CN1602355A - 与人成纤维细胞生长因子有关的组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了FGF23多肽、制备此肽的方法和组合物，用此多肽及其激动剂和拮抗剂治疗磷酸消瘦病的方法。

Description

与人成纤维细胞生长因子有关的组合物

发明领域

本发明一般涉及分泌的低分子量人源蛋白质，更具体地，涉及与人成纤维细胞生长因子家族蛋白相关的多肽和其他组合物及它们的用途。

发明背景

许多低分子量分泌蛋白通过生长刺激作用、生长抑制作用或者通过调节关键代谢途径对健康和疾病有极大影响。这些分子包括生长因子，细胞因子，肽激素及类似化合物。生长因子是与细胞表面受体结合的蛋白，它的主要效果是激活细胞增殖或分化。许多生长因子具多效性，在许多不同细胞类型中刺激细胞分裂或具有其他效应；而另一些对特定细胞类型或组织是特异的。许多生长因子或来自它们的产物已经成为重要药品，例如：促红细胞生成素(EPO)、干扰素-α(α-INF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；而许多其他的生长因子，例如，胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、肿瘤生长因子-α(TGF-α)、白介素、成纤维细胞生长因子蛋白等正在深入研究中以了解它们在不同疾病，特别是癌症中的作用，例如，Jameson，第73-82页，于Jameson编的《Principles of Molecular Medicine》(Humana Press，Totowa，NJ，1998)一书中。

成纤维细胞生长因子(FGFs)是一个重要的蛋白家族，包括几十个成员，有着与多种疾病及多种发育和生理现象有关的宽范围活性，Baird等编，成纤维细胞生长因子家族，Annals of the New York Academy of Sciences，第638卷(New York Academy of Sciences，New York，1991)；Wilkie等，Current Biology，第5卷：第500-507页(1995)；Szebenyi和Fallon，Internat.Rev.Cytol，第185卷：第45-106页(1999)。近来，FGF家族的一个新成员，命名为“FGF23”，已经被描述，据认为它与人的磷酸消瘦病(phosphate wasting disease)有关，见例如，ADHR Consortium，Nat.Genetics，第26卷：第345-348页(2000)；White等，J.Clin.Endocrin.Metabol.，第86卷：第497-500页(2001)。然而，蛋白的活性形式及它在这些疾病中的准确作用仍然未知。

活性FGF23多肽和增强或调节FGF23生物效应的相关化合物的获得将通过提供治疗磷酸消瘦病的新治疗策略满足本领域的需求。

发明概述

本发明涉及与人成纤维细胞生长因子23(FGF23)多肽和FGF23多肽抗体相关的组合物、及制备和使用这些组合物的方法。本发明进一步包括使用FGF23多肽组合物—包括抗体化合物—治疗个体与FGF23多肽异常表达有关的病症的方法。

一方面，本发明包括具有与SEQ ID NO：2序列有至少95％同一性，更优选至少98％，甚至更优选至少99％同一性的氨基酸序列的多肽。最优选地，本发明包括具有与SEQ ID NO：2相同的氨基酸序列的多肽。

另一方面，本发明包括由6到40个氨基酸组成的分离肽，其序列与具有序列SEQ ID NO：1的成熟FGF23多肽中的连续氨基酸组成的亚序列是同一的。更优选地，本发明包括由6到40个氨基酸组成的分离肽，其序列与SEQ ID NO：2的成熟FGF23多肽中由连续氨基酸组成的亚序列是同一的。这些肽在抗原组合物的生产中是有用的中间体，这些抗原组合物可用于生产对FGF23多肽具特异性的肽抗体。

另一方面，本发明包括具有选自下组的氨基酸序列的肽：SEQ IDNO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10及SEQID NO：11。

另一方面，本发明包括对上述任一多肽，肽片段或肽具特异性的分离抗体。优选地，本发明抗体是单克隆抗体。这些抗体有诊断和治疗的用途，特别是在治疗与FGF23多肽相关的疾病中。治疗方法包括，但不限于，使用对FGF23多肽抗原特异的抗体或来自抗体的组合物。用于检测特定组织样品中的FGF23多肽的诊断方法及用于检测组织中FGF23多肽的表达水平的诊断方法也成为本发明的一部分。

另一方面，本发明包括编码SEQ ID NO：2的FGF23多肽的分离多核苷酸。

另一方面，本发明包括在所选群体中有至少2％频率的FGF23多肽的天然变体。更优选地，这些天然变体在所选群体中有至少5％的频率，最优选地，有至少10％的频率。所选群体可以是在群体遗传学领域中认同的任何研究群体。优选地，所选群体是高加索人，黑人或亚洲人。更优选地，所选群体是法国人、德国人、英国人、西班牙人、瑞士人、日本人、中国人、朝鲜人、华裔新加坡人、冰岛人、北美人、以色列人、阿拉伯人、土耳其人、希腊人、意大利人、波兰人、太平洋岛屿上的人、或印度人。

另一方面，本发明提供含有编码FGF23多肽的DNA的载体。本发明也包括含有此载体的宿主细胞。本发明也提供生产FGF23多肽的方法，它包括在适宜此FGF23多肽表达的条件下培养所述宿主细胞及从细胞培养物中将此多肽回收。

再一个方面，本发明包括含有多肽及可药用载体化合物的药物组合物和制剂，所述多肽有选自SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11的氨基酸序列。

附图简述

图1是本发明多肽的氨基酸序列的列表。

定义

术语“多肽”或“肽”或“肽片段”，如本文所用是指由单条氨基酸残基直链组成的化合物，这些残基通过肽键连接。在这些化合物中氨基酸残基数目有很大的变化；然而，优选地，肽在此处通常指有6到40个氨基酸残基。多肽和肽片段在此处通常指有几十个氨基酸残基(如20个)到几百个氨基酸残基(如200或更多个)。一般地，用重组DNA方法生产多肽更方便。

术语“蛋白”，如本文所用，可用作术语“多肽”的同义词，或者，也可以指两个或多个多肽通过肽键以外的键连接而成的复合体，例如，构成蛋白的多肽可以通过二硫键连接。术语“蛋白”也可以理解为有同一氨基酸序列但不同翻译后修饰的多肽家族，翻译后修饰为例如磷酸化、酰化、糖基化等，特别是当这些蛋白在真核宿主中表达时可加上所述修饰。

此处氨基酸残基用它们的标准单字母或三字母符号表示：A，丙氨酸；C，半胱氨酸；D，天冬氨酸；E，谷氨酸；F，苯丙氨酸；G，甘氨酸；H，组氨酸；I，异亮氨酸；K，赖氨酸；L，亮氨酸；M，甲硫氨酸；N，天冬酰胺；P，脯氨酸；Q，谷氨酰胺；R，精氨酸；S，丝氨酸；T，苏氨酸；V，缬氨酸；W，色氨酸；Y，酪氨酸。

关于双螺旋的“完全匹配”是指组成双螺旋的多或寡核苷酸链彼此形成双链结构，以至于每条链上的每个核苷酸都与另一条链上的一个核苷酸形成沃森-克里克碱基配对。此术语也可理解为指可以使用的核苷类似物的配对，所述类似物为例如脱氧肌苷、有2-氨基嘌呤碱基的核苷等。关于三螺旋，此术语是指由完全匹配的双螺旋与第三链组成的三螺旋，其中第三链的每个核苷酸与完全匹配的双螺旋的碱基对一起形成Hoogsteen或反向Hoogsteen连接。相反地，双螺旋中标记物与核苷酸间的“错配”是指双螺旋或三螺旋中的核苷酸对或核苷酸三体没能形成沃森-克里克和/或Hoogsteen和/或反向Hoogsteen键合。

参照序列与另一序列(即，“候选”序列)对比中使用的术语“同一性百分数”或类似术语，是指两个序列间最佳比对时，在个数相当于所给百分数的多个亚单位位置上候选序列与参照序列是同一的，亚单位是指用于多核苷酸对比的核苷酸或用于多肽对比的氨基酸。如本文所用，被比序列的“最佳比对”是指在构建比对时使亚单位间的匹配达到最大且所用的空位(gap)数目最小。用商业上的算法执行工具(Wisconsin序列分析软件包的“GAP”程序，Genetics Computer Group，Madison，WI)可以确定同一性百分数，所述算法见Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.，第48卷：第443-453页(1970)。本领域内用于构建比对和计算同一性百分数或用于相似性的其他测量的其他软件包包括基于Smith和Waterman的算法(Advances in Applied Mathematics，第2卷：第482-489页(1981))的“BestFit”程序(Wisconsin序列分析软件包，Genetics Computer Group，Madison，WI)。也就是说，例如，为了获得具有与参照氨基酸序列至少95％同一的氨基酸序列的多肽，可以将参照序列中不超过5％的氨基酸残基缺失或用其他氨基酸替换，或者可以将不超过参照序列中总氨基酸残基数的5％的氨基酸插入到参照序列中。参照序列的这些改变可以发生在参照氨基酸序列的氨基或羧基端位置，或者这两端位置之间的任何地方，单个地散布在参照序列的残基之间或以一个或多个连续组的形式分散于参照序列中。应当理解，在与本发明参照序列对比时，候选序列可以是更大的多肽或多核苷酸的组分或片段，并且用于计算同一性百分数目的的这种对比将就相关组分或片段进行。

本发明多肽或多核苷酸中涉及的术语“分离的”是指从其天然环境的成分中基本上分离出来。优选地，分离的多肽或多核苷酸是由与其天然环境的成分相比至少8％重量的、序列定义的多肽或多核苷酸组成的组合物；更优选地，此组合物由与其天然环境的成分相比至少95％重量的、序列定义的多肽或多核苷酸组成；甚至更优选，此组合物由与其天然环境的成分相比至少99％重量的、序列定义的多肽或多核苷酸组成。最优选地，分离的多肽或多核苷酸是通过基于分子量和等电点的双向凝胶电泳常规分离之后可以解析为单个点的均一组合物。用常规双向凝胶电泳进行此分析的操作方案是本领域普通技术人员已知的，例如，Hames和Rickwood，编，GelElectrophoresis of Proteins：A Practical Approach(IRL Press，Oxford，1981)；Scopes，Protein Purification(Springer-Verlag，New York，1982)；Rabilloud，编，Proteome Research：Two-Dimensional Gel Electrophoresisand Identification Methods(Springer-Verlag，Berlin，2000)。

本文所用的术语“寡核苷酸”是指有天然或修饰的单体或键的线性寡聚体，包括脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、其端基异构体形式、肽核酸(PNAs)等；这些寡核苷酸能以单体-单体相互作用的常规模式，例如，Watson-Crick型碱基配对、碱基堆积、Hoogsteen或反向Hoogsteen型碱基配对等与多核苷酸特异结合。通常，单体通过磷酸二酯键或其类似物相连，以形成大小从几个单体单位(例如3-4个)到几十个单体单位(如40-60个)的寡核苷酸。当寡核苷酸或多核苷酸以字母序列，例如“ATGCCTG”，或等价的小写字母表示时，除非上下文另有说明或不同理解，应理解为核苷酸从左到右是5′→3′顺序，“A”代表脱氧腺苷，“C”代表脱氧胞苷，“G”代表脱氧鸟苷，“T”代表脱氧胸苷，“U”代表尿苷。通常，本发明寡核苷酸含有四种天然核苷酸，一个与另一个之间以天然磷酸二酯键相连；然而它们也可含有非天然核苷酸类似物并且还可以含有非天然核苷间连接键，尤其在用作反义或诊断组合物时。本领域技术人员清楚，当含有天然或非天然核苷酸的寡核苷酸可以根据本发明使用时，在例如需要用酶处理的情况下，通常需要由天然核苷酸组成的寡核苷酸。

如本文所用，“核苷”包括天然核苷，包括2′-脱氧和2′-羟基形式，例如在Kornberg和Baker，DNA Replication，第二版(Freeman，SanFrancisco，1992)中所描述的。核苷“类似物”包括含有修饰碱基部分和/或修饰糖部分的合成核苷，如Scheit，Nucleotide Analogs(John Wiley，NewYork，1980)；Uhlman和Peyman，Chemical Reviews，第90卷：第543-584页(1990)等中所述的，唯一的条件是它们能进行特异杂交。这些类似物包括设计用于增强结合特性、降低复杂度、增强特异性等的合成核苷。

发明详述

本发明包括FGF23多肽及其相关组合物，此组合物包括但不限于编码FGF23多肽或其片段的寡核苷酸、对FGF23多肽或其片段特异的抗体、含有本发明多核苷酸的重组DNA构建体和载体以及用于复制FGF23多肽转录本或用于表达FGF23多肽的含有此类重组DNA构建体或载体的宿主细胞。本发明也包括药物组合物，其含有FGF23多肽、其激动剂或拮抗剂，特别是衍生自对FGF23多肽组合物特异的单克隆抗体的拮抗剂。

本发明的FGF23多肽及肽片段包括天然和人工变体，所述变体的氨基酸序列因一或多个替换、插入或缺失而与序列表中的参照氨基酸序列不同。这些变体通常通过用盒式或PCR诱变或本领域其他技术在编码FGF23多肽或肽片段的DNA中进行核苷酸位点特异诱变以产生编码变体的DNA、然后在重组细胞培养物中表达此DNA来制备，见下面更完全的描述。变体FGF23多肽也可以用下述的常规肽合成技术或汇集合成技术进行化学合成。

通过使用本发明寡核苷酸及分析技术对所选群体中的个体进行筛选可以获得本发明多肽的天然变体。优选地，用PCR或类似技术扩增含有全部或部分基因组区域的基因组区域，之后用常规方法对扩增序列测序，或者用常规技术在特定基因座对扩增序列进行分析，例如Taylor，编，Laboratory Methods for the Detection of Mutations and Polymorphisms inDNA(CRC Press，1997)；Landegren，编，Laboratory Protocols forMutation Detection(Oxford University Press，1996)；Shi，Clinical Chem.，第47卷：第164-172页(2001)；Pastinen等，Genome Res.，第10卷：第1031-1042页(2000)；Armstrong等，Cytometry，第40卷：第102-108页(2000)；Mein等，Genome Res.，第10卷：第330-343页(2000)；Li等Electrophoresis，第20卷：第1258-1265页(1999)等。然后此序列与本发明多核苷酸对比以确定是否出现影响编码蛋白的变异。优选地，FGF23多肽的天然变体在所选群体中有至少2％的频率，更优选地，此天然变体在所选群体中有至少5％的频率，甚至更优选，至少10％的频率。最优选地，此天然变体在所选群体中有至少20％的频率。所选群体可以是群体遗传学领域中认同的任何研究群体。优选地，所选群体是高加索人，黑人或亚洲人。更优选地，所选群体是法国人、德国人、英国人、西班牙人、瑞士人、日本人、中国人、爱尔兰人、朝鲜人、新加坡人、冰岛人、北美人、以色列人、阿拉伯人、土耳其人、希腊人、意大利人、波兰人、太平洋岛屿上的人、芬兰人、挪威人、瑞典人、爱沙尼亚人、澳大利亚人或印度人。更优选地，所选群体是冰岛人、拉普兰人(Saami)、芬兰人、有高加索人血统的法国人、瑞士人、华裔新加坡人、朝鲜人、日本人、魁北克人(Quebecian)、北美皮玛印第安人、Pennsylvanian Amish和Amish Mennonite、纽芬兰人或波利尼西亚人。优选的，所选群体由至少500个个体样本组成，更优选地，所选群体由至少1000个个体样本组成，最优选地，由至少2000个个体样本组成。

FGF家族成员的特征在于多种多样与生长和发育相关的生物活性，见例如Szebenyi等(上面引文)；Baird等(上面引文)，包括在中胚层来源细胞中的促分裂活性及在胚胎组织中的形态发生活性。FGF对其有促分裂作用的细胞类型包括NIH3T3细胞、BaF3细胞、人包皮成纤维细胞、人神经胶质细胞、人羊膜成纤维细胞和人表皮细胞，Gospodarowicz等.In Vitro，第14卷：第85-118页(1978)；Ornitz等，J.Biological Chemistry，第271卷：第15292-15297页(1996)；此文献中有关FGF促分裂活性的分析的描述通过参考并入此处。

FGF23多肽的重组制备

本文中描述的多核苷酸序列可用在重组DNA分子中，该DNA分子可在宿主细胞中指导相应多肽表达。由于遗传密码的简并性，其他DNA序列也可编码相当的氨基酸序列，也可用于克隆和表达FGF23多肽。为了增加表达速率和/或效率，可以选择特定宿主细胞优选的密码子并通过替换放入自然发生的核苷酸序列中。编码目的FGF23多肽的核酸(例如，cDNA或基因组DNA)可以插入用于克隆(扩增DNA)或用于表达的复制载体内。根据本领域已知的方法，多肽可以在多种表达系统的任一种中重组表达(Ausubel等，编，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley &Sons，New York，1990)。合适的宿主细胞包括酵母、细菌、古细菌、真菌、昆虫和动物细胞，包括哺乳动物细胞，例如原代细胞，包括干细胞，包括但不限于骨髓干细胞。更具体的，它们包括但不限于，微生物例如被重组噬菌体、质粒或柯斯质粒DNA表达载体转化的细菌，和被酵母表达载体转化的酵母。也包括被重组昆虫病毒(例如杆状病毒)感染的昆虫和哺乳动物表达系统。可以用各种不同的方法将待表达的核酸序列插入载体中。一般地，用本领域已知技术把DNA插入合适的限制性内切酶位点。载体成分一般包括，但不限于，一个或多个信号序列、复制起点，一个或多个标记基因、增强子元件、启动子、转录终止序列。可以用本领域技术人员已知的标准连接技术构建含有一个或多个此类成分的合适载体。

通过在可以诱导或引起本发明FGF23蛋白表达的合适条件下，培养被含有编码FGF23多肽的核酸的表达载体转化的宿主细胞可以生产本发明的FGF23多肽。适于FGF23多肽表达的条件随表达载体和宿主细胞的选择而变化，本领域技术人员通过常规试验可以容易地确定此条件。例如，表达载体中使用组成型启动子时需要优化宿主细胞的生长和增殖，而使用诱导型启动子时需要用于诱导的合适生长条件。另外，在一些实施方案中，收获时间的选择是重要的。例如，在昆虫细胞表达中使用的杆状病毒系统是裂解病毒，因此对产品产量而言收获时间的选择是至关重要的。

宿主细胞株系可以基于其以所期望的方式调节插入序列的表达的能力或者加工表达蛋白的能力选择。这些蛋白修饰包括但不限于，酰化、羧化、糖基化、磷酸化、脂化、乙酰化。切割蛋白的“前蛋白原”形式的翻译后加工对正确插入、折叠和/或功能也可能是重要的。例如，宿主细胞例如CHO、HeLa、BHK、MDCK、293、W138等对此翻译后活性有特定的细胞机器和特征机制，可对其进行选择以确保引入的外源蛋白的正确修饰和加工。特别有意义的是果蝇(Drosophia melangaster)细胞、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和其他酵母、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(Bacillus substilis)、SF9细胞、C129细胞、293细胞、链孢霉(Neurospora)、BHK、CHO、COS和HeLa细胞、成纤维细胞、神经鞘瘤(schwanoma)细胞系、哺乳动物永生化髓样和淋巴样细胞系、Jukat细胞、人细胞和其他原代细胞。

编码FGF23多肽的核酸必须是“可操作连接的”，即使其与另一核酸序列产生功能性关系。例如，将编码前序列或分泌前导序列的DNA与编码多肽的DNA可操作地连接，这样多肽可以表达为参与多肽分泌的前蛋白形式；将启动子或增强子与编码序列可操作地连接，这样它们可影响序列的转录；或者将核糖体结合位点与编码序列可操纵地连接，这样此核糖体结合位点的放置将利于翻译进行。通常，“可操作连接的”DNA序列是邻接的，并且，对于分泌前导序列而言，是邻接的且在阅读框中。然而，增强子不必是邻接的。结合通过在合适限制位点的连接完成。如果这些位点不存在，可以根据常规的实践方法使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。启动子序列编码组成型或诱导型启动子。启动子可以是天然的启动子或杂合启动子。杂合启动子组合一个以上启动子的元件，也是本领域已知的，并且在本发明中是有用的。表达载体可以含有附加元件，例如，表达载体可以有两个复制系统，因此允许其在两种生物体中保持，例如在哺乳动物或昆虫细胞中表达并在原核宿主中克隆和扩增。表达和克隆载体都含有能使载体在一种或多种所选宿主细胞中复制的核酸序列。对于各种细菌、酵母和病毒，这些序列是已知的。来自质粒PBR322的复制起点对大多数革兰氏阴性菌是合适的，2：质粒复制起点对酵母是合适的，各种病毒复制起点(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)对哺乳动物细胞内的克隆载体是有用的。另外，对整合表达载体，表达载体在表达构建体的两侧含有至少一个与宿主细胞基因组同源的序列，优选地，有两个同源序列。通过选择合适的同源序列包括在载体中，整合载体可以被引入宿主细胞内的特异位点。整合载体的构建是本领域已知的。

优选地，表达载体含有选择标记基因以允许选择转化的宿主细胞。选择基因是本领域已知的，并因所用宿主细胞不同而不同。表达和克隆载体典型地含有选择基因，也称为选择标记。典型的选择基因编码如下蛋白：(a)赋于对抗生素或其他毒素，例如氨苄青霉素、新霉素、氨甲蝶呤或四环素的抗性的蛋白，(b)弥补营养缺陷型的缺陷的蛋白，或者(c)提供复合培养基中没有的关键营养成分的蛋白，例如，编码芽孢杆菌D-丙氨酸消旋酶的基因。

编码前列腺肿瘤抗原的核苷酸序列转化的宿主细胞可以在适合于从细胞培养物中表达和回收此编码蛋白的条件下培养。根据所用的序列和/或载体，重组细胞产生的蛋白可以是分泌的、膜结合的或胞内的。本领域技术人员可以理解，可以设计带有信号序列的、含有编码FGF23多肽的多核苷酸的表达载体，此信号序列将引导FGF23多肽分泌穿过原核或真核细胞膜。目的FGF23多肽不但可以直接地而且可以与异源多肽形成融合多肽进行重组表达，此异源多肽可以是在成熟蛋白或多肽的N端有特异切割位点的信号序列或其他多肽。总之，信号序列可以是载体的组分，或者可以是插入载体中的编码FGF23多肽的DNA的一部分。信号序列可以是原核信号序列，例如，选自：碱性磷酸酶、青霉素酶、Ipp或热稳定肠毒素∏的前导序列。对于酵母中的分泌，信号序列可以是，例如，酵母转化酶前导序列、α因子前导序列(包括酵母属(Saccharomyces)和克鲁维酵母属(Kluyveromyces)α-因子前导序列，后者在美国专利号5,010,182中有描述)，或者酸性磷酸酶前导序列、白色念珠菌(C albicans)葡糖淀粉酶前导序列(EP362，179，1999年4月4日出版)，或WO90113646(1990年11月15日出版)中描述的信号序列。在哺乳动物细胞中表达时，哺乳动物信号序列可用于引导蛋白分泌，例如来自同一或相关物种的分泌多肽的信号序列以及病毒分泌前导序列。根据所选的表达系统，将编码序列插入合适载体中，而载体可能需要某些特征性“控制元件”或“调节序列”的存在。合适的构建体通常是本领域已知的(Ausubel等，1990)，在许多情况下，能从供应商，例如Invitrogen(San Diego，Calif.)，Stratagene(LaJolla，Calif.)，Gibco BRL(Rockville，Md.)或者Clontech(Palo Alto，Calif.)处获得。

在细菌系统中表达。可以用可诱导启动子例如“BLUESCRIPT”噬粒(stratagene)或“pSPORT1”(Gibco BRL)的杂合LacZ启动子使细菌细胞得以转化。另外，有许多表达载体可供选择用于细菌细胞中以生产能被容易地检测和/或纯化的可切割融合蛋白，所述载体包括但不限于“BLUESCRIPT”(α-半乳糖苷酶；stratagene)或pGEX(谷胱甘肽-s-转移酶；Promega，Madison，Wis.)。合适的细菌启动子是能结合细菌RNA聚合酶并启动下游(3′)编码FGF23多肽序列的基因转录成mRNA的任何核酸序列。细菌启动子有通常位于编码序列5′端附近的转录起始区。这个转录起始区典型地包括RNA聚合酶结合位点和转录起始位点。编码代谢途径酶的序列提供了特别有用的启动子序列。例子包括来自糖(例如半乳糖、乳糖、麦芽糖)代谢酶的启动子序列；以及来自生物合成酶例如色氨酸生物合成酶的序列。也可以使用来自噬菌体的启动子，其是本领域已知的。另外，合成的启动子及杂合启动子也是可用的；例如，tat启动子是trp和lac启动子序列的杂合体。还有，细菌启动子也可以包括能与细菌RNA聚合酶结合并启动转录的非细菌来源的天然启动子。也可能需要存在有效的核糖体结合位点。表达载体也可以包括引导前列腺肿瘤抗原蛋白在细菌中分泌的信号肽序列。信号序列典型地编码引导蛋白从细胞中分泌的、由疏水氨基酸组成的信号肽，这是本领域已知的。蛋白可以分泌到生长培养基(革兰氏阳性菌)或者分泌到周质间隙—位于内外细胞膜之间(革兰氏阴性菌)。细菌表达载体也可以包括允许筛选被转化细菌株的可选择标记基因。合适的选择基因包括药物抗性基因例如氨苄青霉素、氯霉素、红霉素、卡那霉素、新霉素和四环素抗性基因。选择标记也包括生物合成基因，例如组氨酸、色氨酸和亮氨酸生物合成途经中的基因。当需要大量FGF23多肽，例如用于诱导抗体时，可能需要能指导容易纯化的融合蛋白高水平表达的载体。这些载体包括但不限于，多功能大肠杆菌克隆和表达载体例如BLUESCRIPT(stratagene)，其中编码前列腺肿瘤抗原的序列可以与编码β-半乳糖苷酶的氨基端Met及随后的7个残基的序列以符合阅读框的形式一起连入载体，以产生杂合蛋白；PIN载体[Van Heeke & SchusterJ.Biol.Chem第264卷：第5503-5509页1989]；PET载体(Novagen，MadisonWis)；及类似的载体。细菌表达载体包括上面列出的各种成分，并是本领域已知的。例子包括枯草芽孢杆菌的载体、大肠杆菌的载体，乳脂链球菌(Streptococcus cremovis)的载体、Streptococcus lividans的载体等等。用本领域已知的技术，例如，氯化钙介导的转染、电穿孔等，可以将细菌表达载体转化入细菌宿主细胞。

在酵母中表达。酵母表达系统是本领域已知的，包括用于酿酒酵母、白色念珠菌和C.maltosa、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)和乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、季也蒙毕赤酵母(Pichia guilliermondii)和巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)、粟酒裂殖酵母(schizosaccharomyces pomb)和Yarrowia lipolytica的表达载体。在酵母宿主中使用的合适启动子的例子包括3-磷酸甘油酸激酶的启动子[Hitzeman等，J.Biol.Chem.第255卷：第2073页(1980)]或其他糖酵解酶的启动子[Hess等，J.Adv.Enzyme Reg.第7卷第149页(1968)；Holland，Biochemistry第17卷：第4900页(1978)]，例如烯醇化酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、6-磷酸葡萄糖异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、丙糖磷酸异构酶、磷酸葡糖异构酶、α因子、ADH2IGAPDH的启动子、葡糖激酶醇氧化酶和PGH的启动子。[参见例如，Ausubel等，1990；Grant等，Methods in Enzymology第153卷：第516-544页，(1987)]。其他诱导型酵母启动子具有生长条件控制转录的额外优点，包括醇脱氢酶2、isocytochrome C、酸性磷酸酶、与氮代谢有关的降解酶、金属硫蛋白、3-磷酸甘油醛脱氢酶及负责麦芽糖和半乳糖使用的酶的启动子区域。在酵母表达中使用的合适载体和启动子在EP73,657中有进一步描述。酵母选择标记包括ADE2、His4、LEU2、TRP1和ALG7，它们赋予衣霉素抗性；新霉素磷酸转移酶基因，它赋予G418抗性；CUP1基因，它允许酵母在有铜离子存在下生长。可以构建用于从编码目的FGF3多肽的DNA胞内生产或分泌FGF23多肽的酵母表达载体。例如，可将所选的信号肽与合适的组成型或诱导型启动子插入到所选质粒的合适限制位点内，以引导FGF23多肽的胞内表达。为了FGF23多肽的分泌，可以将编码FGF23多肽的DNA与编码启动子、酵母α-因子分泌信号/前导序列和接头序列(如果需要)的DNA一起克隆入所选质粒，以表达FGF23多肽。然后用上述表达质粒转化酵母细胞，并在合适的发酵培养基中培养。然后可以用10％三氯乙酸沉淀来浓缩由此转化酵母产生的蛋白，并在SDS-PAGE分离及用考马斯蓝染色之后进行分析。随后用本领域技术人员已知的技术可以从发酵培养基中分离并纯化重组FGF23多肽。

在哺乳动物系统中表达。FGF23多肽可以在哺乳动物细胞中表达。哺乳动物表达系统是本领域已知的，包括逆转录病毒载体介导的表达系统。可以用许多不同的基于病毒，例如腺病毒的表达系统中的任一种来转化哺乳动物宿主细胞，其中编码区可以连接入由晚期启动子和三联前导序列组成的腺病毒转录/翻译复合体中。在此病毒基因组的非必需E1或E3区的插入可产生能在感染的宿主细胞中表达目的多肽的活病毒。优选的表达载体系统是逆转录病毒载体系统，例如在PCT/US97/01019和PCT/US97/101048中有大体描述。合适的哺乳动物表达载体含有哺乳动物启动子，它是能结合哺乳动物RNA聚合酶并启动下游(3′)编码FGF23多肽的序列转录成mRNA的任何DNA序列。启动子有通常位于编码序列5′端附近的转录起始区，和位于转录起始位点上游25～30个碱基对处的TATA盒。据认为TATA盒引导RNA聚合酶II在正确位点开始RNA合成。哺乳动物启动子也包括上游启动子元件(增强子元件)，通常位于TATA盒上游100到200个碱基对处。上游启动子元件决定转录起始速率并且可以在任一方向上都起作用。尤其有用的哺乳动物启动子是来自哺乳动物病毒基因的启动子，因为病毒基因通常高表达并有宽的宿主范围。例子包括来自病毒基因组的启动子，例如多瘤病毒、禽痘病毒、(UK2,211,540，1989年7月5日出版)，腺病毒(例如腺病毒2)，牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒和猿猴病毒40(sv40)的启动子；来自异源哺乳动物的启动子，例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子；来自热休克的启动子，前提是这些启动子应与宿主细胞系统相容。在载体中插入增强子序列可以增强高等真核生物中编码FGF23多肽的DNA的转录。增强子是DNA的顺式作用元件，通常大约10到300bp，它作用于启动子以增强其转录。来自哺乳动物基因(珠蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白、和胰岛素)的许多增强子序列现在是已知的。然而，通常人们使用来自真核细胞病毒的增强子。例子包括SV40增强子，巨细胞病毒早期启动子的增强子，多瘤病毒复制起点晚期侧的增强子，和腺病毒增强子。增强子优选位于启动子的5′端。通常，哺乳动物细胞识别的转录终止和聚腺苷酸化序列是位于转录终止密码子3′的调控区，因此，与启动子元件一起位于编码序列的两侧。成熟mRNA的3′端是通过位点特异性转录后切割和聚腺苷酸化形成的。转录终止子和聚腺苷酸化信号的例子包括来自SV40的那些。在稳定表达系统中可以进行长期、高产量的蛋白生产。为此可以使用含有病毒复制起点或内源表达元件和选择标记基因的表达载体。含有可用于哺乳动物细胞中的选择标记的合适载体在商业上容易获得，并且是本领域技术人员已知的。这些选择标记的例子包括但不限于，在tk-或hprt-细胞中分别使用的单纯疱疹病毒胸苷激酶和腺嘌呤磷酸核糖转移酶。将外源核酸引入哺乳动物宿主及其他宿主中的方法为本领域已知，并因所用宿主细胞的不同而异。技术包括葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、polybrene介导的转染、原生质体融合、电穿孔、病毒感染、在脂质体内将多核苷酸包囊化、以及将DNA直接微注射到细胞核中。

在昆虫细胞中表达。FGF23多肽也可以在昆虫细胞中产生。用于转化昆虫细胞的表达载体，尤其是基于杆状病毒的表达载体，是本领域已知的。在这样一个系统中，编码FGF23多肽的DNA融合于杆状病毒表达载体内的附加表位的上游。可以用苜蓿银纹夜蛾(Autographa california)核型多角体病毒(AcNPV)作为载体以在草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)sf9细胞或粉纹夜蛾(Trichoplusia)幼虫中表达外源蛋白。编码FGF23多肽的序列克隆入病毒非必需区，例如多角体蛋白基因中，并置于多角体蛋白启动子的控制下。编码FGF23多肽的序列的成功插入将使多角体蛋白基因失活并产生缺少外壳蛋白的重组病毒。然后重组病毒用于感染草地夜蛾细胞或粉纹夜蛾幼虫，而FGF23多肽将在其中表达[Smith等，J.Wol.第46卷：第584页(1994)；Engelhard E K等，Proc.Nat.Acad.Sci.第91卷：第3224-3227页(1994)]。与编码FGF23多肽的DNA融合的合适附加表位包括聚-组氨酸标签及免疫球蛋白标签(如IgG的Fc区)。可以使用许多质粒，包括商业上可获得的质粒例如pVL1393(Novagen)。简要地，用与5′和3′区互补的引物通过PCR扩增编码FGF23多肽的DNA或者编码FGF23多肽的期望部分的DNA。5′引物可以在其侧加入限制位点。然后用所选限制酶消化PCR产物并亚克隆入表达载体。用脂转染试剂(可从GIBCO-BRL商业上获得)或本领域技术人员已知的其他方法，将以上质粒和BaculoGold^TM病毒DNA(Pharmingen)共转染入草地夜蛾(“Sf9”)细胞(ATCC CRL 1711)中产生重组杆状病毒。将sf9细胞在28℃培养4-5天产生病毒，并用于进一步扩增。所使用的方法在O′Reilley等，BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS：A LABORATORYMANUAL，Oxford University Press(1994)中有进一步描述。如Rupert等，Nature第362卷：第175-179页(1993)所述从感染重组病毒的Sf9细胞中制备提取物。可选择地，表达的有附加表位的FGF23多肽可以用亲合层析纯化，或者例如，可以使用层析技术，包括蛋白质A或蛋白质G柱层析，进行带IgG标记(或Fc标记)的FGF23多肽的纯化。

基因表达的估计。可以简单地用例如本领域技术人员已知的标准技术并用基于本文提供的序列的合适标记的探针来估计样品中的基因表达，所述技术例如，DNA印迹法(用于DNA检测)，RNA印迹法(测定mRNA的转录)，斑点印迹(DNA或RNA)或原位杂交。可选择地，抗体可用在检测核酸的分析中，例如用于检测特定双链体，包括DNA双链体、RNA双链体、DNA-RNA杂合双链体或者DNA-蛋白双链体。可以标记这些抗体并在双链体可与表面结合的地方进行测定，以使表面上形成双链体时，可以检测到与双链体结合的抗体的存在。可选择地，可以用细胞或组织切片的免疫组织化学染色和对细胞培养物或体液的分析测定基因表达，以直接估计FGF23多肽的表达。用于此免疫分析的抗体可以是单抗或者多抗，并可以针对基于本文提供的DNA序列的FGF23多肽天然序列制备抗体。

表达蛋白的纯化。可以用本领域技术人员已知的多种方法中任一种在FGF23多肽表达之后纯化或分离表达的FGF23多肽。依据样品中存在的其他组分的不同，所用的合适技术也不同。通过分离或纯化去除的污染物组分是通常干涉多肽的诊断或治疗用途的物质，可能包括酶、激素和其他溶质。所选的纯化步骤依赖于，例如，所用的生产方法的性质以及所生产的特定FGF23多肽。FGF23多肽或蛋白可以从培养基或从宿主细胞溶解物中回收。如果是膜结合的，可以用合适的去污剂溶液(例如Triton-X100)或用酶切使之从膜上释放。可选择地，用于表达FGF23多肽的细胞可以用不同的物理或化学方法裂解，例如冻融循环、超声波降解、机械裂解或用细胞溶解剂。纯化方法的示例包括但不限于，离子交换柱层析；用硅胶或阳离子交换树脂(例如DEAE)的层析；用例如，SephadexG-75的凝胶过滤；去除污染物例如IgG的蛋白质A Sepharose柱；使用金属螯合柱结合具附加表位的FGF23多肽的层析；乙醇沉淀；反相HPLC；层析聚焦；SDS-PAGE；硫酸铵沉淀。通常地，用至少一个纯化步骤制备分离的FGF23多肽。例如，可以用标准抗-FGF23多肽抗体柱纯化FGF23多肽。与蛋白浓缩相关的超滤和透析技术也是有用的(参见，例如，Scopes，R.，PROTEINPURIFICATION，Springer-Verlag，New York，N.Y.，1982)。所需的纯化程度随FGF23多肽的用途不同而不同。在某些情况下，不纯化是必须的。一旦按需要进行表达和纯化后，本发明的FGF23多肽与核酸可用于多种应用中，如下面详述。

表达蛋白的标记。本发明的核酸、蛋白和抗体可被标记。本文中被标记是指化合物连接上至少一个元素、同位素或化学化合物以使其能被检测到。通常，标记分为三类：a)同位素标记，可以是放射性或重同位素；b)免疫标记，可以是抗体或抗原；c)有色或荧光染料。标记可以并入化合物的任何位置，只要它不影响被检测的化合物的生物活性或特性。

FGF23多肽融合蛋白。本发明FGF23多肽也可被修饰以形成含有与另一个异源多肽或氨基酸序列融合的FGF23多肽的嵌合分子。本文所用的术语“融合蛋白”指含有与“导向多肽”融合的FGF23多肽或其结构域序列的嵌合多肽。导向多肽应有足够的残基以利于导向特定细胞类型或受体，然而它也应足够小以至于不影响FGF23多肽的生物学功能。导向多肽优选还具有相当的独特性，以至于融合蛋白不与其他细胞类型或受体有实质上的交叉反应。合适的导向多肽通常有至少约10个氨基酸残基，并且通常在约10到约500个氨基酸残基之间。优选导向多肽有约20到约200个氨基酸残基。融合蛋白也可以包括标签多肽与FGF23多肽的融合物，所述标签多肽将提供抗-标签抗体能选择结合的表位。附加表位通常置于FGF23多肽的氨基或羧基端。可以用抗标签多肽的抗体来检测FGF23多肽的这些具附加表位的形式。而且，附加表位的提供可以使FGF23多肽能通过使用抗-标签抗体或能与附加表位结合的其他类型亲合基质而容易地被纯化。可选择地，融合蛋白可以包括FGF23多肽与免疫球蛋白或免疫球蛋白特定区域的融合物。对于二价形式的嵌合分子，此融合可以是与IgG分子的Fc段或者，例如，GM-CSF的融合。优选的融合蛋白包括但不限于，能促进FGF23多肽的免疫寻靶的分子。可以用本领域已知的技术制备用于各种其他目的的FGF23多肽融合蛋白。例如，为了制备抗体，如果目的表位很小，可以用部分或完全的FGF23多肽与载体蛋白融合以形成免疫原。可选择地，可以将FGF23多肽制成融合蛋白以增强该抗原刺激细胞和/或体液(基于抗体)免疫应答的能力，或达到其他目的。

编码FGF23多肽的合成基因。一旦能够得到天然蛋白的核酸序列和/或氨基酸序列信息，就能够用现有的多种技术在天然序列内造成实质上的突变，例如，Shortle，Science，第229卷，第1193-1201页(1985)；Zoller和Smith，Methods in Enzymology，第100卷，第468-500页(1983)；Mark等，美国专利号4,518,584；Wells等，Gene，第34卷，第315-323页(1985)；Estell等，Science，第233卷，第659-663页(1986)；Mullenbach等，J.Biol.Chem.，第261卷，第719-722页(1986)；Feretti等，Proc.Natl.Acad.Sci.，第83卷，第597-603页(1986)，因此，这些文献以参考文献的形式并入本文。

天然多肽的变体(有时称作“突变蛋白质”)在多种情况下是希望得到的。例如，可以用特定变体降低不想要的副作用，特别是当副作用活性和想要的活性与多肽中不同部分相关时。在一些表达系统中，天然多肽易于被蛋白酶降解。在这种情况下，通过氨基酸的选择性替换和/或删除来改变易降解序列能显著地增加产量，例如，英国专利申请号2173-804-A，其中人组织血纤维蛋白溶酶原激活物中275位的Arg被Gly或Glu替换。通过消除易于被氧化、酰化、烷化或其他化学修饰的氨基酸，变体也可以增加纯化过程中的产量和/或增强蛋白的保存期。见例如，甲硫氨酸易于被氧化形成亚砜，这在许多蛋白中与生物活性的丧失有关，见例如Brot和Weissbach，Arch.Biochem.Biophys.，第223卷，第271页(1983)。甲硫氨酸常被更惰性的氨基酸置换且几乎不或完全不丧失生物活性，例如澳大利亚专利申请号AU-A-52451/86。在细菌表达系统中，有时可以通过消除或置换构象不必需的半胱氨酸残基来增加产量，例如，Mark等，美国专利号4,518,584。

优选地使用盒式诱变产生突变蛋白。用具有独特(当插入合适载体中)限制性内切酶位点的序列构建合成基因，其中这些位点沿基因近乎均一地间隔。这些独特限制位点允许基因片段方便地被切除并被编码所需突变的合成寡核苷酸(即，“盒子”)替换。确定独特限制位点的数目和分布必需考虑几个因素，包括(1)在用于表达的载体中预先存在的限制位点，(2)物种或属特异的密码子使用是否是想要的，(3)能够得到的不同非载体切割限制性内切酶的数目(和它们在合成基因中的复数(multiplicity))，(4)独特限制位点间的片段的合成和/或测序的方便性和可靠性。

以上技术对于天然蛋白序列中保守氨基酸替换及类似的替代是方便的方法。此处所用“保守”指(i)改变尽量是构象中性的，就是说，设计以产生与天然蛋白相比三级结构最小变化的突变多肽，(ii)改变尽量是抗原性中性的，就是说，设计以产生与天然蛋白相比抗原决定簇最小变化的突变多肽。以下是将氨基酸分为相似类的优选分类：芳族(phe，trp，tyr)，疏水的(leu，ile，val)，极性的(gln，asn)，碱性的(arg，lys，his)，酸性的(asp，glu)，小的(ala，ser，thr，met，gly)。构象中性是保持生物活性所需的，抗原性中性是给患者或动物使用本发明化合物时避免引发免疫反应所需的。尽管绝对肯定地选择构象和抗原性中性的替代是困难的，但存在能指导本领域技术人员的规则，通过这些规则可以使改变有很大可能性为构象和抗原性中性的，例如Anfisen(上述引文)；Berzofsky，Science，第229卷，第932-940页1985)；和Bowie等，Science，第247卷，第1306-1310页(1990)。一些更重要的规则包括(1)替换疏水残基使抗原性变化的可能性较小，因为它们可能位于蛋白的内部，例如Berzofsky(上面引文)和Bowie等(上面引文)；(2)生理化学相似，即同义的残基替换产生构象改变的可能性较小，因为替换氨基酸能扮演与被替换氨基酸相同的结构角色；(3)进化保守序列的改变可能产生有害的构象效应，因为进化保守意味着序列可能是功能上重要的。除了选择变体序列的这些基本规则外，可以进行分析以确认所构建的分子的生物活性及构象。上面更完全地描述了本发明多肽的生物学分析。可以用至少两个已知的方法检验构象的变化：微量补体结合法，例如Wasserman等，J.Immunol.，第87卷，第290-295页(1961)，或Levine等.Methods in Enzymology，第11卷，第928-936页(1967)，该方法在蛋白三级结构的进化研究上广泛应用；以及与多组构象特异单克隆抗体的亲合性，例如Lewis等，Biochemistry，第22卷，第948-954页(1983)。

FGF23多肽的化学生产

可以用标准技术合成本发明的肽，例如Stewart和Young，Solid PhasePeptide Synthesis，第二版(Pierce Chemical Company，Rockford，IL，1984)。优选地，使用商业上的肽合成仪，例如Applied Biosystem，Inc.(fosterCity，CA)的430A型，可以用汇聚合成方法从多个分别合成并纯化的肽装配本发明多肽，例如Kent等，美国专利号6,184,344；Dawson和Kent，Annu.Rev.Biochem.，第69卷第923-960页(2000)。可以在交联聚苯乙烯支持物上通过固相合成来装配本发明的肽，即从羧基端残基开始逐步加上氨基酸直至形成完整肽。以下文献是对合成中使用的化学的指导：Schnolzer等，Int.J.Peptide Protein Res.，第40卷第180-193页(1992)；Merrifield，J.Amer.Chem.Soc.，第85卷，第2149页(1963)；Kent等，第185页《Peptides》1984，Ragnarsson，编(Almquist and Weksell，Stockholm，1984)；Kent等，第217页《Peptide Chemistry》84，Izumiya，编(Protein ResearchFoundation，B.H.Osaka，1985)；Merrifield，Science，第232卷，第341-347页(1986)；Kent，Ann.Rev.Biochem.，第57卷，第957-989页(1988)，及在后两篇文献中引用的文献。

固相合成中最重要的是清除副产物的合成，它主要是终止、缺失或修饰的肽。通过使用无杂质且充分表征的树脂、无杂质的氨基酸衍生物、无杂质溶剂并对正确的偶联及切割方法和反应条件进行选择可以消除或最小化大多数副反应，例如Barany和Merrifield，The Peptides，Cross andMeienhofer，Eds.，第2卷，第1-284页(Academic Press，New York，1979)。重要的是监测偶联反应以确定它们进行完全，这样可以避免出现缺失一个或多个残基的缺失肽。定量的茚三酮反应可用于此目的，Sarin等，Anal.Biochem，117卷，147页(1981)。Na-叔丁氧羧基(t-Boc)-氨基酸与在链装配条件下稳定而在强酸下不稳定的合适侧链保护基一起使用。受保护的肽链装配完之后，在硫酯清除剂存在下用先低浓度后高浓度的无水氟化氢去除保护基并切割肽的锚定键，Tam等，J.Amer.Chem.Soc.，第105卷，第6442页(1983)。使用的侧链保护基是Asp(OBzl)、Glu(OBzl)、ser(Bzl)、Thr(Bzl)、Lys(Cl-Z)、Tyr(Br-Z)、Arg(NGTos)、Cys(4-MeBzl)、His(ImDNP)。(Bzl，苄基；Tos，甲苯磺酰基；DNP，二硝基苯基；Im，咪唑；Z，苄氧羰基)。剩下的氨基酸无侧链保护基。每圈循环使tBoc Na保护的肽-树脂暴露于二氯甲烷(DCM)(Mallenckrodt)中的65％三氟乙酸(来自EastmanKodak)(用前蒸馏)：先1分钟后13分钟以去除Na保护基。在DCM中洗肽-树脂，用二甲基甲酰胺(DMF)(Applied Biosystems)中的10％二异丙基乙基胺(DIEA)(Aldrich)中和两次，每次1分钟。之后用DMF洗涤进行中和。用氨基酸的对称酸酐在DMF中16分钟进行偶联。此对称酸酐通过在6ml DCM中溶解2mmol氨基酸并加入2ml DCM中的1mmol二环己基碳二亚胺(Aldrich)在合成仪上制备。5分钟后，活化的氨基酸转到单独的管中，用连续氮气流吹洗使DCM蒸发。在吹洗的不同阶段用DMF(共6ml)代替DCM。初次偶联之后，用DCM、DCM中10％DIEA、然后用DCM清洗肽-树脂。为了再次偶联，将相同的氨基酸和激活剂，二环己基碳二亚胺，顺序转入反应管中。原位激活并偶联10分钟之后，加入足够的DMF以制成50％DMF-DCM混合物，偶联持续15分钟。精氨酸在DMF中以羟基苯并三唑(Aldrich)酯的形式偶联60分钟，然后以相同的方式与其他氨基酸再偶联。天冬酰胺与谷氨酰胺在DMF中以羟基苯并三唑酯形式偶联两次，每次偶联40分钟。对于所有残基，第二次偶联后洗涤树脂，样品自动采集，用于通过定量茚三酮反应监测未偶联残基的α-氨基，Sarin等。(上面引文)。

优选地，通过天然化学连接装配寡肽来实施本发明多肽的化学合成，见如Dawson等，Science，第266卷第776-779页(1994)；Kent等，美国专利号6,184,344所述。简要地，此方法中第一寡肽提供有未氧化巯基侧链的N端半胱氨酸，第二寡肽提供C端硫酯。然后N端半胱氨酸的未氧化巯基侧链与C端硫酯缩合以产生通过β-氨基硫酯键连接第一和第二寡肽的中间寡肽。然后中间寡肽的β-氨基硫酯键进行分子内重排，产生通过酰胺键连接第一和第二寡肽的寡肽产物。优选地，如下述用环状噻唑烷保护基保护内在片段的N端半胱氨酸免受不想要的环化和/或串联反应。优选地，此环状噻唑烷保护基是硫脯氨酰基团(thioprolinyl group)。

可以如下列文献所述制备有C端硫酯的寡肽，这些文献以参考文献的形式并入：Kent等，美国专利号6,184,344；Tam等，Proc.Natl.Acad.Sci.，第92卷第12485-12489页(1995)；Blake，Int.J.Peptide Protein Res.，第17卷第273页(1981)；Canne等，Tetrahedron Letters，第36卷第1217-1220页(1995)；Hackeng等，Proc.Natl.Acad.Sci.，第94卷第7845-7850页(1997)；或Hackeng等，Proc.Natl.Acad.Sci.，第96卷第10068-10073页(1999)。优选地，使用Hackeng等(1999)所述的方法。简要地，在固相支持物(下述)上合成寡肽，通常在0.25mmol规模上，对于Boc化学使用原位中和/HBTu激活步骤进行，如Schnolzer等，Int.J.Peptide Protein Res.，第40卷第180-193页(1992)所述，其以参考文献形式并入此处。(HBTu是2-(lH-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐，Boc是叔丁氧羰基)。每个合成循环的组成为：用纯TFA处理1到2分钟以去除N^α-Boc、1分钟DMF流洗，在DIEA存在下用1.0mmol预活化的Boc-氨基酸进行10-20分钟偶联之后第二次DMF流洗。(TFA是三氟乙酸，DMF是N，N-二甲基替甲酰胺，DIEA是N，N-二异丙基乙胺)。其中在过量DIEA(3mmol)存在下用1.0mmol HBTu(DMF中0.5M)预活化N^α-Boc-氨基酸(1.1mmol)3分钟。每个偶联步骤之后，用常规定量茚三酮分析通过测量残基的自由氨基来确定产率，例如，见Sarin等，Anal.Biochem.，第117卷第147-157页(1981)所示。Gln残基偶联之后，用TFA去保护之前和之后用DCM流洗，以防止可能的高温(TFA/DMF)催化的吡咯烷酮形成。链装配完成之后，通过用无水氟化氢在0℃处理1小时及将4％对甲酚用作清除剂使寡肽去保护并从树脂上切除。因为dnp去除步骤与C端硫酯基团不相容，所以咪唑侧链的2，4-二硝基苯基(dnp)保护基仍在His残基上。然而，可以在连接反应中用硫醇逐步去除dnp。切除之后，用冰冷的乙醚沉淀寡肽，在含水乙腈中溶解，冻干。

上述硫酯寡肽优选在三苯甲基连接的巯基丙酸-亮氨酸(TAMPAL)树脂上合成，此树脂的制备利用如Hackeng等(1999)所示方案或类似方案。简要地，在6mmol DIEA存在下用3.6mmol HBTu活化N^α-Boc-Leu(4mmol)，与2mmol对甲基二苯甲基胺(MBHA)树脂或等价物偶联16分钟。之后，在6mmol DIEA存在下用2.7mmol HBTu活化3mmolS-三苯甲基巯基丙酸，与Leu-MBHA树脂偶联16分钟。用TFA中的3.5％三异丙基硅烷和2.5％水处理两次各1分钟去除三苯甲基保护基之后，产生的TAMPAL树脂可用作多肽链装配的起始树脂。用标准原位中和肽偶联方案处理1小时可以与任何想要的氨基酸形成硫酯键，如Schnolzer等(以上引文)所公开。用无水HF处理最终寡肽产生C端活化的巯基丙酸-亮氨酸(MPAL)硫酯寡肽。

优选地，在如Hackeng等(1999)所述条件下或类似条件下，在天然化学连接中使用噻唑烷保护的硫酯寡肽中间体。简要地，向待连接的干燥肽中加入含有6M胍、4％(v/v)苄硫醇、4％(v/v)苯硫酚的0.1M磷酸缓冲液(pH8.5)，得到最终肽浓度为1-3mM且pH为约7，pH降低是由于加入了硫醇和来自冻干肽的TFA。优选地，在加热器中37℃进行连接反应，同时周期性涡旋以平衡硫醇添加剂。可以用MALDI-MS或HPLC及电喷射离子化MS监测反应的完成度。

天然化学连接反应完成或终止后，用半胱氨酸去保护剂，例如O-甲基羟胺(0.5M)在37℃及pH3.5-4.5处理2小时，打开产物的N端噻唑烷环，之后将10倍过量的Tris-(2-羧基乙基)-膦加入到反应混合物中以完全还原任何氧化反应成分，之后用常规制备性HPLC纯化产物。优选地，含有连接产物的组分用电喷射MS鉴定、之后合并、冻干。

合成完成及最终产物纯化之后，用常规技术使最终多肽产物重折叠，例如Creighton，Meth.Enzymol.，第107卷第305-329页(1984)；White，Meth.Enzymol.，第11卷第481-484页(1967)；Wetlaufer，Meth.Enzymol.，第107卷第301-304页(1984)等。优选地，用空气氧化通过以下步骤或类似方法使最终产物重折叠：在有100mM Tris、10mM甲硫氨酸pH8.6的1M盐酸胍(或类似的离液剂)中溶解还原的冻干产物(约0.1mg/ml)。轻柔搅拌过夜之后，用常规方法通过反相HPLC分离重折叠产物。

抗-FGF23多肽抗体

本发明还提供了抗-FGF23多肽抗体。本发明抗体包括多克隆、单克隆、人源化、双特异性和异源缀合抗体。

多克隆抗体。本发明的抗-FGF23多肽抗体可以是多克隆抗体。制备多克隆抗体的方法是本领域技术人员已知的。这些多克隆抗体可在哺乳动物中产生，例如，在一或多次注射免疫剂及优选地佐剂后。典型地，用一系列皮下或腹膜内注射把免疫剂和/或佐剂注射入哺乳动物体内。免疫剂包括FGF23多肽或其融合蛋白。将抗原与已知在被免疫动物体内有免疫原性的蛋白连接可能是有用的。这些有免疫原性的蛋白的例子包括但不限于，匙孔虫戚血蓝蛋白(KLH)、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白和大豆胰蛋白酶抑制剂。佐剂包括，例如，弗氏完全佐剂和MPL-TDM佐剂(单磷酰脂A，合成的海藻糖二霉菌酸脂)。基于标准方案或用常规实验，本领域技术人员能确定免疫方案。

单克隆抗体。可选择地，抗-FGF23多肽抗体可以是单克隆抗体。可以用杂交瘤生产单克隆抗体，其中用免疫剂免疫小鼠、仓鼠或其他合适宿主动物，以引起将产生或能够产生与免疫剂特异结合的抗体的淋巴细胞[Kohler和Milstein，Nature第256卷：第495页(1975)]。可选择地，可以在体外免疫淋巴细胞。免疫剂典型地包括FGF23多肽或其融合蛋白。一般地，如果需要非人哺乳动物来源则使用脾细胞或淋巴结细胞，如果用人源细胞则使用外周血淋巴细胞(“PBL”)。用适合的融合剂，例如聚乙二醇，把淋巴细胞与无限增殖化细胞系融合，以产生杂交瘤细胞[Goding，MONOCLONAL ANTIBODIES：PRINCIPLES AND PRACTICE，Academic Press，第59-103页(1986)]。通常，无限增殖化细胞系是转化的哺乳动物细胞，例如，大鼠、小鼠、牛或人源的骨髓瘤细胞。在合适培养基中培养杂交瘤细胞，此培养基优选含有一种或多种抑制未融合的无限增殖化细胞生长或存活的物质。例如，如果亲本细胞缺少次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)，杂交瘤的培养基典型地包括次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸苷(HAT)，这些物质能抑制HGPRT缺陷型细胞的生长。优选无限增殖化细胞系能有效融合、支持抗体稳定高水平表达并且是对培养基例如HAT培养基敏感。更优选的无限增殖化细胞系是鼠或人骨髓瘤细胞系，可以从，例如，美国典型培养物保藏中心(ATCC)(Rockville，MD)获得。也有人骨髓瘤和鼠-人杂合骨髓瘤细胞系用于生产人单克隆抗体的描述[Kozbor，J.Zmmunol.第133卷：第3001页(1984)；Brodeur等，MonoclonalAntibody Production Techniques and Applications，Marcel Dekker，Inc.，New York，第51-63页(1987)]。

分析培养杂交瘤的培养基(上清液)，看是否存在FGF23多肽的单克隆抗体。优选地，用免疫沉淀或体外结合试验，例如放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)，测定杂交瘤上清液中单克隆抗体的结合特异性。合适的技术和分析方法是本领域已知的。单克隆抗体的结合亲和力可以，例如，通过Munson和Pollard，Anal，Biochem.107：220(1980)的Scatchard分析来测定。鉴定产生所需抗体的杂交瘤细胞之后，可以用有限稀释法克隆细胞并用标准方法培养[Goding，1986]。用于此目的的合适培养基包括，例如，Dulbecco改良的Eagle培养基和RPMI-1640培养基。可选择地，杂交瘤细胞可以在哺乳动物体内作为腹水生长。用本领域技术人员通常使用的免疫球蛋白纯化方法，例如蛋白质A-Sepharose、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲合层析，可以从培养基或腹水液体中分离或纯化所选克隆分泌的单克隆抗体。

也可以用重组DNA方法制备单克隆抗体，例如美国专利号4,816,567中所述。可以从FGF23多肽特异杂交瘤细胞中分离编码本发明单克隆抗体的DNA并测序，例如，其中使用能与编码鼠抗体重和轻链的基因特异结合的寡核苷酸探针。分离之后，可以将DNA插入表达载体，然后转入宿主细胞例如猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或不产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞，以实现在重组宿主细胞内单克隆抗体的合成。DNA也可被修饰，例如，将同源鼠序列替换为人重和轻链恒定区的编码序列[Morrison等，Proc.Nat.Acad.Sci.第81卷：第6851-6855页(1984)；Neuberger等，Nature第312卷：第604-608页(1984)；Takeda等，Nature第314卷：第452-454页(1985)]，或使免疫球蛋白编码序列与非免疫球蛋白多肽的全部或部分编码序列共价连接。可用非免疫球蛋白多肽代替本发明抗体的恒定区，或者代替本发明抗体的一个抗原结合位点的可变区以产生嵌合二价抗体。抗体也可以是单价抗体。制备单价抗体的方法是本领域已知的。例如，体外方法是适合于制备单价抗体的。可以用本领域已知的常规技术完成抗体消化以产生其片段，尤其是，Fab片段。

也可以用重组方法制备本发明杂交瘤的特征抗体或抗体片段，方法是提取mRNA、构建cDNA文库、筛选编码抗体分子片段的克隆，例如Wall等，Nucleic Acids Research，第5卷，第3113-3128页(1978)；Zakut等，NucleicAcids Research，第8卷，第3591-3601页(1980)；Cabilly等，Proc.Natl.Acad.Sci.，第81卷，第3273-3277页(1984)；Boss等，Nucleic Acids Research，第12卷，第3791-3806页(1984)；Amster等，Nucleic Acids Research，第8卷，第2055-2065页(1980)；Moore等，美国专利号4,642,334；Skerra等，Science，第240卷，第1038-1041页(1988)；Huse等，Science，第246卷，第1275-1281页(1989)。具体地，可以使用这些技术制备种间(interspecific)单克隆抗体，其中一个物种的抗体的结合区与另一个物种的抗体的非结合区组合以降低免疫原性，例如，Liu等，Proc.Natl.Acad.Sci.，第84卷，第3439-3443页(1987)。

多克隆及单克隆抗体均可以用ELISA筛选。如其他固相免疫测定一样，本试验基于大分子对塑料的非特异性吸附趋势。此反应的不可逆性不使免疫活性丧失，并允许形成抗原-抗体复合体以及可将此复合体从未结合材料中简单分离出来。为了滴定抗肽血清，将与载体缀合的肽吸附到96孔微量滴定板的孔中，此载体与免疫接种时所用的不同。然后将吸附的抗原在孔中与抗肽血清稀释液反应。洗去未结合抗体，将剩下的抗原-抗体复合体与特异针对免疫动物的IgG的抗体反应。此第二抗体与酶，例如碱性磷酸酶缀合。加入酶底物时产生可视的颜色反应产物，这表明这个孔已经结合抗肽抗体。使用分光光度计读数器可对结合的肽特异性抗体数量进行更好的定量。高效价血清在10^-3到10^-5稀释物之间产生线性滴定曲线。

FGF23肽抗体。本发明包括来自FGF23多肽的肽和含有载体与本发明肽之间的缀合物的免疫原。如此处所用术语免疫原指能引起免疫应答的物质。术语载体在此指与本发明肽化学缀合后能使免疫了此缀合物的宿主生物体产生对缀合肽特异的抗体的任何物质。载体包括红细胞、噬菌体、蛋白或合成微粒例如琼脂糖珠。优选地，载体是蛋白，例如血清白蛋白、γ-球蛋白、匙孔虫戚血蓝蛋白、甲状腺球蛋白、卵白蛋白、纤维蛋白原等。

将合成肽与载体连接的常用技术在几篇文献中有描述，例如Walter和Doolittle，″抗合成肽抗体″Setlow等，编，《Genetic Engineering》，第5卷，第61-91页(Plenum Press，N.Y.，1983)；Green等.Cell，第28卷，第477-487页(1982)；Lerner等，Proc.Natl.Acad.Sci.，第78卷，第3403-3407页(1981)；Shimizu等，美国专利号4,474,754；Ganfield等，美国专利号4,311,639。因此，这些文献以参考文献的方式并入本文。而且，把半抗原与载体连接的技术与上述参考技术大体上相同，例如Tijsseu Practice and Theory ofEnzyme Immunoassays(Elsevier，New York，1985)中第二十章。将肽连到载体上的四个最常用方案是(1)用于氨基偶联的戊二醛，例如Kagan和Glick，在Jaffe and Behrman编的Methods of Hormone Radioimmunoassay一书中第328-329页(Academic Press，N.Y.，1979)；Walter等.Proc.Natl.Acad.Sci.，第77卷，第5197-5200页(1980)所述；(2)用于羧基与氨基偶联的水溶性碳二亚胺，例如Hoare等，J.Biol.Chem.，第242卷，第2447-2453页(1967)所述；(3)用于酪氨酸与酪氨酸侧链偶联的双偶氮联苯胺(DBD)，例如Bassiri等，第46-47页，Jaffe and Behrman，编.(上面引文)；Walter等.(上面引文)所述；(4)用于半胱氨酸(或其他巯基)与氨基偶联用的马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)，例如Kitagawa等，J.Biochem.(Tokyo)，第79卷，第233-239页(1976)；Lerner等.(上面引文)。选择一个将给定肽与蛋白载体偶联的合适方法的一般规则可陈述如下：待连接的基团应在序列中只出现一次，优选在片段的合适末端。例如，如果酪氨酸残基出现在序列的主要部分中，而此序列是因为有潜在的抗原特征而被选择的，则不应使用BDB。相似地，位于中间的赖氨酸则排除戊二醛方法，天冬氨酸和谷氨酸的频繁出现排除碳二亚胺法。另一方面，合适的残基可以位于所选序列片段的任一端作为连接位点，无论它们是否存在于“天然”蛋白序列中。与氨基和羧基端不同，内部片段在“未连接末端”与存在于具有连续的多肽主链的天然蛋白中的相同序列有显著的不同。这个问题可通过乙酰化α-氨基然后由其羧基端实现肽连接而在一定程度上缓解。使用放射性标记肽可方便地测量与载体蛋白的偶联效率，放射性标记肽的制备方法有：在合成的一个步骤中使用放射性氨基酸或者通过酪氨酸残基的碘化标记完整肽。肽中酪氨酸的出现也使得可以在需要时设定灵敏的放射免疫测定。因此，可以引入酪氨酸作为末端残基，如果它不是天然多肽限定的肽序列的一部分的话。

优选载体是蛋白，优选的蛋白载体包括牛血清白蛋白、甲状腺球蛋白、卵白蛋白(OVA)、匙孔虫戚血蓝蛋白(KLH)或类似的。可以用MBS将肽与KLH通过半胱氨酸连接起来，如Liu等，Biochemistry，第18卷，第690-697页(1979)的公开。将肽溶解在磷酸缓冲盐溶液(pH7.5)、0.1M硼酸钠缓冲液(pH9.0)或1.0M醋酸钠缓冲液(pH4.0)中。选择溶解肽的pH以使肽溶解度达到最优。用Ellman法测定可溶肽的游离半胱氨酸的含量，Ellman，Arch.Biochem.Biophys.，第82卷，第70-77页(1959)。对于每一个肽，使0.25ml10mM磷酸钠缓冲液(pH7.2)中的4mg KLH与0.7mgMBS(溶解在二甲基甲酰胺中)反应，并在室温下搅动30分钟。逐滴加入MBS以保证甲酰胺的局部浓度不会过高，因为KLH在30％甲酰胺中是不溶的。然后，使反应产物KLH-MBS通过用50mM磷酸钠缓冲液(pH6.0)平衡的sephadex G-25以去除游离MBS。从柱洗脱物的峰组分中回收的KLH(在OD₂₈₀检测)估计约为80％。然后KLH-MBS与1ml所选缓冲液中25溶解的5mg肽反应。pH调到7-7.5，反应在室温搅动3小时。用放射性肽通过相对于磷酸缓冲盐溶液透析缀合物样品以监测偶联效率，范围在8％到60％。一旦能够得到肽-载体缀合物，即可用标准技术生产多克隆或单克隆抗体，例如Campbell，Monoclonal Antibody Technology(Elsevier，New York，1984)；Hurrell，编Monoclonal Hybridoma Antibodies：Techniques and Applications(CRC Press，Boca Raton，FL，1982)；Schreier等。Hybridoma Techniques(Cold Spring Harbor Laboratory，New York，1980)；美国专利号4,562,003等所述。特别地，美国专利号4,562,003以参考文献的方式并入本文。

人源化抗体。本发明抗-FGF23多肽抗体还包括人源化抗体或人抗体。术语“人源化抗体”指非人(例如鼠)抗体的人源化形式，它是含有来自非人抗体的部分序列的嵌合抗体、其免疫球蛋白链或片段(例如，Fv、Fab、Fab′、F(ab′)，或抗体的其他抗原结合部分序列)。人源化抗体包括人免疫球蛋白，其中人免疫球蛋白互补决定区(CDR)的残基被非人物种，例如小鼠、大鼠或兔的CDR残基所替代，后者有所需的结合特异性、亲和力和容量。通常，人源化抗体基本上包括至少一个、通常两个可变区的全部，其中全部或基本上全部的CDR与非人免疫球蛋白的CDR区对应而全部或基本上全部FR区是具有人免疫球蛋白共有序列的FR区。人源化抗体优选地也包括免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，它通常是人免疫球蛋白的[Jones等，Nature第321卷：第522-525页(1986)；Presta，Curr.Op.Struct.Biol.第2卷：第593-596页(1992)]。使非人抗体人源化的方法是本领域已知的。通常，人源化抗体具有从非人来源引入的一个或多个氨基酸，以使其与人抗体更相似时仍保留抗体的最初结合活性。抗体人源化的方法在Jones等，Nature第321卷：第522-525页(1986)；Riechmann等，Nature第332卷：第323-327页(1988)；Verhoeyen等，Science第239卷：第1534-1536页(1988)中有进一步详述。此“人源化”抗体是嵌合抗体，其中实质上非整个的人可变区被来自非人物种的对应序列替换。

异源缀合抗体。异源缀合抗体含有两个共价连接的抗体，也属于本发明之列。可以用合成蛋白质化学中的已知方法体外制备异源缀合抗体；包括其中使用交联剂的方法。例如，可以用二硫化物交换反应或通过形成硫醚键来制备免疫毒素。

双特异性抗体。双特异性抗体有对至少两种不同抗原的结合特异性。此抗体是单克隆的，优选是人的或人源化的。本发明双特异性抗体的一个结合特异性是对FGF23多肽的，而另一个优选针对细胞表面的蛋白或受体或受体亚基。制备双特异性抗体的方法是本领域已知的，通常，双特异性抗体的重组产生是基于在杂交瘤细胞中两个免疫球蛋白重链/轻链对的共表达。其中两条重链有不同的特异性[Milstein和Cuello，Nature第305卷：第537-539页(1983)]。考虑到免疫球蛋白重链和轻链的随机组合可导致杂交瘤产生可能的十种不同抗体分子，故正确分子的纯化通常需要某种亲合纯化，例如亲合层析。

抗体拮抗剂。优选地，本发明拮抗剂来自对FGF23多肽特异的抗体。更优选地，本发明拮抗剂含有对FGF23多肽特异的片段或结合组合物。抗体含有由二硫桥连接在一起的多肽链。二个主要多肽链，即轻链和重链，组成抗体的所有主要结构类型(同种型)。重链和轻链可进一步分成亚区，即可变区和恒定区。重链含有一个可变区和三个不同的恒定区，轻链含有一个可变区(与重链上的不同)和一个恒定区(与重链上的不同)。重链和轻链的可变区负责抗体的结合特异性。如此处所用，术语“重链可变区”指这样的多肽，(1)其长度有110到125个氨基酸，(2)从重链的N端氨基酸开始，其氨基酸序列与本发明单克隆抗体的重链的序列对应。同样地，术语“轻链可变区”指这样的多肽，(1)其长度有95到115个氨基酸，(2)从轻链的N端氨基酸开始，其氨基酸序列与本发明单克隆抗体轻链中的序列对应。如此处所用，术语“单克隆抗体”指均一的免疫球蛋白群体，它能特异地结合FGF23多肽。如此处所用，术语“结合组合物”指含有两个多肽链的组合物，所述两个多肽链(1)在可操作连接时，呈现对FGF23多肽有强结合亲和力的构象且(2)来源于产生对FGF23多肽特异的单克隆抗体的杂交瘤。术语“可操作连接”意味着可以用许多方式把两条多肽链相对放置以结合，方式包括在天然抗体片段，例如Fab或Fv内连接，或者在羧基端利用基因工程构建的含有半胱氨酸的肽接头。通常，这两条多肽链与FGF23多肽特异性单克隆抗体的轻链可变区和重链可变区对应。优选地，本发明拮抗剂来自对FGF23多肽特异的单克隆抗体。能阻断或中和FGF23多肽的单克隆抗体可通过它们抑制FGF23多肽诱导的效应的能力选择。

抗体片段的使用和产生也是已知的，例如Fab片段：Tijssen，Practiceand Theory of Enzyme Immunoassays(Elsevier，Amsterdam，1985)；Fv片段：Hochman等。Biochemistry，第12卷，第1130-1135页(1973)，Sharon等，Biochemistry，第15卷，第1591-1594页(1976)；Ehrlich等，美国专利号4,355,023；抗体半分子：Auditore-Hargreaves，美国专利号4,470,925。

纯化和药物组合物

当本发明多肽以可溶形式表达时，例如作为转化的酵母或哺乳动物细胞的分泌产物时，可以用本领域的标准方法将它们纯化，包括硫酸铵沉淀、离子交换层析、凝胶过滤、电泳、亲合层析、和/或类似的步骤，例如，″酶的纯化和相关技术″Methods in Enzymology，第22卷：第233-577页(1977)；Scopes，R.，Protein Purification：Principles and Practice(Springer-Verlag，New York，1982)提供了这些纯化的指导。同样地，当本发明多肽以不可溶形式表达时，例如作为聚集体、包含体或类似物，也可用本领域的标准方法将它们纯化，包括：通过离心从破碎的宿主细胞中分离包含体，用离液剂和还原剂使包含体溶解，稀释溶解混合物，降低离液剂和还原剂的浓度以使多肽呈现生物活性构象。后面的这些方法在下列文献中有描述，所述文献以参考文献的方式并入：Winkler等，Biochemistry，第25卷：第40414045页(1986)；Winkler等，Biotechnology，第3卷第992-998页(1985)；Koths等，美国专利号4,569,790；和欧洲专利申请号86306917.5和86306353.3.。

如此处所用，“有效量”指足够改善自身免疫病症状的量。对特定患者的有效量依赖多种因素的不同而不同，这些因素如所治疗疾病的状况、患者的总体健康、用药方法、副作用的严重性等。通常，FGF23多肽以含有有效量的FGF23多肽和药物载体的药物组合物形式给药，药物载体可以是任何相容的无毒物质，它应适合于将本发明组合物递送给患者。通常，用于这些药物的胃肠外用药的组合物是已知的，例如Remington′sPharmaceutical Science，第十五版(Mack Publishing Company，Easton，PA1980)。可选择地，可以用可移植或可注射药物递送系统将本发明组合物送入患者体内，例如Urquhart等，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.，第24卷，第199-236页(1984)；Lewis，编Controlled Release of Pesticides andPharmaceuticals(Plenum Press，New York，1981)；美国专利号3,773,919；美国专利号3,270,960；和类似文献。

当胃肠外用药时，FGF23多肽与药物载体结合制成单位剂量可注射形式(溶液、悬浮液、乳剂)。此载体的例子是生理盐水、林格溶液、葡萄糖溶液、和Hank溶液。也可以使用非水性载体例如固定油和油酸乙酯。优选的载体是5％葡萄糖/盐水。载体可含有少量添加剂例如能增强等渗性和化学稳定性的物质，例如，缓冲液和防腐剂。FGF23多肽优选制成纯化形式，基本上不含聚集体和其他蛋白，浓度为约5到20μg/ml之间。优选地，以连续输注方式施用FGF23多肽，以至递送量约为50-800μg每天(即，约1-16μg/kg/天)。每日输注率可以不同，这可基于对副作用的监测，例如对血细胞数、体温等的监测而改变。

可以从被载有FGF23多肽基因的表达载体瞬时转染或稳定转化的哺乳动物细胞的培养上清液中纯化FGF23多肽。优选地，从被pcD表达载体瞬时转染的COS7细胞的培养上清液中纯化FGF23多肽。用pcD转染COS7细胞的过程如下：转染前一天，把约10⁶COS7猴细胞种在单个100mm平板上在含有10％胎牛血清和2mM谷氨酰胺的Dulbecco改良Eagle培养基(DME)中。为了进行转染，吸出每个平板中的培养基并替换为含有50mM TrisHCl pH7.4、400mg/ml DEAE-葡聚糖和50μg质粒DNA的4mlDME。37℃温育平板4小时，然后去除含有DNA的培养基，用5ml无血清DME洗平板两次。DME加回平板，然后37℃再温育3小时。用DME洗平板一次，之后以标准浓度加入含有4％胎牛血清、2mM谷胺酰胺、青霉素(100μ/L)和链霉素(100μg/L)的DME。然后37℃温育细胞72小时，之后收集生长培养基用于纯化FGF23多肽。可选择地，可以用实施例中描述的电穿孔完成转染。用于转染的质粒DNA通过在大肠杆菌MC1061(见Casadaban和Cohen，J.Mol.Biol.，第138卷，第179-207页(1980)描述)或类似的生物体中扩增含有FGF23多肽cDNA插入的pcD(SRα)或类似表达载体获得。用标准技术从培养物中分离质粒DNA，例如Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版(Cold Spring Harbor Laboratory，New York，1989)或Ausubel等(1990，上面引文)。

当本发明拮抗剂来自抗体时，它们通常进行肠胃外用药，优选静脉内用药。由于此蛋白或肽拮抗剂可能有免疫原性，它们优选缓慢用药，利用常规静脉内用药装置或从皮下贮库给药，如Tomasi等，美国专利号4,732,863中的教导。当肠胃外用药时，抗体和/或片段与药物载体结合配制成单位剂量可注射形式，如上所描述。抗体优选地制成纯化形式，基本上不含聚集体、其他蛋白、内毒素等，浓度为约5到30mg/ml，优选10到20mg/ml。优选地，内毒素水平低于2.5EU/ml。

选择拮抗剂的用药方案依赖于几个因素，包括拮抗剂的血清代谢率、与所治疗疾病有关的FGF23多肽的血清水平、拮抗剂的免疫原性、目标FGF23多肽的可达性(例如，当非血清FGF23多肽待被封闭时)、与FGF23多肽和拮抗剂相比FGF23多肽和其受体的相对亲合力等。优选用药方案使递送给患者的拮抗剂量达到最大，同时又符合副作用可接受水平。因此，递送的拮抗剂的量部分地取决于特定拮抗剂和所治疗疾病的严重性。在有关抗体治疗用途的文献中可找到对选择合适剂量的指导，例如Bach等，第22章，Ferrone等，编，Handbook of Monoclonal Antibodies(NogesPublications，Park Ridge，NJ，1985)；Russell，第303-357页，和Smith等，第365-389页，Haber等，编.Antibodies in Human Diagnosis and Therapy(Raven Press，New York，1977)。优选地，当拮抗剂含有单克隆抗体或其Fab大小的片段(包括结合组合物)时，剂量范围为约1-20mg/kg每天。更优选剂量是约1-10mg/kg每天。

实施例1

FGF23多肽的化学合成

在本实施例中，用天然化学连接合成有图1序列的多肽。从以下列出的以前合成的寡肽中间体装配全长多肽(上标数字表示片段在图1序列中的位置)。如以下更完全地描述，用Dawson等，Science，第266卷：第776-779页(1994)和Hackeng等，Proc.Natl.Acad.Sci.，第96卷：第10068-10073页(1999)的天然化学连接化学，首先将片段1与片段2偶联形成第一产物，经制备HPLC纯化之后，第一产物与片段3偶联形成目的多肽。

                SEO

片段           ID NO             寡肽中间体的序列

1	3	C68RPFAKFI75
			2	4	C30SQELPSAEDNSPMASDPLGVVRGGRVNTHAGGTGPEG67
3	5	H1TRSAEDDSERDPLNVLKPRARMTPAPAS29

硫酯的形成。在产生硫酯的树脂上合成片段2和3。为此目的，在标准条件下使Leu-PAM树脂与S-乙酰基-硫基乙酸五氟苯酯或S-三苯甲基巯基丙酸偶联；首先，在DMF中用10％巯基乙醇、10％哌啶处理30分钟去除乙酰基保护基之后，将产生的树脂用作肽链延伸的起始树脂，规范0.2mmol。用标准原位中和偶联(例如，Schnolzer等，Int.J.Peptide ProteinRes.，第40卷：第180-193页(1992))作用1小时形成硫酯，合成片段3时用Boc-Ile-OH及合成片段4时用Boc-Phe-OH。之后，用TFA中的2.5％三异丙基硅烷和2.5％H₂O处理两次各1分钟以去除三苯甲基保护基。利用标准原位中和偶联方案作用1小时，将第一个氨基酸(片段2用Boc-Ala-OH)立即人为地偶联到树脂上。根据本发明，通过Boc-硫代脯氨酸(Boc-SPr)偶联到各个链的末端代替常规N^α或S^β保护的Cys，以保护片段2和3的N端Cys残基的N^α，Brik等，J.Org.Chem.，第65卷：第3829-3835页(2000)。

肽合成。在来自Applied Biosystems的定做的改良433A肽合成仪上进行固相合成，其中对于逐步Boc化学链延伸使用原位中和/2-(1H-苯并三唑-l-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HBTU)活化方案，如Schnolzer等，Int.J.Peptide Protein Res.，第40卷：第180-193页(1992)所述。每个合成循环的组成为：用纯TFA处理1到2分钟除去N^α-Boc、DMF流洗1分钟、在过量DIEA存在下用2.0mmol预活化Boc-氨基酸偶联10分钟、第二次DMF流洗。在过量DIEA(6mmol)存在下用1.8mmol HBTU(DMF中0.5M)预活化Na-Boc-氨基酸(2mmol)3分钟。Gln残基偶联之后，用TFA去保护前和后用二氯甲烷流洗，以防止可能的高温(TFA/DMF)催化的吡咯烷酮羧酸形成。有侧链保护的氨基酸是Boc-Arg(对甲苯磺酰基)-OH、Boc-Asn(愣只)-OH、Boc-Asp(O-环己基)-OH、Boc-Cys(4-甲基苄基)-OH、Boc-Gln(O-环己基)-OH、Boc-His(二硝基苯基苄基)-OH、Boc-Lys(2-Cl-Z)-OH、Boc-Ser(苄基)-OH、Boc-Thr(苄基)-OH、Boc-Trp(甲酰基)-OH、Boc-Tyr(2-Br-Z)-OH。使用的其他氨基酸无侧链保护。在Boc-Leu-O-CH₂-Pam树脂上合成C端片段1(每g填装树脂0.71mmol)，而在Boc-Xaa-S-CH₂-CO-Leu-Pam树脂上开始片段2和4的机械辅助合成，在Boc-Xaa-S-(CH₂)₂-CO-Leu-Pam树脂上合成片段3。在标准情况下通过S-乙酰基-巯基乙酸五氟苯酯或S-三苯甲基巯基丙酸与Leu-PAM树脂偶联而获得后两种树脂；首先在DMF中用10％巯基乙醇、10％哌啶处理30分钟去除乙酰保护基之后，将产生的树脂用作肽链延伸的起始树脂，规模0.2mmol。之后，用TFA中2.5％三异丙基硅烷和2.5％H₂O处理两次各1分钟去除三苯甲基保护基。用标准原位中和偶联方案作用1小时，将第一个氨基酸立即人为地与树脂偶联。

链装配完成之后，用无水氟化氢在0℃处理1小时，并用5％对甲酚作清除剂将肽去保护并从树脂上切下。在所有过程中，咪唑侧链的2，4-二硝基苯基(DNP)保护基仍留在His残基上，因为DNP去保护步骤与C端硫酯基团不相容。然而连接反应中DNP可被硫醇逐渐去除，产生去保护的His。切除之后，两个肽都用冰冷乙醚沉淀，在含水乙腈中溶解并冻干。用在缓冲液A(H₂O/0.1％三氟乙酸)中的缓冲液B(乙腈/0.1％三氟乙酸)线性梯度通过在C18柱上HPLC纯化肽，并在214nm用UV检测。用Esquire仪器(Brucker，Bermen，德国)通过电喷射质谱(ESMS)分析样品。

天然化学连接。未保护片段的连接实施如下：在6M盐酸胍(GuHCl)、0.2M磷酸pH7.5中溶解等克分子数的量的干燥肽，以在pH约7.0得到1-5mM终肽浓度，然后加入1％苄硫醇、1％苯硫酚。通常，反应过夜并用HPLC和电喷射质谱监测。随后处理连接产物以去除仍存在的保护基。用肼将溶液pH升到9.0并在37℃温育1小时以切割Trp的甲酰基团。打开N端噻唑烷环还需要在pH3.5加入固体甲氧胺(methoxamine)至0.5M终浓度，并于37℃再温育2小时。在制备性HPLC纯化之前加入10倍过量Tris(2-羧基乙基)膦。用ESMS鉴定含有多肽链的组分，合并并冻干。

在pH7.0，6M GuHCl中进行寡肽中间体的连接。每个反应物浓度为8mM，加入1％苄硫醇和1％苯硫酚以创造还原环境并利于连接反应。37℃过夜搅拌之后观察到几乎定量的连接反应。CH₃-O-NH₂·HCl作为粉末加入至0.1M终浓度并加入肼使pH升至pH9.0，以去除Trp¹²⁸的甲酰基。37℃温育1小时之后，向溶液中再加入CH₃-O-NH₂·HCl至0.5M终浓度。随后用比肽10倍过量的Tris(2-羧基乙基膦)处理反应混合物，15分钟后，用制备性HPLC(C4，20-60％CH₃CN，0.5％每分)纯化连接产物，冻干并在-20℃贮存。同样的步骤重复第二次。

通过在1M GuHCl、100mM Tris、10mM甲硫氨酸，pH8.6中溶解还原的冻干蛋白(约0.1mg/ml)，用空气氧化使全长肽重折叠。轻柔搅拌过夜后，如上述通过RP-HPLC纯化蛋白溶液。纯化之后，通过在1M GuHCl、100mM Tris、10mM甲硫氨酸，pH8.6中溶解还原的冻干蛋白(约0.1mg/ml)，用空气氧化使全长多肽重折叠。轻柔搅拌过夜后，如上述通过RP-HPLC纯化蛋白溶液。

实施例2

对FGF23多肽特异的单克隆抗体

用COS7细胞表达的FGF23多肽的半纯化制品免疫雄性Lewis大鼠。首先用在弗氏完全佐剂中的约50μg FGF23多肽免疫大鼠，之后用在弗氏不完全佐剂中的同量物质强化免疫两次。采集试验血液。用磷酸缓冲盐溶液中的25μg多肽最后一次加强免疫动物，四天后取脾脏用于融合。

约3×10⁸个大鼠脾细胞与等量的P3x63-AG8.653小鼠骨髓瘤细胞(可从ATCC获得，保藏号CRL1580)融合。在3840微量滴定板孔的每个孔中种5.7×10⁴个亲本骨髓瘤细胞。之后用标准方案进行融合和随后的杂交瘤培养，例如Chretien等，J.Immunol.Meth.，第117卷，第67-81页(1989)所述方法。融合12天后，收集上清液并在包被有COS7产生的FGF23多肽的PVC平板上用简接ELISA筛选。

本发明以上实施方案的描述是为了阐释和描述的目的。它们无意于将本发明限于所公开的这些精确形式，而且显而易见地鉴于以上教导内容许多修饰和改变是可能的。选择和描述实施方案是为了最好地解释本发明的原理，由此使本领域技术人员能在各种实施方案中及利用适于所考虑的特定用途的不同修饰最好地实施本发明。本发明的范围在由此后所附的权利要求书限定。

                          序列表

<110>  基因蛋白公司(GENEPROT，INC.)

<120>  与人成纤维细胞生长因子相关的组合物

<130>  5004-02

<140>

<141>  2001-05-24

<160>  11

<170>  Microsoft Word 2000

<210>  1

<211>  251

<212>  PRT

<213>  人(Homo Sapiens)

<220>

<221>  信号序列

<222>  (1)..(24)

<223>  可能的

<220>

<221>  肽

<222>  (25)..(251)

<223>  成纤维细胞生长因子-23

<400>  1

Met Leu Gly Ala Arg Leu Arg Leu Trp Val Cys Ala Leu Cys Ser Val

1               5                   10                  15

Cys Ser Met Ser Val Leu Arg Ala Tyr Pro Asn Ala Ser Pro Leu Leu

            20                  25                  30

Gly Ser Ser Trp Gly Gly Leu Ile His Leu Tyr Thr Ala Thr Ala Arg

        35                  40                  45

Asn Ser Tyr His Leu Gln Ile His Lys Asn Gly His Val Asp Gly Ala

    50                  55                  60

Pro His Gln Thr Ile Tyr Ser Ala Leu Met Ile Arg Ser Glu Asp Ala

65                  70                  75                  80

Gly Phe Val Val Ile Thr Gly Val Met Ser Arg Arg Tyr Leu Cys Met

                85                  90                  95

Asp Phe Arg Gly Asn Ile Phe Gly Ser His Tyr Phe Asp Pro Glu Asn

            100                 105                 110

Cys Arg Phe Gln His Gln Thr Leu Glu Asn Gly Tyr Asp Val Tyr His

        115                 120                 125

Ser Pro Gln Tyr His Phe Leu Val Ser Leu Gly Arg Ala Lys Arg Ala

    130                 135                 140

Phe Leu Pro Gly Met Asn Pro Pro Pro Tyr Ser Gln Phe Leu Ser Arg

145                 150                 155                 160

Arg Asn Glu Ile Pro Leu Ile His Phe Asn Thr Pro Ile Pro Arg Arg

                165                 170                 175

His Thr Arg Ser Ala Glu Asp Asp Ser Glu Arg Asp Pro Leu Asn Val

            180                 185                 190

Leu Lys Pro Arg Ala Arg Met Thr Pro Ala Pro Ala Ser Cys Ser Gln

        195                 200                 205

Glu Leu Pro Ser Ala Glu Asp Asn Ser Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu

    210                 215                 220

Gly Val Val Arg Gly Gly Arg Val Asn Thr His Ala Gly Gly Thr Gly

225                 230                 235                 240

Pro Glu Gly Cys Arg Pro Phe Ala Lys Phe Ile

                245                 250

<210>  2

<211>  75

<212>  PRT

<213>  人

<220>

<221>  二硫化物

<222>  (30)..(68)

<223>  预测的

<220>

<221>  位点

<222>  (7)..(7)

<223>  预测的PHEX内肽酶切割位点

<220>

<221>  位点

<222>  (8)..(8)

<223>  预测的PHEX内肽酶切割位点

<220>

<221>  位点

<222>  (12)..(12)

<223>  预测的PHEX内肽酶切割位点

<220>

<221>  位点

<222>  (39)..(39)

<223>  预测的PHEX内肽酶切割位点

<220>

<221>  位点

<222>  (46)..(46)

<223>  预测的PHEX内肽酶切割位点

<400>  2

His Thr Arg Ser Ala Glu Asp Asp Ser Glu Arg Asp Pro Leu Asn Val

1               5                   10                  15

Leu Lys Pro Arg Ala Arg Met Thr Pro Ala Pro Ala Ser Cys Ser Gln

            20                  25                  30

Glu Leu Pro Ser Ala Glu Asp Asn Ser Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu

        35                  40                  45

Gly Val Val Arg Gly Gly Arg Val Asn Thr His Ala Gly Gly Thr Gly

    50                  55                  60

Pro Glu Gly Cys Arg Pro Phe Ala Lys Phe Ile

65                  70                  75

<210>  3

<211>  8

<212>  PRT

<213>  人

<400>  3

Cys Arg Pro Phe Ala Lys Phe Ile

                5

<210>  4

<211>  38

<212>  PRT

<213>  人

<220>

<221>  二硫化物

<222>  (30)..(68)

<223>  可能的

<400>  4

Cys Ser Gln Glu Leu Pro Ser Ala Glu Asp Asn Ser Pro Met Ala Ser

                5                   10                  15

Asp Pro Leu Gly Val Val Arg Gly Gly Arg Val Asn Thr His Ala Gly

            20                  25                  30

Gly Thr Gly Pro Glu Gly

        35

<210>  5

<211>  29

<212>  PRT

<213>  人

<400>  5

His Thr Arg Ser Ala Glu Asp Asp Ser Glu Arg Asp Pro Leu Asn Val

1               5                   10                  15

Leu Lys Pro Arg Ala Arg Met Thr Pro Ala Pro Ala Ser

            20                  25

<210>  6

<211>  6

<212>  PRT

<213>  人

<220>

<221>  注释

<222>  (2)..(5)

<223>  与SwissProt登录号PTHR_HUMAN[143..146]同一

<400>  6

His Thr Arg Ser Ala Glu

1               5

<210>  7

<211>  5

<212>  PRT

<213>  人

<400>  7

Asp Asp Ser Glu Arg

1               5

<210>  8

<211>  4

<212>  PRT

<213>  人

<400>  8

Asp Ser Glu Arg

1

<210>  9

<211>  27

<212>  PRT

<213>  人

<400>  9

Asp Pro Leu Asn Val Leu Lys Pro Arg Ala Arg Met Thr Pro Ala Pro

1               5                   10                  15

Ala Ser Cys Ser Gln Glu Leu Pro Ser Ala Glu

            20                  25

<210>  10

<211>  7

<212>  PRT

<213>  人

<400>  10

Asp Asn Ser Pro Met Ala Ser

1               5

<210>  11

<211>  30

<212>  PRT

<213>  人

<400>  11

Asp Pro Leu Gly Val Val Arg Gly Gly Arg Val Asn Thr His Ala Gly

1               5                   10                  15

Gly Thr Gly Pro Glu Gly Cys Arg Pro Phe Ala Lys Phe Ile

            20                  25                  30

Claims (10)

1.具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的分离多肽。

2.分离的多核苷酸，其具有编码具SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。

3.药物组合物，其含有具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽及可药用载体。

4.分离的肽，其具有选自如下的氨基酸序列：SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11。

5.权利要求4的分离的肽，其具有SEQ ID NO：6中所列的氨基酸序列。

6.权利要求4的分离的肽，其具有SEQ ID NO：7中所列的氨基酸序列。

7.权利要求4的分离的肽，其具有SEQ ID NO：8中所列的氨基酸序列。

8.权利要求4的分离的肽，其具有SEQ ID NO：9中所列的氨基酸序列。

9.权利要求4的分离的肽，其具有SEQ ID NO：10中所列的氨基酸序列。

10.权利要求4的分离的肽，其具有SEQ ID NO：11中所列的氨基酸序列。

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