DE69905368T2

DE69905368T2 - Oxydiertes thymosin beta 4

Info

Publication number: DE69905368T2
Application number: DE69905368T
Authority: DE
Inventors: John Lawrence; John Pappin; Duncan Stevenson; John Young
Original assignee: IMP CANCER RES TECHNOLOGY ICRT; University of Glasgow
Current assignee: IMP CANCER RES TECHNOLOGY ICRT; University of Glasgow
Priority date: 1998-03-28
Filing date: 1999-03-29
Publication date: 2003-12-18
Anticipated expiration: 2019-03-30
Also published as: US20060229234A1; NZ507642A; US6602519B1; ZA200005196B; IL138665A0; CN1644586A; US20040213772A1; CN1178695C; WO1999049883A2; GB9806632D0; AU766493B2; DE69905368D1; CN1308543A; KR20010074461A; ATE232396T1; AU3155399A; ES2192839T3; WO1999049883A3; CA2325984A1; JP2002509893A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft oxidiertes Thymosin β4, das aus Steroidbehandelten Monozyten isoliert worden ist. Insbesondere betrifft die Erfindung oxidiertes Thymosin β4, das verwendet werden kann um Steroidtherapie zu ersetzen.
Steroide werden effektiv zur Behandlung von Entzündungen wie etwa Asthma, Ekzem, allergischen Reaktionen, und rheumatischen Erkrankungen wie etwa rheumatoide Arthritis verwendet. Steroide haben jedoch schwerwiegende Nebenwirkungen und werden daher nur in Fällen verwendet, bei denen nichtsteroide entzündungshemmende Arzneimittel nicht wirksam sind.
Monozyten sind wichtige Immuneffektorzellen, die eine fundamentale Rolle in zellulärer Immunität spielen. Zusätzlich zu ihren Antigen-präsentierenden und phagozytischen Aktivitäten an Entzündungsorten sind mononukleare Zellen aus peripherem Blut auch an der Synthese und Freisetzung einer Reihe von entzündungsfördernden Enzymen und Polypeptidcytokinen, welche die Reaktionen von Neutrophilen modulieren, beteiligt. Die Produktion dieser Komponenten kann durch Glucocorticoide unterdrückt werden, und dies ist als die Grundlage derer entzündungshemmender Wirkung vorgeschlagen worden.
Die Wirkung von Steroid-induzierten Faktoren auf die Migration von Neutrophilen ist primär von Interesse für die Aufklärung entzündungshemmender Mechanismen. Corticosteroide regulieren die Synthese von vielen entzündungsfördernden Mediatoren nach unten (Lew et al., 1988; Almawi et al., 1991; Stanford et al., 1992), aber manche ihrer Wirkungen können als eine Regulation von entzündungshemmenden Mediatoren nach oben interpretiert werden.
Die eine Migration von Neutrophilen stimulierende Aktivität von Steroidinduzierten Faktoren legt nahe, dass dispersive Fortbewegung tendenziell die Zellen davon abhält, sich an einem Entzündungsherd zu sammeln, und dies kann für die Beendigung von Entzündungsreaktionen von Bedeutung sein.
Stevenson (1973, 1974, 1978) zeigte, dass Humanmonozyten bei Inkubation in der Gegenwart von entzündungshemmenden Corticosteroiden einen Protease- empfindlichen Faktor freisetzen, der die Migration von Neutrophilen aus einem Zellpellet, das in einer kurzen Kapillarröhre enthalten ist, fördert.
Spätere Untersuchungen zeigten, dass das Phänomen der stimulierten Neutrophilenmigration auch mit Leukozyten aus Patienten, die eine Steroidtherapie erhielten, beobachtet wird.
Vor kurzem untersuchten Chettibi et al. (1993, 1994) die Steroid-induzierte stimulatorische Wirkung auf die Neutrophilenmigration unter Verwendung eines automatisierten Zellverfolgungsassays, der die Untersuchung des Verhaltens von Zellen, welche auf einem Protein-beschichteten Deckglas migrieren, ermöglicht.
Diese Studien zeigten:
1. Überstand von Steroid-behandelten Monozyten (STMS, steroid-treated monocyte supernatant) ruft eine dramatische Erhöhung der Fortbewegungsgeschwindigkeit von Humanneutrophilen und eine signifikante Verringerung ihrer Adhäsion auf Protein-beschichtetem Glas hervor. Im Gegensatz dazu haben Überstände von Kontrollmonozyten eine geringere Wirkung auf die Fortbewegungsgeschwindigkeit, rufen aber eine starke Erhöhung ihrer Adhäsionsfähigkeit hervor.
2. Die Aktivität des Überstands wurde genauso gut in Gegenwart oder Abwesenheit von Serum nach 24-stündiger Kultivierung bei 37ºC mit 10&supmin;&sup6; M Dexamethason erzeugt.
3. Die Wirkung des Überstands von Steroid-behandelten Monozyten auf die Fortbewegungsgeschwindigkeit von Humanneutrophilen aus peripherem Blut wurde durch polyklonale Antiseren aus Kaninchen gegen die Lipocortine 1-6 nicht verändert.
4. Anti-Interleukin-8-Antikörper aus Kaninchen, der die Wirkung von IL-8 auf die Fortbewegungsgeschwindigkeit von Neutrophilen blockierte, hatte keine antagonistische Wirkung auf die fortbewegungsstimulierende Wirkung von Überstand von Steroid-behandelten Monozyten.
5. Die exozelluläre Freisetzung dieses Faktors bzw. dieser Faktoren durch mononukleare Humanleukozyten legt nahe, dass sie ein in vivo Mediator der entzündungshemmenden Wirkung von Glucocorticoiden sind.
Es gibt jedoch keine Offenbarung darüber, was der bzw. die Wirkstoffe in STMS sein könnten.
Huff T. et al. (1995) und Heintz D. et al. (1994) beschreiben Untersuchungen über beta-Thymosine, und wie sie in einem biomolekularen Komplex mit G-Actin wechselwirken und unter Hochsalzbedingungen die Polymerisation zu F-Actin inhibieren. Es ist offenbart, dass die oxidierte Form von Thymosin β4 die Actinpolymerisation inhibiert, jedoch nur in einer 20-fach höheren Konzentration als Thymosin β4. Keines der Dokumente legt jedoch eine medizinische Rolle für oxidiertes Thymosin β4 nahe. Tatsächlich scheinen die Dokumente von einer positiven Rolle für oxidiertes Thymosin β4 weg zu lehren.
US-A-5,578,570 (Goldstein et al.) offenbart ein Verfahren zur Behandlung von septischem Schock durch Verabreichung von Thymosin β4. Es gibt jedoch keine Offenbarung in Bezug auf oxidiertes Thymosin β4, oder einen Vorschlag, dass dieses eine Rolle bei der Behandlung von septischem Schock haben könnte.
Es ist ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung, einen Ersatz für Steroidtherapie bereitzustellen.
Die vorliegende Erfindung beruht zum Teil auf den Beobachtungen durch die jetzigen Erfinder, dass der mit der Fortbewegung von Neutrophilen assoziierte Faktor eine oxidierte Form von Thymosin β4 ist.
Gemäß einem ersten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung von oxidiertem Thymosin β4 oder einer physiologisch aktiven Variante davon zur Therapie bereit.
Typischerweise ist oxidiertes Thymosin β4 eine Form von Thymosin β4, bei der ein Methioninrest, 6 Aminosäuren vom N-Terminus, (Met6) oxidiert ist, so dass der Rest zu Methioninsulfoxid umgesetzt worden ist. Darüber hinaus kann der Methioninrest (Met6) weiter zum Methioninsulfon oxidiert werden, und dies wird als solches auch von der vorliegenden Erfindung umfasst. Andere Modifikationen des Methioninrests können ebenfalls in Erwägung gezogen werden, wie etwa eine Komplexierung des Schwefels mit Metallen, was zu einer aktiven Form von Thymosin β4, ähnlich der hierin beschriebenen oxidierten Form führen kann.
Es wird verstanden, dass das oxidierte Thymosin β4 beispielsweise durch Reaktion von nativem Thymosin β4 unter oxidierenden Bedingungen erhalten werden kann, beispielsweise durch Behandlung mit Wasserstoffperoxid, wobei oxidiertes Thymosin β4 gebildet wird. Somit kann zunächst natives Thymosin β4 erhalten werden und danach zu der oxidierten Form oxidiert werden.
Es wurde beobachtet, dass Proben von nativem Thymosin β4 geringe Gehalte, wie etwa 10%, an oxidiertem Thymosin β4 enthalten können, von denen angenommen wird, dass sie das Ergebnis von Autoxidation sind. Die jetzigen Erfinder sind jedoch die ersten, die die oxidierte Form von Thymosin β4 mit einer physiologischen Aktivität assoziieren. In allgemeinen Worten stellt die vorliegende Erfindung daher die Verwendung von gereinigtem oxidierten Thymosin β4 bereit. Typischerweise stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung von Präparationen von gereinigtem oxidierten Thymosin β4 bereit, die mindestens 30%, bevorzugt 60%, stärker bevorzugt 80%, am meisten bevorzugt 90% oxidiertes Thymosin β4 umfassen, wobei der Restanteil nichtoxidiertes Thymosin β4 ist. Bevorzugt umfassen die Präparationen von oxidiertem Thymosin β4 jedoch im Wesentlichen ausschließlich oxidiertes Thymosin β4 (d. h. im Wesentlichen kein nicht-oxidiertes Thymosin β4).
Thymosin β4 in einer oxidierten oder nicht-oxidierten Form kann aus jeder geeigneten Quelle erhalten werden, beispielsweise aus Steroid-behandelten Monozyten. Darüber hinaus kann das Thymosin β4 aus jeder geeigneten Spezies stammen, hat aber typischerweise eine Herkunft aus Säugern, wie etwa eine Herkunft aus Rind, Pferd, Maus oder Mensch. Es ist festzustellen, dass Thymosin β4 aus Rind, Pferd, Maus, Ratte und Mensch identische Sequenzen hat. Somit kann beispielsweise Thymosin β4 aus Rind eine geeignete Quelle für Thymosin β4 zur nachfolgenden Oxidation und Verabreichung einer anderen Spezies, wie etwa Menschen, bereitstellen.
Es wird verstanden, dass physiologisch aktive Varianten des oxidierten Thymosin β4 Varianten sind, welche die gleichen oder ähnliche physiologische Eigenschaften wie das oxidierte Thymosin β4 zeigen. Es ist vorzuziehen, dass derartige Varianten das oxidierte Methionin umfassen, aber sie können verkürzte, deletierte oder mutierte Formen davon sein.
Es wird verstanden werden, dass Variationen (natürliche oder andere) zu dem hierin umfassten besonderen oxidierten Thymosin β4 existieren können. Diese Variationen können veranschaulicht werden durch eine oder mehrere Aminosäureunterschiede in der Gesamtsequenz oder durch Deletionen, Substitutionen, Insertionen, Inversionen oder Additionen einer oder mehrerer Aminosäuren in der Sequenz. Alle derartigen Derivate werden vom Schutzumfang dieser Erfindung umfasst, vorausgesetzt dass die Derivate physiologisch aktiv sind (d. h. die Aktivität von oxidiertem Thymosin β4, wie hierin definiert, zeigen). Beispielsweise können bei der vorliegenden Erfindung konservative Austausche zwischen Aminosäuren innerhalb der nachfolgenden Gruppen ausgeführt werden:
(I) Alanin, Serin und Threonin;
(II) Glutaminsäure und Asparaginsäure;
(III) Arginin und Lysin;
(IV) Asparagin und Glutamin;
(V) Isoleucin, Leucin und Valin;
(VI) Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan;
(VII) Methionin und andere Methioninanaloga;
(VIII) Methionin und andere Methioninanaloga, bei denen der Schwefel durch Gruppe VIB-Elemente (z. B. Selen, Tellur, Polonium) ersetzt ist;
(IX) oxidisiertes Methionin und andere oxidierte Methioninanaloga (z. B. Gruppe VIB-Analoga, Methioninsulfoximin);
(X) Methionin und andere Schwefel-enthaltende Aminosäuren (z. B. Cystein), einschließlich derer oxidierten Analoga.
Frühe Molekülmodellierstudien legen nahe, dass der Methioninrest (Met-6) an der Spitze von einer aus drei Helices im Peptid liegt. Molekülmodellierung sollte helfen, ein kürzeres Peptid zu identifizieren, das die für STMS und oxidiertes Thymosin β4 beobachtete Aktivität haben kann, und es wäre ein bevorzugtes Molekül zur Verwendung bei der Herstellung von Arzneimitteln mit entzündungshemmender Aktivität.
Tatsächlich kann dies die Entwicklung von Peptidmimetika unterstützen, welche die gleiche physiologische Funktion wie oxidiertes Thymosin β4 zeigen.
Darüber hinaus kann es möglich sein, die Halbwertszeit von oxidiertem Thymosin β4 oder physiologisch aktiven Varianten davon durch die Verwendung geeigneter chemischer Modifizierung (z. B. Acetylierung) oder die Verwendung von D-Aminosäuren zu erhöhen.
Das isolierte oxidierte Thymosin β4 kann einen blockierten N-Terminus aufweisen.
Erfindungsgemäß wird auch ein synthetisches oxidiertes Thymosin β4 bereitgestellt, umfassend die Peptidsequenz von Thymosin β4 in oxidierter Form, oder physiologisch aktive Varianten davon.
Das synthetische oxidierte Thymosin β4 kann wie vorstehend beschrieben modifiziert sein oder Aminosäuren ausgetauscht haben, solange die physiologische Aktivität aufrechterhalten bleibt. Beispielsweise könnte Selenomethionin anstelle von Methionin eingeführt werden und auf die gleiche Weise oxidiert werden.
Die Erfindung stellt weiter die Verwendung eines oxidierten Proteins wie hierin beschrieben bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer chronischen oder akuten Entzündung bereit. Derartige Entzündungen umfassen entzündliche Arthropathien, wie etwa rheumatoide Arthritis, Arthritis psoriatica, Kristallarthritis, reaktive Arthritis, ankylosierende Spondylitis, infektiöse Arthritis, juvenile chronische Arthritis; Bindegewebserkrankungen, wie etwa systemischer Lupus erythematodes, Sjörgen Syndrom, Polymyalgia rheumatica, Temporalarteriitis; vaskulärentzündliche Syndrome, wie etwa Wegener Granulomatose, Polyarteriitis nodosa, Churg-Strauss Syndrom; Atemwegserkrankungen, wie etwa Asthma, chronische obturierende Lungenerkrankung, fibröse Alveolitis, Überempfindlichkeitslungenentzündung, Sarkoidose, allergische Aspergillose, kryptogenetische Lungeneosinophilie, obturierende Bronchiolitis organisierende Pneumonie; dermatologische Erkrankungen, wie etwa entzündliche Dermatose, umfassend Psoriasis, Ekzem, Urtikaria; gastrointestinale Erkrankungen, wie etwa ulzeröse Colitis, Morbus Chron, lupoide Hepatitis; hämatologische Erkrankungen, wie etwa hämolytische Anämie, idiopathische Thrombozytopenie, multiples Myelom, Lymphom/Leukämie; Transplantation/Prothesen, wie etwa Gewebsabstoßung, Transplantat-Wirt-Reaktion, Gewebsreaktion auf implantierte Prothesen; und Infektionen, wie etwa Tuberkulose, Malaria, Pneumocystis carinii Pneumonie, Lepra.
Darüber hinaus kann oxidiertes Thymosin β4 in Kombination mit anderen Arzneimitteln verabreicht werden, z. B. Cytokinen wie etwa Interferon, die als Nebenwirkung eine Entzündungsreaktion induzieren können. Somit kann in einem Aspekt oxidiertes Thymosin β4 zur Minimierung oder Verminderung von physiologischen Zuständen oder Entzündungen dienen, welche zum Teil durch eine unangemessene Entzündung gekennzeichnet sind.
Zusätzlich sollte erkannt werden, dass die vorstehend erwähnten Verwendungen von oxidiertem Thymosin β4 sich nicht nur auf Humanerkrankungen erstrecken. Somit kann oxidiertes Thymosin β4 bei der Behandlung von Tieren wie etwa Katzen, Hunden, Pferden, Kühen, Schafen, Schweinen und Ziegen mit ähnlichen Erkrankungen wie den vorstehend erwähnten verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung stellt weiter die Verwendung von oxidiertem Thymosin β4 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von septischem Schock bereit. Typischerweise liegt das oxidierte Thymosin β4 in einer gereinigten Form vor, wie vorstehend beschrieben.
Die Erfindung stellt weiter eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, umfassend oxidiertes Thymosin β4, wie hierin beschrieben.
Die Erfindung stellt weiter die Verwendung eines Nukleotidmoleküls mit einer Sequenz, welche für Thymosin β4 wie hierin beschrieben kodieren kann, bereit, zur nachfolgenden Herstellung von oxidiertem Thymosin β4.
In einer besonderen Ausführungsform stellt die Erfindung die Verwendung eines oder mehrerer das Nukleotidmolekül umfassenden Vektoren zur Herstellung von oxidiertem Thymosin β4 und verkürzter, deletierter und mutierter Formen davon, wie hierin beschrieben, bereit.
Alternativ stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung eines oder mehrerer das Nukleotidmolekül umfassenden Vektoren zur Herstellung eines Arzneimittels, umfassend oxidiertes Thymosin β4 und verkürzte, deletierte und mutierte Formen davon, zur Behandlung einer Entzündung, bereit.
Die Verwendung von oxidiertem Thymosin β4 wie hierin beschrieben anstelle einer Steroidbehandlung wird die Nebenwirkungen, die üblicherweise mit der Verwendung von Steroiden assoziiert sind, lindern.
Das oxidierte Thymosin β4 kann zur Behandlung von Patienten verwendet werden, bei denen derzeit aufgrund der Gefahr von Nebenwirkungen nichtsteroide entzündungshemmende Arzneimittel als eine Alternative zu Steroiden verwendet werden.
Die Verwendung von hoch gereinigtem oxidierten Thymosin β4 oder von synthetischem oder exprimiertem Thymosin β4, das danach oxidiert wird, wird sicher und zuverlässig sein, da es im Allgemeinen für den Körper, dem es verabreicht wird, nicht fremd ist.
Es können genaue Mengen verabreicht werden.
Die Menge an oxidiertem Thymosin β4, welche für Wirksamkeit in einer Behandlung erforderlich ist, wird natürlich variieren, und unterliegt letztendlich dem Ermessen des behandelnden Arztes oder Veterinärs. Die zu berücksichtigenden Faktoren umfassen die zu behandelnde Erkrankung, den Verabreichungsweg und die Natur der Formulierung, das Körpergewicht des Empfängers, Oberfläche, Alter und Allgemeinzustand, und die besondere, zu verabreichende Verbindung. Eine geeignete wirksame Dosis kann im Bereich von etwa 0,001 bis etwa 120 mg/kg Körpergewicht liegen, z. B. von 0,01 bis etwa 120 mg/kg Körpergewicht, bevorzugt im Bereich von etwa 0,01 bis etwa 50 mg/kg, beispielsweise 0,05 bis 20 mg/kg. Die gesamte Tagesdosis kann als eine Einzeldosis, als mehrere Dosen, z. B. zwei bis sechs Mal täglich, oder durch intravenöse Infusion während eines ausgewählten Zeitraums verabreicht werden. Für einen Säuger (z. B. einen Menschen) mit einem Gewicht von 75 kg kann der Dosisbereich beispielsweise von etwa 8 bis 9000 mg pro Tag betragen, und eine typische Dosis könnte etwa 50 mg pro Tag betragen. Wenn mehrere getrennte Dosen indiziert sind, könnte die Behandlung typischerweise aus 15 mg oxidiertem Thymosin β4, die bis zu vier Mal täglich verabreicht werden, bestehen.
Obwohl es möglich ist, den Wirkstoff alleine zu verabreichen, ist es bevorzugt den Wirkstoff in einer pharmazeutischen Formulierung zu präsentieren. Erfindungsgemäße Formulierungen zur medizinischen Verwendung umfassen oxidiertes Thymosin β4 oder ein Salz davon zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch akzeptablen Trägern und gegebenenfalls anderen therapeutischen Bestandteilen. Der oder die Träger sollten in dem Sinne pharmazeutisch akzeptabel sein, dass sie mit den anderen Bestandteilen der Formulierung kompatibel sind und für den Empfänger nicht schädlich sind.
Die vorliegende Erfindung stellt somit eine pharmazeutische Formulierung bereit, welche oxidiertes Thymosin β4 oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz oder physiologisch funktionales Derivat davon zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger dafür umfasst.
Es wird auch ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Formulierung bereitgestellt, umfassend das in Assoziation Bringen von oxidiertem Thymosin β4 oder einem pharmazeutisch akzeptablen Salz oder physiologisch funktionalen Derivat davon mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger dafür.
Erfindungsgemäße Formulierungen umfassen diejenigen, welche für orale, nasale, topische, vaginale, rektale oder parenterale (umfassend subkutane, intraarthroidale (d. h. in Gelenke), intramuskuläre und intravenöse) Verabreichung geeignet sind, einschließlich biolistische Verabreichung, z. B. Powderject®. Bevorzugte Formulierungen sind diejenigen, welche für orale, topische oder parenterale Verabreichung geeignet sind.
Die Formulierungen können günstig in Einheitsdosisform dargestellt werden und gemäß jeder der in der Pharmazie gut bekannten Techniken hergestellt werden. Alle Methoden umfassen den Schritt des in Assoziation Bringens des Wirkstoffs mit einem Träger, der einen oder mehrere Hilfsstoffe ausmacht. Im Allgemeinen werden die Formulierungen hergestellt durch gleichförmiges und inniges in Assoziation Bringen des Wirkstoffs mit einem flüssigen Träger oder einem fein verteilten festen Träger, oder mit beiden, und danach Formen des Produkts zu einer gewünschten Formulierung, sofern erforderlich.
Erfindungsgemäße, zur oralen Verabreichung geeignete Formulierungen können dargestellt werden als diskrete Einheiten als Kapseln, Kachets, Tabletten, Pastillen, welche den Wirkstoff in einer geschmackskorrigierten Basis, üblicherweise Sucrose und Akazie oder Traganth umfassen; als Pastillen, welche den Wirkstoff in einer inerten Basis wie etwa Gelatine und Glyzerin oder Sucrose und Akazie umfassen; und als Mundspülungen, welche den Wirkstoff in einem geeigneten flüssigen Träger umfassen. Jede Formulierung enthält im Allgemeinen eine vorbestimmte Menge des Wirkstoffs als ein Pulver oder als Körnchen, oder als eine Lösung oder Suspension in einer wässrigen oder nichtwässrigen Flüssigkeit wie etwa einem Sirup, einem Elixier, einer Emulsion oder einem Trunk und dergleichen.
Eine Tablette kann durch Kompression oder Formung, gegebenenfalls mit einem oder mehreren Hilfsstoffen hergestellt werden. Presstabletten können hergestellt werden durch Komprimieren des Wirkstoffs in einer rieselfähigen Form wie etwa einem Pulver oder Körnchen, gegebenenfalls gemischt mit einem Bindemittel (z. B. Povidon, Gelatine, Hydroxypropylcellulose), einem Gleitmittel, einem inerten Verdünnungsmittel, einem Konservierungsmittel, einem Desintegrationsmittel (z. B. Natriumstärkeglycolat, vernetztes Povidon, vernetzte Natriumcarboxymethylcellulose), einem oberflächenaktiven Mittel oder einem Dispergiermittel, in einer geeigneten Vorrichtung. Formtabletten können hergestellt werden durch Formen der pulverförmigen, mit einem inerten flüssigen Verdünnungsmittel angefeuchteten Verbindung in einer geeigneten Vorrichtung. Die Tabletten können gegebenenfalls beschichtet oder eingekerbt werden und können derart formuliert werden, so dass sie eine langsame oder gesteuerte Freisetzung des Wirkstoffs darin bereitstellen, beispielsweise unter Verwendung von Hydroxypropylmethylcellulose in variierenden Anteilen, um das gewünschte Freisetzungsprofil bereitzustellen.
Ein Sirup kann hergestellt werden durch Zugabe des Wirkstoffs zu einer konzentrierten wässrigen Lösung eines Zuckers, beispielsweise von Sucrose, zu der auch alle Hilfsstoffe zugegeben werden können. Ein derartiger Hilfsstoff bzw. derartige Hilfsstoffe können Geschmacksstoffe, ein Mittel zur Verzögerung der Kristallisation des Zuckers oder ein Mittel zur Erhöhung der Löslichkeit anderer Bestandteile, wie etwa einen mehrwertigen Alkohol, beispielsweise Glyzerin oder Sorbitol, umfassen.
Formulierungen zur rektalen Verabreichung können als ein Zäpfchen mit einem herkömmlichen Träger wie etwa Kakaobutter hergestellt werden.
Formulierungen, die zur parenteralen Verabreichung geeignet sind, umfassen vorteilhaft eine sterile wässrige Präparation des Wirkstoffs, die bevorzugt mit dem Blut des Empfängers isotonisch ist. Derartige Formulierungen umfassen zweckmäßig eine Lösung eines pharmazeutisch und pharmakologisch akzeptablen Salzes von oxidiertem Thymosin β4, welche mit dem Blut des Empfängers isotonisch ist.
Geeignete Formulierungen umfassen auch konzentrierte Lösungen oder Feststoffe, die oxidiertes Thymosin β4 enthalten, und die bei Verdünnung mit einem geeigneten Lösungsmittel eine Lösung zur parenteralen Verabreichung wie vorstehend ergeben.
Das hierin offenbarte oxidierte Thymosin β4 oder die physiologisch aktive Variante davon kann durch jedes geeignete Mittel den Lungen einer Person verabreicht werden, wird aber bevorzugt verabreicht durch Erzeugen eines aus einatembaren Partikeln zusammengesetzten Aerosols, wobei die einatembaren Partikel aus dem Wirkstoff zusammengesetzt sind und die Person die Partikel inhaliert (z. B. durch Inhalationsverabreichung). Die einatembaren Partikel können flüssig oder fest sein.
Partikel, die aus oxidiertem Thymosin β4 zusammengesetzt sind, für die praktische Durchführung der vorliegenden Erfindung, sollten Partikel einer einatembaren Größe umfassen: das bedeutet, Partikel mit einer Größe, die ausreichend klein ist um bei Inhalation den Mund und die Luftröhre zu passieren, und in die Bronchien und Alveolen der Lungen. Im Allgemeinen sind Partikel mit einer Größe im Bereich von 0,5 bis 10 Mikrometern (insbesondere mit einer Größe von weniger als 5 Mikrometern) einatembar. Partikel mit einer nichteinatembaren Größe, die im Aerosol vorhanden sind, neigen dazu, sich in der Kehle abzulagern und verschluckt zu werden, und bevorzugt wird die Menge an nichteinatembaren Partikeln im Aerosol auf ein Minimum gebracht. Für nasale Verabreichung ist eine Partikelgröße im Bereich von 10-500 um bevorzugt um Retention in der Nasenhöhle sicherzustellen.
Flüssige pharmazeutische Zusammensetzungen von oxidiertem Thymosin β4 zur Herstellung eines Aerosols können hergestellt werden durch Kombinieren des oxidierten Thymosin β4 mit einem geeigneten Vehikel, wie etwa sterilem, Pyrogen-freiem Wasser. Festpartikelzusammensetzungen, die einatembare trockene Partikel von feinstzerkleinertem oxidierten Thymosin β4 enthalten, können hergestellt werden durch Zermahlen von trockenem oxidierten Thymosin β4 mit einem Mörser und einem Stößel, und danach Führen der feinstzerkleinerten Zusammensetzung durch ein Sieb mit Maschenweite 400, um große Agglomerate aufzubrechen oder abzutrennen. Eine Festpartikelzusammensetzung aus dem oxidierten Thymosin β4 kann gegebenenfalls ein Dispergiermittel enthalten, welches dazu dient, die Bildung eines Aerosols zu vereinfachen. Ein geeignetes Dispergiermittel ist Lactose, die mit dem oxidierten Thymosin β4 in jedem geeigneten Verhältnis gemischt werden kann (z. B. in einem Gewichtsverhältnis von 1 zu 1).
Aerosole von Flüssigpartikeln, die das oxidierte Thymosin β4 umfassen, können durch jedes geeignete Mittel hergestellt werden, wie etwa mit einem Zerstäuber. Siehe beispielsweise US Patent Nr. 4,501,729. Zerstäuber sind kommerziell erhältliche Vorrichtungen, die Lösungen oder Suspensionen des oxidierten Thymosin β4 in einen therapeutischen Aerosolnebel überführen, entweder mittels Beschleunigung eines komprimierten Gases, typischerweise Luft oder Sauerstoff, durch eine enge Venturiöffnung, oder mittels Ultraschallerregung. Geeignete Zusammensetzungen zur Verwendung in Zerstäubern bestehen aus dem oxidierten Thymosin β4 in einem flüssigen Träger, wobei das oxidierte Thymosin β4 bis zu 40% w/w der Zusammensetzungen, aber bevorzugt weniger als 20% w/w ausmacht. Der Träger ist typischerweise Wasser oder eine verdünnte wässrige Alkohollösung, welcher bevorzugt durch die Zugabe von beispielsweise Natriumchlorid isotonisch zu Körperflüssigkeiten gemacht wird. Fakultative Zusätze umfassen Konservierungsstoffe, wenn die Zusammensetzung nicht steril hergestellt wird, beispielsweise Methylhydroxybenzoat, Antioxidantien, Geschmacksstoffe, flüchtige Öle, Puffer und oberflächenaktive Mittel.
Aerosole von Festpartikeln, die das oxidierte Thymosin β4 umfassen, können ebenso mit einem Festpartikelarzneimittel-Aerosolgenerator hergestellt werden. Aerosolgeneratoren zur Verabreichung von Festpartikelarzneimitteln einer Person erzeugen Partikel, die einatembar sind wie vorstehend erläutert, und erzeugen ein Aerosolvolumen, welches eine vorbestimmte abgemessene Dosis eines Arzneimittels enthält, in einer für die Verabreichung an einen Menschen geeigneten Rate. Beispiele derartiger Aerosolgeneratoren umfassen Meßdosis- Inhalatoren und -Durchblasungsvorrichtungen.
Für eine Entzündung von externem Gewebe, z. B. der Haut, werden die Formulierungen bevorzugt als eine topische Salbe oder Creme aufgetragen, welche den Wirkstoff in einer Menge von beispielsweise 0,075 bis 20% w/w, bevorzugt von 0,2 bis 15% w/w und am meisten bevorzugt von 0,5 bis 10% w/w enthält. Bei Formulierung in einer Salbe können die Wirkstoffe mit entweder einer paraffinischen oder einer mit Wasser mischbaren Salbenbasis verwendet werden. Alternativ können die Wirkstoffe mit einer Öl-in-Wasser-Cremebasis in einer Creme formuliert werden.
Falls gewünscht, kann die wässrige Phase der Creme beispielsweise mindestens 30% w/w eines mehrwertigen Alkohols umfassen, d. h. eines Alkohols mit zwei oder mehr Hydroxylgruppen, wie etwa Propylenglykol, Butan- 1,3-diol, Mannitol, Sorbitol, Glyzerin und Polyethylenglykol und Gemische davon. Die topischen Formulierungen können vorteilhaft eine Verbindung umfassen, welche die Absorption oder Penetration des Wirkstoffs durch die Haut oder andere betroffene Gebiete verstärkt. Beispiele derartiger Hautpenetrationsverstärker umfassen Dimethylsulfoxid und verwandte Analoga.
Die ölige Phase der erfindungsgemäßen Emulsionen kann aus bekannten Bestandteilen in bekannter Weise zusammengesetzt sein. Obwohl die Phase lediglich eine Emulgiersubstanz (anderweitig als Emulgator bekannt) umfassen kann, umfasst sie vorteilhaft ein Gemisch von mindestens einem Emulgator mit einem Fett oder einem Öl oder sowohl einem Fett als auch einem Öl. Der hydrophile Emulgator wird bevorzugt zusammen mit einem lipophilen Emulgator aufgenommen, der als ein Stabilisator wirkt. Es ist auch bevorzugt, sowohl ein Öl als auch ein Fett aufzunehmen. Zusammen genommen machen der bzw. die Emulgatoren mit oder ohne Stabilisator(en) das so genannte Emulgierwachs aus, und das Wachs zusammen mit dem Öl und/oder Fett machen die so genannte emulgierende Salbenbasis aus, welche die dispergierte Ölphase der Cremeformulierungen bildet.
Emulgatoren und Emulsionsstabilisatoren, die zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Formulierungen geeignet sind, umfassen Tween 60, Span 80, Cetostearylalkohol, Myristilalkohol, Glyzerinmonostearat und Natriumlaurylsulfat.
Die Auswahl geeigneter Öle oder Fette für die Formulierung beruht darauf, die erwünschten kosmetischen Eigenschaften zu erhalten, da die Löslichkeit des Wirkstoffs in den meisten Ölen, die mit hoher Wahrscheinlichkeit in pharmazeutischen Emulsionsformulierungen verwendet werden, sehr gering ist. Somit sollte die Creme bevorzugt ein nicht-fettiges, keine Flecken verursachendes und abwaschbares Produkt mit einer geeigneten Konsistenz sein, um ein Auslaufen aus Tuben oder anderen Behältern zu vermeiden. Geradkettige oder verzweigtkettige ein- oder zweibasische Alkylester wie etwa Diisoadipat, Isocetylstearat, Propylenglykoldiester von Kokosnußfettsäuren, Isopropylmyristat, Decyloleat, Isopropylpalmitat, Butylstearat, 2- Ethylhexylpalmitat oder ein als Crodamol CAP bekanntes Gemisch von verzweigtkettigen Estern können verwendet werden, wobei die drei letztgenannten bevorzugte Ester sind. Diese können in Abhängigkeit von den erforderlichen Eigenschaften alleine oder in Kombination verwendet werden. Alternativ können hochschmelzende Lipide wie etwa weißes Weichparaffin und/oder flüssiges Paraffin oder andere Mineralöle verwendet werden.
Zusätzlich zu den vorstehend genannten Bestandteilen können die erfindungsgemäßen Formulierungen weiter eine oder mehrere Hilfssubstanzen, ausgewählt aus Verdünnungsmitteln, Puffern, Geschmacksstoffen, Bindemitteln, oberflächenaktiven Mitteln, Verdickungsmitteln, Gleitmitteln, Konservierungsmitteln (umfassend Antioxidantien) und dergleichen umfassen.
Die nachfolgenden Beispiele beschreiben die Reinigung von oxidiertem Thymosin β4 und die Charakterisierung von partiell gereinigtem Faktor und von Überstand von Steroid-behandelten Monozyten. Spätere Beispiele beschreiben die Charakterisierung von oxidiertem Thymosin β4 und der Aktivität des oxidierten Thymosin β4.
Die Beispiele werden beschrieben unter Bezugnahme auf die beigefügten Figuren, worin:
Fig. 1 zeigt die Wirkungen von STMS auf die Fortbewegung von Humanneutrophilen. Zellen wurden 2 Minuten unter Verwendung der computerisierten Verfolgungsassaymethode verfolgt. Der in Zeitabständen von 5 Sekunden bestimmte Mittelwert der Zellgeschwindigkeit betrug 15,2 um/min für die Geschwindigkeit, und extrapolierte Werte von 1,02 um²/sec und 63 sec für den Diffusionskoeffizienten bzw. die Persistenz.
Fig. 2 zeigt die Wirkung von Überständen von Humanmonozyten, die 24 Stunden bei 37ºC mit und ohne 10&supmin;&sup6; M Dexamethason kultiviert worden waren, auf die Adhäsion von Humanneutrophilen auf Monoschichten von Endothelzellen aus Rinderaorta. (a) Kulturmedium ohne Dexamethason; (b) Kulturmedium mit 10&supmin;&sup6; M Dexamethason; (c) Überstand von Kontrollmonozyten (CMS, control monocyte supernatant); (d) Überstand von Steroid-behandelten Monozyten (STMS). Mittlere ± Standardabweichung (vertikale Balken) N = 3. P < 0,001 gegeben bei**.
Fig. 3 zeigt den Vergleich der Morphologie von Humanneutrophilen, die mit STMS und verschiedenen Stimulatoren der Neutrophilenfortbewegung behandelt worden waren, unter Verwendung von Rasterelektronenmikroskopie.
(a) 10&supmin;&sup8; M fMLP; (b) IL-8 und (c) STMS. Balken 2 um.
Fig. 4 zeigt den Vergleich der Morphologie von Humanneutrophilen, die mit STMS und verschiedenen Stimulatoren der Neutrophilenfortbewegung behandelt worden waren und auf Monoschichten von Endothelzellen aus Rinderaorta angeimpft worden waren, unter Verwendung von Rasterelektronenmikroskopie.
(a) 10&supmin;&sup8; M fMLP und (b) STMS. Balken 2 um.
Fig. 5 zeigt den Vergleich der F-Actin-Verteilung in Humanneutrophilen, die mit STMS und verschiedenen Stimulatoren der Neutrophilenfortbewegung behandelt worden waren.
(a) Kulturmedium mit und ohne 10&supmin;&sup6; M Dexamethason; (b) 10&supmin;&sup8; M fMLP; (c) TNF; (d) STMS. Balken 2 um.
Fig. 6 zeigt die Inhibition der fMLP-induzierten Chemotaxis von Humanneutrophilen durch STMS, gemessen unter Verwendung eines modifizierten Boyden-Kammer-Assays.
(a) obere Kammer - Kulturmedium mit Dexamethason; untere Kammer - 10&supmin;&sup8; M fMLP; (b) obere Kammer - STMS; untere Kammer - 10&supmin;&sup8; M fMLP; (c) obere Kammer -10&supmin;&sup8; M fMLP; untere Kammer - 10&supmin;&sup8; M fMLP; (d) obere Kammer - Kulturmedium mit Dexamethason; untere Kammer-STMS. Anzahl von Zellen, welche die halbe Migrationsdistanz von Positivkontrolle (a) migriert sind.

Zellfrontmigrationsdistanz.

Fünf zufällig ausgewählte Felder wurden für jeden Filter ausgezählt. Gezeigte Werte sind mittlere +Standardabweichung (vertikale Balken). P < 0,001 gegeben bei **.
Fig. 7 zeigt die Daten für Peptid 1, wobei die beobachtete Ionenreihe für Niedrigenergie-CID nach Derivatisierung mit SPA gezeigt ist. Schlüssel: Coff- Stoßoffset (Volt); Xle Leucin (Leu) oder Isoleucin (Ile); Kpy Lysin-epsilon-N-(3- pyridyl)acetat; Mso Methioninsulfoxid; und * gibt im CID-Spektrum beobachtete Ionen an.
Die Fig. 8a-c erläutern (a) dispersive Fortbewegung von Neutrophilen in Reaktion auf Thymosin β4 (Tβ4) und oxidiertes Thymosin β4 (Tβ4so); (b) fMLP induzierte Chemotaxis von Humanneutrophilen in einer modifizierten Boyden- Kammer wird durch Tβ4so in einem größeren Ausmaß inhibiert als durch das nicht modifizierte Peptid. Es wurde eine dosisabhängige Wirkung der Inhibition der Chemotaxis durch Tβ4 und Tβ4so beobachtet, wobei das oxidierte Peptid zehnfach stärker inhibitorisch war als das native Peptid; und (c) Thymosin β4- Sulfoxid fördert die Wundheilung in einem einfachen Kratzassay. Es wurde gezeigt dass die Oxidation des Methioninrests (Met-6) die Verschlussrate eines Kratzers, der in einer endothelialen Monoschicht auf Gewebskulturkunststoff gemacht worden war, erhöht.
Die Fig. 9a-9c zeigen die Assayergebnisse von Tβ4 und Tβ4so im Karragen- induzierten Oedemtest.

BEISPIELE

Materialien und Methoden

Reagenzien

IL-8 und TNF wurden von Genzyme bezogen, in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) aufgelöst und mit 1 ug pro ml bei -70ºC aufbewahrt.
Dexamethason und fMLP wurden von der Sigma Chemical Co. bezogen. Dexamethason wurde als eine 10&supmin;² M Vorratslösung in Ethanol hergestellt und fMLP als eine 10&supmin;² M Vorratslösung in Dimethylsulfoxid (DMSO).

Reinigung von Neutrophilen

Neutrophile wurden erhalten wie von Chettibi et al. [1993] beschrieben. In kurzen Worten wurde Gesamtblut mit 1 : 10 v/v 5% Dextran gemischt und 1 Stunde bei 37ºC sedimentieren gelassen. Nycoprep 1.077 wurde mit dem Leukozytenreichen Plasma überschichtet und es wurde 15 Minuten bei 750 G zentrifugiert. Erythrozyten im resultierenden Pellet wurden mittels hypotonischer Lyse entfernt und Neutrophile wurden zweimal mit balancierter Salzlösung (BSS) gewaschen. Die Zellen wurden durch Trypanblau-Ausschluss auf Überlebensfähigkeit überprüft (im Allgemeinen mehr als 96% lebensfähig).

Zellverfolgungsassay

Automatisierte Zellverfolgungsmigrationskammern wurden hergestellt wie früher beschrieben [Chettibi et al., 1993] und auf den Objekttisch eines Inversphasenkontrastmikroskops gestellt, in einem Temperaturgesteuerten (37ºC) durchsichtigen Behälter, und die Fortbewegung wurde beobachtet mittels einer Videokamera, die angeschlossen war an einen Monochrom-Monitor und auch an einen Acorn A5000 Computer mit einer Watford Videodigitalisiervorrichtung, programmiert um alle 5 Sekunden einen Frame einzufangen und zu analysieren. Daten wurden von einem Maximum von 80 ausgewählten Zellen erhalten und dazu verwendet, die momentane Geschwindigkeit, den 2-dimensionalen Diffusionskoeffizienten und die Fortbewegungspersistenzdauer zu berechnen, unter Verwendung des beschriebenen Verfahrens um den Einfluss systematischer Verschiebung zu eliminieren [Chettibi et al., 1994].

Adhäsionsassay

Endothelzellen aus Rinderaorta wurden auf Deckgläsern mit einem Durchmesser von 13 mm in einer Multiwellplatte in Dulbecco's modifiziertem Eagles-Medium mit 10% fötalem Kälberserum und 10% Pferdeserum kultiviert und bis zur Konfluenz wachsen gelassen. Humanneutrophile, suspendiert in BSS 0,1% Rinderserumalbumin (BSA), wurden mit [&sup5;¹Cr]Natriumchromat markiert, indem 1 · 10&sup6; Zellen/ml, 20 uCi/ml, 1 Stunde unter periodischer Bewegung inkubiert wurden. Freies &sup5;¹Cr wurde mittels dreier Waschschritte mit BSS 0,1% BSA entfernt. 200 ul Neutrophile wurden mit 800 ul STMS Peptidfaktor oder anderen Testsubstanzen gemischt, zu den Wells zugegeben und 30 Minuten bei 37ºC inkubiert. Nicht-adhärente Zellen wurden dreimal mit BSS 0,1% BSA sanft abgewaschen, und die Deckgläser wurden in einen Wilj- Gammazähler gegeben.

Elektronenmikroskopie

Neutrophile wurden 20 Minuten mit verschiedenen Agonisten stimuliert, vor einstündiger Fixierung in 2% gepuffertem Glutaraldehyd und zweimaligem Waschen in PBS. Nach einer Nachfixierung in Osmiumtetroxid erfolgte Waschen in destilliertem Wasser. Danach wurde Uranylacetat zu den Proben zugegeben und sie wurden mindestens eine Stunde vor dem Waschen im Dunkeln gelassen. Die Zellen wurden durch eine abgestufte Reihe von Aceton (oder Alkoholen) im Bereich von 30% bis absolut trocken geleitet, vor kritischer-Punkt- Trocknung und Montage.
Eine Alternative zu kritischer-Punkt-Trocknung war Lyophilisierung, bei der die Zellen, nachdem das Osmiumtetroxid abgewaschen worden war, in flüssigen Stickstoff getaucht wurden (nur geeignet für Zellen, die an einem Festsubstrat haften). Die Präparate wurden danach mit Gold beschichtet und im Rasterelektronenmikroskop (SEM) betrachtet.

Actinfärbung und konfokale Mikroskopie

Gereinigte Neutrophile wurden auf Albumin-beschichtete Deckgläser gegeben, vor Behandlung mit verschiedenen Stimuli, und 30 Minuten bei 37ºC inkubiert. Die Zellen wurden eine Stunde in 1% Paraformaldehydlösung fixiert, mit BSS gewaschen und 15 Minuten bei Raumtemperatur mit 1% Triton X-100 permeabilisiert. Die Zellen wurden dreimal mit BSS gewaschen und 20 Minuten bei Raumtemperatur mit 0,1 mg/ml TRITC-markiertem Phalloidin behandelt. Die Zellen wurden dreimal in Zeitabständen von 5 Minuten in BSS gewaschen und mit 50% Glyzerin auf Deckgläser montiert. Ergebnisse wurden unter Verwendung von konfokaler Mikroskopie analysiert.

Chemotaxisassay

Filter (Sartorius Membranfilter, 3 um Poren) wurden zerschnitten und in eine modifizierte 1 ml Spritzentonne geklebt. 300 ul 2 · 10&sup6;/ml Neutrophile wurden zu 300 ul Antagonist zugegeben und 200 ul der Suspension wurden zu der oberen Kammer (Spritzentonne) zugegeben. Die untere Kammer (ein 5 ml Becherglas) enthielt 3,6 ml Agonist. Nach 45 Minuten wurden die Zellen 5 Minuten in 70% Ethanol fixiert. Diese Vorgehensweise entfernt auch den Filter aus der Spritzentonne, indem der Klebstoff aufgelöst wird. Die Filter wurden in eine Multiweliplatte gegeben und wie folgt behandelt:
2 Minuten destilliertes Wasser, 1 Minute Harris Haematoxylin, 1 min destilliertes Wasser, 5 Minuten Scotts Leitungswasser (1 : 1 0,7% Natriumbicarbonat: 4% Magnesiumsulfat (v/v)), 3 min 70% Ethanol, 3 Minuten 95% Ethanol und 5 Minuten 80% : 20% Ethanol : Butanol (v/v). Die Filter wurden 5 Minuten in Xylol geklärt, in DEPEX montiert und unter Hellfeldbeleuchtung mit einem 40 · Objektiv untersucht. Für jeden Filter wurden fünf zufällig ausgewählte Felder ausgezählt.

Kratzwundenassay

Humane Nabelvene-Endothelzellen (HUVEC, human umbilical vein endothelial cells) wurden in Multiwellplatten (Corning) zur Konfluenz wachsen gelassen und es wurde mit einer sterilen Pipettenspitze ein Kratzer entlang des Durchmessers jedes Wells gemacht. Die resultierende Wunde (annähernd 1 mm) wurde danach vor Zugabe von Tβ4 oder Tβ4so und in Zeitabständen von 45 min gemessen.

Induktion einer Entzündungsreaktion auf Karrageen

Gruppen von Mäusen wurden subkutan 300 ug Karrageen gemischt mit dem Thymosin β4, nativ oder Sulfoxid, in einem Endvolumen von 50 ul in eine Hinterpfote injiziert. Kontrolltieren wurde das gleiche Volumen Salzlösung injiziert. Die Anschwellung des Fußballens wurde unter Verwendung einer Federschublehre gemessen, und ausgedrückt als der Unterschied der Schwellung zwischen der Pfote, in die Karrageen injiziert worden war, und der Pfote auf der anderen Körperseite, in die nichts injiziert worden war. Den Tieren wurden die gleiche Dosis Thymosin β4, nativ oder Sulfoxid, intraperitoneal (ip) injiziert, und Messungen des Fußballens wurden zum Zeitpunkt 6, 24, 48 und 72 Stunden durchgeführt.

Beispiel 1

Herstellung von Überstand von Steroid-behandelten Monozyten (STMS) und von partiell gereinigtem STMS Peptidfaktor

Überstand von Steroid-behandelten Monozyten (STMS) wurde erhalten durch die Kultivierung von Humanmonozyten, die 60 min in einer Konzentration von 5 · 10&sup7; Zellen pro ml in Hams F-10 Medium in der Gegenwart von wärmeinaktiviertem 10% fötalem Kälberserum (FCS) ausplattiert worden waren, mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen worden waren und danach 24 Stunden in Abwesenheit von FCS in der Gegenwart von 10&supmin;&sup6; M Dexamethason kultiviert worden waren.

Herstellung von STMS Peptidfaktor

STMS wurde im Wesentlichen erhalten wie von Chettibi et al. [1993] beschrieben, durch die Kultivierung von Humanmonozyten in Hams F-10 Medium mit 10% fötalem Kälberserum (FCS) in einer Konzentration von annähernd 5 · 10&sup7; Zellen pro ml während 60 Minuten, Waschen mit PBS und danach Kultivierung ohne FCS in der Gegenwart von 10&supmin;&sup6; M Dexamethason während 24 Stunden. Parallelkulturen, bei denen Dexamethason weggelassen wurde, wurden zur Herstellung von Überstand von Kontrollmonozyten (CMS, control monocyte supernatant) verwendet. Die Reinigung von STMS Peptidfaktor wurde ausgeführt unter Verwendung des 2-dimensionalen Diffusionskoeffizienten zur Identifizierung der aktiven Fraktion. Eine partielle Reinigung wurde unter Verwendung von Gelfiltration und Ionenaustauschchromatographie an Mono-Q-Harz erreicht. Hochgereinigtes Material wurde durch die zusätzliche Verwendung von Reversphase-HPLC erhalten.
Eine anfängliche Sequenzanalyse des Peptidfaktors war nicht erfolgreich, vermutlich aufgrund eines blockierten N-Terminus.
Diese Beobachtungen legten nahe, dass eine Behandlung von Neutrophilen mit STMS einen in hohem Maße ungewöhnlichen Cytoskelettorganisationsmodus induzierte (Fig. 5d), erlaubten aber keinen direkten Einblick in die der persistenten Fortbewegung zugrunde liegende Basis. Die offensichtliche Korrelation zwischen Verhalten und Adhäsion unter dem Lichtmikroskop wurde daher auf Untersuchungen mittels Rasterelektronenmikroskop und konfokaler Mikroskopie ausgedehnt.

Beispiel 2

Biologische Studien des STMS Peptidfaktors

Das biologische Interesse an STMS Peptidfaktor gilt seiner potentiellen Rolle als ein Mediator von machen oder allen entzündungshemmenden Wirkungen von Glucocorticoiden. Viele vorläufige Beobachtungen unter Verwendung des Überstands, im Gegensatz zum Peptidfaktor, schienen dieses Rolle zu unterstützen, aber andere, wie etwa das Phänomen der dispersiven Fortbewegung, waren keine offensichtlichen entzündungshemmenden Reaktionen. Verringerte Adhäsionsfähigkeit, die eine der zugrunde liegenden Ursachen für dispersive Fortbewegung zu sein scheint, hat jedoch klar entzündungshemmende Implikationen.

Charakterisierung der Fortbewegung von Neutrophilen

Agonisten wurden in Konzentrationen verwendet, die ähnliche, submaximale Stimulation der basalen Beweglichkeit verursachten. Frühere Untersuchungen von rohem und partiell gereinigtem STMS Peptidfaktor hatten gezeigt, dass er Neutrophile dazu stimulierte, eine in hohem Maße dispersive Fortbewegung in einem gleichförmigen Konzentrationsgradienten einzugehen. Dies stand in ausgeprägtem Kontrast zu Reaktionen auf andere Mittel und insbesondere auf fMLP, bei denen die Fortbewegungseigenschaften nahelegten, dass die Zellen, obwohl sie in hohem Maße beweglich waren, ihre anfänglichen Adhäsionen zu dem Substrat nicht leicht aufbrechen konnten. Hier ist gezeigt, dass partiell gereinigter STMS auch eine dispersive Reaktion erzeugt, in einer Konzentration, welche eine ähnliche momentane Geschwindigkeit bei 10 nm fMLP ergibt (Fig. 1, 2).
Zusätzlich zur Bestimmung von quantitativen Fortbewegungsparametern zeigte die Beobachtung der Zellen während des Assays sehr klare und charakteristische Verhaltensmuster, wenn die Zellen mit verschiedenen Stimulatoren behandelt wurden. Neutrophile, die STMS ausgesetzt werden, werden phasendunkel, entsprechend Abflachen und Adhäsion, erlangen danach aber wieder den phasenhellen Zustand und werden beweglich. Im Gegensatz dazu induziert IL-8 ein ausgeprägtes zyklisches Verhalten, wobei die Zellen reversibel dunkel und hell werden, während mit fMLP behandelte Zellen phasenhell bleiben. Mit STMS behandelte Zellen zeigten auch ein sehr charakteristisches Aussehen, das den subjektiven Eindruck machte, dass die Zelle an einer einzigen Stelle an dem Substrat haftet, während der Zellkörper darüber dynamisch aktiv ist. Alle anderen getesteten Stimulantien schienen zu verursachen, dass die Neutrophilen mehrere Befestigungspunkte zum Substrat bildeten. Diese Beobachtung ist konsistent mit früheren Adhäsionsstudien, welche zeigten, dass Neutrophile, die mit STMS behandelt worden waren, sehr leicht von einer proteinbeschichteten Glasoberfläche abgewaschen werden.

Polarisation und Membranmorphologie von Neutrophilen

Neutrophile, die mit partiell gereinigtem STMS Peptidfaktor behandelt worden waren, erschienen unter dem Phasenkontrastmikroskop länglich, und die charakteristischen Eigenschaften ihrer Adhäsion an eine proteinbeschichtete Glasoberfläche deuteten darauf hin, dass sie an einer einzigen Stelle anhaften könnten. Die Zellen wurden durch Waschen relativ leicht abgelöst, und auch das Aussehen legte nahe, dass ein großenteils nicht anhaftender Zellkörper durch einen länglichen Fortsatz mit der Oberfläche verbunden war.

Rasterelektronenmikroskopie

Die Ergebnisse dieser Untersuchung zeigten, dass Zellen, die mit fMLP oder IL- 8 behandelt worden waren, klassische Polarisation zeigten, mit ausgiebigen Flächen gekräuselter Membran und keinem klaren Führungssaum (Fig. 3a, b, c). Zusätzlich zu der Kräuselung, die sich an den anscheinenden Kontaktpunkten mit dem Substrat zeigt, war die Membran über dem Zellkörper stark gewunden. Durch fMLP und IL-8 induzierte Unterschiede in der Membran waren, obwohl ersichtlich, sehr schwierig zu definieren. Im Gegensatz dazu war die von STMS induzierte Morphologie einzigartig und einfach zu beschreiben (Fig. 3c).
Die Zellen hatten eine ausgestreckte bipolare Gestalt, aber die zwei Enden, die am adhäsiven Kontakt mit dem Substrat beteiligt zu sein schienen, waren nicht identisch. Die Membran war relativ glatt mit relativ zahlreichen kleinen Vorsprüngen, und es gab keinen sehr klaren Unterschied in der Oberflächenerscheinung zwischen dem Zellkörper und den scheinbaren Pseudopodien.
Neutrophile wurden 30 Minuten auf Rinderaorta-Endothelmonoschichten angeimpft und für die SEM vorbereitet. Diese Behandlung machte wenig Unterschied auf das Aussehen der Oberflächenmembran, die in Reaktion auf IL- 8 und fMLP gekräuselt war, aber in Reaktion auf STMS relativ glatt war. Der signifikanteste Unterschied war, dass während fMLP- und IL-8-behandelte Neutrophile nahezu ausschließlich an Endothelzellverbindungen aufgefunden wurden, SMTS-behandelte Zellen dazu neigten, auf dem Körper der Endothelzelle gefunden zu werden (Fig. 4a, b).

Konfokale Mikroskopie

Um die zugrunde liegende Basis für die Unterschiede in der Gestalt zu untersuchen und die Natur der dispersiven Fortbewegung zu verstehen, untersuchten wir die Verteilung von polymerisiertem Actin in den Zellen. Nicht aktivierte Kontrollneutrophile zeigten eine schwache, eher punktförmige Verteilung der Fluoreszenz, aber ohne Anzeichen eines größeren polarisierten Herds, entsprechend einer relativ gleichförmigen Verteilung von kortikalem Actin (Fig. 5a). Die für fMLP erhaltenen Ergebnisse waren ähnlich zu den von anderen Gruppen veröffentlichten [Coates et al., 1992] und sind konsistent mit der Interpretation, dass die Actinpolymerisation viel intensiver ist als in Kontrollzellen, und mit Punkten von adhäsivem Kontakt assoziiert ist, die Herde aktiver Fortbewegung sind (Fig. 5b). Zellen, die in Reaktion auf CMS oder TNF in hohem Maße ausgebreitet waren, zeigten eine extrem punktförmige Verteilung von F-Actin (Fig. 5c). Das Muster der Actinfärbung in STMS behandelten Zellen war höchst ungewöhnlich und verschieden. Anfärbung war nur in den Endbereichen der bipolaren Zellen vorhanden, und von diesen zwei Enden, welche die adhäsiven Kontaktpunkte zu sein scheinen, war stets eines stärker gefärbt als das andere (Fig. 5d).

Modulation der Adhäsion von Neutrophilen an Endothelzellen

Partiell gereinigter Peptidfaktor verringerte die Adhäsionsfähigkeit von Neutrophilen an eine Endothelzell-Monoschicht.
Rasterelektronenmikroskopuntersuchungen der Wechselwirkungen von Neutrophilen/Endothel zeigten, dass in ausgeprägtem Gegensatz zu anderen Stimuli, der Peptidfaktor aus dem Überstand Adhäsion und scheinbare Invasion an Endothelzellverbindungen verhindert.

Inhibition der Sezernierung von Neutrophilen

Partiell gereinigter Peptidfaktor inhibierte die Sezernierung von Elastase aus Neutrophilen, die mit Cytochalasin behandelt worden waren (Daten nicht gezeigt).

Beispiel 3

Detaillierte biologische Untersuchungen von STMS und Peptidfaktor

Adhäsion von Neutrophilen an Endothelzellen aus Rinderaorta

Die früheren Daten, welche zeigen, dass STMS die Adhäsion von Neutrophilen an proteinbeschichtetes Glas verringert [Chettibi et al., 1993] wurden erweitert unter Verwendung des physiologischeren Substrats der Endothelzellen aus Rinderaorta (Fig. 2).

Chemotaxis

Vorläufige Beobachtungen der Chemotaxis von Neutrophilen unter Verwendung der modifizierten Boyden-Kammer zeigten einen ausgeprägten Kontrast zwischen der Reaktion auf STMS und fMLP. Neutrophile zeigten massive Invasion des Filters, wenn fMLP in der unteren Kammer vorhanden war, ergaben aber keine derartige Reaktion auf STMS. Wenn die Filter jedoch durch die Vorderfrontmethode untersucht wurden, wurde klar, dass manche STMS- behandelte Zellen erfolgreich eindringen konnten, in Übereinstimmung mit den Voraussagen bezüglich persistenter Fortbewegung. Diese Beobachtungen legten nahe, dass es eine geeignetere Analyse wäre, die Gesamtinvasion zu messen, oder die Anzahl an Zellen zu bestimmen, die auf halbem Weg zwischen der Vorderfront und der Oberfläche des Filters vorhanden sind. Fig. 6 zeigt die Analyse der Chemotaxisassays unter Verwendung sowohl der Vorderfrontmethode als auch der Methode der mittleren Invasionsfähigkeit. Die Ergebnisse zeigten, dass STMS selbst nicht chemotaktisch war, aber wenn in der oberen Kammer vorhanden, die Reaktion auf fMLP drastisch inhibierte. Bei einer gleichförmigen fMLP-Konzentration (d. h. in beiden Kammern vorhanden) gab es eine ausgeprägte Verringerung der Invasionsfähigkeit.
Da die Produktion von STMS durch entzündungshemmende Steroide induziert wird, gibt es Grund zu der Annahme, dass dieses Molekül ein wirklicher entzündungshemmender Mediator sein kann. Die meisten der bisher gezeigten Eigenschaften sind konsistent mit einer Rolle als Inhibitor der entzündungsfördernden Reaktionen von Neutrophilen, seine am besten charakterisierte Eigenschaft, die Induktion persistenter Fortbewegung in Zielzellen, ist jedoch keineswegs eine erwartete entzündungshemmende Reaktion. Entzündungsfördernde Cytokine haben ein komplexes Programm von Niedrigdosis- und Hochdosiswirkungen, welche zu einem extrem variablen Programm an Reaktionen von Zellen, die einem Konzentrationsgradienten derartiger Moleküle ausgesetzt sind, resultieren. Beispielsweise werden viele der dynamischen Wirkungen von fMLP primär als eine Reaktion auf einen Konzentrationsgradienten interpretiert. Im Gegensatz dazu deutet die Wirkung von STMS auf Neutrophile nicht an, dass bei niedrigen und hohen Konzentrationsgradienten quantitativ verschiedene Wirkungen beobachtet werden würden. Die Untersuchungen mit gleichförmiger Agonistenkonzentration heben die kritische Rolle von Konzentrationsgradienten für die chemotaktische Reaktion weiter hervor; somit sind Neutrophile, die mit einer gleichförmigen Konzentration von fMLP oder IL-8 behandelt worden sind, obwohl sie in hohem Maße aktive Fortbewegungsfortsätze haben, nicht in der Lage, eine effektive Verlagerung zu machen. Im Gegensatz dazu führt ein von STMS-behandelten Zellen gezeigter, ähnlicher Grad an Fortbewegungsaktivität zu einer sehr effektiven Fortbewegung.
Es ist gut etabliert, das Actinpolymerisation eine frühe Reaktion auf Stimulierung von Neutrophilen mit fMLP ist. Coates et al. [1992] haben Beweise geliefert, dass Actinpolymerisation das frühe und dominante Ereignis ist, welches Änderungen der Gestalt bestimmt und die spezifischen Polarisationsmuster diktiert. Es wird angenommen, dass das Bindeglied zwischen dem fMLP- Rezeptor und diesen frühen Membranereignissen durch Aktivierung von Proteinkinase C (PKC) bereitgestellt wird, was danach zu Aktivierung der kleinen cytosolischen GTP-bindenden Proteine führt [Ridley, 1994].
Zusätzlich wurde vor kurzem von Janmey [1995] ein Überblick über die Rolle von PKC in der Phosphorylierung von MARCKs und die dynamische Rolle von Phosphorylierung und Calciumbindung in der Bestimmung der zyklischen Wechselwirkung von Actinfilamenten mit der Plasmamembran gegeben. Die vorliegenden Beobachtungen legen nahe, dass auf Actin basierende Fortbewegungsfortsätze entlang der Zellperipherie kompetieren und nur zu einer produktiven Verlagerung führen, wenn ein Agonistengradient eine ungleiche Aktivität derartiger Fortsätze am Führungssaum der Zelle verursacht. Ein alternatives Modell ist, dass die Rolle des Gradienten primär darin besteht, Adhäsionen am Schwanz der Zelle zu schwächen.
Das Muster der Reaktionen auf STMS ist in Bezug auf viele wichtige Aspekte ungewöhnlich. Der Actinpool ist anscheinend in hohem Maße dynamisch, aber die Verteilung von F-Actin ist vorwiegend auf ein Ende beschränkt, was eine unipolare Verteilung von Actin in einer bipolaren Zelle ergibt. Die Membran bleibt über den Großteil des Zellkörpers relativ glatt, und dieses Fehlen an Kräuselung wurde sowohl mit Zellen in Suspension beobachtet als auch an der Oberfläche von Zellen, die (wenn auch lose) am Endothel hafteten. Interessantenweise kann sich dieses Fehlen an Kräuselung in der Unfähigkeit dieser Neutrophilen manifestieren, die Lücken zwischen Endothelzellen zu erkennen, wodurch eine Entzündungsreaktion inhibiert wird.
Die im Neigungsassay erhaltenen Daten, bei dem die Zellfortbewegung in hohem Maße durch ein Gravitationsfeld polarisiert ist, zeigen dass die aktiven Zellen immer einen stabilen Adhäsionspunkt mit dem Substrat aufrecht halten. Daraus folgt somit, dass zur Aufrechterhaltung dieser Polarität der Großteil des polymerisierten Actins wiederholt vom einen Ende der Zelle zum anderen zyklieren muss. Dieses Aktivitätsmuster scheint nicht nahezulegen, dass die Dipolarität der Zelle durch ein zuvor vorhandenes, bisher nicht charakterisiertes Strukturmerkmal bestimmt wird.
Einer der wichtigsten Aspekte des Verhaltens von STMS Peptidfaktor als ein entzündungshemmender Mediator ist seine Modulation von Zellreaktionen auf entzündungsfördernde Mediatoren. Dies wurde in der vorstehenden Arbeit unter Verwendung von Beweglichkeitsstimulation als dem Basisparameter zum Aktivitätsvergleich getestet. Unter Bedingungen, bei denen STMS und fMLP oder IL-8 gleichermaßen als Stimulatoren der Fortbewegung wirksam waren, dominierten tendenziell die Reaktionen auf STMS in Bezug auf Morphologie, Adhäsion und Fortbewegung, und die Zellen bleiben phasenhell, bipolar, und gehen dispersive Fortbewegung ein.
Von noch größerer Bedeutung ist, dass STMS Peptidfaktor, der selbst nicht chemotaktisch ist, die chemotaktische Reaktion auf fMLP supprimieren kann. Es ist hier von Interesse, die Rolle von Persistenz in Chemotaxis zu diskutieren. Aufgrund der eigentlichen Natur des Konzepts hat jede Form von gerichteter Fortbewegung Persistenz. Dies ist sehr deutlich beim Neigungsassay [Chettibi et al., 1994] ersichtlich, bei dem die Reaktion auf STMS mehr als 90% gerichtete Fortbewegung zeigte und die Persistenz, obwohl unendlich, ein im Wesentlichen bedeutungsloses Konzept wurde. Für Fortbewegung in einer gleichförmigen STMS-Konzentration reflektiert Persistenz irgendeine Art von Trägheit im Fortbewegungssystem. Unter Berücksichtigung der niedrigen Reynolds Zahl- Zustände muss diese Trägheit mit der Organisation der Struktur, auf die das Cytoskelett wirkt oder sich verteilt während Fortebewegung, in Beziehung stehen.
Die elektronenmikroskopischen Aufnahmen von STMS-behandelten Zellen auf einer Endothelschicht zeigen zunächst, dass die Zellen die Verbindungen zwischen Endothelzellen nicht suchen oder keine geeigneten Erkundungsführungslamellen haben, um eine derartige Lücke, wenn sie gefunden wurde, zu penetrieren.
Es kann geschlossen werden, dass durch Steroid-induzierte Faktoren verursachte Persistenz der Fortbewegung von Neutrophilen aus einer Wirkung auf die Actinverteilung und -polymerisation resultiert. Dieser Typ von Fortbewegung scheint Neutrophile gegenüber chemotaktischen Stimuli resistent zu machen und ihre Fähigkeit, an Endothelzellen anzuhaften und durch Endothelzellverbindungen zu migrieren, zu beeinträchtigen. Als solches scheint dieser Faktor ein bedeutender Mediator von entzündungshemmender Glucocorticoidwirkung zu sein, und reiner Peptidfaktor könnte effektiv anstelle von Steroiden zur Therapie von chronischen Entzündungen verwendet werden.

Beispiel 4

Identifizierung von aktivem Faktor

STMS (Überstand von Steroid-behandelten Monozyten) wurde definiert als eine Aktivität im Kulturmedium von Steroid-behandelten Humanmonozyten, welche die Beweglichkeit von Humanneutrophilen beeinflusst, insbesondere derart, so dass eine dispersive oder persistente Fortbewegung, gekennzeichnet durch einen hohen 2-dimensionalen Diffusionskoeffizienten, erhalten wird.
Das von Dr. Chettibi et al. beschriebene Material wurde durch eine Kombination von Ionenaustausch- und Gelfiltrationsschritten stark aufgereinigt, aber das kritische Verfahren war Reversphase-HPLC unter Verwendung einer HPLC- Säule und eines Elutionsgradienten aus:
A) 0,1% Trifluroessigsäure
B) 0,1% Trifluroessigsäure in 50% Acetonitril.
Die Aktivität eluierte bei oder etwa bei 34% B.
Abtrennungsmethoden, die extreme pH-Werte oder Ionenstärken umfassten, veränderten die Dosis-Wirkung-Kurve zugrundelegend.
Das aktivste durch diese Methode hergestellte Material ist hellrosa in konzentrierter Lösung und war gekennzeichnet durch eine Elutionsspur, die einen Absorptionspeak bei 214 nm mit einer deutlichen Schulter zeigte. Weitere Auflösung war nicht möglich, und die Aktivität konnte weder dem Peak noch der Schulter zugeordnet werden. Massenspektroskopie zeigte eine einzige Hauptkomponente mit einer Masse von 1331 Da, und Fragmentationsanalyse ergab Spezies von 1186 Da und 991 Da. Vollständige Analyse (Dr. Pappin ICRF) bestätigte, dass der Hauptpeak Acyanocobalamin, ein Derivat von Vitamin B&sub1;&sub2;, war. Es wurde vermutet, dass Vitamin B&sub1;&sub2; tatsächlich eine Kontamination sein könnte, oder dazu dienen könnte, den tatsächlichen Peptidfaktor zu maskieren. Eine Herstellung von STMS und anschließende Reinigung des Peptidfaktors wurde daher unter Weglassen von Vitamin B&sub1;&sub2; durchgeführt. Es war zu diesem Zeitpunkt, dass entdeckt wurde, dass Zellen auf aus der HPLC eluierendes Material mit einem Konzentrationsoptimum reagierten, das mindestens 10&sup4;-fach niedriger war als die im Kulturmedium vorhandene Konzentration. Diese Beobachtungen legten nahe, dass der aktive Faktor ein Komplex eines kleinen Moleküls mit einem Trägerprotein ist.
Die Herstellung von STMS, welche unter Weglassen von Vitamin B&sub1;&sub2; aus dem Medium durchgeführt wurde, ergab eine hohe Ausbeute an Aktivität. Diese wurde gereinigt unter Verwendung von Zwangsdialyse (in vacuo), um 500 ml Kulturmedium auf weniger als 20 ml einzuengen. Der Dialysand wurde mit destilliertem Wasser, zweimaliger Wechsel, gewaschen. Die Probe wurde danach gereinigt durch Absorption und Elution von Mono Q Anionenaustauschharz und Gelfiltration über die Pharmacia Peptidsäule, bei hoher Salzkonzentration. Die Probe wurde danach einer Reinigung über Reversphase-HPLC, wie oben, unterzogen. Das am höchsten gereinigte Material eluierte als ein Einzelpeak und war nicht pigmentiert.
Massenspektroskopische Analyse ergab nunmehr einen einzigen Hauptpeak mit einer mittleren Masse von 4980 Da (±2 Da). Massenbestimmung eines kleinen Teils des Peptidmaterials nach Veresterung deutete auf die Gegenwart von 11 sauren Aminosäureresten hin (Asparagin- und Glutaminsäure).
Das Peptid wurde danach über Nacht bei 25ºC mit 100 ng Trypsin (Boehringer, modifiziert) in 6 ul 50 mM Ammoniumbicarbonat (pH 7,8), enthaltend 15% v/v n- Propanol und 0,5% Hexyl-B-glucopyranosid (HBG), verdaut. Die verdauten Peptide wurden danach mit N-succinimidyl-2-(3-pyridyl)acetat (SPA) umgesetzt um die b-Ionenhäufigkeit zu erhöhen und eine Sequenzanalyse durch Tandemmassenspektrometrie (Sherman et al., 1995) zu erleichtern. Getrocknete Peptidfraktionen wurden 20 min auf Eis mit 7 ul 1% w/v N-succinimidyl-2-(3- pyridyl)acetat in 0.5 M HEPES (pH 7,8 mit NaOH), enthaltend 15% v/v Acetonitril, behandelt. Die Reaktion wurde mit 1 ul Heptaflorbuttersäure (HFBA) gestoppt, und die Lösung wurde sofort in eine Reversphase-Kapillarsäule (300 um · 15 cm) injiziert, die mit POROS R2/H Material (Perseptive Biosystems, MA) gepackt war, äquilibriert mit 2% v/v Acetonitril/0,05% v/v TFA, und mit 3 ul/min betrieben wurde. Die adsorbierten Peptide wurden 30 min bei 3 ul/min mit 10% v/v Acetonitril/0,05% v/v TFA isokratisch gewaschen um das überschüssige Reagenz und HEPES-Puffer zu eluieren. Die derivatisierten Peptide wurden danach mit einem Einstufengradienten auf 75% v/v Acetonitril/0,1% v/v Ameisensäure eluiert und in einer einzigen 4 ul Fraktion gesammelt. Fünf derivatisierte Peptide wurden danach vollständig sequenziert, unter Verwendung von Niederenergie-Stoß-induzierter Dissoziation (CID, collision induced dissociation), unter Verwendung eines Finnegan MAT TSQ7000 Dreifach- Quadrupol-MS, das mit einer Nanoelektrosprayquelle (Hunt et al., 1986; Wilm and Mann, 1996) ausgestattet war. CID wurde durchgeführt unter Verwendung von 2-3 mTorr Argon mit Stoßoffsetspannungen zwischen -13 V und -33 V. Die Produktionenspektren wurden gesammelt mit Q3 gescannt bei 500 amu/sec.
Die 5 erhaltenen Sequenzen waren:
1) Ac-SDKPDMAE[LI]EKFDK Ac - Acetyl; Met oxidiert zum Met-Sulfoxid (+ 16Da)
2) TETQEK
3) NP[LI]PSK
4) ET[LI]EQEK
5) QAGES freie Säure am C-Terminus
Die Daten, welche Peptid 1 identifizieren und bestätigen, dass das Methionin zum Met-Sulfoxid oxidiert war, sind in Fig. 7 gezeigt.
Anmerkung: Zwischen Leu und Ile [LI] kann nicht unterschieden werden, da sie Isomere sind. Die Sequenzen entsprachen exakt tryptischen Fragmenten von humanem Thymosin β4.
Thymosin β4 wurde nunmehr aus Humanneutrophilen hergestellt, durch das Verfahren von Hannapell et al. (1982), die HPLC-Reinigung des Perchlorsäureüberstands verwendeten. Es wurden vier Hauptpeaks erhalten und mittels Massenspektroskopie analysiert. Die Identifizierung von zwei dieser Peaks wurde bestätigt als Thymosin β4 (dem Hauptpeak), das bei 37% B eluierte, und oxidiertem Thymosin β4, das bei 34% B eluierte. Zwei andere Peaks ergaben keine MW-Signaturen.
Thymosin β4 wurde auch von Dr. Pappin synthetisiert, aber das Endprodukt hatte eine nicht identifizierte Modifikation, von der angenommen wird, dass sie im C-terminalen Serin liegt.
Wir versuchten nunmehr, das Thymosin β4 unter Verwendung von Wasserstoffperoxid zu oxidieren, und mit dem HPLC-Elutionsmuster als dem Assay. Eine fünfminütige Behandlung von Thymosin β4 bei Raumtemperatur mit H O (50 Vol.) ergab praktisch quantitative Umsetzung.
Dr. Pappin zeigte, dass dieses Molekül eine mittlere Masse von 4980 Da (± 2 Da) hat.

Beispiel 5

Die Aktivität von Tβ4so in den Neutrophilenfortbewegungsassays zeigte, dass Tβ4so in niedrigen Konzentrationen dispersiv war, und oberhalb eines Konzentrationsoptimums nicht-dispersive Fortbewegung stimulierte, Fig. 8a. Natives Tβ4 ergab in diesen Assays keine signifikante dispersive Fortbewegung. Neutrophilenfortbewegungsassays sind offenkundig schwierig zu standardisieren, und wir versuchten daher, die Identität des Faktors unter Verwendung eines unabhängigen Assays, der Inhibition der Chemotaxis, zu bestätigen. Frühere Arbeiten hatten gezeigt, dass STMS die Chemotaxis von Neutrophilen auf fMLP inhibierte (Young et al., 1997). Wir bestimmten nun die Aktivitäten von Tβ4 und Tβ4so im Boyden-Kammer-Assay und zeigten, dass keines chemotaktisch war, aber dass beide die Chemotaxis auf fMLP inhibierten, wobei die oxidierte Form um eine Größenordnung wirksamer war, Fig. 8b. Diese Ergebnisse lieferten Grund zu der Annahme, dass Tβ4so die biologisch aktive extrazelluläre Form von Tβ4 sein könnte, und wir untersuchten dies durch Vergleich der Aktivitäten der zwei Spezies im Endothellagenwundverschlusstest, einem der besser zugänglichen Bioassays für Tβ4-Aktivität (Malinda et al., 1997). Die Ergebnisse für die Wirkung von Tβ4 waren in enger Übereinstimmung mit veröffentlichten Daten, aber die Wirksamkeit von Tβ4so war mindestens eine Größenordnung höher als die des nativen Peptids, Fig. 8c. Angesichts der Kontamination des nativen Tβ4 mit dem aktiveren Oxidationsprodukt (in diesem Fall 7%) sind die vorliegenden Ergebnisse mit der Hypothese konsistent, dass Tβ4so die alleinige biologisch aktive Spezies ist. In weiteren Untersuchungen wurde HPLC-gereinigtes Tβ4 getrocknet und bei - 20ºC unter Stickstoff aufbewahrt und unmittelbar vor Gebrauch aufgelöst. Diese Ergebnisse, und insbesondere die Inhibition der Chemotaxis gaben Grund zu der Annahme, dass Tβ4so Entzündungsvorgänge abschwächen könnte, die mit Neutrophilen assoziiert sind, somit wurden die in vitro Beobachtungen in vivo ausgedehnt, unter Verwendung des Karrageen-induzierten Entzündungsmodells, das durch massive Infiltration von Neutrophilen mit begleitender Ödembildung gekennzeichnet ist (Ianaro, 1994). Verabreichung von Tβ4so 30 Minuten vor, während und 6 Stunden nach Injektion von Karrageen in den hinteren Fußballen von Balb/c Mäusen induzierte eine signifikante Suppression der Schwellung, was nach 6 Stunden klar ersichtlich war und bis zu 24 Stunden aufrecht erhalten blieb (Fig. 9a). Die Suppression war dosisabhängig und spezifisch, da eine Verabreichung von 10 oder 100 ng Dosen von Tβ4so oder von PBS oder Tβ4 (1000 ng) nicht wirksam war (Fig. 9b). Es wurde ein Vergleich von 800 ng Dosen von Tβ4so und Tβ4 in diesem Assay durchgeführt, und klar gezeigt, dass nur das oxidierte Peptid Karrageen- induziertes Ödem signifikant verringerte (Fig. 9c). Diese Daten deuteten klar darauf hin, dass Methioninoxidation kritisch war um in vivo entzündungshemmende Aktivität von Tβ4so zu erhalten, und stützten deutlich die biologische Plausibilität der in vitro Erkenntnisse.

Literaturstellen

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Claims

1. Pharmazeutische Formulierung umfassend oxidiertes Thymosin β4, eine physiologisch aktive Variante oder ein Salz davon und einen pharmazeutisch verträglichen Träger dafür, worin das aktive Agens das oxidierte Thymosin β4 ist.

2. Pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 1, worin das oxidierte Thymosin β4 eine Form von Thymosin β4 ist, in welcher ein Methionin- Rest, 6 Aminosäuren vom N-Terminus, oxidiert ist zu Methionin-Sulfoxid.

3. Pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 1, worin das oxidierte Thymosin β4 eine Form von Thymosin ist, in welcher ein Methionin-Rest, 6 Aminosäuren vom N-Terminus, komplexiert ist mit Metall(en).

4. Pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 1, worin die physiologisch aktive Variante ein oxidiertes Peptid ist, welches ein Spaltprodukt des oxidierten Thymosin β4 ist.

5. Pharmazeutische Formulierung nach einem beliebigen vorangehenden Anspruch, worin das oxidierte Thymosin von einem Säuger stammt.

6. Pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 1 bis 4, worin das oxidierte Thymosin β4 synthetisiert ist.

7. Pharmazeutische Formulierung nach einem beliebigen vorangehenden Anspruch, worin das oxidierte Thymosin β4, eine physiologisch aktive Variante oder ein Salz davon mindestens 30% des Gesamt-Thymosins β4 in der Formulierung ausmacht.

8. Pharmazeutische Formulierung nach einem beliebigen der Ansprüche 1-6, worin das oxidierte Thymosin β4, eine physiologisch aktive Variante oder ein Salz davon im Wesentlichen kein nicht-oxidiertes Thymosin β4 umfasst.

9. Pharmazeutische Formulierung nach einem beliebigen vorangehenden Anspruch, umfassend ein zusätzliches pharmazeutisches Agens, worin eine Nebenwirkung des zusätzlichen pharmazeutischen Agens Entzündung ist.

10. Pharmazeutische Formulierung nach einem beliebigen vorangehenden Anspruch, die zur oralen, nasalen, topischen, rektalen, vaginalen oder parenteralen Anwendung geeignet ist.

11. Oxidiertes Thymosin β4, eine physiologisch aktive Variante oder ein Salz davon zur Verwendung als Medikament.

12. Verwendung von oxidiertem Thymosin β4, einer physiologisch aktiven Variante oder einem Salz davon bei der Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung eines entzündlichen Zustands.

13. Verwendung nach Anspruch 12, worin der entzündliche Zustand zurückzuführen ist auf eine entzündliche Arthropathie, Kollagenose, Vaskulitis-Syndrom, Atemwegserkrankung, dermatologische Erkrankung, gastrointestinale Erkrankung, hämatologische Erkrankung, Abstoßung oder Infektion durch Transplantation oder Prothesen.

14. Verwendung nach Anspruch 12, worin der entzündliche Zustand das Ergebnis einer separaten Arzneimitteltherapie ist.

15. Verwendung von oxidiertem Thymosin β4, einer physiologisch aktiven Variante oder einem Salz davon bei der Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von septischem Schock.