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Beschreibung:
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Die Herstellung von Humaninterferon hat aufgrund seines medizinischen
Tnteresses, insbesondere bei der Behandlung von Virus-Infektionen und als Antitumor-Mittel,
großes Interesse gefunden.
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Die bisher bekannten Verfahren zu seiner Herstellung und Reinigung
sind jedoch alle unbefriedigend, da sie menschliche Leukozyten benötigen, die nicht
unbegrenzt zur Verfugung stehen oder menschliche Zellen, deren Kultivierung im größeren
Maßstab Schwierigkeiten bereitet.
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Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein einfaches Verfahren
zur Herstellung von Humaninterferon und dessen Reinigung, welches dadurch gekennzeichnet
ist, daß durch Paramyxo-Viren infizierte Namalva-Zellen in einem serumfreien Medium
inkubiert werden und das so gewonnene Rohinterferon aus der Lösung durch Fällen
mit einem Zinksalz, Behandlung der gelösten salzsauren Fällung mit einem Ionenaustauscher,
Eluationedes aufgezogenen Interferons, erneutes Fällen mit einem Alkalithiocyanat,
Behandlung der gelösten Fällung mit einem Molekularsieb und Korn~ zentrieren mittels
eines Ionenaustauschers und mittels Dialyse der Eluate erhalten wird.
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Erfindungsgemäß wird also zur Herstellung des Rohinterferons eine
permanente humane lymphoblastoide Zellart, nämlich sogn. "Namalva-Zellen", welche
erstmals von a. Klein (siehe Inter. J. Caner 10, 44-57 (1972)) gewonnen und beschrieben
wurden, verwendet. Diese Zellen lassen sich in einem Wachstumsmedium, vorzugsweise
dem Medium RPMI 1640 (Firma Gibco, USA, oder Flow, Großbritannien), das mit 15-25
Vol S, vorzugsweise jedoch 20 Vol S, Tryptose-Phosphat-Brot, und 1-5 Vol %, vorzugsweise
jedoch 2 Vol %, vorgereinigtem Humanserum angereichert ist, vermehren. Die vorzugsweise
durch Zentrifugieren gewonnenen Namalva-Zellen werden in dem Wachstumsmedium zweckmäßigerweise
bei einer Dichte von 50 x 106 Zellen/ml suspendiert. Diese Suspension wird mit Paramyxo-Viren,
z.B. mit
Sendai- oder Newcastle Disease-Viren, infiziert und anschließend
inkubiert. Nach 1 bis 3 Stunden werden die infizierten Zellen durch Zentrifugieren
gesammelt und bei einer Dichte von 5 - 10 x 106 Zellen/ml in einem serumfreien Medium,
z.B. in serumfreien Eagle's Minimum Essential Medium (Firma Gibco, USA, oder Flow,
Großbritannien), 15-24 Stunden, vorzugsweise 20 Stunden, bei 35,5°C und pH 7,2 -
7,4, vorzugsweise pH 7,3, inkubiert. Nach dieser Zeit werden die Zellen zweckmäßigerweise
mittels Zentrifugation abgetrennt, die erhaltene Lösung des Rohinterferons wird
unter KUhlung mit einer Mineralsäure, z.B. Salzsäure, angesäuert, vorzugsweise auf
pH 2,0 eingestellt, und zur Inaktivierung der verwendeten Paramyxo-Viren mehrere
Tage, z.B. 3 bis 5 Tage, im KUhlraum stehen gelassen.
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Die so gewonnene Lösung des Rohinterferons wird folgenden Reinigungsschritten
unterzogen: a) Die erhaltene Lösung wird beispielsweise mit Natronlauge neutralisiert
und das Interferon mit einem Zinksalz, z.B. Zinkacetat, gefällt und mittels Zentrifugation
abgetrennt. Das erhaltene Präzipitat wird in kalter verdUnnter Salzsäure, z.F.
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0,1 N Salzsäure, in Lösung gebracht.
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b) Nach Klärung der salzsauren Lösung mittels erneuter Zentrifugation
wird diese mit einem Ionenaustauscher, vorzugsweise 1,5 g Ionenaustauscher SP-Sephadex
C-25 der Firma Pharmacia Fine Chemicals (Uppsala) Je Liter Rohlösung, versetzt und
mehrere Stunden gerührt. Nachdem das Interferon vom Ionenaustauscher aufgenommen
wurde, wird dieser mehrmals zur vollständigen Entfernung der Zinkionen mit einem
Puffer gewaschen, z.B. 3-mal mit 0,1 m Glycin/SalzsMure-Purrer pH 2,5 und dreimal
mit 0,1 m Kaliumzitrat pH 4,0, dem 0,005 m Dinatium-Sthylendiamin-tetraacetat zugesetzt
war. Anschließend wird der lonenaustauscher mit dem Zitratpuffer in eine Chromatographiesäule
gerillt und das Interferon mit einem schwach basischen Puffer, z.B. mit 0,1 m Kalium-phosphat
pH 8, dem 1 m Kaliumchlorid zugesetzt war, eluiert.
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c) Die gesammelten proteinhaltigen Eluate werden mit Salzsäure bei
niederen Temperaturen zweckmäßigerweise auf pH 3,5 eingestellt und nach Entfernung
der entstandenen TrUbung mittels Zentrifugation wird zur Fällung des Interferons
eine Lösung von KRliumthlocyanat zugesetzt. Der gebildete Niederschlag wird absitzen
gelassen, durch Zentrifugieren gesammelt und in einem möglichst kleinen Volumen
eines schwach basischen Puffers, z.B.
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0,1 m Kaliumphosphat pH 8, aufgenommen und die Lösung ultrazentrifugiert.
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d) Die so gewonnene Lösung wird Uber eine Chromtographiesäule weiter
gereinigt. Hierzu wird zweckmäßigerweise ein Molekularsieb wie Sephadex Q-100 der
Firma Pharmacia Fine Chemicals (Uppsala) mit der Teilchengröße 40-120 p und als
Eluens Phosphat-gepufferte physiologische Kochsalzlösung, der 0,001 m Dinatriumrãthylendiamintetraacetat
zugegeben ist, verwendet.
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Hierbei ist es zweckmäßig, vor Verwendung der Säule diese mit Proteinen
von bekanntem Molgewicht zu eichen. Es werden die Fraktionen des Eluates gesammelt,
die einem Moletulargewicht von 10.000 - 35.000 Daltons entsprechen.
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e) Die gesammelten Fraktionen werden mittels Salzsäure vorzugsweise
auf pH 3 eingestellt und über eine kleine Säule, gefüllt mit einem Ionenaustauscher
wie SP-Sephadex C-25 (siehe Punkt geleitet, welche zweckmäßigerweise mit 0,1 m Kaliumzitrat
pH 3,0 vorgewaschen wird. Bei diesem pH wird das Interferon von der Säule festgehalten
und anschließend nach kurzem Waschen mit dem Zitrat-Puffer mit einem Phosphat-Puffer,
z.B. 0,1 m Kaliumphosphat pH 8, eluiert. Die proteinhaltigen Fraktionen werden gesammelt
und gegen Phosphat-gepufferte physiologische Kochsalzlösung dialysiert.
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Das so gewonnene Präparat weist eine spezifische Aktivität von Uber
106 Interferon-Einheiten Je mg Protein auf.
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Von den literaturbekannten Verfahren zur Herstellung von Interferon
unterscheidet sich das erfindungsgemäße Verfahren durch folgende Punkte: 1. Die
Verwendung von Humanserum anstelle von fötalem Kalbserum bei der Kultur der Namalva-Zellen.
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2. Das vor der Infektion mit Paramyxo-Viren meist durchgeführte "Primingw
der Namalva-Zellen mit Interferon entfällt.
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3. Die verwendeten Paramyxo-Viren werden vorgereinigt und der von
den Namalva-Zellen nicht aufgenommene Anteil entfernt.
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4. Die Herstellung des Interferons erfolgt in einem serum-freien Medium,
was eine sehr hohe spezifische Aktivität des Rohinterferons ergibt.
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5. Zwischen den einzelnen Reinigungsschritten a-e ist keine Dialyse
erforderlich, das Verfahren kann daher rasch durch fUhrt werden und die Verluste
bei der Reinigung des Rohinterferons bleiben klein.
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6. Der letzte Konzentrierungsschritt ist neu.
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7. Das erfindungsemäße Verfahren läßt sich leicht in grflßerem Maßstab
durchCUhr.n.
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Die nachfolgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern:
Vorbemerkung: Die "Namalv8-Zellen" werden in Suspensionskultur in einem Fermentor
vermehrt. Hierbei wird als Wachstumsmedium das Medium RPMI 1640, dem 20 Vol S Tryptose-Phosphat-Broth
und 2 Vol % vorgereinigtes Humanserum beigegeben ist, verwendet. Das vorgereinigte
Humanserum wird durch Fällung eines Teiles der Serumproteine mit 6 S Polyäthylenglykol
6000 hergestellt (siehe Inglot et al.
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in Acta Virol 19, 250-254 (1975)). Die erreichten Zelldichten liegen
bei 2-7 x 106 Zellen/ml.
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Das "Sendai-Virus" wird in embryonierten HUhnereiern vermehrt, die
Reinigung erfolgt mittels einer High-Speed Zentrifuge und die Suspension im Wachstumsmedium
mittels Ultraschall Behandlung.
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Das "Sendai-Virus" wird bei -70°C aufbewahrt.
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Herstellung des rohen Interferons: 90 x 109 Namalva-Zellen aus 23
Litern Zellsuspension à 6 3,92 x 10 Zellen/ml, die durch Zentrirugieren (bei 700
g, 15 Minuten) gewonnen wurden, werden in 1,8 Litern Wachstumsmedium bei einer Dichte
von 50 x 106 Zellen/ml suspendiert. Hierzu wird das Sendai-Virus bis zu einer Konzentration
von mindestens 500 Hämagglutinations-Einheiten/ml, in diesem Falle 2000 Hämagglutinations-Einheiten/ml,
zugegeben und das Gemisch 2 Stunden in Rollerflaschen bei 37°C inkubiert. Die auf
diese Weise infizierten Zellen werden durch Zentrifugation gesammelt und bei einer
,Dichte von 5,3 x 106 Zellen/ml in 17 Litern serumfreiem Eagle's Minimum Essential
Medium (mit Earle-Salzen) bei 35,50C 20 Stunden lang bei pH 7,3 inkubiert. Hierzu
werden 20 Liter RUhrkolben eingesetzt. Die Rohld8ung (= Zellüberstand) wird nach
Abzentrifugieren der Zellen (bei 2000 g, 30 Minuten) bei einer Temperatur
von
max. 10°C mit 5 N Salzsäure auf pH 2,0 eingestellt und 3-5 Tage bei 4 0C zur Inaktivierung
des verwendeten Sendai-Virus aufgehoben.
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Konzentration und Reinigung des rohen Interferons: a) Konzentration
mit Zinkacetat 17,2 Liter Rohinterferon werden mit 2 N Natronlauge neutralisiert,
1 m Zinkacetat bis zu einer Konzentration von 0,02 m unter Rtlhren zugegeben, und
das pH mit Natronlauge auf 7,2 ein gestellt. Das entstandene Präzipitat enthält
das Interferon.
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Es wird 2 Stunden absitzen gelassen und der Überstand so weit als
möglich abgesaugt. Der Niederschlag wird sodann durch Zentrifugieren gewonnen und
mit 640 ml eisgekflhlter 0,1 N Salzsiure bis zur Lösung digeriert, wobei das pH
aut 2,5 eingestellt wird. Die trtlbe Lösung wird in der Zentrifuge geklärt (bei
2000 g, 60 Minuten).
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b) 1. ChromatograPhie am lonenaustauscher Zu 635 ml der sauren Lösung
des Interferons werden 25,8 g Ionenaustauscher SP-Sephadex C-25 (Pharmacia Fine
Chemicals, Uppsala) zugegeben und die Mischung ueber Nacht im KUhlraum gerührt.
DU Interferon wird dabei vom Ionenaustauscher aufgenonen. Er wird sodann 3-mal mit
jeweils 1 Liter 0,1 m Glycins Salzsäure-Puffer pH 2,5 und anschließend 3-mal mit
jeweils 1 Liter 0,1 1 Kaliui-sitrat pH 4,0 (dem 0,005 m Dinatriumãthylendiamin-tetraacetat
zugesetzt sind) dekantiert, bis keine Zinkionen mehr mit Dithizon im Waschwasser
nachweisbar sind.
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Der Ionenaustauscher wird sodann mit dem Zitratpuffer in eine Chromatographiesãule
gefUllt und das Interferon mit 0,1 m Kalium-phosphat pH 8,0, welches 1 m Kaliumchlorid
enthält, eluiert. Die proteinhältigen Fraktionen werden gesammelt (210 ml), wobei
als Indikator die Extinktion bei 280 nm (E280 nm) verwendet wird.
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c) Konzentrierung mit Kalium-thiocyanat Die gesammelten Fraktionen
(210 ml) werden mit Salzsäure bei 40C auf pH 3,5 eingestellt und die entstandene
Trtlbung durch Zentrifugieren entfernt. Zu der Lösung werden hicrauf 1/10 des Volumens
an 10 m Kalium-thiocyanat zugesetzt. Der entstehende Niederschlag, der das Interferon
enthält, wird 30 Minuten absitzen gelassen, durch Zentrifugieren gesammelt, und
in 3 ml 0,1 m Kalium-phosphat pH 8 aufgenommen. Die Lösung wird durch Ultrazentrifugieren
geklärt (bei 70 000 g, 80 Minuten).
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d) Gelfiltration Eine Chromatographiesäule von 5 x 50 cm wird mit
Sephadex G-100 (Teilchengröße 40-120 u, Firma Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala)
gefällt, welches mit Phosphat-gepufferter physiologischer Kochsalzlösung (PBS) unter
Zusatz von 0,001 m Dinatrium-äthylendiamin-tetraacetat gequollen wurde. Die Chromatographie
erfolgt im RUhlraum mit Phosphat gepufferter physitologischer Xochsalzlösung/Xthylen-diamitetraacetat
als Eluiermittel und 40 ml/ Stunde Flußgeschwindigkeit. Jede neugefUllte Säule wird
vor Verwendung mit Proteinen von bekanntem Molgewicht geeicht. Das Interferon-Konzentrat
(3,5 ml) wird unter denselben Bedingungen nach der Molekfllgröße der Komponenten
fraktioniert und die Fraktionen des Eluates, die einem Molekulargewicht von 10.000
-35.000 Daltons entsprechen, gesammelt (30,5 ml). In diesem Bereich ist die gesamte
Interferon-Aktivität enthalten (Molgewicht etwa 22.000).
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e) 2. Chromatographie am Ionenaustauscher Die gesammelten Fraktionen
(30,5 ml) werden mit Salzsäure auf pH 3 eingestellt und Uber eine kleine (1 x 7
cm) Säule von SP-Sephadex C-25 gepumpt, welche mit 0,1 m Kalium-zitrat pH 3,0 vorgewaschen
wurde. Das Interferon wird bei diesem pH von der
Säule festgehalten.
Nach kurzem Waschen mit dem Zitratpuffer wird das Interferon mit 0,1 m Kalium-phosphat
pH 8 eluiert.
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Die proteinhaltigen Fraktionen werden nach der E280 nm des Eluates
gesammelt, gegen Phosphat-gepufferter physiologischer Kochsalzlösung dialysiert
und bei -20°C aufgehoben. Dao Volumcn des gereinigten Konzentrats betrug 3,9 ml.
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Die nachfolgende Tabelle gibt die Resultate der Reinigungs- und Konzentrations-Prozedur
wieder:
Reinigung Einheiten spezifische volumen |
Aktivität ml |
Einh./ml total(%) Einh./mg Proteir |
Rohlösung pH=2 3.200 55 x 106 (100) 59.000 17.200 |
Schritt a + b: 239.000 50 x 106 (91) 368,000 210 |
Schritt c: 11 x 106 38 x 106 (69) 639.000 3,5 |
Schritt d: 690.000 21 x 106 (38) 2,2 x 106 3Q,5 |
Schritt e: 3,9 x 106 15 x 106 (27) 3,4 x 106 3,9 |