CN1089951A - 新的可溶性补体受体i的糖型 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及可溶性补体受体I型(SCR1)制剂及 新的糖型，以及它们在治疗补体介导的疾病和失调 (包括炎症和不适当补体激活，血栓形成或休克症状) 方面的应用。本发明提供新的糖型以及这些糖型的 生产、检测、富集以及纯化的方法。本发明进一步提 供以重组或化学手段生产特定糖型的方法。本发明 优选的实施方案中包括唾液酸化糖型和以色谱聚焦 法测定pH≤5.1的糖型或唾液酸与甘露糖摩尔比≥ 0.25的糖型。该糖型可单独配制成治疗组合物或与 溶血栓剂相结合。

Description

本发明涉及可溶性补体受体1型（sCR1）的新的糖型（glycoform），及其在补体活性相关疾病和各种炎性以及免疫性疾病的诊断和治疗中的应用。本发明也提供该糖型的生产，检测和提纯方法。
补体系统
构成正常血清中约10%球蛋白的补体系统由许多不同蛋白组成，这些蛋白在免疫系统对外来抗原的应答方面是很重要的。当补体系统的初级成份分裂，而分裂的碎片单独的或者同其它蛋白一起激活另外的补体蛋白时，结果引起连锁蛋白溶解反应，于是便使补体系统激活。补体系统激活导致血管通透性增加，吞噬细胞趋化性、炎性细胞激活，外来颗粒受调理素影响，直接杀死细胞以及损伤组织。补体系统激活可由抗原-抗体复合物（经典途径）启动，或者例如由病原体细菌细胞壁上存在的脂多糖引发（替代途径）。
膜结合补体受体1型
补体受体1型（CR1）存在于红细胞、单核细胞/巨噬细胞，粒细胞、B细胞、某些T细胞、脾滤泡树突细胞以及肾小球足状突细胞的膜上。CR1可与补体成份C3b和C4b结合，并被称之为C3b/C4b受体。CR1的结构组织和初级序列是已知的（Klickstein  等人，1987，J.Exp.Med.165∶1095-1112;Klickstein等人，1988，J.Exp.Med.168∶1699-1717;Hourcade等人，1988，J.Exp.Med.168∶1255-1270）。它由含60-70个氨基酸的30个短的一致重复链（SCRs）组成，每个SCR中，平均65个氨基酸中的29个保持不变。推断出各SCR均通过二硫键形成三维三环结构，其中第3和第1半胱氨酸以及第4和第2半胱氨酸连于二硫键中。CR1进一步排列成各由7个SCRs组成的4个长的同源重复链（LHRs）。在引导序列（转译后除去）后，CR1分子由含C4b结合区的N-最末端LHR-A、含C3b结合区的两个重复键LHR-B和LHR-C以及C最末端的LHRD组成，其后接有2个其它SCRs，一个是25残基的推测横跨膜区和一个是43残基的细胞质尾。
CR1系蛋白质超科中一员，以该SCR同源性为特征。有C3/C4结合功能的某些超科成员包括CR2、C4结合蛋白、H因子、B因子和C2，而缺乏该功能的蛋白质包括白细胞介素-2受体、β2-糖蛋白I、Clr，结合珠蛋白α链以及ⅩⅢb因子。
CR1被认为是糖蛋白，其推断氨基酸序列有用于胞外区N-连接糖基化作用（氨基酸一致序列NXS或NXT）的25个潜在位点。据载这些可利用的位点只有6-8个连接到低聚糖上（Sim，1985，Biochem.J.232∶883）。CR1的非糖基化形式于衣霉素存在下产生，表现出连接iC3能力降低（Lublin等人，1986，J.Biol.Chem.261∶5736），看来糖蛋白N-末端被阻隔了。
目前为止，已鉴定出四种不同CR1等位基因型或异型，其大小上有30-50KDa增量之别。在人群中，这些异型的基因频率各不相同（Holer  等人，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84∶2459-2463）。F（或A）异型由4个LHR组成，其分子量约为250KDa;较大的S（或B）异型分子量约为290KDa，含有系LHR-B的5′半和LHR-A3′半嵌合体的第5LHR，预测它有第3个C3b连接位点（Wong等人，1989，J.Exp.Med.169∶847）。最小的F′（或C）异型（最大可能是由于LHR-B和一个C3b结合位点的缺失引起的）在全身性红斑狼疮（SLE）病人中含量增加（Van  Dyne等人，1987，Clin.exp.Immunol.68∶570;Dykman  等人，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA80∶1698）。
可溶性补体受体1型
天然出现的可溶性CR1在正常个体一和某些患SLE的个体的血浆中检测出来（Yoon等人，1985，J.Immunol.134∶3332-3338）。其特征是结构和功能上都与红细胞（细胞表面）CR1相似。Hourcade等人（1988，J.Exp.Med.168∶1255-1270）也观察到预料产生分泌形式CR1的人CR1转录单元中的其它聚腺苷酸化位点。由该平切序列编码的mRNA含CR1的第一8.5SCRs，并且它编码包括C4b结合区的约80KDa蛋白质。当相应于上述平切序列的cDNA转染于COS细胞并表达时，它表现出预料的C4b结合活性，但不结合C3b（Krych  等人，1989，FASEB  J.3∶A368）。Krych等人也在几种人细胞系中观察到相似于预期的一种mRNA，并假定这种具C4b结合活性的CR1平切可溶形式可以在人体中合成。
借助重组DNA方法，从正被表达的DNAs中消除横跨膜区，已生成几种可溶性CR1片断（Fearon等人，Intl.Patent  Publ.Wo89/09220，10/5/89;Fearon等人，Intl.Patent  Publ.Wo91/05047，4/18/91）。该可溶性CR1片断依据其所含的区而具有功能活性，可结合C3b和/或C4b、并表现出因子Ⅰ辅助因子活性。这样的构件于体外抑制补体激活所产生的后果，例如中性白细胞氧化破裂、补体介导血细胞溶解，以及C3a和C5a产生。一种可溶性构件SCR1/pBSCR1C也表现出体内逆转被动局部过敏坏死反应活性（Fearon  等人，1989，1991，前述文献;Yeh  等人，1991，J.Immunol.146∶250），也具抑制心肌缺血后感染及坏死活性（Fearon等人，上述文献;Weisman等人，Science，1990，249∶146-151），并且能提高移植后的成活率（Pruitt  &  Bollinger，1991，J.Surg.Res  50∶350;Pruitt等人，1991，Transplantation52;868）。此外，载体sCR1/pBSCRIC可溶性产物与对甲氧苯甲酰化的人血浆酶原-链激酶-激活因子复合物（APSAC）的合剂也能产生与单用SCR1/pBSCR1C产物相似的抗溶血活性，这表明补体抑制剂sCR1与血栓溶解剂的组合是可行的（Fearon等人，同上）。
国际专利申请No.Wo89/09220（1989年10月5日公开）和No。WO91/05047（1991年4月18日公开）全文均引入本文作为参考。
本发明涉及新的可溶性补体受体1型蛋白（sCR1）的糖型以及它们在治疗涉及补体活性的疾病和各种炎性以及免疫性疾病中的应用。
本发明人已揭示，在一定生产条件下，可获得sCR1的新的糖型，该糖型具有能延迟从血液中消除，而又保留其主要功能活性的所希望特性。此种长效半衰期使得便于简单地团块给药及有助于发挥体内效能。
本发明使用各种提纯方法来溶解和富集特种sCR1糖型。因此本发明提供含一种或多种复合低聚糖结构的可溶性补体受体1（sCR1）糖蛋白分子，该低聚糖结构的一种或多种其末端带有平均一个或多个唾液酸残基。
在一个实施方案中，描述分子里含一种或多种复合低聚糖结构的sCR1糖蛋白的制备，其中低聚糖结构至少有40%平均含至少1个末端唾液酸残基。优选该分子含一种或多种复合低聚糖结构，其中至少有70%平均含至少1个末端唾液酸残基。
在一个实施方案中，一种sCR1制剂含有sCR1糖蛋白分子，其中占优势的糖型，经色谱聚焦（chromatofocusing）法测定其等电点PI小于或等于5.1，而经神经氨酸苷酶处理后PI提高。
在另一实施方案中，一种sCR1制剂含有一种sCR1糖蛋白，其中唾液酸与甘露糖摩尔之比大于或等于0.25。
优选的本发明sCR1制剂，具有至少25%的去糖基化sCR1的功能补体抑制活性。
优选的本发明的分子或制剂的实施方案中，该sCR1糖蛋白的蛋白骨架含LHR-A、LHR-B、LHR-C、LHR-D、sCR29以及sCR30区，直达（和包括）横跨膜区的第1丙氨酸残基。
本发明也针对含有治疗有效量的上述一种sCR1糖蛋白分子和一种药物学上可接受载体或赋形剂的药用组合物。在一个实施方案中，该药用组合物还含有治疗有效量的溶血栓剂。
优选溶血栓选自如下药剂组成的一类：
（a）血浆酶原激活剂或其突变蛋白;
（b）对甲氧苯甲酰化血浆酶原-链激酶激活剂复合物（APSAC）;
（c）单链尿激酶;
（d）双链尿激酶;
（e）链激酶;
（f）纤维蛋白溶解活性杂交蛋白，该蛋白包括第1双链蛋白酶的一个链连于第2双链蛋白酶的一个链上，所说第1和第2蛋白酶的至少一个有纤维蛋白溶解活性，因此，所说杂的交蛋白有作为纤维蛋白溶解活性之基础的催化位点，它可以由能被除去的阻断基团加以阻断。
（g）在体内可逆性阻隔的纤维蛋白溶解酶，其中作为所说酶的纤维蛋白溶解活性之基础的催化位点由通过水解能除去的基团加以阻隔，其水解过程按在等渗水溶液中，PH7.4，37℃下以假一级水解速度常数在10-6sec-1至10-3sec-1的范围内的水解速度进行。
本发明也提供治疗由炎症或不适当补体激活引起的疾病或失调的方法，包括给需要治疗的患者施用上述治疗有效量的sCR1药物组合物。
本发明也提供治疗血栓形成病态的方法，包括给需要此类治疗的患者施用有效量的sCR1药物组合物，或者优选施用上述包括溶血栓剂的药物组合物。
上述方法中，“患者”优选人。
本发明进一步针对上述sCR1糖蛋白或sCR1制剂的制备方法，包括：
（a）在培养的哺乳动物宿主细胞中，表达编码该sCR1蛋白骨架的DNA分子，该培养条件是细胞生长不受限于营养补充，且该宿主细胞能使低聚糖链唾液酸化（Sialylation）。
（b）从培养物中分离sCR1糖蛋白。
在优选方案中，该方法进一步包括下述步骤：
（c）从步骤（b）所得物质中分离出含唾液酸分子。
上述方法中，优选培养条件包括一个流体化床生物反应器，空心纤维生物反应器，滚动瓶培养或搅拌罐生物反应器体系，后两体系带有或不带有细胞微载体。
上述细胞培养的sCR1糖蛋白产物可通过亲和、体积排斥、离子交换或疏水相互作用色谱法来提纯。为富集含唾液酸分子，优选采用可收集更多酸级分的离子交换软凝胶色谱或利用阳离子或者阴离子树脂的HPPLC方法。含唾液酸分子也可通过色谱聚焦（chromatofocusing）或外源凝集素亲和色谱来分离。
优选哺乳动物宿主细胞系能表达唾液酸转移酶者，其表达水平要能足以保证表达的sCR1糖蛋白中低聚糖的基本唾液酸化。适宜的宿主细胞包括CHO系，优选DUX  B11细胞系。
缩写和定义：
APSAC＝甲氧苯甲酰化的血浆酶原-链激酶激活剂复合物
PI＝等电点
HPLC＝高效液相色谱
IH50%＝产生50%溶血抑制作用的浓度
SRBC＝羊红血细胞
EIA＝酶免疫检测
W/V＝重量体积之比
V/V＝体积与体积之比
KDa＝千道尔顿
ELISA＝酶联免疫吸附检测
gu＝葡萄糖单元
SDS-PAGE＝十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳
glycoforms＝糖蛋白品种，例如本发明的可溶性CR1糖蛋白，以其碳水化合物成分，色谱表现和/或电荷为特征
TP10HD＝一种特定可溶性CR1构件，它含有LHR-A、LHR-B、LHR-C、LHR-D、SCR29、SCR30区直至（和包括）横跨膜区的第一个丙氨酸残基;TP10HD相当于质粒pBSCR1中的CR1编码序列Fearon等人，Int′l  Patent  Publication  No.WO  89/09220  1989年10月5日）
TP10HD-CC＝如本文所述由流体化床灌注生物反应器中培养的细胞产生，并经联合色谱提纯的.TP10HD
TP10HD-CCW＝由制备型HPLC阳离子交换色谱分离的TP10HD-CC弱阳离子型
TP10HD-CCS＝由制备型HPLC阳离子色谱分离的TP10HD-CC的强阳离子型
TP10H-CX＝由空心纤维生物反应器培养的细胞产生的，经HPLC阳离子交换色谱提纯的TP10HD（Fearon等人，同上）
TP10HD-CXD＝以n-聚糖酶促除糖基化的TP10HD-CX
附图简介
图1是于280nm处的一系列吸收图，表示以不同方法提纯的TP10HD制剂的HPLC分析结果。修改的Hydropore-SCXHPLC纯化法用于证明TP10HD糖型的存在。
其中A图：由亲和色谱提纯的TP10HD物质，含有多种糖型，主要的糖型均为强阳离子型（即于约125mM  NaCl洗脱）。
B图：由联合色谱提纯的TP10HD物质，含多种糖型，弱阳离子糖型对强阳离子糖型浓度之比在70∶30至80∶20之间。
C图：由HPLC阳离子交换色谱提纯的TP10HD，仅含强阳离子糖型。
图2表示以50-250mM  NaCl梯度液从S-琼脂糖柱上洗脱T10HD剖面图。表示出相应于库1和库2的峰值，流速为2ml/分钟，绘图速度为0.25cm/min，在280nm满刻度敏感度为0.2吸收单位。
图3表示从图2的S-琼脂糖柱上洗脱的物质的SDS-PAGE凝胶图形。泳道1：高分子量标准物;泳道5和8：S-琼脂糖库1（各2.4μg）;泳道6和9：S-琼脂糖库2（分别5.0和6.7μg）。
图4表示来自TP10HD-CCW（右边一组）和来自TP10HD-CCS（左边一组）的低聚糖链的四个放射电泳图。其中下面两图表示经唾液酸苷酶处理后的情况。
图5表示来自TP10HD-CCS（A）和TP10HD-CCW（B）的低聚糖链的两个色谱显示尺寸及相对比例。
图6表示TP10HD-CC（上）和TP10HD-CX（下）的色聚焦柱记录图。
本发明涉及可溶性补体受体1型蛋白（sCR1）的新糖型及其在诊断和治疗补体活性相关疾病和各种炎性以及免疫性疾病中的应用。
可溶性补体受体1（sCR1）在本文中定义为含所有30个胞外SCR区的可溶形式的人CR1。
sCR1及其制备方法曾公开于国际专利公开号WO89/09220（1989.10.5）和WO91/05047（1991.4.18）中。优选该sCR1物质于流体化床灌注生物反应器中，培养重组中国仓鼠卵巢（CHO）DUX  B11细胞来制备（见以上WO91/05047）。在一优选情况下可使用包含有质粒pBSCR1c/pTCSgpt的（ATCC登记号CRL0052）CHO细胞系DUX  B11。
本发明的sCR1糖型以其碳水化合物成分，色谱表现和/或电荷为特征。由此本发明提供：
（1）含以一个或多个唾液酸残基为末端的复合低聚糖的sCR1;
（2）由色谱聚焦法测量的等电点为PI≤5.1的sCR1，若用神经氨酸酶处理则PI提高;
（3）其中至少40%低聚糖含以一个或多个唾液酸残基为末端的复合低聚糖的sCR1制剂;
（4）至少70%所含低聚糖结构系唾液酸末端分子的优选sCR1制剂;
（5）其中唾液酸与甘露糖之摩尔比≥0.25的sCR1制剂;和
（6）具至少25%非糖基化sCR1的抗补体功能活性的优选sCR1糖型和制剂。
优选的糖蛋白是所含低聚糖相似或者等同于人类天然糖蛋白的低聚糖之糖蛋白。具有此类低聚糖的sCR1制剂的优点在于施用于人后它们所产生的致免疫力有较低风险。
本发明的sCR1糖型及制剂的特征也在于其功能活性，因此它们优选表现出有关sCR1分子的任何一种或多种活性，包括（但不限于）下述活性：
（1）结合单体和/或聚合物C3b和/或C4b或C4ma;
（2）避免在补体激活的血清中C3a或C5a产生;
（3）因子Ⅰ辅助因子活性，
（4）抑制补体诱导中性白细胞氧化破裂，以及
（5）抑制补体介导的血细胞溶解
sCR1糖型的培养，提纯及富集
本发明的sCR1糖型和制剂，可通过在各种不同的细胞培养条件下，使表达重组sCR1编码DNA的细胞生长来制备，这些细胞培养条件包括（但不限于）流体化床生物反应器、空心纤维生物反应器、滚动瓶培养或搅拌罐生物反应器等体系，后两体系带有或不带有微载体。
本发明的sCR1糖型可通过在哺乳动物宿主细胞中表达编码sCR1或编码sCR1片断的DNA来获得。优选哺乳动物宿主细胞是能表达一种功能性唾液酸转移酶者，该酶能使含低聚糖链（优选是一个或多个末端唾液酸残基）的sCR1糖型产生。根据本发明的适宜的宿主细胞包括CHO系，优选DUX、B11细胞系。
细胞培养条件按能达到所希望的唾液酸化水平的原则来选择。影响唾液酸化作用程度的加工参数包括氧化水平和葡萄糖水平，细胞密度、时间、和贮存条件（例如温度）也影响唾液酸化作用。
每个复合低聚糖结构含2个或更多唾液酸残基的sCR1糖型在体内有较长的清除速率。而该制剂的清除速率可以操纵于由制剂唾液酸化总程度限定的很宽范围内。碳水化合物成分对血清（或血浆）清除的影响与功能活性关系不大，去糖基化作用导致快速血浆清除，但却极少增加体外功能活性。
在这些培养物中产生的经表达的sCR1糖型可按常规方法提纯，例如亲和，体积排斥、离子交换和/或疏水相互作用色谱（HIC）。能得到亲和色谱使用的几种CR1-特异性抗体（Changelian等人，1985，J.Immunol.134∶1851）。
可利用很多基质来填制HIC柱，最为广泛使用的是琼脂糖，也可使用硅石和有机高聚物树脂。适用的疏水配体包括（但不限于）2-10个碳原子的烷基（例如丁基、丙基或辛基）;或苯基之类的芳基。常规的HIC用的凝胶和柱料可从市场上购得，其商品名为：丁基-SEPHAROSE
Figure 931176247_IMG1
、苯基-SEPHAROSE
Figure 931176247_IMG2
、CL-4B，辛基-SEPHAROSE
Figure 931176247_IMG3
FF及苯基-SEPHAROSE
Figure 931176247_IMG4
FF（Pharmacia LKB AB Uppsala.Sweden）;TOYOPEARL丁基650M（Fractogel TSK 丁基-650）或TSK-GEL苯基-5PW（Tosoh Corporation，Tokyo，Japan）;烷基-琼脂糖，其中的烷基含2-10个碳原子（Miles-Yeda，Rehovot Israel）;以及Bakerbond WP-HI-丙基（J.T.Baker Phillipsburg，NJ.）。
使用常规的化学法也可制备所需的HIC柱（如参见Er-el，Z.等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.49∶383（1972）;Ulbrich，V.等人Coll.Czech  Chem  Commum.9∶1466（1964））普通专业技术人员能够决定具体选择什么样的凝胶。一般来说蛋白质与HIC配体之间相互作用的强度随烷基配体的链长而增加，而有约4到约8个碳原子的配体对于大部份分离工作来说都是适用的。高盐浓度对于蛋白质向HIC柱的吸附有利，但是根据蛋白质的性质以及选择的具体HIC配体，该实际浓度可于很宽范围内调节之。一般说来，盐浓度用约0.75-约2M硫酸铵或约1-约4M氯化钠。
无论分步洗脱或以梯度形式洗脱，均可按不同方法进行：（a）改变盐浓度，（b）改变溶剂的极性或（c）加入洗涤剂。
HIC若与其它蛋白纯化技术联合使用，则特别有用。
按已知技术，对于离子交换色谱来说，各种阴离子或阳离子取代基可连接于基质上，形成阴离子或阳离子载体。阴离子交换取代基包括二乙基氨基乙基（DEAE）、季氨基乙基（QAE）以及季胺（Q）基团。阳离子交换取代基包括羧甲基（CM）、磺基乙基（SE）、磺基丙基（SP）、磷酸根（P）和磺酸根（S）。市场上可购得的离子交换材料包括：纤维素离子交换树脂，例如DE23、DE32、DE52、CM-23、CM-32和CM-52（Whatman Ltd.Maidstone，Kent.UK）;SEPHADEXr为基础和交联的离子交换树脂，例如DEAE-、QAE-、CM-和SP-SEPHADEX
Figure 931176247_IMG5
和DEAE-、Q-、CM-和S-SEPHAROSE
Figure 931176247_IMG6
（Pharmacia AB）;DEAE-和CM-衍生的乙二醇-甲基丙烯酸共聚物，例如TOYOPEARL DEAE-650S和TOYOPEARL CM-450S（Toso Haas Co.，Philadelphia，PA）。
体积排斥或凝胶过滤色谱系根据分子大小来加以分离。优选的基质材料是化学上呈惰性的、刚性的多孔物质。对于大规模生产来说，在确定的总流速的情况下，刚性是很重要的。优选更新研制的能增加刚性的凝胶，例如，SEPHACRYL
Figure 931176247_IMG7
、ULTROGEL
Figure 931176247_IMG8
、FRACTOGEL
Figure 931176247_IMG9
、SUPEROSE
Figure 931176247_IMG10
、和TOYOPEARL
Figure 931176247_IMG11
HW系列基质（Toso Haas）。
通过离子交换软凝胶色谱或使用阳离子或阴离子交换树脂的HPLC可以富集含唾液酸分子的本发明所需之sCR1糖型（其中收集含较多酸的级分）。优选的分离sCR1糖型的基质为S-Sepharose。在总的蛋白提纯过程中，该S-Sepharose色谱分析一步可以早期使用，此时，可将所需糖型sCR1与其它糖型分开，而其余的提纯步骤便可在该所需糖型上进行。或者，用来解析该糖型的附加S-Sepharose提纯步骤在多步蛋白提纯过程的最后使用，如下述实施例Ⅴ所述。
也可以通过外源凝集素亲和色谱或色谱聚焦法来选择特异性sCR1糖型。
假如需要，通过常规碳水化合物分析技术，该sCR1糖型的复合碳水化合物蛋白可以很容易进行分析。例如外源凝集素印迹（该领域已知的）法表明末端的甘露糖或其它糖（如半乳糖）所占比例很低。采用无水肼或酶促法使糖从蛋白中释放出，并通过离子交换或体积排斥色谱或者本领域其它已知技术使低聚糖分级，可以确证由唾液酸形成的单、双、三或四元低聚糖末端。为进一步鉴定糖型，测量用神经氨酸斥色谱或者本领域其它已知技术使低聚糖分级，可以确证由唾液酸形成的单、双、三或四元低聚糖末端。为进一步鉴定糖型，测量用神经氨酸酶处理除去唾液酸前后的PI，神经氨酸酶处理后若PI增加，则表明在该糖型上存在唾液酸。
CR1糖型的治疗用途
本发明的sCR1糖型和制剂用于治疗和诊断许多补体介导的或补体相关的疾病和失调，包括（但不限于）下表1所列种种：
表1
涉及补体的疾病和失调
神经失调
多发性硬化症
中风
Guillain  Barre′综合症
创伤性脑损伤
帕金森氏症
不适当或不需要的补体激活引起的失调
血液透析并发症
超急性同种移植排斥
异种移植排斥
IL-2治疗期间白细胞介素-2诱导的毒性
炎性疾病
自身免疫性炎性疾病
Crohn氏病
成年人呼吸窘迫综合症
包括烧伤的热损伤或冻伤
局部缺血后再注入症状
心肌梗塞
囊性血管形成
心肺旁路或肾血液透析过程中的抽吸后综合症
肾局部缺血
传染病或脓毒症
免疫综合失调和自身免疫性疾病
类风湿性关节炎
全身性红斑狼疮(SLE)
SLE肾炎
增生性肾炎
肾小球肾炎
溶血性贫血
重症肌无力
治疗由不适当补体激活或炎症引起的疾病或失调的方法，是将治疗有效量的sCR1糖型或制剂施用于需要此种治疗的患者、优选的患者是人。
治疗疾病或失调的sCR1糖型有效量是在0.01-100mg/Kg剂量范围，优选0.1mg-10mg/Kg。
为便于给药，sCR1糖型或制剂应配制成适当的药物或治疗的组合物。此种组合物一般含治疗活性量的sCR1糖型或制剂以及药物学上可接受的赋形剂或载体，例如盐水，缓冲盐水，葡萄糖或水。组合物也可含有特定稳定剂，例如糖，包括甘露糖或甘露醇，以及用于注射组合物的局部麻醉剂例如利多卡因。
为了抑制补体激活同时提供血栓溶解治疗，本发明提供的组合物可进一步包含治疗有效量的溶血栓剂。溶血栓剂有效量为0.01-10mg/Kg剂量范围、优选0.1-5mg/Kg。优选的溶血栓剂包括（但不限于）链激酶、人组织型血浆酶原激活剂和尿激酶分子及其衍生物，或其片断或共轭物。溶血栓剂可包含可以融合或可逆连接于其它试剂的一个或多个链、形成杂交分子（EP-A-0297882和EP155387），例如，连接于血浆酶的尿激酶（EP-A-0152736），连接于水溶性高聚物的纤维水解酶（EP-A-0183503）。该溶血栓剂也可包括血浆酶原激活剂的突变蛋白（EP-A0207589）。在一优选实施方案中，溶血栓剂可包括如英国专利No.4285932所述的体内可逆性阻隔的纤维水解酶。最优选的酶是对甲氧苯甲酰化的血浆酶原-链激酶激活剂复合物（如美国专利No.4808405所述），该剂已由Smithkline  Beecham  Pharmaceuticals公司以商品名EMINASE投放市场（例如总称为anistreplase，也叫作APSAC;Monk等人，1987，Drugs  34∶25-49）。
一种如上所述的，优选的抑制补体激活或综合治疗用的治疗组合物，含有本发明的新sCR1糖型或制剂，该剂表现出具从血液中延迟清除的作用，同时保持很强功能活性。此种延迟功能性半衰期，带来简化团块给药之便并有助于在体内保持效能。优选的治疗组合物中的补体激活抑制剂包括上述sCR1糖型及制剂，例如：
（1）含以一个或多个唾液酸残基为末端的复合低聚糖的sCR1糖型;
（2）通过色谱聚焦法测量等电点PI≤5.1的制剂，其中该PI对神经氨酸酶处理敏感;
（3）含复合低聚糖的sCR1的制剂，其中至少40%复合低聚糖是以一个或多个唾液酸残基为末端的。
（4）唾液酸对甘露糖摩尔比≥0.25的sCR1制剂。
更优选治疗活性sCR1糖型和制剂应当含至少70%的以唾液酸为末端的分子和至少25%具抗补体激活活性的非糖基化sCR1。治疗组合物进一步优选的治疗活性补体激活抑制剂，应当含与人糖蛋白中所含相似或相同的天然出现的低聚糖。
本发明的单用或联合使用的治疗组合物的给药途径包括标准途径。例如静脉输注或注射浓缩药团。活性补体阻断剂与溶血栓剂可一起给药，也可按任何顺序依次给药。
本发明也提供治疗血栓症状的方法，特别是人或动物心肌梗塞症。该方法包括给需治疗的人或动物施用有效量的根据本发明的sCR1糖型或制剂以及有效量的溶血栓剂。
也提供本发明的sCR1糖型或制剂和溶血栓剂，在制造治疗人或动物血栓形成疾病的药物上的应用，该方法和应用可参照现有文献进行（国际专利公开号Wo91/05047，引入本文作为参考）
本发明也提供治疗成个人或非人类动物呼吸窘迫综合症（ARDS）的方法。该方法包括给患者施用根据本发明的有效量的sCR1糖蛋白或制剂。
通过施用根据本发明的有效量的sCR1糖型或制剂，本发明也提供减缓接受器官移植的人或动物所出现的超急性同种移植排斥或超急性异种移植排斥的方法。
现已完成对本发明的一般性叙述，参考下述实施例将会更容易理解本发明内容，这些实施例只为详述细节，而决不以此构成对本发明的限制（除非特殊情况）。
实施例1
制备和提纯TP10HD制剂
从条件组织培养基制得的TP10HD，通过亲和色谱，HPLC（或非HPLC）阳离子交换色谱，以及联合使用阳离子交换，疏水相互作用及体积排斥色谱来加以提纯。
条件细胞培养基来源
A.空心纤维生物反应器
将表达sCR1基团产物TP10HD的重组CHO  DUX  B11细胞（Fearon等人1989，1991，见上面）接种于配有Ⅳ-L型，30000道尔顿分子量切分筒（Cell-Pharm  Cell  culture  System  I  CD  Medical  Miami  Lakes  FL）的空心纤维生物反应器中的适当生长培养基中，这些培养基例如是补充有谷氨酰胺（GIBCO，Grand  Island，NY）和1-10%牛胎血清（Hyclone  Laboratories，Inc.Logan  UT）的CHO-1完全培养基系统（Ventrex  Laboratories  Inc  Portland，ME），并按厂商说明书操作。所合成的TP10HD分泌入生长培养基中，因为其分子量大（约200KDa），故存留在反应器筒的细胞分隔间里。间隔1-3天，将条件培养基从细胞分隔间里除去，离心除去污染细胞及细胞碎片，将澄清的条件培养基分配于可抛弃的实验容器中，于2-8℃保存直至纯化。在这些条件下条件培养基中含多达500μg/ml  TP10HD。
B.滚动瓶细胞培养
将表达TP10HD的重组CHO DUX B11细胞接种于滚动瓶中的适当生长培养基中，这些培养基例如可以是由Hams F12和DMEM（JHR Biosciences，Inc.，Denver，PA）混合物并补充谷氨酰胺（GIBCO，Grand Island NY），牛血清白蛋白、人转铁蛋白和牛胰岛素（Pentex-Miles Inc.， Kankakee  IL;Intergen，Purchase  NY）制得的无血清制剂。当培养完成后（约3天，可从培养基颜色由粉变黄看出），将约10ml胶原微载体（Verax  Corporation  Lebanon  NH）与新鲜培养基一起加入。间隔3天，替换一半培养基（约150ml）。过滤从条件培养基中除去细胞和细胞碎片，将澄清的条件培养基分配于可抛弃的实验容器中，在-70℃（或更低）贮存直至纯化。在这些条件下，条件培养基含约15μg/ml  TP10HD。
C.流化床输注生物反应器
将表达TP 10HD的重组CHO DUX B11细胞接种于流化床输注生物反应器（System S200和System S2000 Verax Corporation，Lebanon，NH）中的适当生长培养基中，这些培养基例如可以是由Hams F12和DMEM混合物补充以谷氨酰胺（GIBCO，Grand Island NY），牛血清白蛋白，人转铁蛋白和牛胰岛素（Pentex-Miles Inc.，Kankakee，IL;Intergen，Purchase NY）制得的无血清制剂，按厂商说明书操作该生物反应器。间隔约2天，将收集到的条件培养基从生物反应器产物贮存罐中移出，过滤除去细胞及细胞碎片，将其通过50KDa或100KDa分子量切分超滤膜（Millipore Corp Bedford，MA）使之超滤浓缩10-100倍。将经浓缩的条件培养基分配于塑瓶中于-70℃（或更低）贮存直至提纯。在这些条件下，浓缩的条件培养基含＞900μg/mlTP10HD。
提纯方案
A.亲和色谱
来自空心纤维生物反应器的条件培养基用单克隆抗体（mAb）亲和树脂加以纯化。单克隆抗体YZ1识别天然人CR1的胞外部份上的抗原决定基（Changelian  PS等人，1985，（J/mmunol  134∶1851，Wong，W.等人，1985，J.Immunol.Methods，82∶303-313）。根据厂商说明（BioRad  Corporation，Richmond，CA）使此mAb与Affigel-10结合生产亲和基质，它具有从含牛血清杂质的条件培养基中分离出TP10HD的特殊功能，也正如己有文献报道的（Yoon  等人，见上面）。简单说来，将条件组织培养基与该亲和基质一起于4℃于轻轻混和之中培养过夜。将该混合物倾入色谱柱，用10mM  Hepes，0.1M  NaCl  PH7缓冲液彻底洗涤，使所有非特异性结合物从基质中除去。用20mM磷酸钠，0.7M  NaCl，PH12的缓冲液将TP10HD从基质中解吸出，使用市售的鉴定物（BioRad.Corporation.Richmond，CA）检试柱上各级分存在m蛋白质。将会蛋白质级分汇集，以磷酸盐缓冲盐水（PH7.2-7.4）于4℃透析。以TP10HD特异性免疫鉴定法确证制剂中存在TP10HD。以4-20%线性梯度的SDS-PAGE法测试，用以上方法生产的TP10HD制剂估计为90%纯度。
B.联合色谱
将来自滚动瓶培养或流化来输注生物反应器培养的条件组织培养基进行一系列色谱分离步骤。用1NHCl酸化该条件培养基质PH降至5.2-5.5。在酸化过程中该培养基变得混浊，随后将之用0.45和0.2μm膜过滤澄清。将经酸化澄清的条件培养基于阳离子交换柱S-Sepharose  上（Pharmacia  Fine  Chemicals，Piscataway  NJ）上样，该柱经用磷酸钠0.02M，氯化钠0.06M，PH5.5的缓冲液平衡过。上样之后用初始缓冲液连续冲洗该柱，直至吸收率回复到基线。在这些条件下，所有TP10HD糖型都结合于树脂上，而来自组织培养基的蛋白质大部份不与树脂结合而洗出柱外。用磷酸钠0.02M，氯化钠0.50M，PH8.0的缓冲液将TP10HD从柱上洗脱。含TP10HD的洗脱汇集液由280nm波长处测吸收率来加以监测。
将S-Sepharose洗脱液与硫酸铵混合至终浓度为0.8-0.9M，并于疏水相互作用柱丁基-Sepharose（Pharmacia  Fine  Chemicals，Piscataway，NT）上样，该柱以磷酸钠0.1M，硫酸铵0.9M，PH7.0的缓冲液平衡过。上样以后，用初始缓冲液连续冲洗该柱，直至吸收率回复到基线。在以上条件下，所有TP10HD糖型结合于树脂上，而杂蛋白不与树脂结合而洗出柱外。然后将TP10HD用磷酸钠0.1M，PH7.0的缓冲液从柱中洗脱，该洗脱缓冲液中因排除了硫酸铵，而使得TP10HD从树脂上解吸下来。含TP10HD的洗脱汇集液于280nm波长处测其吸收率而加以监测。
再将丁基-Sepharose洗脱液上样于体积排斥柱Sephacryl  S-300（Pharmacia  Fine  Chemicals，Piscatanway，NJ）上，该柱以磷酸盐缓冲盐水（0.01M磷酸钠，0.15M氯化钠）PH7.0-7.4平衡过。上样以后，测吸收率来监测TP10HD的洗脱。收集刚从体积排斥柱洗脱后的洗脱物，用对TP10HD有特异性的酶免疫测定法来测定提纯的TP10HD量。将样品分成等分，于-70℃（或更低）冷冻贮存。通过4-20%线性梯度的SDS-PAGE检测，该方法生产的TP10HD制剂，估计其纯度为＞90%。
结论
表达修饰的sCR1  DNA并产生称之为TP10HD的sCR1蛋白的重组CHO  DUX  B11细胞，可以在实验室条件下培养，例如使用空心纤维生物反应器或滚动瓶，或者以大规模生产培养条件培养，例如流化床输注生物反应器，产生含分泌的TP10HD的条件组织培养基。该分泌重组蛋白可用几种方法来分离，特别是亲和色谱，阳离子交换HPLC或离子交换，疏水性相互作用和体积排斥色谱联合使用，得到一种提纯的制剂。
实施例2
分子差别的鉴定
TP10HD制剂的特征
在不同条件下产生并以多种方法提纯的TP10HD制剂，包括不同程度糖基化作用的多肽骨架。
方法
当用4-20%SDS-PAGE检测如例1所述通过阳离子交换HPLC和联合色谱分离的TP10HD制剂时，发现其出现不同的表观分子量。由阳离子交换HPLC制备之物，其分子量（约30KDa）与用色谱制备之物的分子量相比较低。当各制剂按厂商（Genzyma  Corporation，Boston  MA;见下例6）所述用n-聚糖酶消化去糖基化时，其分子量降低至等于TP10HD分子肽链的理论分子量分布值，约200KDa。
结论
这些结果证明在不同细胞培养条件下产生，并经多种提纯方案分离的TP10HD分子，是由经不同程度糖基化的相似肽链组成，其结果表现出分子量不同。这符合先前指出的观点：有不同的TP10HD糖型（有不同碳水化合物组份）存在。
实施例3
TP10HD各种糖型存在的进一步证明
当以几组不同条件之一组，从条件细胞培养基生产TP10HD时，（这几组条件包括（a）在空心纤维生物反应器中;（b）在含微载体的滚动瓶中或（c）在流化床输注生物反应器中）;并且通过阳离子交换，疏水性相互作用及体积排斥联合色谱提纯，或通过亲和色谱提纯时，经HPLC分析表明，所生产的TP10HD由各糖型的混合物组成。
分析方法
将经不同方案提纯的样品以磷酸钠20mM，氯化钠30mM，PH7.0的缓冲液透析，并以0.2μm膜过滤。将Hydropore-SCX  HPLC柱（10×100mm）（Rainin  Instrument  Company，Emeryville，CA）以同样缓冲液平衡。以2ml/min速率上样，连续用初始缓冲液洗柱直至吸收率回复到基线。将缓冲液中NaCl浓度提高到50mM，而该TP10HD则定义为弱阳离子从树脂上洗脱下来。当吸收率回到基线以后，用50-250mM的NaCl线性梯度液洗脱强阳离子糖型，其结果示于图1。
在以上所用条件下，所有TP10HD糖型结合于树脂上。根据以下指标，直接通过柱的未吸收物质是非蛋白、非TP10HD杂质，最大可能是细胞DNA，这些指标是：（a）其吸收光位于紫外光谱区;（b）它不与检测蛋白质的化学检测剂起反应;（c）它不与用于SDS-PAGE显象的蛋白特异性染料起作用;以及（d）在作TP10HD特异性免疫测试时，它不起作用。
上样以后，若将缓冲液中NaCl浓度增至50mM，则该TP10HD分子定义为弱阳离子糖型从树脂上洗脱下来。在作特异性免疫测试时，所有作为弱阳离子糖型洗脱出来的物质可视为同样的TP10HD。最后，以线性方式增加NaCl浓度结合更坚固的蛋白从树脂上洗脱出来。在NaCl浓度为125mM时，定义为强阳离子的糖型的该TP10HD分子被洗脱下来（图1）。以特异性免疫测试法检测，所有作为强阳离子的糖型洗脱下来的物质可视为同样的TP10HD。
通过亲和色谱纯化TP10HD
使用HPLC阳离子交换法分析时，经亲和色谱提纯的TP10HD物质含多种糖型。图1A中的吸收率图形证明占主要成份的糖型是强离子型（即在约125mM  NaCl洗脱的）。
通过联合色谱提纯的TP10HD
以HPLC阳离子交换法分析时，表明以流化床输注生物反应器生产的物质含多种TP10HD糖型。弱阳离子糖型与强阳离子糖型浓度之比在70∶30至80∶20之间（图1B）。从滚动瓶培养得到的物质也表明含多种TP10HD糖型，其弱阳离子糖型与强阳离子糖型之比是76∶24。
通过HPLC阳离子交换色谱提纯的TP10HD
表明该物质仅含有强阳离子TP10HD糖型（图1C）。正如以前所介绍的（国际专利Pub.WO89/09220和WO91/05047;Weisman  HF等人，1990，Seience  249∶146;Yeh  CG等人，1991，J.Immunol  146∶250）按本方法分离的物质证明在体内和体外显示人sCR1蛋白的功能特性。
结论
从以上结果证明，在来自流化床输注生物反应器、滚动瓶以及空心纤维生物反应器的条件培养基中，存在可由阳离子交换色谱区别出的多种TP10HD糖型，但在不同来源的培养基中各不同糖型所占比例相差很大。
实施例4
经提纯的弱的和强的阳离子糖型制剂的分离
可通过HPLC制备弱和强阳离子糖型
方法
制备型HPLC以21.4mm×100mm硫基丙基取代的离子交换树脂柱（Hydropore-SCX，Rainin  Instrnment  Company.Inc.Emeryville，CA）进行。该柱以20mm磷酸钠、30mM  NaCl、PH7.0m缓冲液平衡。如前所述的以联合色谱提纯的TP10HD样品，在使用前经同样的缓冲液透析。上样之后，在该柱上不断展开（一般20分钟），用同样缓冲液从树脂上洗出非特异性结合的蛋白质。将缓冲液变为20mM磷酸钠、50mM  NaCl、PH7.0，并继续展开（一般仍为20分钟）直到所有弱阳离子糖型从柱上洗脱下来为止。最后该柱的展开以50-250mMNaCl线性梯度来完成（20mM磷酸钠，PH7.0缓冲液）。一般NaCl为125mM时，强阳离子糖型从柱中洗脱下来。
结果
一般的制备方法是将含约100mgTP10HD的125ml样品上样于柱上。相应于弱（TP10HD-CCW）和强（TP10HD-CCS）阳离子糖型的各级分，按上面指出的方法加以汇集，用TP10HD特异性免疫测试法测定TP10HD的量。
结论
已分离出足够量的多种TP10HD糖型供体内和体外作功能性研究，并进行细致的生化分析。
实施例5
TP10HD提纯以后通过S-Sepharose
柱阳离子交换色谱解析TP10HD糖型
用上述的HPLC阳离子交换提纯法将TP10HD糖型解析成两个级分（例如见图1B）称为“峰”2的峰（糖基化较高的物质）是从左数的第2峰，而“峰3”（糖基化较低的物质）是最右边的峰。该原方法经使用HPLC阳离子交换柱Hydropore-SCX（购自Rainin  Instrumeuts）而建立。经延长时间观察发现该色谱步骤的结果是可变的，这种不一致是由于该HPLC柱在其使用和贮存条件下的使用寿命有限而造成的。
因此本发明找到一种可供选择的解析sCR1糖型的纯化方法，其具更一致的重要性。且不对其它各种厂家提供的HPLC柱评价，而只挑选一种常规的阳离子交换树脂，S-Sepharose  fast  Flow树脂来试验。之所以挑选该树脂主要因为S-Sepharose上官能团与上述Hydropore-SCX柱官能团相同。这些树脂仅有的区别是支撑基质不同：即琼脂糖（S-Sepharose）与硅石充填封盖以亲水高分子层（SCX）之别。
以S-Sepharose充填体积2.5×1.8cm制备2.5cm  Kontes-Flex柱，并与UA-6UV检测仪（Isco）联机。
在此研究中被试TP10HD材料是使用流化床输注生物反应器（Verax  System  S200;见上面）制得的，其蛋白质浓度为5.5mg/ml。从浓缩条件细胞培养基所得TP10HD材料在进行本研究之前，已首先进行过一系列提纯步骤（见共同转让的美国专利申请，Gail  Folena-Wasserman等人，for“Protin  Purification”1992年3月24日申请，流水号07/857022，该全文引入本文作为参考）。
即首先，将粗培养基以S-Sepharose柱进行阳离子的交换色谱，以20mM磷酸钠，500mM NaCl（PH7.0）洗脱。将该洗脱蛋白质用硫酸铵沉淀，再溶解并吸附在疏水性相互作用色谱载体（丁基-TOYOPEARL柱）上，该柱以0.8M（NH4）2SO4于100mM磷酸钠PH7.0的溶液平衡过。用0.7M（NH4）2SO4于100mM磷酸钠PH7.0的溶液将所需物质洗脱。该洗脱物再吸附在阳离子交换载体（DEAE-TOYOPEARL）上，洗脱，用TOYOPEARL CM650S作载体进行第二次阳离子交换色谱。该蛋白质用5倍柱体积的0-250mM NaCl（在50mM MES/MES.Na中，PH5.5）的线性梯度液洗脱，并用1/10体积的0.5M磷酸二钠中和。从TOYOPEARL CM上得到的产物再于TOYOPEARL  HW65S柱上进行体积排斥色谱，该柱予先用10mM磷酸钠，0.9%W/V  PH7溶液平衡过。将全部产物峰收集浓缩贮存，现将所得TP10HD物质用作本研究试验。
下述各种缓冲液用于S-Sepharose柱分级处理：平衡和洗涤缓冲液-20mM磷酸钠，30mM  NaCl，PH5.2;二次洗涤缓冲液和缓冲液A-20mM磷酸钠，50mM  NaCl，PH7.0;缓冲液B-20mM磷酸钠，250mM  NaCl，PH7.0。
将1.5ml提纯的TP10HD（8.25mg蛋白）样品于S-Sepharose柱上样，该柱予先平衡至PH5.2。然后将柱洗至流出物达基线读数（A280）为止。继而用2.5倍床体积的二次洗涤缓冲液洗涤该柱，再使用缓冲液A和B的50-250mM NaCl线性梯度液（10倍床体积）洗脱。根据UV吸收率，将洗脱的TP10HD级分收集在一起作为一份样品。每级份蛋白质浓度由A280（使用对1%溶液E（1%/280）消光系数等于10cm-1）测定。
结果
该结果示于图2和3。次要峰绘于图2，称为汇集样品1，相应于图1B中的“峰2”，占上样样品的2%。图2中的主峰称为汇集样品2（相应于图1B中的“峰3”），占上样样品的89%。
将上述两份样品进行SDS-PAGE，其结果示于图3。根据SDS-PAGE分析，样品1的物质比样品2的物质分子量要大。
结论
根据上述结果，我们可以得出结论，采用S-Sepharose柱的非HPLC阳离子交换色谱法，是使TP10HD的二种主要糖型级份达到可重复性分离的有效手段，该法优于上述的HPLC  SCX柱法。正如本文所述、该提纯步骤可以放在来自条件培养基的TP10HD多步纯化之后。此外，多步纯化法中的最初S-Sepharose步也可用于分离不同糖型，而这些糖型可以分别再进一步进行纯化。
实施例6
SCR1糖型的药物动力学研究
测定不同糖型制剂的血浆药物动力学半衰期和/或清除速率。与强阳离子糖型相比，弱阳离子糖型表现出血浆半衰期延长和/或总清除速率降低，而上述两种糖型与酶促去糖基化糖型制剂相比都显示出相当大的血浆半衰期延长和/或总速率降低。
材料和方法
A.研究物质来源
见前述定义部份有关各种TP10HD制剂的定义（TP10HD-CX，TP10HD-CC，TP10HD-CCW，TP10HD-CCS和TP10HD-CXD），按实施例1所述将试验物质提纯。
B.药物动力学研究
9种不同药物动力学研究列于下表2中：
表2
研究编号  材料  动物种类
1  TP10HD-CX  鼠
2  TP10HD-CX  兔
3  TP10HD-CC  猪
4  TP10HD-CC  鼠
5  TP10HD-CCW  鼠
6  TP10HD-CCW  兔
7  TP10HD-CCS  鼠
8  TP10HD-CCS  兔
9  TP10HD-CXD  鼠
C.将研究物质碘化
在第1、2、4、5、7和9号研究中通过氯胺-T法进行碘化。将磷酸钠缓冲液0.5M，PH7.6，5μl加入到采用的1 mciN-125I（New England Nuclear，Boston，MA）中。加入TP10HD样品，一般是100μg于100μl中（研究5＝69μg;研究7＝34μg;研究9＝91μg），接着加入新配制的15mg/ml氯胺-T溶液50μl，将反应混合物剧烈振动60秒。然后用移液管将偏亚硫酸氢钠（50μl，15mg/ml）和碘化钠（100μl，10mg/ml）加入反应瓶中。将反应混合物过PD10柱（Pharmacia Fine Chemicals，Piscataway，NJ），该柱用含0.1%牛血清白蛋白（Sigma Chemical Company，St.Louis，MO）的磷酸盐缓冲盐水（PH7.2-7.4）予平衡过。将10份0.5ml级份收集在一起并将2μl等分样直接计数以及与100μl0.1%牛血清白蛋白溶液和1ml20%三氯乙酸混合物混合后再计数。0℃保温1小时后，于1000Xg离心10分钟，将带有放射性的可酸沉淀的蛋白质收集之，并用闪烁计数器定量分析。将在酸沉淀中含＞90%总放射性的级份汇集在一起为下一步使用。
对于研究6和8，采用原碘（iodogen）法进行碘化（Fraker等人，1978，Biochem Biophys Res Commun 80∶849）平均125I取代度为0.56原子/蛋白分子时，达到22.7KBq/mg特异性活性供研究6用，而平均125I取代度为0.76原子/蛋白分子时达到29.5KBq/mg特异性活性供研究8使用。
D.剂量溶液的配制
研究1：将放射性碘化的TP10HD与经提纯的未标记TP10HD-CX混合，得到一种适宜按1mg/Kg总TP10HD剂量（含16-25×106cpm放射性标记的TP10HD-CX）给药的剂量溶液。
研究2：将放射性碘化的TP10HD-CX-5%W/W与经提纯的TP10HD-CX混合配成含1mg/mlTP10HD-CX（于0.1M  Hepes，0.15M  NaCl  PH7.4的缓冲液中）的剂量溶液。
研究3：按最终剂量1mg/Kg将TP10HD-CC给药。
研究4：将放射性碘化的TP10HD-CC与经提纯未标记的TP10HD-CC混合，配成适宜于以1mg/Kg或3mg/Kg总TP10HD剂量（含-20×106cpm放射性标记物）给药的剂量溶液。
研究5：将放射性碘化的TP10HD-CCW与经提纯的未标记TP10HD-CCW混合配成适于按1mg/Kg总TP10HD剂量（含-20×106cpm放射性标记物）给药的剂量溶液。
研究6和8：与研究2同，除了加入的放射性碘化TP10HD-CCW为-1%W/W而外。
研究7：将放射性碘化TP10HD-CCS与经提纯的未标记TP10HD-CCS混合，配成适于按1mg/Kg总TP10HD剂量（含-20×106cpm）给药的剂量溶液。
研究9：将放射性碘化TP10HD-CXD与经提纯的未标记TP10HD-CXD混合，配成适于按1mg/Kg总TP10HD剂量（含-20×106cpm）给药的剂量溶液。
E.方法
在研究1、4、5、7和9中，将被试物质经静脉注射（ⅳ）入四只Sprague-Dawley鼠体内（2雌2雄）。注射后的第1、3、5、10、20、30、45和60分钟，分别从鼠的后眼窝血管丛抽取血样，测定其放射性。其它输注后血样于注射后的第2、3和4小时抽取（研究4），以及于第120分钟抽取（研究5）。保留剩余血样的血浆成份供下一步分析用。
测量下列数据，分析血浆样品的残留试验物质：
（1）总残留放射性;
（2）用TCA沉淀放射标记物的百分率;
（3）在SDS存在下残留的酸沉淀放射性;
（4）经酶免疫测试通过免疫方法可识别为TP10HD的物质。
放射性同位素数据表示为总cpm/ml血液或血浆及达零值的理论时间的百分数，药物动力学半衰期从放射性测量数据计算出。
在研究2中，将试验物质以1mg/Kg剂量，经静脉注射入5只雄Dutch兔（约1Kg）的两组兔体内。将临试验前和注射后的第5、10、20、45、60、120和180分钟，从耳动脉抽取的血样各2ml，分别与肝素混合（最终浓度25μg/ml）。用闪烁计数器测定等分样的放射性。将经2000Xg离心5分钟获得的血浆于-40℃贮存。
通过体外功能试验分析血浆样品的残留试验物质，及人补体对抗体包被的羊红血细胞（SRBC）溶血的抑制作用。药物动力学半衰期从残留功能活性的效价来计算得出。
在研究3中，将试验物用颈静脉套管静脉注射入体重在4.5-6.1Kg范围内的小猪体内。通过预先植入的颈静脉套管，血样被抽进含有锂肝素（最终浓度15单位/ml）的注射器中。在时间为0分钟时取注射前样品10ml，注射后样品1.0ml，分别于5、10、15、30、45、60、120、180、240、300、360分钟及24小时时抽取。将抗凝血样于3000rpm、4℃离心5分钟，将此含少量血小板的血浆分成等分样于-70℃（或更低）贮存。
按上述方法以体外功能测试法分析血浆样品的残留试验物质，测试用猪补体而不用人补体。从残留功能活性的效价计算药物动力学半衰期。
在研究6和8中，试验物质经静脉注射入一组5只Dutch兔（约1Kg）体内，剂量为1mg/Kg。将分别于临试验给药前和第5、10、20、30、60、120、和180分钟从耳动脉抽取的血样各1ml与肝素混合。用三氯乙酸沉淀后，以闪烁计数器测量各等分样的放射性。
由对TP10HD有特异性的酶免疫测试法（EIA）分析血浆样品中所残留的试验物质。药物动力学半衰期由放射测定及免疫测试数据二者计算出。
F.N-聚糖酶处理
在研究9中，用n-聚糖酶消化将N-连接的低聚糖链除去，按厂商的说明书进行（Genzyme  Corporation，Boston，MA）。一般是，将58μgTP10HD在37℃，于0.2M磷酸钠P8.6的缓冲液中与10.5单位n-聚糖酶保温18小时。
G.酸沉淀
以三氯乙酸进行沉淀按如下所述进行：连续加入450μl的0.13Tris  HCl，4%SDS，10%甘油PH6.8的缓冲液、接着加入30μl胎牛血清和500μl20%三氯乙酸使血浆（20μl）沉淀。每次加入后均剧烈混合并于4℃保温72小时。于1000×g离心10分钟收集沉淀蛋白质团块。移弃上清液，由闪烁计数器测定残留放射性。
H.酶免疫测试
使用市售测验剂（Cellfree
Figure 931176247_IMG12
CD35、T Cell Diagnostics，Inc.Cambridge，MA）。简单说来，将涂复有多克隆兔抗-TP10HD抗体的聚苯乙烯小球，与经稀释的试验样品和一种辣根过氧化酶共轭多克隆免抗TP10HD抗体一起保温后，将小球从反应混合物中取出、洗去非特异性结合物、然后在适当稀释的底物存在下保温。加入硫酸终止显色，测定吸收率（光密度）作为TP10HD浓度的度量。
I.溶血试验
将兔血浆样品于甲胺（12.5mM）存在下，在56℃加热1小时，使硫酯基酰胺化，并灭活内源补体成份C3和C4。该方法消除试验物质中的内源兔补体活性物而并不太大影响TP10HD的活性。然后用0.1Hepes，0.15M  NaCl  PH7.4的缓冲液稀释试验样品，稀释度1∶50，并测试。
将以兔抗-SRBC抗体（Diamedix，Miami，FL）予敏化的SRBC，在V形底微三角孔中（Caster，Cambridge  MA），与试验血浆的适当稀释液和稀释人血清作为补体源的等分样混合。于37℃保温1小时后，离心沉淀不溶的红细胞，将上清液转移到相应的平底微孔中（Cosler，Cambridge，MA），并于415nm波长处测量吸收率。试验物存在下该吸收率的降低，即代表对抗体包被的SRBC的补体介导溶胞作用的抑制使用。利用带有已知量TP10HD的标准曲线来校椎该测试，这样其结果可以表示为：保留在血浆中的TP10HD（mg/ml）对时间的曲线。
研究3溶血试验
输注TP10HD-CC以前，从各猪身上收集血浆作为样品稀释剂和溶血试验的补体来源。用0.1MHepes，0.15M  NaCl  PH7.4的缓冲液，以1∶50比例稀释样品作为极小稀释值。要进一步稀释。则将试验样品，用以同样缓冲剂按1∶50已稀释的输注前血浆来稀释之，因此其最终血浆浓度仍保持1∶50。在该稀释液中，如前所述溶血度等于以人补体的溶血作用。其它操作照前面所述。用以已知量TP10HD制得的标准曲线来校准该试验，这样其结果可以表达为：保留在血浆中的TP10HD（μg/ml）对时间的曲线。
结果
该药物动力学研究的结果列于表3-7中。对研究1、4、5、7和9而言，分别测定兔体内，125I-TP10HD-CX，125I-TP10HD-CC，125I-TP10HD-CCW，125I-TP10HD-CCS，和125I-TP10HD-CXD，从血液中清除率。从每只鼠的后眼窝血管丛收集全血（300μl）。每个时间点均作重复样品100μl计数。然后按组平均并标准化换算为CPm/ml。即每个时间点取几份样品在SDS存在下用TCA沉淀，计数、按组平均再标准化换算成CPm/ml。清除率由125I标记物质的总TCA可沉淀计数及由EIA来测定。其结果示于表3，表示每次研究的双相清除图形，其α相半衰期较短，β相半衰期较长。
表3
双相清除图形
研究编号  动物  材料  α相(分钟)  β相(分钟)
1  鼠  TP10HD-CX  4.3  167
2  兔  TP10HD-CX  9-11
3  猪  TP10HD-CC  8.3  360
4  鼠  TP10HD-CC
(1mg/Kg)  9.2  181.1
(3mg/Kg)  9.8  267.1
5  鼠  TP10HD-CCW  12.21  100
6  兔  TP10HD-CCW  8  216
7  鼠  TP10HD-CCS  6.64  133
8  兔  TP10HD-CCS  6  216
9  鼠  TP10HD-CXD  <1  6.1
表4
兔体内TP10HD-CX的血清药物动力学（研究2）
测定项目  单位  第一组  第2组
血清半衰期  分钟  9.1±1.4  11.1±1.2
体积分布率  ml/Kg  67.0±9.0  44.6±3.7
浓度峰值(t=0)  μg/ml  16.5±2.4  23.7±1.7
总清除率  ml/min/Kg  5.8±1.2  2.9±0.1
表5
猪体内TP10HD-CC的血清药物学动力学（研究3）
测定项目  单位  平均值(8只动物)
血清半衰期,α相  分钟  8.3
血清半衰期,β相  分钟  363
体积分布率,α相  ml/Kg  36
体积分布率,β相  ml/Kg  73
浓度峰值(t=0)  μg/ml  29.3
总清除率  ml/min/Kg  0.24
给剂量后24小时抽取的血浆样品出现的TP10HD-CC水平与对照水平没什么区别。清除速率，隔室体积，速度常数和半衰期等药物动力学参数，系将每只猪的数据适用于二或三隔室模型而获得。统计分析表明，对某些猪来说三隔室模型较适合，而对其它猪来说二隔室模型较好，对所有猪来说为避免数据复杂化，使用二隔室模型处理数据。发现平均半衰期α相是8.3分钟而β相是6小时。该两相分别代表69%和31%的给定剂量，这样该剂量的三分之一被慢慢清除。
该研究表明TP10HD-CC制剂表现出明显的两相清除方式，其中β相比α相慢得多。这些结果与糖型群体的不同清除率也是一致的，即某些种类除去很慢。
研究6的结果归纳于下表6
表6
兔体内TP10HD-CCW的血清药物动力学（研究6）
测定项目  单位  放射测定数据  免疫检测数据
血清半衰期,α相  分钟  7.8±0.5  14
剂量清除%,α相  30.9±1.5  30
血清半衰期,β相  分钟  216.6±18.8  376
剂量清除%,β相  69.1±1.9  70
体积分布率,α相  ml/Kg  56.2±1.0
体积分布率,β相  ml/Kg  22.6±1.9
浓度峰值(t=0)  μg/ml  17.8±0.3
总清除率  ml/min/Kg  0.26±0.02  0.1
由放射性分析测定得出TP10HD-CCW的药物动力学半衰期α相约为8分钟，而β相约为216分钟。在快速的α相期间将总剂量的30%都被清除，而在较长的β相期间则清除总剂量的70%。该糖型的总清除速率为0.26ml/分钟/Kg而β相的隔室体积为-23ml/Kg。
研究8的结果归纳于下表7
表7
兔体内TP10HD-CCS的血清药物动力学（研究8）
测定项目  单位  放射测定数据  免疫检测数据
血清半衰期,α相  分钟  6.0±0.4  10
剂量清除%,α相  74.5±1.4  73
血清半衰期,β相  分钟  216.5±36.8  76
剂量清除%,β相  25.5±1.5  27
体积分布率,α相  ml/Kg  69.8±4.8
体积分布率,β相  ml/Kg  162.0±13.9
浓度峰值(t=0)  μg/ml  14.6±1.0
总清除率  ml/min/Kg  0.85±0.12  1.24
由放射性测定分析得出TP10HD-CCS的药物动力学半衰期α相数为6分钟，β相约为216分钟。在快速的α相期间总剂量的75%左右已被清除，而较长的β相期间则清除总剂量的25%。该糖型的总清除率为0.85ml/分钟/Kg，而β相的隔室体积为～162ml/Kg。
在研究9中，由放射性测定分析得出的TP10HD-CXD的药物动力学半衰期α相小于1分钟，而β相为6.1分钟。
综述
以上给出的结果证明含糖型的TP10HD提纯制剂其清除率各异。这样的差别是由于糖基化作用的不同所致，与下述结果一致：
（1）假如所有TP10HD制剂的多肽链相同，那么纯化的TP10HD制剂的去糖基化作用产生具有共同分子量的分子。
（2）去糖基化的TP10HD清除快速;并且
（3）由于增加糖基化作用（例如TP10HD制剂CC和CCW）而以分子量较大为特征的TP10HD制剂与由于糖基化程度较低（例如CX和CCS制剂）而分子量较小制剂相比其血浆半衰期较长和/或总清除率较低。
对研究6和8的结果加以比较表明，制剂TP10HD-CCW和TP10HD-CCS之间的主要差别，不在于以双相清除率为特征的半衰期，而在于慢清除的物质所占比例（TP10HD-CCW该比例较高）。
下述详细的碳水化合物分析说明，TP10HD糖型之间的不同是由于糖基化程度，低聚糖链的组成以及末端低聚糖碳水化合物残基的性质引起的。
实施例7
TP10HD的多糖型末端低聚糖残基的测定
TP10HD末端低聚糖残基的测定证明弱阳离子型表现出唾液酸化水平较高。
方法
测定TP10HD制剂末端碳水化合物结构。使用市售Dot-Blot装置（Bio-Rad  Richmond  CA）将每种制剂样品1μg固定在硝基纤维素膜上。按照厂商的说明书使用市售的鉴定糖蛋白末端低聚糖残基的Glycan  Differentiation  药盒（BoehringerMannheim  Biochemicals，Indianapolis，IN）。该药盒含5种毛地黄毒苷-外源凝集素探针：Galanthus.Nivalis  凝集素（GNA）;Sambucus  nigra  凝集素（SNA）;Maackia  amurensis  凝集素（MAA）;花生凝集素（PNA）;以及Datura  stramonium  凝集素（DSA）。
简单说来，系将每种TP10HD制剂的重复几份样品用毛地黄毒苷-外源凝集素复合物探测，通过改变外源凝集素来使探针的特异性改变从而使之能检测各种碳水化合物残基。结合以后以碱性磷酸酶共轭羊抗毛地黄毒苷Fab试剂检测毛地黄毒苷表位，可使探针显现，加入底物后5分钟内即出现色显影。
其结果归纳入表8。
表8
TP10HD多种糖型的末端低聚糖残基
外源凝集素
碳水化合  GNA  SNA  DSA  MAA  PNA
物特异性  terminal  NeuAc  Gal  NeuAc  Gal
Man  α(2-6)  β(1-4)  α(2-3)  β(1-3)
Gal  GlcNAc  Gal  GlcNac
TP10HD-CX  +  -  -  -  -
TP10HD-CC  -  -  +  +  -
TP10HD-CXD  -  -  -  -  -
TP10HD-CCW  -  -  ±  +  -
TP10HD-CCS  +  -  ±  ±  -
以上的缩写：Gal为半乳糖;Man为甘露糖;GlcNAc为N-乙酰葡糖胺;NeuAc为5-N-乙酰神经氨糖酸，即唾液酸。
TP10HD-CX仅与GNA外源凝集素反应表明该制剂为甘露糖残基末端。正如所予期的，TP10HD-CXD不与所有探针反应，表明经N-聚糖酶处理后除去了低聚糖链。TP10HD-CCW与MAA反应很强而与DSA反应很弱，表明其末端为唾液酸α（2，3）半乳糖和半乳糖β（1，4）N-乙酰葡糖胺结构。TP10HD-CCS与GNA反应很强表明其末端甘露糖残基占优势，而其与MAA和DSA反应很弱，则表示其与TP10HD-CCW交叉污染。
结论
该结果证明经提纯的TP10HD糖型存在不同的低聚糖结构，其中弱阳离子糖型TP10HD-CCW以末端唾液酸残基为特征，而强阳离子糖型TP10HD-CX和TP10HD-CCS，以末端甘露糖残基为特征。这些发现表明末端唾液酸残基的存在引起较慢的血浆清除率，而末端为甘露糖残基，则使TP10HD与纤维素碳水化合物受体结合水平较高，而导致更快的血浆清除速率。
实施例8
TP10HD的低聚糖碳水化合物组成及结构测定
对实施例2制备的TP10HD低聚糖碳水化合物组成和结构的测定表明，较强阳离子TP10HD糖型的唾液酸成分含量低于弱阳离子糖型。快速血浆清除率与低聚糖链上唾液酸含量很少（或无），以及与（通过干扰）蛋白质与甘露糖或半乳糖受体的可接触性有关。慢速清除率则与一个或多个末端唾液酸残基相关。
TP10HD糖型单糖组成
A.试验材料来源
按实施例1和5所述分离TP10HD，并解析为弱阳离子糖型TP10HD-CCW和强阳离子糖型TP10HD-CCS。
B.方法
使用下述步骤进行分析：
1.将样品（约270-280mg）以去离子水透析，除去所有缓冲盐，接着将其冻干。
2.以无水肼使完整低聚糖链释放出。
3.用无水甲醇HCl处理该完整低聚糖链释放出个体单糖（为O-甲基衍生物）。
4.将每个伯氨基团进行N-乙酰基化反应。
5.衍生为过-O-三甲基甲硅烷基甲基苷。
6.在CP-SIL8柱上通过毛细管GLC（气-液色谱）将这些衍生物分离。
7.将GLC和质谱分析得到的保留时间与已知标准保留时间相比较鉴定出各种苷衍生物。
8.以内标物（13-O-甲基-D-葡萄糖）通过FID分析确定各衍生物量。
C.结果
二种TP10HD糖型中各单糖的相对摩尔含量示于下表9中。
表9
二种TP10HD糖型中单糖的相对摩尔含量
单糖  TP10HD-CCS  TP10HD-CCW
岩藻糖  1.0*  1.0
半乳糖  3.0  3.4
甘露糖  5.4  4.1
N-乙酰葡糖胺  8.2  7.5
唾液酸  0.9  1.3
葡萄糖  ND  ND
N-乙酰半乳糖胺  ND  ND
木糖  ND  ND
＊各值均相对于岩藻糖（＝1.0）而言。ND表示未检测。
D.与TP10HD-CC相比较
为表征如前所述用空心纤维生物反应器生产的TP10HD（TP10HD-CX），与用流化床生物反应器生产的经分级的糖型TP10HD-CCW和TP10HD-CCS，以及未经分级的糖型物（TP10HD-CC）之间可能存在的单糖组成之不同，使用另一种分析方法，将各批这些物质加以比较。
用高效阴离子交换色谱结合脉冲电流检测法（HPAE-PAD  Carbohydrate  System，Dionex  Corp.）测定中性和氨基糖。在20%（V/V）三氟乙酸中，100℃下水解6小时，糖即释放出来，将水解物冷冻干燥或用Speed-Vac（Savant  Instruments）干燥。将残留物溶于1%乙酸钠三水合物溶液中，并按Anumula等人（Anal  Biochem.195∶269-280（1991）所述，以AS6柱经HPLC将其进行分析。将样品进行四重分析。
以三份重复样品用Yao等人（Anal  Biochem.179∶332-335（1989）的直接比色法，分别测定唾液酸。
其结果示于下表10中
表10
在TP10HD各批量和各糖型中每种单糖的相对摩尔含量
批号  TP10HD-CX  TP10HD  TP10HD-CC  TP10HD
-CCS  -CCW
R  V  G020  K002  HII5  HII8
糖
岩藻糖  0.7*  0.9  0.5  0.4  0.6  0.7  0.6  0.5
半乳糖  0.9  1.3  1.6  1.9  2.1  2.3  2.2  2.1
甘露糖  3.0  3.0  3.0  3.0  3.0  3.0  3.0  3.0
葡糖胺  3.5  4.1  3.5  3.9  4.3  4.1  4.0  4.0
唾液酸  0.2  0.4  0.7  1.7  1.6  1.3  1.1  1.6
唾液酸/  0.08  0.15  0.24  0.56  0.54  0.42  0.38  0.53
甘露糖之
比
＊其结果均以对甘露糖（＝3）的相对值表示，该检测法中葡糖胺含量等于上面检测法中的N-乙酰葡糖胺含量。
结论
糖型TP10HD-CCW和TP10HD-CC的单糖组成一般是在末端呈单、双或三分支的复合低聚糖形式的唾液酸，所说低聚糖在N-连接蛋白取代位点附近岩藻糖基化并含三甘露糖核。可以得出结论，糖型TP10HD-CCW物比糖型TP10HD-CCS所含唾液酸比例要高得多和/或含甘露糖比例较低，所含半乳糖和（N-乙酰）半乳糖胺差别可能不太大。从TP10HD-CX的唾液酸/甘露糖比例来看，该物质（Feaxon等介绍过，见上面所列文献）与糖型TP10HD-CCS相似，而与TP10HD-CCW和TP10HD-CC不同。后者看来主要含弱阳离子糖型，这与前面给出的其它数据一致。
结果表明较慢血浆清除率（TP10HD-CCW）与较高唾液酸含量或较高唾液酸/甘露糖之比（＞0.25）相关。相对低甘露糖含量也反应出该物质中分支程度较高（即二和三分支结构较多）。
实施例9
TP10HD糖型释放之低聚糖的电荷和体积分布分析
通过肼解反应从每种糖型样品（0.6mg）中将复合低聚糖释放出来。用还原氚化作用将低聚糖链进行放射性标记。在碱性条件下，将带电低聚糖进行高压纸上电泳、检出峰值并用氚射线照相定量分析。将低聚糖链用Arthrobacter  ureafaciens唾液酸苷酶处理除去唾液酸，并再一次电泳。
在BioGel  P4，400目，2m×15mm（BioRad  Corporation  Richmond  CA）上，将放射性标记的去唾液酸化处理后（即呈中性）的低聚糖链进行体积排斥色谱分析，该色谱于水中，55℃，流速0.2ml/min的条件下进行。将样品与作为内标的，未标记的葡聚糖部份酸水解物相混合。用联机的流氏放射性同位素监测器检测经放射标记的糖型低聚糖链，并用联机的差式折射仪检测低聚葡萄糖内标物。
在下述结果中，各低聚糖的流体动力学体积表示为表观葡萄糖单位（gu），该值由与低聚糖醛醇紧相近的葡萄糖低聚物之间的三次仿样函数内推法测定出。
图4表示经唾液酸苷酶处理前后TP10HD-CCW和TP10HD-CCS的放射性电泳图的比较。在两种情况下，唾液酸苷酶处理均使所有标记的低聚糖链变成中性，证明负电荷完全是由唾液酸给出的。
在糖型TP10HD-CCS中，约64%低聚糖链最初为中性，其余的有与单个唾液酸单位相应的泳动度。而对于来自TP10HD-CCW糖型的低聚糖，则比例要高得多，即有69%的酸性低聚糖，其中的40-50%具有与二个或多个唾液酸残基相应的泳动度。在经唾液酸苷酶处理前糖型TP10HD-CCW则仅有约31%的低聚糖链为中性。
经体积图分析所测定的去唾液酸化的糖型低聚糖链的体积示于表11中。
表11
去唾液酸化的糖型低聚糖链的体积图分析
TP10HD-CCW  TP10HD-CCS
20.1*  20.0
17.3  17.3
15.0  15.0
14.0  14.0
12.8  12.7
11.5  11.6
10.4  10.5
9.3  9.3
3.0  3.0
＊各值均以葡萄糖单位（gu）表示。
因此，从各糖型衍生的低聚糖链基体很相近，然而正如图5所示各种体积的相对比例是不同的。与TP10HD-CCS相比，TP10HD-CCW所含大体积低聚糖链比例较高，特别是15gu低聚糖占多数，而14gu所占比例较低。
结论
电荷公布数据进一步证实由TP10HD-CCW表现出的高唾液酸含量与低血浆清除率之间是相关的。对两种糖型而言，酸性和中性低聚糖链之相对比例，相似于其快速和慢速从血浆中清除的物质之比（见例6）。该结果也表明在主要是N-连接低聚糖链的糖蛋白分子中有1个或多个唾液酸残基的情况下，其从血浆中的清除将很慢，而根据仍不太清楚的机理，中性低聚糖链与快速血浆清除率有关。
只凭低聚糖链体积图，尚不能清楚地鉴定出复合低聚糖链的精确结构。然而，其组成和体积数据相结合，即与含将末端半乳糖不同程度唾液酸化和不同程度岩藻酸化的三甘露糖核心（即双分支）的主要结构相一致。其它可能性包括进一步分支形成带3个Gal单元的三分支结构。很清楚，体积图本身并不表明与慢速血浆清除率相关的任何主要结构类型。
慢速血浆清除率仅与上述类型少量核心结构的唾液酸化程度相关。
实施例10
弱阳离子TP10HD糖型的PI低于强阳离子糖型
高唾液酸化糖型的PI比低唾液酸化糖型的PI低。
方法
色谱聚焦法是根据蛋白质的等电点PI来分离其异构形式的方法，其中使用离子交换柱及以不同PH值的两性缓冲液形成PH梯度。在本研究中，使用PH7.1-4.0的梯度来分析TP10HD制剂，色谱树脂用Mono  P，Hr5/5（Pharmacia  Fine  Chemicals，Piscataway，NJ），初始缓冲液是用饱和亚氨二乙酸滴定到PH7.1的0.025M  Bis/Tris，洗脱液是多缓冲液7-4（Pharmacia  Fine  Chemicals，Piscataway  NJ），按1∶10（V/V）比例用水稀释，并用HCl将PH调节到4.0，清除缓冲液是2M  NaCl水溶液。该实验选用能产生线性梯度PH7.1-4.0单位的条件。
结果
图6归纳本实验结果。TP10HD-CX中主要异构形的等电点约6.0和5.7，少量物质其PI为5.0和更低。在TP10HD-CC制剂中，PI5.7异构形是次要成分，其主要形式的PI为5.1和4.8。将各峰积分，求出约40%  TP10HD-CC制剂的PI＜4.9。因为TP10HD-CX制剂中PI＜4.9的物质含量很低，以致于不能精确评估该制剂中低PI物质所占比例。
结论
发现TP10HD-CX比TP10HD-CC平均PI较高。这与转译后衍生酸基团含量较低是一致的。但在异构形图中，该两种TP10HD制剂之间有一定重叠。具低PI（PI＜4.9）的TP10HD-CC的百分含量与猪体内血浆中慢速清除物质的百分含量相关（见图6）。这些结果与例8所述结果一致，该例发现末端唾液酸残基水平较高的糖型其PI较低。
实施例11
TP10HD糖型的功能活性：体外抑制补体介导的血细胞溶解作用
不同TP10HD糖型在检测置信区间，其体外抗溶血功能活性都相近似，正如下面给的结果表明的一样。
方法
溶血抑制试验根据TP10HD溶液抑制SRBC的溶胞作用来进行的，其中该SRBC在作为补体源的人血清存在下以兔多克隆抗体敏化过（上述例6介绍过）。
该活性表示为达到50%溶血抑制作用时该TP10HD的浓度，即IH50（在标准检测条件下）。产生50%抑制的TP10HD或TP10HD糖型的浓度越低，其制剂效力越高。对每份样品在TP10HD或TP10HD糖型的7.8-1000ng/ml稀释度范围内试验。
结果
TP10HD-CX的IH50值一般为20±7ng/ml，而TP10HD-CC的该值较高约50±3ng/ml，这说明弱阳离子含量高，唾液酸化程度高的糖型制剂的效力比强阳离子糖型低两倍。TP10HD-CCW的IH50一般为44ng/ml，而TP10HD-CCS的IH50约为27ng/ml。这些结果对于未经分级处理的TP10HD-CX和TP10HD-CC制剂来说也是一致的。去糖基化作用可将TP10HD-CX的IH50从80ng/ml降至TP10HD-CXD的40ng/ml。
结论
本检测的检测内可变性为15-20%，因此IH50值2倍之差即很难解释清楚，而4倍或更大的变化那就实在太大了。由此，如果作出结论，本试验中TP10HD-CC，TP10HD-CCW和TP10HD-CCS的效力不同那是没有根据的。增加这些糖型的糖基化程度或唾液酸化程度，明显增加体内血浆半衰期，但很清楚它主要并不影响体外溶血抑制作用的效力。
中国仓鼠卵巢（CHO）细胞系DUX  B11（带有质粒pBSCR1c/pTCSgpt）寄存于美国典型培养物收藏中心（ATCC），（Rockville，Maryland）寄存日期1989年3月23日，入藏号CRL  10052。
本文上述所有摘录的参考文献均列入本文作为参考，不管具体引入与否。
现已对本发明作出完全叙述，本专业领域技术人员在不偏离本发明精神和范围以及避免不适宜的实验方法的情况下，以广义等同的参数，浓度、和条件范围来进行同样的研讨仍是值得监赏的。
当本发明结合其具体实施方案加以介绍时，应当明确它仍然可以作进一步的修改。本申请试图包括总的来说遵循本发明原则的任何变化，应用，修正等内容，也包括下述的一些看似偏离本发明公开内容之修改：来自与本发明相关的本领域公知和习惯采用的，并可适用于本文前述的基本特征的实践，这些正如下面所附权利要求书所划定的范围。

Claims (38)

1、一种经提纯的可溶性补体受体1(.sCR1)糖蛋白分子，含有一种或多种复合低聚糖结构，其中一种或多种结构末端带有平均每个结构一个或多个唾液酸残基。
2、含sCR1糖蛋白分子的sCR1制剂，其中如色谱聚焦法测定所示其主要糖型等电点PI小于或等于5.1，而且所说分子的PI在经神经氨酸苷酶处理后即提高。
3、含sCR1分子的sCR1制剂，其中所说分子含一种或多种复合低聚糖结构，其中至少约40%所说低聚糖结构的每个低聚糖结构其末端带有一个或多个唾液酸残基。
4、根据权利要求3的制剂，其中所说分子含一种或多种复合低聚糖结构，而至少约70%所说低聚糖结构其末端带有一个或多个唾液酸残基/每低聚糖结构。
5、一种sCR1制剂，基本上由sCR1分子组成，其中，所说的制剂中唾液酸对甘露糖之摩尔比大于或等于0.25。
6、权利要求2的sCR1制剂，正如色谱聚焦法测定所示，其中至少40%所说糖蛋白分子其等电点小于或等于5.1。
7、权利要求6的sCR1制剂，正如色谱聚焦法测定所示，其中至少75%所说糖蛋白分子其等电点小于或等于5.1。
8、含根据权利要求1的分子的sCR1制剂，所说制剂具备至少25%去糖基化的sCR1的功能性补体抑制活性。
9、根据权利要求2、3、4或5的sCR1制剂，具备至少25%去糖基化的sCR1的功能性补体抑制活性。
10、根据权利要求1的分子，其中所说sCR1糖蛋白的蛋白骨架包含LHR-A，LHR-B，LHR-C，LHR-D、sCR29和sCR30区域直至（和包括）横跨膜区的第1个丙氨酸残基。
11、根据权利要求2、3、4或5的sCR1制剂，其中sCR1糖蛋白的蛋白骨架包含LHR-A，LHR-B，LHR-C，LHR-D、sCR29、sCR30区域直至（和包括）横跨膜区的第1个丙氨酸残基。
12、一种药物组合物，包含根据权利要求1的治疗有效量的sCR1糖蛋白分子和药物学上可接受的载体或赋形剂。
13、一种药物组合物，包含根据权利要求2的治疗有效量的制剂和药物学上可接受的载体或赋形剂。
14、一种药物组合物，包含根据权利要求3的治疗有效量的制剂和药物学上可接受的载体或赋形剂。
15、一种药物组合物，包含根据权利要求4的治疗有效量的制剂和药物学上可接受的载体或赋形剂。
16、一种药物组合物，包含根据权利要求5的治疗有效量的制剂和药物学上可接受的载体或赋形剂。
17、根据权利要求12的药物组合物，还进一步包括治疗有效量的溶血栓剂。
18、根据权利要求13的药物组合物，还进一步包含治疗有效量的溶血栓剂。
19、根据权利要求14的药物组合物，还进一步包括治疗有效量的溶血栓剂。
20、根据权利要求15的药物组合物，还进一步包括治疗有效量的溶血栓剂。
21、根据权利要求16的药物组合物，还进一步包括治疗有效量的溶血栓剂。
22、根据权利要求17、18、19、20或21的药物组合物，其中所说溶血栓剂选自下列一组物质：
（a）血浆酶原激活剂或其突变蛋白质;
（b）甲氧苯甲酰化血浆酶原-链激酶激活剂复合物;
（c）单链尿激酶;
（d）双链尿激酶;
（e）链激酶;
（f）纤维蛋白溶解活性杂交蛋白，它包括第一双蛋白酶的一个链连于第二双链蛋白酶的一个链，至少所说的第一或第二蛋白酶之一具纤维蛋白溶解活性，这样所说杂交蛋白具有作为纤维蛋白溶解活性基础的催化剂位点，该位点可以以可除去的阻隔基团加以阻隔;
（g）体内可逆性阻隔的纤维蛋白溶解酶，其中所说酶中作为纤维蛋白溶解活性基础的催化位点，由可经水解除去的基团加以阻隔，所说水解过程，是在等渗水溶液中，PH7.4，37℃条件下，以假一级水解速度常数为10-6sēc-1到10-3sec-1范围的速度进行的。
23、权利要求1的经提纯的sCR1或权利要求2、3、4或5的制剂的应用，它们用于制备治疗患者炎症或不适当补体激活相关性疾病或失调的药物。
24、权利要求1的经提纯的sCR1或权利要求2、3、4或5的sCR1制剂的应用，它们用于制备治疗患者血栓形成症状的药物。
25、权利要求1的经提纯的sCR1或权利要求2、3、4或5的sCR1制剂和溶血栓制剂的应用，它们用于制备治疗患者血栓形成症状的药物，其中所说溶血栓剂选自以下一组物质：
（a）血浆酶原激活剂或其突变蛋白质;
（b）甲氧苯甲酰化血浆酶原-链激酶激活剂复合物;
（c）单链尿激酶;
（d）双链尿激酶;
（e）链激酶;
（f）纤维蛋白溶解活性杂交蛋白，它包括第一双链蛋白酶的一个链连于第二双链蛋白酶的一个链，至少所说的第1和第2蛋白酶之一具纤维蛋白溶解活性，这样所说杂交蛋白具有作为纤维蛋白溶解活性基础的催化位点，该位点可以以可除去的阻隔基团加以阻隔;
（g）体内可性阻隔的纤维溶解酶，其中所说酶中作为纤维蛋白溶解活性基础的催化位点，由可经水解除去的阻隔基加以阻隔，所说水解过程，是在等渗水溶液中，PH7.4，37℃条件下，以假一级水解速度常数为10-6sec-1到10-3sec-1范围之速度进行的。
26、权利要求1的经提纯的sCR1或权利要求2、3、4或5的sCR1制剂的应用，它们用于制备治疗患者成年呼吸窘迫综合症的药物。
27、权利要求1的经提纯的sCR1或权利要求2、3、4或5的制剂的应用，将其用于制备治疗患者移植排斥的药物。
28、根据权利要求27的应用，其中所说移植是异种移植或同种移植。
29、根据权利要求23的应用，其中所说患者是人。
30、根据权利要求24的应用，其中所说患者是人。
31、根据权利要求25的应用，其中所说患者是人。
32、根据权利要求26的应用，其中所说患者是人。
33、根据权利要求27的应用，其中所说患者是人。
34、根据权利要求28的应用，其中所说患者是人。
35、根据权利要求1的sCR1糖蛋白的制备方法包括：
（a）将编码所说sCR1的蛋白骨架的DNA分子在哺乳动物宿主细胞中于条件培养下表达，其中所说条件是细胞生长不受营养补充所限制，其中所说宿主细胞能将所说低聚糖链唾液酸化;以及
（b）从所说培养物中分离所说sCR1糖蛋白。
36、根据权利要求35的方法进一步还包括：
（c）从步骤（b）所获得物质中分离含唾液酸的分子。
37、制备根据权利要求2、3、4或5的sCR1制剂的方法，包括：
（a）将编码所说sCR1糖蛋白的蛋白骨架的DNA分子在哺乳动物宿主细胞中，于条件培养下表达，其中所说条件是细胞生长不受营养补充的限制，其中所说宿主细胞能使糖蛋白的低聚糖链唾液酸化;以及
（b）从所说培养物中分离所说sCR1。
38、根据权利要求37的方法，进一步，还包括
（c）从步骤（b）获得的物质中分离含唾液酸的分子。
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