JPH05503842A

JPH05503842A - モノクローナル抗体、ハイブリドーマおよびそれらの用途

Info

Publication number: JPH05503842A
Application number: JP3501880A
Authority: JP
Inventors: 香西　義雄; 晃堀; 市森　有三
Original assignee: 武田薬品工業株式会社
Priority date: 1989-12-27
Filing date: 1990-12-27
Publication date: 1993-06-24
Also published as: EP0507948A1; WO1991009875A1; CA2069872A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】モノクローナル抗体、ハイブリドーマおよびそれらの用途垣血圀団本発明は塩基性線維芽細胞増殖因子（本明細書において、ｂＦＧＦと略称することがある。）蛋白質の生物活性を中和し、高感度にｂＦＧＦ蛋白質と結合するモノクローナル抗体、ハイブリドーマ、それらの製造法およびそれらの用途に関する。

背見且羽塩基性線維芽細胞増殖因子は分子量約１７．０００のヘパリン結合性の塩基性ポリペプチドホルモンであるＣＤ、　Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚ　；ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）　２４９：１２３　（＋９７４））。現在、ｂＦＧＦは中胚葉系への分化因子として、中胚葉由来の殆んどの細胞への増殖因子として作用していると考えられている。例えば神経細胞の増殖を誘導する。例えば血管内皮細胞の増殖を誘導し、血管新生を引き起こす。例えば癌細胞の増殖を誘導する。したがって、ｂＦＧＦはこれらの作用と相まって腫瘍などの疾病と関与している。それらの治療薬の一つとしてｂＦＧＦの活性を阻害するモノクローナル抗体が考えられるが、現在までその可能性は、認められていない。また、それらの疾病を診断する手段の一つとして血中ｂＦＧＦＷ度を測定することが考えられるが、現在までの方法ひは高感度にｂＦＧＦを検出することが不可能である。

ｂＦＧＦは、癌などの疾病と関与しており、したがって、ｂＦＧＦの癌細胞への増殖促進活性を阻害することがこれらの治療薬となる可能性がある。

また、ｂＦＧＦは、それ自体が創傷、火傷の際の治療薬となる可能性がある。この際、ｂＦＧＦを医薬品として開発する上でｂＦＧＦを定量することは不可欠となる。さらに、癌などのｂＦＧＦに起因する疾病においても血中ｂＦＧＦ量を追跡することによって該疾病を診断することが可能となる。

ｂＦＧＦは、血管内皮細胞間に存在するヘパラン硫酸に吸着するため血中には微量にしか存在せず、より感度の高い測定法が必要となる。

凡皿五皿ヱ上記実状にかんがみ、本発明者らは高感度のｂＦＧＦ蛋白質の測定を可能ならしめ、かつｂＦＧＦ蛋白質の作用を免疫的に中和するモノクローナル抗体を作製し、これに基づいてさらに研究した結果、本発明を完成した。

本発明は、（１）、次の性質を有し、ｂＦＧＦ蛋白質の作用を免疫的に中和し、高感度にｂＦＧＦ蛋白質と結合するモノクローナル抗体：（ａ）分子量：約１４０，０００〜１６０，０００（ｂ）酸性線維芽細胞増殖因子と交差反応しない。

（Ｃ）免疫グロブリングラスがＩｇＧ、に属する。

（ｄ）　ｒｈｂＦＧＦムティンＣ５２３（ｂｂＦＧＦ中７０位中上０位８位のシスティンがセリンで置換されているムティン）に結合する。

（ｅ）　２ｒ＋ｇ／ｎｉＡ　ｂＦＧＦ存在下におけるヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥ）の増殖を、５０ｎｇ／ｍ　Ｑ添加により完全に抑制する。

（ｆ）モノクローナル抗体ＭｏＡｂ１２（固相）とペルオキシダーゼ標識化抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法により、、　２０ｐｇ／ｍＱのｂＦＧＦ蛋白質を定量できる。

（２）　ｂＦＧＦの少なくとも一個のシスティンがセリンで置換されているムティンで免疫した哺乳動物の肺臓細胞と、同種または異種のリンパ球様細胞とからなるクローン化されたハイブリドーマ、（３）　ｂＦＧＦの少なくとも一個のシスティンがセリンで置換されているムティンで免疫しだ哺乳動物の肺臓細胞と、同種または異種のリンパ球種細胞とを細胞融合し、クローニングすることを特徴とする該肺臓細胞と該リンパ球様細胞とからなるクローン化されたハイブリドーマの製造法、（４）　ｂＦＧＦの少なくとも一個のシスティンがセリンで置換されているムティンで免疫した哺乳動物の肺臓細胞と、同種または異種のリンパ球様細胞とからなるクローン化されたハイブリドーマを液体培地中または哺乳動物の腹腔内で増殖し、モノクローナル抗体を生成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする上記（１）項記載のモノクローナル抗体の製造法、（５）上記（１）項記載のモノクローナル抗体を用いることを特徴とするｂＦＧＦ蛋白質の精製法、および（６）上記（１）項記載のモノクローナル抗体を用いることを特徴とするｂＦＧＦ蛋白質の検出、定量法である。

図面の簡単な説明第１図は、参考例１で用いられた、ヒトａ、　Ｆ　Ｇ　ＦのｃＤＮＡ配列を示す。

第２図は、参考例１で得られた、プラスミドｐＴＢ９７５の構築図を示す。

第３図は、参考例１で得られた、溶出パターンを示す。

第４図は、参考例１で得られた、溶出パターンを示す。

第５図は、参考例１で得られた、溶出パターンを示す。

第６図は、実施例４で得られた、本発明のモノクローナル抗体３Ｈ３抗体のｒｈｂＦＧＦムティンＣ５２３に対する結合性を示すグラフである。

第７図は、実施例６で得られた、本発明のモノクローナル抗体３Ｈ３抗体のヒトｂＦＧＦ中和活性を示すグラフである。

第８（ａ）図および８（ｂ）図は、実施例６で得られた、本発明のモノクローナル抗体３Ｈ３抗体の、ＨＵＶＥ細胞の増殖阻害効果を示すグラフであり、第８　（ａ）図は３日間培養、第８（ｂ）図は５日間培養のものである。

第９図は、実施例９で得られた、ｈｂＦＧＦの濃度と吸光度との関係を示すグラフである。

第１０図は、実施例１Ｏで得られた、ｈｂＦＧＦ測定系でのヘパリンの影響をみたグラフであり、第１０図−（１）はＭＡｂ１２を固相化した場合であり、第１Ｏ図−（２）はＭＡｂ５２と責Ａｂ９８の等量混合物を固相化した場合である。

第１１図は、実施例１１で得られた、ｈｂＦＧＦ測定系における酸変性ｈｂＦＧＦの反応をみたグラフであり、第１１図−（１）はＭＡｂ１２を固相化した場合であり、第１１図−（２）はＭＡｂ５２とＭＡｂ９８の等量混合物を固相化した場合である。

第１２図は、実施例１３で得られた本発明抗体の抗腫瘍効果を見たグラフである。

第１３図は、参考例２で得られた、プラスミドｐＴＢｌｏｏｏの構築図である。

且五ム韮胆ｆｌ監本発明のｂＦＧＦ蛋白質としては、ｂＦＧＦおよびｂＦＧＦの少なくとも一個のシスティンがセリンで置換されているムティンであってｂＦＧＦ活性を有するものが挙げられる。

該ｂＦＧＦ蛋白質としては、式％式％で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドが好ましい。

本発明のｂＦＧＦとしては、哺乳動物由来のものが挙げられる。該哺乳動物としては、ヒト、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマなどが挙げられる。

また該ｂＦＧＦとして、脳や下垂体などの既にその存在が明らかにされている各種臓器から抽出されるものが挙げられる。

また該ｂＦＧＦ蛋白質としては１組み換えＤ　Ｎ　Ａ技術により製造されたものでもよい。

ｂＦＧＦのアミノ酸配列としては、次のものが例として挙げられる。

Ｐｒｏ−Ａ　１ａ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇ　１ｕ−Ａ　ｓｐ　−Ｇ　１ｙ−Ｇ　１ｙ−５ｅｒ−Ｇ　１ｙ−Ａ　ｌ　ａ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｐ　窒潤|Ｇ１．ｙ− Ｈｉ　ｓ　−Ｐｈｅ　−Ｌｙｓ　−Ａ　５ｐ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａ　ｒｇ−Ｌｅｕ　−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ　−Ｌｙｓ　−Ａ　ｓｎ　−Ｇ　１ｙ|Ｇ　１ｙ−Ｐｈｅ　− Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−１１ｅ−Ｈｉ　５−Ｐｒｏ−Ａ　５ｐ−Ｇ　Ｉｙ−Ａｒｇ−Ｖａ　ｌ　−Ａ　５ｐ−Ｇｌｙ−Ｖａ　ｌ　−Ａ　ｒ■|Ｇｌ　ｕ− Ｌｙｓ−５ｅｒ−Ａ　５ｐ−Ｐｒｏ−Ｈ１ｓ−１１ｅ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇ　１　ｎ−Ｌｅｕ−Ｇ　Ｉｎ−Ａ　ｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｒ■| Ｇ　］、ｙ−Ｖａ　ｌ　−Ｖａ　ｌ−５ｅｒ−１１ｅ−Ｌｙｓ　−Ｇ　１ｙ−Ｖａｌ　−Ｃｙｓ　−Ａ　ｌ　ａ−Ａｓｎ−Ａ　ｒｇ−Ｔｙｒ|Ｌｅｕ−Ａ　１　ａ− Ｍｅ　ｔ　−Ｌｙｓ　−Ｇ　１．ｕ−Ａｓｐ−Ｇ　ｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ　−Ａ　Ｉａ−５ｅｒ−Ｌｙｓ　−Ｃｙｓ　−Ｖａ　１−sｈｒ−Ａ　５ｐ− Ｇ　１ｕ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇ　ｌｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇ　ｌ　ｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ａ　ｓｎ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｔｈ秩| Ｔｙｒ−Ａｒｇ−３ｅｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｘ　−５ｅｒ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｙ　−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇ１．ｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−１１，ｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ− Ｍｅｔ−５ｅｒ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−５ｅｒ　（Ｉ［）〔式中、ＸはＴｈｒまたはＳｅｒを示し、ＸがＴｈｒのときＹはＳｅｒを、ＸがＳｅｒのときＹはＰｒｏをそれぞれ示す１゜ｂＦＧＦとしてはヒトｂＦＧＦが好ましい。ヒトｂＦＧＦのアミノ酸配列は、上記式（ＩＩ）において、ＸがＴｈｒでありＹがＳｅｒである。

上記ｂＦＧＦの少なくとも一個のシスティンがセリンで置換されているムティンとしては、たとえば５ｅｎｏら、バイオフィジカルバイオケミカルリサーチコミュニケーション（Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、　Ｃｏ１ｎ＋ｕｎ、珪旦、　７０１（１９８８）、ヨーロッパ特許出願公開第２８１，８２２号公報に記載されたそれらが挙げられる。

なかでも、ヒトｂＦＧＦの７０位および８８位のシスティンがそれぞれセリンで置換されているリコンビナントヒトｂＦＧＦムティンＣ５２３（以下、ｒｈｂＦＧＦムティンＣＳ２３と略称することもある。）が好ましい。なお、該アミノ酸の位置の番号は、前記式（ｎ）においてＸがＴｈｒでありＹがＳｅｒであるペプチドのＮ末端にＮｅｔが付加したアミノ酸において、該Ｍｅｔを第１番目として数えるものとする。

上記遺伝子工学的手法で製造されたｂＦＧＦにおいてヒトｂＦＧＦの例としては、たとえばフェブスレターズ（ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ）、２１３．１８９（１９８７）。

バイオフィジカルバイオケミカルリサーチコミュニケーション（Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、）１４６．４７０（＋９８７）、ヨーロッパ特許出願公開第２３７゜９６６号公報に記載の方法で製造されたものが挙げられる。

ｂＦＧＦ蛋白質または蛋白複合体を用いて免疫するに際し、免疫する哺乳動物は、羊、山羊、兎、モルモット、ラット、マウス等の実験動物が使われるが、モノクローナル抗体を得るためには、ラット、マウスが好ましい。

免疫方法は、例えばマウスを免疫する場合、皮下、腹腔内、静脈内。

筋肉内、皮肉等のいずれのルートからでも可能であるが、主として皮下、腹腔内、静脈内に（とりわけ皮下）注入するのが好ましい。また、免疫間隔、免疫量等も可変度は高く、種々の方法が可能であるが、例えば２週間隔で約２〜６回免疫し、最終免疫後、約１〜５日、好ましくは約２〜４日後に摘出した肺臓細胞を用いる方法がよく用いられる。

免疫量は１回にペプチド量として、マウス当り約０．１ｕｇ以上、好ましくは約１０μｇ〜３００μｇ用いることが望ましい。又、膵臓を摘出する前に、部分採血を行い、血中の抗体価の上昇を確認した上で、肺臓細胞を用いる融合実験を行うことが望ましい。

上記肺臓細胞とリンパ球様細胞との細胞融合は例えば摘出したマウスの肺臓細胞を、ヒボキサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損（ＨＧＰＰＴ−）や、チミジンキナーゼ欠損（ＴＫ−）の様なマーカーを持った適切な同種または異種（好ましくは同種）のミエローマ〔例、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ・８ＵＩ　（市森他ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッド８０５５　（１９８５）））等の、リンパ球様細胞株との間で融合させる。例えばケラ−およびミルスタインらの方法〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）　２５６・４９５　（＋９７５））に準じて融合させることにより製造される。

すなわち、たとえばミニローマ細胞と牌細胞とを約ｌ：５の割合で、たとえばイスコツ培地とハムＦ−１２培地を１：１に混合した培地（以下ＩＨ培地と称する。）に懸濁させ、センダイウィルス、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の融合剤が用いられる。もちろんジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）その他の融合促進剤を加えることも可能である。ＰＥＧの重合度は、ふつう約１．．０００〜６，０００、時間は約０．５〜３０分、濃度は約１０％〜８０％等が用いられるが、好ましい条件の一例として、ＰＥＧ　６，０００を約３５〜５５％で約４〜１０分処理することにより、効率よく融合させることが出来る。融合細胞は、ヒボキサンチン−アミノプテリン−チミジン培地［ＨＡＴ培地；ネイチャー、近臣、　４９５　（１９７５）］等を用いて、選択的に増殖させることが出来る。

増殖して来た細胞の培養上清は、目的とする抗体産生があるか否かについてスクリーニングを行うことができるが、抗体価のスクリーニングは次の様に行うことが出来る。即ち、この場合には、まず第１段階として免疫したペプチドに対する抗体産生の有無を、ラジオイムノアッセイ（ＲＪＡ）法またはエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）法等の方法で調べることが出来るが、これらの方法についても種々の変法が可能である。

好ましい測定法の一例として、ＥＩＡを用いる一つの方法について述べる。セルロースビーズ等の担体に、例えばウサギ抗マウスイムノグロブリン抗体を常法に従ってカプリングさせておき、これに測定したい培養上清や、マウスの血清を加え、一定時間、定温（約４〜４０℃を示す。以下においても同様。）で反応させる。この後、反応物をよく洗った後、酵素で標識したペプチド（酵素とペプチドを常法に従いカプリングさせた後精製）を加え、一定時間、定温で反応させる。

反応物をよく洗った後、酵素基質を加え、一定時間、定温で反応させ、その後、生成発色物を吸光度または蛍光度等で測定することが出来る。

増殖して来た細胞の培養上清について、ｂＦＧＦ蛋白質に対する中和活性のスクリーニングは次の様に行うことができる。即ち、この場合には、ｂＦＧＦ蛋白質によって細胞増殖が誘導される細胞を用いて調べることが出来る。細胞としては血管内皮細胞、繊維芽細胞、神経細胞などを用いることが可能であるが好ましくは血管内皮細胞を用いｂＦＧＦ蛋白質の添加効果を阻害するかどうかを、細胞数を測定することによって知ることが望ましい。

細胞数を測定する方法としては直接細胞数を測定する方法、トリチウムチミジンを用いて放射活性を定量する方法、（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈテトラゾリウムプロミド（ＮＴＴ）を用いて比色定量的に測定する方法（ＭＴＴ法）がある。好ましい測定法の一例として、ヒトー帯静脈由来血管内皮細胞を用い、ＭＴＴ法で細胞増殖を測定する方法について述べる。細胞を播種した後、ｂＦＧＦ蛋白質および測定したい培養上清を添加し、一定時間、定温（３７℃）、低酸素下（約７％が望ましい）で培養する。その後培養液をＭＴＴの入ったものと交換しさらに培養を行うことにより細胞内生ミトコンドリア中でＭＴＴは比色物質フォルマザンに還元される。

一定時間後ＳＤＳを添加し、細胞を溶かし、フォルマザン濃度を均一化した後、０Ｄ５９０ｎｎ＋の吸光度を測定する。細胞の増殖性は吸光度に相関する。したがって、ハイブリドーマ上清無添加の場合の吸光度に比べて添加した場合、吸光度が減少すれば上清中の抗体に中和活性があると着像すことができる。

選択培地で増殖を示し、免疫に用いたペプチドに対する抗体活性、免疫的中和活性のみられたウェルの細胞は、限界稀釈法等によりクローニングを行うことが望ましい。クローン化された細胞の上清について同様にスクリーニングを行い免疫的中和活性の高いウェルの細胞を増やすことにより、免疫したペプチドと反応性を示すモノクローナル抗体産生ハイブリドーマクローンが得られる。

このようにしてクローン化されたハイブリドーマを、液体培地中で増殖させる。

具体的には例えば、液体培地たとえばＲＰＭＩ−１６４０［Ｍｏ○ｒｅ。

Ｇ、Ｅ、、　ｅｔ、　ａｌ、ジャーナル・オブ・アメリカン・メディカル・アソシエーション（Ｊ、　Ａｍ、　Ｍｅｄ、Ａｓ５ｏｃ、）　１９９．５４９　（１９６７）］　に約０．１〜４０％の牛血清を加えた培地等で約２〜１０日間、好ましくは約３〜５日間培養することにより、培養液から該モノクローナル抗体を得ることができる。また、哺乳動物の腹腔内に接種し、細胞を増殖させ、腹水を採取することにより抗体を取得することが出来る。このためには、例えばマウスの場合、ミネラルオイル等を前もって接種したＢＡＬＢ／ｃ等のマウスに約ｌＸ１０’〜１ｘｉｏ“個、好ましくは約５×１０″〜２×１ｒ個のハイブリドーマを腹腔内に接種し、約７〜２０日後、好ましくは約１０〜１４日後に腹水液を採取する。腹水に生成蓄積した抗体は、例えば硫安分画、ＤＥＡＥ−セルロースカラムグロマトグラフイー等により、容易にモノクローナル抗体を純粋な免疫グロブリンとして単離することができる。

本発明のモノクローナル抗体は、免疫原のペプチドのみならず、ｂＦＧＦ蛋白質と高感度に特異的に結合する。さらにｂＦＧＦ蛋白質に対する中和活性を示す。

本発明のモノクローナル抗体は、ｂＦＧＦ蛋白質に対し高感度に結合することから、ｂＦＧＦ蛋白質の測定試薬、ｂＦＧＦ蛋白質の精製用試薬として極めて有用である。

本発明のモノグローナル抗体を用いた測定法ではｂＦＧＦ蛋白質を２０９ｇ／ｍＱまで測定可能である。このことは、極微量しか存在しない生体内ｂＦＧＦを測定する上で極めて画期的なことである。ｂＦＧ濾過剰産生により引き起こされる疾病としては、腫瘍が考えられる。腫瘍においては、ｂＦＧＦに対して直接癌細胞が増殖して増殖する場合と血管内皮細胞が腫瘍より産生ずるｂＦＧＦに反応して増殖し、腫瘍に栄養物を送る新生血管を誘導した結果、腫瘍塊を増大させる場合がある。これらの場合において過剰産生されるｂＦＧＦ量を測定する事によりこれらの疾病を予知することができる。この際、ｂＦＧＦは血管内壁面に付着しやすく、できる限り高感度の定量法が必要である。

さらにｂＦＧＦにより症状が改善されると考えられる疾病として創傷、火傷を治療する際にも有効であると考えられる。この際ｂＦＧＦよりも安定性の高いｂＦＧＦのシスティン残基をセリン残基に置換したムティンを用いた方がさらに効果的である。本発明のモノグローナル抗体は、ｂＦＧＦの少なくとも一個のシスティンがセリンで置換されているムティンにも高感度に結合するため該ムティンを治療薬として用いる際、生体内談ムティン量を追跡する手段として用いることができる。

また、前述した様に多くの腫瘍は体内にあるｂＦＧＦにより増殖していると考えられている。本発明のモノクローナル抗体には強い免疫的中和活性があるため生体内のｂＦＧＦを除去し、抗腫瘍活性を発揮する。この際の投与量は、約１００ μｇ／ｋｇ〜１０■／ｋｇである。さらに、血管新生に伴なう腫瘍の増大の治療にも本モノクローナル抗体は有効である。

１）ＦＧＦ蛋白質の検出、定量法としては、たとえば、担体上に保持されたｂＦＧＦ抗体、および担体上に保持された抗体とは抗原決定部位を異にする抗ｂＦＧＦ抗体に標識剤を直接結合させた結合物を用いてｂＦＧＦ蛋白質を測定する免疫化学的測定法により行なうことができる。

上記測定方法において用いられる担体上に保持された抗体における担体としては、例えば、ゲル粒子（例、アガロースゲル［例、セファロース４Ｂ、セファロース６Ｂ（ファルマシア・ファインケミカル社（スエーデン）製）］、デキストランゲル［例、セファデックスＧ−７５、セファデックスＧ−１００、セファデックスＧ−２００（ファルマシア・ファインケミカル社（スエーデン）製）〕、ポリアクリルアミドゲルし例、バイオゲルＰ−３０、バイオゲ）ｌｉ　Ｐ−６０、バイオゲルＰ−１ｏｏ（バイオラッド・ラボラトリーズ社（米国）製）、セルロース粒子（例、アビセル（脂化成製）、イオン交換セルロース（例、ジニチルアミノエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース）〕、物理的吸着剤［例、ガラス（例、ガラス球、ガラスロッド、アミノアルキルガラス球、アミノアルキルガラスロッド〕、シリコン片、スチレン系樹脂（例、ポリスチレン球、ポリスチレン粒子）、イムノアッセイ用プレート（例、ヌング社（デンマーク）製）］、イオン交換樹脂（例、弱酸性陽イオン交換樹脂〔例、アンバーライトＩＲｃ− ５０（ローム・アンド・ハース社（米国）製）、ゼオカーブ２２６（バームチット社（西ドイツ）製）〕、弱塩基性陰イオン交換樹脂ｃ例、アンバーライトＩＲ −４Ｂ、ダウエックス３　（ダウケミカル社（米国）製）〕）などが挙げられる。

担体に抗体を保持させるには、公知の常套手段を応用し得るが、例えば、°゛代謝パ、第８巻（１９７１年）、第６９６頁に記載されているブロムシアン法、ゲルタールアルデヒド法などが挙げられる。また、より簡便な方法として物理的に担体表面に吸着させてもよい。

標識剤を結合させた抗体における標識剤としては、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが挙げられるが、酵素を用いるのが好ましい。酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ等を用いることができるが、ペルオキシダーゼが好ましい。ペルオキシダーゼとしては、種々の起源のものを用いることができるが、その例としては、たとえば西洋わさび、パイナツプル、イチジク、せ諸、ソラマメ、トウモロコシなどから得られるペルオキシダーゼが挙げられ、特に西洋わさびから抽出されたホースラディツシュペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）（ＨＲＰ）が好ましい。

ペルオキシダーゼと抗体を結合するにあたり、抗体分子としてのＦａｂ’のチオール基を利用するために、あらかじめペルオキシダーゼにマレイミド基を導入したものを用いると好都合である。

マレイミド基をペルオキシダーゼに導入する方法としては、ペルオキシダーゼのアミノ基を介してマレイミド基を導入することができる。

そのためには、Ｎ−サクシニミジル−マレイミド−カルボキシレート誘導体を用いることができ、好ましくは、Ｎ−（γ−マレイミドブチルオキシ）サクシイミド（ＧＭＢＳと略称することもある）などがよい。

従って、マレイミド基とペルオキシダーゼとの間に一定の基が入っていることとなってもよい。

ＧＭＢＳをペルオキシダーゼに反応させるには、両者をｐＨ約６ないし８の緩衝液中で約ＩＯないし５０℃の温度で約１０分ないし２４時間反応させることによって行われる。該緩衝液としては、たとえば、ｐＨ７，０の０゜１Ｍリン酸緩衝液などが挙げられる。このようにして得られたマレイミド化ペルオキシダーゼは、たとえばゲルグロマトグラフィーなどにより精製することができる。該ゲルグロマトグラフィーを行う際に用いられる担体としては、例えば、セファデックスＧ−２５［ファルマシア・ファインケミカル社（スエーデン）製〕、バイオゲルＰ−２［バイオラッド・ラボラトリーズ社（米国）製］などが挙げられる。

マレイミド化ペルオキシダーゼと抗体分子との反応は、両者を緩衝液中で約０℃ ないし４０℃の温度で、約１ないし４８時間反応させることにより行うことができる。該緩衝液としては、たとえば、ｐＨ６，０の５ｍＭエチレンジアミン四酢酸ナトリウム塩を含む０．１Ｍリン酸緩衝液などが挙げられる。このようにして得られたペルオキシダーゼ標識抗体は、たとえばゲルグロマトグラフィーなどにより精製することができる。該ゲルグロマトグラフィーを行う際に用いられる担体としては、例えば、セファデックスＧ−２５［ファルマシア・ファインケミカル社（スエーデン）製］、バイオゲルＰ−２［バイオラッド・ラボラトリーズ社（米国）製］などが挙げられる。

さらに、ペルオキシダーゼにチオール基を導入し、マレイミド化された抗体分子と反応させても良い。

ペルオキシダーゼ以外の酵素を抗体に直接結合させるには、ペルオキシダーゼの場合に準じて行うことができ、また、自体公知のグルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸法、水溶性カルボジイミド法などが用いられる。

本発明の測定系における被検試料としては、尿、血清、血漿、髄液等の体液、あるいは、動物細胞や菌体の抽出液またはその培養上清が挙げられる。

本発明の測定方法の例として、標識剤がペルオキシダーゼの場合について以下に具体的に説明するが、ペルオキシダーゼに限定されるものではない。

まず、■　担体に保持された抗体に、測定すべきｂＦＧＦ蛋白質含有の分析対象物を加えて抗原抗体反応を行った後、これに、前記で得られたペルオキシダーゼと抗ｂＦＧＦ蛋白質抗体との結合物を加えて反応させる。

■二〇で得られた反応生成物にペルオキシダーゼの基質を加え、生じた物質の吸光度もしくは蛍光強度を測定することにより上記の反応生成物の酵素活性を知る。

■：上記■〜■の操作を既知量のｂＦＧＦ蛋白質の標準溶液に対してあらかじめ行い、ｂＦＧＦ蛋白質と吸光度もしくは蛍光強度との関係を標準曲線として作成しておく。

■：未知量のｂＦＧＦ蛋白質を含む分析対象物（被検試料）について得られた吸光度もしくは蛍光強度を標準曲線にあてはめ、分析対象物中のｂＦＧＦ蛋白質の量を測定する。

ｂＦＧＦ蛋白質の精製のためには、精製した本発明の抗体を例えば活性化したアガロースゲルビーズの様な適切な担体に常法に従ってカプリングさせた後、カラムに充め、培養上清或いは破さいした菌体等の粗ｂＦＣＦ蛋白質を含む試料を抗体アフィニティカラムにかけ、吸着させた後、洗浄し、その後例えばＫＳＣＮ　（チオシアン酸カリウム）の様なカオトロビッグ試薬、或いはｂＦＧＦの失活のない程度の弱酸性条件で溶出させる方法等により、効率よく精製できる。

抗体カラムの作製は、例えばハイブリドーマを接種した腹水等から純粋に精製した本発明のモノクローナル抗体を適切な担体とカプリングさせることにより、以下の様な方法でできる。

用いる担体は、カプリングの後にｂＦＧＦ蛋白が特異的に効率よく吸着され、その後適切な溶出が可能なものであればどの様なものでもよく、該担体としては、たとえばアガロース、セルロースまたはアクリルアミドのポリマーが挙げられ、その−例としての蛋白の一級アミンが結合し易い様に活性化されたポリアクリルアミドゲルルビーズ、例えばアフィゲル−１０（バイオラド社製）などが以下に述べる様な方法で好都合に用いられる。アフィゲル−１０と抗体との反応は、約０．００１〜ＩＭ５好ましくは約０．１Ｍのパイカーボネート等の緩衝液中で反応を行う。反応条件は約０℃〜２０℃、約１０分〜２４時間、種々のｐｉ（が可能であるが、好ましくは、約４℃、約４時間、ｐＨ約３〜ｌＯの条件が用いられる。混合するアフィゲル＝ｌＯと抗体の量比は、アフィゲル１ｍＱに対し抗体量が約５０ｍｇ位迄は多ければ多い程多くの抗体がつくので、この範囲内でいくらでもよいが、結合効率およびアフィニティーカラムクロマトグラフィーにおける精製効率を考慮して約１０〜３０ｍｇの抗体が好都合に用いられる。この様にしてできた抗体−担体結合物は、反応に用いた緩衝液でよく洗った後、数日放置するか、もしくは最終濃度約０．０５〜０．　ＩＯＭのエタノールアミン・塩酸、グリシン等の一級アミンを有する化合物を加え約４℃で約１〜４時間反応させる。あるいは１〜５％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）等のタンパク質を４℃−複反応させる等の方法により、残存する未反応の活性基をブロックした後、適切なカラムにつめることにより、抗体カラムとして使用できる。

上記した抗体カラムで精製するに際しては、たとえばｂＦＧＦ蛋白質含有試料を中性付近の緩衝液、たとえばリン酸緩衝液やトリス・塩酸緩衝液に溶解して抗体カラムに吸着させる。次にカラムを同じ緩衝液で洗浄したのち、ｂＦＧＦ蛋白質を溶出する。溶出液としては、弱酸性溶液たとえば酢酸溶液、ポリエチレングリコールを含む溶液、試料にくらべ抗体により結合し易いペプチドを含む溶液、高濃度塩溶液などおよびこれらを組合せた溶液などが用いられ、ｂＦＧＦ蛋白質の分解をあまり促進しないものが好ましい。

カラム溶出液は、常法により緩衝液で中和する。必要により再度上記の抗体カラムによる精製操作を行うことができる。

このようにして、実質的にパイロジエンもエンドトキシンも含まない、実質的に純粋なりＦＧＦ蛋白質が得られる。本発明の実質的に純粋なりＦＧＦ蛋白質としては、蛋白質含量としてｂＦＧＦ蛋白質を９０％（ｗ／Ｗ）以上であるもの、さらに好ましくはｈｂＦＧＦ蛋白質を９５％（Ｗ／Ｗ）以上であるものが挙げられる。

本発明のモノクローナル抗体は、ｂＦＧＦ蛋白質の生物活性を低濃度で免疫的に中和し、ｂＦＧＦ蛋白質と高感度に特異的に結合するので、癌などの疾病の治療薬として用いることができ、また、ｂＦＧＦ蛋白質の測定のための試薬として用いることができる。

後述の実施例２（４）で得られたマウス３８３細胞は、平成元年１１月１０りから財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）に受託番号ＩＦＯ５０２１６として寄託されており、さらにこの細胞は通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（ＦＲＩ）に、平成元年１１月１４日から受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−２６５８として寄託されている。

以下の実施例に記載の、抗ｂＦＧＦモノクローナル抗体ＭＡｂ１２、ＭＡｂ５２、ＭＡｂ９８は、ハイブリドーマ　−β−２２０９〜２２＋　（１９８９）　、ヨーロッパ特許出願公開筒２８８，６８７号公報に記載の方法で製造することができ、ＭＡｂ　ｌ　２の認識部位は、ｂＦＧＦのＮ末端１位から９位のアミノ酸配列に含まれており、ＭＡｂ５２およびＭＡｂ９８の認識部位は、ｂＦＧＦの１４位から４０位のアミノ酸配列に含まれている。ヒトリコンビナントａＦＧＦについては、後述の参考例Ｉに記載の方法で製造されたものを用いた。

ヒトリコンビナントｂＦＧＦ　（ｒｈｂＦＧＦ）はＩＷａｎｅら、バイオフィジカルバイオケミカルリサーチコミュニケーション（Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｒｅｓ。

Ｃｏｍｍｕｎ、）　１４６．４７０（１９８７）、ヨーロッパ特許出願公開筒２３７，９６６号公報に記載の方法で製造されたものを用いた。

ｒｈｂＦＧＦムティンＣ５２３は、形質転換体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＭ２９４／ｐＴＢ７６２（ＩＦＯ１４６１３，ＦＥＲＭ　ＢＰ−１６４５）を用いて、５ａｎｏら、バイオフィジカルバイオケミカルリサーチコミュニケーション（Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、）　！５１．７０１（＋９８８）、ヨーロッパ特許出願公開筒２８１，８２２号公報に記載の方法で製造されたものを用いた。上記Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＭＭ２９４／ｐＴＢ７６２は１９８７年５月２７日からＩＦＯに受託番号ＩＦＯ１４６１３として寄託されており、また本形質転換体はＦＲＩに１９８７年６月１１日から受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−９４０９として寄託され、該寄託はブダペスト条約に基づく寄託に切り換えられて、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−＋６４５としてＦＲＩに保管されている。

参考例１で得られた形質転換体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ＬｙｓＳ。

ｐＴＢ７６２ハ平成元年（１９８９年）９月１２日力らＩＦＯ４：受託番％ＩＦ０１４９３６トして寄託されている。さらにこの細胞は、平成元年（１９８９年）９月２０８からＦＲＩに受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−２５９９として寄託されている。

次の実施例は本発明を、好まし〈実施されるものについて具体的に示したものである。この実施例は例示に過ぎず、本発明がこれらの限定されることはない。

１上■ 参考例１　組換え型ヒトａＦＧＦの調製ヒトａＦＧＦを、バイオテクノロジー（Ｂｉｏｃｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）　５．９６０（１９８７）　：ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｌｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２６３．　＋６４７１（１９８８）、およびＩｃ５Ｕシヨート　レポート（ＩＣＵＳ　５ｈｏｒｔ　Ｒｅｐｏｒｔ）　ｖｏｌｕｍｅ　８　、アドバ〉シズインジーンテクノロジー（Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）；プロティンエンジニアリングアンドプロダクション（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｒｒｇ　ａｎｄ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）、ブロシージングスオブザ１９８８マイアミバイオ／テクノロジーウィンターシンポジウム（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　１９８８　Ｍｉａｍｉ　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ。

ｇｙ　Ｗｉｎｔｅｒ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ）、　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、ｐａｇｅ　１１０．に記載の方法を参考にして、次に示す方法により製造した。

（ａ）　プラスミドの化学合成されたヒトａＦＧＦのＤＮＡ　（第１図）をｐＬｌｃ１８　［メソツズインエンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｒ＋　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）　１０１．２Ｏ−７８（１９８３）］に組み込んだプラスミドｐＴＢ９１７をＢｓｐＭ　ｌで切断し、ｌａｒｇｅ　ｆｒａｇｍｅｎｔの反応によりこの部位を平滑末端にしだ後ＢａｍＨＩで消化して０．４５ｋｂのＤＮＡ断片を調製した。

ヘクターＤＮＡにはＴ７フアージのφ１０プロモーターを保持するｐＥＴ　３　ｃ　（Ｓｔｕｄｉｅｒ、Ｆ、Ｗ、らジャーナルオブモレキュラーバイオロジー（Ｊ、Ｍｏｌ、Ｂｉｏｌ、）　＋８９：１１３−＋３０（１９８６））を用い、ｐＥＴ３ｃをＮｄｅｒで切断し、ｌａｒｇｅ　ｆｒａｇｍｅｎｔで平滑末端としだ後Ｔ４ＤＮＡリガーゼによりＮｃｏｌリンカ−５″−ＣＣＡＴＧＧ−３’　を結合させた。

このプラスミドをＮｃｏｆで切断し、その部位をＤＮＡポリメラーゼｌａｒｇｅ　ｆｒａ、ｇｍｅｒ＋ｔにより平滑化した後ＢａｍＨＩで切断して３１０の配列を除き、そこに先の０．４５ｋｂ　ｂｌｕｎｔ　Ｂｓ　ｐＭＩ−ＢａｍＨＩ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて組み込んでｐＴＢ９７５を得た（第２図）次に大腸菌ＭＭ２９４株にＴ７フアージのＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を組み込んだλファージＤ　Ｅ　３　（Ｓｔｕｄｉｅｒ、Ｆ、Ｗ、らジャーナルオブモレキュラーバイオロジー（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、）±：１１３−１３０（１９８６））を溶原化させ、さらにＴ７フアージのリゾチーム遺伝子をもつプラスミドｐＬ　ｙ　ｓ　Ｓ　（Ｓｔｕｄｉｅｒ、Ｆ、Ｗ、らジャーナルオブモレキュラーバイオロジ−（Ｊ、Ｍｏｌ、Ｂｉｏｌ、）　１８９：１１３−１３０（１９８６））を導入し、大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳ株を作製した。この大腸菌株にｐＴＢ９７５を導入し大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳ、ｐＴＢ９７５　（ＩＦＯ１４９３６、ＦＥＲＭ　ＢＰ−２５９９）をつくった。

この菌を３５μｇ　／　ｍ　Ｑアンピシリン、ｌ（Ｊｔｔｇ／ｍｔ２グロラムフェニコールを含む培地で３７℃で培養し、濁度がＫｌｅｔｔ　１７０になったときイソプロピルβ−Ｄチオガラクトシド（ｆ　ＰＴＧ）を最終濃度が０．５ｍＭになるように加え更に３時間培養を継続した。菌体を遠心により集め、水冷したＰＢＳで洗った後、再集菌し使用時まで一２０’Ｃに保存した。

（ｃ）旦］旦履凪鏝１ｋｌ　１ｉｔｅｒ培養から集めた菌体をｌｏｏｍＱの水冷１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　− ＨＣｎ（ｐＨ７，４）、　ｌｏｍＭ　ＥＤＴＡ、　０．６Ｍ　Ｎ　ａ　ＣＱ　、　１０％シヨ糖、　０．２５ｍＭ　ＰＭＳＦに懸濁し、卵白リゾチームを０．５ ■／　ｍ　Ｑとなるよう添加した。１時間水中に放置後３７℃で５分間インキュベートし、水冷下で超音波処理（２０秒間、２回）を行ない、遠心（ＳＯＲＶＡＬＬ、　１８Ｋｒｐｍ、　３０分、４℃）して上清を得た。この上清を２００ｍ　Ｑの氷冷２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣＱ　（ｐｆ（７，４）、１　ｍＭ　ＥＤＴＡと混和し、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＱ（ｐ）ｌ　７．４）、ｌ　ｍＭＥＤＴＡ、　０，２Ｍ　Ｎ　ａ　ＣＱで平衡化したヘパリンセファロースカラム（径２．５Ｘ４ｃｍ）にかけた。カラムを１５０ｍ　Ｑ、の２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　− ＨＣＱ　（ｐＨ７，４）、］、　ｍＭ　ＥＤＴＡ、　０，５Ｍ　Ｎ　ａ　ＣＱで洗った後、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＱ（ｐＨ７，４）、ｌ　ｍＭ　ＥＤＴＡ、　１．５Ｍ　ＮａＣｎで蛋白を溶出した。溶出液を６ｍＱ毎に分画し、ＯＤ、、、をモニターして２番目のピーク画分（８〜１１番、計２４ｒｒｌ）を集めた（第３図）。この画分２２ｍ１２に対して等量の２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＱ　（ｐＨ７，４）、１　ｍＭ　ＥＤＴＡ、　２Ｍ　（ＮＨ、）、Ｓ０４を混和し、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＱ　（ｐＨ７，４）、１　ｍＭ　ＥＤＴＡ。

１Ｍ　（ＮＨ，）、Ｓｏ、で平衡化したフェニルセファロースカラム（径２゜５Ｍ８ｃｍ）にかけた（流速　０．５ｍ　Ｑ　７分）。２０ｍαの同じ緩衝液でカラムを洗った後、ＩＭからＯＭの硫酸アンモニウム直線的′ａ度勾配（流速　０．５ｍＱ／分、勾配時間２００分）をかけ、溶出された画分４０−５５を集め（第４図）、精製ヒトａＦＧＦとした。

（ｄ）ｆｉ皿Ｃ４Ｈ己ＬＣ精製ヒトａＦＧＦ　１．　、２　ｍｇ　／　ｍ　Ｑ溶液を０．２５ｍＱの０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、！＝混合し、逆相Ｃ４カラム（ＶＹＤＡＣ）　ｉニアブライし、０，１％ＴＦＡ存在下に０％がら９０％アセトニトリルの直線的濃度勾配をかけ溶出パターンで調べた。流速　１ｍＱ／分、勾配時間６０分で行った（第５図）。

（ｅ）土豊皿ユヒトａＦＧＦの活性は佐々田らの方法（Ｓａｓａｄａら、モレキュラーセルオブバイオロジ−（Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、）　８　：５８８−５９４（１９８８））に従い、マウスＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣＮｏ、ＣＲＬ６５８７）のＤＮＡ合成誘起をビＨ］チミジンの取り込みを指標として測定した。検体添加時、必要に応じて培地中および検体中にヘパリン（ＳＩＧＭＡ　Ｇｒａｄｅ　Ｉ　）溶液を混合した。

参考例２（ａ）ヒトｂＦＧＦムティン発現用プラスミドｐ　Ｔ　Ｂ　１０００の構築特開平２−１９３号公報（Ｅ　Ｐ−２８１，８２２に対応）記載のプラスミドｐＴＢ７６２（大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）／Ｌｙｓ、ｐＴＢ６７２　（ＩＦｏ　１４９３６、ＦＥＲＭ　ＢＰ−２５９９）　から得られ６］　を制限酵素ＥｃｏＲ１ −ＢａｍＨｒで切断し、ヒトｂＦＧＦムティンＣ３２３のコード領域を含む０．３８ｋｂ　ＤＮＡ断片を得た。また、特開昭６２−１７５１８２号（Ｅ　Ｐ　− ２２５，７０１＋、：対応）公報記載のプラスミドｐＴＢ５０３をＣ１ａｌ−ＥｃｏＲＩで切断し、マウス白血病ウィルス（ＭｕＬＶ）ＬＴＲ領域、Ｓ　Ｖ４０由来プロモーターおよびスプライス領域、およびヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２）リーダー配列を含む１．７ｋｂＤＮ、Ａ断片を得た。さらに、特開平２ −１９３号（Ｅ　Ｐ−２８１，８２２に対応）公報記載のプラスミドｐ　Ｔ　Ｂ６７５をＣ１ａ、ｌ−Ｂａｍ１（＋で切断し、ヒトｂＦＧＦのＣ末端側のコード領域と３′非翻訳領域およびプラスミドｐ　Ｂ　Ｒ３２２由来アンピシリン耐性遺伝子および大腸菌における複製開始点を含む３．４ｋｂＤＮＡ断片を得た。これら３種のＤＮＡ断片をＴ４　ＤＮＡリガーゼを用いて直結し、プラスミドｐ　Ｔ　Ｂ　１０００を得た（第１３図）。

（ｂ）マウスＢＡ、ＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞［Ｔ、Ｋａｋｕｎａｇａら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２０９．　５０５−５０７　（１９８０）　］のトトランスフオーム細胞ンとトランスフオーム細胞の樹立マウスＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３クローンＡ３１細胞を１０％０％仔牛血清むＤ　ｈｉ　Ｅ　Ｍ培地［Ｄｕｌｂｅｃｃｏら、ヴイロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、　８　、　３９６（１９５９）］で直径６ｃｍの組織培養用ディツシュに播種した。翌日、同培地で培地交換し、４時間後に、リン酸カルシウム法［Ｇｒａｈａｍら、ヴイロロジ−（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）　５２，４５６（１９７３月により、上記（１）で得たプラスミドｐＴＢｌｏｏｏ　ＤＮＡ　１０μｇまたは１μｇをトランスフェクトした。トランスフェクション後は、５％仔牛血清を含むＤＭＥＭ培地で培養を続けた。約３週間後、生成したフォーカス（フォーで培養し、さらにリミテイングダイリューション法によりクローン化した。得られたトランスフオーム細胞クローン３株（Ｋ１００Ｏ−Ｆ　１．。

Ｋ１００Ｏ−Ｆ２．　Ｋ１００Ｏ−Ｆ３）について、培養液および細胞抽出液中のＦＧＦ活性を静止状態のＡ３＋細胞に対するＤＮＡ合成促進作用とじて測定した結果を表に示した。

細胞　ＦＧＦ活性（ｎｇＦＧＦ当量／ディツシュ）培養液　細胞抽出液Ｋ１００Ｏ−Ｆｌ　Ｏ，０９８，６Ｋ１００Ｏ−Ｆ２　０．１６　１１．３Ｋ１００Ｏ−Ｆ３　０．０９　４，５Ａ３＋　＜０．０５　＜０．２これらのトランスフオーム細胞は、いずれも悪性化細胞腺の形態を示し、軟寒天培地中でコロニーを形成した。

実施例１　（免疫）ＢＡＬＢ／ｃマウス（♀８週令）に対し、フロイント完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ社製）に溶解させた５０μｇの抗原ヒトｒｈｂＦＧＦムティンＣ３２３（ヒトｂＦＧＦ中７０位および８８位のＣｙｓがＳｅｒで置換されているムティン）を腹腔に注射した。２週間後に、フロイント完全アジュバント０．４ｍΩにとがした５０μｇの抗原ｒｈｂＦＧＦムティンＣ３２３を腹腔に再投与した。さらに２週間後にフロインド不完全アジュバント０．４ｍ　Ｑにとかした５０μｇの抗原ｒｈｂＦＧＦムティンＣ５２３の追加免疫を行い、その２週間後に生理食塩水に溶かした５０μｇのヒトｒｂＦＧＦムティンＣ５２３をマウス尾静脈内に接種した。

実施例２（１）細胞融合実施例１で示した免疫マウスより、抗原最終投与の３日後牌臓を摘出し、細胞融合に用いる細胞を得た。この細胞は、イスコツ培地とハムＦ−１２培地をｌ：１の比率で混合した培地（以下ＩＨ培地と略す）に懸濁した。

マウス骨髄腫様細胞５Ｐ２１０−Ａ、Ｇ１４（ＡＴＣＣＮｏ、　ＣＲＬ　１５８ｉ）は、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地で５％炭酸ガス、９５％空気の条件で継代培養した。

細胞融合は、ケーラーおよびミルスタインらが確立した方法［ケーラー、Ｇ、およびミルスタイン、Ｃ１：ネイチャ−（Ｎａｔｕｒｅ）　２５６．４９５（１９７５）］に準じて行った。上記ミエローマ細胞２×１０“個と上述した方法で得られた免疫されたリンパ球１．５ＸＩＯ“個を混合、遠沈し、１ｍαの＋Ｈ培地に溶解した４５％ポリエチレングリコール６０００　（以下ＰＥＧ　６０００）を滴下した。ＰＥＧ６０００溶液は、予め３７℃に温め、ゆっくりと１分間かけて滴下した。

次にＩＨ培地ｌＩｌ！氾を１分間、１ｍＱを１分間、８ｍｆｆを３分間かけて滴下した。その後室温で１，０００回転５分遠心し上清を除去した。この細胞沈殿物を２０％仔牛血清を含む１）（培地３０ｍαに懸濁し、９６穴マイグロブレート　（ヌツク社）に１００μαずつ植えつけた。１日後、ＨＡＴ　（ヒボキサンチンＩＸ］、Ｏ−判、アミノプテリン４ＸＩＯ−’Ｍ、チミジン１，６ＸｌＯ− ’Ｍ）を含んだ１１（培地（２０％仔牛血清含有）（以下ＨＡＴ培地と称する。

）を各ウェルに１００μαずつ添加し、さらに３日おきに、培地の１／２量をＨＡＴ培地と交換した。このようにして生育した細胞は雑種細胞である。

（２）抗体産生細胞の検索２００ｎｇ／ｍＱのｒｈｂＦＧＦムティンＣ５２３を含む固定緩衝液（０，１，Ｍ炭酸水素ナトリウム（ＰＨ９，６）、０．０２％アジ化ナトリウム）をポリスチレン製９６六マイクロプレート（ヌツク社）にｌＯＯμＱ／穴加えた。２時間後、洗浄液＜０．０５％トウィーン２０、生理的リン酸緩衝液）で洗った後、培養上清５０μＱと希釈用緩衝液［０，０５Ｍ　ｈリス・塩酸（Ｐｌ］８．０１．１ｍＭ塩化マグネシウム、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０５％トウィーン２０．０．０２％アジ化ナトリウム、０．３％ゼラチン）］５０μαを混合した溶液１００μαをマイクロプレートに加えた６２時間後培養上清を洗浄液で洗った後、２次抗体としてアルカリフォスファターゼ標識抗マウスＩｇＧヤギ抗体（バイオラッド社）を加えた。２時間後２次抗体を洗浄液で洗った後、反応基質を加えた呈色反応を行った（ＥＬＩＳＡ法）。この方法により４つのウェルにｒｈｂＦＧＦムティンＣ３２３結合活性が認められた。

（３）　ｂＦＧＦ免疫的中和抗体産生細胞の検索ヒト謄帯静脈血管内皮細胞を２．５％牛脂児血清を含むＧＩＴ培養液〔和光純薬工業株式会社より購入可。動物細胞培養用の哺乳動物血清由来の組成物。補乳動物血清を汚染微生物の不活化工程および塩析／脱塩工程を含む精製処理に付すことによって製造される。米国特許第４゜６５４．３０４号参照〕に懸濁し、９６穴マイグロブレートに２．０００個／穴で１００μΩ播種した。翌日種々の濃度のハイブリドーマ培養上清、４ｍｇ／ｍＱｒｈｂＦＧＦ、２．５％牛脂児血清を含むＧＩＴ培養液１．ｏ０μＱ、／穴添加し３日間３７℃、５％ＣＯ１，７％０．下で培養した。３日後培養液を除去した後１　ｍｇ　７ｍ（ＩＴＴ　（４，，５ジメチル２チアゾリル）　− ２，５−ジフェニル−２Ｈテトラゾリウムブロマイド）を含む２．５％牛脂児血清を含むＧＩＴ培養液［００μＱ／穴加えた。４時間、３７℃、５％ＣＯ，，７％Ｏ１下で培養した後、１ｍ％Ｓｏｄｉｕｍ　Ｄｏｃｌｅｃｙｌ　５ｕｌｆａｃｅ　（ＳＤＳ）を１００μＱ／穴加えた。

４時間後、ＯＤ５９０ｎｍの吸光度を９６穴用分光光度計（タイターチック社）で測定した（ＭＴＴ法）。この方法により１つのウェルに強い中和活性が観察された。

（４）雑種細胞のクローニングこのウェル中の細胞を、１ウエルあたり０．５個となるように、予めマウス胸腺細胞を栄養細胞としてまいておいた９６穴マイグロタイタープレートにまき、クローニングを行った。その結果、ハイブリドーママウス３Ｈ３細胞（ＩＦＯ５０２１６，ＦＥＲＭ　ＢＰ−２６５８）を得た。

クローニングされた細胞は、１０％仔牛血清を含む１１１培地に１０％となるようジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を加え液体窒素内に貯蔵した。

実施例３（モノクローナル抗体の免疫グロブリングラス）実施例２−（３）で得られた３）］３細胞の培養上清を、マウス抗体サブクラス検出キット（バイオラッド社）により各種標品免疫グロブリンと反応させた。その結果を第１表に示す。

第１表標品免疫グロブリン　３Ｈ３抗体表中、＋は反応陽性を、−は反応陰性を示す。第１表より、３Ｈ３細胞培養上清中の抗体は免疫グロブリンクラスｔｇｃ、サブクラスに属する。

実施例４　（培養上清、腹水からのモノクローナル抗体の精製）（］）培養上清からの精製結合緩衝液（３Ｍ塩化ナトリウム、１．５Ｈグリシン（ｐＨ８，７）　）で平衡化したプロティンＡカラムに、マウス３１１３細胞の培養上清と結合緩衝液を１．１で混合したものを添着した。結合緩衝液で洗った後、溶出緩衝液（０，１Ｍクエン酸（ｐｔ（５））で溶出した。溶出液には１Ｍトリス（ｐＨ８゜０）を加え中性化して生理的リン酸緩衝液中で透析した。

標品のＩｇＧ１１定量は実施例２（２）の方法に従って以下の様に行った。

濃度のわかっているマウスＩｇＧ、および、３）１３抗体を様々な希釈倍率で固定緩衝液でポリスチレン製９６六マイクロプレートに固定した。２時間後、アルカリフォスファターゼ標識抗マウスＩｇＧヤギ抗体（バイオラッド社）を加えた。２時間後反応基質を加えた呈色反応を行った（Ｅｌ□ＩＳＡ法）。濃度のわかっているマウスＩｇＧ、について定量曲線を画き、それに対して標品のＩｇＧ量を定量した。これにより３Ｈ３抗体６０μｇ／ｒｉＱの溶液を調製した。

この精製したモノクローナル抗体について、実施例２（２）の方法により測定したｒｈｂＦＧＦムティンＣ５２３に対する抗体価の結果について第６図に示す。

１μｇ／ｍＱのウサギ抗ｂＦＧＦポリクローナル抗体を固定し、ｒｈｂＦＧＦムティンＣ３２３を添加した後１μｇ／ｍＱの３Ｈ３抗体を添加し、ｌμｇ／ＩＩＩＱのアルカリフォスファターゼ標識抗マウスＩｇＧヤギ抗体を添加した。

この方法により、３ｍｇ／ｍαまでのｒｈｂＦＧＦムティンＣ５２３の検出が可能である。さらに腹水からのモノクローナル抗体の精製を行った。

（２）腹水からの精製マウス３Ｈ３細胞株を、マウス（Ｂａｌｂ／ｃ）にて腹水化した。腹水からのＩｇＧの精製は、常法に従った。すなわち、腹水５ｍＱを４５％飽和の硫酸アンモニウムにて塩析し、沈澱を０．１５Ｍ　ＮａＣ１を含むホウ酸緩衝液（ＢＢＳ、　ｐ）１８．５）に溶解し、ＢＢＳに対して４℃で２０時間透析した。

これを、ＤＥ−５０（英国、Ｗｈａｌａｎ社製、ｌＸ６０ｃｍ）カラムに付し、０゜１間リン酸緩衝液（ｐＨ８，０）中のＮａＣ１１１１度をＯ，ＩＭから０．３５ＭＧこ直線的に変化させる濃度勾配溶出法により、腹水５ＩＩＩＱからモノクローナル抗体３Ｈ３抗体を７■得た。

実施例５（抗原認識部位の決定）実施例４において抗体結合価を測定した３Ｈ３抗体の抗原認識部位を競合的結合阻害実験により検討した。競合物として、ヒトａＦＧＦ、ヒトｂＦＧＦ、　ｒｈｂＦＧＦムティンＣ３２３、合成ペプチドＰａｐｌ：Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｅｕ− Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−３ｅｒ−Ｔｙｒ（ヒトｂＦＧＦのＮ末アミノ酸２−１０のＣ末端にＴｙｒを付加したもの、レギュレートリイベプチズ（Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　Ｐｅｐｔ、１ｄｅｓ）、　ＩＱ、　３０９−３１７（１９８５））　、Ｐｅｐ　２：Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−３ｅｒ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−３ｅｒ　（アミノ酸＋４１−１４７に相当）（ヨーロッパ特許出願公開第２８８，６８７号公報参照）、およびヘパリンナトリウムを用いた。合成ペプチドおよびヘパリンナトリウム、ヒトａＦＧＦ、　ｒｈｂＦＧＦ、　ｒｈｂＦＧＦムティンＣ５２３は、Ｌｏｏｐ、　ｇ　７ｍ　Ｑの濃度に調製し、実施例２（２）の希釈用緩衝液で希釈を行った。

合成ペプチドおよびヘパリンナトリウム、ヒトａＦＧＦ、　ｒｈｂＦＧＦ、　ｒｈｂＦＧＦムティンＣ５２３を用いる場合、ｌｏＯｎｇ／ｍＱの３Ｈ３抗体と競合物を懸濁し、３７℃、６０分間保温した。これらの液中に含まれる未結合の抗体量を実施例２（２）に示すＥＩＡ法によって測定した。これらの結果について第２表にまとめる。

第　２　表３１（３抗体ヘパリンナトリウム　− 第２表中“十″は競合阻害のあったもの、′−”はなかったものを示す。これらの結果より、３Ｉ（３抗体の抗原認識部位は、ヘパリン結合部位以外のヒトｂＦＧＦ分子のアミノ酸１０番目から１４１番目のペプチドとヒトｂＦＧＦ受容体に対するヒトｂ　Ｆ　Ｇ　Ｆの結合部位またはその近傍の領域と考えられる。

実施例６免疫的中和作用の検討実施例４の方法で精製した３Ｈ３抗体を実施例２（３）のＭＴＴ法により、ｒｈｂＦＧＦに対するヒトｂＦＧＦ免疫的中和活性を検討した（第７図）。

すなわち、ヒト血管内皮（ＨＵＶＥ）細胞のｂＦＧＦ２ｎｇ／＋ａΩ存在下での３日間の増殖で測定した。ｂＦＧＦ存在下、モノクローナル抗体非存在下でのＯＤ−５９０ｎｍ値を１００％としてモノクローナル抗体を添加した場合の吸光度で増殖阻害効果を示す。−・−は、３Ｈ３抗体、−ｍ＝は正常マウスＩｇＧを示す。また４４％のラインはｂＦＧＦ無添加時の細胞数を示す。３１（３抗体を添加した場合、５０ｎ　ｇ　７ｍ　Ｑ、でｂＦＧＦ非存在非存組下数まで、ＨＵＶＥ細胞の増殖を阻害した。正常マウスＩｇＧは、増殖阻害効果を示さなかった。

さらに測定方法を変更してＨＵＶＥ細胞の増殖阻害効果を検討した。すなわちＨＵＶＥ細胞を２４穴リンプロプレートに１．ＸＩｏ’個／穴で播種（培養条件は実施例２（３）に同じ）し、翌日ｂＦＧＦ２ｎｇ／ｍＱ、および３Ｈ３抗体を添加、３日間、５日間培養した場合の細胞数をコールタ−カウンター（Ｃｏｕｌｔｅｒ　Ｅｌｅｃｒ、ｒｏｎｉｃｓ、　Ｉｎｃ、　）を用いて測定した（第８図Ａ、Ｂ、Ａは３日間培養した場合、Ｂは５日間培養した場合）。ｂＦＧＦ添加、３Ｈ３抗体無添加時の細胞数を１００％として３Ｈ３抗体添加時の細胞数を百分率で示した。（Ａ）　（Ｂ）いずれにおいても−・−はｂＦＧＦ　２　ｎ　ｇ　／ｍα存在下での、−ｍ＝はｂＦＧＦ非存在非存組下１（３抗体の効果を示す。その増殖阻害のＩＣ５０値（抗体無添加時の細胞増殖を５０％阻害する抗体ｆｉ）は（Ａ）（Ｂ）でそれぞれ１３．２．７．６ｍｇ／ｍＱであった。またｂＦＧＦ非存在非存組下３１（３抗体は何の影響も及ぼさなかった。以上より、３Ｉ（３抗体はｂＦＧＦの生物活性に対して強い免疫的な中和作用を示すことが判明した。

実施例７西洋ワサビペルオキシダーゼ標識化３Ｈ３抗体の調製精製３Ｈ３抗体（７ｍｇ／ｍＱ）を０．ＩＭ　ＮａＣ１を含むＯ，１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４゜５）に対して４℃で２０時間透析し、ペプシン（シグマ社製、米国）（０，１■）を加え、３７℃で８時間消化した。１丁ｒｉｓでｐｉ（を８にして反応を止め、Ｕｌｔ、ｒｏｇｅｌ　ＡｃＡ４４　（ＩＢＦ社製、フランス）のカラムでＯ−１５ＭＮａＣｌを含む０．０２Ｍホウ酸緩衝液（ｐｌ’、８．０）を溶出液として分離し、Ｆ（ａｂ’）、を得た。

これを、１ｍｆｆに濃縮後、０．閂リン酸緩衝液（ｐＨ６，０）に対して４℃で２０時間透析し、０．２４メルカプトエチルアミン、５ｍＭ　ＥＤＴＡ、　０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，０）　Ｏ，１ｍＱ、を加えて、３７℃、９０分間還元した。反応液を５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５ｆｉｎｅ　（ファルマシア・ファインケミカル社製、スエーデン）（φｌｘ６０ｃｍ）で０．２Ｍメルカプトエチルアミン、５ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，０）を溶出液として分離し、Ｆａｂ’画分を得た。

一方、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）　（ベーリンガーマンハイム社製、西ドイツ）ｌｏ■を１．５ｍＭのＯ，１Ｍリン酸緩衝液（ｐｆ４７．０）に溶がし、Ｎ−（γ−マレイミドブチルオキシ）サクシイミド（ＧＭＢＳ）　３．５ ■をＮ、　Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）　ｔｏｏμＣに溶かして加え、３０℃で６０分間攪拌後、５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５ｆｉｎｅ　（φ１．２Ｘ６０ｃｍ）で００１Ｍリン酸緩衝液（ｐｔ（７，０）を溶出液として分離し、マレイミド基の導入されたＨＲＰを得た（マレイミド化ＨＲＰ）。Ｆａｂ’とマレイミド化ＨＲＰをモル比で１＝１になるように混ぜ、４℃で２０時間反応した。

反応液を、Ｕｌｔｒｏｇｅｌ　ＡｃＡ４４のカラムでＯ，１Ｍリン酸緩衝液（ｐ）１７．０）を溶出液として分離し、酵素標識抗体（３Ｈ３−ＨＲＰ）を得た。

実施例８抗体感作プレートの調製ＭＡｂ１２あるいはＭＡｂ５２とＭＡｂ９８の等景況合物をＯ，１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９゜６）にて＋０Ｍｇ／ｍＱとなるように希釈し、ＥＩＡ用イムノプレート（マキシソーブ：ヌツク社製、デンマーク）の各ウェルに１００μαずつ注入して４℃で一夜放置して感作させ該抗体をプレートに固定した。０゜＋５Ｍ　ＮａＣ１を含む０，０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）にて洗浄した後、０．１％ＢＳＡを含む０．０ＩＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）を各ウェルに注入して用時まで冷所保存した。

実施例９ヒトｂＦＧＦの測定（１）検量線の作成（ａ）試薬 ■　実施例７で得られた酵素標識抗体 ■　実施例８で得た抗体感作マイグロブレート■　リコンビナントヒトｂＦＧＦ（ｒ　ｈ　ｂＦＧＦ）　Ｏ〜５０ｎ　ｇ　７ｍ　（１■　緩衝液Ａ　（０，１５Ｍ　ＮａＣ１を含むｐＨ７，０の０．０２Ｍリン酸緩衝液）緩衝液Ｂ（２５％ブロックエース　（乳蛋白質から調製された遮断剤）（大日本製薬）　、０．１５Ｍ　ＮａＣ１を含むｐＨ７，０の０．０２Ｍリン酸緩衝液）■　ペルオキシダーゼ基質溶液（０，０２％過酸化水素と０．１５％０−フェニレンジアミンを含むｐ）１５．５のクエン酸ナトリウム緩衝液）酵素反応停止溶液（２Ｎ−硫酸）（ｂ）測定実施例８で得られた抗体感作プレートの各ウェルに、緩衝液Ｂに溶解させた０、１〜１０００　ｐｇ／ｍｌのｂＦＧＦ溶液１００μαを注入し、４℃で２４時間反応させた。各ウェルを緩衝液Ａで洗浄後、緩衝液Ｂで２００倍に希釈した酵素標識抗体溶液＋００μＱを加えて２５℃でさらに２時間反応させた。各ウェルを緩衝液Ａで洗浄し、ペルオキシダーゼ基質溶液を１００μＱ加え２５℃で３０分反応させ、酵素反応停止溶液１００μＬ加えて反応させた後、マイクロプレート用自動比色計（ＭＴＰ−３２、コロナ社製）を用い、４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。ＨｂＦＧＦの濃度と吸光度との関係を第９図に示す。第９図において、−〇−はＭＡｂ１２を感作したマイグロブレートを用いた場合、−・−はＭＡｂ５２とＭＡｂ９８の等置屋合物を感作したマイクロプレートを用いた場合のｈｂＦＧＦの濃度と吸光度との関係をそれぞれ示す。ＭＡｂ１２を感作した場合２０ｐｇ／ｍ　ＱのｂＦＧＦ蛋白質を検量できることが判明した。

（２）　ｂＦＧＦの免疫化学的測定キットおよびｂＦＧＦの測定下記のｂＦＧＦ免疫化学的測定キットを用い、下記の操作法に従って、被検試料中のｂＦＧＦ量を測定した。

（ａ）試薬 ■　実施例７で得られた酵素標識抗体（３μ３抗体−ＨＲＰ）■　実施例８で得られた抗体感作マイクロプレート■　リコンビナントヒトｂＦＧＦ　（ｒｈｂＦＧＦ）　Ｏ〜５０ｎｇ／ｍＱ ■　緩衝液Ａ　（０゜１５Ｍ　ＮａＣ１を含むｐＨ７，０の０．０２Ｍリン酸緩衝液）緩衝液Ｂ（２５％ブロックエース、０．１５Ｍ　ＮａＣ１を含むｐＨ７，０の０．０２Ｍリン酸緩衝液） ■　０−フェニレンジアミン ■　上記■の溶解に用いる緩衝′ｇＩＤ　（０，０２％過酸化水素、０．００５％チメロサールを含むｐＨ５，５の０９１Ｍクエン酸緩衝液）■　酵素反応停止液（２Ｎ−硫酸）（ｂ）測定緩衝液Ｂに溶解させたｂＦＧＦ標準溶液あるいは緩衝液Ｂで希釈された被検試料溶液＋００μＱを、緩衝液Ａで洗浄された■の各ウェルに注入し、４℃で２４時間反応させた。各ウェルを緩衝液Ａで洗浄後、緩衝液Ｂで１００倍に希釈した試薬■１００μαを加えて、２５℃でさらに２時間反応させた。各ウェルを緩衝液Ａで洗浄後、試薬■で溶解した０、１５％の試薬■１００μαを加えて２５℃で３０分反応させた。

各ウェルに試薬■１００μαを添加して反応を停止させ、４９２ｎｍの吸光度をマイクロプレート用自動比色計（ＭＴＰ−３２、コロナ社製）を用いて測定した。標１１１１ｂＦＧＦの検量線を作成し、被検試料で得られた吸光度から、ｂＦＧＦ濃度を得た。

実施例１ＯＨｂＦＧＦ測定系でのヘパリンの影響実施例９（１）において、標＄ＨｂＦＧＦを希釈する際の緩衝液Ｂに、０．１．１０．１００μｇ／ｍＱとなるようにヘパリンを加え、以下は実施例４−（１）と同様の方法でＨａＦＧＦの測定を行なった場合、第１Ｏ図に示すように、ヘパリンの存在によって標準曲線に大きな変化は見られなかった。

第１０図において、第１０図−（１）はＭＡｂ１２を固相化した場合、第１０図 −（２）はＭＡｂ５２とＭＡｂ９８の等置屋合物を固相化した場合を示している。さらに、それぞれにおいて、−・−１−〇−１−ム一、−△−は、順次ヘパリンの濃度が０．１．１０、ｌｏｏμｇ／ｍＲの場合を示す。

実施例１１ＨｂＦＧＦ測定系における、酸変性ｈｂＦＧＦの反応性。

２０μＱのＨｂＦＧＦ溶液（２００μｇ／＋ａΩの濃度でｈｂＦＧＦを、そして１ＭＮａｃｌを含む２０ｍＭ　トリス塩酸緩衝液ｐＨ７，４）　２０μＱを＋８０μＱの１Ｍ酢酸緩衝液に加え、２５℃でｏ、ｌ、３．１０分間インキュベートした。

これに、４００μＱの１Ｍトリスを加えて中和した後、実施例９−（１）の緩衝液Ｂにて希釈し、以下実施例９−（＋）に従って、各々のインキュベ−１・時間の場合について、検量線を描いたところ、第１１図（１）および（２）に示すようになった。第１１図において、第１１図−（１）はＭＡｂ１２を固相化した場合、第１１図−（２）はＭＡｂ５２とＭＡｂ９８の等置屋合物を固相化した場合である。また、それぞれにおいて、−〇−１−・−１−△−１−ム−はそれぞれ、ｈｂＦＧＦをＯｌｌ、３．．１０分間ｐＨ４で処理した場合である。

第１．１図（１）および（２）よりいずれの測定系においても、ｐＨ４で変性させたｈｂＦＧＦは、１０分で約１％にまで反応性が落ちており、実施例９の測定系は、ネイティブのｈｂＦＧＦのみを測定できる測定系である。

実施例１２各種細胞内ｂＦＧＦの測定Ａ３７５　（ヒトメラノーマ）、Ａ４３１　（ヒト情事上皮癌）、Ａ３４９　（ヒト肺癌）、　５Ｋ−）１ｅｐｌ　（ヒト肝癌）（いずれもＡＴＣＣ１米国）および、ヒト請帯内皮細胞を、２〜５ＸＩＯ’個をセルスフラッパーにてかきとり、０．１５Ｍ　ＮａＣ１を含むリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ、ｐＨ７，２）にて、２回洗浄後、０．６１ＣのＰＢＳを加えて、水冷下、２５秒間超音波処理を行なった。１５，０００　ｒ。

ｐ、ｍ、で遠沈を行なったあと、その上清中のｂＦＧＦ′ａ度を実施例９−（２）に従ってめた。

その結果を第３表に示す。第３表において、Ａは、ＭＡｂ１２を固相化して測定した場合、ＢはＭＡｂ５２と唱ｂ９８の等置屋合物を固相化して測定した場合である。

第３表　細胞内ｂＦＧＦ量第３表より、ＡとＢの測定系でｂＦＧＦの測定値に大きな差を認めた。これは、抽出操作中にｂＦＧＦのＮ末端が切断されたり、あるいは、実際に産生されているｂＦＧＦはＮ末端が切れたり、マスクされたものであるなどの可能性が考えられる。

実施例１３　Ｋ１００Ｏ腫瘍に対する抗腫瘍効果参考例２で得られたＫ１００Ｏ −Ｆｌ細胞をＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃヌードマウス心窩部皮下に３ＸＩＯ＠ｃｅ１１．ｓ／ｍｏｕｓｅ移植した。移植後３日目より連続５日間、実施例４で得られた３μ３抗体および非免疫マウスＩｇＧを尾静脈内に２００　μｇ　／　ｍｏｕｓｅ　／　ｄａｙ投与した。移植後経時的に腫瘍径を測定し、腫瘍体積（＝０゜５×長径×短径″）を算出した。その結果を第１２図に示す。

第１２図において−・−は無処理対照群、−■−は非免疫マウスＩｇＧ投与群、 −ム一は３μ３抗体投与群を表わす。３μ３抗体は、Ｋ　１０００腫瘍に対して抗腫瘍効果（移植後１４４日目おいて無処理対照群の３４％腫瘍体積）を示した。なお、非免疫マウスＩｇＧの抗腫瘍効果は認められなかった。

導入記載された文献ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）　２４９．１２３　（１９７４）バイオフィジカルバイオケミカルリサーチコミュニケーション（Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、　Ｃｏ＋ｕ＋ｕｎ、）旦１．７０１（１，９８８）ヨーロッパ特許出願公開筒２８１，８２２号公報フェブス　レターズ（ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ）、２１３．１８９（１９８７）バイオフィジカルバイオケミカルリサーチコミュニケーション（Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、）１４６．４７０（１９８７）ヨーロッパ特許出願公開筒２３７．９６６号公報ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッド８０．５５　（１９８５）ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）　２５６．４９５　（１９７５）ジャーナル・オブ・アメリカン・メディカル・アソシエーション（、Ｊ、　Ａｍ、　Ｍｅｄ、　Ａｓ５ｏｃ、）里、　５４９　（１９６７）代謝”、第８巻（１９７１年）、第６９６頁ハイブリドーマ　盈、２０９〜２２１　（１９８９）ヨーロッパ特許出願公開筒２８８．６８７号公報バイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）　５　、９６０（＋９８７）ＩＣ５Ｕシヨート　レポート（ＩＣＵＳ　５ｈｏｒｔ　Ｒｅｐｏｒｔ）　ｖｏｌｕｍｅ　８　。

アドバンシズイン　シーンテクノロジー（Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　ＧｅｎｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）　＋　プロティンエンジニアリングアンドプロダクション（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ａｎｄ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）、プロシージングスオブザ１９８８マイアミ　バイオ／テクノロジーウィンターシンポジウム（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　＋９８８　ＭｉａｍｉＢｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ＷｉｎＬｅｒ　Ｓｙｍｐｏｓｉ、ｕｍ）、　ｐａｇｅ　１１０．　ｔＲＬ　Ｐｒｅｓｓジャーナルオブモレキュラーバイオロジー（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、）里、　＋１３１３０（＋９８６）モレキュラーセルオブバイオロジー（Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、）盈、　５８８−５９４（１９８８）メソッズインエンザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」■、２Ｏ−７８（１９８３）特開平２−１９３号（Ｅ　Ｐ−２８１，８２２に対応）公報特開昭６２−１７５１８２号（Ｅ　Ｐ−２２５，７０＋に対応）公報サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２０９．　５０５−５０７　（１９８０）ヴイロロジ−（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、８．３９６　（１９５９）ヴイロロジ−（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）　５２．４５６　（１９７３）米国特許明細書簡４，６５４，３０４号レギしレートリイ　ベプチズ（Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）、皿、３０９−３１７（＋９８５）図　１Ｂｓｐ［ＣＴＣＣＡＧＣＡＡＣＧＣＧＧ（：ＣＣＡＣＴ　ＴＣＣ丁ＧＡＧＧＡＴ　丁Ｃ丁ＴＣＣＧＧＡＴ　ＧＧＣＡＣＡＧＴＧＣＡＴＧＧＧＡＣＡＡf １３０　−．１４０　１５０　１６０　１７０　１８０ＣＧＡＣＡにＧ：ＡＧＣＧＡＣＣＡＧＣＡＣＡ　ＴＴＣＡＧ：ＣＴＧＣＡ　ＡＣＴＣＡＧＴＧＣＩＩ；　ＧＡＡＡＧＣＧＴＣＧ　ＧＣＧＡＣfＴＧＴＡＴＡＴＡＡＡＧＡＧＴ　ＡＣＣｆｌ；ＡＧ：ＡＣＴ（：　ＧＣＣＡＧＴＡＣＴＴ　ＧＧＣＡＡＴＧＧＡＣＡＣＣＧＡＣＧＣＧＣＴＴＴＴＡＴ`ＣにＧ２５０　２６０　２７０　２８０　２９０　・３００Ｃ丁ＣＡＣＡＧＡＣＡ　ＣＣＡＡＡＴｆｌ：ＡＣＧ　ＡＡＴＣＴＴ丁Ｇ丁ＴＣＣ丁（：ＧＡＡＡＧ（：　ＣＴＧＧＡ（、；ＡＧＡ　ＡＣＣＡs丁ＡＣＡＡ３１０　３２０　３３０　’３４０　３５０　３６０ＧＡｆｌ：ＣＴＧＣＡＡＡ　ＣＣＣ（：ＧＴＣＣ丁ＣＧＧＡＣＴＣＡＣＴＡ　丁ＣＣＣＣＡＧＡＡＡ　Ｃ；ＣＡＡＴＣＴ丁Ｃ丁　ＴＴＣ丁ＣbＣＣＣＴａｓａ１図２Ｂａｒｎ）ＩＩ図３フラグジョン数じη４フラグジヨン数図５保持時間（分）図６ｒｈ　ｂＦＧＦ−ムティンＣ５２３Ｘｎ９／ｍ））図７図８（Ａ）ｂＦＧＦ　（ｐｇ／ウェル）図１０−（１）ｂＦＧＦ　Ｃｐｇ／ウェル）図１Ｏ−（２）ｂＦＧＦ　（ｐｇ／ウェル）図　１ｌ−（１）ｂＦＧＦ　（ｐｇ／ウェル）准図１３（１）塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）蛋白質の生物活性を免疫的に中和し、高感度にｂＦＧＦ蛋白質と結合するモノクロ国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

（１）次の性質を有し、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）蛋白質の生物活性を免疫的に中和し、高感度にｂＦＧＦ蛋白質と結合するモノクローナル抗体：（ａ）分子量：約１４０，０００〜１６０，０００（ｂ）酸性線維芽細胞増殖因子と交差反応しない。（ｃ）免疫グロブリンクラスがＩｇＧ１に属する。（ｄ）ｒｈｂＦＧＦムテインＣＳ２３（ｈｂＦＧＦ中７０位および８８位のシステインがセリンで置換されているムテイン）に結合する。（ｅ）２ｎｇ／ｍｌ　ｂＦＧＦ存在下におけるヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥ）の増殖を、５０ｎｇ／ｍｌ添加により完全に抑制する。（ｆ）モノクローナル抗体ＭｏＡｂｌ２（固相）とペルオキシダーゼ標識化抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法により、２０ｐｇ／ｍｌのｂＦＧＦ蛋白質を定量できる。
（２）ｂＦＧＦ蛋白質が、アミノ酸配列：【配列があります】を含むポリペプチドである請求項１記載のモノクローナル抗体。
（３）ｂＦＧＦの少なくとも一個のシステインがセリンで置換されているムテインで免疫した哺乳動物の脾臓細胞と、同種または異種のリンパ球様細胞とを融合させて得られるクローン化されたハイブリドーマ。
（４）哺乳動物がマウスである請求項３記載のハイブリドーマ。
（５）リンパ球様細胞がミエローマである請求項３記載のハイブリドーマ。
（６）ムテインが、アミノ酸配列：【配列があります】を含むポリペプチドである請求項３記載のハイブリドーマ。
（７）マウス３Ｈ３細胞の性質を有する請求項６記載のハイブリドーマ。
（８）ｂＦＧＦの少なくとも一個のシステインがセリンで置換されているムテインで免疫した哺乳動物の脾臓細胞と、同種または異種のリンパ球様細胞とを細胞融合し、クローニングすることを特徴とする該脾臓細胞と該リンパ球様細胞とからなるクローン化されたハイブリドーマの製造法。
（９）哺乳動物がマウスである請求項８記載の製造法。
（１０）リンパ球様細胞がミエローマである請求項８記載の製造法。
（１１）ムテインが、アミノ酸配列：【配列があります】を含むポリペプチドである請求項８記載の製造法。
（１２）ｂＦＧＦの少なくとも一個のシステインがセリンで置換されたムテインで免疫した哺乳動物の脾臓細胞と、同種または異種のリンパ球様細胞とからなるクローン化されたハイブリドーマを液体培地中または哺乳動物の腹腔内で増殖し、モノクローナル抗体を生成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする、請求項１記載のモノクローナル抗体の製造法。
（１３）哺乳動物がマウスである請求項１２記載の製造法。
（１４）リンパ球様細胞がミエローマである請求項１２記載の製造法。
（１５）ムテインが、アミノ酸配列：【配列があります】を含むポリペプチドである請求項１１記載の製造法。
（１６）請求項１記載のモノクローナル抗体を用いることを特徴とするｂＦＧＦ蛋白質の精製法。
（１７）請求項１記載のモノクローナル抗体を用いることを特徴とするｂＦＧＦ蛋白質の検出、定量法。
（１８）ｂＦＧＦが、アミノ酸配列：【配列があります】を含むポリペプチドである請求項１７記載の検出、定量法。
（１９）酵素免疫測定法を行なう請求項１７記載の検出、定量法。
（２０）請求項１記載のモノクローナル抗体を含有するｂＦＧＦ蛋白質の検出、定量のための試薬キット。
（２１）モノクローナル抗体が請求項３ないし５のいずれかのクローン化されたハイブリドーマによって製造されたものである、請求項２０記載の試薬キット。
（２２）ｂＦＧＦ蛋白質がｂＦＧＦの少なくとも一個のシステインがセリンで置換されているムテインである、請求項２１記載の試薬キット。
（２３）酵素標識免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）において使用される、請求項２１記載の試薬キット。