DE69906064T2 - Glycoproteine mit lipidmobilisierenden eigenschaften und deren therapeutische verwendungen - Google Patents

Glycoproteine mit lipidmobilisierenden eigenschaften und deren therapeutische verwendungen Download PDF

Info

Publication number
DE69906064T2
DE69906064T2 DE69906064T DE69906064T DE69906064T2 DE 69906064 T2 DE69906064 T2 DE 69906064T2 DE 69906064 T DE69906064 T DE 69906064T DE 69906064 T DE69906064 T DE 69906064T DE 69906064 T2 DE69906064 T2 DE 69906064T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
lipid
glycoprotein
lipid mobilizing
mobilizing agent
therapy
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
DE69906064T
Other languages
English (en)
Other versions
DE69906064D1 (de
Inventor
Michael John Claverdon Tisdale
Penio Todorov Abingdon Todorov
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Aston University
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Publication of DE69906064D1 publication Critical patent/DE69906064D1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE69906064T2 publication Critical patent/DE69906064T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/473—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used alpha-Glycoproteins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57488—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds identifable in body fluids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/54—F(ab')2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4728—Details alpha-Glycoproteins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Child & Adolescent Psychology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Obesity (AREA)

Description

  • Diese Erfindung betrifft das Gebiet der Biochemie und der Medizin und insbesondere therapeutische Anwendungen bestimmter Glycoproteine, einschließlich deren Fragmente, die in biologischen Systemen lipidmobilisierende Eigenschaften aufweisen. Insbesondere umfasst ein Aspekt der Erfindung die Verwendung solcher Glycoproteine und deren Fragmente zur therapeutischen Behandlung von Säugern zum Erreichen einer Gewichtsreduktion oder zur Kontrolle von Fettsucht. Die Erfindung betrifft auch die Isolierung und Reinigung solcher Glycoproteine aus biologischem Material. Die Erfindung betrifft auch die Verwendung solcher Glycoproteine zur Entwicklung diagnostischer Mittel und Inhibitoren zur therapeutischen Verwendung.
  • Aus Gründen der Zweckmäßigkeit sind Literaturveröffentlichungen, welche die nachstehende Beschreibung betreffen oder in dieser genannt werden, nummeriert und in der beigefügten Bibliographie angegeben.
  • Die Erfindung hat ihren Ursprung in Forschungen, die im Zusammenhang mit Krebs-Kachexie durchgeführt worden sind. Die Krebs-Kachexie ist bei vielen menschlichen Krebspatienten ein häufig vorkommender Zustand, insbesondere bei Patienten mit Magen-Darm-Krebs oder Lungenkrebs, und durch eine progressive Schwäche, einen dramatischen Gewichtsverlust und Auszehrung gekennzeichnet, die sich aus dem Verlust sowohl von Fettgewebe als auch von Skelettmuskelmasse ergeben. Frühere Untersuchungen haben gezeigt, dass der charakteristische Verlust an Gewicht und von Körpergewebe (Fett und Muskeln) gewöhnlich nicht einfach durch eine Verminderung der Nahrungs- und Wasseraufnahme erklärt werden kann, und der Effekt wurde auf die Erzeugung katabolischer Faktoren durch den Tumor zurückgeführt, die in das Kreislaufsystem eindringen. Es sind sowohl lipolytische als auch proteolytische Aktivitäten beteiligt und es gab zahlreiche Versuche, die Substanzen, welche diese Aktivitäten erzeugen, zu isolieren und zu reinigen, insbesondere lipidmobilisierende Faktoren, die für den Katabolismus von Fettgewebe und die Verminderung von Körperfett verantwortlich sind.
  • Beispielsweise ist in der GB-PS 2217330A die Isolierung und Reinigung lipolytischer Faktoren, die von einem mit MAC16 bezeichneten Kachexie-induzierenden Maustumor und auch vom Urin kachektischer Krebspatienten stammen, mit chromatographischen Verfahren beschrieben, die mindestens eine Stufe der Gelfiltrationsausschlusschromatographie umfassen. Dabei wurden Ergebnisse erhalten, die nahe legen, dass mehrere verwandte Molekül spezies vorliegen, die ein scheinbares Molekulargewicht von weniger als 5000 Dalton aufweisen und für den lipolytischen Effekt verantwortlich sind. Schwerwiegende Probleme ergaben sich jedoch beim Versuch, die aktive Molekülspezies in einem Maß zu reinigen, das für die Verwendung in therapeutischen Anwendungen erforderlich ist, und bei der vollständigen Charakterisierung des aktiven Materials bezüglich seines chemischen Aufbaus. In neuerer Zeit (1995) wurde ein Aufsatz von T.M. McDevitt et al. mit dem Titel "Purification and characterisation of a lipid-mobilising factor associated with cachexia-inducing tumours in mice and humans" in Cancer Research 55, 1458-1463 (Literatur 1) veröffentlicht, in dem berichtet wurde, dass ein Material mit einer scheinbaren relativen Molekülmasse Mr von 24 kDa sowohl aus dem vorstehend genannten Kachexie-induzierenden Maustumor MAC16 als auch aus dem Urin von Patienten mit Krebs-Kachexie unter Verwendung eines Isolierungs- und Reinigungsverfahrens isoliert worden ist, das eine Kombination aus Ionenaustausch-, Größenausschluss- und Hydrophobchromatographie umfasst, und es wurde die Meinung geäußert, dass dieses Material eine gereinigte Form eines Krebs-Kachexie-Lipidmobilisierungsfaktors sei. Anschließend wurde jedoch gefunden, dass dieses 24 kDa-Material tatsächlich ein Proteoglykan war, dass dann, wenn es bis zur Homogenität gereinigt wurde, in Mäusen, die keinen Tumor aufwiesen, einen kachektischen Zustand hervorrief, und zwar durch Induktion eines Katabolismus von Skelettmuskelprotein, wie es von P. Todorov et al. 1996, Nature 379, 739-742 (Literatur 2) berichtet worden ist. Folglich war dieses 24 kDa-Material ein proteolytischer Faktor und es scheint, als ob jegliche lipolytische Aktivität auf eine Verunreinigung durch gemeinsame Aufreinigung mit einem getrennten und individuellen lipolytischen Faktor zurückzuführen ist.
  • Die vorliegende Erfindung beruht auf der anschließenden Erkenntnis, dass der wahre lipolytische Faktor oder Lipidmobilisierungsfaktor (LMF), der von dem Kachexie-induzierenden Maustumor MAC16 erzeugt wird und auch in dem Urin von Patienten mit Krebs-Kachexie vorliegt, tatsächlich ein Glycoprotein ist, das ein scheinbares relatives Molekulargewicht von etwa 43 kDa aufweist, das aufgrund seiner elektrophoretischen Mobilität bestimmt worden ist, wenn es einer 15% SDS-PAGE-Elektrophorese unterworfen wird, und das mit einem Glycoprotein identisch ist oder einem Glycoprotein sehr ähnlich ist und Eigenschaften mit diesem gemeinsam hat, das als Zn-α2-Glycoprotein bekannt ist. Zn-α2-Glycoprotein ist bekannt, seit es in menschlichem Blutplasma gefunden worden ist und es wurde zuerst in einem Aufsatz von Burgi und Schmid mit dem Titel "Preparation and properties of Zn-α2-glycoprotein of normal human plasma" (1961), J. Biol. Chem. 236, 1066-1074 (Literatur 3) darüber berichtet. Obwohl die Eigenschaften und die physiologische Funktion dieses Materials noch nicht vollständig bestimmt worden sind, wurde das Material sehr gut gereinigt und bezüglich der chemischen und physikalischen Eigenschaften charakterisiert. Darüber hinaus wurde die vollständige Aminosäuresequenz in einem Aufsatz mit dem Titel "Complete amino acid sequence of human plasma Zn-α2-glycoprotein and its homology to histocompatibility antigens" von T. Araki et al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 679-683 (Literatur 4) beschrieben, wobei gezeigt wurde, dass das Glycoprotein aus einer einzelnen Polypeptidkette mit 276 Aminosäureresten mit drei getrennten Domänenstrukturen (A, B und C) besteht und zwei Disulfidbindungen zusammen mit N-verbundenen Glycanen mit drei Glycosylierungsstellen umfasst. Diese Aminosäuresequenz der Polypeptidkomponente ist in 1 der beigefügten Zeichnungen dargestellt. Obwohl einige nachfolgende Veröffentlichungen gezeigt haben, dass die Zusammensetzung von menschlichem Zn-α2-Glycoprotein in gewisser Weise variieren kann, wenn es aus unterschiedlichen Körperfluiden oder -geweben isoliert wird, weisen alle Zubereitungen dieses Materials im Wesentlichen die gleichen immunologischen Charakteristika auf. Wie es von H. Ueyama et al. (1991) in "Cloning and nucleotide sequence of a human Zn-α2-glycoprotein cDNA and chromosomal assignment of its gene", Biochem. Biophys. Res. Commun. 177, 696-703 (Literatur 5) berichtet worden ist, wurde die cDNA des Zn-α2-Glycoproteins aus Bibliotheken von menschlicher Leber und menschlicher Prostatadrüsen isoliert, und es wurde auch das Gen isoliert, wie es von H. Ueyama et al. (1993) in "Molecular cloning and chromosomal assignment of the gene for human Zn-α2-glycoprotein", Biochemistry 32, 12968-12976 (Literatur 6) berichtet wird. N. Ueyama et al. haben in J. Biochem. (1994) 116, 677-681 (Literatur 7) auch Studien über Zn-α2-Glycoprotein-cDNA's aus Ratten- und Mäuseleber beschrieben, die zusammen mit dem von den entsprechenden mRNA's exprimierten Glycoprotein sequenziert und mit dem menschlichen Material verglichen worden sind. Obwohl Detailunterschiede gefunden worden sind, wie es bei unterschiedlichen Arten erwartet wird, wurde ein hoher Grad an Aminosäuresequenzhomologie mit einer über 50%igen Identität mit dem menschlichen Gegenstück gefunden (über 70% Identität mit der Domäne B des Glycoproteins). Es wurden also gemeinsame immunologische Eigenschaften zwischen den Zn-α2-Glycoproteinen vom Menschen, von der Ratte und der Maus gefunden.
  • Ein Bezug zur biochemischen Charakterisierung und Kristallisation von Zn-α2-Glycoprotein findet sich auch in Studien, die von Luis M. Sanchez et al. in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 94, Seiten 4626-4630 (1997) berichtet werden, jedoch enthält diese Veröffentlichung keine Beschreibung lipolytischer oder lipidmobilisierender Eigenschaften oder einen Vorschlag zur Verwendung dieses Materials als therapeutisches Mittel.
  • Die Herstellung von gereinigtem Zn-α2-Glycoprotein aus frischem menschlichen Plasma mit einem Verfahren, das sechs Schritte der säulenchromatographischen Trennung umfasst, wurde von Ohkubo et al. in einem Aufsatz mit dem Titel "Purification and characterisation of human plasma Zn-α2-gycoprotein" (1988), Prep. Biochem., 18, 413-430 (Literatur 8) beschrieben, dessen Inhalt unter Bezugnahme in diese Beschreibung einbezogen wird.
  • Der im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung isolierte und gereinigte 43 kDa Glycoprotein-lipolytische Faktor oder -Lipidmobilisierungsfaktors (LMF) wurde unter Verwendung eines verbesserten Isolierungs- und Reinigungsverfahrens sowohl von dem Kachexieinduzierenden Maustumor MAC16 als auch aus dem Urin von Patienten mit Krebs-Kachexie im Wesentlichen frei von jeglichem proteolytischen Faktor erhalten. Auch dieses Verfahren umfasst eine Kombination von Ionenaustausch-, Ausschluss- und Hydrophobchromatographie-Trennungen, jedoch unterscheidet sich die Selektivität der Trennungen von der Selektivität chromatographischer Trennungen, die bisher verwendet wurden, wenn der kachektische 24 kDa-Faktor isoliert wurde, wobei ein Produkt erhalten wird, das dann, wenn es einer 15% SDS-PAGE-Elektrophorese unterworfen wird, eine einzelne Bande mit einem scheinbaren relativen Molekulargewicht von etwa 43 kDa zeigt. Wie es bereits erwähnt worden ist, wurde gefunden, dass es sich bei dem so isolierten aktiven lipolytischen Material oder Lipidmobilisierungsfaktor (LMF) sowohl von dem MAC16-Tumor als auch aus dem Urin von Krebspatienten um ein Glycoprotein mit Charakteristika handelt, die es mit den Charakteristika eines von menschlichem Plasma isolierten Zn-α2-Glycoproteins gemeinsam hat oder die mit diesen identisch sind. Demgemäß wurde gefolgert, das es sich sowohl bei dem menschlichen LMF als auch bei dem Maus-LMF um Zn-α2-Glycoproteine oder sehr nahe Analoga davon handelt, die einen wesentlichen Grad an Sequenzhomologie und im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität aufweisen, insbesondere bezüglich der lipolytischen Aktivität im Hinblick auf Adipozyten. Sie können daher als Glycoproteine des Zn-α2-Glycoprotein-Typs bezeichnet werden.
  • Insbesondere wurde gefunden, dass
    • a) die lipidmobilisierenden Faktoren vom Menschen und von der Maus, die aus den vorstehend genannten Quellen isoliert worden sind, mit authentischem menschlichen Plasma-Zn-α2-Glycoprotein auf 15% SDS-PAGE und auf 10% nicht-denaturierenden Gelen zusammen wandern;
    • b) die isolierten Lipidmobilisierungsfaktoren sowohl vom Menschen als auch von der Maus bezüglich Kohlehydraten auf die gleiche Weise wie authentisches Zn-α2-Glycoprotein stark gefärbt wurden;
    • c) ein polyklonaler Antikörper gegen menschliches Plasma-Zn-α2-Glycoprotein die lipidmobilisierende Aktivität von menschlichem Material detektieren und diese Aktivität in vitro neutralisieren konnte;
    • d) authentisches menschliches Plasma-Zn-α2-Glycoprotein auch eine in vitro lipidmobilisierende Aktivität zeigt und auch die Adenylatcyclaseaktivität stimuliert;
    • e) die Lipidmobilisierungsfaktoren vom Menschen und von der Maus und authentisches menschliches Zn-α2-Glycoprotein jeweils das gleiche Chymotrypsin-Abbaumuster zeigen und ähnliche Fragmente und einen ähnlichen Aktivitätsverlust erzeugen;
    • f) der isolierte menschliche Lipidmobilisierungsfaktor bezüglich der Aminosäuresequenz mit authentischem menschlichen Plasma-Zn-α2-Glycoprotein homolog ist, wobei von beiden gezeigt worden ist, dass sie die Erzeugung von Adenylatcyclase in Maus-Adipocytenplasmamembranen in einem GTP-abhängigen Prozess mit einer maximalen Stimulation bei 0,1 μM GTP stimulieren.
  • Der Ausdruck "authentisches Zn-α2-Glycoprotein" wird hier verwendet, um gereinigtes Zn-α2-Glycoprotein zu bezeichnen, wie es von frischem menschlichen Plasma im Wesentlichen gemäß dem von Ohkubo et al. (Literatur 8) beschriebenen Verfahren hergestellt wird. Es sollte beachtet werden, dass in manchen Fällen Fragmente des isolierten Lipidmobilisierungsfaktor oder des authentischen Zn-α2-Glycoproteins ohne Verlust der lipolytischen oder lipidmobilisierenden Aktivität erzeugt werden können, und dass verschiedene Additionen, Deletionen oder Substitutionen durchgeführt werden können, die diese Aktivität auch nicht beeinflussen. Da Aspekte der vorliegenden Erfindung therapeutische Anwendungen betreffen, ist es jedoch wichtig, dass im Allgemeinen ein hoher Reinheitsgrad erreicht wird und insbesondere sollte das Material frei von proteolytischer Aktivität sein.
  • Gemäß eines ersten Aspekts der vorliegenden Erfindung wird ein biologisch aktives Lipidmobilisierungsmittel zur Verwendung in der Therapie bereitgestellt, das eine durch Gelausschlusschromatographie bestimmte scheinbare Molmasse Mr von mehr als 6,0 kDa aufweist und in Säuger-Adipozyten eine Lipolyse induzieren kann, dadurch gekennzeichnet, dass das Lipidmobilisierungsmittel ein glycosyliertes Polypeptid ist, bei dem der Polypeptidrest aus einer der nachstehenden Gruppen ausgewählt ist:
    • (a) einem Polypeptid, das die Aminosäuresequenz eines Zn-a2-Glycoproteins aufweist;
    • (b) einem Polypeptid, das bezüglich (a) einen Mangel an einer Aminosäure oder mehreren Aminosäuren aufweist, welche die Lipidmobilisierung oder die lipolytische Aktivität nicht signifikant beeinflusst/beeinflussen;
    • (c) einem Polypeptid, bei dem bezüglich (a) eine Aminosäure oder mehrere Aminosäuren durch eine andere Aminosäure oder andere Aminosäuren ersetzt ist/sind, welche die Lipidmobilisierung oder die lipolytische Aktivität nicht signifikant beeinfluss/beeinflussen;
    • (d) einem Polypeptid, bei dem bezüglich (a) eine Mehrzahl zusätzlicher Aminosäuren einbezogen ist, welche die biologische lipolytische Aktivität nicht stören.
  • Die Erfindung betrifft auch ein biologisch aktives Lipidmobilisierungsmittel zur Verwendung in der Therapie, das im Wesentlichen aus einem Glycoprotein besteht, das eine durch Gelausschlusschromatographie bestimmte scheinbare relative Molmasse Mr von mehr als 6 kDa aufweist, wobei das Glycoprotein dadurch gekennzeichnet ist, dass es eine Polypeptid-Aminosäuresequenz aufweist, die mit der Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 1) von menschlichem Plasma-Zn-α2-Glycoprotein identisch ist.
  • In mindestens einigen erfindungsgemäßen Ausführungsformen kann das Lipidmobilisierungsmittel ferner durch eine scheinbare relative Molmasse Mr von etwa 43 kDa gekennzeichnet sein, die durch seine elektrophoretische Mobilität bestimmt wird, wenn es einer 15 SDS-PAGE-Elektrophorese unterworfen wird.
  • Folglich ist erfindungsgemäß ein gereinigtes biologisch aktives Lipidmobilisierungsmittel zur Verwendung in der Therapie dadurch gekennzeichnet, dass es aus einem glycosylierten Polypeptid besteht, das eine einzelne Hauptkomponente mit einer durch dessen elektrophoretische Mobilität in einer 15% SDS-PAGE-Elektrophorese bestimmten scheinbaren relativen Molmasse Mr von etwa 43 kDa umfasst und bezüglich der Aminosäuresequenz eine Homologie mit der Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 1) von menschlichem Plasma-Zn-α2-Glycoprotein aufweist. Dieses Lipidmobilisierungsmittel kann in einigen Ausführungsformen ferner dadurch gekennzeichnet sein, dass es durch ein Verfahren erhältlich ist, das aufeinanderfolgende Schritte des Unterwerfens von biologischem Material einer Ionenaustauschchromatographie, einer Ausschlusschromatographie und anschließend einer Hydrophobwechselwirkungschromatographie umfasst, wobei das biologische Material ein Körperfluid von einem Krebs-Kachexiepatienten oder ein Extrakt einer Kultur einer MAC16-Tumorzelllinie ist, die im Namen von Michael John Tisdale mit den Maßgaben des Budapester Vertrags in der European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC) unter der Zugangsnummer 89030816 im Public Health Laboratory Service Centre for Applied Microbiology and Research, Portondown, Salisbury, Wiltshire, Vereinigtes Königreich, hinterlegt ist.
  • In mindestens einigen Ausführungsformen kann das erfindungsgemäße Lipidmobilisierungsmittel ferner durch eines oder mehrere der nachstehenden Merkmale gekennzeichnet sein:
    • (a) Wenn es einem Abbau mit Chymotrypsin unterworfen wird, werden dessen lipidmobilisierende Eigenschaften zerstört.
    • (b) Es weist bei der Inkubation mit Mausadipozyten-Plasmamembranen ein Potenzial zur invitro-Stimulierung von Adenylatcyclase-Aktivität in einem Guanintriphosphat-abhängigen (GTP-abhängigen) Prozess auf.
    • (c) Es weist die gleichen immunologischen Eigenschaften auf wie menschliches Zn-α2-Glycoprotein.
    • (d) Es ist ein aktives lipidmobilisierendes Fragment des vorstehend genannten 43 kDa-Glycoproteins oder ein glycosyliertes Polypeptid, das durch Abbau des vorstehend genannten 43 kDa-Glycoproteins mit Trypsin erzeugt wird.
    • (e) Es ist frei von proteolytischer Aktivität.
    • (f) Die Polypeptidkette der Polypeptidkomponente weist eine N-Endgruppe auf, die durch einen Pyroglutamatrest blockiert ist.
    • (g) Die Lipidmobilisierungsaktivität wird durch Periodatbehandlung zerstört
  • Gemäß eines zweiten Aspekts der vorliegenden Erfindung wird ein biologisch aktives Lipidmobilisierungsmittel zur Verwendung in der Therapie bereitgestellt, das eine Lipolyse in Säugeradipozyten induzieren kann, dadurch gekennzeichnet, dass es eine durch Gelausschlusschromatographie bestimmte scheinbare Molmasse Mr von mehr als 6,0 kDa aufweist, und dass es ein Fragment eines Glycoproteins oder eines glycosyliertes Polypeptids ist, das eine Komponente des vorstehend definierten Lipidmobilisierungsmittels ist, das durch Abbau des Lipidmobilisierungsmittels mit Trypsin erzeugt wird.
  • Die Erfindung stellt auch pharmazeutische Zusammensetzungen zur Verwendung bei der Behandlung von Säugern bereit, z. B. zur Reduzierung ihres Gewichts oder zu Kontrolle von Fettsucht, wobei die Zusammensetzungen als Wirkstoff eine wirksame therapeutische Menge eines hier definierten Lipidmobilisierungsmittels zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger, Verdünnungsmittel oder Vehikel umfassen.
  • Wenn die erfindungsgemäßen Lipidmobilisierungsmittel zur Behandlung eines Säugers zum Herbeiführen einer Gewichtsreduktion oder einer Verminderung der Fettsucht verwendet werden, dann werden diese durch ein Glycoprotein, das mit einem menschlichen Zn-α2-Glycoprotein identisch oder dazu homolog ist, oder ein wirksames Fragment davon bereitgestellt, das im Wesentlichen frei von jeglicher proteolytischen Aktivität ist.
  • Das lipidmobilisierende Glycoprotein oder das Zn-α2-Glycoprotein kann als injizierbare Formulierung hergestellt werden, die einen Träger in Form eines pharmazeutisch verträglichen Injektionsvehikels umfasst.
  • Die Erfindung umfasst auch die Verwendung eines hier definierten Lipidmobilisierungsmittels zur Herstellung eines Medikaments, das in der Humanmedizin zur Behandlung von Übergewicht oder Fettsucht und/oder zur Stimulierung der Muskelentwicklung geeignet ist.
  • Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Isolierung und Reinigung eines lipolytisch aktiven Glycoproteins oder eines Lipidmobilisierungsmittels bereit, das die Eigenschaften und Charakteristika eines Zn-α2-Glycoproteins aufweist, d.h. eines Glycoproteins des Zn-α2-Glycoprotein-Typs, wobei das Verfahren das Unterwerten eines Extrakts eines Kachexieinduzierenden Tumors oder einer Kultur einer Kachexie-induzierenden Tumorzelllinie oder einer Probe von Urin oder eines anderen Körperfluids eines Säugers, der einen Kachexieinduzierenden Tumor aufweist, einer Kombination aus einer Ionenaustauschchromatographie, einer Gelfiltrations- oder Größenausschlusschromatographie und einer Hydrophobchromatographie umfasst, wobei ein einzelnes Produkt oder eine einzelne molekulare Spezies mit einem bzw. einer durch 15% SDS-PAGE-Elektrophorese bestimmten scheinbaren Molekulargewicht bzw. relativen Molmasse von 43 kDa, das/die im Wesentlichen frei von proteolytischer Aktivität ist/sind, erhalten wird.
  • Das Glycoprotein oder dessen Fragment, das in diesen therapeutischen Anwendungen verwendet wird und das möglicherweise auf der bekannten cDNA-Sequenz des Zn-α2-Glycoproteins beruht, die z. B. in der Literatur 7 veröffentlicht worden ist, kann ferner durch bekannte rekombinante DNA-Techniken erzeugt werden Der erfindungsgemäße gereinigte Lipidmobilisierungsfaktor oder das erfindungsgemäße Znα2-Glycoprotein kann auch zur Herstellung von monoklonalen oder polyklonalen, vorzugsweise jedoch monoklonalen Antikörpern verwendet werden, die dann wie vorstehend erwähnt als diagnostische Nachweismittel eingesetzt werden können, oder die in der Therapie als Inhibitoren oder Antagonisten des bzw. der lipolytischen Mittels) verwendet werden können, das bzw. die in Krebspatienten Kachexie verursacht bzw. verursachen.
  • Die genannten Antikörper können z. B. vollständige Antikörper oder Fragmente davon sein. Spezielle Antikörperfragmente können diejenigen umfassen, die durch proteolytische Spaltung vollständiger Antikörper erhalten werden, wie z. B. F(ab')2-, Fab'- oder Fab-Fragmente, oder Fragmente, die durch rekombinante DNA-Techniken erhalten werden, wie z. B. Fv-Fragmente (wie es in der internationalen Patentanmeldung WO 89/02465 beschrieben ist). In einem weiteren Aspekt der Erfindung ist die Verwendung eines oder mehrerer dieser Antikörper zur Herstellung einer medizinischen Zubereitung oder eines Medikaments zur Behandlung von Kachexie vorgesehen, die mit Krebs und/oder Tumoren zusammenhängt.
  • Der Antikörper oder das Antikörperfragment kann im Allgemeinen einer beliebigen Immunglobulinklasse angehören. Folglich kann es sich z. B. um einen Immunglobulin-M-Antikörper (IgM-Antikörper) oder insbesondere um einen Immunglobulin-G-Antikörper (IgG-Antikörper) handeln. Der Antikörper oder das Fragment kann von einem Tier, wie z. B. einem Säuger, und beispielsweise von einer Maus, einer Ratte oder einem Menschen stammen. Es kann sich um einen natürlichen Antikörper oder um ein Fragment davon oder gegebenenfalls um einen rekombinanten Antikörper oder ein rekombinantes Antikörperfragment handeln, d.h. um einen Antikörper oder ein Antikörperfragment, der bzw. das unter Verwendung rekombinanter DNA-Techniken erzeugt worden ist.
  • Spezielle rekombinante Antikörper oder Antikörperfragmente umfassen (1) diejenigen, die eine Antigen-Bindungsstelle aufweisen, bei der mindestens ein Teil von einem anderen Antikörper abgeleitet ist, z. B. diejenigen, bei denen die hypervariablen oder komplementären determinativen Regionen eines Antikörpers in die variablen Gerüstregionen eines zweiten, anderen Antikörpers gepfropft worden sind (wie es im Europäischen Patent Nr. 239400 beschrieben ist); (2) rekombinante Antikörper oder Fragmente, bei denen nicht-Fv-Sequenzen durch nicht-Fv-Sequenzen anderer unterschiedlicher Antikörper ersetzt worden sind (wie es in den Europäischen Patenten Nr. 171496, 172494 und 194276 beschrieben ist); oder (3) rekombinante Antikörper oder Fragmente, die im Wesentlichen die Struktur eines natürlichen Immunglobulins aufweisen, bei denen jedoch die Gelenkregion bezüglich eines natürlichen Immunglobulins eine unterschiedliche Anzahl von Cysteinresten aufweist, oder bei denen sich ein oder mehrere Cysteinrest(e) in einer Oberflächentasche des rekombinanten Antikörpers oder Fragments anstelle eines anderen Aminosäurerests befindet, der im natürlichen Immunglobulin vorliegt (wie es in den internationalen Patentanmeldungen WO 89/01974 bzw. WO 89/01782 beschrieben ist).
  • Wie es vorstehend erläutert worden ist, kann der Antikörper oder das Antikörperfragment polyklonal sein. Vorzugsweise ist der Antikörper oder das Antikörperfragment jedoch monoklonal. Der Antikörper oder das Antikörperfragment kann für das erfindungsgemäße lipolytische Material oder das erfindungsgemäße Zn-α2-Glycoprotein polyspezifisch sein. Vorzugsweise ist der Antikörper oder das Antikörperfragment dafür jedoch monospezifisch.
  • Vollständige Antikörper können unter Verwendung bekannter immunologischer Techniken hergestellt werden, bei denen das gereinigte aktive lipolytische Material oder das Zn-α2-Glycoprotein von einer beliebigen Quelle als Antigen verwendet wird. Folglich kann einem beliebigen geeigneten Wirt das lipolytische Material injiziert und das Serum gesammelt werden, um den gewünschten polyklonalen Antikörper nach einer geeigneten Reinigung und/oder Konzentrierung (z. B. durch Affinitätschromatographie unter Verwendung eines immobilisierten lipolytischen Materials als Affinitätsmedium) zu erhalten. Alternativ können Splenozyten oder Lymphozyten von dem Wirt, in den injiziert wurde, gewonnen und unbegrenzt vermehrt werden, z. B. unter Verwendung des Verfahrens von Kohlen et al. (1976), Eur. J. Immuno., 6, 511 (Literatur 9), wobei die resultierenden Zellen in an sich bekannter Weise segregiert werden, um eine einzelne genetische Linie zu erhalten, die monoklonale Antikörper erzeugt.
  • Wenn das lipolytische Material in den vorstehend genannten Verfahren eine Größe aufweist, die im Wirt keine geeignete Immunantwort auslöst, obwohl es antigenisch sein und an spezifische Antikörper binden kann, kann es bevorzugt sein, das Material kovalent an ein großes Trägermolekül zu binden, das selbst immunogen ist, und die resultierende Konjugatverbindung als Antigen zu verwenden, und zwar erneut gemäß der gängigen Praxis [vgl. z. B. D.M. Weir in "Handbook of Experimental Immunology", 3, 2. Auflage, Seiten A2.10-A2.11, Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1973 (Literatur 10) und M.Z. Atassi und A.F.S.A. Habeeb in "Immuno-chemistry of Proteins" (M.Z. Atassi, Hrsg.), 2, Seiten 177-264, Plenum, New York, 1977 (Literatur 11)].
  • Antikörperfragmente können mit herkömmlichen Techniken hergestellt werden, z. B. durch enzymatischen Abbau beispielsweise mit Pepsin [Lanoyi und Nisonoff (1983), J. Immunol. Meth. 56, 235 (Literatur 12)]. Wenn die Erzeugung erfindungsgemäßer rekombinanter Anti körper erwünscht ist, können diese z. B. unter Verwendung der in den vorstehend genannten Patentbeschreibungen beschriebenen allgemeinen Verfahren hergestellt werden.
  • Das erfindungsgemäße Lipidmobilisierungsmittel kann auch zum Screenen und Identifizieren und/oder zur Durchführung von Untersuchungen möglicher Mittel zum Inhibieren der lipolytischen Aktivität verwendet werden, die ein Potenzial als anti-kachektische therapeutische Mittel oder therapeutische Anti-Tumormittel aufweisen. Dieses Screenen kann durch Zugeben von Proben möglicher Antagonisten oder Inhibitoren der Aktivität des Lipidmobilisierungsmittels zu Zubereitungen des Lipidmobilisierungsmittels und anschließender Inkubation in vitro mit einer Zubereitung von Adipozyten und Testen zur Bestimmung des Grads der lipolytischen Aktivität bezüglich der einer Kontrollprobe durchgeführt werden.
  • Die nachstehend angegebenen Beispiele veranschaulichen zumindest einige Aspekte der Erfindung und deren Entwicklung detaillierter. Zunächst erfolgt jedoch eine Zusammenfassung einiger Materialien, Verfahren und Techniken, die bei der Entwicklung der Erfindung und in den veranschaulichenden Beispielen allgemein verwendet worden sind, falls nichts anderes angegeben ist.
  • Tiere:
  • Reinstämmige NMRI- und ob/ob-Mäuse wurden aus im Hause vorhandenen bestehenden Kolonien gezüchtet. Männliche BKW-Mäuse (40 bis 50 g) wurden von Banting and Kingman, Hull, Vereinigtes Königreich, erworben. Diesen Tieren wurden mit einem Trokar Fragmente des MAC16-Tumors in die Flanken transplantiert, wie es von S.A. Beck et al. (1987), "Production of lipolytic and proteolytic factors by a murine tumour-producing cachexia in the host", Cancer Res. 47, 5919-5923 (Literatur 14) beschrieben worden ist. Die soliden Tumore wurden aus den Mäusen entnommen, als der Gewichtsverlust 25% erreicht hatte.
  • Personen:
  • Urin wurde von Patienten mit nicht reserzierbarem Bauchspeicheldrüsenkrebs mit einem vorhandenen Gewichtsverlust zwischen 1,3 und 10 kg/Monat gesammelt. Diese Patienten erhielten zum Zeitpunkt der Urinsammlung keine Therapie. Die Urinproben wurden in Abwesenheit von Konservierungsmitteln vor der Reinigung bei –20°C eingefroren.
  • Chromatographievorrichtung und -materialien:
  • SephadexTM Mono Q HR 5/5-Anionenaustauscherharz-, SuperoseTM 12H 10/30-Gelausschluss- und ResourceTM Iso-Hydrophobchromatographiesäulen wurden von Pharmacia Biotech, St. Albans, Vereinigtes Königreich, erworben. Eine AquaporeTM AX-300 DEAE-Cellulosesäule wurde von Applied Biosystems, Kalifornien, geliefert. RainbowTM-Proteinmolekulargewichtsmarker, ein ECL-Western-Blottingsystem und eine HyperfilmTM-ECL-Autoradiographiefilm stammten von Nycomed Amersham Plc, Vereinigtes Königreich.
  • Andere Materialien:
  • Andere Materialien umfassten ein DIG-Glycan-Nachweiskit von Boehringer Mannheim GmbH, Deutschland, ein Protein-A-Peroxidasekonjugat von Sigma, Dorset, Vereinigtes Königreich, Nitrocellulosemembranen von Hoefer Scientific Instruments, Kalifornien und Amicon-Filter (YM10) von Amicon Ltd., Stonehouse, Gloucestershire, Vereinigtes Königreich. Es wurden auch "Mini-Message Maker" und Spot-on-Kits von Rand D Systems, Abingdon, Vereinigtes Königreich, und SuperscriptTM TH11 RT reverse Transkriptase von Gibco BRL, Paisley, Schottland, verwendet. Oligonucleotide wurden von Oswell, Southampton, Vereinigtes Königreich, synthetisiert.
  • DEAE-Cellulose-Säulenchromatographie:
  • In einem typischen Beispiel für die Verwendung dieser Technik wird ein Homogenisat, das aktiven Lipidmobilisierungsfaktor (LMF) enthält, zentrifugiert und der Überstand wird mittels Anionenaustauschchromatographie unter Verwendung einer DEAE-Cellulosesäule und Eluieren unter einem Salzgradienten fraktioniert. Die DEAE-Cellulosesäule wird zuerst mit einer Pufferlösung bei dem erforderlichen pH-Wert äquilibriert, bevor eine Probe des zu fraktionierenden Materials aufgebracht wird. Danach wird das Material unter Verwendung eines linearen Salzgradienten wie z. B. 0 bis 0,2 M NaCl in dem gleichen Puffer von der Säule eluiert. Der Abfluss von der Säule wird in Fraktionen mit kleinem Volumen gesammelt, wie z. B. 5 ml-Fraktionen, und die lipolytische Aktivität jeder Fraktion wird mit der nachstehend beschriebenen Lipolyse-Testtechnik gemessen.
  • Die Verwendung einer DEAE-Cellulosesäule mit Elution unter einem Salzgradienten ist ein Verfahren, das zumindest potenziell als vorläufige Trennstufe geeignet ist. Sie kann jedoch zum Erhalten einer weiteren Fraktionierung nach einer Stufe der Gelfiltrationsausschlusschromatographie und vor einer letzten oder späteren Reinigungsstufe mit einer Hydrophob wechselwirkungschromatographie besonders geeignet sein. Wie es nachstehend beschrieben wird, kann in einer nachfolgenden Stufe oder in nachfolgenden Stufen die letztgenannte Chromatographie unter Verwendung ausgewählter Hydrophobchromatographiesäulen wie z. B. ResourceTM Iso-Säulen in Verbindung mit Hochleistungsflüssigkeitschromatographieverfahren (NPLC-Verfahren) durchgeführt werden.
  • Serummetabolitbestimmungen:
  • Unveresterte Fettsäuren (NEFA) wurden unter Verwendung eines Wako-ASC-ACOD-Kits (Wako Chemical GmbH, Neuss, Deutschland) bestimmt. Triglyceride wurden unter Verwendung eines Triglyceridkits (Sigma Chemical Co., Poole, Vereinigtes Königreich) und 3-Hydroxybutyrat mit einem quantitativen Enzymbestimmungskit (Sigma) bestimmt. Glucose wurde unter Verwendung einer Glucoseanalysevorrichtung bestimmt (Beckman, Irvine, CA) und Glycerin wurde enzymatisch unter Verwendung des Verfahrens von Wieland bestimmt, wie es in "Methods of Enzymatic Analysis" (Hrsg. H.U. Bergmeyer), Band 3, Seiten 1404-1409, veröffentlicht von Academic Press, London (1974) (Literatur 13) beschrieben ist.
  • Lipolysetest:
  • Einzelzellsuspensionen weißer Adipozyten wurden aus fein gehackten epididymalen Fettpolstern männlicher BKW-Mäuse unter Verwendung eines Kollagenase-Abbaus im Wesentlichen gemäß S.A. Beck et al. (vgl. die vorstehend genannte Literatur 14) hergestellt. Zu testende Proben wurden 2 Stunden bei 37°C in 1 ml Krebs-Ringer-Hydrogencarbonatpuffer, pH 7,2, mit 105 bis 2 × 105 Adipozyten (bestimmt mittels Hämozytometer) inkubiert. Die Konzentration des freigesetzten Glycerins wurde enzymatisch mit dem Verfahren von Wieland bestimmt, auf das vorstehend Bezug genommen worden ist (vgl. auch die GB-PS 2217330A). Kontrollproben, die nur Adipozyten enthielten, wurden analysiert, um die spontane Glycerinfreisetzung zu bestimmen. Die Lipidmobilisierungsaktivität wurde als μmol freigesetztes Glycerin/105 Adipozyten/2 Stunden ausgedrückt.
  • Isolierung menschlicher Omentum-Adipozyten
  • Menschliches Omentum-Fettgewebe wurde unter einer Allgemeinanästhesie entfernt und sofort in das Labor transportiert. Gewebefragmente (etwa gleich groß wie ein Paar epididymaler Fettpolster einer Maus) wurden durch 30 min Inkubieren bei 37°C in einem 1 ml-Aliquot Krebs-Ringer-Hydrogencarbonatpuffer, der mit 4% Rinderserumalbumin, 1 g/l Glucose und 1,5 mg/ml Kollagenase ergänzt war, abgebaut, so dass eine Einzelzellsuspension von Adipozyten erzeugt wurde, wobei für diesen Zweck ein Schüttelwasserbad eingesetzt wurde.
  • Isolierung von Maus-Adipozytenplasmamembranen
  • In einem typischen Verfahren wurden weiße Adipozyten aus epididymalen Fettpolstern von Mäusen isoliert, wie es vorstehend erläutert worden ist, jedoch wurden die Zellen in 250 mM Saccharose, 2 mM Ethylenglykol-bis(β-aminoethylether)-N,N,N',N' (EGTA), 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) gewaschen. Die Adipozyten wurden in 20 ml des vorstehend genannten Puffers resuspendiert und durch mindestens 10-maliges Saugen durch einen Swinny-Filter homogenisiert. Das Zellhomogenisat wurde dann 5 min bei 300 g zentrifugiert, der Fettkuchen wurde von der Oberfläche entfernt und das verbleibende Pellet und der Unterstand wurden in saubere Röhrchen überführt. Diese wurden 1 Stunde bei 4°C und 30000 g zentrifugiert und das gebildete Membranpellet wurde in dem Saccharosepuffer (200 bis 400 μl) resuspendiert. Die Plasmamembranen wurden von anderen Organellmembranen auf einem sich selbst bildenden Gradienten auf kolloidalen PercollTM-Silicateilchen getrennt. Die Bestandteile waren 250 mM Saccharose, 2 mM EGTA, 10 mM Tris-HCl, pH 7,4; PercollTM; und 2 M Saccharose, 8 mM EGTA, 80 mM Tris-HCl, pH 7,4, die in einem Verhältnis von 32:7:1 zusammen mit der Membransuspension gemischt wurden (in einem Gesamtvolumen von 8 ml). Dieses Gemisch wurde 30 min bei 4°C und 10000 g zentrifugiert. Der Gradient wurde in 0,75 ml-Teile fraktioniert und jeder Teil wurde im Hinblick auf die Gegenwart von Succinatdehydrogenase, NADH-Cytochrom c-Reduktase, Lactatdehydrogenase und 5'-Nucleotidase getestet, um die Plasmamembranfraktion zu lokalisieren. Die Membranfraktionen wurden in 150 mM NaCl, 1 mM EGTA, 10 mM Tris-HCl, pH 7,4 resuspendiert und 2 min bei 4°C und 10000 g zentrifugiert. Dieses Verfahren wurde zweimal wiederholt. Die gewaschenen Plasmamembranen wurden dann in 10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 250 mM Saccharose, 2 mM EGTA und 4 μM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) auf 1 bis 2 mg/ml verdünnt, in flüssigem Stickstoff einem Snap-freezing unterworfen und bis zum Gebrauch bei –70°C gelagert.
  • Adenylatcyclasetest
  • Der verwendete Adenylatcyclasetest beruht auf dem von Salomon et al. (Literatur 16) entwickelten Test. Wasser (Negativkontrolle), Isoprenalin (Positivkontrolle) oder LMF wurde einem Testgemisch (Endvolumen 100 μl) zugesetzt, das 25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl2, GTP (Guanintriphosphat), 8 mM Kreatinphosphat, 16 Einheiten/ml Kreatinphosphokinase, 1 mM 3-Isobutyl-l-methylxanthin und 1 mM [α-32P]-ATP (spezifische Aktivität 20 mCi/mmol) enthielt. Die Vorinkubation wurde 5 min bei 30°C durchgeführt und die Reaktion wurde durch die Zugabe von Plasmamembranen (typischerweise 50 μg Protein) gestartet. Nach 10 min bei 30°C wurde die Reaktion durch die Zugabe von 100 μl einer Lösung beendet, die 2% Natriumdodecylsulfat, 40 mM ATP und 1,4 mM cyclisches AMP enthielt. Zur Bestimmung der Rückgewinnung von cyclischem AMP wurde jedem Röhrchen [8-3H]-Adenosin-3',5'cyclisches Phosphat (1 μCi in 50 μl Wasser) zugesetzt. Die Hintergrundbindung wurde durch Testen von Proben ohne [α-32P]-ATP bestimmt und Probenkontrollen wurden ohne Plasmamembranen durchgeführt.
  • Proben, die markierte Nucleotide enthielten, wurden mit Wasser auf 1 ml verdünnt und auf DowexTM 50W8-400-Ionenaustauschersäulen aufgebracht, die mit 10 ml Wasser geprimed waren. Nach zweimaligem Waschen mit Wasser wurde das cyclische AMP mit 3 ml Wasser in Polypropylenröhrchen eluiert, die 200 μl 1,5 M Imidazol, pH 7,2 enthielten. Die Proben wurden dann auf Aluminiumoxid-WN-3-Säulen aufgebracht (die vorher mit 8 ml 0,1 M Imidazol, pH 7,5 gewaschen worden sind) und das Eluat wurde direkt in Szintillationsbehälter laufengelassen, die ein Szintillationsfluid enthielten, das unter des Marke Optiphase HiSafe 3 geliefert wird. Den Säulen wurde ein weiterer ml 0,1 M Imidazol zugesetzt und das Eluat wurde mit dem Durchlauf vereinigt. Die Radioaktivität wurde unter Verwendung eines TricarbTM 2000A-Szintillationsanalysegeräts bestimmt.
  • Zn-α2-Glycogrotein
  • Zn-α2-Glycoprotein-Proben wurden zur Identifizierung des isolierten Lipidmobilisierungsfaktors verwendet. Das verwendete Zn-α2-Glycoprotein wurde im Wesentlichen gemäß Ohkubo et al., "Purification and characterisation of human plasma Zn-α2-glycoprotein" (1988), Prep. Biochem. 18, 413-430 (Literatur 8), deren Inhalt in diese Beschreibung unter Bezugnahme einbezogen ist, etwa 670-fach aus frischem menschlichen Plasma unter Verwendung einer Kombination aus DEAE-Sephadex A-50-, DEAE-Sephacel-, Zn-Chelat-Sepharose 6B-, Phenyl-Sepharose-, Sephacryl S-300- und HA-Ultrogel-Säulenchromatographie aufgereinigt.
  • Gelelektrophorese
  • Gele wurden gemäß dem Verfahren von Laemmli (Literatur 15) hergestellt und bestanden im Allgemeinen aus einem 5%igen Sammelgel und einem 15% SDS-PAGE-Trenngel (denaturierende oder reduzierende Bedingungen) oder einem 10% SDS-PAGE-Trenngel (nichtdenaturierende oder nicht-reduzierende Bedingungen). Die Proben wurden mit 1 bis 5 μg/Spur aufgebracht. Die Banden wurden entweder durch Färben mit Coomassie- Brilliantblau R-250 oder mit Silber sichtbar gemacht. Die Proben wurden für reduzierende Bedingungen durch 5 min Erhitzen bei 100°C in 0,0625 M Tris-HCl, pH 6,8, 10% Glycerin, 1 % SDS, 0,01% Bromphenolblau und 5% 2-Mercaptoethanol hergestellt.
  • Für das Immun-Blotting wurden die Gele auf Nitrocellulosemembranen überführt, die mit 5% Marvel in 0,15% Tween 20 in PBS bei 4°C über Nacht blockiert worden sind. Die Nitrocellulosemembranen wurden einmal 15 min und zweimal 5 min in 0,5% Tween 20 in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) bei Raumtemperatur gewaschen. Der Immunnachweis wurde unter Verwendung eines polyklonalen Antiserums für Zn-α2-Glycoprotein (10 μg/ml), das gemäß Ohkubo et al. (vgl. die vorstehend genannte Literatur 8) hergestellt worden ist, in 1,5% Marvel, 0,15% Tween 20 in PBS 1 Stunde bei Raumtemperatur durchgeführt. Nach dreimaligem Waschen wie vorstehend wurden die Filter 1 Stunde mit Protein-A-Peroxidasekonjugat bei einer 1:500-fachen Verdünnung inkubiert, worauf einmal 15 min und viermal 5 min mit 0,5% Tween 20 in PBS gewaschen wurde. Es wurde das ECL-Nachweissystem verwendet und die Blots wurden in gleichen Volumina der Nachweisreagenzien 1 und 2 unter Verwendung von 0,125 ml/cm2 1 min bei Raumtemperatur suspendiert und dann in Saran WrapTM eingehüllt. Die Blots wurden abhängig von der Menge des Zielproteins 30 Sekunden bis 10 min einer Autoradiographiefilm (HyperfilmTM ECL) ausgesetzt.
  • Im Zusammenhang mit der Beschreibung der Erfindung und den nachstehend angegebenen veranschaulichenden Beispielen wird auf die beigefügten Zeichnungen Bezug genommen, wobei
  • 1 ein Diagramm der vollständigen Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 1) des menschlichen Plasma-Zn-α2-Glycoproteins ist, wie es von T. Araki et al. (1988), "Complete amino acid sequence of human plasma Zn-α2-glycoprotein and its homology to histocompatibility antigens" (Literatur 4) veröffentlicht worden ist;
  • 2 ein Diagramm des Verteilungsmusters der lipolytischen Aktivität und des Proteingehalts von Fraktionen ist, die in einer Stufe der Anionenaustauschchromatographie unter Verwendung einer AquaporeTM AX-300-DEAE-Säule erhalten worden sind, und zwar angewandt auf die aktiven lipolytischen Fraktionen, die von einer Vorstufe der Gelfiltrationschromatographie-Trennung auf einer Q-Sepharosesäule erhalten worden sind, wie es nachstehend in Beispiel 2 beschrieben wird;
  • 3 ein Diagramm des Verteilungsmusters der lipolytischen Aktivität und des Proteingehalts von Fraktionen ist, die in einer weiteren Stufe der HPLC- Hydrophobwechselwirkungschromatographie auf einer ResourceTM Iso-Hydrophobsäule der in 2 veranschaulichten AquaporeTM AX-300-DEAE-Fraktionierungsstufe, die den Hauptaktivitätspeak enthielt, erhalten worden sind;
  • 4 die Elektrophoresemuster, die von menschlichem LMF und Maus-LMF erhalten wurden, welche gemäß Beispiel 1 und 2 isoliert und gereinigt worden sind, und auch die Muster zeigt, die von menschlichem Plasma-Zn-α2-Glycoprotein nach einer 15% SDS-PAGE erhalten wurden;
  • 5 ein Diagramm ist, das dem von 4 ähnlich ist, jedoch das Bandenmuster zeigt, das für menschliches Plasma-Zn-α2-Glycoprotein (Spur 2) und für menschliches LMF (Spur 3), das gemäß Beispiel 2 hergestellt worden ist, erhalten wurde;
  • 6 weitere Bandenmuster zeigt, die mit SDS-PAGE zum Nachweis von Kohlenhydraten verwendet werden, wie es ebenfalls nachstehend beschrieben wird;
  • 7 ein Western-Blot-Bandenmuster zeigt, das durch menschliches Plasma-Zn-α2-Glycoprotein (Spur 1) und menschliches LMF (Spur 2) nach 15% SDS-PAGE unter Verwendung eines polyklonalen Antikörpers für das Zn-α2-Glycoprotein erhalten wurde;
  • 8 ein weiteres Elektrophoresebandenmuster ist, das nach Experimenten erhalten worden ist, die zur Bestimmung des Effekts von α-Chymotrypsin auf menschliches Plasma-Znα2-Glycoprotein und auf das isolierte und gereinigte menschliche LMF durchgeführt wurden;
  • 9 ein Balkendiagramm ist, das die Stimulierung der Lipolyse in frisch isolierten epididymalen Maus-Adipozyten durch menschliches LMF (A) und menschliches Zn-α2-Glycoprotein (B) vergleicht, wobei die Ergebnisse als Mittelwert ± Standardabweichung angegeben sind und die Glycerinfreisetzung aus Fettzellen allein von den angegebenen Werten subtrahiert worden ist. Die Daten sind repräsentativ für drei getrennte Experimente. Unterschiede zu den Kontrollen wurden mit dem Student-t-Test bestimmt und sind als *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01 und *** p ≤ 0,005 angegeben.
  • 10 ein Diagramm ist, das die Änderung des Körpergewichts von gezüchteten männlichen NMRI-Mäusen (30 bis 40 g) zeigt (o), die durch intravenöse Verabreichung (iv-Verabreichung) von LMF (8 μg), das gemäß Beispiel 2 aus menschlichem Urin isoliert wor den ist, erzeugt worden ist, und von Kontrollmäusen, denen PBS durch iv-Injektion verabreicht worden ist (x);
  • 11 ein Diagramm ist, das dem von 10 ähnlich ist und die Änderung des Körpergewichts von ob/ob-Mäusen zeigt, die durch iv-Verabreichung von LMF (35 μg) (o), das gemäß Beispiel 2 aus menschlichem Urin isoliert worden ist, erzeugt worden ist, und von Kontrollmäusen, denen PBS durch iv-Injektion verabreicht worden ist (x). LMF wurde bei den Zeiten 0, 16, 24, 40, 48, 64, 72, 90, 96, 113, 120, 137 und 144 Stunden injiziert; PBS wurde an den gleichen Zeitpunkten injiziert. Die Tiere wurden 160 Stunden nach der ersten Injektion getötet. Die Ergebnisse sind als Mittelwert ± Standardabweichung für 5 Tiere pro Gruppe ausgedrückt;
  • 12 einen Graphen zeigt, der den Effekt des Trypsinabbaus für verschiedene Zeiträume (2 Stunden, 4 Stunden und 8 Stunden) auf die biologische Aktivität des 43 kDa-LMF veranschaulicht.
  • Beispiel 1
  • Isolierung und Reinigung des Lipidmobilisierungsfaktors aus einem Maus-Adenokarzinom MAC 16
  • Das in diesem Beispiel eingesetzte Verfahren ist in Tabelle 1 am Ende der vorliegenden Beschreibung zusammengefasst und umfasst zunächst die Aufreinigung des Lipidmobilisierungsfaktors (LMF) aus dem MAC16-Tumor unter Verwendung einer vorher durchgeführten Chargenextraktion auf DEAE-Cellulose und/oder gegebenenfalls einer Proteinfällung durch Ammoniumsulfat, worauf eine Anionenaustauschchromatographie auf einer SepharoseTM Mono Q HR 5/5-Anionenaustauschersäule und ein Größenausschluss auf Superose 12 durchgeführt wird.
  • Insbesondere wurden solide Tumoren von Mäusen entnommen, die einen Gewichtsverlust aufwiesen und in 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), das 0,5 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 0,5 mM EGTA und 1 mM DTT enthielt, in einer Konzentration von 5 ml/g Tumor homogenisiert. Bruchstücke wurden durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit (15 min bei 4000 U/min in einer Laborzentrifuge) entfernt. Bei der Verwendung einer Ammoniumsulfatfällung wurde eine Ammoniumsulfatlösung (38% w/v) auf dieser Stufe langsam zu dem Überstand unter Rühren bei 4°C zugegeben und der Niederschlag wurde durch Zentrifugation entfernt (20 min bei 4500 U/min). Der Überstand wurde dann unter Verwendung einer Ami con-Filtrationszelle, die einen Membranfilter mit einer Molekulargewichtsgrenze von Mr 10000 enthielt, gegen frischen Homogenisierungspuffer konzentriert.
  • Eine Chargenextraktion auf DEAE-Cellulose auf dieser Stufe wurde zweckmäßig im Wesentlichen gemäß T.M. McDevitt et al., "Purification and characterization of a lipid-mobilizing factor associated with cachexia-inducing tumours in mice and humans", Cancer Res. (1995), 55, 1458-1463 (Literatur 1) durchgeführt.
  • Der nächste Schritt war eine Anionenaustauschchromatographie unter Verwendung von Q-Sepharose. Als Säule wurde eine Mono Q NR 5/5-Anionenaustauschersäule verwendet, die eine Proteinkapazität von 20 bis 50 mg Protein aufwies. Die Säule wurde vor der Verwendung mit Homogenisierungspuffer äquilibriert und die Probe wurde nach zehnminütiger Zentrifugation bei 1300 U/min als 500 μl-Injektion aufgebracht. Nach einem anfänglichen Waschvorgang wurde das aktive Material unter einem 0 bis 0,2 M NaCl-Gradienten eluiert. Die Gegenwart der aktiven Fraktionen wurde durch die Messung der Glycerinfreisetzung aus Maus-Adipozyten gemäß dem vorstehend erwähnten Lipolyse-Biotest bestimmt. Die aktiven Fraktionen wurden unter Verwendung einer Amicon-Filtrationszelle vor der FPLC-SuperoseTM-Chromatographie (oder SuperdexTM-Chromatographie) konzentriert und in 0,5 ml 50 mM Phosphat (pH 8,0) gelöst, das 0,3 M NaCl, 0,5 mM PMSF, 0,5 mM EGTA und 1 mM DTT enthielt. Die zur Durchführung dieses speziellen Beispiels verwendete Säule war die vorbefüllte Superose 12 10/30-Gelausschlusssäule, die mit dem vorstehenden Puffer 2 Stunden bei 0,25 ml/min äquilibriert worden ist, worauf die Probe als 200 μl-Injektion aufgebracht wurde. Es wurden dreißig 1,0 ml-Fraktionen gesammelt und die Lipidmobilisierungsaktivität wurde mit dem vorstehend genannten Lipolyse-Biotest nachgewiesen.
  • Bis zu diesem Punkt entsprach das Verfahren relativ genau dem von McDevitt et al. in der vorstehend genannten Literatur 9 beschriebenen Verfahren. Wenn jedoch in dem letztgenannten Verfahren mit einem letzten HPLC-Schritt unter Verwendung einer C8-Hydrophobsäule und einem Acetonitril/TFA-Gradienten fortgefahren wird, wurden im vorliegenden Fall die aktiven Fraktionen von der Superosesäule unter Verwendung einer mit einem HPLC-System gekoppelten AquaporeTM AX-300 DEAE-Cellulosesäule und Eluieren unter einem Gradienten von 0 bis 0,3 M NaCl weiter fraktioniert, bevor die letzte HPLC-Hydrophobchromatographiestufe unter Verwendung der unter der Marke "Resource Iso" vertriebenen Hydrophobsäule durchgeführt wurde. Diese Modifizierung führte zur Isolierung eines viel stabileren biologisch aktiven Produkts, das sich von den bisher isolierten Produkten unterschied.
  • Bei dieser letztgenannten HPLC-Stufe unter Verwendung der AquaporeTM AX-300 DEAE-Cellulosesäule betrug die Flussrate typischerweise 0,2 ml min–1 mit einem Lösungsmittelsystem, das aus Komponente A (10 mM Na-Phosphat pH 5,3) und Komponente B (10 mM Na-Phosphat pH 5,3 + 0,3 M NaCl) zusammengesetzt war. Alle Lösungsmittel wurden vor der Verwendung entgast. Bei einer speziellen Trennung wurde der Gradient gemäß der folgenden Vorschrift geändert: 10 min 0% B, 40 min 100% B, 50 min 100% B und 60 min 0% B. Die Extinktion (A21 4) wurde bei 214 nm verfolgt, um den Proteingehalt zu bestimmen. Jeder der eluierten Peaks wurde als getrennte Fraktion gesammelt. Das Salz in diesen Fraktionen von der DEAE-Cellulosesäule wurde durch Ultrafiltration durch einen MicroconTM-Mikrokonzentrator, der einen Membranfilter mit einer Molekulargewichtsgrenze von Mr 10000 (Amicon) enthielt, gegen entionisiertes Wasser entfernt, das 0,5 mM PMSF, 0,5 mM EGTA, 1 mM DTT enthielt. Auch hier wurde die Lipidmobilisierungsaktivität mit dem Lipolyse-Biotest nachgewiesen und aktive Fraktionen wurden vor der HPLC-Hydrophobchromatographie unter Verwendung eines MicroconTM-Mikrokonzentrators gegen 50 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) entfernt, der 1,5 M Ammoniumsulfat enthielt.
  • Im letzten HPLC-Schritt dieses Reinigungsverfahrens unter Verwendung der Hydrophobsäule ResourceTM Iso, 1 ml (Pharmacia Biotech), betrug die Flussrate 1 ml/min–1 mit einem Lösungsmittelsystem C (50 mM Phosphat pH 7,0 + 1,5 M Ammoniumsulfat) und D (50 mM Phosphat pH 7,0). Alle Lösungsmittel wurden vor der Verwendung entgast. Eine typische Gradientenvorschrift war 5 min 0% D, 20 min 100% D, 30 min 100% D und 35 min 0% D. Auch hier wurde die Extinktion (A21 4) bei 214 nm verfolgt, um den Proteingehalt zu bestimmen, und jeder der eluierten Peaks wurde als getrennte Fraktion gesammelt. Nach der Entfernung des Salzes durch Ultrafiltration (durch einen MicroconTM-Mikrokonzentrator gegen entionisiertes Wasser, das 0,5 mM PMSF, 0,5 mM EGTA und 1 mM DTT enthielt) wurde die Lipidmobilisierungsaktivität wie vorstehend mit dem Lipolyse-Biotest nachgewiesen.
  • Beispiel 2
  • Isolierung und Reinigung eines Lipidmobilisierungsfaktors aus dem Urin kachektischer Patienten
  • Urin von einem Krebspatienten mit Gewichtsverlust wurde mit einem ähnlichen Schema isoliert, wie es für den MAC16-Tumor verwendet worden ist, jedoch waren aufgrund des niedrigeren Proteingehalts von Urin weniger Schritte erforderlich, um ein reines Produkt zu erhalten (vgl. die Zusammenfassung in Tabelle 2 am Ende der vorliegenden Beschreibung). In der ersten Stufe wurde der Urin einer Fällung mit 80% (NH4)2SO4 unterworfen und der Nieder schlag wurde gegen 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), das 0,5 mM PMSF, 0,5 mM EGTA und 10 mM DTT enthielt, unter Verwendung einer Amicon-Filtrationszelle dialysiert, die einen Membranfilter mit einer Molekulargewichtsgrenze von Mr 10000 aufwies. Das Urinkonzentrat wurde dann durch Anionenaustauschchromatographie unter Verwendung von Q-Sepharose und anschließender HPLC unter Verwendung einer Aquapore AX-300 (30 × 21 mm) DEAE-Cellulosesäule (Flussrate 0,2 ml min–1 mit 10 mM Phosphatpuffer bei pH 5,3) unter einem linearen 0 bis 0,4 M NaCl-Gradienten fraktioniert, der 30 min laufengelassen wurde. Der Proteingehalt bzw. die biologische Aktivität der Fraktionen wurde durch Messen der Extinktion A21 4 und durch Messen der Freisetzung von Glycerin aus epididymalen Adipozyten unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Standard-Lipolysetests bestimmt. Die Ergebnisse einer typischen Fraktionierung dieser DEAE-Cellulose-Fraktionierungsstufe sind im Diagramm von 2 veranschaulicht.
  • Anschließend wird als letzte Stufe eine Hydrophobwechselwirkungschromatographie unter Verwendung der hydrophoben Säule ResourceTM Iso (6,4 × 30 mm) zur Fraktionierung des von der DEAE-Cellulosesäule erhaltenen aktiven Materials im Wesentlichen so durchgeführt, wie es im Zusammenhang mit Beispiel 1 beschrieben worden ist. In dieser letzten Stufe war der Startpuffer typischerweise 50 mM Phosphat, pH 7,0, der 1,5 M (NH4)2SO4 enthielt und die Säule wurde unter einem linearen Gradienten des Elutionspuffers (50 mM Phosphat, pH 7,0 mit einer Flussrate von 1 ml min–1) laufengelassen. Das Diagramm von 3 veranschaulicht die Ergebnisse in einem Beispiel dieser letzten Stufe der Hydrophobchromatographie.
  • Bei der Wiederholung des Verfahrens von Beispiel 2 mit einer Reihe von Krebspatienten und normalen Personen wurde gefunden, dass LMF im Urin von Krebspatienten ohne Gewichtsverlust und von normalen Personen abwesend war, obwohl bei Krebspatienten mit Gewichtsverlust im Allgemeinen dieses LMF im Urin vorliegt, wie es beispielsweise in Tabelle 3 am Ende der vorliegenden Beschreibung gezeigt ist.
  • Eigenschaften und Identität des Lipidmobilisierungsfaktors (LMF) der in den Beispielen 1 und 2 isoliert worden ist
  • A. Molekulargewicht
  • Sowohl menschlicher LMF als auch Maus-LMF, der wie vorstehend beschrieben isoliert und gereinigt worden ist, zeigte eine einzelne Proteinbande mit einer scheinbaren relativen Molmasse von Mr 43 kDa. Dies ist in 4 gezeigt, in der die Spur 1 Molgewichtsmarker, die Spuren 3 und 4 das mit menschlichem LMF erhaltene Bandenmuster und Spur 5 das mit dem Maus-LMF erhaltene Bandenmuster zeigt.
  • Sowohl menschlicher LMF als auch Maus-LMF zeigte bei der Elektrophorese auf 10% nichtdenaturierendem PAGE ein scheinbares Molgewicht von 84 kDa, wobei das Bandenmuster unter Verwendung des menschlichen LMF in Spur 3 von 5 gezeigt ist und auch hier die Spur 1 Molgewichtsmarker zeigt.
  • B. Struktur und Vergleich mit Zn-α2-Glycoprotein
  • Eine Sequenzanalyse von sowohl menschlichem LMF-Material als auch Maus-LMF-Material zeigte, dass es eine Polypeptidkette mit einer durch einen Pyroglutamatrest blockierten N-Endgruppe aufweist. Die Behandlung mit HCl oder Pyroglutamataminopeptidase zur Entfernung dieses Rests oder die Spaltung mit Chymotrypsin erzeugte Peptide, die bei den Resten 2 bis 6, 55 bis 79 und 146 bis 167 eine Homologie mit menschlichem Plasma-Zn-α2-Glycoprotein aufwies (vgl. Araki et al., Literatur 4). Gereinigtes menschliches LMF und Maus-LMF wanderten auch gemeinsam mit Zn-α2-Glycoprotein, wenn sie auf 15% SDS-PAGE einer Elektrophorese unterworfen wurden, wie es in 4 veranschaulicht ist, wobei die Spur 2 das Bandenmuster zeigt, das unter Verwendung von authentischem menschlichen Zn-α2-Glycoprotein (hergestellt gemäß Literatur 8) erhalten wurde. Das gereinigte menschliche LMF und menschliches Zn-α2-Glycoprotein hatten auf 10% nicht-denaturierendem PAGE auch das gleiche Molekulargewicht (84000) (vgl. die Spuren 3 bzw. 2 in 5). Unter Verwendung von SDS-PAGE zum Nachweis von Kohlenhydraten wurden sowohl menschliches LMF als auch Maus-LMF sowie authentisches menschliches Zn-α2-Glycoprotein stark gefärbt. Dies ist in 6 veranschaulicht, in der die Spur 1 den Effekt von menschlichem Plasma-Zn-α2-Glycoprotein, die Spur 2 den Effekt von menschlichem LMF, die Spuren 3 und 4 die Ergebnisse mit Maus-LMF, die Spur 5 das Ergebnis mit Transferrin (Positivkontrolle) und die Spur 6 das Ergebnis mit Kreatinase (Negativkontrolle) zeigt. Das Gel wurde im Hinblick auf Kohlenhydrate unter Verwendung des DIG-Glycan-Nachweiskits gemäß den Anweisungen des Herstellers gefärbt.
  • Es wurde auch gefunden, dass ein polyklonaler Antikörper, der gegen authentisches menschliches Plasma-Zn-α2-Glycoprotein gezüchtet wurde, menschliches LMF auf Immunblots nachweisen konnte, wie es in 7 gezeigt ist, und die Lipidmobilisierungsaktivität des menschlichen Materials, nicht jedoch die des Mausmaterials in vitro neutralisieren konnte. Das letztgenannte ist in Tabelle 4 gezeigt und die Erklärung dieser Beobachtung könnte in der Tatsache liegen, dass von Maus-Zn-α2-Glycoprotein gezeigt wurde, dass es nur eine 58,6%ige Identität der Aminosäuresequenz mit dem menschlichen Gegenstück aufweist (vgl. Literatur 7).
  • 8 zeigt den Effekt von α-Chymotrypsin auf authentisches menschliches Plasma-Zn-α2-Glycoprotein und LMF. Spur 1 zeigt die Molekulargewichtsmarker, Spur 2 zeigt menschliches Plasma-Zn-α2-Glycoprotein, Spur 3 zeigt menschliches LMF, Spur 4 zeigt das Ergebnis von Zn-α2-Glycoprotein + α-Chymotrypsin, Spur 5 stellt menschliches LMF + α-Chymotrypsin dar und Spur 6 ist α-Chymotrypsin allein (Kontrolle). Die Proteine wurden auf 15% SDS-PAGE einer Elektrophorese unterworfen und mit Coomassie-Brilliantblau gefärbt. Sowohl menschliches Plasma-Zn-α2-Glycoprotein als auch das isolierte und gereinigte LMF zeigten die gleichen Chymotrypsin-Spaltungsfragmente und Chymotrypsin zerstörte die biologische in-vitro-Aktivität des LMF. Weder menschliches Plasma-Zn-α2-Glycoprotein noch menschliches LMF enthielt den Proteolyse-induzierenden Faktor (PIF) mit Mr 24 kDa, von dem bisher berichtet wurde, dass er zusammen mit dem LMF aufgereinigt wird.
  • Die Expression von Zn-α2-Glycoprotein in verschiedenen Maustumoren und in der Mausleber wurde auch mittels kompetetiver PCR quantifiziert. Die Leber, von der bekannt ist, dass sie Zn-α2-Glycoprotein exprimiert, wurde als Kontrolle für die Tumoren verwendet. Es wurde gefunden, dass von den bewerteten MAC-Tumoren nur der Kachexie-induzierende MAC16 das Zn-α2-Glycoprotein exprimierte.
  • C. Biologische Aktivität
  • C.1 In vitro
  • Das wie in Beispiel 2 aus dem Urin von Krebspatienten, die einen Gewichtsverlust aufwiesen, isolierte menschliche LMF-Material wurde bei verschiedenen Dosierungen im Hinblick auf seinen Lipolyse-stimulierenden Effekt auf frisch isolierte epididymale Maus-Adipozyten durch Messen der Glycerinfreisetzung unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Lipolysetests getestet. Der Test wurde auch unter Verwendung von authentischem menschlichen Plasma-Zn-α2-Glycoprotein wiederholt und es wurde gefunden, dass sowohl das authentische Zn-α2-Glycoprotein als auch das menschliche LMF-Material die Glycerinfreisetzung mit einem vergleichbaren Dosis-Wirkungs-Profil stimuliert. Dies ist in 9 veranschaulicht, in der das Diagramm A die Ergebnisse für das menschliche LMF bei verschiedenen Konzentrationen und das Diagramm B die Ergebnisse für das authentische menschliche Plasma-Zn-α2-Glycoprotein zeigen.
  • Es wird vermutet, dass die Induktion der Lipolyse in Adipozyten durch eine Erhöhung des intrazellulären Mediators cyclisches AMP vermittelt wird und in weiteren Tests wurde gefunden, dass die Inkubation von Maus-Adipozyten-Plasmamembranen mit dem menschlichen LMF eine Stimulierung der Adenylatcyclaseaktivität in einem GTP-abhängigen Prozess verursacht, wobei die maximale Stimulierung bei 0,1 μM GTP stattfindet. Es wurde auch gefunden, dass auch diese Aktivierung von Adenylatcyclase bei Konzentrationen von LMF > 5 μg/Test gesättigt werden konnte. Bei der Verwendung von menschlichem Plasma-Zn-α2-Glycoprotein wurde gefunden, dass dies auch die Maus-Adipozyten-Plasmamembran-Adenylatcyclase in einer GTP-abhängigen Weise stimulierte, und zwar ebenfalls mit einer maximalen Stimulierung bei 0,1 μM GTP. Auch hier wurde gefunden, dass diese Aktivierung von Adenylatcyclase durch das Zn-α2-Glycoprotein bei Konzentrationen von > 5 μg/Test gesättigt werden konnte.
  • Diese Daten, welche die ähnlichen Effekte und vergleichbaren Dosis-Wirkungs-Profile für LMF und Zn-α2-Glycoprotein zusammen mit dem Vermögen polyklonaler Antiseren bezüglich Zn-α2-Glycoprotein, die in vitro-Lipolyse durch menschliches LMF zu neutralisieren, die Homologie bei der Aminosäuresequenz und die übereinstimmende elektrophoretische Mobilität zeigen, liefern alle einen starken Beweis dafür, dass es sich bei dem isolierten und gereinigten LMF tatsächlich um das Zn-α2-Glycoprotein handelt. Obwohl bisherige Berichte gezeigt haben, dass Zn-α2-Glycoprotein ein Haftprotein ist, das bezüglich der Aminosäuresequenz und der Domänenstruktur mit den Antigenen des Haupthistokompatibilitätskomplexes nahe verwandt ist, gab es bisher keine Berichte über ein Vermögen des Zn-α2-Glycoproteins zur Induktion einer Lipolyse. Darüber hinaus wurde bisher nicht darüber berichtet, dass es in menschlichem Urin vorliegt. Gegenwärtig ist der Mechanismus, durch den ein großes saures Protein wie das Zn-α2-Glycoprotein die Adenylatcyclase stimulieren kann, nicht bekannt und diese Stimulation ist ziemlich überraschend, da andere bekannte Substanzen, die eine ähnliche Rolle spielen, kleine und basische Polypeptide sind.
  • C.2 In vivo
  • Um zu bestimmen, ob gereinigtes LMF, das wie in Beispiel 2 aus menschlichem Urin isoliert worden ist, zu einer Fettabreicherung in vivo fähig war, wurde eine Probe (8 μg) dieses LMF-Materials während eines Zeitraums von 72 Stunden in gezüchtete männliche NMRI-Mäuse injiziert. Das LMF wurde an den Zeitpunkten 0, 17, 24, 41, 48, 62 und 72 Stunden injiziert und Kontrollmäusen wurde in entsprechender Weise phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) an den gleichen Zeitpunkten injiziert. Die Tiere wurden nach 89 Stunden getötet und die Körperzusammensetzung und die Serummetabolitenkonzentrationen wurden bestimmt. Wie es in 10 gezeigt ist, lag eine progressive Abnahme des Körpergewichts bei Tieren vor, die LMF enthielten, die nach 41 Stunden Behandlung signifikant niedriger war als bei PBS-behandelten Kontrolltieren. Die Änderungen der Körperzusammensetzung und der Serummetabolitenkonzentrationen sind in Tabelle 5 zusammengefasst, wobei ersichtlich ist, dass das Gesamtkörpergewicht während des gesamten 89-Stunden-Zeitraums des Experiments ohne Änderung der Nahrungs- und Wasseraufnahme um 3,6 g abnahm. Die Analyse der Körperzusammensetzung zeigte eine starke Verminderung (42%) des Körperfettgehalts der Mäuse, die LMF erhielten, mit einer Tendenz zur Zunahme der nicht-Fettmasse, obwohl dies kein besonders signifikantes Niveau erreichte. In diesem Zusammenhang wurden einige Hinweise gefunden, die zeigten, dass LMF tatsächlich die Proteinsynthese stimulieren und somit die Muskelmasse erhöhen kann. Trotz dieser Fettmobilisierung gab es keine signifikanten Verminderungen bei den Serumkonzentrationen nicht-veresterter Fettsäuren (NEFA), von Glycerin und Glucose in Mäusen, die LMF erhielten.
  • Wie es in 11 gezeigt ist und es sich aus den Daten in Tabelle 6 ergibt, erzeugte die intravenöse Verabreichung von LMF (35 μg), der aus menschlichem Urin isoliert worden ist, an fettleibige ob/ob-Mäuse ein ähnliches Ergebnis. Es lag eine Abnahme des Gesamtkörpergewichts vor, die innerhalb von 24 Stunden nach der ersten Injektion signifikant wurde und während der 160 Stunden des Experiments unter der Abnahme der Kontrollgruppe lag. Eine Analyse der Körperzusammensetzung zeigte einen Gewichtsverlust, der von einer Verringerung des Körperfetts (26,03 ± 0,70 g bei den Kontrollen und 21,09 ± 0,99 g in LMFbehandelten Tieren) ohne Veränderung des Wassergehalts oder der nicht-Fettmasse stammte (vgl. Tabelle 6). Die Serumkonzentrationen von Glycerin und 3-Hydroxybutyrat waren signifikant erhöht, während die Blutglucosekonzentrationen vermindert waren und weder ein Effekt im Hinblick auf die Triglyceridkonzentration noch auf die NEFA-Konzentration auftrat.
  • D. Fragmentierung
  • Es wurde auch ermittelt, dass das aktive 43 kDa-Glycoprotein mit Trypsin abgebaut werden konnte, wobei ein Fragment mit einem scheinbaren Molekulargewicht oder einer scheinbaren relativen Molmasse von 7 kDa erhalten wurde (bestimmt mittels Gelfiltrationsausschlusschromatographie unter Verwendung einer SephadexTM 50-Säule), bei dem die biologische Aktivität der Funktion als Lipidmobilisierungsmittel beibehalten wurde. Dies wird durch die Ergebnisse eines typischen Experiments veranschaulicht, das in 12 veranschaulicht ist, bei dem Proben des isolierten menschlichen LMF bei 37°C für unterschiedliche Zeiträume mit Trypsin inkubiert und dann mittels Sephadex-50-Gelausschlusschromato graphie und einem Lipolysetest analysiert wurden. Die Ergebnisse zeigen deutlich die Gegenwart aktiver Fragmente innerhalb der 2,5- bis 2,7-Fraktionen, wobei die Molekulargewichte dieser Fragmente, die von einer Kalibrierungskurve abgeleitet worden sind, 6 kDa, 7 kDa bzw. 8 kDa betrugen, wie es in der Figur gezeigt ist. Es wurden Positiv- und Negativkontrollen durchgeführt, die wie folgt waren: –ve = 0,027, +ve = 0,252.
  • Therapeutische Anwendung
  • Insgesamt bestätigten die im vorstehenden Abschnitt C.2 angegebenen Ergebnisse im Zusammenhang mit den in vivo-Experimenten einen erhöhten Fett-Metabolismus und zeigten, dass in diesen Modellsystemen das isolierte und gereinigte menschliche LMF insbesondere durch Abreicherung des Fettgewebes eine Abnahme des Körpergewichts erzeugt. Es ist dieses spezielle Vermögen des menschlichen LMF, bei dem es sich um ein Zn-α2-Glycoprotein oder ein nahes Analogon desselben handelt, Fettgewebe ohne die Beeinflussung der Muskelmasse reduzieren zu können, das am deutlichsten das Potenzial zur Verwendung dieses Materials bei der Behandlung von Fettsucht beim Menschen zeigt. Wie es weiter oben erwähnt worden ist, gibt es auch einige Anzeichen, die zeigen, dass dieses LMF-Material tatsächlich die Proteinsynthese stimulieren kann und daher zur Stimulierung der Muskelentwicklung nützlich sein könnte. Potenziell ist dieses Material auch zur Behandlung von Menschen mit einer erhöhten Empfindlichkeit gegenüber einem Typ-II-Diabetes besonders geeignet, der im Fall von Fettsucht auftreten kann.
  • Für diese therapeutische Verwendung, insbesondere für die kontrollierte Behandlung von Fettsucht beim Menschen, und zwar entweder aus medizinischen oder kosmetischen Gründen, kann eine therapeutisch geeignete und nicht-toxische Menge des im Wesentlichen reinen Wirkstoffs, und zwar entweder eines Lipidmobilisierungsfaktors, der im Wesentlichen so isoliert und gereinigt wurde, wie es hier beschrieben worden ist, oder des äquivalenten gereinigten oder synthetischen Zn-α2-Glycoproteins, oder eines Materials, das ein von dem Zn-α2-Glycoprotein abgeleitetes lipolytisch aktives Fragment darstellt, als pharmazeutische Formulierung zur Verabreichung in einer beliebigen Weise hergestellt werden. Solche Formulierungen können in einer Einheitsdosierungsform bereitgestellt werden und eine pharmazeutische Zusammensetzung umfassen, die mit einem beliebigen, auf dem Gebiet der Pharmazie bekannten Verfahren hergestellt wird, bei dem die Herstellung der aktiven lipolytischen Substanz im engen Verbund oder im Gemisch mit einem beliebigen anderen geeigneten Bestandteil kombiniert wird, der einen kompatiblen pharmazeutisch verträglichen Träger, ein entsprechendes Verdünnungsmittel oder Vehikel bereitstellt. Die Formulierungen umfassen solche, die für eine orale, rektale, lokale und parenterale (einschließlich subkutan, intramus kulär und intravenös) Verabreichung geeignet sind. Zur parenteralen Verabreichung können die Formulierungen sterile flüssige Zubereitungen einer vorbestimmten Menge der aktiven lipolytischen Substanz umfassen, die gebrauchsfertig in Ampullen enthalten sind.
  • Erfindungsgemäße Formulierungen, die zur oralen Verabreichung geeignet sind, können als getrennte Einheiten wie z. B. Kapseln, Oblatenkapseln, Tabletten oder Pastillen bereitgestellt werden, die jeweils eine vorbestimmte Menge des Wirkstoffs in Form eines Pulvers oder eines Granulats bzw. von Körnchen enthalten, oder als Suspension des Wirkstoffs in einer wässrigen Flüssigkeit oder einer nicht-wässrigen Flüssigkeit wie z. B. einem Sirup, einem Elixier oder einer Emulsion einer Arzneimittellösung. Der Wirkstoff kann auch als Bolus, Electuarium oder Paste bereitgestellt werden.
  • Die Menge des Wirkstoffs, die für eine wirksame Behandlung von Fettsucht in Säugern erforderlich ist, wird natürlich variieren und liegt in jedem speziellen Fall letztendlich im Ermessen des behandelnden Arztes oder Veterinärs, der den Säuger behandelt. Die von einem solchen behandelnden Arzt zu berücksichtigenden Faktoren umfassen z. B. den Verabreichungsweg, die Art der pharmazeutischen Formulierung, das Körpergewicht, die Oberfläche, das Alter und den Allgemeinzustand des Säugers.
  • Diagnostische Anwendungen
  • Für diagnostische Zwecke wie z. B. zum Nachweis der Gegenwart eines Tumors in einem menschlichen Patienten oder zur Überwachung des Fortschritts eines behandelten Tumors ist es grundsätzlich nur erforderlich, einfach eine Probe eines Körperfluids wie z. B. Urin zu entnehmen, in dem das Zn-α2-Glycoprotein in gesunden Lebewesen normalerweise nicht vorhanden ist, und anschließend einen Test bezüglich der Gegenwart des Glycoprotein-Lipidmobilisierungsmittels oder des lipolytischen Faktors (oder eines äquivalenten Zn-α2-Glycoproteins), wie sie hier beschrieben worden sind, durchzuführen.
  • In der Praxis kann jedes zweckmäßige Verfahren zum Nachweisen und/oder Messen dieses aktiven Lipidmobilisierungsmittels oder des lipolytischen Faktors in den Proben eingesetzt werden und die erforderliche Vorrichtung und die erforderlichen Materialien können vorteilhaft zusammen mit den zweckmäßigen praktischen Anweisungen in Form in sich geschlossener diagnostischer Kits, die für den sofortigen Gebrauch bestimmt sind, verpackt und geliefert werden. Besonders bevorzugte diagnostische Mittel zum Nachweisen und/oder Messen des aktiven Lipidmobilisierungsmittels oder des lipolytischen Faktors in einer bequemen und verlässlichen Weise sind biochemische Reagenzien, wie z. B. monoklonale oder polyklonale Antikörper, die z. B. menschliches Zn-α2-Glycoprotein spezifisch erkennen und spezifisch daran binden und die dann z. B. durch eine sichtbare Änderung oder ein spezielles Screening unter Verwendung eines dazugehörigen markierten Markermoleküls oder durch eine beliebige andere geeignete bekannte Technik identifiziert werden können.
  • Monoklonale Antikörper
  • Die Herstellung monoklonaler Antikörper bezüglich des Zn-α2-Glycoproteins oder des Zn-α2-Glycoprotein-artigen lipolytischen Faktors dieser Erfindung kann durch die Verwendung bekannter herkömmlicher Techniken erreicht werden, die auf dem Fachgebiet gebräuchlich verwendet werden. Solche monoklonalen Antikörper können nach ihrer Herstellung auf geeigneten Trägern (z. B. in einer Säule) immobilisiert und anschließend für eine Affinitätsreinigung verwendet werden, um in einer bequemen Weise jegliche weitere Mengen herzustellen, die zum Testen des gereinigten aktiven lipolytischen Faktors von Tumorextrakten oder Körperfluiden erforderlich sind.
  • Es ist jedoch vorgesehen, dass eine weitere wichtige Anwendung solcher monoklonaler Antikörper abgesehen von ihrer Verwendung als diagnostisches Mittel eine therapeutische Anwendung auf der Basis ihrer Eigenschaften als Inhibitoren oder Antagonisten bezüglich des lipolytischen Faktors bei menschlichen Krebspatienten ist und sie dementsprechend einen therapeutischen Wert als Mittel zur Behandlung und Unterdrückung der Symptome von Kachexie und/oder zur Verhinderung oder Reduzierung des Tumorwachstums aufweisen. Folglich können sie aufgrund dieser Eigenschaften therapeutische Mittel bereitstellen und insbesondere können sie zur Herstellung einer medizinischen Zubereitung oder eines Medikaments zur therapeutischen Behandlung von mit Krebs zusammenhängender Kachexie und/oder malignen Tumoren in Säugern verwendet werden.
  • Screening-Anwendungen
  • Abgesehen von den vorstehend genannten monoklonalen Antikörpern ist es wahrscheinlich, dass ein beliebiges Mittel, das bezüglich der Aktivität dieses Lipidmobilisierungsfaktors oder dieses lipolytischen Faktors der vorliegenden Erfindung zumindest einen potenziellen therapeutischen Wert für den Menschen aufweist. Somit können Zubereitungen des gereinigten oder zumindest teilweise gereinigten lipolytischen Faktors (LMF), der hier beschrieben worden ist, gemäß eines weiteren Aspekts der vorliegenden Erfindung besonders zur Verwendung bei der Bereitstellung eines bequemen in vitro-Verfahrens zum Screenen von Substanzen zum Auffinden potenzieller anti-kachektischer Mittel und/oder Anti-Tumormittel zur the rapeutischen Verwendung nützlich sein. Ein typisches Beispiel dieser Anwendung unter Verwendung frisch hergestellter Adipozyten aus epididymalem Fettgewebe von der Maus ist nachstehend beschrieben.
  • Die Experimente werden folgendermaßen durchgeführt:
    100 μl gereinigte LMF-Zubereitung + 1 ml Fettzellen
    Zu screenende Verbindung + 1 ml Fettzellen
    100 μl LMF-Zubereitung und Verbindung + 1 ml Fettzellen
    Jede Verbindung wird bei steigenden Konzentrationen getestet und alle Proben werden zweifach hergestellt und verarbeitet.
    Die Proben werden 2 min mit einem Gemisch aus 95% O2, 5% CO2 begast, gemischt und 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Nach 2 Stunden werden 0,5 ml jeder Probe dann im Hinblick auf den Glyceringehalt getestet, wie es vorstehend beschrieben worden ist.
  • Verbindungen, die einen bestimmten signifikanten Grad an Inhibierung zeigen, können dann Kandidaten für eine weitere Bewertung sein.
  • Im Allgemeinen kann erwartet werden, dass der in solchen in-vitro-Experimenten beobachtete Inhibierungseffekt auch in vivo auftritt, und es wird erwartet, dass durch die Verwendung dieses Screening-Verfahrens weitere Antagonisten oder Inhibitoren gefunden werden, die nützliche therapeutische Anwendungen für die Behandlung von mit Krebs zusammenhängender Kachexie und/oder als Anti-Tumormittel haben.
  • MAC16-Zelllinie und Reinigung
  • Obwohl es möglich ist, dass Zubereitungen, die geeignete Mengen des gereinigten oder teilweise gereinigten aktiven Lipidmobilisierungsfaktors oder des lipolytischen Faktors enthalten, aus Extrakten von Tumoren wie z. B. MAC16-Adenokarzinom, das in vivo gewachsen ist, oder aus dem Urin von Krebs-Kachexiepatienten oder mit synthetischen Verfahren hergestellt wird, kann eine bequemere und bevorzugte alternative Quelle durch Extrakte von Tumorgewebezellkulturen bereitgestellt werden, insbesondere von Kulturen der MAC16-Zelllinie, die vorstehend genannt worden ist.
  • Die Zellen dieser Zelllinie können bequem in RPMI 1640-Medien, die 10% fetales Kälberserum enthalten, unter einer Atmosphäre von 10% CO2 in Luft gezüchtet werden. Wenn diese in Kultur gezüchteten Zellen im Adipozyten-Glycerinfreisetzungstest getestet werden, zeigt sich, dass sie eine größere Menge an Glycerin freisetzen können als entsprechende Mengen des Tumors in vivo.
  • Es ist ersichtlich, dass die vorliegende Erfindung eine Anzahl verschiedener Aspekte umfasst und es sollte beachtet werden, dass sie innerhalb ihres Schutzbereichs alle hier entweder explizit oder implizit und entweder einzeln oder kombiniert offenbarten neuen und erfinderischen Merkmale und Aspekte umfasst. Es wird auch darauf hingewiesen, dass, insoweit die Ausdrücke "Lipidmobilisierungsfaktor (LMF)", "Lipidmobilisierungsmittel" und "lipolytischer Faktor" in der vorliegenden Beschreibung verwendet werden, diese Ausdrücke allgemein als synonym betrachtet werden sollen und die gleiche Bedeutung aufweisen. Tabelle 1: Aufreinigung des Lipidmobilisierungsfaktors vom MAC16-Tumor
    Figure 00310001
    Tabelle 2: Aufreinigung des Lipidmobilisierungsfaktors vom Urin von Krebspatienten
    Figure 00310002
    Tabelle 3: Beziehung zwischen dem Gewichtsverlust und dem Auftreten von LMF im Urin
    Figure 00320001
    Tabelle 4: Effekt eines polyklonalen Antikörpers bezüglich menschlichem Zn-α2-Glycoprotein auf die Lipidmobilisierungsaktivität beim Menschen und bei der Maus
    Figure 00320002
  • LMF (5 μg menschliches LMF oder 10 μg Maus-LMF in PBS) wurden über Nacht unter Rühren bei 4°C mit einem polyklonalen Antikörper (pAb) bezüglich menschlichem Plasma-Zn-α2-Glycoprotein (10 μg in PBS) inkubiert und die Lipidmobilisierungsaktivität wurde so bestimmt, wie es in den Verfahren beschrieben worden ist. Die Ergebnisse sind als Mittelwert ± Standardabweichung für drei Bestimmungen angegeben und das Experiment wurde dreimal wie derholt. Die Differenzen der Werte in Abwesenheit von pAb wurden mit dem Student-t-Test bestimmt. Tabelle 5: Effekt von LMF, das von menschlichem Urin isoliert worden ist, auf das Körpergewicht, die Körperzusammensetzung, die Nahrungs- und Wasseraufnahme und die Serummetabolitenkonzentrationen gezüchteter männlicher NMRI-Mäuse
    Figure 00330001
  • Das Material wurde an Mäuse gemäß dem Schema in 10 verabreicht. Die Werte sind als Mittelwert ± Standardabweichung für 5 Mäuse pro Gruppe angegeben. Die Differenzen von den Kontrollwerten wurden mit dem Student-t-Test bestimmt. Tabelle 6: Effekt von menschlichem LMF auf das Körpergewicht, die Körperzusammensetzung, die Nahrungs- und Wasseraufnahme und die Serummetabolitenkonzentrationen in ob/ob-Mäusen 160 Stunden nach der ersten Injektion
    Figure 00340001
  • Das Material wurde an Mäuse gemäß dem Schema in 11 verabreicht. Die Werte sind als Mittelwert ± Standardabweichung für 5 Mäuse pro Gruppe angegeben. Die Differenzen von den Kontrollwerten wurden mit dem Student-t-Test bestimmt.
  • Literatur
    • (1) T. M. McDevitt et al., (1995), "Purification and characterisation of a lipid-mobilising factor associated with cachexia-inducing tumours in mice and humans", Cancer Research 55, 1458-1463.
    • (2) P. Todorov et al., (1996), Nature, 379, 739-742.
    • (3) Burgi und Schmid, (1961), "Preparation and properties of Zn-α2-glycoprotein of normal human plasma", J. Biol. Chem. 236, 1066-1074.
    • (4) T. Araki et al., (1988), "Complete amino acid sequence of human plasma Zn-α2-glycoprotein and its homology to histocompatibility antigens", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 679-683.
    • (5) N. Ueyama et al., (1991), "Cloning and nucleotide sequence of a human Zn-α2-glycoprotein cDNA and chromosomal assignment of its gene", Biochem. Biophys. Res. Commun. 177, 696-703.
    • (6) N. Ueyama et al., (1993), "Molecular cloning and chromosomal assignment of the gene for human Zn-α2-glycoprotein", Biochemistry 32, 12968-12976.
    • (7) H. Ueyama et al., (1994), "Structure and Expression of Rat and Mouse mRNAs for Zn-α2-glycoprotein", J. Biochem., 116, 677-681.
    • (8) Ohkubo et al., (1988), "Purification and characterisation of human plasma Zn-α2-glycoprotein", Prep. Biochem., 18, 413-430.
    • (9) Kohler et al., (1976), Eur. J. Immuno.
    • (10) D.M. Weir, "Handbook of Experimental Immunology", 3, 2. Auflage, Seiten A2.10-A2.11, Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1973.
    • (11) M.Z. Atassi and A.F.S.A. Habeeb, "Immuno-chemistry of Proteins", (Hrsg. M.Z. Atassi), 2, Seiten 177-264, Plenum, New York, 1977.
    • (12) Lanoyi und Nisonoff (1983), J. Immuno. Meth., 56, 235.
    • (13) O. Wieland (1974), in "Methods of Enzymatic Analysis", (Hrsg. H.U. Bergmeyer), Band 3, Seiten 1404-1409, Academic Press, N. Y.
    • (14) S.A. Beck et al. (1987), "Production of lipolytic and proteolytic factors by a murine tumour-producing cachexia in the host", Cancer Res. 47, 5919-5923 (Literatur 14).
  • Figure 00360001
  • Figure 00370001

Claims (24)

  1. Ein biologisch aktives Lipidmobilisierungsmittel zur Verwendung in der Therapie, wobei das Lipidmobilisierungsmittel eine durch Gelausschlusschromatographie bestimmte scheinbare Molmasse Mr von mehr als 6,0 kDa aufweist und in Säuger-Adipozyten eine Lipolyse induzieren kann, dadurch gekennzeichnet, dass das Lipidmobilisierungsmittel ein glycosyliertes Polypeptid ist, bei dem der Polypeptidrest aus einer der nachstehenden Gruppen ausgewählt ist: (a) einem Polypeptid, das die Aminosäuresequenz eines Zn-α2-Glycoproteins aufweist; (b) einem Polypeptid, das bezüglich (a) einen Mangel an einer Aminosäure oder mehreren Aminosäuren aufweist, welche die Lipidmobilisierung oder die lipolytische Aktivität nicht signifikant beeinflusst/beeinflussen; (c) einem Polypeptid, bei dem bezüglich (a) eine Aminosäure oder mehrere Aminosäuren durch eine andere Aminosäure oder andere Aminosäuren ersetzt ist/sind, welche die Lipidmobilisierung oder die lipolytische Aktivität nicht signifikant beeinflusst/beeinflussen; (d) einem Polypeptid, bei dem bezüglich (a) eine Mehrzahl zusätzlicher Aminosäuren einbezogen ist, welche die biologische lipolytische Aktivität nicht stören.
  2. Ein gereinigtes biologisch aktives Lipidmobilisierungsmittel nach Anspruch 1 zur Verwendung in der Therapie, dadurch gekennzeichnet, dass es im Wesentlichen frei von proteolytischer Aktivität ist und im Wesentlichen aus einem glycosylierten Polypeptid mit einer durch dessen elektrophoretische Mobilität in einer 15% SDS-PAGE-Elektrophorese bestimmten scheinbaren relativen Molmasse Mr von etwa 43 kDa besteht und bezüglich der Aminosäuresequenz eine Homologie mit der Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 1) von menschlichem Plasma-Zn-α2-Glycoprotein aufweist.
  3. Lipidmobilisierungsmittel nach Anspruch 2, das ferner dadurch gekennzeichnet ist, dass es durch ein Verfahren erhältlich ist, das aufeinanderfolgende Schritte des Unterwerfens von biologischem Material einer Ionenaustauschchromatographie, einer Ausschlusschromatographie und anschließend einer Hydrophobchromatographie umfasst, wobei das biologische Material Urin von einem Krebs-Kachexiepatienten oder ein Extrakt einer Kultur einer MAC16-Tumorzelllinie ist, die mit den Maßgaben des Budapester Vertrags in der European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC) unter der Zugangsnummer 89030816 hinterlegt ist.
  4. Ein biologisch aktives Lipidmobilisierungsmittel zur Verwendung in der Therapie nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Polypeptid-Aminosäuresequenz im Wesentlichen mit der Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 1) von menschlichem Plasma-Zn-α2-Glycoprotein identisch ist.
  5. Lipidmobilisierungsmittel zur Verwendung in der Therapie nach Anspruch 1 oder 4, das ferner dadurch gekennzeichnet ist, dass es eine durch dessen elektrophoretische Mobilität in einer 15% SDS-PAGE-Elektrophorese bestimmte scheinbare relative Molmasse Mr von etwa 43 kDa aufweist.
  6. Lipidmobilisierungsmittel zur Verwendung in der Therapie nach einem der Ansprüche 1 bis 5, das ferner dadurch gekennzeichnet ist, dass dessen lipidmobilisierende Eigenschaften zerstört werden, wenn es einem Abbau mit Chymotrypsin unterworfen wird.
  7. Lipidmobilisierungsmittel zur Verwendung in der Therapie nach einem der Ansprüche 1 bis 6, das ferner dadurch gekennzeichnet ist, dass es bei der Inkubation mit Mausadipozyten-Plasmamembranen ein Potenzial zur in-vitro-Stimulierung von Adenylatcyclase-Aktivität in einem Guanintriphosphat-abhängigen (GTP-abhängigen) Prozess aufweist.
  8. Lipidmobilisierungsmittel zur Verwendung in der Therapie nach einem der Ansprüche 1 bis 7, das ferner dadurch gekennzeichnet ist, dass es im Wesentlichen die gleichen immunologischen Eigenschaften wie menschliches Zn-α2-Glycoprotein aufweist.
  9. Ein biologisch aktives Lipidmobilisierungsmittel zur Verwendung in der Therapie, wobei das Lipidmobilisierungsmittel in Säuger-Adipozyten eine Lipolyse induzieren kann, dadurch gekennzeichnet, dass es eine durch Gelausschlusschromatographie bestimmte scheinbare Molmasse Mr von mehr als 6,0 kDa aufweist und ein Fragment eines Glycoproteins oder eines glycosylierten Polypeptids ist, das eine Komponente des Lipidmobilisierungsmittels nach einem der Ansprüche 1 bis 8 ist und durch Abbau dieses Lipidmobilisierungsmittels mit Trypsin erzeugt wird.
  10. Lipidmobilisierungsmittel zur Verwendung in der Therapie nach einem der vorstehenden Ansprüche, das ferner dadurch gekennzeichnet ist, dass es im Wesentlichen frei von proteolytischer Aktivität ist.
  11. Lipidmobilisierungsmittel zur Verwendung in der Therapie nach einem der vorstehenden Ansprüche, das ferner dadurch gekennzeichnet ist, dass die Polypeptidkette der Polypeptidkomponente eine N-Endgruppe aufweist, die durch einen Pyroglutamatrest blockiert ist.
  12. Lipidmobilisierungsmittel zur Verwendung in der Therapie nach einem der vorstehenden Ansprüche, das ferner dadurch gekennzeichnet ist, dass die Lipidmobilisierungsaktivität durch Periodatbehandlung zerstört wird.
  13. Verwendung eines Lipidmobilisierungsmittels nach einem der vorstehenden Ansprüche zur Herstellung eines Medikaments, das in der Humanmedizin zur Behandlung von Übergewicht oder Adipositas und/oder zur Stimulierung der Muskelentwicklung geeignet ist.
  14. Ein Verfahren zur Isolierung und Reinigung eines Lipidmobilisierungsmittels, das die Eigenschaften und Charakteristika eines Zn-α2-Glycoproteins aufweist, wobei das Verfahren das Unterwerfen eines Extrakts eines Kachexie-induzierenden Tumors oder einer Kultur einer Kachexie-induzierenden Tumorzelllinie oder einer Probe von Urin oder eines anderen Körperfluids eines Säugers, der einen Kachexie-induzierenden Tumor aufweist, einer Kombination aus einer Ionenaustauschchromatographie, einer Gelfiltrations-Größenausschlusschromatographie und einer Hydrophobchromatographie, und Isolieren eines einzelnen Produkts oder von molekularen Spezies mit einer durch 15% SDS-PAGE-Elektrophorese bestimmten scheinbaren relativen Molmasse von 43 kDa, das/die im Wesentlichen frei von proteolytischer Aktivität ist/sind, umfasst.
  15. Eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung bei der Behandlung von Säugern, wobei die Zusammensetzung als aktiven Bestandteil eine effektive therapeutische Menge eines Lipidmobilisierungsmittels nach einem der Ansprüche 1 bis 12 zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger, Verdünnungsmittel oder Vehikel umfasst.
  16. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 15, welche eine injizierbare Formulierung ist, die einen Träger in Form eines pharmazeutisch verträglichen Injektionsvehikels umfasst.
  17. Verwendung eines Lipidmobilisierungsmittels nach einem der Ansprüche 1 bis 12 zur Erzeugung von Antikörpern zur Verwendung als diagnostisches Nachweismittel zur Verwendung in der Therapie als Inhibitoren oder Antagonisten bezüglich des Lipidmobilisierungsmittels, das in Krebspatienten Kachexie verursacht.
  18. Verwendung einer Antikörperzubereitung zur Herstellung einer medizinischen Zubereitung oder eines Medikaments zur Behandlung von Krebs und/oder Tumoren, die mit Kachexie zusammenhängen, wobei die Antikörper das Lipidmobilisierungsmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 12 spezifisch erkennen und binden können.
  19. Verwendung einer Antikörperzubereitung nach Anspruch 18, wobei die Antikörper monoklonale Antikörper sind.
  20. Verwendung eines Lipidmobilisierungsmittels nach einem der Ansprüche 1 bis 12 zum Screening und Identifizieren und/oder zur Durchführung von Untersuchungen möglicher, die lipolytische Aktivität hemmender Mittel, die ein Potenzial als therapeutische Anti-Kachexie-Mittel oder Antitumormittel aufweisen.
  21. Verwendung nach Anspruch 20, wobei Proben möglicher Antagonisten oder Inhibitoren der Aktivität des Lipidmobilisierungsmittels Zubereitungen des Lipidmobilisierungsmittels zugesetzt werden, worauf in vitro mit einer Zubereitung von Adipozyten inkubiert und zur Bestimmung des Grads der lipolytischen Aktivität bezogen auf eine Kontrollprobe ein Test durchgeführt wird.
  22. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 15, wobei die Zusammensetzung eine Formulierung ist, die zur oralen Verabreichung geeignet ist und in Form von diskreten Einheiten vorliegt, die aus der Gruppe bestehend aus Kapseln, Oblatenkapseln, Tabletten und Pastillen ausgewählt sind, wobei jede dieser Einheiten eine vorbestimmte Menge des aktiven Bestandteils in Form eines Pulvers oder von Körnchen enthält.
  23. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 15, wobei die Zusammensetzung eine Formulierung ist, die zur oralen Verabreichung geeignet ist und eine Suspension des Wirkstoffs in einer wässrigen oder nicht-wässrigen Flüssigkeit ist.
  24. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 23, wobei die Formulierung aus der Gruppe bestehend aus einem Sirup, einem Elixier und einer Emulsion ausgewählt ist.
DE69906064T 1998-05-29 1999-06-01 Glycoproteine mit lipidmobilisierenden eigenschaften und deren therapeutische verwendungen Expired - Lifetime DE69906064T2 (de)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB9811465 1998-05-29
GBGB9811465.5A GB9811465D0 (en) 1998-05-29 1998-05-29 Glycoproteins having lipid mobilising properties and therapeutic applications thereof
PCT/GB1999/001509 WO1999062939A2 (en) 1998-05-29 1999-06-01 Glycoproteins having lipid mobilising properties and therapeutic applications thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE69906064D1 DE69906064D1 (de) 2003-04-24
DE69906064T2 true DE69906064T2 (de) 2004-03-04

Family

ID=10832846

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE69906064T Expired - Lifetime DE69906064T2 (de) 1998-05-29 1999-06-01 Glycoproteine mit lipidmobilisierenden eigenschaften und deren therapeutische verwendungen

Country Status (10)

Country Link
US (6) US6890899B1 (de)
EP (1) EP1082344B1 (de)
JP (2) JP2002519303A (de)
AT (1) ATE234862T1 (de)
AU (1) AU4152799A (de)
CA (1) CA2329138C (de)
DE (1) DE69906064T2 (de)
ES (1) ES2194464T3 (de)
GB (1) GB9811465D0 (de)
WO (1) WO1999062939A2 (de)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1432803B1 (de) * 2001-10-05 2007-12-12 Serono Genetics Institute S.A. Fragmente des humanen zn-alpha2-glykoproteins und deren verwendung in methoden zur behandlung der fettleibigkeit
JP2005514010A (ja) * 2001-10-12 2005-05-19 セローノ ジェネティクス インスティテュート ソシエテ アノニム Ｎｇｚｉｐａ、ｎｇｚｉｐｄ、ｐｇｚｉｐａおよびｐｇｚｉｐｄポリヌクレオチドおよびポリペプチド、ならびにその使用
EP1548445A3 (de) * 2003-12-22 2005-11-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Neue Ziele im Fettgewebe zur Fettleibigkeit
JP2009515538A (ja) * 2005-11-15 2009-04-16 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー Ａｚｇｐ遺伝子の一塩基多型（ｓｎｐ）
WO2007066484A1 (ja) * 2005-12-08 2007-06-14 Sapporo Breweries Limited ストレス判定方法、ストレス判定用マーカー、ストレス判定用診断薬及びストレス判断システム
EP2318021A4 (de) * 2008-06-26 2012-10-31 Healthlinx Ltd Protokolle zur behandlung und prävention von fettsucht und daraus entstehenden komplikationen
US20100173829A1 (en) * 2008-11-07 2010-07-08 Aston University Glycoproteins Having Lipid Mobilizing Properties and Therapeutic Uses Thereof
AU2011268780A1 (en) * 2010-06-25 2013-02-07 Aston University Glycoproteins having lipid mobilizing properties and therapeutic uses thereof
EP2673065B1 (de) 2011-02-10 2015-12-09 Academisch Ziekenhuis Leiden Acting Under The Name Leiden University Medical Center Verfahren zur reinigung eines glycans und/oder eines glycokonjugates durch chromatografie unter verwendung einer stationären phase mit baumwolle
AU2013298343A1 (en) * 2012-07-31 2015-02-19 Aston University Targeted oesophageal administration of Zn-alpha2-glycoproteins (ZAG), methods and formulations thereof
EP3633381A3 (de) 2013-12-05 2020-07-29 The Broad Institute, Inc. Zusammensetzungen und verfahren zur identifikation und behandlung von kachexie oder präkachexie
WO2017106196A1 (en) 2015-12-14 2017-06-22 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for treating cardiac dysfunction

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8806471D0 (en) * 1988-03-18 1988-04-20 Tisdale M J Biologically active material characterised by catabolic activity generally associated with cachexia inducing tumours
US6242246B1 (en) * 1997-12-15 2001-06-05 Somalogic, Inc. Nucleic acid ligand diagnostic Biochip

Also Published As

Publication number Publication date
CA2329138C (en) 2010-12-21
JP2013177395A (ja) 2013-09-09
DE69906064D1 (de) 2003-04-24
GB9811465D0 (en) 1998-07-29
US20140242089A1 (en) 2014-08-28
US20060160723A1 (en) 2006-07-20
ATE234862T1 (de) 2003-04-15
JP2002519303A (ja) 2002-07-02
WO1999062939A3 (en) 2000-03-16
EP1082344B1 (de) 2003-03-19
CA2329138A1 (en) 1999-12-09
US20160046704A1 (en) 2016-02-18
AU4152799A (en) 1999-12-20
US6890899B1 (en) 2005-05-10
US20100151589A1 (en) 2010-06-17
ES2194464T3 (es) 2003-11-16
US7550429B2 (en) 2009-06-23
US20150183843A1 (en) 2015-07-02
WO1999062939A2 (en) 1999-12-09
EP1082344A2 (de) 2001-03-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69837678T2 (de) Compositions zur inhibierung der proliferation glatter muskulatur und verfahren zur diagnose von arteriosklerose
DE69017753T2 (de) Tumor-Nekrosefaktor-Bindungsprotein II, seine Reinigung und spezifische Antikörper.
DE68910354T2 (de) Menschliches mutantes Angiogenin (Angiogenese-Faktor mit überlegener Angiogenin-Aktivität), Gene dafür und Methode zur Expression.
DE69034244T2 (de) Zytotoxischer Lymphozyten-Reifefaktor 35kD Untereinheit und monoklonale Antikörper spezifisch dafür
DE69006100T2 (de) Fibronektin-Derivate.
DE69028671T3 (de) Löslisches extrazellulares Fragment des menschlischen IFN-beta 2/IL-6-Rezeptors, seine Herstellung und diesen Fragment enthaltende pharmazeutische Mischung
DE69014474T2 (de) Antikörper gegen TNF-Bindungsprotein I und deren F(ab)-Fragmente.
DE3650150T2 (de) Modulator der anabolischen Aktivität und seine Verwendungen.
DE69126430T2 (de) Ligand für das neu-gen-produkt
DE69023637T2 (de) Bakterien transformiert mit Expressionsplasmiden, die für den menschlichen NEUROTHROPHEN WIMPER FAKTOR (h-CNTF) kodieren, ihre Verwendung in der Herstellung von h-CNTF, Antikörper gegen h-CNTF und die Anwendung von h-CNTF in medizischer Behandlung.
DE69633717T2 (de) Monoklonale anti-cd6 antikörper zur behandlung und diagnose von psoriasis
DE3750342T2 (de) Menschliches gamma-interferon-spezifisches Rezeptorprotein, Antikörper gegen dieses Protein, Verfahren zur Herstellung dieses Proteins und dieses Antikörpers und dieses Protein und diesen Antikörper enthaltende Zusammensetzungen.
DE69905368T2 (de) Oxydiertes thymosin beta 4
US20160046704A1 (en) Glycoproteins having lipid mobilising properties and therapeutic applications thereof
DE3881801T2 (de) Menschliche somatomedin-träger-protein-untereinheiten und verfahren zu ihrer herstellung.
EP1003786A1 (de) Peptid mit radioprotektiver wirkung
DE69029970T2 (de) Zusammensetzungen zur hemmung der bildung von proteinhormon und deren verwendungen
DE68921979T2 (de) Antikörper für die antilymphozyten-antikörpertherapie.
DE69712124T2 (de) Hormones de croissance humaines mutantes et leur utilisation
EP0340604B1 (de) Monoklonaler Antikörper und seine Verwendung
EP1423425B1 (de) Rezeptor, dessen verwendung sowie mausantikörper
EP0805204B1 (de) Nebenhoden-spezifisches Rezeptorprotein und dessen Verwendung
DE69434024T2 (de) Auf humanen cortikalen thymozyten exprimierte oberflächenproteine und ihre verwendung
DE69417872T2 (de) Inhibitor peptid spezifisch für cathepsin-l
DE3880758T2 (de) Von monozyten abstammendes gefaesswirksames protein und dessen analogen, verfahren zu seiner gewinnung und ihre verwendungen fuer therapeutische zwecke und zur antikoerperherstellung.

Legal Events

Date Code Title Description
8364 No opposition during term of opposition
8328 Change in the person/name/address of the agent

Representative=s name: ZEITLER, VOLPERT, KANDLBINDER, 80539 MUENCHEN

8327 Change in the person/name/address of the patent owner

Owner name: ASTON UNIVERSITY, BIRMINGHAM, GB