CN1310759A - 含治疗和诊断结构域1的β2GP1多肽及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了结构域1β2GPI多肽、编码这些多肽的多核苷酸、这些多肽的模拟物和使用含结构域1β2GPI多肽及模拟物的方法。本发明已显示β2GPI的结构域1能与抗心磷脂(β2GPI－依赖型抗磷脂)抗体结合,这类抗体与诸如血栓形成和流产之类数种病理状况相关。结构域1β2GPI多肽可用于检测样品中的β2GPI－依赖型抗磷脂抗体。本发明进一步提供了用结构域1β2GPI多肽诱发耐受性的方法。

Description

含治疗和诊断结构域1的β2GPI多肽及其使用方法
技术领域
本发明涉及用于诊断和治疗抗磷脂抗体相关病理状况的多肽和方法，尤其是那些与β2GPI-依赖型抗磷脂抗体相关的病理状况。更具体地说，本发明涉及含结构域1的β2GPI多肽、含结构域1的β2GPI多肽模拟物、含结构域1的β2GPI多核苷酸以及使用这些多肽的方法，尤其是用于检测及作为耐受原使用。
背景
抗磷脂抗体(aPL)抗体是通常用于描述与血栓形成、反复流产和作为初级抗磷脂综合症(APS)之血小板减少以及诸如系统性红斑狼疮(SLE)之类自身免疫疾病相关的自身抗体的术语。Harris等(1983)Lancet2:1211-1214；和Lockshin等(1985)N.Engl.J.Med.313:152-156。APS可能是初级的或次级的，意思是它与其他状况，主要是SLE相关。磷脂结合抗体(Harris等，编辑，CRC出版社，BocaRaton,FL,1991；McNeil等，免疫学进展，第49卷，193-281页(Austen等，编辑，学术出版社，圣地哥，CA,1991))。aPL抗体包括所谓的抗心磷脂(aCL)自身抗体，描述如下。在许多状况中检测到aPL抗体(包括aCL抗体)，只有与自身免疫疾病相关的β2GPI-依赖型抗磷脂抗体需要磷脂结合血清蛋白β2GPI的存在。Vaarala等(1986)临床免疫病理学(Clin.Immunol.Immunopathol.)41:8-15。
约30％具持久aPL抗体的病人患有凝血性疾病。APL抗体的存在限定了患SLE的病人中呈血栓形成、血小板减少(TCP)和流产等一种或多种临床症状综合症的一组病人。SLE病人中患此综合症的风险在25％左右；存在aPL抗体时此风险提高至40％，而缺乏它们时则减少至15％。因为aPL抗体被认为针对的是质膜中的磷脂，所以推测通过干预发生于血小板或内皮之类细胞磷脂膜上的止血过程，它们可能在体内产生直接的致病作用。在呈APS的病人中，aPL(包括aCL)抗体看来是存在的唯一风险因素，这一事实进一步证实了这些抗体具有直接的致病作用。用人aPL抗体被动转移小鼠可诱发APS是aPL抗体为直接病原的最好证据。Bakimer等(1992)J.Clin.Invest.89:1558-1563；Blank等(1991)美国国家科学院院报88：3069-3073。虽然估计值有所变化，但认为在约15％的中风病人中，aPL抗体是重要因素。
这些抗体的存在与许多失调疾病之间明确的相互关系可用于它们的检测和检查。不过，临床上aPL抗体的检查仍然是一个不完善的领域，因而存在重大的问题。在许多实验室中可用购买到的标准抗血清(APL Diagnostics,Inc.,Louisville,KY)作为比较实验的标准曲线。不过，在这些实验室所获关于确切GPL和MPL的结果之间存在许多不一致，即分别用于IgG和IgM抗磷脂抗体的检测单位、所给血清额定值以及划分为高(80或更高)、中等(20-80)、低(10-20)或正常(0-10)的GPL和MPL水平。购买到的试剂盒在商用标准指定值方面变化很大。Reber等(1995)血栓形成和止血剂，73:444-452。
aPL自身抗体抗原特异性的确切性质是有争议的，反映在用于这些抗体的发展术语上。首先这些自身抗体被认为定向于阴离子磷脂，由此称为“抗心磷脂抗体”Gharavi等(1987)Ann.Rheum.Dis.46m:1-6。然后明显可见β2GPI在aPL(包括aCL)抗体的抗原特异性中起重要作用。Vermylen等(1992)J.Lab.Clin.Med.120:10；McNeil(1990)美国国家科学院院报87:4120-4124。这些观察表明这些抗体更适于被称为“β2GPI-依赖型抗磷脂自身抗体，”这是用于本发明书的术语。
β2GPI作为辅助因子在β2GPI-依赖型抗磷脂抗体的结合中起作用的报道与β2GPI-依赖型抗磷脂抗体可结合β2GPI自身的报道相结合，造成关于这些抗体所识别之抗原识别位点性质的互相抵触的解释。不过，β2GPI所起的作用仍未清楚，已提出的解释有数种。一些人断定β2GPI-依赖型抗磷脂抗体识别含β2GPI和阴离子磷脂的复合抗原，而其他人已观察到在缺乏磷脂的情况下与β2GPI结合的β2GPI-依赖型抗磷脂。McNeil等(1990)美国国家科学院院报87:4120-4124；Galli等(1990)Lancet335:1544；Roubey等(1995)免疫学杂志154(2):954-960；Arvieux等(1991)免疫学方法杂志143:323。已提出许多说明来解释这些不同。Galli等推测由于β2GPI依赖型抗磷脂抗体是β2GPI的低亲和性抗体，因此它们要求在所给IgG分子上通过多价固相抗原的两结合位点的吻合。Galli等(1990)。他们进一步认为，在某些条件下，例如对微量滴定孔进行γ辐射，可固定足够的β2GPI以使这些低亲和抗体能结合。其他人则认为当β2GPI与γ辐射的孔或心磷脂包被的孔结合时产生β2GPI-依赖型抗磷脂抗体识别的隐藏表位。Matsuura等(1994)J.Exp.Med.179:457。
β2GPI是呈现抗凝血剂数种特性的50kDa的血浆糖蛋白，这些特性有，诸如内在凝血途径接触激活、血小板凝血酶原酶活性和ADP-诱发的血小板激活的抑制之类。Roubey(1996)类风湿性关节炎(Arthritis Rheum.)39:1444；Valesinit等(1992)Automimmunity14:105。β2GPI的氨基酸序列已测定。Lozier等(1984)美国国家科学院院报81:3640；Steinkasserer等(1991)生物化学杂志277:387。β2GPI由5个同源的结构域组成。其中4个由含高度保守之胱氨酸、脯氨酸和色氨酸的约60个氨基酸组成。Lozier等(1984)美国国家科学院院报81:3640；Steinkasserer等(1991)生物化学杂志277:387-391。首先在β2GPI中描述了此蛋白质结构基元，其特征在于它的长度、自主折叠和具有两内部二硫桥形成中涉及的4个半胱氨酸残基同源定位的构架；两个脯氨酸；两个苯丙氨酸、酪氨酸或组氨酸残基；两个甘氨酸；以及一个亮氨酸或缬氨酸。这些重复基元由于其形状而被称为sushi结构，或有时称为短的共有序列重复片段。Reid等(1989)今日免疫学10:177；Ichinose等(1990)生物化学杂志265:13411-14。第五个结构域包含82个氨基酸残基和6个半胱氨酸。
除上述围绕β2GPI-依赖型抗磷脂抗体之抗原特异性性质的争论外，还有许多关于β2GPI中β2GPI-依赖型抗磷脂抗体所识别表位之性质和定位的重要争论。现已提出β2GPI的磷脂结合位点在第五个结构域内。Hunt等(1993)美国国家科学院院报90:2141。Hunt等还报道了β2GPI的活性形式及缺乏β2GPI-依赖型抗磷脂辅因子活性的β2GPI失活形式之间的结构差异，认为推测的β2GPI-依赖型抗磷脂抗体表位最可能在β2GPI的第五个结构域内。Hunt等(1994)免疫学杂志152:653-659。其他研究小组已尝试使用重组β2GPI蛋白质定位β2GPI-依赖型抗磷脂抗体的抗原性表位。其中两个小组在杆状病毒表达系统中生产了已缺失多个结构域的β2GPI突变蛋白质。两小组均推断β2GPI-依赖型抗磷脂抗体的表位是隐藏性的，而结构域4可能是表位暴露中所主要涉及的。Igarashi等(1996)血液87:3262-3270；George等(1998)免疫学杂志160:3917-3923。另有一组在大肠杆菌中表达了多个结构域已缺失的β2GPI突变蛋白质，推断结构域5包含β2GPI-依赖型抗磷脂抗体所识别的表位。Yang等(1997)APLARJ.Rheumatol.1:96-100。
现在很需要有对于β2GPI-依赖型抗磷脂抗体所介导疾病的改良检测系统和耐受原。
本文引用的所有参考文献均全文收编作为参考。
发明内容
本发明提供了含结构域1的β2GPI多肽、编码这些多肽的多核苷酸、含结构域1之β2GPI多肽的模拟物、组合物以及使用这些多肽、多核苷酸和模拟物的方法。
因此，一方面，本发明提供了包括含结构域1之β2GPI多肽的多肽，其中该多肽特异地与β2GPI一依赖型抗磷脂抗体结合，其中应理解此多肽不是由完整的β2GPI氨基酸序列(如图1(SEQ ID NO:1)所示)组成的，另外，也不是由β2GPI的结构域1、2和3或1、2、3和4组成的。在某些实施方案中，多肽包含结构域1的片段，如表1所示的。在其它实施方案中，多肽包含构象表位。在另外的实施方案中，多肽由结构域1组成。
在另一方面，本发明提供了包括结构域β2GPI多肽的多肽，其中此多肽缺少(可检测到的)T细胞表位，所说的T细胞表位在具β2GPI依赖型抗磷脂抗体的个体中能激活T细胞。
本发明还提供了结构域1β2GPI多肽(或包含β2GPI多肽的多肽)任何一种的偶联物、融合物和/或多聚形式。在优选实施方案中，将结构域1β2GPI多肽(尤其是那些缺少T细胞表位的)与合适的多价平台分子偶联，该分子可能是蛋白质的或非蛋白质的。
另一方面，本发明提供了编码此发明多肽实施方案的多核苷酸(包括分离的天然存在和非天然存在多核苷酸)。可在克隆或表达载体和/或合适的宿主细胞内分离此多核苷酸。
另一方面，本发明提供了结构域1β2GPI多肽的模拟物，所说的模拟物能特异结合与结构域1β2GPI多肽可特异结合的抗体(即，与结构域1β2GPI多肽共有表位)。模拟物可以是多肽或本文所述的许多物质之一，包括有机和无机分子。模拟物可以包含或不包含T细胞表位，所说的T细胞表位能在具β2GPI依赖型抗磷脂抗体的个体中激活T细胞。
另一方面，本发明提供了含本文所述多肽、多核苷酸和/或模拟物实施方案中任一种的组合物。在一些实施方案中，组合物中还包括药用可接受赋形剂。在一些实施方案中，组合物里包含了有效量的多肽，其中有效量是足以诱发耐受性的量。在一些实施方案(为了检测的目的)中，有效量是足以检测可与结构域1β2GPI多肽(或模拟物)结合之抗体的量。
另一方面，本发明提供了检测样品中β2GPI-依赖型抗磷脂抗体(或特异结合结构域1β2GPI多肽的抗体)的方法，包括(a)在允许稳定抗原-抗体复合物形成的条件下使样品中的抗体与结构域1β2GPI多肽(或含结构域1β2GPI多肽或结构域1β2GPI模拟物的多肽)接触；及(b)检测步骤(a)中形成的稳定复合物。
另一方面，本发明提供了诱发个体耐受性的方法，包括施用有效量的结构域1β2GPI多肽于个体，尤其是缺乏T细胞表位的结构域1β2GPI多肽，其中有效量是足以诱发耐受性的量。
附图简述
图1描述了β2GPI的核苷酸(SEQ ID NO:1)和氨基酸(SEQ IDNO:2)序列。划线上的数字表示氨基酸的位置。
图2描述β2GPI结构域1的核苷酸(SEQ ID NO:3)和氨基酸(SEQID NO:4)序列。划线上的数字表示氨基酸的位置。
图3是β2GPI之结构域1的三级结构模型，包括β2GPI-依赖型抗磷脂抗体结合的关键氨基酸。
图4是描述在NUNC微量滴定平板上进行的竞争抑制ELISA之结果的图。用野生型β2GPI包被平板。用多种突变β2GPI蛋白质竞争与抗体(来自7104号病人)的结合。符号表示如下重组β2GPI蛋白质：-□-,12345；-□-,1----； 12---；-□-,123-；-□-,1234-；-□-,-2345；-▲-,-345；-□-,-45；和-□-,----5.
重组蛋白质表示为：划线表示丢失的结构域；数字表示存在于蛋白质中的结构域。例如，“---345”是缺少结构域1和2，但保留结构域3、4和5的重组β2GPI蛋白质。
图5是描述与多种重组β2GPI蛋白质结合之兔抗-β2GPI的ELISA分析结果图。以所示浓度的多种重组β2GPI蛋白质包被覆盖镍螯合物的微量滴定板孔，然后检测兔抗-β2GPI抗体的结合能力。各符号分别代表如下重组β2GPI蛋白质：-□-,--345；-□-,---45； -2345；-□-, 12345；-□-,1234-；-□-,123--；-▲-,----5；和---□---,GST-6his。
图6是描述与多种重组β2GPI蛋白质结合之抗-β2GPI的ELISA分析结果图。以所示浓度的多种重组β2GPI蛋白质包被覆盖镍螯合物的微量滴定板孔，然后检测人抗-β2GPI抗体6701(来自6701号病人)的结合能力。关于重组β2GPI的符号如图5。另外的符号如下：------，无β2GPI，有抗体加入；---+---，无β2GPI，无抗体。
图7是描述检测兔抗-β2GPI抗体与多种重组β2GPI蛋白质结合的能力的ELISA结果图，所说的重组β2GPI蛋白质首先与包被心磷脂(CL)的微量滴定孔结合。用CL覆盖IMMULON平板，随后装上所示浓度的重组β2GPI蛋白质。重组β2GPI所用的符号如图5。
图8是描述检测β2GPI-依赖型抗磷脂抗体制品6641(来自6641号病人)与多种重组β2GPI蛋白质结合的能力的ELISA结果图，所说的重组β2GPI蛋白质首先与CL包被的微量滴定孔结合。用CL覆盖IMMULON平板，随后装上所示浓度的重组β2GPI蛋白质。重组β2GPI所用的符号如图6。
图9是描述竞争抑制ELISA结果的图，其中检测了多种肽与野生型β2GPI竞争性结合β2GPI-依赖型抗磷脂抗体的能力。表示肽所用的符号如下：-□-,β2GPI；-□-,CTPRVC； FSTVVP；-□-,KPDDLP；-□-,GRTCPK；-□-,TLKCTP；-▲-,ICPLTG；-□-,FICPLT；-□-,ITYSCK, GRTCPK.
图10A和10B是描述多种浓度的结构域1多肽(图10A)和四聚偶联化合物44(图10B)与来自6626号病人的亲和纯化β2GPI-依赖型抗磷脂抗体结合的表观平衡结合常数的图。表观平衡解离常数也已显示。
图11A和11B是描述多种浓度的结构域1多肽(图11A)和四聚偶联化合物44(图11B)与来自6701号病人的亲和纯化β2GPI-依赖型抗磷脂抗体结合的表观平衡结合常数的图。
图12是描述竞争结合实验结果的图，其中β2GPI(包被于NUCU微量滴定板上)与来自6501号病人的血浆及可变量的四聚体结构域(-◇-)1偶联化合物44(--)、化合物45(-*-)和β2GPI结构域1多肽(-◆-)及已被还原和烷基化的β2GPI结构域1多肽(-■-)反应。
图13A和B描述了用CFA中的β2GPI结构域1多肽-KLH偶联物(图13A)或只用CFA(图13B)免疫小鼠的腘淋巴结细胞的剂量反应。符号：-□-,KLH偶联物；--，未与KLH偶联的β2GPI结构域1多肽；-■-,KLH；△,PPD。
图14是描述β2GPI结构域1多肽-KLH偶联物(10μg、50μg和100μg)引发之剂量应答(以抗-β2GPI抗体表示)的线条图。
图15是描述抗β2GPI结构域1多肽-KLH偶联物的小鼠多克隆抗体特异性的图，是用多种β2GPI结构域突变体(-□-,1---；-◆-，还原和烷基化的1----；
Figure A9980841500131
12----；-△-；1234-；---■---,-2345；---□---,--345；--▲--,--45；-△-,1---5；-X-,12345)的竞争性试验测定的。
图16是描述亲和纯化的β2GPI-依赖型抗磷脂抗体以及正常血浆和IgG对多个病人(6501、6636、6644、7011、7013、6701、7001、6625、6641)血液中的因子Va活性影响的线条图。
进行本发明的方式
我们已发现β2GPI的结构域1与β2GPI依赖型抗磷脂抗体特异结合(即含β2GPI-依赖型抗磷脂抗体的表位)。鉴于现存文献只描述了结构域5和4对于此结合是重要的，故此发现尤其重要。例如，参阅，George等(1998)和Yang等(1997)。我们还发现β2GPI的结构域1与至少100种不同的β2GPI-依赖型抗磷脂抗体结合，这对于本文中的检测/诊断及耐受原尤其显著和重要，因而结构域1β2GPI多肽对于携带β2GPI-依赖型抗磷脂抗体的广泛群体可能是有用的。此外，我们已发现结构域1的各个肽(本文所述)看来与β2GPI-依赖型抗磷脂抗体特异结合。
因此，本发明提供了含有与β2GPI-依赖型抗磷脂抗体特异结合之结构域1β2GPI多肽(包括分离的结构域1)的多肽。本发明还提供了基本上由可特异结合β2GPI-依赖型抗磷脂抗体之结构域1β2GPI多肽组成的多肽。本发明的多肽对于β2GPI-依赖型抗磷脂抗体的检测(在有关的诊断、预测和/或监测中)上是有用的，也可作为耐受剂使用。在某些实施方案中，尤其是在有关耐受原方面，β2GPI多肽缺少T细胞表位并/或是多价形式，诸如与平台分子偶联。本发明还提供了编码β2GPI多肽的多核苷酸。这样的多核苷酸可用于在体外或体内生产β2GPI多肽。本发明还提供了结构域1β2GPI多肽的模拟物，它们与β2GPI-依赖型抗磷脂抗体共有识别位点(即表位)。本发明还提供了含结构域1β2GPI多肽、编码结构域1β2GPI多肽的多核苷酸和/或模拟物的组合物。本发明进一步提供了使用β2GPI多肽和/或模拟物的方法，如用于检测或诱发耐受性(即，B细胞耐受性的诱导)的方法。通用技术
除非另外提到，本发明将应用本领域技术中的分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学常规技术。这样的技术在文献中有完整的解释，如“分子克隆：实验室手册”：第二版(Sambrook等，1989)；“寡核苷酸合成”(M.J.Gait,编辑，1984)；“动物细胞培养”(R.I.Freshney,编辑，1987)；“酶学方法”(AcademicPress,Inc.)；“实验免疫学手册”(D.M.Weir&C.C.Blackwell，编辑)；“用于哺乳动物细胞的基因转移载体”(J.M.Miller&M.P.Calos，编辑，1987)；“分子生物学最新方法”(F.M.Ausubel等，编辑，1987)；“PCR：聚合酶链式反应，”(Mullis等，编辑，1994)；和“免疫学最新方法”(J.E.Coligan等，1991)。定义
“β2GPI结构域1多肽”是可特异结合β2GPI-依赖型抗磷脂抗体，且至少具有图2(SEQ ID NO:4；结构域1)所示5个连续氨基酸的多肽。用本领域已知的标准试验可显示β2GPI结构域1多肽特异结合β2GPI-依赖型抗磷脂抗体，如竞争性抑制试验，在本文和本领域中都有描述。术语“β2GPI结构域1多肽”包含多种实施方案(其中许多在本文中有描述)，包括但不局限于，SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:4的片段；SEQ ID NO:4的延伸、插入和/或缺失；SEQ ID NO:4的序列变体。因此，术语“β2GPI结构域1多肽”意指一类以结构域1为基础、显示必需功能的分子。如此，β2GPI结构域1多肽可能有至少5个(如上提及的)、至少6个、至少10个，至少12个，至少15个，至少20个，至少25个，至少30个，至少40个和/或至少60个图2(SEQ ID NO：4)中所示的连续氨基酸。β2GPI结构域1多肽还可包含结构域1的不同区域，这些区域综合起来能特异结合β2GPI-依赖型抗磷脂抗体(如产生构象表位)。如下所述，在某些实施方案中，“β2GPI结构域1多肽”还缺少可检测的T细胞表位。从本发明的目的出发，T细胞表位定义为能在带β2GPI依赖型抗磷脂抗体的个体中激活T细胞。
与抗体“可特异结合”的多肽是本领域众所周知的术语，而测定这些特异结合的方法也是本领域众所周知的。若一分子与特定细胞或物质的反应或结合比它与别的细胞或物质的反应或结合更频繁、更迅速、具更高的持续性和/或更大的亲和性，该分子被称为可“特异结合”。若一抗体与靶的结合比它与其它物质的结合具更高的亲和力、更容易和/或更持久，则可以说该抗体可“特异结合”靶。
“β2GPI-依赖型抗磷脂抗体”是与β2GPI可特异结合的任何抗体。如上所述，对于属于术语“β2GPI-依赖型抗磷脂抗体”定义内的这些抗体，临床和文献中的术语有不同的名称，如“aPL”和“aCL”抗体，只要存在必需的结合特性即可(即，术语“aPL”和“aCL”抗体包括β2GPI-依赖型抗磷脂抗体)。本文的“抗体”定义明确指出，“β2GPI-依赖型抗磷脂抗体”包括含有可变区的片段，如Fab片段，只要保留了特异结合β2GPI的能力即可。如下所述，应当理解，与任何β2GPI-依赖型抗磷脂抗体的特异结合即已足够，尽管可能比较优选的是β2GPI结构域1多肽与一种以上β2GPI-依赖型抗磷脂抗体结合，优选与至少两种，优选与至少五种，更优选与至少10种，更优选与至少20种不同的β2GPI-依赖型抗磷脂抗体结合。
“抗体”是能通过其可变区内至少一个抗原识别位点与诸如多肽之类靶分子特异结合的免疫球蛋白分子。使用于此时，该术语不仅包含完整的抗体，还包括其片段(如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv)单链(ScFv)、其突变体、融合蛋白、人源化抗体及含所需特异性之抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其它修饰形式。
“完整的β2GPI”指β2GPI完整分子的氨基酸序列(图1和SEQID NO:2中所描述的)。β2GPI的多核苷酸和多肽序列也可从文献和GeneBank(接受号X58100)中公开获得。
“融合多肽”是在不同位置含天然发生之外的区域的多肽。这些区域通常存在于不同蛋白质中，而在融合多肽里被放置在一起，或它们通常存在于同一蛋白质中，但在融合多肽中有新的排列次序。融合多肽也可产生自结构域1β2GPI多肽的线性或分支的多聚形式。
“T细胞表位”是本领域众所周知的术语，指T细胞的结合位点，更具体地说，是激活T细胞的多肽序列或化学结构。测定T细胞表位存在的方法也是本领域众所周知的，并描述于本文中。应当理解，以后可能会开发出更灵敏的试验以检测T细胞表位的存在，对T细胞表位缺乏的确定取决于所用检测系统的类型。对于本发明的目的来说，“缺乏”T细胞表位意指T细胞表位用本领域标准实验，尤其是本申请的起始申请日时的标准实验是检测不到的。还应当理解的是，为了本发明的目的，“T细胞表位”能在含β2GPI-依赖型抗磷脂抗体的个体中刺激T细胞。
本文可互换使用的术语“多核苷酸”和“核酸”指任何长度核苷酸的多聚形式，可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。这些术语包括单链、双链或三链DNA、基因组DNA、cDNA、RNA、DNA-RNA杂合体或含嘌呤和嘧啶碱基或其他天然的、化学或生化修饰的、非天然的或衍生核苷酸碱基的多聚体。多核苷酸主链可包含糖和磷酸基团(通常可在RNA或DNA内找到)，或者修饰或取代的糖或磷酸基团。或者，多核苷酸主链可包含诸如亚磷酰胺之类合成亚基的多聚体，因此可以是寡脱氧核苷氨基磷酸酯(P-NH2)或混合的氨基磷酸酯磷酸二酯寡聚体。硫代磷酸酯键可代替磷酸二酯键使用。此外，双链多核苷酸可获自化学合成的单链多核苷酸产物，所谓的化学合成指在合适的条件下合成互补链并将双链退火，或用合适的引物和DNA聚合酶从头合成互补链。
以下是多核苷酸的非局限性例子：基因或基因片段、外显子、内含子、mRNA、tRNA、rRNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离DNA、任何序列的分离RNA、核酸探针和引物。优选的多核苷酸是DNA。按本文所用的，“DNA”不仅包括碱基A、T、C和G，还包括他们的任何类似物或这些碱基的修饰形式，如甲基化核苷酸，核苷酸间的修饰，如不带电的连键和硫代酯，糖模拟物及修饰和/或其它的主链结构，如聚酰胺。
“天然发生的”指内源多核苷酸或多肽序列，即在自然界中可找到的。此术语包括编码蛋白质的等位基因和等位形式，以及全长和已加工的多核苷酸和多肽。加工可一步或多步发生，这些术语包含了所有的加工阶段。反之，“非天然发生的”序列指所有的其他序列，即不存在于自然界中的序列，如重组序列。
“缩主细胞”包括可作为或已作为载体或掺入多核苷酸和/或蛋白质的受体的细胞或细胞培养物。宿主细胞包括单个宿主细胞的后代，由于天然、偶然或有意的突变，这些后代不必与最初的亲本细胞完全相同(在形态学上或在总DNA基因组方面)。宿主细胞包括用本发明多核苷酸体内转染了的细胞。
“转化”或“转染”指将外源多核苷酸插入宿主细胞，不考虑插入所用的方法，例如，脂转染、转导、感染或电穿孔。外源多核苷酸可作为非整合载体保持，例如质粒，或者可整合入宿主细胞基因组中。
此处所用的术语“模拟物”(也称“类似物”)指可与结构域1β2GPI多肽所特异结合之β2GPI-依赖型抗磷脂抗体特异结合的生物学或化学合成物。“模拟物”与结构域1β2GPI多肽共有表位或结合特异性。模拟物可以是显示所需结合特性的任何化学物质，因此可以是，例如，简单或复杂的有机或无机分子；多肽；多核苷酸；碳水化合物；脂类；脂多糖；脂蛋白，或上述物质的任何组合，包括，但不局限于，包含多核苷酸的多肽；糖基化多肽和糖脂。术语“模拟物”包括术语“mnimotope，”它是本领域众所周知的术语。
“个体”是脊椎动物，优选哺乳动物，更优选人。哺乳动物包括，但不局限于，饲养动物(farm animal)、运动类动物(sport animal)、宠物、灵长类、小鼠和大鼠。
“B细胞无反应性”是本领域众所周知的术语，指需T细胞辅助产生和分泌抗体的那些B细胞的无应答性，包括，但不局限于，不成熟和/或成熟B细胞的克隆缺失及/或B细胞不能生产抗体。
“锈发的耐受性”指降低和/或稳定与免疫原的免疫应答的程度。“免疫应答”可以是体液的和/或细胞的，可用本领域已知的标准试验检测。从本发明的目的出发，免疫应答通常通过β2GPI-依赖型抗磷脂抗体的存在反映。从定量上说，降低量(通过抗体产生的降低衡量)至少约为25％，更优选至少约为50％，更优选至少约为75％，更优选至少约为90％，更优选至少约为95％，最优选100％。应当理解耐受性是抗原特异性的，并为本发明的目的应用于具β2GPI-依赖型抗磷脂抗体的那些个体。“诱发的耐受性”还包括减慢和/或延迟抗体水平增加的速率。
“生物学样品”包含种种获自个体的样品，并可用于诊断或监测试验。此定义包含血液和生物学来源的其他液体样品，如活组织样品之类的固体组织样品或组织培养物或它们的衍生细胞及其后代。该定义还包括已在获得后用任何方式处理过的样品，如用试剂处理、溶解处理或富集某一成分，如蛋白质或多核苷酸。术语“生物学样品”包括临床样品，还包括培养中的细胞、细胞上清、细胞裂解物、血清、血浆、生物液和组织样品。
生化反应中任何两个或多个组分间形成的“稳定复合物”指在二聚体或复合物形成与随后的检测(包括任选的洗涤步骤或可发生于其中的其它处理)间持续时间足够长的二聚体或复合体。
“分离的”或“纯化的”多肽或多核苷酸是基本上无其天然相关物质的多肽或多核苷酸。基本上无是指至少无50％的其天然相关物质，优选至少无70％，更优选至少无80％，还更优选至少无90％。
若一多核苷酸在其天然状态或用本领域技术人员众所周知的方法处理后，可被转录和/或翻译以产生多肽或其片段，则此多核苷酸被称为“编码”该多肽。为了本发明的目的，还为了避免对互补链的麻烦称谓，此多核苷酸的反义(或互补)链也被说成编码此序列；即，“编码”多肽的多核苷酸序列包括常规编码链和互补序列(或链)。
“有效量”(当用于耐受原关系中时)是足以达到有益或预期临床结果的量。有效量可以一或多次施用。为了本发明的目的，结构域1β2GPI多肽的有效量是足以诱发耐受性的量，尤其是对于β2GPI-依赖型抗磷脂抗体来说。从治疗方面来说，结构域1β2GPI多肽的“有效量”是足以减轻、改善、稳定、逆转、减慢或延迟β2GPI-依赖型抗磷脂相关疾病状态(即，β2GPI-依赖型抗磷脂抗体显示潜在或已有病理的状态)的发展。功效指示剂的检测和测量通常基于对β2GPI-依赖型抗磷脂抗体和/或与疾病相关之临床症状的测定，如动脉或静脉血栓形成、流产、一过性缺血发作、脑血管异常、一时性黑矇(单眼视觉)、自身免疫性溶血性贫血症、心脏瓣膜损伤、心肌梗塞、血小板减少症和偏头痛疾病。
此处所说的“价键平台分子”(valency platform molecule)指含允许预定量多肽(在本发明中是结构域1β2GPI多肽)和/或模拟物附着之位点的非免疫原性分子。
当用于描述价键平台分子时，“非免疫原性的”表示此价键平台分子在自身施用于个体时，不能引起免疫应答，和/或不能引起足够的免疫应答。可接受免疫应答的程度取决于价键平台分子所用的环境，可经验测定。
“药效团”用于此处时，指结构域1β2GPI多肽与靶抗体结合中涉及的关键基团的三维定位和化学特性。本发明的结构域1β2GPI多肽
本发明提供了结构域1β2GPI多肽。如上所述，结构域1β2GPI多肽(a)包含描述结构域1之图2(SEQ ID NO:4)的至少5个(或更多个)连续氨基酸；(b)可特异结合β2GPI-依赖型抗磷脂抗体(即一种或多种β2GPI-依赖型抗磷脂抗体)。图3给出了结构域1β2GPI三维结构的模型(基于nmr测定之因子H1 sushi结构域16的实际结构(Norman等(1991)分子生物学杂志219:717；Barlow等(1991)生物化学30:997)，并显示了按诱变研究所测定可能涉及结构完整性和/或抗体结合的残基，包括本文所给出的那些残基。至于本发明的所有多肽实施方案，应当理解为本发明的多肽不包括天然的完整β2GPI，或任何其它原先已分离和定性的β2GPI形式，如结构域缺失突变体(即，结构域1、2、3；结构域1、2、3、4)。
在一实施方案中，本发明包括含(或，在某些实施方案中，由下述组成或基本由其组成的)结构域1β2GPI多肽的结构域1β2GPI多肽，条件是该多肽不是由(a)完整的β2GPI(SEQ ID NO:2),(b)结构域1、2和3；或(c)结构域1、2、3和4组成的。
在一实施方案中，本发明包括由图2(SEQ ID NO:4)所示之代表结构域1的氨基酸序列组成的(或，在某些实施方案中，基本上由其组成的)多肽。如实施例1所述，我们已显示了只有含结构域1的那些结构域缺失β2GPI多肽能特异结合β2GPI-依赖型抗磷脂抗体，而结构域1单独也能结合β2GPI-依赖型抗磷脂抗体。为了本发明的目的，β2GPI的结构域1通常约为β2GPI的第一位氨基酸至第64位氨基酸(图1)。或者，也是为了本发明的目的，结构域1(及本发明的结构域1β2GPI多肽)的范围可从(a)约第一个半胱氨酸至约第四个半胱氨酸(当从N-端开始测定时)；(b)约N端至约第五个半胱氨酸(更准确的说，第五个半胱氨酸之前的最后一个氨基酸)；(c)约第一个半胱氨酸至约第五个半胱氨酸。在某些实施方案中，附加的半胱氨酸可添加至任何合适的位置，以用作偶联的反应基团。因此，额外的半胱氨酸(在某些实施方案中是β2GPI的第五个半胱氨酸)可包含于任何位置，尤其是靠近或在C末端或N末端。结构域1β2GPI多肽也可包含如下之中任何组分(或由它们组成或基本由它们组成):(a)SEQ IDNO:4的第一个氨基酸至第59个氨基酸；(b)SEQ ID NO:4的第2个氨基酸至第60个氨基酸；(c)SEQ ID NO:4的第2个氨基酸至第63个氨基酸；(d)SEQ ID NO:1的第1个氨基酸至第66个氨基酸；(e)SEQ IDNO:1的第4个氨基酸至第66个氨基酸；(f)SEQ ID NO:4的第一个氨基酸至第60个氨基酸；(g)SEQ ID NO:1的第一个氨基酸至第66个氨基酸。我们已发现含第五个半胱氨酸的结构域1β2GPI多肽尤其便于偶联(论述如下)。对于那些含β2GPI头四个半胱氨酸的实施方案来说，通常应当理解，半胱氨酸之间的氨基酸序列应为便于形成合适的二硫桥的形式，而半胱氨酸侧翼的氨基酸序列(即N末端和C末端氨基酸)可以是任何序列(只要保留能使得与抗体结合的必需结构即可)。
在其它的实施方案中，本发明包括含表1(SEQ ID NO:5-11)所示任何多肽的多肽。我们的实验(实施例3中所述)证实了这些多肽能特异结合β2GPI依赖型抗磷脂抗体。
对于本发明的所有多肽实施方案来说，所述多肽能特异结合β2GPI-依赖型抗磷脂抗体。用本领域的标准技术，如竞争结合实验，可测定与β2GPI-依赖型抗磷脂抗体的特异结合。例如，可用β2GPI(天然产生的或重组的，只要重组分子展示必需的结合特性即可)包被微量滴定板，并添加不同浓度的检测多肽。然后加入亲和纯化的β2GPI-依赖型抗磷脂抗体，并使结合产生。用诸如碱性磷酸酶偶联的抗人IgG之类的检测系统或放射性测定结合的抗体量。用检测多肽竞争结合β2GPI的能力表示特异的结合。实施例1和3提供了检测竞争性结合的例证实验。也可用直接的结合试验测定特异的结合，这是本领域所已知的，并在实施例1和3中举例说明。
为了本发明的目的，应当理解，结构域1β2GPI多肽只需与一种β2GPI-依赖型抗磷脂抗体结合，尽管可能比较合乎需要的是结构域1β2GPI多肽与一种以上β2GPI-依赖型抗磷脂抗体结合(例如，在检测中)。β2GPI-依赖型抗磷脂抗体通常来自个体，而抗体序列在个体与个体之间有所不同。还应当理解，通过使用本领域已知的β2GPI-依赖型抗磷脂抗体的片段或其它重组产物，如Fab片段或单链可变区构建体(scFv)，可证实与β2GPI-依赖型抗磷脂抗体的特异结合。
因而，在某些实施方案中，结构域1β2GPI多肽可与一种以上的β2GPI-依赖型抗磷脂抗体结合(即，至少2种，至少5种，至少10种，至少20种，至少50种或更多)。这些实施方案对于检测尤其有用，因为这些多肽可用于检测更宽范围的可能携带β2GPI-依赖型抗磷脂抗体的个体。表1．可特异结合β2GPI-依赖型抗磷脂抗体的结构域1片段
序列 SEQ ID NO:
 CTPRVC  5
 FSTVVP  6
 KPPDDLP  7
 GRTCPK  8
 TLKCTP  9
 ICPLTG  10
 FICPLT  11
 ITYSCK  12
在某些实施方案中，结构域1β2GPI多肽包含sushi结构。“sushi结构域”为本领域技术人员所理解，通常其特征在于(a)含将多肽链缠绕成环状结构的某些残基(如脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、甘氨酸、亮氨酸、缬氨酸和/或组氨酸)；(b)分子量通常约为6kD；和(c)含β折叠结构。Ichmose等(1990)生物化学杂志265:13411。
还应当理解，结构域1β2GPI多肽可通过构象表位与β2GPI-依赖型抗磷脂抗体结合。因此，在某些实施方案中，结构域1β2GPI多肽包含(a)图3的氨基酸55、56和58(异亮氨酸；天冬酰胺；亮氨酸)(SEQ ID NO:4的氨基酸55、56和58)；(b)图3的氨基酸43-45(精氨酸；赖氨酸；苯丙氨酸)(SEQ ID NO:4的氨基酸43-45)；(c)SEQID NO:4的氨基酸40-45(甘氨酸；甘氨酸；甲硫氨酸；精氨酸；赖氨酸；苯丙氨酸)，优选图3的氨基酸38-44(SEQ ID NO:4的氨基酸38-44)；和/或(d)图3的氨基酸19(赖氨酸)(SEQ ID NO:4的氨基酸19)，优选包含(a)和(b)；优选包含(a)和(c)；优选包含(b)和(c)；优选包含(a)和(d)；优选包含(b)和(d)；优选包含(c)和(d)；优选包含(a)、(b)和(d)；优选包含(a)、(c)和(d)；优选包含(b)、(c)和(d)；优选包含(a)、(b)和(c)；优选包含(a)、(b)、(c)和(d)。通过诱变我们已发现从总体上或个体上说这些氨基酸对于结合可能都是关键的。
结构域1β2GPI多肽(或含结构域1β2GPI多肽的多肽)的大小可变化很大，只要符合所需功能(基于与β2GPI-依赖型抗磷脂抗体的特异结合)即可。例如，与β2GPI依赖型抗磷脂抗体达到特异结合所需的长度可小至如5个氨基酸长的序列。我们的数据已显示小至6聚的氨基酸序列仍能与β2GPI-依赖型抗磷脂抗体特异结合(实施例3)。
在某些实施方案中，结构域1β2GPI多肽(以及包含或基本上由结构域1β2GPI多肽组成的多肽)长度小于约350个氨基酸，优选长度小于约300个氨基酸，优选长度小于约250个氨基酸，优选长度小于约200个氨基酸，优选长度小于约160个氨基酸，优选长度小于约150个氨基酸，优选长度小于约125个氨基酸，优选长度小于约115个氨基酸，优选长度小于约110个氨基酸，优选长度小于约100个氨基酸，优选长度小于约75个氨基酸，优选长度小于约60个氨基酸，优选长度小于约50个氨基酸，优选长度小于约25个氨基酸，优选长度小于约15个氨基酸，优选长度小于约10个氨基酸。
应当理解，结构域1β2GPI多肽可与其它结构域1β2GPI多肽(不管这些结构域1β2GPI多肽相同或不同)以及β2GPI的其它结构域相结合、偶联和/或连接。因此，本发明包含结构域1β2GPI多肽的多聚形式。如本文所用，结构域1β2GPI多肽的多聚形式包含多个(即1个以上)结构域1β2GPI多肽。在一实施方案中提供了结构域1β2GPI多肽的线性聚合体。在另一实施方案中提供了结构域1β2GPI多肽的分支聚合体。在其它实施方案中，本发明提供了(a)多个结构域1β2GPI多肽；(b)含结构域1β2GPI多肽和一个或多个β2GPI其它结构域的多肽。这样的实施例包括，但不局限于，(a)与结构域2偶联的结构域1β2GPI多肽；(b)与结构域3偶联的结构域1β2GPI多肽；(c)与结构域5偶联的结构域1β2GPI多肽；(e)与结构域3、4和5偶联的结构域1β2GPI多肽；(f)与结构域4和5偶联的结构域1β2GPI多肽。这些结构域应为本领域技术人员所理解，通常如下(从N端起)：结构域2，约为第65-120位氨基酸；结构域3，约为第121-181位氨基酸；结构域4，约为第182-244位氨基酸；结构域5，约为第245-326位氨基酸(C末端)。
在另一实施方案中提供了结构域1β2GPI多抗原肽(multipleantigen peptide，Map)。Map具有含放射分支状赖氨酸突出的小免疫惰性核心，许多结构域1β2GPI多肽可锚定(即共价附着)于其上。Posnett等(1988)生物化学杂志263：1719-1725；Tam(1989)酶学方法168:7-15。结果产生具有结构域1β2GPI多肽与核心高摩尔比率的大分子。对于ELISA之类的试验，Map是有效的抗原，也可用于多价呈递，如用于耐受原方面。Map可合成制备，也可通过购买得到(Quality Controlled Biochemicals,Inc.Hopkinton,MA)。在典型的Map系统中，核心基质由三种水平的赖氨酸和用于锚定结构域1β2GPI多肽的8个氨基酸组成。Map可用本领域已知方法合成，例如固相方法，参阅，R.B.Merrifield(1963)J.Am.Chem.Soc.85:2149。
应当理解任何分支结构，如环糊精均可使用。分支结构可以，但不必很小。在诱发耐受性时，平台不应当作为T细胞不依赖性抗原。
还应理解可将某些序列变异引入结构域1β2GPI多肽中，可能保持或增强其反应性。因此，本发明包括对结构域1β2GPI多肽不显著影响其特性的修饰，以及具增强活性的变体。这些变体和修饰序列总体上称为“动能相等的变体”：与另一结构域1β2GPI多肽相比，它们可能具有相同的、增强的和减少的结合，被称为相等的是因为它们保持了特异结合β2GPI-依赖型抗磷脂抗体的能力。多肽的修饰是本领域的常规试验，在此无需详述。修饰多肽的例子包括具有保守氨基酸取代、不会显著地负面改变功能活性的一个和多个氨基酸缺失或添加的多肽，或包括化学类似物的使用，包括α-甲基氨基酸取代、非蛋白质天然发生的氨基酸(如刀豆氨酸、DL甲硫氨酸亚砜、盐酸δ-羟赖氨酸和氨基异丁酸)以及非天然氨基酸。可相互保守取代的氨基酸残基包括，但不局限于：甘氨酸/丙氨酸；缬氨酸/异亮氨酸/亮氨酸；天冬酰胺/谷氨酰胺；天冬氨酸/谷氨酸；丝氨酸/苏氨酸；赖氨酸/精氨酸和苯丙氨酸/酪氨酸。这些多肽还包括糖基化和非糖基化多肽，以及具其他翻译后修饰的多肽，如用不同糖进行糖基化、乙酰化和磷酸化。优选氨基酸取代是保守的，即，取代氨基酸具有与原氨基酸相似的化学特性。这样的保守取代是本领域所已知的，例子如上所述。
应当理解某些氨基酸变异(如取代)可能以或不以相同方式或相同程度影响结构域1β2GPI多肽与β2GPI-依赖型抗磷脂抗体的结合。因此，取代氨基酸的特性可影响结合的方式和/或程度。例如，我们已发现，用甘氨酸残基取代第43位的精氨酸(SEQ ID NO:4的第43位氨基酸)会引起某些病人血清中与抗体结合活性的丧失，其他的未改变(而另有其它一些会改变(即干扰)结合能力)。另一实施例是，用赖氨酸或苏氨酸取代第42位的甲硫氨酸看起来不影响结合(在我们已检测的病人中)；不过，若用缬氨酸取代第42位的甲硫氨酸，则似乎在所有病人中结合均被消除了。
除20种天然氨基酸和它们的同型类似物(homoanalog)和正类似物(noranolog)外，本发明中还可应用数种其他类型的α-氨基酸。这些其他类型的例子包括d-氨基酸、Nα-烷基氨基酸、α-烷基氨基酸、环状氨基酸、嵌合氨基酸和各种各样的氨基酸。这些非天然氨基酸已被广泛用于修饰生物活性多肽以增强对蛋白水解的抗性，且/或赋予构象限制以提高生物学活性。Hruby等(1990)生物化学杂志268:249-262；Hruby等(1995)分子生物学方法35:201-240。
最常用的Nα-烷基氨基酸是Nα-甲基氨基酸，如Nα-甲基半胱氨酸(nC)、Nα-甲基甘氨酸(nG)、Nα-甲基亮氨酸(nL)、Nα-甲基赖氨酸(nK)和Nα-甲基缬氨酸(nV)。α-烷基氨基酸的例子包括α-甲基丙氨酸(mA)、α-氨基异丁酸(aiB)、α-甲基脯氨酸(mP)、α-甲基亮氨酸(mL)、α-甲基缬氨酸(mV)、α-甲基-α-氨基丁酸(tv)、二乙基甘氨酸(deG)、二苯基甘氨酸(dpG)和二环己基甘氨酸(dcG)。Balaram(1992)Pure&Appl.Chem.64:1061-1066；Toniolo等(1993)生物聚合体33:1061-1072；Hinds等(1991)Med.Chem.34:1777-1789。
环状氨基酸的例子包括1-氨基-1-环丙烷羧酸(cG)、1-氨基-1-环戊烷羧酸(Ac5c)、1-氨基-1-环己烷羧酸(Ac6c)、aminoindanecarboxylic acid(ind)、四氢异喹啉羧酸(Tic)和2-哌啶羧酸(Pip)。C.Toniolo(1990)Int’l.J.Peptide Protein Res.35:287-300；Burgess等(1995)J.Am.Chem.Soc.117:3808-3819。嵌合氨基酸的例子包括青霉胺(Pe)；半胱氨酸与缬氨酸、4R-和4S-巯基脯氨酸(Mpt)的联合体；同型半胱氨酸与脯氨酸和4R-和4S-羟脯氨酸(hyP)的联合体；以及同型丝氨酸和脯氨酸的联合体。各种各样α氨基酸的例子包括碱性氨基酸模拟物，如鸟氨酸(Or)、Nε-甲基赖氨酸(mK)、4-吡啶基丙氨酸(pyA)、4-哌啶子基丙氨酸(piA)和4-氨基苯丙氨酸；酸性氨基酸模拟物，如瓜氨酸(Cit)和3-羟基缬氨酸；芳香族氨基酸模拟物，如1-萘基丙氨酸(1-Nal)、2-萘基丙氨酸(2-Nal)、苯基甘氨酸(pG)、3,3-二苯基丙氨酸(dpA)、3-(2-噻酚基)丙氨酸(Thi)和卤代苯丙氨酸(如2-氟代苯丙氨酸和4-氯代苯丙氨酸)；疏水氨基酸模拟物，如叔丁基甘氨酸(即叔亮氨酸(tL))、2-氨基丁酸(Abu)、环己基丙氨酸(Cy)、4-四氢吡喃丙氨酸(tpA)、3,3-二环己基丙氨酸(dcA)和3,4-脱氢脯氨酸。
除α-氨基酸外，诸如β氨基酸之类的其他氨基酸也可用于本发明中。这些其他氨基酸的例子包括2-氨基苯甲酸(Abz)、β-氨基丙酸(β-Apr)、γ-氨基丁酸(γ-Abu)和6-氨基己酸(ε-Ahx)。诸如4-氯丁酸(By)和3-氯丙酸(Pp)之类的羧酸也已在环硫醚肽的合成中用作N-末端的第一个残基。
其他的修饰方法包括使用本领域已知的偶联技术，包括，但不局限于，酶促方法、氧化取代和螯合。修饰可用于，例如，免疫试验的标记附着，如放免试验中放射性部分的附着。用本领域已建立的方法制备修饰的结构域1β2GPI多肽，并可用本领域已知的标准试验对其进行筛选，其中一些已描述于此处及实施例中。
本发明还包括含一个或多个β2GPI结构域1多肽的融合蛋白质。从本发明的目的出发，β2GPI结构域1融合蛋白质含一个或多个β2GPI多肽以及在天然分子中不附着的其他氨基酸序列，例如，来自别的区域的异源序列或同源序列，如β2GPI的另外的结构域。有用的异源序列包括，但不局限于，提供从宿主细胞中分泌出来、增强免疫反应性的序列或便于多肽偶联至免疫试验支持物或载体的序列。例如，β2GPI多肽可与便于纯化的异源序列融合。这样的序列例子在本领域中是已知的，包括那些编码诸如Myc、HA(来自流感病毒血凝素)、His-6或FLAG之类表位的序列。其他便于纯化的异源序列来自如谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白质(MBP)和免疫球蛋白Fc部分之类的蛋白质。
结构域1β2GPI多肽可以包含或不包含T细胞表位。对于检测的目的而言，结构域1β2GPI多肽可以包含或不包含T细胞表位，因为在此多肽的主要用途是检测β2GPI-依赖型抗磷脂抗体，这并不依赖于T细胞表位的存在。不过，在耐受原有关方面，结构域1β2GPI多肽缺少对于具β2GPI-依赖型抗磷脂抗体之个体可检测的T细胞表位。从而，在某些实施方案中，结构域1β2GPI多肽不包含(即缺乏)T细胞表位(因此，含结构域1β2GPI多肽的多肽不包含T细胞表位)。
检测T细胞表位存在的方法是本领域众所周知的。例如，可使用检测T细胞增殖的多种试验(如胸苷掺入)。还可通过用本领域众所周知的方法检查T细胞来源淋巴因子的分泌测定T细胞表位的存在。尽管应当理解胸苷掺入的量可能变化(取决于被检测的多肽)，但不能诱发高于背景的统计学上显著的胸苷掺入(即用标准统计学方法测定通常p小于0.05)的多肽通常被认为缺乏T细胞表位。大体上，刺激指数小于约2-3，更优选小于约1表明T细胞表位缺乏。通过经验测定T细胞表位的位置和组成。
在耐受原有关方面，结构域1β2GPI多肽优选可特异与B细胞表面上的β2GPI-依赖型抗磷脂抗体结合(即，与B细胞的表面抗体结合，其中该抗体能特异结合β2GPI-依赖型抗磷脂表位)。此结合，尤其是与交联一起，被认为可激发B细胞的无变应性。应当理解，由于从定义上说结构域1β2GPI多肽能特异结合β2GPI-依赖型抗磷脂抗体，所以预期任何结构域1β2GPI多肽同样应能够结合B细胞上的表面β2GPI-依赖型抗磷脂抗体。
如下所述(以及上文多聚形式中述及)，在耐受原有关方面中，通过多聚形式和/或与合适的价键平台分子偶联，结构域1多肽优选以多价形式呈递。本发明的多肽制备
可用本领域已知方法制备本发明的多肽。这些多肽可用重组方法(即单个或融合多肽)或化学合成产生。用化学合成可方便地制备多肽，尤其是多达约50个氨基酸的较短多肽。化学合成的方法是本领域所已知的，并可购买得到。例如，应用固相方法通过自动多肽合成仪可生产多肽。还可用本领域已知的技术化学合成制备多肽。
还可用重组方法通过表达系统制备多肽。由于编码多肽之多核苷酸的可得性，所以可构建编码完整(即天然的)多肽、其功能相等片段或重组形式的表达载体。编码所需多肽的多核苷酸，不管是融合或成熟形式以及是否包含分泌信号序列，均可连接入适于任何便利宿主的表达载体。真核和原核生物系统均可使用。然后从溶解细胞或培养基中分离多肽并纯化至其目的用途所需的程度。用本领域已知的任何方法均可完成表达于宿主系统中的多肽的纯化或分离。例如，可将编码完整多肽或其片段的cDNA可操作性地与合适启动子连接，插入表达载体中，并转染入合适的宿主细胞。随后在允许转录和翻译发生的条件下培养宿主细胞，并回收所预期的多肽。还可使用其他控制转录或翻译的区段，如将多肽定向于特异细胞区室的信号序列(即，为了分泌)。原核宿主细胞的例子是本领域已知的，包括，例如，大肠杆茵和枯草芽孢杆菌。真核宿主细胞的例子是本领域所已知的，包括酵母、禽类、昆虫、植物和动物细胞，如COS7、HeLa、CHO和其他的哺乳动物细胞。酵母系统包括酿酒酵母、粟酒裂殖酵母和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。
例如，为了在巴斯德毕赤酵母中表达β2GPI结构域1多肽(例如，使用菌株SMD1168和SMD1168H)，使用编码β2GPI的全长cDNA作为PCR的模板，产生在氨基末端具重构的Kex2信号肽切割位点的结构域1基因片段。将片段克隆入用限制酶XhoⅠ和SalⅠ线性化的表达载体pPICZaipha(Invitrogen Corp.)。所构建的基因用酵母α-因子信号肽置换了天然结构域1信号肽，并终止于羧基端的所选氨基酸处。
当使用表达系统生产β2GPI多肽时，经常优选构建便于纯化的融合蛋白。融合蛋白组分的例子包括，但不局限于，myc、HA、FLAG、His-6、谷胱甘肽-S-转移酶、麦芽糖结合蛋白质或免疫球蛋白的Fc部分。这些方法是本领域所已知的。参阅，例如，Redd等(1997)生物化学杂志272:11193-11197。可用本领域已知技术从融合体中去除不需要的氨基酸，如His-6。例如，羧肽酶A可用于去除羧基末端氨基酸。羧肽酶A终止于脯氨酸或精氨酸。为了便于纯化，可使用固相羧肽酶A(Sigma)。
优选地，尤其是用于诊断目的时，多肽至少部分纯化或与其他细胞组分分离。优选多肽纯度至少达50％。在此上下文中，纯度计算为制品总蛋白质含量的重量百分比。更优选蛋白质纯度达50-75％。还可获得更高纯度的多肽，并包含于本发明中。为了临床使用，多肽优选高度纯化，至少约80％的纯度，无致热源和其他污染物。蛋白质纯化的方法是本领域所已知的并详述于此。
在某些系统，尤其是某些重组系统中，对于含额外(第五个)半胱氨酸或待还原半胱氨酸(例如，为了将多肽偶联至平台分子)的实施方案来说，起始产物可包含低分子量混合二硫键，其中第五个(或额外的反应性)半胱氨酸与其他的相对低分子量部分共价连接。在这些例子中，额外半胱氨酸的选择性还原是合乎需要的(同时保持其它二硫键)。用固相支持物如丙烯酰胺(如REDUCTACRYL，CalBiochem,San Diego)上的DTT之类的固相还原剂可完成这样的选择性还原。
此外，在设计和/或用来生产具额外半胱氨酸(即，半胱氨酸用作反应基团)之结构域1β2GPI多肽的系统中，可能期望制备这样的多肽，其中有附加氨基酸在序列中紧随额外的半胱氨酸后，以在合成和/或生产中保护该半胱氨酸。
优选地，尤其是若多肽将与平台偶联时(下述)，使用化学合成。化学合成允许N或C末端的修饰，这方便了与平台分子的偶联。
当生产结构域1β2GPI多肽时，如生产那些除结构域1的4个半胱氨酸之外还有附加半胱氨酸的结构域1β2GPI多肽时，应选择条件以促进正确的二硫桥形成。作为一个例子，通过溶解于6M盐酸胍(GnHCl)中变性还原的多肽，使浓度为0.5mg/ml。通过在室温和如下复性缓冲液中(0.1M GnHCl,0.SmM Tris-HCl和1mM EDTA，pH8.5)透析完成折叠。为了帮助正确的二硫桥形成，加入0.3mM和3mM的分别为氧化和还原的谷胱甘肽的混合物。用HPLC监测反应混合物，质谱分析不同的产物。在我们的实验中，环化5小时后，分析级的HPLC显示有约65％的转换，其中约50％具有正确的质量(Mw=7260)，约15％作为谷胱甘肽加和物出现(Mw=7567)。然后用反相HPLC纯化缺乏谷胱甘肽的折叠蛋白质。结构域1β2GPI多肽的偶联
本发明还提供了结构域1β2GPI多肽的偶联物。在某些实施方案中，可将结构域1β2GPI多肽与载体或标记偶联。获得这样连接的许多技术是本领域所已知的，在此无需详述。可使用安全且自身不诱发对宿主有害之抗体产生的任何载体。合适的载体一般是大的、代谢慢的高分子，如蛋白质；多糖，如胶乳功能化的sepharose、琼脂糖、纤维素、纤维素珠等等；多聚氨基酸，如多谷氨酸、多赖氨酸等等；氨基酸共聚物；和失活的病毒颗粒或减毒细菌，如沙门氏茵。尤其有用的蛋白质底物是血清白蛋白、匙孔血蓝蛋白、免疫球蛋白分子、甲状腺球蛋白、卵清蛋白、破伤风类毒素和本领域技术人员众所周知的其他蛋白质。
标记是本领域所已知的，在此无需详述。有许多不同的标记和标记方法是本领域常规技术人员所已知的。可用于本发明的标记类型例子包括酶、放射性同位素、荧光化合物、胶体金属、化学发光化合物和生物发光化合物。本领域常规技术人员知道其他的合适标记，或可用常规实验法确定合适的标记。此外，可用本领域常规技术人员通用的标准技术使这些标记与本领域的多肽结合。
结构域1β2PI多肽(更优选缺乏T细胞表位)可与非免疫原性价键平台分子(也称“平台”)偶联，这可增强结构域1β2GPI多肽的呈递。美国专利号5,162,515；5,276,013；5,552,391。平台可以是蛋白质或非蛋白质的(即，有机的)。蛋白质平台的例子包括，但不局限于，清蛋白、γ球蛋白、免疫球蛋白(IgG)和卵清蛋白。Borel等(1990)免疫学方法126:159-168；Dumas等(1995)Arch.Dematol.Res.287:123-128；Borel等(1995)Int.Arch.AllergyImmunol.107:264-267；Borel等(1996)Ann.N.Y.Acad.Sci.778:80-87。最优选多价的平台分子(即，包含一个以上的结合或连接位点)。多价平台优选含有至少两个连接位点，更优选至少3个，更优选至少5个，更优选至少7个，更优选至少10个，更优选至少12个，更优选至少15个连接位点。不过，应当理解，在诱发耐受性有关方面(即当平台与合适结构域1β2GPI多肽结合使用以引起免疫耐受性时)，取决于所用结构域1β2GPI多肽的特性和特定的条件，任何数目的连接位点都可能是足够的。还应当理解平台不是T细胞非依赖性抗原。
优选的价键平台分子是生物学稳定的，即，它们显示体内排泄的半寿期经常是数小时到数天到数月以达到治疗效用，优选由合成的组成确定的单链组成。它们的分子量通常约为200-200000，优选约200-50000(或更少，如30000)。本发明中的价键平台分子例子是多聚体(或由多聚体组成)，如聚乙二醇(PEG)、聚-D-赖氨酸、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、D-谷氨酸和D-赖氨酸(比率3∶2)。优选的多聚体是基于分子量约200-8000的聚乙二醇(PEG)。可与结构域1β2GPI多肽偶联的其他分子是清蛋白和IgG。
其他适用于本发明的优选价键平台分子是化学确定的非聚合的价键平台分子，如公开于共有的美国专利5552391中的那些分子。与前述的更传统的平台相比，这些平台具有分子量均一(即均匀)的优点(与多分散的分子量相反)，因而是“化学确定的”。因此，应当理解使用这些平台的偶联物群含均一分子量的平台或基本上是单分散的(即，具有狭窄的分子量分布)。平台分子样品(如平台分子的组合和/或类群)的分子量分布宽度的检查尺度是样品的多分散性。多分散性被用作衡量多聚体样品分子量均一或不均一的尺度。通过用数字平均分子量(Mn)除重量平均分子量(Mw)来计算多分散性。对于完全单分散的多聚体来说，Mw/Mn的值是统一的。用本领域可获得的方法检查多分散性(Mw/Mn)，如凝胶渗透层析。平台分子样品的多分散性(Mw/Mn)优选小于2，更优选小于1.5，或小于1.2，小于1.07，小于1.02，或如约1.05-1.5或约1.05-1.2。典型的多聚体通常具有的多分散性是2-5，或在某些情况下是20或更大。因为分子在大小上基本均一，价键平台分子低多分散性特性的优点包括提高了生物适合性和生物有效度，而由于分子量广泛变化引起的生物活性变化被最小化。因而多分散性分子以药物学上最适的方式配制，且易于分析。此外样品中分子群体的化合价受到控制。
适用于本发明的优选均一的化学确定的价键平台分子例子包括衍生的2，2’-乙二胺二氧乙烯(EDDA)和三乙基乙二醇(TEG)。其他优选的均匀、化学确定的平台分子例子描述于下文及本领域中。在其他的实施方案中，结构域1β2GPI多肽与清蛋白、IgG和/或PEG偶联。
另外的合适价键平台分子包括，但不局限于，四氨基苯、七氨基β环糊精、四氨基季戊四醇、1,4,8,11-四氮杂环十四烷(Cyclam)和1,4,7,10-四氮杂环十二烷(Cyclen)。
一般说来，用标准的化学合成技术制备这些平台。PEG必须被衍生化并制备成多价的，这可通过标准技术完成。一些适于偶联合成的物质，如PEG、清蛋白和IgG可购买得到。
可以许多方式完成结构域1β2GPI多肽与价键平台分子的偶联，其中一般涉及多肽和价键平台分子上一个或多个交联剂和官能团。平台和结构域1β2GPI多肽必须具有合适的连接基团。用标准的化学合成技术将连接基团加到平台上。可以用标准的固相合成技术或重组技术将连接基团加到结构域1β2GPI多肽上。为了与接头连接，重组方法中可能需要进行翻译后修饰，这样的方法是本领域所已知的。
作为例子来说，多肽包含氨基酸侧链部分，此部分含用作偶联多肽至平台之位点的官能团，如氨基、羧基或巯基基团。若多肽未包含这些基团，可将具这样的官能团的残基加到多肽上。可用固相合成技术或重组技术掺入这样的残基，两种方法均是肽合成领域众所周知的。当多肽具有碳水化合物侧链时，可用常规化学方法将氨基、巯基和/或醛基官能团掺入其中。例如，可在氰基硼氢钠存在时通过与乙二胺反应掺入伯氨基团，通过半胱胺二盐酸盐的反应并随后用标准二硫化物还原剂还原可引入巯基，而在过氧化物氧化后可产生醛基。如果价键平台分子不具有合适的官能团，也可以相似的方式将其衍生化以包含官能团。
多肽还可在其C-末端通过称为逆蛋白水解的过程被位点特异性修饰。基本上，逆蛋白水解使用了蛋白水解酶以催化酰胺键的形成，所用条件是驱动反应向此方向的条件。为了在其C-末端通过酰胺键与含酰肼接头(Rose,K等，生物偶联化学1991,2,154-159)或含氨氧基接头(Rose,K等，生物偶联化学1996,7,552-556)连接，已用逆蛋白水解修饰多肽。这样的修饰多肽可进行反应，与包含醛基或酮基的其它感兴趣分子形成腙或肟键。除其它接头外，通过逆蛋白水解还可将诸如含巯基接头之类的物质连接。
可变长度的疏水接头对连接多肽(或其它生物活性分子)至价键平台分子上是有用的。合适的接头包括乙二醇线性寡聚物或多聚物。这样的接头包括符合以下公式的接头：R1S(CH2CH2O)nCH2CH2O(CH2)mCO2R2，其中n=0-200,m=1或2,R1=H或如三苯甲基之类的保护基团，R2=H或烷基或芳香基，如4-硝基苯基酯。这些接头可用于将诸如卤代乙酰基(haloaceyl)、马来酰胺等之类含巯基反应基团的分子通过硫醚连接至通过酰胺键含氨基的第二个分子。这些接头的附着次序是可变的，即硫醚可以先形成或后形成。
如上所述，通过许多方法可将结构域1β2GPI多肽与许多合适的平台连接。在优选的实施方案中，使用了四溴乙酰基平台PIZ/IDA/TEG-β2GPI结构域1。其他优选的实施方案见实施例。
PIZ/IDA/TEG(PITG)平台的衍生物可制备如下。
PITG平台上的相容性交联基团例子偶联物
平台 结构域1多肽 偶联物
R=XCH2CO  D1-SH  R1=D1-SCH2CO
以偶联物实施方案为例，通过固相肽合成或重组方法制备N-末端带巯基接头的结构域1β2GPI多肽。接头可以是半胱氨酸或含SH部分。然后通过合适的衍生化平台(如溴代乙酰基或碘代乙酰基)可将被修饰的多肽烷化。
在某些实施方案中，结构域1β2GPI多肽通过硫氢基团(巯基或SH)(例如在半胱氨酸上的)偶联，形成偶联物中的硫醚键。在某些实施方案中通过包括β2GPI的第五个半胱氨酸提供此反应性半胱氨酸(实施例5)。
在某些实施方案中，通过肟键合形成偶联物。可通过例如，结构域1β2GPI多肽上的醛或酮之类羰基与含氨氧基、氨氧基乙酰基和氨氧基烷基之类氨氧基反应基团的平台之间的反应形成肟键。氨基氧基团可以在三甘醇或己基链上；不过，只要终止于-ONH2，含碳、氧、氮或硫原子的任何链就符合要求。
为了制备这些偶联物，选择性地修饰结构域1β2GPI多肽以在多肽特异位置，如N-末端产生醛或酮部分。其次，将多肽与含氨基氧基团的多价键平台反应形成平台与多肽之间的肟键。
通过转氨基反应可以将结构域1β2GPI多肽的N-末端转变成醛或酮，这是本领域所已知的。一般说来，转氨基反应将N-末端碳-氮单键转变成碳氧双键。N-末端的甘氨酸反应形成乙醛酰基，一种醛基。大部分其他氨基酸由于氨基酸侧链而反应形成酮。
在N-末端产生乙醛酰基的另一方法是用过碘酸钠氧化N-末端的丝氨酸或丝氨酸。此氧化作用切割N-末端丝氨酸或苏氨酸的羟基和氨基之间的碳-碳键，形成乙醛酰基基团。
在某些实施方案中，为了将选择性修饰多肽与平台连接，可以产生含氨基氧乙酰基(AOA)反应基团的多价键平台。通过用N-保护的氨基氧乙酰基团酰化并随后去除保护基团，可方便地将氨基氧乙酰(AOA)基团附着于含胺基团的多价键平台上。不过，乙醛酰基多肽与AOA衍生平台的反应过程缓慢，需数天才形成多肽和平台之间的肟键。实施例5描述了偶联化合物44的合成，其中包括将转氨基化β2GPI多肽附着于氨基乙酰基四聚平台上。本发明包括此偶联物。
在其他实施方案中，可使用含氨基氧烷基反应基团的平台。氨基氧烷基基团定义为在第一个碳位置处的氨基氧基团，其中第一个碳优选并不直接附着于电子吸收基团上，如作为羰基基团一部分的第二个碳上。我们已观察到氨基氧烷基基团比氨基氧乙酰基团更易与酮和醛反应形成肟。看起来氨基氧乙酰基团通常比不与羰基邻接的其他氨基氧基团(氨基氧烷基基团)反应性低。可认为由于电子吸收作用，氨基氧乙酰基团的羰基引起反应性的降低。有关这些平台和偶联物的更多信息可见于实施例和共同拥有的美国专利申请序列号____(代理人文档号25231-20074000)。通过将转氨基化β2GPI结构域1多肽附着于氨基氧基四聚平台上合成实施例5所述的偶联化合物45。本发明包括此偶联物，以及来自以AO为基础合成的那些β2GPI结构域1多肽肟偶联物。本发明的多核苷酸
本发明还提供了编码结构域1β2GPI多肽的多核苷酸(包括分离的天然存在和非天然存在多核苷酸)。这样的核苷酸可用于，例如，结构域1β2GPI多肽的生产。用重组克隆/表达载体和蛋白质纯化方法之类的标准技术可完成结构域1β2GPI多肽的生产。若在体内生产，需用诸如下述之类的合适表达系统。凭借对结构域1β2GPI多肽的氨基酸序列的了解(用标准蛋白质测序技术获得)，可设计编码特异氨基酸序列的多核苷酸。多核苷酸可合成或从基因组或cDNA序列中获得(在适当的时候)。
本发明还包括含任何上述多核苷酸的克隆载体和表达载体。这些载体是本领域众所周知的(如用于体外的细菌、哺乳动物、酵母和昆虫表达体系)，在此无需描述。参阅，例如，Gacesa和Ramji,载体，John Wiley&Sons(1994)。
本发明还包括含(即用其转化，或包含)任何本文所述多核苷酸和/或载体的宿主细胞。原核和真核宿主细胞均可使用。原核宿主包括细菌细胞，例如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和分枝杆菌。真核宿主有真菌(包括酵母)、昆虫、鸟类、植物和哺乳动物细胞。宿主系统是本领域所已知的，在此无需详述。除此之外，本发明的宿主细胞可用作上述多核苷酸的源泉和/或用于结构域1β2GPI多肽多核苷酸和/或多肽生产的载体。它们还可用作结构域1β2GPI多肽的体内运送载体。本发明的结构域1β2GPI模拟物
本发明还提供了结构域1β2GPI模拟物(或类似物)，它们可特异结合结构域1β2GPI多肽(包括完整的结构域1)所特异结合的β2GPI-依赖型抗磷脂抗体(即，模拟物与结构域1β2GPI多肽共有特异于β2GPI-依赖型抗磷脂抗体的表位)。另一方面，模拟物模拟了结构域1中的表位(即，在结构域1β2GPI多肽存在时竞争结合β2GPI-依赖型抗磷脂抗体)。模拟物可以是如上所述的许多化学物质。根据它们的化学特性不同，可以用化学和生化领域(包括生物技术)中的标准技术生产本发明的模拟物。这些模拟物可用于检测中并/或用作耐受原。当用作耐受原时，模拟物缺少可检测的T细胞表位。
用常规技术可鉴定本发明的模拟物。例如，可筛选候选分子以测定它们是否(a)与β2GPI-依赖型抗磷脂抗体特异结合和/或(b)缺乏T细胞表位(即，不能引发T细胞应答或T细胞相关活性)。本领域和本文中已描述了这两种活性或二者之一的测定。用本领域已知的噬菌体展示方法(包括微量淘选)可完成候选多肽模拟物的筛选(见实施例3)。以下是一些这样的技术的概述。
为了从表位文库筛选中鉴定最佳表位，已开发了不同程度严谨性的种种试验。试验以增加的严谨性列举如下：生物淘选(biopanning)<微量淘选(micropanning)<噬茵体-捕捉ELISA<噬茵体ELISA=茵落印迹=肽ELISA。
“生物淘选”这种技术是将亲和纯化的β2GPI-依赖型抗磷脂抗体和带随机肽插入片段之噬菌体混合，然后抗体特异的回收捕捉结合的噬茵体。此噬菌体使繁殖于含四环素培养基中的大肠杆菌具有四环素抗性，然后将它们分离。多轮生物淘选富集了样品中免疫特异性噬茵体的数目。通常在3-5轮筛选之后回收噬茵体，但它们可能只代表对于筛选抗体以低亲和性非特异结合的序列。需要有进一步评估这些噬茵体(微量淘选)的方法。
微量淘选提供了对噬茵体与β2GPI-依赖型抗磷脂抗体结合相对强度的估计。在3轮或更多轮生物淘选之后进行微量淘选，并使用与生物淘选中所用相同的抗体。此方法包括，从最后一轮生物淘选中稀释噬菌体，微量淘选分析50个或更多个这些克隆。通过培养各克隆至相同密度，然后在事先以恒量抗体包被的微量滴定孔中温育以最佳单一浓度稀释的噬茵体，从而完成微筛选。噬茵体的最适单一浓度是最可能体现最宽范围微量淘选值(0-4+)的浓度，因此对被检测克隆有最大辨别力。这以6个随机挑选克隆的微量淘选表现为基础，其中测定了系列稀释获得的噬茵体多种浓度下的淘选值。与抗体温育后，洗去未结合的噬菌体，而结合噬茵体的量被用作噬茵体插入片段对抗体亲和性的指示。通过弱酸洗脱，随后中和及感染大肠杆菌测定结合噬菌体的量。通过将大肠杆菌铺于含四环素的琼脂平板上，然后测定各克隆获得的茵落密度，对被感染大肠杆菌的数目进行定量。
开发噬菌体-捕捉ELISA检测以提供中间水平的试验，从而消除微量淘选的相对低严谨性和噬茵体或肽ELISA试验的高严谨性之间的差距。初步研究显示，一些抗体制品通过微量淘选得到太多的阳性克隆，但通过噬菌体-ELISA或肽-ELISA则一个也得不到。描述如下的噬茵体-ELISA的局限性是，各噬茵体上只有5拷贝p-Ⅲ，即使有许多包被于孔上的噬茵体，也只有很少拷贝的插入片段，因而检测需要抗体对插入片段具极高亲和性。用噬菌体-捕捉ELISA方法，可扩增信号多次，这促进了对抗体和插入片段之间较低亲和性、稳定相互作用的检测。
噬菌体-捕捉ELISA包括如下步骤。用β2GPI-依赖型抗磷脂抗体包被微量滴定孔并如微量淘选试验中添加噬茵体克隆。洗去未结合噬茵体，用结合噬茵体的酶偶联羊抗血清对结合噬茵体的量进行定量。将噬菌体捕捉ELISA筛选的噬茵体与许多aPL抗体反应，在随后ELISA试验中可提供强信号。此中间水平的灵敏性可使得肽合成效率更高，因为很少一些微量淘选阳性噬茵体是噬茵体捕捉ELISA阳性的。结果是，合成自阳性噬茵体-捕捉ELISA噬茵体的肽通常具免疫反应性。
筛选的噬茵体-ELISA方法需要插入片段与筛选抗体非常紧密地结合。噬茵体直接包被至微量滴定板的孔上，并与筛选抗体一起温育。洗涤去除未结合抗体后，添加抗人IgG碱性磷酸酶偶联物以结合与噬菌体结合的任何β2GPI-依赖型抗磷脂抗体。然后按本领域众所周知的方法，通过添加显色底物至孔中(其将与碱性磷酸酶反应)检测β2GPI-依赖型抗磷脂抗体。
菌落印迹试验可用于被生物淘选之噬茵体感染的大肠杆菌的大规模菌落筛选。对于鉴定免疫反应性克隆来说，此方法是噬茵体-ELISA之外的又一选择，显示了可比水平的灵敏度，且检测前无需培养各噬菌体克隆。在此试验中，将被一轮生物淘选得到的噬茵体感染的大肠杆菌铺于大直径硝酸纤维素(NC)膜上，并在含四环素的琼脂平板表面培养过夜。Barbas等(1991)美国国家科学院院报88:7978-7982。各茵落产生自含相同序列之噬菌体的感染。用此NC“主膜(master)”制备NC上的数次复制转移印迹并培养于琼脂平板表面。化学和酶促裂解印迹上的噬茵体感染茵落后，可用蛋白质印迹中常用的技术，即染色或免疫印迹探测噬菌体。可将已封闭的印迹与筛选aPL抗体温育。洗涤去除未结合抗体后，添加抗人IgG辣根过氧化物酶偶联物，以结合与噬菌体结合之任何β2GPI-依赖型抗磷脂抗体。显色底物的添加可定位主平板上代表免疫特异性噬茵体的离散菌落，可将其克隆用于进一步研究。
DNA测序测定上述试验中最佳反应噬茵体的肽插入片段序列后，用本领域众所周知的标准Fmoc肽化学方法制备相应的肽。对于肽-ELISA试验来说，肽可以制备成例如分支四价分子，即各分子具有四拷贝插入片段。这样的分子可包被微量滴定板孔，同时还具有暴露于溶液中的表位，可被抗体结合。如上所述，与Map所用方法相似，通过在头两个偶联模拟物处掺入赖氨酸作为分支点，合成四价肽。Posnett等(1988)。在各臂上的赖氨酸之后添加由甘氨酸-丝氨酸-甘氨酸-丝氨酸组成的间隔子，然后加入插入片段，包括噬茵体中的框架氨基酸，羧基端的脯氨酸-甘氨酸和氨基端的丙氨酸-甘氨酸-脯氨酸。用标准Fmoc方法将此合成中的所有氨基酸逐个添加上去。
用ELISA检验这些肽，ELISA的进行是通过包被肽于微量滴定板孔上，然后以标准ELISA模式检测它们与aPL抗体的反应性。实践中，肽通常与原筛选抗体极强结合，并显示与其他β2GPI-依赖型抗磷脂抗体有部分交叉反应性。同时包括非β2GPI-依赖型抗磷脂抗体对照以消除非特异结合肽。
肽竞争结合ELISA测定了两肽是否结合给定试验者血清中的相同抗体群，并对与β2GPI-依赖型抗磷脂抗体的相对结合亲和性进行定量。在此试验中，多种单聚肽与包被于微量滴定板孔上的四价肽竞争。为了进行此试验，用标准Fmoc化学方法将待评估的肽合成为单体，即，无四价肽合成中所用的赖氨酸分支。然后纯化单体肽并以已知浓度溶解。用已知结合β2GPI-依赖型抗磷脂抗体的四价肽包被微量滴定板的孔。将系列稀释的单体肽与恒定稀释度的β2GPI-依赖型抗磷脂抗体一起温育。通过测定四价肽抗该抗体的效价并选择滴定曲线下降段上的稀释度事先测定β2GPI-依赖型抗磷脂抗体的稀释液。将抗体与单体肽温育1小时后，添加抗体/肽溶液至微量滴定板孔中并进行标准的显色ELISA。将获自各孔的比色读数绘制成图，测定降低β2GPI-依赖型抗磷脂抗体与四价肽之结合的各单体肽的浓度。50％抑制的点被用作对单体肽结合相对强度的衡量。
此试验的一种变化形式是使用以β2GPI/心磷脂取代四价肽包被微量滴定板，并检测单体肽阻断β2GPI-依赖型抗磷脂抗体与β2GPI/CL上的表位结合的能力。在此试验中，将最适浓度的无IgG人血清用作β2GPI的来源。将数种浓度的单体肽与最适浓度的β2GPI-抗磷脂抗体以与用四价肽作平板底物的试验类似的方式温育。温育(β2GPI/CL)平板中的β2GPI-依赖型抗磷脂/肽后，如同四价试验中一样在最大吸收的一半处测定抗体的结合和50％抑制所需的肽浓度。
此试验的另一种变化形式是检验单体肽阻断β2GPI-依赖型抗磷脂抗体与直接包被于Nunc Maxisorp微量滴定板孔中之β2GPI结合的能力。在这种变化形式中，不用心磷脂，所用稀释剂和封闭剂是脱脂奶而非鱼明胶。
此试验的另一种改变形式是检测多价结构域1β2GPI多肽偶联物耐受原分子或结构域1β2GPI多肽单体阻断血清或血浆中β2GPI-依赖型抗磷脂抗体与直接包被于Nunc Maxisorp微量滴定板孔中的β2GPI的结合的能力。试验中不用心磷脂。在封闭和稀释溶液中均使用了脱脂牛奶加去污剂吐温-80。
诱导耐受性的理想表位应与β2GPI依赖型抗磷脂抗体一样具有尽可能强的相互作用，但应不包含任何不必要的残基。为了推断表位的最小组成，制备具如下特点的各肽模拟物(ⅰ)缺少给定残基，例如，缺失羧基和/或氨基端的框架残基，或(ⅱ)其中已进行了氨基酸取代，从而与表位文库筛选中所发现的序列不同。这些氨基酸取代可以是天然的，例如用异亮氨酸取代亮氨酸，或非天然的，例如用α甲基脯氨酸取代脯氨酸。然后通过肽竞争ELISA检查这些缺失和/或取代的影响。
本发明还包括模拟物的偶联体、含模拟物的组合物、含模拟物的试剂盒和编码任何多肽模拟物的多核苷酸。上文已描述了如何制备和使用这些实施方案，所提出的原理和技术同样适用于模拟物。本发明的组合物
本发明进一步提供了含结构域1β2GPI多肽(包括上述所有多肽实施方案，如融合体、多聚多肽和偶联物)的组合物，以及含编码结构域1β2GPI之多核苷酸的组合物和含模拟物的组合物。这些组合物对可受益于耐受性诱导的个体施用时尤其有用。此组合物还可用作检测系统的试剂。
一般说来，用于诱发耐受性的本发明组合物包含有效量的结构域1β2GPI多肽(或模拟物)，优选包含在药用可接受的赋形剂中，并可以多种配方配制。正如本领域众所周知的，药用可接受的赋形剂是相对惰性的物质，它方便了药理学有效物质的施用。例如，赋形剂可使药品保持形状或稠度，或用作稀释剂。合适的赋形剂包括，但不局限于，稳定剂、润湿剂和乳化剂、用于改变渗透性的盐、胶囊化试剂、缓冲液和皮肤渗透增强剂。在《Remington的药物科学》(第19版，Mack出版社(1995))一书中提出了赋形剂以及用于肠胃外和非肠胃外药物运送的配方。
一般说来，将这些组合物配制成注射服用形式(如，腹膜内、静脉内、皮下、肌内注射，等等)。因此，这些组合物优选与药用可接受载体，如盐、Ringer溶液、葡萄糖溶液等联合使用。大体上，从溶解度和渗透性等的实际经验考虑出发，偶联物通常占配方重量的约0.01％-10％。具体的给药方式，即剂量、时间和重复度，将取决于具体个体和个体的病史。大体上，每周服用剂量约为1μg-100mg偶联物/kg体重，优选约100μg-10mg/kg体重。对于诸如半寿期之类的问题，从经验考虑通常将对剂量的确定有参考价值。其他合适的剂量安排可以频繁如每天一剂或每周3剂，或每周一剂，或每2-4周一剂，或每个月一剂或更低频率的安排，这取决于个体和疾病状态。可能要求反复用药，通常按B细胞转换率定时，以获得和/或维持体液无反应性状态。如果检测到抗体GPL值增加，这样的反复用药通常包括每30-60天或更快用药约1μg-10mg/kg体重或更高。或者，对于某些病理状况可能要求组合物的缓释。用于达到缓释的种种配方和装置是本领域所已知的。
其他的配方包括本领域已知的合适运送形式，包括，但不局限于，诸如脂质体之类的载体。Mahato等(1997)药学研究14:853-859。脂质体制品包括，但不局限于，细胞转染剂、多层脂质体和单层脂质体。
在一些实施方案中，组合物中可存在一种以上的结构域1β2GPI多肽(或模拟物)。这样的组合物可包含至少一种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种不同的结构域1β2GPI多肽。正如本领域经常所说的，这样的“鸡尾酒”尤其可用于治疗较宽范围的个体群。它们也可能比只使用一种(或较鸡尾酒中所含的种类少)结构域1β2GPI多肽更有效。
组合物可单独施用或与用于增强和/或补充结构域1β2GPI多肽成效的其他形式药剂结合使用，包括，但不局限于，抗辅助T细胞疗法。这样的治疗通常应用诸如类固醇或环孢素之类抑制T细胞的药剂。
用本领域已知的临床参数可识别适合接受这样的组合物的个体，如β2GPI-依赖型抗磷脂抗体GPL值的测定、与疾病状态尤其相关的β2GPI-依赖型抗磷脂抗体存在的测定和/或β2GPI-依赖型抗磷脂相关病理状态的症状。优选个体是人。至于β2GPI-依赖型抗磷脂抗体，GPL值至少约为10，优选约为20，更优选约为40可能表示需要施用任何这些组合物。此值基于目前可购买到的试剂盒，即固相β2GPI-依赖型抗磷脂抗体ELISA(如，Inova(San Diego)；Theratest(Chicago)；APL Diagnostics(Louisville))。指示需要施用这些组合物的还有具任何β2GPI-依赖型抗磷脂抗体相关失调(即，疾病)家族史的那些个体，或被认为具有“正常”GPL值但在一段时间内显示GPL值增加的那些个体。
大体上，通过检查上述临床参数中的任何变化，尤其是β2GPI-依赖型抗磷脂GPL值的变化，判断施用任何这些组合物的功效。不过，对于认为或已显示与待治疗状况相关的任何参数的检查都是合适的。
至于可用作试剂(如在检测试验中)的那些组合物，这些组合物通常包含足以完成检测的结构域1β2GPI多肽(即，一或多种多肽)的量。这些量可凭经验方便地确定。这些组合物可进一步包含诸如缓冲液之类的物质以完成检测。这些组合物还可任选地与检测基质复合，如固相(如，在免疫亲和柱中)。含结构域1β2GPI多肽的试剂盒
本发明还提供了含(即包含)一或多种结构域1β2GPI多肽(或一或多种结构域1β2GPI多肽模拟物)和任选的作为标准之结构域1β2GPI多肽抗体的试剂盒，优选用于检测β2GPI-依赖型抗磷脂抗体的诊断试剂盒。诊断实验室、实践性实验室、开业者或个人可完成使用本发明的结构域1β2GPI多肽的诊断和监测方法。本发明涉及的试剂盒包括能够用来完成对抗结构域1β2GPI多肽抗体的存在进行的试验的那些试剂盒，如本文所述的任一种试剂盒，从而检测和/或定量那些抗体。本发明所涉及的试剂盒还包括，例如可用于检测体外或体内转染细胞中抗结构域1β2GPI多肽的抗体的试剂盒。因此，本发明包括用于检测和/或定量生物学样品中的抗结构域1β2GPI多肽抗体，优选β2GPI-依赖型抗磷脂抗体的含结构域1β2GPI多肽的试剂盒。本发明的试剂盒被恰当地包装，并可任选地提供对此方法有用的附加组分。这些任选组分包括，但不局限于，缓冲液、捕捉剂、现象剂(developing reagent)、标记、反应表面、检测装置、对照样品、说明书和解释性信息。
在检测人β2GPI-依赖型抗磷脂抗体的存在时，可应用检测抗体结合的合适方式(试剂盒中提供)，诸如标记的抗人抗体，其中的标记可以是酶、荧光团、化学发光材料、放射性同位素、辅酶。一般说来，所用的标记是酶。
除检测β2GPI-依赖型抗磷脂抗体之外，β2GPI多肽(或一或多种结构域1β2GPI多肽模拟物)可以是检测凝血之试剂盒的组分。这样的试剂盒能检测β2GPI-依赖型抗磷脂抗体在介导血栓形成途径中的作用(如果有的话)。例如，β2GPI-依赖型抗磷脂抗体可延迟活化的蛋白质C对活化的因子Va的失活作用或可激活组织因子凝血途径。如实施例11所述，我们已发现结构域1特异性抗β2GPI抗体延缓了因子Va的失活。结构域1β2GPI多肽(和/或模拟物)可用于区别β2GPI-依赖型抗磷脂抗体介导的作用和影响因子Va失活或组织因子途径活化的其他机制。此外，结构域1β2GPI多肽(和/或模拟物)可用于其他的功能性凝血(如血栓形成)试验中，其中来自个体的β2GPI-依赖型抗磷脂抗体或血清或血浆可影响特异性凝血试验的结果。例如，若结构域1β2GPI多肽(和/或模拟物)的存在改变了凝血试验的结果(与缺少结构域1β2GPI多肽(和/或模拟物)时此试验的结果比较)，则凝固途径中牵涉β2GPI-依赖型抗磷脂抗体。此信息在评估潜在特异疗法中尤其有用。使用结构域1β2GPI多肽(和结构域1β2GPI多肽模拟物)的方法
本发明还提供了利用结构域1β2GPI多肽(和/或结构域1β2GPI多肽模拟物)的方法，它们可应用于检测和/或治疗中。因此，本发明包括利用本发明的β2GPI多肽(和/或本发明的结构域1β2GPI多肽模拟物)检测生物学样品中合适靶目标的方法。利用多肽进行诊断(即检测)试验的方法是本领域所广泛已知的，对于普通技术人员来说是常规的。通常，为了完成本发明的诊断(即，检测)，可提供本发明的多肽或模拟物之一(通常是组合物)作为检测生物样品中与其反应的靶目标的试剂。从诊断参数待检查的个体中获取合适的生物学样品，由此提供靶分子。如果需要，在进行试验前可将靶分子自样品中部分纯化或扩增。本发明还提供了利用本发明多肽或模拟物纯化β2GPI-依赖型抗磷脂抗体的方法。本发明还提供了利用本发明的多肽、多核苷酸和/或模拟物诱发耐受性的方法。β2GPI-依赖型抗磷脂抗体的检测
在一实施方案中，本发明提供了检测生物学样品中可特异结合结构域1β2GPI多肽抗体，优选β2GPI依赖型抗磷脂抗体的方法。这些方法通常可应用于临床中，例如，用于诊断和/或监测个体中β2GPI-依赖型抗磷脂抗体的水平。这些方法包括在适于抗结构域1β2GPI特异抗体(如β2GPI-依赖型抗磷脂抗体)与结构域1β2GPI多肽之间稳定复合物形成的条件下使样品中的(β2GPI-依赖型抗磷脂)抗体与结构域1β2GPI多肽(即，本发明的任何多肽)接触，并检测所形成的稳定复合物(如果有的话)。因为目前尚无用于这些抗体的普遍方便或合适的试验，本发明的结构域1β2GPI多肽使得这些方法尤其有用。许多免疫试验方法是本利用所已知的，在此无需详述。待检查β2GPI-依赖型抗磷脂抗体的合适样品是生物学样品，包括血清或血浆(优选血清)和靶组织洗脱物。应当理解，所形成复合物的检测可以是直接的(如检查复合物相关标记的量)或间接的(如检查试验中所置换的标记配体的量)。
为了将本发明的多肽或模拟物用于个体中所说抗体的检测，可进行免疫试验。多肽或模拟物以试剂形式提供，抗体是生物学样品中的靶分子。例如，可用固相蛋白A捕捉存在于血清样品中的人IgG抗体分子，然后用标记的多肽试剂覆盖。抗体量应与固相上附着的标记成比例。或者，可首先用含抗体的检测样品覆盖表达多肽的细胞或组织部分，然后用如标记的抗免疫球蛋白之类的检测试剂覆盖。抗体量应与固相上附着的标记成比例。然后将样品中所检测的抗体量与对照样品中检测的量进行比较。
在本发明方法中，通常通过已知技术将结构域1β2GPI多肽或模拟物固定到合适的固相上，如亲和柱填充材料或塑料表面如微滴板或测杆(dipstick)。合适的亲和柱填充材料包括例如琼脂珠基质、聚丙烯酰胺、玻璃、纤维素或交联葡聚糖。合适的塑料表面包括聚甲基丙烯酸酯、聚苯乙烯、聚乙烯、聚对苯二甲酸酯、乙二醇、聚酯、聚丙烯等。通常，任何标准的微滴板均可使用。或者，固相可以是其中掺入了结构域1β2GPI多肽或模拟物的凝胶或基质形式。
为进一步说明，可以将可能含有可与结构域1β2GPI多肽之抗体(如β2GPI-依赖型抗磷脂抗体)的检测样品与通常被可检测标记(如用放射性同位素或酶)的预定的非限量结构域1β2GPI多肽混合。在液相试验中，用诸如过滤或层析之类分离技术去除未反应的试剂。在这些免疫试验技术中，复合物相关联的标记量与样品中的β2GPI-依赖型抗磷脂抗体量正相关。可设计相似的试验，其中检测样品中的β2GPI-依赖型抗磷脂抗体与被标记抗体竞争性地结合有限量的结构域1β2GPI多肽。在此，标记的量与样品中的β2GPI-依赖型抗磷脂抗体量负相关。
在一些实施方案中，生物学样品是组织样品或组织洗脱物，并通过例如竞争性结合试验检测与组织样品相关联的β2GPI-依赖型抗磷脂抗体的量。这些方法可能在应检测和/或监测特殊组织中β2GPI-依赖型抗磷脂抗体的存在情况和/或含量时尤其有用。此类试验可指示，例如，是否显示有特殊疾病(或疾病的风险)(如血栓形成或凝固紊乱的具体形式)。为了诊断和/或监测的目的，这样的试验还可用于对β2GPI-依赖型抗磷脂抗体更精确和灵敏的定位测定。此外，关于β2GPI-依赖型抗磷脂的定位信息还可为临床医生提供合适治疗选择方案的指示。
应当理解这些检测方法可应用于多种临床状况中。例如，检测法可用于鉴定显示有发展性β2GPI-依赖型抗磷脂相关状况或紊乱危险的个体(可能是因能区别病理相关抗体和非病理相关抗体所引起的)。检测还可用于监测治疗过程(如施用任何上述组合物)。检测还可帮助从非病原抗体中识别病原抗体。检测还可帮助临床医生决定最佳治疗方法和/或预测。
如上所述，结构域1β2GPI多肽(和/或模拟物)还可用作凝血试验中的诊断组分，特别是在β2GPI-依赖型抗磷脂抗体能改变特异凝血试验结果的试验中。例如，如果结构域1β2GPI多肽(和/或模拟物)的存在可改变凝血试验的结果(与缺乏结构域1β2GPI多肽(和/或模拟物)时此试验的结果相比)，则此凝固途径中牵涉β2GPI-依赖型抗磷脂抗体。因为结构域1β2GPI多肽(和/或模拟物)可用于区别β2GPI-依赖型抗磷脂抗体介导的作用与凝血的其他机制(如血栓形成)，本发明包括检测凝血(如血栓形成)中β2GPI-依赖型抗磷脂抗体的参与(介导)的方法，包括(a)利用来自个体的合适生物学样品和结构域1β2GPI多肽(和/或模拟物)进行凝血试验；(b)用来自个体的合适生物学样品进行凝血试验，但不使用结构域1β2GPI多肽(和/或模拟物)；(c)比较(a)和(b)的结果，其中结果的不同表明β2GPI-依赖型抗磷脂抗体参与凝血反应。这些方法还可用于根据β2GPI-依赖型抗磷脂抗体在凝血中的介导作用监测病人的状态，以及进行最初的检测。这些方法还可用于指示或检测β2GPI-依赖型抗磷脂抗体涉及(即，介导)的凝血异常。
对于这些方法来说，血浆或血清均可使用。或者使用通过本领域标准方法分离的IgG级分。实施例11中提供了凝血检测系统的例子。在一些实施方案中，通常通过测定凝固时间确定活化因子V(Va)的水平。检测凝血的试验、装置和试剂盒是本领域所已知的，并可购买得到。β2GPI-依赖型抗磷脂抗体的纯化
本发明还包括纯化可与结构域1β2GPI多肽特异结合之抗体(如β2GPI-依赖型抗磷脂抗体)的方法，包括使含β2GPI-依赖型抗磷脂抗体的生物学样品与结构域1β2GPI多肽或其模拟物在能形成稳定抗原-抗体复合物的条件下接触，收获形成的复合物(如果有的话)。通常，将结构域1β2GPI多肽或模拟物偶联至亲和基质以便用亲和柱纯化。这样的方法是本领域的常规方法，在此无需详述。实施例1还描述了β2GPI-依赖型抗磷脂抗体的亲和纯化。诱发耐受性的方法
本发明还包括诱发耐受性(即耐受原状态)的方法，包括将有效量的结构域1β2GPI多肽(或含结构域1β2GPI多肽的多肽)或其模拟物施用于个体上，它们均缺少可检测的T细胞表位。如上所述，优选地，结构域1β2GPI多肽(或含结构域1β2GPI多肽的任何多肽)或模拟物还与适当的平台分子偶联。为了本发明的目的，应当理解，通过诱发耐受性减少和/或消除、稳定免疫应答和/或降低免疫应答增加速率是对β2GPI的免疫应答。因此，诱发的耐受性是抗原特异的，其中的抗原是β2GPI，在已确定具有(至少在施用本发明多肽和/或模拟物之前)β2GPI依赖型抗磷脂抗体的个体中产生了耐受性。
本发明的适当多肽(即，缺乏T细胞表位的含结构域1β2GPI多肽或模拟物)可单独使用或与可提高所需活性/目标的其他物质结合使用。如上所述，种种多肽也可相互结合使用。种种配方和服用方法已论述于上文中。
用本领域已知的方法可完成对于是否已诱发耐受性的测定。大体上，通过检测针对结构域1β2GPI多肽的免疫应答测定耐受性。用标准试验法可测量针对结构域1β2GPI多肽的免疫应答，包括例如测量与结构域1β2GPI多肽或模拟物结合的抗体水平；测量用结构域1β2GPI多肽免疫后细胞因子的产生；在施用本发明的β2GPI多肽或模拟物之后用来自接受此用药的个体(即，具β2GPI-依赖型抗磷脂抗体的个体)的T细胞体外分析对于结构域1β2GPI多肽的T细胞应答，包括，例如，标准的3H-胸苷摄入测定，用于测量在抗原呈递细胞情况下呈递结构域1β2GPI多肽时的T细胞增殖；标准的51Cr释放测定，用于测量细胞毒性T细胞对呈递结构域1β2GPI多肽的细胞的杀灭作用，等等。
以下实施例用于说明，但并未限制本发明。实施例实施例1:β2GPI的结构域1与β2GPI-依赖型抗磷脂抗体具免疫反应性材料和方法结构域缺失突变体的构建
β2GPI由5个“sushi”结构域组成。为了确定β2GPI的抗原性区域，我们选择性地从β2GPI中去除一个或多个结构域。Igarashi等应用了此方法((1996)血液87:3262-3270)，他们制备了人β2GPI的多个缺失体，各缺失体各包含结构域4和5、结构域3-5、结构域2-5、结构域1-4和结构域1-3。除Igarashi等人所述的结构域缺失突变体外，我们还构建了只含结构域1和2的人β2GPI突变体。
这些缺失突变体构建的起始点是克隆入pBacPAK9(Clontech)的人β2GPI全长cDNA(Steinkasserer等(1991)Biochem.J.277:387-391)，由S.Krilis惠赠。第一步是在C-末端引入GlyHis6。在这个过程中，通过将C-末端的半胱氨酸密码子从TGC改变成TGT，随后是甘氨酸(GGC)和组氨酸(CAC)，建立了唯一的Msc1限制性位点(TGGCCA)。His6标记的目的是方便用Ni螯合层析纯化突变蛋白质。
用单链DNA定点诱变引入GlyHis6。所用方法与Kunkel等人，酶学方法(1987)154:367-382中公开的方法一样。在用辅助噬茵体M13K07感染包含插入了人β2GPI cDNA之噬茵粒pBacPAK9的细胞时，从生长培养基中收集的噬茵体颗粒大量含有单链DNA形式pBacPAK9。此外，如果所应用的细胞是诸如CJ236之类的dut1、ung1基因型细胞，就用尿苷置换DNA中的一些胸苷。用酚抽提从噬茵体中纯化单链DNA，酒精沉淀。
与C-末端半胱氨酸一侧区域互补并编码GlyHis6的寡核苷酸ApoH-G6H具有序列5’AAACCACCTTAATGGTGATGGTGATGGTGGCCACATGGCTTTACA3’(SEQ ID NO:13)，将它与已生长于大肠杆菌CJ236中、含人β2GPI基因的pBacPAK9单链DNA退火。用Kunkel的方法延长互补寡核苷酸，产生双链DNA。将反应液转化入大肠杆菌K91.菌株K91不含dut1、ung1基因型，其结果是含尿苷的DNA将被降解。应富集编码GlyHis6的新合成链。用T7测序酶试剂盒或耐热测序酶试剂盒(Amersham Life Sciences)通过DNA测序分析克隆。
按上述方式利用以下寡核苷酸产生人β2GPI的结构域缺失突变体：B2del3-605’GAC ATA CTC TGG GTG TCC GTC CTG CAA TAG C 3’(SEQ ID NO:14)B2del3-1205’TGG AGG GCA GAT GAT CCG TCC TGC AAT AGC 3’ (SEQ ID NO:15)B2del3-1825’GAA TGG GCA TTF TAC TTC CCG TCC TGC AAT AGC 3’(SEQ ID NO:16)B2del3-2425’AGG TAA TTT ACA AGA TGC CCG TCC TGC AAT AGC 3’SEQ ID NO:17)B2del242-3265’ATG GTG ATG GTG GCC ACA ACT TGG CAT GGC 3’(SEQ ID NO:18)B2del 182-3265’ATG GTG ATG GTG GCC GCA TTC TGG TAA TTT AG 3’(SEQ ID NO:I9)
寡核苷酸中的数字指人β2GPI的氨基酸。例如，B2del3-60指第3-60位氨基酸从β2GPI中缺失。产生的蛋白质包含结构域2-5。
有关构建概述如下。结构域    构建体      预期蛋白质序列SEO ID NO:2,3,4,5   B2del3-60       GRTPR         203,4,5     B2del3-120      GRIIC         214,5       B2del3-182      GREVK         225         B2del3-242      GRASC         231,2,3,4   B2del242-326    GRTCP         241,2,3     B2del182-326    GRTCP         24
应用PCR产生其他突变体。反应模板是含人β2GPI cDNA的pBacPAK9。序列为5’CTA TAA ATA CGG ATC CCG GGA ATTCG3’(SEQ ID NO:25)、引发于pBacPAK9多克隆区域上游的寡核苷酸pBacPac9 PCR1270、1297用作5’引物。为了构建只有结构域1的克隆，将具有序列5’GCA GCT GGC CAA CTC TGG GTG TAC ATTTCA GAG TG3’(SEQ ID NO:26)的寡核苷酸结构域1PCR(64)Msc1用作3’引物。同样地，为了产生含结构域1和2的突变体，将具有序列5’GCA GCT GGC CAA TGA TGG GAG CAC AGA GAG GAA G3’(SEQ ID NO:27)的寡核苷酸结构域1、2PCR(122)Msc1用作3’引物。PCR进行25轮循环。产物酚抽提并酒精沉淀。用BamHⅠ在5’端、Msc1在3’端消化这些片段。将这些消化的DNA片段用凝胶纯化，连接入已用相同限制酶切除全长β2GPI的pBacPAK9中。将连接产物转化入大肠杆茵XL1-blue，用DNA测序对克隆定性。结果如下：结构域    构建体         预期蛋白质序列    SEO ID NO:1       B2del165-326       GRTCP          241,2     B2del123-326       GRTCP          24
从感染昆虫细胞的培养基中纯化β2GPI的所有缺失突变体。通常，离心去除细胞，用至少10倍体积的磷酸缓冲盐水(PBS；137mMNaCl,2.7mM KCl,4.3mM Na2HPO4·7H2O,1.4mM KH2PO4)在4℃透析培养基18小时。第二天，离心去除沉淀。将透析过的培养基调成50mM NaPO4,pH7.5,0.5MNaCl，将Ni-NTA树脂加入透析过的培养基中，缓慢混合。4℃1小时后，用布氏漏斗收集树脂，装入4℃保存的水夹层柱中。用50mM NaPO4,PH7.5,0.5M NaCl进一步洗柱直至无可检测到的蛋白。用含20mM、35mM或100mM咪唑的相同缓冲液顺序洗柱。用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS PAGE)分析。收集适当的组分，浓缩蛋白质，用Tris缓冲盐水(TBS；50mM TrisClpH7.5,150mM NaCl)透析。亲和纯化β2GPI-依赖型抗磷脂抗体
为了分离β2GPI-依赖型抗磷脂抗体，将含心磷脂的多层脂质分散体(还包含胆固醇和联十六烷基磷酸酯)与β2GPI-依赖型抗磷脂血浆(或血清)一起保温。将血清离心沉淀这些脂质体。洗涤后，用2％的辛基葡糖苷去污剂裂解脂质体混合物，加入蛋白A琼脂糖柱中。进一步洗涤首先去除脂类、然后去除非IgG组分后，用弱酸将IgGβ2GPI依赖型抗磷脂抗体从蛋白A上洗脱下来，中和、交换缓冲液并用ACA ELISA检测。此方法产生了富集高达10000倍的aPL抗体，按与兔IgG抗人β2GPI抗血清进行的Western印迹所显示的，其中无任何污染的β2GPI。此方法的一个例子如下。从血清中纯化β2GPI依赖型抗磷脂抗体
从显示各种症状的不同年龄病人血清中纯化多个病人的抗体，这些症状包括：SLE、APS(包括APS的多种现象，包括静脉血栓形成、流产、血小板减少、CVA(脑血栓意外，即中风)、TIA(一过性缺血发作)和动脉栓塞。
将25mL圆底摇瓶(Kontes Scientific Co.,Vineland,N.J.)中1.2mL心磷脂(Sigma Chemical,St.Louis,MO,#C-1649)、0.464mL胆固醇(Sigma Diag.,St.Louis,MO,#965-25)、0.088mL的每mL氯仿5mg联十六烷基磷酸酯(Sigma Chemical,St.Louis,MO,D-263 1)的混合物在Rotavap(Buchi，瑞士)干燥约5分钟。去除溶剂后，加入2mL0.96％(wt./vol.)NaCl(J.T.Baker,Inc.,Phillipsburg,NJ)并于VortexGenie Mixer(Scientific Industries,Inc.,Bohemia,NY)中混合11分钟。将脂质体悬液在37℃温育1小时。同时，在Sorvall RT 6000离心机(Dupont Co.Wilmington,DE)中600xg、8℃离心6501血清10分钟。将4mL上清与已制备好的脂质体悬液一起放入25mL圆底摇瓶中，在轨道式摇床Tektator V(Scientific Products,McGraw Park,IL)中以中等速率4℃振荡温育混合物48小时，再37℃2小时。加入20mL冷TBS，将混合物转移至50mL的聚碳酸酯离心管中(Nalge Co.,Rochester,NY),在RC3离心机中用SS-34转头(Sorvall-Dupont,Wilmington,DE)4℃,27000xg离心15分钟。用25mL冷的0.96％NaCl在RC3离心机上洗沉淀3次。将沉淀溶解于1mL含2％(wt/vol)n-辛基-β-D-吡喃葡糖苷(Calbiochem,La Jolla,CA)的TBS中，加入0.6mL蛋白A/交联琼脂糖(Repligen Corporation,Cambridge,MA)柱中，此柱已事先用15倍床体积的1M乙酸洗涤，用15倍柱床体积的TBS平衡。用40倍床体积的2％辛基吡喃葡糖苷洗涤抗体-蛋白A/琼脂糖柱以去除脂类，继续用TBS洗涤直至洗脱液在280nm处的光密度接近基线。用1M乙酸洗脱结合的抗体。收集各为1mL的组分，每组分立即用0.34mL3MTris(Bio-Rad，电泳级的)中和，放置于冰浴中，在分光光度计(Hewlett-Packard,8452A Diode Array Spectrophotometer,PaloAlto,CA)中280nm处测定各组分的光密度。汇集含抗体的部分，在Centricon-30浓缩器(Amicon Division,W.R.Grace&Co.,Beverly,MA)中按制造商的说明书浓缩并用TBS洗4次。通过读取浓缩液试样在280nm处的光密度确定来自4mL血清6501的纯化抗体的终产量，其中1mg=1.34A280nm。所获的平均产量是4mL血清6501为750μg抗体。检测纯化抗体的ACA活性，并用Laemmli SDS-PAGE检查纯度。基于心磷脂的ELISA
用50μg/ml溶于乙醇的心磷脂溶液30μl包被微量滴定板(来自Dynex Technologies的Immulon 1#3350),4℃干燥过夜，用pH7.2的PBS洗3次，再用75μl 5％(w/v)的鱼明胶(Hipure LiquildGelatin,Norland Products Inc.695 Joyce Kilmer Ave.,NeW BrunswickN.J.,USA)室温封闭1小时。用PBS洗平板3次，加入50μl溶于5％鱼明胶的10μg/ml全长重组β2GPI,37℃温育1小时。用PBS洗平板3次，将50μl亲和纯化的β2GPI-依赖型抗磷脂抗体(所用的抗体浓度如表2所示)或兔抗-β2GPI加入各孔中，37℃温育1小时。用PBS洗平板3次，加入50μl适当稀释于5％鱼明胶的碱性磷酸酶偶联抗免疫球蛋白(抗-人IgG,γ链特异性，Zymed#62-8422)或抗兔IgG(Zymed#362-61220),37℃温育1小时。用PBS洗平板3次，加入50μl碱性磷酸酶显色底物(PPMP溶液；7.8g一磷酸酚肽加69.5g2-氨基-2-甲基-1-丙醇溶于100mL水的贮液，临用前以1∶26的比率用水稀释)，室温温育30分钟。在微量平板自动读取仪中测定平板在550nm的光密度(Bio-Teck lnstruments,model EL311)。竞争性抑制ELISA
用10μg/ml溶于pH9.5,0.1M碳酸氢盐的全长重组β2GPI 50μl包被微量滴定板(MaxiSorpTM,Nalge Nunc International,Denmark),4℃放置过夜，用pH7.2的0.15M PBS洗3次，用75μl2％的脱脂奶粉(Carnation,2％NFDM)室温封闭1小时。检测抑制剂稀释于2％NFDM中，各包被孔中加入25μl稀释液。用2％NFDM稀释亲和纯化的β2GPI依赖型抗磷脂抗体，在各孔中加入25μl恒定浓度的稀释液，包括无抑制剂的一组孔，用作阳性对照。混合孔内的溶液并于37℃温育平板1小时。用PBS洗平板3次，加入50μl适当稀释于2％NFDM中的与碱性磷酸酶偶联的抗-人IgG,γ链特异性(Zymed#62-8422),37℃温育1小时。用PBS洗平板3次，加入50μl碱性磷酸酶PPMP显色底物溶液，室温温育30分钟。在微量平板自动读取仪中测定平板在550nm的光密度(Bio-TeckInstruments,model EL311)。用获自无抑制剂各孔的平均OD550除抑制剂存在时获得的OD550，然后乘以100测得抑制百分率，(更具体地说，[无抑制剂的对照孔的平均A550-背景A550]-[抑制剂存在时的A550-背景A550]/[无抑制剂之对照孔的A550-背景A550]×100)。重组β2GPI和突变体的直接结合，用ELISA估计
用系列稀释于PBS中的多种重组β2GPI 50μl包被镍螯合物包被的微孔平板(NCP 010 00 Xenopore Corp.374 Midland Ave.SaddleBrook,NJ USA)，室温2小时。用PBS洗平板3次，以溶于PBS的1％明胶(Sigma#G-2500)75μl室温封闭1小时。用PBS洗平板3次，加入50μl亲和纯化的β2GPI-依赖型抗磷脂抗体(所用浓度为事先显示约为80％最大结合的浓度)或兔抗-β2GPI,37℃温育1小时。用PBS洗平板3次，加入50μl适当稀释于1％明胶中的碱性磷酸酶偶联抗免疫球蛋白(抗-人IgG,γ链特异，Zymed#62-8422)或抗兔IgG(Zymed#62-6122),37℃温育1小时。用PBS洗平板3次，加入50μl碱性磷酸酶PPMP显色底物溶液，室温温育30分钟。在微量平板自动读取仪中测定平板在550nm的光密度(Bio-Tecklnstruments,model EL311)。有关抑制作用的研究结果
用7-9种不同的重组β2GPI突变蛋白质测定13个不同病人的亲和纯化β2GPI-依赖型抗磷脂抗体制品之抗原特异性。以剂量依赖的形式检测各突变重组β2GPI蛋白抑制亲和纯化的β2GPI-依赖型抗磷脂抗体结合全长重组β2GPI的能力。典型实验的结果如图4所示。所有13个亲和纯化的β2GPI-依赖型抗磷脂抗体的检验结果总结于表2中。以下数值还在只有结构域1的重组蛋白质中观察到(1----；见表2的名称)：
Ab 6203,Max20,50％>10；Ab7008,Max40,50％>10；Ab650t,Max30,50％
>10；Ab6626,Max 50,50％>10；Ab6632,Max 70,50％3；Ab6644,Max45,
50％>10；Ab 7015,Max 30,50％>10；Ab 7101,Max 20,50％>10；Ab 6701,
Max80,50％4；Ab 6641,Max98,50％>10.
只有含结构域1的那些突变体抑制β2GPI-依赖型抗磷脂抗体与全长重组β2GPI的结合(图4)。这一点对于所有13个β2GPI-依赖型抗磷脂抗体制品均为正确的(表2)。所有含结构域1的重组突变β2GPI蛋白抑制大于90％，这一事实表明这些抗体的所有可检测抗-β2GPI活性是直接针对结构域1的。表2．用13种不同的β2GPI-依赖型抗磷脂抗体制品对9种重组β2GPI蛋白进行竞争抑制试验的数据总结。
Max=在检测浓度观察到的最大抑制作用。
50％=产生50％抑制作用时的浓度(μM)
   12345          1----           12---        123--        1234-       -2345        --345        ---45      ----5Ab#  Max  50％    Max     50％    Max    50％   Max    50％  Max   50％  Max  50％   Max   50％   Max   50％   Max   50％7104  90  0.8   90    0   0.8      90     1      98     1    90    0.7   10    >57    20    >50    5    >40     0    >476203  75  0.8   60  (20)  >10      20    >10     75     1    30    >8    10    >57    10    >50   10    >40     5    >477008  90  0.2   70  (40)  >10      40    >10     80    0.4   50    >8    20    >57    20    >50   20    >40     20   >476501  80  0.2   70  (30)  30 (>10) 30    >10     85    0.8   30    >8    20    >57    15    >50   15    >40     10   >476626  80  0.3   85  (50)   8 (>10) 50    >10     90    0.8   40    >8    18    >57    20    >50   15    >40     10   >476632  90  0.8   90  (70)   8  (3)  70     3      90    0.2   60    2     20    >57    20    >50   20    >40     10   >476644  90  0.2   90  (45)   8 (>10) 45    >10     90    0.7   50    8     10    >57    10    >50   10    >40     10   >477015  90  0.2   90  (30)   8 (>10) 30    >10     90    0.7   50    8     10    >57    10    >50   10    >40     10   >477101  80  0.8   70  (20)   8 (>10) 20    >10     70     3    20   >8      5    >57     5    >50    5    >40      5   >476652  95  0.8   ND        ND       ND     ND     95    0.3  100  0.5     40    >16    30    >15   20     >5     15   >476509  70  0.1   ND        ND       ND     ND     90    0.3   80    3     20    >16    20    >15   20     >5     10   >476701 100  0.1   ND  (80)  ND  (4)  ND     ND     95    0.3   30   >8     10    >16    20    >15   15     >5     10   >476641  96  0.1   ND  (98)  ND (>10) ND     ND     60     4    60    2     20    >16    10    >15   20     >5     10   >47在缺乏心磷脂的条件下用β2GPI-依赖型抗磷脂抗体检测重组突变β2GPI蛋白直接结合的结果
检查7-9个不同的重组β2GPI突变蛋白质以确定它们在缺乏阴离子磷脂时是否可支持亲和纯化的β2GPI-依赖型抗磷脂抗体制品的直接结合。用来自11个不同病人的亲和纯化β2GPI-依赖型抗磷脂抗体制品检验所有的重组突变β2GPI。以剂量依赖方式检查各突变重组β2GPI蛋白质，GST-6his用作阴性对照。重组突变β2GPI蛋白通过其6-组氨酸尾与镍包被的微量滴定板结合。检测的所有重组突变β2GPI蛋白质与兔抗β2GPI结合，显示它们可用抗体评估(图5)。典型结合实验的结果显示，只有那些含结构域1的蛋白质结合亲和纯化β2GPI-依赖型抗磷脂抗体(图6)。所有11个亲和纯化β2GPI依赖型抗磷脂抗体的检验结果总结于表3中。结果显示，所有病人的抗体显著结合含结构域1的β2GPI重组蛋白质，而对于缺结构域1的重组蛋白质则几乎无特异结合。
表3．用装有所示重组缺失突变β2GPI蛋白质的镍螯合孔对8种不同β2GPI-依赖型抗磷脂抗体制品的直接结合试验
各缺失突变体：抗体组合的最大O.D.
         12345    1----   12---     123--     1234-     -2345     --345     ---45     ----5
Ab#
6501     1.772    0.911   0.028     0.909     0.628     0.018     0.030     0.086     0.004
6626     1.527    0.560   0.073     1.250     0.563     0.008     0.022     0.086     0.028
6652     0.640    0.262    ND       0.320     0.135     0.008     0.016     0.013     0.012
6632     1.419    0.351   0.016     0.121     0.003     0.031     0.004     0.000     0.013
7008     1.380    0.195   0.008     0.360     0.149     0.019     0.018     0.030     0.007
6701     0.948    0.388    ND       0.841     0.715     0.002     0.002     0.000     0.000
6203     1.270    1.029   0.119     0.938     0.668     0.074     0.072     0.142     0.044
7015     1.864    1.102   0.063     1.160     0.454     0.114     0.042     0.167     0.078
6641     2.555    0.252   --        0.530     0.145     0.045     0.019     0.112     0.018
6644     1.848    0.493   --        1.020     0.768     0.041     0.048     0.151     0.017
7101     1.257    0.804   --        0.951     0.843     0.056     0.042     0.167     0.078
兔       2.065    1.9737  --        1.971     1.708     1.873     1.993     1.941     1.663在存在心磷脂时重组突变β2GPI蛋白质与β2GPI-依赖型抗磷脂抗体的直接结合
检查7种不同的重组β2GPI突变蛋白质以确定存在阴离子磷脂时它们是否可支持亲和纯化β2GPI-依赖型抗磷脂抗体制品的直接结合。用兔抗β2GPI和亲和纯化β2GPI-依赖型抗磷脂抗体制品检验所有的7种重组突变β2GPI。以剂量依赖方式检查各突变重组β2GPI蛋白质，GST-6his用作阴性对照。重组突变β2GPI与事先用心磷脂包被的微量滴定板结合。所有7种重组突变β2GPI蛋白质与兔抗β2GPI结合，显示它们可结合心磷脂并可用抗体评估(图7)。用病人抗体进行典型实验的结果显示，只有那些含结构域1和结构域5二者的蛋白质结合亲和纯化的β2GPI-依赖型抗磷脂抗体(图8)。
基于此实施例中的上述数据，我们认为在一定条件下，β2GPI与固相支持物的结合方式(如照射平板、心磷脂包被平板、Nunc品牌微量滴定板和就含6-his尾的重组β2GPI蛋白质来说可用镍螯合平板)能使得结构域1的抗原表位可自由靠近β2GPI-依赖型抗磷脂抗体，但当此抗体与其他表面，如非照射平板、许多其他品牌微量滴定板之类的表面结合时并不能如此。这些抑制作用的研究证实了其他人关于在缺乏磷脂时β2GPI-依赖型抗磷脂可结合β2GPI的报道。GalIi等(1990)Lancet335:1544；Rouby等(1995)；Arvieux等(1991)免疫学方法143:223。在竞争性抑制试验中有抑制作用的相同5种重组突变β2GPI-含结构域1的那些多肽-与在镍螯合平板上结合β2GPI-依赖型抗磷脂抗体的那些多肽相同。由兔抗β2GPI与所有9种重组蛋白质结合的能力证实与镍螯合平板结合的重组β2GPI突变蛋白质。相反，只有全长重组β2GPI(即，含结构域1和结构域5二者的唯一被检测重组蛋白质)可在心磷脂包被平板上方便地检测到。通过兔抗β2GPI结合所有9种重组蛋白质的能力确认与心磷脂包被平板结合的重组β2GPI突变蛋白质。
抑制作用数据(图4)和通过镍包被平板直接结合的数据(图6)均清楚地显示了所研究的13种β2GPI-依赖型抗磷脂抗体制品的抗原特异性针对的是β2GPI结构域1的表位。实施例2:APS病人的抗体特异性
前一实施例所述研究中表位结合区域的定位依赖于对来自高滴度APS病人的亲和纯化抗体的使用。APS抗体的亲和纯化要求高滴度病人，不容易用它去研究较低滴度的病人或大群病人。因此，我们创建了新的方法去评估APS病人样品中的抗体结合结构域，该方法以血清为基础，且可用于评估较大量的病人。
表面等离子体振子共振(surface plasmon resonance,SPR)提供了对于固定蛋白质和可溶分析物之间相互作用的定量检测方法。目前的研究应用SPR测定正常人组和APS病人组血浆中固定化β2GPI和β2GPI结构域缺失突变体之间的相互作用。设计各研究方法以确定β2GPI结构域1的免疫优势是否可推广至较多数APS病人。材料和方法
试剂。CM5芯片、NHS和EDC及HBS-EP缓冲液来自BIAcore。人亲血球蛋白(表型1-1)是含β2GPI中的共有重复短基元的蛋白质，将其固定于芯片上的隔离流动室中并用作阴性对照。用杆状病毒蛋白质表达系统在Tn5细胞中表达重组β2GPI和β2GPI的结构域缺失突变体，并用镍螯合柱自上清纯化。Iverson等(1998)美国国家科学院院报95:15542-15546。正常人血浆样品可购买到(George KingBiomedical)或自提。来自诊断有原发或继发性(对于狼疮来说)抗磷脂抗体综合症的个体的病人血浆样品获自许多临床来源。
研究中所用的55个对照来自异源样品。分析中包括购自GeorgeKing Bio-Medical(Overland Park,KS)的30个对照样品(15个男性；15个女性；平均年龄34岁，范围19-45岁)、5个当地志愿者(3个男性，2个女性)、2个商业来源的汇集样品和18个未知来源的血库捐献者。从数个来源收集病人样品，包括具有静脉血栓形成、动脉阻塞、脑血栓、多次流产和血小板减少病史的病人。通过内部试验测定，研究牵涉的所有病人具有IgG抗磷脂抗体水平(GPL)水平≥20。
用Immunopure Plus蛋白质G琼脂糖珠和Immunopure IgG结合和洗脱缓冲液按制造商推荐的方法(Pierce)从血浆中分离全部IgG级分。
表面等离子体振子共振.所有实验均用BIAcoreTM2000装置在25℃以流速10μL/分钟进行。用脱气HBS-EP缓冲液进行芯片的平衡和结合研究，该缓冲液组成为：0.01M HEPES pH7.4,0.15M NaCl,3mMEDTA和0.005％(v/v)表面活性剂P20。通过使40μL 0.05M NHS/0.2MEDC流过芯片将芯片激活，然后暴露于合适的蛋白质配基中，完成蛋白质配基通过其自由氨基基团与CM5芯片的共价偶联。通过使其溶于10mM乙酸(pH4.8)的25μg/mL溶液50μL流过NHS活化的CM5芯片固定重组β2GPI(His)6、β2GPI的结构域缺失突变体和亲血球蛋白。然后用1M乙醇胺(pH8.5)40μL淬灭芯片表面的过量反应基团。用HBS-EP以1∶1的比率稀释人血浆样品(130μL)，流过β2GPI芯片，收集780秒的应答值。在各样品接触之间用80μL 0.1M甘氨酸-HCl(pH2.1),0.1MNaCl再生芯片。因为在检测期间未达到结合平衡，用制造商的软件(BiaEvaluation version2.2,Uppsala,瑞典)使结合曲线拟合以下方程式，确定平衡结合值(Req)
Rt=Req(1-e-ks(t-t0))+R0
其中Rt是在时间t时的检测的BIAcore应答，Req是平衡平台应答，t是时间，t0是起始时间，ks是表观结合常数(ks=kaC+kdis，其中ka是结合常数，C是分析浓度，而kdis是解离常数)，而R0是应答补偿。在一些实验中，通过与蛋白G结合然后从其上酸洗脱获得来自人血浆样品的总IgG组分。将与蛋白G结合后剩下的血浆与新鲜蛋白G珠再混合，并作为无IgG血浆分离。将用缓冲液以1∶1比率稀释的中和IgG制品和无IgG血浆如上所述流经β2GPI芯片。结果和讨论
将含结构域1-5、2-5和只含结构域1的重组人β2GPI克隆入杆状病毒表达载体并表达于TN5细胞中。分析纯化蛋白质的等份试样，用氨基酸分析定量。各蛋白质包含单个的氨基末端，内部标准便于以氨基酸分析为基础进行精确的定量。
APS病人组来自多个中心，由已诊断具有抗磷脂抗体综合症(APS)症状且GPL≥20的106个病人组成。病史不完全，但可获的病史包括静脉血栓形成、动脉血栓形成、脑血栓、多次流产、早产和血小板减少。GPL值从20-807(413±161，平均±SD)，中间值是77。正常对照人群由55个样品组成，获自内部捐献者、商业来源和圣地哥血库。
用缓冲液以1∶1的比率稀释来自APS病人和对照的血清，评估其与固定化β2GPI(D1-5)的结合。与β2GPI(D1-5)的相互作用大小显示于表4中。对于106个APS病人和55个对照病人来说，β2GPI(D1-5)的平均Req分别是730和328，中间值是635和201。从统计学上说，病人和对照组之间的差别是显著的(p＜0.01,Student’s t-检验)。APS和对照血清与β2GPI(D2-5)相互作用的大小在这些组中是不同的(表4)。
表4．病人血清的结合
    病人(GPL≥20)     对照
受试者数目ReqD1-5(平均±sem)ReqD2-5(平均±sem)中间ReqD1-5中间ReqD2-5％D1选择性     106730±42158±366352488％     55328±2160±620110312％
计算选择性比率，以描述血清样品与区别仅在于结构域1出现与否的β2GPI结构域缺失突变体之间的相对结合。通过用β2GPI(D2-5)的结合除与β2GPI(D1-5)的结合(Req)计算此选择性比率。任意选择3或更大的系数来限定呈现优先与含结构域1之天然蛋白质相互作用的病人。在对照组中与β2GPI(D1-5)和β2GPI(D2-5)的相互作用较小，大部分对照病人显示对任一种固定蛋白均无选择性(表4)。相反，88％的APS病人呈现对含结构域1之β2GPI的选择性≥3倍。41％(43/106)的APS病人具有可忽略的与β2GPI(D2-5)的相互作用(Req＜9)，选择性比率极高。
将具选择性比率为3的10个病人的血清进一步鉴定，以确定血清中观察到的相互作用是否可归于IgG级分。总血浆、无IgG血浆和具β2GPI(D1-5)的总IgG的结合相互作用显示于图5中。用蛋白G从血清中去除IgG，将基本上去除所有与固定化蛋白质的特异结合相互作用。用酸从蛋白G级分洗脱IgG级分，并检验它与蛋白质的相互作用(在表5中指示为“总IgG”，随后的中和作用以相对于总血浆和无IgG血浆为50％的比率稀释了IgG级分)。IgG级分只显示与β2GPI(D1-5)相互作用，产生的应答大小与原始血清和β2GPI(D1-5)相互作用的大小相似(注意稀释度不同)。因此，此检验系统中结构域1选择性病人血清与β2GPI的结合可归于IgG级分。
表5．“D1-选择性”APS病人血浆样品的BIAcore Req值
病人    总血浆(1∶2)       无IgG浆(1∶2)   总IgG(1∶4)
        (d2-5)  (d1-5)  (d2-5)(d1-5)        (d2-5)  (d1-5)
6501     333     1526     0     0             0      732
6701     199     952      0     0             0      460
6626      37     1622     0    49             0     1132
6515     259     1024     0     0             0      440
6207      19     1450     0     0             0      480
6642       8      811     0    48             0      480
7015     158     2092     0     0             0      864
6703      65     1001     0     0             0      556
6601      84      792     0     0             0      266
7201       0      603     0     0             0      292
进一步评估非选择性APS病人亚组(选择性比率＜3)，以确定它们的结合是否可归于IgG级分。结果如表6所示。就结构域1选择性病人来说，通过用蛋白G处理血清耗尽IgG级分，可去除所有与任一种固定化蛋白质的相互作用。看起来病人的IgG级分反映了在原始血清样品中观察到的结合(表6)。
表6．“无选择性”的APS病人血浆样品的BIAcore Req值
病人   总血浆(1∶2)      无 IgG 血浆    总IgG(1∶4)
                               (1∶2)
        (d2-5)  (d1-5)  (d2-5)  (d1-5)   (d2-5)   (d1-5)
6117      386     324     0       0        79      120
6194     3197    2046     0       0       688      470
6649      553     758     0       0       127      253
6627      549     324     0       0       182      132
7013      167     241     0       0        75      115
6611     1002     892     0       0       177      251
本研究应用了表面等离子体振子共振技术定位大的、交叉类群APS病人中的抗体结合结构域(n=106；GPL≥20)。与非APS对照相比，APS病人血清显示与β2GPI的结合明显更大。此外，与含除结构域1之外所有结构域的β2GPI结构域缺失突变体相比，大部分病人血清结合天然β2GPI(D1-5)的程度要大得多。相对于缺少结构域1的结构域缺失突变体来说，88％的病人显示对含结构域1之β2GPI3倍或更多倍的特异性。通过耗尽IgG组分可完全去除APS病人血清中的结构域1结合活性，在IgG级分中可完全重建结合活性。这些结果表明，在多数APS病人中免疫显性结合表位位于β2GPI的氨基末端结构域。实施例3：检验结构域1片段对β2GPI-依赖型抗磷脂抗体的免疫反应性六肽合成
将附着至Wang树脂的N-α-Fmoc保护氨基酸在溶于二甲基甲酰胺(DMF)的20％哌啶中悬浮两次，总反应时间30分钟，以将胺去保护。制备具C-末端脯氨酸的六肽，使未保护的脯氨酸附着于氯三苯甲基树脂而非Wang树脂，以防止哌嗪二酮的形成。
分别用DMF和甲醇漂洗树脂一次。将N-羟基苯并三唑(6 equiv)、1,3-二异丙基碳二亚胺(6 equiv)和第二个氨基酸(6 equiv)和指示剂在DMF中的溶液加入树脂中。室温搅拌反应混合物最少1.5小时。然后分别用DMF和甲醇漂洗树脂一次。在一小部分被漂洗过的树脂上进行Kaiser检验(在甲醇中的5％茚三酮两滴+1滴吡啶+1滴乙醇中的80％酚)以证实缺乏游离胺。
反复进行去保护和氨基酸添加步骤来完成序列合成。如上所述将最后一个氨基酸去保护以产生游离胺。
用在三氟乙酸(TFA)中含7.5％(重量)苯酚、2.5％(体积)乙二硫醇、5.0％(体积)水和5.0％(体积)茴香硫醚的溶液将肽从树脂上切下。搅拌混合物至少3小时。真空抽气去TFA，沉淀肽并用醚洗两次。将固体溶于1∶1的乙腈/水以用于分析。通过LCMS在1.0×150mm的C18(5μ,150)柱上鉴定此肽(A:0.1％TFA,2％乙腈的水溶液；B:0.08％TFA,2％水的乙腈溶液)。
真空或冻干去乙腈和水，将肽储存于0℃。
再次大规模制备有活性的肽，并用C18柱纯化(A:0.1％TFA水溶液；B:0.08％TFA的乙腈溶液)。竞争性抑制ELISA
用50μL溶于0.1M碳酸氢盐，pH9.5的10μg/ml全长重组β2GPI包被微量滴定板(MaxiSorpTM,Nalge Nunc International,丹麦)，4℃保存过夜，用0.15M PBS,pH7.2洗三次，用2％的脱脂奶粉(Carnation,2％NFDM)75μL室温封闭1小时。检验抑制剂稀释于2％NFDM中，将25μL各稀释液加入包被孔中。亲和纯化的β2GPI依赖型抗磷脂抗体稀释于2％NFDM中，将25μL恒定浓度的稀释液加入孔中，包括一组无抑制剂的11个孔，用作阳性对照。将孔中溶液混匀，37℃温育平板1小时。用PBS洗平板三次，加入适当稀释于2％NFDM中的50μL碱性磷酸酶偶联的抗人IgG,γ链特异，(Zymed#62-8422),37℃温育1小时。用PBS洗平板三次，加入50μL碱性磷酸酶PPMP显色底物溶液，室温温育30分钟。在微量平板自动读取仪(Bio-TeckInstruments,model EL311)中测定平板在550nm的光密度。通过用获自无抑制剂的11孔的平均OD550除抑制剂存在时获得的OD550，然后乘以100测定抑制百分率。抑制作用研究
合成74种肽并在竞争性抑制ELISA中进行筛选。简短地说，将未纯化的“粗制”肽以1∶2比率稀释后用三种不同的亲和纯化的抗心磷脂抗体筛选。然后在加倍稀释度以1∶2的稀释比率再筛选阳性肽。再合成和纯化在高稀释度时能抑制的28种肽。然后在竞争性试验中检验这些纯化的肽。重组β2GPI也作为阳性对照一起检测。
图9所示的结果表明，一些肽可抑制抗心磷脂抗体与β2GPI的结合。因为大部分被检验肽不抑制，说明一定程度的特异性是由具抑制作用的肽引起的。除两种阳性肽外，其他所有的肽均通过结构域1中出现的两套二硫键连接的半胱氨酸集中在一起。这两种未被如此集中的两种肽抑制也最差。这些二硫键连接的半胱氨酸可能产生了能被β2GPI依赖型抗磷脂抗体所识别的结构。实施例4：用诱变和微量淘选数据确定结构域1中对结合β2GPI依赖型抗磷脂抗体起关键作用的氨基酸残基易错PCR
易错PCR进行如下。在增加Taq聚合酶错误率的条件下PCR扩增人β2GPI的结构域1.引物是使第1-64位氨基酸扩增的引物。掺入一Sfc1限制性位点作为氨基酸1的一部分。在3’端氨基酸64之后掺入Sal1限制位点。用0.25mM MnCl2如Leung等(1989)技术1：11中所述进行PCR反应。用Sfc1和Sal1消化PCR产物并克隆入已用Apal1和Sal1消化的fd-tet-DOG2。这将结构域1置于pⅢ N-末端紧接pⅢ信号序列之后。连接反应液电穿孔大肠杆菌K91。收获噬茵体并用标准方法测效价。用微量淘选技术检验产生的噬茵体克隆。微量淘选
用蛋白G包被2类Immulon平板。蛋白G溶于0.1M NaHCO3,浓度为5μg/mL，在微量滴定板上每孔加100μL,4℃保存过夜。从平板上弃过量的蛋白G溶液，用200μL 2YT在振荡平台室温振荡1小时封闭各孔。用200μL Tris缓冲盐水，pH7.4/0.5％Tween20(TBS/Tween)在自动平板清洗仪上洗孔4次。将用2YT稀释成2.5μg/mL的人β2GPI依赖型抗磷脂6626、6501、6701、兔β2GPI依赖型抗磷脂或对照的正常IgG 100μl加入洗过的孔中。将平板在摇床上室温温育1小时。
从生物淘选产生的琼脂平板上收获待微量淘选检验的噬茵体。用无菌牙签将待检验的各克隆转移至园底96孔微量滴定板(Corning,Corning,NY)各隔离的孔中，每孔含200μL2YT/Tet,30℃温育过夜。温育过夜后，用微量滴定板固定器1300xg室温离心噬茵体培养物10分钟。上清液是“纯”噬茵体的来源。1∶100-1∶1000稀释纯噬菌体，向平板中加入100μL，平板中含如上所述制备的蛋白G结合的β2GPI依赖型抗磷脂抗体6501和正常IgG。将稀释噬茵体和aPL抗体或对照IgG在平面旋转仪上室温温育2小时。在自动平板清洗仪上用TBS/Tween洗9次后，用20μL 0.2N HCl-甘氨酸/0.1％BSA,pH2.2洗脱IgG结合的噬茵体。洗脱液持续室温温育10分钟，其间制备每孔中含20μL新鲜饥饿大肠杆菌的新Corning微量滴定板并保持冰冷。将140μL 29mMTris加入含噬茵体洗脱液的平板中以中和pH，然后将20μL噬茵体悬浮液从各孔中转移入含饥饿大肠杆菌的平板各孔中。37℃温育10分钟后，加入200μL 2YT，在37℃再次温育30分钟。用多通道加样器将各孔的8μL溶液点到2YT/Tet大琼脂平板上，保持来自最后一块微量滴定板的原8×12孔模式和方向。使斑点干燥30分钟后，平板在30℃温育过夜。第二天，茵落半定量评分为0-4+，用0象征＜10个菌落；1+=10-30；2+=30个茵落至70％铺满；3+=70-90％铺满；4+=铺满。
结果显示于表7A和7B中。对于表7A而言，在两个不同的时间进行兔抗人β2GPI试验。突变列举为原氨基酸、突变位置和突变位置的氨基酸。例如，S31F表明第31位的丝氨酸突变成了苯丙氨酸。未突变结构域1具有数值为3+，而结构域5噬茵体数值为-。沉默突变未显示。克隆开始于N末端并向C末端延伸。
表7B表示突变分析的扩充，显示了针对附加抗体检验附加突变体。最后的4个噬菌体克隆具有用星号指示的突变，表明噬茵体具有多个突变(3A4:D8A,S13T；3F123:L10I,P17Q,Y22C；3G1:R2W,S38T；4D1:N56T,R63G)。
结果表明(见下文)，(a)试验是一致的；(b)不是所有的抗体反应相同；(c)同一位置的不同突变可具有非常不同的作用(例如，参见Met42)。
总结果以图3所示的结构域1三级结构模型描述。它显示氨基酸55-58(异亮氨酸、天冬酰胺、亮氨酸)、氨基酸40-45(包括氨基酸43-45，即精氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸)和氨基酸19(赖氨酸)对于与aCL抗体的结合是重要的。表7A．突变结构域1噬茵体的微量淘选
克隆 突变 6626     微量淘选值     兔
  6501   6701
    2D9A4A10H9D1B6C4E32AlH12B2B112D4A6C1A12D12C3A72C3D11B1B2  T3PD8AD8GF12LT14AK19EK19LT20LT20SK33EV37EM42KM42TM42VR43GR43TF45LF45SL52QP54SN56DN56TL58N   22222ND-233331ND132-31-41     332221NDND3ND3322ND23ND31ND3ND     322231NDND3ND3332ND-2ND31--ND       23,32,233,32,3143433,433,332,3343,332,32,33
表7突变结构域1噬茵体的微量淘选
克隆 突变 兔 兔 兔 兔 兔 6226  6501  6701  6644  7008  6632  6515  6203  710
2D9 T3P     4     4     4     4     4     4     4     4     4     3     4     4     4
4A6 D8G     4     2     2     2     3     2     2     3     3     2
A4 D8A     4     4     4     4     4     4     4     4     4     4     4     4     4
4G8 P11L     4     2     2     2     3     3     2     3     3     3
H9 F12L     4     3     4     4     3     4     3     3     4     3     3     4     3
D1 T14A     3     4     4     4     3     4     4     3     4     3     4     4     3
B6 K19E     3     3     4     4     1     1     1     2     0     0     2     1     1
C4 K19I     3     3     3     3     1     1     0     1     1     1     1     1     1
SE3 T20I     4     4     4     4     3     3     3     3     4     3     4     3     3
2A1 T20S     4     4     4     4     4     4     4     4     4     4     4     4     4
4G1 S31P     4     2     2     2     2     2     2     3     3     2
SH1 K33E     4     4     4     4     4     4     4     4     4     4     4     4     4
2B2 V37E     4     4     4     4     4     4     4     4     4     4     4     4     4
3B4 S38T     4     2     3     2     3     2     2     3     4     2
3E11 G40E     4     2     1     2     3     3     2     4     2     3
B11 M42K     4     4     4     4     4     4     4     4     4     4     4     4     4
2D4 M42T     4     4     4     4     3     4     4     4     4     4     4     4     4
A6 M42V     2     2     3     3     1     2     2     2     3     2     3     2     2
C1 R43G     4     4     4     4     3     1     0     4     4     2     3     4     1
A1 R43T     4     4     4     4     4     4     0     4     3     3     4     4     2
3F6 K44E     4     0     0     0     1     2     0     2     0     0
2D12 F45L     4     4     4     4     4     4     2     4     4     4     4     4     4
SC3 F45S     4     4     4     4     3     1     0     4     4     4     4     4     4
3F8 T50A     4     2     2     2     3     3     2     3     3     2
4812 T50P     4     1     1     1     1     1     1     2     1     1
A7 L52Q     4     4     4     4     4     4     4     4     4     4     4     4     4
3C3 L52P     4     1     1     1     1     1     0     2     1     1
2C3 P54S     2     4     4     4     2     2     2     3     3     3     4     3     3
SC10 N56D     4     4     4     4     3     3     3     3     4     3     3     3     3
B1 N56T     4     4     4     4     4     4     0     4     4     4     4     4     4
3C4 N56     4     1     2     1     2     2     2     1     2     2
B2 L58N     4     4     4     4     2     2     3     4     3     3     4     4     3
3A4 *     4     3     3     3     4     3     3     4     4     3
3F12 *     4     1     1     1     1     1     1     2     1     1
3G1 *     4     1     1     1     1     1     1     1     2     2
4D1 *     4     4     2     4     4     2     3     3     0     4
Dom1 WT     4     4     4     4     4     4     4     4     4     4     4     4     4     4
Dom5 WT     4     4     4     4     0     0     0     0     0     0     0     0     0     0
实施例5：与平台偶联的结构域1β2GPI多肽
四价平台BA/PIZ/IDA/TEG(BA/PITG)的合成
化合物1：向冷却至0℃的1.02g(4.37mmol)N-(叔丁氧羰基)-亚氨二乙酸(US 5,552,39l中的化合物量，化学确定的非聚合物价键平台分子及其偶联物)和1.01g(8.75mmol)N-羟基琥珀酰亚胺的50mL无水THF溶液中加入2.26g(10.94mmol)二环己基碳二亚胺。将混合物搅拌16小时并缓慢升温至室温，然后向混合物中依次加入2.22g(10.1mmol)单-CBZ-哌嗪的25mL THF溶液和1.22mL(887mg,8.75mmol)三乙胺。将混合物室温搅拌7小时然后过滤。将滤液浓缩并将残余物溶于125mL乙酸乙酯，然后与2×125mL 1N盐酸、125mL饱和碳酸氢钠溶液一起振摇，干燥(硫酸镁)、过滤然后浓缩得到2.39g粘稠状固体。通过硅胶色谱纯化(95/5二氯甲烷/甲醇)得到1.85g(66％)1。
化合物2：向1.74g(2.74mmol)化合物1的10mL二氯甲烷溶液中加入10mL三氟乙酸，然后将混合物室温搅拌3小时。将混合物浓缩，将残余物溶于5mL二氯甲烷。将混合物冷却至0℃并加入100mL饱和碳酸氢钠。然后将混合物用4×100mL二氯甲烷萃取。合并二氯甲烷层，干燥(硫酸镁)，过滤然后浓缩得到1.46g(99％)粘稠的吸湿性固体状化合物2，该化合物直接用于下一步骤。
化合物3：于0℃下，向0.7g(1.3mmol)化合物2和226μL(168mg,1.30mmol)二异丙基乙基胺的溶液中加入127μL三甘醇双氯甲酸酯的4mL二氯甲烷溶液，然后将混合物室温搅拌3小时。将混合物在80mL二氯甲烷和80mL 1N盐酸之间进行分配。将二氯甲烷层用2×80mL水洗涤，干燥(硫酸镁)，过滤然后浓缩得到736mg(93％)结晶固体状的化合物3。
化合物5：将化合物3(61mg,0.48mmol)溶于3mL 30％HBr/HOAc并将得到的混合物室温搅拌1小时，然后加入5mL乙醚。将混合物置于冰箱内1小时然后离心。将得到的沉积物用乙醚洗涤然后干燥得到四氢溴酸盐4并将其溶于1mL水中。向混合物中加入49mg(0.58mmol)碳酸氢钠和3mL二噁烷。如需要，可补加碳酸氢钠以使混合物呈碱性。将混合物冷却至0℃，加入748mg(2.89mmol)溴乙酸酐。将混合物搅拌2小时，然后在20mL 1N硫酸和20mL 80/20二氯甲烷/甲醇之间进行分配。将有机层干燥(硫酸钠)，过滤然后浓缩得到粗品量，将其通过硅胶色谱纯化(二氯甲烷/甲醇)得到5。
AOA/PITG四聚体平台和β2GPI结构域1多肽偶联物化合物44的合成
转氨基的结构域1(TA/D1)：在使用前，向水和乙酸钠缓冲液中通入氦气。将结构域1(10.55mg,1.49μmol)在聚丙烯试管中溶于0.5mL水中，然后加入4.0mL 2M pH5.5的乙酸钠缓冲液。向混合物中加入3.73mg(14.9μmol)CuSO4的0.5mL水溶液，然后加入2.75mg(29.9μmol)水合乙醛酸在0.5mL 2M pH5.5的乙酸钠缓冲液中的溶液。将混合物置于氮气氛下并温和地搅拌18小时，此时，分析HPLC表明反应已经结束，所述分析HPLC采用4.6mm×250mm,300埃，5μm，联苯基柱(Vydac)并于280nm下检测(1mL/分钟，梯度25％-45％B,0-20分钟，A=0.1％TFA/H2O,B=0.1％TFA/CH3CN)。近似的保留时间如下：D,13.2分钟；TA/D1,13.7分钟；氧化的TA/D1,13.4分钟。将混合物用水稀释至体积为20mL，过滤，通过HPLC纯化(22.4mm×250mm,300埃，10μm，联苯基柱(Vydac,Hesperia,CA)(12mL/分钟；梯度25％-40％B,0-40分钟，A=0.1％TFA/H2O,B=0.1％TFA/CH3CN)。收集经分析HPLC证实含有纯净TA/D1的馏份并冷冻干燥得到5.0mg(48％)TA/D1。
Figure A9980841500721
氨基氧乙酰基(AOA)/PITG平台的合成
4-硝基苯基-N-(叔丁氧羰基)氨基氧乙酸酯，2’:0℃下，向搅拌中的1.5g(7.85mmol)N-(叔丁氧羰基)氨基氧乙酸(Aldrich Chemical Co.,St.Louis,MO)(化合物1’)的35mL无水THF溶液中依次加入1.09g(7.85mmol)4-硝基苯酚和1.62g(7.85mmol)DCC。将混合物在氮气氛下于0℃搅拌0.5小时，然后室温搅拌18小时。将混合物过滤除去二环己基脲，然后将滤液浓缩并通过硅胶色谱纯化(95/5氯仿/异丙醇)得到2.30g(94％)白色固体状化合物2’:1H NMR(CDCl3)δ1.51(s,9H),4.73(s,2H),7.36(d,2H),7.73(s,1H),8.32(d,2H)。
BOC保护的AOA/PITG平台，4’的合成：将化合物3(300mg,0.235mmol)用1.5mL 30％溴化氢的乙酸溶液处理30分钟。通过加入乙醚使形成的四胺的氢溴酸盐析出沉淀。将混合物离心，弃除上清液。将残余的固体用醚洗涤，真空干燥，溶于9mL DMF。向形成的混合物中加入294μL(1.69mmol)二异丙基乙基胺，然后加入410mg(1.31mmol)化合物2的3mLDMF溶液。将混合物在氮气氛下搅拌4小时，然后在15/1氯仿/甲醇和盐水之间进行分配。将水层用15/1氯仿/甲醇洗涤两次，将合并的有机层干燥(硫酸钠)然后浓缩得到680mg油。通过硅胶色谱纯化(95/5至75/25氯仿/甲醇的梯度)得到215mg(65％)白色固体状化合物4’:1H NMR(CDCl3)δ1.49(s,36H),3.40-3.73(m,40H),4.24(m,12H),4.59(重叠的单峰，8H),8.21(s,2H),8.32(s,2H)。
AOA/PITG平台，化合物5’：向搅拌中的67mg(0.047mmol)化合物4’的10/1/1乙酸乙酯/氯仿/甲醇溶液中通入氯化氢气体15分钟，然后将混合物继续搅拌15分钟。将混合物真空浓缩并在真空下放置16小时得到43mg(78％)白色固体状的化合物5’:1H NMR(DMSO)δ3.33-3.67(m,40H),4.08(m,4H),4.18(s,8H),4.90(s,8H)；质谱(ES)m/z计算值C40H69N14O18:1033，实测值1033。
Figure A9980841500741
四价D1偶联物化合物44的合成：将TA/D1(0.90mg,1.28×10-7mol)在聚丙烯试管中溶于250μL 0.1M乙酸钠(pH4.60)缓冲液。向混合物中加入16.6μL(18.9μg,1.60×10-8mol)0.97μmol/mL的AOA/PITG平台(化合物5’)在0.1M乙酸钠(pH 4.60)缓冲液中的溶液。将混合物在氮气氛下温和地搅拌6天，此时，分析HPLC表明反应已经结束，所述分析HPLC采用4.6mm×250mm,300埃，5μm，联苯基柱(Vydac)并于280nm下检测(1mL/分钟，梯度25％-45％B,0-20分钟，A=0.1％TFA/H2O,B=0.1％TFA/CH3CN)。近似的保留时间如下：TA/D1,13.7分钟；化合物44,17.2分钟。将混合物用95/5水/乙腈稀释至体积为1mL并通过HPLC纯化(10mm×250mm,300埃，5μm，联苯基柱(Vydac)(3mL/分钟；梯度25％-45％B,0-40分钟，A=0.1％TFA/H2O,B=0.1％FA/CH3CN)。收集经分析HPLC证实含有纯净的偶联物化合物44的馏份并冷冻干燥得到0.4mg(25％)化合物44：质谱(ES，平均m/z),C1320H2032N338O370S20的计算值：29,198。实测值：29,218。四聚体AOTEG/DEA/DEG平台和β2GPI结构域1多肽偶联物的合成
2-[2-(2-碘乙氧基)乙氧基]乙醇，7：将2-[2-(2-氯乙氧基)乙氧基]乙醇(12.66g,75.1mmol)和碘化钠(33.77g,225.3mmol)溶于250mL丙酮。在烧瓶上连接回流冷凝器，然后将混合物加热回流18小时。冷却时，将混合物浓缩，将残余物与400mL二氯甲烷以及300mL水和100mL饱和亚硫酸氢钠水溶液的混合物一起振摇。将水层用2×400mL二氯甲烷洗涤并将合并的二氯甲烷层干燥(硫酸镁)，过滤然后浓缩得到18.3g(94％)浅黄色油状的7，该化合物不经纯化直接用于下一步反应：1H NMR(CDCl3)δ2.43(brds,1H),3.28(t,2H),3.61(m,2H),3,68(s,4H),3.78(m,4H)；质谱(ES)m/z:C6H13O3INa(M+Na)+的计算值：283.0。实测值283.0。
2-[2-(2-N-(叔丁氧羰基)氨基氧乙氧基)乙氧基]乙醇，8：向5.85g(1.50mmol)2-[2-(2-碘乙氧基)乙氧基]乙醇，化合物7中加入2.00g(1.00mol)N-(叔丁氧羰基)羟基胺(Aldrich Chemical Co.)和3.36mL(3.42g,1.50mmol)DBU。将混合物搅拌得到温度升高的粘稠液体，将其置于55℃的油浴中18小时形成白色沉淀，该沉淀使混合物固化。将混合物溶于20mL二氯甲烷然后加入500mL搅拌的乙酸乙酯中形成沉淀，滤出沉淀，将滤液浓缩得到棕黄色的油。通过快速色谱纯化(50％丙酮/己烷)得到2.61g(67％)油状的8。1HNMR(CDCl3)δ1.50(s,9H),3.65(t,2H),3.70(brds,4H),3.76(m,4H),4.06(t,2H),7.83(brds,1H)；13C NMR(CDCl3)δ28.0,61.3,68.9,70.1,70.3,72.5,72.6,75.1,81.2,157.1.
2-[2-(2-N-(叔丁氢羰基)氨基氧乙氧基)乙氧基]乙基溴化物，9：将溴(约0.283mmol)滴加到50mg(0.188mmol)化合物8、74mg(0.283mmol)三苯膦和31μL(30mg,0.377mmol)吡啶的2mL二氯甲烷溶液中直至橙色不再消失。将混合物室温搅拌0.5小时，然后加入1mL饱和亚硫酸氢钠溶液除去过量的溴。然后将混合物在10mL水和2×15mL乙酸乙酯之间进行分配。将合并的有机层用盐水洗涤，干燥(硫酸钠)，过滤然后浓缩。将残余物通过硅胶色谱纯化(35/65丙酮/己烷)得到54mg油状的化合物2：1HNMR(CDCl3)δ1.49(s,9H),3.48(t,2H),3.68(s,4H),3.73(m,2H),3.84(t,2H),4.03(t,2H),7.50(s,1H)；13CNMR(CDCl3)δ28.3,30.4,69.4,70.6(两个信号),71.3,75.5,81.7,156.9.
2-[2-(2-N-(叔丁氧羰基)氨基氧乙氧基)乙氧基]乙基叠氧化物.10：
从化合物9合成：将100mg(0.305mmol)化合物9的0.25mL无水DMF溶液加入到159mg(2.44mmol)叠氮化钠的0.5mL无水DMF溶液中。用另外0.25ml DMF将残余的9冲洗到反应混合物中，然后将混合物于115℃加热3小时。冷却时，将混合物在3mL水和4×3mL二氯甲烷之间进行分配。将合并的有机层用10mL水洗涤，干燥(硫酸钠)，过滤然后浓缩得到黄色的油。通过硅胶色谱纯化(35/65丙酮/己烷)得到67mg(76％)油状的10:1HNMR(CDCl3)δ1.47(s,9H),3.4l(t,2H),3.69(brd s,4H):3.73(m,4H),4.03(t,2H),7.50(s,1H)；13C NMR(CDCl3)δ28.1,50.5,69.1,70.1,70.4
(两个信号)，75.2,81.3,156.7.
从化合物13合成10：氮气氛下，向258mg(0.69mmol)化合物13的5mL DMF溶液中加入358mg(5.50mmol)叠氮化钠。将混合物室温搅拌18小时，加入100mL水，将混合物用3×50mL乙酸乙酯萃取。合并乙酸乙酯层并用50mL水洗涤，干燥(硫酸钠)，过滤然后浓缩得到294mg无色的油。通过硅胶色谱纯化(30/70丙酮/己烷)得到无色油状的化合物10。
化合物11:(MR-508-128)将化合物10(1.36g,4.70mmol)和三苯膦(1.48g,5.64mmol)溶于24mL THF和8mL水，然后将形成的溶液室温搅拌2小时。加入约160μL(8滴)1N NaOH，然后将混合物搅拌18小时。将混合物真空浓缩，将浓缩物通过硅胶色谱纯化(80/8/2CH3CN/H2O/浓NH4OH)得到1.16g(94％)黄色油状的11：1HNMR(CDCl3)δ1.50(s,9H),1.90(brd,2H),2.88(t,2H),3.56(t,2H),3.65(m,4H),3.71(m,2H),4.01(m,2H)。
1,2-双(2-碘乙氧基)乙烷,化合物12：将10.0g(5.3mmol)1,2-双(2-氯乙氧基)乙烷(Aldrich Chemical Co.)和16.0g(107mmol)碘化钠的110mL丙酮溶液加热回流18小时。将混合物浓缩并将残余物用氯仿研制以溶解产物而使盐不溶解。将混合物过滤，将滤液浓缩得到橙色的油。通过硅胶色谱纯化(梯度，10/90 EtOAc/己烷至15/85 EtOAc/己烷)得到17.8g(90％)橙色油：1HNMR(CDCl3)δ3.28(t,4H),3.67(s,4H),3.78(t,4H)；13C NMR(CDCl3)δ3.6,70.5,72.2.
化合物13：将DBU(284μL,290mg,1.90mol)加入到266mg(2.0mmol)N-(叔丁氧羰基)羟基胺(Aldrich Chemical Co.)和2.96g(8.0mmol)化合物12的混合物中，然后将混合物密封并振摇至均匀。15分钟后，混合物固化，将其放置45分钟。向混合物中加入5mL二氯甲烷并将混合物再次振摇以溶解固体。将形成的溶液加入到200mL乙酸乙酯中。补加50mL乙酸乙酯，将混合物过滤以除去固体。将滤液浓缩得到油，将该油在100mL乙酸乙酯和3×50mL 1N盐酸之间进行分配。将乙酸乙酯层用2×50mL 1N氢氧化钠洗涤，随后用2×50mL 5％亚硫酸氢钠溶液洗涤然后浓缩得到2.6g黄色的油。通过硅胶色谱纯化(梯度，20/80至45/55 EtOAc/己烷)得到515mg(69％)黄色油状的化合物13:1HNMR(CDCl3)δ1.50(s,9H),3.28(t,2H),3.68(s,4H),3.72(m,4H),4.02(t,2H),7.72(s,lH)；13C NMR(CDCl3)δ2.9,28.3,68.9,69.4,70.2,70.6,72.0,75.4,81.6,156.9.
二甘醇双-4-硝基苯基碳酸酯，化合物60：将吡啶(30.5mL,377mmol)缓慢加入到0℃的5.0g(47.1lmmol)二甘醇和23.74g(118mmol)4-硝基苯基氯甲酸酯的500mL THF溶液中。移走冷却浴，将混合物室温搅拌18小时。将混合物再次冷却至0℃，用6N HCl酸化，然后在400mL 1N HCl和2×400mL二氯甲烷之间进行分配。将合并的有机层干燥(硫酸镁)，过滤然后浓缩得到24.3g白色固体。用己烷/EtOAc结晶得到16.0g(78％)白色粉末状混合物37:mp 110℃；1H NMR(CDCl3)δ3.89(t,4H),4.50(t,4H),7.40(d,4H),8.26(d,4H).
化合物61：将2.5g(5.73mmol)化合物37的17mL吡啶溶液加入到0℃的1.8g(17.2mmol)二乙醇胺的3mL吡啶溶液中。移走冷却浴，将混合物室温搅拌5小时得到化合物38，该混合物不经分离直接用于下一步骤。
化合物14：将上一步骤的混合物再次冷却至0℃，加入40mL二氯甲烷，随后加入11.55g(57.3mmol)4-硝基苯基氯甲酸酯的60mL二氯甲烷溶液，然后将混合物室温搅拌20小时。将混合物再次冷却至0℃，用1N HCl酸化，然后在300mL 1N HCl和2×200mL二氯甲烷之间进行分配。将合并的有机层干燥(硫酸镁)，过滤然后浓缩得到13.6g黄色固体。通过硅胶色谱纯化(CH2Cl2/MeOH和EtOAc/己烷)得到4.91g(83％)粘的无定形固体状化合物39:1H NMR(CDCl3)δ3.72(m,12H),4.31(t,4H),4.48(m,8H),7.40(m,8H),8.29(m,8H)。
Figure A9980841500791
BOC-保护的AOTEG/DEA/DEG平台，化合物15：将三乙胺(157μL,114mg,1.13mmol)加入到搅拌的193mg(0.188mmol)化合物14(按照以上及1998年12月9日申请的U.S.系列号60/111,641中的描述制备)，然后加入298mg(1.13mmol)化合物11。将混合物恢复至室温并搅拌过夜。将混合物冷却至0℃，用1N HCl酸化，然后在20mL 1NHCl和4×20mL二氯甲烷之间进行分配。将合并的有机层用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，干燥(硫酸镁)，过滤然后浓缩得到279mg黄色的油。通过硅胶色谱纯化(97/3 CH2Cl2/MeOH)得到138mg(48％)油状的15；1H NMR(CDCl3)δ1.49(s,36H),3.35(m,8H),3.46-3.78(m,44H),4.04(t,8H),4.21(m,12H),5.80(m,4H),7.91(s,4H)；质谱(ES)m/z计算值C62H117N10O33(M+H)+:1528.8。实测值：1528.5。
化合物16：将化合物15(60mg,39.2μmol)溶于10mL 1/9三氟乙酸/二氯甲烷，然后将混合物保持在室温下3小时。用温和的氮气流蒸除溶剂，然后将残余物溶于最少量的色谱溶剂(5/7.5/87.5浓NH4OH/H2O/CH3CN)中并将混合物上到硅胶柱上。通过硅胶色谱纯化(梯度5/7.5/87.5至5/10/85的浓NH4OH/H2O/CH3CN)得到36mg(82％)无色油状的16:1H NMR(CDCl3)δ3.37(m,8H),3.58(m,16H),3.67(s,16H),3.71(m,12H),3.86(m,8H),4.17-4.29(m,12H),4.93(brd,8H),5.91(m,4H)；13C NMR(CDCl3)δ40.9,47.7,48.2,62.9,64.7,69.4,69.6,70.2,70.3,70.5,74.8,156.1,156.6；质谱(ES)m/z计算值C42H85N10O25(M+H):1129。实测值：1129。
为了通过分析HPLC检测纯度,按照如下方式制备四丙酮肟。将化合物16(0.38mg,0.34μmol)在HPLC样品瓶中溶于240μL 0.1MNaOAc缓冲液。向溶液中加入10μL 49μL丙酮在2.0mL 0.1M NaOAc缓冲液中的溶液。将混合物放置1小时，然后取样进行HPLC分析(4.6mm C18柱，1mL/min,210nm检测，梯度：在20分钟内10-60％B,A=0.1％TFA/H2O,B=0.1％TFA/CH3CN,tR=19分钟)；收集的洗脱液的质谱(ES)m/z计算值C54H101N10O25(M+H):1289。实测值：1289。
Figure A9980841500811
四价D1偶联物化合物45的合成：将TA/D1(5.20mg,7.37×10-7mol)在聚丙烯试管中溶于2.0mL通过氦气的0.1M乙酸钠(pH 4.60)缓冲液中。向混合物中加入15.07μL(139μg,1.23×10-7mol)8.147μmol/mLAOTEG/DEA/DEG平台(化合物16)的0.1M乙酸钠(pH4.60)缓冲液溶液。将混合物在氮气氛下温和地搅拌23小时，此时，分析HPLC表明反应已经结束，所述分析HPLC采用4.6mm×250mm,300埃，5μm，联苯基柱(Vydac)并于280nm下检测(1mL/分钟，梯度25％-45％B,0-20分钟，A=0.1％TFA/H2O,B=0.1％TFA/CH3CN)。近似的保留时间如下：TA/D1,13.7分钟；偶联物化合物45,17.2分钟。将混合物用水稀释至体积为5mL并通过HPLC纯化(10mm×250mm,300埃，5μm，联苯基柱(Vydac)(3mL/分钟；梯度25％-45％B,0-40分钟，A=0.1％TFA/H2O,B=0.1％TFA/CH3CN)。收集经分析HPLC证实含有纯净偶联物化合物45的馏份并冷冻干燥得到1.73mg(48％)偶联物化合物45：质谱(ES，平均m/z)：计算值C1322H2048N334O377S20:29,294。实测值：29,294。
通过将第五半胱氨酸用烷基卤化物平台烷基化制备四价D1偶联物，化合物65：结构域1有四个氧化形式的半胱氨酸，适当折叠的结构域1有两个二硫键。可以在天然半胱氨酸外的N-末端或C-末端的任何位置包含第五个半胱氨酸。在该实施例中，包含第五个半胱氨酸，它是β2GPI的第二结构域中固有的。由于其含有游离的巯基，因此第五半胱氨酸可用于和设计用于同巯基反应的平台进行反应。这种平台之一是卤代乙酰基平台如化合物23。
将第五-Cys D1(四当量)溶于通过氦气的100mM pH8.0的硼酸钠缓冲液中。将溶液保持在氮气氛下，加入溴乙酰化的平台(化合物23)(1当量)的溶液。将混合物搅拌至反应结束，然后将混合物通过制备HPLC纯化得到四价的偶联物(化合物65)。
AOTEG/PIZ/DEA/DEG平台，化合物17的合成：将吡啶(610μL,596mg,7.54mmol)缓慢加入到搅拌中的500mg(1.88mmol)化合物8和760mg(3.77mmol)对-硝基苯基氯甲酸酯的14mL二氯甲烷溶液中，然后将混合物室温搅拌18小时。将混合物冷却至0℃，然后用1N盐酸酸化。将得到的混合物在100mL 1N盐酸和3×100mL二氯甲烷之间进行分配。将合并的有机层干燥(硫酸镁)，过滤然后浓缩得到1.05g粘的固体。通过硅胶色谱纯化(6/4己烷/EtOAc)得到505mg(62％)浅黄色油状的化合物17:1H NMR(CDCl3)δ1.47(s,9H),3.67-3.78(m,6H),3.80(m,2H),4.02(m,2H),4.48(m,2H),7.40(d,2H),7.50(s,1H),8.29(d,2H)；质谱(ES)m/z计算值：C18H26N2O10Na(M+Na):453.1。实测值：453.0。
BOG-保护的AOTEG/PIZ/DEA/DEG平台，化合物19：向化合物18(按照1998年12月9日申请的U.S.系列号60/111,641中的描述制备)在碳酸氢钠水溶液和二噁烷的混合物中的溶液中加入4当量化合物17的二噁烷溶液。反应结束后，将混合物在水和二氯甲烷之间进行分配。将二氯甲烷层浓缩，干燥，然后通过硅胶色谱纯化得到化合物19。
AOTEG/PIZ/DEA/DEG平台，化合物20：按照与制备化合物16时所述基本相似的方式从化合物19上除去BOC保护基得到化合物20。
Figure A9980841500851
AOTEG/SA/AHAB/TEG平台，S-乙酰基-2-[2-(2-N-叔丁氧基羰基氨基氧乙氧基)乙氧基]-乙基硫醇，化合物21a的合成：向500mg(1.52mmol)化合物9a的30mL丙酮溶液中加入191mg(1.68mmol)硫代乙酸钾(Aldrich Chemical Co.)。将混合物室温搅拌18小时，然后滤除形成的沉淀。将滤液浓缩并在300mL EtOAc和2×80mL盐水之间进行分配。将EtOAc层干燥(硫酸钠)，过滤然后浓缩得到460mg(93％)浅棕色油状的化合物21a:1H NMR(CDCl3)δ1.48(s,9H),2.35(s,3H),3.12(t,2H),3.61(t,2H),3.64(m,4H),3.73(m,2H),4.02(m,2H),5.52(s,1H)；13C NMR(CDCl3)δ28.3,28.8,30.6,69.3,69.8,70.2,70.5,75.3,81.5,156.8,195.3.
2-[2-(2-N-叔丁氧基羰基氨基氧乙氧基)乙氧基]-乙基硫醇，化合物22a：将化合物21a用通过氮气的4/1 6N NH4OH/CH3CN溶液在氮气氛下室温处理1小时。将混合物真空浓缩得到化合物22a，该化合物可不经纯化直接使用。
BOC-保护的AOTEG/SA/AHAB/TEG平台，24a：将化合物23(按照Jones等，《药物化学杂志》(J.Med.Chem.)1995,38,2138-2144的描述制备)加入到4当量化合物22a在通过氮气的10/90 H2O/CH3CN中的溶液中。向形成的溶液中加入4当量二异丙基乙基胺。反应结束时，将混合物在水和二氯甲烷之间进行分配。将二氯甲烷层浓缩，干燥，通过硅胶色谱纯化得到化合物24a。
AOTEG/SA/AHAB/TEG平台，25a：按照与制备化合物16时所述基本相似的方式从化合物24a上除去BOC保护基得到化合物25a。
AOHEX/SA/AHAB/TEG平台，1-碘-6-(N-叔丁氧羰基)氨基氧己烷，化合物9b的合成：向140mg(1.05mmol)N-(叔丁氧基羰基)羟基胺(Aldrich Chemical Co.)和658μL(1.35mg,4.0mmol)化合物12的多相混合物中加入149μL(152mg,1.0mmol)DBU。将混合物室温搅拌30秒，此时，反应混合物固化。将该固体放置过夜，然后溶于50mL二氯乙烷。将溶液用2×25mL 1N NaOH和3×25mL 1N HCl洗涤。将合并的碱性含水层用25mL二氯甲烷萃取并将合并的酸性含水层用25mL二氯甲烷萃取。将合并的二氯甲烷层干燥(硫酸钠)，过滤然后浓缩得到黄色的油。通过硅胶色谱纯化(梯度；1/99/0.1至15/85/0.1的EtOAc/己烷/MeOH)得到216mg(68％)黄色油状的9b:1H NMR(CDCl3)δ1.40(m,4H),1.48(s,9H),1.62(m,2H),1.83(m,2H),3.20(t,2H),3.84(t,2H),7.10(s,1H)。
S-乙酰基-6-(N-叔丁氧羰基)氨基氧己-1-硫醇，化合物21b：将化合物9b(209mg,0.61mmol)加入到硫代乙酸钾的15mL丙酮溶液中，然后将混合物室温搅拌18小时。真空蒸除丙酮，将残余物在50mL二氯甲烷和3×25mL 1N NaOH之间进行分配。将二氯甲烷层干燥(硫酸钠)，过滤然后浓缩得到棕色油。通过硅胶色谱纯化(15/85 EtOAc/己烷)得到166mg(94％)无色油状的化合物21b:1H NMR(CDCl3)δ1.39(m,4H),1.48(s,9H),1.59(m,4H),2.32(s,3H),2.86(t,2H),3.82(t,2H),7.10(s,1H)。
6-(N-叔丁氧羰基)氨基氧己-1-硫醇，化合物22b：按照如下描述制备纯净的22b的样品。将化合物21b(50mg,172μmol)和22μL(17.4mg,85.8μmol)三正丁基膦置于氮气氛下，向混合物中加入2mL通过氮气的1M NaOH的甲醇溶液。将混合物室温搅拌18小时，然后加入172μL(180mg,3mmol)三氟乙酸。将混合物在25mL乙酸乙酯和3×25mL 1N HCl之间进行分配。将合并的水层用25mL乙酸乙酯萃取，干燥(硫酸钠)，过滤然后浓缩得到油。通过硅胶色谱纯化(15/85/0.1EtOAc/己烷/MeOH)得到28mg无色油状的22b:1H NMR(CDCl3)δ1.32(t,1H),1.40(m,4H),1.49(s,9H),1.62(m,4H),2.53(dt,2H),3.84(t,2H),7.09(s,1H)。
BOC-保护的AOHEX/SA/AHAB/TEG平台，24b：将化合物21b(13mg,45μmol)和6μL(4.5mg,22.3μmol)三-正丁基膦置于氮气氛下，向混合物中加入3mL通过氮气的4/16N NH4OH/CH3CN溶液。将混合物室温搅拌1小时然后真空浓缩。将残余物溶于3mL通过氮气的10/90水/CH3CN溶液。将形成的溶液保持在氮气氛下，向其中依次加入10mg(7.44μmol)化合物23和8μL(5.77mg,44.6μmol)二异丙基乙基胺。将混合物搅拌18小时然后真空浓缩。将残余物通过硅胶色谱纯化(多梯度，1/99至5/95至7.5/92.5至10/90至15/85的MeOH/CH2Cl2)得到14mg(93％)无色油状的24b:TLC(10/90 MeOH/CH2Cl2),Rf=0.3；质谱(ES)m/z计算值C92H173N14O26S4(M+H):2018。实测值：2018。
AOHEX/SA/AHAB/TEG平台，25b：按照与制备化合物16时所述基本相似的方式从化合物24b上除去BOC保护基。
Figure A9980841500901
AOHOC/DT/TEG平台，6-(叔丁氧羰基氨基氧)己-1-醇，27的合成：向179μL(183mg,1.2mmol)DBU的1mL二氯甲烷溶液中加入133mg(1.0mmol)N-(叔丁氧羰基)羟基胺(Aldrich Chemical Co.)和157μL(217mg,1.2mmol)6-溴己-1-醇(Aldrich Chemical Co.)，然后将混合物室温搅拌18小时。将混合物浓缩得到黄色的油。通过硅胶色谱纯化(35/5/65 EtOAc/MeOH/己烷)得到180mg(77％)无色油状的化合物27:1H NMR(CDCl3)δ1.39(m,4H),1.48(s,9H),1.59(m,4H),3.63(t,2H),3.85(t,2H),7.42(s,1H)；13C NMR(CDCl3)δ25.6,25.8,28.1,28.4,62.8,76.8,81.7,157.2。
化合物28:0℃下，向100mg(0.428mmol)化合物27的2mL二氯甲烷溶液中加入90μL(88.1mg,1.11mmol)吡啶，然后加入113mg(0.557mg)对硝基苯基氯甲酸酯(Aldrich Chemical Co.)。将混合物室温搅拌4小时，冷却至0℃，用1N HCl酸化，然后在20mL 1N HCl和3×20mL二氯甲烷之间进行分配。将合并的二氯甲烷层用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，干燥(硫酸镁)，过滤然后浓缩。通过硅胶色谱纯化得到化合物28。
化合物29：向二亚乙基三胺的EtOAc溶液中加入2当量二异丙基乙基胺，然后加入2当量化合物28。将混合物搅拌至反应结束。去除溶剂，将产物(化合物29)通过硅胶色谱纯化。
BOC-保护的AOHOC/DT/TEG平台，30：向三甘醇双氯甲酸酯(Aldrich Chemical Co.)的吡啶溶液中加入2当量化合物29。将混合物搅拌至反应结束，然后在1N HCl和二氯甲烷之间进行分配。将二氯甲烷层干燥然后浓缩，将产物通过硅胶色谱纯化得到化合物30。
AOHOC/DT/TEG平台，31：按照与制备化合物16时所述基本相似的方式从化合物30上除去BOC保护基。
AOTEG/IDA/TEG平台，化合物32的合成：向三甘醇双氯甲酸酯(Aldrich Chemical Co.)的吡啶溶液中加入2当量亚氨二乙酸(AldrichChemical Co.)。将混合物搅拌至反应结束，然后在1N HCl和二氯甲烷之间进行分配。将二氯甲烷层干燥然后浓缩，将产物通过硅胶色谱纯化得到化合物32。
化合物33：将化合物32的THF溶液用6当量NHS和6当量DCC处理1小时。向混合物中加入4当量化合物11，然后将混合物搅拌至反应结束。加入乙酸以除去过量的DCC，然后滤除形成的固体。将滤液浓缩并通过硅胶色谱纯化得到化合物33。
化合物34：按照与制备化合物16时所述基本相似的方式从化合物33上除去BOC保护基。
AOTEGO/LEV/PITG的合成
平台，对硝基苯基乙酰丙酸酯，35：向800mg(6.89mmol)乙酰丙酸(Aldrich Chemical Co.)的4.25mL吡啶溶液中加入1.78g(7.58mmol)4-硝基苯基三氟乙酸酯(Aldrich Chemical Co.)。将形成的溶液搅拌15分钟，然后在28ml水和2×28mL二氯甲烷之间进行分配。将合并的二氯甲烷层干燥(硫酸镁)，过滤然后浓缩。将浓缩物通过硅胶色谱纯化(梯度，25/75至30/70的EtOAc/己烷)得到1.06g(74％)化合物35:1HNMR(CDCl3)δ2.28(s,3H),2.87(m,4H),7.29(d,2H),8.28(d,2H).
1,2-双(2-(叔丁氧羰基)氨基氧乙氧基)乙烷，化合物36：
向243mg(0.66mmol)化合物12中加入219mg(1.64mmol)N-(叔丁氧基羰基)羟基胺(Aldrich Chemical Co.)，然后加入246μL(250mg,1.64mmol)DBU。将混合物室温搅拌至其固化(约1小时)。再放置1小时后，将混合物溶于2mL二氯甲烷，然后将形成的溶液加入到100mL乙酸乙酯中以使DBU的氢碘酸盐析出沉淀。另外加入50mL乙酸乙酯，然后将混合物过滤。将滤液用2×50mL 1N HCl、2×50mL 5％亚硫酸氢钠溶液和25mL盐水洗涤。将乙酸乙酯层干燥(硫酸钠)，过滤然后浓缩得到油。通过硅胶色谱纯化(梯度，40/60至50/50至80/20的EtOAc/己烷)得到164mg(65％)无色油状的化合物36:1H NMR(CDCl3)δ1.48(s,18H),3.65(s,4H),3.72(t,4H),4.02(t,4H),7.80(s,2H)；13CNMR(CDCl3)δ28.2,69.0,70.3,75.2,81.3,156.8。
1,2-双(2-氨基氧乙氧基)乙烷，化合物37：将化合物36(559mg,1.47mmol)溶于15mL乙酸乙酯，然后向溶液中通入氯化氢气体30分钟。将混合物真空浓缩得到72mg(90％)粘稠的盐酸盐形式的化合物37:1H NMR(D2O)δ3.75(s,4H),3.87(m,4H),4.27(m,4H)；质谱(ES)m/z计算值：C6H17N2O4(M+H):181.1。实测值：181.1。
化合物38：将化合物3用30％HBr的乙酸溶液处理除去CBZ保护基得到四胺氢溴酸盐。将该四胺溶于碳酸氢钠的水和二噁烷溶液中，然后向溶液中加入4当量化合物35。反应结束后，将混合物在水和二氯甲烷之间进行分配。将二氯甲烷层浓缩，干燥，然后通过硅胶色谱纯化得到化合物38。
AOTEGO/LEV/PITG平台，化合物39：向化合物38的0.1M pH4.6的乙酸钠缓冲液中加入20当量化合物37。反应结束后，将混合物在水和二氯甲烷之间进行分配。将二氯甲烷层浓缩，干燥，然后通过硅胶色谱纯化得到化合物39。
Figure A9980841500951
AO/DEGA/DEG平台，化合物41的合成：将溴(约6当量)滴加到化合物40、6当量三苯膦和8当量吡啶的二氯甲烷溶液中直至橙色不再消失。将混合物室温搅拌0.5小时或直至反应结束，然后加入饱和亚硫酸氢钠溶液以破坏过量的溴。将混合物在水和乙酸乙酯之间进行分配。将合并的有机层用盐水洗涤，干燥(硫酸钠)，过滤，浓缩，通过硅胶色谱纯化得到化合物41。
化合物42：向化合物41中加入6当量N-(叔丁氧基羰基)羟基胺(Aldrich Chemical Co.)和6当量DBU。将混合物根据需要加热足够长的时间使反应完成。冷却后，将混合物溶于二氯甲烷并将形成的溶液加入到乙酸乙酯中形成沉淀，过滤除去沉淀，然后将滤液浓缩。通过快速色谱纯化得到8。
化合物43：按照与制备化合物16时所述基本相似的方式从化合物42上除去BOC保护基。
Figure A9980841500961
使用化合物37作为双功能基接头制备四价偶联物的另一种方法：除了将转氨基化的结构域1β2GPI多肽直接与四价氨基氧平台反应外，还可将转氨基化的结构域1与过量的化合物37在pH4.6的100mM乙酸钠缓冲液中反应得到其中氨基氧接头通过肟键与结构域1β2GPI多肽连接的化合物53。将化合物53与过量的接头分离，然后将4当量化合物53与平台38在pH4.6的100mM乙酸钠缓冲液中反应形成第二套肟键，得到四价偶联物，化合物54。
Figure A9980841500971
使用化合物21a作为双功能基接头的前体制备四价偶联物的另一种方法：将化合物21a用氢氧化铵处理除去乙酰基硫保护基，然后用三氟乙酸处理除去BOC保护基，得到接头55。将含有乙醛酰基的多肽(在该情况下为TA/D1)与化合物55反应得到化合物56，带有通过肟键连接的巯基接头的结构域1β2GPI多肽。可以将四当量的化合物56与平台23反应得到四价结构域1β2GPI多肽偶联物，化合物57。实施例6：结构域1β2GPI多肽四聚体偶联化合物44的结合特性
用表面等离子体振子共振的方法分析四聚体偶联化合物44与两种亲和纯化的人抗β2GPI抗体的结合。四聚体偶联化合物44的kd测定的材料和方法
试剂。CM5芯片、NHS和EDC及HBS-EP缓冲液来自BIAcore。将汇集的人正常IgG(Zymed)固定在芯片上的分离流动室中，用作阴性对照。来自两个病人(6701和6626)的亲和纯化β2GPI结构域1特异抗体固定于分离的流动室中。
表面等离子体振子共振。所有的实验均以流速10μL/分钟，25℃进行于BIAcoreTM2000装置上。用脱气HBS-EP缓冲液完成芯片平衡和结合研究，该缓冲液含0.01M HEPES pH7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA和0.005％(v/v)表面活性剂P20。将40μL的0.05M NHS/0.2M EDC流经芯片使其活化，然后暴露在合适的蛋白质配基中，从而完成蛋白质配基通过其游离氨基与CM5芯片的共价偶联。通过使溶于10mM乙酸(pH4.8)的100μg/mL亲和纯化抗体和正常IgG溶液100μL流经NHS活化的CM5芯片，从而将抗体和IgG固定。然后用40μL 1M乙醇胺(pH8.5)淬灭芯片表面的过量反应基团。
滴定。用HBS-EP稀释杆状病毒表达的β2GPI结构域1和四聚体化合物44，使其流经芯片，并收集780秒的应答值。在两次样品接触之间用80μL0.1M甘氨酸-HCl(pH2.1)、0.1M NaCl再生芯片。对各样品进行5次滴定。因为在检测期间未达到结合平衡，用制造商的软件(BiaEvaluation version2.2,Uppsala,瑞典)将结合曲线拟合以下方程式，确定平衡结合值(Req)
Rt=Req(l-e-ks(t-t0))+R0
其中Rt是在时间t时检测的BIAcore应答，Req是平衡平台应答，t是时间，t0是起始时间，ks是表观结合常数(ks=kaC+kdis，其中ka是结合常数，C是分析物浓度，而Kdis是解离常数)，而R0是应答补偿，(Marquart-Levenberg算法)。
各滴定结合曲线均具有阴性对照(正常IgG)室背景，在滴定时减去此值。用GraphPad Prism软件版本2.01将计算的Req对浓度作图。将数据拟合单位点结合(等轴双曲线：Y=Bmax*X/[Kd+X]),Kd值以摩尔单位计算。通过测280nm处的吸收值测定结构域1和化合物44的摩尔浓度，消光系数为1.85。结果和讨论
将来自病人6701和6626的亲和纯化抗体固定在隔离的微量流动腔里，并暴露于不同浓度的人β2GPI结构域1或化合物44。测定各浓度的平衡结合值并作图以确定表观平衡解离常数。结合等温线见图10和11(消光系数=1.85；100μg/mL固定的抗体)，解离常数见表8。
这些实验证实了亲和纯化的抗磷脂抗体可与β2GPI的结构域1结合。此外，它们证实了结构域1β2GPI多肽与平台连接的四聚体偶联物也能与这些抗体结合，亲和力与四聚体中存在的结构域1的摩尔浓度相等或更大。
表8：结构域1和化合物44与亲和纯化的抗磷脂抗体结合的表观平衡解离常数
病人 结构域1 化合物44
 6626  333±18nM  66±23nM
 6701  417±36nM  24±9
实施例7：体外检测结构域1β2GPI多肽偶联物的竞争性抗体结合
用PBS中的2.5μg/mL β2GPI以100μL/孔的量包被NuncMaxisorp微量平板(Nalge Nunc International,丹麦)，室温温育2小时，用250μl/孔2％脱脂牛奶和0.4％Tween-80(Sigma Chemical Co.)室温封闭2小时。用TBS洗5次后，往各孔中添加临用前1小时内制备的100μL溶液，终浓度为每孔中有1∶200稀释的病人6501的血浆，不同量的四聚结构域1偶联化合物44和化合物45或对照结构域1单体在2％脱脂牛奶和0.4％Tween-80中的溶液。室温温育1小时后用TBS洗平板5次。在各孔中添加100μL以1∶1000稀释于2％脱脂牛奶和0.4％Tween-80中的碱性磷酸酶偶联抗人IgG,γ链特异(Zymed)。室温温育1小时后用TBS洗平板5次。在各孔中添加100μlPPMP显色底物，室温显色。在商用微量平板读取仪(Bio-Tek InstrumentsEL311)测定各孔在A550nm处的光吸收值。图12中的结果显示化合物44和45均与血清(病人6501)中的抗磷脂抗体有效竞争。还原和烷化的结构域1未显示这样的竞争性，是阴性对照。常规的单体结构域1也显示竞争性结合，用作阳性对照。实施例8：检测结构域1β2GPI多肽偶联物的免疫小鼠模型
检测对结构域1β2GPI多肽耐受性的免疫模型需满足的要求是：(1)免疫接种必须产生能识别结构域1的抗体和(2)免疫接种必须不产生识别结构域1的T细胞。用结构域1多肽-KLH偶联物免疫接种将产生识别KLH但无对结构域1之可检测反应性的T细胞。为此目的，我们已在昆虫细胞体系中制备了含羧基端第五个半胱氨酸的结构域1β2GPI多肽(SEQ ID NO:1的第1-66位氨基酸)。此分子已通过第五个半胱氨酸共价附着至KLH。将此偶联物用于免疫小鼠。用结构域1-KLH偶联物免疫产生识别KLH但对结构域1无可检测反应性的T细胞。另一方面，用结构域1-KLH偶联物免疫接种确实导致了结构域1特异抗体的产生。材料和方法检测抗结构域1抗体的ELISA
用0.1M碳酸氢盐(pH9.5)中的β2GPI 5μg/ml 50μl包被NUNC微量滴定孔过夜。用PBS洗孔然后加入2％脱脂奶粉(NFDM)封闭1小时。洗孔并加入50μl稀释于2％NFDM中的各小鼠血清的系列稀释液，室温温育1小时，洗涤并加入50μl碱性磷酸酶偶联的抗小鼠IgG，室温温育1小时，洗涤并加入50μl底物。30分钟后读取550nm的OD值。制备已用50μg偶联物免疫的小鼠血清库。在所有试验中检测此库并以标准库的百分数表示。竞争性抑制ELISA
用0.1M碳酸氢盐(pH9.5)中的重组β2GPI 5μg/ml 50μl包被NUNC微量滴定板，4℃过夜，用0.15M PBS(pH7.2)洗3次，用溶于PBS的75μl 2％脱脂奶粉(2％NFDM)室温封闭1小时。将检测抑制剂稀释于2％NFDM中，往包被的孔中加入25μl各稀释液或只加入NFDM。单克隆抗体稀释于2％的NFDM中，将25μl恒定浓度稀释液加入孔中。混合孔中所含溶液并将平板室温温育1小时。用PBS洗平板3次后，添加适当稀释于2％NFDM中的50μl碱性磷酸酶偶联抗小鼠IgG(γ链特异)，37℃温育1小时。用PBS洗平板3次后，加入50μl碱性磷酸显色底物，20℃温育平板30分钟。在微量平板自动读取仪上检测A550。抑制百分率测定如下：[(无抑制剂之对照孔的平均A550-背景A550)-(有抑制剂时的A550-背景A550)/(无抑制剂之对照孔的平均A550-背景A550)]×100。抗结构域1抗体的免疫小鼠模型
用吸附于明矾上的10、50或100μg KLH-结构域1偶联物及2×109个百日咳杆菌作佐剂免疫接种5只C57B1/6小鼠组。3周后用10μg盐水中的偶联物对所有小鼠加强免疫。加强7天后给小鼠放血，收获血清并检测抗结构域1的活性。结果显示于图14中。用结构域1-KLH免疫接种不产生结构域1特异的抗体应答。小鼠免疫接种和T细胞增殖试验
将乳化于完全弗氏佐剂(CFA)中的25μg结构域1(D1)-KLH偶联物从后足垫处注射入C57B1/6小鼠。将乳化CFA(无抗原)从后足垫处注射入另一组小鼠中。7天后从各组的5只小鼠中收获腘淋巴结。从类似的免疫接种中收集淋巴结并制备单细胞悬液。除了检测抗原是D1-KLH、KLH和结构域1(未偶联)外，如上所述象培养人细胞一样培养这些细胞。PPD用作阳性对照。第四天，将25μl含1μCi的3H-胸苷加入各孔中。第五天，收获孔中的内含物并测定各孔中的放射性。用阴性对照的平均CPM除各孔的CPM，计算各孔的刺激指数(SI)。测定各重复试验的平均值(和标准偏差)SI。结果和讨论
用竞争性抑制ELISA试验测定多克隆小鼠抗KLH-结构域1偶联物的特异性。在已用β2GPI包被的孔中将多种重组形式的β2GPI与有限量的抗体混合。然后用碱性磷酸酶偶联的二抗检测仍与孔结合的抗体量。如方法部分所述测定抑制作用百分率，并对抑制剂的微摩尔浓度作图。结果如图15所示。用同一偶联物免疫接种确实产生了特异于结构域1的抗体应答(图15)。
至于T细胞增殖，图13的结果表明，结构域1-KLH免疫小鼠的细胞对结构域1-KLH和KLH以及阳性对照PPD应答，引起增殖。它们不对结构域1(非偶联的)产生应答。另一方面，只用CFA免疫的小鼠的细胞不对检测抗原产生应答，但对阳性对照PPD产生应答。
也就是说，对于免疫小鼠模型而言，抗原引发作用必须不引发识别所给耐受原的T细胞，但必须产生将识别耐受原的记忆B细胞，在此处所提及的免疫小鼠模型符合对免疫小鼠模型的这两个基本要求。实施例9：检测在体内作为耐受原的结构域1β2GPI多肽
用明矾上与匙孔血蓝蛋白(KLH)偶联的结构域1β2GPI多肽并如上所述使用百日咳杆菌作为佐剂免疫小鼠。3周后，用一定剂量范围的耐受原处理小鼠，耐受原可以与平台偶联或不偶联。未处理的一组作为对照组。5天后，用与KLH偶联的10μg结构域1β2GPI多肽加强免疫包括对照组在内的所有小鼠，7天后给小鼠放血。用已知方法分析它们血清中的抗-β2GPI结构域1抗体，包括，例如上文实施例中所述的ELISA。然后将这些值用于确定组中所有个体的平均值和标准偏差。实施例10：检测T细胞反应性
确认缺乏对于结构域1β2GPI多肽的T细胞反应性表明，作为耐受原来说，它不从T细胞提供任何第二信号的表位给B细胞。相反，如果耐受原为T细胞提供增殖(活化)信号，则耐受原可能会加强B细胞的应答。
为了测定T细胞活化作用，收集循环淋巴细胞并进行组织培养。将待测结构域1β2GPI多肽加至培养物上约1周。在这周末，用3H-胸苷脉冲标记T细胞以测定是否有细胞增殖。任选地，也测定了组织培养物上清中细胞因子的存在情况。实施例11：抗β2GPI抗体通过延迟因子Va的失活作用有助于超凝血方法
在存在和缺乏被诊断具抗磷脂综合症(APS)之病人的亲和纯化抗体或总IgG制品时测定阻塞起始后正常人血浆中的已活化因子V(Va)水平。亲和纯化抗体鉴定为抗β2GPI结构域1。如下所述从病人血清中制备总IgG。
用Amelung KC4A微凝血仪以修改过的两阶段阻塞试验测定因子Va水平如下。在旋转的微量比色池中37℃预热50μl因子V缺陷的人血浆(Chromogenix)1分钟。用预热的(37℃)Owren’s缓冲液(Sigma)以1∶10稀释样品。将50μl稀释样品加入50μl因子V缺陷的血浆中。将100μl37℃的ThromboMAX加钙(Sigma)加入以引发阻塞。记录阻塞的时间。1个单位的Va活性定义为用正常参照人血浆(Accuclot,Sigma)的1∶10稀释液凝血V缺陷血浆的时间。在此实验系统中，1个单位的因子Va活性相应于约30秒的凝血时间。
为了测定存在或缺乏抗磷脂抗体或IgG时随时间产生的因子Va的量，利用以下系统产生以上标准试验中所测的样品。混合以下试剂并在37℃温育：一份正常人参照血浆(Accuclot,Sigma)，一份25mMCaCl2和一份含磷脂酰丝氨酸试剂(125μg/ml)和Tris-缓冲盐水(TBS)及抗体或IgG的溶液(在预期浓度适用时)。将TBS用于修正抗体或IgG的体积差异。在添加37℃CaCl2引发凝血前混合正常血浆、磷脂酰丝氨酸、抗体或IgG(若存在)和TBS并在37℃温育2分钟，凝块形成后即将其去除。样品混合物的总体积取决于所检验时间点的数目。在各时间点取出12.5μl温育样品，1∶10稀释于Owren’s缓冲液中，并用上文的标准因子Va试验进行检验。样品中随时间产生的Va的水平反映在因子V缺陷血浆凝固时间的校正上。凝血4-5分钟时有最高的Va水平，因子Va活性水平在4-7个单位的范围内。这相应于此实验系统的标准实验中约5-6秒的凝血时间。
在将APS病人IgG添加到试验中的情况下，通过混合100μl血清(用Pierce Immunopure IgG结合缓冲液1∶l稀释)和100μl琼脂糖固定的蛋白G珠(Pierce Immunopure Plus)从人血清样品中制备总IgG。
在常温下缓慢振荡混合物10分钟。蛋白G结合人免疫球蛋白G之所有亚类的Fc区域。10分钟后短暂离心混合物以沉淀珠子。弃血清混合物上清。
然后用200μlIgG结合缓冲液洗结合有IgG的珠子3次，以去除吸附的蛋白质。随后用3倍100μlIgG洗脱缓冲液(Pierce,Immunopure IgG洗脱缓冲液)从蛋白G珠上将结合的IgG洗脱下来。立即用100μl 1M NaPO4 pH7.5中和洗脱的IgG，从100μl血浆样品中得到了总的终体积为400μl的IgG制品。中和过的IgG制品储存于4℃待分析。
用标准的微量平板Bradford方法(Bio-Rad试剂)测定IgG制品的蛋白质浓度。检测3份试样，各样品每份5μl,以各平板上的牛血清清蛋白为标准曲线。用KC4软件计算蛋白质浓度。
为了因子Va凝血试验中分析，用Microcon离心过滤装置(Amicon，截流分子量30000)将100μl IgG制品浓缩至25μl.25μl全用于单时间点因子Va检验。结果
体外凝血试验中比较来自抗磷脂病人的总IgG和来自正常对照的亲和纯化抗体延迟因子Va失活的能力。总IgG和亲和纯化抗体的结果分别见表9和图16。来自正常对照受试者的IgG和亲和纯化抗体不改变在起始凝血后20分钟观察到的因子Va的失活作用。相反，来自抗磷脂病人的IgG延迟了因子Va的失活作用(Student’s t-检验为p＜0.05)。用亲和纯化抗体也观察到对因子Va失活的相似作用。这些数据显示，人抗β2GPI抗体可通过延迟因子Va的失活作用部分产生超凝血状态。表9APS病人IgG
I.D.    20＂Va   IgG     活性
        (单位)  (mg)   (单位/mg)
7308    0.98    0.08    12.25
7309    0.85    0.06    14.17
7310    0.85    0.06    14.17
7311    0.84    0.07    12.00
7312    0.92    0.06    15.33
7313    0.82    0.06    13.67
7314    1.13    0.06    18.83
7315    0.99    0.07    14.14
7316    0.87    0.06    14.50
7317    0.92    0.08    11.50
7318    0.81    0.08    10.13
7319    0.95    0.10     9.50
7320    0.83    0.05    16.60
7321    0.84    0.07    12.00
7322    0.81    0.06    13.50
7323    0.83    0.09     9.76
7301    0.83    0.05    16.60
7302    0.87    0.05    17.40
7303    1.05    0.08    13.13
7304    1.44    0.07    20.57
7305    0.79    0.08     9.88
7306    0.90    0.07    12.86
7307    1.10    0.07    15.71
6501    1.16    0.06    19.33
6636    1.21    0.05    24.20
6625    0.86    0.10     8.60
6646    0.72    0.05    14.40
6623    1.17    0.07    16.71
6510    0.70    0.05    14.00
平均    0.93    0.07    14.33
STD     0.17    0.01     3.55
正常IgG
I.D.    20＂Va      IgG      活性
        (单位)      (mg)   (单位/mg)
N260F   0.77        0.06      12.83
N712M   0.69        0.07      9.86
N266F   0.78        0.09      8.67
N199F   0.79        0.08      9.88
N280M   0.76        0.07      10.86
平均    0.76        0.07      10.42
STD     0.039623    0.011402  1.557503
尽管为了便于理解，通过图示说明和实施例已对本发明进行了一些详述，但本领域技术人员将明显认识到可对其进行进行一定程度的变化和修改。因此，这些描述和实施例不应理解为对本发明范围的限制，本发明范围由所附的权利要求来说明。
                                序列表<110>Marquis,M.David
 Iverson,M.Gilbert
 Victoria,J.Edward
 Jones,S.David
 Linnik,Matthew<120>治疗和诊断性的结构域1β2GPI多肽及其使用方法<130>252312006900<140>未转让<141>1999-06-08<150>60/088,656<151>1998-06-09<150>60/103,088<151>1998-10-05<160>30<170>Windows Version 3.0所用的FastSEQ<210>1<211>978<212>DNA<213>人<220><221>CDS<222>(1)...(978)<400>1gga cgg acc tgt ccc aag cca gat gat tta cca ttt tcc aca gtg gtc         48Gly Arg Thr Cys Pro Lys Pro Asp Asp Leu Pro Phe Ser Thr Val Val1               5                   10                  15ccg tta aaa aca ttc tat gag cca gga gaa gag att acg tat tcc tgc         96Pro Leu Lys Thr Phe Tyr Glu Pro Gly Glu Glu Ile Thr Tyr Ser Cys
         20                  25                  30aag ccg ggc tat gtg tcc cga gga ggg atg aga aag ttt arc tgc cct        144Lys Pro Gly Tyr Val Ser Arg Gly Gly Met Arg Lys Phe Ile Cys Pro
     35                  40                  45ctc aca gga ctg tgg ccc atc aac act ctg aaa tgt aca ccc aga gta        192Leu Thr Gly Leu Trp Pro Ile Asn Thr Leu Lys Cys Thr Pro Arg Val
 50                  55                  60tgt cct ttt gct gga atc tta gaa aat gga gcc gta cgc tat acg act        240Cys Pro Phe Ala Gly Ile Leu Glu Asn Gly Ala Val Arg Tyr Thr Thr65                  70                  75                  80ttt gaa tat ccc aac acg atc agt ttt tct tgt aac act ggg ttt tat        288Phe Glu Tyr Pro Asn Thr Ile Ser Phe Ser Cys Asn Thr Gly Phe Tyr
             85                  90                  95ctg aat ggc gct gat tct gcc aag tgc act gag gaa gga aaa tgg agc        336Leu Asn Gly Ala Asp Ser Ala Lys Cys Thr Glu Glu Gly Lys Trp Ser
        100                 105                 110ccg gag ctt cct gtc tgt gct ccc atc atc tgc cct cca cca tcc ata        384Pro Glu Leu Pro Val Cys Ala Pro Ile Ile Cys Pro Pro Pro Ser Ile
    115                 120                 125cct acg ttt gca aca ctt cgt gtt tat aag cca tca gct gga aac aat        432Pro Thr Phe Ala Thr Leu Arg Val Tyr Lys Pro Ser Ala Gly Asn Asn
130                 135                 140tcc ctc tat cgg gac aca gca gtt ttt gaa tgt ttg cca caa cat gcg        480Ser Leu Tyr Arg Asp Thr Ala Val Phe Glu Cys Leu Pro Gln His Ala145                 150                 155                 160atg ttt gga aat gat aca att acc tgc acg aca cat gga aat tgg act        528Met Phe Gly Asn Asp Thr Ile Thr Cys Thr Thr His Gly Asn Trp Thr
            165                 170                 175aaa tta cca gaa tgc agg gaa gta aaa tgc cca ttc cca rca aga cca        576Lys Leu Pro Glu Cys Arg Glu Val Lys Cys Pro Phe Pro Ser Arg Pro
        180                 185                 190gac aat gga ttt gtg aac tat cct gca aaa cca aca crt tat tac aag        624Asp Asn Gly Phe Val Asn Tyr Pro Ala Lys Pro Thr Leu Tyr Tyr Lys
    195                 200                 205gat aaa gcc aca ttt ggc tgc cat gat gga tat tct ctg gat ggc ccg        672Asp Lys Ala Thr Phe Gly Cys His Asp Gly Tyr Ser Leu Asp Gly Pro
210                 215                 220gaa gaa ata gaa tgt acc aaa ctg gga aac tgg tct gcc atg cca agt        720Glu Glu Ile Glu Cys Thr Lys Leu Gly Asn Trp Ser Ala Met Pro Ser225                 230                 235                 240tgt aaa gca tct tgt aaa tta cct gtg aaa aaa gcc act gtg gtg tac        768Cys Lys Ala Ser Cys Lys Leu Pro Val Lys Lys Ala Thr Val Val Tyr
            245                 250                 255caa gga gag aga gta aag att cag gaa aaa ttt aag aat gga atg cta        816Gln Gly Glu Arg Val Lys Ile Gln Glu Lys Phe Lys Asn Gly Met Leu
        260                 265                 270cat ggt gat aaa gtt tct ttc ttc tgc aaa aat aag gaa aag aag tgt        864His Gly Asp Lys Val Ser Phe Phe Cys Lys Asn Lys Glu Lys Lys Cys
    275                 280                 285agc tat aca gag gat gct cag tgt ata gat ggc act atc gaa gtc ccc        912Ser Tyr Thr Glu Asp Ala Gln Cys Ile Asp Gly Thr Ile Glu Val Pro
290                 295                 300aaa tgc ttc aag gaa cac agt tct ctg gct ttt tgg aaa act gat gca        960Lys Cys Phe Lys Glu His Ser Ser Leu Ala Phe Trp Lys Thr Asp Ala305                 310                 315                 320tcc gat gta aag cca tgc                                       978Ser Asp Val Lys Pro Cys
            325<210>2<211>326<212>PRT<213>人<400> 2Gly Arg Thr Cys Pro Lys Pro Asp Asp Leu Pro Phe Ser Thr Val Val1               5                   10                 15Pro Leu Lys Thr Phe Tyr Glu Pro Gly Glu Glu Ile Thr Tyr Ser Cys
         20                 25                  30Lys Pro Gly Tyr Val Ser Arg Gly Gly Met Arg Lys Phe Ile Cys Pro
     35                  40                  45Leu Thr Gly Leu Trp Pro Ile Asn Thr Leu Lys Cys Thr Pro Arg Val
50                  55                  60Cys Pro Phe Ala Gly Ile Leu Glu Asn Gly Ala Val Arg Tyr Thr Thr65                  70                  75                  80Phe Glu Tyr Pro Asn Thr Ile Ser Phe Ser Cys Asn Thr Gly Phe Tyr
            85                  90                  95Leu Asn Gly Ala Asp Ser Ala Lys Cys Thr Glu Glu Gly Lys Trp Ser
       100                  105                 110Pro Glu Leu Pro Val Cys Ala Pro Ile Ile Cys Pro Pro Pro Ser Ile
    115                 120                 125Pro Thr Phe Ala Thr Leu Arg Val Tyr Lys Pro Ser Ala Gly Asn Asn
130                 135                 140Ser Leu Tyr Arg Asp Thr Ala Val Phe Glu Cys Leu Pro Gln His Ala145                 150                 155                 160Met Phe Gly Asn Asp Thr Ile Thr Cys Thr Thr His Gly Asn Trp Thr
            165                 170                 175Lys Leu Pro Glu Cys Arg Glu Val Lys Cys Pro Phe Pro Ser Arg Pro
        180                 185                 190Asp Asn Gly Phe Val Asn Tyr Pro Ala Lys Pro Thr Leu Tyr Tyr Lys
    195                 200                 205Asp Lys Ala Thr Phe Gly Cys His Asp Gly Tyr Ser Leu Asp Gly Pro
210                 215                 220Glu Glu Ile Glu Cys Thr Lys Leu Gly Asn Trp Ser Ala Met Pro Ser225                 230                 235                 240Cys Lys Ala Ser Cys Lys Leu Pro Val Lys Lys Ala Thr Val Val Tyr
            245                 250                 255Gln Gly Glu Arg Val Lys Ile Gln Glu Lys Phe Lys Asn Gly Met Leu
        260                 265                 270His Gly Asp Lys Val Ser Phe Phe Cys Lys Asn Lys Glu Lys Lys Cys
    275                 280                 285Ser Tyr Thr Glu Asp Ala Gln Cys Ile Asp Gly Thr Ile Glu Val Pro
290                 295                 300Lys Cys Phe Lys Glu His Ser Ser Leu Ala Phe Trp Lys Thr Asp Ala305                 310                 315                 320Ser Asp Val Lys Pro Cys
            325<210>3<211>192<212>DNA<213>人<220><221>CDS<222>(1)...(192)<400>3gga cgg acc tgt ccc aag cca gat gat tta cca ttt tcc aca gtg gtc         48Gly Arg Thr Cys Pro Lys Pro Asp Asp Leu Pro Phe Ser Thr Val Val1               5                   10                  15ccg tta aaa aca ttc tat gag cca gga gaa gag att acg tat tcc tgc         96Pro Leu Lys Thr Phe Tyr Glu Pro Gly Glu Glu Ile Thr Tyr Ser Cys
         20                  25                  30aag ccg ggc tat gtg tcc cga gga ggg atg aga aag ttt arc tgc cct        144Lys Pro Gly Tyr Val Ser Arg Gly Gly Met Arg Lys Phe Ile Cys Pro
     35                  40                  45crc aca gga ctg tgg ccc arc aac act ctg aaa tgt aca ccc aga gta        192Leu Thr Gly Leu Trp Pro Ile Asn Thr Leu Lys Cys Thr Pro Arg Val
 50                  55                  60<210>4<211>64<212>PRT<213>人<400>4Gly Arg Thr Cys Pro Lys Pro Asp Asp Leu Pro Phe Ser Thr Val Val1               5                  10                  15Pro Leu Lys Thr Phe Tyr Glu Pro Gly Glu Glu Ile Thr Tyr Ser Cys
        20                  25                  30Lys Pro Gly Tyr Val Ser Arg Gly Gly Met Arg Lys Phe Ile Cys Pro
    35                  40                  45Leu Thr Gly Leu Trp Pro Ile Asn Thr Leu Lys Cys Thr Pro Arg Val
50                  55                  60<210>5<211>6<212>PRT<213>人<400>5Cys Thr Pro Arg Val Cys1               5<210>6<211>6<212>PRT<213>人<400>6Phe Ser Thr Val Val Pro1               5<210>7<211>7<212>PRT<213>人<400>7Lys Pro Pro Asp Asp Leu Pro1               5<210>8<211>6<212>PRT<213>人<400>8Gly Arg Thr Cys Pro Lysl               5<210>9<211>6<212>PRT<213>人<400>9Thr Leu Lys Cys Thr Pro1               5<210>10<211>6<212>PRT<213>人<400>10I1e Cys Pro Leu Thr Gly1               5<210>11<211>6<212>PRT<213>人<400>11Phe Ile Cys Pro Leu Thr1               5<210>12<211>6<212>PRT<213>人<400>12Ile Thr Tyr Ser Cys Lys1               5<210>13<211>45<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>13aaaccacctt aatggtgatg gtgatggtgg ccacatggct ttaca45<210>14<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>14gacatactct gggtgtccgt cctgcaatag c31<210>15<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>15tggagggcag atgatccgtc ctgcaatagc30<210>16<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>16gaatgggcat tttacttccc gtcctgcaat agc33<210>17<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>17aggtaattta caagatgccc gtcctgcaat agc33<210>18<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>18atggtgatgg tggccacaac ttggcatggc30<210>19<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成构建体<400> 19
atggtgatgg tggccgcatt ctggtaattt ag
32<210> 20<211> 5<212>PRT<213>人工序列<220><223>从β2GPI(SEQ ID NO:2)中缺失第3-60位氨基酸<400> 20
Gly Arg Thr Pro Arg
1               5<210> 21<211> 5<212>PRT<213>人工序列<220><223>从β2GPI(SEQ ID NO：2)中缺失第3-120位氨基酸<400> 21
Gly Arg Ile Ile Cys
1               5<210> 22<211> 5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>从β2GPI(SEQ ID NO:2)中缺失第3-182位氨基酸
<400>22
    Gly Arg Glu Val Lys
 1               5
<210>23
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从β2GPI(SEQ ID NO:2)中缺失第3-242位氨基酸
<400>23
    Gly Arg Ala Ser Cys
 1               5
<210>24
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从β2GPI(SEQ ID NO:2)中缺失第242-326位氨基酸或第182-326位氨基酸或第165-326位氨基酸或第123-326位氨基酸
<400>24
    Gly Arg Thr Cys Pro
1               5
<210>25
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220><223>合成构建体<400>25ctataaatac ggatcccggg aattcg26<210>26<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>26gcagctggcc aactctgggt gtacatttca gagtg35<210>27<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>27gcagctggcc aatgatggga gcacagagag gaag34<210>28<211>63<212>PRT<213>人<400>28Gly Arg Thr Cys Pro Lys Pro Asp Asp Leu Pro Phe Ser Thr Val Val1               5                  10                  15Pro Leu Lys Thr Phe Tyr Glu Pro Gly Glu Glu Ile Thr Tyr Ser Cys
        20                  25                  30Lys Pro Gly Tyr Val Ser Arg Gly Gly Met Arg Lys Phe Ile Cys Pro
    35                  40                  45Leu Thr Gly Leu Trp Pro Ile Asn Thr Leu Lys Cys Thr Pro Arg
50                  55                  60<210>29<211>62<212>PRT<213>人<400>29Arg Thr Cys Pro Lys Pro Asp Asp Leu Pro Phe Ser Thr Val Val Pro1               5                   10                 15Leu Lys Thr Phe Tyr Glu Pro Gly Glu Glu Ile Thr Tyr Ser Cys Lys
        20                  25                  30Pro Gly Tyr Val Ser Arg Gly Gly Met Arg Lys Phe Ile Cys Pro Leu
    35                  40                  45Thr Gly Leu Trp Pro Ile Asn Thr Leu Lys Cys Thr Pro Arg
50                  55                  60<210>30<211>65<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>30Gly Arg Thr Cys Pro Lys Pro Asp Asp Leu Pro Phe Ser Thr Val Val1               5                   10                 15Pro Leu Lys Thr Phe Tyr Glu Pro Gly Glu Glu Ile Thr Tyr Ser Cys
        20                  25                  30Lys Pro Gly Tyr Val Ser Arg Gly Gly Met Arg Lys Phe Ile Cys Pro
    35                  40                  45Leu Thr Gly Leu Trp Pro Ile Asn Thr Leu Lys Cys Thr Pro Arg Val
50                  55                  60Cys65

Claims (44)

1．含结构域1β2GPI多肽的多肽，其中所述多肽可特异结合β2GPI-依赖型抗磷脂抗体，且该多肽不是由多肽SEQ ID NO:2(图1)组成；也不是由β2GPI的结构域1、2和3组成；也不是由β2GPI的结构域1、2、3和4组成。
2．权利要求1的多肽，其中结构域1β2GPI多肽含多肽SEQ IDNO:4(图2)。
3．权利要求1的多肽，其中结构域1β2GPI多肽选自包括SEQ IDNO:5-12的组。
4．权利要求1的多肽，其中结构域1 β2GPI多肽含SEQ ID NO:1的约第1-66位氨基酸。
5．权利要求1的多肽，其中结构域1β2GPI多肽含SEQ ID NO:4的约第1-59位氨基酸。
6．含权利要求1之多肽的融合多肽。
7．含权利要求1之多肽的聚合多肽。
8．权利要求1的多肽，其中所述多肽缺乏T细胞表位，所说的T细胞表位能在具β2GPI依赖型抗磷脂抗体的个体中激活T细胞。
9．权利要求8的多肽的偶联物。
10．权利要求9的偶联物，其中该偶联物包含标记。
11．权利要求9的偶联物，其中该偶联物包含价键平台分子。
12．权利要求11的偶联物，其中的平台分子是蛋白质类的。
13．权利要求11的偶联物，其中的平台分子是非蛋白质类的。
14．权利要求11的偶联物，其中价键平台分子群的分子量是均匀的。
15．权利要求11的偶联物，其中平台分子通过硫醚键与多肽连接。
16．权利要求11的偶联物，其中平台分子通过肟键与多肽连接。
17．权利要求11的偶联物，其中平台分子是
18．权利要求11的偶联物，其中平台分子是
Figure A9980841500032
19．权利要求11的偶联物，其中偶联物是
Figure A9980841500033
其中D1是β2GPI结构域1多肽。
20．权利要求11的偶联物，其中偶联物是
Figure A9980841500034
其中D1是β2GPI结构域1多肽。
21．编码权利要求1多肽的分离的天然存在的多核苷酸。
22．编码权利要求1多肽的非天然存在的多核苷酸。
23．编码权利要求8多肽的分离的天然存在的多核苷酸。
24．编码权利要求8多肽的非天然存在的多核苷酸。
25．含权利要求21之多核苷酸的表达载体。
26．含权利要求21之多核苷酸的克隆载体。
27．用权利要求21之多核苷酸转化了的宿主细胞。
28．结构域1β2GPI多肽的模拟物，其中该模拟物可特异结合结构域1β2GPI多肽能特异结合的β2GPI-依赖型抗磷脂抗体。
29．权利要求28的模拟物，它是一种多肽。
30．权利要求29的模拟物，它缺乏T细胞表位，所说的T细胞表位能在具β2GPI依赖型抗磷脂抗体的个体中激活T细胞。
31．用于检测可与结构域1β2GPI多肽特异结合的抗体，以合适的包装包含权利要求1之多肽的试剂盒。
32．用于检测凝血的试剂盒，其中以合适的包装包含权利要求1之多肽。
33．含有效量的权利要求8之多肽的组合物，其中有效量是足以诱发耐受性的量。
34．权利要求33的组合物，其中还包括药用可接受的赋形剂。
35．含有效量的权利要求1之多肽的组合物，其中有效量是足以检测β2GPI依赖型抗磷脂抗体的量。
36．检测样品中可与权利要求1之多肽特异结合的抗体的方法，包括(a)在允许形成稳定的抗原-抗体复合物的条件下使样品中的抗体与权利要求1的多肽接触；和(b)检测步骤(a)中形成的稳定复合物(如果有的话)。
37．权利要求36的方法，其中的抗体是β2GPI-依赖型抗磷脂抗体。
38．纯化β2GPI-依赖型抗磷脂抗体的方法，包括在允许稳定的抗原-抗体复合物形成的条件下使生物样品与权利要求1的多肽接触，并收获形成的复合物(如果有的话)。
39．诱发个体耐受性的方法，包括将含权利要求8之多肽的有效量组合物施用于该个体。
40．权利要求39的方法，其中的个体是人。
41．诱发个体耐受性的方法，包括将含权利要求11之偶联物的有效量组合物施用于该个体。
42．权利要求41的方法，其中的个体是人。
43．权利要求42的方法，其中所述多肽包含SEQ ID NO:4的约第1-60位氨基酸的序列。
44．检测β2GPI-依赖型抗磷脂抗体介导的凝血的方法，包括以下步骤：
(a)用来自个体的合适生物学样品进行第一个凝血实验，其中实验中添加权利要求1的多肽；
(b)在缺乏权利要求1之多肽的条件下用来自该个体的合适生物学样品进行第二个凝血实验；
(c)比较步骤(a)和(b)的实验结果，其中结果中存在差异表明了β2GPI-依赖型抗磷脂抗体对凝血的介导。
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