NO315944B1

NO315944B1 - CR1 protein for diagnostisk anvendelse in vitro, dets nukleinsyresekvens, rekombinant celle uttrykkende CR1 proteinet og en fremgangsmåte forå rense et CR1 protein

Info

Publication number: NO315944B1
Application number: NO20000827A
Authority: NO
Inventors: Douglas T Fearon; Lloyd B Klickstein; Winnie W Wong; Gerald R Carson; Michael F Concino; Stephen H Ip; Savvas C Makrides; Jr Henry C Marsh
Original assignee: Avant Immunotherapeutics Inc
Priority date: 1988-04-01
Filing date: 2000-02-18
Publication date: 2003-11-17
Also published as: FI115528B; FI106316B; JPH04501502A; AU647371B2; DE68929466T2; CA1340866C; WO1989009220A1; ZA907693B; FI20002515A; IL89790A0; DK175699B1; IL89790A; EP0411031A4; CA1341443C; CN1092712C; DE68929466D1; CN1036987A; EP0411031A1; CN1053265A; NO20000827D0

Description

1. INTRODUKSJON

Foreliggende oppfinnelse vedrører C3b/C4b reseptor (CR1) genet og dets kodede protein. Oppfinnelsen vedrører også CR1 nukleinsyresekvenser og fragmenter derav og deres kodede peptider eller proteiner. Oppfinnelsen tilveiebringer også ekspresjon av CR1 proteinet og fragmenter derav. CR1 nukleinsyrene og proteinene anvendes for diagnostikk.

2. BAKGRUNN FOR OPPFINNELSEN

2.1. Komplementsystemet

Komplementsystemet er en gruppe proteiner som utgjør omtrent 10% av globuliner i normalt serum til mennesker (Hood, L.E. et al., 1984, Immunology, 2d Ed., The Benjamin/Cummings Publishing Co., Menlo Park, California, s. 339). Komplement (C) spiller en viktig rolle ved formidling av immunreaksjoner og allergiske reaksjoner (Rapp, H.J. og Borsos, T, 1970, Molecular Basis of Complement Action, Appleton-Century-Crofts (Meredith), New York). Aktivering av komplementkomponentene fører

til dannelsen av en gruppe faktorer, inkludert kjemotaktiske peptider som formidler betennelsen assosiert med komplementavhengige sykdommer. Den sekvensielle akti-veringen av komplementkaskaden kan oppstå via den klassiske reaksjonsveien som omfatter antigen-antistoffkomplekser, eller ved en alternativ reaksjonsvei som omfatter gjenkjenning av visse celleveggpolysakkarider. Aktiviteter formidlet av aktiverte komplementproteiner omfatter lysering av målceller, kjemotaksis, opsonisering, stimulering av vaskulære og andre glatte muskelceller, og funksjonelle avvik så som degranulering av mastceller, øket permeabilitet til små blodkar, ledet migrering av leukocytter, og aktivering av B lymfocytter og makrofager (Eisen, H.N., 1974, Immunology, Harper & Row Publishers, Inc. Hagerstown, Maryland, s. 512).

I løpet av proteolytiske kaskadetrinn blir biologiske aktive peptidfragmenter, anafylatoksinene C3a, C4a og C5a (se WHO Scientific Group, 1977, WHO Tech. Rep. Ser. 606:5 og referanser sitert deri), frigjort fra tredje (C3), fjerde (C4) og femte (C5) native komplementkomponenter (Hugli, T.E., 1981, CRC Crit. Rev. Immunol. 1:321; Bult. H. and Herman, A.G., 1983, Agents Actions 13:405).

2.2. C3b/ C4b komplementreseptor ( CR1)

Humant C3b/C4b reseptor, betegnet CR1, er tilstede på erytrocytter, monocytter/makrofager, granulocytter, B celler, noen T celler, miltfoUikulære dendritiske celler og glomerulære podocytter (Fearon, D.T., 1980, J. Exp. Med. 152:20, Wilson, J.G., et al., 1983, J. Immunol. 131:684; Reynes, M., et al., 1985, J. Immunol.. 135:2687; Gelfand, M.C., et al., 1976, N. Engl. J. Med. 295:10; Kazatchkine, M.D., et al., 1982, Clin. Immunol. Immunopathol. 27:170). CR1 binder spesifikt C3b, C4b og iC3b. En oppløselig form av reseptoren er blitt funnet i plasma som har ligandbindings-aktivitet og samme molekylvekt som membran-assosiert CR1 (Yoon, S.H. og Fearon, D.T., 1985, J. Immunol. 134:3332). CR1 binder C3b og C4b som er kovalentlig bundet til immunkomplekser og andre komplementaktivatorer, og konsekvensene til disse interaksjonene avhenger av celletype som bærer reseptoren (Fearon, D.T. og Wong, W.W., 1983, Ann. Rev. Immunol. 1:243). Erytrocytt CR1 binder immunkomplekser for transport til lever (Cornacoff, J.B., et al., 1983, J. Clin. Invest. 71:236; Medof, M.E., et al., 1982, J. Exp. Med. 156:1739). CR1 på nøytrofiler og monocytter internaliserer bundede komplekser, enten ved adsorberende endocytoser gjennom belagte rom (Fearon, D.T., et al., 1981, J. Exp. Med. 153:1615; Abrahamson, D.R. og Fearon, D.T., 1983, Lab. Invest. 48:162) eller ved fagocytose etter aktivering av reseptoren ved forbolestere, kjemotaktiske peptider eller proteiner som er tilstede i den ekstracellulære matriksen, så som fibronektin og laminin (Newman, S.L., et al., 1980, J. Immunol. 125:2236; Wright, S.D. and Silverstein, S.C., 1982, J. Exp. Med. 156:1149; Wright, S.D., et al., 1983, J. Exp. Med. 158:1338). Fosforylering av CR1 kan spille en rolle i ervervelse av fagocytotisk aktivitet (Changelian, P.S. and Fearon, D.T., 1986, J. Exp. Med. 163:101). Virkningen av CR1 på B lymfocytter er mindre definert, til tross for at behandling av disse cellene med antistoff mot CR1 forsterket deres respons overfor suboptimale doser av kermesbær (pokeweed) mitogen (Daha, M.R., et al., 1983, Immunobiol. 164:227 (Abstr.)). CR1 på follikulære dentrittiske celler kan spille en antigen presenterende rolle (Klaus, G.G.B., et al., 1980, Immunol. Rev. 53:3).

CR1 kan også hemme den klassiske og alternative reaksjonsveien C3/C5 konvertase og virke som en kofaktor for spalting av C3b og C4b ved faktor I, som indikerer at CR1 også har komplementregulatoriske funksjoner i tillegg til å virke som en reseptor (Fearon, D.T., 1979, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 76:5867; lida, K. and Nussenzweig, V., 1981, J. Exp. Med. 153:1138). I den alternative reaksjonsveien til komplementaktiveringen er bimolekylærkompleks C3b,Bb et C3 aktiverende enzym (konvertase). CR1 (og faktor H, ved høyere konsentrasjoner) kan bindes til C3b og kan også fremme dissosiasjon av C3b,Bb. Dannelsen av C3b,CRl (og C3b,H) gjør C3b mottagelig for irreversibel proteolytisk inaktivering ved faktor I, resulterende i dannelsen av inaktivert C3b (iC3b). I den klassiske reaksjonsveien til komplementaktivering er kompleks C4b,2a C3 konvertase. CR1 (og C4 bindingsprotein, C4bp, i høyere konsentrasjoner) kan bindes til C4b, og kan også fremme dissosiasjon av C4b,2a. Bindingen gjør C4b mottagelig for irreversibel proteolytisk inaktivering ved faktor I gjennom spaltning til C4c og C4d (inaktiverte komplementproteiner).

CR1 er et glykoprotein bestående av en enkelt polypeptidkjede. Fire allotypiske former av CR1 er blitt funnet som er forskjellige i størrelser på h-40,000-50,000 dalton molekylvekt. De mest vanlige fonnene, F og S allotypene, også betegnet A og B allotyper, har molekylvekter på 250,000 og 290,000 dalton (Dykman, T.R., et al., 1983, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 80:1698; Wong, W.W, et al., 1983, J. Clin. Invest. 72:685), respektivt, og de to mere sjeldne formene har molekylvekter på 210,000 og >290,000 dalton (Dykman, T.R., et al., 1984, J. Exp. Med. 159:691; Dykman, T.R., et al., 1985, J. Immunol. 134:1787). Disse forskjellene representerer sansynligvis variasjoner i polypeptidkjeden til CR1, og ikke glykosyleringstilstand, p.g.a. at de ikke ble borte ved behandling renset reseptorprotein med endoglykosidase F (Wong, W.W., et al., 1983, J. Clin. Invest. 72:685), og de ble observert når reseptorallotyper ble biosyntetisert i nærvær av tunikamycin (Lublin. D.M., et al., 1986, J. Biol. Chem. 261:5736). Alle fire CR1 allotypene har C3b-bindingsaktivitet (Dykman, T.R. et al., 1983, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 80:1698; Wong, W.W., et al., 1983, J. Clin. Invest. 72:685; Dykman, T.R., et al., 1984, J. Exp. Med. 159:691; Dykman, T.R., et al., 1985, J. Immunol. 134:1787).

To ikke-overlappende restriksjonsfragmenter til et CR1 cDNA ble vist å krysshybridisere under betingelser med høy stringens (Wong, W.W., et al., 1985, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 82:7711). Begge cDNA probene hybridiserer også til multiple restriksjonsfragmenter til genomisk DNA, og det meste var felles for begge probene (id.). Eksistensen av repeterende kodende sekvenser innenfor CR1 ble bekreftet ved sekvenssammenligninger (Klickstein, L.B., et al., 1985, Complement 2:44 (Abstr.)). I tillegg, har CR1 genet blitt vist å ha repeterende intervenerende sekvenser ved demonstrasjon av krysshybridisering av en genomisk probe som mangler kodende sekvenser for flere genomiske restriksjonsfragmenter (Wong, W.W., et al., 1986, J. Exp. Med. 164:1531). DNA fra et individ med større S allotype hadde et ytterligere restrik-sjonsfragment som hybridiserte til denne genomiske proben sammenlignet med DNA fra et individ som F allotype, og dette tyder på at duplikasjon av genomiske sekvenser oppsto i assosiasjon med høyere molekylvekt CR1 allele (id.).

CR1 har blitt vist å ha homologi til komplementreseptortypen 2 (CR2) (Weis, J.J., et al., 1986, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 83:5639-5643).

2.3. Unormaliteter til CR1 i humansvkdom

Redusert ekspresjon av CR1 på erytrocytter fra pasienter med systemisk lupus erythamatosus (SLE) har blitt rapportert av forskere fra flere geografiske regioner, inkludert Japan (Miyakawa et al., 1981, Lancet 2:493-497; Minota et al., 1984, Arthr. Rheum. 27:1329-1335), U.S.A. (lida et al., 1982, J. Exp. Med. 155:1427-1438; Wilson et al., 1982, N. Engl. J. Med. 307:981-986) og Europa (Walport et al., 1985, Clin. Exp. Immunol. 59:547; Jouvin et al., 1986, Complement 3:88-96; Holme et al., 1986, Clin. Exp. Immunol. 63:41-48). Sett på som en gruppe, har pasientene et gjennomsnittlig antall reseptorer pr. celle som er 50-60% i forhold til normale populasjoner. En tidlig rapport beskrev at CR1 antallet på erytrocytter varierte inverst med sykdomsaktiviteten, idet laveste antall oppstår i løpet av perioder med mest alvorlige manifestasjoner av SLE, og høyere antall blir observert i løpet av bedre perioder i samme pasient (lida et al., 1982, J. Exp. Med. 155:1427-1438). CR1 antallet er også blitt funnet å korrelere inverst med serumnivåene til immunkompleksene, med serumnivåene til C3d og med mengdene av erytrocytt-bundet C3dg, som kanskje reflekterer opptaket av komplement-aktiverende immunkomplekser og deposisjon på erytrocytten som et "uskyldig vedheng" (Ross et al., 1985, J. Immunol. 135:2005-2014; Holme et al., 1986, Clin. Exp. Immunol. 63:41-48; Walport et al., 1985, Clin. Exp. Immunol. 59:547). En pasient med SLE som mangler CR1 på erytrocyttene ble funnet åha et auto-antistofF mot CR1 (Wilson et al., 1985, J. Clin. Invest. 76:182-190). Reduserte titere av anti-CRl antistoff falt sammen med forbedring av pasientens kliniske tilstand og med delvis reversering av reseptorunormalitet. Anti-CRl antistoff er blitt detektert i to andre SLE pasienter (Cook et al., 1986, Clin. Immunol. Ltnmunopathol. 38:135-138). Nylig ble ervervet tap av erytrocytt CR1 ved setting av aktiv SLE og hemolytisk anemi demonstrert ved observering av hurtig tap av reseptoren fra transfuserte erytrocytter (Walport et al., 1987, Clin. Exp. Immunol. 69:501-507).

Det relative tapet av CR1 fra erytrocytter er også blitt observert i pasienter med human immunsviktvirus (HIV) infeksjoner (Tausk, F.A., et al., 1986, J. Clin. Invest. 78:977-982) og med lepra lepromatosa (Tausk, F.A., et al., 1985, J. Invest. Dermat. 858:58s-61s).

Unormaliteter ved komplementreseptorekspresjon i SLE er ikke begrenset til erytrocytt CR1. Relative mangler i total cellulær CR1 til nøytrofiler og plasmamembran CR1 til B lymfocytter i SLE pasienter er blitt vist å oppstå (Wilson et al., 1986, Arthr. Rheum. 29:739-747).

I pasienter med type IV SLE nefritt, blir all detekterbar CR1 antigen tapt fra podocytter, mens i mindre alvorlige former av SLE nefritt og i ikke-SLE typer av proliferativ nefritt, inkludert membranprolifererende glomeralonefritt type I og II, er CR1 ekspresjon på glomerulære podocytter ikke forskjellig fra normale (Kazatchkine et al., 1982, J. Clin. Invest. 69:90-912; Emancipator et al., 1983, Clin. Immunol. Immunophatol. 27:170-175). Pasienter med type IV SLE nefritt har derimot ikke færre antall erytrocytt CR1 enn SLE pasienter som har andre typer av renal lupus eller ingen nefritt (Jouvin et al., 1986, Complement 3:88-96).

In vivo komplementaktivering opp-regulerer CR1 ekspresjon i plasmamembranen til neutrofiler (Lee, J., et al., 1984, Clin. Exp. Immunol. 56:205-214; Moore, F.D., Jr., et al., 1986, N. Engl. J. Med. 314:948-953).

3. OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN

Foreliggende oppfinnelse vedrører C3b/C4b reseptor (CR1) gen og dets kodede protein. Oppfinnelsen vedrører også CR1 nukleinsyresekvenser og fragmenter derav og deres kodede peptider eller proteiner. Oppfinnelsen tilveiebringer videre ekspresjon av CR1 proteinet og fragmenter derav. Genene og proteinene ifølge oppfinnelsen anvendes innen diagnostikk og terapi av forstyrrelser omfattende komplementaktivitet, og forskjellige immunsystem eller betennelsesforstyrrelser.

I spesifikke utførelsesformer av foreliggende oppfinnelse beskrevet i eksemplene nedenfor er kloning, nukleotidsekvens og avledet aminosyresekvens til et full-lengde CR1 cDNA og fragmenter derav beskrevet.

Ekspresjon av CR1 protein og fragmenter derav er også beskrevet. Ekspresjon av CR1 proteinet og fragmenter derav som inneholder bindingsseter for C3b og/eller C4b, og som utviser faktor I kofaktoraktivitet, er tilveiebragt.

Også beskrevet i eksemplet nedenfor er fremstilling og rensing av oppløselige CR1 molekyler, der molekylene er vist å være terapeutisk nyttige for behandling av betennelsesreaksjoner og ved reduksjon av myokardialinfarktstørrelsen og forhindring av reperfusjonsskade.

3.1. Definisjoner

Ad2 MLP = adenovirus 2 hovedsenpromoter

C = komplement

C3(ma) = metylamin-behandlet C3

C4bp = C4 bindingsprotein

CMV = cytomegalovirus

CR1 = komplementreseptor type 1, C3b/C4b reseptor

CR2 = komplementreseptor, type 2

DCFDA = diklorfluorescindiacetat

HPLC = høy ytelse væskekromatografi

iC3b = inaktivert C3b

LHR = lang homolog gjentagelse

mAb = monoklonalt antistoff

PAGE = polyakrylamid gelelektroforese

RPAR = revers passiv Arthrus reaksjon

SCR = kort konsensusgjentagelse

sCRl = oppløselig CR1 molekyl

4. BESKRIVELSE AV FIGURENE

Figur 1. Nukleotid og aminosyresekvens til hele CR1 kodende region. Sekvensen begynner med det første nukleotidet etter oktamer EcoRI linker i klon XT 109.1. Nukleotidnummer 1531 i denne sekvens er første nukleotid 5' av nukleotid nr. 1 til sekvensen angitt i fig. 3. Tråden som tilsvarer mRNA er vist, med avledet aminosyresekvens presentert nedenfor. Den antatte signalsekvensen kodet av nukleotidnummerene 28-147 er satt i parentes. Figur 2. Resetriksjonskart av 5.5 kb human CR1 cDNa. Den sorte streken angir cDNA, restriksjonssetene er H, HindTII; B, BamHI; R, EcoRI; P, Pstl; A, Apal; S, SacI; G, Bglll; K, Kpnl. cDNa klonene som sekvensen var avledet fra er vist under kartet. Pilene angir retning og rekkevidde av sekvensanalyse ved

dideoksynukleotidkjedetermineringsmetoden. cDNA klonene var orientert på basis av restriksjonskartene og overlappende sekvensidentitet.

Figur 3. Nukleotidsekvens til 5.5 kb human CR1 cDNA. Tråden tilsvarende mRNA er vist og base nr. 1 (tilsvarende base nr. 1532 i fig. 1) er første base etter EcoRI linker i 5' klonen. Stoppkodonet er understreket. 110-bp sekvensen i boksen var funnet mellom nukleotidene 147 og 148 (pil) og antas å representere en del av en mellomliggende

sekvens.

Figur 4. Dottmatriseanalyse av nukleotidsekvensen til 5.5 kb humant CR1 cDNA. En dott ble plottet dersom det var minst 40 bp av 90 bp match. Den mørke linjen som halverer firkanten diagonalt angir identiteten til selve sekvensen. De to ytterligere parallelle, mørke linjene 1.35 og 2.7 kb fra identitetslinjen representerer to tandem, direkte lange homologe gjentagelser (LHR) på 1,35 kb hver. De seks lysere, stiplede linjene mellom to LHR tilsvarer korte konsensusgjentagelser på ~ 0,2 kb. Korte konsensusgjentagelser (SCR) rekker 0,4 kb forbi de lange homologe gjentagelsene. Figur 5. Utledet aminosyresekvens til humant CR1. Hver rest er vist i enbokstavkoden (Lehninger, A.L., 1975, Biochemistry, 2d Ed., Worfh Publishers, Inc., New York, s. 72). Restene i lange homologe gjentagelser er blitt oppstillt for å illustrere homologien. Alle restene i LHR-B er vist, og en rest er gitt for LHR-C og LHR-D bare der hvor den er forskjellig fra den i LHR-B. En hydropatiprofil er oppstillt under COOH-terminus til proteinet for å illustrere den antatte transmembrane regionen. Et strekk på fire positivt ladede rester rett etter den hydrofobe sekvensen er satt strek over. Seks aminosyresekvens med 67% homologi med et sete til proteinkinase C fosforyleringen i epidermal vekstfaktorreseptor er streket under. Et skjematisk diagram av CR1 proteinet er vist over sekvensen. (TM) transmembranregion, (Cyt) cytoplasmaregion, (3TJT) 3' utranslatert sekvens. Figur 6. (A) Oppstilling av SCR til CR1. Gjentagelsene er nummerert 1-23 fra NH2-terminalen til COOH-terminalen. Opphold er blitt innført for å maksimalisere oppstillingen. Boksene representerer konstante rester og vertikale piler angir posisjoner med aminosyrekonservering. En rest må bli konservert dersom det, eller en konservativ substitusjon, er tilstede i minst halvparten av SCR. Den horisontale pilen angir en SCR som også ble sekvensert fra CR1 genomisk klon 2.38 og blir kodet av et enkelt ekson. (B) Restriksjonskart, sekvenseringsstrategi og delvis sekvens til genomisk klon A, 2.38. Restriksjonssetene er: (B) BamHI, (S) SacI, (E) EcoRV, (K) Kpnl, (P) Pstl. Horisontale pilen angir retning og grad av sekvensering og vertikale piler angir ekson-introngrenser. Figur 7. Oppstilling av konsensussekvens til SCR til proteiner kjent for å ha denne strukturen. Områder ble innført for å maksimalisere oppstillingen. En rest må bli konservert som i fig. 5, med unntagelse for de proteinene som bare har en eller to SCR, der en rest er konservert dersom den er tilstede i minst halvparten av de andre proteinene. Skråstrekene tilsvarer ikke-konserverte posisjoner. Understrekede deler av CR2 og C2b angir at ingen sekvensinformasjon er blitt publisert i denne regionen for disse proteinene. Boksene angir konstante halv-cysteiner. Tallene til høyre av sekvensen representerer antall SCR anvendt for å danne konsensussekvensen. Proteinforkortelsene og referansene for sekvensdata anvendt for å bestemme konsensussekvensene er: (CR1) komplemenreseptortype 1, (H) faktor H (Kristensen, T., et al., 1986, J. Immunol. 136:3407), (C4bp) C4 bindingsprotein (Chung, L.P., et al., 1985, Biochem. J. 230:133), (CR2) komplementreseptortype 2 (Weis, J.J., et al., 1986, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 83:5639), (Ba) proteolytisk fragment til faktor B (Morley, BJ. og Campbell, R.D., 1984, EMBO J. 3:153), (C2b) proteolytisk fragment til C2 (Gagnon, J., 1984, Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sei. 306:301), (Clr) r subenhet til Cl (Leytus, S.P., et al., 1986, Biochemistry 25:4855), (Xlllb) b subenhet til faktor XIII (Ichinose, A., et al., 1986, Biochemistry 25:4633), (J52GP1) B2 glykoprotein I (Lozier, J., et al., 1984, Proe. Nati., Acad. Sei. U.S.A. 81:3640), (Hap) haptoglobin (Kurosky, A., et al., 1980, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 77:3388), (IL-2-R) interleukin-2 reseptor (Leonard, W.J. et al., 1985, Science 230:633). Stjerne angir at ufullstendig sekvens er tilgjengelig. Figur 8. Skjematisk diagram til antatt struktur av humant CR1. COOH-terminal cytoplasmaregion er på høyre side av lipidbilaget. 30 SCR er oppstilt lineært på den ekstracellulære siden av plasmamembranen. Klammene angir LHR. Innskuddet er en forstørring av et enkelt SCR for å illustrere trippelloopstruktur. Figur 9. Restriksjonskart av innskuddet til plastmid, pBSABCD, kodende for humant CR1. Angitt innenfor boksen som angir regionen inneholdende den kodende sekvensen er ni fragmenter av åtte cDNA kloner som ble ligert for å danne CR1 konstruksjonen. Klammene angir posisjonene til hhv. LHR-A, -B, -C og -D. Linjene under boksen representerer posisjonene til nylig isolerte 5' cDNA kloner. Restriksjonssetene er: A, Apal; B, BamHI; G, BglH; H, HindlH; K Kpnl; M, BspMII; P, Pstl; R, EcoRI og S, Sacl. Figur 10. Avledet aminosyresekvens til 5' cDNA kloner kodende for syv SCR til LHR-A, og oppstilling av denne sekvensen med tilsvarende SCR til LHR-B, -C og -D. Fire cysteiner som er konserverte i hver SCR er understreket. En rest er vist for LHR-B, -C og -D bare hvor det er forskjellig fra det i LHR-A. Figur 11. Restriksjonskart til ekspresjonsplamidene, piABCD og pMTABCD. Pmj^jT og PcMV representerer murinmetallotionein og cytomegalovirus "irnmediate early" promotere, respektivt. Figur 12. Analyse ved fasekontrast (panelene a og c) og immunofluorescens (panelene b og d) mikroskopi av COS celler transfektert med piABCD (panelene a og b) og CDM8 vektor alene (panelene c og d), respektivt, og indirekte farget med YZ1 monoklonalt anti-CRl antistoff og fluorescein-merket geite anti-muse F(ab')2-Figur 13. Analyse av C3b- og C4b-binding ved COS celler som uttrykker rekombinant CR1. COS celler transfektert med piABCD (panelene a og c) eller med CDM8 vektor alene (panelene b og d) ble inkubert med EAC4b(lim), 3b (panelene a og b) eller med EAC4b (panelene c og d) og undersøkt for dannelsen av rosetter ved fasekontrastmikroskopi. Figur 14. Analyse av rekombinant CR1 uttrykt ved transfekterte COS celler ved SDS-PAGE. COS celler transfektert med CDM8 vektor alene (kolonnene 1 og 4) og med piABCD (kolonnene 2 og 5), respektivt, og erytrocytter fra et individ som har F og S allotyper av CR1 (kolonnene 3 og 6) ble overflatemerket med ^5j> Detergentlysater av cellene ble sekvensielt immunoadsorbert med Sepharose-UPlO (kolonnene 1-3) og Sepharose-YZl (kolonnene 4-6) og eluatene analysert ved SDS-PAGE under ikke-reduserende betingelser og autoradiografi. Figur 15. Spaltning av ^ l- C3( pm) ved faktor I i nærvær av immunoimmobilisert rekombinant CR1. Replikatprøver av <125>j_c3(ma) ble behandlet med faktor I i nærvær av faktor H (kolonne 1), Sepharose-UPClO preinkubert med lysatet til COS cellene transfektert med CDM8 vektor alene (kolonne 2), Sepharose-UPClO preinkubert med lysatet til piABCD-transfekterte COS celler (kolonne 3), Sepharose-YZl (preinkubert med lysatet til CDM8-transfekterte COS celler (kolonne 4), og 6 ul (kolonne 5), 12 ul (kolonne 6) og 25 ul (kolonne 7) Sepharose-YZl som er blitt preinkubert med lysatet til piABCD-transfekterte COS celler. Prøver av ^ I- merket C3(ma) ble også behandlet i fravær av faktor I med 25 ul Sepharose-YZl som er blitt preinkubert med lysatet til piABCD-transfekterte COS celler (kolonne 8). Etter reduksjon ble <125>I-C3(ma) analysert ved SCS-PAGE og autoradiografi. Figur 16. cDNA konstruksjoner kodende for CR1 delesjonsmutanter. Posisjonene til cDNA segmentene kodende for fire LHR er angitt med klammer over full-lengde piABCD konstruksjon hvor restriksjonsseter anvendt for preparering av delesjonsmutantene er vist. cDNA restriksjonsfragmentene som forblir i hver av mutantene er angitt med hele linjer. Restriksjonssetene er: A, Apal; B, Bsml; E, BstEII; og P, Pstl. Figur 17. Sammenligning av rekombinant delesjonsmutanter til CR1 med vildtype F og S allotyper til CR1. Detergentlysater av ^<S>i.ovej-lfatemerkede erytrocytter (kolonnene 1 og 7) og COS celler transfektert med CDM8 vektor alene (kolonnene 2 og 8), piABCD (kolonnene 3 og 9), piBCD (kolonnene 4 og 10), piCD (kolonnene 5 og 11) og piD (kolonnene 6 og 12), respektivt, ble immunpresipitert med Sepharose-UPClO anti-levanantistoff (kolonnene 1-6), Sepharose-YZ-1 anti-CRl monoklonalt antistoff (kolonnene 7-11) og kanin anti-CRl antistoff og Sepharose-protein A (kolonne 12), respektivt. Eluatene ble utsatt for SDS-PAGE under reduserende betingelser og autoradiografi. Figur 18. Spaltning av ^ 1- C3( vai) ved faktor I i nærvær av COS celler som uttrykker full lengde og delesjonsmutanter til CR1. Replikatprøver av <*25>i_C3(ma) ble inkubert med COS celler transfektert med CDM8 vektor alene (kolonnene 1 og 7), piABCD (kolonnene 2 og 8), piAD (kolonnene 3 og 9), piBD (kolonnene 4 og 10), piCD (kolonnene 5 og 11) og piD (kolonnene 6 og 12), respektivt, i fravær (kolonnene 1-6) eller nærvær (kolonnene 7-12) av faktor I. Prøver av <125>i_£3(ma) ble også inkubert med faktor H og faktor I (kolonne 13) og med faktor I alene (kolonne 14), respektivt. Etter reduksjon ble <125>j_c3(ma) analysert ved SDS-PAGE og autoradiografi. Figur 19. Skjematisk modell som viser typer av SCR omfattende hver LHR til CR1, og antatte seter som bestemmer spesifisitetene til reseptoren for C3b og C4b. Sekundære bindingsspesifisiteter til disse er angitt av parentesene. Figur 20. Et skjematisk diagram som illustrerer DNA regionene som forblir i oppløselige CR1 DNA konstruksjoner. Regioner med full-lengde CR1 cDNA er angitt ved boksene langs toppen av figuren. Figur 21. Et skjematisk diagram som illustrerer hovedelementene i pTCS seriene til ekspresj onsvektorer. Figur 22. Et diagram av ekspresjonsvektor PTCSgpt. Polyadenyleringssetet er fra murine lg kappasekvenser (NBRF nukleindatabaseaksessjon #Kcms, bp 1306-1714); Ad2 MLP og tripartittregioner er fra Ad2 sekvensen (NBRF nukleindatabaseaksessjon #Gdad2, bp 5791-6069); SV40 tidligpromoter er fra SV40 genomet (NBRF nukleindatabaseaksessjon $GSV40W). gpt genet, ampicillingenet og bakteriell replikasjonsorigo er fra vektor pSV2gpt (ATCC aksessjonsnr. 37145). Figur 23. 4-20% SDS-PAGE av antistofFafifnitetsrenset sCRl. Dcke-reduserende (kolonnene 1,2,3) og reduserende (kolonnene 4, 5,6) betingelser. Kolonnene 1,3: molekylvektsmarkører; kolonnene 3, 5: cellekultursupernatantutgangsmateriale; kolonnene 4,6: sCRl renset ved antistoffaffinitetskromatografi. Figur 24. Kationutbytte HPLC elueringsprofil. Eluert protein ble registrert ved absorbans ved 280 nm (y-akse). Absorbans av både gjennomstrømning (0-100 minutter) og eluert sCRl (150-165 minutter) var begge utenfor skala, x-aksen representerer elueringstid i minutter. Figur 25. 4-20% gradient SDS-PAGE av kation og anionbytte HPLC renset sCRl. SDS-polyakrylamidgeler ble kjørt under ikke-reduserende betingelser. Kolonne 1, en alikvot av bioreaktorsupernatant; kolonne 2, en alikvot av bioreaktorsupernatant dialysert mot kation HPLC utgangsbuffer; kolonne 3, en alikvot av eluert sCRl topp fra en kationbytte HPLC kolonne; kolonne 4, en alikvot av sCRl topp fra kationbytte HPLC kolonne dialysert inn i utgangsbuffer for anion HPLC; kolonnene 5 og 6, alikvoter av to forskjellige fraksjoner av eluert sCRl fra anion HPLC. Figur 26. C5a induksjon av en oksygenutbrudd i humane neutrofiler. Etter et C5a indusert oksygenutbrudd ble DCFDA oksydert og sterkt fluorescert. Fluorescensintensitet, bestemt ved flowcytometri, ble målt på x-aksen og antall celler på y-aksen. Panel a, profil og fil for cellene; panel b, 0 minutter etter C5a tilsetning; panel c, 1 minutt; panel d, 2 minutter; panel e, 3 minutter; panel f, 4 minutter; panel g, 20 minutter. Denne DCFDA analysen gir en sensitiv indikasjon på C5a. Figur 27. Aktivering av human komplement i nærvær av sCRl viser redusert C5a aktivitet i DCFDA analysen. Panel a, ustimulerte celler; panel b, kontroll uten sCRl som viser en høy grad av fluorescens; panel c, DCFDA analyse i nærvær av sCRl viser en reduksjon på 75% i fluorescensintensitet. y-akse er antall celler og x-akse er fluorescensintensitet. Figur 28. Hemming av klassisk reaksjonsvei C5a og C3a produksjon i humant serum ved sCRl. Lignende profiler ble observert for enten antistoffafifnitetsrenset eller HPLC renset sCRl. Figur 29. Inhibisjon av komplement-mediert hemolyse ved rekombinant sCRl. Lignende profiler ble observert for antistofFafflnitetrenset eller HPLC renset sCRl. Figur 30. Grov morfologi er RPAR i sCRl-behandlede (venstre) og ubehandlede (høyre) rotter, (a) Begge rotten mottok en intravenøs injeksjon av ovalbumin, etterfulgt av en intradermal injeksjon av en blanding av enten sCRl (venstre rotte) eller PBS (høyre rotte) med anti-ovalbumin, ren (venstre sted); anti-ovalbumin, 1/2 fortynning (middelsted) eller kanin IgG (høyre sted). Injeksjonene ble utført dobbelt; topp- og bunnrekker ga identiske resultater. Rottene som mottok sCRl hadde såvidt synlige forandringer, mens ubehandlede rotter utviklet fullstendige symptomer på RPAR. (b) Dermaloverflaten til hudbiopsier fra (a). Biopsi fra ubehandlet rotte (høyre) utviklet klart synlige lesjon, mens biopsi fra sCRl-behandlet rotte (venstre) viste normal morfologi. Figur 31. Lysmikroskopi av hudbiopsier fra sCRl-behandlede (a) og ubehandlede (b) rotter. (a) Perivaskulær akkumulasjon av polymorfonukleære og mononukleære celler ble observert, men ingen omfattende infiltrasjon av nøytrofiler eller ekstravasasjon av erytrocytter ble oppdaget, (b) Omfattende infiltrasjon av polymorfonukleære celler og ekstravasasjon av erytrocytter ble identifisert.

5. DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

Foreliggende oppfinnelse vedrører C3b/C4b reseptor (CR1) genet og dets kodede protein. Oppfinnelsen er også rettet mot CR1 nukleinsyresekvenser og fragmenter derav og deres kodede peptider eller proteiner. Oppfinnelsen tilveiebringer videre ekspresjon av CR1 proteinet og fragmenter derav. Slike CR1 sekvenser og proteiner har verdi ved diagnostikk og terapi av betennelsesforstyrrelser eller immunsystemforstyrrelser, og forstyrrelser som omfatter komplementaktivitet.

I en spesifikk utførelseform vedrører oppfinnelsen oppløselige CR1 molekyler og ekspresjon, rensing og anvendelser derav. Som anvendt heri betyr betegnelsen "oppløselige CR1 molekyler" deler av CR1 proteinet som, i kontrast til de native CR1 proteinene, ikke blir uttrykt på celleoverflaten som membranproteiner. Som et spesielt eksempel, er CR1 molekyler som vesentlig mangler en transmembranregion oppløselige CR1 molekyler. I en foretrukket utførelsesform blir oppløselige CR1 molekyler utskilt av en celle hvor de blir uttrykt.

I spesifikke utførelsesformer av foreliggende oppfinnelse forklart i eksempelseksjonene nedenfor, er kloning og fullstendig nukleotid og utledet aminosyresekvens til full-lengde CR1 cDNA, og av fragmenter derav, og ekspresjon av kodede CR1 produkter, beskrevet. Ekspresjon av CR1 og fragmenter derav, med bindingsseter for C3b og/eller C4b, og som hemmer faktor I kofaktoraktivitet, er også beskrevet. Oppfinnelsen er videre illustrert ved produksjon og rensing av oppløselige, forkortede CR1 molekyler. I spesifikke eksempler har slike molekyler demonstrert å være terapeutisk nyttige ved redusering av betennelse, og ved redusering av hjerteinfarktstørrelse og forhindring av reperfusjonsskade.

5.1. Isolasjon av CR1 genet

Den fullstendige kodende sekvensen til CR1 genet og dets avledede aminosyresekvens er presentert i fig. 1.

En hvilken som helst human celle kan potensielt virke som nukleinsyrekilde for molekylær kloning av CR1 genet. Isolering av CR1 genet omfatter isolering av de DNA sekvensene som koder for et protein som utviser CR1-assosiert struktur eller egenskaper, f.eks. binding av C3b eller C4b eller immunkomplekser, modulerende fagocytose, immunstimulering eller proliferasjon, og regulering av komplement. DNA kan bli tilveiebragt ved standard prosedyrer kjent innenfor fagområdet fira klonet DNA (f.eks. et DNA "bibliotek"), ved kjemisk syntese, ved cDNA kloning eller ved kloning av genomisk DNA, eller fragmenter derav, renset fra ønsket human celle. (Se f.eks. Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York; Glover, D.M. (ed.), 1985, DNA Cloning: A Practical Approach, MRL Press, Ltd., Oxford, U.K., Vol. I, II.) Celler som kan virke som kilder for nukleinsyre for cDNA kloning av CR1 genet omfatter, men er ikke begrenset til monocytter/makrofager, granulocytter, B celler, T celler, miltfollikulære dendritiske celler og glomerulære podocytter. Kloner avledet fra genomisk DNA kan inneholde regulatoriske og intron DNA regioner i tillegg til kodende regioner; kloner avledet fra cDNA vil bare inneholde eksonsekvenser. Hvilken som helst kilde som anvendes bør CR1 genet bli molekylært klonet inn i en egnet vektor for propagering av genet.

Ved molekylær kloning av genet fra genomisk DNA blir DNA fragmenter dannet, hvor noen vil kode for det ønskede CR1 genet. DNA kan bli spaltet ved spesifikke seter ved anvendelse av forskjellige restriksjonsenzymer. Alternativt kan man anvende DNAse i nærvær av mangan for å fragmentere DNA, eller DNA kan bli fysisk spaltet, som f.eks. ved sonikering. De lineære DNA fragmentene kan deretter bli separert etter størrelse ved standard teknikker, inkludert men ikke begrenset til, agarose og polyakrylamidgelektroforese og kolonnekromatografi.

Når DNA fragmentene er blitt dannet, kan identifikasjon av det spesifikke DNA fragmentet inneholdende CR1 genet bli oppnådd på et antall måter. F.eks., dersom en mengde av et CR1 gen eller dets spesifikke RNA, eller et fragment derav, er tilgjengelig og kan bli renset og merket, kan de dannede DNA fragmentene bli screenet ved nukleinsyrehybridisering til den merkede proben (Benton, W. og Davis, R., 1977, Science 196:180; Grunstein, M. og Hogness, D., 1975, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 72:3961). De DNA fragmentene med vesentlig homologi med proben vil hybridisere. Dersom en renset CR1 -spesifikk probe ikke er tilgjengelig kan nukleinsyrefraksjoner anriket i CR1 bli anvendt som en probe, som en begynnende seleksjonsprosedyre. Som et eksempel kan proben representerende B celle cDNA der beskjeder uttrykt av fibroblaster er blitt subtrahert bli anvendt. Det er også mulig å identifisere det hensiktsmessige fragmentet ved restriksjonsenzymspaltning(er) og sammenligning av fragmentstørrelser med de som ventes ifølge et kjent restriksjonskart, dersom dette er tilgjengelig. Seleksjon på grunnlag av egenskapene til genet, eller fysiske, kjemiske eller immunologiske egenskaper til det uttrykte produktet derav, som beskrevet nedenfor, kan bli anvendt etter den opprinnelige seleksjonen.

CR1 genet kan også bli identifisert ved mRNA seleksjon ved nukleinsyrehybridisering etterfulgt av in vitro translasjon. I denne prosedyren blir fragmenter anvendt for å isolere komplementære mRNA ved hybridisering. Slike DNA fragmenter kan representere tilgjengelig, renset CR1 DNA eller DNA som er blitt anriket for CR1 sekvenser.

Immunopresipitasjonsanalyse eller funksjonelle analyser (f.eks., for C3b eller C4b binding, eller fremming av fagocytose eller immunstimulering, eller komplementregulering osv.) av in vitro translasjonsprodukter til isolert mRNA identifiserer mRNA og derfor komplementære DNA fragmenter som inneholder CR1 sekvenser. I tillegg kan spesifikk mRNA bli selektert ved adsorbsjon av polysomer isolert fra celler til immobiliserte antistoff spesifikt rettet mot CR1. Et radiomerket CR1 cDNA kan bli syntetisert ved anvendelse av valgte mRNA (fra adsorberte polysomer) som et templat. Radiomerket mRNA eller cDNA kan deretter bli anvendt som en probe for å identifisere CR1 DNA fragmenter fra andre genomiske DNA fragmenter. Alternativer for isolering av CR1 genomisk DNA omfatter, men er ikke begrenset til, kjemisk syntetisering av selve gensekvensen fra en kjent sekvens eller dannelse av cDNA til mRNA som koder for CR1 genet. F.eks., som beskrevet ovenfor, RNA for cDNA kloning av CR1 genet kan bli isolert fra celler inkludert, men ikke begrenset til monocytter/makrofager, granulocytter, B celler, T celler, dentrittiske celler og podocytter. I en foretrukket utførelsesform kan tonisilarceller virke som kilde for mRNA for cDNA kloning (se seksjon 6.1.2., nedenfor). Andre fremgangsmåter er mulig og innenfor rammen av oppfinnelsen.

Det identifiserte og isolerte genet kan deretter bli skutt inn i en hensiktsmessig kloningsvektor. Et stort antall vektor-vertssystemer kjent innenfor fagområdet kan bli anvendt. Mulige vektorer omfatter, men er ikke begrenset til, plasmider eller modifiserte virus, men vektorsystemet må være kompatibelt med anvendte vertscelle. Slike vektorer omfatter, men er ikke begrenset til, bakteriofager så som lambdaderivater, eller plasmider så som pBR322 eller pUC plasmid eller CDM8 plasmid (Seed, B., 1987, Nature 329:840-842) eller derivater. Rekombinante molekyler kan bli introdusert inn i vertsceller via transformasjon, transfeksjon, infeksjon, elektroporasjon osv.

I en alternativ fremgangsmåte kan CR1 genet bli identifisert og isolert etter innskudd inn i en egnet kloningsvektor, i en "shot gun" tilnærmelse. Anrikning for CR1 genet, f.eks., ved størrelsesfraksjonering, kan bli utført før innskudd inn i kloningsvektoren.

CR1 genet blir skutt inn i en kloningsvektor som kan bli anvendt for å transformere, transfektere eller infisere hensiktsmessige vertsceller slik at mange kopier av gensekvensene blir dannet. I en spesifikk utførelsesform kan kloningsvektoren være CDM8 vektoren, som kan bli anvendt for å oppnå ekspresjon i en pattedyrvertscelle. Innskudd inn i en kloningsvektor kan f.eks. oppnås ved ligering av DNA fragmentet inn i en kloningsvektor som har komplementære kohesive termini. Dersom komplementære restriksjonsseter anvendt for å spalte DNA ikke er tilstede i kloningsvektoren, kan endene til DNA molekylene bli modifisert enzymatisk. Alternativt kan et hvilket som helst sete som er ønsket bli dannet ved ligering av nukleotidsekvenser (linkere) til DNA termini og disse ligerte linkerene kan omfatte spesifikke kjemisk syntetiserte oligonukleotider som koder for restriksjonsendonukleasegjenkjenningssekvenser. I en alternativ fremgangsmåte kan den spaltede vektoren og CR1 genet bli modifisert ved homopolymerisk haledannelse.

Identifikasjon av det klonede CR1 genet kan oppnås på et antall måter basert på egenskapene til selve DNA, eller alternativt, på fysiske, immunologiske eller funksjonelle egenskaper til dets kodede protein. F.eks. kan selve DNA bli detektert ved plaque eller kolonmukleinsyrehybridisering til merkede prober (Benton, W. og Davis. R., 1977, Science 196:180; Grunstein, M. ogHogness, D., 1975, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 72:3961). Alternativt kan tilstedeværelse av CR1 genet bli påvist ved analyser basert på egenskapene til det uttrykte produktet. F.eks. kan cDNA kloner, eller DNA kloner som hybrid-selekterer riktige mRNA, bli valgt som produserer et protein som f.eks. har lignende eller identisk elektroforetisk migrering, isoelektrisk fokuseringsadferd, proteolytiske spaltningskart, C3b og/eller C4b og/eller immunkompleksbmdingsaktivitet, komplementregulatorisk aktivitet, virkning på fagocytose eller irnmunstimulering, eller antigene egenskaper som er kjent for CR1. Ved anvendelse av et antistoff mot CR1 kan CR1 proteinet bli identifisert ved binding av merket antistoff til antatte CR1-syntetiserende kloner, i en ELISA (enzym-bundet immunosorbent analyse)-typeprosedyre.

I spesifikke utførelsesformer muliggjør transformasjon av vertsceller med rekombinante DNA molekyler som inkorporerer det isolerte CR1 genet, cDNA, eller syntetisert DNA sekvens dannelsen av multiple kopier av genet. Genet kan dermed bli oppnådd i store mengder ved dyrking av transformanter, isolering av rekombinante DNA molekyler fra transformantene og, når nødvendig, oppnåelse av det innskutte genet fra isolert rekombinant DNA.

I en spesiell utførelsesform kan CR1 cDNA kloner i en CDM8 vektor bli transfektert inn i COS (apenyre) celler for ekspresjon i stor skala under kontroll av cytomegaloviruspromoter (se seksjon 8, nedenfor).

Dersom målet er å sette genet inn i virusekspresjonsvektorer så som vaccinia virus eller adenovirus, kan rekombinant DNA molekyl som inkorporerer CR1 genet bli modifisert slik at genet er flankert av virussekvenser som muliggjør genetisk rekombinasjon i celler infisert med viruset slik at genet kan bli satt inn i det virale genomet.

Etter at CR1 DNA-inneholdende klon er blitt identifisert, dyrket og høstet, kan dets DNA innskudd bli karakterisert som beskrevet i seksjon 5.4.1, nedenfor.

Når den genetiske strukturen til CR1 genet er kjent er det mulig å manipulere strukturen for optimal anvendelse i foreliggende oppfinnelse. F.eks. kan promoter DNA bli ligert 5' for CR1 kodende sekvens, i tillegg til eller erstatning av den native promoteren for å

tilveiebringe øket ekspresjon av proteinet. Ekspresjonsvektorer som uttrykker CR1 delesjonsmutanter kan også bli dannet, for å tilveiebringe ekspresjon av definerte fragmenter

av CR1 sekvensen (se eksempelseksjonene, nedenfor). I en spesiell utførelsesform kan delesjonsmutanter bli konstruert som koder for fragmenter av CR1 proteinet som utviser ønsket C3b og/eller C4b bindingsaktivitet (se seksjon 9, nedenfor), f.eks. LHR-A for binding av C4b, eller LHR-C for binding av C3b. I en foretrukket utførelsesform kan en ekspresjonsvektor som koder for et CR1 molekyl med en delesjon av transmembranregionen bli anvendt for å fremstille et oppløselig CR1 molekyl (se eksempelseksjonene 11-14, nedenfor). Mange manipulasjoner er mulig og er innenfor rammen av foreliggende oppfinnelse.

Foreliggende oppfinnele omfatter en nukleinsyresekvens kjennetegnet ved at den koder for et CR1 protein ifølge krav 1.

5.2. Ekspresjon av det klonede CR1 genet

Nukleotidsekvensen kodende for CR1 proteinet (fig. 1) eller en del derav, kan bli skutt inn i en hensiktsmessig ekspresjonsvektor, dvs. en vektor som inneholder de nødvendige elementene for transkripsjon og translasjon av den innskutte protein-kodende sekvensen. Nødvendige transkripsjonene og translasjonelle signaler kan også bli tilført fra nativt CR1 gen og/eller dets flankerende regioner. Forskjellige vert-vektorsystemer kan bli anvendt for å uttrykke protein-kodende sekvens. Disse omfatter, men er ikke begrenset til pattedyrcellesystemer infisert med virus (f.eks. vaccinia virus, adenovirus, osv.); insektcellesystemer infisert med virus (f.eks. baculovirus); mikroorganismer så som gjær inneholdende gjærvektorer, eller bakterier transformert med bakteriofag DNA, plasmid DNA eller kosmid DNA. Ekspresjons-elementene til disse vektorene varierer i styrke og spesifisitet. Avhengig av vert-vektorsystemet som blir anvendt kan hvilke som helst av et antall egnede transkripsjons- og translasjonselementer bli anvendt. F.eks. ved kloning i pattedyrcellesystemer kan promotere isolert fra genomet til pattedyrceller eller fra virus som vokser i disse cellene (f.eks., adenovirus, simiannvirus 40, cytomegalovirus) bli anvendt. Promotere produert ved rekombinant DNA eller syntetiske teknikker kan også bli anvendt for å tilveiebringe transkripsjon av innskutte sekvenser.

Spesifikke initieringssignaler er også nødvendig for effektiv translasjon av innskutte proteinkodende sekvenser. Disse signalene inkluderer ATG initieringskodon og ved siden av liggende sekvenser. I tilfeller hvor hele CR1 genet inkludert dets eget initieringskodon og ved siden av liggende sekvenser blir skutt inn i hensiktsmessige ekspresjonsvektorer er det ikke nødvendig med ytterligere translasjonskontrollsignaler. I de tilfellene hvor bare en del av CR1 kodende sekvensen blir skutt inn må eksogene translasjonskontrollsignaler, inkludert ATG initieringskodon, bli tilveiebragt. Initie-ringskodonet må derfor være i fase med leser ammen til proteinkodende sekvenser for å forsikre translasjon av hele innskuddet. Disse eksogene translasjonskontroUsignalene og initeringskodonene kan ha forskjellige opprinnelser, både naturlige og syntetiske.

Hvilke som helst av fremgangsmåtene tidligere beskrevet for innskudd av DNA fragmenter inn i en vektor kan bli anvendt for å konstruere ekspresjonsvektor inneholdende et chimerisk gen bestående av hensiktsmessige transkripsjonelle/translasjonelle kontrollsignaler og proteinkodende sekvenser. Disse fremgangsmåtene kan omfatte in vitro rekombinant DNA og syntetiske teknikker og in vivo rekombinasjoner (genetisk rekombinasjon).

I en spesifikk utførelsesform kan et oppløselig CR1 molekyl bli uttrykt. Et slikt oppløselig molekyl kan bli produsert ved anvendelse av rekombinante DNA teknikker for å deletere DNA sekvenser kodende for CR1 transmembranregion (se seksjonene 11-14, nedenfor). Som demonstrert nedenfor er evnen til å uttrykke et oppløselige CR1 molekyl ikke begrenset til en enkelt genetisk modifikasjon av CR1 nukleinsyresekvensen, dersom nukleinsyresekvensen kodende for en vesentlig del av CR1 transmembranregionen blir deletert, kan oppløselige CR1 konstruksjoner bli oppnådd.

Ekspresjonsvektorer inneholdende CR1 innskudd kan bli identifisert ved tre generelle tilnærmelser: (a) DNA-DNA hybridisering, (b) tilstedeværelse eller fråvær av "markør" genfunksjoner og (c) ekspresjon av innskutte sekvenser. I den første tilnærmelsen kan tilstedeværelse av et fremmed geninnskudd i en ekspresjonsvektor bli påvist ved DNA-DNA hybridisering ved anvendelse av prober omfattende sekvenser som er homologe med det innskutte CR1 genet. I den andre tilnærmelsen kan rekombinant vektor/vertssystem bli identifisert og selektert basert på tilstedeværelse eller fravær av visse "markør" gerifunksjoner (f.eks. tymidinkinaseaktivitet, resistens overfor antibiotika, transformasjonfenotype, okklusjonslegemedannelse i baculovirus osv.) forårsaket av innskudd av fremmede gener inn i vektoren. F.eks., dersom CR1 genet blir skutt inn i markørgensekvensen til vektoren kan rekombinanter inneholdende CR1 innskudd bli identifisert ved fråvær av markørgenfunksjon. I den tredje tilnærmelsen kan rekombinante ekspresjonsvektorer bli identifisert ved analysering av det fremmede genproduktet uttrykt av rekombinanten. Slike analyser kan være basert på fysiske, immunologiske eller funksjonelle egenskaper til genproduktet. Når et bestemt rekombinant DNA molekyl er identifisert og isolert kan flere fremgangsmåter kjent innenfor fagområdet bli anvendt for å propagere det. Når et egnet vertssystem og vekstbetingelser er etablert, kan rekombinante ekspresjonsvektorer bli propagert og preparert i mengder.

I en spesiell utførelsesform angitt i eksemplene i foreliggende oppfinnelse kan CDM8 vektorer med et CR1 cDNA innskudd bli transfektert inn i COS celler der CR1 cDNA

innskuddet blir uttrykt for å produsere CR1 protein. I andre spesielle utførelsesformer angitt i eksempelseksjonene nedenfor, kan CDM8 vektorer med et CR1 cDNA innskudd tilsvarende en del av CR1 kodende regionene bli transfektert inn i COS celler, hvor CR1 eller fragmentet blir uttrykt. I et ytterligere eksempel angitt nedenfor kan forkortede, oppløselige CR1 molekyler bli uttrykt i pattedyrceller ved anvendelse av ekspresjonsvektorer så som pTCS vektorer beskrevet i seksjon 11.3.1. Som tidligere forklart omfatter ekspresjonsvektorene som kan bli anvendt, men er ikke begrenset til, følgende vektorer og derivater derav: humane eller dyrevirus så som vacciniavirus eller adenovirus, insektviruser så såbaculovirus, gjærvektorer, bakteriofagvektorer (f.eks. lambda), og plasmid og kosmid DNA vektorer, for å nevne noen.

I tillegg, kan en vertscellestamme bli valgt som modulerer ekspresjonen av innskutte sekvenser, eller modifiserer og prosesserer det kimeriske genproduktet på en ønsket måte. Ekspresjon fra visse promotere kan bli forhøyet i nærvær av visse indusere, og ekspresjonen av genetisk omkonstruert CR1 proteinet kan bli kontrollert. Forskjellige vertsceller har karakteristiske og spesifikke mekanismer for translasjons- og etter-translasjons prosessering og modifikasjon av proteiner. Hensiktsmessige cellelinjer eller vertssystemer kan bli valgt for å forsikre ønsket modikasjon og prosessering av uttrykt heterologt protein. I en utførelsesform kan f.eks. ekspresjon i et bakterielt system bli anvendt for åprodusere et uglykosylert CR1 protein med den utledede

aminosyresekvensen i fig. 1. Ekspresjon i gjær vil produsere et glykosylert produkt. I en annen utførelsesform kan pattedyr COS celler bli anvendt for forsikre "nativ"

glykosylering av heterologt CR1 protein. Forskjellige vektor/vertsekspresjonssystemer kan videre tilveiebringe prosesseringsreaksjoner så som proteolytiske spaltninger i forskjellige grader. Mange slike forskjellige prosesserte CR1 proteiner kan bli produsert og er innenfor rammen av foreliggende oppfinnelse.

Foreliggende oppfinnelse vedrører en rekombinant celle som er kjennetegnet vd at den uttrykker proteinet ifølge krav 1, som omfatter en ekspresjonsvektor som omfatter en nukleinsyresekvens som koder for et protein som har en aminosyresekvens vesentlig som vist i figur 1, eller et fragment derav som mangler en transmembran region og utviser en komplementregulatorisk aktivitet av full-lengde CR1 for diagnostisk anvendelse.

I en foretrukket utførelsesform kan storskala produksjon av oppløselige CR1 molekyler bli utført som beskrevet nedenfor i seksjon 12.1 et seq.

5.3. Identifikasjon og rensing av uttrykt <g>enprodukt

Når en rekombinant som uttrykker CR1 genet er identifisert bør genproduktet bli analysert. Dette kan bli oppnådd ved analyser basert på fysiske, immunologiske eller funksjonelle egenskaper til produktet.

CR1 proteinene kan bli isolert og renset ved standardmetoder omfattende kromatografi (f.eks. ionebytte-, affinitets- og størrelseskolonnekromatografi, høytrykks væskekromatografi), sentrifugering, difFerensialoppløselighet eller ved annen standard teknikk for rensing av proteiner.

Foreliggende oppfinnelse omfatter en fremgangsmåte for å rense et oppløselig CR1 protein ifølge et hvilket som helst av kravene 1,3,4 eller 5, kjennetegnet ved at den omfatter: (a) uttrykking av CR1 -proteinet i en celle i kultur slik at CRl-proteinet blir utskilt; (b) oppnåelse av en prøve av cellekulturfluidet omfattende det oppløselige CR1

proteinet;

(c) utsette prøven for kationbyttekromatografi; og

(d) eluering av det oppløselige CR1 -proteinet fra kation-byttekromatografimatriksen.

I et foretrukket aspekt, angitt i eksemplene nedenfor, kan store mengder oppløselig CR1 bli renset ved prosedyrer omfattende HPLC (se seksjon 12.2 et seq.). Som beskrevet nedenfor, kan storskala produksjon av renset av CR1 bli oppnådd ved anvendelse av et ekspresjonssystem som produserer oppløselig CR1 som utgangsmateriale og som dermed eliminerer nødvendigheten av oppløsing av membran-bundet CR1 med detergenter. Reduksjon av fetalt kalveserumkonsentrasjoner i bioreaktorkulturer og/eller anvendelse av alternative kulturmedier i disse kulturene eliminerer nødvendigheten av å fjerne høye konsentrasjoner av ytre proteiner fra oppløselig CR1-inneholdende utgangsmaterialet i løpet av påfølgende rensing. Enten kation HPLC eller en kombinasjon av kation HPLC etterfulgt av anionbytte HPLC kan bli anvendt for rensing i dette foretrukne aspektet. Vesentlig ren oppløselig CR1 i høyt utbytte kan dermed bli oppnådd i bare ett eller to trinn.

Alternativt, når et CR1 protein produsert av en rekombinant er identifisert, kan aminosyresekvensen til proteinet bli avledet fra nukleotidsekvensen til det kimeriske genet innbefattet i rekombinanten. Som et resultat kan proteinet bli syntetisert ved standard kjemiske metoder kjent innenfor fagområdet (f.eks. se Hunkapiller, M., et al., 1984, Nature 310:105-111).

Foreliggende oppfinnelse vedrører et isolert CR1 protein for diagnostisk anvendelse in vitro, kjennetegnet ved at det omfatter aminosyresekvensen som angitt i figur 1, eller et fragment derav som mangler en transmembranregion og som utviser en komplementregulatorisk aktivitet til full-lengde CR1.

Oppfinnelsen vedrører videre et protein for diagnostisk anvendelse in vitro, kjennetegnet ved at det omfatter en aminosyresekvens som kodet av en nukleinsyresekvens som vist i figur 1 fra nukleotid nr. 28 til og med nukleotid nr. 1533, i det nevnte protein mangler en transmembranregion og utviser en komplementregulatorisk aktivitet i full-lengde CR1.

Oppfinnelsen omfatter også et CR1 protein for diagnostisk anvendelse in vitro, kjennetegnet ved at det omfatter minst ett fragment av aminosyresekvensen angitt i figur 1, hvori nevnte protein mangler en transmembranregion, i det nevnte protein blir utskilt av en celle hvor den blir uttrykt, og nevnte protein er uglykosylert eller glykosylert og utviser en komplementregulatorisk aktivitet til full-lengde CR1.

I bestemte utførelsesformer, slike CR1 proteiner, enten de blir fremstilt ved rekombinante DNA teknikker eller ved kjemiske syntetiske fremgangsmåter, inkluderer, men er ikke begrenset til de som inneholder, som en primær aminosyresekvens, hele eller del av aminosyresekvensen vesentlig som angitt i fig. 1, inkludert endrede sekvenser der funksjonelt ekvivalente aminosyrerester er substituert for rester innenfor sekvensen som resulterer i en stille forandring. F.eks. kan en eller flere aminosyrerester innenfor sekvensen bli substituert med en annen aminosyre med lignende polaritet som virker som en funksjonell ekvivalent, resulterende i en stille forandring. Dcke-konservative substitusjoner kan også resultere i funksjonelt ekvivalente proteiner.

I en utførelsesform kan substitutter for en aminosyre innenfor CR1 sekvensen bli selektert fra andre medlemmer av klassen som aminosyren hører til. Upolare (hydrofobiske) aminosyre omfatter alanin, leucin, isoleucin, valin, prolin, fenylalanin, tryptofan og metionin. Polare nøytrale aminosyrer omfatter glycin, serin, treonin, cystein, tyrosin, asparagin og glutamin. Positivt ladede (basiske) aminosyrer omfatter arginin, lysin og histidin. Negativt ladede (sure) aminosyrer omfatter asparaginsyre og glutaminsyre. Også innbefattet innenfor rammen av oppfinnelsen er CR1 proteiner som blir differensielt modifisert i løpet av eller etter translasjon, f.eks. glykosylering, proteolytisk spaltning osv.

I et eksempel angitt nedenfor ble klonet rekombinant CR1 uttrykt av transfekterte celler vist å ikke kunne sjeldnes fra F allotypen til erytrocytter ved SDS-PAGE (fig. 14), som har evne til å formidle binding av saueerytrocytter som bærer enten C4b eller C3b, og som kan reprodusere ligandspesifisiteten til CR1 (fig. 13), og utvise faktor I kofaktoraktivitet for spaltning av alfapolypeptidet til C3(ma) (fig. 15).

5.4. Struktur av CR1 genet og proteinet

Struktur av CR1 genet og proteinet kan bli analysert ved forskjellige kjente fremgangsmåter innenfor fagområdet, inkludert, men ikke begrenset til de som er beskrevet nedenfor.

5.4.1. Genetisk analyse

Klonet DNA eller cDNA tilsvarende CR1 genet kan bli analysert ved fremgangsmåter inkludert, men ikke grenset til Southern hybridisering (Southern, E.M., 1975, J. Mol. Biol. 98:503-517), Northern hybridisering (se f.eks., Freeman et al., 1983, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 80:4094-4098), restriksjonsendonukleasekatrlegging (Maniatis, T., 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York), og DNA sekvensanalyse. Stringentheten til hybridiseringsbetingelsene for både Southern og Northern hybridisering kan bli manipulert for åforsikre deteksjon av nukleinsyrer med ønsket grad av slektskap til den spesifikke CR1 proben som bli anvendt. F.eks. kan hybridisering under lave stringhetbetingeler med en probe inneholdende CR1 gensekvenser kodende for LHR-B og LHR-C bli anvendt for å påvise CR2 nukleinsyresekvenser.

Restriksjonsendonukleasekatrlegging kan bli anvendt for å i grove trekk bestemme den genetiske strukturen til CR1 genet. I en spesiell utførelsesform kan spaltning med restriksjonsenzymer bli anvendt for å oppnå restriksjonskartet vist i fig. 2, nedenfor. Restriksjonskart avledet ved restriksjonsendonukleasespaltning kan bekreftes ved DNA sekvensanalyse.

DNA sekvensanalyse kan bli utført ved hvilke som helst teknikker kjent innenfor fagområdet, inkludert, men er ikke begrenset til fremgangsmåten til Maxam og Gilbert (1980, Meth. Enzymol. 65:499-560), Sanger dideoksymetoden (Sanger, F., et al, 1977, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 74:5463), eller anvendelse av en automatisert DNA sekvenator (f.eks. Applied Biosystems, Foster City, CA.). cDNA sekvensen til CR1 genet omfatter sekvensen vesentlig som angitt i fig. 1 og beskrevet i seksjonene 6 og 7, nedenfor.

5.4.2. Proteinanalyse

Aminosyresekvens til CR1 proteinet kan bli avledet ved deduksjon fra DNA sekvensen, eller alternativt, ved direkte sekvensering av proteinet, f.eks., med en automatisert aminosyresekvenator. Aminosyresekvensen til et representativt CR1 protein omfatter sekvensen vesentlig som angitt i fig. 1, og beskrevet i seksjon 6, nedenfor. Som beskrevet nedenfor har hele kodende sekvensen til F allotype CR1 blitt klonet og, etter spaltning av signalpeptidet til 41 aminosyrene inneholdt den modne reseptoren 1998 aminosyrer inkludert en ekstracellulære domene på 1930 rester somdanner 30 SCR, 28 som er organisert til LHR-A, -B, -C og -D, (fig. 10), en enkelt membrandekkende domene på 25 aminosyrer og en relativt kort cytoplasmadomene på 43 aminosyrer.

Blant C3/C4-bindingsproteinene som inneholder multiple SCR, er CR1 unik ved at det har grupper av SCR organisert til LHR. Sammenligning av 4 LHR av CR1 viser at hver enkelt er en sammensetning av fire typer SCR: typene a, b, c og d (fig. 19). F.eks. er sekvensene til SCR-1 og -2 til LHR-A bare 62%, 62% og 57% identiske med første to SCR til LHR-B, -C og -D, respektivt. SCR-3 t.o.m. SCR-7 er forskjellige fra tilsvarende SCR til LHR-B ved bare en enkelt posisjon, og SCR-3 og -4 er forskjellig fra de til LHR-C ved bare tre posisjoner (fig. 10). Noen av type "a" SCR av LHR-A er dermed også tilstede i LHR-B og -C. Første to SCR til LHR-B, som er forskjellige fra de til LHR-A, er 99% identiske med tilsvarende SCR til LHR-C, slik at LHR-B og -C deler type "b" SCR i disse posisjonene. Femte, sjette og syvende SCR til LHR-C er bare 77% identisk med type "a" SCR i LHR-A og -B i disse posisjonene, og blir betraktet som type "c" SCR. Første t.o.m. fjerde SCR til LHR-D er relativt unik og er type "d", mens femte t.o.m. syvende SCR er omtrentlig 93% identisk med "c" type funnet i LHR-C. CR1 proteinsekvensen kan videre bli karakterisert ved en hydrofilisitetsanalyse (Hopp. T. og Woods, K., 1981, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 78:3824). En hydrofilisitetsprofil kan bli anvendt for å identifisere hydrofobe og hydrofile regioner av CR1 proteinet og tilsvarende regioner av gensekvensen som koder for slike regioner. En hydrofilisitetsprofil av COOH-terminus til CR1 proteinet er angitt i fig. 5.

Sekundær strukturell analyse (Chou, P. og Fasman, G., 1974, Biochemistry 13:222) kan også bli utført for å forutsi regioner av CR1 som opprettholder spesifikke sekundære strukturer.

Andre fremgangsmåter for strukturell analyse kan også bli anvendt. Disse omfatter, men er ikke begrenset til røntgenkrystallografi (Engstom, A., 1974, Biochem. Exp. Biol. 11:7-13) og computermodellering (Fletterick, R. og Zoller, M. (eds.), 1986, Computer Graphics and Molecular Modeling, in Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York).

5.5. CRl- relaterte derivater, analoger og peptider

Produksjon og anvendelse av derivater, analoger og peptider beslektet med CR1 blir også betraktet, og hører inn under rammen av foreliggende oppfinnelse. Slike derivater, analoger eller peptider som har ønsket immunogenisitet eller antigenisitet kan bli anvendt, f.eks., i immunoanalyser, for immunisering, terapeutisk osv. Slike molekyler som beholder, eller alternativt inhiberer, en ønsket CR1 egenskap, f.eks. binding av C3b eller C4b, regulering av komplementaktivitet eller fremming av immunstimulering eller fagocytose osv., kan bli anvendt som indusere eller inhibitorer, respektivt, av slik egenskap.

CRl-relaterte derivater, analoger og peptider ifølge oppfinnelsen kan bli produsert ved forskjellige fremgangsmåter kjent innenfor fagområdet. Manipulasjoner som resulterer i deres produksjon kan oppstå på gen eller proteinnivå. F.eks., klonet CR1 gen kan bli modifisert ved hvilke som helst av de mange strategiene kjent innenfor fagområdet (Maniatis, T., 1982, Molcular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York). CR1 sekvensen kan bli spaltet ved hensiktsmessige seter med restriksjonsendonuklease(er), etterfulgt av ytterligere enzymatisk modifikasjon om ønskelig, isolert og ligert in vitro (se seksjon 8, nedenfor). Ved fremstilling av genet kodende for et derivat, en analog eller et peptid beslektet med CR1, bør det forsikres om at det modifiserte genet forblir innenfor samme translasjonelle leseramme som CR1, uavbrutt av translasjonelle stoppsignaler, i

genregionen hvor ønsket CR1-spesifikk aktivitet er kodet.

CR1 genet kan i tillegg bli mutert in vitro eller in vivo, for å danne og/eller ødelegge translasjons-, initierings-og/eller termineringssekvenser, eller å danne variasjoner i kodende regioner og/eller danne nye restriksjonsendonukleaseseter eller ødelegge allerede eksisterende, for å lette ytterligere in vitro modifikasjon. En hvilken som helst teknikk for mutagenese kjent innenfor fagområdet kan bli anvendt, inkludert, men ikke begrenset til, in vitro sete-rettet mutagenese (Hutchingson, C, et al., 1978, J. Biol. Chem. 253:6551), anvendelse av TAB linkere (Pharmacia) osv.

Manipulasjoner av CR1 sekvensen kan også bli utført på proteinnivå. Hvilke som helst av mange kjemiske modifikasjoner kan bli utført ved kjente teknikker, inkludert, men ikke begrenset til spesifikk kjemisk spaltning ved cyanogenbromid, trypsin, chymotrypsin, papain, V8 protease, NaBIfy; acylering, formylering, oksidasjon, reduksjon; metabolsk syntese i nærvær av tunikamycin; osv.

I tillegg kan analoger og peptider beslektet med CR1 bli syntetisert kjemisk. F.eks. kan et peptid korresponderende med en del av CR1 som formidler ønsket aktivitet (f.eks. C3b og/eller C4b binding, immunstimulering, komplementregulering osv.) bli syntetisert ved anvendelse av en peptidsyntesemaskin.

5.6. Anvendelser av CR1

5.6.1. Analyser og diagnose

CR1 proteiner, analoger, derivater og undersekvenser derav, og anti-CRl antistoffer, kan anvendes i analyser og ved diagnostikk. Molekylene ifølge oppfinnelsen som demonstrerer den ønskede CR1 egenskapen eller funksjonen kan bli anvendt for å analysere slik egenskap eller funksjon. F.eks. kan CR1 proteiner eller fragmenter derav, som utviser binding av C3b og/eller C4b, i fri og/eller i komplekse former, bli anvendt i analyser for å måle mengden av slike forbindelser i en prøve, f.eks. en kroppsvæske til en pasient.

I en spesifikk utførelsesform kan full-lengde CR1 eller en CR1 delesjonsmutant uttrykt på celleoverflaten (f.eks., de som er beskrevet i seksjon 8, nedenfor) med evne til å binde C3b (f.eks., se tabell II, seksjon 9, nedenfor), iC3b eller C4b (f.eks. se tabell ri) bli anvendt i analyser for å måle nivåene av henholdsvis C3b, iC3b eller C4b, i en prøve. I en annen utførelsesform kan et CR1 protein eller et fragment derav som er konstruert ved rekombinant DNA teknologi til åmangle en transmembran sekvens, og som dermed blir utskilt, bli anvendt.

I en bestemt utførelsesform kan en slik måling av C3b og/eller C4b være pålitelig som en indikasjon på komplementaktivitet, og kan være nyttige ved diagnostikk av betennelsesforstyrrelser og immunforstyrrelser. Slike forstyrrelser omfatter, men er ikke begrenset til vevsskade forårsaket av brann- eller hj erteinfarkt-indusert trauma, voksen respiratorisk distressyndrom (sjokklunge), autoimmune forstyrrelser, så som leddgikt, systemisk lupus erythematosus, og andre sykdommer eller forstyrrelser omfattende uønskelige eller med uhensiktsmessig komplementaktivitet (se f.eks. Miescher,P.A. og Muller-Eberhard, H.J., eds., 1976, Text Book of frnmunopathology, 2d Ed., Vols. I og II, Grune og Stratton, New York; Sandberg, A.L., 1981, i Cellular Functions in Immunity and Inflammation, Oppenheim, J.J. et al., eds., Elsevier/North Holland, New York, s. 373; Conrow, R.B., et al., 1980, J. Med. Chem. 23:242; Regal, J.F. og Pickering, R.H., 1983, Int. J. Immunopharmacol. 5:71; Jacobs, H.S., 1980, Arch. Pathol. Lab. Med. 104:617).

CR1 proteinet og fragmenter derav inneholdende en epitope anvendes i analyser, inkludert, men ikke begrenset til immunoanalyser. Immunoanalysene som kan bli anvendt omfatter, men er ikke begrenset til konkurrerende og ikke-konkurrerende analysesystemer ved anvendelse av teknikker så som radioimmunoanalyser, ELISA (enzymbundet immunsorbentanalyse), "sandwich" immunoanalyser, presipitinreaksjon, geldiffusjonspresepitinreaksjoner, immun diffusjonsanalyser, agglutinasjonsanalyser, komplement-fikseringsanalyser, immunoradiometriske analyser, fluorescensimmuno-analyser, protein A immunoanalyser og ittimunoelektroforeseanalyser, for å nevne noen.

CR1 gener og beslektede nukleinsyresekvenser og subsekvenser kan bli anvendt i hybridiseringsanalyser. Slike hybridiseringsanalyser kan bli anvendt for å registrere betennelsesreaksjoner eller immunreaksjoner assosiert med CR1 ekspresjon, for å diagnostisere visse sykdomstilstander assosiert med forandringer i CR1 ekspresjon, for å bestemme CR1 allotypen til en pasient, og for å detektere tilstedeværelse og/eller ekspresjon av CR1 genet og beslektede gener (f.eks. CR2).

5.6.2. Terapi

CR1 proteinet og fragmenter, derivater og analoger derav kan være terapeutisk nyttige ved modulering av funksjoner formidlet av CR1. Slike funksjoner omfatter men er ikke begrenset til binding av C3b og/eller C4b, i frie eller i kompleksformer, fremming av fagocytose, komplemenrfegulering, immunstimulering osv. Effektive doser av CR1 proteinene og beslektede molekyler ifølge oppfinnelsen har terapeutisk verdi i mange av sykdommene eller forstyrrelsene assosiert med slike funksjoner, så som immun- eller betennelsesforstyrrelser (f.eks., de som er beskrevet ovenfor i seksjon 5.6.1). F.eks. kan full-lengde CR1 eller fragmenter derav og beslektede molekyler som utviser ønsket aktivitet ha terapeutiske anvendelser ved inhibisjon av komplement ved deres evne til å virke som faktor I kofaktor, for fremming av irreversibel inaktivering av komplementkomponentene C3b eller C4b (Fearon, D.T., 1979, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 76:5867; lida, K. og Nussenzweig, V., 1981, J. Exp. Med. 153:1138), og/eller ved evnen til å inhibere alternative eller klassiske C3 eller C5 konvertasene.

I en spesifikk utførelsesform av oppfinnelsen kan en ekspresjonsvektor bli konstruert slik at den koder for et CR1 molekyl som mangler transmembranregionen (f.eks., ved delesjon karboksy-terminal for arginin kodet av det mest C-terminale SCR), resulterende i produksjon av et oppløselig CR1 fragment. I en utførelsesform kan et slikt fragment beholde evnen til å binde C3b og/eller C4b, i frie eller i komplekse former. I en spesiell utførelsesform kan et oppløselig CR1 protein ikke lenger utvise faktor I kofaktoraktivitet. Oppløselig CR1 produkt kan bli administrert in vivo til en pasient slik at oppløselig CR1 effektivt kan konkurrere ut binding av C3b og/eller C4b til nativ celle-overflate CR1, som dermed blokkerer celle-overflate CR1 faktor I kofaktoraktivitet og øker komplementaktiviteten.

Etter at C3b er kovalent bundet til partiklene og oppløselige immunkomplekser har inaktivering av C3b ved proteolytisk prosessering til iC3b og C3dg to biologiske konsekvenser: forhindring av omfattende aktivering av komplementsystemet via amplifikasjonsveien, og dannelse av ligander som kan engasjere reseptorer forskjellig fra CR1. iC3b fragmentet kan ikke binde faktor B slik at omdanning til denne tilstanden blokkerer ytterligere komplementaktivering via den alternative reaksjonsvei amplifikasjonsløkken. iC3b kan bli bundet av CR1 og CR3, de to komplementreseptorene som formidler fagocytose ved myeolomonocyttiske celler. Den primære biologiske konsekvensen av C3b til iC3b omdanning er opphør av komplementaktivering uten innvirkning med CR1- og CR3-formidlet fjerning av CR3-belagt kompleks. I kontrast til dette, danner den ytterligere omdanningen av iC3b til C3dg et fragment som bare reagerer med CR2 og ikke med CR1 og CR3. Denne tilstanden begrenser komplement-avhengig binding av C3dg-bærende kompleks til celletyper som uttrykker CR2, som inkluderer B lymfocytter, follikulære dentritiske celler og kanskje epiteliske celler i huden, og reduserer eller utelukker interaksjon med fagocyttiske celletyper. Den biologiske konsekvensen av dette endrede mønsteret for cellulær assosiasjon vil være målsøking for C3dg-bærende komplekser til celler involvert i den afferente fasen av immunresponsen i steden for til celler involvert i fjerning og degradering av partikler og komplekser. Derfor kan CR1 molekyler bli anvendt terapeutisk ikke bare for å påvirke klaringsprosessen, men også ved målsøking av kompleser til CR2-bærende celletyper som deltar i antigenpresentasjon og antistoffproduksjon.

I en alternativ utførelsesform kan et CR1 protein eller et fragment derav som kan binde C3b eller C4b, og/eller beholder evnen til å inhibere alternative eller klassiske C3 eller C5 konvertaser, eller beholder faktor I kofaktoraktivitet, bli anvendt for å fremme komplementinaktivering. I en slik utførelsesform kan CR1 proteinet eller fragmentet være verdifullt ved behandling av forstyrrelser som omfatter uønsket eller uhensiktsmessig komplementaktivitet (f.eks., sjokklunge, vevsskade forårsaket av brann eller ischemiske hjertebetingelser, autoimmune forstyrrelser, betennelsesbetingelser osv.).

I en spesifikk utførelsesform beskrevet i eksempelseksjonen 11-14 nedenfor, kan et oppløselig CR1 molekyl bli uttrykt som beholder en ønsket funksjonell aktivitet, som demonstrert, f.eks. ved evnen til å hemme klassisk komplement-formidlet hemolyse, klassisk CSa produksjon, klassisk C3a produksjon eller nøytrofil oksydativ utbrudd in vitro. I en bestemt utførelsesform kan et slikt oppløselig CR1 molekyl bli anvendt for å redusere betennelse og skadelige virkninger, eller å redusere hjerteinfarktsstørrelsen eller forhindre reperfusjonsskade osv. Slike CR1 molekyler som er nyttige for in vivo terapi kan bli undersøkt i forskjellige modellsystemer som er kjent innenfor fagområdet, inkludert, men ikke begrenset til reversert passiv Arthrus-reaksjon (se seksjon 14.1) og en rotte hjerteinfarktmodell (se seksjon 14.3).

I en annen utførelsesform kan et fragment av CR1, eller en analog eller derivat derav, som er vist åinhibere en ønsket CR1 egenskap eller funksjon, bli anvendt for å forhindre eller behandle sykdommer eller forstyrrelser assosiert med den funksjonen.

Forskjellige leveringssystemer er kjente og kan bli anvendt for å levere CR1 og beslektede molekyler, f.eks., innkapsling i liposomer, ekspresjon ved hematopoetiske stamcelleavkom i genterapi, osv. Andre fremgangsmåter for introduksjon omfatter, men er ikke begrenset til intradermale, intramuskulære, intrapeirtoneale, intravenøse, subkutane, intranasale og orale veier.

6. EKSEMPEL: KLONING OG SEKVENSERING AV HUMAN C3b/C4b RESEPTOR (CR1)

I eksemplene beskrevet heri er det beskrevet kloning og nukleotidsekvens til 5,5 kilobase par (kb) til CR1 kodende region (Klickstein, L.B., et al., 1987, J. Exp. Med. 165:1095-1112).

Ti overlappende CR1 cDNA kloner som dekker 5,5 kb ble isolert fra et tonsillarbibliotek og sekvensert i sin helhet eller delvis. En enkelt lang åpen leseramme begynnende ved 5' enden av klonene og som rekker 4,7 kb nedstrøms til et stoppkodon ble identifisert. Denne sekvensen representerer ~ 80% av den beregnede 6 kb av den kodende sekvensen for F allotype til CR1. Tre tandem, direkte, lange homologe gjentagelser (LHR) på 450 aminosyrer ble identifisert. Analyse av sekvensene til tryptiske peptider tydet på en fjerde LHR i F allotypen til CR1. Aminosyreidentitet mellom LHR varierte fra 70% mellom første og tredje gjentagelser til 99% mellom NH2-terminale 250 aminosyrer til de første og andre gjentagelsene. Hver LHR omfatter 7 korte konsensusgjentagelser (SCR) på 60-70 aminosyrer som ligner SCR til andre C3/C4 bindende proteiner, så som komplementreseptortype 2, faktor B og H, C4 bindingsprotein og C2. To ytterligere SCR kobler LHR til en enkelt membran-dekkende domene på 25 aminosyrer: F allotypen til CR1 inneholder dermed sansynligvis minst 30 SCR, idet 23 er blitt foreslått. Hver SCR antas å danne en trippel loop struktur der de fire konserverte halv-systeinene danner disulfidbindinger. Den lineære oppstillingen av 30 SCR som en semi-rigid struktur ville rekke 1,140 Ångstrøm fra plasmamembranen og kan lette interaksjonen til CR1 med C3b og C4b beliggende innenfor mellomrommene til immunkompleksene og mikrobielle cellevegger. COOH-terminale cytoplasmadomenen på 43 rester inneholder en sekvens på 6 aminosyrer som er homolog med sekvensen i epidermal vekstfaktorreseptor som blir fosforylert av proteinkinase C.

6.1. Materialer og fremgangsmåter

6.1.1. Isolering og sekvens til CR1 tr<y>ptiske peptider

CR1 var renset fra vaskede humane erytrocyttmembraner ved sekvensiell Matrex Rød A og YZ-1 monoklon antistoffaffimtetskromatografi (Wong, W.W., et al., 1985, J. Immunol. Methods 828:303). Tryptiske peptider ble preparert og isolert ved sekvensiell gradient og isokratisk revers-fase HPLC (høy ydelse væskekromatografi) som beskrevet

(Wong, W.W., et al., 1985, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 82:7711). Tryptisk peptidanalyse ble utført med en 470A proteinsekvenator (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA), og analyse av hver nedbrytende syklus ble oppnådd ved anvendelse av en 120 PTH-aminosyreanalysator (Applied Biosystems, Inc.).

6.1.2. Isolasjon av cDNA kloner og genomiske kloner

Et cDNA bibliotek ble konstruert i Xgtl 1 fra human mandler (tonsilar) poly(A)<+> RNA som beskrevet (Wong, W.W., et al., 1985, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 82:7711). Ved RNA blothybridisering ble det vist at mandeldonoren var homozygot for F allele til CR1 (id.). cDNA ble selektert på en agarosegel til å omfatte fraksjonene mellom 2 og 7 kb før kloningstrinnene. Den opprinnelige kompleksiteten til biblioteket var 4,5 x 10<6 >rekombinanter pr. 100 mg cDNA og biblioteket ble amplifisert i Escherichia coli stamme Yl 088. Biblioteket ble screenet (Maniatis, T., et al., 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York) med CR1 prober, CRl-1 (ATCC aksessjonsnr. 57330 (E. coli inneholdende CRl-1 plasmid), 57331 (renset CRl-1 DNA)) og CR1-2 (Wong, W.W., et al., 1985, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 82:7711), som var blitt radiomerket til en spesifikk aktivitet på 2-8 x 10<&> cpm/ug ved nikkhybridisasjon. Hybridiseringen ble utført i 50% formamid, 5x SSC (lx SSC: 15 mM natriumsitrat, 150 mM natriumklorid) ved 43°C og filterene ble vasket ved 60°C i 0,2x SSC, ved betingelser som ikke muliggjør deteksjon av CR2 cDNA kloner (Weis, J.J., et al., 1986, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 83:5639). Positive kloner ble plaque-renset to ganger før restriksjonskartlegging og DNA sekvensanalyse.

Et genomisk bibliotek ble konstruert i EMBL-3 med 15-20 kb fragmenter produsert ved delvis spaltning av humant leukocyt DNA med Sau3 AI. Den opprinnelige kompleksiteten var 1,2 x 10<*>\ og biblioteket ble amplifisert i E. coli stamme P2392. Biblioteket ble også screenet med cDNA probene CRl-1 og CR1-2 (Wong, W.W., et al., 1985, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 82:7711).

6.1.3. DNA sekvensanalyse

Restriksjonsfragmenter av cDNA klonene ble subklonet inn i M13mpl8 eller M13mpl9 og sekvensert ved dideoksynukleotidkjedetermineringsmetoden (Sanger, F., et al., 1977, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 74:5463). Noen kloner ble sekvensert helt eller delvis ved først å danne ordnede delesjonsmutanter ved anvendelse av eksonuklease III (Henikoff, S., 1984, Gene 28:351). Hver region ble sekvensert i begge trådene og i de fleste tilfellene ble hver region sekvensert i Ml4 subkloner konstruert fra to uavhengige isolerte cDNA kloner (fig. 2). Sekvensdata ble analysert med "the University of

Wisconsin Genetics Computer Group package" (Madison, WI).

6.2. Resultater

6.2.1. Nukleotidsekvens til CR1 genet

Et størrelsesselektert fra mandel cDNA bibliotek ble screenet med CRl-1 og CR1-2 prober tilveiebragt fra CR1 cDNA klonen, X T8.3 (Wong, W.W., et al., 1985, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 82:7711). Femten positive fag ble identifisert ut i fra 1,5 x IO<6 >rekombinanter og 13 av disse representerte bestemte kloner. Ti ble restriksjonskartlagt og sekvensert helt eller delvis ved dideoksynukleotidkjedetermineringsmetoden. cDNA klonene ble oppstilt på basis av overlappende sekvensidentitet (fig. 2) og ble runnet å dekke 5,5 kb (fig. 3). En enkel lang åpen leseramme ble identifisert begynnende med 5' enden av cDNA klonene og som rekker 4,7 kb nedstrøms til et stoppkodon. Den kodende sekvensen for CR1 i dette biblioteket er ventet å være 6 kb, basert på en beregnet 220,000 dalton molekylvekt for uglykosylert reseptor (Wong, W.W., et al., 1983, J. Clin. Invest. 72:685). Disse klonene dekker derfor ~80% av beregnet kodende sekvens.

Klonene T49.1 og T55.1 inneholder kodende sekvens ved deres 5' ender som indikerer at ytterligere 5' kodende og ikke-kodende sekvenser enda må bli identifisert. 13' regionen inneholder de overlappende klonene T8.2, T43.1 og T87.1 transmembrane og cytoplasmaregioner kodet av en identisk sekvens i hver klon. Klonen som rekker mest 3', T8.2, inneholder 807 bp av utranslatert sekvens uten en poly(A) sekvens. Klon T8.3 inneholder en 91-bp delesjon av nukleotidene 1,406-1,497 og klon T40.1 inneholder en 9-bp delesjon av nukleotidene 1,498-1,507 relativt til sekvensene som finnes i klonene T6.1 og T55.1. Disse delesjonene oppsto i regioner som har sekvenser homologe med 5' spleiseseter og kan representere spleisefeil i mRNA. Klonene T49.1 og T55.1 inneholder et 110 bp innskudd mellom nukleotidene 147og 148 i den åpne leserammen (fig. 3). Denne sekvensen vurderes å være en del av en intron p.g.a. at den ikke hybridiserte til blotter av mandel poly(A)<+> RNA, den inneholder et 5' spleisesete (Breathnach, R., et al., 1978, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 75:4853) (fig. 3), den er flankert av cDNA sekvenser i CR1 genomiske kloner, og den skifter leseramme. Klon T9.4 inneholder 0,88 kb av mellomliggende sekvens ved 3' enden som ikke hybridiserer til blotter av mandel poly(A)<+> RNA.

6.2.2. Analyse av nukleotid og aminos<y>resekvens til CR1

Dotmatriseanalyse av nukleotidsekvensen til CR1 (fig. 3) viste to typer av indre homologier (fig. 4). Første type med indre homologi er representert ved uthevede, uavbrutte linjer som angir tilstedeværelse av tre tandem, direkte, meget homologe gjentagelser på 1,35 kb. Disse nukleotidsekvensene koder for de lange homologe gjentagelsene (LHR) til CR1. Den andre type gjentagelse er representert ved strekede parallellinjer som angir regioner med mindre homologi. Disse sekvensene oppstår for hver 190-210 nukleotider og koder for de korte konsensusgjentagelsene (SCR) til CR1.

Aminosyresekvensen avledet fra cDNA sekvensen er presentert i fig. 5 og de tre LHR, betegnet LHR-B, LHR-C og LHR-D, er oppstilt for å demonstrere deres homologi. LHR-B rekker fra rest 1 til og med rest 438, LHR-C korresponderer med restene 439-891, og LHR-D rekker fra rest 892 til og med 1,341. Restene 451-694 til LHR-C er 99% identiske med restene 1-244 til LHR-B, men er bare 61% identisk med de tilsvarende restene til LHR-D. En kontrast til dette er restene 695-891 til LHR-C 91% identiske med restene 1,148-1,341 til LHR-D, men bare 76% identiske med den tilsvarende regionen til LHR-B. LHR-C ser dermed ut til å være en hybrid som omfatter sekvenser som er mest homologe med den første halvparten av LHR-B og den andre halvparten av LHR-D. LHR er etterfulgt av to SCR som ikke blir gjentatt, et 25 rest hydrofobt segment og en 43 aminosyre COOH-terminal region uten sekvenshomologj med SCR (fig- 5).

5' 1,3 kb til CR1 kodende sekvens representerer en fjerde LHR, LHR-A (se fig. 1, ovenfor, og seksjon 7, nedenfor). Denne konklusjonen ble understøttet av analyse av tryptiske peptider til erytrocytt CR1. Ti tryptiske peptider har sekvenser som er identiske med aminosyresekvensene avledet fra cDNA klonene (tabell I).

Hver LHR omfatter syv 60-70 aminosyre SCR som karakteriserer familien av C3 og C4 bindende proteiner (C4bp) (fig. 6A). Maksimal homologi mellom 23 SCR til CR1 ble observert ved innføring av opphold ved oppstilling av sekvensene (fig. 6A). Til sammen ble 29 av de gjennomsnitlige 65 restene i hver gjentagelse konservert. Det er seks rester som tilstede i alle SCR: de fire halv-cysteinene som i lignende relative posisjoner foreslår at hver kan være involvert i en kritisk disulfidbinding, og tryptofan og andre glycin etter andre halv-cystein (fig. 6A). Sekundær strukturanalyse av sekvensene mellom invariante halv-cysteiner ved anvendelse av algoritmen til Chou og Fasman (Chou, P.Y. og Fasman, G.D., 1974, Biochemistry 13:222) forutså høy sansynlighet for 6-dreiningsdannelse og lav sansynlighet for a-heliksdannelse. Sekvensanalyse av to CR1 genomiske kloner, 2,38 (fig. 6B) og 2,46, angir at SCR-14 (fig. 6A) blir kodet av et enkelt ekson og at COOH-terminus til SCR-23 tilsvarer slutten av en ekson. SCR til CR1 kan dermed bli kodet av separate eksoner som vist for SCR til faktor B (Campbell, R.D. og Bentley, D.R., 1985, Immunol. Rev. 87:19) og til IL-2-R (Leonard, W.J., et al., 1985, Science 230:633).

Konsensussekvensen til CR1 SCR blir sammenlignet med SCR til andre medlemmer av superfamilien som har denne karakteristike strukturen (fig. 7). Disse medlemmene inkluderer ikke bare proteiner som har C3/C4 bmdingsfunksjon, CR2 (Weis, J.J., et al., 1986, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 83:5639), C4bp (Chung, L.P., et al., 1985, Biochem. J. 230:133), faktor H (Kristensen, T., et al., 1986, J. Immunol. 136:3407), faktor B (Morley, B.J. og Campbell, R.D., 1984, EMBO J. 3:153; Mole, J.E., et al., 1984, J. Biol. Chem. 259:3407), og C2 (Bentley, D.R., og Porter, R.R., 1984, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 81:1212; Gagnon, J., 1984, Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sei. 306:301), men også proteiner som ikke er kjent for å ha denne funksjonen, så som interleukin-2 reseptoren (Leonard, W.J., et al., 1985, Science 230:633), fi2-glykoprotein I (Lozier, J., et al., 1984, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 81:3640), Clr (Leytus, S.P., et al., 1986, Biochemistry 25:4855), haptoglobin a kjede (Kurosky, A., et al., 1980, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 77:3388), og faktor XITJb (Ichinose, A., et al., 1986, Biochemistry 25:4633). Halv-cysteinrestene er invariante i SCR til alle proteinene, med unntagelse av haptoglobin som mangler det tredje halv-cysteinet. Tryptofan er også invariant med unntagelse av femte SCR i B2-glykoprotein I og to av gjentagelsene i faktor XUJb. Andre rester som er konservert, men ikke tilstede i hver SCR pleier å bli sammenklumpet rundt halv-cysteinene. Det er bare en fri tiolgruppe i faktor B og C2 (Christie, D.L., og Gagnon, J., 1982, Biochem. J. 201:555; Parkes, C, et al., 1983, Biochem. J. 213:201), og i SCR til fl2-glykoprotein I, er første halv-cystein disulfid-bundet til tredje og andre til fjerde (Lozier, L, et al., 1984, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 81:3640).

I den avledede aminosyresekvensen til CR1 er det 17 potensielle seter for N-bundede oligosakkarider og alle disse er i den ekstracellulære regionen (Fig. 6A). Molekylvektsforskjeller mellom CR1 syntetisert i nærvær eller fravær av tunikamycin (Lublin, D.M., et al., 1986, J. Biol. Chem. 261:5736) og analyse av glykosamininnholdet (Sim, R.B., 1985, Biochem. J. 232:883) foreslår tilstedeværelse av bare 6-8 N-bundede kompleksoligosakkarider, som angir at alle potensielle seter ikke blir anvendt. F.eks. ble asparagin i residie 263 til den avledede aminosyresekvensen (fig. 5) identifisert i peptid 41c (tabell I), som angir fravær av glykosylering i dette setet. I kontrast til dette, korresponderer den uidentifiserte aminosyren i peptid 34b sansynligvis med et glykosylert asparagin i residie 395.

De eneste ikke-repeterende CR1 sekvensene identifisert i 5,5 kb cDNA er beliggende i COOH-terminale regionen. En sekundær strukturanalyse av denne regionen angir en enkelt 25-rest antatt membran-dekkende segment med sterk hydrofob karakter og høyt potensiale for a-heliksdannelse (fig. 5). Denne sekvensen er deretter fulgt av fire positivt ladede rester som er et karaktertrekk til mange membranproteiner. Den antatte cytoplasmaregionen til CR1 omfatter 43 residier og inneholder en seksaminosyre lang sekvens, VHPRTL, som er homolog med sekvensen VRKRTL, et sete av proteinkinase C fosforylering i epidermal vekstfaktor (EGF) reseptor og erbB onkogen produktet (Hunter, T., et al., 1984, Nature 311:480; Davis R.J. og Czech, M.P., 1985, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 82:1974). Det er ingen tyrosinrester i cytoplasmaregionen til tonsillær CR1.

6.3. Diskusjon

Omtrent 80% av den primære strukturen til F allotypen til CR1 er blitt tilveiebragt ved sekvensering av overlappende cDNA kloner. Det mest uvanlige strukturtrekket til CR1 observert i denne analysen er tilstedeværelse av tandem, direkte LHR på 450 aminosyrer, der fire antas å oppstå i F allotypen til CR1 som har en beregnet polypeptidkjedelengde på 2,000 rester (Wong, W.W., et al., 1983, J. Clin. Invest. 72:685; Sim, R.B., 1985, Biochem. J. 232:883). Tre av LHR er blitt klonet og sekvensert mens bevis for eksistensen av den fjerde ble tilveiebragt ved analyse av tryptiske peptider. Hver LHR består av syv SCR som er hovedstrukturene elementer til andre C3/C4 bindingsproteiner. Bevaring av de fire halv-cysteinene pr. SCR, den sansynlige innbefatningen av første og tredje og andre og fjerde halv-cysteiner i disulfidbindinger (Lozier, J., et al., 1984, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 81:3640) og tilstedeværelse av konserverte aminosyrer så som prolin, glycin og asparagin som ofte er funnet i fl-dreininger (Rose, G.D., et al., 1985, Adv. Protein Chem. 37:1) fører til forslaget om at en SCR danner en trippel-loop struktur opprettholde av disulfidbindinger (fig. 8). Denne rollen for halv-cysteinrestene er understøttet ved funnet om at mildt trypsin-behandlet CR1 (Sim, R.B., 1985, Biochem. J. 232:883) og faktor H (Sim, R.B. og DiScipio, R.G., 1982, Biochem. J. 205:285) migrerer som intakte molekyler når analysert ved SDS-polyakrylamidgelelektroforese (PAGE) under ikke-reduserende betingelser og samt multiple tryptiske fragmenter etter reduksjon.

Denne serien av SCR gjentatt i tandem antas å danne en elongert struktur (fig. 8) som foreslått for faktor H og for hver subenhet av human C4bp (Sim, R.B. og DiScipio, R.G., 1982, Biochem. J. 205:285; Whaley, K. og Ruddy, S., 1976, J. Exp. Med. 144:1147; Dahlback, B., et al., 1983, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 80:3461). Elektronmikroskopistudier av subenhetene til C4bp har angitte dimensjoner på 300 x 30 Ångstrøm (Dahlback, B., et al. 1983, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 80:3461). Ider hver subenhet består av åtte SCR (Chung, L.P., et al., 1985, Biochem. J. 230:133), kan hver individuell SCR bli beregnet til 38 x 30 Ångstrøm. Ved å anta at SCR til CR1 har lignende dimensjoner og F allotypen har 30 SCR, kan reseptoren rekke så mye som 1,140 Ångstrøm fra cellemembranen. I samsvar med denne antagelsen angående CR1 strukturen er det tidligere funnet om at ferritin-merket antistoff bundet til CR1 på nøytrofiler ofte var 500 Ångstrøm fra ytre delen av plasmamembranen (Abrahamsen, D.R. og Fearon, D.T., 1983, Lab. Invest. 48:162). En slik utvidet struktur av CR1 ville lette interaksjonen mellom reseptor-bærende celler og C3b som er kovalentlig bundet til relativt uoppnåelige seter innenfor immunkompleksene og mikrobieUe celleoverflater. Funnet om at SCR er hoved, og kanskje eneste, ekstracytoplasmaelement til CR1 tilveiebringer strukturelt bevis for et nære forhold mellom reseptoren og faktor H og C4bp, to plasmaproteiner som eksklusivt eller hovedsakelig består av SCR (Chung, L.P., et al., 1985, Biochem. J. 230:133; Kristensen, T., et al., 1986, J. Immunol. 136:3407). CR1 ble opprinnelig isolert som et erytrocyttmembranprotein med faktor H-lignende aktivitet etter detergentoppløsning (Fearon, D.T., 1979, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 76:5867), og det ble deretter funnet å ha regulatoriske funksjoner til faktor H og C4bp når det var beliggende på plasmamembranen (Jida, K. og Nussenzweig, V., 1981, J. Exp. Med. 153:1138). Ved analyse av arv av strukturell polymorfisme til CR1, faktor H og C4bp ble genene som koder for disse tre proteinene vist å være bundede (de Cordoba, R., et al., 1985, J. Exp. Med. 161:1189), og lokuset for denne bindingsgruppen og for den strukturelt beslektede reseptoren, CR2, er i den senere tid blitt vist ved in situ hybridisering og ved analyse av somatiske cellehybrider å være på den lange armen til kromoson 1, bånd q32 (Weis, J.H., et al., 1987, J. Immunol. 138:312). Før foreliggende studie var det eneste beviset for et strukturelt forhold mellom disse proteinene en signifikant likhet i deres aminosyresarnmensetninger (Wong, W.W., et al., 1985, J. Immunol. Methods 82:303). Foreliggende funn av minst 23 SCR i CR1 utgjør den direkte og formelle demonstrasjon på et strukturelt forhold til reseptoren med faktor H og C4bp (Chung. L.P., et al., 1985, Biochem. J. 230:133; Kristensen, T., et al., 1986, J. Immunol. 136:3407), proteiner med lignende funksjoner og med Ba og C2b fragmentene til faktor B og C2 (Morley, B.J. og Campbell, R.D., 1984, EMBO J. 3:153; Mole, J.E., et al., 1984, J. Biol. Chem. 259:3407; Bentley, D.R. og Porter, R.R., 1984, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 81:1212; Gagnon, J., 1984, Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sei. 306:301), komponenter som danner enzymatiske komplekser med C3b og C4b, respektivt. SCR ble derimot også funnet i flere ikke-komplementproteiner (Campbell, R.D., og Bentley, D.R., 1985, Immunol. Rev. 87:19; Lozier, J., et al., 1984, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 81:3640; Leytus, S.P., et al., 1986, Biochemistry 25:4855; Kurosky, A., et al., 1980, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 77:3388; Ichinose, A., et al., 1986, Biochemistry 25:4633) (fig. 7), som angir at det ikke nødvendigvis representerer en C3/C4 bindende struktur.

Blant proteinene som har SCR er CR1 unik idet den har organisert denne hovedstrukturen og genetiske enheten inn høyere ordens strukturell enhet til LHR. Analyse av et 14,5 kb BamHI fragment av genomisk DNA som er assosiert med ekspresjon av S allotype har tydet på minst en gjentagende genomisk enhet i CR1 er et utvidet segment av DNA inneholdende eksonene kodende for minst 5 SCR og deres flankerende introner (Wong, W.W., et al., 1986, J. Exp. Med. 164:1531). Disse studiene har også foreslått at S allele inneholder en ytterligere kopi av denne genomiske enheten sammenlignet med antallet tilstede i F allelet. Denne observasjonen, kombinert med en tryptisk <p>e<p>tidkartleg<g>mgsstudie (Nickells, M.W., et al. 1986, Mol. Immunol. 23:661) og foreliggende funn om at en LHR representerer et peptid på -40-50 kD gjør det mulig åforutsi tilstedeværelse i S allotypen (290 kD) av en ytterligere LHR relativt til beregningen om fire LHR i F allotypen (250,000 dalton molekylvekt).

I tillegg til å tilveiebringe bevis for duplikeringshendelser foreslår sekvensene til LHR også at omdannelseshendelser har oppstått innenfor CR1 genet. LHR-B og -D er 67% identiske i forhold til hverandre i løpet av hele lengden, mens LHR-C er 99% identisk med LHR-B i NH2-terminale fire SCR og 91% identisk med LHR-D i COOH-terminale tre SCR. Denne organiseringen kunne ikke ha oppstått ved en enkel rekombinasjons-hendelse mellom identiske parentale alleler ved opprinnelsen av dette hybrid LHR. Hybrid LHR kan derimot ha oppstått ved genomdanning (Atchison, M. og Adesnik, M., 1986, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 83:2300) der sekvensene i en LHR-C forløper ble erstattet med sekvenser tilstede i LHR-B eller LHR-D. Den nesten fullstendige identiteten og nøyaktige oppstillingen av homologe sekvenser i disse LHR (flg. 5) er også blitt opprettholdt ved en mekanisme omfattende genomdanning. Analyse av grad av homologi mellom mellomliggende sekvenser av de segmentene av CR1 genet for koder for LHR skal kunne bestemme om genomkonversjon eller seleksjonen basert på funksjonelle begrensninger har begrenset sekvensdivergens.

Til tross for at en tidligere studie foreslår at CR1 er monovalent (Wilson, J.G., et al., 1982, N. Engl. J. Med. 307:981), kan hver LHR representere en enkelt C3b/C4b bindingsdomene, som skulle gjøre reseptoren multivalent og tilpasset for binding av komplekser som bærer multiple molekyler av C3b og C4b. Alternativt kan bestemte LHR være ansvarlig for binding av henholdsvis C3b og C4b (se seksjon 9, nedenfor), som tilveiebringer et strukturelt grunnlag for kombinasjonen av faktor H og C4bp aktiviteter i CR1. LHR til CR1 kan representere struturelle domener som virker på en slik måte at CR1 går ut i fra plasmamembranen, som foreslått ved den antatte strukturelle modellen (fig. 8), og SCR ved NH2-terminale regionen binder C3b og C4b, som funnet for faktor H (Sim, R.B. og DiScipio, R.G., 1982, Biochem. J. 205:285; Alsenz, J., et al., 1984, Biochem. J. 224:389).

Aktivering av proteinkinase C ved forbolestere induserer fosforylering av CR1 i nøytrolfiler, monocytter og eosinofiler (Changelian, P.S. og Fearon, D.T., 1986, J. Exp. Med. 163:101) og CR1 cytoplasmadomenen på 43 aminosyrer har en sekvens som er homolog med et sete som blir fosforylert av proteinkinase C i epidermal vekstfaktorreseptor (Hunger, T., et al., 1984, Nature 311:480; Davis, RJ. og Czech, M.P., 1985, Proe. Nalt. Acad. Sei. U.S.A. 82:1974). Denne cytoplasmasekvensen, som ble funnet i tre uavhengige kloner av mandel (tonsillar) biblioteket, er mest sansynlig den til B celle CR1, som ikke blir fosforylert etter aktivering av proteinkinase C (Changelian, P.S. og Fearon, D.T., 1986, J. Exp. Med. 163:101).

7. EKSEMPEL: CR1 5' cDNA SEKVENSER INNEHOLDER EN FJERDE LANG HOMOLOG REPETISJON

Analyse av en delvis cDNA sekvens av CR1 viste en struktur der 3 LHR, LHR-B, LHR-C, LHR-D, på 450 aminosyrer her besto av syv korte konsensusgjentagelser (SCR) på 65 aminosyrer karakteristisk for C3/C4 bindingsproteinene (se seksjon 6, ovenfor). I eksemplene beskrevet heri, blir kloning og nukleotidsekvensen til en fjerde amino-terminal LHR, LHR-A (Klickstein, L.B., et al., 1987, Complement 4:180) ved sekvensering av 5' cDNA klonene beskrevet. Analyse av LHR-A viste at den er 99% homolog med LHR-B i de fem 3' SCR, men bare 61% homolog i de to 5' SCR.

7.1. Materialer og fremgangsmåter

7.1.1. Konstruksjon av et cDNA bibliotek

Et selektivt primet cDNa bibliotek, X HH, ble konstruert fra 3 ug poly(A)+ RNA renset fra DMSO-induserte celler som beskrevet (Chirgwin, J.M., et al., 1979, Biochemistry 18:5290; Aviv, H. og Leder, P., 1972, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 69:1408; Ausubel, F.M., et al., 1987, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York) med følgende modifikasjoner. LK35.1, et 35-mer oligonukleotid, 5'-TGAAGTCATC ACAGGATTTC ACTTCACATG TGGGG-3', ble anvendt i steden for oligo(dT)i2-18°S 40 uCi a <32>p<->dCTP ble tilsatt i løpet av den andre trådsyntesen. En tredje del av cDNA ble klonet i X gtl 1 og et cDNa bibliotek ble konstruert fra humant tonsill poly(A)<+> RNA som beskrevet i seksjon 6.1.2., ovenfor. 750,000 uavhengige rekombinanter tilveiebragt.

7.1.2. Isolasjon av kloner, prober og DNA sekvensanalyse

Probene anvendt for screening av cDNA bibliotek var CRl-1 (Wong, W.W., et al., 1985, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A., 82:7711) (ATCC aksessjonsnr. 57331), CR-2 (Wong, W.W., et al., ovenfor), CR1-4 (Wong, W.W. et al., 1986, J. Exp. Med. 164:1531), og CR1-18, et 252 bp Sau3AI fragment fra 0,5 kb EcoRI fragmentet til cDNA klon X H3.1 korresponderende med nukleotidene 101-352 i fig. 1. Under betingelser med høy stringenthet hybridiserer CRl-18 bare til cDNA kloner som enten koder for NH2-terminalt SCR til LHR-A eller signalpeptidet. Innskuddene til cDNA klonene ble sekvensert ved dideoksynukleotidteknikken (Sanger, F., et al., 1977, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 74:5463) etter subkloning av fragmentene inn i M13mpl8 og M13mpl9 (Yanisch-Perron, C. et al., 1985, Gene 28:351).

7.2. Resultater

Et spesifikt primet _gtl 1 cDNA bibliotek, _HH, som inneholdt 7,5 x 10^ rekombinanter ble preparert med cDNA syntetisert fra poly (A)<+> RNA fra DMSO induserte HL-60 celler. Disse cellene uttrykker bare F allotypen til CR1 (Lublin, D.M., et al., 1986, J. Biol. Chem. 261:5736) som antas å ha fire LHR (Lapata, M.A., et al., 1984, Nucl. Acids Res. 12:5707). Primeren, LK35.1, var en antisens 35-mer korresponderende med nukleotidene 896-930 til delvis cDNA sekvens til CR1 presentert i fig. 3. Dette oligonukleotidet ble vist åhybridisere til LHR-B, LHR-C og LHR-D under betingelser med revers transkripsjon. 250 positive kloner ble identifisert i en utplatning av 3,8 x 10^ uamplifisert rekombinant fag screenet med et blanding av CR1 cDNA prober, CRl-1 og CR1-4. 38 positive kloner ble plukket og plaque-renset. Southern blots av EcoRI-spaltet DNA fra disse klonene ble screenet med 23-mer oligonukleotidet, KS23,1, 5'-CTGAGCGTAC CCAAAGGGAC AAG-3', korresponderende med nukleotidene 763-785 til delvis CR1 cDNA sekvensen i fig. 3. Denne proben hybridiserte under betingelser med høy stringenthet ved et enkelt sete i sekvensen kodende for LHR-B men ikke til sekvenser som koder for LHR-C eller LHR-D. Innskuddet til klon X H7.1 (fig. 9) inneholdt EcoRI fragmenter på 1,0 kb, 0,9 kb og 0,4 kb og to større fragmenter hybridiserte til KS23,1, som indikerer at denne klonen inneholdt sekvenser kodende for 3' 5/7 av LHR-A og hele LHR-B. Dette funnet bekreftet at LHR-A er meget homolog med LHR-B. Klon X H3,l (fig. 9) inneholdt et enkelt KS23,1-positivt EcoRI fragment på 1,0 kb og et 5', 0,5 kb fragment som hybridiserte svakt med CR1-4 med høy stringenthet. Denne klonen ble betraktet å inneholdt den ytterligere 5' sekvensen som fullfører LHR-A, inkludert SCR-1 og -2 og 0,1 kb av sekvensen oppstrøms. Ingen av de gjenværende 36 klonene, som alle hybridiserte med CRl-1, ble detektert med proben, CRl-18, et 252 bp Sau3AI fragment fra 0,5 kb EcoRI fragmentet til klon X H3,l som ikke hybridiserer til sekvenser kodende for LHR-B, -C eller -D.

DNA sekvensanalyse av X H3,l viste at den åpne leserammen fortsatte mot 5'-enden av cDNA og dette indikerer at klonen ikke rakk til translasjonsstartsetet. cDNA bibliotekene, X HH og XS2T, ble derfor på ny screenet med probe CRl-18 for åidentifisere en klon fra hver av hhv. AH 10,3 og ATI 09,1. EcoRI fragmentene til disse klonene som hybridiserte med CRl-18 ble sekvensert og dette ble også innskuddene fra klonene, A,H3,1 og A,H7,1. Hele sekvensen er presentert i fig. 1 slik at nukleotidet etter nr. 1531 i fig. 1 er nukleotid nr. 1 i fig. 3. Overlappende sekvenser til cDNA klonene til HL-60 og mandelbibliotekene er identiske.

Rett oppstrøms for LHR-A inneholder klonene A,H10,3 og ATI 09,1 identiske antatte hydrofobe ledersekvenser (Von Heijne, G., 1986, Nucl. Acids Res. 14:4683) kodende for 41 aminosyrer, inkludert en ATG som matcher konsensus NNA/GNNATGG foreslått for eukaryote ttanslasjonsinitieringssete (fig. 10) (Kozak, M., 1986, Cell 44:283). En annen ATG, beliggende seks kodoner oppstrøms for valgte ATG og like nedstrøms for et i-leseramme stoppkodon, er en dårlig match for denne konsensussekvensen. De første tre aminosyrene til denne ledersekvensen for CR1, MGA, er de samme som de som er angitt for CR2. Sekvensene til disse to klonene divergerer oppstrøms for ATG og den fra klon A. 10,3 er antatt å representere en del av en mellomliggende sekvens, som beskrevet for andre CR1 cDNA kloner i seksjon 6, ovenfor.

Signalpeptidasespaltningen er antatt (Von Heijne, G., 1986, Nucl. Acids Res. 14:4683) å oppstå mellom glycin-46 og glutamin-47, som foreslår at den blokkerte NH2-terrninale enden av CR1 (Wong, W.W., et al., 1985, J. Immunol. Methods 82:303; Holeis, V.M., et al., 1986, Complement 3:63) kan være forårsaket av tilstedeværelse av et pyrrolidonamid. De første to SCR av NH2-terminal LHR-A innbefattet i disse klonene er bare 61% identisk med den korresponderende regionen til LHR-B, mens SCR 3-7 til LHR-A er 99% identisk med korresponderende SCR til LHR-B (fig. 10). Sammenligning av LHR-A med LHR-C viser at bare tredje og fjerde SCR av hver er sterkt homologe (99% identisk). LHR-A og -D har bare 68% helhetlig identitet, med maksimal identitet på 81% mellom de seks SCR til hver LHR. Fullføring av 5' cDNA sekvensen til CR1 tyder på at F allotypen består av 2039 aminosyrer inkludert et 41 arninosyresignalpeptid, fire LHR til syv SCR hver, to ytterligere COOH-terminale SCR, en 25 rest transmembranregion og en 43 aminosyre cytoplasmadomene. Det er 25 potensielle N-bundede glykosyleirngsseter.

7.3. Diskusjon

Den primære strukturen til NH2-terminusen og signalpeptidet til F allotypen til CR1 er blitt avledet ved isolasjon og sekvensering av 5' cDNA klonene. Den sterkt repeterende naturen til CR1 sekvensen gjorde utvikling av en hensiktsmessig strategi for preparering og identifisering av cDNA klonene som koder for denne regionen av reseptoren meget kritisk. Et cDNA bibliotek ble preparert ved anvendelse som en primer et 35-mer oligonukleotid kjent for å hybridisere under betingelser med revers transkripsjon til LHR-B, -C og -C; og den muligheten ble betraktet at denne primeren også kan hybridisere til LHR-A som var blitt antatt å være meget homolog med LHR-B (se seksjon 6 ovenfor). Hensiktsmessige cDNA kloner ble identifisert ved anvendelse av et annet oligonukleotid, KS23,1, som bare hybridiserer til LHR-B under stringente betingelser, og derved øker sansynligheten for åfinne 5' cDNA kloner. To kloner ble funnet som omfatter nesten hele gjenværende sekvens av CR1, og et Sau3AI fragment av et av disse, CR1-18, hadde sekvens som var tilstrekkelig unik for å tillate anvendelsen derav ved identifikasjon av gjenværende 5' kloner (figurene 9,10).

En 250 bp probe fra 5' regionen av LHR-A, CRl-18, hybridiserte ikke bare til CR1 transkripter på 7,9 og 9,2 kb, men også til et 2 kb transkript i humant mandel RNA under stringente betingelser. Dette kryss-hybirdiserende mRNA ble ikke observert med CR1 cDNA prober fra andre LHR eller i Northern blotter av RNA fra dimentylsulfoksid-induserte HL-60 celler og HSB-2 T lymfoblastoide celler. CR1 inneholder dermed sekvenser som er homologe med to ytterligere B celleproteiner, et som blir kodet av dette nylig oppdagede mRNA og CR2.

8. EKSPRESJON AV REKOMBINANT HUMANT CR1

Som beskrevet ovenfor, er humane CR1 cDNA kloner blitt isolert som dekker 7,0 kb og inneholder en åpen leseramme kodende for 2039 aminosyrer (fig. 1). Den forslåtte forløperformen av reseptoren omfatter et 41 aminosyresignalpeptid, fire lange homologe gjentagelser (LHR) på 450 aminosyrer der hver LHR omfatter 7 korte konsensusgjentagelser (SCR), to COOH-terminale SCR på 65 aminosyrer, en 25 aminosyretransmembrandomene og en 43 aminosyre cytoplasmaregion. CR1 F allotypen inneholder dermed 30 SCR. NH2-terminal LHR, LHR-A (se seksjon 7, nedenfor), er 61% identisk med tilsvarende region til LHR-B i første to SCR og 99% identisk i COOH-terminale fem SCR. Restriksjonsfragmenter av åtte CR1 cDNA kloner ble spleiset for å danne en full-lengdekonstruksjon på 6,9 kb og plassert nedstrøms for en musemetallotioninpromoter eller en cytomegaloviruspromoter, og transfektert inn i L (muse) celler eller COS (ape) celler. Rekombinant celleoverflate CR1 ble detektert ved indirekte radioimmunoanalyse og immunofluorescens. Ikke noe antigen ble detektert på celler transfektert med bare parental vektor (CR1"). Immunopresipitasjon av transfekterte, overflate ^ 1- taerkede, COS (ape) celler ved anti-CRl monoklonalt antistoff, og analyse ved ikke-reduserende natriumdodecylsulfat (SDS) polyakrylamidgelelektroforese, ga 190,000 dalton molekylvektbånd som migrerte sammen med F allotypen fra humane erytrocytter. Ekspresjon av rekombinant CR1 antigen med riktig molekylvekt (Klickstein, L.B., et al., 1988, FASEB J. 2:A1833) tyder på at cDNA inneholder hele kodende sekvens til humant CR1.

8.1. Konstruksjon av plasmid pBSABCD. inneholdende hele CR1 kodende sekvensen Vi beskriver heri konstruksjon av plasmid pBSABCD, en vektor som koder for full-lengde (SCR 1-30) CR1 protein.

2,3 kb innskuddet fra cDNA klon XT8,2 (Klickstein, L.B., et al., 1987, J. Exp. Med. 165:1095; se seksjon 6, ovenfor) ble subklonet inn i pUC18 som et EcoRI fragment, slik at 5' enden var proksimalt for Hindin setet i plasmidpolylinkeren. Dette plasmidet ble betegnet pl 88,2. pl 88,2 ble kuttet med Apal og Hindin, og det store 4,7 kb fragmentet inneholdende CR1 sekvensen fra SCR 26 gjennom 3' utranslaterte regionen pluss vektorsekvensene ble gelrenset.

Innskuddet fra cDNA klon A,T50,1 (Klickstein, L.B., et al., 1987, J. Exp. Med. 165:1095; se seksjon 6, ovenfor) ble subklonet som et EcoRI fragment inn i M13mpl8. Denne fagen ble betegnet 18R50.1. DNA fra replikativ form av denne klonen ble kuttet med Hindlll og Apal, og 1,45 kb fragmentet inneholdende CR1 SCR 18-25 ble isolert, ligert til 4,7 kb fragmenter fra pl 88,2, og ligeringen transformert inn i E. coli DH5a . Dette plasmidet ble betegnet p8.250.1.

0,75 kb og 0,93 kb EcoRI fragmentene fra cDNA klon A.T8,3 (Wong, W.W., et al., 1985, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 22:7711) ble subklonet inn i plasmid pBR327. Disse subklonene ble betegnet pCRl-1 og pCRl-2, respektivt, og inneholdt hhv. SCR 11-14 og SCR 17-21. EcoRI innskuddene ble renset fra hverandre. 0,75 kb pCRl-1 fragmentet ble spaltet med Smal, og spaltingen ble ligert til pUC18 DNA spaltet med EcoRI og Smal. En subklon, pl81-l.l, med 0,5 kb innskudd korresponderende med SCR 12-14, ble isolert. 0,93 kb fragmentet til pCRl-2 ble spaltet med Hindin, og ligert til pUC19 spaltet med EcoRI og Hindffl, og en subklone pl91-2.1, ble isolert som inneholdt et 0,27 kb innskudd inneholdende SCR 17.

cDNA klon A/T6.1 (se seksjon 6, ovenfor; Klickstein, L.B., et al., 1987, J. Exp. Med. 165:1095; Wong, W.W., et al., 1987, J. Exp. Med. 164:1531) ble spaltet med EcoRI, og 0,37 kb fragmentet korresponderende med CR1 SCR 15 og 16 ble subklonet inn i pBR322. Denne klonene ble betegnet pCRl-4. Klon pl81-l.l ble spaltet med EcoRI og

Seal, og 1,4 kb fragmentet ble isolert. Klon pl91-2.1 (Klickstein, L.B., et al., 1987, J. Exp. Med. 165:1095; se seksjon 6, ovenfor) ble spaltet med EcoRI og Seal og 2,0 kb fragmentene ble isolert, ligert til 1,4 kb fragmentet fra pl 81-1.1, og blandingen ble transformert inn i E. coli DH5a. Det resulterende plasmidet ble betegnet p 1-11-2. Plasmid pl-11-2 ble spaltet med EcoRI, og 0,37 kb innskuddsfragment fra pCRl-4 ble skutt inn ved ligering. Det resulterende plasmidet ble anvendt for åtransformere E. coli DH5a.

En subklon ble valgt som inneholdt et 0,39 kb BamHI-Hindlll fragment. Dette plasmidet ble betegnet pl42 og inneholdt CR1 SCR 12-17. 3,5 kb EcoRI-Hindlll innskuddsrfagmentet fra p8.250.1 ble overført til pGEM3b. Dette plasmidet ble betegnet pG8.250.1. 1,2 Hindlll fragmenter frapl42 ble renset og ligert til pG8.250.1 som var blitt kuttet med HindHI. En subklon ble valgt som inneholdt et 2,4 kb Pstl-Apal innskudd, med dermed selektering av riktig orientering. Dette plasmidet ble betegnet pCD og inneholdt CR1 sekvenser fra SCR 12 til og med 3' enden.

cDNA klon A.5'7.1 (Klickstein, L.B., et al., Sept. 1987, Complement 4:180; se seksjon 7, ovenfor) ble kuttet med Pstl, og 1,35 kb fragmentet tilsvarende SCR 6-12 ble isolert og ligert til Pst-I kuttet pCD. Blandingen ble transformert, og en subklon ble selektert som inneholdt 1,35 kb og 1,1 kb Hindin fragmenter. Denne klonen ble betegnet pBCD.

cDNA klon A.5'3.1 (Klickstein, L.B., et al., 1987, Complement 4:180; se seksjon 7, ovenfor) ble kuttet med EcoRI og spaltningen ble ligert til EcoRI-kuttet pUCl 8. En subklon, p3.11-1, ble isolert, som inneholdt et 1,0 kb innskudd tilsvarende SCR 3-7, der innskuddet ble gelrenset. cDNA klon _5'10.3 (Klickstein, L.B., et al., 1987, Complement 4:180; se seksjon 7, ovenfor) ble spaltet med EcoRI, og 0,63 kb innskuddet inneholdende SCR 1 og 2 ble subklonet inn i pUC18. Denne klonen ble betegnet pl0.3.5. Plasmid pl0.3.5 ble delvis spaltet med EcoRI, og et 3,4 kb fragment tilsvarende lineært plasmid ble isolert og ligert med 1 kb fragmentet fra p3.11-1. En subklon, pLA, ble plukket, som inneholdt et 1,3 kb Pst-I fragment, i riktig innskuddssted og orientering.

cDNA klon A.T109.4 (Klickstein, L.B., et al., 1987, Complement 4:180; se seksjon 7, ovenfor) ble spaltet med EcoRI, og subklonet inn i pUC18. En subklon ble valgt som inneholdt et 0,55 kb EcoRI fragment korresponderende til 5' utranslaterte regionen gjennom ledersekvensen og SCR 1 og 2. Plasmid pl09.4 ble spaltet med Pstl og BspMII, og et 3,0 kb fragment inneholdende vektor, ledersekvens og SCR 1, ble isolert.

Fragmenter ble ligert til et 0,81 kb Pstl-BspMII fragment fra pLA som inneholdt SCR 2-5. Dette nye plasmidet ble betegnet pNLA. Plasmid pNLA ble delvis spaltet med EcoRI og fullstendig spaltet med Pstl, og et 1,1 kb EcoRI-Pstl fragment inneholdende CR1 sekvensen fra ledersekvensen gjennom SCR 5 ble isolert og ligert til pBluescript KS+ (Stratagene, San Diego, CA) for å kutte et Xhol sete på 5' siden av cDNA. Dette plasmidet ble betegnet pXLA.

Plasmid pBCD ble spaltet med EcoRV og deretter delvis spaltet med Pstl, og et 6,0 kb Pstl-EcoRV fragment inneholdende CR1 sekvensen fra SCR 6 gjennom 3' utranslaterte regionen ble isolert og ligert til Pstl + Smal-spaltet pXLA. Det resulterende bakterielle ekspresjonsplasmidet, som inneholder hele CR1 cDNA kodende sekvensen ble betegnet

pBSABCD.

8.2. Konstruksjon og analyse av plasmid piABCD. en pattedvrekspresionsvektor inneholdende hele CR1 kodende sekvens

pBSABCD plasmid ble spaltet med Xhol og Noti, og innskuddet ble ligert nedstrøms fra CMV promoteren i 4.4 kb fragmentet til ekspresjonsvektor CDM8 (Seed, B., 1987, Nature 329:840-842), som også var blitt kuttet med disse restriksjonsenzymene. Den resulterende konstruksjonen ble betegnet piABCD (fig. 11). Alternativt ble 6,9 kb Xhol-Notl fragmentet ligert nedstrøms fra metallotioneinpromoteren i ekspresjonsvektor, pMT.neol, som også var blitt spaltet med disse restriksjonsenzymene. Den resulterende konstruksjonen ble betegnet pMTABCD (fig. 11).

Saueerytrocytter sensibilisert med kaninantistoff (EA) og begrensende mengder C4b [EAC4b(lim)] og 12,000 cpm <125>I-C3b pr. celle [EAcC4b(lim),3b] ble preparert ved sekvensiell behandling av EAC4b(lim) (Diamedix) med Cl, C2 og ^^ 1- C3 etterfulgt av inkubasjon i 60 minutter ved 37°C i gelatin veronal-bufret saltvann inneholdende 40 mM EDTA. Alternativt ble metylamin-behandlet C3 [C3(ma)] kovalentlig knyttet til saue E (erytrocytter) behandlet med 3-(2-pyridylditio)propionsyre N-hydroksysuksinimidester (Sigma) (Lambris, J.D., et al., 1983, J. Immunol. Methods 65:277). EAC4b ble preparert med renset C4 (Hammer, C.H., et al., 1981, J. Biol. Chem. 265:3995).

Både piABCD og pMTABCD ble transfektert ved DEAE (dietylaminoetyl)-dekstran fremgangsmåten inn i COS (ape) celler. Rekombinant CR1 ble detektert på overflaten av transfekterte celler ved immunofluorescens ved anvendelse av anti-CRl monoklonalt antistoff, YZ-1; og ved immunopresipitasjon av <125>i_merke(je celler etterfulgt av ikke-reduserende SDS-PAGE, som viste et protein med en mobilitet identisk med den til CR1 immunopresipitert fra humane erytrocytter til en donor som er homozygot for F allotypen (Wong, W.W., et al., 1983, J. Clin. Invest. 72:685), og ved dannelsen av rosetter med saueerytrocytter belagt med C3b (Fearon, D.T., 1980, J. Exp. Med. 152:20). Identiske elektroforetiske mobiliteter til native og rekombinante CR1 proteiner bekreftet at CR1 F allotypen inneholder SCR 1-30. 1 tillegg ble murine L celler ko-transfektert ved DEAE-dekstranmetoden (Ausubel, F.M., et al., 1987, Current Protocols in Molecular Biology, Seidman, J.G. og Struhl, K., eds., John Wiley & Sons, New York; Seed, B., 1987, Nature 329:840) i duplikat med 0, 2 eller 4 ug av enten piABCD eller pMTABCD og 2 ug pXGH5, et reporterplasmid som leder ekspresjon av veksthormon (Seiden, R.F., et al., 1986, Mol.Cell. Biol. 6:3173). Cellene ble høstet etter to dager og analysert for ekspresjon av CR1 ved binding av YZ1 monoklonalt antiCRl antistoff. Det var et doseresponsforhold mellom rekombinant plasmid DNA og ekspresjon av CR1 antigen (tabell II).

Plasmid, piABCD, ledet ekspresjon av neste tre-ganger mere CR1 antigen enn pMTABCD. Veksthormonkonsentrasjonen i kulturmediet varierte med mindre enn to-ganger med unntagelse av plate 5. Ytterligere eksperimenter viste at piABCD ledet den transiente ekspresjonen av tre-ganger mere CR1 antigen i COS celler enn i L-cellene.

CR1 antigenet var tilstede i clustere på overflaten av transfekterte COS celler ifølge vurdering ved indirekte immunofluorecens av celler farget med YZ1 anti-CRl mAB (fig. 12). Denne distribusjonen av rekombinant CR1 på COS celler ligner en til vildtype CR1 på humane leukocytter (Fearon et al., 1981, J. Exp. Med. 153:1615).

Molekylvekten til rekombinant CR1 ble bestemt ved overflatejodinering av COS celler transfektert med piABCD, immunopresipitasjon av cellelysater med Sepharose-YZl, SDS-PAGE og autoradiografi. Rekombinant CR1 hadde en molekylvekt på 190,000 uredusert, som er ekvivalent med den til F allotypen og mindre enn den til S allotypen til erytrocytt CR1 (fig. 14).

C3b-binding og C4b-bmdmgsfunksjonen til rekombinant til CR1 ble analysert ved dannelsen av rosetter mellom transfekterte COS celler og EAC4b eller EAC4b(lim),3b. 131 separate transfeksjoner bandt 5-50% av COS cellene transfektert med plasmid, piABCD, fem eller mere EAC4b eller EAC4b(lim),3b (fig. 13). COS celler som uttrykker CR1 dannet ikke rosetter med EAC4b(lim),3bi, til tross for at dette intermediatet dannet rosetter med Raji B lymfoblastoidceller som uttrykker CR2.

8.3. Ekspresjon av CR1 fragmenter

Ekspresjonsvektorer som koder for del av CR1 kodende sekvens (delesjonsmutanter) ble konstruert som beskrevet nedenfor, og vist å uttrykke deres respektive CR1 innskudd når transformert inn i COS celler. CR1 fragmentene ble uttrykt som celle-overflateproteiner.

8.3.1. Konstruksjon av delesionsmutantene piBCD, piABD, piACD. piAD. piBD, piCD og piD

Konstruksjon av disse delesjonsmutantene ble utført ved åtrekke fordel av tilstedeværelsen av et enkelt Bsml sete i en homolog posisjon nære amino-terminus til hver av de fire CR1 lange homologe gjentagelsene (LHR), og fravær av Bsml seter ellers i CR1 cDNA og Bluescriptvektor (Stratagene, San Diego, CA). 10 ug av plasmid pbSABCD ble delvis spaltet med 50 enheter restriksjonsenzym Bsml i 45 minutter, og spaltningen ble fraksjonert ved agarosegelelektroforese. DNA fragmenter på 8,55 kb, 7,20 kb og 5,85 kb ble renset, tilsvarende lineære segmenter av foreldreplasmidet som mangler 1,2 eller 3 LHR, respektiv. Hver av de tre fragmentene ble ligert til seg selv og legeringene ble anvendt separat for å transformere kompetente E. coli DH5a til ampicillinresistens.

8,55 kb fragmentet ble dannet som en konsekvens av spaltning av pBSABCD ved to ved siden av liggende Bsml seter, og det er dermed tre mulige produktplasmider etter legering, pBCD, pACD eller pABD, hvor hele tall representerer LHR som er i plasmidet. Disse kan sjeldnes ved restriksjonskartlegging med Smal. DNA ble preparert fra 12 kolonier, spaltet med Smal og separert ved agarosegelelektroforese. Fem kloner hadde to Smal fragmenter på 2,5 kb og 6,1 kb, tilsvarende delesjon av den kodende sekvensen til LHR-A, som dermed representerer pBCD. Tre kloner hadde et enkelt lineært fragment på 8,5 kb tilsvarende pACD. Fire kloner hadde to Smal fragmenter på 1,2 kb og 7,4 kb, som var ventet for delesjon av den kodende sekvensen til LHR-C, produserende pABC. 5,6 kb innskuddet til hver av disse tre konstruksjonene ble gelrenset etter dobbeltspaltning med Xhol og Noti, og ligert til ekspresjonsvektor CDM8 som var blitt gel-renset etter spaltning med samme restriksjonsenzymer. E. coli DK1/P3 ble transformert med ligeringsblandingene og DNA ble preparert fra fem kolonier av hver. Tilstedeværelse av deletert CR1 cDNA innskudd i ekspresjonsvektoren ble vist i hvert tilfelle ved SacI spaltning, som viste de ventede to fragmentene på 4,20 kb og 5,75 kb. Disse plasmidene ble betegnet piBCD, piACD og piABD.

7,20 kb fragmentet fra partiell spaltning av pBSABCD var en konsekvens av Bsml spaltning ved tre ved siden av liggende seter eller, ekvivalent med hensyn på det store fragmentet, ved to seter med et enkelt ukuttet sete mellom dem, slik at det dermed var to mulige produkter oppnåelig etter transformasjon, pAD og pCD. Disse ble sjeldnet ved dobbeltspaltning med Xhol og Pstl, som ga to fragmenter på 1,0 kb og 6,2 kb når det gjelder pAD, og et lineært fragment på 7,2 kb for pCD. 4,2 kb innskuddet fra hvert av disse plasmidene ble gel-renset etter dobbeltspaltning med Xhol og Noti, og subklonet inn i CDM8 som ovenfor. Tilstedeværelse av deletert CR1 cDNA i ekspresjonsvektoren ble vist ved dobbeltspaltning med Pstl og Bglll. Klon piAD hadde fragmenter på 2,4 kb

og 6,2 kb, mens piCD hadde et enkelt fragment på 8,6 kb.

5,85 kb fragmentet fra Bsml spaltning av pBSABCD representerer et produkt med fullstendig spaltning og en enkelt klon, pD, ble tilveiebragt etter transformasjon av E. coli DH5a. Dette ble bekreftet ved dobbeltspaltning med Hindin og Bgffl som ga de ventede 3,7 kb og 2,2 kb fragmentene. 2,9 kb innskuddet til klonen ble gel-renset etter dobbeltspaltning med Xhol og Noti og ligert til ekspresjonsvektoren som ovenfor. HinoTII spaltning av den resulterende piD klonen ga det ventede 7,3 kb fragmentet, en Xhol + Bgin dobbeltspaltning ga 2,2 kb og 5,1 kb fragmenter, og en SacI spaltning resulterte i de ventede 1,5 kb og 5,8 kb fragmentene.

Plasmid pBD ble preparert ved Bsml delvis spaltning av pBCD. Det lineære 7,2 kb fragmentet korresponderende med spaltning av to ved siden av liggende Bsml seter ble gel-renset, selvligert som ovenfor og E. coli DH5oc ble transformert til ampicillinresistens. pBD ble identifisert ved tilstedeværelse av 1,2 kb og 6,0 kb fragmenter ved Smal spaltning. 4,2 kb innskuddet ble renset etter dobbeltspaltning med Xhol og Noti, og overført til CDM8 som ovenfor. Klon piBD ble bekreftet ved observasjon av de ventede 0,8 kb og 7,8 kb fragmentene etter Hindin spaltning. COS cellene med transient ekspresjon av piABCD, piBCD, piCD og piD konstruksjoner, respektivt, ble overflatemerket med og immunopresipitert med anti-CRl antistoff. Ved SDS-PAGE etter reduksjon komigrerte produktet til piABCD konstruksjonen med F allotypen til CR1, mens delesjonsmutantene demonstrerte trinnvise reduksjoner på omtrent 45,000 dalton, som henholdsvis indikerer delesjon av 1,2 og 3 LHR (fig. 17).

8.3.2. Konstruksjon av delesjonsmutantene piPl, piEl. piE2. piE- 2. piUl. piU- 2 og piA/ D

Plasmid piABCD ble fullstendig spaltet med BstEn og de to fragmentene ved 1,35 kb (en dublett) og 8,6 kb ble gel-renset, blandet og ligert, og E. coli DK1/P3 ble transformert til ampicillin og tetracyklinresistens. Kolonier ble screenet ved hybridisering med CR1 cDNA probe CR1-4 (se seksjon 8.1, ovenfor), og sterkt positive kloner ble plukket og ytterligere screenet ved spaltning med Smal. piEl ble identifisert ved tilstedeværelse av to fragmenter ved 2,7 kb og 7,3 kb, og piE2 ble identifisert ved et enkelt 10,0 kb lineært fragment. piE-2 ble identifisert som en svak CR 1-4 positiv klon som inneholdt et enkelt 8,6 kb Smal fragment.

Plasmid piPl ble tilveiebragt ved fullstendig spaltning av piABCD med Pstl og gel-rensning av det store, 10,0 kb fragmentet. Dette fragmentet ble ligert og E. coli DK1/P3 ble transformert med blandingen. Det resulterende plasmidet, piPl, inneholdt et enkelt, 10,0 kb Smal fragment.

Plasmidene piUl og piU-2 ble preparert ved først transformering av dem" stamme GM271/P3 med plasmid pXLA, og isolering av DNA. Dette DNA ble dobbeltspaltet med Stul og Noti, og 3,3 kb fragmentet ble gel-renset. Plasmid pBSABCD ble delvis spaltet med Nsil, og resulterende fire basepar 3' overhengende ble fjernet ved behandling med Klenow fragmentet til E. coli DNA polymerase I. DNA'et ble deretter fullstendig spaltet med Noti, og fragmentene på 5,4 kb og 4,0 kb ble gel-renset. Disse ble ligert til 3,3 kb Stul-Noti fragmentet frapXLA, og ligeringsblandingen ble anvendt for å transformere E. coli DH5_ til ampicillinresistens. Kolonier ble screenet ved hybridisering til CR1 cDNA probe CR1-4, og positive kloner ble ytterligere sjekket ved restriksjonsspaltning med Hindlll som ga tre fragmenter på 0,8 kb, 1,3 kb og 6,5 kb for pUl, og to fragmenter på 0,8 kb og 6,5 kb for pU-2. Stul-blutendet Nsil spleis ble bekreftet å være i ramme ved DNA sekvensering av disse plasmidene. Innskuddene til pUl og pU-2, hhv. 5,6 kb og 4,2 kb, ble gel-renset etter Xhol og Noti dobbeltspaltning, og ble ligert til ekspresjonsvektor CDM8 som beskrevet ovenfor. Strukturene til klonene, piUl og piU-2, ble bekreftet ved restriksjonsspaltning med Xhol + Pstl, som tilveiebringer de ventede to fragmentene på 1,2 kb og 8,8 kb for piUl og et lineært 8,7 kb fragment for piU-2.

Plasmid piA/D ble preparert ved først fullstendig spaltning av piABCD med Pstl, Pstl spaltningen ble deretter delvis spaltet med Apal, og 3' overhengene ble fjernet med Klenow fragmentet til E. coli DNA polymerase I. DNA ble deretter fraksjonert ved agarosegelelektroforese og 7,5 kb fragmentet ble isolert, ligert og anvendt for å transformere E. coli DK1/P3 til ampicillin og tetracyklinresistens. Konstruksjonen ble bekreftet ved dobbeltspaltning med Kpnl + SacI, som ga de ventede fire fragmentene på 0,8 kb, 1,5 kb, 1,7 kb og 3,3 kb.

9. EKSEMPEL: IDENTIFIKASJON AV C3b og C4b BINDENDE DOMENER

9.1. Assavs og resultater

Plasmidene PiABCD, piAD, piCD og piD, inneholdende LHR(er) angitt ved store bokstaver i navnet, ble transformert inn i COS celler, som ble anvendt i assays for å vurdere evnen til deres kodede CR1 fragmenter til å binde C3b eller C4b. Bindingsassayene ble utført ved observasjon av erytrocyttrosettering resulterende fra binding av C3b eller C4b-belagte røde celler ved COS celler som uttrykker et full lengde CR1 molekyl eller CR1 delesjonsmutant på deres celleoverflate (transient ekspresjon). Transfekterte celler, 1-4 x lOf<y>ml, ble inkubert med C3- eller C4-bærende erytrocytter, 2-6 x 10<8>/ml, i 0,02 ml i 60 minutter ved 20°C. Prosentandel av transfekterte celler som danner rosetter ble vurdert mikroskopisk idet en transfektert celle ble vurdert som en rosett dersom det var minst fem adherente erytrocytter. Resultatene er vist i tabell Ul.

I hvert av tre separate eksperimenter var andel COS celler som uttrykker full-lengde piABCD konstruksjonen som dannet rosetter med EC3(ma) lik fraksjonen som har påvisbar rekombinant reseptor, som vurdert ved immunofluorescens ved anvendelse av en YZ1 monoklonalt anti-CRl antistoff eller kanin anti-CRl antiserum (tabell III). I kontrast, celler som uttrykker piD dannet ikke rosetter, og dette tyder på at et C3-bindingssete(er) må være i eller kreve tilstedeværelse av LHR-A, -B eller -C. Et sete ble vist å være tilstede i både LHR-B og -C ved demonstrering av cellene som uttrykker enten piBD eller piCD konstruksjoner dannet rosetter med EC3(ma). Celler som uttrykker piAD, piA/D eller piE-3 hadde ikke tilsvarende C3-bindende fuksjon. På grunn av at piE-2 konstruksjonen er forskjellig fra piCD bare i å ha SCR-1 og -2 til LHR-A isteden for første to SCR til LHR-C, må funksjonen av C3-bindingssetet i LHR-C ha disse NH2-terminale SCR.

Proporsjon av COS celler som uttrykker full-lengde piABCD rekombinant som dannet rosetter med EC4(ma) var mindre enn fraksjonen som dannet rosetter med EC3(ma), som kanskje reflekterer færre C4(ma) pr. erytrocytt (tabell III) eller færre C4-bindingsseter pr. reseptor. Delesjonsmutanter som har hele eller deler av LHR-A, pi AD, piA/D og piE-2 konstruksjoner, bandt EC4(ma) bedre enn det delesjonsmutanter, piBD og piCD gjorde; idet piD manglet denne funksjonen. C4-bindingssetet til CR1 ligger hovedsakelig i LHR-A, til tross for at sekundære seter kan være tilstede i LHR-B og -C. Den forbedrede rosetteringsevnen til piE-2 konstruksjonen relativt til piCD foreslår at SCR-1 og -2 til LHR-A er involvert i C4-bindingssetet.

Radioimmunoanalyse av binding av YZ1 monoklonalt anti-CRl antistoff indikerte signifikant opptak ved COS celler som uttrykker piABCD, piAD, piBD og piCD konstruksjoner (tabell IV). Celler transfektert med piD eller piA/D, som består av fem NH2-terrninale SCR til LHR-A og tre COOH-terminale SCR til LHR-D, bandt ikke YZ1 anti-CRl antistoff, til tross for at produktene til disse konstruksjonene bandt polyklonalt anti-CRl antiserum (tabell IV). YZ1 epitopen blir gjentatt i LHR-A, -B og - C, er ikke tilstede i NH2-terminale SCR til LHR-A, og er ikke tilstede eller er utilgjengelig i LHR-D.

TABELL IV

Binding av monoklonalt og polyklonalt anti-CRl antistoff til COS celletransfektanter som uttrykker rekombinante former av CR1

9.2. Diskusjon

Det konserverte Bsml setet som er funnet i midten av den kodende sekvensen til første SCR i hver LHR muliggjorde konstruksjon av en serie delesjonsmutanter som

korresponderte nære med grensene til LHR, og som opprettholdte den åpne leserammen og hensiktsmessige posisjoner til de fire cysteinene som er nødvendige for dannelse av disulfidbinding (fig. 16). Sammenligning av C3(ma)- og C4(ma)-bindingsfunksjoner til disse delesjonsmutantene sjeldnet ikke bare LHR som har disse spesifisiteter, men også de SCR som er kritiske for bestemming av ligandspesifisiteten. Kapasiteten til piAD, piA/D og piE-2 formene av reseptoren, men ikke piD formen, til å formidle rosettdannelse mellom transfekterte COS celler og EC4(ma) indikerte at NH2-terminale to SCR til LHR-A inneholdt et sete for interaksjon med dette kompiementproteinet (tabell III). Dette setet var bare relativt spesifikt for C4(ma) p.g.a. at transfektanter som uttrykker piAD og piA/D også kunne binde EC3(ma) (tabell III). C3(ma)-bindingsfunk-sjonen til reseptorene kodet av piBD og piCD konstruksjonene, demonstrerte ved rosettanalyse og faktor I-kofaktofrunksjon for spaltning av C3(ma) (tabell III; fig. 18), indikerte tilstedeværelse av seter spesifikke for C3(ma) i første to SCR til disse LHR. Disse setene kunne også reagere med C4(ma) (tabell III). Det er foretrekkbart, men overlappende, C4- og C3-bindingsaktiviteter i LHR-A, -B og -C.

Alternativt, kapasiteten til COS cellene som uttrykker piBD og piCD konstruksjonene til å binde EC4(ma) kan ha blitt forårsaket av overføring av nukleotider kodende for NH2-terminale 36 aminosyrer fra SCR-1 LHR-A til LHR-B og -C gjennom ligering av Bsml fragmenter. Disse 36 aminosyrene alene virket ikke på piD produkt C4-rosetterende funksjonen. Vi kan ikke ekskludere en sekundær funksjon av LHR-D i disse reaksjonene p.g.a. at denne LHR var tilstede i alle konstruksjonene analysert for funksjon. Funnet av tre bestemte ligandgjenkjenningsseter i CR1, to for C3b og en for C4b (fig. 19), indikerer at hvert reseptormolekyl kan tilveiebringe effektiv binding av komplekser som bærer multiple C4b og C3b molekyler til tross for å ha relativt lav affinitet for monovalente ligander (Arnaout, M.A., et al., 1983, Immunology 48:229). Dette funnet tilveiebringer også en forklaring for den manglende evnen som oppløselig C4b har til å hemme dannelsen av rosetter mellom erytrocytter som bærer C3b og en human B lymfoblastoid cellelinje (Gaither, T.A., et al., 1983, J. Immunol. 131:899). Mulige ligander som CR1 vil være spesielt tilpasset for kan være de molekylære kompleksene C4b/C3b og C3b/C3b, som blir dannet i løpet av aktivering ifølge klassisk og alternativ reaksjonsvei, respektivt. P.g.a. at det er distinkte bindingsseter i tre av fire LHR, kan CR1 strukturelle allotyper som er forskjellige i antallet LHR ha betraktlige funksjonelle forskjeller forårsaket av variasjoner i antall ligandbindingsseter. Til tross for in vitro studier ikke har rapport forskjellige bindingsaktiviteter til F, S og F' (A, B og C, respektivt) allotypene, kan mindre F1 allotypen som sansynligvis bare har tre LHR kan ha en dårligere evne til å fjerne immunkomplekser. F allotypen er blitt rapportert å muligens være assosiert med systemisk lupus erythematosus (van Dyne, S., et al., 1987, Clin. Exp. Immunol. 68:570).

10. EKSEMPEL: DEMONSTRASJON AV FAKTOR I KOFAKTORAKTIVITET

Rekombinant CR1 protein og spesifikke fragmenter derav, i både celle-overflate og solubiliserte former, ble demonstrert å ha C3b faktor I kofaktoraktivitet.

Assays av faktor I kofaktoraktivitet ble utført ved modifikasjoner av en publisert prosedyre (Fearon, D.T., 1979, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 76:5867).

For assays av faktor I kofaktoraktivitet til solubiliserte CR1 og fragmenter, ble celle-overflate CR1 protein og fragmenter solubilisert med Nonidet P-40, og lysatet ble immunopresipitert med anti-CRl monoklonalt antistoff YZ1 koblet til Sepharose-kuler. Detergentlysater på 1 x 10^ transfekterte COS celler ble immunopresipitert sekvensielt med Sepharose UPC10 anti-levan og Sepharose-YZl. Immunupresipitatet ble deretter analysert for faktor I kofaktoraktivitet ved inkubasjon av vaskede kuler i 60 minutter ved 37°C med 0,5 ug <125>I-C3(ma) og 200 ng faktor I i 0,05 ml PBS, 0,5% NP-40. Etter inkubasjon ble supernatanten inneholdende radiomerket C3(ma) analysert ved SDS-polyakrylamidgelelektroforese og autoradiografi. Faktor I kofaktoraktivitet ble indikert ved tilsynekomst på autoradiogram av lavere molekylærvektsformer av a-kjeden til C3(ma) resulterende fra proteolytisk spaltning ved faktor I.

For assays av faktor I kofaktoraktivitet til celleoverflate CR1 og fragmenter ble transfekterte COS celler inneholdende en CR1 ekspresjonsvektor (piABCD, piAD, piBD, piCD, eller piD, beskrevet ovenfor) inkubert med 0,5 ug <125>j_c3(ma) og 0,2 ug faktor I (Fearon, D.T., 1977, J. Immunol. 119:1248), og analysert som beskrevet ovenfor.

Faktor I-kofaktoraktiviteten til celle-overflaterekombinant CR1 er vist i fig. 15. Faktor I spaltet a-kjeden til C3(ma) til fragmenter med molekylvekter på 76,000 og 46,000 bare i nærvær av immunoimmobilisert, rekombinant CR1 eller faktor H (fig. 15). Regioner korresponderende med båndene fra autoradiogrammet ble kuttet ut fra gelen og analysert for <125>j for å bestemme mengden av a-kjeden som var spaltet. I nærvær av faktor H ble 91% av a-kjeden spaltet mens i nærvær av økende mengde rekombinant CR1, ble 26%, 41% og 55% spaltet. Til tross for COS cellene transfektert med CDM8 vektoren alene inneholdt en viss endogen faktor I-kofaktoraktivitet, var en økning i denne funksjonen klart med COS celler transfektert med piABCD, piBD og piCD (fig. 18). Ingen forsterket spaltning av ^ l- C3( ma) ble sett med COS celle transfektert med piAD eller piD. Blant disse konstruksjonene hadde bare delesjonsmutantene piBD og piCD, som betraktt på COS celler en kapasitet for binding av C3, også hadde faktor I-kofaktoraktivitet for spaltning av C3.

Resultatene av analysene for faktor I kofaktoraktivitet med både celle-overflate og solubiliserte former av CR1 og fragmenter derav er vist i tabell V.

Som vist i tabell V, produserte ekspresjon av piABCD (kodende for et full-lengde CR1 protein), piBD (kodende for LHR-B og -D) eller piCD (kodende for LHR-C og -D) et CR1 produkt med C3b faktor I kofaktoraktivitet. Data i tabell V tyder derfor på at CR1 proteinet eller et fragment derav kan fremme komplementinaktivering.

11. EKSEMPEL: EKSPRESJON AV REKOMBINANT OPPLØSELIG CR1

CR1 cDNA ble modifisert ved rekombinante DNA prosedyrer slik at en oppløselig form (sCRl) av CR1 eller CR1 fragmenter ble produsert. sCRl konstruksjonene ble uttrykt i et pattedyrsystem hvor det uttrykte proteinet ble utskilt fra cellene. Store mengder av oppløselige polypeptider ble produsert, som i kontrast til den membranbundede formen av CR1 proteinene ikke behøvde å bli oppløst for å få dem i oppløsning.

11.1. Materialer og fremgangsmåter

11.1.1. Enzvmspaltninger

Alle restriksjonsenzymspaltninger, linkerlegeringer og T4 DNA ligase og E. coli DNA polymerasereaksjoner ble utført ifølge forhandlerens (New England Biolabs, Inc., Beverley, MA) anbefalinger. E. coli DH1 eller DH5_ ble gjort kompetente ved fremgangsmåten til Morrison, D.A., 1979, Meth. Enzymol. 68:326:331. Kompetente bakterielle celler ble transformert med DNA ifølge Maniatis, T., et al., 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York. Plasmider ble renset ved alkalisk lysering eller ved kokefremgangsmåten (Maniatis, T., et al., ovenfor).

11.1.2. DNA fragmentisoleringer

DNA fragmenter ble renset fra agarose (BioRad, Richmond, CA) geler som følger. Hensiktsmessige DNA bånd ble kuttet ut fra gelen ved anvendelse av en kniv, og agarosebiten ble plassert på et parafilmstykke, kuttet til meget små biter og overført til et nytt parafilmstykke. Agarosestykkene ble knust og agarosen overført til et 1,5 ml rør. Et likt volum fenol (ultrarent, BRL, Gaithersburg, MD) ble tilsatt, blandingen vortekst, deretter frosset ved -70°C i 10 minutter og sentrifugert i 10 minutter. Den vandige fasen ble ytterligere ekstrahert to ganger med fenol/kloroform (1:1) og to ganger med kloroform. DNA ble deretter etanolpresipitert, pelleten vasket, tørket i vakuum og resuspendert i 10 mM Tris-HCl, ph 7,0,1 mM EDTA.

DNA fragmentene ble isolert fra agarose med lav geldannende temperatur (FMC, Corp., Rockland, ME) som følger. Hensiktsmessig DNA bånd ble kuttet ut fra agarosegelen, plassert i et 1,5 ml rør og smeltet ved 65°C i 15 minutter. Den flytendegjorte gelen ble ekstrahert med fenol inneholdende 0,1% natriumdodecylsulfat (SDS, ultraren, BRL, Gaithersburg, MD). Den vandige fasen ble ytterligere ekstrahert en gang med fenol-SDS og to ganger med kloroform. DNA ble deretter etanolpresipitert i 2,0 m NH4acetat, tørket og resuspendert i vann.

11.1.3. Transfeksion inn i patted<y>rceller

Transfeksjon av DNA inn i pattedyrceller ble utført ved CaP04 presipitasjon og glyserolsjokkprosedyren til Graham og van der Eb (1973, Virology 52:456-467). DUX Bil CHO cellene ble etter å ha vært inkubert med DNA-kalsiumfosfatprepareringen i 4 til 6 timer utsatt for glyserolsjokk ved fjering av vekstmediumet ved oppsuging og tilsetning av 5 ml 20% glyserol DMEM medium i 1 minutt. Cellene ble deretter vasket to ganger i fullstendig a MEM og inkubert i dette mediet i 48 timer.

11.1.4. CHO transfektantcellekultur

DUX Bil CHO celletransfektanter ble dyrket i DHFR (dihydrofolatreduktase) seleksjonsmedium bestående av a MEM medium (Gibco) uten nukleosider, supplementert med 10% dialysert fetalt kalveserum (Gibco) og 4 mM L-glutamin. Amplifikasjon ble utført ved dyrking av cellene i økende konsentrasjoner metotreksat (Sigma, #A-6770, Amethopterin) (Kaufman, R.J., et al., 1985, Molec. Cell Biol. 5:1750:1759).

11.1.5. ELISA for deteksjon av oppløselige CR1 nivåer

11.1.5.1. CR1 standarder

Detergentlysater av hemoglobin-frie røde blodcelle (RBC) antydninger (ghosts) ble anvendt som en CR1 standard i ELISA (enzym-bundet immunosorbent analyse). Antydningene ble preparert som tidligere beskrevet (Wong, W.W. og Fearon D.T., 1987, Meth. Enzymol. 150:579-585). Utgått fullblod ble tilveiebragt fra Røde Kors. Røde celler ble vasket tre ganger i PBS, deretter lysert i 6 volum hypotomisk lyseringsbuffer (10 mM Tris pH 8,0,1 mM PMSF (fenylmetylsulfonylfluorid), 0,1 mM TPCK (tosylamidfenyletylklormetylketon), aprotonin, 2 mM EDTA). Antydningene ble vasket flere ganger i lyseringsbuffer, telt i et hemocytometer, alikvotet og frosset ved -70°C inntil bruk. For CR1 ELISA ble anty(lningene fortynnet til 1,6 x 10<8 >antydninger/ml i solubiliseringsbuffer (10 mM Tris pH 8, 50 mM KC1,0,1% NP40, 0,3% DOC, 6,2 mM PMSF, 0,2 mM jodacetamid, aprotonin, 0,1 mM TPCK, 2 mM EDTA, 0,2% NaN3) og fortynnet i serie til 2,5 x 10^ antydninger/ml for anvendelse som standarder i ELISA. Absorbans ved 490 nm ble plottet og ukjent prøvekjøring ble referert til plotten for å oppnå antydningssekvivalenter/ml.

11.1.5.2. CR1 ELISA

Immulon-II plater ble belagt med 100 ul/brønn av en 0,4 ug/ml konsentrasjon av et anti-CRl monoklonalt antistoff (klon J3D3, AMACIOT 17) (Cook, J., et al., 1985, Molec. Immunol. 22:531-538) i PBS og inkubert over natt ved 4°C. Antistoffoppløsningen ble deretter fjernet og platene ble blokkert ved tilsetning av blokkeringsbuffer (1,0% BSA i PBS) ved 300 ul/brønn og inkubering ved 37°C i 2 timer. Etter blokkering ble skålene øyeblikkelig anvendt eller lagret ved 4°C til bruk.

Platene ble vasket tre ganger ved anvendelse av PBS inneholdende 0,05% Tween-20. Prøvene ble tilsatt ved 100 ul/brønn i duplikat og inkubert i 2 timer ved 37°C. Om nødvendig ble prøvene fortynnet i solubiliseirngsbuffer. Standard RBC antydninger ble inkludert ved hver plate. Etter prøveinkubasjon ble platene vasket tre ganger og et konjugat (Wilson, M.B. ogNaKane, P.K., 1978, Immunofluorescens and Related Staining Techniques, North Holland Biomedical Press, s. 215-224) av pepperrotperoksidase (HRP) og monoklonalt antistoff YZ1 (Changelian, P.S., et al., 1985, J. Immunol. 184:1851-1858) ble fortynnet 1:8,000 i 50% FCS, 50% blokkeringsbuffer og tilsatt i 100 ul/brønn. Etter inkubering i 2 timer ved 37°C ble platene igjen vasket tre ganger med PBS inneholdende 0,05% Tween-20. Substratet ortofenylendiamin (OPD) ble tilsatt ved 0,2% konsentrasjon i substratbuffer (0,36% sitronsyre H20,1,74% Na2HP04 • 7H20,0,1% timerosal, 0,4% H2O2, pH 6,3) i 100 ul/brønn. Reaksjonen ble stoppet etter 20 minutter ved romtemperatur ved anvendelse av 50 ul/brønn av 2 N H2SO4. Absorbans ved 490 nm ble avlest.

11.2. Genetiske modifikasjoner av CR1 kodende sekvenser

CR1 cDNA består av omtrent 6,951 nukleotidbasepar (fig. 1, seksjonene 6,7, ovenfor). Translasjonsstoppsignalet til nativt cDNA er beliggende ved basepar 6145. Proteinet er et membran-bundet reseptormolekyl bestående av fire lange homologe gjentagelser (LHR) som er eksponert på den ytre overflaten av cellemembranen, pluss en membran-dekkende domene på omtrent 25 aminosyrer, etterfulgt av en karboksylterminal region som rekker inn i cytoplasma. Denne cytoplasmadomenen består av 43 aminosyrer. Strategien som ble anvendt for å produsere oppløselige CR1 molekyler (sCRl) var å fjerne transmembranregionen som forankret et protein i cellemembranen og deretter å uttrykke de forkortede konstruksjonene som utskilte polypeptider.

11.2.1. Konstruksjon av <p>BSCRlc

Plasmid pBSABCD (eksempel 8, ovenfor) inneholder CR1 cDNA fra nukleotidene 1 til 6860 og mangler de utranslaterte sekvensene 3' til EcoRV setet ved nukleotid 6860. CR1 cDNA inneholder et unikt Ball restriksjonsendonukleasegjenkjenningssete ved basepar 5914,29 basepar bort fra start av transmembrandomenen. pBSABCD ble først spaltet med Ball for åprodusere et lineært molekyl med butte ender og ble deretter ligert ved anvendelse av T4 DNA ligase til et syntetiske oligonukleotid bestående av to 38 nukleotidkomplementære tråder med følgende sekvens:

Det resulterende molekylet hadde et gjenopprettet Ball sete og en endret sekvens som reproduserte den native CR1 sekvensen opp til og inkludert alaninresten ved begynnelsen av transmembrandomenen. I tillegg var et translasjonsstoppsignal (med små bokstaver og understreket ovenfor) blitt ført inn rett etter alanin, etterfulgt av et Xhol restriksjonssete for å lette subkloning av endret cDNA.

Xhol spaltning av dette plasmidet (betegnet pBSCRlc) spaltet cDNA innskuddet (betegnet sCRlc) ved kutting ved oligonukleotid-tilsatte Xhol setet i cDNA ut og ved Xhol setet i pBSKS+ multippel kloningssete ved 5' enden av CR1 cDNA. pBSCRlc inneholder følgende C-terminale sekvenser:

11.2.2. Konstruksjon av pBSCRls

En annen sCRl konstruksjon som mangler en transmembranregion ble dannet som følger. pBSABCD ble spaltet med SacI som kutter ved det unike SacI setet ved nukleotidbasepar 5485 i CR1 cDNA og ved SacI setet i det multiple kloningssetet til vertsplasmidet, beliggende ved 3' enden av CR1 cDNA. Denne spaltningen resulterte i avspaltning av 1375 nukleotidene til DNA sekvensen fra 3' enden av cDNA. Dette fragmentet ble deretter tjernet elektroforetisk. De utsatte endene til det resulterende plasmidet, inneholdende gjenværende sCRl cDNA, ble gjort butte ved anvendelse av T4 DNA polymerase og en butt-endet ligering ble utført. Pharmacia universal transla-sjonsterminator (katalog #27-4890-01, Pharmacia, Inc., Piscataway, NJ), en selv-komplementær oligomer som inneholder translasjonelle stoppsignaler i alle tre leserammene, ble også inkludert i ligeringen. Ved ligering tilveiebragte den innskutte oligomeren et nytt translasjonsstoppsignal for sCRl cDNA.

11.2.3. Konstruksjon av pBM- CRlc

pBMT3X er en eukaryot ekspresjonsvektor (Krystal, M., et al., 1986, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 83:2709-2713) som inneholder det humane metallotionein - IA genet, som vedrører cellens resistens overfor økte nivåer av tungmetaller såsom kadmium. Vektoren inneholder også musemetallotionein-1 genet som inneholder et ingeniørdannet Xhol sete etter initeringskodonet for Mt-1 proteinet. Xhol setet blir anvendt som inn-skuddssete for ekspresjon av gener under kontroll av muse Mt-1 promoteren.

sCRlc innskuddet (omtrent 5,9 kb) ble utkuttet fra pBSCRlc ved anvendelse av Xhol og deretter ligert til det unike Xhol sete til vektor pBMT3X. Den riktige orienteringen til sCRlc innskuddet i pBMT3X ble bestemt ved restriksjonsspalting (Maniatis, T., et al., 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York). Det resulterende plasmidet ble betegnet pBM-CRlc.

11.2.4. Konstruksjon av delesjonsmutantene pT- CRlcl. pT- CRlc2. pT- CRlc3. pT-CRlc4ogpT- CRlc5

Forskjellige delesjonsmutanter ble også konstruert som spesifikt deleterte deler av sCRl cDNA (fig. 20). Hver delesjonsmutant mangler transmembranregionen til full-lengde cDNA slik at ekspresjon av mutantene ville tilveiebringe oppløselige polypeptider.

11.2.4.1. pT- CRlcl

pBSCRlc ble spaltet med Smal, resulterende i to fragmenter på størrelse 2,56 kb og 7,3 kb. Disse fragmentene ble separert ved agarose gelelektroforese og 7,3 kb fragmentet ble renset og religert til seg selv. E. coli DH5cc celler ble gjort kompetente (Morrison, D.A., 1979, Meth. Enzymol. 68:326-331) og deretter transformert med ligeringsblanding. Det resulterende plasmidet ble betegnet pBL-CRlcl. Denne konstruksjonen fjernet 38% LHR-B, 100% LHR-C og 51% LHR-D av CRlc innskuddet. Det dannet i tillegg Smal setet ved grensen 2335/4894 bp og opprettholdt riktig translasjonsramme. pBL-CRlcl ble spaltet med Xhol og CR1 innskuddet ble separert fra pBluscript-vektor. Det isolerte CR1 fragmentet ble deretter skutt inn i det unike Xhol sete til ekspresjonsvektor pTCSgpt for å produsere plasmid pT-CRlcl.

11.2.4.2. pT- CRlc2

pBSCRlc ble spaltet med Clal og Ball, resulterende i to fragmenter med størrelse 3,96 kb og 5,9 kb. Disse fragmentene ble renset fra en agarosegel. Plasmid pBR322 ble spaltet med Clal og Ball og 2,9 kb pBR322 fragmentet ble renset og ligert til 5,9 kb fragmentet fra pBSCRlc. E. coli DH5a cellene ble transformert med ligeringsblandingen og det resulterende plasmidet ble betegnet pBR8.8. Dette plasmidet ble spaltet med Xbal, som dannet to fragmenter med størrelse 7,45 kb og 1,35 kb. 7,45 kb fragmentet ble renset fra en agarosegel og religert til seg selv. Det resulterende plasmidet, pBR7.45 ble spaltet med Clal og Ball, og det isolerte 4,5 kb fragmentet inneholdende sCRl cDNA ble ligert til 3,96 kb fragmentet fra pBSCRlc, resulterende i plasmid pBL-CRlc2. Denne konstruksjonen fjernet 90% av LHR-B i sCRl innskuddet, regenererte Xbal setet ved grensen 1637/2987 bp, og opprettholdt riktig leseramme. pBL-CRlc2 ble spaltet med Xhol, og sCRl innskuddet ble separert fra pBluescript-vektoren. De isolerte sCRl fragmentet ble deretter skutt inn i det unike Xhol setet til ekspresjonsvektor pT-CRSgpt for å produsere plasmid pT-CRlc2.

11.2.4.3. pT- CRlc3

pBSCRlc ble spaltet med Nsil resulterende i tre fragmenter med størrelse 1,09 kb, 1,35 kb og 7,46 kb. 7,46 kb fragmentet ble renset fra en agarosegel og religert til seg selv, for ådanne plasmid pBL-CRlc3. Denne konstruksjonen fjernet 71% LHR-A og resten av CR1 innskuddet. Nsil setet ble regenerert ved grensen 463/2907 bp. Translasjonsrammen ble modifisert slik at et nonsenskodon ble ført inn rett etter det regenererte Nsil setet. pBL-CRlc3 ble spaltet med Xhol og sCRl innskuddet separert fra pBluescript-vektoren. Det isolerte sCRl fragmentet ble deretter skutt inn i det unike Xhol setet til ekspresjonsvektor pTCSgpt for å produsere plasmid pT-CRlc3.

11.2.4.4. pT- CRlc4

pBSCRlc spaltet med Pstl. Pstl setet i polyregionen til pBluescript var blitt fjernet i løpet av ligering av CR1 cDNA til denne vektoren (eksempel 8.1, ovenfor). Resulterende fragmenter med størrelse 1,35 kb og 8,5 kb ble separert ved gelelektroforese, og 8,5 kb fragmentet ble renset og religert til seg selv, med dannelse av plasmid pBL-CRlc4. Denne konstruksjonen fjernet 31% LHR-A og 69% LHR-B av sCRl innskuddet. Pstl setet ble regenerert ved grensen 1074/2424 bp, som dermed opprettholder riktig leseramme. pBL-CRlc4 ble spaltet med Xhol og sCRl innskuddet separert fra pBluescript-vektoren. Det isolerte sCRl fragmentet ble deretter skutt inn i det unike Xhol setet til ekspresjonsvektor pTCSgpt for å produsere plasmid pT-CRlc4.

11.2.4.5. pT- CRlc5

pBL-CRlcl ble spaltet med Smal, som dermed lineariserer plasmidet ved det unike Smal setet. Plasmidet ble defosforylert, og ligert til fosforylert Nhel linker inneholdende et nonsenskodon (New England Biolabs, Beverley, MA). Denne linkertypen inneholder et translasjonsstoppkodon i alle tre mulige leserammer, og inneholder også et Nhel restriksjonssete, som letter bekreftning på nærvær av nonsenslinkeren i sCRl cDNA. Det resulterende plasmidet ble betegnet pBL-CRlc5, og det inneholder LHR-A og 62% LHR-B av sCRl cDNA. pBL-CRlc5 ble spaltet med Xhol, og sCRl innskuddet ble separert fra pBluescript-vektoren. Det isolerte sCRl fragmentet ble deretter skutt inn i det unike Xhol setet til ekspresjonsvektor pTCSgpt for å produsere plasmid pT-CRlc5.

11.3. Ekspresjon av oppløselig CR1

Som demonstrert heri, er ekspresjon av en oppløselig form av CR1 som kan bli utskilt fra celler i høyt utbytte (i) ikke begrenset til et nøyaktig sted i CR1 cDNA som bli anvendt for delesjon eller forkorting, og (ii) er heller ikke begrenset til anvendelse av en bestemt ekspresjonsvektor (se nedenfor). Evnen til å produsere utskilt sCRl ble demonstrert i to forskjellige ekspresjonssystemer.

11.3.1. Konstruksjon av pTCS serier av ekspresjonsvektorene

pTCS seriene av ekspresjonsvektorene som ble anvendt besto av tre plasmider, hvert med et unikt Xhol kloningssete for innskudd av cDNA (fig. 21). Transkripsjon av innskutt cDNA er drevet av et sett tandempromotere. SV40 tidligpromoter som er beliggende oppstrøms for adenovirus 2 hovedsenpromoter (AD2 MLP). Mellom begynnelsen til cDNA og AD2 MLP er adenovirus tripartitlederen. Transkriberte mRNA blir terminert ved et polyadenyleirngssignal tilveiebragt av murin

irnmunoglobulin kappa (Igø) sekvenser beliggende nedstrøms for Xhol cDNa kloningssete. Selekterbare markører xantin-guaninfosforibosyltransferase (gpt), dihydrofolatreduktase (dhfr), eller neomycinresistens (neo<1>), ble tilveiebragt ved innskudd av tilsvarende markører fra henholdsvis pSV2gpt, pSV2dhfr, eller pSV2neo. Disse plasmidene var også kilden for bakteriell replikasjonsorigo og B-laktamasegenet for ampicillinresistens. Valg av hvilke av disse vektorene som bør anvendes avhenger av hvilken selekterbar markør eller kombinasjon av markører er foretrukket for seleksjon av rekombinantene.

Fullstendige DNA sekvenser er kjent for adenovirus 2 (Ad2), SV40, psV2cat (Gorman, C, 1985, DNA Cloning, Volume II, A Practical Approach, ed. D.M. Glover, IRL Press, s. 143-190), og murin irnmunoglobulin kappa. Sekvensene er beliggende i genbankdatabasen og National Biomedical Research merknader og referanser. Hvilke som helst av disse sekvensene kan også virke som en kilde for hensiktsmessige segmenter av pTCS vektorene. Vektorene pTCSgpt, pTCSneo, og pTCS dhfr ble konstruert fra de intermediære plasmidene pEAXgpt og pMLEgpt som følger:

11.3.1.1. Konstruksjon av pEAXgpt

Trinn 1. Ad2 MLP DNA fragmentet ble avledet fra M13 mp9/MLP (Concino, M.F., et al., 1983, J. Biol. Chem. 258:8493-8496). Dette plasmidet inneholder adenovirus 2 sekvensene av nukleotidene 5778 (Xhol setet) til 6231 (Hindin setet) inkludert PvuII restriksjonssetet ved nukleotid 6069 og SacII setet ved nukleotid 5791 (se NBRF nukleindatabase, aksessjons #Gdad2). Xhol til Hindin fragmentet er blitt klonet inn i Hindlll og Sali setene til M13 mp9 ved å danne plasmid M13 mp9/MLP.

Plasmid Ml3 mp9/MLP ble spaltet med EcoRI og Hindin og det mindre MLP inneholdende fragmentet ble isolert. Et pUC plasmid (Pharmacia, Inc., Piscataway, NJ) ble også spaltet med EcoRI og Hindni og det større fragmentet fra dette plasmidet ble deretter ligert til EcoRI til HindJJI MLP fragmentet. Dette resulterte i et nytt MLP-inneholdende plasmid med plasmidslette til pUC. Dette plasmidet ble spaltet med Smal, ligert til Sali linkere og resirkularisert. Dette nye plasmidet ble deretter spaltet med Pvun som spaltet plasmidet ved PvuH setet beliggende i posisjon nr. 6069 innenfor adenovirus 2 innskuddssekvensene. Det resulterende lineære fragmentet ble ligert til Xhol linkere og resirkularisert. Dette plasmidet ble deretter spaltet med Xhol og Sali og det mindre fragmentet inneholdende MLP DNA ble isolert (fragment nr. 1).

Trinn 2. Plasmid pSV2gpt (American Type Culture Collection (ATCC) Aksessjonsnr.

37145), ble spaltet med PvuTJ, ligert til Sali linkere, og spaltet med Sali. Sluttproduktet var et lineært pSV2gpt fragment som virket som kilde for gpt genet (fragment nr. 2). Trinn 3. Et murint irnmunoglobulin Igø fragment (Hieter, P.A., et al., 1980, Cell 22:197-207) ble spaltet med HaeJJI og Avall og fragmentet inneholdende polyadenyleringssekvensene ble isolert. I den murine lg kappa sekvensen tilgjengelig i NBRF nukleindatabasen (aksessjonsnr. Kcms), er lg stoppkodonet i posisjon 1296, etterfulgt av Avall setet ved 1306, AATAAA polyadenyleringssetet ved 1484 og Haelll setet ved 1714. Overhengende ender til dette fragmentet ble fylt i med E. coli DNA polymerase, og fragmentet ble deretter ligert til Xhol linkere, og spaltet med Xhol. Dette fragmentet (fragment nr. 3) virker som kilde for polyadenyleringssetet.

Trinn 4. Fragmentene 1,2 og 3 ble ligert sammen med T4 DNA ligase for å produsere et sirkulært plasmid. Den riktige orienteringen til fragmentene i dette plasmidet ble bekreftet ved restriksjonsenzymanalyse. Nedstrøms for Xhol cDNA kloningssetet var murin kappapolyadenyleringssetet, og ytterligere nedstrøms for dette setet var SV40 promoteren og gpt genet. Oppstrøms for Xhol setet var MLP promoteren og videre oppstrøms fra denne promoteren var det bakterielle replikasjonsorigo og ampicillingenet. Dette plasmidet ble deretter spaltet med Sali og overhengende ender fylt i med E. coli DNA polymerase. Det resulterende buttendede fragmentet ble ligert til EcoRI linkere og resirkularisert med T4 DNA ligase. Dette endelige plasmidet ble betegnet pEAXgpt.

11.3.1.2. Konstruksjon av pMLE<g>pt

Trinn 1. Plasmid pMLP CAT (Lee, R.F., et al., 1988, Virology, 165:51-56) er et ekspresjonsplasmid med et pML vektorskjelett og inneholder adenovirus 2 MLP og tripartittledersekvensene 5' for CAT genet. pMLP CAT ble spaltet med Xhol og SacII, Xhol kutt ved et sete mellom CAT genet og L3 regionen til tripartittlederen, og SacII kutt i posisjon nr. 5791 innenfor adenovirus DNA men 5' for MLP. AD2 MLP og tripartittlederen var dermed beliggende på dette lille Xhol til SacII fragmentet (fragment nr. 4).

Trinn 2. Plasmid pEAXgpt ble spaltet med Xhol og SacII, og det mindre MLP inneholdende fragmentet ble fjernet. Det større fragmentet (fragment nr. 5) ble isolert. Fragmentene 4 og 5, begge med SacII og Xhol ender, ble ligert for å produsere plasmid pMLEgpt.

11.3.1.3. Konstruksjon av pTCSgpt

Trinn 1. pMLEgpt ble spaltet med SacII og endene fylt i med T4 DNA polymerase for å tilveiebringe et buttendet fragment (fragment nr. 6). Dette SacII setet er beliggende ved nukleotid 5791 i adenovirus 2 sekvensen, 5' for MLP-tripartittlederen.

Trinn 2. pSV2dhfr (ATCC Aksessjonsnr. 37146) ble spaltet med Hindin og PvuII. Det mindre 342 nukleotidfragmentet inneholdende SV40 tidligpromoter ble buttendet ved anvendelse Klenow fragmenter til E. coli DNA polymerase (fragment nr. 7). Fragmentene 6 og 7 ble ligert med T4 DNA ligase. Restriksjonsenzymanalyse bekreftet at fragmentene var riktig orientert for å tilveiebringe to, tandempromotere oppstrøms for Xhol cDNA kloningssete, der hver promoter kan prime RNA syntese i samme retning. Dette plasmidet ble betegnet pTCSgpt (fig. 22).

11.3.1.4. Konstruksjon av pTCSdhfr

Trinn 1. pSV2dhfr ble spaltet med Hindlll og PviuT, og det større fragmentet ble deretter renset fra en agarosegel (fragment nr. 8). Det mindre SV40 tidligpromotoirnneholdende fragmentet ble fjernet.

Trinn 2. pTCSgpt ble spaltet med EcoRI og deretter fylt i med Klenow fragmentet til E. coli DNA polymerase for å danne butte ender. Dette lineære fragmentet ble deretter spaltet med Hindlll, og fragmentet (omtrent 1600 nukleotider) inneholdende pTCS transkripsjonsenheten til SV40 promoter, MLP, tripartittleder, Xhol cDNA kloningssete, murine IgX. sekvenser og annen SV40 promoter ble isolert (fragment nr. 9). Dette fragmentet hadde en buttende og en Hindin overhengende ende. Ligering av fragmentene 8 og 9 dannet plasmid pTCSdhfr.

11.3.1.5. Konstruksjonn av pTCSneo

Trinn 1. pSV2neo (ATCC nr. 37149) ble spaltet med Hindin og BamHI, og det større fragmentet (fragment nr. 10) ble isolert. Dette fragmentet inneholdt plasmidsjelettet og neogenet.

Trinn 2. pTCSdhfr ble spaltet med Hindlll og BamHI, og pTCS transkripsjonsenheten (fragment nr. 11) ble isolert fra en agarosegel etter elektroforese av spaltningsproduktene. Ligering av fragmentene 10 og 11 dannet plasmid pTCSneo.

11.3.2. Ekspresjon og analyse av plasmidene pBSCRlc. pBSCRls og pBM- CRlc. pattedvrekspresionsvektorer inneholdende oppløselig CR1 kodende sekvenser

11.3.2.1. Ekspresjon av CR1 konstruksjoner forkortet ved forskjellige posisjoner innenfor CR1 cDNA

Plasmidene pBSCRlc og pBSCRls ble konstruert (seksjon 11.1, ovenfor) slik at det meste av cDNA kodende regioner, med unntagelse av transmembrane og cytoplasmaregioner var konserverte (fig. 20). pBSCRls er kortere enn pBSCRc p.g.a. at det også mangler en del av LHR-D og SCR 29 og 30 som er tilstede i pBSCRlc. sCRl delene av disse plasmidene ble skutt inn i pTCSgpt, etterfulgt av transfeksjon og ekspresjon som beskrevet nedenfor.

pBSCRlc/ pTCSgpt konstruksjon: pBSCRlc ble spaltet med Xhol for å tilveiebringe 5,9 kb innskuddet, sCRlc. sCRlc ble skutt inn i Hhol cDNA kloningssetet til pTCSgpt for å danne pBSCRlc/pTCSgpt.

pBSCRls/ pTCSgpt konstruksjon: pBSCRls ble spaltet med Xhol og Pvul for å frigjøre sCRls innskuddet. Endene til innskuddet ble gjort butte med T4 DNA polymerase. Dette innskuddet ble renset fra en agarosegel. Vektor pTCSgpt ble spaltet med Xhol, og overhengende Xhol ender ble fylt i med E. coli DNA polymerase I. Deretter, ble sCRls innskuddet ligert til den buttendede vektoren for å danne pBSCRls/pTCSgpt.

Plasmidene pBSCRlc/pTCSgpt og pBSCRls/pTCSgpt ble spaltet med Fspl, og resulterende lineære DNA ble transfektert inn i kinesisk hamster ovarieceller som var mutant i dhfr-genet (CHO DUX Bil celler) via kalsiumfosfatkopresipitasjon med plasmid pSV2dhfr. Transfektantene ble valgt ved deres evne til å dyrke i dhfr-seleksjonsmedium. Kultursupernatanter av transfektantkloner ble analysert for utskilt sCRl ved ELISA. Kultursupernatanter fra femte pBSCRlc/pTCSgpt rekombinanter ble analysert og positive rekombinanter ble kjørt igjennom amplifikasjonsprosessen ved å dyrke disse i økende konsentrasjoner metotreksat. I tillegg, ble pooler av transfektanter preparert ved ko-dyrking av åtte pBSCRlc/pTCSgpt transfektanter sammen pr. pool og gjennomkjøring gjennom samme amplifikasjonsprosess. Resultatene av amplifikasjonen er presentert i tabell VI. Tolv rekombinanter fra pBSCRl/pTCSgpt ble analysert for produksjon av oppløselig CR1 ved ELISA. Alle tolv kandidatene viste detekterbare nivåer av utskilt sCRl. De beste produsentene ga sCRl nivåer som kunne sammenlignes med de som ble produsert av beste pBSCRlc/pTCSgpt transfektanter.

pBSCRlc/pTCSgpt og pBSCRls/pTCSgpt rekombinanter produserte oppløselige CR1 med lignende produksjonsnivåer. Dette viste at evnen til å produsere et oppløselig CR1 polypeptid ikke var avhengig av et nøyaktig forkortelsespunkt innenfor CR1 cDNA.

11.3.2.2. Ekspresjons av sCRlc i to forskjellige ekspresjonssystemer Det forkortede CR1 cDNA innskuddet, sCRlc, ble skutt inn i ekspresjonsvektor ptCSgpt og uttrykt som beskrevet ovenfor. Det ble også skutt inn i ekspresjonsvektor pBMT3X som beskrevet ovenfor i seksjon 11.2.3, for å tilveiebringe pBM-CRlc. Begge disse ekspresjonsvektorene har meget sterke promotere. Ekspresjon av oppløselig CR1 ble testet i begge systemene for å bestemme om et system kunne produsere bedre utbytter av utskilt polypeptid.

C127I museceller (ATCC aksessjonsnr. CRL 1616, Rockville, Maryland) ble transfektert med pBM-CRlc ved anvendelse av kalsiumfosfatmetoden (Graham, F.L. og van der Eb, AJ., 1973, Virology 52:456-467). Etter glyserolsjokk, ble cellene på ny matet med D-MEM medium inneholdende 10% fetalt bovint serum og 2 mM L-glutamin, og inkubert ved 37°C i 48 timer. Deretter ble cellene trypsinert, og fordelt ved 1:5 og 1:10 forhold inn i komplett D-MEM medium pluss 10 um kadmiumklorid. Kadmium-resistente kolonier framkom i løpet av 10 dager. Ti kolonier ble fjernet med anvendelse av kloningssylindere. Hver koloni ble overført til en 60 mM petriskål inneholdende komplett D-MEM medium, og inkubert ved 37°C, 5% CO2 inntil cellene oppnådde konfluens.

Deretter, for hver skål, ble de trypsinert og delt inn i tre 60 mm skåler som blir anvendt for preparering av lågere av frosne celler, RNA ekstraksjon og ELISA test av cellemediet for nærvær av utskilt sCRlc.

Når cellemedium fra hver konfluent petriskål ble fjernet og utsatt for ELISA analyse var alle pBM-CRlc klonene som ble testet positive for oppløselig CR1 produksjon. Nivåer av utskilt sCRl fra pBM-CRlc rekombinanter var sammenlignbart med de fra pBSCRlc/pTCSgpt rekombinantene. Dette indikerte at evnen til å produsere høye nivåer av utskilt sCRl polypeptid ikke var avhengig av anvendelsen av bare visse promotere eller ekspresjonssystemer.

11.3.3. Ekspresjon op analyse av <p>lasmidene pT- CRlcl. pT- CRlc2. pT- CRlc3. pT-CRlc4. og pT- CRlc5. patted<y>rekspersjonsvektorer inneholdende oppløselige CR1 kodende sekvenser

pT-CRlc seriene av delesjonsmutantene manglet transmembrane og cytoplasmadomener, som konstruksjonene, pBSCRlc og pBSCRls. I tillegg inneholdt delesjonsmutantene også nokså store delesjoner i forskjellige LHR regioner av CR1 cDNA (se fig. 20). Delesjonsmutantene ble uttrykt i CHO DUX Bil celler og nivåene av oppløselig CR1 polypeptid produsert ble målt.

For hver delesjonskonstruksjon ble førti forskjellige pooler av kloner selektert for ELISA analyse for å bestemme om oppløselige CR1 polypeptider ble produsert. Alle fem pT-CRlc konstruksjonene ble funnet å utskille sCRl inn i cellekulturmediet, som bestemt enten ved ELISA eller ved tilstedeværelse av funksjonell aktivitet i cellekulturmediet. Supernatanter fra celler transfektert med fire av fem pT-CRlc konstruksjoner produserte sCRl som var funksjonell som bestemt ved en hemolytisk analyse (se tabell VII og seksjon 13.2, nedenfor).

Det faktum at delesjonsmutantene også kunne produsere oppløselig CR1, demonstrerte videre at evnen til å uttrykke sCRl ikke var avhengig av en nøyaktig genetisk modifikasjon av CR1 cDNA. Dersom transmembranregionene ble deletert kunne alle konstruksjoner produsere et oppløselig polypeptid.

12. EKSEMPEL: PRODUKSJON OG RENSING AV OPPL¥SELIG CR1

Store mengder sCRl ble produsert i et hult fiber bioreaktorsystem. Mengder av sCRl tilveiebragt var proporsjonal med det relative utbyttet av inokkulerte rekombinante kloner. For optimale rensningsresulater ble et serum-fritt medium valgt som resulterte i høye produksjonsnivåer av sCRl i fravær av store mengder eksogent tilsatt fetalt kalveserumpolypeptider.

12.1. Stor skalaproduksjon av oppløselig CR1

Et Cell-Pharm cellekultursystem I (CD Medical, Inc., Miami Lakes, FL), utstyrt med en modell IV-L hul fiber bioreaktor (30 kD molekylvektsavkutt), ble opptilt under sterile betingelser. To kloner (klon 2 og klon 35 til pBSCRlc/pTCSgpt) ble ekspandert i åtte T-225 flasker. Ved konfluens ble cellene trypsinert, vasket, pelletert og resuspendert i kulturmediet. Omtrent 5 x IO<8> celler fra klon 2 og 10 x 10<8> celler fra klon 35 ble inokulert i to separate hule fiber bioreaktorer. Et 201 tilførselsreservoar av _-MEM pluss 10% fetalt kalveserum, 8 mM L-glutamin, 100 ug/ml penicillin-streptomycin og hensiktsmessig konsentrasjon av metotreksat (50 nM for klon 2; 500 nM for klon 35) ble anvendt. Forblandet gass (5% CO2 i luft) ble boblet inn i reservoarmediet gjennom oksygenatoren for å opprettholde pH. Mediairesirkulering, erstatning og gasstrømningshastigheter ble justert for å tilveiebringe maksimal produksjon. Prøver ble høstet gjennom inokkulerende porter, sentrifugert ved 1,000 rpm i 10 minutter, filtrert gjennom et 0,2 um porestørrelsesfilter og holdt ved 4°C før rensning. Høstevolumet og frekvens ble gradvis øket fra 25 ml, 3 ganger pr. uke ved begynnelse av kulturen, til 40 ml, 5 ganger i uken etter 2-3 måneder. Produksjon av sCRl ble analysert ved en CR1 ELISA. Utbyttene til klon 2 og klon 35 for første måned etter inokkulasjon var 66 ug/dag og 1060 ug/dag. Disse utbyttene økte når kulturene ble etablert.

12.1.1. Produksjon av sCRl i serumfritt medium

To kommersielt tilgjengelige serumfrie media ble testet for dets evne til å understøtte cellevekst og produksjon av sCRl. En konfluent T75 flaske av pBSCRlc/pTCSgpt klon

35 ble delt inn i to T75 flasker. En flaske ble dyrket med alfa MEM, supplementert med 10% fetalt kalveserum, L-glutamin, antibiotika og 500 nM metotreksat. Den andre flasken ble avvent trinnvis fra 5%, 1%, 0,5% og ikke fetalt kalveserum i alfa MEM pluss L-glutamin, antibiotika, 500 nM metotreksat pluss HB CHO vekstsupplement (Hana Biologics, Inc., Alameda, CA). Celleveksten og sCRl produksjonsnivåene til de to flaskene ble sammenlignet. Veksten av cellene i serum-fritt medium nådde aldri konfluens. Nivåene av sCRl produksjon er gitt i tabell VEtl. I hvert tilfelle var nivået av sCRl produksjon best når cellene ble dyrket i 10% fetalt kalveserum. For sammenligning, var nivåene funnet på dag 14 i serum-fritt medium 1,4 x 10<*0 >antydninger/ml sammenlignet med 4,2 x 10^ antydninger/ml for 10% fetalt kalveserum supplementert media.

Cellevekst og sCRl produksjon i rekombinanter ble testet ved anvendelse av en annen kilde serum-fritt media (CHO-1, Ventrex Laboratories, Inc., Portland, ME). P.g.a. at det ikke var nødvendig å avvende serum-dyrkede celler i dette mediet, ble cellene tint og dyrket direkte i det serum-frie mediet. Dette mediet besto av en DME-F12 base og et vekstadditiv. Like antall celler ble tint og sådd ut i separate brønner i en 24-brønn plate. Etter at cellene var blitt tilknyttet ble mediet fjernet, og enten 10% fetalt kalveserum inneholdende medium eller serum-medium ble tilsatt til hensiktsmessige brønner. Hver tilstand ble utført i duplikat. Ulikt tidligere testet serum-fritt media, CHO-1, Ventrex Laboratories medium ga lignende nivåer av cellevekst som fetalt kalveserum inneholdende media.

12.1.2. Konklusjoner

Ovenfor beskrevne resultater angir at sCRl produserende CHO celler kunne bli

opprettholdt i et definert serumfritt medium. Dette resulterte i besparelser av kostnadene til kulturmediet ved stor-skalaproduksjonskjøringer. En ytterligere fordel var at rensing av sCRl fra cellekultursupernatantene ble forenklet p.g.a. at ingen fetalt kalveserumpro-teiner måtte bli fjernet.

12.2. Rensing av oppløseli<g> CR1

Med forløpet av spesifikke anti-CRl antistoffer ble det mulig å erstatte de mange kromatografiske trinnene som var nødvendig for å produsere renset CR1 med en forenklet to-trinnsprosedyre. Dette økte utbyttene av CR1 proteinene som kunne bli oppnådd med omtrent 1-5 mg CR1 pr. 5,9 x 10<*3> erytrocytter (Wong, W.W., et al., 1985, J. Immunol. Methods 82:303-313). P.g.a. at den rapporterte rensningen var av membran-bundede former av CR1 var det alltid nødvendig åoppløse det CR1 inneholdende materialet i detergentene.

Oppløselige CR1 produsert ved rekombinante transfektanter behøver ikke å bli solubilisert med detergenter for rensing, det er allerede oppløselig. Til tross for at oppløselig CR1 kan bli renset ved anti-CRl antistoffkromatografi (se nedenfor), egner denne prosedyren seg ikke for stor-skalaproduksjon. Grad av oppskalering er begrenset av mengden av anti-CRl antistoff som kan bli tilveiebragt for preparering av anustoffmatrisen til antistoffrensningskolonnene. Høy bindingsaffinitet til et antistoff så som YZ1 for CR1 betyr i tillegg at heller kraftige betingelser, f.eks. pH 12,2, må bli anvendt for å fjerne bundet sCRl produkt fra antistofrfnatrisen (Wong, W.W., et al., 1985, J. Immunol. Methods 82:303-313).

For å ha kapasitet til rensning av meget store mengder av oppløselig CR1 ble rensningsprosedyrer omfattende HPLC kolonner utviklet. Disse HPLC kolonnene kan lett bli oppskalert for å produsere enda større mengder av renset oppløselig CR1.1 tillegg så krever disse ikke kraftige betingelser for eluering og isolering av sCRl.

12.2.1. Antistoffaffinitetskolonnerensing

12.2.1.1. Fremgangsmåter

For antistoffaffinitetsrensing av sCRl ble 100 mg monoklonalt antistoff YZ-1 kovalentlig koblet til 7 mg AffiGel-10 (BioRad, Richmond, CA) ifølge forhandlerens instruksjoner. CR1 inneholdende supernatant fra cellekulturer ble inkubert med immobilisert YZ-1 i en flaske som rister ved 4°C over natt. Materialet ble heilt inn i en glasskolonne og vasket omfattende med 10 mM Hepes, 0,1 M NaCl, pH 7. sCRl ble eluert ved anvendelse av 20 mM natriumfosfat, 0,7 M NaCl, pH 12 (Yoon, S.H. og Fearon, D.T., 1985, J. Immunol. 134:3332-3338). Eluerte fraksjoner ble testet for tilstedeværelse av protein ved anvendelse av BioRad proteinanalysen (BioRad, Richmond, CA). Prøver inneholdende protein ble øyeblikkelig slått sammen og dialysert i 0,1 M Hepes pH 7 over natt (2x1 liter) ved 4°C. Prøven ble deretter dialysert i PBS. Tilstedeværelse av sCRl ble analysert ved CR1 ELISA.

12.2.1.2. Resultater

Cellekultursupernatant inneholdende sCRl produsert ved transfektant pBSCRlc/pTCSgpt klon 2 ble applisert på anti-CRl antistoffaffiiutetskolonnen og topp sCRl fraksjoner ble slått sammen. En alikvot av dette rensede materialet ble kjørt på en 4-20% SDS-PAGE gel (DAIICHI; Inc., polyakrylamidgeler; modifisert prosedyre til Laemmli, U.K., 1970, Nature 227:680-685). Under reduserende betingelser var den tilsynelatende molekylvekten til oppløselig CR1 omtrent 240,000 dalton (fig. 24). Dette rensede CR1 ble også vist å være aktivt ved dets evne til å hemme komplement-formidlet hemolyse samt C5a og C3a produksjon (seksjon 13, nedenfor).

12.2.2. CR1 rensing ved HPLC

12.2.2.1. Fremgangsmåter

12.2.2.1.1. Utgangsmateriale

Når kulturer først ble etablert i bioreaktorene var nivåene av sCRl produksjon lavere enn når kulturene var blitt dyrket i flere måneder. Det var generelt en periode på flere uker før cellene i bioreaktoren nådde konfluens og produserte maksimale nivåer sCRl. Cellekultursupematantene med lave nivåer sCRl kunne blitt konsentrert før rensing ved enten ammoniumsulfatpresipitering eller ved ultrafiltrering. Ammoniumsulfatfraksjonering av supernatantene over området 6080% metning presipiterte sCRl i essensielt ekvivalente utbytter. Presipitatet ble løst opp i et minimalt volum og dialysert inn i utgangsbuffren for kationbytte HPLC. Alternativt kunne CHO cellekultursupernatantene ble konsentrert ved ultrafiltrering og dialysert inn i utgangsbuffren for kationbyttekromatografi.

Når bioreaktorene produserte høyere konsentrasjoner av oppløselig CR1 kunne CHO cellekultursupernatantene fra disse kulturene bli dialysert direkte inn i utgangsbufferet for kationbyttekromatografi.

12.2.2.1.2. Kationb<y>tte HPLC prosedyre

Prøver ble dialysert inn i utgangsbuffer (0,02 M natriumfosfat, 0,06 N natriumklorid, pH 7,0) og deretter filtrert gjennom et 0,2 um filter for å fjerne eventuelt partikulat-materiale. Prøven ble deretter applisert på en kationbytte høytrykksvæskekromatografikolonne (10 cm x 10 mm, Hydropore-SCX HPLC kolonne fra Rainin). Kolonnen ble vasket og eluert med en natriumkloridgradient utviklet ved anvendelse av 0,02 M fosfat, 0,5 N NaCl, pH 7,0. sCRl eluerte et sted mellom 0,06 N og 0,25 N NaCl. Eluering ble registrert ved absorbans ved 280 nm og ved ELISA.

12.2.2.1.3. Anionbvtte HPLC prosedyre

Om ønskelig, kunne ytterligere rensing av kation HPLC renset sCRl bli tilveiebragt ved anion HPLC. Toppfraksjoner fra kation HPLC ble dialysert inn i utgangsbufferen for anion HPLC. Prøver ble applisert og kolonnen (Hydropore-AX fra Rainin) ble vasket i 0,01 M fosfat pH 7,5. Kolonnen ble eluert med en serie av trinn og gradienter utviklet ved anvendelse av 0,01 M fosfat, 0,5 N NaCl, pH 7,5. sCRl eluerte et sted mellom 0,0 N og 0,3 N NaCl. Elueringen ble registert som før for kationbytte HPLC. Konsentrasjonene og pH til kation og anion HPLC kolonnebufferene er bare gitt som eksempler. Andre bufferkonsentrasjoner, saltkonsentrasjoner eller pH-betingelser kan også anvendes.

12.2.2.1.4. Western blottanalvse

Western blotting ble utført ved anvendelse av en modifisert prosedyre fra Towbin, H., et al., 1979, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A., 76:4350-4354. Renset sCRl ble kjørt på en 4-20% SDS-PAGE, overført til nitrocellulose, spesifikt probet med anti-CRl (muse mAb YZ-1 eller J3D3), og detektert med geite anti-muse antistoff konjugert med alkalisk fosfatase.

12.2.2.2. Resultater

I en typisk kjøring ble 50-100 ml av supernatanten fra en bioreaktorkultur dialysert inn i utgangsbuffer og applisert på en 10 cm x 10 mm kationbytte HPLC. Toppfraksjoner ble bestemt ved ELISA og absorbans ved 280 nm, og ble slått sammen. Proteinkonsentrasjonen til blandingen ble bestemt ved absorbans ved 280 nm (e (1%) ved 280 nm = 10, som beregnet fra CRlc ammosyresammensetning). Flere tiendedeler milligram ble renset fra 100 ml amplifisert kultursupernatant.

Som et eksempel produserte 100 ml av kultursupernatanten fra transfektant pBSCRlc/pTCSgpt klon 2 22 mg renset sCRl, bestemt ved absorbans ved 280 nm, når renset ved kation HPLC (fig. 24). Når registrert ved CR1 ELISA ble utbyttet beregnet å være 202% med ytterligere 13% i gjennomløpet eller kolonnevaskefraksjonen. Det større enn 100% utbytte reflekterer sansynligvis matriseeffektene i ELISA.

Med hastigheter som kultursupernatanter kan bli tjernet fra en bioreaktor med, bør det være mulig ved dette nivå av metotreksatamplifikasjon å produsere omtrent 100 mg renset oppløselig CR1 pr. uke pr. bioreaktor. Noen måter hvorpå dette produksjonsnivået kan bli oppskallert på omfatter amplifisering av utgangskulturene til et maksimalt nivå med metotreksat før tilsiing av bioreaktoren, økning av antall bioreaktorer i produksjon en viss tid og ved anvendelse av HPLC kolonner med høyere kapasitet.

12.2.2.3. Karakterisering av renset oppløselig CR1

sCRl inneholdende toppfraksjon fra kation HPLC (fig. 24) ble ytterligere renset på en anion HPLC. Renheten til sCRl materialet ved forskjellige trinn ble testet ved SDS-PAGE (fig. 25). Mindre bånd som sees i disse tungt belastede gelene representerer fragmenter av sCRl bestemt ved Western Blottanalyser ved anvendelse av anti-CRl monoklonale antistoffer, YZ1 eller J3D3. Fragment sCRl båndene ble ikke sett i de fleste preparatene.

Funksjonelle aktiviteter til renset sCRl ble testet ved dets evne til å hemme klassisk komplement-mediert hemolyse med 50% ved en renset sCRl konsentrasjon på 0,25 fig/ml. Renset oppløselig CR1 kunne også hemme klassisk komplement C5a produksjon med 50% ved 5 ug/ml og C3a produksjon ved 50% ved 13 ug/ml (se seksjon 13, nedenfor).

12.2.2.4. Konklusjoner

Som beskrevet ovenfor, er det blitt utviklet en forbedret fremgangsmåte for rensing av oppløselig CR1 som lett kan bli oppskalert for å produsere mengdene av sCRl som er nødvendig for terapeutiske anvendelser. Hovedelementene til denne prosedyren omfatter et utgangsmateriale som allerede er oppløselig og dette elirninerer derved nødvendigheten av oppløsning av membranbundet CR1 med detergenter. Reduksjon av fetalt kalveserumkonsentrasjoner i bioreaktorkulturer og/eller anvendelse av alternative kulturmedier i disse kulturene eliminerer nødvendigheten av å fjerne høye konsentrasjoner av ytre proteiner fra sCRl-inneholdende utgangsmaterialer i løpet av påfølgende rensning. Videre tilveiebragte utvikling av en HPLC prosedyre for rensing en fremgangsmåte for rensing i stor skala. Enten kation HPLC eller en kombinasjon av kation HPLC etterfulgt av anionbytte HPLC kan bli anvendt for rensing. Vesentlig rent CR1 i høyt utbytte kan bli oppnådd ved denne prosedyren i bare en eller to trinn.

13. EKSEMPEL: DEMONSTRASJON AV IN VITRO AKTIVITET TIL OPPL¥SELIG CR1

13.1. Hemming av nøytrofil oksidativt utbrudd

I reperfusjonsskademodellen til vevsskade i løpet av hjerteinfarkt induserer aktiverte komplementkomponenter nøytrofil adhesjon og aktivering. Den aktiverte nøytrofilen gjennomgår et oksidativt utbrudd som danner meget toksiske oksygenradikaler. Disse og andre potensielle toksiner blir frigjort i løpet av nøytrofil degranulering som skader omgivende vev. Oppløselig CR1 kan reduser området av skadet vev ved forhindring av dannelsen av C3a og C5a, komplementkomponentene involvert i nøytrofil aktivering.

For å registrere evnen som oppløselig CR1 har til å blokkere dannelsen til C5a i løpet av komplementaktiveringen in vitro, ble bioanalyse som kan kvantitere dannelsen av oksygenradikale produsert nøytrofiler i løpet av et C5a indusert oksygenutbrudd anvendt (Bass, D.A., et al., 1983, J. Immunol. 130:1910-1917). Denne analysen anvender diklorfluorescindiacetat (DCFDA), et lipidoppløselig molekyl som kan gå inn i celler, bli fanget og blir meget fluorescerende ved oksidering.

13.1.1. Materialer og fremgangsmåter

13.1.1.1. Materialer

Friskt fullblod, humane komplementkilder (Beth Israel Hospital, Boston, MA), tørket bakergjær, PBS med 0,1% gelatin og 5 mM glukose, 100 mM EDTA, 10 mM DCFDA i HBSS (Kodak), røde blodcelle (RBC) lyseringsbuffer (Ortho Diagnostics), renset C5a (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), og oppløselig CR1 ble anvendt.

13.1.1.2. Preparering av nøytrofiler

Nøytrofiler ble preparert som beskrevet av Bass (1983, J. Immunol. 130:1910-1917).

2,0 ml fullblod ble vasket 3 ganger i PBS-gelatin-glukose, resuspendert i 5 ml 10 um DCFDA i HBSS pluss 5 ml PBS-gelatin-glukose og inkubert i 15 minutter ved 37°C. Celler ble deretter sentrifugert og resuspendert i 2,0 ml PBS-gelatin-glukose pluss 5 mMEDTA.

13.1.1.3. Preparering av gjærpartikler

Tørket bakergjær ble resuspendert i HtøO, vasket 2 ganger og kokt i 30 minutter. Partiklene ble på nytt vasket 2 ganger i H2O og resuspendert ved 0,5 g/ml i H2O (Simpson, P.J., et al., ovenfor).

13.1.1.4. Aktivering av nøytrofile ved renset C5a

100 ul DCFDA-belastede celler ble behandlet med RBC lyseringsbuffer, vasket 1 gang i PBS-gelatin-glukose EDTA og resuspendert i 1,0 ml PBS-gelatin-glukose. 50 ul renset C5a i 200 ng/ml eller kontroll ble tilsatt til 0,5 ml målceller ved 37°C og analysert på flow-cytometer vd forskjellige tidsintervaller.

13.1.1.5. Aktivering av nøytrofiler ved renset C5a i human serum eller plasma 100 ul DCFDA-belastede celler ble inkubert med 50 ul C5a fortynnet 1:1 i humant serum eller heparinisert plasma (100 ng/ml) eller kontroll ved 37°C i 30 minutter. RBC ble lysert ut og nøytrofilene ble analysert på et flow-cytometer.

13.1.1.6. Aktivering av nø<y>trofiler ved gjærpartikkelaktivert humant serum eller plasma 425 ul friskt frosset serum og plasma pluss 50 ul sCRl eller kontroll ble inkubert med 25 ul gjærpartikler ved 37°C i 30 minutter. Komplement-aktiverte og kontrollprøver ble deretter sentrifugert for å fjerne gjærpartiklene. Ti 2-ganger fortynninger av hver av

disse prøvene ble utført i PBS-gelatin-glukose EDTA. 50 ul av hver seriefortynning av kontroll og aktivert serum og plasma ble tilsatt til 50 ul DCFDA-belastede målceller og inkubert ved 37°C i 30 minutter. RBC ble deretter lysert ut, og nøytrofiler ble analysert ved flow-cytometri.

13.1.2. Resultater

13.1.2.1. C5a induserer et oksygenutbrudd i humane nøytrofiler som kan bli målt ved anvendele av DCFDA

Fig. 26 viser en hurtig økning i fluorescensintensiteten til humane nøytrofiler etter stimulering med renset C5a. I løpet av 4 minutter etter tilsetning av C5a (20 ng/ml sluttkonsentrasjon) var nøytrofilene 10-ganger sterkere enn kontroll DCFDA-belastede nøytrofiler. I løpet av 20 minutter var nøytrofilene 20-ganger så sterke som kontrollene. Denne analysen ser ut til å være en følsom indikator på CS a.

13.1.2.2. Human serum blokkerer oksygenutbraddsvirkriinger til renset C5a på nøytrofiler

Ingen økning i fluorescensintensitet ble observert i nøytrofiler belastet med DCFDA og inkubert med renset C5a fortynnet i human serum. Denne virkningen kan være forårsaket av blodplateavledet vekstfaktor (PDGF) frigjort fira blodplater i løpet av koagulering. Det er blitt vist at lave nivåer PDGF kan inhibere C5a-indusert nøytrofil aktivering (Wilson, E., et al., 1987, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 84:2213-2217).

13.1.2.3. Heparinisert plasma blokkerer ikke virkningene av C5a på nø<y>trofiler

C5a fortynnet 1:1 i heparinisert plasma induserer et oksygenutbrudd i DCFDA belastede nøytrofiler. Til tross for ikke så dramatisk som C5a i buffer var det en 10-ganger økning i fluorescensintensitet etter en 30 minutters inkubasjon med nøytrofilene. Det reduserte signalet kan bli forårsaket av PDGF frigjøringen i løpet av plebotomy eller plasmaisolering. Mere forsiktig og hurtig isolering av plasma fra cellulære komponenter av blod kan minimalisere frigjøringen av PDGF og muliggjøre bedre C5a funksjon.

13.1.2.4. sCRl tilstede i løpet av komplementaktivering blokkerer CSa dannelsen Zymosan-indusert aktivering av humant komplement i nærvær av oppløselig CR1 viste redusert C5a aktivitet målt med DCFDA analysen. Som vist i fig. 27 dannet 1:16 fortynningen av humant plasma aktivert i nærvær av sCRl dannet 70% mindre fluorescensintensitetøkning i nøytrofiler som 1:16 fortynnet plasma aktivert uten tilstedeværelse av sCRl. Dette impliserer inhibisjon av C5a dannelsen ved sCRl. Ytterligere optimalisering av DCFDA analysen og plasmasamling bør resultere i en mere dynamisk og sensitiv analyse for oppløselig CR1 aktivitet.

13.2. Inhibisjon av komplementformidlet hemolyse

13.2.1. Fremgangsmåte

Evnen til å inhibere komplement ble testet ved analysering for hemming av komplement-formidlet rød cellelysering (hemolyse). Hemming av hemolysen ble bestemt som en funksjon av oppløselig CR1 konsentrasjon. sCRl prøver som skal bli undersøkt ble fortynnet i 0,1 M Hepes-buffer (0,15 N NaCl, pH 7,4), og 50 ul ble tilsatt til hver brønn av en V-bunnet mikrotiterplate vanligvis i triplikat. Humant serum, anvendt som komplementkilde, ble fortynnet 1 til 125 i Hepes-buffer, og 50 ul ble satt til hver brønn. Deretter ble kommersielt tilgjengelige saueerytrocytter med anti-saueantistoff (Diamedix Cat. nr. 789-002) anvendt som mottatt og tilsatt K)0 ul/brønn for å initiere komplementreaksjonsveien som fører til hemolyse. Platene ble inkubert i 60 minutter ved 37°C og deretter sentrifugert ved 500 x g i 10 minutter. Supernatantene ble fjernet og plassert i en flat-bunnet mikrotiterplate. Grad av hemolyse ble målt som en funksjon av prøveabsorbans ved 410 nm. Maksimal absorbans (tilsvarende maksimal hemolyse), Amax, ble tilveiebragt fra absorbansen til erytrocyttprøve som bare inneholder humant serum Ag, minus absorbansen til en prøve som bare inneholder røde celler, Aq. Dermed er Amax = A§ - Aq. Forskjellen mellom absorbansen til en erytrocyttprøve inneholdende både humant serum og sCRl, og absorbansen til en celleprøve inneholdende bare sCRl, ble definert som Aprøve. Hemming, IH, ble uttrykt som fraksjon (Amax</A>prøve</>Amax), og IH50 ble definert som konsentrasjon av sCRl nødvendig for å produsere en verdi av IH = 1/2. For å registrere kromatograiffraksjonene ble serum-frie kontroller ikke innbefattet og anti-komplementaktivitet ble registrert kvalitativt som en reduksjon i absorbans ved 410 nm av prøven.

Den hemolytiske analysen beskrevet ovenfor ble også anvendt for å vurdere evnen som human rekombinant sCRl har til åinhibere sauerød cellelysering ved komplement fra andre arter, så som marsvin og rotter. For hver art ble friskt-frosset serum eller friskt lyofilisert serum eller plasma anvendt som en komplementkilde. I noen tilfeller ble sera oppnådd kommersielt (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO).

Serumet ble først titrert for dets evne til å lysere aktiverte røde celler. Den høyeste fortynningen som ga minst 80% maksimal røde cellelysering ble valgt for å vurdere virkningene til tilsatt human sCRl. Analysen ble deretter utført som beskrevet ovenfor, med substituering av dyreserum for human serum ved foretrukket fortynning.

13.2.2. Resultater

Som angitt i fig. 28 inhiberte renset sCRl klassisk komplement-formidlet lysering med 50% ved en sCRl konsentrasjon på 0,12 ug/ml. Evnen som antistoffaiffnitetsrenset sCRl har til å inhibere den hemolytiske analysen ble sammenlignet med den til urenset materiale (sCRl inneholdende cellekultursupernatant). Renset sCRl hadde aktivitet som var sammenlignbar med den til urenset sCRl, idet begge produserte 50% inhibisjon i den hemolytiske analysen ved 1,6 x IO<8> antydninger/ml. Dette indikerte at rensingsprosedyren ikke reduserte den funksjonelle aktiviteten til det endelig sCRl produktet vesentlig.

For å bestemme dersom renset sCRl kunne bli lagret i frossen tilstand, ble en alikvot lagret ved -70°C i en uke. Konsentrasjonen til frossen sCRl var lik den til ikke-frossen sCRl, ifølge bestemmelser av absorbans ved 280 nm og CR1 ELISA. Frossen sCRl hadde også samme aktivitet som ikke-frossen sCRl bestemt ved hemming av hemolysen.

Evnen som human rekombinant sCRl har til å inhibere hemolyse formidlet ved komplement fra flere arter er oppsummert i tabell IX.

Både marsvin- og rottekomplement så ut til å bli inhibert av humant sCRl. Mangel på klar inhibering for andre arter kan reflektere (a) uhensiktsmessigheten av å anvende kaninantistoffer og saueerytrocytter i analysesystemet eller (b) den høye konsentrasjonen av serum som er nødvendig for hemolyse i dette systemet.

13.3. Inhibisjon av C3a og C5a produksjon

13.3.1. Fremgangsmåter

Evnen til å inhibere komplement ble også undersøkt ved analysering for spesifikk inhibisjon av C3a og C5a produksjon. For alle eksperimentene ble en enkel human serumpool, som skal bli anvendt som en kilde for komplement, alikvotet og lagret frossent ved -70°C. Human IgG ble varmeaggregert, alikvotet og lagret frossent ved - 70°C. For hvert eksperiment ble serumalikvoter ekvilibrert ved 37°C idet varierende

konsentrasjoner av sCRl skulle bli testet. Komplementreaksjonsveien ble initiert ved tilsetning av aggregert human IgG. Kontrollprøver som ikke inneholdt IgG ble også

innbefattet. Etter en fastsatt reaksjonstid på 15 minutter (bestemt i en tidligere tidsforløpsstudie for å tilveiebringe et hensiktsmessig tidsintervall der produksjonen av C5a eller C3a er nærmest fullført, dvs. mer enn 90%), ble nivåene av frigjorte komplementpeptider (C5a eller C3a) bestemt ved radioimmunoanalyse ved anvendelse av kommersielt tilgjengelige radioimmunoanalyse (RIA) kits (C5a RIA, Amersham Cat nr. RPA.520; C3a RIA, Amersham Cat. nr. RPA.518) i modiflerte prosedyrer.

P.g.a. at en konkurrerende immunoanalyse anvendt, varierte komplementpeptid (C5a og

C3a) konsentrasjonene med tellingene. Bundede tellinger (CB) for en prøve ble bestemt som totale tellinger (i tellinger pr. minutt, cpm) målt i pelleten.

y-aksen i fig. 29 representerer fraksjonsinhibisjon. Fraksjonsinhibisjon er lik tellinger bundet (CB) for en "prøve", mindre enn CB i "prøve med sCRl", delt på CB for "ingen IgG kontroll" mindre enn CB i "prøve uten sCRl".

13.3.2. Resultater

Aktiviteten til renset sCRl ble analysert ved testing av dets evne til å inhibere C5a og C3a produksjon i en aktivert human serumprøve.

Som angitt i fig. 29, under betingelsene testet, kunne renset sCRl maksimalt inhibere C5a produksjon med 100% og C3a med 60%. Inhibisjon på 50% ble observert ved sCRl konsentrasjoner på 5 ug/ml for C5a produksjon og 15-20 ng/ml for C3a produksjon. Dataene foreslår at rekombinant sCRl inhiberer C5 konvertase mer effektivt enn C3 konvertase.

15. DEPONERING AV MIKROORGANISMER

E. coli stammen DK1/P3 inneholdende plasmid piABCD (betegnet pCRl/piABCD), kodende for full-lengde CR1 protein, ble deponert til Agricultural Research Culture Collection (NRRL), Peoria, Illinois, mars 31, 1988 og ble tildelt aksessjonsnr. B-18355.

Kinesisk hamsterevairecellelinje DUX Bil inneholdende plasmid pBSCRlc/pTCSgpt klon 35,6, kodende for et oppløselig CR1 molekyl, ble deponert til American Type Clrure Collection (ATCC), Rockville, Maryland, mars 23,1989 og ble tildelt aksessjonsnr. CRL 10052.

Foreliggende oppfinnelse er ikke begrenset i ramme av mikroorganismene som er deponert p.g.a. at de deponerte utførelsesformene er ment som enkeltillustrasjon på et aspekt av oppfinnelsen og en hvilken som helst mikroorganisme som er funksjonelt ekvivalent er innenfor rammen av denne oppfinnelsen. Forskjellige modifikasjoner av oppfinnelsen i tillegg til de som er vist og beskrevet heri vil fremgå for fagfolk fra beskrivelsen ovenfor og vedlagte figurer. Slike modifikasjoner faller inn under rammen av vedlagte krav.

Det er også å bemerke at alle baseparstørrelser angitt for nukleotider er omtrentlige og blir anvendt for å beskrive.

Forskjellige referanser er sitert heri, og beskrivelsen derav er inkorporert som referanse i sin helhet.

Claims

1. Isolert CR1 protein for diagnostisk anvendelse in vitro, karakterisert ved at det omfatter aminosyresekvensen som angitt i figur 1, eller et fragment derav som mangler en transmembranregion og som utviser en komplementregulatorisk aktivitet til full-lengde CR1.

2. Nukleinsyresekvens, karakterisert ved at den koder for et CR1 protein ifølge krav 1.

3. Protein for diagnostisk anvendelse in vitro, karakterisert ved at det omfatter en aminosyresekvens som kodet av en nukleinsyresekvens som vist i figur 1 fra nukleotid nr. 28 til og med nukleotid nummer 1533, i det nevnte protein mangler en transmembranregion og utviser en komplementregulatorisk aktivitet til full-lengde CR1.

4. CR1 protein for diagnostisk anvendelse in vitro, karakterisert ved at det omfatter minst et fragment av aminosyresekvensen angitt i figur 1, hvori nevnte protein mangler en transmembranregion, i det nevnte protein blir utskilt av en celle hvor den blir uttrykt, og nevnte protein er uglykosylert eller glykosylert og utviser en komplementregulatorisk aktivitet til full-lengde CR1.

5. CR1 protein ifølge krav 4, karakterisert ved at det er funksjonelt som detektert ved evnen in vitro til å inhibere neutrofil oksidativt utbrudd, komplement-mediert hemolyse eller C3a og C5a produksjon og som blir kodet av en nukleinsyrevektor selektert fra gruppen bestående av pBSCRlc, pBSCRls, pBM-CRlc, PBSCRlc/pTCSgpt, pBSCRls/pTCSgpt, eller som blir kodet av en nukleinsyrevektor valgt fra gruppen bestående av pT-CRlcl, pT-CRlc2, pT-CRlc3, pT-CRlc4 og pT-CRlc5, eller som blir uttrykt av en kinesisk hamsterovariecelle DUX Bli inneholdende plasmid pBSCRlc/pTCSgpt, som deponert til ATCC og tildelt aksesjonsnr. CRL10052.

6. Rekombinant celle, karakterisert ved at den uttrykker proteinet ifølge krav 1 som omfatter en ekspresjonsvektor som omfatter en nukleinsyresekvens som koder for et protein som har en aminosyresekvens vesentlig som vist i figur 1, eller et fragment derav som mangler en transmembran region og utviser en komplementregulatorisk aktivitet av full-lengde CR1 for diagnostisk anvendelse.

7. Fremgangsmåte for å rense et oppløselig CR1 protein ifølge et hvilket som helst av kravene 1,3,4 eller 5, karakterisert ved at den omfatter: (a) uttrykking av CRl-proteinet i en celle i kultur slik at CRl-proteinet blir utskilt; (b) oppnåelse av en prøve av cellekulturfluidet omfattende det oppløselige CR1 proteinet; (c) utsette prøven for kationbyttekromatografi; og (d) eluering av det oppløselige CR1 -proteinet fra kation-byttekromatografimatrik-sen.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 7, karakterisert ved at den videre omfatter, etter trinn (c): (e) utsette det eluerte CRl-proteinet for anionbyttekromatografi; og (f) eluering av det oppløselige CRl-proteinet fra anionbyttekromtografimatriksen ifølge trinn (d).