DE3434122A1

DE3434122A1 - Verfahren zur herstellung von interferon

Info

Publication number: DE3434122A1
Application number: DE19843434122
Authority: DE
Inventors: Toshinori Kasukabe Saitama Kanamori; Ei Tokio/Tokyo Mochida; Masahiro Iwatsuki Saitama Nobuhara; Kiyoshi Kawaguchi Saitama Yamaguchi
Original assignee: Mochida Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Mochida Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1983-09-17
Filing date: 1984-09-17
Publication date: 1985-06-05
Also published as: IL72929A; GB8423247D0; GB2146645B; US4680261A; JPS6062997A; DE3434122C2; IL72929A0; JPH0358717B2; GB2146645A; IT8448861A1; IT8448861A0; IT1179247B

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Interferon, in dem Interferon-produzierende Säugerzellen in einem Zellkulturmedium gezüchtet werden, welches mindestens eine Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe Ascorbinsäure, Ascorbinsaurederivat und einer Vanadiumverbindung, enthält.

Interferon wurde von Nagano et al (Comnt. Rend. Soc. Biol., Bd. 148, S. 1700, 1954) entdeckt; es wird beschrieben, dass es zusätzlich zu dem antiviralen Effekt (Gressor, I. et al, B.B.A., Bd. 516, S. 231, 1978) eine Antitumorwirkung besitzt. Somit ist die Möglichkeit einer Verwendung von Interferon als Arzneimittel von Interesse.

Gegenwärtig erfolgt eine grobe Einteilung der Interferone in drei Gruppen, die jeweils als Interferon-<?6 (IFN-06), Interferon-ß (IFN-ß) und Interferon-^" (IFN-/·") bezeichnet werden (Nature, Bd. 286, S. 110, 1980). IFN-0G wird in der Hauptsache hergestellt durch Stimulierung von Leukocyten mit einem Virus. IFN-ß wird in der Hauptsche hergestellt durch Stimulierung von Fibroblasten mit doppelstrangiger RNA oder einem Virus, und IFN-oO wird in der Hauptsache 0 hergestellt durch Stimulierung von Lymphocyten mit einem Mitogen.

Es besteht ein Bedarf nach einem Verfahren zur Herstellung von Interferon in grosser Menge, um dieses als Arzneimittel einsetzen und untersuchen zu können. Hierzu wurden Herstellungsverfahren beschrieben, wie z.B. ein Super-Induktions-Verfahren (Antimicrob. Ag. Chemother., Bd. 2, S. 476, 1972), bei welchem IFN-ß in grosser Menge hergestellt wird. Ausserdem kommt der sogenannte Primer-Effekt, bei welchem Interferon in grosser Menge hergestellt wird, indem man die produzierenden Zellen mit einer kleinen Menge Interferon bereits vor der Interferonproduktion behandelt, praktisch bei der IFN-06- und IFN-ß-Herstellung im grossen Massstab zur Anwendung.

Eine zufriedenstellende Interferonherstellung im grossen Massstab konnte durch diese Verfahren jedoch noch nicht realisiert werden. Somit besteht noch immer ein Bedarf nach einem ausgezeichneten Verfahren zur Interferonherstellung mit hoher Ausbeute.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Interferonherstellung zur Verfugung .zu. stellen.

Diese Aufgabe wird gemäss der Erfindung durch ein Verfahren gelöst, welches die Züchtung von Ihterferon-produzierenden Säugerzellen in einem Zellkulturmedium, das mindestens eine Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe Ascorbinsäure, Ascorbinsäurederivat und einer Vanadiumverbindung, enthält.

Nach dem erfindungsgemässen Verfahren kann Interferon in einfacher Weise in grossen Mengen hergestellt werden.

Als Ergebnis ausgedehnter Untersuchungen zur Interferonherstellung in grossem Massstab wurde gefunden, dass man grosse Mengen an Interferon herstellen kann, indem man eine Interferon-produzierende Säugerzelle in einem Zellmedium züchtet, welches mindestens eine Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe Ascorbinsäure, Ascorbinsäurederivat und einer Vanadiumverbindung, enthält.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Interferonherstellung, das gekennzeichnet ist durch Züchten einer Interferon-produzierenden Säugerzelle in einem Zellkulturmedium, welches mindestens eine Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe Ascorbinsäure, Ascorbinsäurederivat und einer Vanadiumverbindung, enthält.

Die vorliegende Erfindung wird im allgemeinen in folgender Weise ausgeführt. Entsprechend der konventionellen Züchtung von Interferon-produzierenden Säugerzellen in einem Wachstumsmedium, einem Primer-Medium, einem Induktionsmedium oder einem Produktionsmedium, wird ein Medium, welches mindestens eine Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe Ascorbinsäure, Ascorbinsaurederivat und einer Vanadiumverbindung, enthält, anstelle eines üblichen Mediums verwendet.

L-Ascorbinsäure wird gemäss der Erfindung als Ascorbinsäure bevorzugt. Als Ascorbinsaurederivat ist es möglich, einwertige Metallsalze von Ascorbinsäure zu verwenden, z.B. Lithiumsalze, Kaliumsalze und Natriumsalze, sowie zweiwertige Metallsalze von Ascorbinsäure, z.B. Magnesiumsalze, Kalziumsalze,-Strontiumsalze und Bariumsalze; einwertige Metallsalze sind jedoch bevorzugt. Von diesen einwertigen Metallsalzen ist besonders das Natriumsalz bevorzugt.

Der Gehalt an Ascorbinsäure und dessen Derivaten in dem Zellkulturmedium liegt bevorzugt im Bereich von bis 500 mg/1, besonders bevorzugt im Bereich von 10 bis 100 mg/1.

Bevorzugte Beispiele von Vanadiumverbindungen umfassen Vanadylsulfat, einwertige Metallsalze von Orthovanadat, wie z.B. Kalium-orthovanadat und Natrium-orthovanadat, einwertige Metallsalze von Metavanadat, wie z.B. Kalium-metavanadat und Natrium-metavanadat, einwertige Metallsalze von Decavanadat und Ammonium-metavanadat, wobei einwertige Metallsalze von Orthovanadat besonders bevorzugt sind. Von den

einwertigen Metallsalzen wiederum ist das Natriumsalz besonders vorteilhaft. Der Gehalt an Vanadiumverbindungen in dem Zellkulturmedium liegt vorteilhafterweise in einem Bereich von 0,01 bis 100 mg/1, besonders bevorzugt in einem Bereich von 0,1 bis 10 mg/1.

Die Ascorbinsäure, die Ascorbinsaurederivate und die Vanadiumverbindungen können jeweils einzeln in dem Zellkulturmedium vorliegen; die Verwendung dieser Verbindungen in Kombination ergibt jedoch eine stärkere Wirkung.

Jedes beliebige Wachstumsmedium, Primer-Medium, Induktionsmedium oder Produktionsmedium kann als Medium

¹S verwendet werden, in welches die Ascorbinsäure, Ascorbinsaurederivate und/oder die Vanadiumverbindungen inkorporiert werden. Ausserdem können Ascorbinsäure, Ascorbinsaurederivate und/oder Vanadiumverbindungen auch in diesen Medien in Kombinationen von zwei oder mehr inkorporiert werden.

Als Medien, in welche Ascorbinsäure, Ascorbinsaurederivate und/oder Vanadiumverbindungen inkorporiert werden, verwendet man im allgemeinen Eagle-MEM- und RPMI-1640-Medien; es können jedoch auch andere Medien, wie z.B. ein 199-Medium, ein Ham-F12-Medium, ein L15-Medium, ein modifiziertes Dulbecco-Medium und dergleichen verwendet werden.

Ascorbinsäure, Ascorbinsaurederivate und Vanadiumverbindungen, die gemäss der Erfindung verwendet werden, stellen im Handel erhältliche Verbindungen dar.

Zum Beispiel können L-Ascorbinsäure-, Natrium-L-ascorbat, Natrium-orthovanadat und Natrium-metavanadat, hergestellt von Wako Pure Chemical Industry Co., Ltd. (Tokyo, Japan), verwendet werden. 5

Als Interferon-produzierende Säugerzellen kann man menschliche diploide Zellen verwenden, wie z.B. MRC-5-Zellen, WI-38-Zellen, Flow 1000-Zellen, Flow 4000-Zellen etc., und menschliche periphere Leukocyten. Ausserdem ist es möglich, Human-induzierte heteroide Zellen einzusetzen, wie z.B. Namalwa-Zellen, MG-63-Zellen, CCRF-SB-Zellen, CCRF-CEM-Zellen, sowie auch Zellen, die von anderen Tieren induziert sind, z.B. RK-13 (induziert von Kaninchen), MDCK-Zellen (induziert vom Hund), L929-Zellen (induziert von der Maus) und primäre Kulturzellen verschiedener Tiere etc. .

Diese Zellen sind z.B. über die American Type Culture Collection oder Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd. (Osaka, Japan) erhältlich.

Als Induktionsmittel zur Interferoninduktion nach dem Züchten der Interferon-produzierenden Säugerzellen können übliche Induktionsmittel verwendet werden, z.B. Poly (I), Poly (C), Sendai-Virus, Newcastle-Disease-Virus, Concanavaline A und andere Induktionsmittel, wie z.B. Chlamydia, Rickettsia, Mitogen, Lipopolysaccharide etc..

Die Kulturbedingungen in einem Wachstumsmedium, einem Primer-Medium, einem Induktionsmedium oder einem Produktionsmedium entsprechen im wesentlichen den bisher bekannten Bedingungen.

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Im folgenden wird die Erfindung durch Versuche und Beispiele näher beschrieben; sie ist jedoch nicht auf dieselben beschränkt.

Versuch 1

MRC-5-Zellen (menschlicher diploider Zellstamm) wurden in einer Plastik-Petrischale mit einer Inokula-

4 2 tionsmenge von 3x10 -Zellen/cm zusammen mit

10 ml Eagle-MEM (Wachstumsmedium), welches 10 % Rinderserum enthielt/ inokuliert und anschliessend bei 37°C unter einer 5 %-igen CO^-Atmosphäre gezüchtet.

Nachdem die Zellen konfluent waren, wurde das Medium durch 5 ml Eagle-MEM (Primer-Medium), welches zusätzlich 0,1 % (W/V) Humanserumalbumin mit 100 Einheiten/ml IFN-ß enthielt, ausgetauscht und über Nacht gezüchtet.

Dann wurden dem Medium Poly (I):Poly (C) und Cycloheximid in Endkonzentrationen von jeweils 30 mg/1 und 2 mg/1 zugegeben. Es folgte 5-stündiges Züchten. Im weiteren wurde Actinomycin D in einer Endkonzentration von 1 mg/1 zugegeben und weitere 2 Stunden gezüchtet. Nachdem die Zellen zweimal mit PBS gewaschen wurden, erfolgte ein Austausch mit 5 ml Eagle-MEM (Produktionsmedium), welches mit 0,1 % (W/V) Humanserumalbumin ergänzt war. Nach Züchten über Nacht wurde der Interferontiter in dem Kulturmedium bestimmt. Der Interferontiter wurde mit Hilfe der CPE-Methode bestimmt, wobei FL-Zellen und Sindbis-Virus

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verwendet wurden; der Titer wurde ausgedrückt mittels internationalem Bezugsstandard (G023-902-527) von Interferon als Standard.

Es erfolgte eine Untersuchung des Einflusses auf die Interferonproduktion durch Inkorporieren von 20 mg/1 Natrium-L-ascorbat und/oder 1 mg/1 Natrium-orthovanadat in ein Wachstumsmedium, ein Primer-Medium, ein Induktionsmedium und/oder ein Produktionsmedium. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 wiedergegeben.

Tabelle 1

ZUSATZ UND MEDIUM

Wachstumsmedium

Primer Medium

Induktions
medium

Produktionsmedium

hergestellte Menge an Interferon-ß (Einheit/ml)

kein Zusatz

Natrium-L-ascorbat

kein Zusatz

kein Zusatz kein Zusatz

Natrium-L-ascorbat

kein Zusatz kein Zusatz

Natrium-ortho- kein Zusatz vanadat

kein Zusatz
kein Zusatz
kein Zusatz

Natrium-orthovanadat

kein Zusatz

kein Zusatz kein Zusatz

kein Zusatz

Natrium-L-ascorbat

kein Zusatz kein Zusatz kein Zusatz

Natrium-orthovanadat

kein Zusatz

kein Zusatz
kein Zusatz

Natrium-L-ascorbat

kein Zusatz
kein Zusatz
kein Zusatz

Natrium-orthovanadat

12.500 18.200

17.600 16.500 16.100 19.300 19.000 18.400 18.000

FORTSETZUNG Tabelle 1

Wachstums medium	Primer- Medium	Induktions medium	Produktions medium	hergestellte Menge an Interferon-ß (Einheit/ml)
Natrium-L- ascorbat und Natrium-ortho- vanadat	kein Zusatz	kein Zustz	kein Zusatz	23.800
kein Zusatz	Natrium-L- ascorbat und Natrium-ortho- vanadat	kein Zusatz	kein Zusatz	22.200
kein Zusatz	kein Zusatz	Natrium-L- ascorbat und Natrium-ortho- vanadat	kein Zusatz	21.000
kein Zusatz	kein Zusatz	kein Zusatz	Natrium-L- ascorbat und Natrium-ortho- vanadat	19.500
Natrium-L- ascorbat	Natrium-L- ascorbat	Natrium-L- ascorbat	Natrium-L- ascorbat	27.600
Natrium-L- ascorbat	Natrium-L- ascorbat	Natrium-L- ascorbat	kein Zusatz	25.500
Natrium-L- ascorbat	Natrium-L- ascorbat	kein Zusatz	Natrium-L- ascorbat	24.900

FORTSETZUNG Tabelle 1

Wachstums- medium	Primer- Medium	Induktions medium	Produktions medium	hergestellte Menge an Interferon-ß- (Einheit/ml)
Natrium-L- ascorbat	kein Zusatz	Natrium-L- ascorbat	Natrium-L- ascorbat	23.900
kein Zusatz	Natrium-L- ascorbat	Natrium-L- ascorbat	Natrium-L- ascorbat	23.300
Natrium-ortho- vanadat	Natrium-ortho- vanadat	Natrium-ortho- vanadat	Natrium-ortho vanadat	29.300
Natrium-ortho- vanadat	Natrium-ortho- vanadat	kein Zusatz	kein Zusatz	25.200
Natrium-ortho- vanadat	kein Zusatz	Natrium-ortho- vanadat	kein Zusatz	24.700
Natrium-ortho- vanadat	kein Zusatz	kein Zusatz	Natrium-ortho- vanadat	24.300
kein Zusatz	Natrium-ortho- vanadat	Natrium-ortho- vanadat	kein Zusatz	23.100
kein Zusatz	Natrium-ortho- vanadat	kein Zusatz	Natrium-ortho- vanadat	22.700
kein Zusatz	kein Zusatz	Natrium-ortho- vanadat	Natrium-ortho- vanadat	21.500
Natrium-L- ascorbat	Natrium-ortho- vanadat	Natrium-L- ascorbat	Natrium-ortho- vanadat	28.900

FORTSETZUNG Tabelle 1

Wachstumsmedium

Primer-Medium

Induktionsmedium

Produktionsmedium

hergestellte Menge an Interferon-ß-(Einheit/ml)

Natrium-L-ascorbat und
Natrium-orthovanadat

Natrium-L-ascorbat und Natrium-orthovanadat

Natrium-L-ascorbat und
Natrium-orthovanadat

35.500

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Versuch 2

4 In einen Spinner-Kolben wurden 5x10 -Zellen/ml von Namalwa-Zellen zusammen mit 200 ml RPMI 1640-Medium (Wachstumsmedium), welches 5 % Rinderserum enthielt, inokuliert. Nach 3-tägigem Züchten erfolgte über Nacht das Priming unter Verwendung von 200 ml RPMI 1640-Medium (Primer-Medium), welches 100 Einheiten /ml Interferon-oC und 0,1 % (W/V) Humanserumalbumin enthielt. Daraufhin wurde zu dem Medium Sendai-Virus in einer Endkonzentration von 100 HAU/ml zugegeben. Nach Züchten über Nacht wurde das Sendai-Virus bei pH 2,0 inaktiviert und der Interferon-tfO-Titer in dem Medium bestimmt. Der Titer wurde mit Hilfe des CPE-Verfahrens bestimmt und mit Hilfe des internationalen Bezugsstandards (G023-901-527) von Interferon als Standard ausgedrückt.

Der Einfluss verschiedener Konzentrationen an Natrium-metavanadat, welche in das Wachstumsmedium inkorporiert wurden, auf die gebildete Menge an Interferon-cL' wurde bestimmt; die Ergebnisse sind in Tabelle 2 wiedergegeben. Ausserdem wurde der Einfluss verschiedener Konzentrationen an L-Ascorbinsäure, die in das Primer-Medium inkorporiert wurden, auf die Produktionsmenge an IFN-O^ bestimmt. Diese Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengefasst.

Tabelle 2

Endkonzentration an Natrium- metavanadat zugegeben zum Wachstumsmedium (mg/1)	hergestellte Menge an Interf eron-oC (Einheit/ ml)
0 (Kontrolle)	2.410
0,001	2.520
0,01	3.310
0,1	4.180
1	4.740
10	4.260
100	3.640
1000	2.190

Tabelle 3

Endkonzentration an L- Ascorbinsäure zugegeben zum Primer-Medium (mg/1)	hergestellte Menge an Interferon-cO (Einheit/ ml)
0 (Kontrolle)	2.230
0,1	2.320
1	3.130
10	4.870
30	5.310
100	•4.990
500	3.720
2000	1 .950

Versuch 3

In einen Kunststoffkolben mit einer Kulturfläche von 150 cm wurden 3x10 L929-Zellen zusammen mit 50 ml eines 199-Mediums (Wachstumsmedium), welches 10 % (V/V) an Fötalkälberserum enthielt, inokuliert und bis zur Konfluenz 4 Tage lang gezüchtet. Das Medium wurde dann gegen 50 ml eines 199-Mediums ausgetauscht, welches 100 mg/1 Poly (I); Poly (C) und 0,01 % (W/V) Humanserumalbumin enthielt; dieses wurde nach 5 Stunden gegen 25 ml eines 199-Mediums (Produktionsmedium), welches 0,01 % (W/V) Humanserumalbumin enthielt, ausgetauscht. Nach 18-stündigem Züchten wurde der Interferontiter im Produktionsmedium be-

15 stimmt.

Es wurde der Einfluss verschiedener Vanadiumverbindungen, die in das Wachstumsmedium inkorporiert wurden, auf die Produktionsmenge an Interferon untersucht; die Ergebnisse sind in Tabelle 4 wiedergegeben.

Tabelle 4

in dem Wachstumsmedium ent haltene Vanadiumverbindung (mg/1)	2 mg/1	hergestellte Menge an Interferon (IU/ml)
keine (Kontrolle)	2 mg/1	630
Natrium-ortho- vanadat	2 mg/1	2.500
Vanadylsulfat	2 mg/1	1 .120
Natrium-deca- vanadat	1 .730
Ammonium-meta- vanadat	1 .570

BEISPIEL 1 Herstellung von

Namalwa-Zellen wurden in einer Konzentration von 3x10 -Zellen/ml in ein RPMI-1640-Medium, welches mit 5 % (V/V) Kälberserum ergänzt wurde und 40 mg/1 L-Ascorbinsäure und 3 mg/1 Natriumvanadat enthielt, inokuliert.

Nach 3-tägigem Züchten der Zellen bei 37⁰C in einem Spinner-Kolben wurden die Zellen durch Zentrifugieren gesammelt. Die Zellen wurden in einem RPMI-1640-Medium, welches 0,1 % (W/V) Humanserumalbumin, 40 mg/1 L-Ascorbinsäure, 3 mg/1 Natrium-metavanadat und 100 Einheiten /ml IFN-o6 enthielt, suspendiert und anschliessend über Nacht gezüchtet. Sendai-Virus wurde zu dem Medium in einer Endkonzentration von 100 HAU/ml zugegeben und anschliessend wiederum über Nacht gezüchtet. Durch Zentrifugieren wurden die Zellen eliminiert und der pH des erhaltenen Uberstandes auf 2,0 eingestellt. Durch Stehenlassen und Absitzen bei 4°C über Nacht wurde das Sendai-Virus inaktiviert. Der IFN-t^O-Titer in dem Medium betrug 3.340 Einheiten/ml. Der IFN-oO-Titer betrug 1.820 Einheiten/ml, wenn das Medium weder L-Ascorbinsäure noch Natrium-metavanadat enthielt.

BEISPIEL 2

Herstellung von IFN-ß:
MRC-5-Zellen (menschlicher diploider Zellstamm) wur-

den in einer Konzentration von 4x10 -Zellen/ml in Eagle-MEM, welches 10 % (V/V) Kälberserum, 20 mg/1 L-Ascorbinsäure und 1 mg/1 Natrium-orthovanadat enthielt, inokuliert und 4 Tage lang bei 37°C gezüchtet.

Das Medium wurde gegen ein Eagle-MEM-Medium, welches 0,1 % (W/V) menschliches Serumalbumin, 20 mg/1 Natrium-L-ascorbat, 1 mg/1 Natrium-orthovanadat und 100 Einheiten/ml Interferon-ß enthielt, ausgetauscht und anschliessend über Nacht gezüchtet. 30 mg/1 Poly (I); Poly (C) und 2 mg/1 Cycloheximid wurden zu dem Medium zugegeben. Nach 5-stündigem Züchten wurden 2 mg/1 Actinomycin D zu dem Medium zugegeben und das Züchten weitere 2 Stunden fortgesetzt.

Die gezüchteten Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen, ein Eagle-MEM-Medium, welches 0,1 % (W/V) menschliches Serumalbumin enthielt, wurde zu den Zellen zugegeben und diese über Nacht gezüchtet. Der IFN-ß-Titer im Medium betrug 35.300 Einheiten /ml.

Der IFN-ß-Titer betrug 10.200 Einheiten/ml, wenn das verwendete Medium weder Natrium-L-ascorbat noch Natrium-orthovanadat enthielt.

BEISPIEL 3

Herstellung von IFN- fz

Lymphocytenhaltige Fraktionen wurden aus dem periphären Blut freiwilliger erwachsener Spender mit Hilfe der Ficoll-Hypaque-Gradientenmethode gesammelt. Nach dem Züchten dieser Zellen in einer Plastik-Petrischale wurden nicht-anhaftende Zellen gesammelt. Die gesammelten Zellen wurden in einer Konzentration von 2x10 -Zellen/ml in einem RPMI-1640-Medium, welches mit 0,1 % (W/V) Humanserumalbumin ergänzt war und 20 mg/1 Natrium-L-ascorbat und 2 mg/1 Natrium-metavanadat enthielt, suspendiert. Zu der Suspension wur-

15 de Concanavaline A in einer Konzentration von

5 /Ug/ml zugegeben und anschliessend 48 Stunden lang gezüchtet. Nach Beendigung der Züchtung wurden die Zellen durch Zentrifugieren entfernt. Der IFN-^- Titer in dem Medium wurde mit Hilfe der CPE-Methode unter Anwendung des internationalen Bezugsstandards (G023-901-527) von IFN-^aIs Standard bestimmt. Es ergab sich in dem Medium ein IFN-/"-Titer von 2.930 Einheiten /ml. Ausserdem betrug der IFN-^-Titer Einheiten/ml, wenn ein Medium verwendet wurde, welches weder Natrium-L-ascorbat noch Natrium-metavanadat "enthielt.

Claims

HOFFMANN'-EITLE & PARTNER PATENT- UND RECHTSANWÄLTE 3 A 3 4 1 2 PATENTANWÄLTE DIPL.-ING. W. EITLE ■ DR. RER. NAT. K. HOFFMANN · DIPL.-ING. W. LEHN DIPL.-ING. K. FÜCHSLE · DR. RER. NAT. B. HANSEN . DR. RER. NAT. H-A. BRAUNS . DIPL.-ING. K. SDRG DIPL.-1NG. K. KOHLMANN · RECHTSANWALT A. NETTE 40 765 m/wa - 1 MOCHIDA PHARMACEUTICAL CO., LTD., TOKYO / JAPAN Verfahren zur Herstellung von Interferon PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Herstellung von Interferon, gekennzeichnet durch Züchten von Interferon-produzierenden Zellen eines Säugers in einem Zellkulturmedium, wobei das genannte ZeIlkulturmedium mindestens eine Verbindung aus der Gruppe bestehend aus Ascorbinsäure, Ascorbinsäurederivat und einer Vanadiumverbindung umfasst.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e k e η η · zeichnet, dass die genannte Ascorbinsäure L-Ascorbinsäure umfasst.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das genannte Ascorbin,-säurederivat ein einwertiges Metallsalze von L-Ascorbinsäure umfasst.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration von Ascorbinsäure von 1 bis 500 mg/1 des genannten Kulturmediums beträgt.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass die Konzentration des Ascorbinsäurederivates von 1 bis 500 mg/1 des genannten Kulturmediums beträgt.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass die Vanadiumverbindung Vanadylsulfat umfasst.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Vanadiumverbindung ein einwertiges Metallsalz von Orthovanadat umfasst .

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Vanadiumverbindung ausgewählt wird aus der Gruppe Natrium-orthovanadat und Kalium-orthovanadat.

9, Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die die Vanadiumverbindung ein einwertiges Metallsalz von Metavanadat umfasst.

10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Vanadiumverbindun-g aus der Gruppe Ammonium-metavanadat, Natrium-metavanadat und Kalium-metavanadat ausgewählt wird.

11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass die Vanadiumverbindung ein einwertiges Metallsalz von Decavanadat umfasst.

12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration der Vanadiumverbindung von 0,01 bis 100 mg/1 beträgt.

13. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass das genannte Zellkulturmedium mindestens ein Zellkulturmedium umfasst, das ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus einem Wachstumsmedium, einem Primer-Medium, einem Induktionsmedium und einem Produktionsmedium.

14. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass die genannten Inter- feron-produzierenden Zellen von Säugern menschliehe Zellen darstellen.

15. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die genannten Interferon-produzierenden Säugerzellen mindestens Säugerzellen umfassen, die ausgewählt sind aus der Gruppe MRC-5, WI-38, Flow 1000, Flow 4000, Namalwa, MG-63, CCRF-SB und CCRF-CEM.

16. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass die genannten Interferon-produzierenden Säugerzellen ausgewählt sind aus der Gruppe RK-13, MDCK und L929.

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