1c2 resultiert. Dieses Konstrukt deletierte 90% von LHR-B des sCR1-Inserts, regenerierte die XbaI-Schnittstelle bei der Verbindungsstelle 1637/2987 by und behielt das korrekte Leseraster bei. pBL-CR1c2 wurde mit XhoI verdaut und das sCR1-Insert vom pBluescript®-Vektor separiert. Das isolierte sCR1-Fragment wurde dann in die einzige XhoI-Schnittstelle des Expressionsvektors pTCSgpt inseriert, um das Plasmid pT-CR1c2 zu erzeugen.
11.2.4.3. pT-CR1c3
pBSCR1c wurde mit NsiI verdaut, was in drei Fragmenten der Größe 1,09 kb, 1,35 kb und 7,46 kb resultierte. Das 7,46 kb Fragment wurde aus einem Agarose-Gel gereinigt und mit sich selbst religiert, wodurch das Plasmid pBL-CR1c3 generiert wurde. Dieses Konstrukt deletierte 77% von LHR-A und den Rest des CR1-Inserts. Die NsiI-Schnittstelle wurde an der Verbindungsstelle 463/2907 by regeneriert. Das Translationsraster wurde solchermaßen modifiziert, dass ein Nonsense-Codon eingeführt wurde, das direkt auf die regenerierte NsiI-Schnittstelle folgte. pBL-CR1c3 wurde mit XhoI verdaut und das sCR1-Insert vom pBluescript®-Vektor abgetrennt. Das isolierte sCR1-Fragment wurde dann in die einzige XhoI-Schnittstelle des Expressionsvektors pTCSgpt inseriert, um das Plasmid pT-CR1c3 zu erzeugen.
11.2.4.4. pT-CR1c4
pBSCR1c wurde mit PstI verdaut. Die PstI-Schnittstelle in der Polylinker-Region von pBluescript® war während der Ligation der CR1-cDNA mit diesem Vektor entfernt worden (Beispiel 8.1, s. oben). Die resultierenden Fragmente der Größe 1,35 kb und 8,5 kb wurden durch Gel-Elektrophorese aufgetrennt, und das 8,5 kb-Fragment gereinigt und mit sich selbst religiert, was Plasmid pBL-CR1c4 generierte. Dieses Konstrukt deletierte 31% von LHR-A und 69% von LHR-B des sCR1-Inserts. Die PstI-Schnittstelle wurde an der Verbindungsstelle 1074/2424 by regeneriert, so dass das korrekte Leserraster aufrecht erhalten wurde. pBL-CR1c4 wurde mit XhoI verdaut und das sCR1-Insert vom pBluescript® Vektor abgetrennt. Das isolierte sCR1-Fragment wurde dann in die einzige XhoI-Schnittstelle des Expressionsvektors pTCSgpt inseriert, um das Plasmid pT-CR1c4 zu erzeugen.
11.2.4.5. pT-CR1c5
pBL-CR1c1 wurde mit SmaI verdaut, was das Plasmid an der einzigen SmaI-Schnittstelle linearisierte. Das Plasmid wurde dephosphoryliert und mit einem phosphorylierten NheI-Linker ligiert, der ein Nonsens-Codon enthielt (New England Biolabs, Beverly, MA). Dieser Typ eines Linkers enthält ein Translations-Stop-Codon in allen drei möglichen Leserastern, er enthält ferner eine NheI-Restriktions-Schnittstelle, die es erleichtert, die Anwesenheit des Nonsense-Linkers (Stop-Codon-einführender Linker) in der sCR1-cDNA zu bestätigen. Das resultierende Plasmid wurde pBL-CR1c5 genannt und behielt LHR-A und 62% von LHR-B der sCR1-cDNA bei. pBL-CR1c5 wurde mit XhoI verdaut und das sCR1-Insert vom pBluescript®-Vektor abgetrennt. Das isolierte sCR1-Fragment wurde dann in die einzige XhoI-Schnittstelle des Expressionsvektors pTCSgpt inseriert, um das Plasmid pT-CR1c5 zu erzeugen.
11.3. Expression von löslichem CR1
Wie hier demonstriert wird, ist die Expression einer löslichen Form von CR1, die von Zellen in hohen Mengen sekretiert werden kann (i) nicht auf eine exakte Schnittstelle in der CR1-cDNA, die für eine Deletion oder Verkürzung benutzt wird, beschränkt, und ist (ii) ebenfalls nicht beschränkt auf die Verwendung eines speziellen Expressionsvektors (siehe unten). Die Möglichkeit, sekretiertes sCR1 zu produzieren, wurde in zwei verschiedenen Expressions-Systemen demonstriert.
11.3.1. Konstruktion der pTCS-Reihe von Expressionsvektoren
Die pTCS-Reihe der benutzten Expressionsvektoren besteht aus drei Plasmiden, jedes davon mit einer einzigen XhoI-Klonierungsstelle für die Insertion von cDNAs (21). Die Transkription der insertierten cDNA wird über eine Gruppe von Tandem-Promotoren kontrolliert. Der „SV40 early-Promotor" (früher SV40-Promotor) ist dabei stromaufwärts des „Adenovirus-2 major late Promotors" (AD2 MLP, später Haupt-Promotor von AD2) lokalisiert. Zwischen dem Start der cDNA und dem AD2-MLP-Promotor liegt die dreigeteilte Vorsequenz („leader") des Adenovirus. Transkribierte mRNAs werden an einem Polyadenylierungssignal terminiert, das durch die murinen Immunglobulin-kappa (Igκ)-Sequenzen, lokalisiert stromabwärts der XhoI-cDNA-Klonierungsstelle, bereit gestellt wird. Selektierbare Marker wie Xanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (gpt), Dihydrofolat-Reduktase (dhfr) oder Neomycin-Resistenz (neo^r) wurden durch die Insertion der entsprechenden Marker aus pSV2gpt, pSV2dhfr beziehungsweise pSV2neo erhalten. Diese Plasmide lieferten auch den bakteriellen Replikationsursprung und das Beta-Laktamase-Gen für die Ampicillin-Resistenz. Generell ist die Auswahl dieser Vektoren davon abhängig, welche selektierbaren Marker oder Kombinationen von Markern für die Selektion der Rekombinanten bevorzugt werden.
Die vollständigen DNA-Sequenzen sind für Adenovirus 2 (Ad2), SV40, pSV2cat (Gorman, C., 1985, DNA Cloning, Volume II, A Practical Approach, ed. D. M. Glover, IRL Press, Seiten 143–190) und das murine Immunglobulin-Kappa bekannt. Die Sequenzen sind in der GenBank®-Datenbank und der „National Biomedical Research annotation" sowie in Referenzen zu finden. Jede dieser Sequenzen kann auch als Bezugsquelle der entsprechenden Segmente der pTCS-Vektoren dienen. Die Vektoren pTCSgpt, pTCSneo und pTCS dhfr wurden aus den Zwischenprodukt-Plasmiden pEAXgpt und pMLEgpt wie folgt konstruiert:
11.3.1.1. Konstruktion von pEAXgpt
Schritt 1. Das Ad2-MLP-cDNA-Fragment wurde von M13 mp9/MLP abgeleitet (Concino, M. F., et al., 1983, J. Biol. Chem. 258: 8493–8496). Dieses Plasmid enthält Adenovirus 2-Sequenzen von Nucleotid 5778 (XhoI-Schnittstelle) bis Nucleotid 6231 (HindIII-Schnittstelle), einschließlich der PvuII-Restriktionsstelle bei Nucleotid 6069 und der SacII-Schnittstelle bei Nucleotid 5791 (s. NBRF Nucleic database, Zugangscode #Gdad2). Das XhoI-HindIII-Fragment war in die HindIII und SaII-Schnittstellen von M13 mp9 kloniert worden, um das Plasmid M 13 mp9/MLP zu generieren.
Das Plasmid M13 mp9/MLP wurde mit EcoRI und HindIII verdaut und das kleinere, MLP enthaltende Fragment isoliert. Ein pUC-Plasmid (Pharmacia, Inc., Piscataway, NJ) wurde ebenfalls mit EcoRI und HindIII verdaut und das größere Fragment dieses Plasmids wurde anschließend mit dem EcoRI-HindIII-MLP-Fragment ligiert. Dies resultierte in einem neuen MLP- enthaltenden Plasmid mit dem Plasmid-Rückgrat von pUC. Dieses Plasmid wurde mit SmaI verdaut, mit SaII-Linkern ligiert und wieder zirkularisiert. Dieses neue Plasmid wurde dann mit PvuII verdaut, welches das Plasmid an der PvuII-Schnittstelle spaltete, die an Position #6069 innerhalb der Adenovirus 2-Insert-Sequenzen lokalisiert ist. Das resultierende lineare Fragment wurde mit XhoI-Linkern ligiert und wieder zirkularisiert. Dieses Plasmid wurde anschließend mit XhoI und SaII verdaut und das kleinere Fragment, dass MLP-DNA enthielt, wurde isoliert (Fragment #1).
Schritt 2. Das Plasmid pSV2gpt („American Type Culture Collection" (ATCC) Zugangsnummer 37145) wurde mit PvuII verdaut, mit SaII-Linkern ligiert, und mit SaII verdaut. Das finale Produkt war ein lineares pSV2gpt-Fragment, dass als Bezugsquelle für das gpt-Gen diente (Fragment #2).
Schritt 3. Ein murines Immunglobulin-Igx-Fragment (Hieter, P. A., et al., 1980, Cell 22: 197–207) wurde mit HaeIII und AvaII verdaut und das Fragment, das die Polyadenylierungssequenz enthielt, isoliert. In der murinen Ig-Kappa-Sequenz, die aus der NBRF-Nucleinsäure-Datenbank (Zugangscode #Kcms) ersichtlich ist, befindet sich das Ig-Stop-Codon an der Position 1296, gefolgt von der AvaII-Schnittstelle an Position 1306, der AATAAA-Polyadenylierungsstelle an Position 1484 und der HaeIII-Schnittstelle an Position 1714. Die überhängenden Enden dieses Fragments wurden mit E. coli DNA-Polymerase aufgefüllt und das Fragment anschließend mit XhoI-Linkern ligiert und mit XhoI verdaut. Dieses Fragment (Fragment #3) diente als Bezugsquelle der Polyadenylierungsstelle.
Schritt 4. Die Fragmente 1, 2 und 3 wurden mit T4-DNA-Ligase verbunden, um ein zirkuläres Plasmid zu erzeugen. Die korrekte Orientierung der Fragmente in diesem Plasmid wurde durch Analyse mit Restriktionsenzymen bestätigt. Stromabwärts der XhoIcDNA-Klonierungsstelle befand sich die murine Kappa-Polyadenylierungsstelle, und weiter stromabwärts von dieser Stelle lagen der SV40-Promotor und das gpt-Gen. Stromaufwärts der XhoI-Schnittstelle befand sich der MLP-Promotor und weiter stromaufwärts von diesem Promotor lagen der bakterielle Replikationsursprung und das Ampicillin-Gen. Dieses Plasmid wurde anschließend mit SaII verdaut und die überhängenden Enden mit E. coli DNA-Polymerase aufgefüllt. Das resultierende Fragment mit glatten Enden wurde mit EcoRI-Linkern ligiert und mit T4-DNA-Ligase wieder zirkularisiert. Das endgültige Plasmid wurde als pEAXgpt bezeichnet.
11.3.1.2. Konstruktion von pMLEgpt
Schritt 1. Das Plasmid pMLP CAT (Lee, R. F., et al., 1988, Virology, 165: 51– 56) ist ein Expressions-Plasmid mit einem pML-Vektor-Rückgrat und enthält den Adenovirus 2-MLP und die dreigeteilten Vorsequenzen 5' des CAT-Gens. pMLP-CAT wurde mit XhoI und SacII verdaut; XhoI schneidet an einer Stelle zwischen dem CAT-Gen und der L3-Region der dreigeteilten Vorsequenz, SacII schneidet bei Position #5791 innerhalb der Adenovirus-DNA, jedoch 5' des MLP. Der AD2-MLP und die dreigeteilte Vorsequenz waren daher in diesem kleinen XhoI-SacII-Fragment lokalisiert (Fragment #4).
Schritt 2. Plasmid pEAXgpt wurde mit XhoI und SacII verdaut und das kleinere, MLP-enthaltende Fragment verworfen. Das größere Fragment (Fragment #5) wurde isoliert. Die Fragmente 4 und 5, beide mit SacII- und XhoI-Enden, wurden ligiert, um das Plasmid pMLEgpt zu erzeugen.
11.3.1.3. Konstruktion von pTCSgpt
Schritt 1. pMLEgpt wurde mit SacII verdaut und die Enden mit T4-DNA-Polymerase aufgefüllt, was ein Fragment mit stumpfen Enden lieferte (Fragment #6). Diese SacII-Schnittstelle ist an Nucleotid 5791 in der Adenovirus 2-Sequenz lokalisiert, 5' der dreigeteilten Vorsequenz von MLP.
Schritt 2. pSV2dhfr (ATCC Zugangsnummer 37146) wurde mit HindIII und PvuII verdaut. Das kleinere 342 Nucleotid-Fragment, das den frühen Promotor von SV40 enthält, wurde mittels des Klenow-Fragments aus E. coli DNA-Polymerase mit stumpfen Enden versehen (Fragment #7). Die Fragmente 6 und 7 wurden mit T4-DNA-Ligase ligiert. Die Analyse mittels Restriktionsenzym bestätigte, dass die Fragmente korrekt orientiert waren, um zwei Tandem-Promotoren stromaufwärts der XhoI-cDNA-Klonierungsstelle bereit zu stellen, von denen jeder Promotor dazu befähigt ist, RNA-Synthese in der selben Richtung zu steuern. Dieses Plasmid wurde pTCSgpt genannt (22).
11.3.1.4. Konstruktion von pTCSdhfr
Schritt 1. pSV2dhfr wurde mit HindIII und PvuII verdaut und das größere Fragment anschließend aus einem Agarose-Gel gereinigt (Fragment #8). Das kleinere, den frühen SV40- Promotor enthaltende Fragment wurde verworfen.
Schritt 2. pTCSgpt wurde mit EcoRI verdaut und dann mit dem Klenow-Fragment aus E. coli DNA-Polymerase aufgefüllt, um stumpfe Enden zu generieren. Dieses lineare Fragment wurde anschließend mit HindIII verdaut, und das Fragment (ungefähr 1600 Nucleotide), das die pTCS-Transkriptions-Einheit des SV40-Promotors, MLP, die dreigeteilte Vorsequenz, die XhoI-cDNA-Klonierungsstelle, murine Igλ-Sequenzen und einen zweiten SV40-Promotor enthält, wurde isoliert (Fragment #9). Dieses Fragment hatte ein glattes Ende sowie ein HindIII-überhängendendes Ende. Die Ligation der Fragmente 8 und 9 generierte das Plasmid pTCSdhfr.
11.3.1.5. Konstruktion von pTCSneo
Schritt 1. pSV2neo (ATCC Nummer 37149) wurde mit HindIII und BamHI verdaut und das größere Fragment (Fragment #10) isoliert. Dieses Fragment enthielt das Plasmid-Rückgrat und das neo-Gen.
Schritt 2. pTCSdhfr wurde mit HindIII und BamHI verdaut, und die pTCS-Transkriptions-Einheit (Fragment #11) wurde nach Elektrophorese der verdauten Produkte aus einem Agarose-Gel isoliert. Die Ligation der Fragmente 10 und 11 generierte das Plasmid pTCSneo.
11.3.2. Expression und Assay der Plasmide pBSCR1c, pBSCR1s und pBM-CR1c, Säuger-Expressions-Vektoren, die für lösliches CR1 kodierende Sequenzen enthalten
11.3.2.1. Expression von CR1-Konstrukten, die an verschiedenen Positionen innerhalb der CR1-cDNA verkürzt wurden
Die Plasmide pBSCR1c und pBSCR1s wurden in solcher Weise konstruiert (Abschnitt 11.1, siehe oben), dass der Großteil der kodierenden cDNA-Regionen – mit Ausnahme der transmembranen und zytoplasmatischen Region – erhalten wurde (20). pBSCR1s ist kürzer als pBSCR1c, da diesem Plasmid auch ein Teil von LHR-D und die SCRs 29 und 30 fehlen, die in pBSCR1c enthalten sind. Die sCR1-Abschnitte dieser Plasmide wurden in pTCSgpt inseriert, gefolgt von einer Transfektion und Expression wie unten beschrieben.
pBSCR1c/pTCSgpt-Konstrukt: pBSCR1c wurde mit XhoI verdaut, um das 5,9 KB-sCR1c-Insert zu erhalten. sCR1c wurde in die XhoI-cDNA-Klonierungsstelle von pTCSgpt inseriert, um pBSCR1c/pTCSgpt zu erzeugen.
pBSCR1s/pTCSgpt-Konstrukt: pBSCR1s wurde mit XhoI und PvuI verdaut, um das sCR1s-Insert herauszulösen. Die Enden des Inserts wurden mit T4-DNA-Polymerase in stumpfe Enden überführt. Dieses Insert wurde aus einem Agarose-Gel gereinigt. Der Vektor pTCSgpt wurde mit XhoI verdaut und die überhängenden XhoI-Enden mit E. coli DNA-Polymerase I aufgefüllt. Im folgenden wurde das sCR1s-Insert mit dem stumpfendigen Vektor ligiert, um pBSCR1s/pTCSgpt zu erzeugen.
Die Plasmide pBSCR1c/pTCSgpt und pBSCR1s/pTCSgpt wurden mit FspI verdaut und die resultierenden linearen DNAs mittels Calciumphosphat-Copräzipitation zusammen mit dem Plasmid pSV2dhfr in chinesische Hamster-Eierstockzellen transfiziert, die für das dhfr-Gen mutant sind (CHO DUX B11-Zellen). Die Transfektanten wurden über ihre Fähigkeit, in DHFR-Selektionsmedium zu wachsen, selektiert. Die Kulturüberstände der Transfektanten-Klone wurden mittels ELISA auf sekretiertes sCR1 getestet. Es wurden Kulturüberstände von fünfzig pBSCR1c/pTCSgpt-Rekombinanten getestet und die positiven Rekombinanten einem Amplifikations-Prozess unterzogen, indem sie in steigenden Konzentrationen an Methotrexat kultiviert wurden. Zusätzlich wurden Gruppen von Transfektanten erstellt, indem pro Gruppe acht pBSCR1c/pTCSgpt-Transfektanten zusammen kultiviert wurden und diese dem gleichen Amplifikations-Prozess unterzogen wurden. Die Ergebnisse dieser Amplifikation sind in Tabelle VI dargestellt.
Tabelle VI Expression von pBSCR1c/pTCSgpt Sekretiertes, lösliches CR1 (μg/ml)
Zwölf Rekombinanten von pBSCR1s/pTCSgpt wurden mittels ELISA auf die Produktion von löslichem CR1 getestet. Alle zwölf Kandidaten zeigten nachweisbare Mengen an sekretiertem sCR1. Die besten Produzenten bildeten Mengen an sCR1, die denen vergleichbar waren, die von den besten pBSCR1c/pTCSgpt-Transfektanten produziert wurden.
pBSCR1c/pTCSgpt und pBSCR1s/pTCSgpt-Rekombinanten produzierten lösliches CR1 in vergleichbaren Mengen. Dies zeigte, dass die Fähigkeit zur Produktion von löslichem CR1-Polypeptid nicht von einem bestimmten Verkürzungspunkt innerhalb der CR1 cDNA abhängt.
11.3.2.2. Expression von sCR1c in zwei verschiedenen Expressionssystemen
Das verkürzte CR1-cDNA Insert sCR1c wurde in den Expressionsvektor pTCSgpt inseriert und wie oben beschrieben exprimiert. Es wurde ebenfalls in den Expressionsvektor pBMT3X inseriert, wie oben in Abschnitt 11.2.3. beschrieben, und ergab dadurch pBM-CR1c. Beide dieser Expressionsvektoren besitzen sehr starke Promotoren. Die Expression von löslichem CR1 wurde in beiden Systemen getestet, um zu ermitteln, ob ein System größere Ausbeuten an sekretiertem Polypeptid produzieren würde.
C 127I-Maus-Zellen (ATCC Zugangsnummer CRL 1616, Rockville, Maryland) wurden unter Verwendung der Calciumsphosphat-Methode (Graham, F. L. und van der Eb, A. J., 1973, Virology 52: 456–467) mit pBM-CR1c transfiziert. Nach Glycerin-Schock wurden die Zellen wieder mit D-MEM-Medium, enthaltend 10% fetales bovines Serum und 2 mM L-Glutamin, gefüttert und bei 37°C für 48 Stunden inkubiert. Danach wurden die Zellen trypsinisiert und in Verhältnissen von 1 : 5 und 1 : 10 in vollständiges D-MEM-Medium plus 10 μM Cadmiumchlorid abgelöst. Cadmium-resistente Kolonien erschienen innerhalb von 10 Tagen. Zehn Kolonien wurden mittels Klonierungs-Zylindern herausgenommen. Jede Kolonie wurde in eine 60 mm Petrischale transferiert, die vollständiges D-MEM-Medium enthielt, und bei 37°C und 5% CO₂ inkubiert, bis die Zellen Konfluenz („Sättigungswachstum") erreichten. Danach wurden die Zellen in jeder einzelnen Platte trypsinisiert und auf drei 60 mm Schalen verteilt, um für die Präparationen tiefgefrorener Zellstämme, RNA-Extraktion und ELISA-Test des Zellmediums auf Anwesenheit von sekretiertem sCR1c verwendet werden zu können.
Als das Zellmedium von jeder konfluenten Petrischale entfernt und einer ELISA-Analyse unterzogen wurde, waren alle getesteten pBM-CR1c-Klone für die Produktion von löslichem CR1 positiv. Die Mengen an sekretiertem sCR1 bei den pBM-CR1c-Rekombinanten waren vergleichbar zu denen der pBSCR1c/pTCSgpt-Rekombinanten. Dies zeigt, dass die Möglichkeit, hohe Mengen an sekretiertem sCR1-Polypeptid zu produzieren, nicht von der ausschließlichen Verwendung bestimmter Promotoren oder Expressionssysteme abhängt.
11.3.3. Expression und Assay der Plasmide pT-CR1cl, pT-CR1c2, pT-CR1c3, pT-CR1c4 und pT-CR1cS, Säuger-Expressionsvektoren, die lösliches CR1 kodierende Sequenzen enthalten.
Die pT-CR1c-Reihe von Deletionsmutanten wies ebenso wie die Konstrukte pBSCR1c und pBSCR1s keine transmembranen und zytoplasmatischen Domänen auf. Zusätzlich sind in diesen Deletionsmutanten relativ große Abschnitte verschiedener LHR-Regionen der CR1-cDNA deletiert. (Siehe 20). Die Deletionsmutanten wurden in CHO DUX B11-Zellen exprimiert und die Mengen an produziertem löslichem CR1-Polypeptid gemessen.
Für jedes Deletionskonstrukt wurden 40 verschiedene Klon-Gruppen für die ELISA-Analyse ausgewählt, um festzustellen, ob lösliche CR1-Polypeptide produziert wurden. Es wurde festgestellt, dass alle fünf pT-CR1c-Konstrukte sCR1 in das Zellkulturmedium sekretierten, wobei der Nachweis entweder über ELISA oder durch die Anwesenheit funktioneller Aktivität in dem Zellkulturmedium erfolgte. Bei vier von fünf pT-CR1c-Konstrukten enthielten die Überstände der transfizierten Zellen sCR1, das funktionell war, was über einen Hämolyse-Assay nachgewiesen wurde (siehe Tabelle VII und Abschnitt 13.2 unten).
Tabelle VII Produktion funktioneller sCR1-Fragmente*
Die Tatsache, dass die Deletionsmutanten ebenfalls in der Lage waren, lösliches CR1 zu produzieren, belegte weiterhin, dass die Fähigkeit, sCR1 zu exprimieren, nicht von einer bestimmten genetischen Modifikation der CR1-cDNA abhing. Solange die Transmembranregionen deletiert waren, konnten alle Konstrukte ein lösliches Polypeptid produzieren.
12. Beispiel: Produktion und Reinigung von löslichem CR1
Es wurden große Mengen von sCR1 in einem Hohlfaser-Bioreaktor-System produziert. Die gewonnenen Mengen an sCR1 waren proportional zu den relativen Ausbeuten der inokulierten rekombinanten Klone. Für optimale Reinigungsergebnisse wurde ein serumfreies Medium ausgewählt, das bei Abwesenheit großer Mengen an exogenen zugesetzten fetalen Kälberserum-Polypeptiden zur Produktion großer Mengen an sCR1 führte.
12.1 Produktion von löslichem CR1 in großem Stil
Es wurde ein Cell-PharmTM Zellkultursystem I (CD Medical, Inc., Miami Lakes, FL), ausgestattet mit einem Modell IV-L Hohlfaser-Bioreaktor (30 kD Molekulargewichts-Ausschluss) unter sterilen Bedingungen zusammengebaut. Zwei Klone (Klon 2 und Klon 35 von pBSCR1c/pTCSgpt) wurden in acht T-225-Kulturkolben vermehrt. In konfluentem Zustand wurden die Zellen trypsinisiert, gewaschen, abzentrifugiert und in Kulturmedium resuspendiert. Ungefähr 5 × 10⁸ Zellen von Klon 2 und 10 × 10⁸ Zellen von Klon 35 wurden in zwei separaten Hohlfaser-Bioreaktoren inokuliert. Es wurde ein 20 Liter Nährlösungs-Reservoir mit alpha-MEM + 10% fetalem Kälberserum, 8 mM L-Glutamin, 100 μg/ml Penicillin-Streptomycin und der geeigneten Konzentration an Methotrexat (50 nM für l1on 2; 500 nM für Klon 35) verwendet. Vorgemischtes Gas (5% CO₂ in Luft) wurde durch den Oxygenator in das im Reservoir vorhandene Medium eingeperlt, um den pH-Wert aufrecht zu erhalten. Medium-Rezirkulation, Erneuerung und Gas-Durchfluss-Raten wurden im Hinblick auf maximale Produktion eingestellt. Die Proben wurden über die Inokulierungs-Zugänge geerntet, bei 1000 rpm für 10 Minuten zentrifugiert, durch einen Filter mit 0,22 μm Porengröße filtriert und vor der Reinigung auf 4°C gehalten. Ernte-Volumen und -Frequenz wurden stufenweise gesteigert, und zwar von 25 ml und drei Ernten pro Woche zu Beginn der Kultur auf 40 ml und fünf Ernten pro Woche nach zwei bis drei Monaten. Die Produktion von sCR1 wurde über CR1-ELISA getestet. Die Ausbeuten von Klon 2 und Klon 35 für den ersten Monat nach Inokulation betrugen 66 μg/Tag bzw. 1060 μg/Tag. Die Ausbeuten stiegen an, nachdem die Kulturen etabliert waren.
12.1.1. Produktion von sCR1 in serumfreiem Medium
Zwei kommerziell erhältliche, serumfreie Medien wurden auf ihre Fähigkeit getestet, das Zellwachstum und die Produktion von sCR1 zu unterstützen. Ein konfluenter T75 Kulturkolben von pBSCR1c/pTCSgpt-Klon 35 wurde auf zwei T75 Kulturkolben aufgeteilt. Ein Kolben wurde mit alpha-MEM, supplementiert mit 10% fetalem Kälberserum, L-Glutamin, Antibiotika und 500 nM Methotrexat, kultiviert. Der andere Kulturkolben wurde in alpha-MEM plus L-Glutamin, Antibiotika, 500 nM Methotrexat und HB CHO-Wachstums-Supplement (Hana Biologics, Inc., Alameda, CA) schrittweise entwöhnt, und zwar von 5% auf 1% und 0,5% bis hin zur Abwesenheit von fetalem Kälberserum. Das Zellwachstum und die sCR1-Produktionsraten der beiden Kulturkolben wurden verglichen. Das Wachstum der Zellen in den serumfreien Medien erreichte niemals den Zustand der Konfluenz. Die Mengen der sCR1-Produktion sind in Tabelle VIII angegeben. In jedem Fall war die Rate der sCR1-Produktion dann am besten, wenn die Zellen in 10% fetalem Kälberserum wuchsen. Zum Vergleich betrugen die Mengen, die in serumfreien Medien an Tag 14 aufgefunden wurden, 1,4 × 10¹⁰ Ghosts/ml im Vergleich zu 4,2 × 10¹⁰ Ghosts/ml für mit 10% fetalem Kälberserum supplementierte Medien.
Tabelle VIII Produktion von sCR1 in serumfreien Medien, supplementiert mit CHO-Wachstums-Supplement im Vergleich zu Medien, die 10% fetales Kälberserum enthalten*
Das Zellwachstum und die sCR1-Produktion der Rekombinanten wurde unter Verwendung einer zweiten Quelle serumfreier Medien (CHO-1, Ventrex Laboratories, Inc., Portland, ME) getestet. Da es nicht notwendig war, in Serum gewachsene Zellen für diese Medien zu entwöhnen, wurden die Zellen aufgetaut und direkt in den serumfreien Medien kultiviert. Diese Medien bestehen aus einer DME-F12-Base und einem Wachstums-Additiv. Gleiche Mengen von Zellen wurden aufgetaut und in separate Vertiefungen einer 24-Probenplatte eingebracht. Nachdem die Zellen angehaftet waren, wurden die Medien verworfen und entweder 10% fetales Kälberserum enthaltende Medien oder serumfreie Medien in die entsprechenden Vertiefungen gegeben. Jede Bedingung wurde in doppelter Form getestet. Anders als zuvor getestete, serumfreie Medien erlaubten die CHO-1 Ventrex Laboratories Medien vergleichbares Zellwachstum wie die fetales Kälberserum enthaltenden Medien.
12.1.2. Schlussfolgerungen
Die oben beschriebenen Ergebnisse zeigen, dass sCR1-produzierende CHO-Zellen in bestimmten serumfreien Medien dauerhaft gehalten werden können. Dies erlaubt bei großtechnischen Produktionsläufen eine Kosteneinsparung im Bezug auf das Kulturmedium. Ein weiterer Vorteil ist die Vereinfachung der Reinigung von sCR1 aus den Überständen der Zellkulturen, da keine Proteine aus fetalem Kälberserum entfernt werden müssen.
12.2. Reinigung von löslichem CR1
Mit der Entwicklung spezifischer anti-CR1-Antikörper wurde es möglich, die vielen chromatographischen Schritte zur Gewinnung von gereinigtem CR1 durch ein vereinfachtes Zwei-Schritt-Verfahren zu ersetzen. Dies steigerte die Ausbeute an gewinnbaren CR1-Proteinen bis auf etwa 1–5 mg CR1 pro 5,9 × 10¹³ Erythrozythen (Wong, W. W., et al., 1985, J. Immunol. Methods 82: 303–313). Dennoch war es stets notwendig, das CR1 enthaltende Material in Detergentien zu solubilisieren, da das beschriebene Reinigungsverfahren für Membran-gebundene Formen von CR1 galt.
Durch rekombinante Transfektanten produziertes lösliches CR1 muss nicht mit Detergentien zur Aufreinigung solubilisiert werden; es ist immer löslich. Obwohl lösliches CR1 durch anti-CR1-Antikörper-Chromatographie gereinigt werden kann (siehe unten), ist dieses Verfahren nicht einfach auf die großtechnische Produktion übertragbar. Das Ausmaß der Produktionssteigerung ist durch die Menge an anti-CR1-Antikörper, der zur Präparation der Antikörper-Matrix der Antikörper-Reinigungs-Säulen zur Verfügung steht, begrenzt. Zusätzlich bedeutet die hohe Bindungsaffinität eines Antikörpers wie etwa YZ-1 für CR1, dass eher harte Bedingungen, beispielsweise pH 12,2, verwendet werden müssen, um das gebundene sCR1-Produkt von der Antikörpermatrix zu lösen (Wong, W. W., et al., 1985, J. Immunol. Methods 82: 303–313).
Um die Kapazität zur Reinigung sehr großer Mengen an löslichem CR1 zu erhalten, wurden Reinigungs-Verfahren entwickelt, die HPLC-Säulen beinhalten. Diese HPLC-Säulen können leicht vergrößert werden, um sogar größere Mengen an gereinigtem, löslichem CR1 zu produzieren. Zusätzlich benötigen sie keine harten Bedingungen für die Elution und Gewinnung von sCRI.
12.2.1. Antikörper-Affinitäts-Säulen-Reinigung
12.2.1.1. Methoden
Zur Antikörper-Affinitäts-Reinigung von sCR1 wurden 100 mg monoklonaler Antikörper YZ-1 kovalent an 7 mg AffiGel-10 (BioRad, Richmond, CA) entsprechend den Angaben des Herstellers gebunden. CR1 enthaltender Überstand aus Zellkulturen wurde mit dem imobilisierten YZ-1 in einem Kolben, der bei 4°C über Nacht geschüttelt wurde, inkubiert. Das Material wurde in eine Glassäule umgeschüttet und ausgiebig mit 10 mM Hepes, 0,1 M NaCl, pH 7, gewaschen. Das sCR1 wurde mit 20 mM Natrium-Phosphat, 0,7 M NaCl, pH 12 eluiert (Yoon, S. H., und Fearon, D. T., 1985, J. Immunol. 134: 3332–3338). Die eluierten Fraktionen wurden mittels BioRad-Protein-Assay (BioRad, Richmond, CA) auf die Anwesenheit von Protein getestet. Die Protein- enthaltenden Proben wurden sofort vereinigt und über Nacht bei 4°C in 0,1 M Hepes, pH 7 dialysiert (2 × 1 Liter). Die Proben wurden anschließend in PBS dialysiert. Die Anwesenheit von sCR1 wurde mittels CR1-ELISA analysiert.
12.2.1.2. Ergebnisse
Zellkulturüberstand, der von dem Transfektanten pBSCR1c/pTCSgpt-Klon 2 produziertes sCR1 enthielt, wurde auf die anti-CR1-Antikörper-Affinitätssäule geladen und die Fraktionen mit deutlich messbarem sCR1-Gehalt („peak fractions") vereinigt. Ein Aliquot dieses gereinigten Materials wurde einem Durchlauf auf einem 4–20% SDS-PAGE Gel unterzogen (DAIICHI; Inc., polyacrylamide gels; modified procedure of Laemmli, U.K., 1970, Nature 227: 680–685). Unter reduzierenden Bedingungen betrug das offenbare Molekulargewicht von löslichem CR1 etwa 224.000 Dalton (24). Es wurde außerdem gezeigt, dass dieses gereinigte CR1 aktiv ist, da es die Fähigkeit besaß, komplementvermittelte Hämolyse ebenso wie die Bildung von C5a und C3a zu inhibieren. (Abschnitt 13, unten).
12.2.2. CR 1-Reinigung über HPLC
12.2.2.1. Methoden
12.2.2.1.1. Ausgangsmaterial
Wenn die Kulturen gerade in den Bioreaktoren etabliert wurden, waren die Raten der sCR1-Produktion niedriger als bei den Kulturen, die für mehrere Monate gewachsen waren. Grundsätzlich gab es eine Zeitspanne von einigen Wochen, bevor die Zellen im Bioreaktor einen Zustand der Konfluenz erreichten und maximale Mengen an sCR1 produzierten. Zellkultur-Überstände mit niedrigem Gehalt an sCR1 können vor der Reinigung entweder durch Ammoniumsulfat-Präzipitation oder durch Ultrafiltration konzentriert werden. Ammoniumsulfat-Fraktionierung der Überstände über einen Sättigungs-Bereich von 60% bis 80% präzipitierte das sCR1 in im wesentlichen äquivalenten Ausbeuten. Das Präzipitat wurde in einem minimalen Volumen aufgelöst und für die Kationen-Austausch-HPLC in Start-Puffer dialysiert. Alternativ können die CHO-Zellkultur-Überstände durch Ultrafiltration konzentriert und für eine Kationen-Austausch-Chromatographie in Start-Puffer dialysiert werden. Da die Bioreaktoren höhere Konzentrationen an löslichem CR1 produzierten, können die CHO-Zellkultur-Überstände dieser Kulturen direkt im Start-Puffer für die Kationen-Austausch-Chromatographie dialysiert werden.
12.2.2.1.2. Kationen-Austausch-HPLC-Verfahren
Proben wurden in Start-Puffer dialysiert (0,02 M Na Phosphat, 0,06 N Natriumchlorid, pH 7,0) und dann durch einen 0,2 μm-Filter gefiltert, um jegliches partikuläre Material zu entfernen. Die Probe wurde dann auf eine Kationen-Austausch-Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie-Säule (10 cm × 10 mm, Hydropore-SCX HPLC-Säule von Rainin) geladen. Die Säule wurde gewaschen und mit einem Natriumchlorid-Gradienten, entwickelt unter Verwendung von 0,02 M Phosphat, 0,5 N NaCl, pH 7,0, eluiert. Das sCR1 wurde irgendwo zwischen 0,06 N und 0,25 N Natriumchlorid eluiert. Die Elution wurde durch Absorption bei 280 nm und über ELISA überwacht.
12.2.2.1.3. Anionen-Austausch-HPLC-Verfahren
Wenn gewünscht, konnte eine weitere Reinigung des über Kationen-HPLCgereinigten sCR1 mittels Anionen-HPLC erreicht werden. Spitzen-Fraktionen aus der Kationen-HPLC wurden in dem Startpuffer für Anionen-HPLC dialysiert. Die Proben wurden geladen und die Säule (Hydropore-AX von Rainin) dann in 0,01 M Phosphat, pH 7,5, gewaschen. Die Säule wurde mit einer Reihe von Schritten und Gradienten, entwickelt unter Verwendung von 0,01 M Phosphat und 0,5 N Natriumchlorid, pH 7,5, eluiert. Das sCR1 eluierte irgendwo zwischen 0,0 N und 0,3 N Natriumchlorid. Die Elution wurde, wie zuvor für die Kationen-Austausch-HPLC beschrieben, überwacht. Die Konzentrationen und der pH-Wert der Kationen- und Anionen-HPLC Säulen-Puffer sind nur beispielhaft dargestellt. Andere Pufferkonzentrationen, Salzbedingungen oder pH-Bedingungen würden ebenfalls funktionieren.
12.2.2.1.4. Western Blot-Analyse
Der Western-Blot wurde unter Verwendung einer modifizierten Methode von Towbin, H., et al., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 4350–4354, durchgeführt. Kurz zusammenfassend läßt man gereinigtes sCR1 über eine 4–20%-SDS-PAGE laufen, transferiert das Protein auf Nitrocellulose, die spezifisch mit anti-CR1 (Maus mAK YZ-1 oder J3D3) markiert ist, und detektiert mit Ziege-anti- Maus-Antikörper, der mit alkalischer Phosphatase konjugiert ist.
12.2.2.2. Ergebnisse
Für einen typischen Durchlauf wurden 50–100 ml des Überstandes einer Bioreaktor-Kultur in Start-Puffer dialysiert und auf eine 10 cm × 10 mm Kationen-Austausch-HPLC geladen. Die Spitzen-Fraktionen wurden über ELISA und Absorption bei 280 nm ermittelt und vereinigt. Die Protein-Konzentration des Pools wurde über die Absorption bei 280 nm ermittelt (ε(1%) bei 280 nm = 10, wie aus der Aminosäure-Zusammensetzung von CR1c geschätzt). Einige zehn Milligramm Produkt wurden aus 100 ml des amplifizierten Kulturüberstandes gereinigt.
Zum Beispiel lieferten 100 ml des Kulturüberstandes der Transfektante pBSCR1c/pTCSgpt Klon 2 hierbei 22 mg an gereinigtem sCR1 (bestimmt über die Absorption bei 280 nm), wenn über Kationen-HPLC gereinigt wurde (24). Bei der Messung über CR1-ELISA wurde die Ausbeute auf 202% kalkuliert, mit weiteren 13% in der Durchfluss- oder Wasch-Fraktion der Säule. Die über 100% liegende Ausbeute reflektiert möglicherweise Matrix-Effekte im ELISA.
Wenn man die Frequenzen, mit denen Kulturüberstände aus einem Bioreaktor entnommen werden können, berücksichtigt, sollte es bei diesem Level der Amplifikation durch Methotrexat möglich sein, ungefähr 100 mg an gereinigtem, löslichem CR1 pro Woche und Bioreaktor zu produzieren. Einige Wege, mit denen diese Produktionsrate gesteigert werden kann, schließen die Amplifikation der Start-Kulturen mit Methotrexat auf ein maximales Niveau ein, bevor der Bioreaktor inokuliert wird, ebenso die Steigerung der Anzahl an Bioreaktoren in der Produktion zu beliebiger Zeit sowie die Verwendung von HPLC-Säulen mit größerer Kapazität.
12.2.2.3. Charakterisierung des bereinigten, löslichen CR1
Die sCR1 enthaltende Spitzen-Fraktion aus der Kationen-HPLC (24) wurde mittels einer Anionen-HPLC weiter gereinigt. Die Reinheit des sCR1-Materials während der verschiedenen Schritte wurde über SDS-PAGE getestet (25). Die kleineren Banden, die in diesen stark beladenen Gelen zu sehen waren, stellen Fragmente von sCR1 dar, wie über Western-Blot-Analyse unter Verwendung der monoklonalen anti-CR1 Antikörper YZ1 oder J3D3 ermittelt wurde. Die Fragment-sCR1-Banden wurden in den meisten Präparationen nicht beobachtet.
Die funktionelle Aktivität von gereinigtem sCR1 wurde über seine Fähigkeit, die klassische Komplement-vermittelte Hämolyse bei einer Konzentration von 0,25 μg/ml gereinigtem sCR1 um 50% zu inhibieren, nachgewiesen. Das gereinigte, lösliche CR 1 war ebenso befähigt, die klassische Komplement C5a-Produktion bei einer Konzentration von 5 μg/ml um 50% und die C3a-Produktion bei einer Konzentration von 13 μg/ml ebenfalls um 50% zu inhibieren (siehe Abschnitt 13, unten).
12.2.2.4. Schlussfolgerungen
Wie oben beschrieben, haben wir ein verbessertes Verfahren zur Reinigung von löslichem CR1 entwickelt, das einfach auf größere Mengen umgestellt werden kann, um die für therapeutische Anwendungen benötigten Mengen an sCR1 zu produzieren. Die grundlegenden Elemente dieses Verfahrens schließen ein Ausgangsmaterial ein, das bereits löslich vorliegt und daher die Notwendigkeit zum Solubilisieren des membran-gebundenen CR1 mit Detergentien beseitigt. Die Verringerung der Konzentration an fetalem Kälberserum in den Bioreaktor-Kulturen und/oder die Verwendung alternativer Kulturmedien in diesen Kulturen beseitigt die Notwendigkeit, durch nachfolgende Reinigung hohe Konzentrationen an Fremdproteinen aus dem sCR1-enthaltenden Ausgangsmaterial entfernen zu müssen. Weiterhin stellte die Entwicklung eines HPLC-Verfahrens der Reinigung eine Methode für die Reinigung in großem Umfang bereit. Entweder Kationen-HPLC oder eine Kombination aus Kationen-HPLC, gefolgt von einer Anionen-Austausch-HPLC, können zur Reinigung verwendet werden. Weitestgehend reines, lösliches CR1 in hoher Ausbeute kann durch dieses Verfahren in nur ein oder zwei Schritten gewonnen werden.
13. Beispiel: Nachweis der in vitro Aktivität von löslichem CR1
13.1. Inhibition des oxidativen Burst von Neutrophilen
Im Reperfusions-Verletzungs-Modell der bei einem myokardialen Infarkt auftretenden Gewebezerstörung induzieren aktivierte Komplement-Komponenten Adhäsion und Aktivierung von Neutrophilen. Das aktivierte Neutrophil unterliegt einem sog. oxidativen Burst, der hochtoxische Sauerstoffradikale produziert. Diese und andere potenzielle Toxine werden während der Neutrophilen-Degranulation freigesetzt und schädigen das umliegende Gewebe. Lösliches CR 1 kann den Bereich an geschädigtem Gewebe reduzieren, indem es die Bildung von C3a und C5a, den Komplement-Komponenten, die in die Aktivierung von Neutrophilen involviert sind, verhindert.
Zur Überwachung der Fähigkeit von löslichem CR1, die Bildung von C5a während der Komplement-Aktivierung in vitro zu blockieren, wurde ein Bioassay verwendet, der die Bildung von Sauerstoff-Radikalen quantifizieren kann, welche durch Neutrophile während eines C5a-induzierten oxidativen Burst produziert wurden (Bass, D. A., et al., 1983, J. Immunol. 130: 1910–1917). Dieser Assay verwendet Dichlorfluoreszin-Diacetat (DCFDA), ein lipidlösliches Molekül, welches in Zellen eindringen kann, dort eingeschlossen wird und bei Oxidierung hochgradig fluoresziert.
13.1.1. Material und Methoden
13.1.1.1. Materialien
Es wurden frisches Blut mit allen Bestandteilen („whole blood"), humane Komplementquellen (Beth Israel Hospital, Boston, MA), getrocknete Bäckerhefe, PBS mit 0,1% Gelatine und 5 mM Glucose, 100 mM EDTA, 10 mM DCFDA in HBSS (Kodak), Lysepuffer für rote Blutkörperchen (RBC) (Ortho Diagnostics), gereinigtes C5a (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) und lösliches CR1 verwendet.
13.1.1.2. Präparation der Neutrophilen
Neutrophile wurden gemäß der Beschreibung von Bass (1983, J. Immunol. 130: 1910–1917) präpariert. 2,0 ml Gesamt-Blut wurden 3 mal in PBS-Gelatine-Glucose gewaschen, in 5 ml 10 μM DCFDA in HBSS plus 5 ml PBS-Gelatine-Glucose resuspendiert und für 15 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Zellen wurden anschließend abzentrifugiert und in 2,0 ml PBS-Gelatine-Glucose plus 5 mM EDTA resuspendiert.
13.1.1.3. Präparation von Hefe-Partikeln
Getrocknete Bäcker-Hefe wurde in H₂O resuspendiert, zweimal gewaschen und für 30 Minuten gekocht. Die Partikel wurden erneut zweimal in H₂O gewaschen und in einer Konzentration von 0,5 g/ml in H₂O resuspendiert (Simpson, P. J., et al., s. oben)
13.1.1.4 Aktivierung von Neutrophilen durch bereinigtes C5a
100 μl DCFDA-beladene Zellen wurden mit RBC-Lysepuffer behandelt, einmal in PBS-Gelatine-Glucose-EDTA gewaschen und in 1,0 ml PBS-Gelatine-Glucose resuspendiert. Fünfzig μl gereinigtes C5a in einer Konzentration von 200 ng/ml oder eine Kontrolle wurde zu 0,5 ml der Zielzellen bei 37°C hinzu gegeben; die Analyse erfolgte in unterschiedlichen Zeitintervallen in einem Durchflusszytometer.
13.1.1.5. Aktivierung von Neutrophilen durch bereinigtes C5a in humanem Serum oder Plasma
100 μl DCFDA-beladener Zellen wurden mit 50 μl C5a, 1 : 1 verdünnt in humanem Serum oder in heparinisiertem Plasma (100 ng/ml), oder mit einer Kontrolle bei 37°C für 30 Minuten inkubiert. Die RBCs wurden durch Lyse entfernt und die Neutrophilen in einem Durchflusszytometer analysiert.
13.1.1.6. Aktivierung von Neutrophilen durch Hefe-Partikel-aktiviertes humanes Serum oder Plasma
425 μl frisches gefrorenes Serum und Plasma plus 50 l sCR1 oder einer Kontrolle wurden mit 25 μl Hefe-Partikeln bei 37°C für 30 Minuten inkubiert. Die Komplement-aktivierten Proben und die Kontroll-Proben wurden anschließend zentrifugiert, um die Hefe-Partikel zu entfernen. Zehn 2-fach-Verdünnungen jeder dieser Proben wurden mit PBS-Gelatine-Glucose-EDTA hergestellt. 50 μl jeder dieser seriellen Verdünnungen von Kontrolle und aktiviertem Serum und Plasma wurden zu 50 μl DCFDA-beladener Zielzellen gegeben und bei 37°C für 30 Minuten inkubiert. Die RBCs wurden anschließend durch Lyse entfernt und die Neutrophilen in einem Durchflusszytometer analysiert.
13.1.2. Ergebnisse
13.1.2.1. C5a induziert einen oxidativen Burst in humanen Neutrophilen, der über DCFDA gemessen werden kann.
26 zeigt einen rapiden Anstieg in der Fluoreszenz-Intensität der humanen Neutrophilen nach Stimulation mit gereinigtem C5a an. Innerhalb von vier Minuten nach Zugabe von C5a (20 ng/ml Endkonzentration) waren die Neutrophilen 10-fach heller als die Kontrolle bestehend aus DCFDA-beladenen Neutrophilen. Nach 20 Minuten waren die Neutrophilen 20-fach heller als die Kontrolle. Dieser Assay scheint ein sensitiver Indikator für C5a zu sein.
13.1.2.2. Humanes Serum blockiert den oxidativen Burst-Effekt von gereinigtem C5a auf Neutrophile
Keine Steigerung der Fluoreszenz-Intensität wurde in Neutrophilen beobachtet, die mit DCFDA beladen und mit gereinigtem C5a, verdünnt in humanem Serum, inkubiert wurden. Dieser Effekt kann durch Blutplättchen-Wachstums-Faktor (Platelet derived Growth Factor, PDGF) verursacht worden sein, der während der Blut-Gerinnung von Blutplättchen freigesetzt wird. Es ist gezeigt worden, dass kleine Mengen an PDGF die C5a-induzierte Neutrophilen-Aktivierung inhibieren können (Wilson, E., et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 2213–2217).
13.1.2.3. Heparinisiertes Plasma blockiert die Effekte von C5a auf Neutrophile nicht
In heparinisiertem Plasma 1 : 1 verdünntes C5a induzierte einen oxidativen Burst in DCFDA-beladenen Neutrophilen. Obwohl gemäßigter als bei C5a in Puffer, gab es einen zehnfachen Anstieg der Fluoreszenz-Intensität nach 30 Minuten Inkubation mit den Neutrophilen. Das weniger starke Signal könnte durch die Freisetzung von PDGF während der Phlebotomie (venöse Blutabnahme) oder der Plasma-Isolation verursacht worden sein. Schonendere und schnellere Isolation des Plasmas von den zellulären Blutbestandteilen könnte die Freisetzung von PDGF minimieren und eine verstärkte Funktion von C5a ermöglichen.
13.1.2.4. Während der Komplement-Aktivierung vorhandenes sCR1 blockiert die C5a-Bildung
Durch Zymosan induzierte Aktivierung von humanem Komplement in Gegenwart von löslichem CR1 ergab reduzierte C5a-Aktivität, wie mittels des DCFDA-Assays nachgewiesen wurde. Wie in 27 zu sehen, ergab die 1 : 16-Verdünnung von humanem Plasma, das in der Gegenwart von sCR1 aktiviert wurde, 70% weniger Fluoreszenz-Intensitäts-Anstieg in den Neutrophilen als bei dem 1 : 16 verdünnten Plasma, das ohne Anwesenheit von sCR1 aktiviert wurde. Dies impliziert die Inhibition der C5a-Bildung durch sCR1. Eine weitere Optimierung des DCFDA-Assays und der Plasma-Gewinnung sollte zu einem dynamischeren und sensitiveren Assay für die Aktivität von löslichem CR1 führen.
13.2. Inhibition der Komplement-vermittelten Hämolyse
13.2.1.Methoden
Die Fähigkeit, Komplement zu inhibieren, wurde mittels eines Assays auf Inhibition Komplement-vermittelter Lyse roter Blutzellen (Hämolyse) getestet. Die Inhibition der Hämolyse wurde als Funktion der löslichen CR1-Konzentration bestimmt. Die zu testenden sCR1-Proben wurden in 0,1 M Hepes-Puffer (0,15 N NaCl, pH 7,4) verdünnt und 50 μl in jede Vertiefung einer Spitzboden-Mikrotiter-Platte gegeben, typischerweise in Dreierproben. Humanes Serum, das als Komplement-Quelle verwendet wurde, wurde 1 : 125 in Hepes-Puffer verdünnt und 50 μl in jede Vertiefung gegeben. Im nächsten Schritt wurden kommerziell erhältliche Schafs-Erythrozyten mit anti-Schaf-Antikörpern (Diamedix Katalog Nr. 789-002) wie erhalten verwendet und 100 μl pro Vertiefung zugegeben, um den zur Hämolyse führenden Komplement-Weg auszulösen. Die Platte wurde für 60 Minuten bei 37°C inkubiert und anschließend bei 500 × g für 10 Minuten zentrifugiert. Die Überstände wurden abgenommen und in eine Flachboden-Mikrotiter-Platte überführt. Das Ausmaß der Hämolyse wurde als Funktion der Proben-Absorption bei 410 nm gemessen. Die maximale Absorption (entsprechend maximaler Hämolyse) A_max wurde aus der Absorption einer Erythrozyten-Probe, ausschließlich humanes Serum enthaltend ( = A_s), minus der Absorption einer Probe, ausschließlich rote Blutzellen enthaltend (= A₀), abgeleitet. Daher ist A_max = As – A₀. Die Differenz zwischen der Absorption einer Erythrozyten-Probe, enthaltend humanes Serum und sCR1, und der Absorption einer Zell-Probe, nur sCR1 enthaltend, wurde als A_Probe definiert. Die Inhibition (IH) wurde als Fraktion (A_max – A_Probe/A_max) ausgedrückt und IH₅₀ als die Konzentration von sCR1 definiert, die zur Produktion eines IH-Wertes = ½ benötigt wird. Um Chromatographie-Fraktionen zu untersuchen, wurden die serumfreien Kontrollen nicht einbezogen und anti-Komplement-Aktivität qualitativ als Verminderung der Absorption einer Probe bei 410 nm gemessen.
Der oben beschriebene Hämolyse-Assay wurde auch verwendet, um die Fähigkeit von humanem rekombinantem sCR1 zur Inhibition der Schafs-Erythrocyten-Lyse durch das Komplement anderer Spezies wie Meerschweinchen und Ratte, zu überprüfen. Für jede Spezies wurde frisch eingefrorenes Serum oder frisch lyophilisiertes Serum oder Plasma als Komplement-Quelle verwendet. In manchen Fällen wurden Sera kommerziell erworben (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO).
Das Serum wurde zuerst auf seine Kapazität zur Lyse aktivierter roter Blutzellen titriert. Die höchste Verdünnung, die wenigstens 80% der maximalen Erythrocyten-Lyse lieferte, wurde zur Überprüfung des Effekts von zugesetztem humanem sCR1 verwendet. Der Assay wurde dann wie oben beschrieben durchgeführt, wobei humanes durch tierisches Serum in der bevorzugten Verdünnung ersetzt wurde.
13.2.2. Ergebnisse
Wie in 28 gezeigt, inhibiert gereinigtes sCR1 die klassische Komplement-vermittelte Lyse bei einer sCR1-Konzentration von 0,12 μg/ml um 50%. Die Fähigkeit von über Antikörper-Affinität gereinigtem sCR1, den Hämolyse-Assay zu inhibieren, wurde mit derjenigen von ungereinigtem Material (sCR1 enthaltender Zellkultur-Überstand) verglichen. Das gereinigte sCR1 besaß vergleichbare Aktivität gegenüber ungereinigtem sCR1, wobei beide eine 50%ige Inhibition im Hämolyse-Assay bei 1,6 × 10⁸ Ghosts/ml ergaben. Dies zeigt, dass das Reinigungsverfahren die funktionelle Aktivität des finalen sCR1-Produktes nicht wesentlich vermindert. Um zu ermitteln, ob gereinigtes sCR1 gefroren aufbewahrt werden kann, wurde ein Aliquot für eine Woche bei –70°C gelagert. Die Konzentration des gefrorenen sCR1 war die gleiche wie die des nicht gefrorenen sCR1, wie über die Absorption bei 280 nm und über CR1-ELISA bestimmt wurde. Das gefrorene sCR1 hatte wiederum die gleiche Aktivität wie das nicht gefrorene sCR1, wie über die Inhibition der Hämolyse festgestellt wurde. Die Fähigkeit von humanem, rekombinantem sCR1, die vom Komplement verschiedener Species vermittelte Hämolyse zu inhibieren, ist in Tabelle IX zusammengefasst.
Tabelle IX Hämolyse sensibilisierter Schafs-RBC (rote Blutkörperchen) mittels Komplement aus verschiedenen Tier-Sera
Sowohl Meerschweinchen- als auch Ratten-Komplement zeigten an, dass sie durch humanes sCR1 inhibiert werden. Der Mangel an klarer Inhibition für andere Spezies kann (a) die Unzweckmäßigkeit der Verwendung von Kaninchen-Antikörpern und Schafs-Erythrozyten im Testsystem oder (b) die hohe Konzentration an Serum, die für die Hämolyse in diesem System notwendig ist, reflektieren.
13.3. Inhibition der C3a- und C5a-Produktion
13.3.1. Methoden
Die Fähigkeit, Komplement zu inhibieren, wurde außerdem anhand einer Untersuchung der spezifischen Inhibition der C3a und C5a-Produktion getestet. Für alle Experimente wurde ein einzelner humaner Serum-Pool als Quelle für das Komplement verwendet; dieser wurde aliquotiert und bei –70°C gefroren gelagert. Humanes IgG wurde hitze-aggregiert, aliquotiert und bei –70°C gefroren gelagert. Für jedes Experiment wurden Serum-Aliquots bei 37°C mit verschiedenen zu testenden Konzentrationen von sCR1 equilibriert. Der Komplement-Reaktionsweg wurde durch die Zugabe von aggregiertem humanem IgG gestartet. Kontroll-Proben ohne IgG wurden stets einbezogen. Nach einer festgelegten Reaktionszeit von 15 Minuten (ermittelt in einer früheren Zeit-Verlaufsstudie, um ein günstiges Zeitintervall aufzufinden, während der die Bildung von C5a und C3a nahezu vollständig abgeschlossen ist, d. h. größer als 90%) wurden die Mengen an freigesetzten Komplement-Peptiden (C5a oder C3a) durch Radioimmuno-Assay unter Verwendung kommerziell erhältlicher Radioimmuno-Assay (RIA)-Kits (C5a-RIA, Amersham Katalog-Nr. RPA.520; C3a-RIA, Amersham Katalog Nr. RPA.518) bei modifizierten Verfahren ermittelt.
Da ein kompetitiver Immunoassay verwendet wurde, veränderten sich die Konzentrationen der Komplement-Peptide (C5a und C3a) reziprok zu den Zählimpulsen (counts). Die gemessenen Zählimpulse (counts bound, CB) für eine Probe wurden als die gesamten Zählimpulse (in counts pro Minute, cpm), gemessen im Pellet, definiert.
Die y-Achse in 29 repräsentiert die Fraktions-Inhibition. Die Fraktions-Inhibition entspricht den gemessenen Zählimpulsen (CB) für eine „Probe" minus den CB der „Probe mit sCR1", geteilt durch die CB der "Kontrolle ohne IgG " minus den CB der" Probe ohne sCR1".
13.3.2. Ergebnisse
Die Aktivität von gereinigtem sCR1 wurde überprüft, indem dessen Fähigkeit zur Inhibition der C5a-und C3a-Bildung in einer aktivierten humanen Serum-Probe getestet wurde. Wie in 29 gezeigt, war gereinigtes sCR1 unter den getesteten Bedingungen zur maximalen Inhibition der C5a-Produktion um 100% und der C3a-Produktion um 60% befähigt. Eine 50%ige Inhibition der Produktion wurde für C5a bei einer sCR1-Konzentration von 5 μg/ml und für C3a bei sCR1-Konzentrationen von 15–20 μg/ml beobachtet. Diese Daten legen nahe, dass rekombinantes sCR1 die C5-Convertase effizienter inhibiert als die C3-Convertase.
14. Beispiel: Nachweis funktioneller, therapeutischer Aktivität von löslichem CR1 in vivo
14.1. Lösliches CR1 zeit in vivo-Funktion in einer umgekehrten passiven Arthus- Reaktion
Die Arthus-Reaktion ist eine typische immunologisch induzierte Entzündungsantwort, die durch lokal injiziertes Antigen ausgelöst wird, welches in der Folge mit Antikörpern im Kreislauf reagiert. Die hauptsächliche biologische Antwort ist charakterisiert durch die Ablagerung von Immunkomplexen, Komplement-Fixierung, die Infiltration polymorphkerniger (polymorphonuclear, PMN) Leukozyten, die Freisetzung lysosomaler Enzyme und vasoaktiver Amine sowie durch lokale Gewebeschädigung (Uriuhura, T. and Movat, H. Z., 1966, Exp. Mol. Pathol. 5: 539–558; Cochrane, C. G., 1968, Adv. Immunol. 9: 97–162). Eine Modifikation der direkten Arthus-Reaktion ist die umgekehrte passive Arthus-Reaktion (RPAR), die als Modell zur Identifizierung von antiinflammatorischen (entzündungshemmenden) Agenzien verwendet wurde (Pflum, L. R. und Graeme, M. L., 1979, Agents and Actions 9: 184–189). Bei einer RPAR wird Antikörper lokal injiziert und das Antigen ist im Kreislauf vorhanden.
Bei Test in einem Ratten-RPAR-Modell war lösliches CR1s befähigt, die lokale Entzündungsreaktion zu hemmen. Der Wirkungsmechanismus dieser Funktion von löslichem CR1 in vivo kann durch die Inhibition von Enzymen des Komplement-Reaktionsweges vermittelt sein.
14.1.1. Material und Methoden
Fünf Wochen alte, weibliche Sprague Dawley-Ratten (CD-Stamm) mit einem Gewicht von ungefähr 100–125 Gramm (Charles River Laboratories, Wilmington, MA) wurden mittels intraperitonealer Injektion von 0,1 bis 0,3 ml Avertin-Lösung betäubt. Diese Lösung war eine 1 : 2-Verdünnung einer Stammlösung, die aus 1 g Tribromethanol in 15 ml Amel-Ethanol hergestellt wurde. Das Fell auf dem Rücken der Tiere wurde rasiert. Danach wurde der Schwanz angewärmt, zuerst mit warmem Wasser und dann mit einer Heizlampe. Unter Verwendung einer 1 ml-Spritze wurden 0,35 ml Ovalbumin (Calbiochem Corp., San Diego, CA) in einer Konzentration von 5 mg/ml in 0,15 M Phosphat-gepufferter Saline (PBS) intravenös in die Schwanzvene injiziert, ca. 1–2 Inch von der Schwanzspitze entfernt. Fünf Minuten später wurden die Ratten intradermal mit 0,08 ml einer 20 mg/ml Kaninchen-Ig-Fraktion eines anti-Ovalbumin-Antikörpers mit einem Antikörper-Titer von 4 mg/ml (Organon Teknika Corp., Cappel Division, West Chester, PA) oder mit 0,08 ml an 20 mg/ml Kaninchen-IgG (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) oder mit PBS injiziert. Jede Injektion wurde im Duplikat durchgeführt und die Bereiche um die Injektionen mit einem Filzstift markiert. Die Ratten wurden anschließend nach 1, 4 und 18 Stunden kontrolliert. Nach 24 Stunden wurden die Ratten getötet, indem sie 3 Minuten in Trockeneis getaucht wurden. Hautproben wurden von den Injektions-Stellen entnommen. Eines der Duplikate wurde in 10% Formalin zur Paraffin-Einbettung fixiert und die andere Probe wurde für die Kryostat-Sektionen gefroren. Gewebeschnitte wurden präpariert und mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt.
14.1.2. Ergebnisse
Eine schwache RPAR-Reaktion (z. B. Ödem und Erythem) wurde 3 bis 5 Stunden nach der intradermalen Injektion des anti-Ovalbumin-Antikörpers sichtbar. Die Intensität der Reaktion steigerte sich graduell bis die Ausdehnung der Reaktion 3–5 mm Durchmesser nach 24 Stunden erreichte (30b). Keine Reaktionen konnten in der Rattenhaut beobachtet werden, wenn nur Kaninchen-IgG von nicht immunisierten Tieren oder PBS injiziert worden war.
Bei der mikroskopischen Überprüfung der Gewebe-Schnitte, die von den Läsionsstellen präpariert wurden, waren viele akut-entzündliche Zellen in der Dermis sichtbar, besonders um die Blutgefäße herum (31b). Dieses ist typischerweise als Vaskulitis und Perivaskulitis anzusehen. Das Gewebe zeigte einen typisch entzündlichen Zustand mit ausgedehnter Infiltration von PMN außerhalb der Blutgefäße, der Anwesenheit von Erythrozythen im Bindegewebe und der Auflockerung von Kollagen-Fasern.
14.1.3. Effekte einer intradermalen Applikation von löslichem CR1
Es wurde je eine Mischung mit gereinigtem sCR1 präpariert, bei der 40 μl an 0,75 mg/ml sCR1 mit einem entsprechenden Volumen an anti-Ovalbumin oder normalem Kaninchen-IgG oder PBS gemischt wurden. Es wurde entweder die sCR1 : anti-Ovalbumin-Mischung oder die sCR1 : Kaninchen-IgG-Mischung oder die sCR1 : PBS-Mischung intradermal in intravenös mit Ovalbumin vorbehandelte Ratten injiziert. Kaum sichtbare Läsionen entwickelten sich an den Injektionsstellen, die sCR1 plus anti-Ovalbumin-Antikörper erhielten (30a). Wie erwartet entwickelten sich keine Läsionen an den Injektions-Stellen, die sCR1 : Kaninchen-IgG oder sCR1 : PBS erhielten. Als Gewebe-Schnitte des um die sCR1 : anti-Ovalbumin Injektionsstelle liegenden Gewebes mikroskopisch untersucht wurden, konnten Ansammlungen von PMN und mononucleären Zellen um die kleinen venösen Blutgefäße herum gefunden werden, aber es gab keine extensive Infiltration von PMN oder einen Gefäßaustritt von Erythrozythen (31a). Diese Daten zeigen, dass die Applikation von löslichem CR1 eine Inhibition der Endothelzell-Schädigung und eine Inhibition der Entzündungsreaktion bewirkte. Um die minimale wirksame Dosis von sCR1 zu ermitteln, die notwendig ist, um eine RPAR im oben beschriebenen Ovalbumin-Ratten-Modell zu blockieren, wurden 10-fache serielle Verdünnungen der 0,75 mg/ml sCR1-Stammlösung (unverdünnt, 1/10, 1/100, 1/1000 und 1/10.000) getestet. Jede sCR1-Verdünnung wurde mit einem entsprechenden Volumen an unverdünntem oder zur Hälfte verdünntem anti-Ovalbumin Antikörper gemischt. Jede Stelle wurde mit insgesamt 80 μl injiziert. Die Fähigkeit von sCR1, RPAR zu inhibieren, war dosisabhängig, wobei eine effektive Reduzierung des Ödems bei 300 ng pro Injektionsstelle beobachtet wurde (Tabelle X).
14.2. Pharmakokinetik von in vivo verabreichtem sCR1
Die biologische Halbwertszeit von sCR1 in vivo wurde wie folgt ermittelt. Ratten vergleichbaren Alters (sechs Wochen) und Körpergewichts (110–125 g) wurden intravenös mit 250 μg sCR1 in 0,35 ml injiziert. 2 Minuten, 5 Minuten, 10 Minuten, 60 Minuten bzw. 24 Stunden nach der Injektion wurden die Ratten getötet und Blut durch Punktion der Vena cava erhalten. 1–2 ml des Serums jeder Ratte wurden durch Zentrifugation bei 1800 rpm für 10 Minuten erhalten und die Menge an sCR1 in jeder Probe über CR1-ELISA ermittelt. Zweifache Verdünnungen von 1 μg/ml gereinigtem sCR1, welche in Kontroll-Rattenserum oder Detergens-Lysate Hämoglobin-freier roter Blutkörperchen-Ghosts (1,6 × 10⁸ Ghosts/ml) gegeben wurden, wurden als CR1-Standards verwendet. Die Ergebnisse sind in Tabelle XI dargestellt.
Diese Daten zeigen, dass sCR1 24 Stunden nach intravenöser Injektion detektiert werden kann. Nach 24 Stunden entsprach die Menge an sCR1 im Serum 50% der maximalen Menge, die 10 Minuten nach der Injektion beobachten wurde.
14.3. sCR1 reduziert die Infarkt-Größe in Ratten mit reperfundiertem Myokardinfarkt
Wie hier beschrieben, ist sCR1, das in vitro zur Inhibition der Aktivität der C3/C5-Convertase des Komplement-Reaktionsweges befähigt ist, ebenso in der Lage, das Ausmaß einer Reperfusions-Verletzung in vivo in einem myokardialen Infarktmodell der Ratte zu reduzieren. Ein Myokardinfarkt kann in einer Ratte durch Coronar-Ligation induziert werden. Wenn innerhalb der ersten paar Stunden nach einem Myokardinfarkt eine Reperfusion erfolgte, wurde gezeigt, dass diese das Ausmaß des Infarkts reduziert, die Funktion des linken Ventrikels verbessert und die Mortalität vermindert (Braunwald, E. und Kloner, R. A., 1985, J. Clin. Invest. 76: 1713–1719). Jedoch kann die Reperfusion an einem Myokard, welches schwer ischämisch, aber nicht irreversibel verletzt ist, selbst in gewissem Ausmaß Verletzung hervorrufen und verstärken. Der Mechanismus, der für die durch Reperfusion induzierte Verletzung verantwortlich ist, kann eine Verletzung, hervorgerufen durch freie Sauerstoff-Radikale und zelluläre Calzium-Überladung, einschließen. Leukozyten, die entweder alleine oder zusammen mit mikrovaskulären Endothelzellen agieren, können zu dieser Verletzung beitragen. Komplement-Aktivierung kann an diesem Prozess beteiligt sein (Rossen, R. D., et al., 1985, Cir. Res. 57: 119–130; Crawford, M. H., et al., 1988, Circulation 78: 1449–1458).
14.3.1. Methoden
14.3.1.1. Induktion eines Myokardinfarkts in der Ratte
Ratten (n = 14) mit einem Gewicht zwischen 200 und 250 Gramm wurden mittels Inhalation von Methoxyfluran betäubt, wonach an der rechten Vena jugularis ein Venenschnitt erfolgte und dort eine Kanüle gelegt wurde. Die Hälfte der Tiere (n = 7) erhielt 2 ml (1 mg) sCR1 über die Kanüle, die andere Hälfte erhielt 2 ml Saline-Placebo, in ähnlicher Weise präpariert und verabreicht. Den Tieren wurde die juguläre Kanüle entfernt, die Vena jugularis wurde abgebunden und die Eingriffsstelle verschlossen. Anschließend wurde im Bereich zwischen der 5. und 6. Rippe eine linke Thoraktomie durchgeführt, während der eine stoßweise positive Druckbeatmung mit 95% Sauerstoff und 5% CO₂ verabreicht wurde. Dann wurde eine Perikardiotomie durchgeführt und die linke Coronar-Arterie 2–3 mm links der proximalen Aorta durch Abschnüren mit chirurgischem Nahtmaterial verschlossen. Der Effekt dieser Coronar-Ligation bestand darin, eine große Region der Gefahr eines anterioren transmuralen Infarktes auszusetzen. Die Brust wurde vorübergehend geschlossen, während die Ratten unter Betäubung blieben. 35 Minuten nach dem Verschluss wurde die Brust wieder geöffnet und die Konstriktion entfernt. Diese Zeitspanne wurde so gewählt, dass ein signifikanter Anteil der gefährdeten Region potentiell rettbar blieb. Die Thoraktomie wurde dann dauerhaft verschlossen und die Tiere aus der Narkose aufgeweckt, normalerweise innerhalb von 5–10 Minuten nach der Operation. 100.000 Einheiten Benzathin-Penicillin G und 0,25 mg/kg Morphinsulfat wurden intramuskulär verabreicht. Die Tiere wurden eine Woche lang mit Wasser und Standard-Rattenfutter ernährt und dann, nach Heparinisierung und Methoxyfluran-Betäubung, getötet, indem das Herz entfernt wurde.
14.3.1.2. Morphologische Analyse der experimentellen Infarkte: Präparation der Herzen zur Untersuchung
Nach der Entfernung des Herzens wurden sofort Kanülen in die Aortas eingesetzt und die Coronar-Arterien zunächst, um die Herzen von Blut und Blutgerinnseln zu reinigen, mit Krebs-Henseleit-Lösung und anschließend mit 30 mM KCl für einen diastolischen Herzstillstand durchspült. Die Herzen wurden durch intracoronare Perfusion und Immersion mit 10% gepuffertem Formalin fixiert. Zur adäquaten Kontrolle des Fülldruckes wurden die Herzen durch die Mitralklappe mit Plastikschläuchen ventiliert. Nach der Fixierung wurden die Herzen schräg parallel zu der atrioventrikulären Grube in 2 mm Abschnitte von der Basis zu Spitze geschnitten und histologische Schnitte präpariert.
14.3.2. Ergebnisse
Die Überlebensrate war in beiden Gruppen gleich groß, dabei überlebten 6 von 7 Ratten 7 Tage und wurden untersucht. Bei einer groben Inspektion der histologischen Schnitte hatten 5 von 6 der mit Placebo behandelten Ratten große transmurale Myokardinfarkte (schätzungsweise waren mindestens 15% der gesamten linken Ventrikel-Masse betroffen). Nur 1/6 der überlebenden sCR1-behandelten Tiere wies diesen Befund eines großen, transmuralen Infarktes auf. Die anderen sCR1-behandelten Tiere hatten kleine, örtliche Infarkte, die einen viel kleineren Teil der linken Ventrikel-Masse betrafen (weniger als 15%). Tatsächlich waren die meisten dieser Infarkte nur über Mikroskopie nachweisbar, wogegen die Infarkte der Placebo-behandelten Ratten bereits bei der groben Inspektion erkennbar waren.
14.3.3. Schlussfolgerungen
Die Ergebnisse zeigen, dass die sCR1-Behandlung zur Reduzierung der Reperfusions-Verletzung in vivo effektiv ist und die Auswirkungen eines Myokardinfarktes effektiv abmildert. In dem Umfang, in dem die Reperfusions-Verletzung verringert wird, kann die absolute Menge an gerettetem Myokard gesteigert werden und das Zeitfenster, während dessen die Reperfusion klinisch sinnvoll ist, erweitert werden. Die Behandlung mit sCR1 sollte bei akutem Infarkt eine nützliche, zusätzliche Therapie neben Thrombolytika und Ballon-Coronar-Angioplastik darstellen.
15. Hinterlegung von Mikroorganismen
Der E. coli Stamm DK1/P3, welcher das Plasmid piABCD (bezeichnet als pCR1-piABCD) trägt, das das vollständige CR1-Protein codiert, wurde bei der „Agricultural Research-Culture Collection" (NRRL), Peoria, Illinois, am 31. März 1988 hinterlegt und erhielt die Zugangsnummer B-18355. Eine zusätzliche Hinterlegung des E. coli Stammes DK1/P3, der das Plasmid pCR1-piABCD trägt, wurde entsprechend des Budapester Abkommens mit der NRRL, Peoria, Illinois am 17. Juli 1997 vorgenommen und mit der Zugangsnummer B-18355N belegt.
Die Chinesische-Hamster-Eierstock(CHO) Zell-Linie DUX B11, die das Plasmid pBSCR1c/pTCSgpt, Klon 5.6, trägt, das ein lösliches CR1-Molekül codiert, wurde bei der „American Type Culture Collecton" (ATCC), Manassas, Virginia, am 23. März 1989 hinterlegt und erhielt die Zugangsnummer CRL 10052.
Die vorliegende Erfindung ist in ihrem Schutzbereich nicht durch die hinterlegten Mikroorganismen beschränkt, da die hinterlegten Ausführungsformen nur als Illustration eines einzelnen Aspektes der Erfindung gedacht sind und jeder Mikroorganismus, der funktionell äquivalent ist, in den Schutzbereich der vorliegenden Erfindung fällt. Tatsächlich werden dem Fachmann zusätzlich zu den hier gezeigten und beschriebenen Ausführungsformen verschiedene Modifikationen der vorliegenden Erfindung aus der vorstehenden Beschreibung und den zugehörigen Zeichnungen erkennbar werden. Solche Modifikationen sind als vom Schutzbereich der angefügten Ansprüche eingeschlossen gedacht.
Es versteht sich ebenso, dass alle Basenpaar-Größen, die für Nucleotide angegeben wurden, Annäherungen sind und dem Zweck der Beschreibung dienen.
Formblatt 134, Fortsetzung
Name der Hinterlegungsstelle:
Agricultural Resarch Culture Collection (NRRL)
Adresse der Hinterlegungsstelle:
1815 North University Street Peoria, IL 61604
Datum der Hinterlegung:
31. März 1988
Zugangsnummer:
B-18355

Claims

Nucleinsäuremolekül, umfassend eine Nucleotidsequenz, die ein Polypeptid codiert, dem eine Transmembrandomäne fehlt, und das eine Komplementregulatorische Aktivität von CR1 besitzt, wobei die Nucleotidsequenz ausgewählt ist aus: (a) einer im Wesentlichen wie in 1 dargestellten Nucleotidsequenz von Nucleotidnummer 28 bis Nucleotidnummer 5943, die ein lösliches CR1-Polypeptid codiert; und (b) einer Nucleotidsequenz, die im Bezug auf (a) degeneriert ist, oder ein Fragment der Nucleotidsequenzen von (a) oder (b), das ein Polypeptid codiert, dem eine Transmembrandomäne fehlt, und das eine Komplement-regulatorische Aktivität von CR1 besitzt.
Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1, das eine cDNA-Sequenz umfasst.
Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1, das eine genomische DNA-Sequenz umfasst.
Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1, das ein RNA-Molekül ist.
Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 4, in dem die Komplement-regulatorische Aktivität des codierten Polypeptids mindestens eine der folgenden Eigenschaften aufweist: (a) die Fähigkeit, C3b zu binden; (b) die Fähigkeit, C4b zu binden; und (c) Faktor I-Cofaktoraktivität.
Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 5, in dem die Komplement-regulatorische Aktivität des codierten Polypeptids mindestens eine der folgenden Eigenschaften aufweist: (a) die Fähigkeit, klassische C3-Konvertaseaktivität zu hemmen; (b) die Fähigkeit, alternative C3-Konvertaseaktivität zu hemmen; (c) die Fähigkeit, klassische C5-Konvertaseaktivität zu hemmen; (d) die Fähigkeit, alternative C5-Konvertaseaktivität zu hemmen; (e) die Fähigkeit, neutrophilen oxidativen Burst zu hemmen; (f) die Fähigkeit, Komplement-vermittelte Hämolyse zu hemmen; (g) die Fähigkeit, C3a-Produktion zu hemmen; und (h) die Fähigkeit, C5a-Produktion zu hemmen.
Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 5, in dem die Komplement-regulatorische Aktivität des codierten Polypeptids mindestens eine der folgenden Eigenschaften aufweist: (a) die Fähigkeit, Reperfusions-Verletzung zu verhindern; (b) die Fähigkeit, eine Arthus-Reaktion zu hemmen; (c) die Fähigkeit, das Ausmaß eines Herzinfarkts zu reduzieren; (d) die Fähigkeit, Entzündung zu reduzieren; und (e) die Fähigkeit, Neutrophil-vermittelte Gewebeschädigung zu hemmen.
Rekombinanter DNA-Vektor, umfassend das Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 5.
Rekombinanter Vektor nach Anspruch 8, der ein menschliches oder tierisches Virus, Insektenvirus, einen Hefe-Vektor, Bakteriophagen-Vektor, Plasmidoder Cosmid-DNA-Vektor ist.
Rekombinanter Vektor nach Anspruch 9, der ein rekombinantes Vaccinia-Virus oder Adenovirus ist.
Rekombinanter Expressionsvektor, umfassend das Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 5, der das Nucleinsäuremolekül in einer prokaryotischen Zelle exprimieren kann.
Rekombinanter Expressionsvektor nach Anspruch 11, wobei die prokaryotische Zelle ein Bakterium ist.
Rekombinanter Expressionsvektor, umfassend das Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 5, der das Nucleinsäuremolekül in einer eukaryotischen Zelle exprimieren kann.
Rekombinanter Expressionsvektor nach Anspruch 13, wobei die eukaryotische Zelle eine Säugerzelle ist.
Rekombinanter Vektor, umfassend Plasmid pBSCR1 c/pTCSgpt wie es in der bei der ATCC hinterlegten und mit der Hinterlegungs-Nummer CRL 10052 versehenen Zelllinie enthalten ist.
Zelle, beinhaltend die Nucleotidsequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder transformiert mit dem rekombinanten Vektor nach einem der Ansprüche 6 bis 15.
Zelle nach Anspruch 16, die ein Bakterium, eine Hefezelle, eine Insektenzelle oder eine Säugerzelle ist.
CHO-Zelle DUX B11, die das Plasmid pBSCRi c/pTCSgpt trägt, hinterlegt bei der ATCC und versehen mit der Hinterlegungs-Nummer CRL 10052.
Lösliches CR1-Polypeptid mit Komplement-regulatorischer Aktivität, das erhältlich ist durch die Schritte des Züchtens der Zelle nach einem der Ansprüche 16 bis 18 in einem geeigneten Kulturmedium, und Gewinnen des Polypeptids aus dem Kulturmedium.
Verfahren zur Herstellung eines CR1-Polypeptids, umfassend die Schritte des Züchtens der Zelle nach einem der Ansprüche 16 bis 18 in einem geeigneten Medium und Isolieren des Polypeptids von den Zellen oder dem Medium.
Lösliches CR1-Polypeptid mit Komplement-regulatorischer Aktivität, wobei das Polypeptid von dem Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 5 codiert wird.
Polypeptid nach Anspruch 21, umfassend mindestens eine kurze CR1-Konsensus-Wiederholung und nicht alle der kurzen CR1-Konsensus-Wiederholungen.
Lösliches CR1-Polypeptid, umfassend mindestens die lange homologe CR1-Wiederholung A mit Komplement-regulatorischer Aktivität, mit einer im Wesentlichen wie in 10 dargestellten Aminosäuresequenz der Aminosäurenummern 47 bis 494.
Lösliches CR1-Polypeptid, umfassend die 30 extrazellulären kurzen Konsensus-Wiederholungen, mit einer im Wesentlichen wie in 1 dargestellten Aminosäuresequenz von Gln₄₂ bis Ala₁₉₇₂, wobei dem Polypeptid eine Transmembrandomäne fehlt und es Komplement-regulatorische Aktivität zeigt.
Lösliches CR1-Polypeptid nach einem der Ansprüche 21 bis 24, das unglycosyliert ist.
Lösliches CR1-Polypeptid nach einem der Ansprüche 21 bis 24, das glycosyliert ist.
Lösliches CR1-Polypeptid nach einem der Ansprüche 21 bis 23, dem ein Signalpeptid fehlt.
Lösliches CR1-Polypeptid mit der Fähigkeit, C3b zu binden, welches LHR-C ist, im Wesentlichen wie in 10 dargestellt, mit den Aminosäurenummern 947 bis 1394.
Verfahren zur Reinigung des löslichen CR1-Polypeptids nach einem der Ansprüche 21 bis 28, umfassend: (a) Erhalten einer Probe, die das Polypeptid beinhaltet; (b) Unterziehen der Probe einer Kationenaustausch-Hochdruck- Flüssigkeitschromatographie; (c) Eluieren des Polypeptids von der Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie-Säule; (d) Unterziehen des Polypeptids einer Anionenaustausch-Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie; und (e) Eluieren des Polypeptids von der Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie-Säule von Schritt (d).
Verfahren nach Anspruch 29, wobei das Polypeptid sCR1 ist, mit den gleichen Eigenschaften wie lösliches CR1, das von der CHO-Zelle DUX B11 hergestellt wird, die das Plasmid pBSCR1 c/pTCSgpt trägt, hinterlegt bei der ATCC und versehen mit der Hinterlegungs-Nummer CRL 10052.
Verfahren nach Anspruch 29 oder 30, in dem Schritt (a) umfasst: (a1) Exprimieren des löslichen CR1-Polypeptids in einer Zelle in Kultur, so dass das CR1-Polypeptid sezerniert wird; (a2) Erhalten einer Probe der Zellkulturflüssigkeit, einschließlich des CR1-Polypeptids.
Arzneimittel, umfassend das Polypeptid nach einem der Ansprüche 21 bis 28 und/oder das Polypeptid, hergestellt gemäß dem Verfahren nach einem der Ansprüche 29 bis 31, und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
Arzneimittel nach Anspruch 32 zum Regulieren der Komplementaktivität.
Arzneimittel nach Anspruch 33 zum Behandeln eines Patienten mit einer Immunkrankheit oder einer Krankheit, die unerwünschte oder ungeeignete Komplementaktivität einschließt.
Arzneimittel nach Anspruch 32 zum Behandeln oder Verhindern von Schädigungen in einem Patienten, verursacht durch einen Herzinfarkt.
Arzneimittel nach Anspruch 32 zum Behandeln oder Verhindern von Schädigungen in einem Patienten, verursacht durch Entzündung.
Verwendung des Polypeptids nach einem der Ansprüche 21 bis 28 und/oder des Polypeptids, hergestellt gemäß dem Verfahren nach einem der Ansprüche 29 bis 31, zur Herstellung eines Arzneimittels wie in einem der Ansprüche 32 bis 36 definiert.