JPS60145088A - 動物細胞培養用組成物の製造法 - Google Patents
動物細胞培養用組成物の製造法Info
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- JPS60145088A JPS60145088A JP59000521A JP52184A JPS60145088A JP S60145088 A JPS60145088 A JP S60145088A JP 59000521 A JP59000521 A JP 59000521A JP 52184 A JP52184 A JP 52184A JP S60145088 A JPS60145088 A JP S60145088A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、動物細胞培養用組成物の製造法に関するう
動物細胞や動物組織の培養には、細胞増殖促進物質とし
て、動物血清を基礎培地へ添加することが不可欠とされ
ているが、近年の細胞学や免疫学の進歩、動物１ｆｌｌ
Ｉｌ泡の大量培養法の進歩に伴ない血清の需要量は著し
く増加している。
て、動物血清を基礎培地へ添加することが不可欠とされ
ているが、近年の細胞学や免疫学の進歩、動物１ｆｌｌ
Ｉｌ泡の大量培養法の進歩に伴ない血清の需要量は著し
く増加している。
血清の使用に際しては、動物の種類や年令、微生物速入
の有無、細胞毒性物質の有無、抗体や増殖阻害物質の有
無等の厳重なチェックが必要とされ、それ等に要する労
力、′Ｒ用はかなりのものとなシ、又希望条件に見合う
血清ロットの数や量も限られる場合が多い。
の有無、細胞毒性物質の有無、抗体や増殖阻害物質の有
無等の厳重なチェックが必要とされ、それ等に要する労
力、′Ｒ用はかなりのものとなシ、又希望条件に見合う
血清ロットの数や量も限られる場合が多い。
各種の血清のなかで、胎児牛血清および新生仔牛血清は
細胞増殖促進効果、不用物質混在量等の面で他の血清よ
り優れているため需要量は著しく増大しているが、これ
らは供給源が限られているため、価格は高騰し、入手さ
えも困難を来し大きな問題となって来ている。
細胞増殖促進効果、不用物質混在量等の面で他の血清よ
り優れているため需要量は著しく増大しているが、これ
らは供給源が限られているため、価格は高騰し、入手さ
えも困難を来し大きな問題となって来ている。
かかる状況下、本発明者らは、鋭意研究を行い、胎児や
新生の仔牛血清のみならず成牛はもとよシ馬、羊等の大
量採取が容易な動物の血清を原料とする、優れた細胞増
殖効果を有し、不用又は有害物質の混在が少ない動物細
胞培養用組成物を、安価かつ容易に得ることのできる本
発明の方法を完成した。
新生の仔牛血清のみならず成牛はもとよシ馬、羊等の大
量採取が容易な動物の血清を原料とする、優れた細胞増
殖効果を有し、不用又は有害物質の混在が少ない動物細
胞培養用組成物を、安価かつ容易に得ることのできる本
発明の方法を完成した。
すなわち、本発明は哺乳動物の血清を、混在微生物の不
活化工程および塩析、脱塩工程を含む精製処理に付すこ
とを特徴とする哺乳動物血清由来の動物細胞培養用組成
物の製造法を提供するものである。
活化工程および塩析、脱塩工程を含む精製処理に付すこ
とを特徴とする哺乳動物血清由来の動物細胞培養用組成
物の製造法を提供するものである。
本発明に用いられる哺乳動物の血清は、いがなる種に由
来するものでもよいが、原料入手の容易さなどから牛、
馬、羊などの血清が有利に使用される。
来するものでもよいが、原料入手の容易さなどから牛、
馬、羊などの血清が有利に使用される。
哺乳動物の年令は、胎児、新生作動物、仔動物、成動物
のいずれをも問わないが、本発明の製造法においては、
成動物の血清をも原料としうる。
のいずれをも問わないが、本発明の製造法においては、
成動物の血清をも原料としうる。
本発明において、混在微生物の不活化工程は、動物体由
来の又は採血後に速入してくる可［１に性のある微生物
を不活化することを目的とするが、混在微生物は通常ウ
ィルスやマイコプラズマなどであるので、これらに対す
る不活化力が強力でかっ血清中の細胞増殖促進物質には
悪影響が少ないような不活化剤を血清に添加して処理す
ることが好ましい。不活化剤としては、エチレンオキサ
イ、プロピレンオキサイドなどのｃ２−４のアルヶパル
オキザイド類やグリオキサ−〃、グルター望レしドなど
ジアルデヒド類が有効であるが、不活化力および増殖促
進物質に対する影彎度等の点からエチレンオキサイドが
特に優れておシ、とシゎけ液状エチレンオキサイドが好
ましい。
来の又は採血後に速入してくる可［１に性のある微生物
を不活化することを目的とするが、混在微生物は通常ウ
ィルスやマイコプラズマなどであるので、これらに対す
る不活化力が強力でかっ血清中の細胞増殖促進物質には
悪影響が少ないような不活化剤を血清に添加して処理す
ることが好ましい。不活化剤としては、エチレンオキサ
イ、プロピレンオキサイドなどのｃ２−４のアルヶパル
オキザイド類やグリオキサ−〃、グルター望レしドなど
ジアルデヒド類が有効であるが、不活化力および増殖促
進物質に対する影彎度等の点からエチレンオキサイドが
特に優れておシ、とシゎけ液状エチレンオキサイドが好
ましい。
液状エチレンオキサイドを用いる場合、その添加量は０
．１〜５容量％、好ましくは１〜３容量％であシ、不活
化処理条件としては、０’−３０ｔ：。
．１〜５容量％、好ましくは１〜３容量％であシ、不活
化処理条件としては、０’−３０ｔ：。
好ましくは５℃〜室温で１〜７日間、好ましくは２〜５
日間放置する。他の不活性化剤を用いる場合も上記に準
じて使用することができる。混在微生物の不活化のため
に添加された不活化剤の除去にあたっては、通常特別な
処理を必要とせず、放置することによシまたは他の操作
を行っている間に除去されるが、透析等によりｍ極的に
除去することもできる。
日間放置する。他の不活性化剤を用いる場合も上記に準
じて使用することができる。混在微生物の不活化のため
に添加された不活化剤の除去にあたっては、通常特別な
処理を必要とせず、放置することによシまたは他の操作
を行っている間に除去されるが、透析等によりｍ極的に
除去することもできる。
本発明における塩析、脱塩工程は、例えば下記によシ行
われる。
われる。
塩析には、無機塩類などの塩類が用いられる。
無機塩としては、アンモニウム塩（硫酸アンモニウム、
塩化アンモニウムなど）、ナトリウム塩（塩化ナトリウ
ムなど）、カリウム塩（戻酸カリウム）などがあげられ
るが、アンモニウム塩トシゎけ硫酸アンモニウム（硫安
）が好適である。
塩化アンモニウムなど）、ナトリウム塩（塩化ナトリウ
ムなど）、カリウム塩（戻酸カリウム）などがあげられ
るが、アンモニウム塩トシゎけ硫酸アンモニウム（硫安
）が好適である。
本発明の製造法においては、通常の塩析方法に従い、原
料の血清または前記した混在微生物の不活性化工程を経
た血清を、溶媒（水、エタノール、含水エタノールなど
）に溶解゛または懸濁させ、ｋ４Ａ＜ｎを所定の下限濃
度になるまで加えて飽和させ、析出した沈殿を除去し上
清を得る。この上清にさらに塩類を加え所定の上限濃度
にして飽和させ、析出する沈殿を採取することによシ必
要な両分が得られる。
料の血清または前記した混在微生物の不活性化工程を経
た血清を、溶媒（水、エタノール、含水エタノールなど
）に溶解゛または懸濁させ、ｋ４Ａ＜ｎを所定の下限濃
度になるまで加えて飽和させ、析出した沈殿を除去し上
清を得る。この上清にさらに塩類を加え所定の上限濃度
にして飽和させ、析出する沈殿を採取することによシ必
要な両分が得られる。
さらに具体的には、塩類として＠ｔ、酸アンモニウムを
使用する場合、それの下限濃度として、４０％以上、好
ましくは５０％以上、とシわけ５５％、上限濃度として
８０％以下、とりわけ７０％で塩析するのが好ましい。
使用する場合、それの下限濃度として、４０％以上、好
ましくは５０％以上、とシわけ５５％、上限濃度として
８０％以下、とりわけ７０％で塩析するのが好ましい。
また他の塩類を使用する場合は、上記した硫酸アンモニ
ウム濃度に相当する所定濃度で塩析することができる。
ウム濃度に相当する所定濃度で塩析することができる。
上清と沈殿の分離は、遠心等によシ有利になされる。
得られた沈殿は生理食塩水等に溶解した後、透析、限外
濾過等の方法で脱塩する。
濾過等の方法で脱塩する。
透析は、例えば透析膜などを用いて公知の方法に準じて
実施できる。限外−過を行う場合は、例えば分子量１０
００以下の物質を通過させる限外沖過膜を用いて加圧し
て濾過すればよい。
実施できる。限外−過を行う場合は、例えば分子量１０
００以下の物質を通過させる限外沖過膜を用いて加圧し
て濾過すればよい。
得られた動物細胞培養用組成物は通常２０〜８０”ｆ／
ｍｌの濃度になるよう生理食塩水等で調製してメンブラ
ンフィルタ−等による除菌濾過を行なった後、必要によ
シ凍結または凍結乾燥して保存することができる。
ｍｌの濃度になるよう生理食塩水等で調製してメンブラ
ンフィルタ−等による除菌濾過を行なった後、必要によ
シ凍結または凍結乾燥して保存することができる。
本発明の哺乳動物由来の動物細胞培養用組成物φ製造法
においては、上記した混在微生物の不活１ｒ、工程およ
び塩析、脱塩工程の順序はいずれが先でもよい。
においては、上記した混在微生物の不活１ｒ、工程およ
び塩析、脱塩工程の順序はいずれが先でもよい。
本発明によシ製造される動物細胞培養用組成物は、従来
の血清では速入が懸念されていた濾過性微生物を含まな
い無菌性の高いものであシ、取扱いも安全で、胎児牛血
清や新生作中血清をはじめとする公知の各種動物血清や
牛血清アルブミンと同等もしくはそれ以上の細胞増殖促
進物質が得られ、各種ミエローマ、ハイグリドーマ、単
層細胞その他の動物細胞の培養に有利に使用できる。使
用に際しては該組成物を基礎培地に１−１０ｑ／ｙｓｌ
になるよう単独添加又はインシュリン等の微量増殖促進
物質と混合添加して用いることができる。
の血清では速入が懸念されていた濾過性微生物を含まな
い無菌性の高いものであシ、取扱いも安全で、胎児牛血
清や新生作中血清をはじめとする公知の各種動物血清や
牛血清アルブミンと同等もしくはそれ以上の細胞増殖促
進物質が得られ、各種ミエローマ、ハイグリドーマ、単
層細胞その他の動物細胞の培養に有利に使用できる。使
用に際しては該組成物を基礎培地に１−１０ｑ／ｙｓｌ
になるよう単独添加又はインシュリン等の微量増殖促進
物質と混合添加して用いることができる。
単層又は付着性培養細胞の多くは基礎培地に加える場合
該組成物のみでも十分に増殖するが、ミエローマ系の細
胞の多くは該組成物と微量増殖促進物質を混合した時に
良好な細胞増殖が得られる。
該組成物のみでも十分に増殖するが、ミエローマ系の細
胞の多くは該組成物と微量増殖促進物質を混合した時に
良好な細胞増殖が得られる。
該組成物は硫安４０〜８０％濃度に相当する塩析画分を
含有するものであり、細胞毒性物質、増殖阻害物質、抗
体等の有害又は不用物質を有さず、アルブミンを主とす
る分子ｆｉ６０．０００〜８０．０００のタンパク質を
含有するが、従来の牛血清アルブミンに比べ、よシ多種
類の細胞に優れた細胞増殖促進効果が得られる。更に、
本発明の組成物は動物組織の培養にも用いることができ
、また組成物含有培地で動物細胞の継代培養が可能であ
る。
含有するものであり、細胞毒性物質、増殖阻害物質、抗
体等の有害又は不用物質を有さず、アルブミンを主とす
る分子ｆｉ６０．０００〜８０．０００のタンパク質を
含有するが、従来の牛血清アルブミンに比べ、よシ多種
類の細胞に優れた細胞増殖促進効果が得られる。更に、
本発明の組成物は動物組織の培養にも用いることができ
、また組成物含有培地で動物細胞の継代培養が可能であ
る。
以下に実施例によシ、本発明をさらに具体的に説明する
がこれらに本発明が限定されるものではない。
がこれらに本発明が限定されるものではない。
実施例１ （有効画分の選別）
作中血清を硫酸アンモニウムで分画し、各画分の細胞増
殖促進効果を調べた。常法に従って硫酸アンモニウムに
よる塩析を行ない、０〜５２％。
殖促進効果を調べた。常法に従って硫酸アンモニウムに
よる塩析を行ない、０〜５２％。
５２〜５７％、５７〜６２％、６２〜６７％。
６７〜７２％および７２〜８０％の段階的な塩析画分を
採取し、各画分の沈殿を生理食塩水に溶解後、生理食塩
水で透析した。
採取し、各画分の沈殿を生理食塩水に溶解後、生理食塩
水で透析した。
ｉ析液ｔ−メンブレンフィルター（マイレックス−ＧＶ
、０．２２μｍ；ミリポア社製）を用い除菌濾過した後
、ＤＭＥ培地（日本水産側）とＦ１２培地（フロー社製
）の１：１の混合培地（以下ＤＭＥ／Ｆ１２と略称する
）に添加し、増殖促進物質であるインスリン（シグマ社
製）１０μ９／ｒｘｌ 。
、０．２２μｍ；ミリポア社製）を用い除菌濾過した後
、ＤＭＥ培地（日本水産側）とＦ１２培地（フロー社製
）の１：１の混合培地（以下ＤＭＥ／Ｆ１２と略称する
）に添加し、増殖促進物質であるインスリン（シグマ社
製）１０μ９／ｒｘｌ 。
トランスフェリン（ミリポア社製）２０μｑ／ｌｌ、エ
タノールアミン（和光純薬製）２μＭおよびセレン酸ソ
ーダ（和光純薬製）２．５Ｘ１０−８Ｍ〔以上の各増殖
促進物質およびそれらの濃度の混合添加物をＩＴＥＳと
略称する；村上ら、グロシージングス・ナショナル・ア
カデミ−・オプ・サイエンス ＵＳＡ 、第７９巻、１
１５８−１１６２頁（１９８２））との混合添加による
細胞増殖率を比較検問した。対照として塩析処理前血清
。
タノールアミン（和光純薬製）２μＭおよびセレン酸ソ
ーダ（和光純薬製）２．５Ｘ１０−８Ｍ〔以上の各増殖
促進物質およびそれらの濃度の混合添加物をＩＴＥＳと
略称する；村上ら、グロシージングス・ナショナル・ア
カデミ−・オプ・サイエンス ＵＳＡ 、第７９巻、１
１５８−１１６２頁（１９８２））との混合添加による
細胞増殖率を比較検問した。対照として塩析処理前血清
。
胎児牛血清（５Ｆ’ｌ／ｍｌ ） 、および牛血清アル
ブミン（５ＩＩＩｙ／ｍｔ）添加群を置いた。使用細胞
は工ｇＴ２産生ヒトミエローマであるＵ ２６６ ＃ｌ
胞〔ジャーナル・オグ・クリニカル・エクスベリメンタ
ル・イムノロジー、第７巻、４７７頁（１９７０））を
クローニングして得たＩｉ Ｇ Ｅ −４１細胞および
抗ヒトＩｇＥ 抗体産生マウスハイブリドーマであるｌ
−６３（特開昭５８−９６０２８号公報参照）を使用し
た。各種調製培地を２４穴マルチデイツシユに１＋ｚ／
／ウェルずつ分注した後、ＮＧＥ−４１１ｔＩＩＩ胞又
はｌ−６３，ｍ胞浮遊液（細胞数５×１０５〜１．５
Ｘ １０ ／ｍｌ ）を０．１ ｒｙｅずつ分注し、５
％ＣＯ２インキュベーターで３７℃４〜７日培餐し、各
ウェルの細胞数をコールタ−カウンター（日本科学機械
製）で測定した。結果を第１表に示す。＋ｌ’１ｌｌｌ
ｌｉｅ樋増殖促進効果は細胞増殖率（培イを後の創ｌ
Ｉｌ！２数＋培作開始時の卸１胞数）で示した。
ブミン（５ＩＩＩｙ／ｍｔ）添加群を置いた。使用細胞
は工ｇＴ２産生ヒトミエローマであるＵ ２６６ ＃ｌ
胞〔ジャーナル・オグ・クリニカル・エクスベリメンタ
ル・イムノロジー、第７巻、４７７頁（１９７０））を
クローニングして得たＩｉ Ｇ Ｅ −４１細胞および
抗ヒトＩｇＥ 抗体産生マウスハイブリドーマであるｌ
−６３（特開昭５８−９６０２８号公報参照）を使用し
た。各種調製培地を２４穴マルチデイツシユに１＋ｚ／
／ウェルずつ分注した後、ＮＧＥ−４１１ｔＩＩＩ胞又
はｌ−６３，ｍ胞浮遊液（細胞数５×１０５〜１．５
Ｘ １０ ／ｍｌ ）を０．１ ｒｙｅずつ分注し、５
％ＣＯ２インキュベーターで３７℃４〜７日培餐し、各
ウェルの細胞数をコールタ−カウンター（日本科学機械
製）で測定した。結果を第１表に示す。＋ｌ’１ｌｌｌ
ｌｉｅ樋増殖促進効果は細胞増殖率（培イを後の創ｌ
Ｉｌ！２数＋培作開始時の卸１胞数）で示した。
各硫安画分の単独添加においては、ＮＧＥ−４１細胞で
は５７〜６２％画分で、また、エーロ３細胞では５７〜
６２％画分および６２〜６７％画分で中程度の増殖率が
得られた。ＩＴＥＳとの混合添加においては、ＮＧＥ−
４１細胞では５７〜６２％画分および６２〜６７％画分
において、また、■−６３細胞では５７〜６２％画分。
は５７〜６２％画分で、また、エーロ３細胞では５７〜
６２％画分および６２〜６７％画分で中程度の増殖率が
得られた。ＩＴＥＳとの混合添加においては、ＮＧＥ−
４１細胞では５７〜６２％画分および６２〜６７％画分
において、また、■−６３細胞では５７〜６２％画分。
６２〜６７％両分および６７〜７２％画分においてかな
り高い細胞増殖率が得られた。これらの高い細胞増殖率
は胎児牛血清のそれにはおよばないまでも十分に使用に
たる増殖率であり、従来よｊ４′使用されてきた牛血渭
アルブミンの＃ＩＩＩ胞増殖４１９実施例２ （各種動
物血清中の細胞増殖促進物質のイ灸索） 血清の供給源の拡大を目的として、新生作中崩清、仔牛
血清および成牛血清に加えて馬および羊の血清について
も検討した。塩析前血清および硫安塩析画分について、
各種細胞に対する増殖促進効果を実施例１と同様にそれ
等単独およびＩＴＥｉＳとの混合添加について検討した
。その結果を第２表に示す。
り高い細胞増殖率が得られた。これらの高い細胞増殖率
は胎児牛血清のそれにはおよばないまでも十分に使用に
たる増殖率であり、従来よｊ４′使用されてきた牛血渭
アルブミンの＃ＩＩＩ胞増殖４１９実施例２ （各種動
物血清中の細胞増殖促進物質のイ灸索） 血清の供給源の拡大を目的として、新生作中崩清、仔牛
血清および成牛血清に加えて馬および羊の血清について
も検討した。塩析前血清および硫安塩析画分について、
各種細胞に対する増殖促進効果を実施例１と同様にそれ
等単独およびＩＴＥｉＳとの混合添加について検討した
。その結果を第２表に示す。
胎児牛血清、新生作中血清、仔牛血清、成牛血清、焉血
清および羊血清の各血清について実施例１の成績をふま
えて硫酸アンモニウム４５〜８０％飽和又は５７〜７０
％飽和の両分を採取し、生唾食塩水に透析後除菌沖過し
た。各種塩析前血清および硫安塩析画分を最終蛋白量に
して、ミエローマ系では５ダ／薄ｔになるようＤＭＥ／
Ｆ’１２、培地に添加し、単Ｍ軸胞系では３Ｉｖ／＊／
になるようＭＥＭ培地（日永製薬社製）に添加し、単独
で反はＩＴＥＳとの混合添加で、各細胞に対する増殖促
進効果を細胞増殖率で調べた。使用細胞はミ、エローマ
トシてｔｉＩｇＥ 産生ヒトミエローマであるＮＧＥ−
４１細胞とマウスミエローマであるＭｐａｉｌ（大日本
製薬よシ購入）を用い、単層細胞としてはすμ腎細胞系
のＶｅｒｏ細胞（フロー社よシ購入）とブタ腎細胞系の
ｐｓ細胞（京都大学ウィルス研究所よシ分与された）を
用いた。
清および羊血清の各血清について実施例１の成績をふま
えて硫酸アンモニウム４５〜８０％飽和又は５７〜７０
％飽和の両分を採取し、生唾食塩水に透析後除菌沖過し
た。各種塩析前血清および硫安塩析画分を最終蛋白量に
して、ミエローマ系では５ダ／薄ｔになるようＤＭＥ／
Ｆ’１２、培地に添加し、単Ｍ軸胞系では３Ｉｖ／＊／
になるようＭＥＭ培地（日永製薬社製）に添加し、単独
で反はＩＴＥＳとの混合添加で、各細胞に対する増殖促
進効果を細胞増殖率で調べた。使用細胞はミ、エローマ
トシてｔｉＩｇＥ 産生ヒトミエローマであるＮＧＥ−
４１細胞とマウスミエローマであるＭｐａｉｌ（大日本
製薬よシ購入）を用い、単層細胞としてはすμ腎細胞系
のＶｅｒｏ細胞（フロー社よシ購入）とブタ腎細胞系の
ｐｓ細胞（京都大学ウィルス研究所よシ分与された）を
用いた。
ミエローマに関する培養方法、 ＃ｌｌ＋胞増殖率等は
実施例１と同様に行った。
実施例１と同様に行った。
単層細胞は、各種調製培地を２４穴マｌレチデイツシユ
に１ｒｔｌ／ウニμずつ分注後、Ｖｅｒｏ細胞又はｐｓ
細胞の浮遊液（，１ｆｆｌ胞斂５×１０〜１．５×１０
６／＊ｉりを０．１ ｍｌずつ分注し、５％ＣＯ２イン
キュベーターで３７ｔＥ５日間培養後、上清をすて新た
に０．２５％トリプシン液を１ｔｔｔｌずつ添加し細胞
をマルチディツシュよシ剥がして細胞浮遊液として、コ
ールタ−カウンターで細胞数を測定した。
に１ｒｔｌ／ウニμずつ分注後、Ｖｅｒｏ細胞又はｐｓ
細胞の浮遊液（，１ｆｆｌ胞斂５×１０〜１．５×１０
６／＊ｉりを０．１ ｍｌずつ分注し、５％ＣＯ２イン
キュベーターで３７ｔＥ５日間培養後、上清をすて新た
に０．２５％トリプシン液を１ｔｔｔｌずつ添加し細胞
をマルチディツシュよシ剥がして細胞浮遊液として、コ
ールタ−カウンターで細胞数を測定した。
（以下余白）
第２表
表中の数字は細胞増殖率を示した。
＄１）４５〜８０％飽和または５７〜７０％飽和の硫安
塩析画分 ＊２） （’ ）内は細胞毒性を示さなかった成牛血清
を使用した場合の値を示した。
塩析画分 ＊２） （’ ）内は細胞毒性を示さなかった成牛血清
を使用した場合の値を示した。
ミエローマ株についてみると、羊血清以外の各血清の単
独添加では塩析後の細胞増殖率が塩析前血清に比べ低下
するが硫安塩析画分にＩＴＥＳを混合添加することによ
シ塩析前血清の細胞増殖率と同等もしくはそれ以上の良
好な細胞増殖率を示しだ。
独添加では塩析後の細胞増殖率が塩析前血清に比べ低下
するが硫安塩析画分にＩＴＥＳを混合添加することによ
シ塩析前血清の細胞増殖率と同等もしくはそれ以上の良
好な細胞増殖率を示しだ。
羊血清においては、塩析前血清と硫安塩析画分の単独添
加では、両者間で細胞増殖率は殆んど変らないが、硫安
塩析画分にＩＴＥＳを混合添加すると細胞増殖率はかな
り高くなシ、細胞の種類によっては良好な細胞増殖率が
得られた。
加では、両者間で細胞増殖率は殆んど変らないが、硫安
塩析画分にＩＴＥＳを混合添加すると細胞増殖率はかな
り高くなシ、細胞の種類によっては良好な細胞増殖率が
得られた。
一方、単層細胞についてみるとＶｅｒｏ細胞では、胎児
牛血清以外の血清を用いた場合、硫安塩析両分の細胞増
殖率が塩析前の血清に比べ、同等もしくはやや高い値を
示し、特に硫安塩析画分と工ＴＥＳを混合添加すると良
好な細胞増殖率が得られまた細胞毒性を示した成牛血清
を硫安塩析することにより、毒性物質が除去されること
は実施例・１の場合と同様であった。
牛血清以外の血清を用いた場合、硫安塩析両分の細胞増
殖率が塩析前の血清に比べ、同等もしくはやや高い値を
示し、特に硫安塩析画分と工ＴＥＳを混合添加すると良
好な細胞増殖率が得られまた細胞毒性を示した成牛血清
を硫安塩析することにより、毒性物質が除去されること
は実施例・１の場合と同様であった。
牛血清アルブミンと比較すると両細胞に対し硫安塩析画
分では牛血清アルブミンより高い細胞増殖率が得られ、
特にＩＴＥＳとの混合添加でその差は顕著であった。以
上単層細胞においても各種血清を塩析してＸＴＥＳと混
合添加することによシ良好な細胞増殖促進効果が得られ
た。
分では牛血清アルブミンより高い細胞増殖率が得られ、
特にＩＴＥＳとの混合添加でその差は顕著であった。以
上単層細胞においても各種血清を塩析してＸＴＥＳと混
合添加することによシ良好な細胞増殖促進効果が得られ
た。
実施例３ （血清速入微生物に対する不活化剤の効果）
動物血清中には動物体由来のウィルスやマイコプラズマ
を主とする微生物が混在している危険性があり、これ等
の血清を細胞増殖促進物質として使用すると、混在微生
物とくにｆ過性微生物が細胞に感染して細胞の増殖を阻
害したり死滅させ、大きな障害金きたすことがある。
を主とする微生物が混在している危険性があり、これ等
の血清を細胞増殖促進物質として使用すると、混在微生
物とくにｆ過性微生物が細胞に感染して細胞の増殖を阻
害したり死滅させ、大きな障害金きたすことがある。
しかし、血清を加熱減菌することは不可能であり除菌方
法としては現在のところｐ過法にたよらざるを得ないが
、ウィルス等のｐ過性微生物はこの方法では除去し得な
い。これに対処するため、血清中に存在する微生物を完
全に不活化しかつ血清中の細胞増殖促進物質を阻害しな
いような不活化剤を検索した。
法としては現在のところｐ過法にたよらざるを得ないが
、ウィルス等のｐ過性微生物はこの方法では除去し得な
い。これに対処するため、血清中に存在する微生物を完
全に不活化しかつ血清中の細胞増殖促進物質を阻害しな
いような不活化剤を検索した。
壕ず、微生物に対する不活化効果を調べるため微生物を
含まず細胞増殖促進効果の良好な正常作中血清中に、混
入微生物としてマイコプラズマ。
含まず細胞増殖促進効果の良好な正常作中血清中に、混
入微生物としてマイコプラズマ。
・ｉ＋ｔ：笛ウィルスおよび日本脳炎ウィルスを別個に
浮遊させた。浮ｊｔｑ 頃はマイコプラズマ、１０ＰＦ
ＩＪ／’ｍｅ、痘笥ウイμス： １０８ＴＣＩＤ５＋）
／Ｗ／！および日本脳炎ライｌレス−１０６ＴＣＩＤ５
ｏ／ｖＩＣとした。
浮遊させた。浮ｊｔｑ 頃はマイコプラズマ、１０ＰＦ
ＩＪ／’ｍｅ、痘笥ウイμス： １０８ＴＣＩＤ５＋）
／Ｗ／！および日本脳炎ライｌレス−１０６ＴＣＩＤ５
ｏ／ｖＩＣとした。
各Ｕ＋生物浮ｉｌ＆ ｍｕ清に第３表にかかげる各種不
活化剤を添加し諸条件下で不活化処理を行なった。不活
化処理後、各血清を生理食塩水に対してＩ＆透析し不活
化剤を除去した後、各血清中の残存微生物量を測定し不
活化剤無添加で同様に処理した血清中の残存微生物量と
比較した。
活化剤を添加し諸条件下で不活化処理を行なった。不活
化処理後、各血清を生理食塩水に対してＩ＆透析し不活
化剤を除去した後、各血清中の残存微生物量を測定し不
活化剤無添加で同様に処理した血清中の残存微生物量と
比較した。
さらにこれ等の不活化剤の細胞増殖促進物質に与える影
響を調べた。方法は正常作中血清に各不活化剤を添加し
前述と同様の諸条件下で不活化処理を行なった後、一部
はそのまま生理食塩水に対して１夜透析し塩析前血清と
し、残シは硫酸アンモニウム５７〜８０％飽和で塩析し
生理食塩水に対して１夜透析し硫安塩析画分とした。各
血清材料を蛋白最５１１９ ／ ｍｌになるようＤＭＥ
／Ｆ’１２培地に添加し、単独又はＩＴＥＳとの混合添
加の条件で、実施例１と同様の培養方法でＮＧＲニー４
１細胞を培養し、各細胞増殖率を比較した。
響を調べた。方法は正常作中血清に各不活化剤を添加し
前述と同様の諸条件下で不活化処理を行なった後、一部
はそのまま生理食塩水に対して１夜透析し塩析前血清と
し、残シは硫酸アンモニウム５７〜８０％飽和で塩析し
生理食塩水に対して１夜透析し硫安塩析画分とした。各
血清材料を蛋白最５１１９ ／ ｍｌになるようＤＭＥ
／Ｆ’１２培地に添加し、単独又はＩＴＥＳとの混合添
加の条件で、実施例１と同様の培養方法でＮＧＲニー４
１細胞を培養し、各細胞増殖率を比較した。
以上の結果を第３表に示す。
（以下金白）
実施例４
成牛血清ＩＪによく攪拌しながら液状エチレンオキサイ
ド１５ｔｘｌを滴下した。添加後５℃で５日間放置した
。これに硫安３５０ｇを少しずつ加え・１１ て硫安を溶解させ５℃で一夜放置した。生じた沈：得ら
れた上清液に更に硫安１４０ｇを少しずつ加えた。硫安
溶解後、そのまま５ｔで一夜放置した。
ド１５ｔｘｌを滴下した。添加後５℃で５日間放置した
。これに硫安３５０ｇを少しずつ加え・１１ て硫安を溶解させ５℃で一夜放置した。生じた沈：得ら
れた上清液に更に硫安１４０ｇを少しずつ加えた。硫安
溶解後、そのまま５ｔで一夜放置した。
生じた沈殿を遠心分離（９０００Ｇ、２０分）で集め、
約１００ｓｔ／の生理食塩水に溶解した。この溶解液を
透析膜（ビスキング社製）に入れ、１５！の生理食塩水
に対して５℃で一夜透析した。こ＼で透析液を新しい生
理食塩水１５Ｊに代え、更に５℃で一夜透析した。
約１００ｓｔ／の生理食塩水に溶解した。この溶解液を
透析膜（ビスキング社製）に入れ、１５！の生理食塩水
に対して５℃で一夜透析した。こ＼で透析液を新しい生
理食塩水１５Ｊに代え、更に５℃で一夜透析した。
透析内液をとシ出し、蛋白量を６０１１９７ゴになるよ
うに生理食塩水にて調整した。メングレンフイμター（
０，２２μｍ 、ミリポア社製）で線区濾過し、動物細
胞培養用組成物５００ｔｌ？を得た。
うに生理食塩水にて調整した。メングレンフイμター（
０，２２μｍ 、ミリポア社製）で線区濾過し、動物細
胞培養用組成物５００ｔｌ？を得た。
この培養組成物を蛋白量にして３ｍｆｌ／ｍｌになるよ
うにＤＭＥ／Ｆ１２（１：１）の基礎培地３００ｍ１に
加Ｌ、更に４ンシュリン３ｑ、トランスフェリン６ダ、
エタノーμアミン３６．６μｇ ｔセレン酸ナトリウム
１４μ９を添加し０．２２μのメンブランフィルタ−（
ミリボア社製）で除菌緩揚淳ｉ幅出願人 工業技術院長 手続補正書（自発） 昭和５９年１１月２２日 特許庁長官殿 ／事件の表示 明細書の発明の詳細な説明１図面の簡単な説明の欄及び
図面 ５ 補正の内容 （１）明細書第１０頁の第１表の末尾から下へ３行目お
よび第４９頁の第３表の末尾から下へ３行目にそれぞれ
「−実験せず」を挿入する。
うにＤＭＥ／Ｆ１２（１：１）の基礎培地３００ｍ１に
加Ｌ、更に４ンシュリン３ｑ、トランスフェリン６ダ、
エタノーμアミン３６．６μｇ ｔセレン酸ナトリウム
１４μ９を添加し０．２２μのメンブランフィルタ−（
ミリボア社製）で除菌緩揚淳ｉ幅出願人 工業技術院長 手続補正書（自発） 昭和５９年１１月２２日 特許庁長官殿 ／事件の表示 明細書の発明の詳細な説明１図面の簡単な説明の欄及び
図面 ５ 補正の内容 （１）明細書第１０頁の第１表の末尾から下へ３行目お
よび第４９頁の第３表の末尾から下へ３行目にそれぞれ
「−実験せず」を挿入する。
（２）回書第２１頁５行と６行の間に下記を挿入する。
［実施例５
豚血清について硫安画分の細胞増殖活性を検討した。結
果を第４表に示す６啄血清１１によく攪拌りながら液状
エチレンオキサイド７、５ ｗｅを滴下した。添加後２
５℃で２日間放置した３、このようにして得た３０ツ）
（Ａ、Ｂ、Ｃ）それぞれに硫安３５０ｇを少しずつ加え
て硫安を溶解させ５℃で一夜放置した。生じた沈殿金遠
心分１６（９ｏ。
果を第４表に示す６啄血清１１によく攪拌りながら液状
エチレンオキサイド７、５ ｗｅを滴下した。添加後２
５℃で２日間放置した３、このようにして得た３０ツ）
（Ａ、Ｂ、Ｃ）それぞれに硫安３５０ｇを少しずつ加え
て硫安を溶解させ５℃で一夜放置した。生じた沈殿金遠
心分１６（９ｏ。
ＯＧ 、２０分）で除去した。得られた上清液に更に硫
安１４０ｇを少しずつ加えた。硫安溶解後、そのまま５
℃で一夜放置した。生じた沈殿を遠心−分〜（９０００
Ｇ、２０分）で集め、約１０Ｏｒ／の生理食塩水に溶解
した。この溶解液を透析膜（ビスキング社！ｌ’；！り
に入れ、１５７１の生理食塩水に対して５℃で一夜透析
した。こ！で透析液を新しい生理食塩水１５１に代え、
更に５℃で一夜透析した。
安１４０ｇを少しずつ加えた。硫安溶解後、そのまま５
℃で一夜放置した。生じた沈殿を遠心−分〜（９０００
Ｇ、２０分）で集め、約１０Ｏｒ／の生理食塩水に溶解
した。この溶解液を透析膜（ビスキング社！ｌ’；！り
に入れ、１５７１の生理食塩水に対して５℃で一夜透析
した。こ！で透析液を新しい生理食塩水１５１に代え、
更に５℃で一夜透析した。
透析内液をとシ出し、蛋白量を６０ｑ／ｍｌになるよう
に生理食塩水にて鯛整した。メンブレンフィルター（０
，２２μｍ 、ミリボア社製）で除ｉＷ濾過し、動物細
胞培養用組成物５００ｔ／を得た。
に生理食塩水にて鯛整した。メンブレンフィルター（０
，２２μｍ 、ミリボア社製）で除ｉＷ濾過し、動物細
胞培養用組成物５００ｔ／を得た。
上記組成物２’ｌ／／ｗｌを工８ｃｏｖｅ／ Ｆ １２
基礎培地にＩＴＥＳとともに添加した後、実施例１に
従いミエローマおよびハイグリドーマ計６種の細胞を用
いて細胞増殖活性を胴べた。対照として牛脂児血清およ
び子牛と成牛の硫安画分を用い、これ等の細胞増殖活性
と比較した。豚血清硫安画分の細胞増殖活性は３０ット
間に差は認められず、また牛脂児血清と比較するとやや
活性は劣るものの、子牛および成牛の硫安画分とは同等
もしくはそれ以上の良好な細胞増殖活性を示した。
基礎培地にＩＴＥＳとともに添加した後、実施例１に
従いミエローマおよびハイグリドーマ計６種の細胞を用
いて細胞増殖活性を胴べた。対照として牛脂児血清およ
び子牛と成牛の硫安画分を用い、これ等の細胞増殖活性
と比較した。豚血清硫安画分の細胞増殖活性は３０ット
間に差は認められず、また牛脂児血清と比較するとやや
活性は劣るものの、子牛および成牛の硫安画分とは同等
もしくはそれ以上の良好な細胞増殖活性を示した。
実施例６ （各種基礎培地への本発明の動物細胞培養用
組成物の適用例） 一般に細胞の増殖性の良否は基礎培地と増殖促進用添加
物の種類に大きく依存しておシ、本発明の組成物が細胞
増殖促進効果を最も良く発揮でき得る基礎培地の検索を
合せて行なった。
組成物の適用例） 一般に細胞の増殖性の良否は基礎培地と増殖促進用添加
物の種類に大きく依存しておシ、本発明の組成物が細胞
増殖促進効果を最も良く発揮でき得る基礎培地の検索を
合せて行なった。
培地の検索には工５ｃｏｖｅ Ｃベーリンガー・マンハ
イム・山之内社製、粉末、自家調製（使用書に従い水に
溶解後ｐ過滅菌、以下同じ））、Ｆ’１２（日永社製、
粉末、自家調製）、ＭＥＭ。
イム・山之内社製、粉末、自家調製（使用書に従い水に
溶解後ｐ過滅菌、以下同じ））、Ｆ’１２（日永社製、
粉末、自家調製）、ＭＥＭ。
Ｗｉｌｌｉａｍ −Ｄ 、 Ｗｉｌｌｉａｍ −Ｅ 、
Ｗａｙｍｏｕｔｈ −Ｍ Ｂ７５２／ １ 、 Ｆ’
１ｓｃｈｅｒ、 ＲＰ Ｍニー１６４０゜１９９（以上
ＧＩＢＣＯ社製、液状） 、 ＤＭＥ 、 ＮＣＴＣ−
１０９，ＭｃＣｏｙ ５Ａ、ａｌｐｈａ−ＭＥＭ（以上
ＭＡＢ社製社製状液状１３種類の基礎培地と、Ｓｅｒｕ
ｍｌｅｓｓ Ｍｅｄｉｕｍ （Ｇ Ｉ Ｂ ＣＯ社製、
液状。
Ｗａｙｍｏｕｔｈ −Ｍ Ｂ７５２／ １ 、 Ｆ’
１ｓｃｈｅｒ、 ＲＰ Ｍニー１６４０゜１９９（以上
ＧＩＢＣＯ社製、液状） 、 ＤＭＥ 、 ＮＣＴＣ−
１０９，ＭｃＣｏｙ ５Ａ、ａｌｐｈａ−ＭＥＭ（以上
ＭＡＢ社製社製状液状１３種類の基礎培地と、Ｓｅｒｕ
ｍｌｅｓｓ Ｍｅｄｉｕｍ （Ｇ Ｉ Ｂ ＣＯ社製、
液状。
Ｎｅｕｍａｎ ＆ Ｔｙｔｅｌｌ処法）の計１４種類を
使用した。細胞増殖性の検討にあたっては、上記１４種
類の単独培地および相互に１：１の割合で混合調製した
９１種の混合培地、計１０５種の培地に実施例４に従い
製造した本発明の組成物２１１ｆ／ ／ ｗｉおよびＩ
ＴＦ：Ｓを添加し実施例１に従って細胞を培養し、３代
継代後細胞数を測定をした。
使用した。細胞増殖性の検討にあたっては、上記１４種
類の単独培地および相互に１：１の割合で混合調製した
９１種の混合培地、計１０５種の培地に実施例４に従い
製造した本発明の組成物２１１ｆ／ ／ ｗｉおよびＩ
ＴＦ：Ｓを添加し実施例１に従って細胞を培養し、３代
継代後細胞数を測定をした。
使用細胞はｌ−６３（マウスハイグリドーマ）ＣＥＡ（
マウスハイグリドーマ）およびＨＬ１５−１０（ヒトハ
イグリドーマ）を用いた。
マウスハイグリドーマ）およびＨＬ１５−１０（ヒトハ
イグリドーマ）を用いた。
結果を第５表に示す。
第５表
細胞：ＣＩＡ
＊１ａ−ｎの各単独（表中口で囲んだ部分）および１：
１混合基礎培地に牛血清硫安画分２ＭＩ／肩ｌおよび工
ＴＥＳを添加した。
１混合基礎培地に牛血清硫安画分２ＭＩ／肩ｌおよび工
ＴＥＳを添加した。
中２ 表中の数値は各培地で３代継代培狩後の増殖卸（
胞数を領域変換した値を示す。
胞数を領域変換した値を示す。
）ｒ Ｌ １５−１０
０：死滅
１：５０Ｘ１０ 個／＃７１以下
２：５０〜ｌ０ＱＸＩＯ個／がｔ
３：１００Ｘ１０ 個／ｒ！／以上
ＥＡ
Ｏ：死滅
１：１５Ｘ１０ 個／ｒｒｔｔ以下
２：１５〜２５Ｘ１０ 個／ ｍ１
３：２５Ｘ１０ 個／Ｗｔ以上
−６３
０：死滅
１：１５Ｘ１０’個／ ｖｔｔ以下
２：１５〜３０Ｘ１０ 個／阿ｔ
３：３０Ｘ１０ 個／が２以上
牛胎児血清：対照として各単独基礎培地に牛脂児血清を
１０％量添加した。
１０％量添加した。
牛血溝７μグミン：対照として各単独基礎培地に牛血清
アルブミンを５Ｑ／ｗｌおよび工ＴＥＳを添加した。
アルブミンを５Ｑ／ｗｌおよび工ＴＥＳを添加した。
単独培地についてみると、■−６３では工１’１ＱＯＶ
Ｑ、ＣＥＡではＦ１２に良好な細胞増殖が見られるが、
その他では増殖性は悪く、またＨＬ１５−１０において
は全ての単独培地では良好な増殖が得られなかった。同
様の現象は対照の牛血清アルブミンにおいても認められ
、良好な増殖を促すといわれている牛脂児血清を用いた
場合においても上記３株の細胞に対して同時に良好な増
殖を示す培地−の種類はかなシ限られていた。
Ｑ、ＣＥＡではＦ１２に良好な細胞増殖が見られるが、
その他では増殖性は悪く、またＨＬ１５−１０において
は全ての単独培地では良好な増殖が得られなかった。同
様の現象は対照の牛血清アルブミンにおいても認められ
、良好な増殖を促すといわれている牛脂児血清を用いた
場合においても上記３株の細胞に対して同時に良好な増
殖を示す培地−の種類はかなシ限られていた。
一方混合培地についてみると、Ｘ−６３およル／９
Ｈ’ｒｒ−１０では工５ｃｏｖｅまたはＳｅｔｕｍｌｅ
ｓｓＭｅｄｉｕｍを含んだ混合培地で良好な増殖が見ら
れ、ＣＩＡにおいてはかなシの種類の混合培地で良好な
増殖が見られた。なかでも工５ｃｏｖｅおよびＳｅｒｕ
ｍｌｅｓｓ Ｍｅｄｉｕｍ は多種の培地との混合効果
を発揮した。細胞の増殖性、汎用性等をふまえて総合的
に判断すると、基礎培地は単独使用するよりも混合して
使用する方がはるかに優れた効果が得られ、良好人混合
培地としてはｌ５ｃｏｖｅ ／Ｆ １２、 ｌ５ｃｏｖ
ｅ／Ｓｅｒｕｍｌｅｓｓ Ｍｅｄｉｕｍ、 Ｆ １２／
Ｓｅｒｕｍ −１ｅｓｓ Ｍｅｄｉｕｍ、 ａ］、ｐ
ｈａ −ＭＥＭ／ＳｅｒｕｍｌｅｓｓＭｅｄｉｕｍがあ
げられる。
ｓｓＭｅｄｉｕｍを含んだ混合培地で良好な増殖が見ら
れ、ＣＩＡにおいてはかなシの種類の混合培地で良好な
増殖が見られた。なかでも工５ｃｏｖｅおよびＳｅｒｕ
ｍｌｅｓｓ Ｍｅｄｉｕｍ は多種の培地との混合効果
を発揮した。細胞の増殖性、汎用性等をふまえて総合的
に判断すると、基礎培地は単独使用するよりも混合して
使用する方がはるかに優れた効果が得られ、良好人混合
培地としてはｌ５ｃｏｖｅ ／Ｆ １２、 ｌ５ｃｏｖ
ｅ／Ｓｅｒｕｍｌｅｓｓ Ｍｅｄｉｕｍ、 Ｆ １２／
Ｓｅｒｕｍ −１ｅｓｓ Ｍｅｄｉｕｍ、 ａ］、ｐ
ｈａ −ＭＥＭ／ＳｅｒｕｍｌｅｓｓＭｅｄｉｕｍがあ
げられる。
次に、上記の成績をふまえて２柿培地を混合する際の混
合比についてｌ５ｃｏｖｅとＦ１２培地を用いて検討し
た。ｌ５ｃｏｖｅ （ベーリンガー、マンハイム、山之
内社ｆＡ）とＦ１２（日永社製）を１：０．１：１．１
：２．１：３，１：４，１ニア。
合比についてｌ５ｃｏｖｅとＦ１２培地を用いて検討し
た。ｌ５ｃｏｖｅ （ベーリンガー、マンハイム、山之
内社ｆＡ）とＦ１２（日永社製）を１：０．１：１．１
：２．１：３，１：４，１ニア。
１−１５および０：１の比率で混合し、実施例４で得ら
れた本発明の組成物２１１ｆｌ／ｌｕｔおよびＩＴＥＳ
全添加した後、実施例１に従って培養し、３代納代培養
後の細胞増殖数を測定した。使用細胞はＮＧＥ−４４（
前述しだＮＧＦＪ−４１株の該組成物含有培地馴化株）
、ＣＥＡ（マウスハイプリドーマ）およびエーロ３（マ
ウスハイプリドーマ）を用いた。
れた本発明の組成物２１１ｆｌ／ｌｕｔおよびＩＴＥＳ
全添加した後、実施例１に従って培養し、３代納代培養
後の細胞増殖数を測定した。使用細胞はＮＧＥ−４４（
前述しだＮＧＦＪ−４１株の該組成物含有培地馴化株）
、ＣＥＡ（マウスハイプリドーマ）およびエーロ３（マ
ウスハイプリドーマ）を用いた。
その結果を第１図に示す。いずれの細胞においてもｌ５
ｃｏｖｅまたはＦ１２の単独培地に比べ、各比混合培地
の増殖性はかなシ良く、１Ｉ８ｃｏｖｅ ： Ｆ１２の
混合比 １：１から１＝７において細胞増殖性は良好で
あシ、本発明の組成物を添加した混合培地調製時の培地
混合比はかなシ巾の広いものであるとの結果を得た。
ｃｏｖｅまたはＦ１２の単独培地に比べ、各比混合培地
の増殖性はかなシ良く、１Ｉ８ｃｏｖｅ ： Ｆ１２の
混合比 １：１から１＝７において細胞増殖性は良好で
あシ、本発明の組成物を添加した混合培地調製時の培地
混合比はかなシ巾の広いものであるとの結果を得た。
実施例７ （本発明の動物細胞培養用組成物の回転浮遊
培養における効果） 本発明の組成物の回転浮遊培養への適用性を基礎培地の
種類と組合せて検討した。培地として実施例４で得られ
た組成物（２１Ｍ！／ｘｉ）およびｌＴｌ５を添加した
工５ｃｏｖｅ ／ Ｆ １２ （１： １ ）およびＤ
ＭＥ／Ｆ’１２（１：１）を使用し、エーロ３細胞をシ
アーファーメンタ−（ミツワ理化社製。
培養における効果） 本発明の組成物の回転浮遊培養への適用性を基礎培地の
種類と組合せて検討した。培地として実施例４で得られ
た組成物（２１Ｍ！／ｘｉ）およびｌＴｌ５を添加した
工５ｃｏｖｅ ／ Ｆ １２ （１： １ ）およびＤ
ＭＥ／Ｆ’１２（１：１）を使用し、エーロ３細胞をシ
アーファーメンタ−（ミツワ理化社製。
ＫＭＪ−２ｊ型）にて１ｊ容量で培養した。対照として
同細胞浮遊液を２５６１１＋ 組織培養フラスコ（ファ
ルコン社）に約６ｗ１分注し静置浮遊培養した。その結
果を第２図に示す。
同細胞浮遊液を２５６１１＋ 組織培養フラスコ（ファ
ルコン社）に約６ｗ１分注し静置浮遊培養した。その結
果を第２図に示す。
第２図から明らかなように、本発明の組成物は口伝浮遊
培養、静置培養のいずれにおいてもすぐれた細胞増殖効
果を示した。
培養、静置培養のいずれにおいてもすぐれた細胞増殖効
果を示した。
回転浮遊培養においても、とシわけｌ５ｃｏｖｅ ／Ｆ
′１２培地で最終到達細胞数が８０Ｘ１０ 個となシ、
すぐれた結果が得られた。
′１２培地で最終到達細胞数が８０Ｘ１０ 個となシ、
すぐれた結果が得られた。
４、図面の簡単な説明
第１図は実施例６に記したｌ５ＣＯＶＢ培地とＦ１２培
地の混合比と細胞増殖活性の結果を示す（ｌコニＮＧＦ
−４４細胞１口：ＣＥＡ細胞。
地の混合比と細胞増殖活性の結果を示す（ｌコニＮＧＦ
−４４細胞１口：ＣＥＡ細胞。
嘱：工−６３）。第２図は実施例７に記した本発明の組
成物の静置およびジャーファーメンタ−培養における効
果を示す（・および○はそれぞれｌ５ｃｏｖｅ ／ Ｆ
１２とＤＭＥ／Ｆ’１２’に用いたジャーファメンタ
ー培養の結果を、ムおよびΔはＩｒ：ｃｏｖｅ ／ Ｆ
１２とＤＭＩ：／Ｆ’１２を用いた静置培養）。」 （３）図面（第１図および第２図〕を補充する。
成物の静置およびジャーファーメンタ−培養における効
果を示す（・および○はそれぞれｌ５ｃｏｖｅ ／ Ｆ
１２とＤＭＥ／Ｆ’１２’に用いたジャーファメンタ
ー培養の結果を、ムおよびΔはＩｒ：ｃｏｖｅ ／ Ｆ
１２とＤＭＩ：／Ｆ’１２を用いた静置培養）。」 （３）図面（第１図および第２図〕を補充する。
乙 添付書類の目録
（１）図 面 １通
第１図
９
第２図
；
圀
Claims (1)
- 哺乳動物の血清を、混在微生物の不活化工程および塩析
、脱塩工程を含む精製処理に付すことを特徴とする哺乳
動物血清由来の動物細胞培養用組成物の製造法。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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