CN1053924C - 制备含cr1和溶血栓剂的组合物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及C3b/C4b受体(CR1)基因及其编码的蛋白质。还涉及CRI核酸顺序及其含70核苷酸的片段和其编码的含24氨基酸的肽或蛋白质。本发明还提供了CRI蛋白质及其片段的表达。本发明的基因和蛋白质用于涉及补体活性的疾病、各种免疫系统或炎症疾病的诊断和治疗。本发明实施例叙述全长CR1 cDNA及其片段的克隆、核苷酸顺序及推断的氨基酸顺序、CR1蛋白质及其片段的表达，以及缺少跨膜区的分泌CR1分子表达。该发泌CR1分子或减少炎症引起的损伤，减小心肌梗塞的大小及防止重输注损伤。

Description

制备含CR1和溶血栓剂的组合物的方法

1.简介

本发明涉及C3b/C4b受体(CR1)基因及其编码的蛋白质。本发明还涉及CR1的核酸顺序及其含有70个核苷酸的片段和它们编码的含有24个氨基酸的肽或蛋白质。本发明还提供了CR1蛋白质及其片段的表达。CR1核酸和蛋白质已被用于诊断或治疗涉及补体活性的疾病和各种炎症以及免疫性疾病。

2.发明背景

2.1补体系统

补体系统是一组蛋白质，它们构成了人体正常血清中球蛋白的10％(Hood，L.E.等人，1984，《Immunology》，第2版，The Ben-jamin/Cummings出版公司，Menlo Park，加州，第339页)。补体(C)在介导免疫和过敏反应中起着重要的作用(Rapp，H.J.和Borsos，T.1970，Molecular Basis of Complement Action，Appleton-Century-Crofts(Meredith)，NewYork)。补体组分的激活导致了包括介导与补体依赖性疾病有关的炎症的趋化肽在内的一组因子产生。补体级联放大的连续活化可通过包含抗原-抗体复合体的经典型途径产生，或可通过包括识别某种细胞壁多糖蹦旁路途径产生。通过的活的补体蛋扒质而介导的活性包括靶细胞的裂解，趋化性，调理作用，血管和其它平滑肌细胞的刺激，和诸如乳房细胞失粒的功能性紊乱，增加的小血管渗透性，白细胞的定向迁移和B淋巴细胞和巨噬细胞的活化(Eisen，H.N.1974，Immunology，Harp-er & Row出版公司，Hagerstown，Maryland，第512页)。

在蛋白质水解级联放大步骤中，生物活性肽片段，过敏毒素C3a，C4a和C5a(可参考WHO Scientific Group，1977，WHOTech.Rep.Ser 606：5，此处列为参考)从第3(C3)，第4(C4)和第5(C5)天然补体组分(Hugli，T.E.1981，CRC Crit.Rev.Immunol.1：321；Bult，H和Herman，A.G，1983，Agents Actions 13：405)中释放出来。

2.2 C3b/C4b补体受体(CR1)

人体C3b/C4b受体(称为CR1)存在于红细胞，单核细胞/巨噬细胞，粒细胞，B细胞，部分T细胞，脾卵泡树突状细胞和肾小球足状突细胞中(Fearon，D.T.1980，J.Exp.Med.152：20；Wilson，J.G.等人，1983，J.Immunol.131：684： Reynes.M.等人，1985，J.Immunol.135：2687；Gelfand，M.C.等人，1976，N，Engl.J.Med.295：10；Kazatchkine，M.D.等人，1982，Clin.Immunol.Immunopathol.27：170)。CR1特异性地与C3b，C4b和iC3b结合。在血浆中已发现了一种具有配体结合活性且与膜相关CR1具有相同分子量的可溶形式的受体(Yoon，SH.和Fearon，D.T.1985，J.Immunol，134：3332)。CR1与已与免疫复合体和其它补体激活因子共价连接的C3b和C4b结合，它们相互作用的结果取决于载有该受体的细胞类型(Fearon，D.T.和Wong.W.W.1983，Ann，Rev，Immunol 1：243)，红细胞CR1与免疫复合体结合以转移至肝中(Cornacoff J.B.等人，1983，J.Clin，Invest 71：236； Medof M.E.等人，1982，J.Exp，Med，156：1739)。而嗜中性粒细胞和单核细胞的CR1则通过外膜纹孔的吸附性胞吞作用(Fearon D.T.等人，1981，J.Exp.Med.153：1615；Abrahamson D.R.和Fearon D.T.1983，Lab，Invest.48：162)或通过用佛波醇酯，趋化肽或存在于细胞外基质中的蛋白质，如纤维结合素(Tibronectin)和海带氨酸(Laminin)激活受体后的吞噬作用(Newman.S.L.等人，1980，J，Immunol，125，2236；Wright S.D和Silverstein S.C 1982，J.Exp，Med.156：149；Wright S.D.等人，1983，J.Exp Med.158：1338)使连接的复合物内在化。CR1的磷酸化可能对获得吞噬活性起作用(Changelian，P.S.和Fearon.D.T.1986，J.ExpMed.163：101)。尽管用抗CR1抗体处理这些细胞增强了它们对于亚最适剂量的美州商陆植物的有丝分裂素应答，CR1对于B淋巴细胞的作用则未完全确知(Daha，M.R.等人，1983，Immunobiol.164：227(A bstr.))。卵泡树突状细胞上的CR1有促进抗原递呈的作用(Klaus，G.G.B.等人，1980，Immunol，Rev，53：3)。

CR1还可以抑制C3/C5转化酶的经典和旁路的途径，以及可作为用因子I裂解C3b和C4b的辅助因子，这表明除了作为受体外，CR1还具有补体调节作用(Fearon，D.T.1979.Proc Natl.Acad Sci.U.S.A.76：5867；Iida，K.和Nussenzweig，V，198，J.Exp，Med.153：1138)。在补体激活的旁路途径中，双分子复合体C3b，Bb是C3激活酶(转化酶)。CR1(和H因子，在较高浓度下)可以结合列C3b上并可促进C3b，Bb的解离。此外，C3b，CR1(和C3b，H)的形成使得C3b对于由因子I引起的不可逆的蛋白水解失活作用敏感，而导致了形成失活的C3b(iC3b)。在补体激活的经典途径中，复合体C4b，2a是C3转化酶。CR1(和C4结合蛋白质，C4bp，在较高浓度下)可以结合到C4b上，也可促使C4b，2a的解离。这种结合使得C4b对于由因子I引起的不可逆蛋白水解失活作用敏感而分裂为C4c和C4d(失活的补体蛋白质)。

CR1是一种由单个多肽链组成的糖蛋白。业已发现了四种异型CR1，其分子量为增加约40,000-50,000道尔顿而各异。两种最常见的形式，F和S异型体，又称之为A和B异型体，它们的分子量分别为250,000和290,000道尔顿(Dykman，T.R.等人，1983，Proc.Natl.Acad，Sci.U.S.A.80：1698： Wong，W.W等人，1983，J，Clin.Invest，72：685)，两种较少见形式的分子量则为210,000和＞290,000道尔顿(Dykman，T.R.等人，1984，J.Exp.Med.159：691：Dykman.T.R.等人，1985，J.Immurol134：1987)。这些差异很清楚地表明了变异发生于CR1的多肽链：而不是在糖基化状态时，因为通过用胞内糖苷酶F处理纯化的受体蛋白质不能消除这些差异(Wong.W.W.等人，1983，J.Clin，Invest，72：685)，在衣霉素存在下，当受体的异型体被生物合成时，可观察到这种差异(Lublin，D.M.等人，1986.J/Biol.Chem.261：5736)。四种CR1异型体均具有C3b结合活性Dykman T.R.等人，1983，Proc，Natl，Acad.Sci，USA，80：1698；Wong W.W.等人，1983.J.Clin.Invest.72：625；Dykman T.R等人，1984，J.Exp.Med.159：691；Dykman T.R等人，1985，J Immunol，134：1787)。

在很严格的条件下，CR1 cDNA的两种不重迭的限制性片段显示出交叉杂交(Wong W.W.等人，1985.Proc.Natl.Acad，Sci.U.S.A.82：7711)。两种cDNA探针也与基因组DNA的多个限制性片段杂交，其中大部分片段与两种探针是共同的(id)。CR1中存在重复编码顺序可通过顺序比较而证实(Klickstein，L.B等人，1985，Complement 2：44(Abstr))。此外，通过将设有编码顺序的基因组探针与几个基因组限制性片段交叉杂交证实CR1基因具有重复的插入顺序(Wong W.W.等人，1986.J.Exp.Med.164：1531)。此外，与来自具有F异型体的个体的DNA相比较，来自具有较大的S异型体的个体的DNA有一个与这个基因组探针杂交的附加的限制性片段，表明基因组顺序的重复与较高分子量的CR1等位基因(id)有关。

业已表明，CR1与补体受体2型(CR2)具有同源性(WeisJ.J.等人，1986，Proc，Natl，Acad，Sci，U.S.A.83：5639-5643)。

2.3人体疾病中CR1的异常

来自几个地区的研究者报道了患有全身性红斑狼疮(SLE)的病人的红细胞中CR1的表达的减少，包括日本(Miyakawa等人，1981，Lancet 2：493-497；Minota等人，1984.Arthr，Rheum.27：1329-1335)，美国(Iida等人，1982，T.Exp.Med.155：1427-1438i Wilson等人，1982，N，Engl.J.Med，307：981-926)和欧洲(Walport等人，初.Clin.Exp，Immunol，59：547；Jouvin等人，1986，Complement 3：88-96；Holme等人，1986，Clin，Exp，Immunol 63：41-48)。将病人作为一组来看，其体内每个细胞中受体的平均数是正常人的50-60％。一份早期报道中指出红细胞中CR1的数目与疾病的活性呈反比的变化，在SLE最严重的表现期，CR1的数目最少，而在同一病人中，处于缓解期时，则观察到较多的CR1(Iida等人，1982，J.Exp，Med，155：1427-1438)。研究还发现，CR1的数目与免疫复合体的血清水平，C3d的血清水平和结合红细胞的C3dg的量呈负相关，这可能反映了补体激活免疫复合体的摄入和作为“单纯的旁观者”在红细胞上的沉积(Ross等人，1985，J，Immunol，135：2005-2014；Holme等人，1986，Clin，ExpImmunol.63：41-48，Walport等人，1985，Clin，Exp，Immunol.59：547)。我们发现红细胞上缺乏CR1的SLE的病人对于CR1具有自身抗体(Wilson等人，1985，J.Clin，Invest，76：182-190)。抗CR1的抗体效价的减少与病人的临床情况的改善和受体异常的部分逆转相应。抗CR1抗体在其它两个SLE病人身上也已检测到了(Cook等人，1986，Clin，Immunol，Immunopathol，38：135-138)。最近，通过观察到输入的红细胞中受体迅速丧失而证实了在活动期SLE和溶血性贫血病人中，红细胞CR1的后天性丧失(Walport等人，1987，Clin Exp.Immuniol，69：501-507)。

感染人体免疫缺乏病毒(HIV)病人(Tausk，F.A.等人，1986.T.Clin，Invest，78：977-982)和麻风病(Iepromatusleprosy)(Tausk，F.A等人，1985 J.Invest Dermat 85：58s-61s)的病人中已观察到了相应的CR1从红细胞上丧失。

在SLE中补体受体表达的异常不局限于红细胞CR1，SLE病人的嗜中性粒细胞的全部细胞CR1和B淋巴细胞的胞质膜CR1也已显示出发生相应缺少(Wilson等人，1986，Artbr，Rheum，29：739-747)。

在患有IV型SLE肾炎的病人中，所有可测得的CR1抗原从足状突细胞中消失，而在较不严重的SLE肾炎和非SLE型增生性肾炎，包括膜增生性肾小球性肾炎I和II型病人中，肾小球足状突细胞中CR1的表达与正常的并无不同(Kazatchkine等人，1982，J，Clin，Invest 69：900-912；Emancipator等人，1983，Clin Immunol.Immunopathol 27：170-175)。但是，患有IV型SLE肾炎的病人的红细胞CR1的数目并不比患有其它类型的肾狼疮或无肾炎的SLE病人少。(Jouvin等人，1986，Complement 3：88-96)。

在体内补体活化可促进嗜中性粒细胞的胞质膜上CR1的表达(Lee.J.等人，1984，Clin Exp.Immunol.56：205-214；MooreF.D.Jr等人，1986，N.Engl，J.Med，314：948-953)。

3.本发明的概要

本发明涉及Cb/C4b受体(CR1)基因和它编码的蛋白质。本发明还涉及CR1核酸顺序和含有70个核苷酸的片段和它们编码的含有24个氨基酸的肽或蛋白质。此外，本发明提供了CR1蛋白质及其片段的表达。本发明的基因和蛋白质可用于诊断和治疗涉及补体活性的疾病和各种免疫系统或炎症疾病。

在下面的实例章节所详细描述的本发明的特定实施例中，将描述一个全长CR1cDNA及其片段的克隆、核苷酸顺序和推断的氨基酸顺序。还将描述CR1蛋白质及其片段的表达，并可得到CR1蛋白质及其含有C3b和/或C4b结合位点并显示因子I辅助因子活性的片段的表达。

下面的实例还描述了可溶性的CR1分子的制备和纯化，这些分子对于治疗炎症反应和减小心肌梗塞范围以及预防肿块损伤的是有用的。

3.1定义

Ad2M L P  腺病毒2主要的后期启动子

C-补体

C3(ma)＝甲胺处理过的C3

C4bp C2结合蛋白质

CMV  细胞肥大病毒

CR1＝补体受体，1型，C3b/C4b受体

CR2＝补体受体，2型

DCFDA＝二氯荧光黄二乙酸酯(dichlorofluorescin

                          diacetate)

HPLC＝高压液相色谱

iC3b＝失活C3b

LHR＝长同源重复

mAb＝单克隆抗体

PAGE＝聚丙烯酰胺凝胶电泳

RPAR＝反向被动Arthrus反应

SCR＝短一致重复

SCR1＝可溶性CR1分子

4.图表说明

图1完整的CR1编码区的核苷酸和氨基酸顺序。该顺序始于在克隆λT109.1的八聚体EcoR1接头后的第一个核苷酸。该顺序的1532号核苷酸是图3中描绘的顺序中的1号核苷酸的第1个5′核苷酸。推断的氨基酸顺序，显示在与mRNA相应的链的下面。推断的由28-147号核苷酸编码的推断的信号顺序在括号内。

图2.人体CR1 cDNA的5.5kb的限制酶图谱。黑线表示cDNA，限制酶位点是H.Hind III；B，BamH I；R，EcoR I；P，Pst I；A，Apal；S，Sac I；G，Bgl II；K，Kpn I。获得该顺序的cDNA克隆显示于图的下面。箭头表示采用双脱氧核苷酸链终止方法分析顺序的方向和长度。根据限制酶图谱和重迭顺序同一性而确定cDNA克隆的方向。

图3，人体CR1 cDNA的5.5kb的核苷酸顺序。图中显示了与mRNA相应的链，碱基1(相应于图1中的碱基1532)是大多数5′克隆中EcoR I接头后的第一个碱基。终止密码子用下划线表示。在核苷酸147和148(箭头)之间发现一段110-bp顺序，用方框表示，我们认为，它表示插入顺序部分。

图4，人体CR1 cDNA的5.5kb的核苷酸顺序的点阵分析。如果90bp中至少有40bp匹配，则标绘一个斑点。沿正方形对角线划分的黑线表示与顺序本身相重合。与相重合的线相平行的另外两条黑线1.35和2.7kb代表两者一前一后，引导每一个为1.35kb的长同源重复(LHRs)。在两个LHRs之间的六条较浅的破折号线对应于～2kb的短一致重复。短一致重复(SCRs)沿长同源重复延伸出0.4kb。

图5.人体CR1的推断的氨基酸顺序。每一个残基用一字母码表示(Lehninger A.L，1975，Biochemistry，第2版，Worth印刷公司，New York，P.72)。将长同源重复中的残基排成一行以表明它们的同源性。LHR-B中的所有残基均被表示了，只有当残基不同于LHR-B中的时，才给出LHB-C和LHB-D的残基。亲水性排列于蛋白质的COOH末端下以说明假定的转移膜区。紧靠在疏水顺序后的四个带阳性电荷的残基的范围用上划线表示，而与表皮生长因子受体中的蛋白质激酶C磷酸化位点67％同源的六个氨基酸顺序用下划线表示，CR1蛋白质的图谱示于上述的顺序的上面。(TM)跨膜区，(Cy1)胞质区，(3′UT)非翻译顺序。

图6.(A)CR1的SCRs的排列。重复是从NH末端到COOH末端的1-23号，其中已增加空间以尽可能增大排列。一个残基如果在至少一半SCRs中存在，则被视为保守或保守置换。水平箭头表示一个SCR，它也是从CR1基因组克隆2.38来的顺序且由单一的外显子编码。(B)限制酶图谱，测序方法和基因组克隆入2.38的部分顺序。限制位点是：(B)Bamll I，(S)Sac I，(E)EcoR V，(K)Kpn I，(P)Pst I。水平箭头表示测序的方向和长度，垂直的箭头表示外显子—内含子分界线。

图7，已知具有该结构的蛋白质的SCRs的一致顺序的排列。在其中增加空间以尽可能增大排列。残基被视为保守如图5所示，除了只具有1或2个SCRs的那些蛋白质，其中如果残基在至少一半其它蛋白质中存在，则残基为保守的，破折号相应于非保守的位置。CR2和C2b的下划线部分表示对于这些蛋白质来说，在尚未有过公开发表的该区域的顺序资料。方框表示不变异的半胱氨酸。顺序右边的数字表示用于产生一致顺序的SCRs的数目。用于表示确定一致顺序的顺序资料的蛋白质缩写和参考是：(CR1)补体受体1型，(H)因子H(Kristenscn，T.等人，1986，J.Immunol.136：3407)，(C46p)C4结合蛋白质(Chung，L.P.等人，1985，Biochem.J.230：133)，(CR2)补体受体2型(Weis J.J.等人，1986，ProcNatl.Acad.Sci，U.S.A 83：5639)，(Ba)因子B的蛋白质水解片段(Morley B.J.和Campbell R.D.1984.EMBOJ.3：153)，(C2b)C2的蛋白水解片段(Gagnon，J.1984，Philos，Trans，R.Soc，Lond.B.Biol.Sci.306：301)，(Clr)Cl的r亚基(Leytus S.P.等人，1986，Biochemistry 25：4855)，(X IIIb)因子X III的b亚基(Ichinose A，等人，1986，Biochemistry 25：4633)，(β2GP1)β2糖蛋白I(Lozie J.等人，1984.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81：3640)，(Hap)结合珠蛋白(Kurosky，A.等人，1980，Proc.Natl.Acad，Sci，U.S.A.77：3388)，(IL-2-R)白细胞介素(interleukin)-2受体(Leonard W，J.等人，1985，Science 230：633)。星号表示不完全顺序是可以得到的。

图8.人体CR1的推断的结构图。COOH末端胞质区是位于类脂双层膜的右边。30SCRs被线性地排列在质膜的细胞外一边，括号表示LHRs。插入图是放大的单个SCR，说明三环结构。

图9.编码人体CR1的质粒pBSABCD插入的限制酶图谱。在表示含有编码顺序的区的方框中显示有来自八个cDNA克隆的九个片段，它们被连接后形成CR1结构。括号分别指出了LHR-A，-B，-C，和-D的位置。方框下面的线表示新分离的5′cDNA克隆的位置。限制酶位点是：A，Apal，B，BamH I；G，BglII，H，Hind III；K，Kpn I；M，BspM II；P，Pst I；R，EcoR I；和S，Sac I。

图10，编码LHR-A的七个SCRs的5′cDNA克隆的推断的氨基酸顺序，以及LHR-B，-C和-D相应的SCRs的这个顺序的排列。在每一个SCR中保守的四个胱氨酸用下划线表示。只有当残基与LHR-A中的不同时，LHR-B，-C和-D的残基才表示出来。

图11表达质粒piABCD和pMTABCD的限制酶图谱。PmMT和Pcmv分别代表鼠类金属硫因(metallothionein)和细胞肥大病毒最近的早期启动子。

图12，分别用piABCD(a和b组)和CDM8载体(c和d组)单独转染COS细胞，然后用YZ1单克隆抗-CR1抗体和荧光素标记的山羊抗鼠F(ab′)2间接染色的相差显微镜(a和c组)和免疫荧光显微镜(b和d组)的分析。

图13，采用表达重组CR1的COS细胞的结合C3b和C4b的分析。用piABCD(a和c组)或CDM8载体(b和d组)单独转染的COS细胞与EAC4b(lim)，3b(a和b组)或EAC4b(c和d组)一起孵育，通过相差显微镜检查玫瑰花结的形成。

图14，由转染的COS细胞表达的重组CR1的SDS-PAGE分析。分别用CDM8载体单独转染(通道1和4)和piABCD转染(通道2和5)的COS细胞，和来自于具有CR1的F和S异型的个体的红细胞(通道3和6)的表面用¹²⁵I记。用去垢剂处理的细胞溶解产物，用琼脂糖UPC10(通道1-3)和琼脂糖-YZ1(通道4-6)连续地进行免疫吸附，在非还原条件下用SDS-PAGE和放射自显影分析洗脱物。

图15，在免疫固相化重组CR1的存在下，用因子I裂解125I-C3(ma)。在因子H(通道1)，与CDM8载体单独(通道)转染的COS细胞的溶解产物预孵育的琼脂糖-UPC10(通道2)，与PiABCD转染的COS细胞的溶解产物预孵育的琼脂糖-UPC10(通道3)，用CDM8转染的COS细胞的溶解产物预孵育的琼脂糖-YZ1(通道4)，和与piABCD转染的COS细胞的溶解产物预孵育的6μl(通道5)，12μl(通道6)和25μl(通道7)的琼脂糖-YZ1存在下，用因子1处理¹²⁵I-C3(ma)的重复样品。还在无因子I的条件下，用25μl已经与piABCD转染的COS细胞(通道8)的溶解产物预孵育过的琼脂糖-YZ1处理¹²⁵I-标记的C3(ma)的样品。还原后，采用SDS-PAGE和放射自显影分析¹²⁵I-C3(ma)。

图16，编码CR1缺失型突变体的cDNA结构。在全长piABCD结构(其上显示了用于制备缺失型突变体的限制酶位点)上面，用括号表示编码四个LHRs的cDNA片段的位置。在每一个突变体中所保留的cDNA限制片段均由实线表示。限制酶位点是：A.Apa I；B.Bam I：E，BstE II和P.Pst I。

图17，CR1重组缺失型突变株与野生型CR1的F和S异型的比较。分别用琼脂糖-UPC10抗果聚糖抗体(通道1-6)，琼脂糖-YZ-1抗CR1单克隆抗体(通道7-11)和兔抗CR1抗体和琼脂糖-蛋白质A(通道12)免疫沉淀¹²⁵I表面标记红细胞(通道1和7)及分别用CDM8载体单独(通道2和8)，piABCD(通道3和9)，piBCD(通道4和10)，piCD(通道5和11)和piD(通道6和12)转染的COS细胞去垢剂处理的溶解物。在还原条件下，将洗脱物进行SDS-PAGE和放射自显影分析。

图18，在表达全长和CR1缺失型突变体的COS细胞的存在下，用因子I裂解¹²⁵I-C3(ma)。分别用CDM8载体单独(通道1和7)，piABCD(通道2和8)，piAD(通道3和9)，piBD(通道4和10)，piCD(通道5和1)，和piD(通道6和12)转染的COS细胞，在因子1缺乏(通道1-6)或存在(通道7-12)的情况下，与¹²⁵I-C3(ma)的重复样品一起孵育。并分别用因子H和因子1(通道13)和单独用因子(通道14)与¹²⁵I-C3(ma)样品一起孵育。还原后，用SDS-PAGE和放射自显影分析I-C3(ma)。

图19，描述包括CR1的每一个LHR的SCRs的类型，和决定C3b和D4b受体的专一性的预计位点的图解模型。它们的次级结合专一性用圆括号表示。

图20，保留在可溶性CR1 DNA结构中的DNA区域的示意图。全长CR1 cDNA的区域由图上面的方框表示。

图21，pTCS系列表达载体中主要成份的示意图。

图22，表达载体pTC Sgpt的图。多聚腺苷化位点来自于鼠Ig卡巴粒顺序(NBRF Nucleic database accession # Kams，bp 1306-1714)，Ad2MLP和三分区来自于Ad2顺序(NBRFNucleic database accession # Gdad2，bp 5791-6069)：SV40早1期启动子来自于SV40基因组(NBRF Nucleic Databaseaccession # GSV40W)。gpt基因，氨苄青霉素基因和细菌复制起点来自于载体pSV2gpt(ATCC Accession No.37145)。

图23.抗体亲和纯化的sCR1的4-20％ SDS-PAGE。非还原(通道1，2，3)和还原(通道4，5，6)的条件下。通道1，3：分子量标记，通道3，5：细胞培养上清原材料；通道4，6：通过抗体亲和层析法纯化的sCR1。

图24.阳离子交换HPLC洗脱图。洗脱蛋白在280nm下测定吸收值(y轴)来监测洗脱的蛋白质。流过的(0-100分钟)和洗脱的sCR1(150-165分钟)的吸收部分均被切下。X轴表示洗脱时间(以分表示)。

图25，阳离子和阴离子交换HPLC纯化的sCR1的4-20％梯度SDS-PAGE。SDS-聚丙烯酰胺凝胶在非还原条件下走电泳。通道1，一部分生物反应物的上清液；通道2，经阳离子HPLC初始缓冲液透析的一部分生物反应物的上清液；通道3，从阳离子交换HPLC柱上洗脱的sCR1峰的一部分；通道4，从阳离子交换HPLC层析柱得到的再经阴离子HPLC的初始缓冲液透析的一部分sCR1峰；通道5和6，从阴离子HPLC上洗脱的sCR1的两个不同分部的一部分。

图26.在人体嗜中性粒细胞中C5a所引起氧突增。随着C5a引起氧突增后，DCFDA被氧化并发出很亮的荧光。用流动血球计数法测定荧光强度，荧光强度对应于X轴，细胞数对应于y轴。a组：细胞的图和入口(gate)；b组：加入C5a后0分钟；c组1分钟；d组：2分钟；e组3分钟；f组：4分钟；g组：20分钟。该DCFDA分析显示C5a很敏感。

图27，在sCR1存在下，人体补体的激活显示还原的C5a活性(DCFDA分析)。a组，未刺激的细胞，b组，显示出高度荧光的无sCR1的对照物1；c组，在sCR1存在下DCFDA分析显示出荧光强度降低75％。y轴是细胞数，x轴是荧光强度。

图28，通过sCR1抑制在人血清中通过经典途径产生C5a和C3a。用抗体亲和纯化或HPLC纯化的sCR1观察到相似的图。

图29，通过重组sCR1抑制补体介导的溶血作用。用亲和纯化或HPLC纯化的sCR1观察到相似的图。

图30，在sCR1处理(左)和未处理(右)过的鼠中RPAR的粗形态。(a)两个大鼠均接受卵白蛋白静脉注射，然后用sCR1(左边的鼠)或PBS(右边的鼠)与抗卵白蛋白，纯的(左边的位置)；抗卵白蛋白，1/2稀释(中间位置)或兔IgG(右边位置)的混合物进行皮下注射。注射进行二次；顶端和底部呈现相同的结果。接受sCR1的鼠几乎无肉眼可见的变化，而来处理的鼠则显示了RPAR的全部症状。(b)由(a)得到的皮肤活体组织的皮肤表面。从未处理的鼠(右)中得到的活体组织明显地显示出肉眼可见的损害，而从sCR1处理过的鼠(左)中得到的活体组织则显示了正常的形态。

图31.从sCR1处理过的(a)和未处理的(b)鼠中得到的皮肤活体组织的光学显微镜检查。(a)观察到在血管周围聚集的多形核细胞和单核细胞，但是，未看到嗜中性粒细胞的大量渗入和红细胞的外渗。(b)可见到多形核细胞的大量渗入和红细胞的外渗。

5发明的详细描述

本发明涉及C3b/C4b受体(CR1)基因和它编码的蛋白质。本发明还涉及CR1核酸顺序及其含有70个核苷酸的片段和它们编码的包含24个氨基酸的肽或蛋白质。此外，本发明还提供了CR1蛋白质及其片段的表达。这种CR1顺序和蛋白质在炎症或免疫系统疾病，和涉及补体活性疾病的诊断和治疗中是有价值的。

在一个特例中，本发明涉及可溶性CR1分子和它们的表达，纯化和应用。在这里所采用的术语“可溶性CR1分子”意指与天然的CR1蛋白质相反，部分CR1蛋白质不能以膜蛋白质的形式在细胞表面表达。尤其是，大量缺少跨膜区的CR1分于是可溶性CR1分子。在一个较佳实例中，可溶性CR1分子被表达它们的细胞所分泌。

在下面将要详细描述的本发明的特例中，描述了全长CR1 cDNA以及其片段的克隆和全部核苷酸顺序和推断的氨基酸顺序，和编码CR1产物的表达。具有C3b和/或C4b的结合位点，且抑制因子1辅助因子活性的CR1以及其片段的表达也将描述。本发明通过可溶的，平截的CR1分子的制备和纯化而进一步加以描述。在一个特例中，这类分子被证明对于减轻炎症，减小心肌梗塞范围和防止肿块损伤的治疗是有用的。

5.1 CR1基因的分离

CR1基因的完整编码顺序及其推断的氨基酸顺序列于图1。

任何人体细胞都有可能作为CR1基因的分子克隆的核酸源。CR1基因的分离包括编码显示CR1相关结构或性能(例如，结合C3b或C4b或免疫复合体，调节吞噬作用，免疫激活作用或增殖，以及补体的调节)的蛋白质的那些DNA顺序的分离。DNA可以通过该领域已知的标准方法从克隆的DNA(如，DNA“库”)中获得，可采用化学合成，cDNA克隆，或基因组DNA克隆或它的片段的克隆；和从所需要的人体细胞中提纯(如，可参考Maniatis等人，1982，Molecular Cloning，实验室手册，Gold SpringHarbor实验室，Cold Spring Harbor，New York；GloverD.M.1985，DNA克隆：Apractical Approach，MRL Press有限公司，Oxford，U.K.Vol.1，II.)。可作为CR1基因cDNA克隆的核酸源的细胞包括(但不局限于此)单核细胞/巨噬细胞，粒细胞，B细胞，T细胞，脾卵泡树状突细胞和肾小球足状突细胞。来自于基因组DNA的克隆除编码区外还可能包含调节和内含子DNA区；来自于cDNA的克隆则仅包含外显子顺序。不管来源如何，CR1基因均应分子克隆进入用于基因增殖的合适的载体中。

在对来自于基因组DNA的基因进行分子克隆时，产生DNA片段，它们中的一些将编码所需要的CR1基因。采用不同的限制酶，DNA可在特定的位点切断。或者，在锰存在下，我们可使用DNA酶分解DNA，或DNA可通过诸如声处理方法而被物理地剪切。然后可采用包括(但不局限于此)琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳和柱层析在内的常规方法根据大小将线状的DNA片段分离。

一旦产生了DNA片段，则可用许多方法来鉴定包含CR1基因的特定DNA片段。例如，如果可以得到CR1基因或它的特定RNA，或它们的片段，并可被纯化和标记，则所产生的DNA片段就可通过与标记探针的核酸杂交进行筛选(Benton W和Davis R，1977，Science 196：180；Grunstein M和Hogness D，1975，Proc.Natl.Acad，Sci，U.S.A.72：3961)。与探针大量同源的那些DNA片段将能杂交。如果纯化的CR1专一探针得不到，则富含CR1的核酸部分可以作为探针而用于初步选择方法。作为一个实例来说，可以使用已去除了成纤维细胞表达的信息的表现B细胞cDNA的探针。也可通过限制酶酶切并根据已知的限制酶图谱(如果它是可以得到的)与预期的片段进行片段大小比较来鉴定合适的片段。在初步选择后，根据基因的性能，或它的表达产物的物理，化学或免疫性能(如后面要描述的)，可以进行进一步的选择。

CR1基因也可以通过核酸杂交然后体外翻译进行mRNA选择而被鉴定。在这个过程中，片段被用于通过杂交来分离互补的mRNAs。这些DNA顺序可代表可以得到的，纯化的CR1 DNA，或已被富集CR1顺序的DNA。

分离的mRNAs的体外翻译产物的免疫沉淀分析或功能鉴定(如，C3b或C4b的结合，或吞噬作用或免疫激活的促进，或补体调节等)识别了mRNA和含有CR1顺序的互补DNA片段。此外，通过从细胞中分离出来的多核糖体对专一地抗CR1的固相抗体的吸附，可以选择出特定的mRNAs。用选出的mRNA(来自于被吸附的多核糖体)作为模板可以合成放射标记的CR1 cDNA。然后可用放射标记的mRNA或cDNA作为探针将CR1 DNA片段从基因组其它DNA片段中识别出来。

分离CR1基因组DNA的其它方法包括(但不局限于此)从已知的顺序中化学地合成基因顺序本身或制备编码CR1基因的mRNA的cDNA。例如，如上面所描述的，用于CR1基因的cDNA克隆的RNA可以从包括(但不限于)单核细胞/巨噬细胞，粒细胞，B细胞，T细胞，树状突细胞和足状突细胞在内的细胞中分离出来。在一个较佳具体实施例中，扁桃体(lonsilar)细胞可以作为用于cDNA克隆的mRNA的来源(见后面)。在本发明范围内的其它方法也是可行的。

然后，可将经确定和分离的基因插入合适的克隆载体中。该领域已知的很多载体宿主系统均可采用。可能的载体包括(但不局限于)质粒或经修饰的病毒，但是载体系统必须与所采用的宿主细胞相容。这类载体包括(但不局限于)噬菌体，如λ衍生物；或质粒，如pBR322或pUC质粒或CDM8质粒(Seed B.1987。Nature 329：840-842)或衍生物。重组子可以通过转化，转染，感染，电刺激(electroporation)等而导入宿主细胞。

在另一个方法中，在以“鸟枪”法插入合适的克隆载体后，可以确定和分离CR1基因。在插入克隆载体前，可通过诸如大小分部分离的方法而富集CR1基因。

CR1基因被插入可以用于转化、转染或感染合适的宿主细胞的克隆载体中，这样，可产生很多基因顺序的拷贝。在一个特例中，克隆载体可以是CDM8载体，它可用于在哺乳动物宿主细胞中获得表达。插入至克隆载体内可以通过将DNA片段连接到具有互补的粘性末端的克隆载体中而完成。但是，如果在克隆载体中不存在可用于切割DNA的互补限制酶位点，则DNA分子的末端可进行酶修饰。换句话说，任何所需要的位点均可通过将核苷酸顺序(接头)连接到DNA末端而产生；这些连接接头可以包含能编码限制性核酸内切酶识别顺序的特定的化学合成的寡核苷酸。在另一个方法中，切割的载体和CR1基因可以用同聚加“尾”加以修饰。

根据DNA本身的性能，或者，根据它所编码的蛋白质的物理、免疫学的或功能的性能，可以用许多不同的方法来进行克隆的CR1基因的鉴定。例如，DNA本身可以通过将噬菌斑或菌落与标记的探针进行核酸杂交而检测(Benton W和Davis R.1977，Science196：180；Grunstein M和Hongness D，1975，Proc.Natl.Acad，Sci，U.S.A.72：3961)。或者，CR1基因的存在可以通过根据它的表达产物的性能的测定而检测。例如，可以将能产生这样的蛋白质如与已知的CR1具有相近或相同的电泳迁移，等电聚焦现象，蛋白质水解消化图谱，C3b和/或C4b和/或免疫复合体结合活性，补体调节活性，对吞噬作用或免疫制激的影响，或抗原性的cDNA克隆或能杂交选择合适的mRNAs的DNA克隆选出来。采用一种CR1抗体，用ELISA(酶连免疫吸附分析法)的方法，CR1蛋白质就可通过将标记的抗体与推测的合成CR1的克隆相结合而得以鉴定。

在一个特例中，用插入了分离的CR1基因，cDNA，或合成的DNA顺序的重组DNA分子进行的宿主细胞的转化能够产生多个基因拷贝。因此，通过使转化子生长，从转化子中分离重组DNA分子和，当需要时，从分离的重组DNA中重新得到所插入的基因，就可以获得大量的基因。

在一个特例中，在CDM8载体中的CR1 cDNA克隆可以被转染入COS(猴肾)细胞，以在细胞肥大病毒启动子的控制下进行大量的表达(见下而第8章节)。

如果最终的目的是将基因插入病毒表达载体，如牛痘病毒或腺病毒，将插入CR1基因的重组DNA分子进行修饰，以使该基因侧面与病毒顺序相接，这些病毒顺序允许在被该病毒感染的细胞内发生遗传重组从而使CR1基因能插入到病毒的基因组内。

当含CR1 DNA的克隆鉴定，生长和收集后，它的DNA插入的特性如下面5.4.1中所描述的。

当CR1基因的遗传结构已知时，就有可能操作该结构，使其最佳地用于本发明。例如，启动子DNA可以与编码CR1的顺序的5′相连接，此外，还可替代天然启动子以增加蛋白质的表达。能表达CR1缺失突变体的表达载体也可制备，以得到CR1顺序的确定的片段的表达(见下面8.3章节)。在一个特例中，可以构建能编码可呈现所需要的C3b和/或C4b结合活性(见下面9章节)的CR1蛋白质的片段(例如，结合C4b的LHR-A，或结合C3b的LHR-C)的缺失突变体。在另一个实例中，编码带有缺失跨膜区的CR1分子的表达载体可被用于制备可溶性的CR1蛋白质。在本发明的范围内，很多操作都是可能的。

5.2克隆的CR1基因的表达

编码CR1蛋白质(图1)或它的一部分的核苷酸顺序可以被插入合适的表达载体，即含有插入的蛋白编码顺序的转录和翻译所必需的成份的载体。必要的转录和翻译信号也可由天然CR1基因和/或它的侧面区所提供。各种宿主—载体系统可用于表达蛋白编码顺序。它们包括(但不局限于)被病毒(如牛症病毒，腺病毒等)感染的哺乳动物细胞系统：被病毒(如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；微生物，如包含酵母载体的酵母(菌)；或用噬菌体DNA，质粒DNA或cosmid DNA转化的细菌。这些载体的表达成份的强度和特性不同。根据所采用的宿主—载体系统，可以使用任何一种合适的转录和转译成份。例如，当在哺乳动物细胞系统中克隆时，可以采用自哺乳动物细胞的基因组或在这些细胞中生长的病毒(如腺病毒，猴病毒40，细胞肥大病毒)分离得的启动子。也可以使用由重组DNA或合成技术所制备的启动子以转录插入的顺序。

为了有效地翻译插入的蛋白编码顺序，专一起始信号也是需要的。这些信号包括ATG起始密码子和邻近的顺序。在包括其固有的起始密码子和邻近的顺序的完整CR1基因被插入合适的表达载体内的情况下，不需要附加的翻译控制信号。但是，在只有部分CR1的编码顺序被插入的情况下，一定要提供包括ATG起始密码子在内的外源翻译控制信号。此外，起始密码子必须与蛋白编码顺序的读码同相，以保证整个插入部分的翻译。这种外原翻译控制信号和起始密码子可以是各种来源的，天然或合成的均可。

上述用于将DNA片段插入载体的任何方法均可用于构建包含由合适的转录/翻译控制信号和蛋白质编码顺序所组成的嵌合基因的表达载体。这些方法可以包括体外重组DNA和合成技术和体内重组(遗传重组)。

上述用于将DNA片段插入载体的任何方法均可用于构建包含由合适的转录/翻译控制信号和蛋白质编码顺序所组成的嵌合基因的表达载体。这些方法可以包括体外重组DNA和合成技术和体内重组(遗传重组)。

在一个特例中，可溶性CR1分子可以被表达。这种可溶性分子可以通过采用重组DNA技术，删除编码CR1跨膜区的DNA顺序而制备(见下面11-14章节)。如在下面所演示的，表达可溶性CR1分子的能力不受任何一种CR1核酸顺序的遗传修饰的限制，只要删除编码CR1跨膜区的大部分的核酸顺序，就可获得可溶性的CR1结构。

含有CR1基因插入部分的表达载体可以通过三种普通的方法来鉴别：(a)DNA-DNA杂交，(b)“标记”基因的功能的存在或缺乏，和(c)插入的顺序的表达。在第一种方法中，被插入于表达载体中的外源基因的存在可以通过DNA-DNA杂交，采用含有与插入的CR1基因同源的顺序的探针，来加以检测。在第二种方法中，重组载体/宿主系统可以根据由外源基因插入载体而引起的一定的“标记”基因的功能(例如，胸腺嘧啶核苷激酶活性，耐抗生素性，转化表型，在杆状细菌中闭合体的形成等等)的存在或缺乏而加以鉴别和选择。例如，如果CR1基因被插入于载体的标记基因顺序中，包含CR1插入部分的重组子可以通过标记基因的功能的缺乏而鉴别。在第三种方法中，可以通过测定由重组子所表达的外源基因产物而鉴定重组表达载体。这种测定方法可以根据基因产物的物理，免疫或功能的特性而进行。

一旦当一个特定的重组DNA分子被鉴别和分离，则可用该领域中已知的几个方法使它增殖。当一个合适的宿主系统和生长条件被建立，则重组表达载体可以大量地繁殖和制备。

在本发明的实例中详细描述的一个特例中，携带CR1 cDNA插入部分的CDM8载体可被转染入COS细胞，在其中CR1 cDNA插入部分被表达以产生CR1蛋白质。在下面章节的实例中详细描述的一个特例中，携带相应于部分CR1编码区的CR1 cDNA插入部分的CDM8载体可被转染入COS细胞，在其中CR1或片段被表达。在下面将要描述的另一实例中，通过采用表达载体，如在11.3.1章节中所描述的pTCS载体，平截的，可溶性CR1分子可以在哺乳动物细胞中表达。如前面所述的，可以采用的表达载体包括(但不局限于)下列载体或它们的衍生物：人体或动物病毒，如牛痘病素或腺病毒；昆虫病毒，如杆状病毒；酵母载体：噬菌体载体(如λ-噬菌体载体)和质粒和cosmid DNA载体，前面例举的只是少数。

此外，可以选择一个宿主细胞系，它能调节插入顺序的表达，或按所需要的特定形式修饰和加工嵌合基因产物。在一定的诱导物存在下，一定的启动子的表达可以增强；因此，遗传工程的CR1蛋白质的表达可以控制。而且，不同的宿主细胞对于蛋白质的翻译和翻译后加工和修饰具有特定和专一的机制。可以选择合适的细胞系或宿主系统以保证所表达的异源蛋白质的所需要的修饰和加工。例如，在一个实施例中，在细菌系统中进行表达可用于产生一种具有图1中所推断的氨基酸顺序的未糖基化的CR1蛋白质。而在酵母中表达则得到一种糖基化的产物。在另一个实施例中，为了保证异源CR1蛋白质的“天然”糖基化作用，可以采用哺乳动物的COS细胞。此外，不同的载体/宿主表达系统可能影响加工反应，如产生不同程度的蛋白质裂解。在本发明的范围内，可以得到CR1蛋白质的多种不同的加工产物。

在本发明的一个较佳实施例中，可溶性CR1分子的大量制备可以如下面12.1等章节中所描述的那样进行。

5.3.表达的基因产品的鉴别和纯化

一旦表达CR1基因的重组子被鉴别了，就应该分析基因产物。这可以通过产物的物理，免疫或功能的特性的测定而完成。

CR1蛋白质可通过包括色谱法(如离子交换，亲和层析，和大小分离柱层析，高压液相层析)，离心，差异溶解性，或通过纯化蛋白质的其它常规技术而被分离和纯化。

在下面的实例中详细描述的本发明的一个较佳实例，大量的可溶性CR1可以通过包括HPLC在内的方法而纯化(见12.2等章节)。如下所述，纯化的CR1的大量制备可以通过采用一种表达系统来进行，它产生可溶性CR1作为初始物质，这就不需要对膜结合CR1用去垢剂以使之溶解。在生物反应培养物中牛胎血清浓度的减小和/或在这些培养物中采用选择性培养基就消除了在后面的纯化中从含有可溶性CR1初始物质中除去高浓度的外源蛋白质的需要。在这个较佳实例中，阳离子HPLC或阳离子HPLC，然后阴离子交换HPLC相结合的方法可以用于纯化。这样，仅以一或二个步骤，就可高产率地获得基本纯化的可溶性CR1。

或者，一旦由重组子所产生的CR1蛋白质被鉴定，则蛋白质的氨基酸顺序就可以从包含于该重组子中的嵌合基因的核苷酸顺序来推断。结果，蛋白质可以通过该领域已知的常规化学方法来合成(例如，可参考Hunkapiller M.等人，1984，Nature 310：105-111)。

在本发明的一个特例中，这种CR1蛋白质(不管是由重组DNA技术还是用化学合成方法制得的)包括(但不局限于)包含初级氨基酸顺序，图1中描绘了全部或部分氨基酸顺序包括在该顺序内的由功能相同的残基进行取代而产生同义变化(Silent Change)的改变顺序。例如，在该顺序中的一个或多个氨基酸顺序可以被一个具有相似极性的起同样功能的氨基酸所取代而产生同义置换。非保守的置换也可产生功能相同的蛋白质。

在一个实施例中，CR1顺序内的氨基酸的置换可以从该氨基酸所属的组的其他组份中选择。例如，非极性(疏水的)氨基酸包括丙酸，亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，色氨酸和蛋氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸，丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电荷(碱性)的氨基酸包括精氨酸，赖氨酸和组氨酸。带负电荷(酸性)的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。在翻译中或翻译后，进行各种不同的修饰，如糖基化，蛋白质水解等的CR1蛋白质也包括在本发明的范围内。

在下面要详细描述的本发明的一个实例中，显示了由转染的细胞表达的克隆重组CR1，它不能用SDS-PAGE方法与红细胞的F-异型体区别开来(图14)，它可介导载有C4b或C3b的羊红细胞的结合，和能够再产生CR1的配体专一性(图13)，并显示出对于切割C3(ma)的α多肽的因子1辅助因子活性(图15)。

5.4.CR1基因和蛋白质的结构

CR1基因和蛋白质的结构可以通过该领域已知的多种方法来分析，包括(但不局限于)下面描述的那些。

5.4.1.遗传分析

与CR1基因相应的克隆的DNA或cDNA可以用包括(但不局限于)Southern杂交(Southern E.M.1975，J.Mol.Biol.98：503-517)，Northern杂交(可参考Freeman等人，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80：4094-4098)，核酸限制内切酶图谱(Maniatis T.1982 MolecularCloning，实验室手册，Cold Spring Harbor实验室，ColdSpring Harbor，New York)，和DNA顺序分析在内的方法来分析。Southern和Northern杂交的杂交条件的严格程度可进行控制以保证与所用的特定CR1探针具有所需的核酸顺序的检测。例如，在不很严格的条件下，与含有编码LHR-B和LHR-C的CR1基因顺序的探针杂交可用于检测CR2核酸顺序。

限制性核酸内切酶图谱可用于粗略地确定CR1基因的遗传结构。在一个特例中，用限制酶切割可以得到如下面的图2中所示的限制酶图谱，由限制性核酸性内切酶切割所得到的限制酶图谱可以通过DNA顺序分析而得以证实。

DNA顺序分析可以通过该领域已知的任何技术来进行，包括(但不局限于)Maxam和Gilbert方法(1980，Meth.Enzymol.65：499-560)，Sanger双脱氧方法(Sanger，F.等人，1977，Proc.Natl.Acael.Sci.U.S.A.74：5463)或使用自动DNA测序仪(如，Applied Biosystems，Foster City，CA.)。CR1基因的cDNA顺序包括在后面的图1中所标绘的和在第6，第7章节所描述的顺序。

5.4.2.蛋白质分析

CR1蛋白质的氨基酸顺序可以通过从DNA顺序推断，或者直接测蛋白质的顺序，如采用自动氨基酸顺序仪。一个典型的CR1蛋白质的氨基酸顺序主要包括在图1中和下面的第6章节中详细描述的顺序。如下面所要描述的，所有F异型体CR1的编码顺序均已克隆，在切去41个氨基酸的信号肽后，成熟受体包含1998个氨基酸，其中包括形成30 SC Rs的1930残基的细胞外结构区(其中28个SC Rs被组入1HR-A，-B，-C和-D(图10))，25个氨基酸的跨单层膜区和43个氨基酸的相对较短的胞质区。

在包含多个SC Rs的C3/C4结合蛋白中，CR1是唯一具有几组组入LHRs的SCRs的。比较CR1的四个LHRs显示，每一个均由四种类型的SCRs组成，即a、b、c和d型(图19)。例如，LHR-A的SCR-1和SCR-2的顺序与LHR-B，-C和-D的前二个SCRs分别只有62％，62％和57％相同。但是，SCR-3至SCR-7与LHR-B上相应的SCRs公在一个位置上不同，SCR-3和-4与LHR-C上相应的SCRs仅在三个位置上不同(图10)。因此，LHR-A的“a”型SCRs中的一些也存在于LHR-B和-C中。与LHR-A上相应的SCRs不同的LHR-B的前二个SCRs与LHR-C上相应的SCRs有99％相同，因此，LHR-B和-C在这些位置上共有“b”型SCRs。LHR-C上的SCR-5，-6，-7只有77％与在这些位置上的LHR-A和-B的“a”型SCRs相同，被认为是“c”型SCRs。LHR-D的1-4个SCRs是相对独特的，是“d”型，而SCRs 5-7有约93％与在LHR-C中发现的“c”型相同。

CR1蛋白质顺序可进一步通过亲水性分析(Hopp T.和Woods K.1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.A，78：3824)来定性。亲水性的图可用于鉴别CR1蛋白质的疏水区和亲水区，以及编码这些区域的基因顺序的相应区域。图5描绘了CR1蛋白质的COOH末端的亲水性图。

为了预测CR1特异性二级结构区，可以进行二级结构分析(Chou P.和Fasman G.，1974，Biochcmistry 13：222)。

可以采用其它方法进行结构分析。它们包括(但不局限于)X-射线结晶学(Engstom A.1974，Biochem.Exp.Biol.11：7-13)和计算机模型(Fletterick R.和Zoller M.ceds.)，1986，Computer Graphics and Molecular  Modeling，in Current Communications in Molecular Biology，Cold Spring Harbor实验室，Cold Spring Harbor，New York)。

5.5.与CR1有关的衍生物，类似物和肽

与CR1有关的衍生物，类似物和肽的制备和使用也是可以展望的，关在本发明的范围内。这类具有所需要的免疫原性或抗原性的衍生物、类似物或肽可以被用于诸如免疫分析，免疫接种，治疗等中。这类分子保留或者抑制了一个所需要的CR1性能，例如，C3b或C4b的结合，补体活性的调节，或促进免疫刺激或吞噬作用等，它们可分别用作这些特性的诱导物，或抑制剂。

本发明的CR1相关衍生物，类似物和肽可以通过该领域已知的多种方法来制备。制备它们的操纵可在基因或蛋白质水平上进行。例如，克隆CR1基因可以通过该领域已知的多种方法(ManiatisT.1982，Molecular Cloning，实验室手册，Cold SpringHarbor实验室，Cold Spring Harbor，New York)加以改进得到。可以作核酸限制内切酶(一种或多种)将CR1顺序在合适的位点酶切，如果需要的话，再进一步用酶进行修饰，分离，并在体外连接(见下面第8章节)。在制备编码CR1相关衍生物，类似物或肽的基因时，必须十分仔细以保证经修饰的基因在编码所需要的CR1专一活性的基因区内，保留在与CR1相同的翻译阅读框架中，不被翻译终止信号打断。在一个特定的实例中，可生产出编码融合蛋白的核苷酸顺序，其组成包括部分CR1顺序和非CR1顺序。

此外，CR1基因可以在体外或体内突变，以产生和/或破坏翻译，起始，和/或终止顺序，或在编码区内产生变异和/或新的限制性核酸内切酶位点或破坏先前所存在的位点，促进在体外的进一步修饰。该领域已知的任何突变技术均可使用，包括(但不局限于)在体外直接点突变(Hutchinson C.等人，1978，J.Biol.Chem.253：6551).TAB接头的使用(Pharmacia)，等等。

CR1顺序的操纵也可以在蛋白质水平上进行。可采用已知的技术来进行几种化学修饰中的任一种，包括(但不局限于)通过溴化氰，胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶(糜蛋白酶)，木瓜蛋白酶，V8蛋白酶，NaBH的特异性化学裂解，乙酰化，甲酰化，氧化，还原；在衣霉素的存在下，代谢合成等等。

此外，CR1相关类似物和肽可以用化学方法合成。例如，与可介导所需要的活性(例如，C4b和/或C3b结合，免疫刺激，补体调节等)的一部分CR1相应的肽可以采用肽合成仪(例如，AppliedBiosystems Model 380A)来合成。

5.6.CR1的用途

5.6.1测试和诊断

CR1蛋白质、类似物、衍生物及其亚序列(subsequence)、及抗-CR1抗体可应用在测试及诊断中。本发明的具有所需的CR1性质或功能的分子可用于测试这类性质或功能。例如表现出以游离的或复合物形式连接C3b及/或C4b的CR1蛋白质或其片段可用于测定某一样品，例如病人体液中的该物质的量。

在一个特定的实例中，具有结合C3b(例如参见下述之表II、第9章)ic3b或C4b(例如参见表II)的在细胞表面表达的全长CR1或CR1缺失突变体(例如在以下的第8章所述者)可用于在同一个样品中分别测定C3b、ic3b、或C4b的水平。在另一个实施例中，用重组DNA技术构建的缺失一个跨膜序列的一个CR1蛋白或其片段被分泌并被采用。

在一个特殊的实例中，这类对C3b及/或C4b的测定可以用作对补体活性的标志，从而可用于对炎症及免疫系统疾病的诊断。这类疾病包括(但不限于)因烧伤引起的组织损伤或心肌梗塞引起的创伤成年人的呼吸窘迫综合征(shock lung)，自身免疫性疾病，诸如风湿性关节炎、全身性红斑狼疮，以及其他的涉及不希望的或不正常的补体活性的各种疾病或不适(参见文献：e.g.，Mieseher，P.A.andMuller-Eberhard，H.J.，eds.，1976，Text Book of Immunopathology，2d Ed.，Vols.I and II，Grune and Stratton，NewYork；Sandberg，A.L.，1981，in Cellular Furctions in Immunity and Inflammation，Oppenheim，J.J.et al.，eds.，Elsevier/North Holland，New York，P.373；Conrow，R.B.et al.，1980，J.Med.Chem.23：242；Regal，J.F.and Pickering，R.H.，1983，Int.J.Immunopharmacol.5：71；Jacobs H.S.，1980，Arch.Pathol.Lab.Med.104：617)。

CR1蛋白及其片断含有一个表位，可用于(但不限于)免疫测定等测试中。可以采用的免疫测定包括(但不限于)竞争性和将竞争性测定系统，采用的技术诸如放射免疫测定、ELISA(酶联免疫附试验)、“夹心式”免疫测定、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散试验、凝集试验、补体结合试验、免疫放射量测定、荧光免疫测定、蛋白A免疫测定及免疫电泳测定等，以上列举的是部分。

CR1基因及相关的核酸序列及亚序列可以用于杂交测试法。这类杂交测试法可以用于监测与CR1表达相关的炎症或免疫应答，用于诊断某些与CR1表达的变化相关的疾病状态，用于确定某个病人的CR1异型，用于检测CR1基因及相关基因(例如，CR2)的存在及/或表达。

用于进行本发明的测试的成套工具也有供应。

5.6.2治疗

CR1蛋白及其片段、衍生物及类似物可在调节CR1介导的功能上有治疗作用。这类功能包括(但不限于)以游离或复合物的形式结合C3b及/或C4b、促进吞噬作用、补体的调节、免疫刺激等等。有效剂量的本发明的CR1蛋白及相关分子对于与这些功能相关的许多疾病或不适，诸如免疫或炎症疾病(例如，如以上第5.6.1章节所述)具有治疗价值。例如，那些显示了所需活性的全长的CR1或其片段和相关分子可用于补体抑制的治疗中，通过其作为因子1辅助因子的能力，促进补体成分C3b或C4b的不可逆失活(参见：Fearon，D.T.，1979，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.76：5867；Iida，K.and Nussenzweig，V.，1981，J.Exp.Med.153：1138)，及/或其通过抑制旁路或经典的C3或C5转化酶的能力。

本发明的一个特定的实例中，可以构建一个表达载体，它编码缺乏跨膜区域的一个CR1分子(例如，使C-末端缺失，到为大多数C-末端SCR所编码的精氨酸为止)，从而产生一种，在游离或复合物形式下保持了连接C3b及/或C4b能力的可溶性CR1片段。在一个特别的实例中，这样的一种CR1蛋白可以不再显示出因子1辅助因子的活性。这种可溶性的CR1产物可施于患者体内，以便使可溶性的CR1有效地与天然的细胞表面CR1竞争地结合C3b及/或C4b，从而阻断细胞表面CR1因子1辅助因子活性，并提高补体活性。

当C3b被共价地结合到颗粒及可溶性的免疫复合体后，经过蛋白水解加工C3b失活形成ic3b及C3dg，具有两种生物学结果：阻止补体系统通过放大途径的过多的激活，以及形成可以结合非CR1的受体的配位体。由于ic3b片段不能连接B因子，因而转变成这种状态后可阻断通过另一放大途径的额外的补体激活。然而，ic3b可以与CR1及CR3结合，两种补体受体介导骨髓单核细胞的吞噬作用。因而，C3b转化成为ic3b的初级生物学结果是在不干扰由CR1-及CR3介导的对C3包被的(C3-coated)复合物的清除的情况下，中止补体的激活。相反，ic3b向C3dg的另外的转化所产生的一个片段仅与CR2作用而不与CR1及CR3作用。这种情形限制了依赖补体的载有C3dg的复合物与表达CR2的那类细胞的连结，这类细胞包括B淋巴细胞、滤泡树状突细胞，也许还包括真皮的上皮细胞、并且减少或排除了与吞噬作用型细胞的作用。这种改变的细胞联合形式的生物学结果，应该将涉及免疫应答传入期的细胞而非那些涉及清除及降解颗粒及复合物的细胞作为载有C3dg复合体的靶子。因而，CR1在治疗上不仅可用以影响清除过程，而且可用以将参与抗原递呈及抗体形成的载有CR2的细胞类型作为复合物的靶子。

在另一个实例中，能与C3b或C4b结合、及/或保留抑制旁路的或经典的C3或C5转化酶能力或保留因子1辅助因子活性的CR1蛋白或其片段可以用以促进补体的失活。在该实例中，该CR1蛋白或片段在医治那些涉及不希望的或不合适的补体活性的疾病(例如，成年呼吸窘迫症(Shock lung)，因烧伤引起的组织损伤或心脏局部缺血的病情，自身免疫性疾病，类症情况等等)方面具有价值。

在下述举例的11-14章中细述的特定的实施例，一种可溶性CR1分子被表达，它保留了所需的功能活性，例如在体外具有对经典的补体介导的血细胞胞溶，经典的C5a产生，经典的C3a的产生，或中性粒细胞的氧突增(Oxidative burst)等的抑制能力。在一个特殊的实施例中，该种可溶性的CR1分子可用于减轻炎症及其损害，或减小心肌梗塞的区域大小或预防肿块(reperfusion)损伤等等。这种体内治疗试验中有用的CR1分子可用各种现有技术中的模型系统进行测定，包括(但不限于)反相被动阿图斯氏反应(见第14.1章节)及大鼠心肌梗塞模型(见第14.3章节)。

在本发明的另一个实施例中，一个显示能抑制所需的CR1性质或功能的CR1的片段或其类似物或衍生物可用以预防或治疗与这些功能有关的疾病或不适。

已知各种传递系统可用于递送CR1及相关分子，例如，用脂质体微分子包囊法或微胶囊法、在基因治疗中用造血干细胞后代来表达等等。其它的引入的方法包括(但不限于)皮肤内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内及口服等等施用途径。

本发明还提供了药理学组合物。这些组合物包括治疗上有效量的CR1蛋白，或其类似物，衍生物，或片段，及药理学上可接受的载体。这种载体包括但不局限于盐水、缓冲盐溶液，右旋糖及水。

5.6.3联合疗法

本发明的另一方面提供了治疗血栓形成的方法，尤其是人类及动物中的急性心肌梗塞，这个方法包括给需要的人或动物服用本发明的有效量的可溶性CR1蛋白质，及有效量的溶血栓剂。

本发明还提出了将可溶性CR1蛋白质和溶血栓剂制成药物，治疗人类及动物中的血栓形成疾病。

在上述方法中，化合物可以任何方便的方式给药，如输注或药用注射，可以依次或一并给药。当依次给予本发明的可溶性CR1蛋白质和溶血栓剂时，可在接受溶血栓剂前或后使用可溶性CR1蛋白。当同时给予可溶性CR1蛋白质和溶血栓剂时，较好的方法是以包含两种药剂的药理学组合物的形式给药。因此，在本发明的另一方面，提供了一种药理学组合物，它包含一种可溶性CR1蛋白质和一种溶血栓剂，在一种药理学上可行的载体上。

在一个较佳实施例中，组合物可用常规方法加工成适合于人类静脉内给药的形式。

典型的静脉内给药的组合物为在无菌等渗缓冲液中的溶液。如必要的话，组合物还可包括一种增溶剂和一种局部麻醉剂，如利多卡因，以缓解注射处的疼痛。一般来说，各组分可以单位剂量形式分别或混合提供，例如，以干燥冻干粉末或无水浓编物形式在密封的容器如安瓿或袋中，上面以活性单位形式标明活性剂的量。如组合物以输注方式给药，可将它在含无菌药学级“注射用水”或盐水的输注瓶中配药。当组合物是以注射方式给药时，需提供一安瓿元菌注射用水或盐水，以便在给药前先混合组分。

包含一个或更多个基中有一个或更多个药理学组合物组分的容器的药物包也在本发明的范围内。

使用的材料量，以及溶血栓剂对CR1蛋白质的比率，将根据血栓栓塞严重的程度及血块的位置和大小来决定。所用的精确量及给药形式需考虑到病的性质，由主治医生根据情况决定。但是，通常情况下，治疗血栓的病人一般接受每标准剂量的溶血栓剂0.5至50毫克补体制剂(可溶性CR1组分)。

用于上述联合疗法的特定的溶血栓剂为溶(血)纤维蛋白酶，包括(血)纤维蛋白溶酶原激活剂。

名词(血)纤维蛋白溶酶原激活剂包括但不局于链激酶，人体组织血纤维蛋白溶酶原激活剂(t-PA)及尿激酶(u-PA)(单链或双链形式)。这些酶可从天然来源或从组织中或通过重组DNA方法得到，在DNA重组技术中，异种宿主有机体如细菌、酵母、真菌或哺乳动物类细胞编码特定酶的基因，这一术语还包括：

(a)在EP(欧洲专利公开文本)-A-0155387和EP-A-0297882中公开的蛋白质，这二篇文献公开了具血纤维蛋白溶解活性的杂交蛋白质，该蛋白质包括二链蛋白酶中的一条链与另一个不同的二链蛋白酶的一条链连结，在杂交蛋白质中至少有一条链来自有血纤维蛋白溶解活性的蛋白酶，这样杂交蛋白质具有对血纤维蛋白溶解活性重要的催化位点，它可被一个可移动的阻遏基团阻遏；

(b)EP-A-0152736公开的蛋白质结合物，如可逆性阻遏的的血纤维蛋白溶酶连接的尿激酶；

(c)由EP-A-155388公开的血纤维蛋白溶解酶的衍生物，其中酶上的与血纤维蛋白溶解活性有关的催化位点被一种人体蛋白所阻遏，该蛋白通过可逆性连接基团而附着在其上，例如尿激酶可逆地与人类血纤维蛋白溶酶活性中心连接；

(d)EP-A-0183503公开的结合物，包括一种血纤维蛋白溶解酶与一种水溶性多聚物通过一种可逆的连接基团连接；及

(e)基因工程得到衍生物，包括如EP-A-0201153、EP-A-0207589、WO(PCT出版物)-8604351、EP-0041766、EP-0213794、EP-0199574、EP-A-020334、EP-A0241208、EP-A-0241209、EP-A-0241210、EP-A-0233013、EP-A-290228、EP-A-292326、EP-A-0213794、EP-A-0231883、WO 8704722、EP-A-0242836、EP-A-0234051、EP-A-0253582、EP-A-0253241、WO-8604351、EP-A-0236040、EP-A-0200451、EP-A-0238304、EP-A-0225286、DE(西德出版物)-3537176、EP-A-0236289、WO-8601538、EP-0227462，AU(澳大利亚出版物)-08661804、WO-8703906和EP-0199574公开的自然产生血纤维蛋白溶酶原激活剂的突突蛋白质，如des(cys₅₁-asp₈₇)t-PA。

在本发明的一个特定方面，血纤维蛋白溶酶原激活剂为一个杂交分子，如EP-A-0297882所述，它包括血纤维蛋白溶酶原的5个区域通过一氨基酸顺序与t-PA或u-PA以B链连结，该B链上依次包括在残基275和276之间的t-PA的切割位点，及t-PA的264半胱氨酸残基，或者在残基158至159之间的u-PA的切割位点，及u-PA的148半胱氨酸残基。

这些杂交分子的例子包括含有一和二链变异体的血纤维蛋白溶酶原1-544/t-PA262-527，lys₇₈和glu₁变异体，及其混合物；

包括一和二链变异体的血纤维蛋白溶酶原1-544/t-PA 262-257(arg₂₇₅→gln)，lys₇₈和glu₁变异体，及其混合物；

包括一和二链变异体的血纤维蛋白溶酶原1-514/t-PA 262-257，lys₇₈和glu₁变异体，及其混合物；

包括一和二链变异体的t-PA 1-50/t-PA 88-91/pro-gly-ser/血纤维蛋白溶酶原84-544/t-PA 262-527，gly_-3，ser₁和val₄变异体，及其混合物；

包括一和二链变异体的t-PA 1-91/pro-gly-ser/血纤维蛋白溶酶原84-544/t-PA 262-527，gly_-3，ser₁和val₄变异体，及其混合物；或

包括一和二链变异体的血纤维蛋白溶酶原1-546/u-PA 137-411，lys₇₈和glu₁变异体，及其混合物。

在一较佳实施例中，在联合疗法中用的溶血栓剂是一种被可逆阻遏的体内血纤维蛋白溶解酶，具有在美国专利号4,285,932中Smith给的含意，即一种体内血纤维蛋白溶解酶，其中对血纤维蛋白溶解活性重要的催化位点被一基团所阻遏，该基团可通过水解除去，水解率为水解的恒定准一级速率在10^-6/秒至10^-3/秒之间，在等渗含水介质中进行，PH为7.4，温度为37℃。

当血纤维蛋白溶解酶为血纤维蛋白溶酶原激活剂，包括t-PA或尿激酶的丝氨酸蛋白酶区时，可移动的阻遏基因的一个例子是2-氨基苯甲酰基，其中3或4位被一个卤原子取代，也可任意地进一步被一个或多个弱吸电子或供电子基团取代，其中衍生物水解的恒定准一级速率在6.0×10^-5/秒至4.0×10^-4/秒之间，它是在一种缓冲液系统中测定的，该系统含0.05M磷酸钠，0.1M氯化钠，0.01％v/v的去垢剂包括聚氧乙烯脱水山梨糖醇含油酸基化合物，其分子量约为1300，该缓冲液PH为7.4，温度为37℃。

较佳的是，可逆阻遏的体内血纤维蛋白溶解酶是一个链激酶和血纤维蛋白溶酶原的二元复合物，更佳的是无内部键裂解的对甲氧苯甲酰链激酶/血纤维蛋白溶解酶原复合物，如美国专利号4,808,405所述，由Beecham Group Inc.以商标EMINASE销售(一般名称为anistreplase，以后称作APSAC，即甲氧苯甲酰化人类血纤维蛋白溶酶原-链激酶-激活剂复合物，参见如J.P.Monkand R.C.Heel，1987，Drugs 34：25-49)。

在一较佳实施例中，在联合疗法中用的可溶性CR1组分由核苷酸载体编码，该载体从下述组中选出，它包括pBSCRlc，pBSCR1s，pBM-CR1c，pBSCR1c/pTC Sgpt及pBSCR1s/pTC Sgpt，以及尤其是从上述的pBSCR1c/pTC Sgpt制备的(见第12章)。

在联合疗法中所用的特定溶血栓剂(有给药剂量和方法例子)如下：链激酶                  1.0-3.0兆单位  在30分钟至3小时中APSAC                   30单位         注射2-5分钟t-PA(野生型)            50-150毫克     输注6小时二链尿激酶              40-100毫克     输注6小时

                    (3-12兆单位)单链尿激酶              30-100毫克     输注5小时杂交的血纤维蛋白        20-100毫克     注射或输注溶酶原激活剂和酰基衍生物(如EP-A-0155387)血纤维蛋白              10-100毫克     注射或输注溶酶原激活剂的突变蛋白(如EP-A-0207589)

6.例子：人类C3b/C4b受体(CR1)的克隆及测序

在此详述的例子中，我们就5.5千碱基对(kb)的CR1编码区的克隆及核苷酸顺序进行了描述(Klickstein，L.B.，et al.，1987，J.Exp.Med.165：1095-1112)。

10个全长5.5kb的重叠的CR1 cDNA克隆从扁桃体库中分离出，并对其整个或部分进行测序。已经鉴定了一个自该克隆5′端开始的、向下游延伸4.7kb到中止密码子处的长的单独的开放阅读框架。它代表了预计为6kb的CR1 F异型的编码序列的80％。还确定了三个450个氨基酸的串联的长同源重复(LHRs)。胰蛋白酶肽顺序分析为CR1 F异型存在第四个LHR提供了证据。各LHR之间的氨基酸的同一性范围为自第一及第三个重复之间的70％，到第一个重复及第二个重复的氨基末端的250个氨基酸之间的99％。每个LHR包括七个60-70氨基酸的短一致重复(SCR)，类似于其它C3/C4结合蛋白，诸如补体受体2型、因子B及H、C4结合蛋白及C2的SCRs。有两个另外的SCRs将LHRs与25个氨基酸的单一的跨膜区域相连接：因而，CR1的F异型可能含有至少30个SCRs，其中的个23已被测序。预计每个SCR形成一个三环结构，四个保守的半胱氨酸形成二硫桥。作为一种半坚固结构，该线状排列的30个SCR可自质膜伸出1,140埃，并且可以促进CR1与位于免疫复合物及微生物细胞壁的空隙中的C3b及C4b的作用。43个残基的羧基末端胞质区域含有一个六个氨基酸的序列，它与被蛋白激酶C磷酸化的表皮生长因子受体序列是同源的。

6.1.材料及方法

6.1.1.CR1胰蛋白酶肽的分离及测序

CR1是用连续的Matrex红A及YZ-1单克隆抗体亲和层析法从洗过的人类红细胞上提纯的(参见：Wong，W.W.，et al.，1985，J.Immunol.Methods 82：303)。胰蛋白酶肽是用所述的连续梯度及常液反相HPLC制备并提纯的(参见：Wong，W.W.，et al.，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82：7711)。胰蛋白酶肽的分析是用一个470A蛋白质测序仪(Applied Biosystems，Inc.，Foster city，CA)进行的，而对每个降解循环的分析是通过采用一个120 PTH氨基酸分析仪(Applied Biosystems，Inc.)进行的。

6.1.2.cDNA克隆及基因组克隆的分离

如上所述，用人类扁桃体poly(A)⁺RNA在λgtll中构建了一个cDNA库(参见：Wong，W.W.，et al.，1985，Proc.Nat I.A cad.Sci.U.S.A.82：7711)。用RNA印迹杂交法，使扁桃体(tonsil)供体对于CR1的F等位基因为同型接合的(id)。在琼脂糖凝胶上进行cDNA选择，使之在克隆之前包括2至7kb的组份。该库的起始容量为每100ng cDNA有4.5×10⁶重组子，该库在大肠杆菌Y1088株中扩增。该库的筛选(Maniatis，T.，et.，al.，1982，Molecular Clonig，A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York)采用CR1探针、CR1-1(ATCC保藏号第57330号(含CR1-1质粒的大肠杆菌)、第57331号(纯化的CR1-1DNA)及CR1-2(参见：Wong，W.W.，et al.，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82：7711)，其已通过缺口转移进行放射标记达比活性为2-8×10⁸cpm/μg。杂交过程是在50％甲酰胺(使用5×SSC(1×SSC：15mM柠檬酸钠，150mM氯化钠))，在43℃下进行的，而将滤纸在60℃下于0.2×SSC中洗涤，这些条件不能用于检测CR2 cDNA克隆(参见：Weis，J.J.，et al.，1986，Proc.Natl.Acad Sci.U.S.A.83：5639)。在进行限制酶图谱及DNA序列分析之前先对阳性克隆进行两次噬菌斑纯化。

用由Sau3 AI部分酶切人类白细胞DNA所产生的15-20kb片段，在EMBL-3中组建一个基因组库。最初的容量为1.2×10⁶，并将该库在大肠杆菌P2392株中进行扩增。该库同样用cDNA探针CR1-1及CR1-2进行筛选(参见：Wong，W.W.，et al.，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82：7711)。

6.1.3 DNA顺序分析

cDNA克隆的限制性片段被亚克隆入M13mp18或M13mp19并用双脱氧核苷酸链终止法(参见：Sanger F.，et al.，1977 Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.74：5463)进行测序。通过首先用核酸外切酶III产生预定的缺失突变子的方法，全部地或部分地对一些克隆进行测序(参见：Henikoff，S.，1984，Gene 28：351)。每个区域在两条链上都进行测序，在大多数情况下，每个区域在由两个独立分离的cDNA克隆(图2)所组建的M13亚克隆上进行测序。在对序列数据进行分析时，采用了威斯康星大学遗传学计算机组设备。

6.2结果

6.2.1 CR1基因的核苷酸序列

用从CR1 cDNA克隆、λT8.3中得的CR1-1及CR1-2探针对经大小选择的扁桃体cDNA库进行筛选(Wong，W.W.，et al..1985，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82：7711)从1.5×10⁶个重组体中确定出15个阳性噬菌体，而其中的13个为不同的克隆。对其中10个进行了限制酶图谱分析，并用双脱氧核苷酸链终止法进行全部的或部分的测序。cDNA克隆根据其重叠序列的一致性(图2)而排列成直线，并且已发现其长为5.5kb(图3)。已经确定自该cDNA克隆的5′端起一直延伸至下游的4.7kb处的一个终止密码子为单一的长的开放阅读框架。在该库中CR1的编码顺序预计为6kb，依据为该非糖基化的受体的估计分子量为220,000(参见：Wong，W.W.，et al.，1983，J.Clin Invest.72：685)。因而这些克隆占了所估计的编码序列的约80％。

克隆T49.1及T55.1在其5′端含有编码序列，表明附加的5′编码及非编码序列仍待确定。在3′区域，重叠克隆T8.2、T43.1及T87.1含有由各个克隆中的相同序列所编码的跨膜及细胞质区。延伸到最远3′端的克隆T8.2含有一个无poly(A)序列的807个碱基对的不翻译序列，与克隆T6.1及T55.1中所发现的序列比较，克隆T8.3在1,406-1,497之间缺失91bp的核苷酸，而克隆T40.1在1,498-1,507之间缺失9-bp的核苷酸。这些缺失出现在具有与5′拼接位点同源序列的区域，可能表示这是mRNA中的拼接错误。克隆T49.1及T55.1在开放阅读框架的147及148核苷酸之间含有一个110bp的插入片段(图3)。该序列据判断为内含子的一部分，因为它不与扁桃体poly(A)⁺RNA印迹杂交，它含有一个5′拼接位点(参见：Breathnach，R.，et al.，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.75：4853)(图3)，它在CR1基因组克隆中位于cDNA序列的侧翼，而且，它还移动了读码。克隆T9.4在3′端含有0.88kb的插入顺序，该插入顺序不与扁桃体poly(A)⁺RNA印迹杂交。

6.2.2 CRl的核苷酸及氨基酸顺序分析

CR1的核苷酸顺序(图3)的点阵(Dot)分析揭示出有两种类型的内在同源性(图4)。第一类型的内在同源性如粗黑的实线所示，在1.35kb中存在三个正向的高度同源的串联重复。这些核苷酸顺序编码CR1的长同源重复(LHRs)。第二类型的重复由平行的虚线所示，指明具有较低同源性的区域。每隔190-210个核苷酸这些序列总要出现，并且编码CR1的短一致重复(SCRs)。

从cDNA顺序推断的氨基酸序列如图5所示，这三个LHR分别称为LHR-B、LHR-C及LHR-D，它们在图中被排成直线以示其同源性。LHR-B自残基1延伸至残基438，LHR-C相应于残基439-891，而LHR-D自残基892延伸到残基1,341。LHR-C的残基451-694 99％相同于LHR-B的残基1-244，然而与LHR-D相应残基只有61％相同。相反，LHR-C的残基695-891 91％相同于LHR-D的残基1,148-1,341，而与LHR-B相应区域只有76％相同。由此看来，LHR-C为一个杂合体，包括的序列与LHR-B的前半部，及LHR-D的后半部非常同源。

LHRs后接两个不重复的SCR，即为一个25残基的疏水片段及一个与该SCR无序列同源性的43个氨基酸COOH末端区域(图5)。

CR1编码序列的5′的1.3kb的片段为第四个LHR，即LHR-A(参见以上的图1及以下的第七章)。该结果由红细胞CR1的胰蛋白酶水解肽的分析来支持。十个胰蛋白酶水解肽具有与来自于cDNA克隆的氨基酸序列相同的序列(表I)

                      表I

         发现于衍生的氨基酸序列*中的CR1

         胰蛋白酶水解肽

肽号码      氨基酸序列            在衍生序列中残基数

66       VDFVCDEGFQLKGS-A             330-345

28       GAASL----QG-WSPEAP           732-749，1,185-

                                               1,202

49       ------------IFC-NP-AIL       805-826，1,258-

                                               1,279

35       CQALNKWEPELPSCSR             228-243，678-693

41c      DKDNFSPGQEVFYSCEPGYDLR       260-281

34b      AV-YTCDPRPORGTSFDLIGESTIR    393-417

44d      VCQPPPEILHG                  694-704，1,147-

                                               1,157

54d      VFELVGEPSIYCTSNDDQVGIWSGPAPQ 152-179，602-629

57b      YECRPEYYGRPFS                19-31，469-481

39b      LIGHSSAECILSGNAA             85-100*发现于衍生的氨基酸序列中的来自人类红细胞CR1的胰蛋白酶水解肽。

列于右手一栏内的数字范围表明该肽位于衍生氨基酸序列中的位子。在肽66、28及49中的每个破折线表明在那一轮中已确定多个残基。而在肽34b中的破折线表明在那一轮中已确定无残基。

每个LHR包括七个60-70氨基酸SCR，它们是C3及C4结合蛋白(C4bp)族的特征(图6A)。通过在线性排列的序列(图6A)中引入空间，可以观察到CR1的23个SCRs中最大的同源性。概括起来在每个重复中平均65个残基中其有29个保守。有六个残基存在于所有的SCRs中：四个半胱氨酸位于相似的相关位置上，这一点表明它们各自涉及关键的二硫键，及第二个半胱氨酸后面的色氨酸及第二个甘氨酸。(图6A)。采用周氏(chou)  及范斯曼(Fasman)的规则(参见：chou，P.Y.and Fasman，G.D.，1974，Biochemistry 13：222)对那些恒定的半胱氨酸之间顺序的二级结构的分析，作出的预言为，它具有较高的形成β-折叠的几率而具有较低的形成α-螺旋的几率。对两种CR1基因组克隆，即2.38(图6B)及2.46克隆的序列分析表明，SCR-14(图6A)是由一个单一的外显子编码的，而SCR-23的COOH的末端相应于一个外显子的末端。因而，CR1的SCRs可以被不相连的外显子编码，正如在B因子的SCRs(参见：Campbell，R.D.and Bentley，D.R.，1985，Immunol.Rev.87：19)及在1L-2-R的SCRs(参见：Leonard，W.J.，et，al.，1985，Science 230：633)所表现的那样。

将CR1 SCRs的相同序列与具有该特征性结构(图7)的超家族(Superfamily)的其它成员的SCRs相比较。这类成员不仅包括具有C3/C4结合功能的蛋白，如CR2(参见：Weis，J.J.，etal.，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83：5639)、C4bp(参见：Chung，L.P.，et al.，1985，Biochem.J.230：133)、H因子(参见：Kristensen，T.，et al.，1986，J.Immunol.136：3407)、B因子(参见：Morley，B..J.and Campbell，R.D.，1984，EMBO J.3：153；Mole，J.E.，et al.，1984，J.Biol.Chem.259：3407)及C2(参见：Bentley.D.R.and Porter，R.R.，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81：1212；Gagnon，J.，1984，Philos.Trans.R.Soc.Lond.B.Biol.Sci.306：301)，而且还包括那些还不知其有该功能的蛋白，诸如：白细胞介素(interleukin)2受体(参见：Leonard，W.J.，et.，al.，1985，Science 230：633)、β2-糖蛋白1(参见：Lozier，J.，J.et al.，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81：3640)、Clr、(参见：Leytus，S.P.，et al.，1986，Biochemistry 25：4855)、触珠蛋白α链(参见：Kurosky，A.，et al.，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.77：3388)，以及XIIIb因子(参见：Ichinose，A.，et al.，1986，Biochemistry 25：4633)。除了触珠蛋白缺乏第三个半胱氨酸外，半胱氨酸残基在所有蛋白的SCRs中都不变化。色氨酸同样也保持不变，但β2-糖蛋白I中的第五个SCR及XIIIb因子中的两个重复为例外。其它虽保守但并不在每一个SCR中都存在的残基趋向于聚集在半胱氨酸周围。在B因子及C2中仅有一个游离的巯基(参见：Christie，D.L.and Gagnon，J.，1982，Biochem.J.201：555；Parkes，C.，et al.，1983，Biochem.J.213：201)而在β2-糖蛋白I的SCRs中第一个半胱氨酸与第三个形成二硫键，而第二个与第四个形成二硫键(参见：Lozier，J.，et al.，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A81：3640)。

在衍生的CR1的氨基酸序列中，存在17个N-连接寡糖的潜在位点，而且它们均位于细胞外区域(图6A)。在存在与不存在衣霉素的情况下合成的CR1在分子量上的差异(参见：Lublin，D.M.，et al.，1986，J.Biol.Chem.261：5736)及对氨基葡萄糖含量的分析(参见：Sim，R.B.，1985，Biochem.J.232：883)表明仅有6-8N连接复合寡糖存在，说明潜在位点并未全部用上。例如，肽41C中已确定了衍生的氨基酸序列(图5)的第263残基位上为天冬酰胺(表I)，表明在该位点不存在糖基化作用。相反，在肽34b上未经确定的氨基酸也许在第395残基上对应于一个糖基化的天冬酰胺。

在5.5kb cDNA上的已确定的唯一的不重复的CR1序列位于COOH末端区域。对于该区域的二级结构的分析确定了有一个单一的25个残基的推定的跨膜片段，它具有很强的疏水性，从而具有很高的形成α-螺旋的潜力(图5)。该序列之后紧跟着四个带正电的残基，这是许多膜蛋白的特征。推测的CR1的细胞质区域包括43个残基，含有一个六个氨基酸的序列，即VHPRTL，该序列与作为在表皮生长因子(EGF)受体及crb B致癌基因产物的蛋白激酶C的磷酸化作用位点的VRKRTL有同源性(参见：Hunter，T.，etal.，1984，Nature 311：480；Davis，R.J.and Czech，M.P.，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82：1974)。扁桃体CR1的细胞质区域中不存在酪氨酸残基。

6.3讨论

通过对重叠cDNA克隆进行测序，已经获得CR1的F异型初级结构的约80％。在这个分析中发现的最为不寻常的CR1结构特点为，存在450个氨基酸的正向串联LHRs，预计有四个出现在长约2,000残基的多肽链CR1的F异型中(参见：Wong，W.W.，et al.，1983 J.Clin.Invest.72：685；Sim，R.B.，1985，Biochem.J.232：883)。这些LHRs中的三个已被克隆并测序，而其中的第四个存在的依据已由胰蛋白酶肽的分析而提供。每个LHR含有七个SCRs，它们是其它C3/C4连接蛋白的基本结构成分。在每个SCR中都有四个保守的半胱氨酸，第1与第3及第2与第4个半胱氨酸之间可能形成二硫键(参见：Lozier，J.，et al.，1984，Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.81：3640)，还有，保守的氨基酸诸如脯氨酸、甘氨酸及天冬酰胺常常出现于β-折叠中(参见：Rose，G.D.，et al.，1985，Adv.Protein Chem.37：1)，所有这些情况导致这样一个推断，即SCR是借二硫键维持而形成的一个三环结构(图8)。对半胱氨酸的这一作用的推测，通过以下的发现得到支持，即经胰蛋白酶温和处理的CR1(参见：Sim，R.B.，1985，Biochem.J.232：883)及H因子(参见：Sim，R.B.and Di Scipio，R.G.，1982，Biochem，J.205：285)当用SD S-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)在非还原条件下进行分析时发现它们作为一个完整的分子进行迁移，而当还原之后则转化成多个胰蛋白酶片段。

预计串联的重复的SCRs系列将形成一个延长的结构(图8)，与对H因子及人类C4bp的各个亚基的预计一样(参见：Sim，R.B、and Di Scipio，R.G.，1982 Biochcm.J.205：285；Whaley，K.and Ruddy，S.，1976 J.Exp.Med.144：1147：Dahlback，B.，et al.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80：3461)。对于C4bp亚基进行的电子显微镜的研究表明其大小为300×30埃(参见：Dahlback，B.，et al.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80：3461)。因为每个亚基是由8个SCRs组成的(参见：Chung，L.P.，et al.，1985，B iochem.J.230：133)，一个单独的SCR的大小计为38×30埃。假设CR1的各个SCR有相近的大小并且F异型具有30个SCR，受体可以自细胞膜向外伸展至1,140埃的距离。与对CR1结构的预言相一致的是早先的发现，即结合于中性粒细胞上的CR1的铁蛋白标记抗体常常与质膜的外层小叶相距500埃(参见：Abrahamson，D.R.and Fearon，D.T.，1983，Lab.Invest.48：162)。CR1的这种延伸的结构可以促进载有受体的细胞与共价地结合于相对地不易接近的免疫复合物及微生物细胞表面上的位点的C3b发生作用。

SCR是主要的也许是唯一的CR1的细胞质外的成分的发现为受体与H因子及C4bp的紧密关系提供了结构方面的依据，H因子和C4bp这两个原生质蛋白是由大量的SCR或主要由SCR组成的(参见：Chung，L.P.，et al.，1985，Biochem.J.230：133，Kristensen，T.，et al.，1986，J.Immunol.136：3407)。CR1最初是作为一个具有类H因子活性的红细胞膜蛋白用去垢剂溶解法分离的(参见：Fearon，D.T.，1979，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A76：5867)，随后发现当其位于原生质膜上时具有H因子及C4bp的调节功能(参见：Lida，K.and Nussenzweig V.，1981，J.Exp.Med.153：1138)。通过对CR1、H因子，及C4bp的结构多态性的遗传分析，表明编码这三种蛋白的基因是相连的(参见：de Cordoba，R.，et al.，1985，J.Exp.Med.161：1189)，最近，通过原位(in situ)杂交作用及体细胞杂合体的分析已经显示出该连接组及结构上相关的受体CR2的位置位于1号染色体长臂q32带(参见：Weis，J.H.，et al.，1987，J.Immunol.138：312)。在本研究之前，这些蛋白结构上关系的依据仅是这些蛋白质的氨基酸组成明显相似(参见：Wong，W.W.，et al.，1985，J.Immunol.Methods 82：303)。因而，本发明在CR1中至少有23个SCR的发现为受体与具有类似功能的蛋白，H因子及C4bp之间的结构关系(参见：Chung，L.P.，et al.，1985，Biochem.J.230：133：Kristensen，T.，et al.，1986，J.Immunol.136：3407)、和为受体与B因子及C2的Ba及C2b片段之间的关系提供了直接而正式的证据，B因子及C2分别为与C3b和C4b形成酶复合物的成分(参见：Morley，B.J.and Campbell，R.D.，1984，EMBOJ.3：153；Mole，J.E.，et al.，1984，J.Biol.Chem.259：3407 Bentley，D.R.and Porter，R.R.，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81：1212；Gagnon，J.，1984，Philos，Trans.R.Soc.Lond.BBiol.Sci.306：301)。然而，SCR也同样可见于几个非补体蛋白中(参见：Campbell，R.D.，and Bently，D.R.，1985，Immunol.Rev.87：19；Lozier，J.，et al.，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81：3640；Leytus，S.P.，et al.，1986，Biochemistry 25：4855：Kurosky，A.，et al.，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.77：3388；Ichinose，A.，et al.，1986，Biochemistry 25：4633)(图7)，这表明它并不一定代表一个C3/C4结合结构。

在那些具有SCR的蛋白中，CR1在将该种基本结构及遗传单位组织到较高的有序的LHR的结构单位方面是独特的。对于与S异型表达相关的基因组DNA的14.5kb BamH I片段的分析表明，在CR1中至少有一个重复基因组单位是一个含有编码至少五个SCR的外显子及与其邻侧相接的内含子的延伸了的DNA片段(参见：Wong，W.W.，et al.，1986，J.Exp.Med.164：1531)。这类研究还表明与F等位基因中存在的数目相比，S等位基因含有这类基因组单位的额外拷贝。这一观察连同胰蛋白酶肽图谱的研究(参见：Nickells，M.W.，et al.，1986 Mol.Immunol.23：661)及LHR代表了一个40-50KD的肽这一发现，使我们可以预言，相对于估计在F异型(分子量为250,000道尔顿)中有四个LHR，而在S异型(290KD)中具有一个附加的LHR。

除了提供重复方面的依据之外，LHRs的序列还表明CR1基因内存在着转变。LHR-B与LHR-D在全长范围内有67％的同源性，而LHR-C与LHR-B在NH末端四个SCR中有99％的同源性，与LHR-D在COOH末端三个SCR中有91％的同源性。在这个杂合LHR起源时这样的结构不可能通过相同亲代等位基因之间的一次单一的重组而引起，而是杂合的LHR可能通过基因转变而产生(参见：Atchison，M.and Adesnik，M.，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83：2300)，即一个LHR-C前体中的序列被存在于LHB-B或LHR-D中的序列取代了。三个LHRs中近乎完全相同的和精确的线性排列的同源顺序(图5)同样可能采用一个涉及基因转变的机制来维系。对编码该LHRs的CR1基因的那些片段的插入顺序之间的同源性程度进行分析，可以确定是基因转变还是基于功能性限制的选择严格地限制了顺序的差异。

尽管原先的研究表明CR1为单价的(参见：Wilson，J.G.，et al.，1982，N.Engl.J.Med.307：981)，而每一个LHR可能代表一个单独的C3b/C4b结合区域，从而使受体成为多价的，并且适应于与载有多个C3b及C4b分子的复合物结合。或者，各种LHR能够分别地连结C3b及C4b，(见下文，第9章)从而为在CR1中的H因子及C4bp结合活性提供结构基础。结果，如假设的结构模型(图8)所示，CR1的LHR可以代表使CR1自质膜向外延伸的结构区域，以及正如H因子中所发现的，NH₂末端区域的SCR结合C3b及C4b(参见：Sim，R.B.and Di Scipio，R.G.，1982，Biochem.J.205：285；Alsenz，J.，et al.，1984，Biochem.J224：389)。

用佛波醇酯激活蛋白质激酶C诱导了嗜中性粒细胞、单核细胞、嗜酸粒细胞(参见：Changelian，P.S.and Fearon，D.T.，1986，J.Exp.Med.163：101)中的CR1的磷酸化作用，在43个氨基酸的CR1细胞质区域具有一个与在表皮生长因子受体中被蛋白激酶C磷酸化的位点同源的序列(参见：Hunger，T.，et al.，1984，Nalure 311：480：Davis、R.J.and Czech，M.P.，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82：1974)。然而，存在于扁桃体库中三个独立克隆中的这个细胞质顺序，最有可能是在蛋白激酶C激活后来被磷酸化的B细胞CR1(参见：Changelian，P.S.and Fearon，D.T.，1986，J.Exp.Med.163：101)

7.例子：含有第四个长同源重复的CR15′DNA序列

对于CR1的部分cDNA顺序的分析显示了一种结构，在该结构中有三个450个氨基酸的LHR，即LHR-B、LHR-C、LHR-D，它们各自含有七个具有C3/C4结合蛋白特征的65个氨基酸的一致短重复(SCR)(参见上文第6章节)。在此所述的例子中，我们将通过对5′cDNA克隆测序来对第四个氨基末端LHR，即LHR-A的克隆核苷酸序列进行描述(参见：Klick tein，L.B.，et al.，1987，Complement 4：180)。对LHR-A的分析显示，在五个3′SCR中它与LHR-B的同源性有99％，面在两个5′SCR中仅有61％的同源性。

7.1材料及方法

7.1.1 cDNA库的构建

一个选择性预备的cDNA库，λHH，是用自DMSO诱导(induced)细胞中纯化的3μg poly(A)⁺RNA构建的(有下列修饰)(参见：Chirgwin，J.M.et al.，1979，Biochemstry 18：5290，Aviv，H.and Leder，P.，1972，Proc.Natl.Acad.SciU.S.A.69：1408；Ausubel，F.M.，et al.，1987，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York)。一个LK35.1，35-mer寡核苷酸，即5′-TGAAGTCATC ACAGGATTTC ACTTCACATG TGGGG-3′用以代替寡(dT)12-18，并且在第二链合成中加入40μCiαP-dCTP。三分之一的cDNA被克隆进入λgtll，并且如上文的第6.1.2所述自人类扁桃体poly(A)⁺RNA中构建了一个cDNA库。获得了750,000个独立的重组子。

7.1.2克隆的分离、探针及DNA顺序分析

用于筛选cDNA库的探针为CR1-1(参见：Wong，W.W.，et al.，1985.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82：7711)(ATCC accession no.57331)、CR-2(Wong，W.W.，et al.，supra)、CR1-4(参见：Wong，W.W.et al.，1986，J.ExpMed.164：1531)、及CR1-18，及一个252bp Sau 3A I片段，它来自cDNA克隆λH3.1的相应于图1中核苷酸101-352的0.5kb EcoR I片段。在高度严格的条件下，CR1-18仅与编码LHR-A的NH2末端SCR或者信号肽的cDNA克隆杂交。在将片段亚克隆入M13mp18及M13mp19之后(参见：Yanisch-Perron，C.et al.，1985，Gene 28：351)，通过双脱氧核苷酸技术(参见：Sanger，F.，et al.，1977，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.74：5463)对cDNA克隆插入部分进行测序。

7.2结果

一个特别预备的λgtll cDNA库，即λHH含有7.5×10⁵个重组子，是从DMSO诱导的HL-60细胞的poly(A)⁺RNA合成的cDNA。这些细胞仅仅表达那些预计有四个LHR(参见：Lapata，M.A.，et al.，1984，Nucl.Acids Res.12：5707 )的CR1F异型(参见：Lublin，D.M.，et al.，1986，J.Biol.Chem.261：5736)。引物，LK35.1，为一个反意35-mer，相应于图3所示的CR1部分的cDNA顺序的896-930核苷酸部分。这个寡核苷酸显示在反转录条件下可与LHR-B、LHR-C及LHR-D杂交。在用CR1-1及CR1-4的混合CR1 cDNA探针进行筛选的未扩增的含有3.8×10⁵个重组噬菌体的平板上确定了250个阳性克隆。挑出38个阳性克隆并进行噬菌斑提纯。来自这些克隆的经EcoR I酶切的DNA的Southern印迹是用23-mer寡核苷酸，KS23.1，即5′-CTGAGCGTAC CCAAAGGGAC AAG-3′，也就是相应于图3的部分CR1 cDNA序列的核苷酸763-785来进行筛选。该探针在高度严格的条件下，仅在编码LHR-B的顺序的一个位点进行杂交，而不与LHR-C或LHR-D的编码序列杂交。克隆λH7.1(图9)的插入部分含有三个EcoR I片段，1.0kb、0.9kb及0.4kb，其中两较大的片段与K S23.1杂交，这一点表明该克隆含有编码LHR-A的3′的七分之五及LHR-B的全部顺序。这一发现证实了LHR-A是与LHR-B是高度同源的。克隆λH3.1(图9)含有一个单独的K S23.1-阳性的1.0kb EcoR I片段，及一个在高度严格的条件下与CR1-4有弱杂交的5′0.5kb的片段。据认为该克隆含有构成完全LHR-A的额外的5′序列(5′Sequence completing LHR-A)，包括SCRs-1、SCRs-2及0.1kb的上游顺序。所有与CR1-1杂交的剩余的36个克隆，均不能用探针CR1-18检测到，该探针为不与编码LHR-B、-C或-D的序列杂交的来自克隆λH3.1的0.5kb EcoR I片段的252bp的Sau 3AI片段。

λH 3.1的DNA序列分析揭示了开放阅读框架待续至cDNA的5′末端，这表明该克隆不延续至翻译起始位点。因而，用探针CR1-18重新筛选cDNA库，即λHH及λS2T，并分别找到了一个克隆λH10.3及λT109.1。这些与CR1-18杂交的克隆的EcoRI片段和来自克隆λH3.1及λH7.1的插入部分一样被进行测序，该组成的序列列于图1中，在图1中数码为1531号之后的核苷酸为图3中的核苷酸#1。来自HL-60的cDNA克隆的重叠序列与扁桃体库是相同的。

紧靠LHR-A的上游处的克隆λH10.3及λT109.1含有相同的编码41个氨基酸，包括一个与ATG相配的被认为是真核生物翻译起始位点的(图10)NNA/GNNATGG一致顺序(参见：Kozak，M.，1986，Cell 44：283)的推定的疏水前导序列(参见：VonHeijne，G.，1986，Nucl.Acids  Res.14：4683)。位于所选的ATG上游六个密码子处，且在一个框架内终止密码子下游处的第二个ATG与该一致序列的匹配很差。CR1的该前导序列的头三个氨基酸为MGA，与所报导的CR2的一样。这两个克隆的序列偏离ATG的上游，而来自克隆λ10.3的序列据信代表了一个插入序列的一部分，这已在上文的第6章节中对CR1 cDNA的其它克隆进行了叙述。

预计信号肽的酶切(参见：Von Heijne，G.，1986，Nucl.Acids Res.14：4683)将发生于gly-46及gly-47之间，这一点表明，被阻断(blocked)的CR1 NH₂-末端(参见：Wong.，W.W.，etal.，1985，J.Immunol.Methods 82：303：Holeis，V.M.，etal.，1986，Complement3：63)可能是由于吡咯烷酮酰胺的存在引起的。这些克隆中LHR-ANH₂-末端的头两个SCR与LHR-B的相应区域仅有61％的相同，而LHR-A的SCRs3-7与LHR-B的相应SCRs(图10)有99％的相同。将LHR-A与LHR-C相比较显示，仅仅是各自的第三及第四个SCRs才有较高的同源性(99％相同)。LHR-A及LHR-D仅有68％整体同一性，在每个LHR的第六个SCR之间的最高同一性为81％。因而，CR15′cDNA序列的完全测定表明，F异型由2039个氨基酸组成，包括41个氨基酸信号肽、四个各有七个SCRs的LHRs、两个额外的COOH-末端SCRs、一个25残基的跨膜区及一个43个氨基酸的细胞质区域。有25个潜在的N-连接的糖基化位点。

7.3讨论

CR1的F异型的信号肽及NH₂-末端的初级结构，已通过对5′cDNA克隆的分离及测序而推断出来。CR1序列的高度重复的特性，使之成为制备及鉴定编码受体该区域的cDNA克隆的方法发展的关键。以一个已知在反转录条件与LHR-B、-C及-D杂交的35-mer寡核苷酸为引物，制备一个cDNA库。该引物可能也会与被预测与LHR-B具有高度的同源性的LHR-A发生杂交(参见：上文第6章节)。合适的cDNA克隆是通过采用另一个在严格条件下仅与LHR-B杂交的寡核苷酸，KS23.1，从而使找到5′cDNA克隆的几率提高的方法来检出的。发现两个克隆差不多包括了CR1的所有的残余顺序，其中一个Sau3 AI片段，CR1-18，具有十分独特的顺序可用于鉴定其它5′克隆(图9，10)。

一个来自LHR-A5′区域的250bp的探针，CR1-18，在严格的条件下不仅与7.9kb及9.2kb的CR1转录产物杂交，而且与人类扁桃体RNA的2kb的转录产物杂交。这种交叉杂交mRNA未在采用来自其它的LHRs的CR1 cDNA探针时发现，也未在来自二甲基亚砜诱导的HL-60细胞及HSB-2T类淋巴母细胞的northern印迹中发现。因而，CR1含有与两种附加的B细胞蛋白同源的序列，其一种是这种新确定的mRNA编码的，以及CR2。

8.例子：人类CR1重组子的表达

如上文所述，人类CR1 cDNA克隆已被分离，其长为7.0kb，包含一个编码2039氨基酸(图1)的开放阅读框架。假设的受体的前体形式包括一个41个氨基酸的信号肽、四个450个氨基酸的各含七个短一致重复(SCRs)的长同源重复(LHRS)、两个65个氨基酸的COOH末端SCRs、一个25个氨基酸的跨膜区域，以及一个43个氨基酸的细胞质区域。因而，该CR1 F异型含有30个SCRs。NH-末端LHR(LHR-A)(见上文的第7章节)在头两个SCR中与LHR-B的相应区域有61％的同源性，而在COOH-末端五个SCRs中有99％的同源性。八个CR1 cDNA克隆的限制性片段，拼接而形成一个全长的6.9kb的结构，并且置于小鼠金属硫因启动子的下游或巨大细胞病毒启动子的下游，随后转染入L(小鼠)细胞或者COS(猴)细胞中。重组细胞表面CR1用间接放射免疫测试法及免疫荧光法来检测。在仅用亲代载体(CR1)转染的细胞上未检测出抗原。用抗-CR1单克隆抗体对转染的、表面用¹²⁵I标记的COS(猴)细胞进行免疫沉淀测试，以及用非还原的、十二烷基磺酸盐(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳加以分析，得出一种与人类红细胞的F异型共迁移的190,000道尔顿的区带，对于正确分子量的重组CR1抗原的表达(参见：Klickstein，L.B.，et al.，1988，FASEBJ.2：A1833)为该cDNA含有人类CR1完整的编码序列提供了证据。

8.1含有完整的CR1编码序列的质粒pBSABCD的构建

我们在此描述一个编码全长(SCRs1-30)CR1蛋白的质粒载体pBSABCD的构建。

将来自cDNA克隆λT8.2的2.3kb插入部分(参见：Klickstein，L.B.，et al.，1987，J，Exp.Med，165：105；see Section 6，supra)作为一个EcoR I片段亚克隆至pUC18中，以使5′末端靠近质粒多聚接头中的Hind III位点。这质粒称为p188.2。p188.2用Apa I及Hind III酶切，对较大的4.7kb的含有CR1序列自SCR26至3′非翻译区及载体序列的片段进行胶提纯。

来自cDNA克隆λT50.1(参见：Klickstein，L.B.，et a1，1987，J.Exp.Med.165：1095 see Section 6，supra)的插入部分作为一个Eco RI片段亚克隆入M13mp 18。该噬菌体称为18R50.1。来自该克隆的复制型DNA用Hind III及ApaI进行酶切，分离其中含有CR1 SC Rs18-25的1.45kb的片段，并连接至来自pl88.2的4.7kb的片段上，再将该连接产物转化入大肠杆菌DH5α中。该质粒称为p8.250.1。

将来自cDNA克隆λT8.3(参见：Wong，W.W.，et al.，1985，Proc.Natl.A cad.Sci.U.S.A 22：7711)的0.75kb及0.93kb的EcoRI片段亚克隆入质粒pB R327。这些亚克隆分别称为pCR1-1及pCR1-2，它们分别含有11-14 SC Rs及17-21 SC Rs。EcoRI插入部分被各自从中提纯出来。用SamI酶切0.75kb pCR1-1片段，随后将其连接到用EcoRI及SmaI切开的pUC18DNA上去。分离出一种具有0.5kb的相应于SCRs12-14的插入部分的亚克隆pl81-1.1。用Hind III酶切0.93kbpC R1-2的片段，并连接到用EcoRI及Hind III切开的pUC19上，并且分离出一种含有0.27kb的包括SC R17的插入部分的亚克隆pl91-2.1。

用EeoRI酶切cDNA克隆λT6.1(参见上文第6章节、Klickstein，L.B.，et al，1987，J.Exp.Med.165：1095；Wong，W，W，et al.，1987，J，Exp.Med.164：1531)并将相应于CR1 SCR15及16的0.37kb的片段亚克隆入pBR322。该克隆称为pCR1-4，用EcoRI及SmaI酶切克隆pl81-1.1，并且分离出1.4kb的片段，用EcoRI及SmaI酶切克隆pl91-2.1(参见：Klickstein，L.B.，et al.，1987，.J，Exp.Med.，165：1095；see Section 6，supra)，分离2.0kb的片段，并连结到来自pl81-1.1的1.4kb片段上，随后将混合物转化入大肠杆菌DH5α中。获得的质粒称为pl-11-2。质粒pl-11-2用EcoRI进行酶切，通过连接插入来自pCR1-4的0.37kb的插入片段。将获得的质粒用于转化大肠杆菌DH5α。

选择一个含有0.39kb的BamH I-Hind III片段的亚克隆。该质粒称为pl42，含有CRI SC Rs12-17。将来自p8.250.1的3.5kb的Eco RI-Hind III插入片段转移到pGEM3b中。该质粒称为pG8.250.1。提纯来自p142的1.2kb Hind III片段，并且连接到已用Hind III切开的pG 8.250.1上。选择一个含有2.4kb的Pst I-ApaI插入部分的亚克隆，随后选择正确的方向。该质粒称为pCD，含有自SC R12直至3’端的C RI序列。

用Ps I切断cDNA克隆λ5′7.1(参见：Klickstein，L.B.，et al，Sepl.1987，Complement 4：180；see Section 7，supra)，随后分离出相应于SC Rs6-12的1.35kb的片段，再连接到Pst I酶切的pCD上。转化该混合物，随后选择一个含有1.35kb及1.1kb Hind III片段的亚克隆。该克隆称为pBCD。

用EcoRI酶切cDNA克隆λ5′3.1(参见：Klickstein，L.B.，et al，1987，Complement 4：180；see Section 7，supra)，并将其连接到EcoRI酶切的pUC18上。分离出一个含有1.0kb相应于SC Rs3-7的插入部分(该插入部分用凝胶提纯)的亚克隆p3.11-1。用EcoRI酶切cDNA克隆λ5′10.3(参见；Klickstein，LB.，et al，1987，Complement 4：180；see Section 7，supra)，并将含有SC Rs1及2的0.63kb插入部分亚克隆λpUC18。该克隆称为pl0.3.5。质粒pl0.3.5用EcoRI进行部分酶切，并分离出一个相应于线性质粒的3.4kb的片段，随后，连接到来自p3.11-1的1kb的片段上。在正确的插入位点及方向上含有一个1.3kb的Pst I片段的亚克隆pL A被挑出。

用EcoRI酶切cDNA克隆λT109.4(参见：Klickstein.LB.，et al，1987，Complement 4：180；see Section 7，supra)，并亚克隆入pUC18。选择一个含有相应于5′非翻译区直至前导序列及SC Rs1及2的0.55kb的EcoR I片段的亚克隆。用Pst 1及BspMII酶切质粒p109.4，并且分离出一个含有载体、前导序列及SC R1的3.0kb片段。将该片段连接到含有SC Rs2-5的来自pLA的0.81kb Pst I-BspM II片段上。该新的质粒称为pNLA。质粒pNLA先用EcoR I部分酶切再用Pst I完全酶切，将一个含有自前导序列直至SC R5的CRI序列的1.1kb的EcoR I-Pst I片段分离出来，并连到pBluescript KS+上(Stratagene，SanDiego，CA)，以在cDNA的5′端上放置一个Xho I位点。该质粒称为pXLA。

用EcoR V酶切质粒pBCD，而后用Pst I部分酶切，然后分离出一个含有自SC R6直至3′非翻译区的CR1序列的6.0kb的Pst I-EcoR V片段，接着将其连接到用Pst I及Sma I酶切过的pXLA上。所获的含有完整的CR1 cDNA编码序列的细菌表达质粒称为pBSABCD。

8.2.质粒piABCD，一种含有全部CP1编码顺序的哺乳动物表达载体的构建和鉴定

用Xho I和Not I酶切pBSABCD质粒，在业已用这些限制性内切酶酶切的表达载体CDM8(Seed，B.，1987，Nature329：840-842)的4.4kb片段中的CMV启动子的下游连接插入部分。所得的结构称之piABCD(图11)。另外，在业已用这些限制性内切酶酶切的表达载体pM T.neol中的金属硫因启动子的下游连接6.9Kb Xho I-Not I片段。所得的结构称之pMTABCD(图11)。

通过用C1、C2和¹²⁵I-C3先后处理EAC4b(lim)(Diamedix)，随后在37℃下、在含有EDTA 40mM的明胶凡罗那缓冲盐溶液中孵育60分钟，制备用免的抗体(EA)及少量的C4b[EAC4b(lim)]和每个细胞[EAc C4b(lim)，3b]12,000cpm的¹²⁵I-C3b致敏的羊红细胞。另外，把经甲胺处理的C3[C3(ma)]共价连接到用3-(2-吡啶基二硫代)丙炔酸N-羟基丁二酰亚胺酯(Sigma)处理的羊E(红细胞)上(Lambris，J.D.，et al.，1983，J.Immunol.Methods 65：277)。用纯化的C4制备EAC4b(Hammer，C.H.，et al.，1981，J.Biol.Chem.256：3995)。

采用DEAE(二乙胺乙基)-葡聚糖法，把piABCD和pMTABCD转染入COS(猴)细胞中。在经转染的细胞表面上，用抗CR1单克降抗体YZ-1免疫荧光法；和由¹²⁵I标记细胞的免疫沉淀法及非还原性SDS-PAGE，(它显示一种具有与由F异型纯合的供体的人的红细胞免疫沉淀的CR1的相同泳动速度的蛋白质)(Wong，W.W.，et al.，1983，J.Clin.Invest.72：685)；以及通过用C3b包被的羊红细胞形成玫瑰花结(Fearon，D.T.，1980，J.Exp.Med.152：20)来检测重组子CR1。天然的和重组CR1蛋白质的相同的电泳泳动速度证实CR1 F异型含有SCRs1-30。

此外，采用DEAE-葡聚糖法(Ausubel，F.M.，et al.，1987.Current Protocols in Molecular Biology，Seidman，J.G.and Struhl，K.，eds.，John Wiley & Sons，New York；Seed，B.，1987，Nature 329：840)，用双份0，2或4μg piABCD或者pMTABCD和2μg pXGH5，一种指示生长激素表达的信息质粒(Selden，R.F.，et al.，1986，Mol.Cell.Biol.6：3173)其转染鼠类L细胞。两天后收集该细胞且通过与YZ1单克隆抗CR1抗体的结合检测CR1的表达。重组体质粒DNA和CR1抗原的表达之间存在一种剂量应答关系(表II)。

                    表II

           重组CR1和人类生长激素在

         在共转染的L细胞中的剂量应答

测定板  pXGH5  pMTABCD  pIAHCD  YZI 抗CR1   生长激素

编号    (μg)   (μg)   (μg)   mAB RIA*    (ng/ml)

                                 (cpm)

  1       2      0       0       1444         120

  2       2      0       2       6058         130

  3       2      0       2       6531         140

  4       2      0       4       10620        180

  5       2      0       4       9898         80

  6       2      2       0       3111         180

  7       2      2       0       2747         160

*放射免疫测定(RIA)：

在0℃，在含有1％牛血清白蛋白和0.02％叠氮化钠的0.1ml磷酸盐缓冲液中将3×10⁵的转染细胞的重复样品与3μg/ml YZ-1抗CR1 Ig G1一起孵育60分钟(Changelian，P.S.，et al.，1985，J.Immunol.134：1851)。细胞经洗涤且重新悬浮在含有1-2μci/ml ¹²⁵I-F(ab’)山羊抗小鼠IgG或者¹²⁵I-蛋白A的0.1ml缓冲液中。在0℃下1-2小时之后，洗涤细胞且测定¹²⁵I。

质粒piABCD指导的CR1抗原的表达几乎比pMTABCD的多三倍。除了测定板5之外，培养基中的生长激素浓度的变化小于两倍。补充的实验显示，piABCD在COS细胞中的CR1抗原的瞬时表达较在L细胞中多三倍。

当由用YZ1抗CR1 mAB染色的细胞的间接免疫荧光法测定时，CR1抗原在转染的COS细胞的表面上呈束状(图12)。重组CR1在COS细胞上的这种分布类似野生型CR1在人类白细胞上的分布(Fearon et al.，1981，J.Exp.Med.153：1615)。

重组CR1的分子量通过piABCD转染的COS细胞的表面碘化、用Sepharose-YZ1的细胞裂解物的免疲沉淀。SDS-PAGE以及放射自显影术确定。重组CR1的分子量不小于190,000，相等于F异型的分子量而小于红细胞CR1的S异型的分子量(图14)。

通过在经转染的COS细胞和EAC4b或EAC4b(lim)，3b之间形成玫瑰花结来测定重组CR1的C3b结合功能和C4b结合功能。在31次单独转染中，5％-50％用质粒piABCD转染的COS细胞结合5个或5个以上EAC4b或EAC4b(lim)，3b(图13)。表达CR1的COS细胞并不同EAC4b(lim)，3bi形成玫瑰花结，虽然这种中间体与表达CR2的Raji B类淋巴母细胞形成玫瑰花结。

8.3.CR1片段的表达

如下所述，构建编码部分CR1编码顺序的表达载体(缺失突变型体)，当它们转化入COS细胞时能表达它们各自的CR1插入部分。CR1片段被表达为细胞表面蛋白质。

8.3.1缺失突变型piBCD，piABD、piACD、piAD、piBD，piCD和piD的构建

这些缺失突变型的构建是利用在4个CR1长同源重复(LHRs)的每一个接近氨基未端的同源位置中存在一个单Bsm I位点，而在CR1 cDNA的其他位置和Blucscript载体中无Bsm I位点(Stratagene，San Diego，CA)进行的。

用50单位限制性内切酶Bsm I部分酶切10微克质粒pBSABCD45分钟，并且用琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物。纯化分别对应于缺少一个、二个或三个LHRs的亲本质粒线型片段的8.55kb、7.20kb和5.85kb的DNA片段。把这三种片段中的每一片段自身连接起来，连接产物分别用于转化感受态的E.Coli DH5α使之抗氨苄青霉素。

8.55kb片段是由于pBSABCD在二个邻近的Bsm I位点上酶切而产生的，故而在连接之后有三种可能的质粒产物，pBCD、pACD或pABD，其中大写字母代表质粒中仍然存在的LHRs。这些是可通过用Sma I做的限制酶图谱区别的。从12个克隆制备DNA，用Sma I酶切和琼脂糖凝胶电泳分离。5个克隆具有二个Sma I片段，2.5kb和6.1kb对应于LHR-A的编码顺序的缺失，因此代表pBCD。3个克隆具有8.5kb单个线型片段，对应于pACD。4个克隆具有1.2kb和7.4kb两个Sma I片段，预计为LHR-C的编码顺序的缺失，形成pABD。这三种结构中的每一种的5.6kb插入部分在用Xho I和Not I双酶切之后经凝胶纯化，连接到在用相同限制性内切酶酶切之后业已经凝胶纯化的表达载体CDM8上。用连接混合物转化E.Coli DK/p3且由各自的5个克隆制备DNA。在用Sac I酶切的每种情况下都表明，在表达载体中存在缺失的CR1 cDNA插入部分，这显示了4.20kb和5.75kb的两个所预期的片段。这些质粒称之piBCD，piACD和piABD。

pBSABCD的部分酶切产生的7.20kb片段是Bsm I在三个邻近的位点上酶切的结果，或者对该大片段而言，在两个位点间有一个未被酶切的位点，这样，在转化之后可得到两种可能的产物：pAD和pCD。这些可用Xho I和Pst I双酶切来区别，在pAD情况下得到1.0kb和6.2kb两个片段，而对pCD则得到一个7.2kb线型片段。自这些质粒的每一质粒中来的4.2kb插入部分在用Xho I和NotI双酶切之后经凝胶纯化，再亚克隆入上述的CDM8。由Pst I和Bgl II双酶切表明，在表达载体中有缺失的CR1 cDNA。克隆piAD具有2.4kb和6.2kb两片段，而piCD具有一个8.6kb片段。

自pBSABCD的Bsm I酶切中来的5.85kb片段，代表一种完全酶切的产物，而单克隆pD是在转化E.Coli DH5α之后得到的。这可用Hind III和Bgl II双酶切，得到所预期的3.7kb和2.2kb两片段来证实。该克隆的2.9kb插入部分在用Xho I和Not I双酶切之后经凝胶纯化后连接到上述的表达载体上。所得piD克隆的Hind III酶切得到了预期的7.3kb片段，Xho I和Bgl II双酶切得到2.2kb和5.1kb两片段，Sac I酶切产生预期的1.5kb和5.8kb两片段。

由pBCD的Bsm I部分酶切制备质粒pBD。凝胶纯化相应于在两邻近Bsm I位点酶切产生的7.2kb线型片段，经如上所述的自身连接，再转化E.coli DH5α为抗氨苄青霉素。通过在Sma I酶切时存在1.2kb和6.0kb两片段来识别pBD。4.2kb插入部分在用Xho I和Not I双酶切之后经纯化且转移到上述的CDM8。通过在Hind III酶切后看到预期的0.8kb和7.8kb两片段证实了克隆piBD。

用¹²⁵I分别对瞬时表达piABCD、piBCD、piCD和piD的COS细胞作表面标记，再用抗CR1抗体作免疫沉淀。在还原性SDS-PAGE上，piABCD结构的产物与CR1的F异型共迁移，而缺失突变型表明约为45,000道尔顿逐渐减少，分别表示一个、二个和三个LHRs的缺失(图17)。

8.3.2.缺失突变型piP1、piE1、piE2、piE-2、piU1、piU-2和piA/D的构建

用BstE II完全酶切质粒piABCD，1.35kb(一种二联体)和8.6kb的两个片段经凝胶纯化、混合以及连接，并且使E.coli DK1/p3转化成抗氨苄青霉素和四环素。通过与CR1 cDNA探针CR1-4杂交筛选菌落(参见上述8.1节)，挑选强阻性克隆并且通过用Sma I酶切进一步筛选。piE1通过存在2.7kb和7.3kb两个片段来识别，piE2由10.0kb一个线型片段来识别。piE-2被认为是一种含有一个8.6kb Sma I片段的弱CR1-4阳性克隆。

通过用Pst I完全酶切piABCD以及凝胶纯化10.0kb大片段得到质粒piP1。连接该片段且用连接混合物转化E.coli DK1/p3。所得到的质粒piP1含有一个10.0kb Sma I片段。

通过首先用质粒pXLA转化dcm^-菌株GM271/P3，再分离DNA来制备质粒piU1和piU-2。这种DNA用Stu I和Not I双酶切，凝胶纯化3.3kb片段。质粒pBSABCD用Nsi I部分酶切，产生的4个碱基对的3′凸出通过用E.coli DNA聚合酶  的Klenow片段处理来去除。然后，用Not完全酶切1DNA，凝胶纯化5.4kb和4.0kb片段。把这些片段连接到来自pXLA的3.3kb Stu I-Not I片段上，再用连接混合物转化E.coli DH5α成抗氨苄青霉素。通过与CR1 cDNA探针CR1-4杂交筛选菌落，然后用Hind III限制性酶切进一步验证阳性克隆、对于pU1来说得到0.8kb、1.3kb和6.5kb三个片段，对于pU-2得到0.8kb和6.5kb二个片段。通过这些质粒的DNA测序证实Stu I钝化的Nsi I剪接是处于框架内。在Xho I和Not I双酶切之后，凝胶纯化分别为5.6kb和4.2kb的pU1和p-2的插入部分，再连接在如上所述的表达载体CDM8上。经用Xho I+Pst I限制性酶切证实了克隆piU1和piU-2的结构，对于piU1，得到1.2kb和8.8kb两个预期的片段，对于piU-2，得到8.7kb一线型片段。

通过首先用Ps1 I完全酶切piABCD来制备质粒piA/D。然后，用Apa I部分地酶切Pst I酶切产物，再用E.coli DNA聚合酶1的Klenow片段去除了3′凸出。随后，用琼脂糖凝胶电泳使DNA分开，分离7.5kb片段，连接并转化E.coliDK1/P3转化成抗氨苄青霉素和四环素。用Kpn I+Sac I双酶切证实了该结构，即得到0.8kb、1.5kb、1.7kb和3.3kb四个预期的片段。

9.实例：C3b和C4b结合区域的鉴定

9.1.测定和结果

将含有由它们名称的大写字母表示的LHR(s)的质粒piABCD、piAD、piCD和piD转化入COS细胞，在测定中，它们用于评定它们的编码的CR1片段结合C3b或C4b的能力。结合测定这样进行；即观测由通过在其细胞表面上表达一个全长CR1分子或者一个CR1缺失突变型(瞬时表达)的COS细胞结合C3b或C4b包被的红细胞而引起的红细胞玫瑰花结。在20℃下，用在0.02ml中有2-6×10⁸/ml的载有C3或C4的红细胞与1-4×10⁶/ml的转染细胞一起孵育60分钟。用显微镜评定形成玫瑰花结的转染细胞的百分数，将一个至少附着有五个红细胞的转染细胞计为一个玫瑰花结。其结果示于表III。

                      表III

     表达CR1的重组形式的COS细胞转染子和载有

    C3(ma)或C4(ma)的羊红细胞之间玫瑰花结的形成

             形成玫瑰花结的转染子％

             具有抗CR1的荧光转染子％

COS细胞

转染子            EC3(ma)*           EC4(ma)#

piABCD            109(3)^π            62(2)

piAD              8(3)                 107(2)

piBD              107(3)               12(2)

piCD                    127(3)          32(2)

piD                     0(3)            0(2)

piA/D                   11(2)           83(2)

piE-2                   1(1)            102(1)*每个红细胞中的C3(ma)数目，在采用这种中间体的三次试验中分别为60,000、350,000和900,000#每个红细胞中的C4(ma)数目，在采用这种中间体的二次试验中分别为160,000和140,000。π试验次数。

在三次单独试验的每一次中。根据用YZ1单克隆抗CR1抗体或者兔抗CR1抗血清免疫荧光评定表明(表III)，与EC3(ma)形成玫瑰花结的表达全长piABCD结构的COS细胞的比例与具有可检测的重组受体的百分率相似。反之，表达piD的细胞不形成玫瑰花结，这表明C3结合位点一定存在于或者要求有LHR-A、-B或-C的存在。通过论证表达piBD或piCD结构的细胞与EC3(ma)形成玫瑰花结，说明一个位点同时存在于LHR-B和LHR-C中。表达piAD、piA/D或piE-2的细胞并不具有相等的C3结合功能。由于piE-2结构与piCDM不同仅在具有LHR-A的SCR-1和-2而不是LHR-C的开头二个SCRs，故LHR-C中C3结合位点的功能必须要求这些NH₂末端的SCRS。

与EC4(ma)形成玫瑰花结的表达全长piABCD重组子的COS细胞的比例小于与EC3(ma)呈玫瑰花结的百分率，也许这反映了每个红细胞中C4(ma)较少(表III)或者每个受体中C4结合位点较少。具有全部或部分LHR-A的缺失突变型piAD、piA/D和piE-2结构与EC4(ma)的结合优于缺失突变型piBD和piCD；piD缺少这种功能。因此，CR1的C4结合位点主要存在于LHR-A中，虽然二级位点可以存在于LHR-B和-C中。piE-2结构相对于piCD具有较高呈玫瑰花结能力，说明LHR-A的SCR-1和-2与C4结合位点有关。

放射性免疫测定指出表达piABCD、piAD、piBD和piCD结构的COS细胞与YZ1单克隆抗CR1抗体的结合是显著的(表IV)。用由LHR-A的五个NH₂末端SCRs和LHR-D的三个COOH末端SCRs组成的piD或piA/D转染的细胞并不与YZ1抗CR1抗体结合，虽然这些结构的产物与多克隆抗CR1抗血清结合(表IV)。因此，YZ1表位在LHR-A、-B和-C中重复出现，但不存在于LHR-A的NH₂末端SCRs中，也不存在于或者在LHR-D中是不可接近的。

                  表IV

      单克隆和多克隆抗CR1抗体对表达

     CR1重组形式的COS细胞转染子的结合

COS细胞       结合的YZ1       结合的兔的

转染子       单克隆抗体*      多克隆抗体*

piABCD         2362             12277

piAD           2879             19891

piBD           3646             21922

piCD           2189             19926

piA/D          410              23052

piD            404              16386

CDM8           428              4886*在0℃下，用3μg/ml YZ1 Ig G1抗CR1 mAb(Changelian，P.S.，et al.，1985，J.Immunol.134：1851)或者用90μg/ml兔的1gG抗CR1抗体与3×10⁵转染细胞的重复样品在含有1％牛血清白蛋白和0.02％叠氮化钠的0.1ml磷酸盐缓冲液中孵育60分钟。细胞经洗涤且重新悬浮在含有1-2μci/ml ¹²⁵I-F(ab′)山羊抗小鼠1g G或者¹²⁵ I-蛋白A的0.1ml缓冲液中。在0℃下1-2小时之后，洗涤细胞且测定¹²⁵I。所示的数值为二次测定的平均值，每3×10⁵COS细胞中的cpm。

9.2.讨论

在每个LHR中第一个SCR的编码顺序中间找到的保守的BsmI位点使得精密地相应于LHRs的界面的一系列缺失突变型的构建有可能，并保持了开放性阅读框架和保留了形成推测的二硫键所必需的四个半胱氨酸的合适的位置(图16)。这些缺失突变型的C3(ma)和C4(ma)结合功能的比较不仅识别了具有这些特异性的LHRs，而且识别了那些对确定配位体特异性致关重要的SCRt。故而，受体的piAD、piA/D和piE-2形式(但不是piD形式)在介导转染的COS细胞和EC4(ma)之间的玫瑰花结形成方面的能力表明，LHR-A的NH₂末端的二个SCRs包含一个与这种补体蛋白质相互作用的位点(表III)。这个位点对C4(ma)仅相对专一，因为表达piAD和piA/D的转染子还能够结合EC3(ma)(表III)。由玫瑰花结测定和因子1-辅因子对C3(ma)的酶切作用证明的由piBD和piCD结构编码的受体的C3(ma)结合功能(表III，图18)指出在这些LHRs的开头二个SCRs中存在着对C3(ma)的专一性位点。这些位点也能够与C4(ma)相互作用(表III)。因此，在LHR-A、-B和-C中具有优先的但是重叠的C4和C3结合活性。

另外，表达piBD和piCD结构的COS细胞结合EC4(ma)的能力可能是编码NH2末端36氨基酸的核苷酸从LHR-A的SCR-1经过Bsm I片段的连接转到LHR-B和-C形成的。然而，这些36氨基酸单独并不使piD产物具有与C4形成玫瑰花结的功能。我们不可能排除LHR-D在这些反应中的辅助作用，因为这种LHR存在于所有用于测定功能的结构中。在CR1中发现三个性质不同的配位体识别位点，对C3b为二个和对C4b为一个(图19)，这表明，每个受体分子能够有效地结合带有多价C4b和C3b分子的复合体，尽管它们对单价配位体具有较低的亲和性(Arnaout，M.A.，et al.，1983，Immunology 48：229)。这种发现还为可溶性C4b不能阻止在带有C3b的红细胞和人类B类淋巴母细胞株系之间形成玫瑰花结提供一种解释(Gaither，T.A.，et al.，1983，J.Immunol.131：899)。CR1特别适合的可能的配位体可能是分子复合体：C4b/C3b和C3b/C3b，它们分别在经典和旁路的途径的激活过程中产生。因为四个LHRs中的三个中有不同的结合位点，所以其LHRs数目不同的CR1结构异型可能具有由配位体结合位点的数目变化而引起的重要的功能差异。虽然，在体外研究中尚未报导过F，S和F′(分别为A、B和C)异型的不同结合活性，但是推测仅有三个LHRs的较小的F异型可能具有一种削弱的清除免疫复合体的能力。据报道，F′异型可能与全身性红斑狼疮有关(Van Dyne，S.，et al.，1987，Clin.Exp.Immunol.68：570)。

10.实例：因子I-辅因子活性的证明

有人证明，在细胞表面和可溶形式中的重组CR1蛋白质及其特定的片段具有C3b因子1-辅因子活性。

用改进的一种公开发表的方法进行因子1-辅因子活性的测定(Fearon，D.T.，1979，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.76：5867)。

为测定可溶CR1和片段的因子1-辅因子的活性，用NonidetP-40使细胞表面CR1蛋白质和片段溶解，再用偶联在琼脂糖珠上的抗CR1单克隆抗体YZ-1免疫沉淀裂解液。接着用SepharoseUPC10抗果聚糖和Sepharose-YZ-1免疫沉淀1×10的转染COS细胞的去垢剂处理的裂解液。然后，通过用0.5μg ¹²⁵I-C3(ma)和200ng因子I，在37℃下与洗涤过的珠在0.05ml PBS，0.5％NP-40中孵育60分钟，测定免疫沉淀物的因子I-辅因子活性。孵育之后，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影术分析含有放射性标记的C3(ma)的上清液。放射自显影照片上的，由因子I蛋白分解功能产生的C3(ma)的α链的低分子量形式的出现表明了因子I-辅因子的活性。

为了测定细胞表面CR1和片段的因子1-辅因子活性，用0.5μg¹²⁵I-C3(ma)和0.2λg因子1孵育带有CR1表达载体(如上所述的piABCD、piAD、piBD、piCD或piD)的转染COS细胞(Fearon，D.T.，1977，J.Immunol.19：1248)且按上述分析。

细胞表面重组CR1的因子I-辅因子活性示于图15。因子1仅仅在有免疫制动的重组CR1或者因子H的情况下才使C3(ma)的α链分解成分子量为76,000和46,000的片段(图15)。自凝胶中切去相应于放射自显影照片上的带的区域，测定¹²⁵I以确定分解的α链的数量。在因子H存在下，91％的α链被分解，而在重组CR1的数量逐渐增加的情况下，则分解分别为26％、41％和55％。虽然，只用CDH8载体转染的COS细胞具有一些内源的因子I-辅因子活性，但是用piABCD、piBD和piCD转染COS细胞，这种功能会增大(图18)。在用piAD或piD转染COS细胞的情况下，未见¹²⁵I-C3(ma)的分解增大。因此，在这些结构中，只有给COS细胞提供了结合C3能力的缺失突变型piBD和piCD具有分解C3的因子I辅因子活性。

用CR1及其片段的细胞表面和溶解形式测定因子-辅因子活性的结果示于表V。

                   表V

CR1及其片段的细胞表面和溶解形式及CR1片段

         的因子I-辅因子活性

             因子1-辅因子活性^b

质粒^a        细胞表面       溶解的

piABCD            +             +

piAD              -             -

piBD              +             ND^c

piCD              +             +

piD               -             ND^da编码测定的CR1蛋白质或片段，为表达转染入COS细胞。b(+)表示辅因子活性在只用CDM8载体转染时所观测的内源水平以上的增量。c未测定d未测定，由于在LHR-D中缺少用抗CR1单克隆抗体YZ1识别的表位。

如表V所示，piABCD(编码-全长CR1蛋白质)、piBD(编码LHR-B和-D)或者piCD(编码LHR-C和-D)表达形成一种具有C3b因子I-辅因子活性的产物。这样，表V的数据提供了CR1蛋白质或其一个片段可以促使补体失活的证据。

11.实例：可溶性CR1重组子的表达

用重组DNA方法修饰CR1 cDNA，以便形成CR1或CR1片段的可溶性形式(sCR1)。在能从细胞中分泌表达蛋白质的哺乳动物系统中表达sCR1结构。与膜结合形式的CR1蛋白质不同，形成大量可溶性的多肽，不必为了获得溶液中的多肽而使它们溶解。

11.1材料和方法

11.1.1.酶切

根据制备者的建议(New England Biolabs，Inc，Beverlcy，MA)进行所有的限制性内切酶酶切，接头连接以及T4 DNA连接酶和E.Coli DNA聚合酶反应。用Morrison，D.A.，1979.Meth，Enzymol 68：326-331中的方法，使E.Coli DH1或DH5α成感受态细胞。按照Maniatis，T，.et al.，1982.Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harhor Laboratory，Cold  Spring Hrbor，New York的方法，用DNA转化感受态细菌细胞。用碱性裂解或者用沸腾法(上述的Maniatis，T.，et，al)以纯化质粒。

11.1.2.DNA片段分离

如下所示，用琼脂糖凝胶(Bio Rad，Richmond，CA)纯化DNA片段。用刀片从凝胶中切除合适的DNA带，并且把琼脂糖块置于一片石蜡膜(parafilm)上，切成较小的片再转移到一片新的石蜡膜上。捣碎琼脂糖片，把琼脂糖转移到1.5ml试管中。加入等体积苯酚(超纯级，BRL，Gaithersburg，MD)，使混合物振荡，然后在-70℃下冷冻10分钟，再离心10分钟。水相用苯酚/氯仿(1∶1)提取两次，再用氯仿提取两次。尔后，用乙醇沉淀DNA，洗涤沉淀物，经真空干燥，重新悬浮在10mM盐酸三羟甲基氨基甲烷缓冲液(Tris-HCl)，pH7.0，1mM EDTA中。

如下所述，由低熔点胶琼脂糖中分离DNA片段(FMC，Corp.，Rockland，ME)。将琼脂糖凝胶中切出来的合适的DNA带置于1.5ml试管中，在65℃下熔融15分钟。用含有0.1％十二烷基硫酸钠(SDS，超纯级，BRL，Garthersburg，MD)的苯酚提取液化凝胶。水相再用苯酚-SDS提取一次，用氯仿提取两次。然后，在2.0M乙酸铵中乙醇沉淀DNA，经干燥并重新悬浮在水中。

11.1.3.转染入哺乳动物的细胞中

通过CaPO4沉淀和Graham和Vander Eb的甘油刺激方法(1973，Virology 52：456-467)，把DNAs转染入哺乳动物细胞中。在用DNA磷酸钙制剂培养4-6小时之后，通过以吸气法去除生长培养基和1分钟内加入5ml 20％甘油DMEM培养基，使DUX B11CHO细胞受甘油刺激。然后，在完全的αMEM中洗涤两次且在该培养基中培养48小时。

11.1.4.CHO转染细胞培养

使DUX B11 CHO细胞转染子在DHFR(二氨叶酸还原酶)选择性培养基中生长，该培养基由没有核苷的αMEM培养(Gibco)组成。补充有10％经透析的胎牛血清(Gibco)和4mM L-谷氨酰胺。通过提高氨甲蝶呤(Sigma，#A-6770，Amcthopterin)的浓度使细胞生长进行扩增(Kaufman，R.J.et al.，1985，Molec.Cell Biol.5：1750-1759)。

11.1.5.可溶的CR1浓度水平测定的酶连接免疫吸附剂试验(ELISA)

11.1.5.1CR1标准

把无血红蛋白的红细胞(RBC)血影细胞去污剂裂解液用作ELISA(enzymc-liked immunosorbent assay)中的CR1标准。血影细胞按上所述制备(Wong，WW，and Fearon D.T.1987.Meth，Enzymol 150：579-585)。简言之，由红十学会获得死亡后的全血。红细胞用PBS洗涤三次，然后裂解在6份体积的低渗的裂解缓冲液(10mM Tris pH8，0.1mM PMSF(苯基甲基磺酰氟)，0.1mM TPCK(甲苯基亚磺酰氨基氯甲基酮)，aprotonin，2mM EDTA)中。血影细胞用裂解缓冲液洗涤几次，用红细胞计数器计数、分装并在-70℃下冷冻待用。对于CR1 ELISA来说，在溶解性缓冲液(10mM Tris pH8，50mM KCl，0.2％ NP4O，0.3％ DOC，6.2mM PMSF，0.2mM碘乙酰胺，aprotonin，0.1mM TPCK，2mM EDTA，0.3％NaN3)中把血影细胞稀释到1.6×10⁸血影细胞/ml，接着稀释到2.5×10⁶血影细胞/ml，用作ELISA的标准。标绘出490nm下的吸收度的曲线，任何未知的样品参照该曲线可得到相当血影细胞/ml。

11.1.5.2. CR1 ELISA

用PBS中0.4μg/ml浓度的抗CR1单克隆抗体(克隆J3D3，AMAC IOT17)(Cook，J.，et al.，1985，Molec.Immunol.22：531-538)以100μl/井包被Immulon-II试验板且在4℃培养过夜。然后丢弃抗体溶液，再通过添加封阻缓冲液(PBS中有1.0％BSA)，以300μl/井封阻试验板，在37℃下培养2小时。封阻之后，立即使用试验板或者在4℃贮存待用。

用含有0.05％ Tween-20的PBS洗涤试验板三次。以100μl/井添加样品且在37℃下培养2小时(平行作两份)如需要，用溶解缓冲液稀释样品。在每块试验板上包含标准的RBC血影细胞。在样品培养之后，洗涤试验板三次，加100ul/井的以50％ FCS，50％封阻缓冲液按1∶8000稀释的辣根过氧化物酶(HRP：horseradish peroxidase)(wilson，M.B.and Nakane，P.K.，1978，Immunof luorescerce and Related Staining Techniques，NoryhHolland Biomedical press，pp.215-224)和单克隆抗体YZI(Changelian，p.s.，et al.，1985，J，Immunol.184：1851-1858)的结合物。在37℃下培养2小时之后，再用含有0.05％ Tween-20的PBS洗涤试验板三次。每井加入100μl 0.2％浓度底物邻苯二胺(OPD)，底物缓冲液为0.36％柠檬酸H₂O、1.74％ Na₂HPO₄·7H₂O，0.1％乙基汞硫代水杨酸钠，0.4％H₂O，pH6.3。在室温下20分钟后用50μl/井2NH SO₄停止反应。记录490nm下的吸收度。

11.2.CR1编码顺序的基因修饰

CR1 cDNA由大约6,951核苷酸碱基对组成(如上图1，6，7节)。不然cDNA的转译终止信号是位于6145碱基对。蛋白质是一种膜结合受体分子，由暴露在细胞膜外表面上的四个长同源重复(LHRs)组成的加上一种约为25氨基酸的跨膜区，紧接为一延伸到细胞质中的羧基末端区，这种细胞质结构区由43氨基酸组成。我们所采用的生产可溶性CR1分子(SCR1)的方法是去除把蛋白质固定在细胞膜上的跨膜区，然后把切断的结构表达为分泌出来的多肽。

11.2.1.pBSCR1c的结构

质粒pBSABCD(上述实例8)含有核苷酸1-6860中的CR1 cDNA，缺少3′到6860核苷酸处的EcoRV位点的未翻译顺序。CR1 cDNA在碱基对5914处具有唯一的Bal I限制性的核酸内切酶识别位点，离跨膜结构区起始点有29碱基对。首先用Bal I酶切pBSABCD，以形成一个具有平头的线型分子，然后用TDNA连接酶把它连接到由两股具有以下顺序的38核苷酸互补链组成的合成的寡核苷酸上：

    5′：CCAAATGTACCTCTCGTGCACATGATGCTtaaCTCGAG

    3′：GGTTTACATGGAGAGCACGTGTACTACGAATTGAGCTC

所得的分子具有一个恢复的Bal I位点和一个经过改变的顺序，它再现了天然CR1顺序一直到并且包含在跨膜区起始点的丙氨酸残基。此外，紧跟在丙氨酸之后引入一转译终止信号(在下面情况和以上划线部分)，接着为一个Xho I限制性位点，以促进形成亚克隆改变的cDNA。

这个质粒(称之pBSCR1c)的Xho I酶切，是切割在cDNA上的加了寡核苷酸的Xho I位点和在CR1 cDNA的5′末端上pBSKS+多克隆部位中的Xho I位点，去除了cDNA插入部分(称之SCR1c)。pBSCR1c含有下列C末端顺序：

碱基No.5911：CTGGCCAAATGTACCTCTCGTGCACATGATGCTTMCTCGAG

氨基酸：     L  A  K  C  T  S  R  A  H  D  A  END XhoI

                                                  site

11.2.2. pBSCR1s的结构

如下所示，形成了缺少跨膜区的第二个sCR1结构。用Sac I酶切pBSABCD，该酶在CR1 cDNA中5485核苷酸碱基对处唯一的Sac I位点和宿主质粒的多克隆部位中的Sac I位点处被切割，该位点位于CR1 cDNA的3′末端上。这一酶切导致在cDNA的3′末端切除DNA顺序中的1375核苷酸。然后电泳去除这种片段。用T4DNA聚合酶修平所得到的含有残余SCR1 cDNA的质粒的暴露末端，再进行平末端连接。该连接中还包括Pharmacia的广谱转译终止子(catalog#27-4890-01)，Pharmacia，Inc.，piscataway，NJ)，一在全部三个阅读框架中均含有转译终止信号的自补寡聚体。连接时，插入的寡聚体为SCR1 cDNA提供了一个新的转译终止信号。

11.2.3. pBM-CR1c的结构

pBMT3 X是一种真核表达载体(Krystal，M.，et al.，1986，Proc.Natl.Acad Sci USA83：2709-2713)，它含有人类金属硫因一1A基因，它使细胞具有抵抗重金属诸如镉含量增加的能力。该载体还含有小鼠金属硫因-1基因，它含有一个位于Mt-1蛋白质的起始密码子前的构建的Xho I位点。Xho I位点作为在小鼠Mt-I启动子控制下表达基因的插入部位。

用Xho I从pBSCR1上c切下SCR1c插入部分(约为5.9kb)，然后连接到载体pBMT3 X的唯一的Xho I位点上。用限制性酶切确定pBMT3 X中SCR1插入部分的正确定向(Maniatis，T.，et al.，1982.Molecular Cloning，A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor，New York)。所得质粒称之pBM-CR1c。

11.2.4.缺失型突变体pT-CR1c1、pT-CR1c2、pT-CR1c3、pT-CR1c4和pT-CR1c5的构建

SCR1 cDNA缺失特定的部分可以构建各种不同的缺失型突变体(图20)。每种缺失型突变体均缺少全长度cDNA的跨膜区，所以突变体的表达会产生可溶性多肽。

11.2.4.1. pT-CR1c1

用 Sma I酶切pBSCR1c，获得大小分别为2.5kb和7.3kb的两个片段。它们用琼脂糖凝胶电泳分离，再纯化7.3k片段，然后自身连接。使E.coli DH52细胞成感受态(Morrison，D，A.，1979.Meth.Enzymol，68：326-331)，然后用连接混合物转化。所得质粒称之pBL-CR1c1。这种结构去除了CR1c插入部分的38％ LHR-B、100％ LHR-C及51％ LHR-D。此外，在连接处2335/4894bp上重新形成Sma I位点，保持了正确的转译框架。用Xho I酶切pT-CR1C1，把CR1插入部分与pBlueseript载体分离。然后，将分离的CR1片段插入到表达载体pTC Sgpt上唯一的Xho I位点中，形成质粒pT-CR1c1。

11.2.4.2. pT-CR1C2

用Cla I和Bal I酶切pBSCR1C，得到大小为3.96kb和5.9kb的两个片段，这两个片段用琼脂糖凝胶纯化。用Cla I和BalI酶切质粒pBR322，纯化2.9kbp BR322片段且连接到pBSCR1c中的5.9kb片段上。用连接混合物转化E.coli DH5α细胞，所得的质粒称之pBR8.8。用Xba I酶切该质粒，形成大小为7.45kb和1.35kb的两个片段。由琼脂糖凝胶纯化7.45kb片段，然后再自身连接。所得的质粒pBR7.45用Cla I和Bal I酶切，把分离得的含有SCR1 cDNA的4.5kb片段连接到pBSCR1c中的3.96kb片段上，得到质粒pBL-CR1c2。这种结构去除了SCR1插入部分中90％ LHR-B，在连接处1637/2987bp重新形成Xba I位点，且保持了正确的阅读框架。用Xho I酶切pBL-CR1c2，使SCR1插入部分与pBluescript载体分离。然后，将分离的SCR1片段插入到表达载体上pTC Sgpt上唯一的Xho I位点中，形成质粒pT-CR1c2。

11.2.4.3. pT-CR1c3

用Nsi I酶切pBSCR1c，得到大小为1.09kb、1,35kb和7.46kb的三个片段。由琼脂糖凝胶纯化7.46kb片段，再自身重连接，由此形成质粒pBL-CR1c3。这种结构去除了SCR1插入部分中77％ LHR-A和100％CHR-B。在连接处463/2907bp重新形成NsiI位点，同时保持了正确的阅读框架。用Xho I酶切pBL-CR1c3、使SCR1插入部分与pBluescript载体分离。然后，将分离的SCR1片段插入到表达载体pTC Sgpt中唯一的Xho I位点上，形成质粒pT-CR1c3。

11.2.4.4. pT-CR1c4

用Pst I酶切pBSCR1c。在把CR1 cDNA连接到该载体pBluescript上的过程中，去除了pBluescript的多聚接头区中的Pst I位点为1.35kb和8.5kb的片段，纯化8.5kb片段，再自身连接，形成质粒pBL-CR1c4。这种结构去除了SCR1插入部分的31％LHR-A和69％ LHR-B。在连接处1074/2424bp重新形成Pst I位点，由此保持了正确的阅读框架。用Xho I酶切pBL-CR1c4，使SCR1插入部分与pBlueseript载体分离。然后，把分离的SCR1片段插入到表达载体pTC Sgpt中唯一的Xho I位点上，形成质粒pT-CR1c4。

11.2.4.5.  pT-CR1c5

用Sma I酶切pBL-CR1c1，由此在唯一的Sma I位点上使质粒线性化。使该质粒去磷酸化，再连接到含有一无义密码子的经磷酸化的Nhe I接头上(New England Bolabs，Beverley，MA。)这类接头含有一个在所有三个可能的阅读框架中的均有的转译终止密码子，并且还包含一Nhc I限制位点，这便于确认SCR1cDNA中存在无义接头。所得的质粒称之pBL-CR1C5，它保留了SCR1 cDNA的LHR-A和62％ LHR-B。用Xho I酶切pBL-CR1C5，使SCR1插入部分与pBluecript载体分离。然后，把分离出来的SCR1片段插入到表达载体pTC Sgpt上唯一Xho I位点中，形成质粒pT-CR1c5。

11.3.可溶性CR1的表达

如本文所述，可以从细胞中以高产量分泌的CR1的可溶形式的表达(i)不限于用于缺失或切断的CR1 cDNA中一个精确的位点，(ii)也不限于应用一种特殊的表达载体(参见上述)。可以两个不同的表达系统来说明形成分泌SCR1的能力。

11.3.1.表达载体的pTCS系列的构建

所用的pTCS系列表达载体由三个质粒组成，每个均具有一插入cDNA的唯一Xho I克隆位点(图21)。由一组串联启动子驱动插入的cDNA的转录。SV40早期启动子位于腺病毒的主要晚期启动子(AD2 MLP)的上游。腺病毒的三联前导顺序处于cDNA开头和AD2 MLP之间。经转录的mRNAs由位于Xho I cDNA克隆位点下游的鼠类免疫球蛋白卡巴(Igk)顺序提供的多腺苷化信号终止。通过插入pSV2gpt，pSV 2dhfr或pSV 2neo中的相应的标记，分别提供了可选择的标记黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(gpt)、二氢叶酸还原酶(dhfr)或者新霉素抗性(neor)。这些质粒还是细菌复制起点和抗氨苄青霉素的β-内酰胺酶基因的来源。一般来说，对载体的选择取决于什么样的选择标记或组合标记对选择重组子是较好的。

人们已经知道腺病毒2(Ad2)、SV40、pSV 2cat(Gorman，c，1985，DNA Cloning，Volume II，A Practical Approach，ed.D.M.Glover，I RL Press，pp.143-190)以及鼠类免疫球蛋白卡巴的全部DNA顺序。这些顺序在基因库(Gen Bank)数据库和National Biomedical Research注解和参考文献中。这些中的任何一些还用作pTCS载体的适当部分的来源。

由中间质粒pEAXgpt和pML Egpt构建的载体pTC Sgpt、pTC Sneo和pT Sdhfr如下：

11.3.1.1.  pEA Xgpt的构建

步骤1 从M13mp9/MLP中得到Ad2MLP DNA片段(Concino，M.F.，et al.，1983，J.Biol.Chem.258：8493-8496)。这个质粒含有腺病毒2的核苷酸5778(Xho I位点)到6231(HindIII位点)的顺序，其中包括核苷酸6069上的Pvu II限制位点和核苷酸5791上的Sac II位点(参见NBRL核酸数据库，保藏号#Gdad2)。把Xho I到Hind III片段克隆到M13mp)的Hind III和Sal I位点中，产生质粒M13mp9/MLP。

用EcoR I和Hind III酶切质粒M13mp 9/MLP，分离出较小的含MLP片段。再用EcoRI和Hind III酶切pUC质粒(Pharmacia，Inc.，Piscataway，NJ)，然后，把该质粒中较大的片段连接到EcoR I到Hind III的MLP片段上。结果形成一个具有pUC质粒骨架的含MLP的新质粒。用Sam I酶切该质粒，连接到Sal I接头上，再重新环化。然后，用Pvu II酶切这个新质粒，质粒的Pvu II位点位于腺病毒2插入顺序中#6069位置上。把所得的线型片段连接到Xho I接头上，再重新环化。尔后，用Xho I和Sal I酶切该质粒，分离出含有MLPDNA的较小的片段(片段#1)。

步骤2 用Pvu II酶切质粒pSV 2gpt(American TypeCulture Collection(ATCC)保藏号37145)，连接到Sal I接头上，再用Sal I酶切。最终产物为线型pSV 2gpt片段(片段#2)。它可作为gpt基因的来源。

步骤3  用Hae III和Ava II酶切鼠类免疫球蛋白Igk片段(Hieter，P.A.，et al；1980.Cell 22：197-207)，分离含有多腺苷化顺序的片段。在可由NBRF核酸数据库(入藏号#Kcms)中得到的鼠类Ig卡巴顺序中，Ig终止密码子在1296位上，紧接的是1306上的Ava II位点、1484上的AATAAA多腺苷化位点以及1714上的Hac III位点。用E.coli DNA聚合酶修平该片段的突出末端，然后把片段连接到Xho I接头上，再用Xho I酶切。这个片段(片段#3)用作多腺苷化位点的主源。

步骤4  片段1、2和3与T4 DNA连接酶一起连接，形成一环状质粒。用限制性内切酶分析证实该质粒中的片段的正确定向。Xho I cDNA克隆位点的下游是鼠类卡巴多腺苷化位点，该位点的更下游是SV40启动子和gpt基因。Xho I位点的上游是MLP启动子，该启动子的更上游是细菌复制起点和氨苄青霉素基因。然后，用Sal I酶切该质粒，用E.coli DNA聚合酶修平突出末端。使所得的补平末端片段连接到EcoR I接头上，用T4DNA连接酶重新环化。这个最终质粒称之pEAXgpt。

11.3.1.2.  pMLEgpt的构建

步骤1  质粒pMLPCAT(Lee，R.F.，et al.，1988.Virology，165：51-56)是一个具有pML载体骨架的表达质粒，它含有腺病毒2MLP和三联前导顺序，5′到CAT基因。用Xho I和Sac II酶切pMLP CAT；Xho I的酶切位点在CAT基因和三联前导顺序的L3区之间，Sac II的酶切位点在除MLP的5′以外的腺病毒DNA中的#5791位上。由此AD2MLP和三联前导顺序位于这个小的Xho I到Sac II的片段上(片段#4)。

步骤2  用Xho I和Sac II酶切质粒pEAXgpt，除去含有MLP的较小片段。分离较大的片段(片段#5)。使均具有Sac II和XhoI末端的片段4和5连接，形成质粒pMLEgpt。

11.3.1.3.  pTC Sgpt的构建

步骤1 用Sac II酶切pML Egpt，用T4 DNA聚合酶修平末端，得到一补平末端的片段(片段#6)。这个Sac II位点是位于腺毒2顺序中MLP三联前导顺序5′的核苷酸5791上。

步骤2用Hind III和Pvu II酶切pSV 2dhfr(ATCC保藏号37146)。用E.coli DNA聚合酶的Klcnow片段修平含有SV40早期启动子的较小的342核苷酸片段(片段#7)的末端。用T4DNA连接酶连接片段6和7。限制性酶的分析证实了这些片段定向正确，在Xho I cDNA克隆位点的上游有两个前后排列的启动子，每个启动子能启动在相同方向上的RNA合成。这一质粒称之pTC Sgpt(图22)。

11.3.1.4  pTC Sdhfr的构建

步骤1  Hind III和Pvu II酶切pSV 2dhfr，然后用琼脂糖凝胶纯化较大的片段(片段#8)。舍弃较小的含有SV40早期启动子的片段。

步骤2  用EcoR I酶切pTC Sgpt，然后用E.coli DNA聚合酶的Klenow片段填充，形成补平末端。再用Hind III酶切这种线型片段，分离含有SV40启动子、MLP、三联前导顺序物、Xho IcDNA克隆位点、鼠类Ig λ顺序以及第二SV40启动子的pTCS转录单元的片段(大约1600核苷酸)(片段#9)。该片段具有一平末端和一Hind III突末端。连接片段8和9形成质粒pTC Sdhfr。

11.3.1.5. pTC Sneo的构建

步骤1  用Hind III和BamH I酶切pSV 2neo(ATCC保藏号37149)，再分离较大的片段(片段#10)。该片段含有质粒骨架和neo基因。

步骤2  用Hind III和BamH I酶切pTC Sdhfr，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳之后，分离出pTCS转录单元(片段#11)。连接片段10和11形成质粒pTC Sneo。

11.3.2.含有可溶性CR1编码顺序的哺乳动物表达载体质粒pB SCR1c、pB SCR1s和pBM-CR1c表达和鉴定。

11.3.2.1  在CR1 cDNA中的不同位置上切断的CR1结构的表达

构建质粒pBSCR1c和pBSCR1s，它们保存了除跨膜区和胞质区之外的大部分cDNA编码区(上述的11.1.节)(图20)。pBSCR1s比pBSCR1c短，因为它缺失了pBSCR1c中所含有的LHR-D和SCR S29及30部分。将这些质粒的SCR1部分插入到pTC Sgpt中，接着如上所述进行转染和表达。

pBSCR1c/pTC Sgpt的构建：用Xho I酶切pBSCR1c，得到5.9kb的插入部分，SCR1c。将SCR1c插入到pTC Sgpt的Xho I cDNA克隆位点中，产生pBSCR1c/pTC Sgpt。

pBSCR1s/pTC Sgpt的构建：用Xho I和Pvu I酶切pBSCR1s得到SCR1s插入部分。用T4 DNA聚合酶修平插入部分的末端。用琼脂糖凝胶纯化该插入部分。用Xho I酶切载体pTC Sgpt，用E.coli DNA聚合酶I填平Xho I突末端。接着，把SC R1s插入部分连接到末端补平的载体上，形成pB SC R1s/pTC Sgpt。

用Fsp1酶切质粒pBSCR1c/pTC Sgpt和pBSCR1s/pPTC Sgpt，与质粒pSV 2dhfr经磷酸钙共沉淀，把所得的线型DNA′s转染到dhfr基因为突变体的中国仓鼠卵巢(Chinese Hamster Ovary)细胞中(CHO DUX B11细胞)。让它们在DHFR选择性培养基上生长而选择转染子。用ELISA鉴定转染子克隆的培养上清中分泌的SCR1。鉴定50个pBSCR1c/pTC Sgpt重组子的培养上清，并且通过在把它们提高的氨甲喋呤浓度中培养的扩增方法获得阳性重组子。此外，通过每管共同培养8个pPBSCR1c/pTC Sgpt转染子并且使它们经相同的扩增方法，制备数管转染子。扩增的结果示于表VI。

                      表VI

           pBSCR1c/pTC Sgpt的表达

           分泌的可溶性CR1(μg/ml)CLONE     O MTX   20nM MTX     50nM MTX     100nM MTX    500nM MTX2*         0.7     3.4             11          10.94          0.04    0.16          0.049          0.0210         0.211         0.1212         0.1413         0.0714         0.215         0.45    1.1             7.3         9.021         0.0730         0.27    ＜0.02         ＜0.0235*1       0.82     6.3            8.4         10.9        10.940         0.0541         0.0550         0.1252         0.12

POOL

A                   0.02

B                   0.04

C                   0.23

D                   ＜0.02        ＜0.02

E                   0.27          1.1

F                   3.6           5.8         9.1

G                   0.27

H                   0.04

*选择克隆2和35以大规模生产SCR1。

1通过有限稀释将克隆35进行亚克隆，测定每种亚克隆形成的可溶性CR1。

pBSCRc/pTC Sgpt-克隆35.6的产量最高，

为17.7μg/ml sCR1。

MTX：氨甲喋呤(methtrexate)

用ELISA鉴定pBSCR1s/pTC Sgpt的12个重组予形成的可溶性CR1。所有12个鉴定物都显示分泌可检测水平的SCR。最好的生产者产生的SCR1的水平可与最好的pBSCR1c/pTCSgpt转染子产生的相比。

pBSCR1c/pTC Sgpt和PBSCR1s/pTC Sgpt重组子产生具有相似水平的可溶性CR1。这表明，产生可溶性CR1多肽的能力并不取决于CR1 cDNA中的一个确切的切断点。

11.3.2.2在两种不同的表达系统中sCR1c的表达

将切断的CR1 cDNA插入部分，sCR1c插入至表达载体pTC Sgpt中，并如上所述进行表达。它还被插入至表达载体pBMT3X中，如上面的11.2.3章节中所描述，产生pBM-CR1c。这两种表达载体都具有非常强的启动子。在两种系统中测试可溶性CR1的表达以确定是否有一个系统可以获得较好产量的分泌多肽。

采用磷酸钙方法(Graham，F.L.和Van der Eb，A.J.1973，Virology 52：456-467)，用pBM-CR1c转染C127 I鼠细胞(ATCC保藏号CRL 1616，Rockville，Maryland)。经甘油刺激后，用含有10％胎牛血清和2mM L-谷氨酰胺的D-MEM培养基恢复细胞，在37℃下培养48小时。然后，用胰酶消化细胞，分成1∶5和1∶10的比例加入完全D-MEM培养基+10μm氯化镉中，10天内出现耐镉菌落。采用克隆圆筒将10个菌落取出，将每个菌落都转移到含有完全D-MEM培养基的陪替氏培养皿中，在37℃，5％CO下培养直至细胞融合。然后，对每一个培养皿中的细胞进行胰酶消化，并分装入三个60mm的培养皿中用于制备冰冻细胞原种，RNA抽提物，并用于采用ELISA法测试细胞培养基中是否存在分泌sCR1c。

当从每一个融合的陪替氏培养皿中移出细胞培养基并进行ELISA分析时，发现被测试的所有pBM-CR1c克隆对生产可溶性CR1均为阳性。将来自pBM-CR1c重组子的分泌sCR1的量与来自pBSCR1c/pTCSgpt重组子的那些进行比较。结果表明高产量地生产分泌sCR1多肽的能力并不依赖于仅使用某些启动子或表达系统。

11.3.3含有可溶性CR1编码顺序的哺乳动物表达载体，pT-CR1c系列，质粒pT-CR1 c1，pT-CR1 c2，pT-CR1 c3，pT-CR1 c4和pT-CR1 c5的表达和测试。

pT-CR1c系列缺失突变体缺失跨膜和胞质区，和pBSCR1c和pBSCR1s的结构一样。此外，缺失突变体还包括相当大量的CR1 cDNA的各种LHR区的缺失(见图20)。将缺失突变体在CHODUXB11细胞中表达，并测定其产生的可溶性CR1多肽的量。

对于每一种缺失结构，选出40种不同管的克隆进行ELISA分析以确定是否产生了可溶性CR1多肽。通过ELISA或通过在细胞培养基中检查其功能活性的存在，发现所有5种pT-CR1c结构均可在细胞培养基内分泌sCR1。用5种pT-CR1c结构中的4种转染的细胞的上清液中所产生的sCR1，通过溶血分析测定认为是功能性的(见表VII和下面的13.2章节)。

                  表VII

          功能性sCR1片段的制备*

结构             ELISA              溶血分析pT-CR1 c1              -                    +pT-CR1 c2              +pT-CR1 c3              -                    +pT-CR1 c4              +                    未测定pT-CR1 c5              -                    +*用于ELISA测试或溶血分析的上清液是从生长在T75烧瓶或24井培养板中培养物中获得。因为在这些条件下，不同量的可溶CR1都可以累积于培养上清中，所显示的结果是定性的。(+)表示由所指定的分析法检测，产生了功能性的sCR1。

缺失突变体也能够产生可溶性CR1的事实进一步显示了表达sCR1的能力不依赖于CR1 cDNA的一种确切的遗传修饰。象删除跨膜区后，所有的结构均能制备可溶性多肽。

12实例：可溶性的CR1的制备和纯化

大量的sCR1在空心纤维生物反应器系统中制备。所获得的sCR1的量与接种的重组子克隆的相应产量成正比。为了获得最佳的纯化效果，选用血清培养基，在缺乏大量的外源加入的胎牛血清多肽的情况下，仍可获得高生产水平的sCR1。

12.1可溶性CR1的大规模制备

与IV-L型空心纤维生物反应器(30KD分子量中止)相配的细胞一PharmTM细胞培养系统I(CD Medical Inc，MiamiLakes，FL)在无菌条件下装配。将两个克隆(pBSCR1c/pTCSgpt的克隆2和克隆35)扩展至8个T-225烧瓶中。当融合时，用胰酶消化细胞，洗涤和制丸，并将其重悬浮于培养基中。约5×10⁸个克隆2的细胞和10×10⁸个克隆35的细胞接种到两个分开的空心纤维生物反应器中。采用一个20升的料液藏器，其中盛有α-MEM+10％胎牛血清，8mM L-谷氨酰胺，100μg/ml青霉素链霉素和适当浓度的氨甲蝶呤(对于克隆2为50nM，而对于克隆35为500nM)。预先混合的气体(含5％CO₂的空气)通过氧气发生器向贮藏器中的培养基鼓泡以维持pH。调整培养基的重复循环，替换和气体流速以获得最大的产量。将接种的部分在1000rpm下离心10分钟，通过0.22μM孔径的过滤而收集样品，纯化前保持于4℃。收集的体积和频率从25ml，培养初期为每星期3次起逐渐增加，至40ml，2-3个月后每星期5次。通过CR1 ELISA来测试所产生的sCR1。接种后第一个月，克隆2和克隆35的产量分别为66μg/天和1060μg/天。产量随着培养株的形成而增加。

12.1.1在无血清培养基中sCR1的制备

对两种商业上可购得的无血清培养基支持细胞生长和sCR1产生的能力进行测试。pBSCR1c/pTCSgpt克隆35的T75烧瓶中的融合物被分装入2个T75烧瓶中。一个瓶子用补充有10％胎牛血清，L-谷氨酰胺，抗生素和500nM氨甲蝶呤的α-MEM培养。另一个瓶则在α-MEM+L-谷氨酰胺，抗生素，500nM氨甲蝶呤+HBCHO生长添加剂(Hana Biologics，Inc.Alameda，CA)中培养并逐步减少胎牛血清，从5％，1％，0.5％至无牛胎血清。比较两个瓶中细胞的生长和sCR1生产水平。在无血清的培养基中生长的细胞不会达到融合。sCR1生产产量列于表VIII中。在每一种情况下，当细胞在10％的胎牛血清中生长时，sCR1的生产水平是最高的。比较发现，在14天时，无血清培养基中的产量是1.4×10¹⁰个血影细胞/ml，而在补充10％胎牛血清的培养基中则为4.2×10¹⁰个血影细胞/ml。

                   表VIII

      在补充CHO生长补充剂的无血清培养

       基和含有10％胎牛血清的培养基中

        sCR1的产生*

        第4天        第7天      第11天      第14天瓶1CHO生长补充剂+      5％FCS      1％FCS     0.5％FCS    0％FCS

         2.6         2.4        2.95        1.4瓶210％FCS      4.8         3.85       4.3         4.2*以10¹⁰个血影细胞/ml表示。

采用第二种来源的无血清培养基(CHO-1，Ventrex Laboratories，Inc.Protland，ME)测试重组子中细胞的生长和sCR1的产生。因为不需要在该培养基中逐步去掉细胞生长的血清，所以，细胞在无血清的培养基中直接解冻和培养。该培养基由DME-12碱和生长添加剂组成。将相等数量的细胞解冻并接种入24-并培养板中各个井孔中。细胞附着后，除去培养基，将含有10％胎牛血清的培养基或无血清的培养基加入至适当的井孔中。每一种情况都进行二次。与先前所测试的无血清培养基的情况不同，CHO-1，Ventrex Laboratories培养基可产生与含有牛胎血清的培养基相似水平的细胞生长。

12.1.2.结论

上述结果表明产生sCR1 CHO细胞可以维持在一定的无血清的培养基中。这就减少了大规模生产所花费的培养基的成本。另一个优点是简化了从细胞培养上清液中纯化sCR1，因为不需要除去胎牛血清蛋白质。

12.2可溶性的CR1的纯化

随着专一性抗CR1抗体的出现，用简化的二步法来代替制备纯化的CR1所需的多步层析法就成为可能了。这样也增加了CR1蛋白质的产量，每5.9×10¹³个红细胞可获得约1-5mg CR1(Wong，W.W等人，1985，J.Immunol.Methods 82：303-313)。但是因为所报导的纯化是与膜结合形式的CR1的纯化，所以总是需要用去垢剂溶解含CR1的物质。

用重组转染子所制得的可溶性CR1不必要用去垢剂溶解再纯化；它已经是可以溶解的。尽管可溶性CR1可以通过抗CR1抗体层析法纯化(见下面)，但该过程本身不适宜于大量制备。扩大产量的程度受到可以得到的用于制备抗体纯化柱的抗体基质的抗CR1抗体的量的限制。此外，对于CR1具有高结合亲和力的抗体，如YZ-1意味着相当苛刻的条件，如必须达到pH12.2以从抗体基质中去除结合的sCR1产物(Wong，W.W.等人，1985，J.Immunol.Methods 82：303-313)。

为了具备纯化很大量可溶性CR1的能力，形成了包括HPLC柱在内的纯化方法。这些HPLC柱可以容易地扩大以生产相当大量的纯化的可溶性CR1。此外，它们不需要在苛刻的条件下洗脱和复原sCR1。

12.2.1.抗体亲和柱纯化

12.2.1.1.方法

为了进行sCR1的抗体亲和纯化，根据制造商的说明，将100mg单克隆抗体YZ-1以共价偶联到7mg Affi Gel-10(BioRad，Richmond， CA)上。在瓶中用固定的YZ-1孵育来自于细胞培养物的含有CR1的上清液，在4℃振荡过夜。将物质倾注入玻璃柱中，用10mM Hepes，0.1M Nacl，pH7彻底冲洗，用20mM磷酸钠，0.7M NaCl，pH12洗脱sCR1(Yoon.S.H和Fearon D.T.1985，J.Immunol.134：3332-3338)。用Biorad蛋白质分析仪(BioRad，Richmond，CA)来检验洗脱的级分中蛋白质的存在。将含有蛋白质的样品马上收集起来并在0.1MHepes，pH7(2×11)中，于4℃透析过夜。然后在PBS中透析样品。通过CR1 ELISA分析存在的sCR1。

12.2.1.2.结果

将由转染子pBSCR1c/p TC Sgpt克隆2所制得的含有sCR1的细胞培养上清液加到抗CR1抗体亲和层析柱上，收集峰值sCR1级分。将一组这种纯化的物质在4-20％的SDS-PAGE凝胶上走电泳(DAIICHI；Inc.，聚丙烯酰胺凝胶，modified procedure of Laemmli，U.K.，1970，Nature.227：680-685)。在还原条件下，可溶的CR1的表观分子量是约224,000道尔顿(图24)。该纯化的CR1分子具有抑制补体介导的溶血作用，同样也抑制C5a和C3a产生，这也表明它是具有活性的(下面第13章节)。

12.2.2.采用HPLC的CR1纯化

12.2.2.1.方法

12.2.2.1.1.原料

当培养物在生物反应器中刚刚形成时，sCR1的生产水平低于培养物已生长了几个月的时候。通常，在细胞在生物反应器中达到融合和产生最大产量的sCR1以前，有一个几个星期的周期。含有少量sCR1的细胞培养上清液在纯化前可通过硫酸铵沉淀或超滤法而浓缩。用60～80％饱和的硫酸铵分级分离上清液，所沉淀的sCR1呈现基本相当的产量。将沉淀物以最小的体积溶解并在用于阳离子交换HPLC的初始缓冲液中透析。或者，可以超滤浓缩CHO细胞培养上清液并透析到用于阳离子交换层析的初始缓冲液中。

因为生物反应器中产生了较高浓度的可溶性CR1，从这些培养物中得到的CHO细胞培养上清液可直接透析至用于阳离子交换层析的初始缓冲液中。

12.2.2.1.2.阳离子交换HPLC过程

将样品透析至初始缓冲液中(0.02M磷酸钠，0.06N氯化钠，pH7.0)，然后通过一个0.2μm过滤器过滤以除去所有的粒状物质。然后，将样品加到阳离子交换高压液相色谱柱上(10cm×10mm，Hyd ropore-SCX HPLC柱，Rainin)。洗涤该色谱柱，并用0.02M磷酸盐，0.5N NaCl pH7.0形成的氯化钠梯度洗脱。约在0.06N和0.25N NaCl之间将SCR1洗脱下来。通过280nm处吸收和ELISA监测洗脱。

12.2.2.1.3.阴离子交换HPLC过程

如果需要的话，可以由阴离子HPLC对阳离子HPLC纯化的sCR1进一步纯化。将阳离子HPLC的峰值级分透析至阴离子HPLC的初始缓冲液中。上样后用0.01M磷酸盐，pH7.5洗涤(Hydropore-AX，Rainin)。采用0.01M磷酸盐，0.5NNaCl，pH7.5形成的(NaCl)梯度洗脱该柱(采用一系列的步骤)。约在0.0N和0.3N NaCl之间将sCR1洗脱下来。如前面对于阳离子交换HPLC一样监测洗脱情况。所给出的阳离子和阴离子HPLC柱缓冲液的浓度和pH只是一些例子。其它浓度的缓冲液，盐的条件或pH条件也可以采用。

12.2.2.1.4.Wcstern印迹法分析

Western印迹法采用Towbin H.等人，1979，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76：4350-4354的修改方法而进行。简而言之，将纯化的sCR1在4-20％ SDS-PAGE上凝胶上电泳，再将其转移至硝酸纤维膜上，用抗CR1抗体(鼠mAb YZ-1或J3D3)专一探查，并用与碱性磷酸酯酶连接的山羊抗鼠抗体检测。

12.2.2.2.结果

就一个典型循环而言，将50-100ml取自生物反应器培养物的上清液透析至初始缓冲液中，并加到10cm×10mm阳离子交换HPLC上。通过在280nm处吸光值和ELISA法确定峰值级分，并收集。通过280nm处吸光值((ε值1％)在280nm处＝10，如对于CR1c氨基酸成分估计)而测定收集物中蛋白质的浓度。从100ml扩大培养的上清液中纯化得到几十毫克产品。

在一个实例中，当采用阳离子HPLC纯化时，通过在280nm处的吸光值的测定100ml来自转染子pBSCRlc/pTC Sgpt克隆2的培养物上清液产生22mg纯化的sCR1，当采用阳离子HPLC纯化时，通过在280nm处的吸光率而测定(图24)。当用CR1 ELISA检验时，计算得到产率为202％，另外13％是在流过的或柱的洗涤级分中。产率大于100％可能反映了ELISA分析中的基质的影响。

给定培养物上清液从生物反应器中抽出的速率，在该水平的氨甲蝶呤扩增下，每个生物反应器每周可生产约100mg纯化的可溶性CR1。该水平的生产能力可以增加的一些方法包括在接种到生物反应器前，用氨甲蝶呤将初始反应物扩增到最大，增加任何一次生产中生物反应器的数量，和采用较大容量的HPLC柱。

12.2.2.3.纯化的可溶CR1的特性

从阳离子HPLC得到的含有sCR1的峰值级分在阴离子HPLC中进一步纯化(图24)。通过SDS-PAGE对于在不同的步骤中的sCR1物质的纯度进行测试(图25)。在这些高负载凝胶上可看到的较小的带代表sCR1片段，如通过采用抗CR1单克隆抗体，YZ1或J3D3的Western印迹法所测定的。在大多数制备中，未观察到sCR1片段色带。

纯化的sCR1的功能活性通过浓度为0.25μg/ml的纯化的sCR1可以抑制50％经典的补体介导的溶血作用的能力而测试。在5μg/ml时，纯化的可溶性CR1也能够抑制50％经典的补体C5a的产生，而在13μg/ml时，则可抑制50％ C3a的产生(见下面第13章节)

12.2.2.4.结论

如上所述，我们建立了一种纯化可溶性CR1的改进的方法，所述的可溶性CR1可以容易地扩大以生产大量治疗应用所需的sCR1。该方法的基本要点包括已经溶解的起始原料，这样，就不需要用去垢剂来溶解与膜结合的CR1。在生物反应器培养基中胎牛血清浓度的减少和/或在培养中采用另一种培养基排除了在随后的纯化过程中从含有sCR1的原料中去除高浓度外源蛋白质的需要。此外，用HPLC方法进行纯化提供了大规模纯化的方法。阳离子HPLC或先阳离子HPLC，然后阴离子交换HPLC结合的方法均可用于纯化。采用这种方法，只以1或2个步骤就可以高产率地获得基本纯的可溶的sCR1。

13.实例：可溶性CR1体外活性的实验

13.1.抑制嗜中性粒细胞的氧化突增。

在心肌梗塞中遭受损害的组织的重输注损伤模型中，活化的补体组分诱导嗜中性粒细胞的粘连和活化，活化的嗜中性粒细胞经历氧化突增形成剧毒氧基，这些和其它一些潜在的毒素在嗜中性粒细胞脱粒时释放出来，破坏周围的组织。可溶性CR1可通过阻止在嗜中性细胞活化中产生C3a和C5a以及补体组分而减小被破坏的组织的区域。

为了检验可溶性CR1阻止在体外补体激活中产生C5a的能力，采用一种生物分析法，它可以对在C5a诱导的氧化突增过程中由嗜中性细胞所产生的氧基进行定量(Bass，D.A.等人，1983，J.Immunol.130：1910-1917)。该分析中采用二氯二乙酸荧光素酯(DCFDA)，一种可进入细胞中并残留下来的脂溶性分子，氧化时可发出强烈的荧光。

13.1.1.材料和方法

13.1.1.1.材料

采用新鲜的全血，人体补体来源(Beth Israel Hospital，Boston，MA)，干燥的Baker′s酵母，具有0.1％明胶和5mM葡萄糖的PBS，100mMEDTA，在HBSS中的10mM DCFDA，(Kodak)，红血细胞(RBC)溶解缓冲液(Ortho Diagnostics)，纯化的C5a(Sigma Chemical CO.St.Louis，MO)，和可溶性CR1。

13.1.1.2.嗜中性粒细胞的制备

采用Bass(1983，J.Immunol.130：1910-1917)所描述的方法来制备嗜中性粒细胞。将2.0ml全血在PBS-明胶-葡萄糖中洗涤3次，再悬浮于5ml在HBSS中的10μM的DCFDA+5ml PBS-明胶-葡萄糖中，于37℃下孵育15分钟，然后离心分离细胞并重新悬浮于2.0ml PBS-明胶-葡萄糖+5mM EDTA中。

13.1.1.3酵母颗粒的制备

将干燥的Baker′s酵母重悬浮于H₂O中，洗涤2次并沸腾30分钟。将颗粒再在H₂O中洗涤2次，并以0.5g/ml重悬浮于水中，(Simpson P.J.等人，上述的)。

13.1.1.4.用纯化的C5a来活化嗜中性粒细胞

用RBC溶解缓冲液处理100μl载有DCFDA的细胞，在PBS-明胶-葡萄糖-EDTA中洗涤1次，并重悬浮于1.0mlPBS-明胶-葡萄糖中。将50μl200ng/ml的纯化的C5a或对照物在37℃加入0.5ml靶细胞中，在不同的时间间隔下，用流式细胞光度计进行分析。

13.1.1.5.用人血清或血浆中的纯化C5a激活嗜中性粒细胞

用50μl在人血清或肝素化的血浆中(100ng/ml)以1∶1稀释的C5a或对照物在37℃下与100μl载有DCFDA的细胞一起孵育30分钟。RBC被溶解出来，用流式细胞光度计分析嗜中性粒细胞。

13.1.1.6.用酵母颗粒活化的人血清或血浆活化嗜中性粒细胞

在37℃下，25μl酵母颗粒与425μl新纤冰冻的血清和血浆+50μl sCR1或对照物一起孵育30分钟。然后，将激活的补体或对照样品离心分离以除去酵母颗粒。每一个这种样品都在PBS-明胶-葡萄糖-EDTA中进行10次2倍的稀释。将50μl每一种稀释后的对照和活化的血清和血浆加入50μl载有DCFDA的靶细胞中，在37℃下孵育30分钟。然后，溶解出RBC′s，用流式细胞光度计分析嗜中性粒细胞。

13.1.2.结果

13.1.2.1.可用DCFDA测定的C5a诱导的人体嗜中性粒细胞中的氧化突增

图26显示了用纯化的C5a刺激后，人体嗜中性粒细胞的荧光强度迅速增加。在加入C5a(最终浓度为20ng/ml)后4分钟内，嗜中性粒细胞比载有DCFDA的对照嗜中性粒细胞亮10倍。到20分钟时，嗜中性细胞的亮度则是对照的亮度的20倍。这个分析似乎是C5a的灵敏检测器。

13.1.2.2.人体血清可阻断纯化的C5a对于嗜中性粒细胞的氧突增作用

在与用人血清稀释的纯化C5a一起孵育的，并载有DCFDA的嗜中性粒细胞中没有观察到荧光强度的增加。这个效应可能是由于在血凝过程中从血小板中释放出来的血小板衍生生长因子(PDGF)作用的结果。业已发现，低水平的PDGF可以抑制C5a诱导的嗜中性粒细胞的活化(Wilson E.等人，1987，Proc Natl.Acad.Sci.USA 84：2213-2217)。

13.1.2.3.肝素化的血浆不阻滞C5a对嗜中性粒细胞的作用

在肝素化的血浆中1∶1稀释的C5a诱导载有DCFDA的嗜中性粒细胞的氧突增。尽管不如在缓冲液中由C5a引起的作用剧烈，在用该嗜中性粒细胞培养30分钟后，荧光强度增加了10倍。减弱的信号可能是由于在静脉放血或血浆分离中释放的PDGF所引起。更温和及迅速地从血液细胞组分中分离出血浆可使PDGF的释放最小并可得到较好的C5a功能。

13.1.2.4.存在于补体活化过程中的sCR1阻止C5a的产生

在可溶性CR1的存在下，酵母多糖引起人类补体的活化，当用DCFDA测试时发现减少了C5a的活性。如图27所示，在sCR1存在下被活化的人类血浆的1∶16稀释液所产生的中性粒细胞中的荧光密度的增加比不存在sCR1时被活化的血浆的1∶16稀释液少70％。这意味着sCR1对C5a产生抑制作用。对DCFDA测定法及血浆的收集作进一步的改进，可以获得一个测定可溶性CR1活性的更高效和更为敏感的方法。

13.2.对补体介导的溶血作用的抑制

13.2.1方法

对补体抑制能力的测试是通过测定对补体介导的红细胞溶胞(溶血作用)的抑制来进行的。对溶血作用的抑制是可溶性CR1溶液的一个功能。将sCR1样品在0.1M Hepes缓冲剂(0.15N NaCl，pH7.4)中稀释以进行测定  在V形底的微量滴定板上的每个井中加入50μl，一般同一样品重复3次。将作为补体来源的人类血清用Hepes缓冲液稀释成1∶125，在每个井加入50μl。接着，采用商业上可获得的具有抗绵羊抗体的绵羊红细胞(Diamedix Cat.No.789-002)，每井中加入100μl，以起始补体的溶血作用途径。滴定板在37℃下孵育60分钟，随后，在500xg下离心10分钟。移取上清液并置于一个平底的微量滴定板上。溶血作用的程度是通过样品在410nm处的吸收值来测定的。将仅含人类血清的红细胞样品的吸光值As减去仅含红细胞的样品的吸收值Ao，得到最大吸收值(相应于最大的溶血作用)Amax。即：Amax As-Ao。既含有人类血清又含有sCR1的红细胞样品的吸收值与仅含有sCR1的细胞样品的吸收值之间的差值被称为A样品。抑制率1H用比值(Amax-A样品/Amax)表示，而1H50为1H 1/2时的sCR1的浓度。在监测层析的分部时，未将无血清的对照包括在内，而抗-补体活性是以样品在410nm处吸收值的降低而作定性监测的。

上述的溶血测试也用于评价人类重组sCR1通过其他种的动物(诸如：豚鼠及大鼠)的补体而对绵羊红细胞胞溶进行抑制的能力。对于各种物种，可用新鲜冷冻的血清或新鲜冷冻干燥的血清或血浆作为补体来源。有时血清可以购得(Sigma Chemical Company，Sl.Louis，Mo)。

首先对血清溶解活化的红细胞的能力进行滴定，选样至少达到最大红细胞胞解的80％的最大程度的稀释液，以评价加入的人类sCR1的作用。随后如上所述，进行测试，并在较佳的稀释度时用动物血清替代人血清。

13.2.2.结果

如图28所述，纯化的sCR1在浓度为0.12μg/ml时，抑制了50％的经典的补体-介导的胞溶。将抗体亲和纯化的sCR1抑制血细胞胞溶的能力与使用未纯化的材料(含有细胞培养物上清液的sCR1)的情况作比较。纯化的sCR1的活力与来纯化的sCR1的活力相比，两者在溶血测试中在1.6×10⁸血影细胞/ml时均有50％抑制作用。这就表明，纯化步骤未使最终sCR1产物的功能性活力明显地下降。

为了确定纯化的sCR1是否能冷冻保藏，将一份贮于-70℃达一周。当用CR1 ELISA测定及在280nm下测定吸收值时，经冷冻的sCR1的浓度与未经冷冻者相同，对血细胞溶解抑制的测定表明冷冻过的sCR1的活力也与未经冷冻者相同。

表IX罗列了人类重组sCR1对于来源于多种物种的补体所介导的血细胞胞溶的抑制能力。

                  表IX

      采用来源于多种动物血清的补体时，

     对于致敏的绵羊RBC的血细胞溶解作用动物   采用血清的  sCR1的      抑制作用1H**      1H**

   最终浓度    抑制作用    (血影细胞/ml)  (血影细胞/ml)豚鼠*    1∶500      是       66％(2.6×10⁹)    1.0×10⁹人       1∶500      是       94％(2 5×10⁹)    2.0×10⁸人       1∶312      是       94％(1.2×10⁹)    1.0×10⁷大鼠      1∶200       是    85％(2.6×10⁹)    2.4×10⁸大鼠*     1∶200       是    77％(3.8×10⁹)    1.0×10⁹狗        1∶50        否兔*       1∶20        否小鼠*     1∶5         否

*购得的冷冻干燥的血清(Sigma Chemical Co.，St.L

 ouis，Mo.)

**如上文所述(第13.2章节)

无论是豚鼠或是大鼠的补体都显示出被人类sCR1所抑制。对于其他的物种没有明显的抑制作用可能反映了(a)在测试系统中采用兔抗体及绵羊红细胞不合适，或者(b)在这个系统中血细胞胞溶需要高浓度的血清。

13.3.C3a及C5a产生的抑制作用

13.3.1.方法

对补体的抑制能力也可通过对C3a和C5a产生的特异性抑制作用的测试来测定。在所有的实施例中，采用同一个瓶中的人类血清作为补体的来源并分成若干份置于-70℃冷冻。人类IgG(免疫球蛋白G)被热凝集后，分成若干份置于-70℃下冷冻。在每一个实验中，每一份血清用要测定的不同浓度的sCR1于37℃进行平衡。加入凝集的人类IgG引发补体作用途径，每次都包括不含IgG的对照样品。经过15分钟固定的反应时间(这是由先前进行的反应时间的研究所确定的，这段时间内C5a或C3a的产生近乎完全，即大于90％)后用改良的方法，使用购得的放射免疫测定(RIA)盒(C5a RIA，Amersbam Cat NO.RPA.520；C3a RIA，Amersham CatNO.RPA.518)用放射免疫测定法对释放的补体肽(C5a或C3a)的浓度水平进行测定。

因为采用的是竞争性的免疫测定法，补体肽(C5a及C3a)浓度和所得计数呈反比，样品中结合的计数(counts bound(CB)被定作总计数(每分钟计数，cpm)，是在小丸中测定的。

图29中的y轴代表抑制率。抑制率等于某一“样品”的结合计数(CB)，减去“没有SCR1样品”的CB，再除以“无免疫球蛋白对照”的(CB)减去“无SCR1样品”的CB。

13.3.2.结果

纯化的sCR1的活性是通过测试其在一个活化的人类血清样品中抑制C5a及C3a产生能力来测定的。

如图29所示，在测试条件下，纯化的sCR1可最大程度抑制100％的C5a的产生，60％的C3a的产生。对C5a的产生，当sCR1的浓度为5μg/ml时，而对C3a的产生，当sCR1的浓度为15-20μg/ml时，可观察列有50％的抑制作用。这一结果表明重组sCR1对于C5转化酶的抑制比对C3转化酶的抑制为更有效。

14.例子：可溶性CR1在体内治疗活性中的功能的演示

14.1.在反相被动阿图斯氏反应中进行可溶性CR1的体内功能的演示

阿图斯(Arthus)氏反应是一个经典的免疫学诱导炎症反应，通过局部地注射抗原，随后在循环中与抗体反应。主要的生物反应的特征为，免疫复合物沉积、补体结合、多形态核(PMN)白细胞浸润、溶菌酶的释放、作用于血管的胺的释放，及局部的组织损伤(参见Uriuhura，T.and Movat，H.Z.，1966，Exp.Mol.Pathol.5：539-558；Cochrane，C.G.，1968，Adv.Immunol.9：97-162)。作为经改良的直接的阿图斯氏反应，反相被动阿图斯反应(RPAR)已在确定抗炎症剂方面用作模型(参见：Pflum，L.R.and Graeme，M.L.，1979，Agents and Actions9：184-189)。在RPAR中，局部注射抗体，而抗原存在于循环中。

当在大鼠RPAR模型中测定时，可溶性sCR1可以阻止局部炎症反应。该可溶性CR1在体内的这一功能的作用机制可能是通过抑制补体途径的酶；而介导的抑制。

14.1.1.材料及方法

对体重在100-125克范围内的五周龄的Sprague Dawley大鼠(CD株)(Charles River Laboratories，Wilmington，MA)腹膜内注射0.1至0.3ml的三溴乙醇使之麻醉、该溶液为用1克三溴乙醇溶于15ml Amel乙醇中而形成的原液经1∶2稀释而成的。剃去大鼠背部的毛，接着，使鼠尾发热，先用热水后用发热的灯泡。采用一个1ml的注射管，将浓度为5mg/ml的溶于0.15M磷酸缓冲盐的卵白蛋白0.35ml(Calbiochem Corp.，San Diego，CA)在距尾端大约1至2英寸处静脉注射注入鼠尾静脉。五分钟之后，对大鼠皮肤注射0.08ml的浓度为20mg/ml的兔1g，它是抗-卵白蛋白抗体，抗体效价为4mg/ml(Organen Teknika Corp.，Cappel Division，West Chester，PA)或注射0.08ml 20mg/ml的兔IgG(Sigma Chemical Co.，St.Louis，Mo)，或注射PBS。每次注射均同样地施于两只大鼠，注射区域用记号笔划出。随后在1、4及18小时对大鼠进行监视。24小时之后，将大鼠埋于干冰中3分钟而杀死。将注射位点处的皮肤样品害下，相同的两个样品中的一个置于10％福尔马林固定以供石蜡包埋，而另一个则冷冻以作冰冻切片。制成的组织切片用苏木素及曙红染色。

14.1.2.结果

皮肤内注射抗卵白蛋白抗体3至5小时之后，才开始可见有微弱的RPAR反应(例如：水肿及红斑)。反应强度逐渐地加剧，直到24小时之后，反应区域直径达到3-5mm(见图30b)。仅注射非免疫兔Ig G或PBS的大鼠皮肤上无反应。

在显微镜下对取自受损部位的组织切片进行观察，发现在真皮上，特别是在血管周围有许多急性炎症细胞(见图31b)。这都是典型的血管炎及血管周炎所具有的。被观察的组织显现了典型的炎症情况，即在血管外有广泛的PMN浸润、结缔组织中存在红细胞、及胶原纤维的疏松等。

14.1.3.皮内施用可溶性CR1的效果

将40μl的0.75mg/ml sCR1与等体积的抗-卵白蛋白或正常兔Ig G或PBS混合而制成纯化的sCR1混合物。将sCR1：抗-卵白蛋白混合物或sCR1：兔IgG混合物、或sCR1：PBS混合物通过皮内注射入已经静脉注射了卵白蛋白的大鼠内。仅在注射了sCR1加上抗-卵白蛋白抗体的注射部位出现了可见的损伤(见图30a)。正如所料，在注射了sCR1：兔IgG或sCR1：PBS的部位未发生损伤。当用显微镜观察sCR1：抗-卵白蛋白注射位点四周的组织切片时，沿血管四周可见PMN簇及单核细胞簇，但是却没有广泛的PMN浸润或红细胞的外渗(见图31a)。这些数据表明，施用可溶性CR1可引起对内皮细胞损伤及炎症反应的抑制作用。

为了测定在上述的卵白蛋白大鼠模型中阻止RPAR所必需的sCR1的最低有效数量，分别地将0.75mg/ml SCR1原液十倍地系列稀释(即原液、1/10、1/100、1/1000及1/10,000)进行测定。对每个sCR1稀释液与等体积的抗-卵白蛋白抗体的原液或二分之一稀释液混合。每个注射部位的注射总量为80μl。sCR1抑制RPAR的能力是剂量依赖性的，每个注射位点施用300毫微克时，可明显地观察到水肿的减少(见表X)。

                   表X

   sCR1的剂量对RPAR抑制作用的影响

sCR1(微克/位点)           RPAR残留的程度

     30                        +/-

     3                         +/-

     0.3                       +/-

     0.03                      ++

     0.003                     ++++

     0                         ++++

14.2.体内施用sCR1的药物动力学

如下对sCR1的体内的生物半衰期进行测定。对相似周龄(六周)及体重(110-125克)的大鼠，通过静脉注射含250μg sCR1的注射液0.35ml。分别于注射后2分钟、5分钟、10分钟、60分钟、及24小时，将大鼠杀死，并用静脉腔穿刺取出血液。在1800rpm下离心10分钟，从每只鼠获得1-2ml血清，用CR1 ELISA对每一样品中的sCR1的量进行测定。将1μg/ml纯化sCR1的二倍稀释液加入对照大鼠血清或无血红蛋白的血影细胞(1.6×10⁸个血影细胞/毫升)的去垢剂胞溶物中作为CR1的标准物。结果示于表XI。

                     表XI

            随时间变化的注射入sCR1

         的血清浓度变化的药物动力学数据

静脉注射后的时间           sCR1浓度(μg/ml)

      对照                       0.01

      2分钟                      0.17

    5分钟                         0.80

    10分钟                        1.01

    60分钟                        0.38

    24小时                        0.49

这些数据表明，sCR1在静脉注射后24小时还可被测出。在24小时，sCR1在血清中的水平为注射后10分钟所观察到的峰值的一半。

14.3. sCR1减小大鼠重新输注(REPERFUSED)

梗塞心肌的梗塞区的大小

如上所述的在体外试验中具有抑制补体途径C3/C5转化酶活性的能力的sCR1也可在体内用于大鼠心肌梗塞模型，可以减少受重新输注损伤的程度。

大鼠的心肌梗塞可以通过结扎冠状血管而引起。如在心肌梗塞发生后头几个小时后进行测定，发现重新输注(reperfusion)可减小梗塞区大小，改善左心室的功能，因而减少死亡率(参见：Braunwald，E.and Kloner，R.A.，1985，J.Clin.Invest.76：1713-1719)。然而，重新输注至已严重局部缺血但并非不可逆的损伤的心肌，其本身可能产生或扩大损伤。重新输注(reperfusion)引起损伤的机理包括，由于氧自由基及细胞钙过载而引起损伤等。白细胞单独地或与微血管内皮细胞一起作用可能对可这种损伤起作用。这一过程可能涉及补体的激活(参见：Rossen，R.D.，et al.，1985，Cir.Res.57：119-130；Crawford，M.H.，et al.，1988，Circulation 78：1449-1458)。

14.3.1.方法

14.3.1.1引发大鼠心肌梗塞

用吸入甲氧氟烷(methoxyflurane)的方法麻醉十四只体重在200至250克的大鼠，将右颈静脉切断，插入套管。其中的一半大鼠(七只)通过套管得到2ml(1mg)sCR1，而另一半大鼠则以相似的方式被施于2ml制备的盐水安慰剂。移去大鼠颈套管，结扎颈静脉，并缝合伤口。随后在第五、六肋骨间对大鼠施行左胸胸廓切开术，同时对大鼠通以间歇的正压的95％氧气及5％二氧化碳混合气体。接着进行心包切开术，在邻近主动脉的左侧处2-3mm内缝合结扎左冠状动脉。冠状动脉扎结的后果是在一个大区域具有形成前透壁梗塞的危险。在大鼠仍处麻醉状态时暂时关闭胸腔。闭合35分钟之后，重新打开胸腔，并拆去缝线，要适当地选择这段时间以保证处于危险之中的区域的相当一部份具有挽救的可能。随后，永久地关闭胸腔，并且可以让大鼠从麻醉中苏醒，一般于术后5至10分钟之内。通过肌肉注射对大鼠施以100,000单位的苄星青霉素G及0.25mg/kg吗啡硫酸盐。对大鼠喂以水及标准鼠饲料，一周之后，使之肝素化，用甲氧氟烷(methoxyflurane)麻醉，随后切除心脏而杀死大鼠。

14.3.1.2.实验梗塞的形态分析：制取供研究的心脏

切除心脏之后，迅速地在主动脉上插上套管，首先向冠状动脉输以Krebs Henseleit溶液以清除血及血凝块，随后输以30mM KCl以舒张停博的心脏。对冠状动脉灌注及浸入10％缓冲的福尔马林，固定该心脏。为了对注入压力有足够的控制，在心脏上二尖瓣瓣膜处通以塑料管。固定之后，将心脏自底部一直至尖端沿着平行于房室沟的平行线横切成2mm的切片，制成组织切片。

14.3.2.结果

两组的存活率是一致的，即，七只之中六只存活7天，用作分析。对组织切片进行大致的观察，发现用安慰剂(placebo)处理的六只中五只呈现较大的透壁性(transmural)心肌梗塞(据估计至少占有左心室的15％)。而在存活的用sCR1处理6只的大鼠中，仅一只发现有大区域透壁性梗塞。其他的经sCR1处理的大鼠在左心室具有小得多的小补钉块状的梗塞(少于15％)。事实上，多数梗塞只有凭显微镜才可以察出，而用安慰剂处理的大鼠的梗塞十分明显，粗略一看便可察觉。

14.3.3.结论

结果表明，sCR1处理对于减轻体内重新输注(reperfusion)损伤是有效的，具有可以改善心肌梗塞的病症的效果。甚至可以在一定程度上改善重新输注的(reperfusion)损伤，被挽救的心肌的绝对数量可以增加，而且可以延长重新输注(reperfusion)在临床上是用用的时间。用sCR1治疗应该是伴随于对急性梗塞时所作的溶血栓处理，如下所述，或囊冠状血管成形术治疗中的有用的辅助疗法。

15.实例：可溶性补体受体1(sCR-1)与对甲氧苯酰化人类血纤维蛋白溶酶原-链激酶-激活剂复合物(APSAC)的共同制剂

将如12.2节中所述制备的纯化sCR-1(0.93毫克在无菌Dulbecco磷酸缓冲盐水中，1.0毫升)加入在无菌水(4.0毫升)中复苏的一小瓶APSAC中。APSAC制剂具以下成分：

APSAC                        30单位

D-甘露醇                     100毫克

人类血清白蛋白E.P.           30毫克

对氨基苯基p-茴香酸盐·HCl    0.15毫克

L-赖氨酸·HCl                35毫克

6-氨基己酸                   1.4毫克

(所有数字都经过一般分析方差)

溶液充分混和，用固体CO₂使小瓶在-78℃冷冻。产物在2-3毫巴1-60℃(压缩温度)真空冷冻干燥24小时，小瓶重新塞住，在-70℃保存。复苏时，将小瓶溶于0.1M Hepes，0.15M NaCl pH7.4(1.0毫升)，并置于冰上。测试用的稀释液也用此Hepes缓冲液制备。作为对照，一瓶单独的APSAC(同一批)  用同样方式复苏，一种新鲜解冻的sCR-1样品(同一批)也作为对照进行了测试。根据13.2.1节中所述的方法，测定样品对补体介导的溶血的抑制作用，结果示于下面的表XII。

                    表XII

            SCR-1/APSAC，APSAC和

            sCR-1抗溶血活性的比较

                       对照溶血的抑制百分数稀释液  最终sCR1浓度   sCR-1/APSAC  sCR-1           APSAC

       (ng/ml)1∶500       465        97.5(1.1)    96.8(1.2)        01∶2500      93         90.9(0.7)    90.6(1.3)        01∶5000      46.5       81.5(2.3)    82.6(2.5)        ND1∶12500     18.6       54.6 (2.4)   51.4(2.6)        01∶50000     4.65       11.0(2.4)    13.2(0.6)        0*在括号内的数字是四次重复测定的标准误差

表XII中的弯曲排列的数字给出50％抑制溶血的sCR-1的浓度值，对sCR-1/APSAC为15.7±3.0ng/ml，对单独SCR-1为16.0±2.9ng/ml。这些数字没有差异，结果表明与一个APSAC药物剂型的共同制剂并不影响sCR-1的活性。

16.微生物保藏

带有质粒piABCD且编码全长CR1蛋白质的E.coli菌株DK1/P3(称之pCR1-prABCD)已于1988年3月31日保藏在美国伊利诺斯州、皮奥里亚、农业研究培养物收集处(NRRL)。保藏号为B-18355。

带有编码可溶性CR1分子的质粒pBSCR1c/PTCSgpt克隆35.6的中国仓鼠卵巢细胞系DUXB11已于1989年3月23日由美国、马里兰州，罗克维莱的美国典型培养物保藏中心(ATCC)保藏，保藏号为CRL10052。

本发明并不限于由保藏的微生物所规定的范围，因为具体保藏的微生物为本发明的一方面的一个实例，而功能上等同的任何微生物均在本发明的范围之内。当然，除了本文中所说明和叙述的之外，自上述的说明书和附图得出的本发明的各种改进对于本技术领域中的技术人员来说将是显而易见的。应当认为，这样一些改进均包括在以下的权利要求书的范围内。

还应指出，文中所给核苷酸的所有碱基对大小均是近似的且用于叙述的目的。

这里引用了各种参考资料，本申请结合参考资料已全文公开。

Claims (6)

1.一种可溶性CR1分子或其活性片段的用途，其特征在于，该可溶性CR1分子或其活性片段被用于制备用于治疗血栓形成或心肌梗塞的药物组合物，其中该可溶性CR1分子的氨基酸序列如下：QCNAPEWLP FARPTNLTDE FEFPIGTYLN YECRPGYSGR PFSIICLKNS VWTGAKDRCPRKSCRNPPDP VNGMVHVIKG IQFGSQIKYS CTKGYRLIGS SSATCIISGD TVIWDNETPICDRIPCGLPP TITNGDFIST NRENFHYGSV VTYRCNPGSG GRKVFELVGE PSIYCTSNDDQVGIWSGPAP QCIIPNKCTP PNVENGILVS DNRSLFSLNE VVEFRCQPGF VMKGPRRVKCQALNKWEPEL PSCSRVCQPP PDVLHAERTQ RDKDNFSPGQ EVFYSCEPGY DLRGAASMRCTPQGDWSPAA PTCEVKSCDD FMGQLLNGRV LFPVNLQLGA KVDFVCDEGF QLKGSSASYCVLAGMESLWN SSVPVCEQIF CPSPPVIPNG RHTGKPLEVF PFGKAVNYTC DPHPDRGTSFDLIGESTIRC TSDPQGNGVW SSPAPRCGIL GHCQAPDHFL FAKLKTQTNA SDFPIGTSLKYECRPEYYGR PFSITCLDNL VWSSPKDVCK RKSCKTPPDP VNGMVHVITD IQVGSRINYSCTTGHRLIGH SSAECILSGN AAHWSTKPPI CQRIPCGLPP TIANGDFIST NRENFHYGSVVTYRCNPGSG GRKVFELVGE PSIYCTSNDD QVGIWSGPAP QCIIPNKCTP PNVENGILVSDNRSLFSLNE VVEFRCQPGF VMKGPRRVKC QALNKWEPEL PSCSRVCQPP PDVLHAERTQRDKDNFSPGQ EVFYSCEPGY DLRGAASMRC TPQGDWSPAA PTCEVKSCDD FMGQLLNGRVLFPVNLQLGA KVDFVCDEGF QLKGSSASYC VLAGMESLWN SSVPVCEQIF CPSPPVIPNGRHTGKPLEVF PFGKAVNYTC DPHPDRGTSF DLIGESTIRC TSDPQGNGVW SSPAPRCGILGHCQAPDHFL FAKLKTQTNA SDFPIGTSLK YECRPEYYGR PFSITCLDNL VWSSPKDVCKRKSCKTPPDP VNGMVHVITD IQVGSRINYS CTTGHRLIGH SSAECILSGN TAHWSTKPPICQRIPCGLPP TIANGDFIST NRENFHYGSV VTYRCNLGSR GRKVFELVGE PSIYCTSNDDQVGIWSGPAP QCIIPNKCTP PNVENGILVS DNRSLFSLNE VVEFRCQPGF VMKGPRRVKCQALNKWEPEL PSCSRVCQPP PEILHGEHTP SHQDNFSPGQ EVFYSCEPGY DLRGAASLHCTPQGDWSPEA PRCAVKSCDD FLGQLPHGRV LFPLNLQLGA KVSFVCDEGF RLKGSSVSHCVLVGMRSLWN NSVPVCEHIF CPNPPAILNG RHTGTPSGDI PYGKEISYTC DPHPDRGMTFNLIGESTIRC TSDPHGNGVW SSPAPRCELS VRAGHCKTPE QFPFASPTIP INDFEFPVGTSLNYECRPGY FGKMFSISCL ENLVWSSVED NCRRKSCGPP PEPFNGMVHI NTDTQFGSTVNYSCNEGFRL IGSPSTTCLV SGNNVTWDKK APICEIISCE PPPTISNGDF YSNNRTSFHNGTVVTYQCHT GPDGEQLFEL VGERSIYCTS KDDQVGVWSS PPPRCISTNK CTAPEVENAIRVPGNRSFFS LTEIIRFRCQ PGFVMVGSHT VQCQTNGRWG PKLPHCSRVC QPPPEILHGEHTLSHQDNFS PGQEVFYSCE PSYDLRGAAS LHCTPQGDWS PEAPRCTVKS CDDFLGQLPHGRVLLPLNLQ LGAKVSFVCD EGFRLKGRSA SHCVLAGMKA LWNSSVPVCE QIFCPNPPAILNGRHTGTPF GDIPYGKEIS YACDTHPDRG MTFNLIGESS IRCTSDPQGN GVWSSPAPRCELSVPAACPH PPKIQNGHYI GGHVSLYLPG MTISYTCDPG YLLVGKGFIF CTDQGIWSQLDHYCKEVNCS FPLFMNGISK ELEMKKVYHY GDYVTLKCED GYTLEGSPWS QCQADDRWDPPLAKCTSRAH DA.

而且所述的CR1活性片段含有2-28个短一致重复序列SCR，且这些短一致重复序列的氨基酸序列如下：

                                                                          SCR#QCNAPEWLPF ARPTNLTDEF EFPIGTYLNY ECRPGYSERP FSIICLKNSV WTGAKDRCRR              1KSCRNPPDPV NGMVHVIKGI QFGSQIXYSC TKGYRLIGSS SATCIISGDT VIWDNETPIC DR           2IPCGLPPTIT NGDFISTNRE NFHYGSVVTY RCNPGSGGRK VFELVGEPSI YCTSNDDQVG IWSGPAPQCI   3IPNKCTPPNV ENGILVSDNR SLFSLNEVVE FRCQPGFVMK GPRRVKCQAL NKWEPELPSC SR           4VCQPPPDVLH AERTQRKKDN FSPGQEVFYS CEPGYDLRGA ASMRCTPQGD WSPAAPTCEV              5KSCDDFMGQL LNGRVLFPVN LQLGAKVDFV CDEGFQLKGS SASYCVLAGM ESLWNSSVPV CEQ          6IFCPSPPVIP NGRHTGKPLE VFPFGKAVNY TCDPHPDRGT SFDLIGESTI RCTSDPQGNG VWSSPAPRCG I 7HCQAFDHFLF AKLKTQTNAS DFPIGTSLKY ECRPEYYGRP FSITCLDNLV WSSPKDVCKR              8KSCKTPPDPV NGMVHVITDI QVGSRINYSC TTGHRLIGHS SAECILSGNA AHWSTKPPIC QR           9IPCGLPPTIA NGDFISTNRE NFHYGSVVTY RCNPGSGGRK VFELVGEPSI YCTSNDDQVG IWSGPAPQCI   10IPNKCIPPNV ENGILVSDNR SLFSLNEVVE FRCQPGFVMK GPRRVKCQAL NKWEPELFSC SR           11VCQFPPDVLH AERTQRDKDN FSPGQEVFYS CEPGYDLRGA ASMRCTPQGD WSPAAPTCEV              12KSCDDFMGQL LNGRVLFPVN LQLGAKVDFV CDEGFQLKGS SASYCVLAGM ESLWNSSVPV CEQ          13IFCPSPPVIP NGRHTGKPLE VFPFGKAVNY TCDPHPDRGT SFDLIGESTI RCTSDPQGNG VWSSPAPRCG I 14HCQAPDHFLF AKLKTQTNAS DFFIGTSLKY ECRPEYYGRP FSITCLDNLV WSSPKDVCKR              15KSCKTPPDPV NGMVHVITDI QVGSRINYSC TTGHRLIGHS SAECILSGNT AHWSTKPPIC QR           16IPCGLPPTIA NGDFISTNRE NFHYGSVVTY RCNLGSRGRK VFELVGEPSI YCTSNDDQVG IWSGPAPQCI   17IPNKCTPPNV ENGILVSDNR SLFSLNEVVE FRCQPGFVMK GPRRVKCQAL WKWEPELPSC SR           18VCQPPPFILH GEHTPSHQDN FSPGQEVFYS CEPGYDLRGA ASLHCTPQGD WSPEAPRCAV              19KSCDDFLGQL PHGRVLFPLN LQLGAKVSFV CDEGFRLKGS SVSHCVLVGM RSLWNNSVPV CEH          20IFCPNPPAIL NGRHTGTPSG DIPYGKEISY TCDPHPDRGM TFNLIGESTI RCTSDPHGNG VWSSPAPRCE L 21HCKTPEQFPF ASPTIPINDF EFPVGTSLNY ECRPGYFGKM FSISCLENLV MSSVEDNCRR              22KSCGPPPEPF NGMVHINTDT QFGSTVNYSC NEGFRLIGSP STTCLVSGNN VTWDKKAPIC EI           23ISCEPPPTIS NGDFYSNNRT SFHNGTVVTY QCHTGPDGEQ LFELVGERSI YCTSKDDQVG VWSSPPPRCI   24STNKCTAPEV ENAIRVPGNR SFFSLTEIIR FRCQPGFVMV GSHIVQCQTN GRWGPKLPHC SR           25VCQPPPEILH GEHTLSHQDN FSPGQEVFYS CEPSYDLRGA ASLHCTPQGD WSPEAPRCTV              26KSCDDFLGQL PHGRVLLPLN LQLGAKVSFV CDEGFRLKGR SASHCVLAGM KALWNSSVPV CEQ          27IFCPNPPAIL NGRHTGTPFG DIPYGKEISY ACDTHPDRGM TFNLIGESSI RCTSDPQGNG VWSSPAPRCE L 28

且该CR1活性片段至少具有SCR1-2，或至少具有SCR8-9，或至少具有SCR15-16。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，该可溶性CR1分子是由图1所示的151-5943位的核酸序列所编码。

3.一种可溶性CR1分子的用途，该可溶性CR1分子被用于制备用于治疗血栓形成或心肌梗塞的药物，其特征在于，该可溶性CR1分子由携带质粒pBSCR1s/pTCSgpt的中国仓鼠卵巢细胞DUXB11所产生，该细胞被保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC C89006。

4.如权利要求1、2或3所述的用途，其特征在于，该药物组合物还含有溶血栓剂。

5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，溶血栓剂选自下列各组物质：

(a)血纤维蛋白溶酶原激活剂或其突变蛋白；

(b)甲氧苯甲酰化的血纤维溶酶原-链激酶-激活剂复合物；

(c)单链尿激酶；

(d)双链尿激酶；

(e)链激酶；

(f)血纤维蛋白溶解活性杂合蛋白质，该杂合蛋白质包括第一个双链蛋白酶的一条链和第二个双链蛋白酶的一条链，此两条链交联，其中所述的第一个和第二个蛋白酶中至少有一个具有血纤维蛋白溶解活性，这样所述的杂合蛋白具有催化位点，该催化位点对血纤维蛋白溶解活性至关重要并能被可移动的阻断基团随意地阻滞；

(g)一种体内可逆阻断的血纤维蛋白溶解酶，其中在所述的酶上，对血纤维蛋白溶解活性至关重要的催化位点被一基团所阻断，该基团可在一定速率下水解移去，该条件相当于在等渗含水介质中，pH7.4，37℃时，水解准一级速率常数为10^-6/秒至10^-3/秒。

6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，该药物组合物含有的可溶性CR1分子足以提供0.5-50mg的CR1分子/标准剂量的溶血栓剂。

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