DE3434122C2

DE3434122C2 -

Info

Publication number: DE3434122C2
Application number: DE3434122A
Authority: DE
Inventors: Masahiro Iwatsuki Saitama Jp Nobuhara; Toshinori Kasukabe Saitama Jp Kanamori; Kiyoshi Kawaguchi Saitama Jp Yamaguchi; Ei Tokio/Tokyo Jp Mochida
Original assignee: Mochida Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Mochida Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1983-09-17
Filing date: 1984-09-17
Publication date: 1992-05-21
Also published as: US4680261A; IT1179247B; JPH0358717B2; IT8448861A1; IL72929A0; GB2146645A; GB2146645B; DE3434122A1; JPS6062997A; IL72929A; GB8423247D0; IT8448861A0

Description

Die Erfindung betrifft ein bestimmtes Verfahren zur Herstellung von Interferon durch Züchten von Interferon-produzierenden Zellen in einem das Zellwachstum stimulierenden Kulturmedium.

Interferon wurde von Nagano et al. (Comnt. Rend. Soc. Biol., Bd. 148, S. 1700, 1954) und Isaacs et al. (Proc. Roy. Soc. Ser. B., Bd. 147, S. 258, 1957) entdeckt; es wird beschrieben, daß es zusätzlich zu dem antiviralen Effekt (Gressor, I. et al., B. B. A., Bd. 516, S. 231, 1978) eine Antitumorwirkung besitzt. Somit ist die Möglichkeit einer Verwendung von Interferon als Arzneimittel von Interesse.

Gegenwärtig erfolgt eine grobe Einteilung der Interferone in drei Gruppen, die jeweils als Interferon-α (IFN-α), Interferon-B (IFN-B) und Interferon-γ (IFN-γ) bezeichnet werden (Nature, Bd. 286, S. 110, 1980). IFN-α wird in der Hauptsache hergestellt durch Stimulierung von Leukocyten mit einem Virus. IFN-β wird in der Hauptsache hergestellt durch Stimulierung von Fibroblasten mit doppelstrangiger RNA oder einem Virus, und IFN-α wird in der Hauptsache hergestellt durch Stimulierung von Lymphocyten mit einem Mitogen.

Es besteht ein Bedarf nach einem Verfahren zur Herstellung von Interferon in großer Menge, um dieses als Arzneimittel einsetzen und untersuchen zu können. Hierzu wurden Herstellungsverfahren beschrieben, wie z. B. ein Super-Induktions-Verfahren (Antimicrob. Ag. Chemother., Bd. 2, S. 476, 1972), bei welchem IFN-B in großer Menge hergestellt wird. Außerdem kommt der sogenannte Primer-Effekt, bei welchem Interferon in großer Menge hergestellt wird, indem man die produzierenden Zellen mit einer kleinen Menge Interferon bereits vor der Interferonproduktion behandelt, praktisch bei der IFN-α- und IFN-B-Herstellung im großen Naßstab zur Anwendung.

Aus Chemical Abstracts, 1980, 92: 4565k, ist ein Verfahren zur Herstellung von Interferon bekannt, bei dem die Interferon-produzierenden Zellen in einem Kulturmedium, das Ascorbinsäure enthält, gezüchtet werden, wodurch die Ausbeute an Interferon steigt.

Eine zufriedenstellende Interferonherstellung im großen Maßstab konnte durch diese Verfahren jedoch nicht realisiert werden. Somit besteht noch immer ein Bedarf nach einem ausgezeichneten Verfahren zur Interferonherstellung mit hoher Ausbeute.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Interferonherstellung mit erhöhten Ausbeuten zur Verfügung zu stellen.

Diese Aufgabe wird gemäß der Erfindung durch ein Verfahren zur Herstellung von Interferon durch Züchten von Interferon-produzierenden Zellen in einem Zellkulturmedium gelöst, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß man ein Zellkulturmedium einsetzt, das eine Vanadiumverbindung enthält, wobei die Konzentration der Vanadiumverbindung 0,01 bis 100 mg/l beträgt.

Weitere bevorzugte Ausführungsformen gemäß der Erfindung entsprechen den Ansprüchen 2 bis 4.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren kann Interferon in einfacher Weise in großen Mengen hergestellt werden.

Als Ergebnis ausgedehnter Untersuchungen zur Interferonherstellung in großem Maßstab wurde gefunden, daß man große Mengen an Interferon herstellen kann, indem man eine Interferon-produzierende Säugerzelle in einem Zellmedium züchtet, welches eine Vanadiumverbindung enthält, wobei die Konzentration der Vanadiumverbindung 0,01 bis 100 mg/l beträgt.

Die vorliegende Erfindung wird im allgemeinen in folgender Weise ausgeführt. Entsprechend der konventionellen Züchtung von Interferon-produzierenden Säugerzellen in einem Wachstumsmedium, einem Primer-Medium, einem Induktionsmedium oder einem Produktionsmedium, wird ein Medium, welches die im Hauptanspruch genannten Zusätze enthält, eingesetzt.

Bevorzugte Beispiele von Vanadiumverbindungen umfassen Vanadylsulfat, einwertige Metallsalze von Orthovanadat, wie z. B. Kalium-orthovanadat und Natrium-orthovanadat, einwertige Metallsalze von Metavanadat, wie z. B. Kaliummetavanadat und Natrium-metavanadat, einwertige Metallsalze von Decavanadat und Ammonium-metavanadat, wobei einwertige Metallsalze von Orthovanadat besonders bevorzugt sind. Von den einwertigen Metallsalzen wiederum ist das Natriumsalz besonders vorteilhaft. Der Gehalt an Vanadiumverbindungen in dem Zellkulturmedium liegt vorteilhafterweise in einem Bereich von 0,01 bis 100 mg/l, besonders bevorzugt in einem Bereich von 0,1 bis 10 mg/l.

Jedes beliebige Wachstumsmedium, Primer-Medium, Induktionsmedium oder Produktionsmedium kann als Medium verwendet werden, sofern in dieses eine Vanadiumverbindung in der im Anspruch 1 genannten Menge inkorporiert wird.

Als Medien, in welche eine Vanadiumverbindung inkorporiert wird, verwendet man im allgemeinen Eagle-MEM- und RPMI-1640-Medien; es können jedoch auch andere Medien, wie z. B. ein 199-Medium, ein Ham-F12-Medium, ein L15-Medium, ein modifiziertes Dulbec-co-Medium und dgl. verwendet werden.

Als Interferon-produzierende Säugerzellen kann man menschliche diploide Zellen verwenden, wie z. B. MRC-5-Zellen, WI-38-Zellen, Flow 1000-Zellen, Flow 4000-Zellen etc., und menschliche periphere Leukocyten. Außerdem ist es möglich, Human-induzierte heteroide Zellen einzusetzen, wie z. B. Namalwa-Zellen, MG-63-Zellen, CCRF-SB-Zellen, CCRF-CEM-Zellen, sowie auch Zellen, die von anderen Tieren induziert sind, z. B. RK-13 (induziert von Kaninchen), MDCK-Zellen (induziert vom Hund), L929-Zellen (induziert von der Maus) und primäre Kulturzellen verschiedener Tiere etc.

Als Induktionsmittel zur Interferoninduktion nach dem Züchten der Interferon-produzierenden Säugerzellen können übliche Induktionsmittel verwendet werden, z. B. Poly(I) : Poly(C), Sendai-Virus, Newcastle-Disease-Virus, Concanavalin A und andere Induktionsmittel, wie z. B. Chlamydia, Rickettsia, Mitogen, Lipopolysaccharide etc.

Die Kulturbedingungen in einem Wachstumsmedium, einem Primer-Medium, einem Induktionsmedium oder einem Produktionsmedium entsprechen im wesentlichen den bisher bekannten Bedingungen.

Im folgenden wird die Erfindung durch Beispiele näher beschrieben.

Beispiel 1

MRC-5-Zellen (menschlicher diploider Zellstamm) wurden in einer Plastik-Petrischale mit einer Inokulationsmenge von 3 × 10⁴-Zellen/cm² zusammen mit 10 ml Eagle-MEM (Wachstumsmedium), welches 10% Rinderserum enthielt, inokuliert und anschließend bei 37°C unter einer 5%igen CO₂-Atmosphäre gezüchtet. Nachdem die Zellen konfluent waren, wurde das Medium durch 5 ml Eagle-MEM (Primer-Medium), welches zusätzlich 0,1% (W/V) Humanserumalbumin mit 100 Einheiten/ml IFN-B enthielt, ausgetauscht und über Nacht gezüchtet.

Dann wurden dem Medium Poly(I) : Poly(C) und Cycloheximid in Endkonzentrationen von jeweils 30 mg/l und 2 mg/l zugegeben. Es folgte 5stündiges Züchten. Im weiteren wurde Actinomycin D in einer Endkonzentration von 1 mg/l zugegeben und weitere 2 Stunden gezüchtet. Nachdem die Zellen zweimal mit PBS gewaschen wurden, erfolgte ein Austausch mit 5 ml Eagle-MEM (Produktionsmedium), welches mit 0,1% (W/V) Humanserumalbumin ergänzt war. Nach Züchten über Nacht wurde der Interferontiter in dem Kulturmedium bestimmt. Der Interferontiter wurde mit Hilfe der CPE-Methode bestimmt, wobei FL-Zellen und Sindbis-Virus verwendet wurden; der Titer wurde ausgedrückt mittels internationalem Bezugsstandard (G023-902-527) von Interferon als Standard.

Es erfolgte eine Untersuchung des Einflusses auf die Interferonproduktion durch Inkorporieren von 1 mg/l Natrium-orthovanadat in ein Wachstumsmedium, ein Primer-Medium, ein Induktionsmedium und/oder ein Produktionsmedium. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 wiedergegeben.

Tabelle 1

Zusatz und Medium

Beispiel 2

In einen Spinner-Kolben wurden 5 x 10⁴-Zellen/ml von Namalwa-Zellen zusammen mit 200 ml RPMI 1640-Medium (Wachstumsmedium), welches 5% Rinderserum enthielt, inokuliert. Nach 3tägigem Züchten erfolgte über Nacht das Priming unter Verwendung von 200 ml RPMI 1640-Medium (Primer-Medium), welches 100 Einheiten/ml Interferon-α und 0,1% (W/V) Humanserumalbumin enthielt. Daraufhin wurde zu dem Medium Sendai-Virus in einer Endkonzentration von 100 HAU/ml zugegeben. Nach Züchten über Nacht wurde das Sendai-Virus bei pH 2,0 inaktiviert und der Interferon-α-Titer in dem Medium bestimmt. Der Titer wurde mit Hilfe des CPE-Verfahrens bestimmt und mit Hilfe des internationalen Bezugsstandards (G023-901-527) von Interferon als Standard ausgedrückt.

Der Einfluß verschiedener Konzentrationen an Natrium-metavanadat, welche in das Wachstumsmedium inkorporiert wurden, auf die gebildete Menge an Interferon-α wurde bestimmt; die Ergebnisse sind in Tabelle 2 wiedergegeben.

Endkonzentration an Natrium-metavanadat zugegeben zum Wachstumsmedium (mg/l)
Hergestellte Menge an Interferon-α (Einheit/ml)
0 (Kontrolle)
2.410
0,001	2.520
0,01	3.310
0,1	4.180
1	4.740
10	4.260
100	3.640
1000	2.190

Beispiel 3

In einen Kunststoffkolben mit einer Kulturfläche von 150 cm² wurden 3×10⁶ L929-Zellen zusammen mit 50 ml eines 199-Mediums (Wachstumsmedium), welches 10% (V/V) an Fötalkälberserum enthielt, inokuliert und bis zur Konfluenz 4 Tage lang gezüchtet. Das Medium wurde dann gegen 50 ml eines 199-Mediums ausgetauscht, welches 100 mg/l Poly(I) : Poly(C) und 0,01% (W/V) Humanserumalbumin enthielt; dieses wurde nach 5 Stunden gegen 25 ml eines 199-Mediums (Produktionsmedium), welches 0,01% (W/V) Humanserumalbumin enthielt, ausgetauscht. Nach 18stündigem Züchten wurde der Interferontiter im Produktionsmedium bestimmt.

Es wurde der Einfluß verschiedener Vanadiumverbindungen, die in das Wachstumsmedium inkorporiert wurden, auf die Produktionsmenge an Interferon untersucht; die Ergebnisse sind in Tabelle 3 wiedergegeben.

Tabelle 3

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Interferon durch Züchten von Interferon-produzierenden Zellen in einem Zellkulturmedium, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Zellkulturmedium einsetzt, das eine Vanadiumverbindung enthält, wobei die Konzentration der Vanadiumverbindung 0,01 bis 100 mg/l beträgt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Vanadiumverbindung Vanadylsulfat, ein einwertiges Metallsalz von Orthovanadat, ein einwertiges Metallsalz von Metavanadat oder ein einwertiges Metallsalz von Decavanadat einsetzt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das einwertige Metallsalz von Orthovanadat Natriumorthovanadat oder Kaliumorthovanadat darstellt.

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das einwertige Metallsalz von Metavanadat Natriummetavanadat oder Kaliummetavanadat darstellt.