CN1221428A - Pigr生物大分子特征性高级结构和相关配体的细胞内化作用 - Google Patents

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Abstract

与细胞的聚免疫球蛋白受体(pIgR)的生物大分子特征性高级结构特异性结合的成分和方法,条件是该配体在生理条件下基本上不结合pIgR的分泌成分。该配体可以定靶到、进入或通过细胞,并且可以包含生物活性成分。

Description

PIGR生物大分子特征性高级结构和相关配体 的细胞内化作用
                          发明领域
本发明总的来说涉及将配体特异性结合到聚免疫球蛋白受体的生物大分子特征性高级结构区并内化进入到细胞中或者经细胞转的组合物和方法。
                          发明背景
在医药和生物制药工业中最富有挑战性的问题之一是将药物在体内运送通过各种各样的半透膜。特别是在大分子的情况下，使花费有效或使治疗方便的障碍经常是由于缺乏合适的药物运送系统。而该问题指明药物的生产是否是经济易行的。因此对于替代的运送系统的研究经常与新药本身的研究相匹敌。
基因转移方法可以视为是大分子药物运送的一个范例。这些方法可以分成三种类型：物理方法(例如电穿孔、直接的基因转移和粒子轰击)，化学方法(例如类蛋白质、微乳状液和脂质体)，和生物学方法(例如病毒产生的载体和受体介导的吸收)。生物转移方法中，受体介导的吸收是特别有希望的。将配体定向于胞吞受体可作为将配体运送到细胞中的一种方法。但是，受体介导的系统的一个缺点是其一般依赖于静脉内给药，这严重限制了它的应用。粘膜上皮细胞系是易进入组织的细胞，例如在上呼吸道和胃肠道中发现的那些。这些细胞的易进入性使其成为药物运送的令人注意的焦点。参见，例如Ferkol等，临床研究杂志(J.Clin.Invest.)92:2394-2400(1993)；Ferkol等，临床研究杂志(J.Clin.Invest.)95:493-502(1995)。已经报道过抗体的从上皮细胞腔到基底外侧表面的逆行运输，尽管是在非常低的水平。Breitfeld等，细胞生物学杂志(J.Cell Biology)109:475-486(1989)。在该项研究中，穿过细胞的运动之后是将抗体结合到聚免疫球蛋白受体(pIgR)的分泌成分上。相对于基底外侧至顶端运输的水平，Breitfeld等报道少于5％的运输在自然界是逆行的。正常水平逆运输减小了分泌成分作为将生物活性成分运送到细胞中的方法的实用性。此外，由于腔中富含裂解的pIgR，配体与裂解的pIgR结合而不是与细胞表面完整的pIgR结合，这将减小pIgR逆运输作为药物运送机理的实用性。
因此，本领域所需要的是以高效率将配体运送到细胞表面中或者运送过细胞表面的方法。更具体地说，本领域所需要的是将大分子运送到、进入或通过胃肠道或呼吸道细胞系的方法。本发明提供这些和其它的利益。
                           发明概述
一方面，本发明涉及与细胞特异性结合的聚免疫球蛋白受体(pIgR)的生物大分子特征性高级结构的配体，前提是该配体在生理条件下基本上不结合pIgR的分泌成分。一般情况下，该抗体只受特异性结合生物大分子特征性高级结构。在一个实施方案中，该配体是一种抗体，优选人源化的抗体。在另一个实施方案中，该配体是抗体的重组单链可变区片段。在又一个实施方案中，该配体与受体裂解位点邻近的细胞膜的头33个氨基酸中的胞外表位结合。
该配体可以包含结合生物大分子特征性高级结构的结合成分和生物活性成分，例如核酸、蛋白质、放射性同位素、脂质和碳水化合物。生物活性成分包括消炎药、抗感染剂、反义寡核苷酸、抗生素和抗感染剂。在一个实施方案中，生物活性成分是编码野生型囊性纤维化跨膜传导调节蛋白的核酸。在一个优选的实施方案中，该细胞是上皮细胞，最优选是哺乳动物的上皮细胞。
另一方面，本发明涉及通过将配体与细胞的聚免疫球蛋白受体的生物大分子特征性高级结构结合，从而将配体导入表达聚免疫球蛋白受体的细胞中的方法，前提是该配体在生理条件下基本上不结合pIgR的分泌成分。在一个实施方案中，该配体与细胞顶端表面处的生物大分子特征性高级结构结合，在另一个实施方案中，配体被胞转到细胞的基底外侧表面，并且在基底外侧表面处从生物大分子特征性高级结构释放。
另一方面，本发明涉及将配体与表达聚免疫球蛋白受体的细胞结合的方法，包括配体结合受体的生物大分子特征性高级结构的步骤，前提是该配体在生理条件下基本上不结合pIgR的分泌成分。在一个实施方案中，该配体在结合后被导入细胞。通过参考本发明各方面，可以实现本发明的各种实施方案。
在各种体内和体外应用中，本发明可以用来将治疗组合物或诊断组合物运输到、进入或通过粘膜上皮细胞。因此本发明提供了将核酸或蛋白质转入上皮细胞中的高效方便的方法。
                     优选实施方案的描述
本发明涉及与细胞的聚免疫球蛋白受体(pIgR)特异性结合的生物大分子特征性高级结构的配体，前提是该配体在生理条件下基本上不结合pIgR的分泌成分。本发明特别提供将配体结合和导入到表达pIgR的细胞中的方法。
运输到上皮细胞顶端表面后，大部分pIgR裂解并释放分泌成分。令人惊奇地和出人意料地发现，腔中完整pIgR的裂解留下剩余的完整pIgR胞外域(即“生物大分子特征性高级结构”)；此外，生物大分子特征性高级结构仍然是容易结合的，尽管蛋白水解酶一般富含于腔周围。对与pIgR生物大分子特征性高级结构结合的配体的结合、胞吞和胞转的能力部分提供了这里所公开的和权利要求书所要求的本发明。
本发明具有的实用性是它可作为将治疗组合物或诊断组合物运输给、进入(胞吞作用)或经过(胞转作用)表达pIgR的细胞的方法。因此本发明可以用来运输生物活性成分，例如蛋白质、核酸、或特异于pIgR表达细胞的可检测标记。本发明也提供从病理研究中的混合的细胞种群中标记和区分上皮细胞的方法。此外，因为相对于正常上皮来说，癌上皮中的pIgR表达减少，所以pIgR的标记具有作为内窥镜方法或放射方法中的诊断辐助物的实用性。另外，治疗配体与pIgR的结合在延长其在各种途径的腔中的时间和提高其效力方面具有实用性。
                             定义
在这里除非另有说明，这里所使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属技术领域的技术人员所共同理解的含义相同的。Singleton等(1994)，微生物和分子生物学词典(Dictionary of Microbiology and MolecularBiology)，第二版，John Wiley和Sons(纽约)，和Hale和Marham(1991),The Harper Collins Dictionary of Biology,Harper Perennial,NY，提供给技术人员本发明所使用的很多术语的通用词典。氨基酸在这里可以通过IUPAC-IUB生物化学命名委员会所建议的公知的三字母符号或一字母符号表示。类似地，核苷酸可以通过其普遍接受的单字母码表示。为本发明目的，下文定义下面的术语。
“配体”或“配体结合部分”是指能特异性与聚免疫球蛋白受体(pIgR)结合的所有分子。配体包括但不限于抗体、蛋白质、肽、核酸、脂质、和碳水化合物。
“生物活性成分”是指体内直接引起或抑制细胞转录、翻译、受体结合、主动或被动转运、细胞信号、信号转导、细胞分裂、细胞分化、细胞死亡、细胞粘连、细胞运动、细胞形态、代谢、酶活性、细胞程序性死亡、蛋白质降解、蛋白质运动(例如分泌)、蛋白质稳定性或磷酸化作用等增加或减少的化合物。生物活性成分也包括使上述事件容易进行的诊断组合物。
“结合特异性”或“特异性结合”或“被结合”或“结合”是指配体全部或部分地与带有特定靶分子或标记物的细胞或组织优先结合，而不与没有这种靶分子的细胞或组织结合。当然可理解在分子和非靶物细胞或组织之间可能发生一定程度的非特异性相互作用。不管怎样，根据通过靶分子特异性识别介导可以区别特异性结合。一般情况下，特异性结合在被运输的分子与带有靶分子的细胞之间的结合比在结合的分子与没有该靶分子的细胞之间的结合强得多。与没有耙分子或标记物的细胞或组织相比，特异性结合产生的与带有靶分子的细胞或组织结合的配体的量的增加(每单位时间)一般大于2倍，优选大于5倍，更优选大于10倍，最优选大于100倍。
“生物大分子特征性高级结构”是指相应于构成分泌成分的pIgR片段裂解之后与细胞结合的pIgR区的聚免疫球蛋白受体(pIgR)的胞外成分。不管相应于分泌成分的pIgR片段是否从pIgR裂解，生物大分子特征性高级结构都存在。
“pIgR”或“聚免疫球蛋白受体”是指在粘膜上皮细胞中表达的受体，粘膜上皮细胞包括呼吸道上皮细胞、粘膜下腺细胞、肠细胞、鼻上皮、肺、口腔粘膜、尿道和生殖道上皮和缔结组织并且参与了在二聚体免疫球蛋白A(dlgA)和/或五聚体IgM的基底外侧至顶端的胞转作用。
“基本上不结合”是指不多于15％的特异性结合靶分子的配体结合特定的非靶分子。更优选地，不多于10％结合非靶分子，更进一步优选地，不多于5％，最优选不多于1％。
“分泌成分”是指一般在基底外侧至顶端胞转之后裂解的pIgR的胞外部分。一般情况下，分泌成分包括pIgR的二聚体IgA(dIgA)结合部分。分泌成分一般释放到腔中，其上不一定有dIgA与之结合。
“生理条件”是指具有使感兴趣的细胞获得营养或生长的条件(例如温度、pH和渗透性)的胞外环境。
“抗体”是指通过体外或体内产生体液应答而获得的免疫球蛋白分子，并且包括单克隆抗体和多克隆抗体。该术语也包括遗传工程形式，例如嵌合抗体(例如人源化小鼠抗体)，异源接合抗体(例如双特异性抗体)，和重组单链Fv片段(scFv)。术语“抗体”也包括抗体的抗原结合形式(例如Fab,F(ab)2)。
“人源化抗体”是指包括非人氨基酸序列但是其恒定区已经被改变以减少人体的免疫原性的抗体。
“野生型囊性纤维化跨膜传导调节蛋白”是指囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)的一种功能形式。Riordan等，科学，245:1066-1073(1989)。
“顶端表面”是指完整的pIgR在胞吞之后从基底外侧表面胞转到该细胞的细胞的表面。一般情况下，该细胞的顶端表面与腔相连并且其中完整的pIgR被裂解后，释放出分泌成分。
“基底外侧表面”是指一个细胞表面，完整pIgR在内质网中合成之后从该细胞运输到高尔基复合物并且通过该复合物。
“生物大分子特征性高级结构表面”是指该生物大分子特征性高级结构的胞外区。
“释放”是指配体全部或部分与其靶分子特异性结合中的干扰。
“胞转”或“胞转作用”是指通过胞内途径从细胞的一个质膜到另一个的运输。一般情况下，胞转作用发生在从基底外侧至顶端或者从顶端至细胞的基底外侧细胞质膜。
“细胞膜近侧”是指紧邻或邻近细胞膜。
“胞外”是指从围绕细胞的脂质双层向外延展的区域。
                         pIgR的鉴定
在多种分类学多样性物种中已经鉴定了聚免疫球蛋白受体的核酸和氨基酸序列。参见，Piskurich等，免疫学杂志(Joumal of Immunology)154:1735-1747(1995)。从其它物种中鉴定pIgR可以通过任何本领域熟知的方法进行。例如，使用公开的pIgR序列，可以构建对于pIgR的核酸探针。该探针一般应该从pIgR的保守区产生。该探针与基因组或cDNA库的杂交可以用来鉴定未知物种中的pIgR。本领域技术人员应该理解pIgR探针的核酸序列一般应该是与该被探测的物质的最相关的物种。关于核酸杂交的详细指南见Tijssen(1993)，生物化学和分子生物学中的实验技术--与核酸探针的杂交，第一部分，第二章，“杂交原理和核酸探针分析策略综述”(LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with NucleicAcid Probes。PartI,Chapter2“Overview of principles of hybridization andstrategy of nucleic acid probe assays”),Elsevier，纽约。
在另一项研究中，pIgR或者其肽片段(例如分泌成分)可以用来产生筛选表达文库的抗体。参见，例如，Ferkol等，临床研究杂志(J.Clin.Invest),95:493-502(1995)。在下面的文献中可以发现本领域技术人员熟知的这些方法和其它方法：Berger和Kimmel，分子克隆技术指南，酶学方法(Molecular Cloning Techniques,Method in Enzymology),152卷，学术出版社，Inc.,SanDiego,CA(Berger)；Sambrook等(1989)，分子克隆-实验手册(Molecular Cloning-A Laboratory Manual)(第二版)，1-3卷；和分子生物学常用方法(Current Protocols in Molecular Biology),F.M.Ausubel等编著，Current Protocols,a joint venture between Greene Pubilishing Associates,Inc.and John Wiley & Sons,Inc.(1994补充本)(Ausubel)。通过这些研究，根据构建推定的pIgR蛋白质的抗体，并且证明这些抗体结合具有pIgR特征(例如存在于上皮细胞表面，结合二聚体IgA或五聚体IgM等)的蛋白质的能力，来证明核酸或蛋白质编码pIgR的性质。
                鉴定生物大分子特征性高级结构
生物大分子特征性高级结构可以通过本领域技术人员公知的各种的技术鉴定。已经鉴定了推定的识别pIgR裂解位点从而确定生物大分子特征性高级结构氨基末端的七肽共有序列。鉴定其中Xaa是极性或带电荷氨基酸的序列Phe-Ala-Xaa-Glu(SEQ ID NO:1)正是该推定的裂解位点。Piskurich等，免疫学杂志154:1735-1747(1995)。在该共有序列位点处的裂解释出分泌成分并且确定其羧基端。分泌成分的羧基端可以通过第二次裂解(例如外肽酶或内肽酶活性)而改变，如上得到第二羧基端。但是，最初确定生物大分子特征性高级结构氨基端和分泌成分的羧基端的酰胺键可以通过序列对比和鉴定裂解共有序列来鉴定。
用于序列对比的对比方法是本领域公知的。优选的用于对比的序列对比通过下面的方法进行：Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2:482的局部同源性规则；Needleman和Wunsch(1970)，分子生物学杂志48:443的同源性对比规则；Pearson和Lipman(1988)，美国国家科学院院刊85:2444的相似性寻找方法研究；这些规则的计算机执行程序(包括但不限于CLUSTAL in the PC/Gene程序，Intelligenetics,Mountain View,California,GAP,BESTFIT,FASTA，和TFASTA,Wisconsin GeneticsSoftware Package,Genetics Computer Group(GCG),575 Science Dr。,Madison,Wisconsin,USA)；CLUSTAL程序由Higgins和Sharp(1988),基因，73:237-244和Higgins和Sharp(1989)CABIOS5:151-153；Corpet等(1988)，核酸研究16,10881-90；Huang等(1992)计算机在生物科学中的应用8,155-65，和Pearson等(1994)分子生物学方法24,307-31充分地说明。序列对比还经常通过检查和人工比较来进行。
在另一项研究中，分泌成分可以从顶端腔里的流体中分离(例如奶液或胆汁)，并且通过本领域技术人员公知的氨基酸测序方法测序，例如通过Edman降解，或者质谱。Eiffert等，Hoppe-Seyler’s Z.Physiol.Chem.365:1489-1495(1984)。在通过第二次裂解确定各种第二羧基末端时，可以鉴定与裂解位点相邻的羧基端氨基酸。
相应于所选物种pIgR生物大分子特征性高级结构的肽包括：
小鼠：Glu-Arg-Glu-Ile-Gln-Asn-Val-Arg-Asp-Gln-Ala-Gln-Glu-Asn-Arg-Ala-Ser-Gly-Asp-Ala-Gly-Ser-Ala-Asp-Gly-Gln-Ser-Arg-Ser-Ser Ser-Ser-Lys (SEQ IDNO:2)
大鼠：Glu-Arg-Glu-Ile- Gln-Asn-Ala-Gly-Asp-Gln-Ala-Gln-Glu Asn-ArgAla-Ser-Gly-Asn-Ala-Gly-Ser-Ala-Gly-Gly-Gln-Ser-Gly-Ser-Ser-Lys(SEQ ID NO:3)
人：Glu-Lys-Ala-Val-Ala-Asp-Thr-Arg-Asp-Gln-Ala-Asp-Gly-Ser-Arg-Ala-Ser-Val-Asp-Ser-Gly-Ser-Ser-Glu-Glu-Gln-Gly-Gly-Ser-Ser-Arg (SEQ IDNO:4)
牛：Glu-Ser-Val-Lys-Asp-Ala-Ala-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Pro-Ala-Asp-Pro-Gly-Arg-Pro-Thr-Gly-Tyr-Ser-Gly-Ser-Ser-Lys(SEQ ID NO:5)
兔：Leu-Ala-Glu-Val-Ala-Val-Gln-Ser-Ala-Glu-Asp-Pro-Ala-Ser-Gly-Asp-Pro-Ala-Ser-Gly-Ser-Arg-Ala-Ser-Val-Asp-Ser-Gly-Ser-Ser-Glu-Glu-Gln-Gly-Gly-Ser-Ser-Arg-Ser-Lys (SEQ ID NO:6)
                       表达pIgR的细胞
本发明广泛涉及真核生物细胞。本发明pIgR表达细胞优选哺乳动物细胞，更优选正常分泌IgA的哺乳动物上皮细胞。哺乳动物细胞也可以用从一种或几种期望的物种分离的，合成的或产生的编码pIgR的核酸转染。哺乳动物细胞中转染和表达基因的方法是本领域公知的。用病毒载体转导细胞包括，例如，在引起感染所必须的条件和浓度下，将病毒与病毒宿主范围内的细胞孵育。参见，例如，酶学方法，vol.185，科学出版社，Inc.,San Diego,CA(D.V.Goeddel，编著)(1990)或M.Krieger，基因转移和表达--实验手册，StocktonPress，纽约，NY,(1990)，以及其中所引的文献。
在本发明中使用的细胞包括细胞系和来自组织或血液样品的培养的细胞的培养是本领域公知的。Freshney(动物细胞培养，基础技术手册，第三版，Wiley-Liss，纽约(1994))及其中的文献提供了细胞培养的一般性指南。编码来自期望物种的pIgR的核酸序列可以在多种真核宿主细胞中表达，包括酵母和多种高级真核细胞，例如COS、CHO和Hela细胞系和骨髓瘤细胞系以及MDCK和人结肠癌产生的细胞如Caco2。重组蛋白基因被可操作地连接到每一个宿主的合适的表达调控序列上。对于真核细胞，调控序列包括启动子并优选包括一个增强子，该增强子例如从免疫球蛋白基因SV40、巨细胞病毒等产生聚腺苷酸化序列，并且可以包括剪切供体和受体序列。
              配体与生物大分子特征性高级结构结合
特定的与生物大分子特征性高级结构结合的配体对本发明并不关键，在本发明中可以使用各种各样的配体。有许多构建和选择配体的方法是本领域公知的，所述配体是例如具有所期望的特异性结合特征的核酸、蛋白质或肽(统称为肽)或者抗体，或者小的有机物或无机物(例如美国专利5143854；WO90/15070；WO92/10092；WO96/11878)。优选地，本发明配体在生理条件下与生物大分子特征性高级结构结合，而基本上不与pIgR的分泌成分结合。更优选地，本发明配体在生理条件下只特定地与生物大分子特征性高级结构结合。典型的生理条件随组织的不同而不同。但是，典型的生理条件可在哺乳动物胃肠道或呼吸道中获得，但哺乳动物不限于人。选择配体来结合该生物大分子特征性高级结构头第6、9、12、15、18、21、24、27、30、或33膜近侧氨基酸内所包含的胞外配体结合位点(“表位”)。
可以构建抗体，包括多克隆抗体，单克隆抗体，或重组单链Fv抗体，用作本发明中的配体。产生多克隆抗体和单克隆抗体的方法是本领域公知的。参见，例如，Coligan(1991)，免疫学常用方法Wiley/Greene,NY；和Harlow和Lane(1989)抗体：实验手册，Cold Spring Harbor出版社，NY；Stites等(编著)基础和临床免疫学(第4版)，Lange Medical Publications,LosAltos,CA，及其中文献；Goding(1989)，单克隆抗体：原理和应用(第二版)，科学出版社，纽约，纽约州；和Kohler和Mistein(1975)，自然，256:495-497；参见，Huse等(1989)，科学246:1275-1281；和Ward等(1989)，自然341:544-546。Birch和Lennox，单克隆抗体：原理和应用，Wiley-Liss，纽约，纽约州(1995)。
其它用于抗体或肽配体制备的合适的技术包括在噬菌体或类似载体中选择重组抗体/肽的文库。生物大分子特征性高级结构高亲和性抗体和肽可以通过使用在噬菌体表面表达重组单链Fv(scFv)片段或肽配体的噬菌体展示方法来快速分离。简言之，编码噬菌体表面蛋白的基因被改变，以使在携有该基因的噬菌体表面上被表达为融合蛋白的抗体或肽基因的插入。表达期望的抗体或肽配体的噬菌体可以通过其对于生物大分子特征性高级结构的亲和性/亲和力来选择性地富集和分离。编码配体的DNA被包装在相同噬菌体中，这于是使编码配体的基因分离。多种这样的方法在文献中有充分的讨论并且是本领域技术人员熟知的。参见，例如，Winter等，Annu.Rev.Immunol.12:433-455(1994)；Mark等，J.Mol.Biol.222:581-597(1991)；Vaughan等Nature Biotechnology 14:309-314(1996)，美国专利号4642334；4816397；4816567；4704692；WO86/01533；WO88/09344；WO89/00999；WO90/02809；WO90/04036；EP0324162；EP0239400。
在化学肽合成中，称之为“分裂，偶联和重组”(DCR)的方法已经被用来产生组合肽文库。参见，例如，Furka等，Int.J.Pept.Protein Res.37:487-493(1991)和Houghten等，自然354:84-86(1991)。作为对DCR的替代方法，通过直接偶联单体混合物也制备了肽混合物。参见，例如Rutter等，美国专利5010175。有建议用这种方法来制备其它线性聚合物例如“肽类似物”的混合物。参见，Simon等，美国国家科学院院刊89:9367-9371(1992)。在寡核苷酸合成中，通过例如在合成中的特定步骤中将等摩尔单体混合物给与寡核苷酸聚合物，来制备寡核苷酸产物的“简并的”或“摆动”混合物。参见，Atkinson和Smith，“寡核苷酸合成实用方法”，1984,IRL出版社，Oxford,M.Gait编著，pp.35-81。这些合成肽或寡核苷酸的方法提供用于实验的大量的化合物，其如果是活性的，则可以容易地鉴定。
优选地，例如通过将配体中存在的自身(自身的)序列数目最大化来构建配体以将宿主的免疫原性最小化。因此，优选具有非异源基因可变区的嵌合抗体。特别优选的是，使用其中不包括异源基因部分的抗体，或者基本上限制为人源化抗体互补决定区。
                     配体结合和试验
配体与pIgR生物大分子特征性高级结构的结合(即接触)可以在分泌成分裂解之前或之后发生；并且该配体可以在基底外侧或顶端表面处结合。因此，配体可以在基底外侧或顶端被胞吞，或者在顶端至基底外侧，或基底外侧至顶端进行胞转作用。配体或其任何元件的结局将会根据其物理-化学性质而不同。因此，可以选择或设计配体的性质以在细胞表面、核体内或者在胞转之后执行所期望的功能。例如，改变配体对蛋白酶解或还原环境的敏感性，可以用来测定结合的、内化的、或通过细胞运输的配体的分布。如果需要，可以设计配体以在结合或胞转之后仍然特异性地结合于细胞上，或者释放到胞外周围中。因此根据需要，可以设计或选择配体所有的不同元件的性质，以获得不同程度的亲和性、稳定性、或者不同胞内区室或细胞表面处的活性，这些元件包括结合成分、生物活性成分或接头。
                    A．配体结合的体外试验
配体与生物大分子特征性高级结构的体外结合一般通过测定哺乳动物上皮细胞中结合的配体的胞吞作用或胞转作用来测定。“胞吞作用”一般指细胞例如通过吞噬作用或胞饮作用吸收物质的现象。受体介导的胞吞作用提供了引起细胞吸收结合到细胞表面受体上的物质的有效方法。参见，Wu和Wu(1987)，生物化学杂志262:4429-4432；Wagner等(1990)美国国家科学院院刊87:3410-3414，和EP-A10388758。任何测定胞吞作用的已知的方法都可以用来测试结合。例如，结合、胞转作用和内化作用测试详细描述于Breiftfeld等，细胞生物学杂志，109:475-486(1989)。
顶端胞吞作用一般通过下面的方法测定，在4℃下，将配体例如Fab片段与Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞的顶端表面处的生物大分子特征性高级结构结合，温热至37℃保持短时间(0-10分钟)，然后将细胞冷却到4℃，然后测定。MDCK细胞中pIgR表达的方法是本领域公知的。Breitfeld等，细胞生物学方法，32:329-337(1989)。保留在表面上的Fab通过在pH2.3下剥离而去除。分子内Fab是剥离后仍然结合于细胞上的片段，而表面结合Fab是通过酸洗而去除的那些片段。非特异性粘合的对照物包括使用没有以pIgR转染的免疫前Fab和/或MDCK细胞。
通过使MDCK细胞在4℃下结合顶端表面处的Fab，温热至37℃保持0-240分钟，然后测定运输到基底外侧基质中的Fab的量，可以容易测定胞转作用。基底外侧运输的Fab的量相当于保留结合在细胞(胞内或酸剥离)上的Fab和释放回顶端基质中的Fab的总和。或者，通过持续将细胞暴露给顶端基质中的Fab，并且测定Fab在基底外侧基质中的累积，可以测定胞转作用。该方法避免了冷却细胞，但是没有提供运输配体单股的动力学。在两种方法中，通过将等份的胞转的Fab过SDS-PAGE，并且用抗鸡抗体探测Western印迹来测定Fab的降解。非特异性运输(例如由于液相胞吞作用和胞转作用，或者细胞间的副细胞(Paracellular)键)可以通过使用没有以pIgR和/或免疫前Fab转染的MDCK细胞来控制。
                   B．配体结合的体内试验
体内胞转作用可以常规地使用没有病原的实验动物例如Sprague-Dawley大鼠来测试。将标记的配体(例如放射性碘化的抗体)施加到鼻孔中。正如本领域技术人员所理解的，“标记”是通过分光光度的、光化学的、生物化学的、免疫化学的、电磁的、放射化学的或者化学的方法，例如荧光、化学荧光或者化学发光等方法可检测的成分。通过测定由标记的存在所决定的进入循环的配体可以方便地测定顶端至基底外侧的胞转作用。从循环回收的配体的整合度可以通过用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳对配体进行分析来测定。
                         生物活性成分
配体的生物活性成分可以与配体共价或非共价结合。例如，螯合剂可以用来结合各种同位素，或者核酸可以通过氢键结合配体。生物活性成分也可以包含在乳液、蛋白质类似物或脂质体中。如本领域技术人员所公知的，这样的结构可以通过衍生化的极性头部基团或者通过膜内在蛋白与配体共价连接。配体的结合成分也可以包括生物活性成分。
生物活性成分包括本领域技术人员已知为消炎药、细胞因子、抗感染剂、酶活化剂或抑制剂、异构修饰剂、或抗生素的多种化合物。因此，生物活性成分包括这样的化合物，如核酸、蛋白质、肽、氨基酸或衍生物、糖基蛋白、放射性同位素、脂质、碳水化合物或重组病毒。术语“核酸”指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，除非另有限制，包括天然核苷酸已知的类似物。核酸包括反义核酸、用于与单链或双链体DNA共价交联的衍生化的寡核苷酸、三链形式的寡核苷酸或者编码蛋白质或肽的核酸。核酸也包括用于基因治疗的，例如编码野生型囊性纤维化跨膜传导调节蛋白的那些。
                    生物活性成分与配体结合
生物活性成分与配体结合的方法根据该成分的化学结构而不同。一般情况下，配体含有多种功能基团，其可与生物活性分子上的合适的功能基团反应，以结合那里的试剂。或者，配体和/或生物活性成分可以衍生化以暴露或结合另外的反应功能基。衍生化作用可以包括任何各种分子，例如从PierceChemical Company,Rockford lllinois购得的那些接头分子。这里所使用的是指用来共价或非共价地连接配体和生物活性成分的分子。合适的接头是本领域技术人员公知的，包括但不限于直链或支链的碳接头，杂环碳接头，或者肽接头。参见，例如，Birch和Lennox，单克隆抗体：理论和应用，第4章，Wiley-Liss，纽约，纽约州(1995)；美国专利5218112,5090914；Hermanson，生物接合技术(Bioconjugate Techniques)，学术出版社，SanDiego,CA(1996)。
在两个分子都是多肽时，接头可以通过其侧基与组成氨基酸连接(例如，通过二硫键与半胱氨酸连接)。具有一个与特定生物活性成分上的基团反应的功能基和另一个与配体反应的功能基的双功能接头可以用来生成期望的接合物。或者，衍生化作用可以包括成分的化学处理；例如糖蛋白抗体的糖基部分用高碘酸盐进行乙二醇裂解(glycol cleavage)，以产生游离的醛基。抗体上游离的醛基可以与试剂上的游离的胺或肼基反应，以结合那里的试剂。(参见美国专利4671958)。抗体或抗体片段上的游离的巯基的产生方法也是已知的(参见美国专利4659839)。用于各种化合物包括放射性核素金属螯合物，毒素和药物与蛋白质例如抗体结合的很多方法和接头分子是已知的。参见，例如欧洲专利申请No.188256；美国专利4671958,4659839,4414148,4699784；4680338；4569789；和4589071；和Borlinghaus等，癌症研究，47:4071-4075(1987)。
有时希望当到达靶位点时释放接合的分子。因此，可以使用包括在靶位点附近可裂解的键的接合物。从抗体释放生物活性成分的键的裂解可以通过酶活性或接合物在靶细胞内或在靶细胞位点周围的条件来促进。当靶位点是肿瘤时，可以使用在肿瘤位点的条件(例如当暴露给肿瘤相关的酶或酸性pH时)下可裂解的接头。使用顺-乌头酸间隔臂对于核内体释放生物活性成分是有用的。类似地，二硫键在核内体的还原环境中是可裂解的。
多种不同的可裂解接头是本领域技术人员公知的。参见，美国专利4618492；4542225和4625014。试剂从这些接头基团释放的机理包括，例如，对光不安的键的紫外线照射和酸催化水解。美国专利5141648公开了包括特定化学结构接头的免疫接合物，其中键在体内裂解，从而释放结合的化合物(放射疗剂，药物，毒素等)。该接头易在温和酸性pH下裂解，并且相信在运输到靶细胞细胞质期间裂解，从而在靶细胞中释放生物活性化合物。美国专利4671958包括对含有接头的免疫接合物的描述，这些接头在体内在靶位点处通过患者互补系统的蛋白酶裂解。根据已经大量报道的关于与配体结合各种各样的放射诊断化合物，放射治疗化合物、药物、毒素和其它成分的方法，本领域技术人员能够确定给定成分与本发明配体结合的合适方法。
                       配体从核内体输出
本领域技术人员公知的多种方法可以用来将配体，或者其任何部分运输出核内体。
与特异性结合生物大分子特征性高级结构的配体结合的聚-L-赖氨酸/核酸复合物可以用于有效转染。Ferkol等，临床研究杂志(J.Clin.Invest.),92:2394-2400(1993)；和Ferkol等，临床研究杂志，95:493-502(1995)。
在另一项研究中，聚-L-赖氨酸可以例如通过基因融合或化学接头与特异性结合pIgR生物大分子特征性高级结构的配体连接。接着，该复合物可以与有缺陷的腺病毒连接。Curiel及其同事证明与已经连接有缺陷的腺病毒的变体的聚-L-赖氨酸或聚-L-赖氨酸-运铁蛋白静电结合的裸质粒DNA可以运输给细胞，转染率达90％。腺病毒-聚-L-赖氨酸-DNA接合物与正常的腺病毒受体结合，并且接着通过受体介导的胞吞作用而内在化。这种方法已使得基因治疗载体表达量增加了1000倍。疱疹病毒具有类似的性质。
Curiel等(1991)，美国国家科学院院刊88:8850-8854；Cotten等(1992)美国国家科学院院刊89:6094-6089；Curiel等(1992)Hum GeneTher 3:147-154；Wagner等(1993)J.Boil.Chem.268:6866-6869；Curiel等(1992)Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.6:247-252，以Harris等(1993)Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.9:441-447；Gao等(1993)Hum.Gene.Ther.4:17-24；Curiel等美国专利申请序列号07/768,039。
在另一项使用流感病毒的研究中，血凝素中的疏水性肽在低pH可以作为融合肽起作用来进行病毒与核内体膜的融合，并且将病毒运输到细胞质中。该肽已经在用于使用运铁蛋白受体的基因转移的运铁蛋白/肽/聚-L-赖氨酸/DNA复合物中使用，并且大大提高了表达效率。Wagner等，美国国家科学院院刊89:7934-7938(1992)。该肽可以经基因工程进入配体，用来将配体或其部分运出核内体。
另一项研究可以使用蓖麻毒蛋白A。蓖麻毒蛋白A链能穿出核内体并且进入胞质溶胶。Beaumell等，生物化学杂志，268:23661-23669(1993)。本发明配体可以通过例如基因融合或化学接头与蓖麻毒蛋白A连接。
尽管本发明为了清楚理解的目的，通过详细说明和实施例进行了详细描述，但是显而易见在权利要求书范围内是可以实施一些变化和改变的。
                          实施例1
实施例1描述了特异性结合兔pIgR生物大分子特征性高级结构区的鸡抗体和Fab片段的产生和测定方法。
兔pIgR跨膜片段在位置630处的缬氨酸开始。位于跨膜片段之前的兔pIgR的24个胞外残基序列是：607-AspProAlaSerGlySerArgAlaSerValAspAlaSerSerAlaSerGlyGlnSerGlySerAlaLys-629(SEQ ID NO:7).
合成了代表pIgR的胞外膜近侧16和23个氨基酸的两个肽(Immuno-Dynamics,Inc.,La Jolla,CA)。为接合目的而加入C-末端半胱氨酸。第一个肽的肽序列是(单字母码)：DPA SGS RAS VDA SSA SGQ SGSAKC(SEQ ID NO:8)；第二个肽是：ASV DAS SAS GQS GSA KC(SEQ IDNO:9)。每个肽的量的一半接合匙孔戚血蓝蛋白(KLH)(Immuno-Dynamics,Inc提供)。
KLH-接合的肽被送到Lampire Biological Laboratories(Pipersville,PA)，以使得每种肽在两只鸡中都产生鸡抗体。对鸡免疫的Lampire’标准方法之后收集免疫前蛋和免疫前试验血样；在方案开始时用弗氏完全悬浮液肌内注射2mg肽；第1周用弗氏不完全悬浮液肌内注射0.5mg肽；第2周用弗氏不完全悬浮液肌内注射0.25mg肽；第3周不注射；第4周用弗氏不完全悬浮液肌内注射0.25mg肽；第5周不注射，第6周取血样。在第6周左右开始每天收集鸡蛋，并且每月取血样。每月运输鸡蛋。
到达后，小心从蛋白中分离蛋黄，保存在4℃50-80m1/蛋黄的碱性缓冲液(0.01M磷酸钠，pH7.5,0.1M氯化钠，0.01％叠氮化物)中，直到用于提取鸡抗体(“IgY”)。根据Polson等的方法，免疫学通讯(ImmunolCommun.)9:475(1980)，通过一系列PEG沉淀后的一系列硫酸铵沉淀，从批量贮存的蛋黄中提取IgY。简要地说，向碱性缓冲液中的蛋黄加入固体PEG(聚乙二醇，MW8000)，达到PEG重量与稀释的蛋黄的体积之比为3。5％，并在室温下搅拌直到溶解。溶液在20℃以14000g离心10分钟，并且通过疏松地铺有一层吸收剂棉网的漏斗倾析。向澄清的滤液中加入更多的PEG，达到最终PEG浓度为12％，以沉淀IgY。通过在20℃以14000g离心10分钟沉积沉淀物后，将蛋黄将沉淀物溶解于60ml/蛋黄的碱性缓冲液中，并且加入等体积24％碱性缓冲液中的PEG以再生成沉淀。沉淀物在20℃以14000g再离心10分钟两次，以去除所有的残余PEG溶液。将小丸溶解于30ml/蛋黄碱性缓冲液中，然后通过缓慢加入等体积饱和的硫酸铵并且通过在4℃下搅拌过夜，使蛋白质在50％饱和的硫酸铵中沉淀。沉淀在4℃以14000g离心10分钟，并且用等体积冷的50％硫酸铵洗涤小丸，沉淀再次在4℃以14000g离心10分钟，溶解于没有钙或镁，pH7.5的PBS中，并且在PBS中透析以去除所有的硫酸铵。通过SDS-PAGE(大约90-95％)证实IgY制剂的纯度，通过测定280nm处的吸收值并使用1.3消光系数来估计IgY的量。
首先将肽与SULFOLINK偶联凝胶(Pierce Chemical Company)共价连接，这产生了对疏基例如该肽C-端半胱氨酸上的巯基的特异性结合从而实现从注射有第一肽SEQ ID NO:8的鸡亲和纯化。根据产品说明，用3mg肽制备3ml柱子。简要地说，用6柱体积的50mM Tris,5mM EDTA,pH8.5平衡3ml柱子，然后将3ml 50mM Tris,5mM EDTA,pH8.5中的3mg肽SEQ ID NO:8加入到柱中，室温下混合15分钟。在不搅拌的情况下，将柱凝胶和肽再孵育30分钟。从凝胶中排出肽缓冲液并留下以备后来进行试验证明偶联的效率，试验时使用检测巯基的Ellman试剂(DTNB(5,5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸))，Pierce Chemical Company)。肽SEQ ID NO:8不含有任何芳香氨基酸基团，不可能用分光光度法或者通过标准的蛋白质测试技术例如Bradford分析来测定。使用Ellman试剂，根据产品说明，比较与凝胶结合之前或之后的肽溶液样品，证明100％结合效率。用3柱体积50mMTris,5mM EDTA,pH8.5冲洗凝胶柱子，然后在室温下与3ml 50mM Tris,5mM EDTA,pH8.5中的半胱氨酸溶液混合15分钟，封闭非特异性结合位点，然后在不搅拌的情况下再封闭30分钟。排空柱子，并且用16柱体积1M氯化钠冲洗后用16柱体积脱气的0.05％叠氮化钠冲洗。
根据Rosol等，兽医免疫学和免疫生理学，35:321-337,1993的改进的方法，在这种肽连接的SULFOLINK凝胶上亲和纯化IgY。一旦处于室温下，就将柱子用10柱体积PBS冲洗。IgY在柱子上循环2小时。然后用10柱体积PBS冲洗柱子，然后用10柱体积磷酸盐缓冲盐水(PBS)及0.5M氯化钠冲洗柱子。用500mM甘氨酸，pH2.5洗脱肽特异性IgY，并用1M TrispH9.5中和。使用UV分光光度计和绘图仪器跟踪冲洗和蛋白质从柱上的洗脱。在OD280nm处有信号的样品在centriprep 30(Amicon)中浓缩至500-600μl体积。
根据产品说明和改进的Akita和Nakai的免疫学方法杂志，162:155-164,1993的方法，由亲和纯化的IgY与固定的胃蛋白酶(PierceChemical Company)孵育，制备Fab片段(“Yab片段”)。用16倍体积的50mM乙酸钠缓冲液pH4.2将胃蛋白酶浆状物冲洗两次，并且悬浮于2倍体积的乙酸钠缓冲液中。亲和纯化的IgY与固定的胃蛋白酶在37=BOC处孵育，并且混合5小时。加入1摩尔Tris-HCl pH8.0，使最终pH为7.5。胃蛋白酶混合物以1000g离心5分钟，并且将含有该片段的上清液加入到CENTRICON 10过滤器(Amicon)中，以去除小的Fc片段。通过SDS-PAGE证明完全裂解。
通过ELISA对来自连续试验血样的鸡血清和从集中的蛋黄批量提取的IgY进行测试以证明识别该肽。通过蛋白质印迹对亲和纯化的IgY和Fab’片段(“Yab”)测定其识别完整pIgR的能力。根据Breitfeld等(细胞生物学方法，32:329-337(1989))的方法，使用含有1μg/ml蛋白水解酶抑制剂和苯基甲基磺酰基氟(PMSF)的10％NP40裂解缓冲液，从Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞和用兔pIgR(“pWe”)转染的MDCK细胞制备细胞裂解产物。细胞裂解产物在还原条件下过10％凝胶柱，并转移到PVDF(聚二氟乙烯)膜(Millipore,Bedford,MA)上。对pIgR细胞质部分的小鼠单克隆抗体，SCl66(Solari等，细胞，36:61-71(1984))，被用作正对照抗体，从免疫前蛋黄分离的IgY被用作负对照。HRP-接合的兔抗-鸡IgY(JacksonImmunochemicals)和HRP-接合的兔抗-小鼠(Biorad)被用作第二抗体。来自用第一肽注射的鸡的IgY和来自用亚序列肽注射的鸡的IgY识别完整的pIgR，但是来自用亚序列抗体注射的鸡的IgY则不能识别。MDCK和pWe细胞在盖玻片上生长，用4％多聚甲醛固定并用皂草苷渗透的对于IgY和Yab片段(来自用第一肽注射的鸡)的免疫荧光研究显示出pIgR-转染的细胞更特异的染色(从Jackson Immunochemicals获得FITC-接合的兔抗-鸡和抗-小鼠抗体)。固定细胞和渗透细胞的细胞ELISA(M Hahne等，细胞生物学杂志，121:655-64,1993的改进的方法)表明Yab片段染色用pMe细胞比MDCK细胞快5-倍。这些数据证明我们成功地获得了抗兔pIgR生物大分子特征性高级结构肽的多充隆抗体，并且其识别完整的pIgR。
                           实施例2
实施例2描述了通过噬菌体展示(phage display)对人重组单链可变区片段(scFv)抗体的选择。
通过噬菌体展示对scFv的选择需要可溶的生物素化抗原或固定在固相载体上的抗原。因为通过噬菌体展示选择的scFv趋向于是低亲和性的结合剂并且因为溶解的抗原可以选择较高亲和性的scFv(R Schier等，分子生物学杂志255:28-43,1996)，所以选择了溶解的抗原选择方法。以产品说明中描述的方法为基础，使用生物素-BMCC((1-生物素酰氨-4-(4’[马来酰亚胺甲基]环己烷-甲酰胺)丁烷)(Pierce Chemical Company,Roekford,IL))，使实施例1中描述的相应于兔pIgR的膜近侧胞外部分23个氨基酸的pIgR生物大分子特征性高级结构第一肽通过半胱氨酸残基的巯基与生物素接合。为了保证肽没有通过巯基二聚体化，首先用1％0.1M Tris 5mM EDTA pH8.0中的硼氢化钠将肽还原。通过加入1N盐酸将溶液pH降低至pH5。一旦溶液不再产生气体，则加入1M Tris重新达到pH7。通过将生物素化试剂溶解于DMSO中来制备8.5mM生物素-BMCC溶液。将5倍摩尔过量的生物素-BMCC加入到还原的肽中，并在4℃下孵育过夜。通过C18柱，用10-50％CH3CN梯度范围进行HPLC 30分钟，以215nmUV检测，从而从游离的生物素中分离生物素化的肽。通过电喷射和LSIMS(液体第二离子质谱)用质谱鉴定相应于生物素化的肽的正确峰。
将生物素化的第一肽与编码多种不同人scFv(大约1010)的噬菌体文库孵育。该噬菌体文库根据现有技术的描述来制备(JD Marks等，分子生物学杂志，222:581-97,1991；JD Marks等，生物/技术10；779-783,1992；JD Marks等，生物/技术11:1145-1149,1993；AD Griffths等，EMBO J12:725-734,1993)。根据Marks等的描述(分子生物学222:581-97,1991)和下面的改进，在大肠杆菌抑制因子菌株TG-1中一共进行4轮选择、噬粒补救和扩展。已知所使用的噬菌体文库含有几种链酶抗生物素蛋白结合剂，这样头3轮选择包括预清除步骤，用链酶抗生物素蛋白琼脂糖(Sigma)孵育噬菌体30分钟两次。然后噬菌体与5μg生物素化的肽孵育1小时。为了使生物素化的肽与接触的噬菌体结合，肽-噬菌体溶液与抗生物素蛋白磁珠孵育，分别在第一轮孵育15分钟，在第三轮孵育5分钟，并与链酶抗生物素蛋白磁珠分别在第二轮孵育10分钟，在第四轮孵育5分钟。把从第四轮选择中补救的噬菌体感染到大肠杆菌非抑制因子菌株HB2151中，用IPTG诱导各个噬粒克隆产生溶解的scFv片段，如Marks等(分子生物学杂志，222:581-97,1991)所述。
对来自各个克隆的细菌上清液在点印迹分析中分析溶解的scFv片段的表达，并在ELISA测定中分析与生物素化的第一肽的结合(Finnem等，免疫学临床实验，102:566-574,1995)。但是ELISA测定用下面的方法改进：在4℃下用抗生物素蛋白(10μg/ml，于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中)包被96孔微孔平板(Immulon-4)过夜，用PBS冲洗3次，用PBS中2％的牛奶封闭，并用生物素化的肽(5μg/ml，于PBS中)结合。用TMB(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺)溶液(Kirkegaard和Perry)作为底物(100μl/孔)，在450nm波长处在ELISA读数器中读到颜色反应之前用0.18M H2SO4终止反应。点印迹分析表明，用自第4轮选择选出的噬菌体感染的96个补救HB2151菌落中的66％产生scFv。ELISA测定表明96个菌落中的43个产生结合肽的scFv。
通过PCR筛选测定所有阳性克隆的多样性。重链和轻链的scFv插入片段首先通过引物LMB3和fd-Seq1(Marks等，分子生物学杂志，222:581-97,1991)扩增，然后用限制酶BstN1消化。用SequiTherm Lone-Read循环测序试剂盒(Epicentre Technologies)和Licor机，对具有不同DNA指纹图案的克隆测定序列。鉴定了5种单一序列。
为了获得大量的纯化的scFv用于进一步表征和应用，将5个单一序列scFv亚克隆到表达载体pUC119 Sfi-NotmycHis，其在scFv的C-末端加入一个六组氨酸标记物(Schier等，分子生物学杂志，255:28-43,1996)。
                          实施例3
实施例3描述了以Ferkol等，临床研究杂志，92:2394-2400(1993)；和Ferkol等，临床研究杂志，95:493-502(1995)中描述的方法的变化方法，将野生型囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)基因定向于表达pIgR的哺乳动物细胞中，所引用的两篇文献在此用作参考。
通过例如实施例1所公开的技术制备与pIgR生物大分子特征性高级结构区反应的Fab片段并纯化。根据Ferkol等(1993)的方法，使用异双功能交联剂N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶二硫代)-丙酸酯(SPDP)，使Fab与聚-(L-赖氨酸)(MW20000道尔顿)连接。
包含CFTR基因的质粒与巨细胞病毒早期启动子连接，并插入到载体pCB6中。Thomas等生物化学杂志，268:3313-3320(1993)。通过将质粒DNA与3M氯化钠中的Fab-聚赖氨酸结合来制备Fab-聚赖氨酸-DNA复合物。
通过将复合物溶解于0.1ml磷酸缓冲盐水中，并且将其放入用甲氧氟烷吸入麻醉剂轻微麻醉的无病原Sprague-Dawley大鼠(250-300克)的鼻孔中。用微移液管将100μl PBS中的质粒直接施加到人为制约后处于仰卧位置的大鼠鼻孔中来导入复合物。大鼠保持这种位置直到溶液被吸入。已经证明该技术可使得将样品有效施加到鼻粘膜上。Shahin等，感染和免疫60:1482-1488(1992)；Gizurarson等，疫苗，10:101-106(1992)。转染的基因的转录通过产生CFTR蛋白质的免疫荧光测试来测定。
                          实施例4
实施例4描述了体内将外源蛋白质定向于表达pIgR的细胞中的方法。
使蛋白质自核内体外出的有效方法是使用与腺病毒偶联的蛋白质-Fab复合物。该方法已经对多种受体系统使用，它导致表达量增加多至1000倍。Curiel等，J.Respir.Cell Mol.Biol.6:247-252(1992)；Curiel等，美国国家科学院院刊88:8850-8854(1991),Gao等，Hum.Gene Ther.4:17-24(1993)，各文献在此用作参考。偶联通过腺病毒和Fab/聚-赖氨酸的生物素化接着用抗生物素蛋白交联来实现。得到的复合物和实施例4一样给药。
                         实施例5
实施例5描述了特异性结合生物大分子特征性高级结构的抗体从包含pIgR的MDCK(Madin Darby犬肾)细胞的顶端至基底外例膜的胞转作用。
根据实施例1的说明制备与pIgR反应的Yab片段。通过Goldsein等(酶学方法，96:241-249)的一氯化碘方法将抗-pIgR生物大分子特征性高级结构Yab片段放射性碘标记。放射性碘标记的IgA被用作对照配体。向在12mm直径，0.4μm孔大小细胞培养插入物(Transwells,Costar)上以极化方法生长4天的MDCK和pWe细胞的顶端表面加入放射性碘标记的Yab片段或IgA(107cpm于100μl/孔)。Breitfeld等，细胞生物学方法32:329-337(1989)。在有和没有与蛋白酶抑制剂，亮抑酶肽，50μl/ml预孵育2小时情况下，向细胞中加入放射性标记的Yab片段。在37℃顶端吸收20分钟后，用MEM(极限必需培养基)/BSA(牛血清白蛋白)快速冲洗未结合的放射性标记的配体3次，一次冲洗5分钟，两次冲洗更快。在7、15、30、60和120分钟时间点收集和变化顶端和基底外侧培养基。以在γ计数器(Beckman InstrumentsPalo Alto,CA)中定量。在120分钟切下细胞培养插入片段用于γ计数器中的定量，并计算放射性总的初始提入量。从pWe细胞的摄入量减去MDCK背景摄入以计算放射性标记的配体的特异性再循环和胞转作用。结果表明Yab片段的13-18％从用亮抑酶肽预处理的细胞的顶端表面胞转到基底外侧表面，相反IgA是5-6％。
该说明书中提到的所有的公开物和专利在此引入说明书作为参考，同样地，被具体地和个别地指出的各个公开物或专利也在这里用作参考。
序列表
(1)基本资料：
 (ⅰ)申请人：
  (A)名称：The Regents of the University of Califomia
  (B)街道：300 Lakeside Drive,22nd Floor
  (C)城市：Oakland
  (D)州：California
  (E)国家：美国
  (F)邮编(ZIP):94612-3558
  (G)电话：(510)748-6600
  (H)电传：
  (I)电报：
 (ⅱ)发明名称：PIGR生物大分子特征性高级结构和相关配体的细胞内化作用
 (ⅲ)序列数目：11
 (ⅳ)联系地址：
  (A)地址：Townsend and Townsend and Crew LLP
  (B)街道Two Embarcadero Center,Eighth Floor
  (C)城市：San Francisco
  (D)州：California
  (E)国家：美国
  (F)ZIP:94111-3834
 (ⅴ)计算机可读形式：
  (A)软磁盘
  (B)计算机：IBMPC兼容
  (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
  (D)软盘：PatentIn Release#1.0，版本#1.3
 (ⅵ)当前申请数据：
  (A)申请号：没有登记WO
  (B)申请日：没有登记
  (C)分类：
 (ⅶ)先前申请数据：
  (A)申请号：US60/018958
  (B)申请日：1996年6月4日
 (ⅷ)代理人/事务所信息：
  (A)名称：Weber,Kenneth A.
  (B)登记号：31677
  (C)参考/记录号：02307E-067910PC
 (ⅸ)电讯信息：
  (A)电话：(415)576-0200
  (B)电传：(415)576-0300
(2)SEQ ID NO:l的信息：
 (ⅰ)序列特征：
  (A)长度：4个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：
  (D)拓扑学：线性
 (ⅱ)分子类型：肽
 (ⅸ)特征：
  (A)名词/关键词：修饰位点
  (B)位置：3
  (D)其它信息：/产物=“其它
              /注=“Xaa=极性或带电荷的氨基酸”
 (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:1:
Phe Ala Xaa Glu
l
(2)SEQ ID NO:2的信息：
 (ⅰ)序列特征：
  (A)长度：33个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：
(D)拓扑学：线性
 (ⅱ)分子类型：肽
 (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:2:Glu Arg Glu Ile Gln Asn Val Arg Asp Gln Ala Gln Glu Asn Arg Ala1               5                   10                  15Ser Gly Asp Ala Gly Ser Ala Asp Gly Gln Ser Arg Ser Ser Ser Ser
        20                   25                 30Lys
(2)SEQ ID NO:3的信息：
 (ⅰ)序列特征：
  (A)长度：31个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：
  (D)拓扑学：线性
 (ⅱ)分子类型：肽
 (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:3:Glu Arg Glu Ile Gln Asn Ala Gly Asp Gln Ala Gln Glu Asn Arg Ala1               5                   10                  15Ser Gly Asn Ala Gly Ser Ala Gly Gly Gln Ser Gly Ser Ser Lys
        20                  25                  30
(2)SEQ ID NO:4的信息：
 (ⅰ)序列特征：
  (A)长度：31个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：
(D)拓扑学：线性
 (ⅱ)分子类型：肽
 (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:4:Glu Lys Ala Val Ala Asp Thr Arg Asp Gln Ala Asp Gly Ser Arg Ala1               5                   10                  15Ser Val Asp Ser Gly Ser Ser Glu Glu Gln Gly Gly Ser Ser Arg
        20                  25                  30
(2)SEQ ID NO:5的信息：
 (ⅰ)序列特征：
  (A)长度：27个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：
  (D)拓扑学：线性
 (ⅱ)分子类型：肽
 (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:5:Glu Ser Val Lys Asp Ala Ala Gly Gly Pro Gly Ala Pro Ala Asp Pro1               5                   10                  15Gly Arg Pro Thr Gly Tyr Ser Gly Ser Ser Lys
        20                  25
(2)SEQ ID NO:6的信息：
 (ⅰ)序列特征：
  (A)长度：40个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：
  (D)拓扑学：线性
 (ⅱ)分子类型：肽
 (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:2:Leu Ala Glu Val Ala Val Gln Ser Ala Glu Asp Pro Ala Ser Gly Asp1               5                   10                  15Pro Ala Ser Gly Ser Arg Ala Ser Val Asp Ser Gly Ser Ser Glu Glu
        20                  25                  30Gln Gly Gly Ser Ser Arg Ser Lys
    35                  40
(2)SEQ ID NO:7的信息：
 (ⅰ)序列特征：
  (A)长度：23个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：
  (D)拓扑学：线性
 (ⅱ)分子类型：肽
 (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:7:Asp Pro Ala Ser Gly Ser Arg Ala Ser Val Asp Ala Ser Ser Ala Ser1               5                   10                  15Gly Gln Ser Gly Ser Ala Lys
        20
(2)SEQ ID NO:8的信息：
 (ⅰ)序列特征：
  (A)长度：24个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：
(D)拓扑学：线性
 (ⅱ)分子类型：肽
 (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:8:Asp Pro Ala Ser Gly Ser Arg Ala Ser Val Asp Ala Ser Ser Ala Ser1               5                   10                  15Gly Gln Ser Gly Ser Ala Lys Cys
        20
(2)SEQ ID NO:9的信息：
 (ⅰ)序列特征：
  (A)长度：17个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：
  (D)拓扑学：线性
 (ⅱ)分子类型：肽
 (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:9:Ala Ser Val Asp Ala Ser Ser Ala Ser Gly Gln Ser Gly Ser Ala Lys1               5                   10                  15Cys
(2)SEQ ID NO:10的信息：
 (ⅰ)序列特征：
  (A)长度：61个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：
  (D)拓扑学：线性
 (ⅱ)分子类型：肽
 (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:10:Ala Asp Ala Ala Pro Asp Glu Lys Val Leu Asp Ser Gly Phe Arg Glu1               5                   10                  15Ile Glu Asn Lys Ala Ile Gln Asp Pro Arg Leu Phe Ala Glu Glu Lys
        20                  25                  30Ala Val Ala Asp Thr Arg Asp Gln Ala Asp Gly Ser Arg Ala Ser Val
    35                  40                  45Asp Ser Gly Ser Ser Glu Glu Gln Gly Gly Ser Ser Arg
50                  55                  60
(2)SEQ ID NO:11的信息：
 (ⅰ)序列特征：
  (A)长度：61个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：
  (D)拓扑学：线性
 (ⅱ)分子类型：肽
 (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:11:Ala Asp Ala Ala Pro Asp Glu Lys Val Leu Asp Ser Gly Phe Arg Glu1               5                   10                  15Ile Glu Asn Lys Ala Ile Gln Asp Pro Arg Leu Phe Ala Glu Glu Lys
        20                  25                  30Ala Val Ala Asp Thr Arg Asp Gln Ala Asp Gly Ser Arg Ala Ser Val
    35                  40                  45Asp Ser Gly Ser Ser Glu Glu Gln Gly Gly Ser Ser Arg
50                  55                  60

Claims (29)

1．一种特异性结合细胞聚免疫球蛋白受体(pIgR)的生物大分子特征性高级结构的配体，条件是该配体在生理条件下基本上不结合pIgR的分泌成分。
2．权利要求1的配体，其中配体是抗体。
3．权利要求1的配体，其中配体是人源化抗体。
4．权利要求1的配体，其中配体是抗体的重组单链可变区片段。
5．权利要求1的配体，其与受体裂解位点细胞膜近侧头33个氨基酸内的胞外表位结合。
6．权利要求1的配体，其与选自下组的肽结合：
    小鼠：Glu-Arg-Glu-Ile-Gln-Asn-Val-Arg-Asp-Gln-Ala-Gln-Glu-Asn-Arg-Ala-Ser-Gly-Asp-Ala-Gly-Ser-Ala-Asp-Gly-Gln-Ser-Arg-Ser-Ser-Ser-Ser-Lys(SEQ ID NO:2)
    大鼠：Glu-Arg-Glu-Ile-Gln-Asn-Ala-Gly-Asp-Gln-Ala-Gln-Glu-Asn-Arg-Ala-Ser-Gly-Asn-Ala-Gly-Ser-Ala-Gly-Gly-Gln-Ser-Gly-Ser-Ser-Lys(SEQ ID NO:3)
    人：Glu-Lys-Ala-Val-Ala-Asp-Thr-Arg-Asp-Gln-Ala-Asp-Gly-Ser-Arg-Ala-Ser-Val-Asp-Ser-Gly-Ser-Ser-Glu-Glu-Gln-Gly-Gly-Ser-Ser-Arg (SEQ IDNO:4)
    牛：Glu-Ser-Val-Lys-Asp-Ala-Ala-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Pro-Ala-Asp-Pro-Gly-Arg-Pro-Thr-Gly-Tyr-Ser-Gly-Ser-Ser-Lys (SEQ ID NO:5)
    兔：Leu-Ala-Glu-Val-Ala-Val-Gln-Ser-Ala-Glu-Asp-Pro-Ala-Ser-Gly-Asp-Pro-Ala-Ser-Gly-Ser-Arg-Ala-Ser-Val-Asp-Ser-Gly-Ser-Ser-Glu-Glu-Gln-Gly-Gly-Ser-Ser-Arg-Ser-Lys (SEQ ID NO:6)。
7．权利要求1的配体，其进一步定义为具有选择性结合受体生物大分子特征性高级结构的结合成分和其中生物活性成分选自核酸、蛋白质、放射性同位素、脂质和碳水化合物的生物活性成分。
8．权利要求7的配体，其中核酸编码野生型囊性纤维化跨膜传导调节蛋白。
9．一种通过将配体与细胞聚免疫球蛋白受体的生物大分子特征性高级结构结合而将配体引入表达聚免疫球蛋白受体的细胞的方法，条件是该配体在生理条件下基本上不结合pIgR的分泌成分。
10．权利要求9的方法，其中配体是抗体。
11．权利要求9的方法，其中配体是人源化抗体。
12．权利要求10的方法，其中配体是抗体的重组单链可变区片段。
13．权利要求9的方法，其中配体与受体裂解位点细胞膜近侧头33个氨基酸内的胞外表位结合。
14．权利要求9的方法，其中配体与选自下组的肽结合：
    小鼠：Glu-Arg-Glu-Ile-Gln-Asn-Val-Arg-Asp-Gln-Ala-Gln-Glu-Asn-Arg-Ala-Ser-Gly-Asp-Ala-Gly-Ser-Ala-Asp-Gly-Gln-Ser-Arg-Ser-Ser-Ser-Ser-Lys(SEQ ID NO:2)
    大鼠：Glu-Arg-Glu-lle-Gln-Asn-Ala-Gly-Asp-Gln-Ala-Gln-Glu-Asn-Arg-Ala-Ser-Gly-Asn-Ala-Gly-Ser-Ala-Gly-Gly-Gln-Ser-Gly-Ser-Ser-Lys (SEQ ID NO:3)
    人：Glu-Lys-Ala-Val-Ala-Asp-Thr-Arg-Asp-Gln-Ala-Asp-Gly-Ser-Arg-Ala-Ser-Val-Asp-Ser-Gly-Ser-Ser-Glu-Glu-Gln-Gly-Gly-Ser-Ser-Arg (SEQ IDNO:4)
    牛：Glu-Ser-Val-Lys-Asp-Ala-Ala-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Pro-Ala-Asp-Pro-Gly-Arg-Pro-Thr-Gly-Tyr-Ser-Gly-Ser-Ser-Lys (SEQ ID NO:5)
    兔：Leu-Ala-Glu-Val-Ala-Val-Gln-Ser-Ala-Glu-Asp-Pro-Ala-Ser-Gly-Asp-Pro-Ala-Ser-Gly-Ser-Arg-Ala-Ser-Val-Asp-Ser-Gly-Ser-Ser-Glu-Glu-Gln-Gly-Gly-Ser-Ser-Arg-Ser-Lys (SEQ ID NO:6)。
15．权利要求9的方法，其中配体进一步定义为具有选择性结合受体生物大分子特征性高级结构的结合成分和其中生物活性成分选自核酸、蛋白质、放射性同位素、脂质、和碳水化合物的生物活性成分。
16．权利要求15的方法，其中核酸编码野生型囊性纤维化跨膜传导调节蛋白。
17．权利要求1的配体，其进一步定义为具有选择性结合受体生物大分子特征性高级结构的结合成分和其中生物活性成分选自消炎药、反义寡聚物、抗生素、和抗感染剂的生物活性成分。
18．权利要求9的方法，其中细胞是哺乳动物细胞。
19．权利要求18的方法，其中细胞是上皮细胞。
20．权利要求9的方法，其中配体与细胞顶端表面处的生物大分子特征性高级结构结合。
21．权利要求20的方法，其中配体被胞转到细胞的基底外侧面。
22．权利要求21的方法，其中配体从细胞基底外侧表面处的生物大分子特征性高级结构释放。
23．权利要求9的方法，其中配体与细胞基底外侧表面处的生物大分子特征性高级结构结合。
24．权利要求9的方法，其中配体只特异性结合生物大分子特征性高级结构。
25．权利要求1的配体，其中配体只特异性结合生物大分子特征性高级结构。
26．一种把配体与表达聚免疫球蛋白受体的细胞结合的方法，包括配体与受体的生物大分子特征性高级结构结合的步骤，前提是该配体在生理条件下基本上不结合pIgR的分泌成分。
27．权利要求26的方法，其中配体在结合后胞吞到细胞中。
28．权利要求l的配体，其与具有下面序列的肽结合：
    Ala-Asp-Ala-Ala-Pro-Asp-Glu-Lys-Val-Leu-Asp-Ser-Gly-Phe-Arg-Glu-Ile-Glu-Asn-Lys-Ala-Ile-Gln-Asp-Pro-Arg-Leu-Phe-Ala-Glu-Glu-Lys-Ala-Val-Ala-Asp-Thr-Arg-Asp-Gln-Ala-Asp-Gly-Ser-Arg-Ala-Ser-Val-Asp-Ser-Gly-Ser-Ser-Glu-Glu-Gln-Gly-Gly-Ser-Ser-Arg (SEQ ID NO:10)。
29．权利要求9的配体，其与具有下面序列的肽结合：
    Ala-Asp-Ala-Ala-Pro-Asp-Glu-Lys-Val-Leu-Asp-Ser-Gly-Phe-Arg-Glu-Ile-Glu-Asn-Lys-Ala-Ile-Gln-Asp-Pro-Arg-Leu-Phe-Ala-Glu-Glu-Lys-Ala-Val-Ala-Asp-Thr-Arg-Asp-Gln-Ala-Asp-Gly-Ser-Arg-Ala-Ser-Val-Asp-Ser-Gly-Ser-Ser-Glu-Glu-Gln-Gly-Gly-Ser-Ser-Arg (SEQ ID NO:11)。
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