DE2420415A1 - Eine mitogenische blutfraktion und verfahren zur herstellung derselben - Google Patents

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PATENTANWALT DIPL-INQ. JOACHIM STRASSE «. -τ *. w -» ι ν

HANAU · RÖMERSTR.1» · POSTFACH 793 · TEL. (06181) 10803 · TELEQRAMME: HANAUPATENT . TELEX: 4184782pat

Research Foundation of Children's Hospital 26. April 1974 Washington, D. C, USA Str/Jg - 11 082

Eine mitogenische Blutfraktion und Verfahren zur Herstellung derselben

Die Erfindung bezieht sich auf eine Blutserumsfraktion und ein Verfahren für die Herstellung derselben. Im besonderen bezieht sich diese Erfindung auf eine Blutserumsfraktion, die frei ist von Virenagenzien, Mikroorganismen, MIkroplasma und cytotoxisehen Faktoren, und die besonders nützlich ist bei der Vermehrung und Kultivierung von Zellen und Insbesondere bei menschlichen dlploiden Faserkeimen.

Seit einiger Zeit und besonders in den letzten zehn Jahren gab es eine große Menge Forschungsarbeit und Tätigkeit bei der Kultivierung von Zellen unter Glas zur Verwendung In der Forschung und zur Erzeugung von Impfstoffen. Eine Anzahl von Gewebekulturmedien sind bekannt, bei denen verschiedene Nährfaktoren, wie Aminosäuren, einfache Proteine, anorganische Salze, Vitamine, Enzyme und ähnliche, verwendet wurden, um eine chemisch bestimmte Media für die Kultivierung von Zellen herzustellen. Leider führten die Versuche, normale menschliche und tierische Zellen unter Glas mittels der Gewebekulturmedien der Entgegenhaltungen zu vermehren, ent-

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weder zu einem vollständigen Ausbleiben des Wachsens, zu nur kurzen Perioden des Wachstums oder zu einer Veränderung der Zellen während des Wachsens. Versuche, um die Probleme zu überwinden, auf die man mit diesen Gewebekulturmedien der Entgegenhaltungen stieß, resultierten in der Verwendung einer Anzahl verschiedener Techniken und Gewebekulturmedien, und es wurde herausgefunden, daß Blutserum eine wichtige Ergänzung für chemisch bestimmte Gewebekulturmedien Ist, um die erforderlichen Wachstumsfaktoren für die Kultur von Zellen, besonders Säugetierzel{en, unter Glas zu bieten. Sogar bei Verwendung von Blutserum als Ergänzung zu chemisch bestimmten Medien für Gewebevermehrung wurden die Schwierigkeiten, auf die man bei der Vermehrung von normalen Säuget I erze Ilen unter Glas stieß, nicht vollständig überwunden. Folgende veröffentlichte Arbeiten stehen stellvertretend dafür, wie man an das Problem der Zellenvermehrung In Gewebekulturmedien unter Glas herantrat.

In "Journal of Experimental Medicine" (Zeitschrift für experimentelle Medizin}, Band 108, S, 945 - 955 (1959) offenbarten Puck und andere ein spezialisiertes Gewebekulturmedium, das Vitamine, Aminosäuren, Kohlehydrate, Enzyme, anorganische Salze und Wasser mit fötalem Kalbsserum ergänzt enthält. Jedoch ist fötales Kalbsserum äußerst knapp, schwierig zu erhalten, kann bei der Gewinnung verunreinigt werden und kann deshalb beträchtliche Mengen von Materialien enthalten, die für das Wachstum von normalen SäugetIerzeHen toxisch sind. Während der Entdeckung, daß die Verwendung von fötalem Kalbsserum ein bedeutender Fortschritt in der Gewebekultur von Zeilen unter Glas war, sind auch Verbesserungen an den Gewebekulturmedien, die ein solches Serum oder solche Serumfraktionen verwenden, in dieser Branche bekannt.

Das US-Patent 3 122 476 offenbart ein Verfahren für die Reinigung und Fraktionierung des Blutes von unentwickelten Kälbern,

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nachq£reicht

um GammagIobuI I η und andere vorhandene toxische Substanzen zu entfernen, und die Verwendung der Sc-umf raktI on als eine Ergänzung des Gewebekulturmediums. Im wesentlichen beinhaltet das Verfahren das Sammeln des ganzen Blutes, man läßt das dlut gerinnen und entfernt dann den ülutfaserstoffrest, um ein rohes Blutserum zu erhalten. Hieran schließt sich eine Präzlpltation an unter Verwendung von Äthylalkohol zusammen mit pH Kontrolle und Abkühlung sowie Zentr1fugIeren und Filtrieren, um GammagIobuI I η und un I dent IfI ζ 1erte niedergeschlagene toxische Substanzen zu entfernen. Jodoch Ist das In diesem Patent beschriebene Verfahren nicht vollständig wirksam, um alle nicht erwünschten Matariallen aus dem Clutsorum zu entfernen, ist gemäß der Offenbarung auf die Verwundung des Blutes von unentwickelten Kälbern, d. h. von ein bis vier Tage alten, und schließt die Hinzufügung von chemischen Zusätzen zu dem Blutserum ein, was die Merkmale <ier Bestandteile des Blutserums verändern oder In einer Denaturierung derselben resultieren kann.

Auch Im US-Patent 3 128 223 wird die Herstellung eines Gewebekul turmed I ums offenbart, das Blutserum als ein Bestandteil des Mediums verwendet. In dieser Patentschrift wird offenbart, daß das Medium, das für die Kultivierung von ZeIlen verwendet wird, das Vorhandensein von Serum als ein Bestandteil erfordert. Um dieses wichtige üestandtell für die GewebekuI turnedlen zu liefern und um die Ausgabe bei der Verwendung von Rinderfötusserum zu überwinden, wird eine Fraktionierung des Elutsarums bewerkstelligt. In wesentlichen wird das Serum hergestellt, indem man das Blut zum Gerinnen bringt, und das Serum wird durch Zentrlfun Ieren wiedergewonnen. Dem erhaltener Serum wird Arrimon I umsu I f at hinzugefügt, und die nach einer gewissen Zeit aüsgef ei I I ten Proteine werden abgoflltort. Aufeinanderfolgende Arntrcn 1 umsu I f atzusctze werden vorgenommen, und die aktive Fraktion des Serums wird eis Präzlpltat widorgewonnen. Urn das bei der Füllung vorwandte Ammon I umsu I f at zu entfernen, wird das Prözlpitat dlalyslert und die Losung geklärt. Das sich daraus ergebende fraktionierte Serum wird

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BADORIGfNAL

lyophI Iisfort und enthält Im wesentlich Albumin und ein spezifisches A IphaglobuI I η, das eine gewisse eIektrophoretI sehe Beweg I Ichkeft hat. Dieses fraktionierte Material wird dann In einem Gewebeku I turn.ed I um vorwendet, aber leider kann das fraktionierte Serum, selbst bei dieser Fraktionierung, nicht erfolgreich mit diploiden menschlichen Faserkeimen verwendet werden und enthält noch Materialien, die schädlich für das Wachstum normaler S3uget1 erze I I en sein können.

Das US-Patent 3 429 3C7 offenbart ein Agsmma KaIbsserum, das für Zoll- und GewebekuIturverwendung geeignet Ist. Das Verfahren für die Herstellung des Acarr.na Kalbsserums schließt die Abtrennung des Euglobulins ein, die Ansteuerung bis zu einen. pH von 4.i> - b.5 um Albumin auszufällen sowie Alphaglobulln und betarIobuI I η, um das GammagIobu!iη in der Lösung zurückzulassen. üIg Bestandteile werden dann getrennt und gleichmäßig In einem schwach a I akaI I sehen wäürlgen Medium vei— teilt, das einen pH ungefähr gleich dem des normalen Blutserums hat. Obgleich dieses Verfahren die Möglichkeit bietet, das In dem Blutserum vorhandene GammaglobuI I η zu entfernen, und dio Offenbarung dazu befähigt, das ganze tilut von Kälbern zu verwenden ohne Rücksicht auf das Alter Im Gegensatz zu dem erfordernIs, fatales Kalbsserum zu verwenden, so beseitigt dieses Verfahren doch noch nicht vollständig verschiedene Virusagenzlen und cytotoxlsche Faktoren, um ein gereinigtes SäugetIerb Iutserum zu bieten, das wünschenswertorwelse bei der Vermehrung von normalen Säuget I erze I I en verwendet werden kann.

Die US-Patente 3 382 227, 3 555 001, 3 074 351, 3 664 994 und 3 70C 660 beziehen sich auch auf die Fraktionierung von Blutserum, um besondere Bestandteile zu erhalten, die In dem Blutserum enthalten sind. Diese Patente verwenden Im allgerreinen eine Chromatograph Ischo Adsorption oder eine chemische Präzipltation, um die Fraktionierung zu erreichen. Die chromatographlscho Adsorptions-Relη Igungs- und Trennungstechnik hat

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BAD ORIGfNAL

keine vollständige Zerlegung des Serums In gereinigte Fraktionen zur Folge und ist außerordentlich langsam, und deshalb ist eine Chromatographisehe Trennung kommerziell unattraktiv. Gleichermaßen spaltet auch eine Fraktionierung, die eine chemische Präzlpitatlon verwendet, das Blutserum nicht vollständig In seine verschiedenen Bestandteile, da die chemische Präztρitat Ion spezifisch für ein besonders Teil oder Bruchteil des Blutserums Ist. Darüber hinaus schließt die chemische PräzI ρitatlonstechnik die Htnzufügung eines chemischen Reagens ein, das entweder nach der Fraktionierung entfernt werden muß oder eine schädliche Wirkung auf die Blutserumsbestandteile per se haben kann.

Aus dem Obigen Ist ersichtlich, daß die bisher bekannten Schriften reichlich mit Offenbarungen von Techniken für die Herstellung eines Blutserums versehen sind, das vorteilhafterweise als eine Ergänzung für ein GewebekuIturmedlum verwendet werden kann. Während diese Techniken einen Fortschritt bedeuten gegenüber der Verwendung von rohem oder ungereinigtem Blutserum, haben diese Techniken jedoch keine vollständig gereinigte Blutserumsfraktion In ausreichendem Maße geboten, die in der Herstellung billig ist und von der verschiedene toxische Agenzien und cytotoxische Faktoren vollständig entfernt worden sind. Es ist daher eine Aufgabe dieser Erfindung, eine gereinigte Tierblutserumsfraktion zu bieten, die frei von schädlichen Verschmutzungen ist, wie Virusagenzien, Mikroplasma und Bakteri ophagen.

Es ist auch Ziel der Erfindung, eine Tierblutserumsfraktion verfügbar zu machen, die billig In der Herstellung ist und aus einer großen Vielzahl von Serumsquellen hergestellt werden kann. Es ist auch ein Gegenstand dieser Erfindung, eine Blutserumsfraktion zu bieten, die keine Reste von hinzugefügten Materialien enthält, die toxisch oder zumindest hemmend für das Wachstum von Säugetierzellen in einem Gewebekulturmedium

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sein können, das die Blutserumsfraktion dieser Erfindung enthäIt.

Es Ist ferner ein Anfiegen dieser Erfindung, eine Blutserumsfraktion zu bieten, die im wesentlichen aus jeglichen T|erbfutquellen hergestellt werden kann und ohne Rücksicht auf das Alter des Tieres und auf das Vorhandensein von GammagIobuIinen, die normalerweise in dem Blut von älteren Tieren enthalten sind. Es ist auch ein Gegenstand dieser Erfindung, eine gereinigte Blutserumsfraktion zu bieten, die frei ist von Virusagenzien, Mikroorganismen, Mikroplasma und cytotoxisehen Faktoren und die darüber hinaus das mitogenisch aktive Bestandteil von ganzem Blutserum enthält, das erforderlich ist für das fortwährende Wachstum von normalen Säugetierzellen, insbesondere diploide menschliche Zellen, und noch spezieller, dipjolde menschliche Faserkeime.

Schließlich ist noch mit der Erfindung beabsichtigt, die Bestandteile des Blutserums zu isolieren, die das mitogenisch aktive Wachstum fördern, und die Fraktion des Blutserums wiederzugewinnen, worin die mltogenische Tätigkeit konzentriert ist.

Diese und andere Gesichtspunkte der Erfindung lassen sich gemäß der im folgenden enthaltenen Offenbarung erreichen.

Die Erfindung enthält eine mitogenisch aktive Blutserumsfraktion, frei von Virusagenzien und cytotoxisehen Faktoren. Die Blutserumsfraktion enthält Blutserumsbestandteile, Insbesondere BetagI obu1iη, die ein Molekulargewicht im Bereich von ungefähr 50.000 bis ungeähr 300.000 haben.

Die Erfindung bietet auch ein Verfahren für die Herstellung einer Blutserumsfraktion, gereinigt und frei von Virusagenzien und cytotoxisehen Faktoren. Dieses Verfahren umfaßt folgende Schritte:

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NAOHQgREICHT

Cl) Entfernung von Bestandteilen aus einem rohen Blutserum, die ein Molekulargewicht über ungefähr 300.000 haben, und

(2) Entfernung von Bestandteilen aus einem rohen Blutserum, die ein Molekulargewicht von weniger als unoefähr 50.000 haben, um eI re Blutserumsfraktion zu bieten, die ein Molekulargewicht Im tiereich von ungefähr 50.000 bis ungefähr 300.000 hat.

Das Verfahren dieser Erfindung, wie oben beschrieben, umfaßt im wesentlichen die Fraktionierung des Blutserums in eine Fraktion, die ein Mo I eku I argev/i cht im Bereich von ungefähr 50.000 bis ungefähr 300.000 hat. Als Ausgangsrnater I a I verwendet das Verfahren dieser Erfindung ein rohes Blutserum, aus dem die Fibrin-, Fibrinogen- und Blutkörperchen entfernt worden sind, z. B. Indem man das Blut gerinnen Iäl3t und dann das rohe Glutserum der oben beschriebenen Fraktionierung unterwirft.

In einer bevorzugten Ausführung dieser Erfindung enthält das Verfahren die folgenden Schritte:

(1) Entfernen des gerinnbaren Materials, wie Fibrinogen, Fibrin und adsorbierte Zellen,

(2) Verdünnen des rohen Blutserums mit Wasser, vorzugsweise entionisiert oder destilliert, und Klärung des verdünnten rohen Blutserums um korpuskulare Materialien zu entfernen,

(3) Olalyslsren des geklärten rohen Blutserums der Stufe (2), Entfernung der aufgelösten Salze und endend mit der Entfernung dor Eujlobulln·,

(4) Fraktionieren des Serums der Stufe (3), um eine gereinigte BlutserumsfraktI on zu bieten; das Fraktionieren schließt die Entfernung der Bestandteile ein, die ein Molekulargewicht von über ungefähr 300.000 und der Qestandte i I e.. die ein Molekulargewicht von weniger als ungefähr 50.000 haben, und

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(5) Konzentrieren der gereinigten Blutserumsfraktion der Stufe (4).

Das Verfahren dieser Erfindung, wodurch das Produkt dieser Erfindung hergestellt wird, wie oben beschrieben, schließt im allgemeinen eine Serie von physikalischen Behandlungsstufen ein, bei denen Blutserum fraktioniert und gereinigt wird.

Die Ausgangsmaterialien, die in dem Verfahren dieser Erfindung verwendet werden, können Blutsera von irgendeiner tierischen Quelle sein und insbesondere von Säugetierquellen, wie Blutsera von Pferden, Kühen, Hunden, Kaninchen, Menschen und ähnlichen. Um das Blutserum zu gewinnen, wird das Blut gesammelt, wie z. B. in einem Schlachthaus, dann bleibt es einfach stehen, und man läßt es gerinnen. Eine geeignete Zeitspanne für dieses Gerinnen kann z. B. von ungefähr 1 bis zu ungefähr 18 Stunden dauern, bei einer Temperatur von ungefähr 0 bis ungefähr 15 C. Nach der Gerinnung wird das Gerinnsel von der obenschwimmenden Flüssigkeit entfernt. Diese Trennung kann durch Zentrifugieren unter Verwendung einer SorvaI-Zentrifuge geschehen. Alternativ kann das Material auch gefiltert werden, nachdem das Blut geronnen ist und ein Gerinnsel und ein Serum gebildet hat, indem man z. B. eine im Handel erhältliche Filterpresse verwendet. Grundsätzlich kann jedes Mittel nach Stand der Technik verwendet werden, um das Gerinnsel von der obenschwimmenden Flüssigkeit zu trennen. Alles was erforderlich ist, ist die Entfernung der Materialien, die gerinnen, um ein rohes Blutserum zu gewinnen. Dieser Gerinnungs- und Trennungsschritt entfernt Fibrinreste und Zellen. Wo gewünscht, kann das Serum einfach vorsichtig von dem Gerinnsel abgegossen werden, um das rohe Blutserum zu gewinnen. Jedoch ist es aus Gründen der Wirksamkeit und der Vollständigkeit der Rückgewinnung erwünscht, daß Zentrifugieren oder Filtrieren angewandt wird.

Wenn nun das rohe Blutserum erhalten wurde, kann es verdünnt werden, indem entionisiertes oder entmineraIisiertes Wasser

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verwendet wird, und das Serum kann infolge einer teilweisen Präziρita I on der Euglobuline dickflüssig werden. Ein geeignetes Verdünnungsverhältnis liegt im Gereich von 5 : 1 bis 20 : 1 der Wassermenge zu dem rohen Blutserum. Um das rohe Blutserum zu klären und diese Dickflüssigkeit zu entfernen, wird das Blutserum entweder wieder zentrifugiert oder gefiltert wie oben beschrieben, und dies bietet ein klares verdünntes rohes Blutserum. Danach, falls gewünscht, kann das verdünnte rohe Blutserum dialysiert und IyophiIisiert werden. Obgleich nicht wesentlich, Ist dies jedoch zu empfehlen, denn es gestattet die Verwendung des Serums in einer mehr konzentierten Form und macht daher das Verfahren dieser Erfindung noch w i rksamer.

Die obenschwimmende Flüssigkeit, die man nach dem Durchgang durch einen Filter oder nach dem Zentrifugieren erhält, entweder in dialysierter Form oder wiederhergestellt, wenn lyophilisiert wurde, wird dann ultragefiltert, ζ. B. unter Verwendung einer Membrane oder eines Hohlfadens als Filter. Eine geeignete Art, diese UI trafi I trierung vorzunehmen, ist es, Ultrafiltriermembranen zu verwenden, wie DiafIo-Membranen, die im Handel durch die Amicon Corporation erhältlich sind, und das im Handel erhältliche Ze I I ruhrsystem, Modell 402, zu verwenden, wie es von der Firma Amicon Corp., Boston, hergeste Mt w i rd .

Wenn man eine Serie von UI trafi I tri er-Membransieben benutzt, kann das Blutserum in eine Blutserumsfraktion fraktioniert werden, deren Molekulargewicht im Bereich von 50,000 bis 300,000 liegt. In anderen Worten, diejenigen Bestandteile des rohen Blutserums, die ein Molekulargewicht über 300.000 haben, können entfernt werden durch U i traf i I tri erung des rohen Blutserums durch eine Ultrafiltriermembrane, die diejenigen Bestandteile zurückbehalten wird, die ein Molekulargewicht über ungefähr 300.000 haben, z. B. bei Verwendung einer Diaflo XM300 Ultrafiltriermembrane, und dies bewirkt die Entfernung

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derjenigen Materialien, die ein Molekulargewicht über 300.000 haben, von dem rohen Blutserum. Die gewünschte Fraktion ist das Teil des Serums, das durch die Ultrafiltriermembrane hindurchgeht.

In ähnlicher Weise kann die Entfernung der Bestandteile, die ein Molekulargewicht von weniger als ungefähr 50.000 haben, durch Ultrafiltrieren des Materials durch eine Membrane bewirkt werden, die Bestandteile zurückbehält, die ein Molekulargewicht von ungefähr 50.000 oder höher haben, z. B. bei Verwendung einer DiafIo-UI trafi I triermembrane TM30. Die gewünschte Fraktion wird auf der Ultrafiltriermembrane zurückgehalten, und das Material, das durch die Membrane läuft, wird ausrangiert. Durch Entfernung der Bestandteile des rohen Blutserums, die auf der Ultrafiltriermembrane zurückgehalten wurden, welche Materialien passieren läßt, die ein kleineres Molekulargewicht als 300.000 haben, und indem man die Bestandteile des rohen Blutserums auswählt, die auf einer Ultrafiltriermembrane zurückgehalten werden, die ein Molekulargewicht von 50.000 passieren läßt, wird die Möglichkeit geboten, eine Blutserumsfraktion zu erhalten, deren Molekulargewicht sich zwischen ungefähr 50.000 bis ungefähr 300.000 bewegt. Solch eine Blutserumsfraktion, die diesen Molekulargewichtsbereich hat, ist gereinigt und frei von Virusagenzien, Mikroorganismen, Mikroplasma und Bakteriophagen, die ein Molekulargewicht über 300.000 haben. Auf ähnliche Weise werden Materialien entfernt wie IgM, von dem man annimmt, daß es eine Form von GammagI obuIiη ist, das ein Molekulargewicht von ungefähr 750.000 hat und das sich an der Oberfläche von Zellen anfügt, dadurch das Zellenwachstum in schädlicher Weise beeinflußt, wenn Serum in einem Gewebewachstumsmedium verwendet wird, und auch der C. Anteil der Komplementkette, der ein Molekular-

gewicht von ungefähr 450.000 hat, was die cytolytische Tätigkeit des Komplements aktiviert.

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Auf ähnliche 'Weise entfernt das Ausrangieren der Fraktion, die ein Molekulargewicht von weniger als ungefähr 50.000 hat, Materialien, die das Ze I I enwachstum in schädlicher Vie i se beeinflussen und' toxisch auf das Ie I I enwschst urr·. wirken. Man nimmt an, da"3 solcne Materialien kleine L\ndotoxi nc sind, Ή Ich- od&r lrenztr.ub«ns'iuren, anorocn i scha Salze, cytotoxischo Peptide., die durch Prote i η zersetz uric; ?ntstcnen, oder ähnliche. 0 ί ·3 Trennung des rohen Slutsoruns, dio diese Ultraf i I tr 1 erteehn i k anw>5nd-.it, um ο ine '.'■ I utsorunsf rakt i on zu b i e- J3u , o\e Bestandteile ε-nthült, d^ron ,".o I oKu I arncw i cN t zwischen ungefähr 30.000 und 300.000 I tor,+ , entfernt auf dies? Vrclse Jiiijenlgon Materialien, die schädlich für (! i n Verwendung der oareinigten T i ut sorumsf rakt i on als ein !,ostandteil In einen Ce η -a be k u 11 ur.ied i un sind.

Es Ist beKönnt, <e3 dqs Vorhandonso i η von V I rusagenz 1 on in einotvi Gewobeku I turmed i um eine Veränderung der Ze 1 I ennerkna I a zum Ergebnis η aben kann, z. ?. dlploide in heteropoIoide. Oeshslb ist c-s w Unschensvicrt, ein Sowubeku I turmec i um zu lloton, dessen üestandta i I g I :n wesentlichen die Ze I I enmarkrr.i I e während dar Zo I Ien-KuI tür nicht beeinflussen. Die Entfernung der Virusagenzien usw. aus dem Blutserun und die Schaffung einer gereinigten üIutserumsfraktI on hat die Möglichkeit zur Folge, die _;3θΓ3ΐ η i ';te 3 I utserumsf rakt I on als oln Bestandteil des GewebekuI turned I ums zu verwanden, wo gewünscht wird, normale Säugetierze I I en zu kultivieren, die nicht durch das Vorhandensein Irgendwelcher Virusagenzien angegriffen oder verändert werden, was eine Abwandlung oder änderung der Ze MmerkmaIe der menschlichen Zollen zur Folge haben könnte. Auf ähnliche Weise hat die Entfernung von Mikroorganismen aus dem Blutserum zur Folge, dafi man die 31 utserunsf rakt I on als Bestandteil eines Gev/ebeku I turrr.ed i ums verwenden kann, unbeeinflußt von Endotoxinon, die von MI kroorcan i sm-an als ein Beiprodukt ihres Stoffwachse Iprozessos erzeugt werden.

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Wenn gewünscht, kann die Fraktionierung durch Trennung des Blutserums in eine Fraktion vorgenommen werden, die ein Molekulargewicht Im Bereich von ungefähr 50.000 bis ungefähr 100.000 bis 150-000 hat bei Verwendung der oben beschriebenen U-I traf ΐ Itriertechnlken und geeigneter 3J If raf I 1 triermembranen. Während dies zu einer Konzentration der mltogenlschen Tätigkeit In einein engeren Bereich molekularer Gewichte führt, Ist dies vom kommerziellen Gesichtspunkt aus nicht vorzuziehen, da die Bearbeitungszelt erhöht wird. Die Anwendung der Fraktionierung In einem Molekulargewichtsbereich von ungefähr 50.000 bis ungefähr 300.000 ist nicht nur vorteilhaft In kommerzieller Hinsicht wegen der schnellen Verarbeitung, sondern reicht auch vollkommen aus, um eine Serumfraktion zu bieten, die von Virusagenzien, cytotoxIschen Faktoren und ähnlichem frei Ist.

Wenn gewünscht, kann die Blutserumsfraktion mit einem Molekulargewicht . Im Bereich von ungefähr 50.000 bis 300.000 konzentriert werden, Indem man einfach das Wasser von der Blutserumsfraktion entfernt. Dies kann bewerkstelligt werden, Indem man das Material durch eine Ui trafiItriermembrane ultrafI1triert, die diejenigen Materialien durchlast, die ein Molekulargewicht von weniger als 50.000 haben, aber diejenigen Materialien zurückbehält, die ein Molekulargewicht über ungefähr 50.000 haben. Eine soiehe Konzentration kann erfolgen, Indem man die Bl utseruuisf raktion In eine Ultraf I Itrlerzel Ie einbringt, die ein Molekularsieb enthält, das diejenigen Materialien durchläßt, die ein Molekulargewicht von weniger als ungefähr 50.000 haben, und Indem man einen Druck anwendet auf das System, wie z. B- unter Verwendung eines inaktiven Gases, wie Nitrogen. Der Gasdruck treibt das Wasser durch das Molekularsieb, dadurch wird das Wasser entfernt und die gewünschten Bestandteile werden konzentriert. Dies Ist kein wesentlicher Schritt In dem Verfahren dieser Bfindung, aber bei gewissen Anwendungen, wo man eine konzentrierte Blutserumsfraktion verwenden möchte, kann dieses Konzentrierungsverfahren zum Vorteil angewandt werden.

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Alternativ kann die Blutserumsfraktion, die «In Molekulargewicht Im Bereich von ungefähr 50.000 bis 300.000 hat, lyophllislert werden bei Anwendung herkömmlich bekannter Techniken, das gefrorene und getrocknete Material wird z. B. In 0.15 MNaCI oder anderen Salzlösungen aufbewahrt und wiederhergestellt zur Verwendung an einem späteren Zeltpunkt. In ähnlicher Welse kann dl· Blutserumsfraktlon dieser Erfindung auch eingefroren und In gefrorenem Zustand gelagert werden. Das Erzeugnis dieser Erfindung kann handelsmäßlg auf den Markt gebracht werden In Form des fraktionierten Serums per se, als da3 Lyophlllsat oder In gefrorenem Zustand.

Die Blutserumsfraktton, die ein Molekulargewicht im Bereich von ungefähr 50.000 bis ungefähr 300.000 hat, kann danach als eine Ergänzung bei der Herstellung eines Gewebekulturmediums verwandt werden, welches sehr vorteilhaft Ist bei der Vermehrung von Säugetierzellen und Insbesondere normaler Säugetlerzellen.

Es wurde festgestelIt, daß diese Blutserumsfraktion die wesentlichen Faktoren enthält, dfo für die Gewebekultur normaler Süugetlerzellan erforderlich sind. Insbesondere menschlicher dlploider Faserkeime. Die Wachstumstätigkeit Ist in dieser Fraktion fast bis zum Ausschluß Jeglicher Wachstumstätigkeit In den anderen größeren und kleineren Molekulargewlchtsfraktlonen konzentriert, die entfernt worden sind. Das Verfahren dieser Erfindung bietet die Möglichkeit, eine Blutserumsfraktion xu erhalten, die eine hohe biologische Tätigkeit hat, und solches mit hoher biologischer Aktivitätsausbeute zu erhalten, z. B. Wiederherstellung der biologischen Aktivität Über 90 %, und im allgemeinen näher an 100 Ji.

Die Fraktlonlerungstechnlkeji, die fn den Entgegenhaltungen angewan t wurden, haben nicht die Zerlegung erreicht, die man erhalt, wenn man das Verfahren dieser Erfindung anwendet, und haben Im allgemeinen ein Erzeugnis zur Folge gehabt, das ein« reduzierte Wachstumstatlgkelt hatte, Insbesondere für dlploide menschliche Faserkeime.

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Wie oben beschrieben, kann die Blutserumsfraktion dieser Erfindung in geeigneter Weise als ein aktiver Bestandteil der Göwebeku I turmedi en verwendet werden, die in dieser Wissenschaft wohl bekannt sind. z. B. wie in dem US-Patent 3 122 und US-Patent 3 128 228 beschrieben. Die gereinigte Blutserumsfraktion dieser Erfindung hat sich besonders vorteilhaft für das Wachstum diploider Zellen erwiesen, die Serum als ein Bestandteil des Gewebekulturmediums benötigen.

Die folgenden Beispiele sind Erläuterungen des Verfahrens und des Produktes dieser Erfindung. Diese Beispiele sind zum Zwecke der Illustration des Verfahrens und des Produktes dieser Erfindung angeführt und dienen nicht als Begrenzung des Rahmens der Erfindung.

BEISPIEL I

Gesammeltes frisches Kalbsserum (das man erhält, indem man ganzes Kalbsblut gerinnen läßt, das Serum davon abtrennt und das Serum sammelt), wurde dialysiert bei einer Temperatur von 4 C gegen 200 Volumen destillierten Wassers während einer Zeit von 48 Stunden. Die ausgefällten Euglobuline wurden durch Zentrifugieren entfernt, und das Obenschwimmende wurde Iyophi1isiert. Das Lyophiltsat wurde wiederhergestellt in 0.15 M NaCI bei einer pH von 6.8 zu einer Konzentrierung von 6 mg/ml und wurde einem Sieben durch Diaflo Ultrafiltriermembranen unterworfen unter Verwen-dung von Ze I I ruh rsystemen , Modell 402, ein Produkt der Firma Amicon Corporation, Boston. Das Serum wurde in fünf molekulare Gewichtsbereiche unter Verwendung von Ultrafiltrierzellen wie folgt fraktioniert: über 300.000 (Verwendung eines XM 300 Siebes); 300 - 100 (Verwendung eines XM 10QA Siebes); 100.000 - 50.000 (Verwendung eines XM 50 Siebes); 50.000 - 30.000 (Verwendung eines PM 30 Siebes); und 30.000 - 10.000 (Verwendung eines UM 10 Siebes). Die Ultrafiltrierzellen wurden in Serie aufgestellt, wie offenbart bei Zipilivan et al in Anal. Biochem., Band 30, S. 91-98 (1969), in abfallender Anordnung der Molekulargewichte. Die

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UltrafiItrierung wurde bei 4 C durchgeführt, und im wesentlichen wurden 10 Volumen von 0.15 M NaCJ durch die untereIjaainider verbundenen Olaf Io Zellen gespült, bis die NaCl Lösung 3im wesentlichen frei von jeglichen Serumbestandteilen war, wie dies spektroskopisch bestätigt wurde durch das Fehlen jeglicher Absorbens bei 220 und 280 Nanometer. Jede dieser moäekularen Gewichtsfraktionen wurde dann dialysiert gegen destilliertes Wasser bei 4 ° C und 1yophiIisiert.

Das Molekulargewicht der oben getrennten Bestandteile wurde bestätigt sowohl durch Anwendung einer Ge 1-Fi 1 tri erungstechaal k, die Bio-GeI-P-200, ein Produkt der Calbiochem Co., verwendet gemäß dem Verfahren, das von Piez in Anal. Bio. Chem., Band 26, S. 305 - 313 (1968), offenbart wurde, als auch durch die Verwendung von Sod!umdodecy1su1 fat Polyacrylamid Gel Elektroplfoorese (ohne Mercaptoäthano1) gemäß Verfahren von Weber et a3, wie offenbart in J. Biol. Chem., Band 244, S. 4406 - 4416 (1969). Diese beiden Verfahren behandeln ein Stück des Blocks ("a plot of the log") des Molekulargewichts bekannter Normern versus entweder Auswaschung (Ve/Vo für P-200} oder e lektropäuoretische Beweglichkeit mit Blau Dextran 2000, einem Produkt der LKB Company, gereinigtes Transferrin, Albumin, Ovalbumiia und die Beta-Kette von säurelöslicher Gelatine, die als Noruien in der GeI-Fi1trierungsbestimmung verwandt werden, und Albumin, Ova Ib um in und Myoglobin, die für die Sodiumdodecy1sulfat-Elektrophorese-Bestimmung verwandt werden.

Um die virusfreie/cytotoxischerfaktorfreie Natur der gereiraägten Blutserumsfraktion dieser Erfindung zu demondstrieren, die ein Molekulargewicht im Bereicht von ungefähr 50.000 bis ungefähr 300.000 hat, wurden die erhaltenen Fraktionen bei der Herstel lung eines Gewebekulturmediums verwandt- Zwei diploide menschliche Faserkeim-Ze11-LInien, die von embryonaler Lunge (Wl-38) stammten, und von einer Hautbiopsie eines Erwachsenen (GWF) wurden als Gewebekultur benutzt. Darüber hinaus wurde die Transformation von Vi ΐ - 3 8 Faserkeim durch Inkubation mit

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I NACHgteRBCHT

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SV„ ,, Virus benutzt, un ei non hotorop lol den Fasarkein für die UuJ tür zu erh.il tön. Das verwendete Gewebeku J turned i um war irjles min. wesentliche Mädiura (MEH), ergänzt r.iit Glutamin (2 Molar), Streptomycin (90 Einheiten/ml), Penicillin (90 £1 nhei tsn/isl ) und entweder rohen lilutserum (6. G jr.g/rcl ) oder i!3s fraktionierte Slutscrun.

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üngcfllhr 4 χ 10 Zellen/cm wurden In eln-3 Zzr I -3 von Leighton könren verpflanzt. .^ach Inkubation tior ZaI len bei oinsr Temperatur von 37 C In de^r,i normalen Mod !um (Medium das rohen - lutsorum enthalt) ^:'ber nacht wurden dlo Kulturen wfodorholt fi.it oinl^an Teilen von E^rles ausgewogener Salzlösung gespült, um sowohl das Serun als auch die Zellen zu entfernen, die nicht sn der GlasoboriI Sehe haftengeblieben waren. Die Versuchs-53runifraktionen trannten sich wie oben beschrieben, jede wurde dann dem "EM zugefügt und das ergänzte MEM beigeoeben, um die Zollkulturen zu roproduzieren, Im allgemeinen 3-5. Das ZeII-Ku I tunned! um wurdt; danach dreinral pro Vsc-che Gewechselt. Die

2 "

hl cor Zellen pro cn wurde tue I Ich gezählt unter Verwendung ο ines uni^ekehrtön .Mikroskops und eines Ilniierten Oku-13 rs, ν; I c beschrieben in Raff et al, J. Ceil. Physlol., tand 74, 5. 235 - 243 (1969). Vcn der üeigung des linearen Toils einer logarithmischen Darstellung der Anzahl der Zellen versus Inkubationszeit, die einen Ze-itraun von 120 Stunden deckt, wurde der itechstumsgrad berechnet als die ^: 3evöl kerungs-.lenerat lonsziii t" In Stunden, wie beschrieben In Raff et al, supra. Dies wurde danach als ein Prozent der Zeilbevöikerung ausgedruckt, arhcht aMe 24 Stunden odor die "Prozent-Wachstums rate".

Die Prozentwachstunsrate, sowohl für ViI -38 GViF als auch für die transformierten SV.q-Iv'I-38 Zollen, boi verschiedenen Konzorstri erungon für das rohe Slutserun und für dia Blutserumfraktlonen, die wio oben boschrlcbon gstrennt wurden, ist In Jon folgenden Leiden Tafeln dargestellt:

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BAD ORIGINAL

Tafel 1
Verwendung von rohem Blutserum in dem Gewebekulturmedium

Konzentrierung des rohen Blutserums (Volumen %)	W1-38 2/	Prozent-Wachstumsrate 1/ GWF 3/	SV40	-WI-38 4/
0.0	0	0	18 Jt1	0.5
0.625	15 + 0.4	15 +_ 0.5	26 J1	1.5
1.25	20 _+_ 0.5	18 +_ 0.4	23 +	1.3
2.5	31 +_ 1.8	31 ± 1.6	31 +	. 1·3
5.0	43 _+ 1.5	39 _+ 1.5	46 +	1.7
7.5	51 +_ 2.7	49 _+ 2.2	38 +	2.2
10.0	73 _+ 3.6	71 +_ 2.4	75 +	3.7
20.0	67 +_ 2.9	63 _+_ 1.8	- -	-
30.0	20 _+ 2.1	17 +_ 0.5	- -	-
40.0 50.0	Abgesondert Abgesondert	Abgesondert Abgesondert	- -	-

Y/ Mittlere und Standard-Abweichung; Mittelwerte, die sich durch mehr als zwei Standard-Abweichungen unterscheiden, waren statistisch verschieden (p-=^ 0.05).

2/ Normale diploide Faserkeime, die von menschlicher embryonaler Lunge stammten.

3/ Normale diploide Faserkeime, die von der Hautbiopsie eines menschlichen Erwachsenen stammten.

4/ WI-38 umgewandelt durch Kultivierung mit 106 Einheiten des Simian Virus ._ pro ml für 10 Verdopplungen in karyologisch heteroploiden Ze I I en.

Wie man bei einer Prüfung der oben auf Tafel I dargestellten Ergebnisse feststellen kann, benötigen normale diploide Zellen Blutserum als ein Bestandteil des Gewebekulturmediums. Transformierte Zellen, d. h. die SV._n-Wi-38 Zellen, erfordern nicht das Vorhandensein von Blutserum in dem Gewebekulturmedium. Dies

— IO

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demonstriert, daß Serum ein wesentliches Material in einem Gewebekulturmedium für die Kultivierung von diploiden Zellen ist. Man kann auch sehen, daß erhöhte Konzentrierungen des rohen Blutserums auch die Prozentwachstums rate erhöhten, wobei die Prozentv/achstumsrate ein Maximum von 10 % bei Volumen erreicht. Bei Konzentrierungen von mehr als 10 % nimmt die Prozentwachstumsrate ab, was das Vorhandensein von cytotoxisehen Faktoren in dem rohen Blutserum demonstriert.

Auf ähnliche Weise werden die Ergebnisse, die man erhielt, wo die verschiedenen Fraktionen, die gemäß des Verfahrens dieser Erfindung hergestellt wurden, als ein Bestandteil in einem Gewebekulturmedium verwendet wurden, in der Tafel II unten dargestelit:

TAFEL I I
Verwendung von Blutserumsfraktionen in Gewebekulturmedium

Gewebekulturmedium Prozentwachstumsrate 1/

Ergänzung

Keine

10 % Serum (6.6 mg/ml) 2/ Molekulargewichtfraktionen (6 mg/ml) I Über 300.000 (51 %) +/

11 300.000 - 100.000 (30 %) +/

III 100.000 - 50.000 (12 %) *J

IV 50.000 - 30.000 (5 %) +/

V 30.000 - 10.000 (2 %) +/

WI-38	6	GWF	2.4
O		O
73 _+ 3.		71 _+
O	1	O	2.8
O		O
96 _+ 1.		92 +_
O	O
O	O

_1/ Mittlere und Standard-Abweichung; mittlere Werte, die um mehr als zwei Standard-Abweichungen verschieden sind, waren statistisch verschieden (p <L 0.05).

2/ Rohes Blutserum (unfraktioniert).

+_/ Prozentsatz von gesamten nicht-dialysierbaren Serum-Macromolekülen.

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Bei einer Durchsicht der auf Tafel Il oben dargestellten Ergebnisse ist ersichtlich, daß die Fraktion, die ein Molekulargewicht im Bereich von ungefähr 100.000 bis 50.000 hat, Im wesentlichen alle mitogenisehe Aktivität des Blutserums enthielt. Die Fraktionen, die Bestandteile enthalten mit einem Molekulargewicht über ungefähr 100.000, und die Fraktion des Serums, die Materialien enthält mit einem Mo Iekulargewicht von weniger als ungefähr 50.000 boten keine mitogenische Aktivität von solcher Art, daß die diploiden Zellen wachsen konnten. Es ist aus den oben dargelegten Ergebnissen ersichtJ ich, daß die Fraktion des Blutserums, die ein Molekulargewicht Im Bereich von ungefähr 50.000 bis 100.000 hat, eine erstaunliche Zunahme der Prozentwachstumsrate entstehen ließ im Vergleich zu dem rohen unfraktionierten Blutserum.

BEISPIEL I I

Das Verfahren, das oben im Beispiel I beschrieben wurde in bezug auf die Fraktionierung und Reinigung des Ka [bsseruuas, wurde wiederholt mit der Ausnahme, daß eine Blutserumsfraktion mit einem Molekulargewicht im Bereich von ungefähr 50.000 bis 300.000 hergestellt wurde. Um die mitogenische Aktivität dieser Fraktion im Vergleich zu dem rohen unf raktion i erten Bllutserum festzustellen, wurden die im Beispiel I beschriebenen Ze I1kuIturverfahren bei der Verwendung des fraktionierten Serums und des rohen Blutserums wiederholt, und der Prozentwachstumsgrad von diploiden Faserkeimen (Wl-38 und GWF) for das fraktionierte Blutserum mit einem Molekulargewicht ϊ im Bereich von ungefähr 50.000 bis ungefähr 300.000 wurde bei verschiedenen Konzentrierungen bestimmt. Die Ergebnisse, die für die Serumsfraktion mit einem Molekulargewicht im Bereich von ungefähr 50.000 bis ungefähr 300.000 erzielt wurden, sind auf Tafel IN unten dargestellt.

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Tafel .1 I I

Verwendung eines fraktionierten Blutserums mit Molekulargewicht von ungefähr 50.000 bis 300.000 als Gewebekulturmediumbestandteil

Prozentwachstums rate 1/ WI-38 GWF ~

27 J₁ 2.2 25 _+ 1.7

44 +_ 3.8 49 J₁ 3.0

52 +1.9' 61 "+_ 9.4

78 J₁ 4.7 75 J₁ 5.6

83 J₁ 5.0 86 J₁ 3.7

96 J₁ 1.1 92 J₁ 2.8

96 + 1.4 96 + 7.0

Serumkonzentrierung im Medi um (mg/ml)	y
0.5	2/
1.0	2/
1.5	2/
2.0
3.0
6.0
12.0

JY Mittlere und Standard-Abweichung; Mittelwerte, die um mehr als zwei Standard-Abweichungen differieren, waren statistisch verschieden (p-<. 0.05).

2/ 2.0 mg/ml, 3.0 mg/ml, 6.0 mg/ml und 12.0 mg/mt von fraktioniertem Serum entspricht einer rohen Serumskonzentrierung von 10 %, 15 %, 30 % und 60 # bzw.

Die oben dargestellten Ergebnisse zeigen, daß die Verwendung einer Konzentrierung von 2 mg des fraktionierten Material pro Milliliter des Gewebekulturmediums eine Prozentwachstums rate der diploiden menschlichen Faserkeime zur Folge hatte, die mit derjenigen vergleichbar ist, wo 6.6 mg/ml rohes Blutserum verwendet wurde. Diese Ergebnisse demonstrieren _t daß eine merklich geringere Konzentrierung des fraktionierten Blutserums mit einem Molekulargewicht von ungefähr 50.000 bis ungefähr 300.000 verwendet werden könnte, um im wesentlichen dieselbe Prozentwachstums rate zu erzieI en,. wie man sie mit dem rohen Blutserum erhält. Weiterhin, die Verwendung von hohen Konzentrierungen (d. h. gleich 15 %, 30 % und 60 % auf. dem rohen Blutserum basierend) des fraktionierten Blutserums

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I NACHgERgICHTrI

mit einem Molekulargewicht In LJe re Ich von ungefünr 50.000 bis ungefähr 300.000, hinderte nicht das Wachstum der Jiploiden menschlichen Faserkeimo Im oOQonsatz zu dor Lage, wie sI ο bei der Verwendung von hohen Konzentrl arunco-n von unfrakt ion i ortem rohem blutserum existierte.

Dleso Ergebnisse bostOtlgon dia erstaunliche Zunahme an rnltoganlschor Aktivität bol der Verwendung dos Blutserums mit einem Molekulargewicht Im Bereich von ungefähr 50.000 bis 300.000 und die Ausscheidung von dom ZeI!wachstum schädlichen Faktoren aus dem fraktionierten Serum, Insbesondere dI ρ I οide menschliche Faserkolme.

Die oben aufgeführten Ergebnisse zeigen klar, daß die Fraktionierung von Blutserum eine Konzentrierung der mltogenlsch aktiven Bestandteile das Blutserums zur Folge hat sowie die Entfernung von Virusagenzlon, die Veränderungen Im Zollwachstun hervorrufen können, wenn Serum als ein Bestandteil eines Gewebekulturmodi ums verwandt wird, und die Entfernung von cytotoxlschen Faktoren, die das Ze I I wachstum hemmen, wenn das Serum in dem GewebokuIturmedium als eine Ergänzung In hohen Konzentrierungen verwandt wird. Weiterhin, um eine Prozentwachstumsrate von 70 % zu erzielen, ist es erforderlich, 6.6 mg/ml lyophlIIslertes rohes Blutserum zu verwenden Im Vergleich zu nur 2.0 mg/ml der Blutserumsfraktion, die ein Molekulargewicht Im Bereich von ungefähr 50.000 bis ungefähr 300.000 hat.

Darüber hinaus werden ähnliche Ergebnisse erreicht bei der Verwendung von Sera von Menschen und von tierischen Quellen, wie Pferd, ausgewachsene Kuh, fötales Kalb und Kaninchen. Serumfraktionen mit einem Molekulargewicht Im Bereich von ungefähr 50.000 bis 300.000, die aus anderen Serurnque I I en hergestellt wurden, erwiesen, daß die Serumfraktion, die gemäß des Verfahrens dieser Erfindung hergestellt wurde. Im wesentlichen dieselben Eigenschaften und mltogenlsche Aktivität hat.

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Diese Resultate zeigen klar, daß Serum ein notwendiger Bestandteil eines GewebekulturmodI ums für die Mitose von diploiden menschlichen FaserkoImen Ist, was für heteroplolde Zellen nicht erforderlich Ist. Um dlplolde Zellen wirksam und ohne Veränderung zu kultivieren, Ist es erforderlich, da3 das Serum, das In den GewebekuIturmedlen verwendet wird, frei von Virusaoenzlen tst, dlo die Zellen verändern könnten, und von cytotoxischen Faktoren, die das Wachstum und die Vermehrung von Zeilen hemmen könnton. Das Produkt dieser Erfindung und das Verfahren dieser Erfindung bieten einen markanten Vorteil in dem Vermögen, dieses notwendige Bestandteil der GowebekuIturmedlen zu bieten, Insbesondere für dlplolde menschliche Faserkeime, so daß diese Zellen kultiviert werden können ohne im wesentlichen normende Wirkung wegen der Verwendung von rohem Blutserum oder ohne verändernde Wirkung aufgrund des Vorhandenseins von VIrusagonzian, die natürI Icharweiso in ungereinigtem und unfraktioniertem Blutserum enthalten sind. Darüber hinaus bietet das Vorfahren dieser Erfindung die Möglichkeit, Sera als Rohmaterialien aus einem groi3en Bereich von verschiedenen Quellen zu verwenden ohne Rücksicht auf das Erfordernis der Entgegenhaltungen, Serum von Fötli zu verwenden oder die Verwendung von Serum von außerordentlich jungen Tieren. Das Vorfahren dieser Erfindung überwindet die Nachteile, die die Isolations- und ReInigungstechnIkan für Serumproteine der Entgegenhaltungen begleiten, die anorganische Salz- und Alkohol-Fraktion ierungan verwenden, die die Bestandteile nicht wirksam zerlegen, und die Nachteile von Ionenaustausch chromatographischer und hochspannungs-elektrophoretlscher Trennungen, die eine Zerstörung der biologischen Aktivität und der physikalisch-chemlsehen Merkmale des. in dom Serum enthaltenen Proteins verursachen.'

üas Verfahren dieser Erfindung, das im wesentlichen nur physikalische Behandlungen enthält, kann leicht durchgeführt werden, und ein gereinigtes Produkt kann auf leichte Weise erzielt werden. Obgleich die Erfindung im Einzelnen und In Form von

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verschiedenen Ausführungen derselben beschrieben wurde, ist es offensichtlich, daß eine Person mit üblichen Kenntnissen in diesem Fach verschiedene Umänderungen und Abänderungen vornehmen kann, ohne von dem Geist und Rahmen der hierin besen ri ebenen■Erf i ηdung abzuwe i eheη,

Ansprüche:

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Claims (12)

Patentansprüche:

1. Mitogenisch aktives Blutserum, frei von Virusagenzien und cytotoxisehen Faktoren, dadurch gekennzeichnet, daß Blutserumbestandteile mit einem Molekulargewicht im Bereich von ungefähr 50.000 bis ungefähr 300.000 enthalten sind.

2. Blutserumsfraktion eines Serums gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Blutserumsfraktion eine Säugetierblutserumsfraktion enthält.

3. BIutserumsfraktion eines Serums gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Molekulargewicht im Bereich von ungefähr 50.000 bis ungefähr 150.000 Iiegt.

4. Blutserumsfraktion nach Anspruch 2, dadurch gekennze i chnet, daß die Säugetierblutserumsfraktion eine PferdebIutserumsfraktion, eine Rinderblutserumsfraktion oder eine menschliche Serumsfraktion ist.

5. Verfahren für die Herstellung einer mitogenisch aktiven Blutserumsfraktion, gereinigt frei von Virusagenzien und cytotoxisehen Faktoren, gekennzet chnet durch folgende Schritte:

(1) Entfernen der Bestandteile eines Blutserums, die ein Molekulargewicht von über ungefähr 300.000 haben, und

(2) Entfernen der Bestandteile des besagten Blutserums, die ein Molekulargewicht von weniger als ungefähr 50.000 haben,

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um eine Blutserumsfraktion verfügbar zu machen, die ein Molekulargewicht im Bereich von ungefähr 50.000 bis ungefähr 300.000 hat.

6. Verfahren gemäß Anspruch 5, -dadurch g e -

k en nzeichnet, daß der erste Schritt (1) das Entfernen der BestandteiIe umfaßt, die ein Molekulargewicht von über ungefähr 150.000 haben.

7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennz e i c h η e t , daß das Blutserum ein Säugetierblutserum ist.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennz e Lehnet, daß das Säugetierblutserum ein Pferdeblutserum, Rinderblutserum oder menschliches Blutserum ist,

9. Verfahren nach Anspruch 5,, dadurch gekennzel ch net, daß das Entfernen d.er entsprechenden. Bestandteile, die ein Molekulargewicht von über ungefähr 300.000 und weniger als ungefähr 50.000 haben, durch Ultrafiftrierung erfolgt.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzei chnet, daß die UltrafiItrierung durch die Anwendung einer Ultrafiltriermembrane oder eines Ultrafi I tri er-Faserf i I ters vorgenommen wird.

11. Verfahren für die Herstellung einer mitogenisch aktiven Blutserumsfraktion, gereinigt frei von Virusagenzien und cytotoxisehen Faktoren, gekennze.lehnet " · durch folgende Schritte:

(1) Entfernen des Fibrins, FIbrinogens und der Zellen aus dem Blut, um ein rohes Blutserum zu bieten, und

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(2) Fraktionieren des besagten rohen Blutserums, um eine Blutserumsfraktion zu bieten; besagtes Fraktionieren umfaßt das Entfernen von Bestandteilen des besagten rohen BJutserums, die ein Molekulargewicht von über ungefähr 300.000 haben, sowie von Bestandteilen des besagten rohen Blutserums, die ein Molekulargewicht von weniger als ungefähr 50.000 haben.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekenn zeichnet, daß im Anschluß an das Entfernen nächsten Schritt (1) und vor dem Fraktionieren das Verfahren darüber hinaus noch das Dialysieren des besagten rohen Blutserums gegen Wasser, das LyophiIisieren des dialysierten Serums und das WiederhersteI I en.des lyophili sierten Serums einschließt, um das Blutserum für den zweiten Schritt (2) zu bieten.

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