DE2821466A1

DE2821466A1 - Verbessertes verfahren zur herstellung von humaninterferon

Info

Publication number: DE2821466A1
Application number: DE19782821466
Authority: DE
Inventors: Rainer Guenther Adolf; Gerhard Dr Bodo; Silvia Jutta D Lindner-Frimmel; Peter Dr Meindl; Peter Dr Swetly; Hans Dr Tuppy
Original assignee: Dr Karl Thomae GmbH
Current assignee: Boehringer Ingelheim Pharma GmbH and Co KG
Priority date: 1978-05-17
Filing date: 1978-05-17
Publication date: 1979-11-29
Also published as: AT370132B; JPS6251114B2; JPS5568296A; ATA337779A

Description

Verbessertes Verfahren zur Herstellung von Humaninterferon
Die Herstellung von Humaninterferon aus Zellen humanen Ursprungs hat aufgrund der medizinischen Bedeutung der Interferone bei der Behandlung akuter und chronischer Virusinfektionen sowie bei der Krebstherapie an Menschen und Tieren weltweite Beachtung gefunden. Die hierfür benötigten Mengen von Interferonen können jedoch durch die bisher bekannten Verfahren zu ihrer Herstellung nicht zur VerfUgung gestellt werden, da bei dieser nach Induktion der Gewebekulturzellen nur eine niedrige Konzentration von Humaninterferonen erreicht werden kann.
Die Herstellung der Interferone erfolgt bei den bisher bekannten Verfahren durch Inkubation mit einem Interferoninduktor, z . B.
einem viralen Induktor oder einem NukleinsMureinduktor behandelter Zellen in einem Zellkulturmedium. Anschließend werden die Zellen abgetrennt und gegebenenfalls die verwendeten Induktor-Viren durch Zugabe einer Mineralsäure und Stehen während mehrerer Tage zerstört. Die so gewonnene Lösung von Rohinterferon wird anschließend mittels herkömmlicher Reinigungsschritte konzentriert und gereinigt (siehe beispielsweise DE-OS 2 724 918).
Als Zellen für die Interferoninduktion werden hierbei üblicherweise entweder eine permanent kultivierbare Zellinie lymphoblastoiden Ursprungs, z.B. Namalwa-Zellen (siehe G. Klein et al.
in Intern, J. Cancer 10, 44-57 (1972)), oder menschliche Fibroblastenzellen entweder mit diploidem Chromosomensatz und beschrAnkter Lebensdauer unter Zellkulturbedingungen oder mit heteroploidem Chromosomensatz und permanenter Teilbarkeit verwendet.
Pls Induktor-Viren werden Ublicherweisen Paramyxoviren, z.B. vesiculäres Stomatitis-Virus, Haemagglutinierendes Virus Japan (VJ = Sendai-Virus) oder Newcastle Disease-Virus, und Nukleinsäureinduktoren, z.B. eine doppelstrMngige RihonukleinsSure wie poly I:C, gegebenenfalls in Kombination mit metabolischen Inhibitoren und/oder Polykationen, verwendet.
berraschenderweise wurde nun gefunden, daß die Zugabe einer sogenannten Stimulatorsubstanz oder eines Gemisches derartiger Substanzen zu geeigneten Zellen zu einer Steigerung der produzierten Interferonmenge auf ein Vielfaches, z.B. auf das 4- bis 60-fache, der Ausbeute ohne Vorbehandlung führt. Die Zugabe des Stimulators erfolgt hierbei vorzugsweise vor der Interferonherstellung mit Interferoninduktoren, diese kann jedoch auch bevor und wShrend der Zugabe des Stimulators erfolgen. Ilierbei ist es besonders fiberratschend, daß die erfindungsgemMBe Ausbeutesteigerung an Interferon sowohl auf einer Erhöhung des Prozentsatzes an Interferon-produzierenden Zellen als auch auf einer Steigerung der Interferonausbeute pro Zelle beruht.
Als Stimulatoren haben sich hierbei insbesondere solche Substanzen bewEhrt, durch deren Zusatz zum Zellkulturmedium der Prozentsatz derjenigen Zellen, welche Interferon Droduzieren, erhöht wird.
Hierunter sind solche Substanzen zu verstehen, deren Zusatz zum Zellkulturmedium bewirkt, daß Zellen, welche sich in logarithmischer Wachstumsphase befinden, bei optimalen Wachstumsbedingungen aus der Wachstumsphase in eine Ruhephase übergehen, welche dadurch definiert ist, daß die Zellen bezüglich ihres Desoxyribonukleinsäure (DNA)-Gehalts postmitotischen (Gl-Phase) Zellen entsprechen und keine DNA-Synthese abläuft.
Als Stimulatoren haben sich insbesondere gesättigte und ungesättigte aliphatische Carbonsäuren, z.B. Alkansäuren und Alkensäuren mit 3 bis 5 Kohlenstoffatomen wie Propionsäure, n-Buttersäure, Isobuttersäure, n-ValeriansSure, Acrylsäure, CrotonsSure, Angelicasäure oder Tiglinsäure und deren Salze mit anorganischen oder organischen Basen, N,N'-diacetylierte Diamine mit 4 bis 8 Kohlenstoffatomen, insbesondere jedoch deren a ,(Ar -Derivate wie beispielsweise Pentamethylenbisacetamid, Hexamethylenbisacetamid oder Heptamethylenbisacetamid, heteroaromatische Carbonsäureamide, z.B. Pyridincarbonsäureamide wie Nicotinamid, Antimetaboliten wie 9-ß-D-arabinofuranosylcytosin oder organische Schwefelverbindungen, z.B. deren Sulfoxide wie Dimethylsulfoxid, als geeignet erwiesen.
Die Endkonzentration dieser Stimulatoren beträgt zweckmäßigerweise 0,1 pMol - 250 mMol. Die bevorzugte Endkonzentration bei einer als Stimulator verwendeten Alkan- oder Alkensäure beträgt jedoch 0,5 -5 mMol, bei einem diacetylierten Diamin 1-10 m Mol, bei einem heteroaromatischen Carbonsäureamid 10 - 50 mMol, bei einem Antimetaboliten 0,1 - 2 rMol und bei einer organischen Schwefelverbindung wie Dimethylsulfoxid 50 - 250 mMol.
Als besonders geeignete Stimulatoren haben sich hierbei Propionsaure, n-Buttersäure, n-Valeriansäure und deren Alkalisalze wie die Natriumsalze, Hexamethylenbisacetamid, Cytosinarabinosid oder Dimethylsulfoxid erwiesen.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird jedoch wie folgt besonders bevorzugt durchgeführt: Namalwa-Zellen werden in einem Wachstummedium, vorzugsweise dem Medium RPMI 1640 (Firma Gibco, USA, oder Firma Flow, Großbritannien) vermehrt, welches als Zusätze 10 - 25 Vol. X, vorzugsweise jedoch 20 Vol. %, Tryptosephosphat-Broth und 1-10 Vol %, vorzugsweise jedoch 2-6 Vol. %, vorgereinigtes Humanserum enthält.
Hierbei kann alternativ zu Humanserum auch ein Zusatz von Serum oder Serumfraktionen anderer Species verwendet werden, z.B. foetales Rindserum in einer Konzentration von 5-15 Vol. %.
Die derart kultivierten Zellen werden in Suspension bei einer Dichte von 0,2 - 5 x 106 Zellen/ml, vorzugsweise aber bei einer 6 Dichte von 0,5 - 1 x 106 Zellen/ml, mit einer Stimulatorverbindung, z.B. einem Alkalisalz der n-Buttersäure, in einer Endkonzentration von zweckmäßigerweise 1 mMol> versetzt und zweckmäßigerweise bei einer Temperatur von 35-37°C inkubiert. Nach einem Zeitraum von 6 - 72 Stunden, vorzugsweise jedoch von 24-48 Stunden, werden die Zellen durch Zentrifugation gewonnen und zweckmäßigerweise bei 6 einer Dichte von 50 x 10 Zellen/ml Medium, mit oder ohne Stimulatorsubstanz, suspendiert. Diese Suspension wird beispielsweise mit HVJ-Virus als Interferoninduktor infiziert und inkubiert. Nach ungefähr 1-3 Stunden werden die infizierten Zellen durch Zentrifugation gesammelt und bei einer Dichte von 5-10 x 106 Zellen/ml in einem serumfreien Zellkulturmedium, z.B. in nMinimum Essential Medium-Eagle"- Zellkulturmedium (Firma Gibco, USA, oder Firma Flow, Großbritannien), für einen Zeitraum von 15-24 Stunden, vorzugsweise aber 18-20 Stunden, in Gegenwart oder Abwesenheit der Stimulatorsubstanz bei 35-37 0C und einem pH-Wert des Gewebekulturmediums von 6,7 - 8,0, vorzugsweise jedoch von 7,3, inkubiert. Die erhaltene Lösung des lymphoblastoiden Rohinterferons wird durch Zentrifugation von den Namalwa-Zellen abgetrennt und zur Inaktivierung restlicher Induktor-Viren durch Zugabe von Mineralsäure, beispielsweise von Salzsäure auf ein pH-Wert von vorzugsweise 2,0 eingestellt und mehrere Tage, z.B. 3-5 Tage, bei 0-4 0C inkubiert.
Zur weiteren Reinigung kann die so gewonnene Lösung von lymphoblastoidem Rohinterferon beispielsweise folgenden Reinigungsschritten unterzogen werden: a) Die erhaltene Lösung wird beispielsweise mit Natronlauge neutralisiert und das Interferon mit einem Zinksalz, z.B, Zinkacetat, gefällt und mittels Zentrifugation abgetrennt. Das erhaltene Präzipitat wird in kalter verdünnter Salzsäure, z,B.
0,1 N Salzsäure, in Lösung gebracht.
b) Nach Klärung der salzsauren Lösung mittels erneuter Zentrifugation wird diese mit einem Ionenaustauscher, vorzugsweise Ionenaustauscher SP-Sephadex C-25 der Firma Pharmacia Fine Chemicals (Uppsala) je Liter Rohlösung, versetzt und mehrere Stunden gerührt. Nachdem das Interferon vom Ionenaustauscher aufgenommen wurde, wird dieser mehrmals zur vollständigen Entfernung der Zinkionen mit einem Puffer gewaschen, z.B. 3-mal mit 0,1 M Glycin/Salzsäure-Puffer pH 2,5 und dreimal mit 0,1 M Kaliumzitrat pH 4,0, dem 0,005 M Dinatriumäthylendiamin-tetraacetat zugesetzt war. Anschließend wird der Ionenaustauscher mit dem Zitratpuffer in eine Chromatographiesäule gefüllt und das Interferon mit einem schwach basischen Puffer, z.B. mit 0,1 M Kalium-phosphat pH 8, dem 1 M Kaliumchlorid zugesetzt war, eluiert.
c) Die gesammelten proteinhaltigen Eluate werden mit Salzsäure bei niederen Temperaturen zweckmäßigerweise auf pH 3,5 eingestellt und nach Entfernung der entstandenen Trübung mittels Zentrifugation wird zur Fällung des Interferons eine Lösung von Kaliumthiocyanat zugesetzt. Der gebildete Niederschlag wird absitzen gelassen, durch Zentrifugieren gesammelt und in einem möglichst kleinen Volumen eines schwach basischen Puffers, z.B. 0,1 M Kaliumphosphat pH 8, aufgenommen und die Lösung ultrazentrifugiert.
d) Die so gewonnene Lösung wird über eine Chromatographiesäule weiter gereinigt. Hiersu wird zweckmäßigerweise ein Molekularsieb wie Sephadex G-100 der Firma Pharmacia Fine Chemicals (Uppsala) mit der Teilchengröße 40-120 P und als Eluens Phosphat-gepufferte physiologische Koehsalzlösung, der 0,001 M Dinatrium-athylendiamintetraacetat zugegeben ist, verwendet.
Hierbei ist es zweckmäßig, vor Verwendung der Säule diese mit Proteinen von bekanntem Molgewicht zu eichen. Es werden die Fraktionen des Eluates gesammelt, die einem Molekulargewicht von 10.000 - 35.000 Daltons entsprechen.
e) Die gesammelten Fraktionen werden mittels Salzsäure vorzugsweise auf pH 3 eingestellt und Uber eine kleine Säule, gefüllt mit einem Ionenaustauscher wie SP-Sephadex C-25 (siehe Punkt b), geleitet, welche zweckmäßigerweise mit 0,1 M Kaliumzitrat pH 3,0 vorgewaschen wird. Bei diesem pH wird das Interferon von der Säule festgehalten und anschließend nach kurzem Waschen mit dem Zitrat-Puffer mit einem Phosphat-Puffer, z.B.
0,1 M Kaliumphosphat pH 8, eluiert. Die proteinhaltigen Fraktionen werden gesammelt und gegen Phosphat-gepufferte physiologische Kochsalzlösung dialysiert.
Die nachfolgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern: Vorbemerkung: Die "Namalwa-Zellen" werden in Suspensionskultur in einem Fermentor vermehrt. Hierbei wird als Wachstumsmedium das Medium RPMI 1640, dem 20 Vol % Tryptose-Phosphat-Broth und 2-4 Vol % vorgereinigtes Humanserum beigegeben ist, verwendet. Das vorgereinigte Humanserum wird durch Fällung eines Teiles der Serumproteine mit 6 % Polyäthylenglykol 6000 hergestellt (siehe Inglot et al. in Acta Virol 19, 250 - 254 (1975)). Die erreichten Zelldichten liegen bei 2 - 7 x 106 Zellen/ml.
Das Sendai-Virusn wird in embryonierten HUhnereiern vermehrt die Reinigung erfolgt mittels einer High-Speed Zentrifuge und die Suspension im Wachstumsmedium mittels Ultraschall Behandlung. Das "Sendai-Virusn wird bei -700C aufbewahrt.
Beispiel 1 Namalwa Zellen, in exponentiellem Wachstumsstadium wurden in 85 1 Wachstumsmedium bei einer Dichte von 5 x 105 Zellen/ml suspendiert.
Die Stimulatorsubstanz wurde für einen Zeitraum von t Stunden bei 37°C in einer Konzentration von c mMol zum Zellkulturmedium zugesetzt. Während dieser Vorbehandlungszeit geht die Rate der DNA-Synthese bezogen auf die DNA-Synthese in unbehandelten Zellen auf unter 2 % zurück und die Zellen sind in einem, bezüglich der DNA-Synthese definierten, Ruhezustand, welcher der G-1 Phase des Zellzyklus entspricht. Nach der Vorbehandlungszeit wurden die Zellen durch Zentrifugation (700 x g, 15 Minuten) gesammelt und bei einer Dichte von 5 x 107 Zellen/ml in 1,7 Litern Wachstumsmedium bei 37°C 2 Stunden in Rollkulturflaschen mit 2 Haemagglutinationseinheiten HVJ/ml inkubiert. Die auf diese Weise induzierten Zellen wurden durch Zentrifugation gesammelt und bei einer Dichte von 6 5 x 106 Zellen/ml in 17 Litern serumfreiem Eagle's-Minimum Essential Medium (mit Earle Salzlösung) bei 35,50C 20 Stunden lang bei pH 7.3 inkubiert. Hierzu wurden 20 1 Rührkolben eingesetzt. Die Rohlösung (:Zellüberstand) wurde nach Abzentrifugieren der Zellen (2000 x g,30 Minuten) bei einer Temperatur von maximal iOOC mit 5N Salzsäure auf pH 2 eingestellt und 3-5 Tage bei 40C zur Inaktivierung des verwendeten HVJ gelagert.

Die nachfolgende Tabelle enthält die gefundene Ausbeutesteigerung an Interferon bei Zugabe von c mMol n-Buttersäure als Stimulator:

Konzentration Dauer der Vorbehandlung IE/lO6Z+ Faktor
c mMol t Stunden
O 280 1
1 26 7 270 26
0 1 480 1
2 40 55 550 38
0 1 100 1
i 48 36 000 33
2,5 48 65 520 60
o 1 630 1
1 68 44 000 27

Internationale Einheiten Interferon pro 106 Zellen.

Beispiel 2 Namalwazellen wurden als Suspensionskultur in 85 1 Wachstumsmedium bis zum Erreichen einer Zelldichte von 5 x 105 Zellen/ml kultiviert.
In diesem Stadium befinden sich die Zellen in der exponentiellen Wachstumsphase, welche sich durch ein Maximum an DNA-Synthese pro Zelle auszeichnet. Die Stimulatorsubstanz wurde nun als wässrige Lösung für einen Zeitraum von t Stunden bei 35,5 - 370C in einer Konzentration von c mMol zum Zellkulturmedium zugesetzt. Nach dieser Vorbehandlungszeit, innerhalb derer die DNA-Syntheserate auf weniger als 12 % einer nicht mit Stimulatorsubstanz behandelten Kontrollkultur gesunken war und der Großteil der Zellen in einer der G1-Phase des Zell zyklus entsprechenden Ruhephase angesammelt war, wurden die Zellen durch Zentrifugation bei 700 x g in einem kontinuierlichen Durchflußzentrifugationsverfahren sedimentiert.
Die derart gesammelten Zellen wurden bei einer Dichte von 1 x 107 Zellen/ml in 9 1 Wachstumsmedium, welches c mMol Stimulatorsubstanz enthielt, suspendiert und 4 Stunden lang bei 35,5 - 37°C in einem Rührkolben mit 28 HBmagglutinationseinheiten HVJ/ml inkubiert. Die auf diese Weise induzierten Zellen wurden durch Zentrifugation gesammelt und bei einer Dichte von 5 x 106 Zellen/ml in 18 1 serumfreien Eagle's Minimum Essential Medium (mit Earle Salzen) suspendiert und bei 360C 24 Stunden lang bei pH 7.1 in einem 20 1 Rührkolben inkubiert. Nach Abzentrifugieren der Zellen (2000 x g, 30 min) stellt der Zellüberstand die Interferonrohlösung dar, Diese wurde mit 5 N Salzsäure auf pH 2 eingestellt und 3-5 Tage bei 40C zur Inaktivierung des viralen Induktors gelagert.
Die nachfolgende Tabelle enthält die gefundene Ausbeutesteigerung an Interferon bei Zugabe von c mMol Hexamethylenbisacetamid als Stimulator:

Konzentration I Dauer der Vorbehandlung IE/106Z Faktor

c mMol t Stunden

2 2 400 1

2,5 72 10 400 4

0 1 480 1

O 1 480 1

5 40 29 800 20

+ Internationale Einheiten Interferon pro 106 + Internationale Einheiten Interferon pro 10 Zellen.
Beispiel 3 Namalwazellen wurden als Suspensionskultur in 85 1 Wachstumsmedium bia zum Erreichen einer Zelldichte von 1 x 106 Zellen/ml kultiviert, Die Zellen befinden sich in der exponentiellen Wachstumsphase, welche sich durch optimale DNA-Syntheserate auszeichnet.
Stimulatorsubstanzen wurden in Form einer neutralen Lösung für einen Zeitraum von 48 Stunden bei 35.5 - 370C in folgender Mischung zum Wachstumsmedium zugegeben: Propionsäure 2,5 mMol> Cytosinarabinosid 0,1 pMol. Die Syntheserate war innerhalb der 48-stUndigen Behandlungszeit auf weniger als 5 % einer nicht mit dem Stimulatorsubstanzengemisch behandelten Kontrollkultur gesunken und der Großteil der Zellen in einer der G1-Phase des Zellzyklus entsprechenden Ruhephase angesammelt. Nach der Vorbehandlungszeit wurden die Zellen bei 700 x g in einem kontinuierlichen Durchflußzentrifugationsverfahren sedimentiert. Die derart gesammelten Zellen wurden bei einer Dichte von 4,5 x 107 Zellen/ml in 2 1 Wachstumsmedium suspendiert und 2 Stunden lang mit 210 Haemagglutinationseinheiten HVJ/ml in Rollkulturflaschen bei 370C inkubiert. Nach dieser Zeit wurden die Zellen gesammelt und bei einer Dichte von 1 x 106 Zellen/ml in 85 1 serumfreien Wachstumsmedium suspendiert und 36 Stunden bei pH 7.3 in Suspensionskultur bei 35,5 - 370C gehalten. Nach Abtrennen der Zellen bei 2000 x g in einem kontinuierlichen Durchflußzentrifugationsverfahren wurde der Zellüberstand angesammelt, mit 5N Salzsäure bei höchstens 100C ° auf pH 2 eingestellt und 3-5 Tage bei 4 C gelagert. Die so gewonnene Rohinterferonlösung zeichnet sich durch einen um einen Faktor 18 gegenüber einer nicht vorbehandelten Kontrollkultur aus (Kontrollkultur: 1230 IE Interferon) 106 Zellen; mit Propionsäure und Cytosinarabinosid behandelte Kultur: 22850 IE Interferon/106 Zellen).

Beispiel 4 Analog den vorstehenden Beispielen wurde bei einer Zelldichte von 5 x 105 Namalwazellen/ml und einer Vorbehandlungszeit von 48 Stunden mit folgenden Stimulatorsubstanzen eine Ausbeutesteigerung um den Faktor X gegenüber Kontrollkulturen erzielt:

Konzentration Stimulator Faktor (X)

1 mMol Propionsäure 3

mMol n-Buttersäure 22

1 mMol n-Valeriansäure 1 2

2,5 mMol Propionsäure 8

5 mMol Propionsäure 25

5 mMol n-Buttersäure 22

5 mMol n-Valeriansäure 14

20 mMol Nicotinamid 8

40 mMol Nicotinamid 10

0,3 uMol Cytosinarabinoxid 6

1,5 uMol Cytosinarabinoxid 10

50-250 mMol Dimethylsulfoxid 10

Das gemäß den Beispielen 1-4 hergestellte Interferon kann beispielsweise wie folgt abgetrennt und/oder gereinigt werden: a) Konzentration mit Zinkacetat 17,2 Liter Rohinterferon werden mit 2N Natronlauge neutralisiert, 1 m Zinkacetat bis zu einer Konzentration von 0,02 m unter Rühren zugegeben, und das pH mit Natronlauge auf 7,2 eingestellt. Das entstandene Präzipitat enthält das Interferon. Es wird 2 Stunden absitzen gelassen und der überstand so weit als möglich abgesaugt. Der Niederschlag wird sodann durch Zentrifugieren gewonnen und mit 640 ml eisgekühlter 0,1 M Salzsäure bis zur Lösung digeriert, wobei das pH auf 2,5 eingestellt wird. Die trübe Lösung wird in der Zentrifuge geklärt (bei 2000 g, 60 Minuten).

b) 1. Chromatographie am Ionenaustauscher Zu 653 ml der sauren Lösung des Interferons werden 25,8 g Ionenaustauscher SP-Sephadex C-25 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala) zugegeben und die Mischung über Nacht im Kühlraum gerührt, Das Interferon wird dabei vom Ionenaustauscher aufgenommen. Er wird sodann 3-mal mit jeweils 1 Liter 0,1 M Glycin/ Salzsäure-Puffer pH 2,5 und anschließend 3-mal mit jeweils 1 Liter 0,1 M Kalium-zitrat pH 4,0 (dem 0,005 M Dinatriumäthylendiamin-tetraacetat zugesetzt sind) dekantiert, bis keine Zinkionen mehr mit Dithizon im Waschwasser nachweisbar sind.
Der Ionenaustauscher wird sodann mit dem Zitratpuffer in eine Chromatographiesäule gefüllt und das Interferon mit 0,1 M Kalium-phosphat pH 8,0, welches 1 M Kaliumchlorid enthält, eluiert. Die proteinhaltigen Fraktionen werden gesammelt (210 ml), wobei als Indikator die Extinktion bei 280 nm (E280 nm) verwendet wird.
c) Konzentrierung mit Kalium-thiocyanat Die gesammelten Fraktionen (210 ml) werden mit Salzsäure bei 40C auf pH 3,5 eingestellt und die entstandene Trübung durch Zentrifugieren entfernt. Zu der Lösung werden hierauf 1/10 des Volumens an 10 M Kalium-thiocyanat zugesetzt. Der entstehende Niederschlag, der das Interferon enthält, wird 30 Minuten absitzen gelassen, durch Zentrifugieren gesammelt, und in 3 ml 0,1 M Kalium-phosphat pH 8 aufgenommen. Die Lösung wird durch Ultrazentrifugieren geklärt (bei 70 000 g, 80 Minuten).
d) Gelfiltration Eine Chromatographiesäule von 5 x 50 cm wird mit Sephadex G-100 (Teilchengröße 40-120 p, Firma Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala) gefüllt, welches mit Phosphat-gepufferter physiologischer Kochsalzlosung (PBS) unter Zusatz von 0,001 M Dinatriumsãthylendiamin -tetraacetat gequollen wurde. Die Chromatographie erfolgt im Kühlraum mit Phosphat gepufferter physiologischer Kochsalzlösung/tthylen-diamitetraacetat als Eluiermittel und 40 ml/ Stunde Flußgeschwindigkeit. Jede neugefüllte Säule wird vor Verwendung mit Proteinen von bekanntem Molgewicht geeicht. Das Interferon-Konzentrat (3,5 ml) wird unter denselben Bedingungen nach der Molekülgröße der Komponenten fraktioniert und die Fraktionen des Eluates, die einem Molekulargewicht von 10.000 -35.000 Daltons entsprechen, gesammelt (30,5 ml). In diesem Bereich ist die gesamte Interferon-Aktivität enthalten (Molgewicht etwa 22.000).
e) 2. Chromatographie am Ionenaustauscher Die gesammelten Fraktionen (50,5 ml) werden mit Salzsäure auf pH 3 eingestellt und über eine kleine (1 x 7 cm) Säule von SP-Sephadex C-25 gepumpt, welche mit 0,1 M Kalium-zitrat pH 3,0 vorgewaschen wurde. Das Interferon wird bei diesem pH von der Säule festgehalten. Nach kurzem Waschen mit dem Zitratpuffer wird das Interferon mit 0,1 M Kalium-phosphat pH 8 eluiert.
Die proteinhaltigen Fraktionen werden nach der E280 nm des Eluates gesammelt, gegen Phosphat-gepufferter physiologischer Kochsalzlösung dialysiert und bei -200C aufgehoben. Das Volumen des gereinigten Konzentrats beträgt 3,9 ml.

Claims

P a t e n t a n 5 p r il c h e 1. Verfahren zur Herstellung von Interferon, dadurch gekennzeichnet, daß, bevor bzw. bevor und während Zellen einer permanent kultivierbaren Zellinie lymphoblastoidem Ursprungs oder menschliche Fibroblastenzellen mit diploidem Chromosomensatz und beschränkter Lebensdauer oder mit heteroploidem Chromosomensatz und permanenter Teilbarkeit mit Interferoninduktoren inkubiert werden, diese Zellen mit geeigneten Stimulatoren hehandelt werden und gewUnschtenfalls das bei der Inkubation gebildete Interferon abgetrennt und/oder nach an sich bekannten Methoden gereinigt wird.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Stimulatoren solche Substanzen verwendet werden, deren Zusatz zum Zellkulturmedium bewirkt, daß Zellen, welche sich in logarithmischer Wachstumsphase befinden, bei optimalen Wachstumsbedingungen aus der Wachstumsphase in eine Ruhephase übergehen, welche dadurch definiert ist, daß die Zellen bezüglich ihres Desoxyribonukleinsäuregehalts postmitotischen (Gi-Phase) Zellen entsprechen und keine DNA-Synthese abläuft.
3. Verfahren gemAß den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Stimulator eine gesättigte oder ungesättigte aliphatische Carbonsäure und deren Salze, diacetylierte Diamine, insbesondere deren ,Lff-Derivate, heteroaromatische CarbonsMureamide, Antimetaboliten oder organische Schwefelverbindungen sowie deren Gemische verwendet werden.
erfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Stimulator eine Alkansäure oder Alkansäure mit 3-5 Kohlenstoffatomen oder deren Salze, N,N'-diacetylierte Diamine mit 4-8 Kohlenstoffatomen, Pyridincarbonsäureamide, Cytosinarahinosid und Dimethylsulfoxid sowie deren Gemische verwendet werden.
5. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Stimulator Propionsäure, n-Buttersäure, Isobuttersäure, n-Valeriansäure, Acrylsäure, Crotonsäure, Angelicasäure oder Tiglinsäure und deren Salze mit anorganischen oder organischen Basen, Pentamethylenbisacetamid, Hexamethylenbisacetamid oder Heptamethylenbisacetamid, Nicotinamid, Dimethylsulfoxid und 9-ß-D-arabinofuranosylcytosin sowie deren Gemische verwendet werden.
6. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1-6, dadurch gekennzeichnet, daß die Endkonzentration des Stimulators 0,1 pMol - 250 mMol beträgt.
7. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1-6, dadurch gekennzeichnet, daß der Stimulator zu den Zellen für einen Zeitraum von 6-72 Stunden, vorzugsweise jedoch 24 - 48 Stunden, vor der Zugabe der Interferoninduktoren zugegeben wird.
8. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Interferoninduktor ein viraler Induktor oder ein Nukleinsäureinduktor verwendet wird.
9, Humaninterferon hergestellt gemäß den Ansprüchen 1-8.
10. Verwendung des gemäß den Ansprüchen 1-8 hergestellten Interferons zur Bekämpfung von Virusinfektionen.
11. Verwendung des gemäß den Ansprüchen 1-8 hergestellten Interferons zur Krebstherapie.
12. Verwendung einer Alkansäure oder Alkensäure mit 3-5 Kohlenstoffatomen oder deren Salze, eines bisacetylierten,(AT-Diamins mit 4-8 Kohlenstoffatomen, eines Pyridincarbonsäureamids, von Cytosinarabinosid und Dimethylsulfoxid sowie deren Gemische zur Ausbeutesteigerung bei der Interferonherstellung.