CN1036987A - 人体C3b/C4b受体(CR1) - Google Patents
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Abstract
本发明涉及C3b/C4b受体(CR1)基因及其编
码蛋白质。还涉及含70核苷酸的CR1核酸顺序及
其片段和其含24氨基酸的编码肽或蛋白质。本发
明还提供了CR1蛋白质及其片段的表达。本发明的
基因和蛋白质用于包括补体活性、各种免疫系统或炎
性疾病的疾病诊断和治疗。本发明实施例叙述全长
CR1CDNA及其片段的克隆、核苷酸顺序及推断的
氨基酸顺序以及CR1蛋白质及其片段的表达。获得
含C3b和(或)C4b结合位点和呈因子I-辅因子活
性的CR1蛋白质及其片段的表达。
Description
1.本发明涉及C3b/C4b受体(CR1)基因和它的编码蛋白质。本发明还涉及含有70个核苷酸的CR1核酸顺序及其片段和它们编码的含有24个氨基酸的肽或蛋白质。本发明还提供了CR1蛋白质及其片段的表达。CR1核酸和蛋白质已被用于诊断或治疗包括补体活性的疾病和各种炎症以及免疫疾病。
2.1补体系统
补体系统是一组蛋白质,它们构成了人体正常血清中球蛋白的10%(Hood,L.E.等人,1984,《Immunology》,第2版,Benjamin/Cummings出版公司,Menlo Park,加州,第339页)。在免疫和过敏反应的调解作用中,补体(C)起着重要的作用(Rapp,H.J.和Borsos,T.1970,Molecular Basis of Complement Action,Appleton-Century-Crofts(Meredith),New York)。补体组分的激活导致了包括调解与补体依赖性疾病有关的炎症的趋化肽在内的一组因子产生。补体级联放大的连续活化可通过包含抗原-抗体复合体的典型途径而发生,或通过包括识别细胞壁多糖的另一途径而发生。通过活化的补体蛋白质而调节的活性包括靶细胞的裂解,趋化性,调理作用,血管和其它平滑肌细胞的刺激,和诸如乳房细胞失粒的功能性紊乱,增加的小血管渗透性,白细胞的定向迁移和B淋巴细胞和巨噬细胞的活化(Eisen,H.N,1974,Immunology,Harper & Row出版公司,Hagerstown,Maryland,第512页)。
在蛋白质分解级联放大步骤中,生物活性肽片段,过敏毒素C3a,C4a和C5a(可参考WHO Scientific Group,1977,WHO Tech.Rep.Ser 606:5,此处列为参考)从第3(C3),第4(C4)和第5(C5)天然补体组分(Hugli,T.E.1981,CRC Crit.Rev.Immunol.1:321;Bult,H和Herman,A.G,1983,Agents Actions 13:405)中释放出来。
2.2 C3b/C4b/补体受体(CR1)
人体C3b/C4b受体(称为CR1)存在于红细胞,单核细胞/巨噬细胞,粒细胞,B细胞,部分T细胞,脾卵泡树突状细胞和肾小球足状突细胞中(Fearon,D.T.1980,J.Exp.Med.152∶20;Wilson,J.G.等人,1983,J.Immunol.131:684;Reynes.M.等人,1985,J.Immunol.135:2687;Gelfand,M.C.等人,1976,N,Engl.J.Med.295:10;Kazatchkine,M.D等人,1982,Clin.Immunol.Immunopathol.27:170)。CR1专一地结合C3b,C4b和ic3b。在血浆中发现了具有配体结合活性和与膜相关CR1具有相同分子量的可溶形式的受体(Yoon,SH.和Fearon,D.T.1985,J.Immunol,134:3332)。CR1与已与免疫复合体和其它补体激活因子共价连接的C3b和C4b结合,它们相互作用的结果取决于载有该受体的细胞类型(Fearon,D.T.和Wong.W.W.1983,Ann,Rev,Immunol 1∶243),红细胞CR1与免疫复合体结合以转移至肝中(Cornacoff J.B.等人,1983,J.Clin,Invest 71:236;Medof M.E.等人,1982,J.Exp,Med,156:1739)。而嗜中性细胞和单核细胞的CR1则通过覆盖的纹孔的吸附性胞吞作用(Fearon D.T.等人,1981,J.Exp.Med.153:1615;Abrahamson D.R.和Fearon D.T.1983,Lab,Invest.48:162)或通过用佛波醇酯,趋化肽或存在于细胞外基质,如纤维结合素(fibronectin)和/海带氨酸(Laminin)中的蛋白质激活受体后的吞噬作用(Newman.S.L.等人,1980,J,Immunol,125,2236;Wright S.D和Silverstein S.C 1982,J.Exp.Med.156:149;Wright S.D.等人,1983,J.Exp Med.158:1338)使连接的复合物胞合化。CR1的磷酸化对于获得吞噬活性可能有作用(Changelian,P.S.和Fearon.D.T.1986,J.Exp.Med.163:101)。尽管用抗CR1抗体处理这些细胞以增强它们对于美州商陆植物的有丝分裂原的最适度以下剂量的应答,CR1对于B淋巴细胞的作用则较少确知(Daha,M.R.等人,1983,Immunobiol.164:227(Abstr.))。对于卵泡树突状细胞来说,CR1有促进抗原出现的作用(Klaus,G.G.B.等人,1980,Immunol,Rev,53∶3)。
CR1还可以抑制C3/C5转化酶的典型和另外的途径,以及可作为用因子1裂解C3b和C4b的辅助因子。这表明除了作为受体外,CR1还具有补体调节作用(Fearon,D.T.1979.Proc Natl.Acad.Sci.U.S.A.76:5867;Iida,K.和Nussenzweig,V,1981,J.Exp,Med.153:1138)。在补体激活的另一个途径中,双分子复合体C3b,Bb是C3激活酶(转化酶)。CR1(和H因子,在较高浓度下)下以结合到C3b中并可促进C3b,Bb的解离。此外,C3b,CR1(和C3b,H)的形成使得C3b对于由因子I引起的不可逆的蛋白分解失活敏感,而导致了失活的C3b(iC3b)的形成。在补体激活的典型途径中,复合体C4b,2a是C3转化酶。CR1(和C4结合蛋白质,C4bp,在较高浓度下)可以结合到C4b中,也可促使C4b,2a的解离。这种结合使得C4b通过因子I分裂为C4c和C4d(失活的补体蛋白质)而对不可逆蛋白分解失活作用敏感。
CR1是一种由单个多肽链组成的糖蛋白。业已发现了四种异型的CR1,通过增加~40,000-50,000道尔顿分子量而表现其不同。两种最普通的形式,F和S异型体,又称之为A和B异型体,它们的分子量分别为250,000和290,000道尔顿(Dykman,T.R.等人,1983,Proc.Natl.Acad,Sci.U.S.A.80:1698;Wong,W.W等人,1983,J,Clin.Invest,72:685),两种较少见形式的分子量则为210,000和>290,000道尔顿(Dykman,T.R.等人,1984,J.Exp.Med.159:691;Dykman.T.R.等人,1985,J.Immunol.134:1987)。这些差异很清楚地表明了变异是发生于CR1的多肽链中,而非在糖苷化状态时,因为通过用胞内糖苷化酶F处理纯化的受体蛋白质不能消除差异(Wong.W.W.等人,1983,J.Clin,Invest,72:685),在衣霉素存在下,当受体异型体生物合成时,可观察到这种差异(Lublin,D.M.等人,1986.J/Biol.Chem.261:5736)。四种CR1异型体均具有C3b结合活性(Dykman T.R.等人,1983,Proc,Natl,Acad.Sci,USA,80:1698;Wong W.W.等人,1983.J.Clin.Invest.72:625;Dykman T.R等人,1984,J.Exp.Med.159:691;Dykman T.R等人,1985,J.Immunol,134:1787)。
在很严格的条件下,CR1 cDNA的两种不重迭的限制片段显示出交差杂交(Wong W.W.等人,1985.Proc.Natl.Acad,Sci.U.S.A.82:7711)。两种cDNA探针也与基因组DNA的多元限制片段杂交,这些片段的大部分与两种探针是共同的(id)。CR1中存在重复编码顺序可通过顺序比较而证实(Klickstein,L.B等人,1985,Complement 2:44(Abstr))。此外,通过将无编码顺序的基因组探针与几个基因组限制片段交叉杂交实验表明CR1基因具有重复的插入顺序(Wong W.W.等人,1986.J.Exp.Med.164:1531)。此外,与来自具有F异型体的个体的DNA相比较,来自具有较大S异型体的个体的DNA具有与这个基因组探针杂交的一个附加的限制片段,这表明基因组顺序的重复与一个较高分子量CR1等位基因(id)有关。
业已表明,CR1与补体受体2型(CR2)具有同源性(Weis J.J.等人,1986,Proc,Natl,Acad,Sci,U.S.A.83:5639-5643)。
2.3人体疾病中CR1的异常
患有全身性红斑狼疮(SLE)的病人的红细胞中CR1的表达的减少已由几个地区的研究者报道了,包括日本(Miyakawa等人,1981,Lancet2:493-497;Minota等人,1984.Arthr,Rheum.27:1329-1335),美国(Iida等人,1982,T.Exp.Med.155:1427-1438i Wilson等人,1982,N,Engl.J.Med,307:981-926)和欧洲(Walport等人,初.Clin.Exp,Immunol,59:547;Jouvin等人,1986,Complement 3:88-96;Holme等人,1986,Clin,Exp,Immunol.63:41-48)。从一组情况来看,病人体内每个细胞中受体的平均数是正常人的50-60%。一份早期报道中指出红细胞中CR1的数目随疾病的活性呈相反的变化,在SLE最严重的表现期内,CR1的数目最少,而在同一病人的缓解期内,则观察到较多的CR1(Iida等人,1982,J.Exp,Med,155:1427-1438)。还发现,CR1的数目与免疫复合体的血清水平,C3d的血清水平和结合红细胞C3dg的量呈负相关,这可能反映了补体激活免疫复合体的摄入和在红细胞内降解为“单纯的旁观者”(Ross等人,1985,J,Immunol,135:2005-2014;Holme等人,1986,Clin,Exp Immunol.63:41-48;Walport等人,1985,Clin,Exp,Immunol.59:547)。我们发现红细胞上缺乏CR1的患SLE的病人对于CR1具有自身抗体(Wilson等人,1985,J.Clin,Invest,76:182-190)。抗CR1的抗体的效价的减少与病人的临床条件的改善和异常受体的部分逆转相符合。抗CR1抗体已在其它两个SLE病人身上也检测到了(Cook等人,1986,Clin,Immunol,Immunopathol,38:135-138)。最近,通过观察到受体从输入的红细胞中迅速丧失而证明在活动期SLE和溶血性贫血病人,红细胞CR1的获得性的丧失(Walport等人,1987,Clin Exp.Immuniol,69:501-507)。
CR1从红细胞中相应的丧失已在人体免疫缺乏病毒(HIV)感染病人(Tausk,F.A.等人,1986.T.Clin,Invest,78:977-982)和麻风病(Iepromatus Ieprosy)(Tausk,F.A.等人,1985 J.Invest Dermat 85:58s-61s)的病人中观察到了。
在SLE中补体受体表达异常不局限于红细胞CR1,嗜中性细胞的全部细胞CR1和SLE病人的B淋巴细胞的原生质膜CR1已表现出发生相应缺少(Wilson等人,1986,Arthr,Rheum,29:739-747)。
在患有Ⅳ型SLE肾炎的病人中,所有可测CR1抗原从足状突细胞中消失,而在较不严重的SLE肾炎和非SLE型增生肾炎,包括膜增生肾小球性肾炎Ⅰ和Ⅱ型病人中,肾小球足状突细胞中CR1表达与正常的并无不同(Kazatchkine等人,1982,J,Clin,Invest 69:900-912;Emancipator等人,1983,Clin Immunol.Immunopathol 27:170-175)。但是,患有Ⅳ型SLE肾炎的病人的红细胞CR1的数目并不比患有其它类型的肾狼疮或无肾炎的SLE病人少。(Jouvin等人,1986,Complement 3:88-96)。
在体内补体活化可调节在嗜中性细胞的原生质膜中CR1的表达(Lee.J.等人,1984,Clin.Exp.Immunol.56:205-214;Moore F.D.Jr等人,1986,N.Engl,J.Med,314:948-953)。
本发明涉及C3b/C4b受体(CR1)基因和它的编码蛋白质。本发明还涉及含有70个核苷酸的CR1核酸顺序和片段和它们编码的含有24个氨基酸的肽或蛋白质。此外,本发明提供了CR1蛋白质及其片段的表达。本发明的基因和蛋白质可用于诊断和治疗包括补体活性的疾病和各种免疫系统或炎症疾病。
在下面的实例章节中详细描述的本发明的特例中,将描述全长CR1cDNA及其片段的克隆,核苷酸顺序和推断的氨基酸顺序。还将描述CR1蛋白质及其片段的表达。得到含有C3b和/或C4b结合位点且显示因子Ⅰ辅助因子活性的CR1蛋白质及其片段的表达。
下面的实例还描述了可溶的CR1分子的制备和纯化,这些分子对于处理炎症反应和减小心肌梗塞范围以及预防肿块损伤的治疗是有用的。
3.1定义
Ad2MLP 腺病毒α主要的后期启动子
C=补体
C3(ma)=甲胺处理过的C3
C4bp=C4结合蛋白质
CWV=细胞肥大病毒
CR1=补体受体,1型,C3b/C4b受体
CR2=补体受体,2型
DCFDA-二氯荧光黄二乙酸酯(dichlorofluorescin diacetate)
HPLC=高压液相色谱
i C3b=失活的C3b
LHR=长同源重复
mAb=单克隆抗体
PAGE=聚丙烯酰胺凝胶电泳
RPAR=反向被动Arthrus反应
SCR=短一致重复
SCR1=可溶的CR1分子
图1,完整CR1编码区的核苷酸和氨基酸顺序。该顺序始于在克隆λT109.1的八聚体EcoR1接头后的第一个核苷酸。该顺序的第1531号核苷酸是在图3中描绘的顺序的第1号核苷酸的第1个5′核苷酸。推断的氨基酸顺序,显示在与mRNA相应的链的下面。由28-147号核苷酸所编码的推断的信号顺序在括号内。
图2,人体CR1 cDNA的5.5kb的限制酶图谱。黑线表示cDNA,限制酶位点是H.HindⅢ;B,BamHⅠ;R,EcoRⅠ;P.PstⅠ;A,ApaⅠ;S,SacⅠ;G.BglⅡ;K,KpnⅠ。获得该顺序的cDNA克隆显示于下面的图中。箭头表示采用双脱氧核苷酸链终止方法分析顺序的方向和范围。cDNA克隆根据限制酶图谱和重迭顺序同一性而确定方向。
图3,人体CR1 cDNA的5.5kb的核苷酸顺序。显示了与mRNA相应的链和碱基1(与图1中的碱基1532相对应)是在大多数5′克隆中EcoRⅠ接头后的第一个碱基。终止密码子用下划线表示。在核苷酸147和148(箭头)之间发现一段110-bp顺序,我们认为,它表示插入顺序部分。
图4,人体CR1 cDNA的5.5kb的核苷酸顺序的点阵分析。如果90bp中至少有40bp匹配,则标绘一个斑点。沿正方形对角线划分的黑线表示与顺序本身相重合。与相重合的线相平行的另外两条黑线1.35和2.7kb代表两者一前一后,引导每一个1.35kb的长同源重复(LHRs)。在两个LHRs之间的六条较浅的破折号线对应于一0.2kb的短一致重复。短一致重复(SCRs)沿长同源重复延伸出0.4kb。
图5,人体CR1的推断的氨基酸顺序。每一个残基用一字密码表示(Lehninger A.L,1975,Biochemistry,第2版,Worth印刷公司,New York,P.72)。将长同源重复中的残基排列以表明它们的同源性。所有在LHR-B中的残基均被显示了,只有当残基不同于LHB-B中的残基时,才给出LHB-C和LHB-D的残基。亲水图排列于蛋白质的COOH末端下以说明假定的转移膜区。紧靠在疏水顺序后的四个带阳性电荷的残基的范围用上划线表示,而与表皮生长因子受体中的蛋白质激酶C磷酸化位点67%同源的六个氨基酸顺序用下划线表示,CR1蛋白质的图显示了上述的顺序。(TM)转移膜区,(Cyt)胞质区,(3′UT)非翻译顺序。
图6,(A)CR1的SCRs的排列。重复是从NH2末端到COOH末端的1-23号。引入空间以尽可能增加排列。“盒”表示不变异的残基,垂直箭头表示氨基酸保守的位置。一个残基如果在至少一半SCRs中存在,则被视为保守或保守置换。水平箭头表示SCR,它也是CR1基因组克隆2.38的顺序且由单一的外显示编码。(B)限制酶图谱,测序方法和基因组克隆入2.38的部分顺序。限制位点是:(B)BamHⅠ,(S)SacⅠ,(E)EcoRⅤ,(K)KpnⅠ,(P)PstⅠ。水平箭头表示测序的方向和范围,垂直的箭头表示外显子-内含子分界线。
图7,已知具有该结构的蛋白质的SCRs的一致顺序的排列。引入空间以尽可能增加排列。如图5所示残基被视为保守,除了只具有1或2个SCRs的那些蛋白质,其中如果残基在至少一半其它蛋白质中存在,则残基为保守的,破折号相应于非保守的位置。CR2和C2b的下划线部分表示对于这些蛋白质来说,该区中尚未有过公开发表的顺序。“盒”表示不变异的半胱氨酸。顺序右边的数字表示用于产生一致顺序的SCRs的数字。用于确定一致顺序的蛋白质缩写和参考顺序是:(CR1)补体受体1型,(H)因子H(Kristensen,T.等人,1986,J.Immunol.136:3407),(C46p)C4结合蛋白质(Chung,L.P.等人,1985,Biochem.J.230:133),(CR2)补体受体2型(Weis J.J.等人,1986,Proc Natl.Acad.Sci,U.S.A83:5639),(Ba)因子B的蛋白质水解片段(Morley B.J.和Campbell R.D.1984.EMBO J.3:153),(C2b)C2的蛋白水解片段(Gagnon,J.1984,Philos,Trans,R.Soc,Lond.B.Biol.Sci.306:301),(Clr)C1的r亚基(Leytus S.P.等人,1986,Biochemistry 25:4855),(ⅩⅢb)因子ⅩⅢ的b亚基(Ichinose A,等人,1986,Biochemistry 25:4633),(β2GP1)β2糖蛋白I(Lozier J.等人,1984.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:3640),(Hap)结合珠蛋白(Kurosky,A.等人,1980,Proc.Natl.Acad,Sci,U.S.A.77:3388),(IL-2-R)白细胞间素(interleukin)-2受体(LeonardW,J.等人,1985,Science 230:633)。星号表示不完全顺序是可以得到的。
图8,人体CR1推断结构图。COOH末端胞质区是位于类脂双层膜的右边。30SCRs被线性化地排列在原生质膜的细胞外,括号表示LHRs。插入图是单个SCR的放大以说明三环结构。
图9,编码人体CR1的质粒pBSABCD的插入限制酶图谱。在表示含有编码顺序的区的“盒”中所描述的是八个cDNA克隆的九个片段,它们被连接以形成CR1结构。括号分别指出了LHR-A,-B,-C,和-D的位置。“盒”下面的线表示新分离的5′cDNA克隆的位置。限制酶位点是:A,ApaⅠ,B,BamHⅠ;G,BglⅡ,H,HindⅢ;K,KpnⅠ;M,BspMⅡ;P,PstⅠ;R,EcoRⅠ;和S,SacⅠ。
图10,编码LHR-A的七个SCRs的5′cDNA克隆的推断的氨基酸顺序,和具有LHR-B,-C和-D相应的SCRs的这个顺序的排列。在每一个SCR中保守的四个胱氨酸用下划线表示。只有当残基与LHR-A中的不同时,LHR-B,-C和-D的残基才表示出来。
图11,表达质粒piABCD和pMTABCD的限制酶图谱。pmMT和Pcmv分别代表鼠类金属硫因(metallothionein)和细胞肥大病毒最近的早期启动子。
图12,分别用piABCD(a和b组)和CDM8载体(c和d组)转染COS细胞的相差显微镜(a和c组)和免疫荧光显微镜的分析,用YZ1单克隆抗-CR1抗体和荧光标记的山羊抗鼠F(ab′)间接染色。
图13,采用表达重组CR1的COS细胞结合C3b和C4b的分析。由piABCD(a和c组)或CDM8载体(b和d组)转染的COS细胞用EAC4b(lim),3b(a和b组)或EAC4b(c和d组)培养,通过相差显微镜检查玫瑰花结的形成。
图14,由转染的COS细胞表达的重组CR1的SDS-PAGE方法分析。分别用CDM8载体(图谱通道1和4)和piABCD(通道2和5)转染的COS细胞,和来自于具有CR1(通道3和6)的F和S异型的个体的红细胞的表面用125Ⅰ标记。用琼脂糖UPC(通道1-3)和琼脂糖-YZ1(通道4-6)连续地免疫吸附细胞的用去垢剂处理的裂解产物,在非还原条件下用SDS-PAGE和放射自显影分析洗脱物。
图15,在免疫制动反应化重组CR1的存在下,用因子Ⅰ裂解125Ⅰ-C3(ma)。在因子H(通道1),用CDM8载体(通道)转染的COS细胞的溶解产物预孵育的琼脂糖-UPC10,pi ABCD转染的COS细胞(通道3)的溶解产物预孵育的琼脂糖-UPC10,用CDM8转染的COS细胞(通道4)的溶解产物预孵育的琼脂糖-YZ1,和已用piABCD转染的COS细胞预孵育的6μl(通道5),12μl(通道6)和25ml(通道7)的琼脂糖-YZ1存在下,用因子Ⅰ处理125Ⅰ-C3(ma)的重复样品。还在缺乏因子Ⅰ的条件下,用25μl已经用piABCD转染的COS细胞(通道8)的溶解产物预孵育过的琼脂糖-YZ1处理125Ⅰ-标记的C3(ma)的样品。还原后,采用SDS-PAGE和放射自显影分析125Ⅰ-C3(ma)。
图16,编码CR1缺失型突变体的cDNA结构。用全长piABCD结构(其上显示了用于制备缺失型突变体的限制酶位点)上的括号表示编码四个LHRs的cDNA片段的位置。在每一个突变体中所保留的cDNA限制片段均由实线表示。限制酶位点是:A.ApaⅠ;B.BamⅠ;E,BstEⅡ和P.PstⅠ。
图17,CR1重组缺失型突变株与野生CR1的F和S异型的比较。分别用琼脂糖-UPC10抗果聚糖抗体(通道1-6),琼脂糖-YZ-1抗CR1单克隆抗体(通道7-11)和兔抗CR1抗体和琼脂糖-蛋白质A(通道12)免疫沉淀分别用CDM8载体(通道2和8),piABCD(通道3和9),piBCD(通道4和10),piCD(通道5和11)和piD(通道6和12)转染的125Ⅰ-表面标记的红细胞(通道1和7)和COS细胞用去垢剂处理的裂解物。在还原条件下,将洗脱物进行SDS-PAGE和放射自显影分析。
图18,在表达全长和CR1缺失型突变体的COS细胞的存在下,用因子Ⅰ裂解125Ⅰ-C3(ma)。用CDM8载体(通道1和7),piABCD(通道2和8),piAD(通道3和9),piBD(通道4和10),piCD(通道5和1),和piD(通道6和12)分别转染的COS细胞,在因子Ⅰ缺乏(通道1-6)或存在(通道7-12)的情况下,与125Ⅰ-C3(ma)的重复样品一起孵育。并分别用因子H和因子Ⅰ(通道13)和单独用因子Ⅰ(通道14)孵育125Ⅰ-C3(ma)的样品。还原后,用SDS-PAGE和放射自显影分析125Ⅰ-C3(ma)。
图19,描述包括CR1的每一个LHR的SCRs的类型,和决定受体对C3b和D4b的专一性的预计位点的图解模型。它们的次级结合专一性用圆标号表示。
图20,保留在可溶的CR1 DNA结构中的DNA区的示意图的例子。全长CR1 cDNA的区由图顶端的“盒”表示。
图21,在pTCS系列表达载体中主要成份的示意图。
图22,表达载体pTC Sgpt的图。多聚腺苷化位点来自于鼠Ⅰg卡巴粒顺序(NBRF Nucleic database accession # Kams,bp1306-1714),Ad2MLP和三分区来自于Ad2顺序(NBRF Nucleic database accession # Gdad2,bp 5791-6069);SV40早期启动子来自于SV40基因组(NBRF Nucleic Database accession # GSV40W)。gpt基因,氨苄青霉素基因和细菌复制起点来自于载体pSV2gpt(ATCC Accession No.37145)。
图23,抗体亲和纯化的SCR1的4-20%的SDS-PAGE。非还原(通道1,2,3)和还原(通道4,5,6)的条件下。通道1,3∶分子量标记j通道3,5∶原材料的细胞培养上清液;通道4,6∶通过抗体亲和层析法纯化的sCR1。
图24,阳离子交换HPLC洗脱图。用在280nm下吸收值(y轴)来监测洗脱的蛋白质。流过的(0-100分钟)和洗脱的sCR1(150-165分钟)的吸收部分均被切下。X轴表示洗脱时间(以分表示)。
图25,阳离子和阴离子交换HPLC纯化的sCR1的4-20梯度SDS-PAGE。SDS-聚丙烯酰胺凝胶在非还原条件下进行。通道1,一部分生物反应体的上清液;通道2,经阳离子HPLC初始缓冲液透析的一部分上清液;通道3,从阳离子交换HPLC柱中洗脱的sCR1峰的一部分;通道4,从阳离子交换HPLC层析柱所得到的再透析至用于阴离HPLC的初始缓冲液的一部分sCR1峰;通道5和6,从阴离子HPLC得到的洗脱的sCR1的两种不同级分的部分。
图26,在人体嗜中性细胞中C5a所引起氧损伤。随着C5a所引起的氧损伤,DCFDA被氧化并发出很亮的荧光。用流动血球计数法测定荧光强度,荧光强度对应于X轴,细胞数对应于y轴。a组:细胞的图和入口(gate);b组:加入C5a后0分钟;c组;1分钟;d组:2分钟;e组:3分钟;f组:4分钟;g组:20分钟。该DCFDA分析提供了C5a的敏感性的显示。
图27,在sCR1存在下,人体补体的激活显示还原的C5a活性(DCFDA分析)。a组,未刺激的细胞,b组,显示出高度荧光的无sCR1的对照物;c组,在sCR1存在下DCFDA分析显示出荧光强度降低75%。y轴是细胞数,x轴是荧光强度。
图28,通过sCR1抑制在人血清中通过典型途径的C5a和C3a的制备。对于抗体亲和纯化或HPLC纯化的sCR1观察到相似的图。
图29,通过重组sCR1抑制补体调解的溶血作用。对于亲和纯化或HPLC纯化的sCR1观察到相似的图。
图30,在sCR1处理(左)和未处理(右)过的鼠中RPAR的粗形态。(a)两个大鼠接受卵白蛋白静脉注射,然后用sCR1(左边的鼠)或pBS(右边氖螅┯肟孤寻椎鞍祝康模ㄗ蟊叩奈恢茫?抗卵白蛋白,1/2稀释(中间位置)或兔ⅠgG(右边位置)的混合物进行皮下注射。注射进行二次;顶端和底部呈现相同的结果。接受sCR1的鼠几乎无肉眼可见的变化,而未处理的鼠则显示了RPAR的全部症状。(b)由(a)得到的皮肤活体组织的皮表面。从未处理的鼠(右)中得到的活体组织明显地显示出肉眼可见的损害,而从sCR1处理过的鼠(左)中得到的活体组织则显示了正常的形态。
图31.从sCR1处理过的(a)和未处理的(b)鼠中得到的皮肤活体组织的光学显微镜检查。(a)观察到在血管周围聚集的多形核细胞和单核细胞,但是,未看到嗜中性细胞的大量渗入和红细胞的外渗。(b)多形核细胞的大量渗入和红细胞的外渗被确定。
5.
本发明涉及C3b/C4b受体(CR1)基因和它的编码蛋白质。本发明还涉及含有70个核苷酸的CR1核酸顺序和它们的片段和它们编码的包含24个氨基酸的肽或蛋白质。此外,本发明还提供了CR1蛋白质及其片段的表达。这种CR1顺序和蛋白质在炎症或免疫系统疾病,和涉及补体活性疾病的诊断和治疗中是有价值的。
在一个特例中,本发明涉及可溶的CR1分子和它们的表达,纯化和使用。在这里所采用的术语“可溶的CR1分子”意指与天然的CR1蛋白质相比较,CR1的部分蛋白质不能象膜蛋白质那样在细胞表面表达。在一个特例中,基本无转移膜区的CR1分子是可溶的CR1分子。在一个较佳实例中,可溶的CR1分子由在其中它们被表达的细胞所分泌。
在下面将要详细描述的本发明的特例中,描述了全长CR1 cDNA以及其片段的克隆和完全核苷酸和推断的氨基酸顺序,和编码CR1产物的表达。具有C3b和/或C4b的结合位点,并抑制因子Ⅰ辅助因子活性的CR1以及其片段的表达也将描述。本发明通过可溶的,平截的CR1分子的制备和纯化而进一步列举。在一个特例中,这类分子出对于减轻炎症,减小心肌梗塞范围和防止肿块损伤的治疗是有用的。
5.1CR1基因的分离
CR1基因的完整编码顺序及其推断的氨基酸顺序呈现于图1中。
任何人体细胞都有可能作为CR1基因的分子克隆的核酸源。CR1基因的分离包括编码显示CR1相关结构或性能(例如,结合C3b或C4b或免疫复合体,调整吞噬作用,免疫激活作用或增殖,以及补体的调节数)的蛋白质的那些DNA顺序的分离。DNA可以通过该领域已知的标准方法从克隆的DNA(如,DNA“库”)中获得,可采用化学合成,cDNA克隆,或基因组DNA克隆或它的片段克隆;和从所需要的人体细胞中提纯(如,可参考Maniatis等人,1982,Molecular Cloning,实验室手册,Gold Spring Harbor实验室,Cold Spring Harbor,New York;Glover D.M.1985,DNA克隆:Apractical Approach,MRL Press有限公司,Oxford,U.K.Vol.Ⅰ,Ⅱ.)。可作为CR1基因cDNA克隆的核酸源的细胞包括(但不局限于此)单核细胞/巨噬细胞,粒细胞,B细胞,T细胞,脾卵泡树突状细胞和肾小球足状突细胞。来自于基因组DNA的克隆除编码区外还可能包含调节和内含子DNA区;来自于cDNA的克隆则仅包含外显子顺序。不管来源如何,CR1基因均应分子克隆进入用于基因繁殖的合适的载体中。
在对来自于基因组DNA的基因进行分子克隆时,产生DNA片段,它们中的一些将编码所需要的CR1基因。采用不同的限制酶,DNA可在特定的位点切断。换句话说,在锰存在下,我们可使用DNA酶分解DNA,或DNA可通过诸如声处理方法而被物理地剪切。然后可采用包括(但不局限于此)琼脂和聚丙烯酰胺凝胶电泳和柱层析在内的标准方法根据大小将线状的DNA片段分离。
一旦产生了DNA片段,则可用几种方法来鉴定包含CR1基因的特定DNA片段。例如,如果一定量的CR1基因或它的特定RNA,或它们的片段是有用的,并可被纯化和标记,则所产生的DNA片段就可通过与标记探针的核酸杂交进行筛选(Benton W和Davis R,1977,Science 196:180;Grunstein M和Hogness D,1975,Proc.Natl.Acad,Sci,U.S.A.72:3961)。与探针真真同源的那些DNA片段将杂交。如果纯化的CR1专一探针不能得到,则CR1中富集的核酸部分可以作为探针而用于初步选择程序。作为一个实例来说,已减去了成纤维细胞表达的信息的表现B细胞cDNA的探针可以使用。通过限制酶酶切和用已知的限制酶图谱(如果它是可以得到的)中所需要的那些来比较片段的大小而鉴定合适的片段是可能的。在初步选择后,根据基因的性能,或它的表达产物的物理,化学或免疫性能(如后面要描述的),可以进行进一步的选择。
CR1基因也可以通过核酸杂交然后体外翻译进行mRNA选择而被鉴定。在这个过程中,片段被用于通过杂交作用而分离互补的mRNAs。这些DNA顺序可代表有用的,纯化的CR1 DNA,或已被富集的CR1顺序的DNA。
分离的mRNAs的体外翻译产品的免疫沉淀分析或功能鉴定(如,C3b或C4b的结合,或吞噬或免疫激活的促进,或补体调节等)识别了mRNA和含有CR1顺序的互补DNA片段。此外,通过从细胞中分离出来的多核糖体吸附,可以选择出特定的mRNAs以固定专一地抗CR1的抗体。用选出的mRNA(来自于吸附的多核糖体中)作为模板可以合成放射标记的CR1 cDNA。然后可将放射标记的mRNA或cDNA作为探针以识别其它基因组DNA片段中的CR1 DNA片段。
分离CR1基因组DNA的可供选择的方法包括(但不局限于此)从已知的顺序中化学地合成基因顺序本身或制备编码CR1基因的mRNA的cDNA。例如,如上面所描述的,用于CR1基因的cDNA克隆的RNA可以从包括(但不限于)单核细胞/巨噬细胞,粒细胞,B细胞,T细胞,树状突细胞和足状突细胞在内的细胞中分离出来。在一个较佳具体实施例中,扁桃体(tonsilar)细胞可以作为用于cDNA克隆的mRNA的来源(见后面)。在本发明范围内的其它方法也是可行的。
然后,可将经确定和分离的基因插入合适的克隆载体中。该领域已知的很多载体宿主系统均可采用。可能的载体包括(但不局限于)质粒或经修饰的病毒,但是载体系统必须与所采用的宿主细胞相容。这类载体包括(但不局限于)噬菌体,如入衍生物;或质粒,如pBR322或pUC质粒或CDM8质粒(Seed B.1987,Nature 329:840-842)或衍生物。重组子可以通过转化,转染,感染,电刺激(electroporation)等而导入宿主细胞。
在一个可供选择的方法中,在以“鸟枪”法插入合适的克隆载体后,可以确定和分离CR1基因。在插入克隆载体前,可通过诸如大小分部分离的方法而富集CR1基因。
CR1基因被插入可以用于转化、转染或感染合适的宿主细胞的克隆载体中,这样,可产生很多基因顺序的拷贝。在一个特例中,克隆载体可以是CDM8载体,它可用于在哺乳动物宿主细胞中获得表达。插入至克隆载体内可以通过将DNA片段连接到具有互补的粘性末端的克隆载体中而完成。但是,如果在克隆载体中不存在可用于切割DNA的互补限制酶位点,则DNA分子的末端可进行酶修饰。换句话说,任何所需要的位点均可通过将核苷酸顺序(接头)连接到DNA末端而产生;这些连接接头可以包含能编码限制性核酸内切酶识别顺序的特定的化学合成的寡核苷酸。在一个可选择的方法中,切割的载体和CR1基因可以用同聚加“尾”加以修饰。
根据DNA本身的性能,或者,根据它的编码蛋白质的物理,免疫学或功能的性能,可以用几种不同的途径来进行克隆的CR1基因的鉴定。例如,DNA本身可以通过将噬菌斑或菌落核酸与标记的探针杂交而检测(Benton W和Davis R.1977.Science 196:180;Grunstein M和Hongness D,1975,Proc.Natl.Acad,Sci,U.S.A.72:3961)。或者,CR1基因的存在可以通过根据它的表达产物的性能的测定而检测。例如,能产生这样的蛋白质,如与已知的CR1具有相近或相同的电泳迁移,等电聚焦现象,蛋白质分解消化图,C3b和/或C4b和/或免疫复合体结合活性,补体调节活性,吞噬作用或免疫制激,或抗原性的cDNA克隆或能杂交选择合适的mRNAs的DNA克隆可以选出来。采用一种CR1抗体,用ELISA(酶连免疫吸附分析法)的过程,CR1蛋白质就可通过将标记的抗体与推测的合成CR1的克隆相结合而得以鉴定。
在一个特例中,用具胁羧氲椒掷氲腃R1基因,cDNA,或合成的DNA顺序的重组DNA分子进行的宿主细胞的转化能够产生多个基因拷贝。因此,通过使转化体生长,从转化体中分离重组DNA分子和,当需要时,从分离的重组DNA中重新得到所插入的基因,就可以获得大量的基因。
在一个特例中,在CDM8载体中的CR1 cDNA克隆可以被转染入COS(猴肾)细胞,以在细胞肥大病毒启动子的控制下进行大量的表达(见下面第8章节)。
如果最终的目的是将基因插入病毒表达载体,如牛痘病毒或腺病毒,则掺入CR1基因的重组DNA分子就可被修饰,这样,基因侧面与病毒顺序相接,使得基因可在用病毒感染后的细胞中遗传重组,这样,基因就可插入病毒基因组。
当含CR1 DNA的克隆鉴定,生长和收集后,它的DNA插入的特性如下面5.4.1中所描述的。
当CR1基因的遗传结构是已知的时候,就有可能操作该结构,使其最佳地用于本发明。例如,启动子DNA可以与编码CR1的顺序的5′相连接,此外,还可替代天然启动子以增加蛋白质的表达。能表达CR1缺失突变体的表达载体也可被制备,以得到CR1顺序的确定的片段的表达(见下面8.3章节)。在一个特例中,能编码可呈现所需要的C3b和/或C4b结合活性(见下面9章节)的CR1蛋白质的片段(例如,结合C4b的LRA-A,或结合C3b的LHR-C),的缺失突变体可以被构建。在另一个实例中,编码带有缺失转移膜区的CR1分子的表达载体可被用于制备可溶性的CR1蛋白质。在本发明的范围内,很多操作都是可能的。
5.2克隆的CR1基因的表达
编码CR1蛋白质(图1)或它的一部分的核苷酸顺序可以被插入合适的表达载体,即含有编码插入蛋白质的顺序的转录和翻译所必需的成份的载体。必要的转录和翻译信号也可由天然CR1基因和/或它的侧面区所提供。各种宿主-载体系统可用于表达编码蛋白质的顺序。它们包括(但不局限于)用病毒(如牛痘病毒,腺病毒等)感染的哺乳动物细胞系统;用病毒(如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统;微生物,如包含酵母载体的酵母(菌);或用噬菌体DNA,质粒DNA或cosmidDNA转化的细菌。这些载体的表达成份的长度和特性不同。根据所采用的宿主-载体系统,可以使用任何一种合适的转录和转译成份。例如,当在哺乳动物细胞系统中克隆时,可以采用分离自哺乳动物细胞的基因组或在这些细胞中生长的病毒(如腺病毒,猴肾病毒40,细胞肥大病毒)的启动子。由重组DNA或合成技术所制备的启动子也可以被使用以提供插入的顺序的转录。
为了有效地翻译编码插入的蛋白质的顺序,专一启始信号也是需要的。这些信号包括ATG启始密码子和邻近的顺序。在包括其固有的启始密码子和邻近的顺序的完整CR1基因被插入合适的表达载体内的情况下,不需要附加的翻译控制信号。但是,在只有一部分编码CR1的顺序被插入的情况下,一定要提供包括ATG启始密码子在内的外原翻译控制信号。此外,启始密码子必须与编码蛋白质的读码同相,以保证整个插入部分的翻译。这种外原翻译控制信号和起始密码子可以是各种来源的,天然或合成均可。
上述用于将DNA片段插入载体的任何方法均可用于构建包含由合适的转录/翻译控制信号和蛋白质编码顺序所组成的嵌合基因的表达载体。这些方法可以包括体外重组DNA和合成技术和体内重组(遗传重组)。
在一个特例中,可溶的CR1分子可以被表达。这种可溶的分子可以通过采用重组DNA技术,删除编码CR1转移膜区的DNA顺序而制备(见下面11-14章节)。如在下面所演示的,表达可溶的CR1分子的能力不限于任何一种遗传修饰的CR1核酸顺序;象编码CR1转移膜区的部分的核酸顺序一样长的顺序被删除,就可获得可溶的CR1结构。
含有CR1基因插入部分的表达载体可以通过三种普通的方法来鉴别:(a)DNA-DNA杂交,(b)“标记”基因的功能的存在或缺乏,和(c)插入的顺序的表达。在第一种方法中,被插入于表达载体中的外源基因的存在可以通过DNA-DNA杂交,采用含有与插入的CR1基因同源的顺序的探针,来加以检测。在第二种方法中,重组载体/宿主系统可以根据由外源基因插入载体而引起的一定的“标记”基因的功能(例如,胸腺嘧啶核苷激酶活性,耐抗生素性,转化表型,在杆状细菌中闭合体的形成等等)的存在或缺乏而加以鉴别和选择。例如,如果CR1基因被插入于载体的标记基因顺序中,包含CR1插入部分的重组体可以通过标记基因的功能的缺乏而鉴别。在第三种方法中,可以通过测定由重组体所表达的外源基因产物而鉴定重组表达载体。这种测定方法可以根据基因产物的物理,免疫或功能的特性而进行。
一旦当一个特定的重组DNA分子被鉴别和分离,则该领域中已知的几个方法可用于繁殖它。当一个合适的宿主系统和生长条件被建立,则重组表达载体可以大量地繁殖和制备。
在本发明的实例中详细描述的一个特例中,携带CR1 cDNA插入部分的CDM8载体可被转染入COS细胞,在其中CR1 cDNA插入部分被表达以产生CR1蛋白质。在下面章节的实例中详细描述的一个特例中,携带相应与部分CR1编码区的CR1 cDNA插入部分的CDM8载体可被转染入COS细胞,在其中CR1或片段被表达。在下面将要描述的另一个实例中,通过采用表达载体,如在11.3.1章节中所描述的pTCS载体,平截的,可溶的CR1分子可以在哺乳动物细胞中被表达。如前面所述的,可以采用的表达载体包括(但不局限于)下列载体或它们的衍生物:人体或动物病毒,如牛痘病毒或腺病毒;昆虫病毒,如杆状病毒;酵母载体;噬菌体载体(如λ-噬菌体载体)和质粒和cosmid DNA载体,这些只是少数。
此外,调节插入的顺序的表达,或修饰和加工所需要的特定形式的嵌合基因产物的宿主细胞系被选出。在一定的诱导物存在下,从一定的启动子中的表达可以增强;因此,遗传工程的CR1蛋白质的表达可以被控制。进一步地说,不同的宿主细胞对于蛋白质的翻译和翻译加工后和修饰具有特定和专一的机制。可以选择合适的细胞系或宿主系统以保证所表达的异源蛋白质的所需要的修饰和加工。例如,在一个实施例中,为了产生一种具有图1中所推断的氨基酸顺序的未糖基化的CR1蛋白质,可以在细菌系统中进行表达。而在酵母中表达则得到一种糖基化的产物。在另一个实施例中,为了保证异源CR1蛋白质的“天然”糖基化作用,可以采用哺乳动物的COS细胞。此外,不同的载体/宿主表达系统可能影响加工反应,如产生不同程度的蛋白质裂解。在本发明的范围内,可以得到CR1蛋白质的多种不同的加工产物。
在本发明的一个较佳实施例中,可溶的CR1分子的大规模制备可以如下面12.1等章节中所描述的那样进行。
5.3.表达的基因产品的鉴别和纯化
一旦表达CR1基因的重组子被鉴别了,就应该分析基因产物。这可以通过产物的物理,免疫或功能的特性的测定而完成。
CR1蛋白质可通过包括色谱法(如离子交换,亲和层析,和大小分离柱层析),离心分离,不同的溶解性在内的标准方法,或通过纯化蛋白质的其他标准技术而被分离和纯化。
在下面的实例中详细描述的本发明的一个较佳的实例,大量的可溶CR1可以通过包括HPLC在内的方法而纯化(见12.2等章节)。如在下面所描述的,纯化的CR1的大规模生产可以通过采用一种表达系统来进行,它产生可溶的CR1作为初始物质,这就不需要将CR1与去垢剂相连接的溶解的膜。在生物反应培养物中牛胎血清浓度的减小和/或在这些培养物用采用选择培养基就消除了在连续纯化中从含有可溶的CR1初始物质中除去高浓度的外源蛋白质的需要。在这个较佳实例中,阳离子HPLC或阳离子HPLC,然后阴离子交换HPLC相结合的方法可以用于纯化。这样,仅以一或二个步骤,就可高产率地获得基本纯化的可溶的CR1。
或者,一旦由重组子所产生的CR1蛋白质被鉴定,则蛋白质的氨基酸顺序就可以从包含于该重组子中的嵌合基因的核苷酸顺序来推断。结果发现,蛋白质可以通过该领域已知的标准化学方法来合成(例如,可参考Hunkapiller M.等人,1984,Nature 310:105-111)。
在本发明的一个特例中,这种CR1蛋白质(不管是由重组DNA技术还是用化学合成方法制得的)包括(但不局限于)包含初级氨基酸顺序,图1中所描绘了全部或部分氨基酸顺序包括在该顺序内的由功能相同的残基进行取代而产生同意变化的改变顺序。例如,在该顺序中的一个或多个氨基酸顺序可以被产生同意置换的功能相同作用相似的极性的其他氨基酸所取代。非保守的置换也可产生功能相同的蛋白质。
在一个实施例中,CR1顺序内的氨基酸的置换可以从该氨基酸所属的组的其他组份中选择。例如,非极性(疏水的)氨基酸包括丙氨酸,亮氨酸,异亮氨酸,缬氨酸,脯氨酸,苯丙氨酸,色氨酸和蛋氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸,丝氨酸,苏氨酸,半胱氨酸,酪氨酸,天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电荷(碱性)的氨基酸包括精氨酸,赖氨酸和组氨酸。带负电荷(酸性)的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。在翻译中或翻译后,进行各种不同的修饰,如糖基化,蛋白质分解等的CR1蛋白质也包括在本发明的范围内。
在下面要详细描述的本发明的一个实例中,显示了由转染的细胞表达的克隆重组CR1,它不能通过SDS-PAGE而从红细胞的F-异构体中区别出来(图14),它可调节载有C4b或C3b的羊红细胞的结合,和能够再产生CR1的配体专性(图13),并显示出对于切割C3(ma)的α多肽的因子Ⅰ辅助因子活性(图15)。
5.4.CR1基因和蛋白质的结构
CR1基因和蛋白质的结构可以通过该领域已知的多种方法来分析,包括(但不局限于)下面描述的那些。
5.4.1.遗传分析
与CR1基因相应的克隆的DNA或cDNA可以用包括(但不局限于)Southern杂交(Southern E.M.1975,J.Mol.Biol.98:503-517),Northern杂交(可参考Freeman等人,1983,Proc.Natl.Acael.Sci.U.S.A.80:4094-4098),核酸限制内切酶图谱(Maniatis T.1982,Molecular Cloning,实验室手册,Cold Spring Harbor实验室,Colod Spring Harbor,New York),和DNA顺序分析在内的方法来分析。Southern和Northern杂交的杂交条件的严格程度可进行控制以保证与所用的特定CR1探针具有所需的核酸顺序的检测。例如,在不很严格的条件下,与含有编码LHR-B和LHR-C的CR1基因顺序的探针杂交可用于检测CR2核酸顺序。
限制性核酸内切酶图谱可用于粗略地确定CR1基因的遗传结构。在一个特例中,用限制酶切割可以得到如下面的图2中所示的限制酶图谱,由限制性核酸性内切酶切割所得到的限制酶图谱可以通过DNA顺序分析而得以证实。
DNA顺序分析可以能通过该领域已知的任何技术来进行,包括(但不局限于)Maxam和Gilbert方法(1980,Meth.Enzymol.65:499-560),Sanger双脱氧方法(Sanger,F.等人,1977,Proc.Natl.Acael.Sci.U.S.A.74:5463)或使用自动DNA测序仪(如,Applied Biosystems,Foster City,CA.)。CR1基因的cDNA顺序包括在后面的图1中所标绘的和在第6,第7章节所描述的顺序。
5.4.2.蛋白质分析
CR1蛋白质的氨基酸顺序可以通过从DNA顺序推断,或者直接测蛋白质的顺序,如采用自动氨基酸顺序仪而得到。具有代表性的CR1蛋白质的氨基酸顺序包括在随后的图1中和下面的第6章节中详细描述的顺序。如下面所要描述的,所有F异型体CR1的编码顺序均已克隆,在将41个氨基酸的信号肽切掉后,成熟受体包含1998个氨基酸,其中包括形成30SCRs的1930残基的细胞外结构区(其中28个SCRs被组入LHR-A,-B,-C和-D(图10)),25个氨基酸的跨单层膜区和43个氨基酸的相对较短的胞质区。
在包含多个SCRs的C3/C4结合蛋白质中,CR1是唯一具有组入LHRs的SCRs组的。CR1的四个LHRs的比较显示了每一个均是四种类型,即a、b、c和d型的SCRs的组合物(图19)。例如,LHR-A的SCR-1和SCR-2与LHR-B,-C和-D的前二个SCRs分别只有62%,62%和57%相同。但是,SCR-3到SCR-7与LHR-B相应的SCRs仅在一个位置上不同,SCR-3和-4与LHR-C的相应的SCRs仅在三个位置上不同(图10)。因此,LHR-A的“a”型SCRs中的一些也存在于LHR-B和-C中。与LHR-A的SCRs不同的LHR-B的前二个SCRs与LHR-C的相应的SCRs有99%相同,因此,LHR-B和-C在这些位置上共有“b”型SCRs。LHR-C的SCR-5,-6,-7只有77%与在这些位置上的LHR-A和-B的“a”型SCRs相同,被认为是“c”型SCRs。LHR-D的1-4个SCRs是相对独特的,是“d”型,尽管SCRs 5-7有约93%与在LHR-C中发现的“c”型相同。
CR1蛋白质顺序的进一步定性是通过亲水性分析(Hopp T.和Woods K.1981,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A,78:3824)来表示的。亲水性的图可用于鉴定CR1蛋白质的疏水区和亲水区和编码这些区的基因顺序的相应区。图5描绘了CR1蛋白质的COOH末端的亲水性图。
为了预测CR1特定二级结构区,可以进行二级结构分析(Chou P.和Fasman G.,1974,Biochemistry 13:222)。
结构分析的其他方法也可以采用。它们包括(但不局限于)X-射线结晶学(Engstom A.1974,Biochem.Exp.Biol.11:7-13)和计算机模型(Fletterick R.和Zoller M.ceds.),1986,Computer Graphics and Molecular Modeling,in Current Communications in Molecular Biology,Cold Spring Harbor实验室,Cold Spring Harbor,New York)。
5.5.与CR1有关的衍生物,类似物和肽
CR1相关的衍生物,类似物和肽的制备和使用也是可以展望的,并在本发明的范围内。这类具有所需要的免疫原性或抗原性的衍生物、类似类肽可以被用于诸如免疫分析,免疫接种,治疗等中。这类分子保留或抑制了一个所需要的CR1性能,例如,C3b或C4b的结合性,补体活性的调整,或促进免疫刺激或吞噬作用,它们可分别用作为这些特性的诱导物,抑制剂。
本发明的CR1相关衍生物,类似物和肽可以通过该领域已知的多种方法来制备。获得它们的操作可在基因或蛋白质水平上发生。例如,克隆的CR1基因可以通过该领域已知的多种方法(Maniatis T.1982,Molecular Cloning,实验室手册,Cold Spring Harbor实验室,Cold Spring Harbor,New York)中的任何一种而加以修饰。可以用核酸限制内切酶(一种或多种)将CR1顺序在合适的位点切开,如果需要的话,再进一步进行酶修饰,分离,并在体外连接(见下面第8章节)。在编码CR1相关衍生物,类似物或肽的基因的制备中,必须十分仔细以保证经修饰的基因在编码所需要的CR1专一活性的基因区内保留在与CR1相同的翻译读码中,不被翻译终止信号打断。
此外,CR1基因可以在体外或体内突变,以产生和/或破坏翻译,启始,和/或终止顺序,或在编码区内产生变异体和/或新的限制性核酸内切酶位点或破坏先前所存在的位点,促进在体外的进一步修饰。该领域已知的任何突变技术均可使用,包括(但不局限于)在体外直接的位点突变(Hutchinson C.等人,1978,J.Biol.Chem.253:6551),TAB 衔接子的使用(Pharmacia),等等。
CR1顺序的操纵也可以在蛋白质水平进行。几种化学修饰的任一种均可采用已知的技术来进行,包括(但不局限于)通过溴化氰,胰蛋白酶,胰凝乳蛋白酶(糜蛋白酶),木瓜蛋白酶,V8蛋白酶,NaBH4的专一化学裂解;乙酰化,甲酰化,氧化,还原;在衣霉素的存在下,代谢合成;等等。
此外,CR1相关类似物和肽可以化学地合成。例如,与可调节所需要的活性(例如,C4b和/或C3b结合,免疫刺激,补体调节等)的部分CR1相应的肽可以采用DNA合成器(例如,Applied Biosystems Model 380A)来合成。
5.6. CR1的用途
CR1蛋白质、类似物、衍生物及其亚序列(subsequence)、及抗-CR1抗体在测试及诊断中有用途。本发明的表现所需的CR1性质的分子可用于测试这类性质或功能。例如表现出以游离的或复合物形式连覥3b及/或C4b的CR1蛋白质或其片段可用于测定某一样品,例如病人体液中的该物质的数量的测试中。
在一个特定的实例中,具有结合C3b(例如参见下述之表Ⅱ、第9章)ic3b或C4b(例如参见表Ⅱ)的在细胞表面表达的全长的CR1或CR1缺失突变体(例如在以下的第8章所述者)可用于同一个样品中分别地测定C3b、ic3b、或C4b的水平。在另一个实施例中,用重组DNA技术组建的缺失转膜序列的一个CR1蛋白或其片段被分泌并被采用。
在一个特殊的实例中,这类对C3b及/或C4b的测定可用作对补体活性的指示,从而可用于对炎症及免疫系统疾病的诊断。这类疾病包括(但不限于)因烧伤引起的组织损伤或心肌梗塞引起的创伤,成年人的呼吸窘迫综合征(shock lung),诸如风湿性关节炎、全身性红斑狼疮等自身免疫的疾病,以及其他的涉及不希望的或不正常的补体活性的各种疾病或不适(参见文献:e.g.,Miescher,P.A.and Muller-Eberhard,H.J.,eds.,1976,Text Book of Immunopathology,2d Ed.,Vols.Ⅰ and Ⅱ,Grune and Stratton,New York;Sandberg,A.L.,1981,in Cellular Functions in Immunity and Inflammation,Oppenheim,J.J.et al.,eds.,Elsevier/North Holland,New York,P.373;Conrow,R.B.et al.,1980,J.Med.Chem.23:242;Regal,J.F.and Pickering,R.H.,1983,Int.J.Immunopharmacol.5:71;Jacobs H.S.,1980,Arch.Pathol.Lab.Med.104:617)。
CR1蛋白及其片断含有一个表位,可用于免疫测试法(但不限于)等等测试中。可以采用的免疫吸附试法包括(但不限于)采用诸如放射免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附试验)、“夹心式”免疫测定、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散试验、凝集试验、补体-固相测定、免疫放射量测定、荧光免疫测定、蛋白A免疫测定及免疫电泳测定等等技术的竞争性的及非竞争性的测试系统。
CR1基因及相关的核酸序列及亚序列可以用于杂交测试法。这类杂交测试法可以用于监测炎症或与CR1表达相关的免疫应答用于诊断某些与CR1表达的变化相关的疾病状态,用于确定某个病人的CR1异型,用于检测CR1基因及相关基因(例如,CR2)的存在及/或表达。
5.6.2治疗法
CR1蛋白及其片段、衍生物及类似物可在治疗上用于调节受CR1调节的功能。这类功能包括(但不限于)以游离或复合的形式结合C3b及/或C4b、促进吞噬作用、补体的调节、免疫刺激等等。本发明的有效剂量的CR1蛋白及相关分子对于与这些功能相关的许多疾病或不适,诸如免疫或炎症疾病(例如,如以上第5.6.1章节所述)具有治疗学价值。例如,那些显示了所需活性的全长的CR1或其片段和相关分子可用于补体抑制的治疗中,通过其作为因子Ⅰ辅因子的能力,促进补体成分C3b或C4b的不可逆失活(参见:Fearon,D.T.,1979,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.76:5867;Iida,K.and Nussenzweig,V.,1981,J.Exp.Med.153:1138),及/或其抑制替代的或典型的C3或C5转化酶的能力。本发明的一个特定的实例中,一个表达载体可以组建以编码缺乏转膜区域的CR1分子(例如,通过使为大多数C-末端SCR所编码的精氨酸的羰基末端缺),从而产生一种,在游离或复合物形式下保持了连接C3b及/或C4b的能力的可溶性的CR1片段。在一个特别的实例中,这样的一种CR1蛋白可以不再显现因子Ⅰ辅因子的活性。该可溶性的CR1产物可施于患者体内,以便使可溶性的CR1有效地与天然的细胞表面CR1竞争以结合C3b及/或C4b,从而阻断细胞表面CR1因子Ⅰ辅因子活性,并提高补体活性。
当C3b被共价地结合到颗粒及可溶性的免疫复合体,用蛋白水解加工成ic3b及C3dg引起的失活具有两种生物学结果:组止补体系统通过放大途径的过多的激活,以及形成非CR1的可以成为受体的配位体。由于ic3b片段不能连接B因子,因而转化成这种状态后可通过另一放大圈途径而组断额外的补体激活。然而,ic3b可以与CR1及CR3通过骨髓单核细胞调节吞噬作用的两种补体受体结合。因而,C3b转化成为ic3b的初级生物学结果是在不干扰由CR1-及CR3所调节的对C3-coated复合物的清除的情况下,中止补体的激活。相反,ic3b向C3dg的额外的转化所产生的片段仅与CR2作用而不与CR1及CR3作用。这种情形限制了依赖补体的载有C3dg的复合物与表达CR2的那类细胞的连结,这类细胞包括B淋巴细胞、滤泡树状突细胞,也许还包括真皮的上皮细胞、并且减少或排除与吞噬作用细胞类型的作用。这种改变的细胞联合的型式的生物学结果,应该将涉及免疫应答传入期的细胞而非那些涉及清除及降解颗粒及复合物的细胞作为载有C3dg复合体的靶子。因而,CR1在治疗学方面不仅可用以影响清除过程,而且可用以将参与抗原呈现及抗体产生的载有CR2细胞类型作为复合物的靶子。
在另一个实例中,能与C3b或C4b结合、及/或保留抑制可选择的或典型的C3或C5转化酶能力或保留因子Ⅰ辅因子活性的CR1蛋白或其片段可以用以促进补体的失活。在该实例中,该CR1蛋白或片段在医治那些涉及不希望的或不合适的补体活性的疾病(例如,成年呼吸窘迫症、Shock lung,因烧伤引起之组织损伤或心脏局部缺血的病情,自身免疫病患等等)方面具有价值。
在下述的例子的章节11-14中细述的特定的实施例中,一种可溶性的CR1分子被表达,它保留了所需的功能活力,例如在体外试验中对经典的补体媒介的血细胞溶的抑制能力,经典的C5a产生,经典的C3a的产生,或中性白细胞的氧化性损伤(Oxidative burst)等的抑制。
在一个特殊的实施例中,该种可溶性的CR1分子可用于减轻炎症及其损害,或减小心肌梗塞的区域大小或预防重新输注的(reperfusion)损伤等等。该在体内治疗试验中有用的CR1分子可用各种现有技术中的系统进行测定,包括(但不限于)反相被动阿图斯氏反应(见第14.1章节)及大鼠心肌梗塞(见第14.3章节)。
在本发明的另一个实施例中,显示抑制所需的CR1性质或功能的CR1的片段或其类似物或衍生物可用以预防或治疗与这些功能有关联的疾病或不适。
已知各种递药系统可用于递送CR1及相关分子,例如,用脂质体胶囊法、在基因治疗中用造血干细胞后代来表达等等。其它的引入的方法包括(但不限于)皮肤内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内及口服等等施用途径。
6.例子:人类C3b/C4b受体(CR1)
的克隆及定序
在此详述的例子中,我们就5.5千碱基对(kb)的CR1编码区的克隆及核苷酸顺序进行描述(Klickstein,L.B.,et al.,1987,J.Exp.Med.165:1095-1112)。
全长5.5kb的重叠的CR1 cDNA克隆从扁桃体库中分离出,并对整体或部分进行定序。已经确定了一个自该克隆5′端开始的、延至距中止密码子下游4.7kb处的长的单独的开放读码。它代表了预计为6kb的CR1 F异型的编码序列的80%。还确定了三个450个氨基酸的串联的长同源重复(LHRs)。胰蛋的酶肽序列分析提供证表明CR1 F异型存在第四个LHR。各LHR之间的氨基酸的同一性范围为自第一及第三个重复之间的70%,第一个重复的氨基末端的250个氨基酸及第二个重复之间的99%。每个LHR包括七个60-70氨基酸的短的一致的重复(SCR),类似于其它C3/C4结合蛋白,诸如补体受体2型、因子B及H、C4结合蛋白及C2的SCRs。有两上额外的SCRs将LHRs与25个氨基酸的单一的跨膜区域相连接:因而,CR1的F异型可能含有至少30个SCRs,其中的23已被定序。每个SCR预计形成一个三环结构,四个保守的半胱氨酸形成二硫桥。作为一种半坚固结构,该线状排列的30个SCR可自原生质膜伸出1,140埃,并且可以促进CR1与位于免疫复合物及微生物(细胞壁的空隙中的C3b及C4b作用。43个残基的羧基末端胞质区域含有一个六个氨基酸的序列,它是与被蛋白质激酶C磷酸化表皮生长因子受体序列相同源的。
6.1.材料及方法
6.1.1.CR1胰蛋白酶肽的分离及序列
CR1是用连续的Matrex红A及YZ-1单克隆抗体亲和层析从洗过的人类红细胞上提纯的(参见:Wong,W.W.,et al.,1985,J.Immunol.Methods 82:303)胰蛋白酶肽是用已述的连续梯度及常液反相HPLC制备并提纯的(参见:Wong,W.W.,et al.,1985,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82:7711)。胰蛋白酶肽的分析是用一个470A蛋白质定序仪(Applied Biosystems,Inc.,Foster city,CA)进行的,而对每个降解循环的分析是通过采用一个120 PTH氨基酸分析仪(Applied Biosystems,Inc.)获得的。
6.1.2.cDNA克隆及基因组克隆的分离
如上所述,从人类扁桃体poly(A)+RNA在入gtll中组建了一个cDNA库(参见::Wong,W.W.,et al.,1985,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82:7711)。用RNA吸印杂交法,使扁桃体(tonsil)供体对于CR1的F等位基因为同源的(id)。在琼脂糖凝胶上进行cDNA选择,使在克隆步骤之前包括自2至7kb和组份。库初期的复杂性为每100ng cDNA为4.5×106重组子,而且该库被在大肠杆菌Y1088株中放大。该库的筛选(Maniatis,T.,et.,al.,1982,Molecular Clonig,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York)采用CR1探针、CR1-1(ATCC保藏号第57330号(含CR1-1质粒大肠杆菌)、第57331号(纯化的CR1-1DNA)及CR1-2(参见:Wong,W.W.,et al.,1985,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82:7711),其已通过切口转移进行放射标记达2-8×108cpm/μg的专一活性。杂交过程是在50%甲酰胺(使用5×SSC(1×SSC:15mM柠檬酸钠,150mM氯化钠)),在43℃下进行的,而将滤纸在60℃下于0.2×SSC中洗涤,这些条件不能用于检测CR2 cDNA克隆(参见:Weis,J.J.,et al.,1986,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83:5639)。在进行限制酶图谱及DNA序列分析之前先对阳性克隆进行两次噬菌斑纯化。用由Sau3 AⅠ部分地酶切人类白细胞DNA所产生的15-20kb片段在EMBL-3中组建一个基因组库。最初的复杂性为1.2×106,并将该库在大肠杆菌P2392株中进行放大。该库同样用cDNA探针CR1-1及CR1-2进行筛选(参见::Wong,W.W.,et al.,1985,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82:7711)。
6.1.3 DNA序列分析
cDNA克隆的限制性片段被亚克隆入M13mp18或M13mp19并用双脱氧核苷酸链终止法(参见:Sanger F.,et al.,1977 Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.74:5463)进行定序。通过首先用核酸外切酶Ⅲ产生预定的缺失突变体的方法,全部地、部分地对一些克隆进行定序(参见:Henikoff,S.,1984,Gene 28:351)。每个区域在两条链上都进行定序,在大多数情况下,每个区域在由两个独立分离的cDNA克隆(图2)所组建的M13亚克隆上进行定序。在对序列数据进行分析时,采用了威斯康星大学遗传学计算机组设备。
6.2结果
6.2.1CR1基因的核苷酸序列
用从CR1 cDNA克隆、入T8.3所得的CR1-1及CR1-2探针对经大小选择的扁桃体cDNA库进行筛选(Wong,W.W.,et al.,1985,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82:7711)。15个阳性噬菌体被从1.5×106个重组体中确定出来,而其中的13个为不同的克隆。对其中10个进行了限制酶图谱分析,并用双脱氧核苷酸链终止法进行全部的或部分的定序。cDNA克隆根据其重叠序列的一致变(图2)而排列成直线,并且已发现其长为5.5kb(图3)。已经确定自该cDNA克隆的5′端起一直延伸至终止密码子下游的4.7kb处的一个单一的长的开放读码。在该库中CR1的编码顺序预计为6kb,依据为该非糖基化的受体的估计的分子量为220,000(参见:Wong,W.W.,et al.,1983,J.Clin Invest.72:685)。因而这些克隆占了所估计的克隆序列的80%。克隆T49.1及T55.1在其5′端含有编码序列,表明附加的5′编码及非编码序列仍可确定。在3′区域重叠克隆T8.2、T43.1及T87.1含有由各个克隆中的相同序列所编码的转膜及细胞质区延伸到最远3′端的克隆T8.2含有一个无poly(A)序列的807个碱基对的不翻译序列,与克隆T6.1及T55.1中所发现的序列比较,克隆T8.3含有在1,406-1,497之间缺失的91bp的核苷酸,而克隆T40.1含有在1,498-1,507之间缺失的9-bp的核苷酸。这些缺失出现在具有与5′拼接位点同源序列的区域,可能表示这是mRNA中的拼接错误。克隆T49.1及T55.1在开放读码的147及148核苷酸之间含有一个110bp的插入片段(图3)。该序列据判断为内含子的一部分,因为它不与扁桃体poly(A)+RNA的吸印杂交,它含有一个5′拼接位点(参见:Breathnach,R.,et al.,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.75:4853),(图3)它在CR1基因组克隆中位于cDNA序列的侧翼,而且,它还转移了读码。克隆T9.4在3′端含有0.88kb的插入顺序,该插入顺序不与扁桃体poly(A)+RNA的吸印杂交。
6.2.2CR1的核苷酸及氨基酸序列的分析
CR1的核苷酸序列(图3)的点征(Dot)分析揭示出有两种类型的内在同一性(图4)。第一类型的内在同一性由粗黑的实线所示,存在三个1.35kb的正向的高度同源的串联重复。这些核苷酸顺序编码CR1的长同源的重复(LHRs)。第二类型的重复由平行的破折线所示,指明具有较低同源性的区域。每隔190-210个核苷酸这些序列总要出现,并且编码CR1的短一致重复(SCRs)。
从cDNA顺序推断的氨基酸序列如图5所示这三个LHR分别称为LHR-B、LHR-C及LHR-D,它们在图中被排成直线以示其同一性。LHR-B自残基1延伸至残基438,LHR-C相应于残基439-891,而LHR-D自残基892延伸到残基1,341。LHR-C的残基451-694 99%相同于LHR-B的残基1-244,然而与LHR-D相应残基之间只有61%相同。相反,LHR-C的残基695-891,91%相同于LHR-D的残基1,148-1,341,而与LHR-B相应于区域只有76%相同。由此看来,LHR-C为一个杂合体,包括的序列绝大多数同一于LHR-B的前半部,及LHR-D的后半部。
LHR后接两个不重复的SCR,即为一个25残基的疏水片段及一个与SCR无序列同源性的43个氨基酸COOH末端区域(图5)。
CR1编码序列的5′的1,3kb的片段为第四个LHR,即LHR-A(参见以上的图1及以下的第七章)。该结果由红细胞CR1的胰蛋白酶肽的分析来支持。十个胰蛋白酶肽具有与来自于cDNA克隆的氨基酸序列相同的序列(表Ⅰ)
表Ⅰ
发现于衍生的氨基酸序列*中的CR1
胰蛋白酶肽
肽号码 氨基酸序列 在衍生序列中残基数
66 VDFVCDEGFQLKGS-A 330-345
28 GAASL-QG-WSPEAP 732-749,1,185-
1,202
49 -IFC-NP-AIL 805-826,1,258-
1,279
35 CQALNKWEPELPSCSR 228-243,678-693
41c DKDNFSPGQEVFYSCEPGYDLR 260-281
34b AV-YTCDPHPDRGTSFDLIGESTIR 393-417
44d VCQPPPEILHG 694-704,1,147-
1,157
54d VFELVGEPSIYCTSNDDQVGIWSGPAPQ 152-179,602-629
57b YECRPEYYGRPFS 19-31,469-481
39b LIGHSSAECILSGNAA 85-100
*发现于衍生的氨基酸序列中的来自人类红细胞CR1的胰蛋白酶。
列于右手一栏内的数学范围表明该肽位于衍生氨基酸序列中的位子。在肽66、28及49的每个破折线表明在那一轮中已确定多残基。而在肽34b中的破折线表明在那一轮中已确定无残基。
每个LHR包括七个60-70氨基酸SCR,它们是C3及C4族结合蛋白(C4bp)的特征(图6A)。通过在线性排列的序列(图6A)中引入空间,可以观察到CR1的23个SCRs中最全的同源性平均65个残基中,在每个重复中共有29个保守。有六个残基存在于所有的SCRs中:四个半胱氨酸位于近似的相关位置上这一点表明它们各自涉及关键的硫键,及第二个半胱氨酸后面的色氨酸及第二个苷氨酸(图6A)。采用周氏(chou)及范斯曼(Fasman)的规则(参见:chou,P.Y.and Fasman,G.D.,1974,Biochemistry 13:222)对那些不变的半胱氨酸之间顺序的二级结构的分析,作出的预言为,它具有较高的形式β-折叠的几率而具有较低的形成α-螺旋的几率。对两种CR1基因组克隆,即2.38(图6B)及2.46克隆的序列分析表明,SCR-14(图6A)是由一个单一的外显子编码的,而SCR-23的COOH的末端相应于一个外显子的末端。因而,CR1的SCRs可以被割裂的外显子编码,正如在B因子的SCRs(参见:Campbell,R.D.and Bentley,D.R.,1985,Immunol.Rev.87:19)及在IL-2-R的SCRs(参见:Leonard,W.J.,et,al.,1985,Science 230:633)所表现的那样。
将CR1 SCRs的相同序列与具有该特征性结构(图7)的总科(Superfamily)的其它成员的SCRs相比较。这类成员不仅包括具有C3/C4结合功能的蛋白,如CR2(参见:Weis,J.J.,et al.,1986,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83:5639)、C4bp(参见:Chung,L.P.,et al.,1985,Biochem.J.230:133)、H因子(参见:Kristensen,T.,et al.,1986,J.Immunol.136:3407)、B因子(参见:Morley,B.J.and Campbell,R.D.,1984,EMBO J.3:153;Mole,J.E.,et al.,1984,J.Biol.Chem.259:3407)及C2(参见:Bentley.D.R.and Porter,R.R.,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:1212;Gagnon,J.,1984,Philos.Trans.R.Soc.Lond.B.Biol.Sci.306:301),而且还包括那些还不知其有该功能的蛋白,诸如:白细胞间素(interleukin)2受体(参见:Leonard,W.J.,et.,al.,1985,Science 230:633)、β2-糖蛋白Ⅰ(参见:Lozier,J.,et al.,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:3640)、Clr、(参见:Leytus,S.P.,et al.,1986,Biochemistry 25:4855)、触珠蛋白α链(参见:Kurosky,A.,et al.,1980,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.77:3388),以及XⅢb因子(参见:Ichinose,A.,et al.,1986,Biochemistry 25:4633)。除了触珠蛋白缺乏第三个半胱氨酸外,半胱氨酸残基在所有蛋白的SCRs中都不变化。色氨酸同样也保持不变,但β2-糖蛋白Ⅰ中的第五个SCR及ⅩⅢb因子中的两个重复为例外。并不在每一个SCR中都存在的其它的保守的残基趋向于聚集在半胱氨酸周围。在B因子及C2中仅有一个游离的巯基(参见:Christie,D.L.and Gagnon,J.,1982,Biochem.J.201:555;Parkes,C.,et al.,1983,Biochem.J.213:201),而在β2-糖蛋白Ⅰ的SCRs中第一个半胱氨酸与第三个形成二硫键,而第二个与第四个形成二硫键(参见:Lozier,J.,et al.,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:3640)。
在衍生的CR1的氨基酸序列中,存在17个N-连接寡糖的潜在位点,而且它们均位于细胞外区域(图6A)。在存在与不存在衣霉素的情况下合成的CR1在分子量的差异(参见:Lublin,D.M.,et al.,1986,J.Biol.Chem.261:5736)及对氨基葡萄糖含量的分析(参见:Sim,R.B.,1985,Biochem.J.232:883)表明仅有6-8N连接复合寡糖存在,说明潜在位点并未全部用上。例如,肽41C中已确定了衍生的氨基酸序列(图5)的第263残基位上为天冬酰胺(表Ⅰ),表明在该位点不存在糖基化作用。相反,在肽34b上未经确定的氨基酸也许在第395残基上对应于一个糖基化的天冬酰胺。
在5.5kb cDNA上的已确定的唯一的不重复的CR1序列位于COOH末端区域。对于该区域的二级结沟姆治鋈范擞幸桓龅ヒ坏?5个残基的推定的跨膜片段具有很强的疏水性从而具有很高的形成α-螺旋的潜力(图5)。该序列之后紧跟着四个带正电的残基,这是许多膜蛋白的特征。被推测的CR1的细胞质区域包括43个残基,含有一个六个氨基酸的序列,即VHPRTL,该序列与作为在表皮生长因子(EGF)受体及erb B致癌基因产物的蛋白激酶C的磷酸化作用位点的VRKRTL有同源性(参见:Hunter,T.,et al.,1984,Nature 311:480;Davis,R.J.and Czech,M.P.,1985,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82:1974)。扁桃体CR1的细胞质区域中不存在酪氨酸残基。
6.3讨论
通过对重叠cDNA克隆进行的定序,大致已经获得CR1的F异型初级结构的80%。在该分析中发现的最为不同寻常的CR1结构特点为,存在450个氨基酸的正向串联LHRs,预计有四个出现在长约2,000残基的多肽链CR1的F异型(参见:Wong,W.W.,et al.,1983 J.Clin.Invest.72:685;Sim,R.B.,1985,Biochem.J.232:883)。这些LHRs中的三个已被克隆,而其中的第四个存在的依据已由胰蛋白酶肽分析来提供。每个LHR含有七个SCRs,它们是另外的C3/C4连接蛋白的基本结构成分。在每个SCR都有四个保守的半胱氨酸,二硫键,及可能为第1与第3及第2与第4个半胱氨酸之间(参见:Lozier,J.,et al.,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:3640),还有,保守的氨基酸的存在诸如脯氨酸、甘氨酸及天冬酰胺这类常常出现于β-折叠中(参见:Rose,G.D.,et al.,1985,Adv.Protein Chem.37:1)所有这些情况导致这样一个推断,即SCR是借二硫键维持而形成的一个三环结构(图8)。半胱氨酸的这一作用的推测,通过以下的发现得到支持,即经胰蛋白酶温和处理的CR1(参见:Sim,R.B.,1985,Biochem.J.232:883)及H因子(参见:Sim,R.B.and Di Scipio,R.G.,1982,Biochem.J.205:285)当用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)在非还原条件下进行分析时发现它们作为一个完整的分子进行迁移,而当还原之后则转化成多个胰蛋白酶片段。
预计串联的重复的SCRs系列将形成一个延长的结构(图8),与对H因子及人类C4bp的各个亚基的预计一样(参见:Sim,R.B、and Di Scipio,R.G.,1982 Biochem.J.205:285;Whaley,K.and Ruddy,S.,1976 J.Exp.Med.144:1147;Dahlback,B.,et al.,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80:3461)。对于C4bp亚基进行的电子显微镜的研究表明其大小为300×30埃(参见:Dahlback,B.,et al.,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80:3461)。因为每个亚基是由8个SCRs组成的(参见:Chung,L.P.,et al.,1985,Biochem.J.230:133),一个单独的SCR的大小计为38×30埃。假设CR1的各个SCR有相近的大小并且F异型具有30个SCR,受体可以自细胞膜向外伸展至1,140埃这么长的距离。对于CR1结构的预言与早先的发现相一致,即结合于中性白细胞的CR1的铁蛋白标记抗体常常与原生质膜的外层小叶相距500埃(参见:Abrahamson,D.R.and Fearon,D.T.,1983,Lab.Invest.48:162)。CR1的该延伸的结构可以促进载有受体的细胞与共价地结合于相对地不易接近的免疫复合物及微生物细胞外表内的位点的C3b发生作用。
SCR是主要的也许是唯一的CR1的细胞质外的成分,该发现为受体与H因子及C4bp的紧密关系提供了结构方面的依据,这两个原生质蛋白是由大量的SCR或主要由SCR组成的(参见:Chung,L.P.,et al.,1985,Biochem.J.230:133,Kristensen,T.,et al.,1986,J.Immunol.136:3407)。CR1最初是作为具有类H因子的活性红细胞膜蛋白用去垢剂溶解法分离(参见:Fearon,D.T.,1979,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.76:5867),随后发现当其位于原生质膜上时具有H因子及C4bp的调节功能(参见:Lida,K.and Nussenzweig V.,1981,J.Exp.Med.153:1138)。通过对CR1、H因子、及C4bp的结构多态性的遗传分析,示明编码这三种蛋白的基因是相连的(参见:de Cordoba,R.,et al.,1985,J.Exp.Med.161:1189),最近,通过原位(in situ)杂交作用及体细胞杂合体的分析已经示出了该连接组及结构上相关的受体CR2的位置位于1号染色体长臂q32带(参见:Weis,J.H.,et al.,1987,J.Immunol.138:312)在本研究之前,在这些蛋白的结构上的关系的依据仅是这些蛋白质的氨基酸组成有相当高的相似性(参见:Wong,W.W.,et al.,1985,J.Immunol.Methods 82:303)。因而,本发明在CR1中至少有23个SCR的发现为受体与具有类似功能的蛋白,H因子及C4bp之间的结构关系(参见:Chung,L.P.,et al.,1985,Biochem.J.230:133;Kristensen,T.,et al.,1986,J.Immunol.136:3407)、和为受体与分别与C3b和C4b形成酶复合物的成分的B因子及C2的Ba及C2b片段之间的关系提供了直接的正式证据(参见:Morley,B.J.and Campbell,R.D.,1984,EMBO J.3:153;Mole,J.E.,et al.,1984,J.Biol.Chem.259:3407 Bentley,D.R.and Porter,R.R.,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:1212;Gagnon,J.,1984,Philos,Trans.R.Soc.Lond.B Biol.Sci.306:301)。然而,SCR也同样可见于几个非补体蛋白中(参见:Campbell,R.D.,and Bentley,D.R.,1985,Immunol.Rev.87:19;Lozier,J.,et al.,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:3640;Leytus,S.P.,et al.,1986,Biochemistry 25:4855;Kurosky,A.,et al.,1980,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.77:3388;Ichinose,A.,et al.,1986,Biochemistry 25:4633)(图7),这表明它并不一定代表一个C3/C4结合结构。
在那些具有SCR的蛋白中,CR1的独特之处在于,将该种基本结构及遗传单位组织到较高的有序的LHR的结构单位中。对于与S异型表达相关的基因组DNA的14.5kb BamHⅠ片段的分析表明,在CR1中至少有一个重复基因组单位是一个含有编码至少五个SCR的外显子及与其邻侧相接的内含子的延伸了的DNA片段(参见:Wong,W.W.,et al.,1986,J.Exp.Med.164:1531)。这类研究还表明与F等位基因中存在的数目相比,S等位基因含有这类基因组单位的额外拷贝。这一观察连同胰蛋白酶肽图谱的研究(参见:Nickells,M.W.,et al.,1986 Mol.Immunol.23:661)及LHR为40-50KD的肽这一现有的发现,使我们可以预言,相比于估计在F异型(分子量为250,000道尔顿)中有四个LHR,在S异型(290KD)中具有一个附加的LHR。
除了提供重复方面的依据之外,LHR的该序列还表明CR1基因内存在着基因转变。LHR-B与LHR-D在全长范围内有67%的同一性,而LHR-C与LHR-B在NH2末端四个SCR中有99%的同一性,与LHR-D在COOH末端三个SCR中有91%的同一性。在杂合的LHR起源中的这样的安排不可通过相同亲代等位基因之间的一次单一的重组而导致。而杂合的LHR则可通过基因转变而产生(参见:Atchison,M.and Adesnik,M.,1986,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83:2300),即一个LHR-C前体中的序列被存在于LHB-B或LHR-D中的序列取代了三个LHR中同一序列的近乎完全相同的、精细的线性排列(图5)同样维系于一个涉及基因转变的机制。编码该LHRs的CR1基因的那些片段的插入顺序之间的同源性范围的分析,可以确定是基因转变还是基于功能性限制的选择严格地限制了序列差异。
尽管原先的研究表明CR1为单价的(参见:Wilson,J.G.,et al.,1982,N.Engl.J.Med.307:981),而每一个LHR可能代表一个单独的C3b/C4b连续区域,从而使受体成为多价的,并且适应于载有多分子C3b及C4b结合复合物。换言之,各种LHR能够分别地连结C3b及C4b,(见下文,第9章)从而提供了在CR1中的H因子及C4bp活性联合的结构基础。结果,如假设的结构模型(图8)所示,CR1的LHR可以代表使CR1自原生质膜向外延伸的结构区域,正如H因子中所发现的情况,NH2末端区域的SCR结合C3b及C4b(参见:Sim,R.B.and Di Scipio,R.G.,1982,Biochem.J.205:285;Alsenz,J.,et al.,1984,Biochem.J.224:389)。用佛波醇酯激活蛋白质激酶C诱导了嗜中性细胞、单核细胞、嗜酸性细胞(参见:Changelian,P.S.and Fearon,D.T.,1986,J.Exp.Med.163:101)中的CR1的磷酸化作用,在43个氨基酸CR1细胞质区域具有一个与在表皮生长因子受体中被蛋白激酶C磷酸化的位点的同源的序列(参见:Hunger,T.,et al.,1984,Nature 311:480;Davis,R.J.and Czech,M.P.,1985,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82:1974)。然而,发现于扁桃体库中三个独立克隆中的该细胞质序列,最有可能是在蛋白激酶C激活后未被磷酸化的B细胞CR1(参见:Changelian,P.S.and Fearon,D.T.,1986,J.Exp.Med.163:101)。
7.例子:含有第四个长同源重复的CR15′DNA序列
对于CR1的部分cDNA序列的分析揭示一种结构,在该结构中有三个450个氨基酸的LHR,即LHR-B、LHR-C、LHR-D,它们各自含有七个具有C3/C4结合蛋白特征的65个氨基酸的一致短重复(SCR)(参见上文第6章节)。在此所述的例子中,我们将通过对5′cDNA克隆定序来对第四个氨基末端LHR,即LHR=A的克隆核苷酸序列进行描述(参见:Klickstein,L.B.,et al.,1987,Complement 4:180)。对LHR-A的分析揭示,在五个3′SCR中与LHR-B的同源性有99%,而在两个5′SCR中仅有61%的同源性。
7.1材料及方法
7.1.1 cDNA库的组建
一个选择性预备的cDNA库,入HH,构建自DMSO诱导(induce)细胞的3μg poly(A)+RNA的描述如下(有下列改变)(参见:Chirgwin,J.M.et al.,1979,Biochemstry 18:5290;Aviv,H.and Leder,P.,1972,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.69:1408;Ausubel,F.M.,et al.,1987,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,New York)。一个LK35.1,35-mer寡核苷酸,即5′-TGAAGTCATC ACAGGATTTC ACTTCACATG TGGGG-3′用以代替寡(dT)12-18,并且在第二股合成中加入40μCiα32P-dCTP。三分之一的cDNA被克隆进入λgtll,并且如上文的第6.1.2所述自人类扁桃体poly(A)+RNA组建了一个cDNA库。获得了750,000个独立的重组子。
7.1.2克隆、探针的分离及DNA序列分析
用于筛选cDNA库的探针为CR1-1(参见:Wong,W.W.,et al.,1985,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82:7711)(ATCC accession no.57331)、CR-2(Wong,W.W.,et al.,supra)、CR1-4(参见:Wong,W.W.et al.,1986,J.Exp.Med.164:1531)、及CR1-18,及一个来自cDNA克隆λH3.1的相应于图1中核苷酸101-352的0.5kb EcoRⅠ片段的252bp的San3 AⅠ片段。在高度严格的条件下,CR1-18仅与编码LHR=A的NH2末端SCR,或者信号肽的cDNA克隆杂交。在将片段亚克隆λM13mp18及M13mp19之后(参见:Yanisch-Perron,C.et al.,1985,Gene 28:351),通过双脱氧核苷酸技术(参见:Sanger,F.,et al.,1977,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.74:5463)对cDNA克隆插入部分进行定序。
7.2结果
一个特别预备的λgtll cDNA库,即λHH含有7.5×105个重组子,是用DMSO诱导的HL-60细胞的poly(A)+RNA进行cDNA合成而制备的。这些细胞仅仅表达那些预计有四个LHR(参见:Lapata,M.A.,et al.,1984,Nucl.Acids Res.12:5707)的CR1 F异型(参见:Lublin,D.M.,et al.,1986,J.Biol.Chem.261:5736)。引物,LK35.1,为一个反意35-mer,相应于图3所示的CR1部分的cDNA序列的896-930核苷酸部分。这个寡核苷酸显示可与LHR-B、LHR-C及LHR-D在反转录条件下杂交。在用CR1-1及R1-4的混合CR1 cDNA探针进行筛选的未扩增的含有3.8×105个重组噬菌体的平板上确定了250个阳性克隆。38个阴性克隆被挑出并进行噬菌斑提纯。来自这些克隆EcoRⅠ酶切的DNA的Sorthern吸印是用23mer寡核苷酸,KS23.1,即5′-CTGAGCGTAC CCAAAGGGAC AAG-3′),也就是相应于图3的部分CR1 cDNA序列核苷酸763-785来进行筛选。该探针在高度严格的条件下,仅在编码LHR-B的序列上一个位点进行杂交,而不与LHR=C或LHR=D的编码序列杂交。克隆λH7.1(图9)的插入部分含有三个EcoRT片段,而1.0kb、0.9kb及0.4kb,其中两较大的片段与KS23.1杂交,这一点表明该克隆含有编码LHR-A的3′的七分之五及LHR-B的全部的顺序。这一发现证实了,LHR-A是与LHR-B高度同源的。克隆λH3.1(图9)含有一个单独的1.0kb的KS23.1一阳性的EcoRⅠ片段,?一个在高度严格的条件下与CR1-4有弱杂交的5′0.5kb的片段。据认为该克隆含有完成LHR-A额外的5′序列(5′Sequence completing LHR-A),包括SCRs-1、SCRs-2及0.1kb的上游序列。所有与CR1-1杂交的剩余的36个克隆,均未用探针CR1-18,即不与编码LHR-B、-C或-D的序列杂交的来自克隆λH3.1的0.5kb EcoRⅠ片段的252bp的Sau 3AⅠ片段,进行检测。
λH3.1的DNA序列分析揭示了开放读码持续至cDNA的5′末端,这表明该克隆不延续至翻译起始位点。因而,用探针CR1-18来重筛选cDNA库,即λHH及λS2T,并分别找到了一个克隆λH10.3及λT109.1。这些与CR1-18杂交的克隆EcoRⅠ片段和来自克隆λH3.1及λH7.1的插入部分一样被进行定序,该重组序列列于图1中,使得在图1中数码为1531号之后的核苷酸为图3中的核苷酸#1。来自HL-60的cDNA克隆的重叠序列与扁挑体库是相同的。
紧靠LHR-A的上游处的克隆λH10.3及λT109.1含有编码41个氨基酸,包括一个ATG及与其相配的被认为是真核生物翻译起始位点的(图10)NNA/GNNATGG一致顺序(参见:Kozak,M.,1986,Cell 44:283)的相同的推定的疏水前导序列(参见:Von Heijne,G.,1986,Nucl.Acids Res.14:4683)。位于所选的ATG上游六个密码子处,及一个框架内终止密码子下游处,的第二个ATG与该一致序列的匹配很差。CR1该前导序列的头三个氨基酸为MGA,与所报导的CR2一样。这两个克隆的序列偏离该ATG的上游,而来自克隆λ10.3的序列据信代表了一个插入序列的一部分,这已在上文的第6章节中对CR1 cDNA的其它克隆进行叙述。
预计信号肽的酶切(参见:Von Heijne,G.,1986,Nucl.Acids Res.14:4683)将发生于gly-46及gly-47之间,这一点表明,被阻断(blocked)的CR1 NH2-末端(参见:Wong.,W.W.,et al.,1985,J.Immunol.Methods 82:303;Holeis,V.M.,et al.,1986,Complement 3:63)可能是由于吡咯烷酮酰胺存在引起的。含于这些克隆中的NH2-末端LHR-A的头两个SCR与LHR-B的相应区域仅有61%的相同,而LHR-A的SCRs3-7与LHR-B的相应SCRs(图10)有99%的相同。将LHR-A与LHR-C相比较揭示,仅仅是各自的第三及第四个SCRs才有较高的同一性(99%相同)。LHR-A及LHR-D仅有68%整体同一性,在每个LHR的第六个SCR之间的最高同一性为81%。因而,CR15′cDNA序列的完成表明,F异型由2039个氨基酸组成,包括41个氨基酸信号肽、四个各有七个SCRs的LHRs、两个额外的COOH-末端SCRs、一个25残基的转膜区域及一个43个氨基酸的细胞质区域。有25个潜在的N-连接的糖基化位点。
7.3讨论
CR1的F异型的及信号肽的NH2-末端初级结构,已通过对5′cDNA克隆的分离及定序而推断出来。CR1序列的高度重复的特性,使得成为对于制备及确定编码受体该区域的cDNA克隆的方法的发展的关键。以一个已知在反转录条件与LHR-B、-C及-D杂交的35-mer寡核苷酸为引物,制备一个cDNA库。对于该引物也与被预计为与LHR-B具有高度的同源性的LHR-A发生杂交的可能性已经考虑到了(参见:上文第6章节)。合适的cDNA克隆是通过采用另一个在严格条件下仅与LHR-B杂交的寡核苷酸,KS23.1,从而使产生5′cDNA克隆的几率增加的方法来检出的。发现这两个克隆差不多包括了CR1的所有的残余顺序,及一个Sau3AⅠ片段的-CR1-18,其具有足够的独特性以允许用于鉴定其它5′克隆(图9,10)。
一个来自LHR-A5′区域的250bp的探针,CR1-18,在严格的条件下不仅与7.9kb及9.2kb的CR1转录产物杂交,而且与人类扁桃体RNA的2kb的转录产物杂交。这种交叉杂交mRNA未在用来自其它的LHRs的CR1 cDNA探针时发现,也未在来自二甲基亚砜诱导的HL-60细胞及HSB-2T类淋巴母细胞的northern吸印中发现。因而,CR1含有的序列同源于两种附加的B细胞蛋白,其一种是该新确定的mRNR的编码的,以及CR2。
8.例子:人类CR1重组子的表达
如上文所述,人类CR1 cDNA克隆已被分离,其长为7.0kb,包含一个2039氨基酸(图1)的开放读码。假设的受体的前体形式包括一个41个氨基酸的信号肽、四个450个氨基酸的各含七个短一致重复(SCRs)的长同源重复、两个65个氨基酸的COOH末端SCRs、一个25个氨基酸的转膜区域,以及一个43个氨基酸的细胞质区域。因而,该CR1 F异型含有30个SCRs。NH2-末端LHR-LHR-A(见上文的第7章节)在头两个SCR中与LHR-B的相应区域61%的相同性,而在COOH-末端五个SCRs中有99%的相同性。八个CR1 cDNA克隆的限制性片段,拼接而形成一个全长的6.9kb的结构,并且置于小鼠金属硫因启动子的下游或巨大细胞病毒启动子的下游,随后转染入L(小鼠)细胞或者COS(猴)细胞中。重组子细胞表面CR1用间接放射免疫测试法及免疫荧光法来检测。未在仅用亲代载体(CR1)转染的细胞上检测出抗原。用抗-CR1单克隆抗体对转染的、表面用125Ⅰ标记的COS(猴)细胞进行免疫沉淀测试,以及用非还原的、十二烷基磺酸盐(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳加以分析,得出一种与人类红细胞的F异型共迁移的190,000道尔顿的区带,对于正确分子量的重组CR1抗原的表达(参见:Klickstein,L.B.,et al.,1988,FASEB J.2:A1833)为该cDNA含有人类CR1完整的编码序列提供了证据。
8.1对含有完整的CR1编码序列的质粒pBSABCD的组建
我们在此描述作为编码全长(SCRs1-30)的CR1蛋白的载体的质粒pBSABCD的构建。
将来自cDNA克隆λT8.2的2.3kb插入部分(参见:Klickstein,L.B.,et al.,1987,J,Exp.Med,165:105;see Section 6,supra)作为一个EcoRⅠ片段亚克隆至pUC18中,以使5′末端靠近质粒多聚接头中的HindⅢ位点。这质粒称为p188.2。p188.2用ApaⅠ及HindⅢ酶切,较大的4.7kb的含有CR1序列自SCR26经过3′非翻译区加载体序列的片段被胶提纯。
来自cDNA克隆λT50.1(参见:Klickstein,L.B.,et al,1987,J.Exp.Med.165:1095 see Section 6,supra)的插入部分被作为一个EcoRⅠ片段亚克隆进入M13mp18。该噬菌体称为18R50.1。来自该克隆的复制型DNA用HindⅢ及ApaⅠ进行酶切,而其中的含有CR1 SCRs18-25的1.45kb的片段被分离,并连接至来自p188.2的4.7kb的片段上,再将该连接产物转化入大肠杆菌DH5 α中。该质粒称为p8.250.1。
将来自cDNA克隆λT8.3(参见:Wong,W.W.,et al.,1985,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A22:7711)的0.75kb及0.93kb的EcoRⅠ片段亚克隆入质粒pBR327。这些亚克隆分别称为pCR1-1及pCR1-2,分别地含有11-14SCRs及17-21 SCRs。EcoRⅠ插入部分被各自从中提纯出来。用SamⅠ酶切0.75kb pCR1-1片段,随后将其连接到用EcoRⅠ及SmaⅠ切开的pUC18DNA上去。分离出一种具有0.5kb的相应于SCRs12-14的插入部分的亚克隆p181-1.1。用HindⅢ酶切0.93kb pCR1-2的片段,并连接到用EcoRⅠ及HindⅢ切开的pUC19上,并且分离出一种含有0.27kb的包括SCR17的插入部分的亚克隆p191-2.1。
用EcoRⅠ酶切cDNA克隆λT6.1(参见上文第6章节、Klickstein,L.B.,et al.,1987,J.Exp.Med.165:1095;Wong,W,W,et al.,1987,J.Exp.Med.164:1531)并将相应于CR1 SCR15及16的0.37kb的片段亚克隆入pBR322。该克隆称为pCR1-4。用EcoRⅠ及ScaⅠ酶切克隆p181-1.1,并且分离出1.4kb的片段。用EcoRⅠ及ScaⅠ酶切克隆p191-2.1(参见:Klickstein,L.B.,et al.,1987,J.Exp.Med.,165:1095;see Section 6,supra),并分离2.0kb的片段,并连结到来自p181-1.1的1.4kb片段,随后将混合物转化入大肠杆菌DH5α中。获得的质粒称为p1-11-2。质粒p1-11-2用EcoRⅠ进行酶切,通过连接使来自pCR1-4的0.37kb的插入片段插入。将获得的质粒用于转化大肠杆菌DH5α。
选择一个含有0.39kb的BamHⅠ-HindⅢ片段的亚克隆。该质粒称为p142,含有,CR1 SCRs12-17。将来自pG8.250.1的3.5kb的EcoRⅠ-HindⅢ插入片段转移到pGEM3b。该质粒称为pG8.250.1。提纯来自p142的1.2kb HindⅢ片段,并且连接到已用HindⅢ切开的pG8.250.1上。选择一个含有2.4kb的PstⅠ-ApaⅠ插入部分的强寺。婧笱≡裾返姆较颉8弥柿3莆猵CD,含有自SCR12直至3′端的CR1序列。
用PstⅠ切断cDNA克隆入5′7.1(参见:Klickstein,L.B.,et al,Sept.1987,Complement 4:180;see Section 7,supra),随后分离出相应于SCRs6-12的1.35kb的片段,再连接到PstⅠ一酶切的pCD。转化该混合物,随后选择一个含有1.35kb及1.1kb HindⅢ片段的亚克隆。该克隆称为pBCD。
用EcoRⅠ酶切cDNA克隆λ5′3.1(参见:Klickstein,L.B.,et al,1987,Complement 4:180;see Section 7,supra)并将其连接到EcoRⅠ切断的pUC18上。分离出一个含有1.0kb相应于SCRs3-7的插入部分(该插入部分用凝胶提纯)的亚克隆p3.11-1。用EcoRⅠ切断cDNA克隆λ5′10.3(参见:Klickstein,L.B.,et al,1987,Complement 4:180;see Section 7,supra),并将含有SCRs1及2的0.63kb插入部分亚克隆进pUC18。该克隆称为p10.3.5。质粒p10.3.5用EcoRⅠ进行部分酶切,并分离出一个相应于线性质粒的3.4kb的片段,随后,连接到来自p3.11-1的1kb的片段上。在正确的插入位点及方向上含有一个1.3kb的PstⅠ片段的亚克隆pLA被挑出。
用EcoRⅠ酶切cDNA克隆λT109.4(参见:Klickstein,L.B.,et al,1987,Complement 4:180;see Section 7,supra),并亚克隆进pUC18。选择一个含有相应于5′非翻译区直至前导序列及SCRs1及2的0.55kb的EcoRⅠ片段的亚克隆。用PstⅠ及BspMⅡ酶切质粒p109.4,并且分离出一个含有载体、前导序列及SCR1的3.0kb片段。将该片段连接到含有SCRs2-5的来自pLA的0.81kb PstⅠ-BspMⅡ的0.81kb片段上。该新的质粒称为pNLA。该质粒pNLA先用EcoRⅠ部分酶切再用PstⅠ完全酶切,将一个含有自前导序直至SCR5的CR1序列的1.1kb的EcoRⅠ-PstⅠ片段分离出来,并连到pBluescript KS+上(Stratagene,San Diego,CA),以在cDNA的5′侧上放置一个XhoⅠ位点。该质粒称为pXLA。
用EcoRⅠ酶切质粒pBCD,而后用PstⅠ部分酶切,然后分离出一个含有自SCR6直至3′非翻译区的CR1序列的6.0kb的PstⅠ-EcoRⅤ片段,接着将其连接到用PstⅠ及SmaⅠ酶切过的pXLA上。所获的含有完整的CR1 cDNA编码序列的细菌表达质粒称为pBSABCD。
8.2.质粒piABCD,一种含有全部CP1编码顺序的哺乳动物表达载体的结构和鉴定
用XhoⅠ和NotⅠ酶切pBSABCD质粒,以及在业已用这些限制性内切酶酶切的表达载体CDM8(Seed,B.,1987,Nature 329:840-842)的4.4kb片段中的CMV启动子的下游连接插入部分。所得的结构称之piABCD(图11)。另外,在业已用这些限制性内切酶酶切的表达载体pMT.neol中的金属硫因启动子的下游连接6.9Kb XhoⅠ-NotⅠ片段。所得的结构称之pMTABCD(图11)。
通过用C1、C2和125Ⅰ-C3先后处理EAC4b(lim)(Diamedix),随后在37℃下、含有EDTA40mM的明胶凡罗那缓冲盐溶液中孵育60分钟,制备用兔的抗体(EA)及有限量的C4b[EAC4b(lim)]和每个细胞[EAc C4b(lim),3b]12,000cpm的125Ⅰ-C3b致敏的羊红细胞。另外,把经甲胺处理的C3[C3(ma)]和[C3(ma)]共价连接到用3=(2=吡啶基二硫代)丙炔酸N=羟基丁二酰亚胺酯(σ)处理的羊E(红细胞)上(Lambris,J.D.,et al.,1983,J.Immunol.Methods 65:277)。用纯化的C4制备EAC4b(Hammer,C.H.,et al.,1981,J.Biol.Chem.256:3995)。
采用DEAE(二乙胺乙基)-葡聚糖法,把piABCD和pMTABCD转染入COS(猴)细胞中。在经转染的细胞表面上,用抗CR1单克降抗体YZ-1免疫荧光法;和由125Ⅰ标记细胞的免疫沉淀法,随后使用非还原性SDS-pAGE,它显示一种具有与由F异型纯合的供体的人的红细胞免疫沉淀的CR1的相同泳动速度的蛋白质(Wong,W.W.,et al.,1983,J.Clin.Invest.72:685);以及通过用C3b包被的羊红细胞形成玫瑰花结(Fearon,D.T.,1980,J.Exp.Med.152:20)来检测重组子CR1。天然的和重组CR1蛋白质的相同的电泳泳动速度证实CR1 F异型含有SCRs1-30。
此外,采用DEAE-葡聚糖法(Ausubel,F.M.,et al.,1987,Current Protocols in Molecular Biology,Seidman,J.G.and Struhl,K.,eds.,John Wiley & Sons,New York;Seed,B.,1987,Nature 329:840),用双份0.2或4μg piABCD或者pMTABCD和2μg pXGH5,一种指示生长激素表达的信息质粒(Selden,R.F.,et al.,1986,Mol.Cell.Biol.6:3173)共转染鼠类L细胞。两天后收集该细胞且通过YZ1单克隆抗CR1抗体的结合检测CR1的表达。重组体质粒DNA和CR1抗原的表达之间存在一种剂量应答关系(表Ⅱ)。
表Ⅱ
重组体CR1和人类生长激素在
经共同转染的L细胞中的剂量反应
测定板 pXGH5 pMTABCD pTABCD YZ1抗CR1 生长激素
编号 (μg) (μg) (μg) mAB RIA* (ng/ml)
(cpm)
1 2 0 0 1444 120
2 2 0 2 6058 130
3 2 0 2 6531 140
4 2 0 4 10620 180
5 2 0 4 9898 80
6 2 2 0 3111 180
7 2 2 0 2747 160
8 2 4 0 3547 160
9 2 4 0 3337 140
*放射免疫测定(RⅠA):
在0℃,使在含有1%牛血清白蛋白和0.02%叠氮化钠的0.1ml磷酸盐缓冲液中将3×105的转染细胞的重复样品与3μg/ml YZ-1Ⅰg G1抗CR抗体一起孵育60分钟(Changelian,P.S.,et al.,1985,J.Immunol.134:1851)。细胞经洗涤且重新悬浮在含有1-2μci/ml125Ⅰ-F(ab′)山羊抗小鼠Ⅰg G或者Ⅰ-蛋白质A的0.1ml缓冲液中。在0℃下1-2小时之后,洗涤细胞且测定125Ⅰ。
质粒piABCD指导的CR1抗原的表达几乎比pMTABCD的多三倍。除了测定板5之外,培养基中的生长激素浓度的变化小于两倍。补充的实验显示,piABCD在COS细胞中的CR1抗原的瞬间表达较L细胞中多三倍。
当由用YZ1抗CR1 mAB染色的细胞的间接免疫荧光法评定时,CR1抗原在经转染的COS细胞的表面上呈束状(图12)。重组CR1在COS细胞上的这种分布类似野生型CR1在人类白细胞上的分布(Fearon et al.,1981,J.Exp.Med.153:1615)。
重组CR1的分子量通过piABCD转染的COS细胞的表面碘化、细胞裂解物的免疫沉淀用Sepharose-YZ1、SDS-pAGE以及放射自显影术确定。重组CR1的分子量不小于190,000,相等于F异型的分子量而小于红细胞CR1的S异型的分子量(图14)。
通过在经转染的COS细胞和EAC4b或EAC4b(lim),3b之间形成玫瑰花体来测定重组CR1的C3b结合功能和C4b结合功能。在31次单独转染中,用结合五个或五个以上EAC4b或EAC4b(lim),3b的质粒piABCD转染5%-50%的COS细胞(图13)。表达CR1的COS细胞并不同EAC4b(lim),3bi形成玫瑰花结,虽然这种中间体并不与表达CR2的Raji B类淋巴母细胞形成玫瑰花结。
8.3.CR1片段的表达
如下所述,构成编码部分CR1编码顺序的表达载体(缺失突变型体),当转化入COS细胞时能表达它们各自的CR1插入部分。CR1片段被表达为细胞表面蛋白质。
8.3.1缺失突变型piBCD、piABD、piACD、piAD、piBD、piCD和piD的结构
这些缺失突变型的结构这样构成,即利用在4个CR1长同源重复(LHRs)的每一个接近氨基未端的同源位置中存在一个单BsmⅠ位点,以及在CR1 cDNA的其他位置和Bluescript载体中缺少BsmⅠ位点(Stratagene,San Diego,CA)。
用50单位限制性内切酶BsmⅠ,在45分钟部分酶切10微克质粒pBSABCD,并且用琼脂糖胶电泳分离酶切产物。纯化分别对应于缺少一个、二个或三个LHRs的亲本质粒线型片段的8.55kb、7.20kb和5.85kb的DNA片段。把这三种片段中的每一片段自身连接起来,连接产物分别用于转化感受态的E.Coli DH5α使之抗氨苄青霉素。
8.55kb片段是由于pBSABCD在二个邻近的BsmⅠ位点上酶切而产生的,故而在连接之后有三种可能的产物质粒,pBCD、pACD或pABD,其中大写字母代表质粒中保持的LHRs。这些是可通过用SmaⅠ做的限制酶图谱区别的。从12个克隆制备DNA,用SmaⅠ酶切以及用琼脂糖胶电泳分离。5个克隆具有二个SmaⅠ片段,2.5kb和6.1kb对应于LHR-A的密码顺序的缺失,因此代表pBCD。3个克隆具有8.5kb单个线型片段,对应于pACD。4个克隆具有1.2kb和7.4kb两个SmaⅠ片段,预计为LHR-C的偏码顺序的缺失,形成pABD。这三种结构中的每一种的5.6kb插入部分在用XhoⅠ和NotⅠ双酶切之后经凝胶纯化,并且连接到在用相同限制性内切酶酶切之后业已经凝胶纯化的表达载体CDM8上。用连接混合物使E.Coli DK/p3转化且由各自的5个克隆制备DNA。在用SacⅠ酶切的每种情况下都表明,在表达载体中存在缺失的CR1 cDNA插入部分,这显示了4.20kb和5.75kb的两个所希望的片段。这些质粒称之piBCD、piACD和piABD。
pBSABCD的部分酶切产生的7.20kb片段是BsmⅠ在三个邻近的位点上酶切的结果或者相当于大片段在两个位点间有一个未被酶切的位点的位点上酶切的结果,这样,在转化之后可得到两种可能的产物:pAD和pCD。这些可由用XhoⅠ和PstⅠ双酶切来区别,在pAD情况下得到1.0kb和6.2kb两个片段,而对pAD则得到7.2kb线型片段。自这些质粒的每一质粒中来的4.2kb插入部分在用XhoⅠ和NotⅠ双酶切之后经凝胶纯化,再亚克隆入上述的CDM8。由PstⅠ和BglⅡ双酶切表明,在表达载体中有缺失的CR1 cDNA。克隆piAD具有2.4kb和6.2kb两片段,而piCD具有一个8.6kb片段。
自pBSABCD的BsmⅠ酶切中来的5.85kb片段,代表一种完全酶切的产物,而单克隆pD是在对E.Coli DH5 磷蟮玫降摹U饪捎肏indⅢ和BglⅡ双酶切,得到所希望的3.7kb和2.2kb两片段来证实。该克隆的2.9kb插入部分在用XhoⅠ和NotⅠ双酶切之后经凝胶纯化且连接到上述的表达载体上。所得piD克隆的HindⅢ酶切得到了所希望的7.3kb片段,XhoⅠ和BglⅡ双酶切得到2.2kb和5.1kb两片段,SacⅠ酶切产生所希望的1.5kb和5.8kb两片段。
由pBCD的BsmⅠ部分酶切制备质粒pBD。
凝胶纯化相应于在两邻近BsmⅠ位点酶解产生的7.2kb线型片段,经如上所述的自身连接,再转化E.coli DH5 α为抗氨苄青霉素。通过在SmaⅠ酶切时存在1.2kb和6.0kb两片段来识别pBD。4.2kb插入部分在用XhoⅠ和NotⅠ双酶切之后经纯化且转移到上述的CDM8。通过在HindⅢ酶切后看的所希望的0.8kb和7.8kb两片段证实了克隆piBD。
用125Ⅰ对分别瞬时表达piABCD、piBCD、piCD和piD的COS细胞作表面标记,再用抗CR1抗原作免疫沉淀。在还原性SDS-pAGE,piABCD结构的产物与CR1的F异型共同迁移,而缺失突变型表明约为45,000道尔顿逐渐减少,分别表示一个、二个和三个LHRs的缺失(图17)。
8.3.2.缺失型突变体pipl、piE1、piE2、piE-2、piU1、piU-2和piA/D的构建
用BstEⅡ完全酶切质粒piABCD,1.35kb(一种二联体)和8.6kb的两个片段经凝胶纯化、混合以及连接,并且使E.coli DK1/p3转化成抗氨苄青霉素和四环素。通过与CR1 cDNA探针CR1-4杂交筛选菌落(参见上述8.1节),挑选强阴性克隆并且通过用SmaⅠ酶切进一步筛选。piE1由存在2.7kb和7.3kb的两个片段来识别,piE2由10.0kb一个线型片段来识别。piE-2被认为是一种含有一个8.6kb SmaⅠ片段的弱CR1-4阴性克隆。
通过用PstⅠ完全酶切piABCD以及凝胶纯化10.0kb大片段得到质粒pipl。连接该片段且用连接混合物转化E.coli DK1/p3。所得到的质粒pipl含有一个10.0kb SmaⅠ片段。
通过首先用质粒pxLA转化dcm菌株GM271/p3,再分离DNA来制备质粒piU1和piU-2。这种DNA用StuⅠ和NotⅠ双酶切,凝胶纯化3.3kb片段。质粒pBSABCD用NsiⅠ部分酶切,所得的4个碱基对3′悬突通过用E.coli DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段处理来去除。然后,用NotⅠ使DNA完全酶切,凝胶纯化5.4kb和4.0kb片段。把这些片段连接在来自pXLA的3.3kb StuⅠ-NotⅠ片段上,再用连接混合物使E.coli DH5 α转化成抗氨苄青霉素。通过与CR1 cDNA探针CR1-4杂交筛选菌落,然后用HindⅢ限制性酶切进一步验证正克隆,对于pul来说得到0.8kb、1.3kb和6.5kb三个片段,对于pu-2得到0.8kb和6.5kb二个片段。通过这些质粒的DNA定序证实StuⅠ纯化的NsiⅠ剪接是处于构架内。在XhoⅠ和NotⅠ双酶切之后,凝胶纯化分别为5.6kb和4.2kb的pul和pu-2的插入部分,再连接在如上所述的表达载体CDM8上。经用XhoⅠ+PstⅠ限制性酶切证实了克隆piul和piu-2的结构,对于piul,得到1.2kb和8.8kb两个希望的片段,对于piu-2,得到8.7kb一线型片段。
通过首先用PstⅠ完全酶切piABCD来制备质粒piA/D。然后,用ApaⅠ部分地酶切PstⅠ酶切产物,再用E.coli DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段去除了悬突。随后,用琼脂糖凝胶电泳使DNA分开,分离7.5kb片段,连接以及用于使E.coli DK1/p3转化成抗氨苄青霉素和四环素。用KpnⅠ+SacⅠ双酶切证实了该结构,得到0.8kb、1.5kb、1.7kb和3.3kb四个希望的片段。
9.实例:C3b和C4b结合区域的鉴定
9.1.测定和结果
将含有由它们名称的大写字母表示的LHR(S)的质粒piABCD、piAD、piCD和piD转化入COS细胞,在测定中,它们用于评定它们的编码的CR1片段结合C3b或C4b的能力。结合测定这样完成,即观测由通过在其细胞表面上表达一个全长CR1分子或者一个CR1缺失突变型(瞬间表达)的COS细胞结合C3b或C4b包被的红细胞而引起的红细胞玫瑰花结。在20℃下,用在0.02ml中有2-6×108/ml的载有C3或C4的红细胞与1-4×106/ml的转染细胞一起孵育60分钟。用显微镜评定形成玫瑰花结的转染细胞的百分数,将一个至少附着有五个红细胞的转染细胞计为一个玫瑰花结。其结果示于表Ⅲ。
表Ⅲ
表达CR1的重组形式的COS细胞转染子和载有
C(ma)或C4(ma)的羊红细胞之间玫瑰花结的形成
形成玫瑰花结的转染子%
具有抗CR1的荧光转染子%
COS细胞
转染子 EC3(ma)*EC4(ma)#
piABCD 109(3)π62(2)
piAD 8(3) 107(2)
piBD 107(3) 12(2)
piCD 127(3) 32(2)
piD 0(3) 0(2)
piA/D 11(2) 83(2)
piE-2 1(1) 102(1)
*每个红细胞中的C3(ma)数目,在采用这种中间体的三次试验中分别为60,000、350,000和900,000。
#每个红细胞中的C4(ma)数目,在采用这种中间体的二次试验中分别为160,000和140,000。
π试验次数。
在三次单独试验的每一次中,根据由用YZ1单克隆抗CR1抗体或者兔抗CR1抗血清免疫荧光评定(表Ⅲ),与EC3(ma)形成玫瑰花结的表达全长piABCD结构的COS细胞的比例与具有可检测的重组受体的百分率相似。反之,表达piD的细胞不形成玫瑰花结,这表明C3结合位点必须存在于或者要求有LHR-A、-B或-C。通过论证表达piBD或piCD结构的细胞与EC3(ma)形成玫瑰花结,说明一个位点同时存在于LHR-B和LHR-C中。表达piAD、piA/D或piE-2的细胞并不具有相等的C3结合功能。由于piE-2结构与piCD不同仅在具有LHR-A的SCR-1和-2而不是LHR-C的开头二个SCRs,故LHR-C中C3结合位点的功能必须要求这些NH2末端的SCRS。
与EC4(ma)形成玫瑰花结的表达全长piABCD重组子的COS细胞的比例小于与EC3(ma)呈玫瑰花结的百分率,也许这反映了每个红细胞中C4(ma)较少(表Ⅲ)或者每个受体中C4结合位点较少。具有全部或部分LHR-A的缺失突变型piAD、piA/D和piE-2结构与EC4(ma)的结合优于缺失突变型piBD和piCD;piD缺少这种功能。因此,CR1的C4结合位点主要存在于LHR-A中,虽然第二个位点可以存在于LHR-B和-C中。要使piE-2结构相对于piCD提高呈玫瑰花结能力,则建议把LHR-A的SCR-1和-2包含在C4结合位点中。
YZ1单克隆抗CR1抗体的结合的放射性免疫测定指出由表达piABCD、piAD、piBD和piCD结构的COS细胞摄取是有意义的(表Ⅳ)。用由LHR-A的五个NH2末端SCRs和LHR-D的三个COOH末端SCRs组成的piD或piA/D转染的细胞并不与YZ1抗CR1抗体结合,虽然这些结构的产物结合多克隆抗CR1抗血清(表Ⅳ)。因此,YZ1表位在LHR-A、-B和-C中重复,并不存在于LHR-A的NH2末端SCRs中,也不存在于或者不可到达LHR-D。
表Ⅳ
把单克隆和多克隆抗CR1抗体结合到表达
CR1重组形式的COS细胞转染子上
COS细胞 结合的YZ1 结合的兔的
转染子 单克隆抗体* 多克隆抗体*
piABCD 2362 12277
piAD 2879 19891
piBD 3646 21922
piCD 2189 19926
piA/D 410 23052
piD 404 16386
CDM8 428 4886
*在0℃下,用3μg/ml YZ1 Ig G1抗CR1 mAb(Changelian,P.S.,et al.,1985,J.Immunol.134:1851)或者用90μg/ml兔的Ig G抗CR1抗体与3×105转染细胞的重复样品在含有1%牛血清白蛋白和0.02%叠氮化钠的0.1ml磷酸盐缓冲液中孵育60分钟。细胞经洗涤且重新悬浮在含有1-2μci/ml125Ⅰ-F(ab′)山羊抗小鼠Ig G或者125Ⅰ-蛋白质A的0.1ml缓冲液中。在0℃下1-2小时之后,洗涤细胞且测定125Ⅰ。所示的数值为二次测定的平均值,每3×105COS细胞中的cpm。
9.2.讨论
在每个LHR中第一个SCR的编码顺序中间找到的保守的BsmⅠ位点使得精密地相应于LHRs的界面的一系列缺失突变型的构建有可能,这与突变型保持开放性读码和推测的二硫化键形成所必需的四个半胱氨酸的合适的位置(图16)。这些缺失突变型的C3(ma)和C4(ma)结合功能的比较不仅识别了具有这些特异的LHRs,而且识别了那些对确定配位体特异性致关重要的SCRs。故而,受体的piAD、piA/D和piE-2形式(但不是piD形式)在调节转染COS细胞和EC4(ma)之间的玫瑰花结形成方面的能力表明,LHR-A的NH2末端的二个SCRs包含一个用于与这种补体蛋白质相互作用的位点(表Ⅲ)。这个位点对C4(ma)仅相对专一,因为表达piAD和piA/D的转染子还能够结合EC3(ma)(表Ⅲ)。由玫瑰花结测定和因子Ⅰ-辅因子对C3(ma)的酶解作用证明的由piBD和piCD结构编码的受体的C3(ma)结合功能(表Ⅲ;图18)指出在这些LHRs的开头二个SCRs中存在着对C3(ma)的专一性位点。这些位点也能够与C4(ma)相互作用(表Ⅲ)。因此,在LHR-A、-B和-C中具有优先的但是重叠的C4和C3结合活性。
另外,表达piBD和piCD结构的COS细胞结合EC4(ma)的能力业已可由经过BsmⅠ片段的连接,使编码NH2末端36氨基酸的核苷酸从LHR-A的SCR-1转得到LHR-B和-C来形成。然而,这些36氨基酸单独并不提供piD产物与C4形成玫瑰花结功能。我们不可能排除LHR-D在这些反应中的辅助作用,因为这种LHR存在于所有测定功能的结构中。在CR1中发现三个性质不同的配位体识别位点,对C3b为二个和对C4b为一个(图19),这表明,每个受体分子能够有效地结合带有多介C4b和C3b分子的复合体,尽管它们对单价配位体具有较低的亲和性(Arnaout,M.A.,et al.,1983,Immunology 48:229)。这种发现还为可溶性C4b不能阻止在带有C3b的红细胞和人类B类淋巴母细胞株系之间形成玫瑰花结提供一种解释(Gaither,T.A.,et al.,1983,J.Immunol.131:899)。CR1特别适合的可能的配位体可能是分子复合体:C4b/C3b和C3b/C3b,它们分别在典型的和选择的途径的激活过程中产生。因为四个LHRs中的三个中有不同的结合位点,所以其LHRs数目不同的CR1结构异型可能具有由配位体结合位点的数目变化而引起的重要的功能差异。虽然,在体外研究中尚未报导过F、S和F′(分别为A、B和C)异型的不同结合活性,但是推测仅有三个LHRs的较小的F′异型可具有一种削弱的清除免疫复合体的能力。据报道,F′异型可能与全身性红斑狼疮有关(Van Dyne,S.,et al.,1987,Clin.Exp.Immunol.68:570)。
10.实例:因子Ⅰ-辅因子活性的证明
有人证明,在细胞表面和可溶形式中的重组CR1蛋白质及其特定的片段具有C3b因子Ⅰ-辅因子活性。
用改进的一种公开发表的方法进行因子Ⅰ-辅因子活性的测定(Fearon,D.T.,1979,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.76:5867)。
为了可溶CR1和片段的因子Ⅰ-辅因子活性的测定,用Noniclet p-40使细胞表面CR1蛋白质和片段溶解,再用联接在琼脂糖珠上的抗CR1单克隆抗体YZ-1免疫沉淀溶菌液。接着用Sepharose UPC10抗果聚糖和Sepharose-YZ-1免疫沉淀1×106转染的COS细胞的去垢剂处理的溶菌液。然后,通过用0.5μg125Ⅰ-C3(ma)和200ng因子Ⅰ,在37℃下与洗涤过的珠在0.05ml PBS,0.5%NP-40中孵育60分钟,测定免疫沉淀物的因子Ⅰ-辅因子活性。孵育之后,用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影术分析含有放射性标记的C3(ma)的上清液。放射自显影照片上的,由因子Ⅰ蛋白分解功能产生的C3(ma)的α链的低分子量形式的出现指示了因子Ⅰ-辅因子的活性。
为了测定细胞表面CR1和片段因子Ⅰ-辅因子活性,用0.5μg125Ⅰ-C3(ma)和0.2μg因子Ⅰ孵育带有CR1表达载体(如上所述的piABCD、piAD、piBD、piCD或piD)的转染COS细胞(Fearon,D.T.,1977,J.Immunol.119:1248)且按上述分析。
细胞表面重组CR1的因子Ⅰ-辅因子活性示于图15。因子Ⅰ仅仅在有免疫制动的重组CR1或者因子H的情况下才使C3(ma)的α链分解成分子量为76,000和46,000的片段(图15)。自凝胶中切去相应于放射自显影照片上的带的区域,测定125Ⅰ,确定分解的α链的数量。在因子H存在下,91%的α链被分解,而在重组的CR1的数量逐渐增加的情况下,则分解分别为26%、41%和55%。虽然,COS细胞用仅仅含有一些内源的因子Ⅰ-辅因子活性的CDM8载体转染,但是用piABCD、piBD和piCD转染COS细胞,这种功能会增大(图18)。在用piAD或piD转染COS细胞的情况下,未见125Ⅰ-C3(ma)的分解增大。因此,在这些结构中,只有把结合C3的能力给予COS细胞的缺失突变型piBD和CD也具有分解C3的因子Ⅰ辅因子活性。
用CR1的细胞表面和溶解形式及其片段测定因子-辅因子活性的结果示于表Ⅴ。
表Ⅴ
CR1细胞表面和溶解形式及CR1片段
的因子Ⅰ-辅因子活性
因子Ⅰ=辅因子活性b
质粒 细胞表面 溶解的
piABCD + +
piAD - -
piBD + ND
piCD + +
piD - ND
a 编码测定的CR1蛋白质或片段,为表达转染入COS细胞。
b (+)表示辅因子活性在只用CDM8载体转染时所观测的内源水平以上的增量。
c 未测定
d 未测定,由于缺少用抗CR1单克隆的抗体YZ1识别的表位LHR-D。
如表Ⅴ所示,piABCD(编码-全长CR1蛋白质)、piBD(编码LHR-B和-D)或者piCD(编码LHR-C和-D)和表达形成一种具有C3b因子Ⅰ-辅因子活性的产物。这样,表Ⅴ的数据提供了CR1蛋白质或其一个片段可以促使补体失活的证据。
11.可溶性CR1重组体的表达
用重组DNA方法修饰CR1 cDNA,以便形成CR1或CR1或CR1片段的可溶性形式(SCR1)。在从细胞中分泌表达蛋白质的哺乳动物低持斜泶颯CR1结构。形成的大量可溶性的多肽,它与CR1蛋白质的膜结合形式不同,为了获得溶液中的多肽不必被溶解。
11.1物质和方法
11.1.1.酶内切
根据制备者的建议(New England Biolabs,Inc,Beverley,MA),进行所有的限制性内切酶酶切联结子连接以及T4 DNA连接酶和E.Coli DNA聚合酶反应。用Morrison,D.A.,1979.Meth,Enzymol 68:326-331中的方法,把E.Coli DH1或DH5 α做成感受态细胞。按照Maniatis,T,.et al.,1982.Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York,用DNA转化感受态细菌细胞。用碱性溶菌或者用沸腾法(上述的Maniatis,T.,et,al)以纯化质粒。
11.1.2.DNA片段分离
如下所示,用琼脂糖凝胶(BioRad,Richmond,CA)纯化DNA片段。用刀片从该凝胶中切除合适的DNA带,并且把琼脂糖切片置于被切成极小切片的一片类膜(parafilm)上,再转移到一片新片的类膜上。捣碎琼脂糖片,把琼脂糖转移到1.5ml试管中。加入等体积苯酚(超纯级,BRL,Gaithersburg,MD),使混合物涡旋,然后在-70℃下冷冻10分钟,再离心10分钟。用苯酚/氯仿(1∶1)分两次提取琼脂糖相,并用氯仿提取两次。尔后,以乙醇沉淀DNA,洗涤片状沉淀物,经真空干燥,并且重新悬浮在10mM盐酸三羟甲基氨基甲烷缓冲液(Tris-Hcl),pH7.0,1mM EDTA中。
如下所述,由低胶凝温度的琼指糖中分离DNA片段(FMC,Corp.,Rockland,ME)。将置于1.5ml试管中的琼脂糖凝胶中切出来的合适的DNA带,在65℃下熔融15分钟。用含有0.1%十二烷基硫酸钠(SDS,超纯级,BRL,Garthersburg,MD)的苯酚提取液化凝胶。再用苯酚-SOS提取一次水相,用氯仿提取两次。然后,在2.0M乙酸铵中乙醇沉淀DNA,经干燥以及重新悬浮在水中。
11.1.3.转染入哺乳动物的细胞中
通过CaPO4沉淀和Graham和Vander Eb的甘油电震方法(1973,Virology 52:456-467),把DNAs转染入哺乳动物细胞中。在用DNA磷酸钙制剂培养4-6小时之后,通过以吸气法去除生长培养基和1分钟内加入5ml20%甘油DMEM培养基,使DUX BllCHO细胞经甘油电震。然后,在完全的αMEM中洗涤两次且在该培养基中培养48小时。
11.1.4.CHO 转染细胞培养
由10%经透析的胎牛血清(Gibco)和4mM L-谷氨酰胺补充没有核苷的情况下,使DUX Bll CHO细胞转染体在由αMEM培养(Gibco)组成的DHFR(二氢叶酸还原酶)选择性培养基中生长。通过提高氨甲蝶呤(λ,#A-6770,Amethopterin)的浓度使细胞生长进行扩增(Kaufman,R.J.et al.,1985,Molec.Cell Biol.5:1750-1759)。
11.1.5.可溶的CR1浓度水平测定的酶连接免疫吸附剂试验(ELISA)
11.1.5.CR1标准
把无血红蛋白的红细胞(RBC)血影细胞去污溶菌液用作ELISA(enzyme-liked immunosorbent assay)中的CR1标准。血影细胞按上所述制备(Wong,W.W,and Fearon D.T.1987.Meth,Enzymol 150:579-585)。简言之,由红十学会获得的死亡后的全血。红细胞用PBS洗涤三次,然后溶解在6份体积的低渗的溶菌缓冲液(10mM Tris pH8、0.1mM PMSF(苯基甲基磺酰氟)、0.1mM TPCK(甲苯基亚磺酰氨基氯甲基酮)、aprotonin,2mM EDTA)中。血影细胞用溶菌缓冲液洗涤12次,用白细胞计数器计数、等分以及在-70℃下冷冻到使用。对于CR1 ELISA来说,在溶解的缓冲液(10mM Tris pH8、50mM KCl.0.2%NPAO、0.3% DOC、6.2mM PMSF、0.2mM碘乙酰胺.aprotonin、0.1mM TPCK、2mMEDTA、0.3%NaN3)中把血影细胞稀释到1.6×108血影细胞/ml,接着稀释到2.5×106血影细胞/ml,用作ELISA的标准。标绘出490nm下的一些吸收度的曲线,任何未知的样品参照该曲线可得到相当血影细胞/ml。
11.1.5.2. CR1 ELISA
用PBS中0.4μg/ml浓度的抗CR1单克隆抗体(克隆J3 D3、AMAC IOT17)(Cook,J.,et al.,1985,Molec.Immunol.22:531-538)的100μl/井孔包被Immulon-Ⅱ试验板且在4℃培养过夜。然后抛弃抗体溶液,再通过添加封阻缓冲液(pBS中有1.0%BSA),以300μl/井孔封阻试验板,在37℃下培养2小时。封阻之后。立即使用试验板或者在4℃贮存到使用。
用含有0.05%Tween-20的pBS洗涤试验板三次。以100μl/井孔添加样品且在37℃下培养2小时(平行两作份)如需要,用溶解缓冲液稀释样品。在每块试验板上包含标准的RBC血影细胞。在样品培养之后,试验板洗涤三次以及以50%FCS,50%封阻缓冲液把辣根过氧化物酶(HRP:horseradish peroxidase)的接合物(wilson,M.B.and Nakane,P.K.,1978,Immunofluorescence and Related Staining Techniques,North Holland Biomedical press,pp.215-224)和单克隆抗体YZ1 Changelian,p.s.,et al.,1985,J,Immunol.184:1851-1858)稀释成1∶8000且以100μl/井孔添加。在37℃下培养2小时之后,再用含有0.05%Tween-20的pBS洗涤试验板三次。以基质缓冲液(0.36%柠檬酸H2O,1.74%Na2HPO4·7H2O,0.1%乙基汞硫代水杨酸钠,0.4%H2O pH6.3)中0.2%浓度基质邻苯二胺(OPD)添加至基质缓冲液中达100μl/井孔。在室温下20分钟后用2NH2SO4的50μl/井孔停止反应。记录490nm下的一些吸收度。
11.2.CR1编码顺序的基因修饰
CR1 cDNA由大约6,951核苷酸碱基对组成(如上图1,6,7节)。本身cDNA的转译终止信号是置于碱基对6145上。蛋白质是一种由暴露在细胞膜外表面上的四个长的同源重复单元(LHRs)组成的膜结合受体分子加上一种约为25氨基酸的膜间隔的结构区,紧接为一延伸到细胞质中的羧基末端区。这种红胞质结构区由4氨基酸组成。我们用于形成可溶的CR1分子(SCR1)的策略在于去除把一蛋白质固定在细胞膜中的转移膜区,然后把切断的结构表达为分泌出来的多肽。
11.2.1.pBSCR1 C的结构
质粒pBSABCD(上述实例8)含有核苷酸1-6860中的CR1 cDNA,在核苷酸6860上缺少未转译的顺序3′到EcoRⅤ位点。CR1 cDNA在碱基对5914上具有唯一的BalⅠ限制性的核酸内切酶识别位点,29碱基对远离起始的转移膜结构膜区。首先用BalⅠ酶切pBSABCD,以形成一个具有平端的线型分子,然后用T4DNA连接酶把它连接到由两股具有以下顺序的38核苷酸互补线组成的合成的寡核苷酸上:
5′:CCAAATGTACCTCTCGTGCACATGATGCTtaaCTCGAG
3′:GGTTTACATGGAGAGCACGTGTACTACGAATTGAGCTC
所得的分子具有一个恢复BalⅠ位点和一直止再现本身CR1顺序且包含在起始的膜转移结构区上的丙氨酸残基的交替顺序。此外,在丙氨酸之后立即引入一转译终止信号(在以下情况和以上着重指出的),紧接为一个XhoⅠ限制位点,以帮助改变的cDNA的亚克隆。
这个质粒(称之pBSCR1 C)的XhoⅠ酶切通过在cDNA中的加有寡核苷酸的XhoⅠ位点切割和在CR1 cDNA的5′末端上pBSKS+多克隆部位中的XhoⅠ位点上的切断去除cDNA插入部分(称之SCR1 C)。pBSCR1 C含有C末端顺序:
碱基No.5911:CTGGCCAAATGTACCTCTCGTGCACATGATGCTTAACTCGAG
氨基酸:L A K C T S R A H D A END XhoⅠ
site
11.2.2.pBSCR1 S的结构
如下所示,形成缺少膜转移区的第二SCR1结构。用在CR1cDNA中核苷酸碱基对5485上的唯一SacⅠ和宿主质粒的多克隆部位中的SacⅠ位点上切下的SacⅠ酶切pBSABCD,再置于CR1 cDNA的3′末端上。这种酶切导致切除cDNA的3′末端中的DNA顺序的1375核苷酸。然后电泳去除这种片段。用T4DNA聚合酶填平含有保留的SCR1 cDNA的所得质粒的暴露末端,再进行补平末端连接。该连接中还包括药学万能转译终止区(catalog#27-4890-01),pharmacia,Inc.,piscataway,NJ),-在三个全部读码中含有转译终止信号的自补寡聚体。连接时,插入的寡聚体为SCR1 cDNA提供了一个新的转译终止信号。
11.2.3.pBM-CR1 C的结构
pBMT3 T是一种真核表达载体(Krystal,M.,et al.,1986,Proc.Natl.Acad,Sci,USA 83:2709-2713),它含有人类金属硫因-1A基因,它使细胞具有抵抗诸如镉的重金属含量增加的能力。该载体还含有小鼠金属硫因-1基因,它含有一个上述的Mt-1蛋白质的起始密码子的构建的XhoⅠ位点。XhoⅠ位点用作在控制小鼠Mt-1启动子下表达基因的插入部位。
用XhoⅠ从pBSCR1 C中切除SCR1 C插入部分(约为5.9kb),然后连接载体pBMT3 X的唯一XhoⅠ位点上。由限制性酶切确定pBMT3 X中SCR1插入部分的正确定向(Maniatis,T.,et al.,1982.Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York)。所得质粒称之pBM-CR1 C。
11.2.4.缺失型突变体pT-CR1 C1、pT-CR1 C2、pT-CR1 C3、pT-CR1 C4和pT-CR1 C5结构
由SCR1 cDNA的具体缺失部分还可构建各种不同的缺失型突变体(图20)。每种缺失型突变体均缺少全长度cDNA的转移膜区,以致于突变体的表达应产生可溶的多肽。
11.2.4.1.pT-eRC
用SmaⅠ酶切pBSCR1 C,获得大小分别为2.5kb和7.3kb的两个片段。它们用琼脂糖凝胶电泳分离,再纯化7.3kb片段,然后自身连接。把E.coli DH52细胞做成感受态(Morrison,D,A.,1979.Meth.Enzymol,68:326-331),然后用连接混合物转化。所得质粒称之pBL-CR1 C1。这种结构去除了CR1 C插入部分的38%LHR-B、100%LHR-C和51%LHR-D。此外,在连接处2335/4894bp上重新形成SmaⅠ位点,保持了正确的译码。用XhoⅠ酶切pT-CR1 C1,把CR1插入部分与pBlueseript载体分开。然后,将分离的CR1片段插入到表达载体pTC Sgpt的唯一XhoⅠ位点中,形成质粒pT-CR1 C1。
11.2.4.2.pT-CR1 C2
用C1aⅠ和BalⅠ酶切pBSCR1 C,得到大小为3.96ub和5.9kb的两个片段这两个片段用琼脂糖凝胶纯化。用ClaⅠ和BalⅠ酶切质粒pBR322,纯化2.9kbp BR322片段且连接到pBSCR1 C中的5.9kb片段上。用连接混合物转化E.coli DH5α细胞,所得的质粒称之pBR8.8。用XbaⅠ酶切该质粒,形成大小?.45kb和1.35kb的两个片段。由琼脂糖凝胶纯化7.45kb片段,然再自身连接。所得的质粒pBR7.45用ClaⅠ和BalⅠ酶切,把含有SCR1 cDNA的分离的4.5kb片段连接到pBSCR1 C中的3.96kb片段上,得到质粒pBL-CR1 C2。这种结构去除了SCR1插入部中90%LHR-B,在连接处1637/2987bp重新形成XbaⅠ位点,且保持了正确的读码。用XhoⅠ酶切pBL-CR1 C2,使SCR1插入部分与pBluescript载体分开。然后,将分开的SCR1片段插入到表达载体pTC Sgpt的唯一XhoⅠ位点中,形成质粒pT-CR1C2。
11.2.4.3.pT-CR1 C3
用NsiⅠ酶切pBSCR1 C,得到大小为1.09kb、1,35kb和7.46kb的三个片段。由琼脂糖凝胶纯化7.46kb片段,再自身重连接,由此形成质粒pT-CR1 C3。这种结构去除了77%LHR-A和剩余的CR1插入部分。在连接处463/2907bp重新形成NsiⅠ位点。修饰译码,以致于在重新形成的NsiⅠ位点之后立即引入无义密码子。用XhoⅠ酶切pBL-CR1 C3,使SCR1插入部分与pBluescript载体分开。然后,将分开的SCR1片段插入到表达载体pTC Sgpt的唯一XhoⅠ位点中,形成质粒pT-CR1 C3。
11.2.4.4.pT-CR1 C4
用PstⅠ酶切pBSCR1 C。在把CR1 cDNA连接到该载体上过程中,去除了pBluescript 的多联结子区中的PstⅠ位点(上述的实例8.1)。用凝胶电泳分离大小为1.35kb和8.5kb的所得的片段,纯化8.5kb片段,再自身连接,形成质粒pT-CR1 C4。这种结构去除了SCR1插入部分的31%LHR-A和69%LHR-B。在连接处1074/2424bp重新形成PstⅠ位点,由此保持正确的读码。用XhoⅠ酶切pT-CR1 C4,使SCR1插入部分与pBlueseript载体分开。然后,把分开的SCR1片段插入到表达载体pTC Sgpt的唯一XhoⅠ位点中,形成质粒pT-CR1 C4。
11.2.4.5.pT-CR1 C5
用SmaⅠ酶切pBL-CR1 C1,由此使唯一SmaⅠ位点上质粒线性化。使该质粒去磷酸化,再连接到含有一无义密码子的经磷酸化的NheⅠ联结子上(New Eguland Biolabs,Beverley,MA。)这类联结子含有一个在三个所有的可能读码中的转译终止密码子,并且还包含一NheⅠ限制位点,这便确认SCR1 cDNA中存在无义联结子。所得的质粒称之pBL-CR1 C5,它保留了SCR1 cDNA的LHR-A和62%LHR-B。用XhoⅠ酶切pBL-CR1 C5,使SCR1插入部分与pBluescript 载体分开。然后,把分离出来的SCR1片段插入到达达载体pTC Sgpt的唯一XhoⅠ位点中,形成质粒pT-CR1 C5。
11.3.可溶性CR1的表达
如本文所述,可以从细胞中以高产量分泌的CR1的可溶形式的表达(ⅰ)不限于在用于缺失或切断的CR1 cDNA中一个精确的位点,(ⅱ)也不限于应用一种特殊的表达载体(参见上述)。以两个不同的表达系统来说明形成分泌SCR1的能力。
11.3.1.表达载体的PTCS系列的结构
所用的PTCS系列表达载体由三个每个均具有一插入cDNA的唯一XhoⅠ克隆位点的质粒组成(图21)。由一组串联启动子驱动插入的cDNA转录。位于腺病毒上游的SV40前启动子为主要二个后启动子(AD2 MLP)。腺病毒三部分之间引物处于cDNA开头和AD2 MLP之间。经转录的mRNAs以由位于XhoⅠ cDNA克隆位点下游的鼠类免疫球蛋白卡巴(Igk)顺序提供的多腺苷酰化作用信号终止。通过插入psv2gpt、psv2dhfr或psv2neo中的相应的标记,分别提供了可选择的标记黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(gpt)、二氢叶酸还原酶(dhfr)或者新霉素抗性(neor)。这些质粒还是复制和对抗氨苄青霉素的β-内酰胺酶基因的细菌起源的来源。一般来说,对重组体的选择优先采用选择这些应用取决于可选择标记或组合标记的载体。
人们已经知道腺病毒2(Ad2)、SV40、psv2cat(Gorman,c,1985,DNA Cloning,VolumeⅡ,A Practical Approach,ed,D.M.Glover,IRL Press,pp.143=190)以及鼠类免疫球蛋白卡巴的全部DNA顺序。这些顺序在基因库(Gen Bank )数据库和National Biomedical Research注解和参数文献中。这些任何顺序还应用作pTCS载体的合适部分的来源。
如下所示,由中间体质粒pEAXgpt和pMLEgpt构建载体pTC Sgpt、pTCSneo和pT Sdhfr。
11.3.1.1.pEAXgpt的构建
步骤1从M13mp9/MLP中得到Ad2LLP DNA片段(Concino,M.F.,et al.,1983,J.Biol.Chem.258:8493-8496)。这个质粒含有腺病毒2的核苷酸5778(XhoⅠ位点)到6231(HindⅢ位点)的顺序,其中包括核苷酸6069上的PvuⅡ限制位点和核苷酸5791上的SacⅡ位点(参见NBRL核酸数据库,入藏号#Gdad2)。把XhoⅠ到HindⅢ片段克隆到M13mpq的HindⅢ和SalⅠ位点中,形成质粒M13mpq/MLP。
用EcoRⅠ和HindⅢ酶切质粒M13mpq/MLP,分派出含有片段的较小MLP。再用EcoRⅠ和HindⅢ酶切PUC质粒(Pharmacia,Inc.,Piscataway,NJ),然后,把该质粒中较大的片段连接到EcoRⅠ到HindⅢMLP片段上。结果形成一个具有PUC的质粒骨架上的含MLP的新质粒。用SamⅠ酶切该质粒,连接到SalⅠ联结子上,再封闭。然后,用使质粒在位于腺病毒2插入顺序中#6069位上的PVUⅡ位点裂开的PVUⅡ酶切这个新质粒。把所得的线型片段连接到XhoⅠ联结子上,再封闭。尔后,用XhoⅠ和SalⅠ酶切该质粒,分离出含有MLP DNA的较小的片段(片段#1)。
步骤2 用PVUⅡ酶切质粒PSV2gpt(American Type Culture Collection(ATCC)保藏号37145),连接到SalⅠ联结子上,再用SalⅠ酶切。最终产物为线型PSV 2gpt片段(片段#2)。它可作为gpt基因的来源。
步骤3 用HaeⅢ和AvaⅡ酶切鼠类免疫球蛋白Igk片段(Hieter,P.A.,et al;1980.Cell 22:197-207),分开含有多腺苷酰化作用顺序的片段。在可由NBRF核酸数据库(入藏号#Kcms)中得到的鼠类Ig卡巴顺序中,Ig终止密码子在1296位上,紧接的是1306上的AvaⅡ位点、1484上的AATAAA多腺苷酰化作用位点以及1714上的HacⅢ位点。用E,coli DNA聚合酶填充该片段的突出末端,然后把片段连接到XhoⅠ联结子上,再用XhoⅠ酶切。这个片段(片段#3)用作多腺苷酰化作用位点的源。
步骤4 片段1、2和3与TDNA连接酶一起连接,形成一环状质粒。由限制性内切酶分析证实该质粒中的片段的定向正确。XhoⅠcDNA克隆位点的下游是鼠类卡巴多腺苷酰化作用位点,该位点的更下游是SV40启动子和gpt基因。XhoⅠ位点的上游是MLP启动子,该启动子的更上游是复制和氨苄青霉素基因的细菌起源。然后,用SalⅠ酶切该质粒,用E.coli DNA聚合酶填充突出末端。使所得的补平末端片段连接到EcoRⅠ联结子上,用TDNA连接酶再封闭。这个最终质粒称之PEAXgpt。
11.3.1.2.PMLEgpt的构建
步骤1 质粒PMLPCAT(Lee,R.F.,et al.,1988.Virology,165:51-56)是一个具有PML载体骨架的表达质粒且含有腺病毒2MLP和三部分引物顺序5′到CAT基因。用XhoⅠ和SacⅡ酶切PMLP CAT;XhoⅠ在CAT基因和三部分引物的L3区之间的一位点上切断,SacⅡ在腺病毒DNA中除MLP的5′之外的#5791位上切断。由此把AD2MLP和三部分引物置于这小的XhoⅠ到SacⅡ片段上(片段Y3)。
步骤2 用XhoⅠ和SacⅡ酶切质粒PEAXgpt,除去含有片段的较小MLP。分离较大的片段(片段5#)。使片段4和5与SacⅡ和XhoⅠ末端连接,形成质粒PMLEgpt。
11.3.1.3.PTCSgpt的构建
步骤1 用SacⅡ酶切PML Egpt,用T4 DNA聚合酶填充末端,得到一末端补平的片段(片段#6)。把这个SacⅡ位点置于MLP三部分引物的腺病毒2顺序5′中的核苷酸5791上。
步骤2 用HindⅢ和PvuⅡ酶切PSV 2dhfr(ATCC保藏号37146)。用E.coli DNA聚合酶的Klenow片段补平末端含有SV40前启动子的较小的342核苷酸片段(片段#7)。用T4 DNA连接酶连接片段6和7。限制性酶的分析证实了这些片段定向正确,给以XhoⅠcDNA克隆的两个衔接启动子上游,每个启动子能提供在相同方向上的RNA合成。这一质粒称之PTC Sgpt(图22)。
11.3.1.4 PTC Sdhfr的构建
步骤1 HindⅢ和PvuⅡ酶切psv2dhfr,然后用琼脂糖凝胶纯化较大的片段(片段#8)。含有片段的较小的sv40前启动子舍弃。
步骤2 用EcoRⅠ酶切pTC Sgpt,然后用E.coli DNA聚合酶的Klenow片段填充,形成补平末端。再用HindⅢ酶切这种线型片段,分离含有SV40启动子、MLP、三部分的引物、XhoⅠcDNA克隆位点、鼠类Ig入顺序以及第二SV40启动子的pTCS转录单元的片段(大约1600核苷酸)(片段#9)。该片段具有一平端和一HindⅢ突端。连接片段8和9形成质粒pTCSdhfr。
11.3.1.5.pTC Sneo的构建
步骤1 用HindⅢ和BamHⅠ酶切PSV 2neo(ATCC保藏号37149),再分开较大的片段(片段#10)。该片段含有质粒骨架和neo基团。
步骤2 用HindⅢ和BamHⅠ酶切pTC Sdhfr,在酶切产物经琼脂糖凝胶电泳之后,由分离出pTCS转录单元(片段#11)。连接片段10和11形成质粒pTC Sneo。
11.3.2.含有可溶的CR1编码顺序的质粒pBSCRⅠC、pBSCRⅠS和pBM-CRⅠC、哺乳动物表达载体的表达和鉴定
11.3.2.1在CR1 cDNA中的不同位置上切断的CR1结构的表达
除了保存转移膜和胞质区之外,构建质粒pBSCRⅠC和pBSCRⅠS的大部分cDNA编码区(上述的11.1.节)(图20)。pBSCRⅠS比pBSCRⅠC短,因为它缺了pBSCRⅠC中有的一部分LHR-D和SCRS29及30。将这些质粒的SCR1部分插入到pTC Sgpt中,接着如上所述转染和表达。
pBSCRⅠC/pTCSgpt构建:用XhoⅠ酶切pBSCRⅠC,得到5.9kb插入部分SCRⅠC。将SCRⅠC插入到PTCSgpt的XhoⅠcDNA克隆位点中,产生pBSCRⅠC/PTCSgpt。
pBSCR1s/PTCSgpt构建:用XhoⅠ和PvuⅠ酶切pBSCR1 S放出CRⅠS部分。用T4 DNA聚合酶补平插入部分的末端。由琼脂糖凝胶纯化该插入部分。用XhoⅠ酶切载体pTCSgpt,用E.coli DNA聚合酶Ⅰ填充XhoⅠ突端。接着,把SCRⅠS插入部分连接到末端补平的载体上,形成pBSCRⅠS/pTCSgpt。
用EspⅠ酶切质粒pBSCR1C/PTCSgpt和pBSCRⅠS/pPTCSgpt,用质粒psv2dhfr经磷酸钙共沉淀,把所得的线型DNA′s转染到在dhfr基因中为突变体的中国仓鼠卵巢(Chinese Hamster Ovary)细胞中(CHO DUX B11细胞)。通过它们能够在DHFR选择性培养基中生长选择转染体。由ELⅠSA鉴定转染体克隆的培养物上清液中的分泌的SCR1。鉴定50pBSCRⅠC/pTC Sgpt重组体中的培养物上清液,并且通过在提高氨甲喋呤浓度中培养它们的扩增方法获得正的重组体。此外,通过共同培养每管8个pPBSCRⅠC/pTC Sgpt转染体并且使它们经相同的扩增方法,制备n管转染体。扩增的结果示于表Ⅵ。
表Ⅵ
pBSCR1c/pTC Sgpt的表达
分泌的可溶性CR1(μg/ml)
克隆 O MTX 20 nM MTX 50 nM MTX 100 nM MTX 500 nM MTX
2*0.7 3.4 11 10.9
4 0.04 0.1
6 0.04
9 0.02
10 0.2
11 0.12
12 0.14
13 0.07
14 0.2
15 0.45 1.1 7.3 9.0
21 0.07
30 0.27 <0.02 <0.02
35*↑ 0.82 6.3 8.4 10.9 10.9
40 0.05
41 0.05
50 0.12
52 0.12
管
A 0.02
B 0.04
C 0.23
D <0.02 <0.02
E 0.27 1.1
F 3.6 5.8 9.1
G 0.27
H 0.04
*为了在规模生产SCR1选择克隆2和35。
|由有限稀释以亚克隆35,对每种克隆测定形成的可溶性CR1 pBSCR1c/pTC Sgpt-克隆35.6是最高的生成者,
为17.7μg/ml sCR1。
MTX:氨甲喋呤(methorexate)
由ELISA鉴定pBSCRIS/pTC Sgpt中的12个重组体形成的可溶性CR1。所有12个选择物都显示了分泌SCRⅠ的可检测水平。最好的生成者所具有的SCRⅠ的水平可与最好的pBSCRIC/pTCSgpt转染体产生的比较。
pBSCRIC/pTCSgpt和PBSCRIS/pTCSgpt重组体均产生具有同样水平的可溶性CR1。这表明,产生可溶性CR1多肽的能力并不取决于CR1 cDNA中的一个精确的切断点。
11.3.2.2 在两种不同的表达系统中sCR1c的表达
将平截的CR1 cDNA插入部分,sCR1 C插入至表达载体pTCSgpt中,并如上所述进行表达。它还被插入至表达载体pBNT3 X中,如上面的11.2.3章节中所描述,这样就产生了pBM-CR1c。这两种表达载体都具有非常强的启动子。测试可溶的CR1在两种系统中的表达以确定是否有一个系统可以获得较好产量的分泌多肽。
采用磷酸钙方法(Graham,F.L.和Van der Eb,A.J.1973,Virology 52:456-467),用pBM-CR1c转染C127Ⅰ鼠细胞(ATCC保藏号.CRL.1616,Rockville,Maryland)。经甘油电震后,用含有10%小牛胎血清和2mML谷氨酰胺的D-MEM培养基恢复细胞,并在37℃下培养48小时。然后,胰酶消化该细胞,并以1∶5和1∶10的比例均匀加入完全D=MEM培养基+10μm氯化镉中使之分裂。10天内出现耐镉菌落。采用克隆圆筒将10个菌落移出。将每个菌落都转移到含有完全D-MEM培养基的陪替氏培养皿中,在37℃,5%CO2下培养直至细胞融合。然后,对每一个培养皿中的细胞进行胰酶消化,并分装入三个60mm的培养皿中以用于制备冰冻细胞原种,RNA抽提物,并用ELISA测试细胞培养基中分泌的sCR1c的存在。
当从每一个融合的陪替氏培养皿中移出细胞培养基并进行ELISA分析时,发现被测试的所有pBM-CR1c克隆都可用于制备可溶性CR1。将来自pBM-CR1c重组体的分泌的sCR1的量与来自pBSCR1c/pTCSgpt重组体的那些进行比较。结果表明高产量地生产分泌的sCR1多肽的能力并不依赖于一定的启动子或表达系统的任一个的应用。
11.3.3质粒pT-CR1c1,p T-CR1c2,pT-CR1c3,pT-CR1c4和pT-CR1c5的表达和分析,含有可溶的CR1编码顺序的哺乳动物表达载体。
缺失突变体的pT-CR1c系列漏失转移膜和胞质区,和pBSCR1c和pBSCR1s的结构一样。此外,缺失突变体还包括相当大量的CR1 cDNA的各种LHR区的缺失(见图20)。将缺失突变体在CHO DUX B11细胞中表达,并测定所产生的可溶CR1多肽的量。
对于每一种缺失结构型均选出40种不同的克隆库进行ELISA分析以确定是否产生了可溶的CR1多肽。通过ELISA或通过在细胞培养基中功能活性的存在测定发现5种pT-CR1c结构可在细胞培养基内分泌sCR1。用5种pT-CR1c结构的4种转染细胞的上清液中所产生的sCR1,它具有可通过溶血分析而测定的功能(基)(见表5和下面的13.2章节)。
表Ⅶ
功能性sCR1片段的制备
结构 ELISA 溶血分析
pT-CR1c1 - +
pT-CR1c2 + +
pT-CR1c3 - +
pT-CR1c4 + 未测定
pT-CR1c5 - +
*进行ELISA测试或溶血分析的上清液从在T75瓶或24深井型培养皿中生产的培养物中获得。因为在这些条件下,不同量的可溶CR1都可以累积于上层培养液中,所显示的结果是定性的。(+)表示产生了功能性的sCR1,由所指定的分析法检测。
缺失突变体也能够产生可溶的CR1的事实进一步显示了表达sCR1的能力不依赖于CR1 cDNA的一种正确的遗传修饰。象转移膜这样长的区被删除后,所有的结构仍能制备可溶的多肽。12.实例:可溶性的CR1的制备和纯化
大量的sCR1在空心纤维生物反应器系统中制备。所获得的sCR1的量与培养的重组体克隆的相应产量成正比。作为最佳的纯化结果来说,无血清培养基被选出,在外源加入的牛胎血清多肽大量缺乏的情况下,它仍可获得高产量水平的sCR1。
12.1 可溶性的CR1的大规模制备
配备Ⅳ-L型空心纤维生物反应器(30KD分子量中止)的细胞-药物TM细胞培养系统Ⅰ(CD Medical Inc,Miami Lakes,FL)在无菌条件下装配。将两个克隆(pBSCR1c/pTCSgpt的克隆2和克隆35)扩展至8个T-225瓶中。当融合时,用胰酶消化细胞,洗涤和制丸,并将其重悬浮于培养基中。约5×108个克隆2的细胞和10×108个克隆35的细胞在两个分开的空心纤维生物反应器中培养。采用一个20升的料液藏器,其中盛有α-MEM+10%小牛胎血清,8mM L-谷氨酰胺,100μg/ml青霉素链霉素和合适浓度的氨甲蝶呤(对于克隆2为50nM,而对于克隆35为500nM)。预先混合的气体(含5%CO2的空气)通过氧气发生器向贮藏器中的培养基鼓泡以维持pH。调整培养基的重复循环,替换和气体流速以获得最大的产量。将培养的部分在1000rpm下离心10分钟,通过0.22μM孔径的过滤而收集样品,纯化前保持于4℃。收集的体积和频率从25ml起梯度增加,在培养初期为每星期3次,至40ml,2-3个月后每星期5次。通过CR1 ELISA来分析所产生的sCR1。培养后第一个月的克隆2和克隆35的产量分别为66μg/天和1060μg/天。产量随着培养株的形成而增加。
12.1.1在无血清培养基中sCR1的制备
对两种商业上可购得的无血清培养基进行其支持细胞生长和sCR1产生的能力的测试。pBSCR1c/pTCSgpt克隆35的T75瓶中的融合物被分装入2个T75瓶中。一个瓶子用补充有10%小牛胎血清,L-谷氨酰胺,抗生素和500nM氨甲蝶呤的α-MEM培养基。另一个瓶则从用5%,1%,0.5%和无牛胎血清的α-MEM+L-谷氨酰胺,抗生素,500nM氨甲蝶呤+HB CHO生长添加剂(Hana Biologics,Inc.Alameda,CA)培养中逐步减少。比较两个瓶中细胞生长和sCR1生产产量。在无血清的培养基中生长的细胞不会达到融合。sCR1生产产量列于表Ⅷ中。在每一种情况下,当细胞在10%的小牛胎血清中生长时,sCR1的生产产量是最好的。比较发现,在14天时,无血清培养基中的产量是1.4×1010个血影细胞/ml,而在补充10%牛胎血清的培养基中则为4.2×1010个血影细胞/ml。
表Ⅷ
在补充CHO生长补充剂的血清培养
基和含有10%牛胎血清的培养基中
sCR1的产生*
*以1010个血影细胞/ml表示。
采用第二种来源的无血清培养基(CHO-1,Ventrex Labor atories,Inc.Protland,ME)测试在重组体中细胞生长和sCR1产生。因为不需要在该培养基中逐步去掉细胞生长的血清,所以,细胞在无血清的培养基中直接解冻和培养。该培养基由DME-12碱和生长添加剂组成。将相等数量的细胞解冻并接种入24-深井型培养皿中分开的井孔中。细胞附着后,除去培养基,将含有10%小牛胎血清的培养基或无血清的培养基加入至合适的井孔中。每一种条件下的实验都平行进行二次。与先前所测试的无血清培养基的情况不同,CHO-1,Ventrex Laboratories培养基可产生与含有牛胎血清的培养基相似水平的细胞生长。
12.1.2.结论
上述结果表明CHO细胞制备的sCR1可以维持于一定的无血清的培养基中。这就解决了大规模生产所花费的培养基的成本问题。另一个优点是从细胞培养上清液中纯化sCR1得以简化了,因为不需要除去牛胎血清蛋白质。
12.2可溶性的CR1的纯化
随着专一性抗CR1抗体的出现,用简化的二步法来代替制备纯化的CR1所需的多步层析法就成为可能了。这样也增加了CR1蛋白质的产量,每5.9×1013个红细胞可获得约1-5mg CR1(Wong,W.W等人,1985,J.Immunol.Methods 82:303-313)。但是,因为所报导的纯化是与膜结合形式的CR1的纯化,所以总是需要用去圬剂溶解含CR1的物质。
用重组转染体所制得的可溶性的CR1不必要用去圬剂溶解再纯化;它已经是可以溶解的。尽管可溶的CR1可以通过抗CR1抗体层析法纯化(见下面),但该过程本身不适宜于大规模生产。生产扩大的范围受到可以被得到的并用于制备抗体纯化柱的抗体基质的抗CR1抗体的量的限制。此外,对于CR1具有高结合亲和力的抗体,如YZ-1意味着相当苛刻的条件,如pH12.2必须达到以从抗体基质中移出结合的sCR1产品(Wong,W.W.等人,1985,J.Immunol.Methods 82:303-313)。
为了具备纯化很大量可溶的CR1的能力,形成了包括HPLC柱在内的纯化方法。这些HPLC柱可以容易地扩大以生产相当大量的纯化的可溶性CR1。此外,它们不需要在苛刻的条件下洗脱和复原sCR1。
12.2.1.抗体亲和柱纯化
12.2.1.1.方法
为了进行sCR1的抗体亲和纯化,根据制造商的说明,将100mg单克隆抗体YZ-1以共介偶合到7mg Affi Gel-10(Bio Rad,Richmond,CA)上。在瓶中用固定的YZ-1培养来自于细胞培养的含有CR1的上清液,在4℃振荡过夜。将物质倾注入玻璃柱中,M磷酸钠,0.7 M NaCl,pH12洗提sCR1(Yoon.S.H和Fearon D.T.1985,J.Immunol.134:3332-3338)。采用Biorad蛋白质分析法(Bio Rad,Richmond,CA)来检验洗脱的级分中蛋白质的存在。将含有蛋白质的样品马上收集起来并在0.1M Hepes,pH7(2×11)中,于4℃透析过夜。然后在PBS中透析样品。通过CR1 ELISA分析存在的sCR1。
12.2.1.2.结果
将由转染体pBSCR1c/p TC Sgpt克隆2所制得的含有sCR1的细胞培养上清液加入抗CR1抗体亲和层析柱中,收集峰sCR1级分。将一部分这种纯化的物质展开于4-20%的SDS-PAGE凝胶上(DAIICHI;Inc.,聚丙烯酰胺凝胶,modified procedure of Laemmli,U.K.,1970,Nature.227:680-685)。在还原条件下,可溶的CR1的表观分子量是约224,000道尔顿(图24)。该纯化的CR1分子具有抑制以补体作媒介的溶器作用以抑制C5a制和C3a产生的能力,这表明它也是具有活性的(下面第13章节)。
12.2.2.采用HPLC的CR1纯化
12.2.2.1.方法
12.2.2.1.1.原料
当培养物在生物培养基中刚刚形成时,sCR1的生产能力低于培养物已生长了几个月的时候。通常,在细胞在生物反应器中达到融合和产生最大产量的sCR1以前,有几个星期的一个周期。含有少量sCR1的细胞培养上清液在纯化前可通过硫酸铵沉淀或超滤法而浓缩。用60~80%饱和的硫酸铵分级分离所沉淀的sCR1呈现基本相当的产量。将沉淀物以最小的体积溶解并在用于阳离子交换HPLC的初始缓冲液中透析。或者,可以超滤浓缩CHO细胞培养上清液并透析到用于阳离子交换层析的初始缓冲液中。
因为生物反应器中产生了较高浓度的可溶的CR1,从这些培养物中得到的CHO细胞培养上清液可直接透析至用于阳离子交换层析的初始缓冲液中。
12.2.2.1.2.阳离子交换HPLC过程
将样品透析至初始缓冲液中(0.02M磷酸钠,0.06N氯化钠,pH7.0),然后通过一个0.2μm过滤器过滤以除去所有的粒状物质。然后,将样品加入阳离子交换高压液相色谱柱中(10cm×10mm,Hydropore-SCX HPLC柱,Rainin)。洗涤该色谱柱,并用0.02M磷酸盐,0.5N Nacl pH7.0展开的氯化钠梯度洗脱。洗提的Sc R1约在0.06N和0.25N Nacl之间。通过280nm处吸光率和ELISA监测洗脱。
12.2.2.1.3.阴离子交换HPLC过程
如果需要的话,可以通过阴离子HPLC而得到阳离子HPLC纯化的sCR1的进一步纯化产物。将阳离子HPLC的峰级分透析至阴离子HPLC的初始缓冲液中。将样品装入柱中,并用0.01M磷酸盐,pH7.5洗涤柱(Hydropore-AX,Rainin)。采用0.01M磷酸盐,0.5N Nacl,pH7.5展开的(Nacl)梯度洗脱该柱(采用一系列的步骤)。洗脱的sCR1是在0.0N和0.3NNacl之间。如前面对于阳离子交换HPLC一样监测洗提情况。所给出的阳离子和阴离子HPLC柱缓冲液的浓度和pH只是一些例子。其它浓度的缓冲液,盐的条件或pH条件也可以采用。
12.2.2.1.4.Western吸印法分析
Western吸印法采用Towbin,H.等人,1979,Proc.Natl.Acacl.Sci.USA,76:4350-4354的修改方法而进行。简而言之,将纯化的sCR1展开于4-20%SDS-PAGE上,再将其转移至硝酸纤维素中,用抗CR1(鼠mAb YZ-1或J3 D3)专一探查,并用与碱性磷酸酯酶共轭相连接的山羊抗鼠抗体检测。
12.2.2.2.结果
一个典型的展开中,将50-100ml取自生物反应器培养物的上清液透析至初始缓冲液中,并加入10cm×10mm阳离子交换HPLC中。通过在280nm处吸光率和ELISA法检测峰级分,并收集。通过280nm处吸光率(E值1%)在280nm处=10,如对于CR1c氨基酸组合物估计)而测定收集物中蛋白质的浓度。从100ml放大培养的上清液中纯化得到几十毫克产品。
在一个实例中,100ml来自转染体pBSCR1c/pTCSgpt克隆2的培养物上清液产生了22mg纯化的sCR1,当采用阳离子HPLC纯化时,通过在280nm处的吸光率而测定(图24)。当用CR1 ELISA检验时,计算得到产率为202%,和另外13%是在流过的或柱的洗涤级分中。产率大于100%可能反映了ELISA分析中的基质的影响。
给定培养物上清液从生物反应器中抽出的速率,在该水平的氨甲蝶呤放大下,每个生物反应器每周可产生约100mg纯化的可溶性的CR1是可能的。该水平的生产能力可以放大的一些方法包括在接种到生物反应器前,用氨甲蝶呤将初始反应物放大到最大,增加在任何一个生产时间中生物反应器的数量,和采用较大容量的HPLC柱。
12.2.2.3.纯化的可溶CR1的特性
从阳离子HPLC得到的含有sCR1的峰级分在阴离子HPLC中进一步纯化(图24)。通过SDS-PAGE对于在不同的步骤中的sCR1物质的纯度进行测试(图25)。在这些高负载凝胶上可看到的较小的色带代表sCR1片段,如通过采用抗CR1单克隆抗体,YZ1或J3 D3的Western吸印法所测定的。在大多数制备中,未观察到sCR1片段色带。
纯化的sCR1的功能活性通过浓度为0.25μg/ml的纯化的sCR1可以抑制50%典型的补体作媒介的溶血作用的能力而测试。在5μg/ml时,纯化的可溶性CR1也能够抑制50%典型的补体C5a的产生,而在30μg/ml时,则可抑制50%C3a的产生(见下面第13章节)。
12.2.2.4.结论
如上所述,我们建立了一种纯化可溶性的CR1的改进的方法,所述的可溶的CR1可以容易地扩大以生产大量治疗应用所需的sCR1。该方法的基本成份包括已经溶解的起始原料,这样,就不需要用去圬剂来溶解与膜结合的CR1。在生物反应器培养基中小牛胎血清的减少和/或在培养中采用另一种培养基排除了在随后的纯化过程中从含有sCR1的原料中移出高浓度外源蛋白质的需要。此外,用HPLC方法进行纯化提供了大规模纯化的方法。阳离子HPLC或先阳离子HPLC,然后阴离子交换HPLC结合的方法均可用于纯化。采用这种方法,只以1或2个步骤就可以高产率地获得基本纯的可溶的sCR1。
13.实例:可溶的CR1体外活性的实验
13.1.抑制嗜中性细胞的氧化性损伤。
在心肌梗塞中遭受损害的组织的重输注损伤模型中,活化的补体组分诱导嗜中性细胞的粘连和活化。活化的嗜中性细胞经历氧化性损伤形成剧毒氧基。这些和其它一些潜在的毒素在嗜中性细胞脱粒时释放出来,破坏周围的组织。可溶的CR1可通过阻止在嗜中性细胞活化中产生C3a和C5a以及补体组分而减小破坏的组织的区域。
为了检验可溶的CR1阻止在体外补体激活中C5a产生的能力,采用一种生物分析法,它可以对在C5a诱导的氧化过程中由嗜中性细胞所产生的氧基进行定量(Bass,D.A.等人,1983,J.Immunol.130:1910-1917)。该分析中采用二氯二乙酸荧光素酯(DCFDA),一种液态的可进入细胞中并残留下来的分子,氧化时可发出强烈的荧光。
13.1.1.材料和方法
13.1.1.1.材料
所采用的有新鲜的全血,人体补体来源(Beth Israel Hospital,Boston,MA),干燥的Baker′s酵母,具有0.1%明胶和5mM葡萄糖的PBS,100mMEDTA,HBSS中的10mM DCFDA,(Kodak),置于溶解用的缓冲液中的红血细胞(RBC)(Ortho Diagnostics),纯化的C5a(Sigma Chemical CO.St.Louis,MO),和可溶的CR1。
13.1.1.2.嗜中性细胞的制备
采用Bass(1983,J.Immunol.130:1910-1917)所描述的方法来制备嗜中性细胞。将2.0ml全血在PBS-明胶-葡萄糖中洗涤3次,再悬浮于5ml在HBSS中的10μM的DCFDA+5ml PBS-明胶-葡萄糖中,于37℃下培养15分钟,然后离心分离细胞并重新悬浮于2.0ml PBS-明胶-葡萄糖+5mMEDTA中。
13.1.1.3酵母颗粒的制备
将干燥的Baker′s酵母重悬浮于H2O中,洗涤2次并沸腾30分钟。将颗粒再在H2O中洗涤2次,并以0.5g/ml重悬浮于水中,(Simpson P.J.等人,上述的)。
13.1.1.4.通过纯化的C5a来活化嗜中性细胞
用溶解于缓冲液中的RBC处理100μl载有DCFDA的细胞,在PBS-明胶-葡萄糖中洗涤1次,并重悬浮于1.0ml PBS-明胶-葡萄糖中。将50μ1200ng/ml的纯化的C5a或对照物加入37℃下的0.5ml靶细胞中,在不同的时间间隔下,用流式细胞光度计进行分析。
13.1.1.5.用纯化的C5a激活人血清或原生质中的嗜中性细胞
用50μl在人血清或肝素化的原生质(100ng/ml)以1∶1稀释的C5a或对照物在37℃下培养100μl载有DCFDA的细胞,培养30分钟。RBC被溶解出来,用流式细胞光度计分析嗜中性细胞。
13.1.1.6.用活化的哮母颗粒活化人血清或原生质中的嗜中性细胞
在37℃下,用25μl酵母颗粒培养425μl新鲜的冰冻血清和原生质+50μl sCR1或对照物,培养进行30分钟。然后,将激活的补体或对比样品离心分离以除去酵母颗粒。每一个这种样品都在PBS-明胶-葡萄糖-EDTA中进行10次2倍的稀释。将50μl每一种稀释后的对照物和活化的血清和原生质加入50μl载有DCFDA的靶细胞中,在37℃下培养30分钟。然后,溶解出RBC′s,用流式细胞光度计分析嗜中性细胞。
13.1.2.结果
13.1.2.1.可用DCFDA测定的C5a诱导人体嗜中性细胞中的氧化损性损伤
图26显示了用纯化的C5a刺激后,人体嗜中性细胞的荧光强度的迅速增加。在C5a(最终浓度为20ng/ml)加入后4分钟内,嗜中性细胞比载有DCFDA的对比嗜中性细胞亮10倍。到20分钟时,嗜中性细胞的亮度则是对照物的亮度的20倍。该分析似乎是C5a的灵敏检测器。
13.1.2.2.人体血清阻滞纯化的C5a对于嗜中性细胞难趸鹕俗饔?
嗜中性细胞中荧光强度的增加。该效应可能是由于在血凝块过程中从血小板中释放出来的生长因子(PDGF)衍生的血小板产生的。业已发现,低水平的PDGF可以抑制C5a诱导的嗜中性细胞的活化(Wilson E.等人,1987,Proc Natl.Acad.Sci.USA 84:2213-2217)。
13.1.2.3.肝素化的原生质不阻滞C5a对于嗜中性细胞的作用
在肝素化的原生质中1∶1稀释的C5a诱导在载有DCFDA的嗜中性细胞中氧损伤。尽管不如在缓冲液中由C5a引起的作用剧烈,在用该嗜中性细胞培养30分钟后,荧光强度增加了10倍。减弱的信号可能是由在静脉放血或原生质分离中释放的PDGF所引起。较温和或迅速地从血液细胞组分中分离出原生质可使PDGF的释放最小并可得到较好的C5a功能。
13.1.2.4.存在于补体活化过程中的sCR1阻碍C5a的产生
在可溶性的CR1存在的情况下,酵母多糖引起的人类补体的活化,当用DCFDA测试时发现减少了C5a的活性。如图27所示,在sCR1存在下被活化的人类原生质的1∶16的稀释液所产生的中性白细胞中的荧光密度的增加比不存在sCR1时被活化的原生质的1∶16稀释液下降70%。这意味着sCR1对C5a产生的抑制作用。对DCFDA测定法及原生质的收集作进一步地优化,可以获得一个对可溶性的CR1活性的更为高效能和更为敏感的测定方法。
13.2.对补体媒介的溶血作用的抑制
13.2.1方法
对补体抑制能力的测试是通过测定补体媒介的红细胞溶胞(溶血作用)的抑制来进行的。针对于可溶性CR1的浓度对溶血作用的抑制进行测定。将sCR1样品稀释于0.1M Hepes缓冲剂(0.15N NaCl,pH7.4)以进行测定,在V形底的微滴定板上的每个眼中zz加入50μl,同样平行操作三只样品。将作为补体来源的人类血清用Hepes缓冲液稀释成1∶125,在每眼中加入50μl。接着,采用商业上可获得的具有抗绵羊抗体的绵羊红细胞(Diamedix Cat.No.789-002),每眼中加入100μl,以启动补体的溶血作用途径。在37℃下将该板保温60分钟,随后,在500g下离心10分钟。移取上清液并置于一个平底的微滴定板上。溶血作用的程度是通过样品在410nm处的吸收值来测定的。通过将仅含人类血清As的红细胞样品的吸光值减去仅含红细胞的样品的吸收值而获得最大吸收值(相应于最大的溶血作用),Amax。即:Amax=As-Ao。既含有人类血清又含有sCR1的红细胞样品的吸收值与仅含有sCR1的细胞样品的吸收值之间的差值被称为A样品。抑制率-IH用比值(Amax-A样品/Amax)表示,而IH50为产生的IH=1/2时的sCR1的浓度。在监测层析的流份时,未将无血清的对照包括在内,而抗-补体活性是以样品在410nm处吸收值的降低而对其作定性监测的。
上述的溶血测试也同于估测人类重组体sCR1通过其他种的动物(诸如:豚鼠及大鼠)的补体而对绵羊红细胞胞溶进行抑制的能力。对于各种物种,可用新鲜冷冻的血清或新鲜冷冻干燥的血清或原生质作为补体来源。有时血清可以购得(Sigma Chemical Company,St.Louis,Mo)。
首先对于血清溶解活化的红细胞的能力进行滴定。将至少达到最大红细胞胞解的80%的最大程度的稀释液选用以估测加入的人类sCR1的作用。随后如上所述,进行测试,并以优选的稀释度用动物血清替代人类血清。
13.2.2.结果
如图28所述,纯化的sCR1在浓度为0.12μg/ml时,抑制了经典的补体-媒介的胞溶的50%。将抗体亲和性的纯化的sCR1抑制血细胞胞溶的能力测试与使用未纯化的材料的情况作比较(含有细胞培养物上清液的sCR1)。纯化的sCR1的活力可与未纯化的sCR1的活力相比,即两者在溶血测试中于1.6×108红细胞外壳/ml均能抑制50%。这就表明,纯化步骤未使最终sCR1产物的功能性活力明显地下降。
为了决定纯化的sCR1是否能于冷冻中保藏,将一份贮于-70℃达一周。当用CR1 ELISA测定及在280nm下测定吸收值,表明经冷冻的sCR1的浓度无异于未经冷冻者。对血细胞溶解抑制的测定表明冷冻过的sCR1的活力也与未经冷冻者相同。
表Ⅸ罗列了人类重组体sCR1对于来源于多种物种的补体所媒介的血细胞胞溶抑制的能力。
表Ⅸ
采用来源于多种动物血清的补体时,
对于敏感的绵羊RBC的血细胞溶解作用
动物 采用血清的 sCR1的 抑制率IH** IH50**
最终浓度 抑制作用 (红细胞外壳/ml)(红细胞外壳/ml)
豚鼠* 1∶500 是 66%(2.6×109) 1.0×109
人 1∶500 是 94%(2.5×109) 2.0×108
人 1∶312 是 94%(1.2×109) 1.0×107
大鼠 1∶200 是 85%(2.6×109) 2.4×108
大鼠* 1∶200 是 77%(3.8×109) 1.0×109
狗 1∶50 否
兔* 1∶20 否
小鼠* 1∶5 否
*购得的冷冻干燥的血清(Sigma Chemical Co.,St.Louis,Mo.)
**如上文所述(第13.2章节)
无论是豚鼠或是大鼠的补体都显示出被人类sCR1所抑制。对于其他的物种没有明显的抑制作用可能反映了(a)在测试系统中兔抗体及绵羊红细胞不相适应,或者(b)在该系统中血细胞胞溶需要高浓度的血清。
13.3.C3a的抑制及C5a的产生
13.3.1.方法
对补体的抑制能力也可通过对C3a和C5a的专一性抑制的测试来测定。在所有的实施例中,采用同一个瓶中的人类血清作为补体的来源并分成若干份置于-70℃冷冻。人类IgG(免疫球蛋白G)被热凝集后,分成若干份置于-70℃下冷冻。在每一个实验中,每一份血清用已测定的不同的浓度的sCR1于37℃进行平衡。加入凝集的人类IgG引发补体作用途径。每次都包括一个不含IgG的对照样品经过固定的15分钟(这是由先前进行的反应时间的研究所确定的,提供了使C5a或C3a的产生近乎完全,比如大于90%所需要的时间)的反应时间之后,用改善了的方法,使用购得的放射免疫测试(RIA)仪(C5aRIA,Amersham Cat NO.RPA.520;C3aRIA,Amersham Cat.NO.RPA.518)用放射免疫测试法对释放的补体肽(C5a或C3a)的浓度水平进行测定。
因为采用的是竞争性的免疫测定法,补体肽(C5a及C3a)浓度和所得计数呈反比,样品中结合的计数(counts bound(CB)定作总计数(每分钟计数cpm)是在小药丸中测定的。
图29中的y轴代表抑制率。抑制率相等于某一“样品”的结合计数(CB),减去“样品中加入SCR1”再除以“无免疫球蛋白对照品”的(CB)减去样品无SCR1”的CB。
抑制率= ([(样品的CB)-(没有sCR1的CB)])/([(无IgG的CB)-(无sCR1的CB)])
13.3.2.结果
纯化的sCR1的活性是通过在一个活化的人类血清样品中测试其对C5a及C3a产生的抑制能力来测定的。
如图29所荆诓馐蕴跫拢炕膕CR1最大程度可以100%地抑制C5a的产生,60%抑制C3a的产生。对C5a的产生,当sCR1的浓度为5μg/ml时,而对C3a的产生,当sCR1的浓度为15-20μg/ml时,观察到有50%的抑制作用。这一结果表明重组体sCR1对于C5转化酶的抑制比对C3转化酶的抑制为更有效。
14.例子:可溶性CR1在体内治疗活性中的功能的演示
14.1.在反相的被动阿图斯氏反应中进行的可溶性CR1的体内功能的演示
阿图斯(Arthus)氏反应是一个经典的免疫学的诱发的炎症反应通过局部地注射抗原,随后在循环中在该处与抗体反应。主要的生物子反应的特征为,免疫复合物沉积、补体结合固定、多形态核白细胞浸润、溶菌体酶的释放、作用于血管的胺的释放,及局部的组织损伤(参见Uriuhura,T.and Movat,H.Z.,1966,Exp.Mol.Pathol.5:539-558;Cochrane,C.G.,1968,Adv.Immunol.9:97-162)。作为直接的阿斯图氏反应的改进的反相的被动阿斯图反应(RPAR)已在确定抗炎症剂方面用作模型(参见:Pflum,L.R.and Graeme,M.L.,1979,Agents and Actions 9:184-189)。在RPAR中,抗体被局部地注射入体内,而抗原存在于循环中。
当在大鼠RPAR模型中测定时,可溶性的sCR1可以阻止局部炎症反应。该可溶性CR1在体内的功能的作用机制可能是对于补体途径的酶的作用过程的抑制。
14.1.1.材料及方法
对体重在100-125克左右的范围的五周龄的(Sprague Dawley)大鼠(CD strain)(Charles River Laboratories,Wilmington,MA)腹膜内注射0.1至0.3ml的三溴乙醇使之麻醉。该溶液为用1克三溴乙醇溶于15ml Amel乙醇中而形成的储液经1∶2稀释而成的。将大鼠背部的毛剃去。接着,使鼠尾发热,先用热水后用发热的灯泡。采用一个1ml的注射管,将0.35ml的浓度为5mg/ml的溶于0.15M磷酸缓冲盐中的卵清蛋白(Calbiochem Corp.,San Diego,CA)在大约距尾端1至2英寸处的尾茎上通过静脉注射入鼠体。五分钟之后,对大鼠通过皮肤注射以20mg/ml浓度的抗-卵清蛋白抗体(具有的抗体效价为4mg/ml)(Organon Teknika Corp.,Cappel Division,West Chester,PA)中的兔Ig免疫球蛋白0.08ml,或注射以0.08ml 20mg/ml兔IgG(Sigma Chemical Co.,St.Louis,Mo),或注射以PBS。每次注射均同样地施于两只大鼠,注射区域用记号笔划出。随后对大鼠进行1、4及18小时监视。24小时之后,将大鼠埋于干冰中3分钟而被杀死。将皮肤样品从注射位点上割下。将相同的两个样品中的一个置于10%福尔马林中以供石蜡包埋,而另一个则冷冻以供切片。制成的组织切片用苏木紫及曙红染色。
14.1.2.结果
当皮肤内注射抗卵清蛋白抗体之后的3至5小时之后,才开始可见有微弱的RPAR反应(例如:水肿及红斑)。24小时之后,反应逐渐地加剧,反应区域直径直至3-5mm(见图30b)。非免疫兔IgG或PBS注射的大鼠皮肤上无反应。
在显微镜下对取自受损部位的组织切片进行观察,发现在真皮上,特别是在血管周围有许多急性的炎症细胞(见图31b)。这都是血管炎及血管周炎所典型具有的。被观察的组织显现了典型的炎症条件,即在血管外有广泛的PMN浸润、结缔组织中存在红细胞、及胶原纤维的松弛等。
14.1.3.皮内施用可溶性CR1的作用
将40μl的0.75mg/ml sCR1与等体积的抗-卵清蛋白或正常兔IgG或PBS混合而制成纯化的sCR1混合物。将sCR1:抗-卵清蛋白混合物或sCR1∶兔IgG混合物、或sCR1∶PBS混合物通过皮肤内注射入已经静脉注射了卵清蛋白的大鼠内。仅在注射了sCR1加上抗-卵清蛋白抗体的注射部位出现了可见的损伤(见图30a)。正如所料,在注射了sCR1∶兔IgG或sCR1∶PBS的部点未发生损伤。当用显微镜观察sCR1∶抗-卵清蛋白注射坏闼闹艿淖橹衅保匮芩闹芸杉鸓MN簇及单核细胞簇,但是却没有广泛的PMN浸润或红细胞的外渗(见图31a)。这些情况表明,可溶性CR1的施用可引起对内皮细胞损伤及炎症反应的抑制作用。
为了测定在上述的卵清蛋白大鼠模型中,阻止RPAR所必需的sCR1的最低有效数量。分别地将0.75mg/ml十倍地系列稀释SCR1贮液(即原液、1/10、1/100、1/1000及1/10,000)进行测定。对每个sCR1稀释液混以等体积的抗-卵清蛋白抗体的原液或二分之一稀释液。每注射部位的注射总量为80μl。sCR1抑制RPAR的能力是依赖于剂量的,每注射位点施用300毫微克时,可明显地观察到水肿的减少(见表Ⅹ)。
表Ⅹ
sCR1抑制作用的剂量的影响
sCR1(微克/位点) RPAR程度残留
30 +/-
3 +/-
0.3 +/-
0.03 + +
0.003 ++++
0 ++++
14.2.体内施用的sCR1的药物动力学
如下对sCR1体内的生物半衰期进行测定。对相似周龄(六周)及体重(110-125克)的大鼠,通过静脉注射含250μg sCR1的注射液0.35ml。分别于注射后2分钟、5分钟、10分钟、60分钟、及24小时,将大鼠杀死,并用静脉腔穿刺取出血液。在1800rpm下离心10分钟自每只鼠获得1-2ml血清,并用CR1 ELISA对每一样品种的sCR1数量进行测定。将μg/ml纯化sCR1的二倍稀释液加入对照大鼠血清或无血红蛋白的血红细胞外壳的去剂胞溶物(1.6×108个外壳/毫升),作为CR1的标准物。结果示于表Ⅺ。
表Ⅺ
随时间变化的注射入sCR1
的血清浓度变化的药物动力学数据
静脉注射后的时间 sCR1浓度(μg/ml)
对照 0.01
2分钟 0.17
5分钟 0.80
10分钟 1.01
60分钟 0.38
24小时 0.49
这些数据表明,sCR1在静脉注射后24小时还可被测出。在24小时时,sCR1在血清中的水平为注射后10分钟所观察到的峰值的一半。
14.3.sCR1减小大鼠重新输注(REPERFUSED)
梗塞心肌的梗塞区的大小
如上所述的在体外试验中具有抑制补体途径C3/C5转化酶活性的能力的sCR1也可在体内用于大鼠心肌梗塞模型,以减少受重新输注损伤的程度。
大鼠的心肌梗塞可以通过扎结冠状血管而引起。如在心肌梗塞发生后头几个小时后进行测定,发现重新输注(reperfusion)已被证明可减小梗塞区大小起作用,并改善了左心室的功能,因而减小了死亡率(参见:Braunwald,E.and Kloner,R.A.,1985,J.Clin.Invest.76:1713-1719)。然而,重新输注至心肌可造成严重局部缺血但并非不可逆的损伤的心肌的重新输注(reperfusion)其本身可能产生或扩大伤害。重新输注(reperfusion)引起的伤害有关的机理包括,由于氧自由基及细胞钙过载而引起伤害等。白细胞单独地或与微血管谄は赴黄鹂刹渭拥秸庵稚撕χ小2固宓幕罨炭赡馨ㄓ诟霉讨校ú渭篟ossen,R.D.,et al.,1985,Cir.Res.57:119-130;Crawford,M.H.,et al.,1988,Circulation 78:1449-1458)。
14.3.1.方法
14.3.1.1引发大鼠的心肌梗塞
用吸入甲氧氟烷(methoxyflurane)的方法十四只体重在200至250克的大鼠麻醉,将右颈静脉切断,插入套管。其中的一半大鼠(七只)通过套管得到2ml(1mg)sCR1,而另一半大鼠则以相似的方式被施于2ml盐水(placebo)对照。将大鼠颈套管移去,将颈静脉扎结,并缝合伤口。随后在第五、六肋骨间对大鼠施行左胸胸廓切开术,同时对大鼠通以间歇的正压的95%氧气及5%二氧化碳混合气体。接着进行心包切开术,在邻近主动脉的左侧处2-3mm内缝合扎结左冠状动脉。冠状动脉扎结的后果是在一个大区域具有产生前透壁梗塞形成的危险。在大鼠仍处麻醉状态时暂时关闭胸腔。闭合35分钟之后,重新打开胸腔,并拆去缝线。适当地选择这段时间以保证处于危险之中的区域的相当一部份具有挽救的可能。随后,永久地关闭胸腔,并且可以让大鼠从麻醉中苏醒,一般于术后5至10分钟之内。通过肌肉注射对大鼠施以100,000单位的苄量青霉素G(benzathine)及0.25mg/kg码啡硫酸盐。对大鼠喂以水及标准鼠饲料,达一周之后,使之肝素化,用甲氧氟烷(methoxyflurane)麻醉,随后切除心脏,杀死大鼠。
14.3.1.2.实验梗塞的形态分析:
制取供研究的心脏
切除心脏之后,迅速地在主动脉上插上套管,首先向冠状动脉输以(Krebs Henseleit)溶液以清除血及血凝块,随后输以30mMKCl以舒张停博的心脏。通过对冠状动脉灌注及浸入10%缓冲的福尔马林,使该心脏固定(fix)。为了控制足够的注入压力,在心脏上二尖瓣瓣膜处通以塑料管。固定化之后,将心脏自底部一直至尖端沿着平行于房室沟的平行线横切成2mm的切片,制成组织切片。
14.3.2.结果
存活率两组中是一样的,即是,七只之中六只存活7天,供作分析。对组织切片进行大致的观察,发现用对照剂(placebo)处理的六只中五只呈现较大的透壁性(transmural)心肌梗塞(据估计至少占有左心室的15%)。而在用sCR1的大鼠中,六只中仅一只发现有大区域透壁性梗塞。其他的经sCR1处理的大鼠在左心室具有小得多的小补钉块状的梗塞(少于15%)。事实上,所有这些都只有凭显微镜可以察出,而用对照处理的大鼠的梗塞十分明显,粗略一看便可察觉。
14.3.3.结论
结果表明,sCR1体内处理对于减轻重新输注(reperfusion)损伤是有效的,具有可以改善心肌梗塞的病症的效果。甚至可以改善重新输注的(reperfusion)损伤,被挽救的心肌的绝对数量可以提高,而且可以提供时间窗(time window),而对重新输注(reperfusion)在临床上的用途可被扩展。使用sCR1的处理法应该是伴随于对急性梗塞时所作的溶血栓处理或囊冠状血管成形术治疗中的有用的辅助疗法。
15.微生物保藏
带有质粒piABCD(称之pCR1-piABCD)且编码全长CR1蛋白质的E.coli菌株DK1/p3已于1988年3月31日保藏在美国伊利诺斯州、皮臭里亚、农业研究培养物收集处(NRRL)。保藏号为B-18355。
带有编码可溶性CR1分子的质粒pBSCRIC/PTCSgpt克隆35.6的中国仑鼠卵巢细胞系DUXB11已于1989年3月23日由美国、马里兰州:罗克维莱的美国典型培养物保藏中心(ATCC)保藏,保藏号待定。
本发明并不限于由保藏的微生物所规定的范围,因为想要把具体保藏的微生物作为本发明的一方面的一个实例而功能上等同的任何微生物均在本发明的范围之内。当然,除了本文中所说明和叙述的之外,自上述的说明书和附图得出的本发明的各种改进对于本技术领域中的技术人员来说将是显而易见的。应当认为,这样一些改进均包括在以下的权利要求书的范围内。
还应指出,文中所给核苷酸的所有碱基对大小均是近似的且用于叙述。
Claims (105)
1、一种核酸顺序,其特征在于它包括一编码基本上如图1核苷酸28至6147所示的全长度CR1蛋白质的顺序。
2、根据权利要求1所述的顺序,其特征在于它包括一DNA顺序。
3、根据权利要求1所述的顺序,其特征在于它包括一RNA顺序。
4、一种重组核酸载体,其特征在于它包括权利要求1的顺序。
5、一种重组核酸载体,其特征在于它包括权利要求2的顺序。
6、一种重组DNA载体,其特征在于它包括pABCD。
7、一种重组DNA载体,其特征在于它包括由NRRL保藏的,保藏号为B-18355的piABCD。
8、一种重组表达载体,其特征在于它包括权利要求1的顺序。
9、根据权利要求8所述的表达载体,其特征在于它能够表达细菌中的顺序。
10、根据权利要求8所述的表达载体,其特征在于它能够表达哺乳动物细胞中的顺序。
11、根据权利要求10所述的表达载体,其特征在于它包括由NRRL保藏,保藏号为B-18355的piABCD。
12、一种重组细胞,其特征在于它包括权利要求1的顺序。
13、一种重组细胞,其特征在于它包括一含有权利要求4的核酸载体的细胞。
14、一种重组细胞,其特征在于它包括一含有权利要求5的核酸载体的细胞。
15、一种重组细胞,其特征在于它包括一含有权利要求8的核酸载体的细胞。
16、一种重组细胞,其特征在于它包括一含有权利要求10的核酸载体的细胞。
17、根据权利要求12、13或14所述的重组细胞,其特征在于它包括一种细菌。
18、一种大肠杆菌(Escherichia coli),其特征在于它由NRRL保藏,保藏号为B-18355。
19、一种核酸顺序,其特征在于它包括基本上如图1核苷酸28至1533所示的顺序。
20、根据权利要求19所述的核酸顺序,其特征在于它为编码一基本上缺少转移膜区的蛋白质的顺序。
21、根据权利要求20所述的核酸顺序,其特征在于所说的蛋白质由其中被表达的细胞分泌。
22、根据权利要求21所述的核酸顺序,其特征在于所说的蛋白质起由抑制嗜中细胞的氧化性损伤、补体传递溶血作用或者C3a和C5a产生的能力(在玻璃试管内的试验)检测的作用。
23、根据权利要求19、20或21所述的核酸顺序,其特征在于它包括一DNA顺序。
24、根据权利要求19、20或21所述的核酸顺序,其特征在于它包括一RNA顺序。
25、一种重组核酸载体,其特征在于它包括权利要求19或20的顺序。
26、一种重组核酸载体,其特征在于它包括权利要求21或22的顺序。
27、一种重组表达载体,其特征在于它包括权利要求19的顺序。
28、一种重组表达载体,其特征在于它包括权利要求20的顺序。
29、一种重组表达载体,其特征在于它包括权利要求21的顺序。
30、根据权利要求28所述的重组表达载体,其特征在于它选自由pBSCRIC、pBSCRIS、pBM-CRIC、pBSCRIC/PTCSgpt以及pBSCRIS/pTCSgpt组成的组。
31、根据权利要求28所述的重组表达载体,其特征在于它选自由pT-CRICI、pT-CRIC2、pT-CRIC3、pT-CRIC4以及pT-CRIC5组成的组。
32、一种重组DNA载体,其特征在于它包括由ATCC保藏,保藏号待定的质粒pBSCRIC/pTCSgpt。
33、一种重组细胞,其特征在于它包括权利要求19、20或21的顺序。
34、根据权利要求33所述的重组细胞,其特征在于它包括一种细菌。
35、一种重组细胞,其特征在于它包括一含有权利要求25的载体的细胞。
36、一种重组细胞,其特征在于它包括一含有权利要求26的载体的细胞。
37、一种重组细胞,其特征在于它包括一种含有权利要求27的载体的细胞。
38、一种重组细胞,其特征在于它包括一含有权利要求28的载体的细胞。
39、一种重组细胞,其特征在于它包括一含有权利要求29的载体的细胞。
40、一种中国仓鼠卵巢细胞DUXB11,其特征在于带有由ATCC保藏,保藏号待定的质粒pBSCRIC/pTCSgpt的中国仓鼠卵巢细胞。
41、一种蛋白质,其特征在于它包括基本上如图1所示的氨基酸顺序。
42、一种权利要求41的蛋白质的片段,其特征在于有能够结合C3b的能力。
43、一种权利要求41的蛋白质的片段,其特征在于它有能够结合C4b的能力。
44、一种权利要求41的蛋白质的片段,其特征在于它有能够结合C3b和结合C4b的能力。
45、一种权利要求41的蛋白质的片段,其特征在于它具有因子Ⅰ辅因子活性。
46、一种权利要求41的蛋白质的片段,其特征在于它可以抑制C3转化酶活性。
47、一种权利要求41的蛋白质的片段,其特征在于它可以抑制C5制转化酶活性。
48、根据权利要求41所述的蛋白质或其一片段,其特征在于它包括糖苷基化的24个氨基酸。
49、根据权利要求41所述的蛋白质,其特征在于它未经糖基化作用。
50、根据权利要求41所述的蛋白质,其特征在于它表示为一细胞表面蛋白质。
51、一种蛋白质,其特征在于它包括基本上如图1所示的核苷酸28到1533编码的氨基酸顺序。
52、一种核酸顺序,其特征在于它为编码权利要求51的蛋白质的顺序。
53、根据权利要求51所述的蛋白质,其特征在于它基本上缺少一转移膜区。
54、根据权利要求53所述的蛋白南,其特征在于它由一其中被表达的细胞所分泌。
55、一种CR1分子,其特征在于它基本上缺少一转移膜区。
56、根据权利要求55所述的CR1分子,其特征在于它由一其中被表达的细胞所分泌。
57、根据权利要求55所述的CR1分子,其特征在于它未经糖基化作用。
58、根据权利要求55所述的CR1分子,其特征在于它经糖基化作用。
59、根据权利要求55所述的CR1分子,其特征在于它起由抑制嗜中性细胞的氧化性损伤、补体传递溶血作用或者C3a和C5a产生的能力(在玻璃试管内)检测的作用。
60、根据权利要求55所述的CR1分子,其特征在于它由选自由pBSCRIC、pBSCRIS、pBM-CRIC、pBSCRIC/pTCSgpt以及pBSCRIS/pTCSgpt组成的组的一种核酸载体编码。
61、根据权利要求55所述的CR1分子,其特征在于它由选自由pT-CRICI、pT-CRIC2、pT-CRIC3、pT-CRIC4以及pT-CRIC5组成的组的一核酸载体编码。
62、根据权利要求55所述的CR1分子,其特征在于它由带有由ATCC保藏,保藏号待定的质粒pBSCRIC/pTCSgpt的一中国仓舐殉蚕赴鸇UXB11表达。
63、一种重组细胞,其特征在于它在其表面上表达权利要求41的蛋白质。
64、一种重组细胞,其特征在于它表达权利要求42、43或45的蛋白质。
65、一种重组细胞,其特征在于它表达权利要求51的蛋白质。
66、一种重组细胞,其特征在于它表达权利要求55的蛋白质。
67、一种重组细胞,其特征在于它表达权利要求56的蛋白南。
68、一种重组细胞,其特征在于它表达含有24个氨基酸的权利要求36的蛋白质的一片段,所说的片段由该细胞分泌。
69、一种CR1蛋白质或其片段的纯化方法,其特征在于它包括:
(a)获得含有CR1蛋白质或片段的样品;
(b)使所说的样品经阳离子交换高压液相层析;
(c)从高压液相层析柱洗脱所说的蛋白质或片段。
70、根据权利要求69所述的方法,其特征在于在步骤(c)之后还包括:
(d)使所说的蛋白质或片段经阴离子交换高压液相层析;
(e)用步骤(d)的高压液相层析柱洗脱所说的蛋白质或片段。
71、根据权利要求69或70所述的方法,其特征在于CR1蛋白质或片段基本上缺少一转移膜结构区。
72、一种CR1分子的纯化方法,其特征在于它包括:
(a)表达培养基一细胞中基本上缺少转移膜结构区,以致于在培养液中分泌CR1分子;
(b)获得含有CR1分子的细胞培养液的样品;
(c)使所说的样品经阳离子高压液相层析;
(d)用高压液相层析柱洗脱所说的CR1分子。
73、根据权利要求72所述的方法,其特征在于在步骤(c)之后还包括:
(d)使所说的分子经阴离子交换高压液相层析;
(e)用步骤(d)的高压液相层析柱洗脱所说的分子。
74、一种CR1分子的生成方法,其特征在于它包括使权利要求12的细胞生长。
75、一种CR1分子的生成方法,其特征在于它包括使权利要求13的细胞生长。
76、一种CR1分子的生成方法,其特征在于它包括使权利要求14的细胞生长。
77、一种CR1分子的生成方法,其特征在于它包括使权利要求15的细胞生长。
78、一种CR1分子的生成方法,其特征在于它包括使权利要求33的细胞生长。
79、一种CR1分子的生成方法,其特征在于它包括使权利要求34的细胞生长。
80、一种CR1分子的生成方法,其特征在于它包括使权利要求35的细胞生长。
81、一种CR1分子的生成方法,其特征在于它包括使权利要求36的细胞生长。
82、一种CR1分子的生成方法,其特征在于它包括使权利要求37的细胞生长。
83、一种CR1分子的生成方法,其特征在于它包括使权利要求38的细胞生长。
84、一种CR1分子的生成方法,其特征在于它包括使权利要求39的细胞生长。
85、一种CR1分子的生成方法,其特征在于它包括使权利要求40的细胞生长。
86、一种患有免疫性失调疾病或者包括不希望有的或不合适的补体活性的疾病的病人的治疗方法,其特征在于它包括把含有24氨基酸的权利要求41的蛋白质或其片段给予所说的病人。
87、一种患有免疫性失调的疾病或者包括不希望有的或不合适的补体活性的疾病的病人的治疗方法,其特征在于它包括把权利要求42或43的片段给予所说的病人。
88、一种患有免疫性失调的疾病或者包括不希望有的或不合适的补体活性的疾病的病人的治疗方法,其特征在于它包括把权利要求45的片段给予所说的病人。
89、一种患有免疫性失调的疾病或者包括不希望有的或不合适的补体活性的疾病的病人的治疗方法,其特征在于它包括把权利要求51、53或54的片段给予所说的病人。
90、一种患有免疫性失调的疾病或者包括不希望有的或不合适的补体活性的疾病的病人的治疗方法,其特征在于它包括把权利要求55的分子给予所说的病人。
91、一种患有免疫性失调的疾病或者包括不希望有的或不合适的补体活性的疾病的病人的治疗方法,其特征在于它包括把权利要求56的分子给予所说的病人。
92、一种患有免疫性失调的疾病或者包括不希望有的或不合适的补体活性的疾病的病人的治疗方法,其特征在于它包括把权利要求59的分子给予所说的病人。
93、一种患有免疫性失调疾病或者包括不希望有的或不合适的补体活性的疾病的病人的治疗方法,其特征在于它包括把权利要求62的分子给予所说的病人。
94、一种治疗或预防心肌梗塞引起病人危险的方法,其特征在于它包括把包含24氨基酸的权利要求41的蛋白质或其片段给予所说的病人。
95、一种治疗或预防心肌梗塞引起病人危险的方法,其特征在于它包括讶ɡ?5的分子给予所说的病人。
96、一种治疗或预防心肌梗塞引起病人危险的方法,其特征在于它包括把权利要求56的分子给予所说的病人。
97、一种治疗或预防心肌梗塞引起病人危险的方法,其特征在于它包括把权利要求59的分子给予所说的病人。
98、一种治疗或预防心肌梗塞引起病人危险的方法,其特征在于它包括把权利要求60或61的分子给予所说的病人。
99、一种治疗或预防心肌梗塞引起病人危险的方法,其特征在于它包括把权利要求62的分子给予所说的病人。
100、一种治疗或预防由于炎症所引起病人危险的方法,其特征在于它包括把含有24氨基酸的权利要求41的蛋白质或其片段给予所说的病人。
101、一种治疗或预防由于炎症所引起病人危险的方法,其特征在于它包括把权利要求55的分子给予所说的病人。
102、一种治疗或预防由于炎症所引起病人危险的方法,其特征在于它包括把权利要求56的分子给予所说的病人。
103、一种治疗或预防由于炎症所引起病人危险的方法,其特征在于它包括把权利要求59的分子给予所说的病人。
104、一种治疗或预防由于炎症所引起病人危险的方法,其特征在于它包括把权利要求60或61的分子给予所说的病人。
105、一种治疗或预防由于炎症所引起病人危险的方法,其特征在于它包括把权利要求62的分子给予所说的病人。
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