CN101275136A - 调节磷酸代谢,钙代谢,钙化和维生素d代谢的多肽及其编码dna - Google Patents

调节磷酸代谢,钙代谢,钙化和维生素d代谢的多肽及其编码dna Download PDF

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Abstract

一种编码以下多肽(a)，(b)，(c)或(d)的DNA：(a)由SEQ ID NO：2或4所示氨基酸序列组成的多肽(b)由SEQ ID NO：2或4所示氨基酸序列经缺失，取代或添加1或几个氨基酸得到的氨基酸序列组成的多肽，并且该多肽具备低磷酸盐血症诱导活性，磷酸盐转运抑制活性，钙化抑制活性或者调节体内维生素D代谢的活性，(c)由SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的部分序列组成的多肽，其中上述部分序列含有以上氨基酸序列中的至少第34到第201个氨基酸，或者(d)由SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的部分序列组成的多肤，其中上述部分序列：(i)含有所述氨基酸序列中第34个到第201氨基酸的氨基酸序列，(ii)含有由所述部分序列经缺失，取代或添加1或几个氨基酸得到的氨基酸序列，以及(iii)具有低磷酸盐血症诱导活性，磷酸盐转运抑制活性，钙化抑制活性或者体内维生素D代谢调控活性。

Description

调节磷酸代谢，钙代谢，钙化和维生素D代谢的多肽及其编码DNA
本申请是申请日为2001年8月10日，申请号为01817296.2的、发明名称和本发明相同的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及一种调节磷酸代谢，钙代谢，钙化和/或维生素D代谢的多肽，编码所述多肽的DNA，以及含有该多肽为活性成分的药物组合物，和识别所述多肽的抗体，以及以该抗体为活性成分的药物组合物，利用所述抗体的诊断方法和诊断组合物。
背景技术
无机磷酸盐(以下也称为磷酸盐)是体内能量代谢和维持细胞功能所必需的，并与钙一起对组织钙化起着重要的作用。生物体的磷酸盐供给情况主要取决于肠道的吸收，而磷酸盐的排泄取决于肾脏中的尿排泄和肠道中的粪便排泄。在活的有机体中，磷酸盐分布于体液，胞内组分和钙化组织中。成人体内无机磷酸盐的排泄水平与其吸收水平几乎相同，这表明存在着一个能维持磷酸盐代谢稳态的调节机制。众所周知，在其分布和血液水平的稳态控制方面与磷酸盐代谢有相似之处的钙的代谢，在哺乳动物体内是由调控因子协同调节的，这些因子至少有比如甲状旁腺激素，降钙素和1α，25-二羟维生素D3。
在磷酸盐代谢调控中，已知甲状旁腺激素能促进肠道内磷酸盐的排泄，1α，25-二羟维生素D3能促进肠道内磷酸盐的吸收。这清楚地表明了磷酸盐代谢和钙代谢之间的密切关联。但是，至今未能弄清调控磷酸盐的主要物质。
目前，与磷酸盐代谢失去稳态和血液中无机磷酸盐水平低相关的疾病包括原发性甲状旁腺功能亢进，遗传性血磷酸盐过少佝偻病和肿瘤诱发的骨软化症。
原发性甲状旁腺功能亢进表现为甲状旁腺中甲状旁腺激素过量，并且我们知道它能发展为磷酸盐排泄增加的低磷酸盐血症，这是由于过量的甲状旁腺激素抑制了无机磷酸盐在肾脏的重新吸收。
此外，已知由于遗传病造成的低磷酸盐血症例子包括I型维生素D-依赖性佝偻病，II型维生素D-依赖性佝偻病和维生素D抗性佝偻病。I型维生素D-依赖性佝偻病是产生活性维生素D代谢物的合成酶遗传性功能异常引起的疾病，II型维生素D-依赖性佝偻病是维生素D受体遗传性功能异常引起的疾病。由于维生素D3代谢物作用减退，这两种疾病都能发展成低磷酸盐血症并伴有低钙血症。相反地，对于维生素D抗性佝偻病，已知存在不同原因引起的至少两种临床症状，X连锁的染色体和常染色体血磷酸盐过少佝偻病。
以上提及的维生素抗性佝偻病的临床症状都能导致低磷酸盐血症，其特征为肾磷酸盐。最近，在X-连锁的血磷酸盐过少佝偻病(以下称为XLH)患者中显示这种疾病是由位于X染色体上编码名为PHEX的类肽链内切酶蛋白质的基因发生突变诱发的。但是功能异常的PHEX蛋白质诱发低磷酸盐血症的机制并未阐明。有趣的是，对患有低磷酸盐血症的天然出现的突变小鼠(Hyp)进行基因分析揭示了这个小鼠编码PHEX的基因发生了部分缺失。用这些小鼠进行的实验显示出PHEX缺陷型小鼠具备正常的肾功能，在Hyp小鼠的体液中存在一种体液因子，该因子不同于甲状旁腺激素，但也能诱发低磷酸盐血症。对于常染色体显性血磷酸盐过少佝偻病/骨软化症(以下称为ADHR)，正在寻找引起该病的基因，连锁分析表明在12p13区域内存在一个这样的基因。但是经过缩小的区域仍然太宽，含有许多基因，还没有明确的候选基因。
肿瘤诱导的骨软化症能发展为与肿瘤发生相关联的低磷酸盐血症，伴有肾磷酸盐增加，其特征在于通过对肿瘤进行辐射或切除肿瘤能消除低磷酸盐血症。这种疾病被认为肿瘤产生了一种因子，由于抑制肾脏中磷酸盐的重吸收而诱发低磷酸盐血症。
还没有证实引起维生素D抗性佝偻病的分子是否与肿瘤诱导性骨软化症的诱发分子相同。但是，这两种分子显然均是未知的能促进尿磷酸盐排泄的磷酸盐代谢因子。假定的磷酸盐代谢调控因子经常被称为Phosphatonin。这种未知磷酸盐代谢调控因子与维生素D抗性佝偻病或肿瘤诱导性骨软化症的关系已经被总结为概述(Neison，A.E.，Clinical Endocrinology，47：635-642，1997；Drezner，M.K.，KidneyInt.，57：9-18，2000)。
维生素D抗性佝偻病或肿瘤诱导性骨软化症的另一个特征是对骨骼钙化的损害。受损的骨骼钙化可以被认为是低磷酸盐血症继发性发展造成的。但是由于在使用Hyp小鼠的实验中异常的骨骼钙化，维生素D抗性佝偻病的模型小鼠表现出发育不依赖于磷酸盐水平(Ecarot，B.，J.Bone Miner.Res.，7：215-220，1992；Xiao，Z.S.，Am.J.Physiol.，E700-E708，1998)因此上述未知的磷酸盐代谢调控因子可以直接调控骨骼组织的钙化是可能的。
如上所述，研究资料强烈地暗示存在一种未知的调节磷酸盐代谢的因子，但还没有例子能在分子水平明确这种具备预期活性的实体。WO99/60017公开了一种新的多肽类激素(Phosphatonin)的新多肽序列，但它没有公开Phosphatonin诱发低磷酸盐血症的独特活性。因此，可以想见在生物中存在一种未被识别的调节磷酸盐代谢的内在因子。
从食物中摄取的维生素D2和D3，或者在皮肤中合成的维生素D3被主要存在于肝脏的维生素D-25-羟化酶水解产生25-羟基维生素D。然后，25-羟基维生素D被存在于肾脏的近端小管表皮细胞的25-羟基维生素D-1α-羟化酶水解产生1α，25-二羟基维生素D。这种物质是一种具有生理活性的矿物调节激素，它能增加血清的钙和磷酸盐水平，并且已知它能抑制甲状旁腺激素的分泌，参与促进骨骼再吸收。然后，1α，25-二羟基维生素D被主要存在于肾脏和小肠的24-羟化酶体内转化为不具有上述生理活性的代谢物。在这点上，24-羟化酶被认为是使1α，25-羟基维生素D失活的酶。另一方面，已知24-羟化酶也作用于25-羟基维生素D，将它转化为24，25-二羟基维生素D。有报道说24，25-二羟基维生素D具有增加骨量或促进软骨分化的生理作用，表明该酶也有产生生物活性维生素D代谢物的方面。
调节1α-羟化酶(该酶对维生素D的活化有重要作用)的表达水平的已知因子包括甲状旁腺激素(PTH)，降钙素，1α，25-二羟基维生素D等。血液中钙含量的下降能促进PTH的分泌，PTH作用在存在于肾脏近端小管表皮细胞的PTH受体上从而通过提高细胞内cAMP水平促进1α-羟化酶的转录，使得血液中1α，25-二羟基维生素D浓度上升。1α，25-二羟基维生素D促进肠道中钙的吸收以及肾脏中钙的重吸收，从而提高血液中的钙含量。此外，已有报道说1α，25-二羟基维生素D结合了维生素D受体(VDR)能作用于1α-羟化酶基因或PTH基因的启动子区从而抑制这些基因的转录。具体来说，1α，25-二羟基维生素D对它的活化因子，PTH和1α-羟化酶有一个反馈调控机制。这个机制对维持钙代谢稳态起着重要作用。
最近，有报道说血清中磷酸盐水平下降能增强1α-羟化酶基因的表达。在磷酸盐代谢中，估计也存在一种机制，即与血清磷酸盐水平下降相关联的1α-羟化酶表达的加强能提高血清1α，25-二羟基维生素D水平，从而通过促进小肠的磷酸盐吸收修正血清磷酸盐水平。
负责调控24-羟化酶基因表达的因子包括1α，25-二羟基维生素D和PTH。1α，25-二羟基维生素D和维生素D受体(VDR)相互作用，该复合物结合到一个存在于24-羟化酶基因启动子区的维生素D受体应答序列从而促进转录。1α，25-二羟基维生素D被认为能激活24-羟化酶，然后诱导1α，25-二羟基维生素D水平由于代谢途径被活化而降低。人们已经知道24-羟化酶基因的表达受到PTH的抑制，但不清楚其详细的分子机制。
发明公开
本发明的目的是提供一种新的能诱导血液磷酸盐水平下降的肿瘤衍生因子。
可以想见在肿瘤诱导性骨软化症中鉴定到的肿瘤能分泌一种有生理活性的可溶性因子，致使血液磷酸盐水平下降。这种肿瘤衍生因子使得磷酸盐代谢失去稳态。所以，该因子可以归结为以下之一(1)该因子本来在体内不产生，是特定产生于肿瘤的，(2)该因子在肿瘤中过量产生，虽然在正常组织中也有，以及(3)该因子在肿瘤中不受生理控制地产生。
基于这样一种假设，即如上所述的低磷酸盐血症诱导的肿瘤衍生因子特征性地产生于肿瘤诱导的低磷酸盐血症衍生肿瘤中，我们预计在肿瘤中编码低磷酸盐血症诱导因子的转录加强或者该因子的mRNA稳定性加强。因此，为了治疗目的从一个肿瘤诱导性低磷酸盐血症患者切除了部分肿瘤组织，我们从中提取RNA之后，利用噬菌体载体和质粒载体制备了cDNA文库，然后筛选在肿瘤中特异表达的基因片段。用于筛选的方法是挑选在肿瘤中特异表达的cDNA片段，以及挑选在肿瘤衍生cDNA文库中不与来自肾脏近端小管表皮细胞细胞系的cDNA探针发生交叉反应的cDNA片段。我们通过验证序列的新颖性和在肿瘤中的特异表达性进一步缩小了挑选出的cDNA片段，从而获得了预期能编码低磷酸盐血症诱导因子的cDNA片段。由序列信息，我们尝试克隆含有每个片段所在的ORF的cDNA，并且成功地获得了编码新多肽的DNA。我们进一步彻底地研究了这些新多肽的生物活性，所以我们通过阐明所述新多肽具有在动物中抑制磷酸盐转运，诱导低磷酸盐血症和抑制骨骼组织钙化的活性完成了本发明。
具体来说，本发明如下所述。
(1)一种编码以下多肽(a)，(b)，(c)或(d)的DNA：
(a)由SEQ ID NO：2或4所示氨基酸序列组成的多肽
(b)由SEQ ID NO：2或4所示氨基酸序列经缺失，取代或添加1或几个氨基酸得到的氨基酸序列组成的多肽，并且该多肽具备低磷酸盐血症诱导活性，磷酸盐转运抑制活性，钙化抑制活性或者调节体内维生素D代谢的活性，
(c)由SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的部分序列组成的多肽，其中上述部分序列含有以上氨基酸序列中的至少第34到第201个氨基酸，或者
(d)由SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的部分序列组成的多肽，其中上述部分序列：
(i)含有从以上氨基酸序列中第34个到第201氨基酸的氨基酸序列，
(ii)由所述部分序列经缺失，取代或添加1或几个氨基酸得到的氨基酸序列组成，以及
(iii)具有低磷酸盐血症诱导活性，磷酸盐转运抑制活性，钙化抑制活性或者体内维生素D代谢调节活性。
(2)一种DNA，其含有以下DNA(e)或(f)：
(e)由SEQ ID NO：1所示核苷酸序列中从核苷酸133到885的核苷酸序列组成的DNA，
或者由SEQ ID NO：3所示核苷酸序列中从核苷酸1到681的核苷酸序列组成的DNA，或者
(f)在严谨条件下与探针杂交，并编码具有低磷酸盐血症诱导活性，磷酸盐转运抑制活性，钙化抑制活性或者体内维生素D代谢调节活性的多肽的DNA，所述探针由SEQ ID NO：1或3所示核苷酸序列的全部或部分组成的DNA制得。
此处，术语“严谨条件”满足盐浓度在750mM或以上，优选900mM或以上，温度在40℃或以上，优选42℃的条件。具体来说，严谨条件由6x SSC，5x Denhardt，0.5％SDS，50％甲醛和42℃组成。
(3)一种含有上述DNA的重组载体。
(4)一种含有上述重组载体的转化子。
(5)一种多肽，它是以下多肽(a)，(b)，(c)或(d)
(a)由SEQ ID NO：2或4所示氨基酸序列组成的多肽，
(b)由SEQ ID NO：2或4所示氨基酸序列经删除，取代或添加1或几个氨基酸得到的氨基酸序列组成的多肽，其具有低磷酸盐血症诱导活性，磷酸盐转运抑制活性，钙化抑制活性或者体内维生素D代谢调节活性，
(c)由SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的部分序列组成的多肽，其中所述部分序列含有以上序列中至少从氨基酸34到201的氨基酸序列，或者
(d)由SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的部分序列组成的多肽，其中所述部分序列：
(i)含有以上序列中至少从氨基酸34到201的氨基酸序列，
(ii)由所述部分序列经删除，取代或添加一或几个氨基酸得到的氨基酸序列组成，以及
(iii)具有低磷酸盐血症诱导活性，磷酸盐转运抑制活性，钙化抑制活性或者体内维生素D代谢调控活性。
上述多肽还包括经至少一种物质修饰过的多肽，该物质选自聚乙二醇，葡聚糖，聚(N-乙烯-吡咯烷酮)，聚丙二醇均聚物，聚丙烯氧化物和聚乙烯氧化物的共聚物，聚氧乙基化多元醇和聚乙烯醇。
(6)一种含有上述多肽作为活性成分的药物组合物。
上述药物组合物可以用于体内调节钙代谢，磷酸盐代谢，钙化或者维生素D代谢。此外，上述药物组合物能有效地抵制高磷酸盐血症，甲状旁腺功能亢进，肾性骨营养不良，异位钙化，骨质疏松和维生素D过多症中的至少一种症状。
(7)一种与上述多肽或其部分片段反应的抗体。
所述抗体可以通过这样的方法获得，该方法包括用本发明的多肽或其部分片段作为抗原免疫动物的步骤。
(8)一种含有上述抗体作为活性成分的药物组合物。
上述药物组合物能够调节体内钙代谢，磷酸盐代谢，钙化或维生素D代谢，或者有效地抵制骨骼疾病。此处，骨骼疾病是骨质疏松，抗维生素D佝偻病，肾性骨营养不良，透析相关性骨骼疾病，钙化不全骨病，佩吉特病和肿瘤诱导性骨软化症中的至少一种疾病。
(9)一种诊断试剂，其含有上述抗体，用于表现为异常钙代谢，异常磷酸盐代谢，异常钙化和异常维生素D代谢中的至少一种异常的疾病(例如，肾衰竭，肾磷酸盐渗漏，肾小管性酸中毒和范科尼综合征中的一种疾病)。
(10)一种用于骨骼疾病的诊断试剂，其含有上述抗体，其中所述骨骼疾病是骨质疏松，抗维生素D佝偻病，肾性骨营养不良，透析相关性骨骼疾病，钙化不全骨病，佩吉特病和肿瘤诱导性骨软化症中的至少一种疾病。
(11)一种诊断试剂，其包含具有SEQ ID NO：11所示核苷酸序列的DNA或其部分片段，该试剂用于表现为异常钙代谢，异常磷酸盐代谢，异常钙化和异常维生素D代谢中的至少一种异常的疾病。
上述部分序列的一个例子具有SEQ ID NO：11所示核苷酸序列中核苷酸498到12966之序列。所述疾病的一个例子是常染色体显性的血磷酸盐过少性佝偻病/骨软化症。
本发明详细解释如下。此说明书包括日本专利申请2000-245144，2000-287684，2000-391077和2001-121527的说明书和/或附图所公开的部分或全部内容，这些专利是本申请的优先权文本。
本说明书中使用的术语限定如下。
术语“降低血液1，25-二羟基维生素D3水平的活性”表示产生使血液1，25-二羟基维生素D3水平下降的效果的活性。
术语“低磷酸盐血症诱发活性”表示降低血液磷酸盐水平的活性。血液磷酸盐水平由以下两者间的平衡限定(i)肠道的吸收和排泄到尿和粪便，以及(ii)磷酸盐在体内细胞中和以骨骼组织为代表的钙化组织中的分布。因此，用于本说明书的术语“低磷酸盐血症诱发活性”意味着降低健康的活体内血液磷酸盐水平的活性，并不一定指引起病理性低磷酸盐血症的活性。在组织水平上，低磷酸盐血症诱发活性可以等同于肠道内的磷酸盐吸收抑制活性，肾脏或肠道的磷酸盐排泄促进活性，或者促进磷酸盐转移到细胞的活性。
此外，本发明中术语“磷酸盐转运抑制活性”表示作用于靶细胞从而抑制存在于细胞膜上的磷酸盐转运载体的活性的活性。可能的靶细胞主要是肾管的表皮细胞，肠或造骨细胞的表皮细胞。
另外，本发明中的术语“钙化抑制活性”表示抑制作为骨骼组织和软组织成分的含有钙和磷酸盐的结晶物质产生或积累过程的活性。
另外，术语“体内维生素D代谢调节活性”表示调控体内存在的维生素D及由它在体内合成的代谢物，在绝对量或者丰度上的变化的能力。维生素D及其代谢物的体内调控主要受以下控制(i)在肠道中的吸收或排泄和(ii)在肾脏中的重吸收或排泄，还有(iii)维生素D的体内合成，以及(iv)羟化反应导致的代谢转化。已知由代谢转化(iv)生成的主要代谢物有：由维生素D-25-羟化酶使维生素D第25位羟基化产生的25-羟基维生素D；由25-羟基维生素D-1α-羟化酶使羟基维生素D的1α位置羟基化产生的1α，25-二羟基维生素D；或者由24-羟化酶使代谢物的第24位的羟基还原产生的24，25-二羟基维生素D或者1α，24，25-三羟基维生素D。维生素D代谢调控活性可以描述为调节参与产生这些维生素D代谢物的酶的活性，基因表达或者酶的蛋白表达量的变化的活性。
1.编码调节磷酸盐代谢，钙代谢，钙化和维生素D代谢的多肽的DNA
(1)DNA克隆
SEQ ID NO：1所示DNA是本发明的DNA之一，它是利用从一个怀疑患有肿瘤诱导性骨软化症的病人身上切除的肿瘤的一部分制备cDNA文库，通过筛选该文库得到的。
肿瘤诱导性骨软化症是一种和肿瘤的存在相关联的，由于骨骼组织钙化不足导致低磷酸盐血症和骨软化症的疾病，其特征是切除肿瘤症状即消失。已有报道说，肿瘤提取物能促进小鼠尿磷酸盐排泄(Popvtzer，M.M.等，Clinical Research 29：418A，1981)，还有在一个实验中将切除的肿瘤移植到小鼠体内时，诱发了低磷酸盐血症(Miyauchi，A.等，J.Clin.Endocrinol.Metab.67：46-53，1988)。因此，考虑过可能是肿瘤产生并且分泌一种系统的未知因子。
我们使用了与Fukumoto，S等(Bone25：375-377，1999)描述过的肿瘤相关的一个病例。在这个病例中，手术切除肿瘤使低磷酸盐血症取得显著的康复。此外，在该例中，肿瘤的大小只有直径1厘米。基于这样的推论，即如此小的组织能产生并分泌一种诱发低磷酸盐血症和系统性骨软化症的活性物质，我们预计我们所制备的肿瘤衍生cDNA文库与其他组织所衍生的cDNA文库相比，更可能含有编码参与诱发这些临床症状的活性物质的基因的至少部分片段。相应地，为了鉴定编码肿瘤衍生活性物质的基因的片段序列，通过差异筛选法提取了在肿瘤cDNA文库中含量特别高的cDNA片段。
接下来，确定了所得cDNA片段的核苷酸序列，并进行了相互比较。然后根据核苷酸序列的重叠，制备了重叠群将各个被认为是来自同一基因的序列分组。对这样得到的核苷酸序列与Genbank(由美国国家生物技术信息中心提供的数据库，以下也称为NCBI)中注册的核苷酸序列进行同源性检索。这样，获得了在肿瘤cDNA文库中特别丰富的核苷酸序列，即SEQ ID NO：1所示核苷酸序列中从核苷酸1522到2770的序列。这个序列与在Genbank中注册的保藏号为AC008012的人类序列12p13BAC RPCI11-388F6的一部分相同。该注册序列被认为代表人类染色体序列中12p13区域的部分序列。虽然在该注册序列中显示了预期基因的位置和核苷酸序列信息，SEQ ID NO：1所示核苷酸序列中从核苷酸1522到2770的序列，以及本发明中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列并未包括在预期基因的任何指明区域内。
然后根据SEQ ID NO：1所示核苷酸序列中从核苷酸1522到2770之间的核苷酸序列设计探针和PCR引物，并分离和鉴定包含在肿瘤cDNA文库中的一个连续核苷酸序列，从而得到了本发明SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。SEQ ID NO：1的核苷酸序列有一个开放读码框(以下也称为ORF)，其编码由本发明SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的多肽，该多肽预计有一个分泌信号。我们认为这是一个具有新序列的多肽，因为该多肽的氨基酸序列没有在Genbank的氨基酸序列数据库注册。经过用SEQ ID NO：1所示核苷酸序列和SEQ ID NO：2所示氨基酸序列进行检索，我们已经鉴定到SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列以及SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列，这两个序列被认为是所述分子的鼠直向同源物。正如下文所述，根据人的氨基酸序列制备的重组蛋白质在小鼠中有活性。因此，我们将SEQ ID NO：2所示氨基酸序列与SEQ ID NO：10所示氨基酸序列或小鼠全长序列(Biochem.Biophys.Res.Commun.2000，277(2)，494-498)进行了比较，本发明使得能容易地评估某些蛋白质，这些蛋白质在保守氨基酸之外的一个氨基酸被取代，是否具有与本发明所述多肽相同或类似的生物活性。
(2)核苷酸序列的确定
我们确定了(1)所描述的DNA的核苷酸序列。可以通过已知技术确定所述核苷酸序列，比如Maxam-Gilbert化学修饰法或利用M13噬菌体的双脱氧核苷酸链终止法。通常，测序是用自动测序仪(例如，PERKIN-ELMER生产的373A DNA测序仪)进行的。
本发明所述DNA的核苷酸序列的一个例子是SEQ ID NO：1，本发明所述多肽的氨基酸序列的一个例子是SEQ ID NO：2。只要由所述氨基酸序列组成的多肽具备低磷酸盐血症诱发活性，磷酸盐转运抑制活性，钙化抑制活性或维生素D代谢调节活性，所述氨基酸序列可以含有突变，比如删除，取代或添加1或几个氨基酸。
例如，可以从SEQ ID NO：2所示氨基酸序列中删除1或几个，优选1到10个，更优选1到5个氨基酸；可以给SEQ ID NO：2所示氨基酸序列添加1或几个，优选1到10个，更优选1到5个氨基酸；或者可以用其他氨基酸取代SEQ ID NO：2所示氨基酸序列中的1或几个，优选1到10个，更优选1到5个氨基酸。
此外，作为一种取代方法，可以在能一定程度上保持氨基酸特性的一个家族内进行保守取代。通常根据氨基酸侧链的特性分成的家族的例子如下。
(i)酸性氨基酸家族：天冬氨酸，谷氨酸
(ii)碱性氨基酸家族：赖氨酸，精氨酸，组氨酸
(iii)非极性氨基酸家族：丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸，色氨酸
(iv)不带电荷的极性氨基酸家族：甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，半胱氨酸，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸
(v)脂肪族羟基氨基酸：丝氨酸，苏氨酸
(vi)含有酰氨基的氨基酸家族：天冬酰胺，谷氨酰胺
(vii)脂肪族氨基酸：丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸
(viii)芳香族氨基酸：苯丙氨酸，色氨酸，酪氨酸
(ix)疏水性氨基酸：亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸
(x)小氨基酸家族：丙氨酸，丝氨酸，苏氨酸，甲硫氨酸，甘氨酸
取代的例子是由SEQ ID NO：2所示氨基酸序列用另一个氨基酸，优选用Ala，Gln或Trp取代176位的Arg和/或179位的Arg得到的序列，这样此处的切割位点被阻止或抑制。此外，本发明所述多肽也涵盖这样的多肽，其由以SEQ ID NO：2所示氨基酸序列从N末端，C末端或两端删除10个或以上氨基酸得到的氨基酸序列(末端删除型)组成。这种末端删除型的例子包括由SEQ ID NO：2所示氨基酸序列在C末端删除20，40，45或50个氨基酸，和/或在N末端删除24或33个氨基酸得到的序列。末端删除型的实施方案如下所示。
 N末端删除的氨基酸数  C末端删除的氨基酸数   在SEQ ID NO：2所示氨基酸序列中的位置(在SEQ IDNO：1中的核苷酸编号)
 N末端33个  没有删除   34-251(232-885)
 N末端33个  C末端20个   34-231(232-825)
 N末端33个  C末端40个   34-211(232-765)
 N末端33个  C末端45个   34-206(232-750)
 N末端33个  C末端50个   34-201(232-735)
 N末端24个  没有删除   25-251(205-885)(对应于1到681在SEQ ID NO：3中，和SEQ ID NO：4中)
 N末端24个  C末端20个   25-231(205-825)
 N末端24个  C末端40个   25-211(205-765)
 N末端24个  C末端45个   25-206(205-750)
 N末端24个  C末端50个   25-201(205-735)
 没有删除  C末端20个   1-231(133-825)
 没有删除  C末端40个   1-211(133-765)
 没有删除  C末端45个   1-206(133-750)
 没有删除  C末端50个   1-201(133-735)
除了上述SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的部分片段，本发明的多肽还涵盖由这些末端删除型多肽经过删除，取代或添加1或几个氨基酸得到的突变片段。在上表中SEQ ID NO：2中的氨基酸位置之后的括号中的数字表示在SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的核苷酸位置。因此，本发明也涵盖了由这些位置所示的核苷酸序列组成的DNA或者与这些DNA在严谨条件下杂交的DNA。
在本发明中，为了向发明所述多肽的至少部分氨基酸序列中引入突变，采用了给编码该氨基酸的DNA的核苷酸序列引入突变的技术。
可以通过已知技术向DNA中引入突变，比如Kunkel法或Gappedduplex法，或者相应的方法。例如，基于利用突变寡核苷酸作为引物的定点突变法引入突变。此外，也可以使用用于产生突变的试剂盒，比如Mutan-K(TAKARA)，Mutan-G(TAKARA)，LA PCR体外突变试剂盒(TAKARA)等来引入突变。
另外，本发明的DNA也涵盖这样的DNA，它与由本发明上述DNA(SEQ ID NO：1，3，5，7和9)制备的探针在严谨条件下杂交，并且编码具有低磷酸盐血症诱发活性，磷酸盐转运抑制活性，钙化抑制活性或者维生素D代谢调节活性的多肽。此处所用的探针具有与SEQ IDNO：1，3，5，7或9所示序列的全部序列或者其连续17个或更多个核苷酸(部分序列)互补的序列。
这里，术语“严谨条件”满足盐浓度在750mM或以上，优选900mM或以上，温度在40℃或以上，优选42℃的条件。具体来说，此处使用的严谨条件包括6x SSC，5x Denhardt，0.5％SDS，50％甲醛和42℃。另外，6x SSC表示900mM NaCl和90mM柠檬酸钠。Denhardt溶液(Denhardt)含有BSA(小牛血清白蛋白)，聚乙烯吡咯烷酮和Ficoll400。50x Denhardt溶液由1％BSA，1％聚乙烯吡咯烷酮和1％Ficoll400(5x Denhardt表示50x Denhardt浓度的十分之一)组成。
本发明所述DNA的核苷酸序列一经确定，可以通过化学合成或者由已确定的核苷酸序列合成引物经PCR得到发明所述DNA。
2.含有发明所述DNA的重组载体以及转化子的制备
(1)重组载体的制备
通过将本发明所述DNA连接到合适的载体中可以获得本发明的重组载体。用于插入发明所述DNA的载体没有特别限制，只要它能在宿主中复制。这类载体的例子包括质粒DNA和噬菌体DNA。
质粒DNA的例子包括得自大肠杆菌的质粒(例如，pBR322，pBR325，pUC118和pUC119)，得自枯草芽孢杆菌的质粒(例如pUB110和pTP5)，得自酵母的质粒(例如，YEp13，YEp24和YCp50)。噬菌体DNA的一个例子是λ噬菌体。此外，也可以使用动物病毒载体比如逆转录病毒，腺病毒或痘苗病毒，或者昆虫病毒载体比如杆状病毒。另外，可以使用连接了GST，His-tag等的融合质粒。
为了将本发明的DNA插入载体，可以使用这样一种方法，其包括首先用适当的限制酶切割纯化的DNA，并通过将切好的DNA插入适当载体DNA的限制酶位点或多克隆位点来使所得切好的DNA载体与载体连接。
本发明的DNA必须整合到载体中从而该DNA能执行其功能。对于发明所述载体，除了启动子和本发明的DNA，如果需要可以连接上顺式作用元件比如增强子，剪接信号，poly A添加信号，选择标记和核糖体结合序列(SD序列)。此外，选择标记的例子包括二氢叶酸还原酶基因，氨苄抗性基因和新霉素抗性基因。
(2)转化子的制备
通过将发明所述重组载体导入宿主中，使靶基因能够表达，可以获得本发明的转化子。此处所用宿主没有特定的限制，只要它能表达本发明的DNA。这类宿主的例子包括细菌：埃希氏菌属，比如大肠杆菌；芽孢杆菌属，比如枯草芽孢杆菌；假单胞菌属，比如恶臭假单胞菌；或者酵母比如酿酒酵母或者粟酒裂殖酵母。此外，也可以使用动物细胞，比如COS细胞，CHO细胞或者HEK293细胞，以及昆虫细胞，比如Sf9或Sf21。
当用细胞，比如大肠杆菌作为宿主时，优选发明所述重组载体可以在细菌中自主复制，并包含启动子，核糖体结合序列，本发明的DNA以及转录终止序列。另外，也可以含有调控启动子的基因。大肠杆菌的例子包括JM109和HB101，枯草芽孢杆菌的例子是枯草芽孢杆菌。可以使用任何启动子，只要它能在宿主，比如大肠杆菌中表达。例如，得自大肠杆菌的启动子，例如trp启动子，lac启动子，PL启动子或PR启动子或者来源于噬菌体的T7启动子等。也可以使用人工设计和修饰的启动子，比如tac启动子。此处将重组载体导入细菌所采用的方法没有特别限制，只要它是将DNA导入细菌的方法。这类方法的例子包括使用钙离子的方法和电穿孔法。
当使用酵母作为宿主时，可以用例如酿酒酵母，粟酒裂殖酵母和巴斯德毕赤氏酵母。这种情况下使用的启动子没有特别限制，只要它能在酵母中表达。这类启动子的例子包括gal1启动子，gal10启动子，热震蛋白启动子，MFα1启动子，PHO5启动子，PGK启动子，GAP启动子，ADH启动子和AOX1启动子。将重组载体导入酵母的方法没有特定限制，只要它是一种将DNA导入酵母的方法。这类方法的例子包括电穿孔法，原生质球法和醋酸锂法。
当使用动物细胞作为宿主时，可以猴细胞COS-7，Vero，中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)，小鼠L细胞，大鼠GH3细胞，人FL，HEK293，HeLa，Jurkat细胞等。作为启动子，可以使用SRα启动子，SV40启动子，LTR启动子，β-肌动蛋白启动子等。另外，可以使用人巨细胞病毒等的早期基因启动子。将重组载体导入动物细胞的例子包括电穿孔法，磷酸钙法和脂质转染法。
当用昆虫细胞作为宿主时，可以使用Sf9细胞，Sf21细胞等。作为将重组载体导入昆虫细胞的方法，可以使用磷酸钙法，脂质转染法，电穿孔法等。
3.具有低磷酸盐血症诱发活性的多肽
曾有多次尝试从肿瘤诱导性骨软化症中分离和鉴定具有低磷酸盐血症诱发活性的肿瘤衍生因子。因此，本发明的多肽表现出由肿瘤诱导性骨软化症的肿瘤产生的新的分泌因子的特性。该低磷酸盐血症诱发因子的预期生物活性有如下报导。
对促进磷酸盐排泄到尿中的影响：
Aschinberg，L.C.等，J.Pediatrics 91：56-60，1977，Lau，K.等，Clinical Research 27：421A，1979，Miyauchi，A.等，J.Clin.Endocrinol.Metab.67：46-53，1988
对肾小管表皮细胞的磷酸盐转运活性的抑制：
Cai，Q.等，N.Engl.J.Med.330：1645-1649，1994，Wilkins，G.E.等，J.Clin.Endocrinol.Metab.80：1628-1634，1995，Rowe，P.S.N.等，Bone 18：159-169，1996
对25-羟基维生素D-1α-羟基酶活性的抑制：
Miyauchi，A.等，J.Clin.Endocrinol.Metab.67：46-53，1988
特别是，已建议将一种直接具有抑制肾脏中磷酸盐重吸收的未知分子称为Phosphatonin(Econs，M.J.&Drezner，M.K.，Engl.J.Med330：1679-1681，1994)。还有建议说一种具有这样的生物活性的未知分子也存在于XLH中。对XLH患者的临床发现的特征在于尿磷酸盐排泄增强的低磷酸盐血症，这是与肿瘤诱导性骨软化症患者相同的，并且由于骨组织中钙化不足XLH会发展成骨软化症或佝偻病。已经证明引起XLH的基因是一个编码类肽链内切酶蛋白质的基因，称为PHEX。最近，在Hyp小鼠，即已知能表达类似于XLH的表型特征的自然突变小鼠，中发现其编码PHEX的基因有部分删除，这暗示认为Hyp小鼠是XLH模型小鼠是正确的(Strom，T.M.等Human MolecularGenetics 6：165-171，1997)。Hyp小鼠中的低磷酸盐血症诱发因子是一种体液因子，这一点在使用Hyp小鼠和正常小鼠的异种共生实验中得到证实(Meyer，R.A.等，J.Bone Miner.Res.4：493-500，1989)。在这个实验中，正常小鼠的血液磷酸盐水平下降，尿磷酸盐排泄增加。因此，有人认为Hyp小鼠中存在的体液低磷酸盐血症诱发因子能作用于正常小鼠。到目前为止预期具有肽链切割活性的PHEX和这个未知的低磷酸盐血症诱发因子之间的关系还不清楚。但是，也有人提出了这样一些涉及两者关系的假设，即PHEX可能调节未知的低磷酸盐血症诱发因子的活性，还有这样的可能性，在肿瘤诱导型骨软化症中发现的低磷酸盐血症诱发因子与在XLH中发现的因子是一样的(Drezner，M.K.Kidney Int 57：9-18，2000)。根据这个假设，PHEX和低磷酸盐血症诱发因子都常规地在相同细胞中表达，PHEX抑制性地作用于低磷酸盐血症诱发因子。PHEX的这种功能在XLH患者中下降或消失，因此低磷酸盐血症诱发因子的活性得以强烈表达。据认为在肿瘤诱导性骨软化症中，PHEX和低磷酸盐血症-诱发因子都升高，最终活性低磷酸盐血症诱发因子在数量上超过了正常水平。也有认为该低磷酸盐血症诱发因子抑制性地作用于NPT2的磷酸盐转运活性，后者是肾脏中的磷酸盐载体之一。为了寻找这个未知的低磷酸盐血症诱发因子人们做了许多尝试，但都未能鉴定到该分子。根据Cai等的一项研究，预计该低磷酸盐血症诱发因子的分子量在8kDa到25kDa(Cai，Q.等，N.Engl.J.Med.330：1645-1649，1994)，但Rowe等提出56kDa和58kDa的两个蛋白质是候选分子。最近，Rowe等提交了一份关于一种多肽的专利申请(WO99/60017)，该多肽包含430个氨基酸残基，是用于肿瘤诱导性骨软化症的肿瘤衍生磷酸盐代谢调控因子。但是，该申请所公开的多肽是原来存在的一个蛋白质的部分序列，并且没有公开与低磷酸盐血症诱发活性相关的生物活性。最近，有人报导了该专利中公开的名为MEPE的全长分子所对应的多肽，但没有同时公开其诱发低磷酸盐血症的活性(Rowe，P.S.N.等，Genomics，67：54-68，2000)。另外，该分子和本发明所述多肽之间没有可识别的序列或结构上的相似性。
如上所述，推断出存在一个具有诱发低磷酸盐血症活性的生理活性因子，但至今没有确定其身份。在本发明中，我们弄清了该多肽的实体，以及编码该多肽的基因序列。此外，正如后面描述的，我们制备了本发明所述多肽，表明该产物可以作为磷酸盐代谢，钙代谢和维生素D代谢或者钙化和骨生成的调节因子，以及该产物可以作为药物组合物。另外，我们已经证实本发明所述抗体不仅可以用于治疗，还可以用于临床检测和诊断。而且，我们表明编码本发明所述多肽的DNA可用于诊断遗传疾病，以及磷酸盐代谢，钙代谢和骨代谢的多态性诊断。
本发明中具有低磷酸盐血症诱发活性的多肽可以这样制备，即将例如含有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列中核苷酸133到885的序列以能被表达的形式导入合适的宿主细胞来制备转化子细胞，然后令导入到转化子细胞的DNA表达。此外，以这样方式制备的多肽链可以由宿主的蛋白质修饰机制被修饰，比如切割或添加糖链。
通过培养以上转化子，然后从培养产物中收集可以得到本发明的多肽。术语“培养产物”意味着，除了培养物上清外，所有的培养细胞或培养微生物，或者被裂解的细胞或微生物。
本发明的转化子可以通过任何常规的宿主培养方法来培养。
只要含有碳源，氮源，无机盐等能被微生物同化，有效地培养转化子，天然或合成的培养基都可用于培养利用微生物，比如大肠杆菌或酵母作为宿主得到的转化子。碳源的例子包括碳水化合物比如葡萄糖，果糖，蔗糖或淀粉，有机酸比如醋酸或丙酸，以及醇比如乙醇或丙醇。氮源的例子包括氨，有机或无机酸的铵盐比如氯化铵，硫酸铵，醋酸铵或磷酸铵，或其他含氮的化合物，以及蛋白胨，肉提取物，和玉米浆。矿物质的例子包括磷酸二氢钾，磷酸氢二钾，磷酸镁，硫酸镁，氯化钠，硫酸铁，硫酸锰，硫酸铜和碳酸钙。
培养通常在有氧条件下进行，比如于37℃下震荡培养或通气搅拌4到48小时。在培养过程中，pH保持在6.0到8.0之间。用无机或有机酸，碱溶液等调节pH。培养时，如果需要可以向培养基中加入抗生素，比如氨苄青霉素或四环素。
当培养使用诱导性启动子的表达载体转化之微生物时，如果需要可以向培养基中加入诱导剂。例如，当培养用含有T7启动子的表达载体转化的微生物时，该启动子可以用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导，就可以向培养基中加入IPTG等。此外，当培养用含有trp启动子的表达载体转化的微生物时，该启动子可以用吲哚乙酸(IAA)诱导，就可以向培养基中加入IAA等。
培养利用动物细胞作为宿主得到的转化子的培养基的例子包括普遍使用的RPMI1640培养基，DMEM培养基或者补充了胎牛血清等的培养基。培养通常在37℃，5％CO2条件下进行1到10天。培养时，如果需要可以向培养基中加入抗生素，比如卡那霉素或青霉素。培养后，当本发明所述多肽产生于微生物或细胞内时，可以通过超声，反复冻融，匀浆处理等破碎微生物或细胞从而收集靶多肽。而当本发明所述多肽产生于细菌或细胞外部时，用全部培养液，进行离心等来除去细菌或细胞。然后，可以将分离和纯化蛋白质的常规生化方法(比如硫酸铵沉淀，凝胶层析，离子交换层析和亲合层析)单独或联合使用从上述培养产物中分离和纯化本发明的多肽。
正如上面对XLH的描述，被认为是一种肽链内切酶的PHEX在调节低磷酸盐血症诱发因子中有重要意义。因此，本发明中具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽有可能在进一步修饰和切割后具备变化了的活性。在本发明中，利用CHO ras-clone 1细胞作为宿主，制备了一种能产生在本发明所述多肽的C末端带有6个连续His的重组多肽的克隆细胞系。该细胞系保藏在国立先进工业科学与技术研究院，国际专利生物保藏处(Chuo 6，1-1-1，Higashi，Tsukuba-shi，Ibaraki，Japan)(保藏号FERM BP-7273，最初保藏日：2000年8月11日)。
当检测本发明中由细胞系产生并分泌到培养液中的多肽时，利用识别His-tag序列的抗体通过Western印迹探测不同大小的基因产物，如图2所示。分离各个条带所对应的蛋白质并确定其N末端氨基酸序列。这样，SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：8分别代表的N末端氨基酸序列的N末端氨基酸序列是相同的。也可以认为具有前一序列的蛋白质可能对应于一个被除去信号序列的蛋白质，具有后一序列的蛋白质对应被酶，比如肽链内切酶切割过的蛋白质。
目前，弗林蛋白酶是已知的识别RXXR的蛋白水解酶之一。实际上，当在弗林蛋白酶缺陷型细胞系内表达本发明的多肽时，未能检测到片段。而且，当具有弗林蛋白酶抑制活性的重组蛋白α1-PDX与本发明所示多肽共表达时，上清中被切割的产物显著减少。
因此，本发明还涵盖了制备发明所述多肽的一种方法，其包括培养时使用弗林蛋白酶缺陷型细胞，或与能抑制弗林蛋白酶活性的物质共存这样的步骤。
Cai等曾提出通过培养肿瘤诱导性骨软化症的肿瘤衍生细胞得到的培养液上清中的磷酸盐转运抑制活性，当用透析膜经分级分离法测量时显示分子量范围在8KDa到25KDa。同样可以想象的是，通过将本发明具有SEQ ID NO：4之氨基酸序列的多肽转化为在SEQ ID NO：2的179残基Arg和180残基Ser之间切割所产生的多肽，可以改变所述活性。
本发明的多肽具有抑制肾脏近端小管表皮细胞的磷酸盐转运活性的能力，这是低磷酸盐血症诱发活性的一种形式，如表2所示(实施例7)。血液中的大部分游离无机磷酸盐在肾小球中被过滤，其中大约80％到90％的无机磷酸盐在肾脏近端小管中被重吸收。
重吸收是由近端小管腔面上存在的II型Na-依赖磷酸盐载体经磷酸盐转运进行的。本发明的多肽具有抑制磷酸盐转运活性的能力。这意味着发明所述多肽能促进体内磷酸盐尿排泄。因此，可以认为本发明的多肽通过发挥其抑制肾脏中磷酸盐重吸收，特别是在近端小管肾细胞中的磷酸盐转运的活性，而诱发低磷酸盐血症，所以预计本发明所述多肽与上面的Phosphatonin是相同的物质。
最近，在肠道中鉴定到了Na-依赖磷酸盐载体。该载体被命名为IIb型，因为它与肾脏中存在的II型Na-依赖磷酸盐载体同源性极高。可以想象与肾脏中的II型Na-依赖磷酸盐载体类似，本发明的多肽也能抑制肠道腔面上存在的IIb型Na-依赖磷酸盐载体。这可以看作是低磷酸盐血症诱发活性的一种形式。
通过实验评估本发明所述多肽的体内活性，该实验中将表达上述多肽的重组细胞皮下移植到裸鼠中。
该实验中的移植细胞在裸鼠的皮下空间生长，然后使其形成肿瘤。随着肿瘤形成由该细胞产生和分泌的本发明的多肽特征在于能释放到小鼠的体液中，从而可以在该动物模型中再现肿瘤诱导性骨软化症中肿瘤衍生体液因子的释放。在这个模型实验中，如表4所示(实施例11)，与通过移植未导入本发明DNA的CHO细胞而形成肿瘤的对照小鼠，或者不形成肿瘤的小鼠相比，移植了表达本发明多肽的细胞的小鼠发展为明显的低磷酸盐血症。与此对应，本发明所述多肽显示出低磷酸盐血症诱发活性。此外，该实验还显示磷酸盐重吸收率也下降了，肾脏中的磷酸盐重吸收被抑制。所以，结论是本发明的多肽是肿瘤诱导性骨软化症的低磷酸盐血症诱发因子。
另一方面，在上述模型实验中，在移植了能产生本发明所述多肽的重组细胞的小鼠中发现了钙不足。因此，这说明本发明的多肽也是钙不足诱发因子。在实施例16所描述的实验中，表达本发明所述多肽的CHO细胞被移植到裸鼠体内，该实验显示血清1α，25-二羟维生素D水平持续下降。如实施例19和20所述，当将本发明的导入了突变的多肽或者发明所述野生型全长多肽给予正常小鼠三次，两者中的血清1α，25-二羟维生素D水平都下降了。此外，如实施例24所述，将本发明的多肽给药一次后，几小时内即观察到血清1α，25-二羟维生素D水平下降。因此，可以想见导致1α，25-二羟维生素D水平下降的活性是发明所述多肽的主要生物或生理效应。
正如上面的描述，血清1α，25-二羟维生素D水平由1α-羟化酶和24-羟化酶调控。如实施例16所述，发明所述多肽降低血清1α，25-二羟维生素D水平的作用伴随着这些代谢酶表达的波动。此外，如实施例24所述，在将本发明的多肽给药后1小时，观察到负责活性维生素D代谢物产生的1α-羟化酶的基因转录产物减少，分解活性维生素D代谢物的24-羟化酶的基因转录产物增加。这些表达情况发生波动之后，血清1α，25-二羟维生素D水平逐渐下降，这暗示着本发明所述多肽的降低1α，25-二羟维生素D水平的效应至少是由于1α-羟化酶基因表达被抑制和24-羟化酶基因表达增强。
与此相反，在一个长期移植实验中(移植后44到46天)，该实验中象实施例11描述过的，表达本发明所述多肽的CHO细胞被移植到裸鼠体内，1α-羟化酶基因表达升高。在此时的小鼠血清PTH水平被证明与对照组相比显著提升。因此，可以推测1α-羟化酶基因表达增强是由于高水平的PTH效应。但有趣的是，即使在高PTH水平的条件下，24-羟化酶基因的表达持续上升，这可以理解为高PTH水平不能干扰本发明的多肽对24-羟化酶基因表达的调控。如实施例11所述，血清1α，25-二羟维生素D3水平没有增加，尽管有小鼠表现出严重的类低磷酸盐血症或类佝偻病的临床发现。这提示了本发明的多肽具有持续增强24-羟化酶基因表达的效果。
A.Nykjaer等已经揭示了25-羟基维生素D是在肾脏近端小管被重吸收(Cell，96：507-515，1999)。尽管本说明书没有描述，但在表达发明所述多肽的CHO细胞被移植到裸鼠体内的一个实验中，没有发现血清25-羟基维生素D水平有显著变化。此外，也没有识别到本发明的多肽影响主要电解质(比如钠，钾或氯，主要的氨基酸或者葡萄糖)的部分排泄(用尿水平/血清水平/GFR计算出的)，这提示肾小管的重吸收功能未被破坏的事实(T.Shimada等，Proc.Natl.Acad.Sci，印刷中)。所以，这说明本发明的多肽不是通过抑制25-羟基维生素D在肾小管的重吸收，而是通过特异地作用于1α，25-二羟维生素D的合成途径从而降低血清1α，25-二羟维生素D水平的。
已知在肿瘤诱导性骨软化症中血清1α，25-二羟维生素D水平显著下降。此外，在血磷酸盐过少性抗维生素D佝偻病(XLH)或Hyp(表现XLH临床症状的模型小鼠)中，血清1α，25-二羟堆生素D水平在正常范围内或者稍低于正常范围的下限，尽管血清磷酸盐水平严重下降。Hyp小鼠中24-羟化酶基因表达升高也是已知的。在这些发展为低磷酸盐血症的临床症状中，正常情况下，随着血清磷酸盐水平下降，1α-羟化酶基因表达升高，从而使血清1α，25-二羟维生索D水平上升。因此，我们认为导致这一正常生理反应丧失的任何调节系统的失灵至少是这些临床症状的原因之一。这些现象与实施例11，19或20描述的在小鼠中观察到的生理反应相似，强烈地提示本发明的多肽能降低以上临床症状中的血清1α，25-二羟维生素D3水平。
图5所示X光图像清楚地显示了与对照组相比，移植了表达发明所述多肽的重组细胞的小鼠，其骨骼组织的钙化程度明显下降。还观察到胸廓变形等现象，提示本发明的多肽对骨骼形成有影响。
换句话说，可以想见本发明的多肽具有抑制骨骼组织钙化，或者促进钙和磷酸盐从骨骼组织中聚集的效果。同样可以想象血液磷酸盐和钙水平的显著下降导致对骨骼组织钙化的再次抑制。
在Hyp小鼠中，据认为骨骼衍生细胞产生一种抑制肾脏近端小管中磷酸盐转运活性的因子(Lajeunesse，D.等，KidneyInt.50：1531-1538，1996)。此外，有报导说Hyp小鼠的成骨细胞释放钙化抑制因子(Xiao，Z.S.，Am.J.Physiol.，E700-E708，1998)。如上所述，在XLH和肿瘤诱导性骨软化症中，临床症状比如低磷酸盐血症和骨骼组织钙化不足彼此非常相象，并且这些临床症状可能由一种体液因子所诱发。归结这些事实提示了这样一种可能，即在这些对Hyp小鼠的研究中报导的肾脏磷酸盐转运抑制活性和骨骼钙化抑制活性是由同一种因子导致的。此外，还有报导说即使在钙和磷酸盐水平处于正常范围的状态下，Hyp小鼠的成骨细胞也显示异常的成骨功能(Ecarot，B.等，J.Bone Miner.Res.7：215-220，1992)。本发明的多肽具有与上述Hyp小鼠的预期因子类似的活性。因此，可以想见本发明的多肽，除了低磷酸盐血症诱发活性，还有不经钙或磷酸盐代谢介导，直接调节骨骼组织钙化的作用。
在完成本发明的过程中，除了编码发明所述多肽的基因，还得到了如实施例3中表1所示的牙基质蛋白-1(DMP-1)。该基因在牙质中表达丰富，其编码的蛋白质是牙质的胞外基质蛋白，它被认为在牙质的钙化基质形成中有重要作用。类似地，得到编码基质胞外磷酸化蛋白(MEPE)的基因OST190。该分子的具体功能不清楚。另外类似地，还得到编码骨桥蛋白的基因。MEPE，DMP-1和骨桥蛋白具有共同的特性，即它们是含有RGD基元序列的磷酸化蛋白质，富含能被磷酸化的丝氨酸和苏氨酸，酸性氨基酸谷氨酸和天冬氨酸含量高，表现出强的酸性蛋白质特性。一个特征性的酸性区域，名为ASARM序列，在MEPE和DMP-1中是保守的(Rowe，P.S.N.等，Genomics 67：54-68，2000)，这提示了它们生理或功能意义的相似性。在开始钙化时与无机钙和/或磷酸盐的相互作用被认为是这样的特征蛋白质的功能之一。除了成骨细胞和破骨细胞，骨桥蛋白基因在各种细胞，比如巨噬细胞中的表达已有报导。另一方面，DMP-1在骨骼组织，特别是在骨细胞中的表达最近有报导。MEPE在骨髓组织或骨肉瘤细胞比如SaOS-2中的基因表达是已知的。在本发明过程中，与本发明所述多肽一起发现了常见于钙化组织的酸性基质蛋白这一事实代表了本发明的多肽的作用的一个方面。具体来说，存在这样的可能，即本发明的多肽诱导了上述分子所代表的钙化组织特异性分子的表达，因此所述多肽以协同方式调节钙化，钙代谢和磷酸盐代谢，或者被诱导的分子次级调节钙化，钙代谢和磷酸盐代谢。还可以想见本发明的多肽可以通过直接作用于成骨细胞，骨细胞和破骨细胞来调节骨代谢。所以，本发明所述多肽可以用于治疗骨质疏松症一类的代谢性骨骼疾病。
最近，具有类成骨细胞表型的细胞显示出现在异常钙化位点，这提示钙化可能是通过与骨骼组织中钙化过程类似的机制发生的。因此，可以想象本发明的多肽对于通过抑制这些负责钙化的细胞的出现或抑制其功能来治疗异常钙化是有效的。
在本发明中，上述多肽可以被修饰。例如，可以适当地选择聚乙二醇，葡聚糖，聚(N-乙烯-吡咯烷酮)，聚丙二醇均聚物，聚丙烯氧化物/乙烯氧化物的共聚物，聚氧乙烯多元醇和聚乙烯醇等使用。可以采用任何已知技术作为修饰方法。例如，在JP专利公开(PCT译本)NO.10-510980中详细公开的一项技术。
4.抗发明所述多肽的抗体
本发明的抗体能与上述本发明的多肽特异性反应。本发明中，术语“抗体”意味着能与抗原多肽或其片段结合的整个抗体分子或其片段(例如，Fab或F(ab’)2片段)，它可以是多克隆或单克隆抗体。
本发明的抗体可以依据常规方法制备。例如，抗体可以通过体内方法制备，其包括使用抗原与佐剂以几周间隔将动物免疫一次或几次(加强免疫)，或者是体外方法制备，其包括分离免疫细胞并利用合适的培养系统来使免疫细胞致敏。能产生发明所述抗体的免疫细胞的例子包括脾细胞，扁桃体细胞和淋巴细胞。
用作抗原的多肽不必是完整的上述本发明的多肽。可以用该多肽的一部分作为抗原。使用短肽作为抗原时，尤其是只有大约20个氨基酸残基那么短的肽，这样的肽要通过化学修饰等方法结合一个有高抗原性的载体蛋白，比如匙孔血蓝蛋白或牛血清白蛋白，或者共价结合一个有分支骨架的肽而非载体蛋白，比如赖氨酸核心MAP肽(Posnett等，J.Biol.Chem.263，1719-1725，1988；Lu等，Mol.Immunol.28，623-630，1991；Briand等，J.Immunol.Methods 156，255-265，1992)。
作为佐剂，可以使用例如弗氏完全或不完全佐剂，氢氧化铝胶等。用抗原免疫的动物，可以使用例如，小鼠，大鼠，兔，绵羊，山羊，鸡，牛，马，豚鼠和仓鼠。
多克隆抗体的获得可以通过从这些被免疫动物采血，分离血清以及利用硫酸胺沉淀，阴离子交换层析和蛋白A或G层析这些方法之一或它们的适当结合来纯化免疫球蛋白。当上述动物是鸡时，可以从鸡蛋中纯化抗体。
通过纯化杂交瘤的培养物上清来制备单克隆抗体，所述杂交瘤是通过将已经在体外致敏或者采自上述动物的免疫细胞与能进行培养的亲代细胞融合制备的，或者从腹腔内接种杂交瘤的动物的腹水中制备所述抗体。动物，比如小鼠的常见成熟细胞系可以用作亲代细胞。此处优选使用的细胞系有药物选择性，并具有未融合时不能在HAT选择培养基(含有次黄嘌呤，氨基喋呤和胸腺嘧啶)中存活，但在与抗体生成细胞融合的状态能存活的特性。这类细胞系的例子包括X63，NS-1，P3U1，X63.653，SP2/0，Y3，SKO-007，GM1500，UC729-6，HM2.0和NP4-1细胞。
制备单克隆抗体的具体技术如下。
将如上所述制备的多肽或其片段作为抗原给予上述动物。当使用佐剂时每个动物的抗原剂量是1到100ug。免疫主要通过静脉内，皮下或腹腔内注射进行。此外，免疫间隔没有特别限定。间隔几天到几周，优选1到3周，免疫进行1到10次，优选2到5次。1到10天后，优选最后一次免疫后1到4天，采集抗体生成细胞。
为了获得杂交瘤，将抗体生成细胞和素代细胞(黑素瘤细胞)融合。细胞融合在用于培养动物细胞的无血清培养基(比如DMEM或RPMI-1640培养基)中进行，通过将5x106到1x108细胞/ml抗体生成细胞与1x106到2x107细胞/ml黑素瘤细胞混合(优选的抗体生成细胞与黑素瘤细胞的比率是5∶1)，并在细胞融合促进剂存在的条件下进行融合反应。可以使用平均分子量在1000到6000道尔顿的聚乙二醇等作为融合促进剂。此外，可以用市场上的细胞融合设备(例如，电穿孔)利用电刺激将抗体生成细胞和黑素瘤细胞融合。
完成细胞融合后，从所述细胞中挑选目标杂交瘤。将细胞悬浮液适当地稀释在，例如含有胎牛血清的RPMI-1640培养基中，以大约5x105细胞/孔的浓度接种到微量培养板中。向每个孔中加入选择培养基，然后进行培养同时适时换选择培养基。最终，在选择培养基中培养大约14天后增殖的细胞可以作为杂交瘤。对已经增殖的杂交瘤的培养上清进行筛选寻找能与本发明的多肽反应的抗体。杂交瘤的筛选可以依据常规方法进行，筛选方法没有特别限制。例如，采集一部分包含在生长杂交瘤的孔中的培养上清，然后通过酶免疫法，放射免疫法等进行筛选。
可替代地，可以通过培养永生化抗体生成细胞来制备单克隆抗体，所述抗体生成细胞是用合适的病毒(比如EB病毒)感染体外致敏的或来自上述被免疫动物的免疫细胞而得到的。
除了这些细胞工程技术，还可以通过基因工程技术获得所述单克隆抗体。例如，可以通过PCR(聚合酶链式反应)从体外致敏的或上述动物的免疫细胞中扩增得到这类抗体基因。将该基因导入微生物(比如大肠杆菌)使其产生抗体，或者令噬菌体将所述抗体表达为细胞表面的融合蛋白。
使用本发明的抗体对发明所述多肽进行体内定量，这使得能够阐明本发明的多肽与各种疾病的临床症状之间的关系。而且，所述抗体可以用于诊断或治疗，并能有效地亲合纯化本发明所述多肽。
据估计，有些疾病的病因在于发明所述多肽的过分作用而导致的血清1α，25-二羟维生素D水平的下降。例如，尽管血磷酸盐过少性抗维生素D佝偻病(XLH)能发展为严重的低磷酸盐血症，没有发现血清1α，25-二羟维生素D3水平上升。其原因被认为是维生素D代谢酶基因的异常。该病中，可能涉及本发明的多肽的过分作用。在Hyp(XLH的小鼠模型)中，有报道说24-羟化酶基因表达增强。这与本发明的多肽能诱导24-羟化酶基因表达增强的作用是一致的。因此，预计通过给予抗本发明所述多肽的抗体来使维生素D的代谢正常，从而纠正血清1α，25-二羟维生素D3的水平可以治疗这种病。与XLH呈现类似的临床表征的一例疾病是常染色体显性血磷酸盐过少性佝偻病(ADHR)。在克隆本发明的多肽时，根据它在染色体上的位置，我们推断编码该多肽的基因就是引起ADHR的基因。最近，有人分析了引起ADHR的一个基因，报道说该病是由编码所述多肽的基因的一个错义突变导致的。我们进一步阐明该突变赋予了这个基因酶切抗性，并且说明这个分子的过度作用是导致该病的原因。可以想见抗本发明所述多肽的抗体通过其抑制作用能有效治疗这种疾病。ADHR发展为骨软化症，矿物质代谢紊乱和维生素D代谢异常。因此在与这些代谢途径密切相关的代谢性骨骼疾病中，可能有一些是由本发明所述多肽引起的。可以预期到的是抗本发明所述多肽的抗体对这类病有效。已知抑制分化成脂肪细胞是1α，25-二羟维生素D的作用之一。并且人们知道骨髓中的脂肪细胞随着年龄增加。这种情况下，由骨髓中普通的支持骨髓造血的造血细胞，脂肪细胞和基质细胞的前体细胞分化为脂肪细胞会增强。可以想见在这个过程中，本发明的多肽可能过分作用导致1α，25-二羟维生素D水平下降。所以，可以预计使用抗本发明所述多肽的抗体能提高血液或局部1α，25-二羟维生素D水平，抑制分化为脂肪细胞，提高下降的骨骼形成或造血能力。此外，预计该抗体也能有效防止肥胖。可以想见还有发明所述多肽参与的一些其他疾病。可以通过ELISA所代表的免疫定量方法结合抗本发明所述多肽的抗体来筛选这类疾病。相应地，可以确定出发明所述多肽的生理正常范围，就可以明确偏离这一范围的疾病。预期抗本发明所述多肽的抗体可以用于治疗这样的疾病，这些疾病中本发明所述多肽经以上方法测量，显示出异常高的血液水平。
5.药物组合物
(1)包含本发明所述多肽的药物组合物
本发明的多肽可以作为药物组合物用于血磷酸盐水平不利地升高的疾病。在慢性肾衰竭中，磷酸盐从肾脏中排泄下降导致血液磷酸盐水平上升。高磷酸盐血症进一步加重了肾脏功能，促进甲状旁腺激素从甲状旁腺分泌，从而诱发继发的甲状旁腺功能亢进。这种疾病导致皮肤瘙痒，以及肾脏中1α，25-二羟维生素D3合成紊乱引起的肠道钙吸收降低。此外，血液磷酸盐储留造成的甲状旁腺激素过量分泌的状况促进钙从骨骼组织的流失。当这种状况持续时，会发生纤维性骨炎或甲状旁腺增生，后者是肾脏骨营养不良的一个临床症状。逃避这一状况的优选方法是提高上面提及的低磷酸盐血症，但目前的医疗方法不能有效控制低磷酸盐血症。在慢性肾衰竭能维持排尿功能的阶段，本发明的多肽具有通过抑制肾脏近端小管表皮细胞中存在的II型Na-依赖性磷酸盐载体从而促进磷酸盐排泄到尿中来纠正血液磷酸盐水平(磷酸盐转运抑制活性)。此外，本发明的多肽能够作用于肠道，通过与在肾脏中类似的方式抑制II型Na-依赖性磷酸盐载体，从而减少磷酸盐吸收到体内来纠正血液磷酸盐水平。
本发明的多肽还可以作为药物组合物用于异常钙代谢和磷酸盐代谢所导致的疾病。术语“异常钙代谢”表示这样一种状态，此时血清钙水平偏离了临床上界定的正常范围，或者是血清钙水平处于正常范围内，但肾脏，肠道，骨骼组织和甲状旁腺的功能异常地增强或下降了以便维持血清钙水平，或者是调节血清钙的激素，比如甲状旁腺激素，1α，25-二羟维生素D3或降钙素呈现异常数值。此外，术语“异常磷酸盐代谢”表示这样一种状态，即血清磷酸盐水平偏离临床上界定的正常范围，或者血清磷酸盐水平处于正常范围，但肾脏，肠道和骨骼组织中的磷酸盐平衡功能异常地增强或下降了。
肾脏骨营养不良以及上述继发性甲状旁腺功能亢进呈现多种临床形式，比如动力缺乏骨骼疾病，纤维性骨炎或者它们的混合表型。为了抗继发性甲状旁腺功能亢进，通常用1α，25-二羟维生素D3，1α-羟基维生素D3等来抑制甲状旁腺激素。当甲状旁腺激素的数值没有被有效抑制，可以采取脉冲疗法(以下也称为“维生素D脉冲疗法”)，它包括给予过量1α，25-二羟维生素D3或1α-羟基维生素D3。正常的血清甲状旁腺激素水平是65pg/ml或以下。当这种病症中甲状旁腺激素水平处于正常水平，会导致动力缺乏骨骼疾病，它是肾脏骨营养不良的一种形态。而且，当甲状旁腺激素水平升高时，会发生与上述临床症状相反的纤维性骨炎。最近对这类疾病的指导方针建议将甲状旁腺激素水平维持在大约130到260pg/ml。但是，异常代谢的根本原因仍不清楚。已知甲状旁腺激素能被升高的血清磷酸盐水平诱导，被升高的血清钙水平抑制。因为本发明的多肽使血液磷酸盐水平和血钙水平降低，可以推断所述多肽能改变甲状旁腺激素的功能。此外，已有报道说在肿瘤诱导性骨软化症患者中，1α，25-二羟维生素D3下降到测量极限或更低。因此，还可以推断本发明的多肽可能参与调节1α，25-二羟维生素D3的活性。可以想见在伴有上述甲状旁腺激素调节异常或活性受损的肾性骨营养不良中，本发明的多肽可以作为临床上有用的药物组合物用于动力缺乏性骨骼疾病或纤维性骨炎。所以，可以想见给予本发明的多肽为肾脏骨营养不良中的纤维性骨炎或动力缺乏性骨骼病提供了一种有用的疗法，它们是相反的。
另外，本发明的多肽可以作为异常钙化的药物组合物。骨骼组织之外的组织钙化会损害生物功能。特别是，心脏或血管钙化导致的功能紊乱会威胁生命。这类异常钙化的一个危险因素是血液钙离子和磷酸盐离子水平(以下也称为“钙-磷酸盐产量”)上升。在上述继发性甲状旁腺功能亢进的疗法中，当用维生素D脉冲疗法抵制低磷酸盐血症的临床症状时，钙-磷酸盐产量会上升从而导致异常钙化。血液透析患者的心血管系统钙化是一个严重的问题。如表4所示，本发明的多肽具有能显著降低血清钙水平和磷酸盐水平的活性，因此预计它能有效地抗异常钙化和多种疾病。
此外，本发明的多肽可以用作抗代谢性骨骼疾病的药物组合物。本发明的多肽对钙代谢，磷酸盐代谢，钙化或维生素D代谢有强调节活性。参与钙代谢和磷酸盐代谢的激素的例子包括降钙素，甲状旁腺激素和1α，25-二羟维生素D3。降钙素有降低血清钙的活性，而甲状旁腺激素和1α，25-二羟维生素D3有提高血清钙的活性。有报道说甲状旁腺激素对磷酸盐排泄到尿有影响，降钙素也有类似活性。1α，25-二羟维生素D3有促进肠道磷酸盐吸收的活性。如上所述，每种激素对维持血清钙和磷酸盐水平之间的平衡有不同活性，但降钙素和1α，25-二羟维生素D被用作骨质疏松症的治疗剂。此外，甲状旁腺激素正被开发为骨质疏松症的治疗药物。
骨骼代谢的特征在于骨骼组织的分解代谢和合成代谢，即骨骼再吸收和骨骼形成是结合在一起的。持续给予甲状旁腺激素会导致骨质减少。但是，已知当间歇性地作用时，甲状旁腺激素能促进骨骼形成。因为本发明的多肽有调节钙代谢和磷酸盐代谢的效果，可以预见到当选择合适的方法使用所述多肽时，它能有效地抗代谢性骨骼疾病包括骨质疏松。
此外，本发明的多肽可以作为药物组合物用于血清1α，25-二羟维生素D水平不利地升高的疾病或临床症状，或者用于伴有血清1α，25-二羟维生素D所诱发的不利生理反应的临床症状。
已知1α，25-二羟维生素D作用于甲状旁腺腺体从而抑制甲状旁腺激素(PTH)的分泌。因此，临床上成熟的用于慢性肾衰竭中继发性甲状旁腺功能亢进，特别是伴有高血清PTH水平的病例的疗法，包括间歇性给予高浓度1α，25-二羟维生素D。这个疗法的一个弊端是它容易导致异常钙化。在血清磷酸盐水平高的慢性肾衰竭患者中，经常观察到给予1α，25-二羟维生素D所引起的骨骼组织之外的组织钙化。由于本发明的多肽有促进血清1α，25-二羟维生素D在给予所述多肽后的几小时内快速下降的效果，该多肽可用于治疗和预防1α，25-二羟维生素D水平过高引起的异常钙化。
此外，间歇给予高浓度1α，25-二羟维生素D会过分地抑制PTH的分泌，因此它能诱发动力缺乏性骨骼疾病，发展为比如骨骼代谢停止这样的临床症状。对于这种情况，可以预见到给予本发明的多肽将导致血清中的1α，25-二羟维生素D降低，促进甲状旁腺腺体的PTH分泌正常并从动力缺乏性骨骼疾病复原。
对于血管钙化，有报道说1α，25-二羟维生素D是其中的一个钙化促进因子。本发明的多肽可以用于治疗或预防与血管钙化有关的临床症状，比如老化引起的动脉硬化，糖尿病性血管病或者透析患者的心血管系统钙化。
已知血清中的1α，25-二羟维生素D能促进肠道中的钙吸收。可以用本发明的多肽通过降低血清1α，25-二羟维生素D水平来纠正低磷酸盐血症。高钙血症的病因包括原发性甲状旁腺功能亢进导致的PTH过量，伴有慢性肉芽瘤的1α，25-二羟维生素D浓度过高，比如肉状瘤病或肺结核，或者恶性肿瘤产生的PTHrP引起的骨骼再吸收加速。在高血钙症中，这种病主要是由过量的1α，25-二羟维生素D以及过量的PTH或PTHrP引起的，可以预见到给予本发明的多肽可以使血清1α，25-二羟维生素D水平下降，从而缓解高血钙症。特别是，在慢性肉芽瘤(比如肉状瘤病或肺结核)中被激活的巨噬细胞有1α-羟化酶活性，并过量产生1α，25-二羟维生素D3。预计本发明的多肽可以直接降低该1α-羟化酶活性。
已知1α，25-二羟维生素D能促进破骨细胞的分化，预计给予本发明的多肽可以抑制骨骼重吸收。在体外，已知1α，25-二羟维生素D是一个强的破骨细胞分化诱导因子。破骨细胞的过分骨骼重吸收会导致以骨质疏松为代表的骨质减少。在这类可以观察到骨骼重吸收提高现象的疾病中，预计本发明的多肽能通过暂时降低血清1α，25-二羟维生素D水平使骨骼流通恢复正常状况。除了抑制破骨细胞在体外的分化，在使用维生素D受体缺陷型小鼠的一个骨骼移植实验中，1α，25-二羟维生素D还被认为是抑制体内骨骼形成的因子。从这些观点来看，可以预见到本发明的多肽，由于它能降低1α，25-二羟维生素D，能有效地抗骨质减少的代谢性骨骼疾病。此外，有一篇报道证实给予维生素D3的代谢物之一24，25-二羟维生素D能导致骨质增加。24，25-二羟维生素D是25-羟基维生素D经24-羟化酶羟化得到的产物。因为本发明的多肽有显著增强24-羟化酶基因表达的作用，可以预见到给予该多肽能导致在比如骨质疏松或者骨骼发育不良等骨骼疾病临床状态下，血液24，25-二羟维生素D水平上升，提高骨质。
已知PTH有强的骨骼重吸收促进作用。但是，通过间歇给予PTH可以刺激骨骼转换，最后能达到增加骨质的效果。发明所述多肽表现出的生理或生物活性包括：调节1α，25-二羟维生素D的效果；调节血清钙和血清磷酸盐水平的效果；和调节钙化的效果。因此，可以想见用该多肽有效地作用于骨组织可以调节骨转换。所以，预计所述多肽能有效地抗骨转换增强的绝经后骨质疏松以及骨转换下降的老年性骨质疏松。可能有其他本发明的多肽参与的疾病。可以通过以ELISA为代表的免疫化学检测方法结合使用1个或多个抗本发明所述多肽的抗体来筛选这类疾病。
相应地，可以设置本发明的多肽的生理正常范围，确认所述蛋白质的水平偏离了该范围的疾病。可以预见到本发明的多肽能用于治疗经以上方法测量，该多肽显示异常低的血液水平的疾病。
(2)含有发明所述抗体的药物组合物
本发明的抗体可以作为药物组合物用于抗维生素D佝偻病和肿瘤诱导性骨软化症。通过上面提及的制备抗体的方法可以得到多克隆或单克隆形式的所述多肽的中和抗体。用抗体作为药物的更合适的方法，可以制备人型抗体或人源化抗体。通过抑制本发明所述多肽的过度活性可以治疗或改善肿瘤诱导性骨软化症的低磷酸盐血症和骨软化症。预期给予抗本发明所述多肽的中和抗体可以改善肿瘤诱导性骨软化症候。此外，因为XLH的低磷酸盐血症诱发因子和钙化抑制因子被认为等同于本发明的多肽，所述中和抗体也可以作为抗维生素D性佝偻病包括XLH的治疗剂。
本发明的抗体可以作为药物组合物用于钙或磷酸盐代谢异常的疾病，或者与存在过量的发明所述多肽有关的代谢性骨疾病。如上所述，在慢性肾衰竭或血液透析患者中，维持钙代谢或磷酸盐代谢稳态的机制发生异常，这些异常可能是由于过量产生或积累了本发明所述多肽。已知本发明多肽调节骨代谢。因此可以预见也存在由于本发明多肽的过量存在导致的代谢性骨疾病。在这种情况下，可以预见到能用抗本发明所述多肽的抗体治疗或改善这些临床症状。
可以应用本发明所述抗体的疾病的例子包括至少一种骨骼疾病，比如骨质疏松，抗维生素D佝偻病，肾性骨营养不良，透析相关的骨骼疾病，高血钙骨病，佩吉特病和肿瘤诱导性骨软化症。此处，所述骨骼疾病可以是单独一种病，或者并发症，或者与上述疾病以外的病并发的骨骼疾病。
(3)给药方案
以本发明的多肽或其抗体为活性成分的药物组合物可以含有医药上可接受的载体和添加剂。这类载体和添加剂的例子包括水，医药上可接受的有机溶剂，胶原，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，羧基乙烯聚合物，藻酸钠，水溶性葡聚糖，羧甲基钠淀粉，果胶，黄原胶，阿拉伯树胶，酪蛋白，白明胶，琼脂，甘油，丙二醇，聚乙二醇，凡士林，石蜡，十八烷醇，硬脂酸，人血清白蛋白，甘露糖醇，山梨醇，乳糖和可作为医药上可接受的添加剂的表面活性剂。根据本发明采用的剂量形式，此处使用的添加剂选自以上单独一种物质或其组合。
当本发明的多肽或抗体用作骨骼疾病的预防或治疗剂时，所述多肽或抗体的使用对象没有特定限制。
本发明的多肽可以用作调节生物组织中的钙代谢，磷酸盐代谢，钙化或维生素D代谢的药物组合物。
本发明的抗体如上所述可以特别用于治疗或预防至少一种骨骼疾病，比如骨质疏松，抗维生素D性佝偻病，肾性骨营养不良，透析相关性骨疾病，伴有低血钙的骨病，佩吉特病，肿瘤诱导性骨软化症。本发明的多肽或抗体可以应用的骨骼疾病，可以是一种疾病，其并发症，或者与这些疾病之外的病并发的骨疾病。
含有本发明所述多肽或抗体的预防剂或治疗剂，对于多肽可以口服或肠胃外给药，对于抗体可以肠胃外给药。
当口服本发明的多肽时，采用的剂量形式可以是固体制剂，比如片剂，颗粒，粉末或药丸，或者液体制剂，比如液体药或糖浆等。特别是，颗粒和粉末可以制成单位剂量形式，即胶囊。对于液体制剂，可以配制成重新溶解使用的干产品。
在这些剂量形式中，用于口服的固体制剂通常在其组合物添加剂中含有经常在医药上采用的，比如粘合剂，赋形剂，润滑剂，崩解剂或润湿剂。此外，口服的液体制剂通常在其组合物添加剂中含有经常在医药上采用的，比如稳定剂，缓冲液，矫味剂，防腐剂，调味剂或着色剂。
当肠胃外给予本发明的多肽或抗体时，可以将其配制成针剂，栓剂等。
对于注射剂，通常以单位剂量安瓿一或多次剂量的容器提供，或者可以作成粉末形式，使用时重新溶解于合适的载体，比如不含热原物质的灭菌水。这些剂型通常在其组合物添加剂中含有经常在医药上采用的，比如乳化剂或悬浮剂。注射程序的例子包括静脉滴注，静脉注射，肌内注射，腹膜注射，皮下注射或皮内注射。此外，剂量差异取决于使用对象的年龄，给药途径和用药频率，可以变化很大。
这种情况下，有效的给药量是有效量的本发明所述多肽或抗体和合适的稀释剂以及医药上使用的载体的结合，对于多肽，为0.01到100μg，优选0.5到20μg/次/kg体重。此外，对于抗体，有效剂量是0.1μg到2mg，优选1到500μg/次/kg体重。
6.疾病诊断剂
(1)本发明所述抗体或多肽
本发明的抗体可以用于对血液或尿中存在的本发明所述多肽或者代谢物进行检测或定量，从而可以阐明本发明的多肽与临床症状之间的关系，所述抗体可以作为相关疾病的诊断剂。
术语“相关疾病”意味着骨骼疾病或者发展出至少一种下列异常的疾病：异常钙代谢，异常磷酸盐代谢，异常钙化和异常维生素D代谢。这类疾病的例子包括：骨质疏松，抗维生素D性佝偻病，肾性骨营养不良，透析相关性骨骼疾病，伴有低血钙的骨病，佩吉特病，肾衰竭，肾性磷酸盐渗漏，肾小管性酸中毒和范科尼综合征。
利用抗体对结合分子进行定量的方法是常规的，比如放射免疫法或酶免疫法。通过这些方法测定的血液或尿中的本发明所述多肽的水平可以指导新的临床诊断。例如，当佝偻病患者显示出其血液中本发明所述多肽的水平比正常对象高，很可能有XLH或ADHR。此外，根据本发明所述多肽的血液水平的变化，可以对慢性肾衰竭患者作出发展为继发性甲状旁腺功能亢进的预后。
对于肿瘤诱导性骨软化症，通常很难发现肿瘤。但是，使用本发明的抗体能建立有用的诊断措施。例如，当一个没有佝偻病或骨软化症家族史的患者，其发明所述多肽在血液中含量显示出比正常个体显著高时，可以怀疑患有肿瘤诱导性骨软化症。
(2)本发明的DNA
本发明中，在一个磷酸盐代谢异常或钙代谢异常，或者有代谢性骨骼疾病的患者中检测本发明的异常DNA可以用于诊断和预防疾病。
在Genbank核苷酸序列数据库中检索本发明的DNA的核苷酸序列表明，该核苷酸序列(三个片段)与人12p13 BAC RPCI11-388F6(保藏号AC008012)序列吻合。这种分段情况说明本发明的DNA的核苷酸序列是染色体序列的剪切产物。这样很明显编码本发明的多肽的DNA包含SEQ ID NO：11所示序列中至少核苷酸498到12966之间的序列或其部分片段。在这个范围内的核苷酸的取代，插入或缺失将导致本发明所述多肽的生物和生理活性的增强，下降或消失。本发明的多肽对磷酸盐代谢，钙代谢，骨骼代谢以及维生素D代谢有很强的影响。所以，当SEQ ID NO：11所示核苷酸序列或其部分区域(例如核苷酸498到12966之间的序列)中的部分核苷酸由于取代，插入，缺失等显示出基因多态性或突变，就有可能对伴有异常磷酸盐代谢和钙代谢的疾病，或发展成异常骨骼代谢的疾病，或者发展成异常维生素D代谢的疾病进行诊断和预防。
目前基于对患有ADHR的家族进行连锁分析的结果有报道，引起ADHR的基因位于12p13(Econs，M.J.等，J.Clin.Invest.100：2653-2657，1997)。在这篇报道中，还显示所述基因位于微卫星标记D12S100和D12S397之间18厘米的范围。我们通过与该报道位置进行比较确定了本发明的DNA所在的位置。编码本发明所述多肽的DNA的区域与引起ADHR的基因所在的区域相同。根据本发明所述多肽的生物活性和该基因在染色体上的位置，可以想见本发明的多肽是引起ADHR的基因所编码的。这一点可以通过从ADHR患者血液中分离细胞成分，从细胞成分分离染色体DNA，然后寻找SEQ ID NO：11所示区域内核苷酸序列发生的突变得到证实。因此，可以将含有上述核苷酸序列区域的基因作为常染色体显性血磷酸盐过低性佝偻病，X-连锁的血磷酸盐过低性佝偻病，血磷酸盐过低性骨骼疾病，骨质疏松等。
在编码本发明所述多肽的DNA区域的外显子1和2之间，存在一个STS序列，我们已在NCBI Genbank以保藏号G19259注册。这个标记被认为在研究DNA和遗传特征间的关系中非常重要。
本发明将极大地改变对钙代谢，磷酸盐代谢，骨骼代谢和维生素D代谢的传统理解。根据本发明，可以延迟到达慢性肾衰竭的血液透析阶段，或者为磷酸盐代谢相关的和钙代谢相关的疾病，以及代谢性骨骼疾病提供了新治疗和诊断方法。此外，本发明还可以用于改善或支持已有治疗方法。
附图简述
图1包括显示经琼脂糖电泳分析的扩增产物的照片。为了研究OST311的肿瘤特异性，用从肿瘤组织提取的第一链cDNA和从对照骨骼组织提取的第一链cDNA作为模板，用SEQ ID NO：22和23所示的OST311特异引物和SEQ ID NO：26和27所示的G3PDH特异引物进行PCR。
图2的照片显示对洗脱组分作Western印迹检测到了重组OST311，所述组分是将重组OST311用镍树脂进行亲合纯化，然后用强阳离子交换树脂SP-5PW分离和纯化制备的。
图3A显示具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽的预期位点，这适合用于利用MacVector6.5.1版本的计算功能制备肽抗体。
图3B显示利用MacVector6.5.1版本的计算功能预测的具有SEQID NO：2所示氨基酸序列的多肽的疏水度。
图4显示移植CHO-OST311H细胞31天后，在无肿瘤组(avr.-代表的线)和具有肿瘤组(avr.+代表的线)之间平均体重随时间的改变。
图5包括一些X光照片，它们显示了对照CHO ras克隆1细胞移植的具有肿瘤的个体，CHO-OST190H细胞移植的具有肿瘤的个体，以及CHO-OST311H细胞移植的具有肿瘤的个体的全副骨骼软X光相片。
图6显示人OST311多肽和小鼠OST311多肽的氨基酸序列比对结果。
图7显示无肿瘤组(n＝6)，CHO ras克隆-1肿瘤组(n＝10)，CHO-OST190H肿瘤组(n＝10)以及CHO-OST311H肿瘤组-1(n＝6)和CHO-OST311H肿瘤组-2(n＝6)的血清磷酸盐水平，血清钙水平和血清碱性磷酸酶活性测量结果。血液在第44到46天，采自每个个体的心脏。
图8包括的照片显示了，Western印迹法测量的钠-磷酸盐协同转运蛋白(NaPi-7)表达水平的比较。具体来说，近端小管表皮细胞的刷毛边层膜是从CHO-OST311H肿瘤个体和无肿瘤个体切除的肾脏制备的，然后通过Western印迹法比较NaPi-7的表达水平。
图9A包括的照片显示，通过Northern印迹法检测的肾脏钠-磷酸盐协同转运蛋白(NaPi-IIb)的mRNA水平的变化。肾脏采自肿瘤移植后第44到46天处死的小鼠。
图9B包括的照片显示，通过Northern印迹法检测的小鼠小肠中的钠-磷酸盐协同转运蛋白(NaPi-IIb)的mRNA水平变化。小肠采自肿瘤移植后第44到46天处死的小鼠。
图9C包括的照片显示，通过Northern印迹法检测的小鼠肾脏维生素D代谢酶(1αOHase，24OHase)的mRNA水平的变化。肾脏采自肿瘤移植后第44到46天处死的小鼠。
图10显示的X光相片展示了采自肿瘤移植后第44到46天处死的小鼠的腿节。
图11A包括的图表显示了移植PBS，CHO ra s克隆-1细胞和CHO-OST311H细胞的裸鼠(6周龄，BALB/c，雄性)在移植后第2天，血清磷酸盐水平和血清钙水平的比较。
每个数值以均值±标准差表示。
图11B包括的图表显示了移植PBS，CHO ras克隆-1细胞和CHO-OST311H细胞的裸鼠(6周龄，BALB/c，雄性)在移植后第6天，血清磷酸盐水平和血清钙水平的比较。
每个数值以均值±标准差表示。
图12包括的照片显示了纯化CHO-OST311H细胞培养上清并利用抗His6抗体和抗OST311肽抗体(311-114)对洗脱组分进行Western印迹所得到的结果。左栏显示检测到311：26-179，中间是311：25-179，右侧是311：180-251。标有*(在胶相片的上半部分)的组分用于在正常小鼠上进行单剂量检测。
图13包括的照片显示经Villanueva-Goldner染色的未脱矿质切片。所述未脱矿质部分是取自CHO-OST311H细胞移植的小鼠和无肿瘤小鼠的胫骨的近端干骺端。
图14包括的照片显示从CHO-OST311H细胞移植的小鼠和对照小鼠切除的肾脏中维生素D代谢酶基因产物的Northern印迹结果。
图15A显示实验1的时间表，在该实验中将产生CHO的重组OST311H全长蛋白给予正常小鼠。图15B包括的图表显示每次采血时血清磷酸盐水平，图15C包括的图表显示在同一时刻血清钙水平。
图16A显示实验2的时间表，在该实验中将产生CHO的重组OST311H全长蛋白给予正常小鼠。图16B包括的图表显示每次采血时的血清磷酸盐水平，图16C包括的图表显示在同一时刻的血清钙水平。
图17的照片显示对产生突变重组OST311RQH的CHO-OST311RQH细胞和OST311RQH/pEAK rapid细胞的培养液上清做Western印迹时，在培养液上清中检测到的重组蛋白质。
图18A显示将突变重组OST311RQH给予正常小鼠的实验的时间表。图18B包括的图表显示每次采血时的血清磷酸盐水平，图18C包括的图表显示在同一时刻的血清钙水平。
图19A显示在CHO-OST311RQH细胞移植实验中移植后第2天的血清磷酸盐水平。图19B显示同一实验中血清钙水平。
图20包括的照片显示利用抗OST311部分肽的兔抗血清经Western印迹在CHO-OST311H细胞的无血清培养液上清中检测到的重组OST311H。
图21A的表显示利用6种抗OST311肽多克隆抗体进行夹心ELISA时，每种结合情况中检测到重组OST311水平。
图21B的图表描绘了纯化重组OST311H的浓度与其对应的测量值之间的关系，所述数值是利用ELISA系统结合使用311-48抗体或311-180抗体作为固定抗体，311-148抗体作为检测抗体获得的。
图22A显示了将重组OST311蛋白或载体给予小鼠后1，3和8小时经Western印迹分析的肾脏NaPi-7的表达量。图22B显示了遵循类似处理过程，利用肾脏总RNA经Northern印迹分析的肾脏NaPi-7的表达量。
图23显示了将重组OST311蛋白或载体给予小鼠后1，3和8小时血清1，25-二羟维生素D3水平的变化。
图24显示了将重组OST311蛋白或载体给予小鼠后1，3和8小时，利用肾脏总RNA经Northern印迹分析的25-羟基维生素D-1-α-羟化酶(1αOHase)或25-羟基维生素D-24-羟化酶(24OHase)基因的表达。
图25显示将CHO-ras克隆-1细胞移植组中细胞移植3天后血清磷酸盐平均水平认为是100％时，每组的血清磷酸盐平均水平。
图26显示质粒OST311/pET28编码的重组His-OST311的核苷酸序列和氨基酸序列，以及质粒pET22-MK-OST311编码的重组MK-OST311的DNA序列和氨基酸序列。
图27显示利用阳离子交换柱SP-5PW(TOSOH，日本)对重组重折叠His-OST311进行HPLC纯化时的洗脱样式。
图28显示利用阳离子交换柱SP-5PW(TOSOH，日本)对重组重折叠MK-OST311进行HPLC纯化时的洗脱样式。
图29显示利用阳离子交换柱SP-5PW(TOSOH，日本)对PEG化的重组MK-OST311进行HPLC纯化时的洗脱样式。
图30包括的图表显示给予一次(A)大肠杆菌产生的His-OST311重组体或(B)PEG化的MK-OST311重组体后8或9小时的血清磷酸盐水平。
图31显示给予一次大肠杆菌产生的His-OST311重组体后1和4个小时，经Northern印迹法对肾脏中维生素D代谢酶基因表达的变化进行分析的结果。
图32显示给予一次大肠杆菌产生的His-OST311重组体后1，4和9个小时，血清1，25-二羟维生素D3水平的变化。
图33显示在OST311的氨基酸174和180引入突变，然后在pEAK细胞中表达该基因从而使突变OST311重组体分泌到细胞上清时，Western印迹所检测到的突变OST311重组体。
实施发明的最佳方式
通过以下实施例更详细地描述本发明。这些实施例不是用于限制发明范围。
实施例1人肿瘤诱导性骨软化症衍生的肿瘤cDNA文库的构建
将液氮冷冻的肿瘤组织在5ml ISOGEN(NIPPON GENE，Japan)溶剂中匀浆，然后按照所附的制造商使用说明制备到大约0.13mg总RNA。使用SMART cDNA文库制备试剂盒(CLONTECH，USA)根据所附的制造商使用说明由1.5ul总RNA合成cDNA。以下该cDNA称为cDNA#2。将该cDNA#2连接上EcoRI接头，然后插入预先用限制酶EcoRI消化的？ZAPII噬菌体载体(STRATAGENE，USA)。用Gigapack III Gold噬菌体包装试剂盒(STRATAGENE，USA)根据所附的制造商使用说明构建肿瘤诱导性骨软化症肿瘤噬菌体文库。所得文库包含总共大约600,000独立克隆。更进一步，用上述噬菌体文库感染大肠杆菌菌株XLI-Blue MRF’，然后倒到20个平板(15cm)上。将这些平板在37℃培养10小时以形成噬菌斑。将全部噬菌斑吸取到SM缓冲液中，从而构建肿瘤诱导性骨软化症肿瘤cDNA噬菌体文库。
实施例2肿瘤cDNA正筛选方案
概要
肿瘤诱导性骨软化症可以通过手术切除肿瘤得到治愈这一事实说明可能在肿瘤中有致病基因高度和特异地表达。此外，有报道说到目前为止肿瘤诱导性骨软化症肿瘤经常由中胚层，特别是间叶细胞构成。因此，有必要鉴定这样一群基因，它们在正常中胚层衍生组织中表达低，只在肿瘤组织中特异和高度地表达。所以，如下所述，应用cDNA减法技术进行了正筛选。从分离自作为对照的骨骼组织cDNA中扣除肿瘤组织衍生cDNA，从而使在骨骼组织中不表达，而仅在肿瘤组织中特异和高度表达的基因得到富集。用扣除cDNA组作为探针与肿瘤cDNA噬菌体文库进行杂交，从而获得在肿瘤中特异表达的基因片段。
(1)对照人骨骼组织cDNA的构建
将液氮冷冻的人骨骼组织在5ml ISOGEN(NIPPON GENE，Japan)溶剂中匀浆，然后按照所附的制造商使用说明制备到大约0.011mg总RNA。使用SMART cDNA文库制备试剂盒(CLONTECH，USA)根据所附的制造商使用说明由3ul总RNA合成cDNA。以下该cDNA称为cDNA#4。
(2)肿瘤诱导性骨软化症肿瘤cDNA和对照骨骼组织cDNA的扣除
为了富集在实施例1所述cDNA高度表达的基因，使用PCR-SelectcDNA扣除试剂盒(CLONTECH，USA)根据所附的制造商使用说明将cDNA#2和实施例2(1)中描述的cDNA#4进行杂交，从而从cDNA#2中扣除包含在cDNA#4中的基因片段。然后根据所附的制造商使用说明经PCR扩增扣除的cDNA#2，这样就得到了扣除cDNA组(A)。
另一方面，由于扣除试剂盒的特点是杂交过程只进行两次，这比一般的技术少，所以很难通过该试剂盒完全扣除大量存在于两种材料中的基因。相应地，当肿瘤诱导性骨软化症的肿瘤cDNA文库与作为探针的扣除cDNA组(A)进行杂交时，不能被完全扣除的基因也被认为是阳性克隆。所以，用同样的方法从实施例2(1)描述的cDNA#4中扣除cDNA#2，然后通过PCR扩增扣除的cDNA#4，这样制备扣除cDNA组(B)作为对照探针。肿瘤cDNA文库与扣除cDNA组(B)和前面描述过的扣除cDNA组(A)分别进行杂交，比较两个信号就能分离肿瘤诱导性骨软化症中特异包含的基因。
(3)肿瘤诱导性骨软化症的肿瘤cDNA文库的示差杂交
用实施例1中描述的肿瘤诱导性骨软化症的肿瘤cDNA噬菌体文库感染大肠杆菌菌株XLI-Blue后，将被感染的大肠杆菌重新接种以形成每平板(15cm)3000个噬菌斑，然后于37℃培养8小时。然后将每个平板上的噬菌斑转移到两张Hybond N+(Amersham Pharmacia Biotech，USA)尼龙膜上。根据所附的制造商使用说明对转移了噬菌斑的尼龙膜进行DNA固定化处理，然后分别用实施例2(2)中描述的扣除cDNA(A)和cDNA(B)作为探针进行筛选。
用Alphos Direct系统(Amersham Pharmacia Biotech，USA)根据制造商使用说明进行探针标记，杂交和信号检测。实施例2(2)中描述的扣除cDNA(A)和cDNA(B)各100ng作为探针，然后根据实验方案用荧光素标记所述探针。将探针分别加入50ml Alphos Direct系统所提供的杂交液，同时，根据实验方案将两组各8张转移有噬菌斑的尼龙膜进行杂交和洗涤。洗涤后，让尼龙膜进行发光反应，对ECL胶片(Amersham Pharmacia Biotech，USA)曝光2小时，用一台自动处理器(FUJI FILM，Japan)显影，然后分析结果。
结果，从视觉上选择当cDNA(A)作为探针时，曝光后严重烤焦，而以cDNA(B)为探针时没有烤焦的那部分中的独立噬菌斑，从平板上刮下来，然后悬浮在0.5ml SM缓冲液中。将悬浮液在4℃放置2小时或以上，提取噬菌体。
(4)阳性克隆的核苷酸序列分析
用0.5ul实施例2(3)中获得的含有阳性克隆的噬菌体溶液作为模板，噬菌体载体内部序列的T7引物(TAATACGACTCACTATAGGG)(SEQID NO：24)和T3引物(ATTAACCCTCACTAAAGGGA)(SEQ ID NO：25)，以及LA-taq聚合酶(TAKARA SHUZO，Japan)，进行35轮PCR，每个循环包括96℃30秒，55℃30秒和72℃30秒。将PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳。利用PCR扩增片段作为模板，用ABI377 DNA测序仪(PE Applied systems，USA)对只看到一条清晰条带的克隆进行测序。
当看到两条条带时，用QIAquick Gel Extraction试剂盒(QIAGEN，Germany)分别从相应条带的胶中提取PCR产物，然后经ABI377 DNA测序仪测序。
对341000个肿瘤诱导性骨软化症噬菌体文库的噬菌斑进行示差杂交的结果，鉴定到456个阳性噬菌斑，确定了所有这些噬菌斑的核苷酸序列。
实施例3缩小人低磷酸盐血症诱导因子候选基因的范围
用实施例2中获得的456个阳性克隆的序列信息对Genbank中(NCBI提供的核苷酸序列数据库)注册的核苷酸序列进行了同源性检索。结果，得到了表1所示的一组基因，它们是出现频率高的已有基因。此外，数据库检索的结果，有100个克隆是不清楚其生物活性的未知基因片段。对于这些未知基因片段的核苷酸序列信息，进一步将克隆间的重叠抽象为频率信息。在它们中，得到了最常重叠的基因，包括7个顺序形成一个毗连序列群的克隆的OST311序列。此处获得的核苷酸序列从SEQ ID NO：1的核苷酸1522到2770。当在已有数据库中检索OST311的一个基因片段时，没有将它注册为cDNA或EST，而只是对应一个基因组序列。所述相关基因组序列是AC008012，已有报道说它位于染色体的12p13。但是，在所得序列中没有发现编码蛋白质的区域(ORF)，所以预计该序列对应3’-非翻译区域。因此，对肿瘤诱导性骨软化症cDNA文库进行了全长cDNA的克隆。此外。利用DNASIS-Mac 3.7版本的ORF预测功能预测了ORF。
表1
  克隆ID   频率   描述
  OST131OST1OST2OST311OST1001OST584OST666OST133OST837OST562OST1002OST1003OST1004OST903   236351374332222222   牙髓质蛋白1(DMP1)热震蛋白90(HSP90)骨桥蛋白未知/基因组DNA12p13CD44抗原纤连蛋白翻译调节肿瘤蛋白Beta2微管蛋白成纤维细胞生长因子(FGF)膜联蛋白II/脂皮质蛋白II细胞色素氧化酶亚基2细胞分裂素未知未知
实施例4全长OST311的克隆
根据实施例3中获得的OST311序列，合成了以下引物。然后，利用肿瘤诱导性骨软化症肿瘤cDNA文库作为模板，做35轮PCR，每个循环包括96℃30秒，55℃30秒，72℃30秒。
311-U65：TTCTGTCTCGCTGTCTCCC(SEQ ID NO：12)
311-L344：CCCCTTCCCAGTCACATTT(SEQ ID NO：13)
将PCR产物做2％琼脂糖凝胶电泳，证实扩增了预期大小的PCR产物，然后用MicroSpin柱子S-300HR(Amersham PharmaciaBiotech，USA)纯化PCR产物。用Alphos Direct系统(AmershamPharmacia Biotech，USA)根据所附的厂商说明将所得PCR产物进行荧光标记。然后，用这些标记的产物作为探针对肿瘤诱导性骨软化症肿瘤cDNA文库的20000个克隆进行噬菌斑杂交。
用T7和T3将获得的40个阳性克隆以实施例2(4)中描述的方式经PCR扩增。根据所得PCR产物的核苷酸序列，合成引物311-L296(SEQID NO：14，GGGGCATCTAACATAAATGC)。利用311-U65(SEQ ID NO：12)和311-L344(SEQ ID NO：13)探针扩增得到PCR产物，以其为探针再次对肿瘤诱导性骨软化症肿瘤cDNA文库的20000个克隆进行噬菌斑杂交。对62个阳性克隆，确定利用T7和311-L296(SEQ ID NO：14)引物扩增得到的PCR产物的核苷酸序列。将确定的序列与已经确定的核苷酸序列连接。因此得到SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。很显然OST311的ORF启始于位于SEQ ID NO：1核苷酸133处的一个启始密码子。此外，合成了以下引物以便最终确定ORF的序列。
311-F1：AGCCACTCAGAGCAGGGCAC(SEQ ID NO：15，核苷酸112到131)
311-F2：GGTGGCGGCCGTCTAGAACTA(SEQ ID NO：16，载体序列)
311-F3：TCAGTCTGGGCCGGGCGAAGA(SEQ ID NO：17，核苷酸539到559)
311-L1：CACGTTCAAGGGGTCCCGCT(SEQ ID NO：18，核苷酸689到708)
311-L3：TCTGAAATCCATGCAGAGGT(SEQ ID NO：19，核苷酸410到429)
311-L5：GGGAGGCATTGGGATAGGCTC(SEQ ID NO：20，核苷酸200到220)
311-L6：CTAGATGAACTTGGCGAAGGG(SEQ ID NO：21，核苷酸868到888)
利用311-F2(SEQ ID NO：16)和311-L6(SEQ ID NO：21)引物，肿瘤诱导性骨软化症肿瘤cDNA文库为模板，以及Pyrobest DNA聚合酶(TAKARA SHUZO，Japan)，进行35轮PCR，每个循环包括96℃30秒，55℃30秒，72℃30秒。
将PCR产物做2％琼脂糖凝胶电泳时，证实是一个大约980核苷酸碱基对的片段。然后利用上述引物(SEQ ID NO：15到21)确定扩增片段的核苷酸序列。这样确定到的编码SEQ ID NO：2所示多肽的ORF区域(SEQ ID NO：1)位于SEQ ID NO：1的核苷酸133处的启始密码子ATG和核苷酸886处的终止密码子TAG之间。
实施例5 OST311抗肿瘤诱导性骨软化症肿瘤的特异性
为了研究OST311的肿瘤特异性，用从肿瘤组织和对照骨骼组织中提取的第一链cDNA作为模板，以下所示OST311特异引物(SEQ ID NO：22和23)进行了35轮PCR。每轮PCR包括96℃30秒，55℃30秒，72℃30秒。此外，向每份反应液中加入DMSO至终浓度为2％，酶使用LA-taq DNA聚合酶(TAKARA SHUZO，Japan)。其次，作为一个内标，利用G3PDH的特异引物(FW：ACCACAGTCCATGCCATCAC(SEQ ID NO：26)，RV：TCCACCACCCTGTTGCTGTA(SEQ ID NO：27))在类似条件下进行PCR。
311F1EcoRI：CCGGAATTCAGCCACTCAGAGCAGGGCACG(SEQ ID NO：22)
311LHisNot：
ATAAGAATGCGGCCGCTCAATGGTGATGGTGATGATGGATGAACTTGGCGAA(SEQ ID NO：23)
如图1所示，将这些PCR产物做2％琼脂糖凝胶电泳。使用OST311引物时，仅在肿瘤组织作为模板的情况下观察到预期大小的PCR产物。相反，当使用G3PDH引物时，在肿瘤组织和对照骨骼组织中均观察到相同水平的预期大小PCR产物。从这些结果可以证实OST311在肿瘤组织中特异性表达。
实施例6分离稳定表达OST311的CHO细胞
(1)OST311表达载体的构建
用实施例5中所示的311F1EcoRI(SEQ ID NO：22)和311LHisNot(SEQ ID NO：23)引物，肿瘤诱导性骨软化症肿瘤cDNA文库作为模板，进行35轮PCR，每个循环(过程)包括96℃30秒，55℃30秒，72℃30秒。此外，向每份反应液中加入DMSO至终浓度为2％，酶使用LA-taq DNA聚合酶(TAKARA SHUZO，Japan)。311F1EcoRI引物退火到位于Kozak序列上游的SEQ ID NO：1的核苷酸111，311LHisNot引物退火到SEQ ID NO：1的核苷酸871。编码SEQ ID NO：2所示全长多肽的区域可以利用这两个引物经PCR扩增。此外，311LHisNot引物包含这样一个核苷酸序列，它在SEQ ID NO：2的氨基酸251后面添加了6个组氨酸残基，并在最后一个组氨酸密码子后加了一个终止密码子。因此，翻译后的重组蛋白质在C末端有一个His6标记，这可用于抗体识别重组体，以及利用镍树脂来纯化重组体。
用限制酶EcoRI和NotI消化后，将所述PCR产物连接到经EcoRI和NotI类似地消化过的质粒载体pcDNA3.1Zeo(INVITROGEN，USA)上用于在动物细胞中进行表达。这样得到的重组载体被导入大肠杆菌菌株DH5α。在3ml含有100mg/ml氨苄青霉素的LB培养基中培养大肠杆菌，然后用GFX质粒纯化试剂盒(Amersham PharmaciaBiotech，USA)纯化质粒。通过常规方法确定插入基因的序列。这样，证实了该序列与SEQ ID NO：1中的等同部分是一样的，紧接终止密码子之前加上了编码His6标记序列的一段核苷酸序列。
(2)稳定表达OST311的CHO细胞的分离
用限制酶FspI消化大约20ug插入了实施例6(1)中制备的OST311ORF部分的质粒，以使切割在载体内的氨苄抗性基因的位点。然后将切割好的载体进行乙醇沉淀，然后溶于10ul超纯水。随后，用GenePulserII(BioRad，USA)通过电穿孔将全部体积的溶液导入宿主细胞。CHO Ras克隆-1细胞(Shirahata，S.，Biosci.Biotech.Biochem，59(2)：345-347，1995)作为宿主细胞。将CHO Ras克隆-1细胞于5％CO2和100％湿度下，培养在含有补充了10％FCS的MEMα培养基的一个75cm2培养瓶中直至细胞生长覆盖接近90％的培养面积。然后通过胰蛋白酶处理使附着的细胞脱离，得到大约1x107细胞。将所得细胞重悬于0.8mlPBS中，与经FspI消化的质粒混合，然后在冰上冷却10分钟。含有质粒的细胞被转移到4毫米宽的玻璃管中。施加设置值(0.25kV和975uF)的电脉冲之后，再将玻璃管冷却10分钟。将转移了基因的细胞在含有10％FCS的MEMα培养基中培养24小时。然后，向培养基中加入Zeosin(INVITROGEN，USA)至终浓度0.5mg/ml，然后再培养1周。随后，对于显示药物抗性的克隆细胞，通过有限稀释法将这些细胞以0.2细胞/孔重新接种在96孔培养板中，然后在有终浓度为0.3mg/ml的zeosin的条件下培养大约3周，这样获得了35个药物抗性菌株的克隆。
(3)稳定表达OST311的CHO细胞产生重组体的证明
对35个显示药物抗性的克隆，通过Western印迹法证实了条件培养基中存在重组体OST311。
用ultra-free MC M.W.5000截留膜系统(MILLIPORE，USA)将收集到的0.2ml条件培养基浓缩至大约40到50ul。向浓缩液中加入10ul含有1M Tris-C1pH6.8，5％SDS，50％甘油和100mM DTT的样品缓冲液，然后于95℃加热5分钟。然后通过梯度为10到20％的聚丙烯酰胺电泳分离条件培养液中的蛋白质。之后，用一个半干印迹系统(OwlSeparation Systems，USA)将凝胶中的蛋白质转移到Immobilon PVDF膜(MILLIPORE，USA)上。该PVDF膜与在TTBS缓冲液(Sigma，USA)中1/5000稀释的抗His(C-末端)抗体(INVITROGEN，USA)一起在室温下保温1小时。然后，用ECL系统(Amersham PharmaciaBiotech，USA)将膜曝光5分钟，并用自动处理仪(FUJIFILM，Japan)显影。结果分离到克隆#20，其最强的信号在大约32kDa和10kDa。此后，#20细胞命名为CHO-OST311H，并保藏在国立先进工业科技研究所，国际专利生物保藏处(Higashi，Tsukuba-shi，Ibaraki 1-1-1)(保藏号FERM BP-7273)。
实施例7 CHO-OST311H的磷酸盐摄取抑制活性的测量
条件培养基
将CHO-OST311H于37℃在5％CO2和100％湿度下，培养在含有补充了10％FCS的MEMα培养基的一个225cm2培养瓶中直至细胞生长覆盖接近80％的瓶面积。然后，用30ml无血清培养基CHO-S-SFM II(LIFETECHNOLOGY，USA)替换培养基。48小时后，收集该条件培养基。将所述条件培养基于1200g离心5分钟以便除去悬浮的细胞等，然后用Minisart-plus 0.22um滤膜(Sartorius，Germany)过滤。
利用该条件培养基，检测了它对人肾脏近端小管细胞系(CL-8细胞)磷酸盐摄取活性的影响。所述人肾脏近端小管细胞系于37℃在5％CO2和100％湿度下，培养在含有10％FCS(LIFE TECHNOLOGY)的DMEM培养基中。为了测量磷酸盐摄取活性，先将所述人肾脏近端小管细胞系培养在含有10％FCS的DMEM培养基48孔培养板(CORNING，USA)中。当开始培养3天后细胞生长至覆盖了培养板的整个底部表面，用200ul无血清培养基CHO-S-SFM II(LIFE TECHNOLOGY，USA)替换培养基，随后继续培养20到24小时。用处于这个状态的细胞进行以下实验来测量磷酸盐摄取活性(实验1和2)。
(1)实验1：
除去CHO-S-SFM II培养基，然后向每孔中加入200ul在CHO-S-SFM II中制备的上述CHO-OST311H细胞的条件培养基。作为对照孔，3个含有没有替换CHO-S-SFM II的培养基的孔，以及以及3个孔，其含有的培养基分别补充了200ul以制备CHO-OST311H类似的方式制备的CHO-OST190H细胞的条件培养基。上述CHO-OST190H细胞是通过与制备CHO-OST311H细胞类似的方式，即将OST190H导入CHOras克隆-1使OST190H得以表达。与OST311H类似，表达的CHO-OST190H含有一个加在多肽C-末端的His6标记序列，这与Rowe，P.S.N等(Genomics67：54-68，2000)报道的名为MEPE的多肽相同。加入每个样品后，在CO2培养箱中再培养26小时，通过以下测量磷酸盐摄取活性的方法测定每个孔中细胞的磷酸盐摄取活性。
(2)试验2：
从200μl正在培养的CHO-S-SFMII培养基中吸出100μl培养液。对这些培养物，向3个孔中分别加入100μlCHO ras克隆-1细胞的条件培养基，另外3个孔中分别加入100μlCHO-OST311H细胞的条件培养基。然后，在CO2培养箱中培养24小时。随后，通过以下测量磷酸盐转运活性的方法测定每个孔中细胞的磷酸盐摄取活性。
磷酸盐摄取活性的测量方法：
加入条件培养基并进行培养后，用不含磷酸的缓冲液(150mMNaCl，1mM CaCl2，1.8mM MgSO4，10mM HEPES，pH7.4)将细胞洗下来，然后在同样的溶液中于室温下保温10分钟。吸去溶液，然后加入一种分析溶液，该溶液是通过向缓冲液中加入放射性KH2PO4(NEN)至浓度为0.105mM制备的。该溶液在室温下培养10分钟。培养后，吸去分析液立即用已经冷冻的终止液(150mM CaCl2，1.8mM MgSO4，10mM HEPES，pH7.4)将细胞洗3次。吸去该洗涤液，向细胞中加入80μl 0.2N NaOH，然后于室温下培养10分钟，从而使细胞裂解。为了测定细胞裂解液中的放射性，将所述溶液转移到ReadyCap(Beckman)中，于50℃干燥，然后放在玻璃管中。然后，用闪烁计数器(Wallac1410，Pharmacia)测定放射性。每项试验中的磷酸盐摄取活性示于表2，其中未补充条件培养基的对照的平均摄取活性视为100％。CHO-OST311H细胞的条件培养基明显地抑制了人肾脏近端曲小管表皮细胞的磷酸盐摄取活性。
表2 OST311抗肾管表皮细胞磷酸盐摄取的活性
试验1
Figure A20081008668300541
实施例8从CHO-OST311H条件培养基中部分纯化重组体OST311
通过以下方法从按照实施例7描述的方式制备的条件培养基中部分纯化重组体OST。过程1)和4)在层析室中于4℃进行。
1)用ProBond镍树脂填充一个可降解的聚丙烯柱子(INVITROGEN，USA)，使其床体积达到3ml，然后洗涤并用30ml缓冲液1(表3)平衡。
2)将120ml以实施例7中描述的方式制备的条件培养基通过自由下降上样到上述镍树脂柱子中，使重组体OST311结合。
3)用30ml表3所示的缓冲液2来除去非特异性吸附的蛋白质。
4)将3ml表3所示的缓冲液3分4次加入，从而使重组体OST311洗脱。这4个流分各取20ul直接以实施例6(3)中描述的方式进行Western印迹。这样，用抗His抗体尝试检测OST311。
结果，在第二个流分中观察到强烈的大约32kDa和10kDa信号。
5)将上述第二个流分上样到NAP25和NAP10柱子(AmershamPharmacia Biotech，USA)中，用表3所示缓冲液4替换溶剂。
6)利用高效液体层析(Hitachi，Japan)将已经用缓冲液4替换溶剂的重组体OST311以1ml/分钟的流速上样到SP-5PW(强阳离子交换树脂，TOSOH，Japan)中。以1％/分钟的梯度加入表3所示缓冲液5进行洗脱，这样从每个流分中采集2ml。如图2所示，以实施例8(5)描述的方式对每个洗脱流分进行Western印迹，以便尝试检测OST311。大约10kDa信号随280mM左右的NaCl洗脱，大约32kDa信号随400mM左右的NaCl洗脱。对相应流分进行SDS聚丙稀酰胺凝胶电泳，然后用银染试剂盒(Daiichi Chemicals，Japan)染色。含有约10kDa和32kDa信号的流分的纯度为70％或以上。
表3
  缓冲液1   缓冲液2   缓冲液3   缓冲液4   缓冲液5
  10mM Na/PipH6.50.5M NaCl   10Mm Na/PipH6.510mM咪唑0.5M NaCl   10Mm Na/PipH6.510mM咪唑0.5M NaCl5mMCHAPS   10Mm Na/PipH6.55mMCHAPS   10mMNa/PipH6.51M NaCl5mMCHAPS
Na/Pi：磷酸钠缓冲液
实施例9部分纯化的重组体OST311的N末端氨基酸序列分析
将通过实施例8所述方法获得的部分纯化流分中被抗His抗体识别的大约10kDa和32kDa信号进行SDS聚丙稀酰胺凝胶电泳。随后，用一个半干印迹系统(Owl Separation System，USA)将凝胶中的蛋白质转移到Immobilon PVDF膜(MILLIPORE，USA)上。该PVDF膜用CBB染色，将大约10kDa和32kDa的条带剪下，然后用蛋白质测序仪492型(PE Applied Systems，USA)确定N末端氨基酸序列。
结果，很显然约35kDa条带的N末端氨基酸序列是从SEQ ID NO：2的第25个残基Tyr开始的OST311序列。根据这个结果，证实了从SEQ ID NO：2的第一个残基Met到第24号残基Ala这段序列作为分泌信号序列被切除了。另一方面，约10kDa条带的N末端氨基酸序列是从SEQ ID NO：2的第180个残基Ser开始的OST311序列。紧挨残基180Ser之前存在一个含有RRXXR的基元表明重组体OST311被某些CHO细胞产生的蛋白酶所切割。
如上所述，CHO-OST311细胞产生的重组体OST311在分泌后至少以3种多肽存在：从残基25 Tyr到251 Ile的多肽(SEQ ID NO：4)，从残基25 Tyr到179 Arg的多肽(SEQ ID NO：6)，以及从序列SEQIDNo：2的残基180 Ser到251 Ile的多肽(SEQ ID NO：8)。
实施例10抗OST311部分肽多克隆抗体的制备
利用MacVector6.5.1版本的计算功能预测SEQ ID NO：2多肽的疏水性，从而推测出适用于制备肽抗体的抗原位点(图3A和B)。此处，合适的位点是根据这样一个观点预测的，即疏水性强的位点不容易发生糖链修饰和磷酸化。因此，被选择和合成作为抗原的是311-48(SEQ ID NO：28)，它是通过在合成阶段给一个从序列SEQ ID No：2的残基48Arg开始的包括20个氨基酸的肽的C末端人工添加一个半胱氨酸残基制备的，以及类似地通过在始自残基114 Arg的包括20个氨基酸的肽添加半胱氨酸残基制备的311-114(SEQ ID NO：29)。具体来说，在合成阶段给两个肽的C末端人工添加半胱氨酸残基，这样产物可以与载体蛋白(牛甲状腺球蛋白)耦合。耦合载体蛋白以及兔子的免疫委托给IBL，CO.，Ltd.(1091-1，Fujioka-shi，Gunma，Japan)(委托号：1515)。
311-48：RNSYHLQIHKNGHVDGAPHQC(SEQ ID NO：28)
311-114：RFQHQTLENGYDVYHSPQYHC(SEQ ID NO：29)
实施例11将CHO-OST311H细胞移植到裸鼠中的实验
为了检验OST311是否是肿瘤诱导性骨软化症的致病因子，将CHO-OST311H细胞移植到6周龄BALB/c裸鼠(雄性)体内诱发肿瘤，从而建立一个从肿瘤中持续分泌重组体OST311的鼠肿瘤诱导性骨软化症模型。作为试验对照，将CHO ras克隆-1细胞和实施例7描述的CHO-OST190H类似地用于移植试验。
(1)CHO细胞的移植
经胰蛋白酶处理将CHO-OST311H细胞从培养瓶上打散，以1x108细胞/ml悬浮于PBS。将悬浮液各0.1ml皮下注射到裸鼠的两个latera(2x107细胞/鼠)。此外，作为对照组，以同样方式皮下注射相同数量的CHO ras克隆-1细胞。注射后大约1个月，将5只裸鼠关在一个塑料笼中，允许接触固体食物CE-2(CLEAJAPAN，Japan)和自来水，随意。移植两周后，在75％的对照组和66.7％OST311组中观察到肿瘤发生。
(2)体重变化的比较
移植CHO-OST311H细胞后，比较无肿瘤组(图表中avr.-所指示的线)和CHO-OST311H细胞肿瘤组(图表中avr.+所指示的线)之间在31天内的平均体重变化。如图4所示，CHO-OST311H细胞肿瘤组与无肿瘤组相比，显示出体重增长被抑制，并且两组间有显著的区别(24.1±1.5g vs.26.7±1.0g，p＜0.001，第31天)。相反，在CHO ras克隆-1细胞肿瘤组和无肿瘤组之间，平均体重没有看到类似的差异(27.0±1.8g vs.26.7±1.0g，无显著差异，第31天)。
(3)血清磷酸盐和钙，以及尿磷酸盐和钙的测量
细胞移植后第30和40天，将裸鼠在金属笼中关24小时。收集尿后，在裸鼠被乙醚(diethylethel)麻醉的状态下从其心脏或眼框采血。用Microtainer(Beckton Dickinson，USA)从外周血制备血清。测量体积后，将尿液离心来收集上清。利用P-test Wako(Wako Pure ChemicalIndustries，Japan)测量血清和尿液磷酸盐水平，血清和尿液钙水平用钙-test Wako(Wako Pure Chemical Industries，Japan)测量，血清和尿液肌氨酸酐水平用CRE-EN KAINOS(KAINOS，Japan)测量。
试验1：
细胞移植后第34天，测量无肿瘤组，CHO ras克隆-1细胞肿瘤组，CHO-OST190H细胞肿瘤组，以及CHO-OST311H细胞肿瘤组的血清磷酸盐水平。
试验2：细胞移植后第44到46天，测量无肿瘤组和CHO-OST311H细胞肿瘤组的血清和尿液磷酸盐水平，钙水平和肌氨酸酐水平。用磷酸盐或钙清除除以肌氨酸酐清除来确定磷酸盐和钙的肾脏部分排泄。
测量结果示于下表4。
表4细胞移植小鼠中的血清和尿液磷酸盐和钙
实验1
Figure A20081008668300571
实验2
Figure A20081008668300572
(4)全副骨骼的软X光照片
移植CHO-OST311H细胞后，确认已形成肿瘤，并且与无肿瘤个体或者对照CHO ras克隆-1移植个体相比，在身体状况和行走功能上表现出显著异常的个体。因此，预计肿瘤个体发生骨骼异常。然后，从对照CHO ras克隆-1移植组，CHO-OST190H细胞移植组和CHO-OST311H细胞移植组中随机挑选确信已形成肿瘤的个体，然后使用放射线照相系统uFX-100(FUJI FILM，Japan)根据所附的厂商使用说明拍摄X光照片。拍摄X光照片的条件是X-射线管电压25kV，电流0.1mA，曝光时间10秒。将所述个体对成像板曝光，然后用BAS2000(FUJI FILM，Japan)进行图像分析。
结果如图5所示，CHO-OST311H细胞移植个体的全副骨骼的软X光照片亮度下降，因此验证了矿化发生缺陷。此外，也验证了骨骼畸形，比如肋骨笼的变形。
(5)血清磷酸盐和钙水平以及碱性磷酸酶活性的测定
细胞移植后第44和46天从心脏中采血，从中得到的血清保存于-20℃。将血清样品一起融化，再次测量每份血清中的磷酸盐和钙水平，同时测定碱性磷酸酶活性。利用P-test Wako(Wako Pure ChemicalIndustries，Japan)测量磷酸盐水平，钙水平用钙-test Wako(WakoPure Chemical Industries，Japan)测量，碱性磷酸酶活性用钙碱性磷B-test Wako(Wako Pure Chemical Industries，Japan)测定。将结果分为无肿瘤组(n＝6)，CHO肿瘤组(n＝10)，CHO-OST190H细胞肿瘤组(n＝10)以及CHO-OST311H肿瘤组(n＝6x2)。将CHO-OST311H组分为两组：一组在第44天处死(CHO-OST311H-1：n＝6)，一组在第46天处死(CHO-OST311-2：n＝6)。如图7所示，在CHO-OST311H肿瘤组中可以看到显著的变化，包括血清磷酸盐水平下降(图7A)，血清钙水平下降(图7B)，血清碱性磷酸酶活性提高(图7C)。
(6)钠-磷酸盐协同载体蛋白(NaPi-7)在肾脏近端小管的表达
i)近端小管表皮细胞刷状缘膜(以下称为BBM)的制备
从利用二乙醚麻醉的CHO-OST311H肿瘤个体和无肿瘤个体切除肾脏。将每个肾脏切成两半得到冠状切面(实验1：6个CHO-OST311H肿瘤个体和4个无肿瘤个体。实验2：6个CHO-OST311H肿瘤个体和2个无肿瘤个体)。使用从每个个体切除的肾脏的各一半，根据Kessler等(Biochem.Biophys.Acta.506，136-154)报道的方案制备BBM。
将肾脏在3ml匀浆缓冲液(50mM甘露醇，2mM Tris/HEPES pH7.5)用一个玻璃匀浆器，以1300rpm匀浆2分钟从而获得匀质的肾脏提取物。向提取物中加入CaCl2至终浓度为10mM后，将溶液在4℃搅拌15分钟，然后于4℃，4900g离心15分钟。用Kimwipe过滤所得上清，然后于4℃，16200g离心60分钟，使含有大量BBM的部分沉淀。将沉淀重新悬浮于5ml悬浮缓冲液(50mM甘露醇，2mM Tris/HEPES pH7.5)中，然后再于4℃，16200g将该溶液离心60分钟。该步骤重复两次，然后将产物重新悬浮于0.1ml悬浮缓冲液中。通过标准方法测定这样得到的溶液的蛋白质浓度为3到4mg/ml。
ii)BBM蛋白质的Western印迹
如上所述，将得自每只小鼠的BBM蛋白质分别用悬浮缓冲液稀释到10ug/ul。然后向稀释过的溶液中加入2.5ul含有1M Tris-Cl，pH6.8，5％SDS，50％甘油和100mM DTT的样品缓冲液。将该溶液在95℃加热5分钟后，经梯度为10到20％的聚丙烯酰胺电泳分离BBM溶液中的蛋白质。随后，用半干印迹系统(Owl SeparationSystems，USA)将凝胶中的蛋白质转移到Immobilon PVDF膜(MILLIPORE，USA)上。将PVDF膜与1/2000稀释在TTBS缓冲液(Sigma，USA)中的抗NaPi-7多克隆抗体于室温保温3小时。所述抗体是用与小鼠NaPi-7C-末端位点对应的合成肽通过KIRIN EREWERYCO.，LTD，Pharmaceutical Research Laboratories，PharmaceuticalDivision的标准方法免疫兔子得到的多克隆抗体。与该抗体反应后，将所述反应产物继续与结合了辣根过氧化物酶(HRP)的抗兔IgG二抗(DAKO，Denmark)保温，然后用ECL系统(Amersham PharmaciaBiotech，USA)检测条带。
在还原性状态下，所述抗体检测到大约80kDa和35kDa的条带以及170kDa到200kDa的高分子成片条带(图8)。这些条带图案与Tatsumi等(J.Biol.Chem 273，28568-28575，1998)报道的相同，并且这些条带被证实随着小鼠或兔从食物中摄取磷酸盐的量而统一变化。由这些事实，证明所述条带是衍生自NaPi-7的多肽。如图8所示，对于所有上述片段(标有箭头的条带)，得自CHO-OST311H肿瘤个体的BBM蛋白质中含有的NaPi-7信号比得自无肿瘤个体的显著减少。这些结果在分别进行的实验1和2可以重复。另一方面，将这些BBM蛋白质经梯度为10到20％的聚丙烯酰胺电泳分离，然后用CBB染色。每个个体的BBM蛋白质同等地染色，说明Western印迹中的信号下降是NaPi-7所特有的(图8)。根据这一事实，推断OST311蛋白作用在肾脏近端小管细胞，在蛋白质水平上下调NaPi-7的表达，从而诱发低磷酸盐血症。
(7)肾脏和小肠中磷酸盐载体蛋白和维生素D代谢酶的mRNA变化分析
i)总RNA的制备
从细胞移植后第44到46天处死的小鼠中切除小肠和肾脏。迅速将肾脏在干冰中冷冻。冰冻的肾脏在-80℃的低温冷库中冷藏待用。将一个冷冻肾脏在5ml ISOGEN(Nippon Gene，Japan)中匀浆，然后根据所附的厂商说明制备总RNA。取15ug总RNA根据标准方法经1％琼脂糖含有甲醛的变性胶电泳，然后通过毛细转移法过夜转移到Hybond-N+(Amersham Pharmacia，USA)上。用UV照射转移了RNA的膜，利用Stratakinker(STRATAGENE，USA)固定转移的RNA，用2xSSC洗涤，风干，然后室温保存待用。用生理盐水清洗小肠以除去内容物，然后翻过来。随后，用一种制剂刮来采集小肠表皮，然后用液氮快速冷冻。将冻好的小肠表皮在-80℃超低温冷库冷藏待用。冷冻的小肠表皮在5mlISOGEN(Nippon Gene，Japan)中匀浆，然后按照所附的厂商说明制备总RNA。取20ug总RNA根据标准方法经1％琼脂糖含有甲醛的变性胶电泳，然后通过毛细转移法过夜转移到Hybond-N+(AmershamPharmacia，USA)上。用UV照射转移了RNA的膜，利用Stratalinker(STRATAGENE，USA)固定转移的RNA，用2xSSC洗涤，风干，然后室温保存待用。
ii)制备探针的模板DNA
取5ug从小鼠(小鼠1)中制备的总RNA在20ul反应溶液(50mMTris(pH8.3)，75mM KCl，3mM MgCl2，10mM DTT，25g/ml(dT)18，2.5mMdNTP，200单位MMLV逆转录酶(TOYOBO，Japan))中，于37℃1小时合成cDNA，然后将反应溶液在70℃保温15分钟灭活酶。将合成的cDNA稀释5倍，用于以下反应。
下列引物由在GenBank(NCBI，USA)注册过的序列合成，然后用于PCR反应：
用于获得小鼠GAPDH cDNA的合成引物
mGAPDHFW TGAAGGTCGGTGTGAACGGATTTGGC(SEQ ID NO：30)
mGAPDHRV CATGTAGGCCATGAGGTCCACCAC(SEQ ID NO：31)
用于获得小鼠Npt-1 cDNA的合成引物
mNPt1FW GTAAAGAACCCTGTGTATTCC(SEQ ID NO：32)
mNpt1RV CTGCCTTAAGAAATCCATAAT(SEQ ID NO：33)
用于获得小鼠NaPi-7cDNA的合成引物
mNaPi7FW GAGGAATCACAGTCTCATTC(SEQ ID NO：34)
mNaPi7RV CTTGGGGAGGTGCCCGGGAC(SEQ ID NO：35)
用于获得小鼠NaPi-2b cDNA的合成引物
mNaPi2bFW TCCCTCTTAGAAGACAATACA(SEQ ID NO：36)
mNaPi2bRV GTGTTTAAAGGCAGTATTACA(SEQ ID NO：37)
用于获得小鼠维生素D1α羟化酶cDNA的合成引物
m1 a OHaseFW CAGACAGAGACATCCGTGTAG(SEQ ID NO：38)
m1 a OHaseRV CCACATGGTCCAGGTTCAGTC(SEQ ID NO：39)
用于获得小鼠维生素D24羟化酶cDNA的合成引物
m24OHaseFW GACGGTGAGACTCGGAACGT(SEQ ID NO：40)
m24OhaseRV TCCGGAAAATCTGGCCATAC(SEQ ID NO：41)
按照TakaLa LA-Taq(TAKARA SHUZO，Japan)所附的厂商说明制备反应溶液。将1μl cDNA和上述引物各10pmol加入50ml反应溶液。将该溶液在94℃保持1分钟，然后进行40轮扩增，每个保温循环包括94℃30秒，55℃30秒和72℃1分钟。然后经0.8％琼脂糖凝胶电泳分离扩增的条带，用Gene Clean II(Bio101，USA)回收靶片段。就GAPDH而言，利用以上获得的片段作为模板和Megaprimer Labeling试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech，USA)制备32P标记的探针，然后用于以下杂交。对于其他基因，将得到的PCR片段连接到pGEM-T载体(Promega，USA)，然后导入大肠杆菌DH5α。向PCR反应液中加入T7(SEQ ID NO：42)和SP6引物(SEQ ID NO：43)各10pmol，然后同样加入转化的大肠杆菌。将所述溶液在94℃保持10分钟后，进行40轮扩增，每个循环包括94℃30秒，55℃30秒和72℃1分钟。反应液经0.8％琼脂糖凝胶电泳分离扩增的条带，用Gene CleanII(Bio101，USA)回收靶片段。
T7 TAATACGACTCACTATAGGG(SEQ ID NO：42)
SP6 GATTTAGGTGACACTATAG(SEQ ID NO：43)
通过以上步骤得到的扩增片段的核苷酸序列用ABI377 DNA测序仪(PE Applied System，USA)确定，从而证实得到了每个靶片段。用Megaprimer Labeling试剂盒(Amersham Pharmacia，USA)将所得DNA片段32P标记，然后用做以下杂交过程的探针。
iii)杂交
根据所附的厂商说明，使用ExpressHyb杂交液(CLONTECH，USA)或Perfecthyb杂交液(TOYOBO，Japan)进行杂交。杂交和洗涤后，将成像板曝光30分钟到过夜，然后用BAS2000图像分析仪(FUJIFILM，Japan)分析(图9A到C)。此外，测量靶条带的信号强度。用GAPDH的信号强度将每个基因的信号强度校正后，得到无肿瘤组(小鼠1到4)与肿瘤组(小鼠5到10)的平均值的比率。下表5显示了所述比率。随着移植了CHO-OST311H的组别中形成肿瘤，肾脏中NaPi-7，II型磷酸盐载体蛋白的mRNA水平显著下降，而肾脏中的NPT-1，I型磷酸盐载体蛋白没有大的变化。此外，小肠的NaPi-IIb和磷酸盐载体蛋白的mRNA有显著减少。相反地，对于肾脏维生素D代谢酶，25-羟基维生素D-1-α羟化酶(1αOHase)和25-羟基维生素D-24-羟化酶(24OHase)的mRNA都增加了。
表5肿瘤组对无肿瘤组的mRNA比率
(肿瘤组/无肿瘤组)
  NPT-1   0.88
  NaPi-7   0.50
  NaPi-2b   0.23
  维生素D1α羟化酶   3.90
  羟基维生素D24羟化酶   1.94
(8)血清1，25-二羟维生素D水平的测量
肿瘤移植后第44天和46天从每只对照组小鼠和OST311H组小鼠采集等量的血清。将采集自各组的血清(各组总量为0.5ml)提交给Mitsubishi Kagaku Bio-Clinical Laboratories，Inc，然后用与临床检验类似的方式测量血清中含有的1，25-二羟维生素D水平。结果，对照组和OST311组的血清1，25-二羟维生素D水平分别为28.0pg/ml和23.9pg/ml。如上所述，即使观察到低磷酸盐血症和低钙血症的情况下，1，25-二羟维生素D水平也没有提高。这个结果清楚地表明维生素D代谢受到的影响是由于OST311的作用。
(9)腿节的软X光照片
无肿瘤小鼠以及CHO ras克隆-1，CHO-OST190H或者CHO-OST311H-移植小鼠在移植后第44天到46天处死，采集腿节，然后将腿节在4％中性福尔马林中固定3天。接下来，去除骨骼周围的软组织。从每组中随机挑选两个，然后使用放射线照相系统uFX-100(FUJIFILM，Japan)在以下条件下照射X光：X-射线管电压25kV，电流0.1mA，曝光时间5秒，然后对成像板曝光。结果示于图10。在CHO-OST311H组中观察到皮质骨的骨柱(bone trabecula of the corticalbone)减少。
实施例12 OST311核苷酸序列同源性和基因组区域的分析
使用SEQ ID NO：2所示氨基酸序列以及SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的至少一部分序列，可以从多个物种中检索到与OST311对应的分子。用SEQ ID NO：1的部分核苷酸序列检索了小鼠的基因组序列数据库，这样在小鼠第6染色体的序列中发现了一个与OST311有极高同源性的序列，其在Genbank的保藏号为AC015538。由该序列得到的小鼠OST311的部分多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示，与部分cDNA序列对应的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。图6显示了人OST311多肽和小鼠OST311多肽之间的氨基酸同源性比较结果。正如实施例11所显示的，显然含有人氨基酸序列的OST311多肽在小鼠中具有明显的生物活性。这些结果表明该活性很容易得以保留，即使图6所示的氨基酸序列中同源性低的区域中的那些氨基酸被取代，缺失或插入。
我们比较了SEQ ID NO：1所示核苷酸序列和人12p13 BACRPCI11-388F6(保藏号AC008012)，后者是利用数据库发现它有一个区域与SEQ ID NO：1的一部分相吻合，这样就确定出编码OST311的区域的序列。与OST311基因相邻的核苷酸序列示于SEQ ID NO：11.TATAA盒位于SEQ ID NO：11的核苷酸498到502。与cDNA序列(SEQ ID NO：1)匹配的第一序列从SEQ ID NO：11的核苷酸1713开始并延续到核苷酸2057。与SEQ ID NO：1所示核苷酸序列匹配的下一个部分从SEQID NO：11的核苷酸8732到8833。该部分被认为是外显子2。与SEQ IDNO：1所示核苷酸序列匹配的最后一个部分始于SEQ ID NO：11的核苷酸10644，结束于核苷酸12966。SEQ ID NO：11中核苷酸498到12966这部分序列可以认为至少是编码OST311的基因的一部分。此外，显然在Genbank中以G19259注册的STS序列位于外显子1和2之间。OST311位于12p13区域。根据Econs，M.J.等(J.Clin.Invest.100：2653-2657，1997)，从连锁分析的结果可以推断导致常染色体抗维生素D佝偻病(ADHR)的基因位于D12S100和D12S397之间的18cM区域，即12p13的微卫星标记(特别是D12S314和D12S397之间的一个约10cM的区域)。我们评估了OST311的物理位置和上述第12染色体的微卫星标记。结果，D12S100和D12S314在一个4602到6129kb的区域内，OST311在一个8958到9129kb的区域内，而D12S397在16280到16537kb的区域内。基于这些结果以及OST311的强磷酸盐代谢调控活性，我们发现OST311就是导致ADHR的基因。
实施例13移植CHO-OST311H细胞到裸鼠体内的短期实验
将CHO-OST311H细胞皮下移植到裸鼠(6用龄，BALB/c，雄性)的背部。移植后第2和第6天，测量血清磷酸盐和钙水平，检验重组体OST311的短期效应。类似地使用CHO ras克隆-1细胞作为该移植实验的对照。
(1)CHO细胞的移植
以实施例11(1)描述的方法相类似的方式，给裸鼠(n＝6)各皮下移植2x107 CHO-OST311H细胞和2x107 CHO ras克隆-1细胞。此外，类似地皮下移植等量PBS(n＝6)。每组的6只裸鼠被关在一个塑料笼子中，允许随意接触固体食物CE-2(CLEA JAPAN，Japan)和自来水。移植后的6天，没有观察到明显的肿瘤形成。
(2)细胞移植后第2天血清磷酸盐和钙水平的测定
细胞移植后的第2天，从被二乙醚麻醉的小鼠眼窝中采血。用Microtainer(Beckton Dickinson，USA)从外周血中分离血清。利用P-test Wako(Wako Pure Chemical Industries，Japan)测量血清磷酸盐水平，血清钙水平用钙-test Wako(Wako Pure ChemicalIndustries，Japan)测量。如图11A所示，与PBS给药组和CHO ras克隆-1细胞移植组相比，在CHO-OST311H细胞移植组全部成员中都观察到了血清磷酸盐水平的明显下降。相反，血清钙水平没有变化。这些结果清楚地表明OST311在给药后第二天仅导致血清磷酸盐水平的下降。
(3)细胞移植后第6天血清磷酸盐和钙水平的测定
细胞移植后的第6天，从被二乙醚麻醉的小鼠心脏中采血。如上所述，测定每组的血清磷酸盐和钙水平。如图11B所示，与移植后第2天类似，较之PBS给药组和CHO ras克隆-1细胞移植组，在CHO-OST311H细胞移植组全部成员中都观察到了血清磷酸盐水平的明显下降。相反，在CHO-OST311H细胞移植组中血清钙水平只有轻微下降。
实施例14重组体OST311的纯化
使CHO-OST311H细胞在37℃，5％CO2和100％湿度下，生长在一个225cm2培养瓶中含有10％FCS的MEMα培养基中。当细胞生长至覆盖瓶子的大约80％区域，用50ml无血清培养基CHO-S-SFM II(LIFETECHNOLOGY，USA)替换培养基，48小时后，收集条件培养基。用这样获得的共1000ml条件培养基通过以下方法纯化重组体OST311。
将1000ml条件培养基于4℃，16200g离心15分钟以除去悬浮细胞，然后将上清上样到装在一个玻璃柱子(内径30mmx200mm长)中的SP-sepharose FF(Amersham Pharmacia，USA)。将从柱子中流出的组分吸附到Talon Superflow(金属螯合树脂，CLONTECH，USA)上。用含有50mM磷酸盐钠缓冲液(pH6.6)和0.3M NaCl的洗涤缓冲液除去非特异性吸附，然后用50mM磷酸盐钠缓冲液(pH6.7)和0.2M咪唑进行洗脱。图12右栏显示利用抗His6抗体(INVITROGEN，USA)经Western印迹检测到的洗脱流份。这些流份含有一个实施例9中描述的包括氨基酸残基180(Ser)到251(Ile)的部分多肽(SEQ ID NO：8)。另一方面，利用0到0.7M NaCl浓度梯度，上述条件培养基中含有的吸附在SP-sepharose FF上的蛋白被50mM磷酸盐钠缓冲液(pH6.7)洗脱。图12左栏显示利用抗His6抗体(INVITROGEN，USA)经Western印迹检测到的洗脱流份。这些在大约0.3M NaCl被洗脱的流份含有一个实施例9中描述的包括氨基酸残基25(Tyr)到251(Ile)的部分多肽(SEQ ID NO：4)。此外，图12中间一栏显示利用实施例10中描述的由OST311部分肽(SEQ ID NO：29)制备的多克隆抗体(311-114)经Western印迹检测到的洗脱流份。这些流份在大约0.4M NaCl被洗脱，其含有一个实施例9中描述的包括氨基酸残基25(Tyr)到179(Arg)的部分肽(SEQ ID NO：6)。因此，含有三种OST311部分肽的流份，具体来说是SEQ ID NO：4(以下记为311：25-251)，SEQ IDNO：6(以下记为311：25-179)和SEQ ID NO：8(以下记为311：180-251)被纯化和分离开，然后用超滤分子量为10000的VIVASPIN柱子(Sartorius，USA)进行浓缩，随后用含有1ml 5mM HEPES(pH6.9)和0.1M NaCl的溶剂置换。
实施例15未去矿化骨骼切片的组织学分析
处死实施例11中制备的CHO-OST311H细胞移植小鼠和无肿瘤小鼠时，切除其右腿节和胫骨，保持膝关节的连接完整。切下胫骨轴和腿节轴后，立即将腿节和胫骨保存在预先准备好的冰中性福尔马林中。这样就制备了未去矿化标本。制备去矿化标本的方法如下所述。
用Villanueva骨骼染料将骨骼组织预先染色3到7天。将组织通过一系列乙醇梯度脱水，然后用丙酮取代溶剂。加入丙酮单体和单体后(After acetone monomer and then monomer were applied)，将组织样品包埋在树脂中。甲基丙烯酸甲酯(MMA)树脂用于包埋样品。将组织样品放在约35℃的培养箱中以便完全聚合。这时，通过适当加入MMA使组织彻底包埋在树脂中。此处用于包埋样品的MMA这样制备的，在100ml MMA单体(Wako Pure Chemical Industries，Japan)中加入并完全溶解40g MMA聚合物(Wako Pure Chemical Industries，Japan)，然后以每份溶液1g的速率添加并溶解Benzoyl过氧化物(Nacalai Tesque，Japan)。制备胫骨的标本。为了能观察胫骨的骨松质，修剪额切面，然后用硬组织所用的切片机(RM2065 super cut，Leica)制备4um厚的额切面。用Villanueva-Goldner进行后染色。用二甲苯将这样得到的切片透明化，然后用CLEAR SEAL(MARUTO，Japan)和ONE LIGHT(MARUTO，Japan)封存。
所述切片的显微图像示于图13。与对照组相比，在CHO-OST311H细胞移植肿瘤小鼠中观察到生长板宽度增加。此外，在干骺端观察到显著增加的前骨质和下降的矿化区域。没有骨炎成纤维(ostitisfibrosa)的迹象，从CHO-OST311细胞移植的肿瘤小鼠采集的骨骼表现出典型的骨软化症特征。
实施例16移植CHO-OST311H细胞后早期对维生素D代谢的检验
为了检验OST311对维生素D代谢的影响，以实施例13描述的方法类似的方式进行向裸鼠(6周龄，BALB/c，雄性)移植CHO-OST311H细胞的实验。建立了两个实验对照组以便于比较，其包括一个类似地移植CHO ras克隆-1细胞的组，和一个给予与细胞悬浮液剂量相同的PBS的组。将每组的6只小鼠关在塑料笼子里，可随意摄取自来水和包含1.03％无机磷酸盐和1.18％钙的固体食物CE2(CLEA JAPAN，Japan)。移植后第1，2，3和6天检验了血清1，25-羟基维生素D水平的波动和维生素D代谢酶表达的变化。
(1)血清1，25-二羟维生素D水平的测定
细胞移植后第1，2，3和6天，从分别被二乙醚麻醉的PBS给药组，CHO ras克隆-1细胞移植组和CHO-OST311H细胞移植组小鼠的心脏中采血，然后用Microtainer(Beckton Dickinson，USA)分离血清。将采自每只小鼠的相同体积的血清混合在一起，使每组总体积为0.25ml。用1，25(OH)2D RIA-试剂盒，“TFB”(TFB，Japan)测定其中的1，25-二羟维生素D水平。结果，如表6所示，与PBS给药组和CHO ras克隆-1细胞移植组相比，在CHO-OST311H细胞移植组中移植后第1天就观察到1，25-二羟维生素D水平显著下降。移植后第2，3和6天也观察到这一下降的效果。这些结果与血清1，25-二羟维生素D水平下降是一致的，这也正是肿瘤诱导性骨软化症的典型临床发现。
表6细胞移植小鼠中的血清1，25-二羟维生素D水平
  移植后                  1         2          3         6
  PBS给药组(pmol/L)n＝5   338       164.3      164.5     273.7CHO-ras克隆-1细胞移植   271.9     178.3      182.9     184.6组(pmol/L)n＝6CHO-OST311细胞移植组    46.7      36.3       34.5      49.1(pmol/L)n＝6
(2)肾脏中维生素D代谢酶基因的表达分析
为了研究上述1，25-二羟维生素D3下降的效果是否是25-羟基维生素D-1-α-羟化酶(1αOHase)基因或25-羟基维生素D-24-羟化酶(24OHase)基因的波动造成的，移植后第3天，从PBS给药组，CHO-ras克隆-1细胞移植组和CHO-OST311H细胞移植组中各随机挑选3或4只小鼠。切除肾脏，根据实施例11(7)描述的步骤制备总RNA，然后用同一实施例中描述的探针进行Northern印迹。结果示于图14。与PBS给药组和CHO-ras克隆-1细胞移植组相比，CHO-OST311H细胞移植组中1αOHase基因的mRNA表达水平显著减弱。这个结果暗示了OST311直接或间接抑制该基因表达，从而抑制血清1，25-二羟维生素D生物合成的可能性。另一方面，与PBS给药组和CHO-ras克隆-1细胞移植组相比，CHO-OST311H细胞移植组中24OHase基因的mRNA表达水平显著增加。该结果暗示了OST311直接或间接增强该基因表达，从而促进血清1，25-二羟维生素D失活的可能性。
在实施例11(8)中，与对照组相比，移植后第44天和46天没有观察到血清1，25-二羟维生素D水平有显著差异。另一个结果与本实施例的不同之处在于1αOHase mRNA表达水平有增长的趋势。至少一个可能的解释是这一差异是由于实施例17中描述的血清甲状旁腺激素的影响。
实施例17移植CHO-OST311H细胞后的早期对血清甲状旁腺激素水平的检验
实施例11，13和16中描述的在移植CHO细胞后的第1，2，3，6和45天，将采集的每份等体积小鼠血清混合到一起，使总体积为0.15ml。然后用Rat PTH IRMA试剂盒(Nihon Medi-Physics，Japan)根据所附的厂商说明测定血清甲状旁腺激素水平。如表7所示，在CHO-OST311移植组中观察到血清甲状旁腺激素水平显著上升，差异在移植后第45天很明显。
表7细胞移植小鼠中的甲状旁腺激素水平
  移植后                 1        2        3        6       45
  PBS给药组(pg/ml)n＝5   45.2     23.8     28.2     19.7    141.9CHO-ras克隆-1细胞移    15.8     26.6     15.7     13.8    240.4植组(pg/ml)n＝6CHO-OST311细胞移植组   13.8     20.6      44      57.8    3211.7(pg/ml)n＝6
1使用无肿瘤小鼠(n＝6)时的测量值。2n＝10，3n＝12。
实施例18给予正常小鼠CHO产生的重组体OST311H全长蛋白的实验
为了研究CHO产生的重组体OST311H全长蛋白对正常小鼠(BALB/c，雄性，6周龄)的影响，通过实施例14(1)描述的纯化方法将C末端带有一个组氨酸标记的多肽部分纯化，所述多肽包括第25个氨基酸残基，Tyr到残基251Ile(SEQ ID NO：4)。将纯化的组分以每次0.1ml腹膜内给予正常小鼠。根据Western印迹得到的荧光强度，估计该纯化组分含有大约0.15到0.75ug重组体OST311。与实施例14类似，将0.1ml溶剂(5mM HEPES缓冲液/0.1M NaCl，pH7.0)腹膜内给予对照组。OST311给药组和对照组分别包括5只小鼠。将每组的5只小鼠关在塑料笼子内，允许随意摄取自来水和含有1.03％无机磷酸盐和1.18％钙的固体食物CE2(CLEA JAPAN，Japan)。
[实验1]
实验概要示于图15A。第一次腹膜内给药后第5，10，23，28和33小时另外给药。这样，总共进行6次腹膜内给药。随后，第一次腹膜内给药后第36，47和71小时用玻璃毛细管从眼窝采血，然后用Microtainer(Beckton Dickinson，USA)分离血清。
利用P-检验Wako或钙-检验Wako(Wako Pure ChemicalIndustries，Japan)根据所附的厂商说明确定这样获得的血清中的磷酸盐和钙水平。如图15B所示，第一次给药后第36小时在OST311给药组观察到血清磷酸盐水平显著下降的效果(t-检验**p＜0.001，*p＜0.01)。此外，这一效果在该时刻后维持了11个小时(第一次给药后47小时)。另一方面，第一次给药后71小时这样的活性消失(最后一次给药后38小时)。另外，任何时刻都没有发现血清钙水平有显著变化(图15C)。
[实验2]
实验概要示于图16A。第一次腹膜内给药后第5和11小时另外给药。这样，总共进行3次腹膜内给药。随后，第一次腹膜内给药后第13和24小时用玻璃毛细管从眼窝采血，然后用Microtainer(BecktonDickinson，USA)分离血清。利用P-检验Wako或钙-检验Wako根据所附的厂商说明确定这样获得的血清中的磷酸盐和钙水平。如图16B所示，第一次给药后13小时在OST311给药组观察到血清磷酸盐水平显著下降的效果(t-检验**p＜0.05，*p＜0.01)。此外，这一效果在该时刻后维持了11个小时。另外，任何时刻都没有发现血清钙水平有显著变化(图16C)。
实验1和2的结果揭示了将CHO产生的重组体OST311蛋白的全长组分腹膜内给予正常小鼠能诱发低磷酸盐血症，在第一次给予后第13小时已经观察到血清磷酸盐水平下降，这一活性能在给药停止后维持11个小时。
实施例19向OST311导入突变
如实施例9显示，CHO-OST311H细胞产生的部分重组体OST311在其分泌过程中被切割为一个具有第25位Tyr到第179位Arg氨基酸残基之序列的多肽(SEQ ID NO：6)，和一个具有第180位Ser到第251位Ile氨基酸残基之序列的多肽(SEQ ID NO：8)。
所述切割可能是由于一个能识别刚好位于第180位氨基酸残基Ser之前，包含RXXR序列或RRXXR序列的基元的蛋白酶。将全长重组体给予活的有机体时，该重组体被认为有可能进行这种切割活类似的降解。因此，制备了基因OST311RQ以便导入突变，所述基因编码以Gln取代第176位的Arg和第179位的Arg氨基酸残基的序列。
(1)OST311/pCAGGS质粒的制备
以OST311H/pcDNA3.1质粒为模板，311F1EcoRI(SEQ ID NO：22)和311LNot(SEQ ID NO：44)为引物，经LA Taq聚合酶(TAKARA SHUZO，Japan)进行PCR。将温度维持在94℃1分钟后，进行25轮反应，每个循环包括94℃30秒，55℃30秒，72℃1分钟。反应完成后，用T4 DNA聚合酶(Roche，Swiss)将PCR产物降解为平末端，然后进行酚-氯仿处理使酶失活。用乙醇沉淀DNA，然后用多核苷酸激酶(Roche，Swiss)使DNA末端磷酸化。经0.8％琼脂糖凝胶电泳分离靶DNA片段，然后用Gene Clean II(BIO101，USA)回收。用EcoRI消化质粒载体pCAGGS(Niwa H等，Gene1991 12月 15；108(2))，然后用Klenow片段(Roche，Swiss)平端化。随后用牛小肠碱性磷酸酶(TAKARASHUZO，Japan)使DNA末端去磷酸化。经0.8％琼脂糖凝胶电泳分离靶DNA片段，然后用Gene Clean II(BIO101，USA)回收。用DNA连接试剂盒(第2版)(TAKARA SHUZO，Japan)根据所附的厂商说明，将这样得到的OST311cDNA连接到预先消化好的pCAGGS质粒上。将产物导入大肠杆菌DH5α进行克隆，这样即得到相关的质粒。该质粒用于制备OST311RQH基因。
311LNot：ATAAGAATGCGGCCGCTCAGATGAACTTGGCGAA(SEQ IDNO：44)
(2)OST311RQH基因的制备
合成以下引物。
OST311ME1：ATGAATTCCACCATGTTGGGGGCCCGCCTCAGG(SEQ IDNO：45)
OST311HNt：ATGCGGCCGCCTAATGATGATGATGATGATGGATGAACTTGGCGAAGGG(SEQ ID NO：46)
OST311RQF：ATACCACGGCAGCACACCCAGAGCGCCGAG(SEQ ID NO：47)
OST311RQR：CTCGGCGCTCTGGGTGTGCTGCCGTGGTAT(SEQ ID NO：48)
OST311ME1是含有OST311的打头亮氨酸的部分的正向引物，OST311HNt是在OST311的3’端添加了6个组氨酸的反向引物，OST311RQF和OST311RQR是用于引入突变的正向和反向引物，分别以腺嘌呤替换在OST311 cDNA编码区第527和536位的鸟嘌呤(对应SEQID NO：1的第659和668位鸟嘌呤)，从而以谷氨酰胺取代氨基酸176和179的精氨酸。根据所附的厂商说明利用pfu DNA聚合酶(Promega，USA)制备两种反应溶液各20ul。另一方面，终浓度0.2uM的OST311ME1和OST311RQR作为引物，10ng实施例6(1)中描述的OST311表达载体用做模板。将温度维持94℃1分钟后，进行25轮PCR反应，每循环包括94℃30秒，55℃30秒和72℃1分钟。另外，终浓度0.2uM的OST311RQF和OST311HNt作为引物，10ng OST311/pCAGGS质粒作为模板。将温度维持94℃1分钟后，进行35轮PCR反应，每循环包括94℃30秒，55℃30秒和72℃1分钟。将以上两种反应产物分别稀释10倍，然后各取1ul溶液加入50ul根据所附的厂商说明利用LA Taq聚合酶(TAKARA SHUZO，Japan)制备的反应液中。将温度维持94℃1分钟后，利用LA Taq聚合酶，以终浓度0.2uM的OST311ME1和OST311HNt作为引物进行25轮PCR反应，每个循环包括94℃30秒，55℃30秒和72℃1分钟。PCR反应完成后，将溶液在72℃维持7分钟。对这样得到的反应产物进行酚/氯仿处理，去蛋白，乙醇沉淀，然后用EcoRI和NotI消化。经2％琼脂糖凝胶电泳分离一个大约800bp的DNA片段，然后用Gene Clean II(BIO101，USA)回收。将得到的DNA片段插入载体IRES-EGFP-pEAK8的EcoRI和NotI位点，从而获得OST311RQH/IRES-EGFP/pEAK8质粒，其中所述IRES-EGFP-pEAK8载体是通过给质粒pEAK8(EdgeBioSystems，USA)连接了一个内部核糖体进入位点(IRES)和增强的绿色荧光蛋白(EGFP)制备的。按照标准方法制备质粒DNA，然后用ABI3700荧光DNA测序仪(PE AppliedSystems，USA)确定核苷酸序列，这样证实了该序列编码一个导入了R176Q和R179Q突变的多肽，并且在C末端加上了组氨酸标记。由该基因编码的多肽以下称为OST311RQH。
(3)稳定表达OST311RQH的CHO细胞的分离
用Transfectam(Promega，USA)根据所附的厂商说明将OST311RQH/IRES-EGFP/pEAK8质粒导入CHO-ras克隆-1细胞。在含有5ug/ml嘌呤霉素和10％FCS的MEMα培养基上挑选药物抗性细胞。然后用FACS vantage(Beckton Dickinson，USA)淘选GFP(绿色荧光蛋白)荧光强度高的细胞，然后克隆。当克隆细胞长满时，用无血清DF培养基(DMEM/F-12)替换培养基，然后在换培养基后2天收集条件培养基。用一个96孔的可变滤膜系统(Lifetechoriental，USA)将50ul收集到的条件培养基吸附到Immobilon P滤膜(Millipore，USA)上。用TBS和TTBS洗涤制备好的滤膜，然后用Blockace(DaiichiPharmaceutical，Japan)在室温下封闭1小时。封闭后，使膜与经Blockace稀释5000倍的HRP标记的抗His6单克隆抗体(Invitrogen，USA)反应1小时。反应后，用TTBS和TBS洗涤滤膜，然后用ECL(Amersham Pharmacia，USA)根据所附的厂商说明检测信号。根据信号强度，挑选高表达克隆CHO-OST311RQH。
(4)OST311RQH pEAK快速细胞的条件培养基的制备
将pEAK快速细胞(EdgeBioSystems，USA)接种在20瓶组织培养瓶(225cm2，CORNING，USA)中。根据pEAK系统(EdgeBioSystems，USA)所附的厂商说明经磷酸钙法将0.48mg OST311RQH/IRES-GFP/pEAK8质粒转染所述细胞。将细胞放置4小时。接下来，用50ml无血清MEMα培养基替换每个瓶中的培养基，将细胞于37℃培养2天，然后收集条件培养基。
(5)重组体OST311RQH表达的证实
得自上述两种CHO-OST311RQH细胞克隆和pEAK快速细胞短暂表达的条件培养基，各取10ul以实施例6(3)描述的方式进行Western印迹，从而检验培养上清中是否存在重组体OST311RQH。抗His(C-末端)抗体(Invitrogen，USA)用作检测抗体。如图17所示，在所有培养液上清中都观察到与实施例6(3)描述的约32kDa条带处于相同位置的一个强信号。并且，对于所有条件培养基，Western印迹没有观察到约10kDa的信号。从这些结果可以推断，引入突变R176Q和R179Q导致预期在这些位置发生的多肽的切割被抑制或减弱，因此具有从氨基酸180 Ser到251 Ile之序列的多肽比率显著下降。
实施例20正常小鼠的重组体OST311RQH给药实验
根据实施例14(1)描述的方法，从500ml实施例19(5)中制备的培养液上清得到含有约2.8ug/ml重组体OST311RQH蛋白的纯化组分。将所述纯化组分以0.1ml/次连续地腹膜内给予正常小鼠(BALB/c，雄性，6周龄)，然后测量血清磷酸盐，钙和1，25-二羟维生素D水平。对于对照组，类似地分别腹膜内给予0.1ml载体(5mM HEPES缓冲液/0.1M NaCl pH＝7.0)。OST311RQH-给药组和对照组各包括6只小鼠。将每组的6只小鼠关在一个塑料笼子中，允许随意摄取自来水和含有1.03％无机磷酸盐和1.18％钙的固体食物CE2(CLEA JAPAN，Japan)。
实验方案如图18A所示。第一次给药后第5，10，24，29和34小时进行额外的给药。因此，总共连续给药6次。在上述过程中，第一次给药后第24小时(第4次给药前)，用玻璃毛细管从被二乙醚麻醉的小鼠的眼窝采血，第一次给药后第48小时从心脏采血。
(1)血清磷酸盐和钙水平的测量
第一次给药后24和48小时采集血清，通过实施例14(3)描述的方法测量血清磷酸盐水平。结果，在任何时间采血，OST311RQH给药组均表现为显著的低磷酸盐血症，如图18B所示(t-检验**p＜0.01，*p＜0.05)。相反，血清钙水平没有明显波动(图18C)。
(2)血清1，25-二羟维生素D水平的测量
第一次给药后48小时，将各组采自每只小鼠的等体积血清混合在一起。然后，通过实施例16(1)描述的方法测量血清1，25-二羟维生素D水平。对照组显示的结果为244.7pmol/L，而OST311RQH给药组表现出明显的下降，即24.6pmol/L。
实施例21 CHO-OST311RQH细胞移植实验
类似于实施例13描述的方法进行这样一个实验，其中将实施例19(3)描述的稳定表达OST311RQH的细胞移植给裸鼠(7周龄，BALB/c-nude，雄性，n＝8)。类似地移植CHO ras克隆-1细胞作为对照组(n＝6)。将每组裸鼠关在一个塑料笼子中，允许随意摄取自来水和含有1.03％无机磷酸盐和1.18％钙的固体食物CE2(CLEA JAPAN，Japan)。
细胞移植后第2天，用玻璃毛细管从眼窝采血，然后通过实施例14(3)描述的类似方法测量血清磷酸盐和钙水平。如图19A所示，在CHO-OST311RQH细胞移植组中观察到血清磷酸盐水平显著下降(t检验*p＜0.001)，而血清钙水平没有明显变化(图19B)。
实施例22抗OST311部分肽多克隆抗体的制备(2)
以实施例10描述的类似方式制备了4种部分OST311肽。用这些肽作为抗原免疫兔子，然后用得到的抗血清根据实施例6(3)描述的方法进行Western印迹，这样在CHO-OST311H细胞的条件培养基中检测到了重组体OST311H。抗体反应在溶液中于4℃搅拌过夜，所述溶液是将每种肽的抗血清用TTBS稀释250倍制备的。洗涤后，向溶液中加入碱性磷酸酶标记的羊抗兔抗体(DAKO，Denmark)进行结合，然后用碱性磷酸酶染色试剂盒(BIO-RAD，USA)检测重组体OST311(图20)。
部分肽
311-148：GMNPPPYSQFLSRRNEC(SEQ ID NO：49)
311-170：CNTPIPRRHTR(SEQ ID NO：50)
311-180：SAEDDSERDPLNVLKC(SEQ ID NO：51)
311-210：LPSAEDNSPMASDC(SEQ ID NO：52)
实施例23 检测OST311蛋白的ELISA系统的构建
(1)从抗OST311部分肽的兔抗血清中纯化抗体
将Ecoho-Pac可降解层析柱(BIO-RAD，USA)填充3ml蛋白Asepharose4FF(Amersham Pharmacia，USA)浆，然后用10ml 0.1M盐酸甘氨酸缓冲液(pH3.3)和20ml PBS洗涤。加入实施例10描述的两种兔抗血清和实施例22描述的4种兔抗血清各800-900ul，从而使抗体组分吸附到树脂上。用9ml PBS洗柱子以便除去污染物，然后各加入1ml 0.1M盐酸甘氨酸缓冲液(pH3.3)得到IgG洗脱流份。进行洗脱时，根据需要向每个流份中加入10ul中和缓冲液(1M Tris)来中和溶液。测量280nm处的光吸收以便确定洗脱流份中含有的抗体的浓度(光吸收吸收计算为：1.34(mg/ml)-1.(cm)-1)。然后，将一些流份一起上样到NAP25柱子，用50mM碳酸氢钠溶液替换溶剂。结果从每份肽抗血清中得到5到15mg抗体(这些多克隆抗体以下分别称为311-48抗体，311-114抗体，311-148抗体，311-170抗体，311-180抗体和311-210抗体)。
(2)抗OST311IgG的生物素化
将上述6种抗OST311肽的多克隆抗体在50mM碳酸氢钠溶液中稀释至1mg/ml。然后将溶解在10ul二甲基甲酰胺中的每种抗体各1mg与Biotin-AC5-Osu溶液(1.82ug/ml)(Japan，Dojindo)通过于4℃倒置2小时混合均匀。随后，用NAP10柱子除去混匀溶液中未反应的Biotin-AC5-Osu，并以PBS置换溶剂，从而得到6种生物素化的抗OST311肽的多克隆抗体。
(3)用抗OST肽的兔多克隆抗体经夹心ELISA法检测表达OST311细胞的条件培养基中的OST311
将用于固定的6种抗OST311肽多克隆抗体和上述6种用于检测的生物素化抗体结合起来构建了一个夹心ELISA系统。这样，检查了对OST311表达细胞条件培养基中的OST311蛋白的检测。
将上述通过纯化蛋白A得到的用于固定的6种抗OST311肽多克隆抗体在50mM碳酸氢钠溶液中稀释至10ug/ml。各取50ul稀释液加入96孔ELISA板Maxisorp(Nunc，USA)的每个孔中，然后于37℃放置1小时，以便固定IgG。接下来，吸去反应液，然后向每个孔中加入50ul溶于TBS的Superblock封闭缓冲液在室温下封闭10分钟。吸去溶液后，加入实施例19(5)描述的OST311RQH峰值快速培养上清或者作为对照的MEMα培养基，每孔50ul，然后在室温下放置1小时使之与固定化抗体结合。抗体反应后，用TTBS将溶液洗3次，向每孔中加入各50ul在TTBS中稀释至10ug/ml，含有10％Blockace(DainipponPharmaceutical，Japan)的上述6种生物素化抗OST311抗体(311-48，311-114，311-148，311-170，311-180和311-210)，然后在室温放置30分钟，进行第二抗体反应。用TTBS将每个孔洗3次，然后备加入50ul用TTBS稀释10000倍含有10％Blockace的HRP标记的链霉亲合素(DAKO，Denmark)，然后在室温放置30分钟使之与生物素化抗体结合。然后用TTBS将每个孔洗3次，每孔加入50μl四甲基对二氨基联苯，加入过氧化物酶生色底物(DAKO，Denmark)，然后在室温成色5分钟。随后每个孔中加入50μl 0.5M磺酸溶液终止反应。用适用于96孔板的光吸收测量系统MTP300(CORONA ELECTRIC，Japan)进行测量，用450nm处光吸收除以570nm处光吸收。当只加入MEMα作为对照时，每例中450nm/570nm得到的值均为0.22或以下。相反，如图21A所示，固定化311-48抗体，用311-180抗体检测结合使用时，或者固定化311-180抗体，用311-148抗体检测结合时，可以检测到条件培养基中的OST311RQH比对照组明显高。并且，固定用311-48抗体，用311-148抗体检测这样的组合时，可以推断不仅可以检测全长多肽，也可以检测N-末端部分多肽片段，因为两种抗体的抗原位点都包含在实施例9描述的OST311蛋白切割位点后的N-末端部分肽(SEQ ID NO：6)。相反，用311-210抗体固定，用311-80抗体检测这样的组合时，可以推断不仅能检测全长多肽，也能检测实施例9描述的切割位点后的C末端部分肽(SEQ ID NO：8)。因此，这些组合方式的多项用途使得能测量样本，比如生物样品中OST311全长多肽和部分多肽的绝对量以及比率。
(4)利用抗OST311肽的兔多克隆抗体经夹心ELISA法定量重组体OST311蛋白浓度
在上述ELISA系统中，以311-48抗体或311-180抗体作为固定抗体，311-148作为检测抗体这样的组合来考察对纯化重组体OST311的检测，其中OST311包括了1，0.67，0.33，0.1，0.067，0.033和0.01μg/ml这样一系列稀释。如图21B所示，在0.1到1μg/ml的范围内可以得到很好的线性(311-48：R2＝0.990，311-180：R2＝0.996)。该结果揭示了至少可以检测在这个浓度范围内的重组体OST311。
实施例24 一次给予重组体OST311蛋白的效果的考察
为了检验CHO产生的重组体OST311H全长蛋白对正常小鼠(BALB/c，雄性，6周龄)的短期效应，将纯化的重组体OST311H全长蛋白以每只小鼠5.0ug/0.1ml经尾部静脉给药一次。对于对照组，经尾部静脉每只小鼠给予0.1ml载体(PBS)。给药后1，3和8小时，从心脏中采血并进行解剖，测量血清磷酸盐，钙和维生素D水平，然后分析钠-磷酸盐协同载体蛋白在肾近端小管上的表达量。OST311给药组和对照组分别包括6只小鼠。将每组的6只小鼠关起来，允许随意摄取自来水和含有1.03％无机磷酸盐和1.18％钙的固体食物CE2(CLEA JAPAN，Japan)。
(1)血清磷酸盐水平随时间的变化
如表8所示，一次给予OST311蛋白后1和3小时，没有观察到血清磷酸盐水平的显著变化，给药后8小时，观察到明显下降。这个结果阐明了OST311的效果需要3到8小时来降低血清磷酸盐水平。另一方面，任何时候都没有观察到血清钙水平的变化。
表8血清磷酸盐水平
  时间   1   3   8
  载体给药组(mg/dL)   9.82±0.61   9.99±0.20   9.55±0.29
  OST311给药组(mg/dL)   9.61±0.51   9.96±0.39   7.82±0.27
  t-检验   P＞0.5   P＞0.5   P＜0.005
(2)钠-磷酸盐协同载体蛋白在肾脏近端小管上的表达
根据实施例11(6)描述的方法，将各组在给药后1，3和8小时采集的肾脏混合在一起，然后制备近端小管的刷缘膜(BBM)。经Western印迹法分析得到的BBM中的钠-磷酸盐协同载体蛋白(NaPi7)的比率。如图22A所示，给药后1和3小时，NaPi7的表达量与载体给药组相当，给药后8小时，与载体给药组相比，OST311给药组中的NaPi7明显下降。同时，为了验证NaPi7蛋白的减少是否与RNA转录调控有关，根据实施例11(7)中描述的步骤，由每只小鼠切除的肾脏中制备总RNA，并用同一实施例中描述的探针进行Western印迹。因此，如图22B所示，给药后1和3小时，NaPi7的mRNA水平与载体给药组相当，但给药后8小时，与载体给药组相比，OST311给药组中的NaPi7明显下降。以上结果清楚地表明血清磷酸盐水平的下降是由于重组体OST311蛋白直接或间接的影响，它下调肾小管上的钠-磷酸盐协同载体蛋白，对NaPi7在mRNA转录水平上的抑制至少是蛋白水平下调的一个因素。
(3)血清1，25-二羟维生素D3水平随时间的变化
通过实施例16(1)描述的方法测量给药后1，3和8小时血清1，25-二羟维生素D3水平。如图23所示，在OST311给药组中，给药后3小时即观察到血清1，25-二羟维生素D3水平的显著下降，给药后8小时观察到进一步下降。
(4)维生素D代谢酶基因的表达变化
为了阐明血清1，25-二羟维生素D3水平的下降是否由于肾脏中25-羟基维生素D-1-α-羟化酶(1αOHase)或25-羟基维生素D-24-羟化酶(24OHase)基因表达的波动，根据实施例11(7)描述的步骤在给药后1，3和8小时，从肾脏制备总RNA，然后用该实施例描述的探针进行Western印迹。如图24所示，在给药后1小时，即观察到1αOHase基因的mRNA水平下降，24OHase基因的mRNA水平提高。给药后8小时这一趋势表现地更明显。在图24中，载体表示重组体OST311蛋白的溶剂，其包含20mM磷酸缓冲液(pH6.7)和0.3M NaCl。
这些结果显示OST311通过调节25-羟基维生素D-1-α-羟化酶(1αOHase)或25-羟基维生素D-24-羟化酶(24OHase)基因在肾脏中的表达降低血清1，25-二羟维生素D3水平。
实施例25 C-末端缺失的OST311的活性的检验
(1)缺少C末端部分的OST311表达系统的构建
合成以下引物。
OST311R693  ATGCGGCCGCTATCGACCGCCCCTGACCACCCC(SEQ ID NO：53)
OST311R633  ATGCGGCCGCTACGGGAGCTCCTGTGAACAGGA(SEQ ID NO：54)
OST311R618  ATGCGGCCGCTCAACAGGAGGCCGGGGCCGGGGT(SEQ ID NO：55)
OST311R603  ATGCGGCCGCTCACGGGGTCATCCGGGCCCGGGG(SEQ ID NO：56)
OST311R693，OST311R633，OST311R618和OST311R603是用于从OST311的3’端分别缺失20，40，45和50个氨基酸残基，并引入一个终止密码子和NotI识别序列的反向引物。将这些反向引物中的每一个与实施例19中描述的含有OST311起始亮氨酸以及EcoRI识别序列的正向引物OST311ME1(SEQ ID NO：45)结合在一起，使终浓度为0.2uM。利用这些引物，Pyrobest DNA聚合酶(TAKARA SHUZO，Japan)和100ng实施例19(2)描述的OST311RQH/IRES-EGFP/pEAK8质粒DNA作为模板，温度维持94℃1分钟后进行25轮PCR反应。每个循环包括94℃30秒，55℃30秒，72℃1分钟。将得到的反应产物进行酚/氯仿处理，去蛋白，然后乙醇沉淀。然后用EcoRI和NotI消化反应产物，进行2％琼脂糖凝胶电泳，以便分离各DNA片段并用Gene CleanII(BIO101，USA)回收。将得到的DNA片段连接到用EcoRI和NotI消化好的pEAK8载体(EdgeBioSystems，USA)，从而得到pPKOST311-ΔC20，-ΔC40，-ΔC45，-ΔC50质粒。经标准方法制备质粒DNA，然后用ABI3700荧光DNA测序仪(PE Applied Biosystems，USA)确定核苷酸序列，从而证实已经按照需要从OST311RQH基因的3’端删除了碱基对。
(2)稳定表达重组体的CHO细胞的分离
用Transfectam(Promega，USA)按照所附的厂商说明将pPKOST311-ΔC20，-ΔC40，-ΔC45，-ΔC50质粒DNA分别导入CHO ras克隆-1细胞。得到在含有5ug/ml嘌呤霉素和10％FCS的MEMα培养基上显示药物抗性的CHO-OST311RQ-ΔC20，-ΔC40，-ΔC45和-ΔC50细胞。将这些细胞分别接种24孔培养板，然后在含有5ug/ml嘌呤霉素和10％FCS的MEMα培养基上培养至长满。随后，用无血清DF(DMEM/F-12)培养基替换培养基。3天后，收集条件培养基。将所述条件培养基用实施例22描述的OST311-特异性多克隆抗体311-148或311-180进行Western印迹，以便证实对应预计分子量的位置的相关蛋白质得到了表达。
(3)表达C末端缺失OST311的CHO细胞的移植试验
将表达上述缺失20，40，45和50个残基的OST311的CHO细胞以实施例13所述方法类似的方式分别腹膜下移植给裸鼠(6周龄，BALB/c-nude，雄性，每组6只)。作为对照组，分别腹膜下移植表达全长OST311RQH的CHO细胞和CHO ras克隆-1细胞(n＝6)。将每组小鼠关在塑料笼子里，允许随意摄取自来水和固体食物CE2(CLEAJAPAN，Japan)。
移植后第3天，从心脏采血，然后通过实施例20所述类似的方法测量血清磷酸盐，钙以及1，25-二羟维生素D3水平。如图25所示，在所有CHO-OST311RQ-ΔC20，-ΔC40，-ΔC45和-ΔC50细胞移植组中，都观察到血清磷酸盐水平与移植了表达全长OST311RQH的细胞的组相当，都有显著下降(t检验，**p＜0.001)。并且，在CHO-OST311RQ-ΔC20，-ΔC40，-ΔC45和-ΔC50细胞移植组中，还观察到血清1，25-二羟维生素D3水平显著下降(CHO ras克隆-1移植组的平均血清水平界定为100％时，全长：3.1％，ΔC40：9.4％，ΔC45：10.0％以及ΔC50：68.1％)。这些结果清楚地显示即使从OST311蛋白的C末端删除50个氨基酸，仍保留了它的血清磷酸盐-降低活性或血清1，25-二羟维生素D3水平降低活性。
实施例26N末端缺失OST311的活性检验
(1)缺少N末端9个氨基酸残基的OST311表达系统的构建
合成以下寡DNA。
OST311SGFW：
aattccaccATGTTGGGGGCCCGCCTCAGGCTCTGGGTCTGTGCTTGTGCAGCGTCTGC
AGCATGAGCGTCCTgcatGC(SEQ ID NO：57)
OST311SGRV：
aattGCatgcAGGACGCTCATGCTGCAGACGCTGCACAAGGCACAGACCCAGAGCCTG
AGGCGGGCCCCCAACATggtgg(SEQ ID NO：58)
OST311SGFW是包括从OST311起始亮氨酸到SEQ ID NO：2的第24个氨基酸Ala这些氨基酸残基的寡DNA，它含有编码信号肽的基因序列，在5’端有一个EcoRI识别序列。OST311SGRV是OST311SGFW的互补链，5’端含有EcoRI识别序列。此外，在OST311SGFW的3’方向和OST311SGRV的5’方向导入了限制酶SphI的识别位点。导入SphI识别位点使信号肽序列中的第23个氨基酸Arg被His所取代。按照标准方法将上述寡DNA退火，从而得到这样一个双链DNA片段，它的两端均含有EcoRI识别序列，与信号肽第23个氨基酸残基对应的位置有一个SphI识别序列，编码从OST311起始亮氨酸开始的全长信号肽并含有一个修饰过的残基。将得到的DNA片段插入pEAK8载体(EdgeBioSystems，USA)。然后选择EF1启动子和上述DNA片段均以正向存在于载体中的质粒DNA，从而得到质粒pPKFGSG。
接下来，合成以下引物。
OST311dN9：ATATGCATGCCTCCAGCTGGGGTGGCCTGATCCAC(SEQ ID NO：59).
OST311dN9是一个设计成这样的正向引物，其5’端含有SphI识别位点，SEQ ID NO：2的第24个氨基酸残基Ala后面是从SEQ ID NO：2的第34个氨基酸残基Ser开始的氨基酸序列。联合使用该引物与反向引物OST311HNt(实施例19，SEQ ID NO：46)(该反向引物含有一个NotI识别序列，C末端添加了6个组氨酸残基，随后是一个终止密码子)，以实施例19(2)描述的OST311RQH/IRES-EGFP/pEAK8质粒DNA为模板，按照实施例25(1)描述的方式进行PCR扩增。用SphI和NotI消化得到的PCR产物，然后根据标准方法插入以上描述的SphI-和NotI-消化的质粒载体pPKFGSG。
利用ABI3700荧光DNA测序仪(PE Applied Biosystems，USA)确定所得质粒OST311ΔN9-pPKFGSG的核苷酸序列，从而证实插入的基因序列含有从起始亮氨酸到OST311RQH基因的第24个氨基酸Ala的信号肽(其中第23个氨基酸Arg被His取代)，缺失第25个氨基酸Tyr到第33个氨基酸Gly这9个氨基酸残基对应的基因序列，并编码从第34个氨基酸Ser到含有终止密码子的组氨酸标记的全部序列。
(2)稳定表达重组体OST311ΔN9的CHO细胞的分离
用Transfectam(Promega，USA)按照所附的厂商说明将OST311ΔN9-pPKFGSG质粒DNA导入CHO ras克隆-1细胞，然后得到在含有5ug/ml嘌呤霉素和10％FCS的MEMα培养基上显示药物抗性的CHO-OST311RQ-ΔN9细胞。以实施例25描述的方式由所得细胞收集条件培养基。然后利用实施例22描述的OST311特异多克隆抗体311-148或者用SEQ ID NO：2中氨基酸237Gly到251Ile的部分多肽免疫兔子得到的多克隆抗体311-237进行Western印迹。这样，证实了在预期分子量所对应的位置的蛋白质得以表达。这些结果揭示OST311信号肽，在SEQ ID NO：2的氨基酸23 Arg被His取代的情况下，仍能保证分泌OST311重组体蛋白质，并且即使删除了至少从氨基酸25 Tyr到33 Gly这一部分，重组体蛋白还能在培养基中一定程度上稳定地存在。
(3)表达N末端缺失9个氨基酸的OST311的细胞的移植试验
以实施例13所述方法类似的方式将以上CHO-OST311RQ-Δ9细胞腹膜下移植给裸鼠(8周龄，BALB/c-nude，雄性，每组6只)。作为对照组，分别类似地腹膜下移植表达全长OST311RQH的CHO细胞和CHO ras克隆-1细胞(n＝6)。将每组的小鼠关在塑料笼子里，允许随意摄取自来水和固体食物CE2(CLEA JAPAN，Japan)。
细胞移植后4天，用玻璃毛细管从眼窝采血，然后以实施例20所述类似的方式测量血清磷酸盐水平。在CHO-OST311RQΔ9细胞移植组观察到血清磷酸盐水平显著下降(CHO ras克隆-1组：6.85±0.12mg/dl，CHO-OST311RQH组：3.91±0.23mg/dl(p＜0.001，相对CHO-ras克隆-1组)，CHO-OST311RQΔ9组：4.33±0.15(p＜0.001，相对CHO-ras克隆-1组))，其与表达全长重组体的细胞移植组相当。
这些结果显示即使将包括SEQ ID NO：2的至少氨基酸25Tyr到33 Gly这9个氨基酸残基删除，OST311的生物活性还完好无损。
实施例27产生OST311重组体的大肠杆菌的检验
(1)OST311大肠杆菌表达载体OST311/pET3a的构建
合成以下引物。
OST311N：TGTATCCCAATGCCTCCCCACTG(SEQ ID NO：60)
OST311Bm：ATGGATCCCTAGATGAACTTGGCGAAGGG(SEQ ID NO：61)
用实施例19中制备的OST311/pCAGGS质粒作为模板，OST311N(SEQ ID NO：60)和OST311Bm(SEQ ID NO：61)引物和pfu DNA聚合酶(Promega，USA)进行PCR。将温度在94℃维持1分钟后，进行35轮反应，每个循环包括94℃30秒，55℃30秒，72℃1分钟。反应完成后，进行酚/氯仿处理来灭活酶，然后经乙醇沉淀回收DNA。用BamHI消化DNA，经2％琼脂糖凝胶电泳分离目标OST311 cDNA片段，然后用GeneClean II(BIO101，USA)回收。同时，用NdeI消化质粒载体pET3a(Novagen，USA)，然后用Klenow片段(Roche，Swiss)使之平端化。所述载体进一步用BamHI消化，经0.8％琼脂糖凝胶电泳分离所得质粒DNA片段，然后用Gene Clean II(BIO101，USA)回收。用DNA连接试剂盒版本2(TAKARA SHUZO，Japan)将得到的OST311cDNA片段连接到消化好的质粒pET3a上。然后将产物导入大肠杆菌DH5α进行克隆，提取质粒。测定质粒的核苷酸序列确保OST311 cDNA已经如期插入pET3a。该质粒命名为OST311/pET3a。
(2)用于在大肠杆菌中表达OST311的OST311/pET28载体的构建
合成以下引物。
OST311Nd：ATCATATGTATCCCAATGCCTCCCCACTG(SEQ ID NO：62)
OST311Not：ATGCGGCCGCCTAGATGAACTTGGCGAAGGG(SEQ ID NO：63)
用OST311/pET3a质粒为模板，OST311Nd(SEQ ID NO：62)和OST311Not(SEQ ID NO：63)引物和LA Taq(TAKARA SHUZO，Japan)进行PCR。将温度在94℃维持1分钟后，进行35轮反应，每个循环包括94℃30秒，55℃30秒，72℃1分钟。反应完成后，进行酚/氯仿处理来灭活酶，然后经乙醇沉淀回收扩增的DNA片断。用NdeI和NotI消化DNA，经2％琼脂糖凝胶电泳分离目标OST311 cDNA片段，然后用Gene Clean II(BIO101，USA)回收。同时，用NdeI和NotI消化质粒载体pET28(Novagen，USA)，然后用牛小肠碱性磷酸酶(TAKARASHUZO，Japan)去磷酸化。然后经0.8％琼脂糖凝胶电泳分离产物，然后用Gene Clean II(BIO101，USA)回收消化好的质粒。用DNA连接试剂盒版本2(TAKARA SHUZO，Japan)将得到的OST311cDNA连接到消化好的质粒pET28上。然后将连接产物导入大肠杆菌DH5α进行克隆，提取质粒。测定质粒的核苷酸序列确保能表达在N末端添加His标记序列的重组体OST311的OST311cDNA已经插入pET28。该质粒被命名为OST311/pET28。该载体编码的重组体His-OST311的氨基酸序列和核苷酸序列如图26所示。
(3)重组体His-OST311在大肠杆菌中的表达和制备
将质粒OST311/pET28导入大肠杆菌BL21(DE3)Codon PlusRP(STRATAGENE，USA)进行转化，然后获得克隆。将所得大肠杆菌克隆接种到100ml含有10mg卡那霉素(SIGMA，USA)的LB培养基中，于37℃培养过夜。将细菌细胞悬浮液接种1L LB培养基至A600＝0.1，然后用一个3L Sakaguchi瓶于37℃振荡培养。随时间测量培养液的光吸收。当达到A600＝0.6到1.0时，加入异丙基-1-硫代-β-半乳糖苷(IPTG)(Wako Pure Chemical Industries，Japan)至1mM。4小时后，离心(7700gx15分钟)回收细胞。将回收的细胞悬浮于20ml含有1mM DTT的0.1M Tris盐酸缓冲液(pH7.5)中，然后用FrenchPress破碎。将含有被破碎细胞的溶液离心(7700gx15分钟)，然后将沉淀悬浮在15ml 0.1M Tris盐酸缓冲液(pH7.5)中。向悬液中加入DNaseI(Roche，Swiss)至0.1mg/ml，然后在4℃振荡1小时。接下来，进行离心(23400gx15分钟)，然后收集包含体形式的沉淀组分。将所得包含体悬浮在10ml含有0.75M尿素和1％Triton-X的20mM Tris盐酸缓冲液(pH8)中以便洗涤，然后离心(23400gx15分钟)来收集沉淀。洗涤过程重复两次。
将洗好的包含体悬浮在5ml变性溶液(含有1mM DTT和6M盐酸胍的50mM磷酸缓冲液(pH8))中，然后在37℃振荡1小时使之溶解。经离心(23400gx15分钟)除去形成沉淀的不溶物，然后用含有6M盐酸胍的50mM磷酸缓冲液(pH6)平衡该溶液。将溶解好的样品上样到填充Ni-NTA Agrose(QIAGEN，Germany)的柱子，然后用含有6M盐酸胍的50mM磷酸缓冲液(pH6)洗。用含有500mM咪唑(NacalaiTesque，Japan)和6M盐酸胍的50mM磷酸缓冲液(pH4.5)洗脱吸附到柱子上的蛋白，从而纯化变性His-OST311。根据纯化样品在280nm的UV吸收得知其浓度，然后向样品中加入含有6M盐酸胍的50mM磷酸缓冲液(pH6)使终浓度为2mg/ml，从而制备到变性His-OST311的溶液。将半胱氨酸作为还原剂加入样品至终浓度1mM，用含有0.6M盐酸胍和0.1％Tween20的20mM磷酸缓冲液(pH6)稀释100倍以便重新折叠。保温在4℃进行3天或以上。
将重折叠溶液在4℃对0.1M醋酸盐缓冲液(pH4.8)进行透析。用超滤膜将透析过的重折叠溶液浓缩约10倍，然后用阳离子交换柱SP-5PW(TOSOH，Japan)经HPLC纯化。用含有甘油的20mM磷酸盐缓冲液(pH6)以0.5M到2M的线性NaCl梯度洗脱蛋白质。洗脱方式如图27所示。SDS-PAGE分析和质谱测量显示在洗脱下来的两类蛋白质峰中，His-OST311包含在较低盐浓度洗脱下来的峰中。如上所述，从大约1L培养细胞中可以制备约0.6mg最终的纯化产物，His-OST311。
(4)构建表达MK-OST311的pET22b-MK-OST311载体
合成以下引物。
OST311MK1：gaattcatatgaaatacccgaacgcttccccgctgctgggctccagctg(SEQ ID NO：64)
OST311MK2：cccaagcttgcggccgcctagatgaacttggc(SEQ ID NO：65)
用以上His-OST311表达质粒OST311/pET28作为模板，OST311MK1(SEQ ID NO：64)和OST311MK2(SEQ ID NO：65)作为引物，经PCR扩增靶序列。在通过该过程获得的OST311 cDNA中，启始密码子(ATG)后面的27个核苷酸已经转换为大肠杆菌的密码子。用QIAquick PCR纯化试剂盒(QIAGEN，Germany)纯化所述PCR产物，然后用限制酶NdeI(TAKARA SHUZO，Japan)和NotI(TAKARA SHUZO，Japan)于37℃消化1小时。消化好的PCR产物经琼脂糖电泳分离，然后用QIAquick PCR纯化试剂盒(QIAGEN，Germany)纯化。所得DNA片段用限制酶NdeI和NotI于37℃消化1小时，然后用DNA连接试剂盒Ver2(TAKARASHUZO，Japan)在16℃与经琼脂糖电泳分离和纯化的质粒载体pET22b(Novagen，USA)连接15分钟。将连接好的产物导入大肠杆菌JM109(TAKARA SHUZO，Japan)进行克隆，然后通过标准方法提取质粒。确定所得质粒的核苷酸序列以确保得到的OST311cDNA已经插入了pET22b载体。该质粒被命名为pET22-MK-OST311。该载体所编码的重组体MK-OST311的核苷酸序列和氨基酸序列如图26所示。
(5)MK-OST311在大肠杆菌中的表达和制备
将质粒pET22-MK-OST311导入大肠杆菌BL21(DE3)Codon PlusRP(STRATAGENE，USA)，然后获得转化克隆。将所得大肠杆菌克隆接种到含有10mg氨苄青霉素的100ml LB培养基中，然后于37℃培养过夜。将细菌的细胞悬浮液接种在1L LB培养基中至A600＝0.1，然后用一个3L Sakaguchi瓶于37℃震荡培养。向细菌细胞培养液中加入IPTG来诱导重组体的表达，然后通过与以上制备His-OST311的方法类似的方式制备包含体。
将洗过的包含体悬浮在5ml变性溶液(含有1mM DTT和6M盐酸胍的50mM磷酸盐缓冲液(pH8))中，然后将悬浮液在37℃震荡1小时使之溶解。用变性溶液将溶解好的产物稀释2倍，然后用含有0.6M盐酸胍和0.1％Tween20的20mM磷酸盐缓冲液稀释100倍使之开始重新折叠。在4℃温育3天或以上。已知在添加氧化剂和pH为7或以上的条件下，蛋白质会沉淀因此重折叠效率明显下降。将重折叠溶液在4℃对0.1M醋酸盐缓冲液(pH4.8)进行透析。用超滤膜将透析过的重折叠溶液浓缩约10倍，然后用阳离子交换柱SP-5PW(TOSOH，Japan)经HPLC纯化。用含有10％甘油的20mM磷酸盐缓冲液(pH6)以0.5M到2M的线性NaCl梯度洗脱蛋白质。如图28所示，有两个蛋白质洗脱峰，并且SDS-PAGE分析和质谱测定显示MK-OST311包含在较低盐浓度洗脱下来的峰中。这样从大约1L培养细胞中可以制备约0.6mg最终的纯化产物，MK-OST311。
(6)MK-OST311的PEG化
用10％乙酸将10ml经离子交换柱纯化的MK-OST311(0.05mg/ml)调节至pH4.8。向该溶液中边搅拌边加入25mg溶解在10mM醋酸缓冲液(pH4.8)中，分子量为20000的活化的PEG(Sharewater，USA)。15分钟后，将溶于10mM醋酸缓冲液(pH4.8)的1M氰基氢硼化钠(Nacalai Tesque，Japan)加入该溶液使终浓度为15mM，然后将溶液在4℃搅拌16小时。通过该反应PEG化的OST311用阳离子交换柱SP-5PW(TOSOH，Japan)经HPLC纯化。用含有10％甘油的20mM磷酸盐缓冲液(pH6)以0.5M到2M的线性NaCl梯度洗脱蛋白质。如图29所示，与MK-OST311相比，PEG化的MK-OST311洗脱为较低离子强度处的一个峰。
(7)His-OST311重组体活性的检测
为了检验纯化His-OST311重组体的生物活性，通过实施例24描述的方式经尾静脉将重组体蛋白质以4.5ug/0.1ml的剂量一次给予正常小鼠(5周龄，BALB/c，雄性，每组六只)。9个小时后，通过与实施例20所述类似的方法测量血清磷酸盐和1，25-二羟维生素D3水平。对一个阳性对照组进行了相同剂量得自CHO-OST311H细胞的纯化重组体的单次给药，还对一个载体给药组，以0.1ml每只的量进行了包括20mM磷酸盐缓冲液(pH6.9)和0.3M NaCl的载体单次给药，两组都是经尾静脉给药。
如图30A所示，给药9小时后与载体给药组相比，在His-OST311给药组中观察到明显的降低血清磷酸盐水平的效果。下降的程度与CHO产生的重组体蛋白给药组相当。此外，如图32所示，给药9小时后，His-OST311给药组中的血清1，25-二羟维生素D3水平也有显著下降。
如实施例24(3)和(4)所述，一次给予CHO细胞产生的OST311蛋白后4小时就观察到血清1，25-二羟维生素D3水平明显下降。在这个时间之前，给药后1小时，在肾脏中观察到25-羟基维生素D-1-α-羟化酶(1αOHase)表达下降，25-羟基维生素D-24-羟化酶(24OHase)表达增强。因此，将His-OST311以每只4.5ug/0.1ml经尾静脉一次给予BALB/c小鼠(5周龄，雄性)，然后在1和4小时后切除肾脏。通过Northern印迹法分析肾脏中1αOHase和24OHase的表达的变化。对一个阳性对照组进行了相同剂量得自CHO-OST311H细胞的纯化重组体的单次给药，还对一个载体给药组，以0.1ml每只的量进行了包括20mM磷酸盐缓冲液(pH6.9)和0.3M NaCl的载体单次给药，两组都是经尾静脉给药。如图31所示，与CHO产生的重组体类似，给药1小时后，His-OST311即导致1αOHase基因表达的下降和24OHase基因表达的增强。这揭示了His-OST311具有与CHO产生的重组体相当的活性，能调节维生素D代谢酶基因的表达。此外，如图32所示，给予所述重组体后4小时，血清1，25-二羟维生素D3水平显示中等下降，8小时显示更明显的下降。这揭示了该变化的方式与实施例24(3)描述的给予CHO产生的重组体实验中观察到的变化几乎是一致的。
由以上结果揭示出大肠杆菌产生的重组体His-OST311至少具有血清磷酸盐降低活性和维生素D代谢调节活性，这与CHO-OST311H细胞产生的分泌重组体的活性相当。
(8)PEG化MK-OST311的活性的检测
PEG化MK-OST311的生物活性的检测是通过将PEG化MK-OST311以每只5.0ug/0.1ml的量一次给予正常小鼠(5周龄，BALB/c，雄性，每组8只)，给药是以实施例24描述的方式经尾静脉进行的，然后通过与实施例20类似的方法在给药9后9小时测定血清磷酸盐水平。还对一个载体给药组，以0.1ml/鼠的量经尾静脉单次给予包括20mM PB(pH6.0)，10％甘油，1M NaCl和0.1％Tween的载体单次给药。给药后8小时，用玻璃毛细管从眼窝采血，然后测定得到的血清中的无机磷酸盐水平。如图30B所示，在PEG化MK-OST311给药组中观察到明显的降低血清磷酸盐水平的效果。这个结果揭示了大肠杆菌产生的重组体被PEG化时，其生物活性没有被抑制。
实施例28向切割位点导入氨基酸突变
正如实施例9所述，OST311在SEQ ID NO：2中的氨基酸残基179(Arg)和180(Ser)之间被切割。同时，在实施例19中证实，将OST311的176(Arg)和179(Ser)位氨基酸残基同时用Gln替代能抑制该切割。这些事实暗示了这样一种可能性，即该切割是由于某些识别包含相邻RXXR和RRXXR序列的基元的蛋白酶。而且，体内给予由SEQ ID NO：4所示多肽构成的全长重组体时，可能会发生与上述相同或类似的切割。因此，将SEQ ID NO：2的175到180位氨基酸残基分别以Ala，Gln和Trp替代，然后检验这些替代如何影响突变重组体在CHO细胞中的表达和分泌方式。
(1)切割位点突变的OST311基因的构建
合成以下引物。
pyh23PA1F  AACACCCCCATAGCACGGCGGCACA(SEQ ID NO：66)
pyh23PA1R  TGTGCCGCCGTGCTATGGGGGTGTT(SEQ ID NO：67)
pyh23RA1F  ACCCCCATACCAGCGCGGCACACCCG(SEQ ID NO：68)
pyh23RA1R  CGGGTGTGCCGCGCTGGTATGGGGGT(SEQ ID NO：69)
pyh23RA2F  CCCATACCACGGGCGCACACCCGGAG(SEQ ID NO：70)
pyh23RA2R  CTCCGGGTGTGCGCCCGTGGTATGGG(SEQ ID NO：71)
pyh23HA1F  ATACCACGGCGGGCCACCCGGAGCGC(SEQ ID NO：72)
pyh23HA1R  GCGCTCCGGGTGGCCCGCCGTGGTAT(SEQ ID NO：73)
pyh23TA1F  CCACGGCGGCACGCCCGGAGCGCCG(SEQ ID NO：74)
pyh23TA1R  CGGCGCTCCGGGCGTGCCGCCGTGG(SEQ ID NO：75)
pyh23RA3F  CGGCGGCACACCGCGAGCGCCGAGGA(SEQ ID NO：76)
pyh23RA3R  TCCTCGGCGCTCGCGGTGTGCCGCCG(SEQ ID NO：77)
pyh23SA1F  CGGCACACCCGGGCCGCCGAGGACGA(SEQ ID NO：78)
pyh23SA1R  TCGTCCTCGGCGGCCCGGGTGTGCCG(SEQ ID NO：79)
pyh23RKQ1F  ACCCCCATACCACAGCGGCACACCCG(SEQ ID NO：80)
pyh23RKQ1R  CGGGTGTGCCGCTGTGGTTGGGGGT(SEQ ID NO：81)
pyh23RKQ2F  CCCATACCACGGCAGCACACCCGGAG(SEQ ID NO：82)
pyh23RKQ2R  CTCCGGGTGTGCTGCCGTGGTATGGG(SEQ ID NO：83)
pyh23RKQ3F  CGGCGGCACACCCAGAGCGCCGAGGA(SEQ ID NO：84)
pyh23RKQ3R  TCCTCGGCGCTCTGGGTGTGCCGCCG(SEQ ID NO：85)
pyh23RWF  CGGCGGCACACCTGGAGCGCCGAGG(SEQ ID NO：86)
pyh23RWR  CCTCGGCGCTCCAGGTGTGCCGCCG(SEQ ID NO：87)
pyh23PA1F和pyh23PA1R是用于导入突变的正向和反向引物，其中以鸟嘌呤替换OST311 cDNA(SEQ ID NO：1)的第652胞嘧啶导致SEQID NO：2的氨基酸残基174(Pro)被Ala取代。以下，该突变称为P174A。
pyh23RA1F和pyh23RA1R是用于导入突变的正向和反向引物，其中分别以鸟嘌呤和胞嘧啶替换OST311 cDNA(SEQ ID NO：1)的655胞嘧啶和656鸟嘌呤导致SEQ ID NO：2的氨基酸残基175(Arg)被Ala取代。以下，该突变称为R175A。
pyh23RA2F和pyh23RA2R是用于导入突变的正向和反向引物，其中分别以鸟嘌呤和胞嘧啶替换OST311 cDNA(SEQ ID NO：1)的658胞嘧啶和659鸟嘌呤导致SEQ ID NO：2的氨基酸残基176(Arg)被Ala取代。以下，该突变称为R176A。
pyh23HA1F和pyh23HA1R是用于导入突变的正向和反向引物，其中分别以鸟嘌呤和胞嘧啶替换OST311 cDNA(SEQ ID NO：1)的661胞嘧啶和662腺嘌呤导致SEQ ID NO：2的氨基酸残基177(His)被Ala取代。以下，该突变称为H177A。
pyh23TA1F和pyh23TA1R是用于导入突变的正向和反向引物，其中以鸟嘌呤替换OST311 cDNA(SEQ ID NO：1)的664腺嘌呤导致SEQ IDNO：2的氨基酸残基178(Thr)被Ala取代。以下，该突变称为T178A。
pyh23RA3F和pyh23RA3R是用于导入突变的正向和反向引物，其中分别以鸟嘌呤和胞嘧啶替换OST311 cDNA(SEQ ID NO：1)的667胞嘧啶和668鸟嘌呤导致SEQ ID NO：2的氨基酸残基179(Arg)被Ala取代。以下，该突变称为R179A。
pyh23SA1F和pyh23SA1R是用于导入突变的正向和反向引物，其中分别以鸟嘌呤和胞嘧啶替换OST311 cDNA(SEQ ID NO：1)的670腺嘧啶和671鸟嘌呤导致SEQ ID NO：2的氨基酸残基180(Ser)被Ala取代。以下，该突变称为S180A。
pyh23RKQ1F和pyh23RKQ1R是用于导入突变的正向和反向引物，其中以腺嘌呤替换OST311 cDNA(SEQ ID NO：1)的656鸟嘌呤导致SEQID NO：2的氨基酸残基175(Arg)被Gln取代。以下，该突变称为R175Q。
pyh23RKQ2F和pyh23RKQ2R是用于导入突变的正向和反向引物，其中以腺嘌呤替换OST311 cDNA(SEQ ID NO：1)的659鸟嘌呤导致SEQID NO：2的氨基酸残基176(Arg)被Gln取代。以下，该突变称为R176Q。
pyh23RKQ3F和pyh23RKQ3R是用于导入突变的正向和反向引物，其中以腺嘌呤替换OST311 cDNA(SEQ ID NO：1)的668鸟嘌呤导致SEQID NO：2的氨基酸残基179(Arg)被Gln取代。以下，该突变称为R179Q。
pyh23RWF和pyh23RWR是用于导入突变的正向和反向引物，其中以胸腺嘧啶替换OST311 cDNA(SEQ ID NO：1)的659胞嘧啶导致SEQ IDNO：2的氨基酸残基179(Arg)被Trp取代。以下，该突变称为R179W。
(1)-1 OST311P174AH基因的构建
用Pyrobest DNA聚合酶(TAKARA SHUZO，Japan)根据所附的厂商说明制备两种反应液(各100ul)。一种反应液，OST311ME1(SEQ IDNO：45)和pyh23PA1F(SEQ ID NO：66)用作引物，终浓度为0.2uM，对于另一种反应液，pyh23PA1R(SEQ ID NO：67)和OST311HNt(SEQ IDNO：46)作为引物，终浓度为0.2uM。向每种反应液中加入10ng实施例19(1)描述的OST311/pCAGGS质粒作为模板，然后将反应液在94℃维持1分钟。然后进行40轮PCR反应，每个循环包括94℃20秒，55℃30秒，72℃1分钟。将这两种反应液分别稀释10倍，然后备取1ul加入100ul根据Pyrobest DNA聚合酶(TAKARA SHUZO，Japan)所附的文件制备的反应液中。加入OST311ME1(SEQ ID NO：45)和OST311HNt(SEQ ID NO：46)至终浓度为0.2uM作为引物，然后将溶液在94℃维持1分钟。然后进行30轮PCR反应，每个循环包括94℃20秒，55℃30秒，72℃1分30秒。PCR反应后，将溶液继续在72℃保持7分钟。用Gene Clean II(BIO101，USA)根据所附的厂商说明收集这样得到的反应产物。然后用EcoRI和NotI消化产物，然后进行2％琼脂糖凝胶电泳来分离大约800bp的DNA片段。用Gene CleanII(BIO101，USA)收集该片段。将得到的DNA片段插入pEAK8载体(EdgeBio，USA)的EcoRI和NotI位点，从而得到质粒OST311P174AH-pEAK8。按照标准方法制备质粒DNA，用ABI3700荧光DNA测序仪(PE Applied Systems，USA)确定其核苷酸序列。这样证实了突变P174H以被导入。并且，还证实了在C-末端添加了一个组氨酸标记。由含有此处导入的P174A的突变基因编码的多肽称为OST311P174AH。
(1)-2 OST311R175AH基因的制备
用pyh23RA1F(SEQ ID NO：68)和pyh23RA1R(SEQ ID NO：69)作为引物，通过与(1)-1类似的方法制备OST311R175AH基因。
(1)-3 OST311R176AH基因的制备
用pyh23RA2F(SEQ ID NO：70)和pyh23RA2R(SEQ ID NO：71)作为引物，通过与(1)-1类似的方法制备OST311R176AH基因。
(1)-4OST311H177AH基因的制备
用pyh23HA1F(SEQ ID NO：72)和pyh23HA1R(SEQ ID NO：73)作为引物，通过与(1)-1类似的方法制备OST311H177AH基因。
(1)-5 OST311T178AH基因的制备
用pyh23TA1F(SEQ ID NO：74)和pyh23TA1R(SEQ ID NO：75)作为引物，通过与(1)-1类似的方法制备OST311T178AH基因。
(1)-6 OST311R179AH基因的制备
用pyh23RA3F(SEQ ID NO：76)和pyh23RA3R(SEQ ID NO：77)作为引物，通过与(1)-1类似的方法制备OST311R179AH基因。
(1)-7 OST311S180AH基因的制备
用pyh23SA1F(SEQ ID NO：78)和pyh23SA1R(SEQ ID NO：79)作为引物，通过与(1)-1类似的方法制备OST311S180AH基因。
(1)-8 OST311R175QH基因的制备
用pyh23RKQ1F(SEQ ID NO：80)和pyh23RKQ1R(SEQ ID NO：81)作为引物，通过与(1)-1类似的方法制备OST311R175QH基因。
(1)-9 OST311R176QH基因的制备
用pyh23RKQ2F(SEQ ID NO：82)和pyh23RKQ2R(SEQ ID NO：83)作为引物，通过与(1)-1类似的方法制备OST311R176QH基因。
(1)-10 OST311R179QH基因的制备
用pyh23RKQ3F(SEQ ID NO：84)和pyh23RKQ3R(SEQ ID NO：85)作为引物，通过与(1)-1类似的方法制备OST311R179QH基因。
(1)-11 OST311R179WH基因的制备
用pyh23RWF(SEQ ID NO：86)和pyh23RWR(SEQ ID NO：87)作为引物，通过与(1)-1类似的方法制备OST311R179WH基因。
(2)切割位点突变的OST311基因的瞬时表达和调节培养基的制备
将pEAK快速细胞(EdgeBiosystems，USA)接种到12孔板。按照pEAK系统(EdgeBiosystems，USA)所附的文件通过磷酸钙法将以上突变体OST311的11种表达质粒转染细胞。将细胞放置4小时，用1.5ml无血清MEMα培养基替换培养基，将细胞在37℃培养2天，然后收集条件培养基。
(3)切割位点突变的OST311基因的表达的评估
将得到的条件培养基以实施例6(3)描述的类似方式进行Western印迹，然后检验条件培养基中是否存在切割位点突变的OST311重组体。实施例22中描述的OST311特异多克隆抗体，311-148用于检测。因此，如图33所示，与野生型类似，在氨基酸残基174到180发生的取代中，导入突变P174A，R175A，R175Q，H177A，T178A或S180A的OST311重组体在大约16kDa均观察到一个含有SEQ ID NO：6所示多肽的降解产物。但是，在导入突变R176A，R179A，R176Q，R179A或R179W的OST311重组体中没有观察到降解产物。这些结果暗示了，特别是氨基酸残基176(Arg)和179(Arg)对发生在氨基酸残基179(Arg)和180(Ser)之间的切割起着重要作用。这就是说，至少用Ala，Gln或Trp中的任何氨基酸取代这两个残基时，能够消除或抑制切割。因此，利用这个发现能促进全长多肽的产量。
实施例29
如实施例6所示，在通过在CHO细胞或COS细胞中表达OST311得到的重组体产物在位于实施例9所示的RXXR基元后面的179(Arg)和180(Ser)氨基酸残基之间被切割。实施例18清楚地显示了，OST311蛋白的低磷酸盐血症诱发活性保留在该位点没有切割的全长蛋白质中。此外，从实施例19和28所示的突变导入实验可以清楚的看到RXXR基元参与了该切割。为了有效地产生和获得重组体OST311，避免该切割是一个重要课题，如实施例28所示在RXXR基元中导入突变是有效的方法之一。弗林蛋白酶是已知识别RXXR基元的一个蛋白酶。该酶位于高尔基体外侧，被认为是通过在分泌过程中识别RXXR基元来切割翻译后蛋白质。
(1)弗林蛋白酶参与OST311的切割
用Transfectum(Promega，USA)将OST311/pCAGGS质粒导入弗林蛋白酶缺陷的LoVo细胞。然后将该细胞培养8天。用311-148抗体通过Western印迹分析瞬时表达并分泌到培养液中的OST311蛋白时，没有检测到被切割过的产物。这个结果表明产生OST311时，弗林蛋白酶参与了观察到OST311的切割。
(2)避免OST311的切割
由以上结果推断，抑制弗林蛋白酶的活性能有效地促进在氨基酸179(Arg)和180(Ser)之间没有切割的OST311的产量。与此相应，可以想见，在诸如LoVo细胞等没有弗林蛋白酶活性的宿主中表达OST311，或者在通过加入弗林蛋白醇抑制剂来抑制弗林蛋白酶活性的条件下。为了抑制CHO-OST311H细胞的弗林蛋白酶活性，按照Benjannet S等报道的方法(J Biol Chem 272：26210-8，1997)瞬时表达α1-抗胰蛋白酶Portland(α1-PDX)，然后收集条件培养基。与没有该基因的对照CHO-OST311H细胞的条件培养基相比，重组体产物中的全长多肽比率提高。相应地，可以得出结论，可以通过外部或内在地引入抑制弗林蛋白酶活性的物质来提高全长OST311蛋白的生产效率。
文中引用的所有出版物，专利和专利申请均全文引入本申请。
工业应用
根据本发明，提供了一种调节磷酸盐代谢，钙代谢和/或钙化的多肽，编码该多肽的DNA，含有所述多肽为活性成分的药物组合物，识别所述多肽的抗体，含有该抗体作为活性成分的药物组合物，利用该抗体的诊断方法以及诊断组合物。
                       序列说明
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序列表
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Claims (17)

1.一种编码以下多肽(a)，(b)，(c)或(d)的DNA：
(a)由SEQ ID NO：2或4所示氨基酸序列组成的多肽
(b)由SEQ ID NO：2或4所示氨基酸序列经缺失，取代或添加1或几个氨基酸得到的氨基酸序列组成的多肽，并且该多肽具备低磷酸盐血症诱导活性，磷酸盐转运抑制活性，钙化抑制活性或者调节体内维生素D代谢的活性，
(c)由SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的部分序列组成的多肽，其中上述部分序列含有以上氨基酸序列中的至少第34到第201位氨基酸，或者
(d)由SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的部分序列组成的多肽，其中上述部分序列：
(i)含有所述氨基酸序列中第34位到第201氨基酸的氨基酸序列，
(ii)由所述部分序列经缺失，取代或添加1或几个氨基酸得到的氨基酸序列组成，以及
(iii)具有低磷酸盐血症诱导活性，磷酸盐转运抑制活性，钙化抑制活性或者体内维生素D代谢调控活性。
2.一种DNA，其含有以下DNA(e)或(f)：
(e)由SEQ ID NO：1所示核苷酸序列中从核苷酸133到885位的核苷酸序列组成的DNA，或者由SEQ ID NO：3所示核苷酸序列中从核苷酸1到681位的核苷酸序列组成的DNA，或者
(f)在严谨条件下与探针杂交，并编码具有低磷酸盐血症诱导活性，磷酸盐转运抑制活性，钙化抑制活性或者体内维生素D代谢调节活性的多肽的DNA，所述探针由SEQ ID NO：1或3所示核苷酸序列的全部或部分组成的DNA制得。
3.一种重组体载体，其含有权利要求1或2的DNA。
4.一种转化子，其含有权利要求3的重组体载体。
5.一种药物组合物，其包含以下多肽(a)，(b)，(c)，(d)或(m)作为活性成分，并且能有效地抵制选自高磷酸盐血症，甲状旁腺功能亢进，肾性骨营养不良，异位钙化，骨质疏松和维生素D过多症的至少一种症状，
(a)由SEQ ID NO：2或4所示氨基酸序列组成的多肽；
(b)由SEQ ID NO：2或4所示氨基酸序列经缺失，取代或添加1或几个氨基酸得到的氨基酸序列组成的多肽，并且该多肽具备低磷酸盐血症诱导活性，磷酸盐转运抑制活性，钙化抑制活性或者调节体内维生素D代谢的活性，
(c)由SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的部分序列组成的多肽，其中上述部分序列含有以上氨基酸序列中的至少第34到第201位氨基酸，或者
(d)由SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的部分序列组成的多肽，其中上述部分序列：
(i)由从以上氨基酸序列中第34位到第201氨基酸的氨基酸序列组成，
(ii)由所述部分序列经缺失，取代或添加1或几个氨基酸得到的氨基酸序列组成，以及
(iii)具有低磷酸盐血症诱导活性，磷酸盐转运抑制活性，钙化抑制活性或者体内维生素D代谢调节活性
(m)经下述物质修饰的上述(a)-(d)的多肽，所述的物质为选自聚乙二醇，葡聚糖，聚(N-乙烯-吡咯烷酮)，聚丙二醇均聚物，聚丙烯氧化物和聚乙烯氧化物的共聚物，聚氧乙基化多元醇和聚乙烯醇中的至少一种。
6.一种制备抗体的方法，该方法包括以多肽(a)，(b)，(c)，(d)或(m)，或其部分片段为抗原免疫动物的步骤
(a)由SEQ ID NO：2或4所示氨基酸序列组成的多肽；
(b)由SEQ ID NO：2或4所示氨基酸序列经缺失，取代或添加1或几个氨基酸得到的氨基酸序列组成的多肽，并且该多肽具备低磷酸盐血症诱导活性，磷酸盐转运抑制活性，钙化抑制活性或者调节体内维生素D代谢的活性，
(c)由SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的部分序列组成的多肽，其中上述部分序列含有以上氨基酸序列中的至少第34到第201位氨基酸，或者
(d)由SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的部分序列组成的多肽，其中上述部分序列：
(i)由从以上氨基酸序列中第34位到第201氨基酸的氨基酸序列组成，
(ii)由所述部分序列经缺失，取代或添加1或几个氨基酸得到的氨基酸序列组成，以及
(iii)具有低磷酸盐血症诱导活性，磷酸盐转运抑制活性，钙化抑制活性或者体内维生素D代谢调节活性
(m)经下述物质修饰的上述(a)-(d)的多肽，所述的物质为选自聚乙二醇，葡聚糖，聚(N-乙烯-吡咯烷酮)，聚丙二醇均聚物，聚丙烯氧化物和聚乙烯氧化物的共聚物，聚氧乙基化多元醇和聚乙烯醇中的至少一种。
7.一种药物组合物，其包含与下述多肽(a)，(b)，(c)，(d)或(m)，或其部分片段反应的抗体作为活性成分，
(a)由SEQ ID NO：2或4所示氨基酸序列组成的多肽；
(b)由SEQ ID NO：2或4所示氨基酸序列经缺失，取代或添加1或几个氨基酸得到的氨基酸序列组成的多肽，并且该多肽具备低磷酸盐血症诱导活性，磷酸盐转运抑制活性，钙化抑制活性或者调节体内维生素D代谢的活性，
(c)由SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的部分序列组成的多肽，其中上述部分序列含有以上氨基酸序列中的至少第34到第201位氨基酸，或者
(d)由SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的部分序列组成的多肽，其中上述部分序列：
(i)由从以上氨基酸序列中第34位到第201氨基酸的氨基酸序列组成，
(ii)由所述部分序列经缺失，取代或添加1或几个氨基酸得到的氨基酸序列组成，以及
(iii)具有低磷酸盐血症诱导活性，磷酸盐转运抑制活性，钙化抑制活性或者体内维生素D代谢调节活性
(m)经下述物质修饰的上述(a)-(d)的多肽，所述的物质为选自聚乙二醇，葡聚糖，聚(N-乙烯-吡咯烷酮)，聚丙二醇均聚物，聚丙烯氧化物和聚乙烯氧化物的共聚物，聚氧乙基化多元醇和聚乙烯醇中的至少一种。
8.一种药物组合物，其包含与下述多肽(a)，(b)，(c)，(d)或(m)，或其部分片段反应的抗体作为活性成分，并且能调节体内钙代谢，磷酸盐代谢，钙化或者维生素D代谢，
(a)由SEQ ID NO：2或4所示氨基酸序列组成的多肽；
(b)由SEQ ID NO：2或4所示氨基酸序列经缺失，取代或添加1或几个氨基酸得到的氨基酸序列组成的多肽，并且该多肽具备低磷酸盐血症诱导活性，磷酸盐转运抑制活性，钙化抑制活性或者调节体内维生素D代谢的活性，
(c)由SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的部分序列组成的多肽，其中上述部分序列含有以上氨基酸序列中的至少第34到第201位氨基酸，或者
(d)由SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的部分序列组成的多肽，其中上述部分序列：
(i)由从以上氨基酸序列中第34位到第201氨基酸的氨基酸序列组成，
(ii)由所述部分序列经缺失，取代或添加1或几个氨基酸得到的氨基酸序列组成，以及
(iii)具有低磷酸盐血症诱导活性，磷酸盐转运抑制活性，钙化抑制活性或者体内维生素D代谢调节活性
(m)经下述物质修饰的上述(a)-(d)的多肽，所述的物质为选自聚乙二醇，葡聚糖，聚(N-乙烯-吡咯烷酮)，聚丙二醇均聚物，聚丙烯氧化物和聚乙烯氧化物的共聚物，聚氧乙基化多元醇和聚乙烯醇中的至少一种。
9.一种药物组合物，其包含与下述多肽(a)，(b)，(c)，(d)或(m)，或其部分片段反应的抗体作为活性成分，并且能有效地抵制骨骼疾病，
(a)由SEQ ID NO：2或4所示氨基酸序列组成的多肽；
(b)由SEQ ID NO：2或4所示氨基酸序列经缺失，取代或添加1或几个氨基酸得到的氨基酸序列组成的多肽，并且该多肽具备低磷酸盐血症诱导活性，磷酸盐转运抑制活性，钙化抑制活性或者调节体内维生素D代谢的活性，
(c)由SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的部分序列组成的多肽，其中上述部分序列含有以上氨基酸序列中的至少第34到第201位氨基酸，或者
(d)由SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的部分序列组成的多肽，其中上述部分序列：
(i)由从以上氨基酸序列中第34位到第201氨基酸的氨基酸序列组成，
(ii)由所述部分序列经缺失，取代或添加1或几个氨基酸得到的氨基酸序列组成，以及
(iii)具有低磷酸盐血症诱导活性，磷酸盐转运抑制活性，钙化抑制活性或者体内维生素D代谢调节活性
(m)经下述物质修饰的上述(a)-(d)的多肽，所述的物质为选自聚乙二醇，葡聚糖，聚(N-乙烯-吡咯烷酮)，聚丙二醇均聚物，聚丙烯氧化物和聚乙烯氧化物的共聚物，聚氧乙基化多元醇和聚乙烯醇中的至少一种。
10.权利要求9的药物组合物，其中所述骨骼疾病是骨质疏松，抗维生素D佝偻病，肾性骨营养不良，透析相关性骨骼疾病，钙化不全骨病，佩吉特病和肿瘤诱导性骨软化症中的至少一种疾病。
11.一种诊断剂，其包含与下述多肽(a)，(b)，(c)，(d)或(m)，或其部分片段反应的抗体作为活性成分，其用于导致异常钙代谢，异常磷酸盐代谢，异常钙化和异常维生素D代谢中的至少一种异常的疾病，
(a)由SEQ ID NO：2或4所示氨基酸序列组成的多肽；
(b)由SEQ ID NO：2或4所示氨基酸序列经缺失，取代或添加1或几个氨基酸得到的氨基酸序列组成的多肽，并且该多肽具备低磷酸盐血症诱导活性，磷酸盐转运抑制活性，钙化抑制活性或者调节体内维生素D代谢的活性，
(c)由SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的部分序列组成的多肽，其中上述部分序列含有以上氨基酸序列中的至少第34到第201位氨基酸，或者
(d)由SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的部分序列组成的多肽，其中上述部分序列：
(i)由从以上氨基酸序列中第34位到第201氨基酸的氨基酸序列组成，
(ii)由所述部分序列经缺失，取代或添加1或几个氨基酸得到的氨基酸序列组成，以及
(iii)具有低磷酸盐血症诱导活性，磷酸盐转运抑制活性，钙化抑制活性或者体内维生素D代谢调节活性
(m)经下述物质修饰的上述(a)-(d)的多肽，所述的物质为选自聚乙二醇，葡聚糖，聚(N-乙烯-吡咯烷酮)，聚丙二醇均聚物，聚丙烯氧化物和聚乙烯氧化物的共聚物，聚氧乙基化多元醇和聚乙烯醇中的至少一种。
12.权利要求11的诊断试剂，其中所述骨骼疾病是肾衰竭，肾磷酸盐渗漏，肾小管酸中毒和范科尼综合征的盐中的至少一种疾病。
13.一种用于骨骼疾病的诊断试剂，其包含与下述多肽(a)，(b)，(c)，(d)或(m)，或其部分片段反应的抗体，
(a)由SEQ ID NO：2或4所示氨基酸序列组成的多肽；
(b)由SEQ ID NO：2或4所示氨基酸序列经缺失，取代或添加1或几个氨基酸得到的氨基酸序列组成的多肽，并且该多肽具备低磷酸盐血症诱导活性，磷酸盐转运抑制活性，钙化抑制活性或者调节体内维生素D代谢的活性，
(c)由SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的部分序列组成的多肽，其中上述部分序列含有以上氨基酸序列中的至少第34到第201位氨基酸，或者
(d)由SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的部分序列组成的多肽，其中上述部分序列：
(i)由从以上氨基酸序列中第34位到第201氨基酸的氨基酸序列组成，
(ii)由所述部分序列经缺失，取代或添加1或几个氨基酸得到的氨基酸序列组成，以及
(iii)具有低磷酸盐血症诱导活性，磷酸盐转运抑制活性，钙化抑制活性或者体内维生素D代谢调节活性
(m)经下述物质修饰的上述(a)-(d)的多肽，所述的物质为选自聚乙二醇，葡聚糖，聚(N-乙烯-吡咯烷酮)，聚丙二醇均聚物，聚丙烯氧化物和聚乙烯氧化物的共聚物，聚氧乙基化多元醇和聚乙烯醇中的至少一种。
14.权利要求13的诊断试剂，其中所述骨骼疾病是骨质疏松，抗维生素D佝偻病，肾性骨营养不良，透析相关性骨骼疾病，钙化不全骨病，佩吉特病和肿瘤诱导性骨软化症中的至少一种异常的疾病。
15.一种诊断试剂，其含有具有SEQ ID NO：11所示核苷酸序列的DNA或其片段，并且用于导致异常钙代谢，异常磷酸盐代谢和异常钙化中的至少一种异常的疾病。
16.权利要求15的诊断试剂，其中所述部分片段具有SEQ IDNO：11所示核苷酸中核苷酸498到12966之序列。
17.权利要求15或16的诊断试剂，其中所述疾病是常染色体显性的血磷酸盐过少性佝偻病/骨软化症。
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