DE3325131C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein neuartiges Interferon-Präparat, das als Interferon-ε bzw. IFN-E bezeichnet ist und sich beispielsweise in der Humanmedizin sowie bei Zellkulturen menschlicher Epithelzellen als antiviral wirksames Mittel vorteilhaft anwenden läßt, ferner ein Verfahren zur Herstellung dieses Interferon-Präparats und eine pharmazeutische Zusammensetzung, die dieses Interferon-ε als Wirkstoff enthält, diese Zusammensetzung wird insbesondere zur Behandlung menschlicher Epithelzellen zur Abwehr von Virusinfektionen eingesetzt (vgl. in diesem Zusammenhang die Ansprüche 1, 2 und 6).

Inerferone sind Stoffe mit antiviralen Eigenschaften. Sie werden durch bestimmte Typen von Zellen erzeugt, die durch Exposition gegenüber einem Virus, bestimmten Nucleinsäuren oder Antigen/Mitogen-Komplexen stimuliert wurden. Interferone stellen dabei extrem wirksame Arzneimittel dar, die als klinische antivirale und Antitumor-Mittel als außerordentlich erfolgversprechend angesehen werden.

Gegenwärtig sind drei Typen menschlicher Interferone bekannt: Das Interferon-a (IFN-α), das von menschlichen Leukocyten oder Lymphoblastoidzellen erzeugt wird, das Interferon-β (IFN-β), das von Fibroblasten erzeugt wird, sowie das Interferon-q (IFN-γ), das von menschlichen T-Lymphocyten erzeugt wird. Alle drei oben genannten Interferone werden durch die betreffenden Zellen ausgeschieden, nachdem diese durch ein Virus oder analoge Stimulation stimuliert wurden.

Eine herkömmliche antivirale Einheit Interferon entspricht derjenigen Konzentration, die 50% der Zellen in einer Kultur menschlicher Fibroblasten vor einem Befall mit VSV (Vesicular Stomatitis-Virus) bei einer Standardkonzentration (1 PFU/Zelle) schützt.

Antivirale Wirksamkeit wurde auch in anderen Zellen menschlichen und tierischen Ursprungs festgestellt. Eine Beeinträchtigung der Vermehrung von Influenza-Virus wurde zuerst von Issacs und Lindenmann 1957 in Kulturen von Chorioallantoidalmembranen von Hühnern festgestellt. Ein weiteres Beispiel ist die Hela-Zellinie, bei der transformierte Krebszellen epithelialen bzw. cervicalen Ursprungs vorliegen (vgl. G. Gey et al., Cancer Research, 12 (1952) 264-265). Ferner können verschiedene transformierte oder neoplastische Zellinien, die sich ursprünglich von menschlichem Epithelialgewebe ableiteten (vgl. Production of Interferon by Human Tumor Cell Lines, Jameson et al., Archives of Virology 62 (1979) 209-219), verwendet werden. Bei herkömmlichen Humaninterferon-Präparaten wurde festgestellt, daß sie gegenüber Humanzellkulturen antivirale Wirksamkeit besitzen.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein neuartiges, antiviral wirksames Interferon-Präparat und Verfahren zu seiner Herstellung anzugeben, das sich beispielsweise zum Schutz von menschlichen Zellen gegenüber Virusinfektionen eignet, ferner seine pharmazeutische Anwendung in entsprechenden pharmazeutischen Mitteln.

Das Interferon-Präparat soll dabei auf einem Interferon beruhen, das normalem, gesundem menschlichem Epithelialgewebe eigen ist, wobei das Interferon-Präparat gegenüber menschlichen Epithelialzellen wirksamer sein soll als gegenüber anderen Arten menschlicher Zellen, beispielsweise menschlichen Fibroblastzellen. Mit dem Interferon-Präparat soll ferner eine Behandlung von Virusinfektionen oder Tumorwachstum in bestimmten Geweben durch Inkontaktbringen mit einem aus dem gleichen Gewebetyp abgeleiteten Interferon möglich sein.

Die Aufgabe wird gemäß den Ansprüchen 1, 2 und 6 gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen des Verfahrens nach Anspruch 2 sind Gegenstand der Unteransprüche 3 bis 5.

Das erfindungsgemäße Interferon-Präparat, das als Interferon-ε bezeichnet wird, scheint wie die anderen Interferone aus mindestens zwei funktionell miteinander in Beziehung stehenden Proteinen zu bestehen.

IFN-ε wird also durch Glimulation primärer diploider Epithelzellen menschlichen Ursprungs erzeugt. Unter primären, diploiden menschlichen Epithelzellen bzw. Zellkulturen wird hierbei Zellmaterial verstanden, das aus gesundem menschlichem Gewebe oder aus Kulturen solcher Zellen entnommen ist, beispielsweise nach dem Verfahren der US-PS 40 16 036, auf das hiermit Bezug genommen wird. Diese Arten von Zellkulturen sind von nicht-humanen Zellen, Humanzellen anderen als epithelialen Ursprungs sowie transformierten oder neoplastischen Epithelzellen zu unterscheiden.

Nach einem erfindungsgemäß bevorzugten Induktionsverfahren wird Newcastle Disease-Virus (insbesondere der Bankowski-Stamm) doer Sendai-Virus verwendet, wobei 100 bis 500 Epithelzellen zur Produktion einer Einheit IFN-e erforderlich sind.

Das erfindungsgemäße Interferon-Präparat kann selbstverständlich auch in natürlich oder künstlich transformierten eukaryotischen Zellen produziert werden, die den Teil der menschlichen Epithelialnucleinsäure enthalten, der für die Produktion von IFN-ε verantwortlich ist, ferner auch in Zellen, die durch DNA-Rekombinationsverfahren modifiziert wurden.

Im Rahmen der Erfindung wurde ferner festgestellt, daß das erfindungsgemäß produzierte Interferon eine größere antivirale Wirksamkeit gegenüber diesem speziellen Zelltyp aufweist als gegenüber anderen Arten von Humanzellen. Das erfindungsgemäße Interferon-ε besitzt dementsprechend höhere antivirale und Antitumorwirksamkeit bei der Behandlung von mit einem Tumor oder einer Virusinfektion befallenem Epithelgewebe im Vergleich zur Wirksamkeit gegenüber anderen Arten von Humanzellen.

Zur Produktion von IFN-ε können normale menschliche Epithelzellen in vitro (beispielsweise gemäß dem Verfahren von Green et al.) kultiviert werden. Die Zellen werden dann einem IFN-Induktionsschritt unterworfen, in dem sie bestimmten Viren oder Nucleinsäuren ausgesetzt werden. So kann beispielsweise das Wachstumsmedium durch ein Medium ersetzt werden, das einen bekannten IFN-Inducer vom Virus- oder Nucleinsäuretyp enthält. Nach kurzer Inkubation, typischerweise in der Größenordnung von einer Stunde, wird der Inducer wieder abgetrennt, und die Zellen werden in normales, frisches Wachstums- oder Aufbewahrungsmedium verbracht und beispielsweise 24 h inkubiert. Durch die Exposition der Zellen gegenüber dem Inducer wird die Expression des genetischen Codes der Zellen zur Produktion von Interferon-ε ausgelöst. Während der anschließenden Inkubation synthetisieren die Zellen IFN-e und scheiden es aus. An diesem Punkt wird das Medium gewonnen; im Test, der beispielsweise nach dem Verfahren von Ho und Enders (Proceedings of the National Academy of Science, 45 (1959) 385-389) durchgeführt wird, wird festgestellt, daß es IFN-ε mit antiviraler Wirksamkeit enthält.

Das aus diesem Verfahren resultierende Produkt zeigt keine signifikante Kreuzreaktivität gegenüber Antikörpern gegen IFN-α, IFN-β oder IFN-γ in Neutralisationsversuchen. Es ist ferner bei pH 2 stabil und besitzt Proteincharakter. Aus Immunabsorptionsversuchen geht hervor, daß Anti-IFN-β-Antiseren mit einem Teil des erfindungsgemäß hergestellten Interferon-Produkts der induzierten Epithelzellen reagiert. Das erfindungsgemäße Interferon weist ferner ein Wirksamkeitprofil bei Säugerzellen auf, das von bekannten Interferontypen verschieden ist. Aufgrund dieser chemischen Eigenschaften stellt IFN-ε eine neuartige Substanz mit einzigartigen Eigenschaften dar.

IFN-ε kann aus normalen Epithelzellen gewonnen werden, die von der menschlichen Epidermis, Conjunctiva, Vagina und Oesophagus abgeleitet sind, wobei 'normale Induktion' (vgl. Field et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, 58 (1967) 1004-1009) und 'Superinduktion' (vgl. Havell und Vilcek, Antimicrobial Agents in Chemotherapy, Vol. 2 (1972) 476-484) mit Nucleinsäure, Poly-I · C, Newcastle Disease Virus (Baron und Issacs, British Medical Journal, 56 (1962) 18-20) und Sendai-Virus (Parainfluenza-1, vgl. Gresser Proceedings of the Society of Experimental and Biological Medicine, Vol. 108 (1961) 303-307) durchgeführt wurden.

Die Versuchsergebnisse zeigen, daß jedes der Induktionsverfahren und jeder der verschiedenen Typen der getesteten Zellkulturen zur Produktion von IFN-ε führen, sofern die Zellen zumindest einen Teil des DNA-Codes menschlicher Epithelzellen enthalten.

Das Produktionsniveau hängt von der Art des angewandten Inducers und den verschiedenen Modifizierungen der angewandten Induktionsverfahren ab. Im Rahmen der Erfindung wurde festgestellt, daß mit Newcastle Disease-Virus gute Ergebnisse erzielbar sind. Es können jedoch auch andere Viren erfolgreich herangezogen werden, wie aus der nachstehenden Tabelle 1 hervorgeht.

Tabelle I

IFN-ε ist am wirksamsten, wenn es zur Behandlung von Epithelzellen verwendet wird, und besitzt eine niedrigere Wirksamkeit bei der Behandlung anderer menschlicher Zellarten.

Demgemäß kann zum Schutz eines gegebenen Zelltyps oder Gewebetyps vor Virusinfektionen, zum Stoppen der Vermehrung eines Virus, der einen gegebenen Zelltyp oder Gewebetyp befallen hat, oder zur Unterdrückung des Wachstums eines Tumors in einem gegebenen Gewebe folgende Verfahrensweise angewandt werden:
Zunächst wird eine Kultur von Zellen des betreffenden Typs nach üblichen Verfahren wie etwa (im Fall von Epithelzellen) dem oben erwähnten Green-Verfahren wachsen gelassen. In den Zellen der Kultur wird dann die Exprimierung des Gens, das für die Produktion von Interferon-ε verantwortlich ist, durch geeignete Behandlung induziert. Dies kann beispielsweise durch IFN-Induktionsverfahren erfolgen. Das Produkt wird dann gewonnen, typischerweise aus dem Medium nach Inkubation. Das Produkt kann als wirksamer antiviraler oder Antitumorwirkstoff zur Behandlung von Zellen oder Gewebe des betreffenden Typs verwendet werden. In vitro werden Kulturen durch Zusatz von 2 bis 5 Einheiten Interferon-ε/ml gegen Virusbefall geschützt. Diese Konzentration ist zum Schutz von Epithelzellen einer Zelldichte von 0,5 · 10⁵ bis 2,5 · 10⁵ Zellen/cm² wirksam.

Signifikante Mengen des erfindungsgemäßen Interferon-Präparats können ferner auch durch zwei an sich bekannte zelluläre Verfahren erzeugt werden. Beim ersten Verfahren werden chemisch, durch Viren oder spontan transformierte Epithelzellen verwendet. Beim zweiten Verfahren werden übliche DNA-Rekombinationstechniken angewandt, wie sie üblicherweise zur Herstellung von IFN-α und IFN-β Verwendung finden.

Beim ersten Verfahren können zur Produktion von IFN-ε befähigte transformierte Zellen durch Anwendung eines von zwei Verfahren erhalten werden: In vivo oder in vitro. Das erste Verfahren, das in vivo vorgenommen wird, umfaßt die direkte Isolierung aus frischem Gewebe transformierter Epithelzellen; das zweite, in vitro vorgenommene Verfahren umfaßt eine Selektion, bei der ein Stamm normaler menschlicher diploider Epithelzellen entweder einer Langzeitkultivierung unterzogen wird, bis eine kleine, aber erkennbare Anzahl der Zellen der Population einer spontanen Transformation unterliegt, oder der ursprüngliche Stamm eine kurze Zeit mit einem Virus oder einem bekannten Mutagen wie EMS, MMS oder MNNG behandelt wird, um die Transformationshäufigkeit zu erhöhen. Einige der nach einer der beiden in vitro Verfahrensweisen transformierten Zellen enthalten transskriptionsmäßig kompetente Gene, deren Codierung für die Produktion von IFN-ε verantwortlich ist.

Bei den so transformierten Kulturen kann durch Anwendung üblicher Induktionsverfahren, wie sie bereits für normale menschliche diploide Epithelzellen beschrieben sind, die Produktion von IFN-ε induziert werden.

Beim zweiten Verfahren wird die aufgrund der IFN-Induktion in den Epithelzellen synthetisierte Messenger-RNA (mRNA) aus den Zellen extrahiert und ggf. durch Ultrazentrifugieren oder dgl. gereinigt, um eine mRNA-Fraktion höherer Spezifität zu erhalten, und der Extrakt als Nährboden für die Synthese der komplementären DNA (cDNA) verwendet. Die cDNA kann unter Verwendung des Enzyms Myoblastose-Reverstranscriptase aus Vögeln erzeugt werden. Das resultierende Endprodukt dieses Verfahrens, die doppelsträngige komplementäre DNA (dscDNA), die die Sequenz enthält, welche die Synthese von IFN-ε codiert, und ein bakterieller oder eukaryotischer Vektor werden anschließend mit einem Restriktionsenzym behandelt, das die DNA spaltet und Bindungsstellen erzeugt, durch die die dscDNA und der Vektor gebunden werden können. Der Vektor und die DNA werden dann zusammengemischt, vereinigt und mit einer Ligase kovalent gebunden. An diesem Punkt des Verfahrens wird die Rekombinantvektor-Präparation zur Transformation einer bakteriellen oder eukaryotischen Zelle verwendet. Die transformierten Zellen enthalten so die DNA, die zu der gesamten RNA oder einem Teil davon komplementär ist, die ursprünglich in den Epithelzellen während ihrer IFN-ε-Produktionsstufe enthalten war.

Diese Rekombinantvektoren werden dann mit einem geeigneten Zelltyp inkubiert, bei dem der Vektor wirksam werden kann. Dies führt zu einer Zellpopulation, die einzelne Zellen enthält, die zur Synthese und Sekretion von IFN-ε in der Lage sind. Die Zellpopulation wird dann einem Screening-Schritt zur Erfassung einer Subpopulation von Zellen unterzogen, die IFN-ε erzeugen; diese Subpopulation wird dann zur Erzielung einer Zellinie kultiviert, die zur Produktion relativ hoher Mengen IFN-ε befähigt ist.

Weitere Einzelheiten des DNA-Rekombinationsverfahrens können beispielsweise den nachstehenden Druckschriften entnommen werden, auf die hier Bezug genommen wird:

• 1. US-PS 42 37 224 - Verfahren zur Herstellung biologisch funktioneller molekularer Chimären;
• 2. Scheller, R. et al., Clones of Individual Repetitive Sequences from Sea Urchins DNA Constructed with Synthetic Eco R₁ Sites, Science, 196 (1977) 197-200;
• 3. Blattner, F. et al., Charon Phages: Safer Derivatives of Bacteriophage Lambda for DNA Cloning, Science, 196 (1977) 161-169;
• 4. Broach, J. R., und Hicks, J. B., Replication and Recombination Functions Associated with Yeast Plasmid, 2 Micron Circle, Cell, 21 (1980) 501-508; und
• 5. Hamer, D., Synthesis, Processing and Secretion of Eukaryotic Proteins in the SV 40 - Monkey Cell System, Recombinant DNA Abstracts, 1 (1981) 4.

Die Erfindung wird im folgenden anhand von Beispielen näher erläutert, deren Angaben nicht einschränkend sind.

Beispiel 1

Eine Epithelzellenkultur von Epidermiszellen wurde in einem MEM-Medium zu einer Zelldichte von 1 bis 2 · 10⁵ Zellen pro cm² kultiviert und zur Produktion von IFN-ε nach dem Induktionsverfahren mit Newcastle Disease-Virus (NDV) (vgl. oben Baron und Issacs) herangezogen. Als Virus wurde der Bankowski-Stamm von NDV verwendet. Vier 1-ml-Proben von MEM-Medium mit 2% HIFCS und ausreichend NDV für eine Endkonzentration von 0, 100 bis 200, 25 bis 50 und 1 bis 16 Virus-PFU/Zelle in den Testproben wurden hergestellt. 0,2 ml der jeweiligen 1-ml-Viruspräparationen (Virus-Inducer) wurden dann zu den Zellkulturen zugesetzt, die in 5-min-Intervallen 30 min bei 37°C geschüttelt wurden. Die restlichen 0,8-ml-Mengen der NDV-Präparationen wurden dann zugesetzt, worauf die Kulturen nochmals 30 min inkubiert wurden. Anschließend wurden die Zellkulturen zweimal mit normalem Medium gewaschen, worauf 1 ml frisches Medium zu jeder Kultur zugesetzt wurde, wonach die Kulturen 24 h inkubiert wurden.

Danach wurde das Medium gewonnen, mit 0,1 N HCl auf pH 2 angesäuert und 5 bis 6 d bei 4°C gelagert, um das NDV zu inaktivieren. Danach wurde das gewonnene Medium mit 0,1 N NaOH neutralisiert und auf IFN-ε geprüft. Bei der kein NDV enthaltenden Probe (Kontrollprobe) war keine antivirale Wirksamkeit feststellbar. Die mit 100 bis 200 NDV-Viruspartikeln/Zelle induzierte Probe enthielt etwa 500 bis 1000 IFN-ε/ml. Die mit der 25 bis 50 Viruspartikel/Zelle enthaltenden NDV-Präparation induzierte Kultur enthielt zwischen 170 und 330 Einheiten IFN-e/ml. Die mit der 1 bis 16 Viruspartikel/Zelle enthaltenden NDV-Präparation induzierte Kultur enthielt schließlich 50 bis 170 Einheiten IFN-ε/ml.

Aus diesen Versuchen geht hervor, daß eine Zellkultur mit 1 bis 2 · 10⁵ Zellen/ml etwa 500 bis 1000 Einheiten IFN-ε/ml produzieren kann. Diese Ausbeute entspricht größenordnungsmäßig etwa 1 Einheit IFN-ε, die von 100 bis 500 Zellen in der Kultur produziert wird.

Beispiel 2

Das Beispiel bezieht sich auf die Ermittlung der Stabilität von IFN-ε bei sauren pH-Werten.

IFN-ε wurde durch Induktion menschlicher Epidermiszellen mit NDV gemäß Beispiel 1 hergestellt. Das gewonnene Medium wurde in drei Teilmengen aufgeteilt. Das Virus wurde in der ersten Teilmenge wie in Beispiel 1 inaktiviert, indem mit HCl auf pH 2 angesäuert wurde. Die zweite Teilmenge wurde nach 5 Tagen durch ein Virusfilter (Millipore-Filter 01310, Ausschlußgrenze der Molekülmasse 100 000) filtriert, um das Virus abzutrennen. Die dritte Teilmenge wurde durch ein Millipore-Filter PTMK 01310 filtriert (Ausschlußgrenze der Molekülmasse 100 000), das zuvor 4 Stunden in einer 1%igen BSA-Lösung eingeweicht worden war.

In allen Fällen wurde das resultierende Medium auf IFN sowie das Vorliegen von restlichen Virus geprüft.

Keine der Proben zeigte irgendeine Virusaktivität, wobei jede Probe die gleiche IFN-ε-Aktivität enthielt. Daraus geht hervor, daß die IFN-ε-Aktivität bei sauren pH-Werten stabil ist.

Beispiel 3

Durch Induktion menschlicher Epidermiszellen mit NDV hergestelltes IFN-ε kann durch Affinitätschromatographie an einer Reihe immobilisierter Liganden gereinigt und aufkonzentriert werden. Hierzu gehören Reaktivrot-Agarose, Phenylsepharose, Procion Red Agarose, Phenyl-Agarose, Glycogel-B, N-(3-Carboxypropionyl)-aminodecan (CPAD)-Agarose und N-Pyromellitylaminodecan (PMAD)-Agarose.

Beispiel 4

Unfraktioniertes IFN-ε wurde zunächst bei einer relativen Zentrifugalbeschleunigung von 300 20 min zentrifugiert. Der Überstand wurde mit Porenglas kontrollierter Porengröße bei 4°C gemischt, wobei 0,28 g Porenglas auf 30 ml des Kultur-Überstands eingesetzt wurden. Nach 3 h wurde der Überstand abgetrennt; die Porenglaskugeln wurden in eine Säule (2,5 × 3,1 cm) gepackt. Die so erhaltene Säule wurde zuerst mit dem vierfachen Säulenvolumen PBS und anschließend mit dem vierfachen Säulenvolumen 1 M NaCl-20 mM Phosphatpuffer, pH 7,4 gewaschen. Das IFN-ε wurde dann mit dem vierfachen Säulenvolumen an 50 Vol.-% Ethylenglycol - 1 M NaCl-20 mM Phosphatpuffer, pH 7,4 gewaschen und in einem gleichen Volumen 1 M NaCl-20 mM Phosphatpuffer gesammelt, wobei eine Endkonzentration an Ethylenglycol von 25% erhalten wurde. Die IFN-ε enthaltende Fraktion wurde durch Ultrafiltration auf 1,0 bis 1,6 ml aufkonzentriert und auf eine Polyacrylamid-Agarose-Säule (Ultragel AcA 54, 1,6 · 85 cm) aufgegeben, die mit 25 Vol.-% Ethylenglycol - 1 M NaCl-20 mM Phosphatpuffer, 7,4 äquilibriert worden war. Das IFN-ε wurde anschließend mit dem Äquilibrierungspuffer bei einem Durchsatz von 6,0 ml/h eluiert. Dabei wurden 2,0-ml-Fraktionen gesammelt und auf ihren IFN- und Proteingehalt getestet (Loury-Test).

Claims (6)

1. Interferon-Präparat mit antiviraler Wirksamkeit, erhältlich durch

• (A) Erzeugung einer Kultur lebender Zellen, die zumindest einen Teil des DNA-Codes menschlicher Epithelzellen enthalten,
• (B) Inkubation der Zellen in einem Medium unter Bedingungen, unter denen die Synthese von Interferon gefördert wird, und
• (C) Gewinnung einer interferonreichen Fraktion aus diesen Zellen.

2. Verfahren zur Herstellung des Interferon-Präparats nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch

• (A) Erzeugung einer Kultur lebender Zellen, die zumindest einen Teil des DNA-Codes menschlicher Epithelzellen enthalten,
• (B) Inkubation der Zellen in einem Medium unter Bedingungen, unter denen die Synthese von Interferon gefördert wird, und
• (C) Gewinnung einer interferonreichen Fraktion aus diesen Zellen.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt (A) als Zellkultur eine Kultur menschlicher Epithelzellen verwendet wird und in Schritt (B) ein Virus zur Induktion der Interferonproduktion in den Zellen herangezogen wird.

4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Virus Newcastle Disease-Virus oder Sendai-Virus verwendet wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Bankowski-Stamm des Newcastle Disease-Virus verwendet wird.

6. Pharmazeutische Zusammensetzungen, gekennzeichnet durch ein Interferon-Präparat nach Anspruch 1 als Wirkstoff.