DE69021128T2

DE69021128T2 - Interleukin-1-Inhibitor.

Info

Publication number: DE69021128T2
Application number: DE69021128T
Authority: DE
Inventors: Vivian Jerusalem Barak; Avi Jerusalem Treves
Original assignee: Hadassah Medical Organization
Current assignee: Hadassah Medical Organization
Priority date: 1989-05-19
Filing date: 1990-05-21
Publication date: 1996-02-29
Anticipated expiration: 2010-05-22
Also published as: CA2017315C; ATE125571T1; EP0398817B1; CA2017315A1; JPH03128397A; JP2863265B2; DE69021128D1; EP0398817A1

Description

Die vorliegende Anmeldung ist eine Continuation-In-Part der Anmeldung Serial No. 07/508 999, eingereicht am 12. April 1990, welche wiederum eine Continuation der Anmeldung, Serial No. 07/354 330, die am 19. Mai 1989 eingereicht wurde, ist, wobei auf jede in ihrer Gesamtheit hier Bezug genommmen wird.

1. Einleitung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein im wesentlichen reines Protein, das die Wirksamkeit von Interleukin 1 (IL-1) hemmt. In vitro bindet dieses Protein von ungefähr 52 kD an den IL-1 Zelloberflächenrezeptor und hemmt die Wirkung von IL-1 im co-mitogenen Assays bei Thymozyten der Maus. In vivo hemmt es die Induktion durch IL-1 von Fieber, Leukozytose und lokaler Lymphknotenvergrößerung bei Säugern.
Der Inhibitor wird durch eine menschliche, von myelomonocytischer Leukämie abgeleitete Zellinie abgesondert. Das durch diese Zellen konditionierte Medium wird durch Ionenaustauschchromatographie, Ionenaustausch-HPLC und Gelfiltration-HPLC gereinigt, wobei der Inhibitor isoliert wird. Neben dem Nutzen als anti-inflammatorisches Mittel kann der Inhibitor nützlich sein in der Behandlung von Krebs und Autoimmunkrankheiten. Andere Verwendungen des Inhibitors als Immunsuppresiva könnten gefunden werden in Gebieten wie der Organtransplantation: Vorbehandlung mit dem Inhibitor sowohl von dem Spendergewebe als auch dem Empfänger könnte eine Abstoßung des Gewebes und/oder die Transplantat-Wirt-Krankheit vermeiden.

2. Hintergrund der Erfindung

Interleukin 1 (IL-1) ist einer der Schlüsselvermittler der Körperreaktion auf Mikrobeninvasionen, Entzündungen, immunologische Reaktionen und Gewebeverletzungen. Obwohl der Macrophag ein primärer Ursprung für IL-1 ist, wird es ebenso von anderen Zellen abgesondert wie synoviale Fibroblasten, Keratinocyten und Langerhans-Zellen der Haut; Mesangialzellen der Niere; B Lymphozyten, natürliche Killerzellen, Astrocyten und microgliale Zellen des Gehirns; vasculäre endotheliale und glatte Muskelzellen; Hornhaut-, Zahnfleisch- und Thymusepithelzellen; und einige Zellinien der T-Lymphozyten. Nichts desto trotz bleibt der Monocyt eine wichtige Quelle für IL-1, wegen seiner strategischen Lage, seiner Fähigkeit große Mengen von IL-1 herzustellen und da er die IL-1-Vorstufe effektiver als andere Zellen bearbeitet.
IL-1 wirkt auch wie ein Hormon und verursacht ein breites Spektrum von systemischen Änderungen in neurologischen, metabolischen, hämatologischen und endokrinologischen Systemen. IL-1 beeinflußt auch Zerstörungs- und Heilungsprozesse im Verlauf von mesenchymalen Gewebeänderungen. Eine der biologischen Hauptwirkungen von IL-1 ist die Induktion von Reifung und Differenzierung in T-Lymphozyten und diese Wirksamkeit ist mit der IL-1 Aktivität für die durch T-Zellen vermittelte Immunität verbunden.
Die Rolle von IL-1 bei Entzündungen liegt in der Stimulierung der Produktion von Metaboliten der Arachidonsäure. IL-1 wirkt auch in synergistischer Weise mit anderen Cytokinen, im besonderen mit dem Tumornecrosefaktor (TNF). Tatsächlich teilen sich IL-1 und TNF wichtige biologische Eigenschaften und die kombinierten Wirkungen dieser beiden unterscheidbaren Cytokine ist oft größer als von einem allein. IL-1 potenziert ebenso die Reaktion von Interleukin 2 (IL-2) und der Interferone. IL-1 kann in Serum, in überstehenden Flüssigkeiten von Kulturen und Urin gefunden werden in einer überwiegenden Größe von 17 kD, wobei größere 30 kD und 64 kD und kleinere 2-4 kD Formen ebenso auftreten. Zwei Formen von IL-1, α (pI = 5) und β (pI = 7), sind isoliert worden. Die Gene, die beide Formen codieren sind von Genen der Maus und vom Menschen kloniert worden, und beide codieren ein nichtaktives 31 kD Vorstufenprotein, das in kleinere biologisch aktive Formen gespalten wird. Membrangebundenes IL-1 (22 kD) scheint biologisch wirksam zu sein und hauptsächlich in der α-Form vorzuliegen, während IL-1, das aus Zellen abgegeben wurde, hauptsächlich in β-Form vorliegt.
Die IL-1 Produktion in vitro wird durch eine große Vielfalt von inerten, immunologischen und Mikroben betreffende Agentien gesteigert.
Lipopolysaccharid (LPS) ist der stärkste Stimulator der IL-1 Produktion durch menschliche Macrophagen Macrophagen scheinen die Fähigkeit zu besitzen, IL-1 in allen Stufen ihrer Differenzierung herzustellen.
Rezeptoren für IL-1 sind in mehreren unterschiedlichen Zelltypen gefunden worden. Es gibt Beweise für hoch affine Rezeptoren, die Internalisierung erleiden und daher IL-1 herunter regulieren, ebenso wie für niedrig affine Rezeptoren, die IL-1 in einem geringeren Ausmaß herunter regulieren.
Die große Menge an Daten, die bezüglich der Funktionen von IL-1 vorhanden ist, ist eine Sammlung gewaltiger Komplexität, während sehr viel weniger bezüglich der Steuerung der IL-1 Aktivitäten bekannt ist. Einzig Corticosteroide blockieren die IL-1 Transcription und vermindern ihre Produktion. Die Induktion von adrenokortikotropen Hormonen (ACTH) durch IL-1 kann ebenso zu einer negativen Rückkopplungsschleife führen. Jedoch kann der Körper seine eigenen Substanzen herstellen, die die biologische Aktivität von IL-1 durch Bindung an das Molekül hemmen, indem sie mit dem IL-1 Rezeptor wechselwirken oder indem sie die Wirkung von IL-1 bei einer Vielfalt von Zellen dämpfen. Mehrere Faktoren sind beschrieben worden, die spezifisch die IL-1 Aktivität hemmen. Diese Faktoren wurden von verschiedenen Quellen abgeleitet und unterscheiden sich in ihrer biochemischen Struktur.
Eine Anzahl von Laboratorien haben die Hemmung der thymozytischen, proliferationsinduzierenden Wirkungen von IL-1 durch Faktoren, die im Serum, Urin und dem Überstand von Zellkulturen vorhanden waren, beschrieben. Dinarello et al. (J. Immunol. 127 : 2517, 1981) beschrieben einen solchen Faktor, der in menschlichem Serum 3 bis 4 Stunden nach der Verabreichung von Endotoxin vorhanden war. Es war nicht dialysierbar und wurde bei 70 ºC zerstört, aber bis 56 ºC blieb die Aktivität erhalten. Weiterhin band der Faktor an immobilisierte Anti- IL-1 Antikörper und konnte daraus eluiert werden, was darauf hindeutet, daß er mit IL-1 strukturell verwandt war oder daß er an IL-1 gebunden war.
Überstehende Flüssigkeiten von Kulturen von einer Anzahl von verschiedenen Zelltypen, die Inhibitoren für IL-1 bilden, sind ebenso gefunden worden. Amento et al. (pNAS 79 : 5307, 1982) berichteten, daß eine menschliche macrophagenartige Zellinie, U937, einen Inhibitor für IL-1 produzieren könnte. Scala et al. (J. Exp. Med. 159 : 1637, 1984) haben einen Inhibitor für IL-1 beschrieben, der von einer Epstein-Barr Virus-transformierten B-Zellinie, ROHA-9, produziert wird. Dieser Inhibitor scheint spezifisch für IL-1 zu sein, da er die Wirkungen anderer T-Zellwachstumsfaktoren nicht blockiert und von Thymozyten absorbiert werden kann. Wilkins et al. (Cell. Immunol. 75 : 328; 1983) beschrieben einen Inhibitor der in der überstehenden Flüssigkeit von U937 Zellen, die mit Concanavalin A (ConA) stimuliert wurden, vorhanden war. Jedoch hemmte dieser Faktor Mitogen-induzierte periphere Blutlymphozytenproliferation und er wurde nicht direkt auf IL-1 hemmende Aktivität getestet. Er hatte anscheinend eine Molekülmasse von 65 kD und wurde teilweise bei 56 ºC inaktiviert. Er war nicht cytotoxisch und seine Wirkungen waren sogar nach 24 stündiger Inkubation mit Lymphozyten reversibel. Fujiwara und Ellner (J. Immunol. 136 : 181, 1986) zeigten, daß U937 Zellen spontan einen 85 kD Hemmfaktor produzieren, der IL-1 und IL-2 induzierte Proliferation von Thymozyten hemmt. Eine ähnliche Aktivität ist in den überstehenden Flüssigkeiten von menschlichen, mononuclearen Zellkulturen durch Shou et al. (Proc. Nat. Acad. Sci (USA) 77 6096, 1980) gefunden worden. Die Beziehung zwischen U937, ROHA-9 und diesem normalen mononuclearen, von Zellen stammenden Faktor ist noch zu bestimmen.
Mehrere Laboratorien haben auch IL-1 hemmende Faktoren in Urin beschrieben. Liao et al. (J. Exp. Med. 159 : 126, 1984) haben bemerkt, daß der Urin von fiebernden Patienten erhöhte Mengen eines Stoffes enthält, der die IL-1 induzierte Proliferation von Thymozyten hemmt. Dieser Stoff erscheint spezifisch für IL-1, da er nicht die IL-2 induzierte Proliferation von Thymozyten hemmt und er nicht cytotoxisch für diese Zellen ist.
Kimball et al. (J. Immunol. 133 : 256, 1984) beschrieben einen ähnlichen Inhibitor in menschlichem Urin, aber sie bemerkten, daß dieser Faktor einen anderen IL-1 induzierten Effekt, die Induktion der Proliferation von Fibroblasten, nicht blockierten. Balavoine et al. (J. Clin. Invest. 78 : 1120, 1986) beschrieben einen 25 - 35 kD Inhibitor der 455 Il-1 induzierten Proliferation von Thymozyten, der im Urin von Patienten mit akuter, monozytärer Leukämie vorlag. Dieser Inhibitor blockiert in vitro auch die IL-1 induzierte Produktion von Prostaglandin und Kollagenase in Fibroblasten.
Schließlich haben Muchmore und Decker (Science 229 : 479, 1985) kürzlich ein 85 kD Glykoprotein beschrieben, das aus menschlichem Urin während der Schwangerschaft (Uromodulin) isoliert wurde, das in vitro durch Tetanus toxisch induzierte Proliferation menschlicher Lymphozyten blockiert. Brown et al. (Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) 83 9119, 1986) haben kürzlich gezeigt, daß Uromodulin ein Inhibitor für IL-1 induzierte Proliferation von Thymozyten ist. Es unterscheidet sich auch in seinen biologischen Funktionen im Vergleich mit Fieberinhibitoren: Uromodulin verstärkt die IL-2 induzierte Proliferation. Außerdem erwähnten Muchmore und Decker, id., daß menschliches Urin andere immunsuppresive Faktoren enthält, von denen einige an Con A binden und über Sephadex G-75 mit Urinproteinen co-chromatographiert werden. Derzeit gibt es keine Informationen über die Beziehung zwischen den Urin IL-1 Inhibitoren und denen, die im Serum und in Überständen von Kulturen gefunden wurden.
Andere Inhibitoren aus Zymosan-stimulierten regulären Makrophagen und mononuklearen Zellen wurden durch Tiku et al. (J. Immunol. 136 : 3686, 1986) beschrieben. Es gab zwei Signale mit hemmender Aktivität: 45 - 70 kD und größer als 160 kD.
Durch Arend et al. (J. Immunol. 134 : 3868, 1985) wurde gefunden, daß mit Immunkomplexen stimulierte menschliche Monozyten einen 22 kD Inhibitor von IL-1 absondern. Mit dem Respiratory Syncial Virus oder Influenza Virus infizierte Monozyten, sondern IL-1 und einen 45-60 kD Inhibitor von IL-1 ab, wie durch Roberts et al. (in Progress in Leukocyte Biology, Bd. 2, Seiten 409-18, Roberts et al., Ed. 1985) beschrieben.
Auch bei AIDS-Patienten wurde durch Berman et al. (Immonopathol. 42 133, 1987) gefunden, daß sie einen Inhibitor von IL-1 mit einem Molekulargewicht von 50-100 kD absondern, das die hohe Produktion von IL-1 maskiert.
Barak et al. (Eur. J. Immunol. 16 : 1449, 1986; Lymphokine Res. 6 (1), 51987, Abstr. Nr. 1133) berichteten über die Isolierung eines Faktors, der durch eine myelomonozytische Zellinie M20 abgesondert wird, der in vitro spezifisch die IL-1 Aktivität hemmt. Man fand heraus, daß der Faktor ein Protein von 52 kD war und man isolierte ihn als Einzelpeak in der Ionenaustauschchromatographie.

3. Inhaltsangabe der Erfindung

Die vorliegende Erfindung ist auf ein im wesentlichen reines Protein von näherungsweise 52 kD, das die Aktivität von IL-1 hemmt, gerichtet. Die Erfindung stellt auch eine kontinuierliche Zellinie, die das Protein produziert, und Methoden zu seiner Reinigung bereit. Die Erfindung ist auch gerichtet auf die Verwendung des hemmenden Proteins, sowohl in vitro als auch in vivo, zur Reduzierung der Proliferation von Leukozyten und von Entzündungen genauso wie Verwendungen in der Immunosubpression und in der Behandlung von Krebs.

4. Kurze Beschreibung der Figuren:

Figur 1: Fraktionen von einer DEAE-Ionenaustauschchromatographie (0.0- 50.6 M NaCl Gradient) aus einer überstehenden Flüssigkeit von M20-2 Zellen wurden in dem Mausthymozytencomitogenitätstest auf IL-1 Hemmung untersucht. Die Meßwerte repräsentieren die CPM für inkorporiertes Thymidin für vierfache Kulturen und die horizontale Linie zeigt die Aktivität in Kontrollkulturen nur mit IL-1 in Abwesenheit des Inhibitors an.
Figur 2: Fraktionen von einer Ionenaustausch HPLC (0-1 M NaCl Gradient) wurden auf IL-1 Hemmung im Mausthymozytencomitogenitätstest untersucht. Meßergebnisse repräsentieren CPM von inkorporiertem Thymidin für 3- fache Kulturen, wobei die horizontale Linie die Aktivitäten in Kulturen mit IL-1 allein anzeigt.
Figur 3: Fraktionen aus einer Ionenaustausch FPLC nach IL-1 Hemmung im Co-Mitogenitätstest wie zuvor untersucht.
Figur 4: Fraktionen 10 und 18 aus dem Co-Mitogenitätstest der in Figur 3 gezeigten Ionenaustausch FPLC-Fraktionen wurden titriert, um ihre Änderung in hemmender Aktivität mit sinkender Konzentration der Fraktion 10 festzustellen. Co-Mitogenitätstest eingeschlossen. Offene Quadrate: Rhomben: Fraktion 18.
Figur 5: Die Fraktionen einer Ionenaustauschchromatographie wurden einer HPLC Gelfiltration unterworfen. Die entstehenden Fraktionen wurden im Co-Mitogenitätstest auf IL-1 Hemmung untersucht und das Signal mit hemmender Aktivität wurde bei einem Molekulargewicht von näherungsweise 50 kD aufgezeigt. Schraffiert: Inhibitorsignal.
Figur 6: SDS-PAGE vom IL-1 Inhibitor. Bahn 1: Molekulargewichtsmarker (BSA, 67 kD; Ovalbumin, 45 kD; Pepsin, 34.7 kD; Trypsinogen, 24 kD; Isozym 14.3 dD). Bahn 2: Peak der auf den Co-Mitogenitätstest basierenden hemmenden Aktivität aus einer DEAE Ionenaustauschchromatographie Bahn 3: Peak der hemmenden Aktivität aus einer nachfolgenden Gel-Filtrationschromatographie, wobei das Material aus der vorhergehenden Ionenaustauschchromatographie verwandt wird.
Figur 7: Die Beziehung der Hitzebehandlung des IL-1 Inhibitors und Retention seiner Fähigkeit an den IL-1 Rezeptor zu binden wurde durch einen in vitro Bindungstest bestimmt. Offene Quadrate: Inhibitor 20 Minuten bei 56 ºC. Volle Kreise: Inhibitor 2 Minuten bei 100 ºC. Offene Kreise: Kontrollinhibitor (keine Hitzebehandlung).
Figur 8: Vergleich durch den in vitro Bindungstest zwischen IL-1 und dem IL-1 Inhibitor und ihre Fähigkeit von dem IL-1 Rezeptor zu dissoziieren. Offene Kreise: Prä-Inkubation des Inhibitors. Kreuze: keine Prä-Inkubation.
Figur 9: IL-1 und verschiedene Mengen des Inhibitors wurden gemeinsam Mäusen injiziert und die prozentuale Hemmung des Fiebers wurde zu verschiedenen Zeitpunkten bestimmt. Offene Quadrate; Hemmung 0.5 Stunden nach gemeinsamer Injektion. Kreuze: eine Stunde nach Injektion Rhomben: 1.5 Stunden nach Injektion. Dreiecke: 2 Stunden nach Injektion.
Figur 10: IL-1 wurde O bis 24 Stunden nach dem Inhibitor in Mäuse injiziert und die prozentuale Hemmung des Fiebers wurde zu zwei verschiedenen Zeitpunkten bestimmt. Nach oben rechts schraffiert: Hemmung 1.5 Stunden nach IL-1 Injektion. Nach oben links schraffiert: Hemmung 1 Stunde nach IL-1 Injektion.
Figur 11: Verschiedene Mengen IL-1 mit und ohne Inhibitor wurden in Mäuse injiziert und die prozentuale Hemmung der Induktion von Leukozytose wurde zu verschiedenen Zeitpunkten bestimmt. Jede Kurve des Experiments repräsentiert die Bestimmung des Indices der Leukozytose 1, 2, 3 bzw. 4 Stunden nach Injektion. Offene Säule: Nur IL-1. Schraffierte Säule: IL-1 und 2 Einheiten des Inhibitors.
Figur 12: IL-1 wurde 0 bis 24 Stunden nach dem Inhibitor in Mäuse injiziert und die prozentuale Hemmung der Leukozytose wurde zu zwei verschiedenen Zeitpunkten bestimmt. Nach oben rechts schraffiert: Hemmung 2 Stunden nach IL-1 Injektion. Nach oben links schraffiert: Hemmung 3 Stunden nach IL-1 Injektion.

5. Beschreibung der Erfindung:

Das vorliegende Protein ist ein IL-1 Inhibitor, der eine Anzahl von klinisch nützlichen Eigenschaften zeigt, die vorher in der Wissenschaft nicht beschrieben wurden. Das fragliche Protein hat ein Molekulargewicht von 52 ± 4 kD, das mit Gel-Filtration und SDS-PAGE mit einem isoelektrischen Punkt von 4.1 ± 0.2 bestimmt wurde. Das Protein ist durch Ionenaustauschchromatographie und HPLC Reinigung aus der überstehenden Flüssigkeit einer myelomonozytischen Zellinie, die man mit M20-2 bezeichnet, erhältlich. Obwohl ein IL-1 hemmendes Protein aus der Zellinie M20 kürzlich beschrieben wurde (Barak et al., Eur. J. Immunol. 16 : 1449-1452, 1986; Lymphokine Res. 6 (1), 1987, Abstr. Nr. 1133) hat der vorliegende IL-1 Inhibitor, der aus einer Nebenlinie des M20 abstammt, einen höheren Grad an Aktivität als man bei dem Protein aus M20 gefunden hat.
Wie unten beschrieben, besitzt das beanspruchte Protein einen hohen Grad an anti-inflammatorischer Aktivität. Drei wissenschaftlich anerkannte Tests werden typischer Weise angewandt, um die fähigkeit einer gegebenen Verbindung, Entzündungsreaktionen zu beeinflussen, zu bestimmen, nämlich: Wirkung auf Fieber, Leukozyten und Vergrößerung der Lymphdrüsen. In jedem dieser Tests zeigt der vorliegende Inhibitor in vivo eine bedeutende Wirkung, indem er jedes dieser charakteristischen Entzündungsreaktionen reduziert. Diese Ergebnisse weisen auf ein bedeutsames therapeutisches Potential für den neuen Inhibitor hin.
Es versteht sich, daß die Identität des IL-1 Inhibitors nicht derart begrenzt ist und verschiedene andere Aminosäuresubstitutionen, -additionen oder -entfernungen der Aminosequenz des beschriebenen IL-1 Inhibitors einschließt.
Ein anderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die rekombinante Herstellung des beschriebenen IL-1 Inhibitors. Ein solches Verfahren wird DNA-Sequenzen anwenden, die den IL-1 Inhibitor codieren, und die Transformierung verschiedener einzelliger Wirte mit den rekombinanten DNA-Molekülen, die durch solche Sequenzen charakterisiert sind, einschließt, unter Herstellung des IL-1 Inhibitors oder von Teilen davon durch Fermentation des transformierten Wirtes. Die vorliegende Erfindung verwendet auch den beschriebenen IL-1 Inhibitor, um die Molekülstruktur und Wirkstelle des IL-1 Inhibitors zu bestimmen, und verwendet diese Information, um Fragmente und Peptide zu entwerfen, zur Verwendung als IL-1 Inhibitor und für die rekombinierte Herstellung, wie in den Verwendungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung beschrieben. Das Folgende umreißt die Techniken, die bei der Erfindung verwandt wurden.

5.1. Verfahren der Reinigung

Eine Anzahl von Verfahren sind gefunden worden, die nützlich bei der Reinigung des Gegenstandes IL-1 Inhibitor aus der überstehenden Flüssigkeit der M20-2 Zellinie sind. Kurz gesagt, wird ein befriedigender Grad an Reinheit, d.h. 1 Aktivitätseinheit/3ug Protein wurde durch Ionenaustauschchromatographie, gefolgt von weiterer Reinigung oder Ionenaustausch HPLC oder FPLC erhalten. Wahlweise stellt bloße Ionenaustausch HPLC ein im wesentlichen reines Produkt bereit. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das hemmende Protein durch isoelektrische Fokusierung gereinigt. Eine kurze Beschreibung jeder Verfahrensweise wird nachfolgend umrissen und detaillierter in den Beispielen von Kapitel 6 dargestellt.
Wenn auch das vorstehend Beschriebene für jede Reinigungsstufe angewandt wurde, liegt es innerhalb der technischen Kenntnisse, diese leicht zu ändern, ohne daß die Ergebnisse bedeutsam geändert werden.

5.1.1. Ionenaustauschchromatographie

Überstehende Flüssigkeit aus M20-2 Zellen, die den IL-1 Inhibitor enthalten, wurden einer wie vorstehend beschriebenen Ionenaustauschchromatographie unterzogen und die entstehenden Fraktionen wurden durch den Co-Mitogenitätstest auf Hemmung untersucht. Die Fraktionen 11-15 (11-15), die Signale mit Inhibitoraktivität (Fig. 1) wurden zur weiteren Charakterisierung vereinigt, gefriergetrocknet und eingefroren.

5.1.2. Ionenaustausch HPLC

Die vereinigten Fraktionen mit dem Signal der IL-1 Aktivität aus der Ioflenaustauschchromatographie wurden weiter durch Ionenaustausch HPLC gereinigt.
Die Fraktionen 11-15 aus der Ionenaustauschchromatographie wurden HPLC und FPLC unterzogen. Für erstere wurden 300 mg des gefriergetrockneten IL-1 Inhibitors in 2.0 ml Wasser wiederhergestellt und auf eine TSK DEAE-5 PW HPLC Säule (Biorad) gegeben, mit einem 0.0 - 0.1 M NaCl Gradienten in 20 mM Tris (pH 7.5) mit 1 ml Fraktionen pro Minute. Figur 2 zeigt die hemmende Aktivität der Fraktionen in vereinigten Einheiten zweier nachfolgender Aliquote, die durch einen leicht modifizierten Co- Mitogenitätstest bestimmt wurde. Bei letzterem wurden 1.0 mg des gleichen Inhibitors in 100 ml Wasser wiederhergestellt und auf eine Mono Q HR 5/5 FPLC Säule (Pharmacia) unter den gleichen Bedingungen (außer pH 8.0) aufgebracht. Die hemmende Aktivität der Fraktionen wurde wie vorstehend beschrieben bestimmt (Fig. 3).
Die IL-1 Inhibitoraktivität aus der FPLC wurde titriert unter Benutzung des Co-Mitogenitätstests unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen (Fig. 4). Steigende Mengen der Fraktionen 10 und 18 zeigten einen ähnlichen Anstieg in der Hemmung der co-mitogenen Wirkung von IL-1.

5.1.3. Gel-Filtration HPLC

Gefriergetrocknetes Material aus der Ioflenaustauschchromatographie wurde über eine Sorbax GF 250 HPLC Säule (Dupont) gegeben. In Figur 5 wurde der Peak der IL-1 Inhibitoraktivität (basierend auf dem oben erwähnten Co-Mitogenitätstest) bei einem Molgewicht angezeigt, das leicht unter dem des BSA Standards, 68 kD liegt, was nahelegt, daß der Inhibitor in einer nicht reduzierten Form näherungsweise 50 kD ist. In diesem Fall wird die niedrigere hemmende Aktivität durch die Gegenwart M20-2 abgeleiteter Wachstumsfaktoren ähnlicher Größe erklärt. Da dieser Faktor im Test weder IL-1 noch IL-2 substituieren kann, ist es anscheinend ein anderer Typ von Wachstumsfaktor.

5.1.4. Isoelektrische Fokusierung

Rohe überstehende Flüssigkeit aus M20-2 Zellen wurde auch direkt einer isoelektrischen Fokusierung ohne irgend eine vorhergehende Reinigung unterzogen. In den 20 hergestellten Fraktionen wurde der Peak der IL-1 Inhibitoraktivität, wie sie durch den Comitogenitätstest bestimmt wurde, übereinstimmend in der neunten Fraktion, die einem pI-Punkt von 4,1 entspricht, gefunden. Es wurde gefunden, daß die Fraktion 300 Aktivitätseinheiten oder 1 Einheit pro 3 mg Protein enthielt. Diese Fraktion erzeugte eine einzige Bande von näherungsweise 52 kD auf einem nicht denaturierenden mit Coomassie Blau gefärbtem 10 % Gel; wenn Abschnitte dieses Gels, die einem Bereich von Molekulargewichten entsprechen, abgetrennt und einzeln mit einem Co-Mitogenitätstest untersucht wurden, korrespondierte die durch die neunte Fraktion erzeugte Bande exakt mit der IL-1 Inhibitoraktivität. Es gab keine hemmende Wirkung in irgend einem der anderen Abschnitte des Gels, die anderen Molekulargewichten entsprechen, mit Ausnahme eines Gebietes mit sehr niedrigen Molekulargewichten am Boden des Gels. Da die Aktivität in diesem Gebiet sogar in Kontrolläufen gefunden wurde, die keine Fraktion aus der isoelektrischen Fokusierung enthielt, ist es nicht auf den Abbau des IL-1 Inhibitors zurückzuführen. Dieses Phänomen ist möglicherweise auf Zerfallsprodukte des Gels selbst zurückzuführen.

5.2 Biochemische Charakterisierung

Es hat sich gezeigt, daß der vorliegende Inhibitor in Co- Mitogenitätstests wirksam ist, die co-mitogene Wirkung von IL-1 auf Mäusethymozytests zu hemmen. Es wurde auch gezeigt, daß der Inhibitor in IL-1 Rezeptor-Bindungstests in der Lage ist, die Bindung von IL-1 α und β an dem Rezeptor zu blockieren; diese hemmende Aktivität wird jedoch vermindert durch kurzzeitige Behandlung des Inhibitors bei 100 ºC, was die proteinartige Natur des Inhibitors anzeigt. Die Bindung des Inhibitors an die IL-1 Rezeptorstelle ist umkehrbar wie die Bindung von IL-1 selbst.
Ein Vergleich mit ähnlichen Inhibitoren, z.B. der aus der Zellinie M20 abgeleitete Inhibitor zeigt, daß der vorliegende Inhibitor wesentlich wirksamer als der Inhibitor aus M20 ist, wenn sie in Co- Mitogenitätstests verglichen werden.

5.3. Aktivität in Vivo

Für alle in vivo-Tests wurde rekombiniertes menschliches IL-1 (Cistron) und rekombiniertes Maus IL-1 (Dr. Ivan Otterness, Pfizer) in PBS (pH 7.2) gelöst und Stammlösungen von 10 Einheiten/ml wurden bei -20 ºC gelagert. "Eine Aktivitätseinheit" für IL-1 wurde definiert als die Menge, die erforderlich ist, die Reaktion vom Mausthymozyten auf PHA im Co-Mitogenitätstest um 50 % zu steigern. Zusätzlich wurde der durch Ioneaustauschchromatographie gereinigte (Gradient 0.0 bis 0.4 M NaCl) IL-1 Inhibitor in allen in vivo-Tests verwandt. Fraktionen wurden gegen RPMI 1640 dialysiert und bei -20 ºC gelagert, wobei "eine Aktivitätseinheit" für den Inhibitor von IL-1 definiert ist als die Menge, die erforderlich ist, die co-mitogene Aktivität einer Einheit von IL-1 um 50 % zu hemmen. Sowohl für IL-1 als auch für seinen Inhibitor genauso wie für Con A und LPS wurden die Aktivitätstitrationen in zweifacher Verdünnung durchgeführt, um die Anzahl der verwandten Einheiten zu bestimmen. Die prozentuale Hemmung wurde errechnet als:
100 x (1 - Aktivität mit Inhibitor)/Aktivität nur mit IL-1
In allen in vivo-Experimenten wurden männlichen, 6 bis 8 Wochen alten Balb/c Mäusen PBS Lösungen von Con A, LPS oder IL-1, allein oder zusammen mit dem IL-1 Inhibitor injiziert, und jede Versuchsgruppe bestand üblicherweise aus vier Mäusen.
Die Versuche zur Prüfung der Hemmung der Fieberinduktion wurden erst gestartet, nachdem drei aufeinanderfolgende und ähnliche Basislinien- Temperaturwerte bei jeder Maus vorlagen. Die rektale Temperatur wurde mit einer Thermistorsonde Nr. 402 (Yellow Springs Instruments, Yellow Springs, Ohio) gemessen, wobei ungefähr 30 Sekunden lang 2 cm tief eingeführt wurde und auf einem Yellow Springs Fernthermometer aufgezeichnet wurde. Die Mäuse wurden während der Prozedur sanft festgehalten durch ihre Beschränkung in einer gelüfteten Röhre mit angemessener Größe. Experimente wurden durchgeführt, in denen entweder 0.25, 0.5, 1.0, 1.5 oder 2.0 Einheiten des IL-1 Inhibitors und 150 Einheiten von menschlichem IL-1 gemeinsam intravenös injiziert wurden und in denen 2 Einheiten des IL-1 Inhibitors von 2 bis 24 Stunden vor den 150 Einheiten IL-1 intravenös injiziert wurden.
Zur Messung der Hemmung der Induktion der Leukozytose wurden Blutproben von den Mäusen durch venöse Schwanzpunktion genommen und in heparinisierten Röhrchen gelagert, wobei die Gesamtleukozytenzahl durch ein Coulter Modell S-Plus (Coulter Electronics, Hialeah, Florida) bestimmt wurde. In einem Experiment wurden entweder 50, 100, 150 oder 200 Einheiten von menschlichem IL-1 allein oder gemeinsam mit 2 Einheiten des Inhibitors intravenös injiziert; in einem anderen Experiment wurden 2 Einheiten des Inhibitors 2 bis 24 Stunden vor den 150 Einheiten IL-1 intravenös injiziert.
Um die Hemmung der Lymphknotenvergrößerung zu testen, wurden 0.05 ml der zu testenden Probe subcutan in beide rechte Fußballen einer Maus injiziert, um eine Reaktion in lokalem Abfluß der Lymphknoten zu verursachen, was durch eine Steigerung im Lymphknotengewicht gemessen wurde. Nach drei Tagen wurden die Mäuse mit Äther betäubt und durch zervikale Dislokation getötet. Die poplitealen Lymphknoten der rechten und linken Seite wurden entfernt, von Fett befreit und gewogen. Nach vorhergehender Bestimmung der Dosierungsreaktion und Kinetik bei optimaler Lymphknotenvergrößerung wurden folgende Mengen, 12.5 ug Con A, 50 ug LPS, 125 Einheiten IL-1 der Maus und 100 Einheiten menschliches IL-1 allein oder in Kombination mit 2 Einheiten des IL-1 Inhibitors injiziert. Ebenso wurde 1 Einheit des IL-1 Inhibitors entweder 2 Stunden bis 4 Tage vor den 125 Einheiten des IL-1 der Maus oder 2 Stunden bis 1 Tag nach IL-1 injiziert.

5.4 Therapeutische Verwendung des IL-1 Inhibitors

Die nachstehend vorgestellten Daten zeigen die Nützlichkeit des unmittelbaren Inhibitors als anti-inflammatorisches Mittel, vermutlich ein Ergebnis seines hemmenden Effektes auf IL-1. So stellt die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Vermeidung oder Behandlung von unerwünschten Entzündungsreaktionen bereit. Von besonderem Interesse sind solche Krankheiten, bei denen ein Ungleichgewicht zwischen IL-1 und seinen natürlichen Inhibitoren den Krankheitszustand verursacht. Unter den Bedingungen, die von unerwünschten Entzundungsreaktionen begleitet werden, sind allergische Reaktionen, chronische Entzündungskrankheiten, Autoimmunkrankheiten (z.B. rheumatoide Arthritis) und mit Krebs oder infektiösen Zuständen verbundenem hohen Fieber. Die wirksame Komponente wird bevorzugt in einer Zusammensetzung in Kombination mit einem pharmazeutisch brauchbaren Träger formuliert. Die Verabreichung der Zusammensetzung kann entweder oral oder durch lokale oder parenterale Injektion erfolgen. Eine wirksame Dosierungseinheitform der vorliegenden Zusammensetzung sollte annährend 0.0001-1,0 ug der wirksamen Komponente pro kg Körpergewicht umfassen. Es liegt jedoch innerhalb der Fähigkeiten eines erfahrenen Arztes, die Dosierung in Übereinstimmung mit den Bedürfnissen des Patienten und den zu behandelnden Zuständen abzustimmen.

5.5 Andere Verwendungen

Der beanspruchte Inhibitor besitzt auch eine bedeutende nicht therapeutische Anwendung als Hilfsmittel in der Identifizierung von Gensequenzen. Es liegt im Anwendungsbereich der Erfindung große Mengen des IL-1 Inhibitors herzustellen, der im wesentlichen von anderen menschlichen Proteinen gereinigt ist, wobei die DNS-Sequenz, zusammen mit eingeschlossenen DNS-Molekülen in einzelligen Wirten, die mit der DNS-Sequenz transformiert wurden, verwendet wird. Der gereinigte IL-1 Inhibitor kann als Quelle für Angaben der Aminosäurensequenz benutzt werden zur Verwendung beim Entwerfen von DNS-Sonden, die dazu benutzt werden können, DNS-Sequenzen, die den IL-1 dieser Erfindung kodieren, zu isolieren und auszuwählen.
Insbesondere können Aminosäuresequenzen verschiedener Stellen und Fragmente des gereinigten IL-1 bestimmt werden und dazu benutzt werden, die DNS-Sequenz, die ihn kodiert, abzuleiten, um DNS-Sonden zu entwerfen, die möglicherweise nützlich sind, verschiedene DNS Bibliotheken auf DNS-Sequenzen hin zu überprüfen, die den IL-1 Inhibitor kodieren. Quellen für solche Bibliotheken können chromosale Genbanken und DNS- oder cDNS Bibliotheken von Gewebe oder alle Zellinien, die den erfindungsgemäßen IL-1 Inhibitor herstellen, einschließen. Methoden zur Herstellung und Klonierung von DNS und Expression eines IL-1 Inhibitors, Durchmustern einer Klonbibliothek nach einer IL-1-Einfügung und die Verwendung der Expression der DNS- Sequenzen in einer Wirt/Vektor-Kombination sind in der Internationalen PCT-Anmeldung, Offenlegungsnummer WO 89/01946 beschrieben, auf die hier in ihrer Gesamtheit Bezug genommen wird und werden als innerhalb des Rahmens der vorliegenden Erfindung betrachtet.
Kurz gefaßt umfaßt die Herstellung von cDNS die Isolierung von PolyA&spplus;mRNS aus einer den IL-1 Inhibitor herstellenden Zellquelle, gefolgt von der Bildung einer cDNS-Bibliothek aus der isolierten PolyA&spplus;mRNS Die Klonbibliothek wird dann nach rekombinanten DNS Molekülen, die den IL-1 Inhibitor enthalten, durchmustert. Dabei werden verschiedene Ansätze benutzt. Ein Einsatz kann die Verwendung von DNS- Sonden einschließen, die cDNS oder genomische Bibliotheken, die den IL-1 Inhibitor kodieren, durchmustern. Die DNS-Sonden bestehen aus einer Reihe von synthetischen DNS-Fragmenten, deren Konstruktion auf partielle Aminosäuresequenzen des gereinigten IL-1 Inhibitors, der durch allgemein bekannte Techniken bestimmt wurde, basiert. Die ausgewählten Sequenzen können dann eingesetzt werden, um den IL-1 Inhibitor der vorliegenden Erfindung in prokaryotische und eukaryotische Wirte zu transformieren und exprimieren. Die DNS- Sequenzen der vorliegenden Erfindung können auch in Vektoren eingesetzt werden, die Segmente chromosomaler, nicht-chromosomaler und Synthetischem DNS bestehen und in einer Vielzahl von Wirt/Vektor Kombinationen exprimieren, um den IL-1 Inhibitor herzustellen. SV40- Derivate und bekannte bakterielle Plasmide als Expressionsvektoren mit an verschiedenen Stellen insertierten DNS-Sequenzen des IL-1 Inhibitors und einer Steuerungssequenz und andere Vektoren, die zur Expression in prokaryotischen und eukaryotischen Wirten fähig sind, können eingesetzt werden. So umfaßt die vorliegende Erfindung das auf jede mögliche Weise hergestellte 52 KD Protein oder seine Equivalente und es ist nicht nur auf ein Protein beschränkt, das aus M20-2 isoliert wurde.

6. Beispiel: Reinigung und Aktivität des Inhibitors

Folgendes ist ein Beispiel für den Reinigungsprozeß, die Charakterisierung und Aktivitätsuntersuchungen des IL-1 Inhibitors aus M20-2 Zellen.

6.1 Verfahren zur Reinigung

Auf jeder Stufe der Reinigung wurde die IL-1 Inhibitor-Aktivität gemessen, wie es beschrieben wurde (Barak et al., Eur. J. Immunol. 16: 1449 - 1452, 1986) durch die Hemmung der IL-1 Zunahme der mitogenen Reaktion bei Thymuszellen der Maus durch PHA. Die Hemmung dieser IL-1 comitogenen Aktivität wurde gezeigt durch den Vergleich der Abnahme des Einbaus von ³(H)-Thymidin in wachsende Zellen in Gegenwart des Inhibitors mit dem Einbau in wachsende Zellen in alleiniger Gegenwart des IL-1. C3H/HeJ Mäusethymocyten wurden 48 Stunden lang in 96 Muldenplatten, kultiviert, die 1.0 × 10&sup6; Zellen, eine Einheit an rekombinantem menschlichem IL-1 (Cistron Biotechnology, Pine Brook, NJ) und 500 ng Phytohämagglutinin (PHA) in 150 pl RPMI 1640 Kulturmedium (mit 10 % fötalem Kalbsserum und 5 × 10&supmin;&sup6;M β-Mercaptoethanol) pro Mulde enthielten. Die PHA mitogene Konzentration wurde vorher durch Titration in einem Thymozytentest bestimmt. Die Kulturen wurden mit 1.0 uC 3(H)- Thymidin radioaktiv markiert, bevor sie 24 Stunden später aufgearbeitet wurden, wobei die Daten auf Impulse pro Minuten (counts per minute = CPM) dreifach oder vierfach erstellten Kulturen basieren.
Als erste Stufe der Reinigung durch Ionenaustauschchromatographie wurden 100 ml überstehende Lösung des Kulturmediums der Myelomonozyten Zellinie M20-2, eine Nebenlinie von M20 (Barak et al., Eur. J. Immunol. 16: 1449 - 1452, 1986, Barak et al., Lymphokine Res. 6(1), 1987, Abstr. Nr. 1133), auf eine Säule (2.5 × 20 cm) aus DEAE Sephacel (Pharmacia, Uppsala, Schweden) aufgegeben, wie es in Barak et al., id., beschrieben wurde. Die Säule wurde mit einem 50 mM Tris HCl-Puffer, pH 7.4 (200 ml) eluiert und dann mit einem linearen NaCl-Gradienten von (0.0 bis 0.6 M) entwickelt. Die Fraktionen wurden gesammelt, gegen RPMI 1640 dialysiert, filtriert und in 20, 50 und 100 ul Aliquote pro Mulde zur Hemmung der IL-1 Aktivität im Co-Mitogenitätstest von Mäusethymozyten mit PHA getestet.
Bei der nächsten Stufe der Reinigung durch Ionenaustausch HPLC wurde zuerst gefriergetrocknetes Protein aus der Ionenaustauschchromatographie, nachdem es über eine PD10 "Entsalzungssäule" (G-10-Säule von Pharmacia) gegeben wurde, mit Wasser rekonstituiert und über eine HPLC oder FPLC-Säule gegeben. Von jeder entstehenden Fraktion wurde die IL-1 hemmende Aktivität von 10 ul Aliquoten im Co-Mitogenitätstest durch Messung der Abnahme des 3(H)- Thymidineinbaus in proliferierende Thymozyten bestimmt.
Als alternatives Verfahren zur Reinigung des IL-1 Inhibitors kann die überstehende Flüssigkeit aus dem Kulturmedium der M20-2 Zellen direkt über eine Ionenaustausch HPLC-Säule ohne vorhergehende Reinigung gegeben werden.
Um den IL-1 Inhibitor weiter zu charakterisieren, wurde das gefriergetrocknete Material aus der Ionenaustauschchromatographie einer Gelfiltration HPLC mit einer Sorbax GF 250 Säule (Dupont) unterworfen.
Phosphatgepufferte physiologische Kochsalzlösung (PBS, pH 7.4) wurde als Puffer benutzt und 25 mg des Materials wurde in 250 ul PBS rekonstituiert als Probe aufgetragen und mit 0.5 ml pro Minute laufengelassen. Von jeder 0.5 ml Fraktion wurde ein 30 ul Aliquot wie zuvor im Co-Mitogenitätstest auf IL-1 hemmende Aktivität getestet.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wurde die Rotoforzelle (Bio-Rad, Richmond, CA) eingesetzt, die eine neue Entwicklung in der präparativen isoelektrischen Fokusierung ist, und auf dem von Egen et al. (in Electrophoresis '83, H. Hirai ed., Walter de Gruyter & Co., Berlin, New York, Seiten 547 - 550 (1984)) beschriebenen Prototyp basiert. Proteine wurden bei diesem Verfahren durch isoelektrische Fokusierung in freier Lösung getrennt. Das Ausgangsmaterial für die Isolierung des Inhibitors bestand aus einem Liter der rohen überstehenden Lösung, die aus der Zellinie M20-2 erhalten wurde. Die überstehende Lösung wurde gefriergetrocknet und das erhaltene Pulver (15 g) wurde in RPMI 1640 gelöst und gegen 1000 svolumina RPMI 1640 auf 1 : 150 verdünnt, dialysiert. Vor dem Durchlauf wurde die Probe, die 1.25 - 1.85 mg/ml des Proteins enthielt, auf das 20fache mit 10 M Harnstoff auf eine endgültige Konzentration von 5 M Harnstoff verdünnt. Trägerampholyte, Bio-Lyte 3/5 wurden hinzugegeben, um eine endgültige Konzentration von 2 % (Gewicht/Volumen) zu erhalten. Das Volumen der Mischung betrug 50 ml. Als Anolyt wurde 0.1 M H&sub3;PO&sub4; und als Katholyt 0.1 M Na0H eingesetzt. Um die Probe auf Durchlauftemperatur (4 ºC) zu bringen, wurde die Zelle 15 Minuten rotiert, bevor elektrischer Strom angelegt wurde. Die Laufbedingungen waren typischerweise wie folgt konstante Leistung 12 Watt; 466 Volt und 26 Milliampere Nach 4 Stunden, wenn der Durchlauf abgeschlossen war, erreichte die Spannung 698 Volt und der Strom betrug 17 Milliampere. Bei Abschluß des Durchlaufes wurde der pH Gradient der 20 gesammelten Fraktionen (jede 2 ml) bestimmt, die auf 1 : 10 mit frisch aufgekochtem zweifach destilliertem Wasser verdünnt waren. Zur Refraktionierung wurden die Fraktionen mit einem pH von 4.03 bis 4.21, die hemmende Aktivität zeigten, gesammelt und mit 10 M Harnstoff auf eine endgültige Konzentration von 5 M Harnstoff verdünnt. Der Durchlauf wurde wie vorstehend durchgeführt, ohne daß zusätzliche Trägerampholyte zugegeben wurden. Die Startlaufbedingungen waren wie folgt: konstante Leistung 12 Watt; 1087 Volt und 12 Milliampere. Am Ende des Durchlaufs erreichte die Spannung 1828 Volt und der Strom betrug 7 Milliampere.
Um den Trägerampholyten zu entfernen, wurden die gesammelten Fraktionen gegen 1 M NaCl und anschließend gegen RPMI 1640 dialysiert. Die Reinheit der Fraktionen, die im Comitogenitätstest Aktivität zeigten, wurde durch analytische isoelektrische Fokusierung mit 0.5 mm Dünnschichtpolyacrylamidgelen bestimmt, wobei das LKB 2117 Multiphorsystem und SDS-PAGE mit der Mini-Protein 11 Blockzelle von Bio-Rad benutzt wurde.

6.2 Biochemische Charakterisierung

Der IL-1 Inhibitor wurde direkt mit dem Inhibitor aus M20 Zellen durch den Co-Mitogenitätstest verglichen. Beide Inhibitoren wurden unter den gleichen Bedingungen durch Ionenaustauschchromatographie (Gradient 0.0 - 0.4 M NaCl) gereinigt und auf ihre hemmende Aktivität bei verschiedenen Verdünnungen getestet.
Getrennt davon wurden Fraktionen des Il-1 Inhibitors mit einer peakhemmenden Aktivität aus einer Ionenaustauschchromatographie durch Gelfiltrationschromatographie auf einer Sephadex G-200 Superfine-Säule (Pharmacia) analysiert.
Die Proben wurden dialysiert, gefriergetrocknet in einem geringen Volumen des Puffers gelöst und 2.0 ml davon aufgegeben. Wie zuvor wurde jede neue Fraktion auf ihre Fähigkeit, die co-mitogene Wirkung von Il-1 auf Mäusethymozyten zu hemmen, getestet.
Fraktionen mit Il-1 hemmenden Aktivitätspeaks aus der Ionenaustauschund Gelfiltrationschromatographie (d.h. vor und nach der G-200 Säule) wurden auf benachbarten Bahnen eines elektrophoretischen SDS- Polyacrylimidgels mit einer Molekulargewichtsmarkierungssubstanz entwickelt.
Il-1 Rezeptorbindungstests wurden wie folgt durchgeführt.
Mäusethymozyten wurden auf einer 24 muldigen Tüpfelplatte aufgebracht und bis zum Überfließen gezüchtet. Die Zellen wurden einmal mit Bindungspuffer (Dulbecco's modifiziertes Eagle's Medium mit 0.1 % Rinderserumalbumin (BSA)), 10 mM HEPES und 0.1 % Azid und insgesamt 5 oder 6 Stunden lang bei 37 ºC inkubiert, wonach die Zellen zweimal mit Bindungspuffer gewaschen wurden und mit 1N Na0H gelöst wurden. Fraktionen des IL-1 Inhibitors aus der Ionenaustausch HPLC wurden bei verschiedenen Verdünnungen und unter verschiedenen Bedingungen getestet. Das resultierende Lysat wurde in einem gamma-Zähler gezählt und der prozentuale Anteil der spezifischen Bindung errechnet. Als Markierung wurde menschliches ¹²&sup5;(I)-IL-1, sowohl a als auch β (Cistron), mit 1 × 10&sup6; CPM benutzt; und 10 ug/ml menschliches IL-1, sowohl α als auch β (Cistron) wurde als "konkurrierender" Inhibitor eingesetzt.

6.2.1 Vergleich mit dem M20 Inhibitor

Wie aus den Co-Mitogenitätsergebnissen aus Tabelle I zu ersehen ist, ist der IL-1 Inhibitor wirksamer als der M20 Inhibitor (Barak et al., Eur. J. Immunol. 16 : 1449 - 1452, 1986; Barak et al., Lymphokine Res. 6(1), 1987, Abstr. Nr. 1133) bei jeder untersuchten Verdünnung. Tabelle I Vergleich zwischen M20- und M20-2-hergestellten IL-1 Inhibitoren durch den Co-Mitogenitätstest Index der IL-1 Aktivität Prozentuale Hemmung Einheiten Inhibitor Verdünnt
M20- und M20-2 abgeleitete Inhibitoren wurden mit demselben Reinheitsgrad (Peaks aus der DEAE-Ionenaustauschsäule) und mit derselben Konzentration auf 2 Einheiten menschlicher rekombinanter IL-1 eingesetzt.
Prozentuale Hemmung ist definiert als CPM für IL-1 plus Inhibitor dividiert durch CPM von IL-1 allein. Index der Aktivität ist definiert als CPM von IL-1 dividiert durch die Hintergrund-CPM ohne IL-1.
Wie gezeigt, besitzt der IL-1 Inhibitor keine Wirkung auf die Zellen in Abwesenheit von IL-1, was seine Spezifität aufzeigt.

6.2.2. Gelfiltrationschromatographie

Die Fraktionen mit einem IL-1 hemmenden Aktivitätspeak aus der Ionenaustauschchromatographie wurden dann durch Gelfiltrationschromatographie charakterisiert, wobei Fraktionen daraus auf die Hemmung der co-mitogenen Wirkung von IL-1 auf Mäusethymozyten getestet wurden.

6.2.3. SDS-PAGE

Die Fraktionen des IL-1 Inhibitors aus der Ionenaustausch- und nachfolgender Gelfiltrationschromatographie wurden durch SDS-PAGE analysiert (Fig. 6).

6.2.4. In vitro Bindungstests

Der IL-1 Inhibitor aus einer vorherigen Ionenaustausch HPLC (0.0 - 0.4 M Gradient) wurde durch 3 Typen von IL-1 Rezeptorbindungstests untersucht. Bei dem ersten wurden Fraktionen der HPLC (9, 15, 10 - 16 XC 15 und 43 - 45) in 1 : 50 oder 1 : 100 Verdünnung mit Mäusethymozyten eine Stunde bei 37 ºC prä-inkubiert. Als Vergleich wurde ein identischer Satz von Zellen mit der gleichen Verdünnung nur mit dem Bindungspuffer (d.h. noch ohne Inhibitor) unter den gleichen Bedingungen behandelt. Danach wurden die prä-inkubierten und die anderen Teile des Tests ¹²&sup5;(I)-IL-1, α oder β, mit 10&sup6; CPM 4 Stunden lang bei 37 ºC ausgesetzt und auch der vorher nur mit Puffer behandelte Abschnitt wurde gleichzeitig mit denselben Fraktionen des IL-1 Inhibitors bei gleichen Verdünnungen inkubiert. Beide Kontrollversuche wurden auf ähnliche Weise behandelt, entweder mit 10 u/ml IL-1, α oder β, in einem Kontrollversuch oder nur das markierte ¹²&sup5;(I)-IL-1, α oder β, mit 10&sup6; CPM in dem anderen Kontrollversuch, unter Ersetzung der Fraktionen des Inhibitors in den prä-inkubierten und gleichzeitigen Abschnitten des Tests. Die prozentuale spezifische Bindung wurde errechnet als:
100 x (CPM mit Inhibitor - CPM mit IL-1)/CPM nur bei Markiertem - CPM mit IL-1
Die Ergebnisse sind in Tabelle II gezeigt. Tabelle II In vitro Bindungstest des IL-I Inhibitors Probe Verdüngung Prä-Inkubation Prozentuale Bindung
"ND" = nicht durchgeführt.
Die Ergebnisse demonstrieren, daß von den getesteten Fraktionen nur 10- 16 XC 15 IL-1 Rezeptorbindungsinhibitoren enthielten. Dieser Inhibitor blockierte die Bindung von IL-1, α und β, und erforderte keine Prä- Inkubation der Zellen vor Zugabe von ¹²&sup5;(I)-IL-1, die diese Hemmung demonstriert, obwohl die Wirkung durch die Prä-Inkubation etwas erhöht wurde.
Für die beiden verbleibenden Tests wurde nur ¹²&sup5;(I)-IL-1 α und IL-1 α eingesetzt und die einzige getestete Inhibitorfraktion war 10-16 XC 15.
Bei dem nächsten Typ von Rezeptorbindungstests wurden mehrere Verdünnungen des Inhibitors auf hemmende Aktivität nach verschiedenen Behandlungen getestet, um die Retention der Bindungsfähigkeit durch den Inhibitor zu beobachten. Das Protokoll war das gleiche wie das für den gleichzeitigen Abschnitt des vorhergehenden Tests. Die prozentuale Hemmung der Bindung betrug:
100 - (prozentuale spezifische Bindung)
Die Ergebnisse sind in Tabelle III aufgezeigt. Tabelle III In vitro Bindung des IL-1 Inhibitors nach Hitzeanwendung Verdünnung Behandlung CPM gebunden Prozentuale Hemmung ohne Inhibitor
Wie man ebenso aus der Abbildung 7 ersehen kann, wurde die Aktivität des Inhibitors, bezogen auf den unbehandelten Inhibitor, zerstört, wenn zwei Minuten lang bei 100 ºC inkubiert wurde, während eine 20minütige Inkubation bei 56ºC, wenn überhaupt, wenig Wirkung auf die Aktivität des Inhibitors hatte, was impliziert, daß die für die Aktivität des Inhibitors verantwortliche Substanz proteinartig ist.
Der letzte Rezeptorbindungstesttyp untersuchte den Grad an Reversibilität der Inhibitorbindung. Das Protokoll war das gleiche wie für die prä-inkubierten Abschnitte des ersten Tests, außer daß der Inhibitor bei mehreren Verdünnungen zwei Stunden lang (anstelle von nur einer Stunde) bei 37 ºC prä-inkubiert wurde, wonach der überschüssige, nicht gebundene IL-1 Inhibitor aus der Hälfte der Zellen bei jeder Verdünnung entfernt wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV aufgezeigt: Tabelle IV Reversibilität der in vitro Bindung des IL-1 Inhibitors Verdünnung Behandlung CPM gebunden Prozentuale Hemmung* kein Inhibitor
* Bezogen auf eine identische Behandlung der Zellen mit 10 ug pro ml IL-1.
Die Ergebnisse, die auch in Figur 8 gezeigt werden, deuten an, daß der IL-1 Inhibitor von dem IL-1 Rezeptor so schnell wie IL-1 selbst dissoziiert, da es keinen Unterschied im Grad des Wettbewerbs macht, ob der Inhibitor im Wettbewerb mit dem markierten IL-1 entfernt oder beibehalten wird. Daher scheinen IL-1 und sein Inhibitor eine ähnliche Affinität zu dem IL-1 Rezeptor zu besitzen.

6.3 Aktivität in vivo

Es wurde gezeigt, daß der IL-1 Inhibitor aus dem hemmenden Aktivitätspeak aus der Ionenaustauschchromatographie des Kulturmediums aus M20-2 Zellen anti-inflammatorische Aktivität bei drei anerkannten Tests besitzt.

6.3.1. Hemmung der Fieberinduktion

Wie vorstehend beschrieben, wurde die Fähigkeit des IL-1 Inhibitors die Fieberinduktion zu hemmen bei Mäusen getestet, wobei die Ergebnisse als "mittlere Körpertemperatur ± Standardfehler (SE)" dargestellt wurde für jede Gruppe zweier Mäuse, die mit der gleichen Verbindung injiziert wurden. Der Unterschied in der Temperatur innerhalb jeder Gruppe über der Zeit wurde als ΔT Werte angegeben.
Die Körpertemperatur wurde nach wachsenden Zeitintervallen nach der gemeinsamen Injektion von 150 Einheiten IL-1 und 1 oder 2 Einheiten des Inhibitors gemessen, wobei Kontrollgruppen nur mit PBS oder menschlichem IL-1 injiziert wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle V gezeigt. Tabelle V Hemmung des IL-1 induzierten Fiebers durch begleitende Injection des IL-1 Inhibitors Zeit nach Injektion (Std.) Injektion PBS Menge IL-1 Inhibitor pro Maus Körpertemp. Hemmung IL-1 plus Inhibitor Einheiten
Δ T : Änderung der Körpertemperatur
Bei allen vier Experimenten wurde eine Stunde nach Injektion von IL-1 allein ein Maximum des Anstiegs der Körpertemperatur beobachtet, während eine vollständige Hemmung der Temperaturerhöhung zu allen vier Zeitpunkten und in allen vier Experimenten beobachtet wurde, wenn der IL-1 Inhibitor begleitend injiziert wurde.
Weiter wurde die Wirkung unterschiedlicher Mengen des Inhibitors auf die IL-1 Fieberinduktion durch Messung der Körpertemperatur zu verschiedenen Zeitpunkten nach der gemeinsamen Injektion von IL-1 und dem Inhibitor (Fig. 9) getestet. Ein allmähliches Ansteigen der Fieberhemmung mit steigenden Mengen Inhibitor wurde unabhängig von der Zeit beobachtet mit einem Bereich von ungefähr 50 % Hemmung, der durch 1 Einheit des Inhibitors erhalten wurde.
Schließlich wurde die Wirkung des Zeitintervalls zwischen der Injektion von 150 Einheiten IL-1 und 2 Einheiten des Inhibitors auf die Körpertemperatur 1.0 und 1.5 Stunden nach der IL-1 Injektion getestet (Fig. 10). Die Ergebnisse zeigten an, daß sich eine Fieberhemmung herausstellte, wenn der Inhibitor 2 bis 16 Stunden vor Injektion von IL-1 injiziert wurde mit einem Nach lassen der Hemmung, wenn der Inhibitor bis zu 24 Stunden vorher injiziert wurde. Demnach kehrt der Inhibitor die Fieberinduktion durch IL-1 um, sogar wenn er 24 Stunden vor IL-1 injiziert wurde.

6.3.2. Hemmung der Leukozytoseinduktion

Die Fähigkeit des IL-1 Inhibitors, die Induktion der Leukozytose durch IL-1 in Mäusen zu hemmen, wurde durch den Leukozytoseindex untersucht, der definiert wurde als die mittlere (± SE) Leukozytenzahl in einer Gruppe, der menschliches IL-1 allein oder in Verbindung mit dem IL-1 Inhibitor injiziert wurde, dividiert durch die mittlere (± SE) Zahl in einer Gruppe der nur PBS injiziert wurde (der Standardfehler für alle Werte lag zwischen 0.0350 und 0.0127).
Im allgemeinen wurde der Peakanstieg der Leukozytenzahl 2 bis 3 Stunden nach der Injektion von 150 bis 200 Einheiten IL-1 pro Maus beobachtet (Fig. 11). Die begleitende Injektion von 2 Einheiten Inhibitor verursachte immer eine Abnahme dieses IL-1 Effektes, wobei eine maximale Hemmung 2 bis 3 Stunden nach der Injektion erhalten wurde.
Wie man es für die Fieberinduktion gefunden hatte, wurde die Hemmung der Leukozytose auch beobachtet, wenn IL-I und der Inhibitor getrennt mit wechselnden Zeitintervallen injiziert wurde (Fig. 12). Der Inhibitor verminderte die durch IL-1 induzierte Leukozytose selbst wenn er 2 bis 24 Stunden vor IL-1 injiziert wurde, aber der Peak der hemmenden Wirkung bei 4 Stunden verkleinerte sich, wenn das Zeitintervall vergrößert wurde.

6.3.3. Hemmung der Induktion der lokalen Lymphknotenvergrößerung

Um die Fähigkeit des IL-1 Inhibitors zu testen, die Induktion der lokalen Lymphknotenvergrößerung durch verschiedene Agentien zu beeinflussen, wurde der Vergrößerungsindex durch das mittlere (± SE) Gewicht des rechten Lymphknotens der Maus (mit IL-1 allein oder in Verbindung mit dem Inhibitor injiziert) dividiert durch das mittlere (± SE) Gewicht des linken Lymphknotens, wobei nur PBS injiziert wurde, bestimmt. Tabelle VI Wirkung des IL-1 Inhibitors auf die lokale Lymphknotenvergrößerung Auslöser Menge pro Maus IL-1 Inhibitor (2 Einheiten) Vergrößerungsindex Prozentuale Hemmung Einheiten Maus Einheiten Human IL-1
Die Ergebnisse in Tabelle VI stellen die durch Mitogene, wie Con A und LPS, genauso wie menschliches IL-I und IL-1 der Maus induzierte optimale Lymphknotenvergrößerung dar. In allen diesen Fällen verursachte die begleitende Injektion von 2 Einheiten des IL-1 Inhibitors eine bedeutende Abnahme der Lymphknotenreaktion.
Der hemmende Effekt auf die Induktion der Lymphknotenvergrößerung durch IL-1 der Maus wurde auch getestet, wenn IL-1 und der Inhibitor getrennt mit wechselnden Zeitintervallen injiziert wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle VII aufgezeigt. Tabelle VII Wirkung des IL-1 Inhibitors auf die lokale Lymphknotenvergrößerung Zeitintervall zwischen IL-1 und Inhibitorinjektion Lymphknoten Gewicht (mg) rechts Lymphknoten Gewicht (mg) links Vergrößerungsindex Prozentuale Hemmung IL-1 (ohne Inhibitor) Tage vorher Stunden nacher
Die Injektion 1 Einheit des Inhibitors 2 Stunden, 1 Tag oder 2 Tage vor den 125 Einheiten IL-1 verursachte immer noch eine bedeutende Hemmung. Die Hemmung wurde erniedrigt, wenn die dazwischenliegende Zeit auf 3 Tage erhöht wurde und nach 4 Tagen war sie nur noch marginal. Eine bedeutende Hemmung wurde auch beobachtet, wenn der Inhibitor 2 Stunden nach IL-1 injiziert wurde, aber sie erniedrigte sich, wenn das Intervall auf 1 Tag erhöht wurde.

7. Hinterlegung von Mikroorganismen

Die folgende M20-2 Zellinie wurde am 4. April 1990 bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland hinterlegt und hat die aufgelistete Zugangsnummer erhalten: Zellinie Zugangsnummer

Claims

1. Protein mit einem Molekulargewicht von 52 ± 4 kD, isolierbar aus einer überstehenden Flüssigkeit der Zellinie M20-2, wobei das Protein durch einen pI von 4,1 ± 0,2 und eine Fähigkeit, IL-1 vermittelte Entzündungsreaktionen zu hemmen oder zu reduzieren, gekennzeichnet ist.

2. Protein nach Anspruch 1, das isolierbar ist aus Fraktionen der überstehenden Flüssigkeit, die aus der ersten Stufe der Reinigung durch Ionenaustausch-Chromatographie resultiert.

3. Protein nach Anspruch 2, das weiter gereinigt wird durch Ionenaustausch, Hochleistungs-Flüssigchromatographie

4. Protein nach Anspruch 1, welches isolierbar ist aus der überstehenden Flüssigkeit durch Ionenaustausch, Hochleistungs- Flüssigchromatographie -

5. Protein nach Anspruch 1, welches isolierbar ist aus der überstehenden Flüssigkeit durch isoelektrische Fokusierung.

6. Therapeutische Zusammensetzung, umfassend eine anti-inflammatorisch wirksame Menge des Proteins nach Anspruch 1, 2, 3, 4 oder 5, zusammen mit einem pharmazeutisch brauchbaren Träger.

7. Pharmazeutische Zusammensetzung zur Hemmung oder Reduzierung einer Entzündungsreaktion, welche umfaßt, einer Person, die solch eine Behandlung benötigt, eine wirksame Menge des Proteins nach Anspruch 1, 2, 3, 4 oder 5 zu verabreichen.

8. Zusammensetzung nach Anspruch 7, worin die Menge ungefähr 0,0001-1,0 ug pro kg Körpergewicht ist.

9. Ein im wesentlichen reines Protein, frei von größeren Verschmutzungen, gezeigt durch das Vorhandensein von einer Bande in der SDS-PAGE, wobei das Protein IL-1 hemmende Aktivität, ein Molekulargewicht von 52 ± 4 kD und einen isoelektrischen Punkt bei 4,1 ± 0,2 besitzt und aus einer überstehenden Flüssigkeit der Zellinie M20-2 isolierbar ist und aktive Fragmente davon.