DE3650150T2

DE3650150T2 - Modulator der anabolischen Aktivität und seine Verwendungen.

Info

Publication number: DE3650150T2
Application number: DE3650150T
Authority: DE
Inventors: Anthony Flanders Nj 07836 Cerami; Masanobu Kita-Ku Tokyo 114 Kawakami
Original assignee: Rockefeller University
Current assignee: Rockefeller University
Priority date: 1985-08-16
Filing date: 1986-08-08
Publication date: 1995-04-27
Anticipated expiration: 2006-08-09
Also published as: DE3650150D1; ATE114673T1; JP2506340B2; AU649019B2; AU7262691A; AU6151186A; JPS62116599A; EP0212489A3; EP0212489A2; EP0613006A1; EP0212489B1

Description

Die Erfindung betrifft Arzneimittel zur Behandlung von Kachexie und Schockzuständen bei Menschen, umfassend einen Anti-Cachectin-Antikörper (d. h. ein Anti- Modulatormaterial).
Die Anmelder sind Autoren oder Coautoren mehrerer Artikel zum Thema der vorliegenden Erfindung. Diese Artikel sind:
(1) Beutler et al., "Purification of Cachectin, a Lipoprotein Lipase-Suppressing Hormone Secreted By Endotoxin-Induced RAW 264.7 Cells", J. EXP. MED. 161, 984-995 (Mai, 1985);
(2) Beutler et al., "Lipopolysaccharide-Treated RAW 264.7 Cells Produce a Mediator Which Inhibits Lipoprotein Lipase in 3T3-L1 Cells", J. IMMUNOL. 134 (3), 1673-1675 (März, 1985); und
(3) Hotez et al., "Lipoprotein Lipase Suppression in 3T3- L1 Cells by a Haematoprotozoan-Induced Mediator From Peritoneal Exudate Cells." PARASITE IMMUNOL. (Oxf.) 6 : 203 (1984)
Die Forschung, die zum Gegenstand der vorliegenden Erfindung führte, wurde teilweise durch Subventionen des National Institute of Health und der Rockefeller-Stiftung unterstützt.
Die Erfindung betrifft Arzneimittel zur Behandlung der Wirkungen von invasiven Reizen, wie einer Infektion, auf tierische Wirte und beschreibt insbesondere die Identifizierung von Materialien, die an der Antwort des Wirts gegenüber solchen invasiven Reizen beteiligt sein können.
Mehrere übliche physiologische und biochemische Entgleisungen wurden bei verschiedenen Säugerwirten bei Antwort auf verschiedene invasive Reize, wie Infektionen durch Bakterien, Viren und Protozoen, sowie auf Tumore und Endotoxämien beobachtet. Diese Antworten umfassen beispielsweise Fieber, Leukocytose, Hyperlipidämie, verringerte Nahrungsmittelaufnahme (Kachexie) und Aktivität und andere Modifikationen bezüglich des Muskels, der weißen Blutkörperchen und des Leberstoffwechsels. Insbesondere erbrachten jüngste Studien mit dem Ziel der Erhellung der biochemischen Mechanismen der Kachexie bei mit Trypanosoma brucei infizierten Kaninchen, daß Tiere mit einer minimalen Parasitenbelastung starben und eine extreme Hypertriglyceridämie zeigten, wobei die Plasmalipoproteine mit sehr niedriger Dichte (VLDL) deutlich erhöht waren; vergleiche C.A. Rouser und A. Cerami, MOL. BIOCHEM. PARASITOL. 1 : 31-38 (1980). Der hypertriglyceridämische Zustand war angesichts des sehr starken Kräfteverfalls, der diese experimentelle Infektion begleitete, beachtlich. Es wurde gezeigt, daß die Erhöhung der Plasma-VLDL aus einem Defekt in der Ausscheidung stammte, welcher durch einen Aktivitätsverlust der peripheren Lipoproteinlipase (LPL) verursacht wurde.
Die LPL-Aktivität wurde von anderen beobachtet, und es wurde festgestellt, daß dieser Zustand vorlag, wenn sich der menschliche Körper im Schockzustand befand; vergleiche E.B. Man et al., "The Lipids of Serum and Liver in Patients with Hepatic Diseases", CLIN. INVEST. 24, 623 ff (1945); vergleiche auch John I. Gallin, et al., "Serum Lipids in Infection", N. ENGL. J. MED. 281, 1081-1086 (13. November 1969); D. Farstchi, et al., "Effects of Three Bacterial Infections on Serum Lipids of Rabbits", J. BACTERIOL. 95, 1615, ff. (1968); S.E. Grossberg, et al., "Hyperlipaemia Following Viral Infection in the Chicken Embryo: A New Syndrome", NATURE (London) 208, 954, ff. (1965); Robert L. Hirsch, et al., "Hyperlipidemia, Fatty Liver and Bromsulfophthalein Retention in Rabbits Injected Intravenously with Bacterial Endotoxin", J. LIPID. RES. 5 563-568 (1964); und Osamu Sakaguchi, et al., "Alternations of Lipid Metabolism in Mice Injected With Endotoxins", MICROBIOL. IMMUNOL. 23 (2) AT 71-85 (1979); R.F. Kampschmidt, "The Activity of Partially Purified Leukocytic Endogenous Mediator in Endotoxin Resistant C3H/HeJ Mice", J. LAB. CLIN. MED. 95, 616, ff. (1980); und Ralph F. Kampschmidt, "Leukocytic Endogenous Mediator", J. RET. SOC. 23 (4), 287-297 (1978)
Zusätzlich sind den Anmeldern Veröffentlichungen bekannt, die die Identifizierung und das Vorhandensein von "Mediatoren" diskutieren, die an der Antwort eines Wirts auf eine Infektion beteiligt zu sein scheinen. Insbesondere werden die folgenden Artikel aufgeführt:
Sipe, J.D., et al., J. EXP. MED., 150 : 597-606 (1979); und Barney, C.C., et al., LIPTON, J.M. (Hrsg.), FEVER: INTER- NATIONAL SYMPOSIUM, Dallas, Texas, 11.-12. April, 1979 XII + 263P. Raven Press: New York, Illus. ISBN 0-89004- 451-1 (08877), 0 (0), Seiten 111-122 (1980); und Dinarello, C.A., "Human Leukocytic Pyrogen: Purification and Development of a Radioimmunoassay", PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, 74(10) 4624-4627 (Oktober, 1977). Von allen Faktoren, die von jedem der Autoren der vorstehend erwähnten Artikel und der Artikel mit Kampschmidt als Autor oder Coautor identifiziert und untersucht wurden, wurde bestimmt, daß sie eine einzelne Gruppierung an Faktoren umfassen, die als Interleukin 1 identifiziert wurden. Diese Bestimmung wurde in einem Artikel von Charles A. Dinarello, der in REVIEWS OF INFECTIOUS DISEASES, Band 6, Nr. 1 (Januar-Februar 1984) veröffentlicht wurde, dokumentiert.
Ein ähnlicher Mangel der LPL-Aktivität wurde von den Anmeldern bei C3H/HeN-Mäusen nach Verabreichung des Escherichia coli-Lipopolysaccharids (LPS) beobachtet. Im Gegensatz dazu war ein Verlust der LPL-Aktivität bei C3H/HeJ- Mäusen, die genetisch gegenüber LPS resistent sind, nicht nachweisbar. Diese Resistenz gegenüber einem Endotoxin-induzierten LPL-Mangel konnte durch Verabreichung von Serum, das aus Endotoxin-empfindlichen Tieren erhalten worden war, denen zwei Stunden zuvor LPS injiziert worden war, umgangen werden. Auf ähnliche Weise konnte eine Resistenz dadurch überwunden werden, daß konditioniertes Medium aus Endotoxin-stimulierten mit Thioglycollat angeregten Makrophagen aus dem Peritoneum, erhalten aus empfindlichen Mäusen, injiziert wurde. Diese Ergebnisse wurden ausführlich in der gleichzeitig anhängigen Stammanmeldung Publikations-Nr. US-A-4603106 dargelegt.
Die vor stehende Arbeit wurde durch die Annahme der Anmelder, daß ein "Mediator" oder "Mediatoren" vorhanden ist/sind, und vermutlich einen signifikanten Effekt auf die allgemeine anabole Aktivität der Energiespeicherzellen in dem tierischen Wirt besitzen, gefördert. Es wurde vermutet, daß ein solcher "Mediator" eine unterdrückende Wirkung auf die Aktivität bestimmter anaboler Enzyme ausübte, deren verringerte Aktivität in Fällen beobachtet wurde, in denen der Wirt Bedingungen, die als Schock bekannt sind, als Antwort auf eine invasive Infektion erlitt. Folglich wurde die Beziehung des Mediators, der von Endotoxin-stimulierten Zellen des Peritoneumexudats von Mäusen produziert wurde, zu Endotoxin-empfindlichen und Endotoxin-unempfindlichen Mäusen in gleicher Weise und die Entwicklung eines Reagenzes zur Messung der Aktivität des anabolen Enzyms mittels einer derartigen Untersuchung in der Anmeldung mit der Publikationsnummer WO 83/00930 dargelegt.
Eine weitere Untersuchung dieses Systems wurde im Zusammenhang mit dem 3T3-L1 "Präadipocyten"-Modellsystem durchgeführt, und die entsprechende Entwicklung von Methoden und damit verbundenen Materialien für die Entwicklung von Antikörpern gegen den "Mediator" und andere diagnostische Verfahren wurden in der Anmeldung mit der Publikationsnummer WO 83/00930 dargelegt.
Danach haben die Anmelder in der Anmeldung mit der Publikationsnummer US-A-4603106 auch dargelegt, daß die Mediatorsubstanz, die sie aus der Endotoxinstimulierung von Macrophagenzellen abgeleitet hatten, die Aktivitäten besaß, die anabolen Enzyme Lipoproteinlipase, Acetyl-Coenzym A-Carboxylase und Fettsäuresynthetase zu unterdrücken und weiterhin das Wachstum und die Differenzierung von Erythrocyt - determinierten Zellen hemmte.
Zusätzliche Arbeit, die seit der Einreichung der vorstehend erwähnten Patentanmeldung durchgeführt wurde, und die in dem vorstehenden Artikel (1) von Beutler et al., dargelegt ist, führte zur Entdeckung, daß die früher identifizierte Mediatorsubstanz eine Proteinkomponente eingeschlossen enthält, die nach Isolierung und Untersuchung eine Anzahl von Aktivitäten zu besitzen scheint, die sie sowohl von der Mediatorsubstanz als auch den anderen Faktoren, die gemäß dem Stand der Technik identifiziert wurden und als Interleukin 1 und Interleukin 2 bekannt sind, unterscheiden. Folglich betrifft die vorliegende Erfindung das neu entdeckte Proteinisolat und seine Aktivitäten und die Anwendung entsprechender Antikörper in Arzneimitteln.
Gemäß einem ersten Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung wird das Modulatormaterial, d. h. das neu entdeckte Isolat der Mediatorsubstanz, offenbart und umfaßt ein Protein, das die Fähigkeit besitzt, im wesentlichen vollständig die Aktivität des anabolen Enzyms Lipoproteinlipase (LPL) zu unterdrücken und in gleicher Weise fähig ist, die Differenzierung der Fettzellen zu verhindern und die Aufnahme von Glucose in die Muskelzellen zu erhöhen. Dieses Protein besitzt jedoch nachweisbar keine Leukocytenaktivatoraktivität, und diese zuletzt genannte Eigenschaft unterscheidet die bekannten Faktoren, die kollektiv als Interleukin 1 identifiziert wurden. Bezüglich seiner bestätigenden Aktivitäten unterdrückt das erfindungsgemäße Modulatormaterial äußerst signifikant die LPL-Aktivität in Unterscheidung zu Interleukin 2 und spielt als solches vermutlich eine Rolle beim Einsetzen einer Kachexie. Ein spezielles Protein mit den vorstehenden Eigenschaften wurde isoliert, und es wurde gefunden, daß es ein Molekulargewicht von etwa 17 Kilodalton und einen pI-Wert von etwa 4,8 besitzt.
Wie vorstehend erwähnt, kann das erfindungsgemäße Modulatormaterial durch die Stimulierung von Makrophagenzellen mit einem Material, das einen invasiven Reiz begleitet, hergestellt werden. Insbesondere kann eine Probe Makrophagenzellen, die aus verschiedenen Quellen stammen kann, mit einem Reizmittel, wie einem Endotoxin oder Trypanosomen, inkubiert werden, um die Mediatorsubstanz, die in der gleichzeitig anhängigen US-A-4603106 offenbart ist, zu produzieren. Eine solche Inkubation kann für eine Zeitspanne bis zu 20 Stunden stattfinden, und die exakten Zeitgrenzen variieren, je nach den zur Inkubation ausgewählten speziellen Zellen. Nach einer derartigen Inkubation kann das Medium geeigneterweise behandelt werden, beispielsweise durch Zentrifugieren, um einen Überstand zu entfernen, der die rohe Mediatorsubstanz enthält. Die Mediatorsubstanz kann dann aus diesem Überstand beispielsweise mit einer 40-60%igen Ammoniumsulfatlösung ausgefällt werden. Danach kann die rohe Mediatorsubstanz einer Reihe bekannter Isolierungstechniken, wie isoelektrischer Fokussierung und Gelelektrophorese, unterworfen werden, wonach das Modulatormaterial isoliert wird. Die vorstehende Erfindung umfaßt natürlich alternative Verfahren zur Herstellung des Modulatormaterials, einschließlich - sofern anwendbar - bekannte genetische Replikationstechniken, und die Erfindung soll folglich derartige synthetische Präparate in ihrem Schutzbereich umfassen.
Genauer, das offenbarte Modulatormaterial umfaßt ein Polypeptid, das nach Erforschung und Untersuchung einige Ähnlichkeiten mit dem bekannten Protein, das als Tumornecrosefaktor (TNF) identifiziert wurde und bei Menschen gefunden wurde, zu besitzen scheint.
Folglich wird erfindungsgemäß auch ein Protein offenbart, das die vorstehend erwähnten Aktivitäten und Eigenschaften besitzt, und das die nachstehend und in Fig. 23 angegebene Aminosäuresequenz, bestimmt an Mäusen, besitzt:
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Die vorstehende Sequenz ist sowohl ähnlich als auch in gewisser Hinsicht unterschiedlich von der bekannten menschlichen TNF-Sequenz, wie nachstehend dargelegt werden wird. Ferner erleichtert die jüngste Isolierung der vorstehenden Aminosäuresequenz und der mRNA-Sequenz die Reproduktion des Modulatormaterials durch herkömmliche Techniken der genetischen Rekombination.
Insbesondere betrifft die Vorliegende Erfindung bestimmte Arzneimittel zur Verhütung und Behandlung des Auftretens von Schock bei Säugetieren, wobei das Vorhandensein und die den Schock fördernde Aktivität des Modulatormaterials nachgewiesen wird und danach ein Antikörper gegen den Modulator in einer effektiv die Entwicklung des Schocks Verhindernde Menge verabreicht wird. Gemäß einer weiteren Ausführungsform dienen die hier bezeichneten Arzneimittel der Behandlung von Kachexie durch Verabreichung von Antikörpern gegen das Modulatormaterial im Hinblick auf die direkte und signifikante Wirkung, die das Modulatormaterial auf die Aktivität des anabolen Enzyms LPL besitzt. Diese Arzneimittel können den Anti-Cachectin- Antikörper in Kombination mit pharmazeutisch verträglichen Trägern und/oder anderen Additiven enthalten.
Weitere Aufgaben und Vorteile ergeben sich für einen Fachmann aus der nachstehenden Beschreibung, die unter Bezugnahme auf die folgenden erläuternden Figuren dargelegt wird.
Die Fig. 1 ist eine graphische Darstellung, die die Ergebnisse von Biotests des Modulatormaterials aus Flüssigkeitsproben aus einer Säule für die isoelektrische Fokussierung darlegt.
Die Fig. 2 ist eine graphische Darstellung, die die Ergebnisse von Biotests von Proben des Modulatormaterials darlegt, welche nach Gelelektrophorese durchgeführt wurden, wobei Gelscheiben ausgeschnitten wurden, und die Bioaktivität dann von jeder Scheibe durch Diffusion in eine Ammoniumbicarbonatlösung eluiert wurde. Die Einheiten der Bioaktivität wurden gegen die Position aufgetragen, an der jede Scheibe relativ zum Boden des Gels entnommen wurde.
Die Fig. 3 ist ein Autoradiogramm, das die Ergebnisse der SDS-PAGE-Analyse von Fraktionen aus der Isolierung des Modulatormaterials zeigt. Proben des rohen Mediums aus Endotoxin-induzierten und nicht-induzierten RAW 264.7-Zellkulturen und Reinigungszwischenprodukte wurden der Elektrophorese in einem Polyacrylamidgel mit einem linearen 10-15%igen Gradienten unterworfen. Die Proben wurden gegen destilliertes Wasser vor der Elektrophorese dialysiert.
Die folgenden Legenden identifizieren die in dem Autoradiogramm gezeigten Bahnen. (1) 150 ul des nicht-induzierten RAW 264.7-Zellmediums; (2) 50 ul des induzierten RAW 264.7-Zellmediums; (3) 10 ul-Probe der Sammelfraktionen aus der Säule für die isoelektrische Fokussierung; (4) 25 ul-Probe aus dem Con A-Sepharose®-Filtrat; (5) 80 ul-Probe der Peakfraktion, erhalten mittels PAGE unter nicht-denaturierenden Bedingungen (homogenes Cachectin). Die Pfeile bezeichnen Cachectin, das dem Medium der nicht-induzierten Zellen vollständig fehlt, aber ein Hauptbestandteil des Mediums der induzierten Zellen ist. Cachectin wird sukzessive durch die vor stehend aufgeführten Reinigungsstufen angereichert. Die Banden mit hohem Molekulargewicht, die in allen Bahnen (einschließlich der Spacer- Bahnen) sichtbar sind, sind β-Mercaptoethanol-Verunreinigungen und sind in den Proben selbst nicht vorhanden.
Die Fig. 4 ist eine graphische Darstellung, die die Ergebnisse der SDS-PAGE-Analyse des gereinigten erfindungsgemäßen Modulatormaterials zeigt. Eine 20-ug-Probe des gereinigten Cachectins wurde 2 Minuten lang in Gegenwart von SDS zum Sieden erhitzt und einer Elektrophorese unter denaturierenden Bedingungen in einem 10-15%-igen linearen Polyacrylamidgel unterworfen. Aufeinanderfolgende 2-mm- Scheiben dieses Gels wurden elektrisch eluiert, und die elektrisch eluierten Fraktionen wurden 1 : 100 mit DME, enthaltend 10% FBS, verdünnt, und 10 ul-Aliquote wurden auf ihre Bioaktivität untersucht.
Die Fig. 5A und 5B sind graphische Darstellungen, die die Ergebnisse der Bindungsstudien mit radioaktiver Markierung, die mit dem gereinigten Modulatormaterial durchgeführt wurden, zeigen.
Die Fig. 6A und 6B sind graphische Darstellungen, die die Ergebnisse der Scatchard-Analysen der Radioiodierung und der Bindungsstudien, die mit dem erfindungsgemäßen Modulatormaterial durchgeführt wurden, zeigen.
Die Fig. 7 ist ein Autoradiogramm, entsprechend der Mono- QFPLC-Anionenaustauschchromatographie, die mit rohem konzentriertem RAW 267.4-Medium durchgeführt wurde. Die eingesetzte Photographie zeigt ein silbergefärbtes SDS-Polyacrylamidgradientgel, das die Trennung von Rohmaterial und aufeinanderfolgenden Säulenfraktionen zeigt.
Die Fig. 8 ist eine Autoradiographie, die eine Superose 12 (FPLC-Gelfiltration)-Chromatographie der Fraktionen aus der anfänglich durchgeführten Mono-Q-Fraktionierung zeigt. Die eingesetzte Photographie zeigt das SDS-Polyacrylamidgradientengel, das das elektrophoretische Profil aufeinanderfolgender Fraktionen, die aus dieser Filtration abgeleitet wurden, zeigt.
Die Fig. 9 ist eine graphische Darstellung, die die Ergebnisse der Zugabe von gereinigtem IL-1 und dem erfindungsgemäßen Modulatormaterial zu 3T3-L1-Zellen zeigt.
Die Fig. 10 ist eine graphische Darstellung, die die Ergebnisse der Zugabe von rekombinantem IL-1 und einem neutralisierenden Ziegen-Antiserum zu den gezüchteten 3T3-L1- Zellen zeigt.
Die Fig. 11 ist eine graphische Darstellung, die die Ergebnisse eines Radiorezeptortests zur Bindung des Modulatormaterials zeigt, worin in dem Segment A rekombinantes IL-1 mit dem markierten Modulator in Konkurrenz gesetzt wird, und in Segment B nicht-markiertes Modulatormaterial in Konkurrenz in dem gleichen System gesetzt wird. Die Bindung wird als Prozentsatz der eingebrachten CPM in Bindung durch die 3T3-L1-Zellen in jedem Test angegeben. Klammern zeigen die durchschnittliche Bindung, ± SEM.
Die Fig. 12 ist eine Photographie, die die Ergebnisse der Isolierung der mRNA aus TA1-Zellen zeigt, bei denen konditionierte Medien aus RAW 264.7-Zellen Präadipocytenkulturen 2 Tage vor der Konfluenz zugesetzt worden waren.
Die Fig. 13 ist eine Photographie der Ergebnisse der Dot- Blot-Tests, die in ähnlicher Weise wie in Fig. 12 durchgeführt wurden.
Die Fig. 14 ist eine Photographie, die die Ergebnisse der Dot-Blot-Tests, basierend auf Transkriptionsassays zeigt, welche durchgeführt wurden, um zu bestimmen, ob die Modulatorhemmung der Fett-spezifischen mRNA-Anhäufung in einer transkriptionellen Beziehung steht.
Die Fig. 15A ist eine graphische Darstellung, die die Ergebnisse der Zugabe des Modulatormaterials zu Adipocyten- Kulturen zeigt, die durch das Verfahren im Zusammenhang mit Fig. 12 differenziert wurden. Die RNA wurde zu den angegebenen Zeiten nach der Exposition gegenüber dem Modulatormaterial isoliert und wurde auf Nitrocellulose mit einem Dot-Blot-Gerät aufgebracht, wonach die Filter mit den angegebenen cDNAs abgesucht, gewaschen, autoradiographisch untersucht und dann gescannt wurden.
Die Fig. 15B ist eine Photographie, die die Ergebnisse der Northern-Analyse der RNA zeigt, wobei die Proben zuerst in einem Agaroseformaldehydgel elektrophoretisch untersucht wurden, und nach Waschen mit destilliertem Wasser, Natriumphosphat und EDTA wurden die Gele auf Nitrocellulose überführt.
Die Fig. 16 ist eine graphische Darstellung, die die Ergebnisse von vergleichenden Futteraufnahmeexperimenten zeigt, wobei die tatsächliche Futteraufnahme zwischen Kontrollmäusen und Mäusen, die Mengen des erfindungsgemäßen Modulators erhielten, gemessen wurde.
Die Fig. 17 ist eine graphische Darstellung, die die relative Veränderung der Körpermasse der Tiere zeigt, die an den unter Fig. 16 dargelegten Vergleichsfutteraufnahmeexperimenten teilgenommen hatten.
Die Fig. 18 ist eine graphische Darstellung, die die Wirkungen auf die Körpermasse der Tiere in Fällen zeigt, bei denen die Verabreichung des Modulators unterbrochen wurde.
Die Fig. 19 zeigt die Ergebnisse der Immunpräzipitation von radioaktiv markierten Proben des erfindungsgemäßen Modulatormaterials.
Die Fig. 20 ist eine Photographie der Ergebnisse einer Western-Blot-Analyse, die nach Elektrophorese durchgeführt wurde, wobei Immun- und Vorimmunseren verglichen wurden.
Die Fig. 21 ist eine graphische Darstellung der Ergebnisse der LD&sub5;&sub0;-Werte für Endotoxin bei Mäusen, die mit Immun- und Nichtimmunseren behandelt wurden.
Die Fig. 22 ist eine graphische Darstellung, die einen Kaplan-Meier-Überlebensplot nach LPS-Behandlung von BALB/c-Mäusen zeigt, die in 5 Gruppen aufgeteilt wurden, und mit einer intraperitonealen Injektion von Anti-Modulatorserum entweder sechs oder drei Stunden vor, begleitend mit oder drei oder sechs Stunden nach der Injektion einer Menge an E. coli inokuliert wurden.
Die Fig. 23 ist eine Darstellung der Aminosäuresequenz des Modulatormaterials, welches aus Mäusen isoliert wurde.
Die vorliegende Erfindung offenbart die Isolierung und Identifizierung eines speziellen Faktors, der nachstehend alternativ als Modulatormaterial oder Cachectin bezeichnet wird, von dem gefunden wurde, daß es in Makrophagen und Makrophagenzellinien vorhanden ist, die durch Materialien, die hier als Reizmittel bezeichnet werden, stimuliert werden, die charakteristischerweise einen invasiven Reiz, wie Bakterien, ein Virus, bestimmte Tumore, Protozoen und andere Toxine, wie Endotoxin, begleiten. Wie die Mediatorsubstanz, die in der Stammanmeldung Publikationsnummer US- A-4603 106 offenbart ist, scheint das erfindungsgemäße Modulatormaterial, das als eine Komponente des zuerst genannten bestimmt wurde, in der Lage zu sein, ein Umschalten des Metabolismus von bestimmten Zellen eines Säugetieres von einem anabolen Zustand in einen katabolen Zustand zu verursachen, mit dem offensichtlichen Zweck, den Wirt gegen den invasiven Reiz zu mobilisieren.
Insbesondere scheint das erfindungsgemäße Modulatormaterial die Aktivität des anabolen Enzyms Lipoproteinlipase (LPL) zu unterdrücken und legt somit nahe, daß es als ein Teil eines Kommunikationssystems in dem Immunsystem des Wirts und seiner Energiespeichergewebe funktioniert. Das Modulatormaterial scheint auch die Differenzierung der Fettzellen zu verhindern, und erhöht die Aufnahme von Glucose in die Muskelzellen, und wirkt daher theoretisch als Antwort auf einen invasiven Reiz dahingehend, daß es eine Wirkung auf die Energiespeichergewebe, wie Fettgewebe, Muskeln und dgl. erzeugt und ausübt, um den drohenden Energiebedarf zur Bekämpfung der Invasion zu erfüllen. Das Modulatormaterial fördert so eine Umwandlung der zellulären Aktivität des Wirts in einen katabolen Zustand, wodurch die Bereitstellung einer derartigen Energie erleichtert wird. Wenn die Invasion von kurzer Dauer ist, kann der Wirt rasch die aufgewendete Energie wiedergewinnen und auffüllen. Wenn jedoch die Invasion kontinuierlicher oder chronischer Natur ist, können eine vollständige Energieentleerung, Kachexie, Schock und schließlich Tod die Folge sein.
Folglich umfaßt eine Form des erfindungsgemäßen Modulatormaterials, wie bestätigt wurde, ein Protein, das ein Molekulargewicht von etwa 17000 Dalton und einen isoelektrischen Punkt von etwa 4,7-4,8 besitzt. Dieses spezielle Modulatormaterial liegt als Dimeres oder größeres Multimeres vor, wie durch die Ergebnisse der Forschungen, die zu seiner Isolierung führten, gezeigt wurde, die in den nachstehenden Beispielen I und II dargelegt sind. Diese Tests bestätigen auch, daß das Modulatormaterial an spezifische Rezeptoren mit hoher Affinität auf den Zellen bindet, mit denen es wechselwirkt. Insbesondere legen die Daten in Beispiel I das Vorhandensein von etwa 104 hochaffinen Bindungsstellen pro Zelle und eine entsprechende Assoziationskonstante (Ka) von 3·10&sup9; nahe. Wie später hier dargelegt werden wird, legt dies seinerseits eine strukturelle und funktionelle Unterscheidung zwischen dem erfindungsgemäßen Modulatormaterial und den bekannten Faktoren aus dem Stand der Technik nahe, da sich die Aktivität und insbesondere der Bindungsmechanismus des erfindungsgemäßen Modulatormaterials klar unterscheiden. Eine weitere Eigenschaft des Modulatormaterials ist, daß es Antikörper gegen sich selbst erzeugen kann, die effektiv einen Endotoxin-induzierten Schock verhindern. Dies wird in Beispiel X dargelegt.
Zusätzlich zu den vorstehend dargelegten Aktivitäten unterscheidet sich das erfindungsgemäße Modulatormaterial in denjenigen Eigenschaften, die ihm fehlen. Insbesondere unterscheidet sich das Modulatormaterial von der Mediatorsubstanz in seiner Unfähigkeit, entweder die anabolen Enzyme Acetyl-Coenzym-A-Carboxylase und Fettsäuresynthetase zu unterdrücken, oder das Wachstum und die Differenzierung Erythrocyt - determinierter Zellen zu verhindern. Auf ähnliche Weise unterscheidet sich das Modulatormaterial von dem bekannten Faktor Interleukin 1 durch sein Fehlen einer Leukocytenaktivatoraktivität. Auch scheint dem Modulator die Fähigkeit, Fieber bei Mäusen oder einen Abbau von Muskelprotein zu verursachen, zu fehlen. Die Unterscheidungen bezüglich der Aktivität, die als identifizierende Besonderheiten sowohl des Modulatormaterials als auch seiner Mediatorvorläufersubstanz dienen, sind ausführlicher in den nachstehend angegebenen Beispielen beschrieben.
Die Herstellung des Modulatormaterials wurde kurz vorstehend diskutiert, und es wird bestätigt, daß sie durch Beginn der Inkubation einer Vielzahl von Zellen mit Reizmitteln aus invasiven Reizen vorgenommen werden kann. Insbesondere kann die Zellinie RAW 264.7 verwendet werden, um die Produktion der Mediatorvorläufersubstanz zu initiieren, aus welcher das Modulatormaterial isoliert werden kann. Insbesondere erleichtert die Entwicklung der Makrophagenzellinie RAW 264.7 der Maus, wie nachstehend ausführlicher diskutiert, die Isolierung des Modulatormaterials in Mengen, die groß genug sind, um die Durchführung einer Analyse und Reinigung zu erlauben. Natürlich werden andere Zellinien oder andere Quellen zur Entwicklung entweder der Mediatorvorläufersubstanz, aus der das Modulatormaterial anschließend isoliert wird, oder des Modulatormaterials selbst, hier in Betracht gezogen, und der Gegenstand der Erfindung ist folglich nicht beschränkt. So werden alternative Verfahren, wie genetische Replikation, erfindungsgemäß hier betrachtet.
Ein erfindungsgemäßes Modulatormaterial wurde aus Mäusen isoliert und analysiert, wie in dem nachstehenden Beispiel II dargelegt ist. Es wurde gefunden, daß es eine gewisse Ähnlichkeit zu dem bekannten Protein-Tumornecrosefaktor (TNF), wie er beim Menschen gefunden wird, besitzt. Weitere Arbeiten, die nach der Beendigung der in Beispiel II dargelegten Versuche durchgeführt wurden, führten zur Erhellung der vollständigen Sequenz dieses Modulatorproteins, und diese Sequenz ist in Fig. 23 angegeben. So wurde bestimmt, daß die Sequenz des reifen Modulatorproteins durch 156 Aminosäuren definiert ist. Ferner wurde die mRNA des Modulators, die zu dieser Aminosäuresequenz gehört, ebenfalls identifiziert und wurde verwendet, um die rekombinante Form dieses beschriebenen Proteins herzustellen. Die verwendete Technik umfaßte die Isolierung der mRNA aus Endotoxininduzierten RAW 264.7-Zellen, die anschließende Herstellung eines geeigneten Vektors, welcher die mRNA enthielt, der dann in E. coli eingeschleust wurde. Die Transformation erfolgte mit hoher Effizienz (z. B. etwa 108 rekombinante Bakterien pro ug DNA), wobei die rekombinante Plasmid-DNA verwendet wurde. Danach wurde eine synthetische Oligonucleotidsonde (Länge 45 np) konstruiert und wurde verwendet, um die cDNA-Bank durch in situ-Hybridisierung mit lysierten Bakterienkolonien abzusuchen, und die Sequenzierung wurde nach dem Didesoxynucleotidverfahren vorgenommen.
Das vorstehende Verfahren ist unveröffentlichten Versuchen entnommen, und man kann erkennen, daß viele der allgemeinen Prinzipien der rekombinanten Technologie, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, daran beteiligt sind. Folglich betrifft die vorliegende Erfindung die Herstellung des erfindungsgemäßen Modulatormaterials und insbesondere des Materials mit der in Fig. 23 gezeigten Aminosäuresequenz nach bekannten rekombinanten Techniken.
Während die Aminosäuresequenz des in Beispiel II dargelegten Modulators dem menschlichen TNF ähnlich zu sein scheint, legen Unterschiede in der Anzahl spezieller Aminosäureeinheiten nahe, daß Unterschiede sowie Ähnlichkeiten zwischen den Proteinen vorhanden sind. Insbesondere vergleicht die Untersuchung in Beispiel II das Modulatormaterial, das von der Stimulierung von Mauszellen abgeleitet ist, mit bekannten Strukturdaten, die jüngst hinsichtlich des menschlichen Tumornecrosefaktors erhoben wurden, und fand sowohl Ähnlichkeiten als auch Unterschiede, wobei die zuletzt genannten in erster Linie bezüglich der Anzahl und der Verteilung bestimmter Aminosäurereste bestehen. Die Untersuchung zeigte auch, daß eine bestimmte Aktivität des von der Maus entwickelten Modulatormaterials vorhanden ist, welche anti-neoplastische Eigenschaften, ähnlich denen des menschlichen TNF, nahelegt.
Im Zusammenhang mit den vorstehenden Ausführungen kann das Modulatormaterial zur Behandlung der Wirkungen von postinfektiösen Zuständen, wie Kachexie und Schock, verwendet werden. Insbesondere kann das Modulatormaterial verwendet werden, um Antikörper gegen sich selbst in einer Vielzahl von Säugetieren nach bekannten Techniken zu erzeugen, wie der Hybridomatechnik unter Verwendung von beispielsweise fusionierten Mausmilz-Lymphocyten und Myelomzellen. Die so erhaltenen Antikörper könnten dann in einem geeigneten Arzneimittel hergestellt werden und dem Wirt, der den invasiven Reiz in sich trägt, verabreicht werden, um den Zustand der Kachexie zu verhindern oder zu behandeln.
Ähnlich der Behandlung der Kachexie können Antikörper gegen das Modulatormaterial hergestellt werden und zur Behandlung des Zustands des Schocks verwendet werden. Die genauen Mengen, die Verabreichungszeiträume und die Verabreichungstechniken hinsichtlich jedes der Arzneimittel können gemäß denen, die auf dem Gebiet der Medizin bekannt sind und gemäß den spezifischen Anweisungen eines qualifizierten Arztes oder Tierarztes variieren. Der qualifizierte Arzt oder Tierarzt wird auch Faktoren, wie Alter, Gewicht, allgemeiner Gesundheitszustand und Konzentration des Modulatormaterials, das in dieser Hinsicht wirkt, berücksichtigen.
Ein Antikörper bzw. Antikörper gegen das Modulatormaterial können nach Standardverfahren, einschließlich der gut bekannten Hybridomatechniken, erzeugt und isoliert werden. Der bzw. die Antikörper kann/können in anderen Arten so verwendet werden, als wären sie ein Antigen/Antigene zur Erzeugung eines Antikörpers/Antikörper. Beide Typen von Antikörper/Antikörpern können verwendet werden, um das Vorhandensein und das Ausmaß der Aktivität des Modulatormaterials zu bestimmen. Zweckdienlicherweise wird/werden der/die Antikörper gegen das Modulatormaterial hier als Ab&sub1; und der bzw. die Antikörper, der bzw. die in einer anderen Art erzeugt wurde/wurden, als Ab&sub2; bezeichnet.
Das Vorhandensein der Aktivität des Modulatormaterials in Wirten, die vermutlich einen invasiven Reiz in sich tragen, kann durch übliche immunologische Verfahren, die für solche Bestimmungen anwendbar sind, festgestellt werden. Eine Anzahl von nützlichen Verfahren sind bekannt. Bei drei solchen Verfahren, die besonders nützlich sind, wird entweder das mit einem nachweisbaren Marker markierte Modulatormaterial, der mit einem nachweisbaren Marker markierte Antikörper Ab&sub1; oder der mit einem nachweisbaren Marker markierte Antikörper Ab&sub2; verwendet. Die Verfahren können durch die folgenden Gleichungen zusammengefaßt werden, worin das Sternchen anzeigt, daß das Teilchen markiert ist, und "Mod" für Modulatormaterial steht:
A. Mod* + Ab&sub1; = Mod*Ab&sub1;
B. Mod + Ab&sub1;ß = ModAb&sub1;*
C. Mod + Ab&sub1; + Ab&sub2;* = ModAb&sub1;Ab&sub2;*
Die Verfahren und ihre Anwendung sind einem Fachmann bekannt, und folglich können sie im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Das "kompetitive" Verfahren, Verfahren A, ist in den U.S. Patenten Nrn. 3 654 090 und 3 850 752 beschrieben. Das Verfahren C, das "Sandwich"- Verfahren, ist in den U.S. Patenten Nrn. RE 31 006 und 4 016 043 beschrieben. Noch andere Verfahren sind bekannt, wie das "Doppelantikörper"- oder "DASP"-Verfahren.
In jedem Fall bildet das Modulatormaterial Komplexe mit einem oder mehreren Antikörper/Antikörpern oder Bindungspartnern, und ein Bestandteil des Komplexes ist mit einem nachweisbaren Marker markiert. Die Tatsache, daß sich ein Komplex gebildet hat, und gegebenenfalls die Menge davon, können nach bekannten Verfahren, die für den Nachweis von Markern anwendbar sind, bestimmt werden.
Aus den vorstehenden Ausführungen geht hervor, daß eine charakteristische Eigenschaft von Ab&sub2; ist, daß er mit Ab&sub1; reagiert. Dies hat seinen Grund darin, daß Ab&sub1;, der in einer Säugerart erzeugt wurde, in einer anderen Art als Antigen verwendet wurde, um den Antikörper Ab&sub2; zu erzeugen. Beispielsweise kann Ab&sub2; in Ziegen unter Verwendung von Ab&sub1; als Antigen erzeugt werden. Ab&sub2; würde daher ein in Ziegen erzeugter Anti-Kaninchen-Antikörper sein. Für diese Beschreibung und die Patentansprüche wird Ab&sub1; als ein Modulatormaterial-Antikörper bezeichnet, und Ab&sub2; als ein mit einem Modulatormaterial-Antikörper reaktiver Antikörper oder alternativ als "Anti-Antikörper" bezeichnet.
Die am häufigsten für diese Untersuchungen verwendeten Marker sind radioaktive Elemente, Enzyme, im UV-Licht fluoreszierende Chemikalien und andere.
Eine Anzahl von fluoreszierenden Materialien ist bekannt und kann als Marker verwendet werden. Diese umfassen beispielsweise Fluorescein, Rhodamin und Auramin. Ein spezielles Nachweismaterial ist der in Ziegen hergestellte Anti-Kaninchen-Antikörper, der mit Fluorescein über ein Isothiocyanat konjugiert ist.
Das Modulatormaterial oder sein Bindungspartner/seine Bindungspartner können auch mit einem radioaktiven Element oder mit einem Enzym markiert werden. Der radioaktive Marker kann nach jedem beliebigen der gegenwärtig verfügbaren Zählverfahren nachgewiesen werden. Die bevorzugten Isotope können aus ¹&sup4;C, ¹³¹I, ³H, ¹²&sup5;I und ³&sup5;S ausgewählt werden.
Enzymmarker sind auf ähnliche Weise nützlich und können nach jeder der gegenwärtig verwendeten colorimetrischen, Spektrophotometrischen, fluorspektrophotometrischen oder gasometrischen Techniken nachgewiesen werden. Das Enzym wird an das ausgewählte Teilchen durch Reaktion mit verbrückenden Molekülen, wie Carbodiimiden, Diisocyanaten, Glutaraldehyd und dgl. konjugiert. Viele Enzyme, die bei diesen Verfahren verwendet werden können, sind bekannt und können verwendet werden. Die bevorzugten sind Peroxidase, β-Glucuronidase, β-D-Glucosidase, β-D-Galactosidase, Urease, Glucoseoxidase plus Peroxidase und saure Phosphatase. Beispielhaft wird auf die U.S. Patente Nrn. 3 654 090; 3 850 752; und 4 016 043 bezüglich ihrer Offenbarung von alternativen Markierungsmaterialien und Methoden Bezug genommen.
Ein spezielles Testsystem, das erfindungsgemäß entwickelt und verwendet wurde, ist als ein Rezeptortest bekannt. In einem Rezeptortest wird das zu untersuchende Material auf geeignete Weise markiert, und dann werden bestimmte zelluläre Testkolonien, wie das 3T3-L1-Zellsystem, zuerst differenziert und dann mit einer Menge des markierten Materials inokuliert, wonach Bindungsstudien durchgeführt werden, um das Ausmaß zu bestimmen, in dem das markierte Material an die Zellrezeptoren bindet. So können Aktivitätsunterschiede zwischen den Materialien festgestellt werden. Dieses Verfahren ist speziell in dem nachstehenden Beispiel 1 erläutert.
So wurde, wie in Beispiel 1 ausführlich beschrieben, eine gereinigte Menge des Modulatormaterials radioaktiv markiert, wonach Bindungsstudien durchgeführt wurden, bei denen jüngst differenzierte 3T3-L1-Zellen verwendet wurden. Eine Lösung, die variierende Mengen des markierten Modulatormaterials enthielt, wurde hergestellt, und Zellproben wurden inokuliert und anschließend inkubiert. Die so erhaltenen einzelligen Schichten wurden dann gewaschen, solubilisiert und in einem Gammacounter für eine ausreichende Zeitspanne, um einen Standardfehler von < 5% zu ergeben, ausgezählt. Die Daten wurden dann einer Scatchard- Analyse unterworfen, wonach Beobachtungen und Schlüsse hinsichtlich der Aktivität des Materials vorgenommen wurden. Während das vorstehende Protokoll ein Beispiel ist, erläutert es die Art, auf die ein Rezeptortest in dem Fall durchgeführt und verwendet werden kann, in dem die zelluläre Bindungsfähigkeit des untersuchten Materials als unterscheidendes Merkmal gelten kann.
Wie vorstehend angegeben, legen die nachstehenden Beispiele die Einzelheiten der Isolierung und Identifizierung des erfindungsgemäßen Modulatormaterials dar, sowie die Beobachtungen hinsichtlich seiner Aktivität, die sowohl die Unterschiede als auch die Ähnlichkeiten bezüglich der Aktivität zwischen dem erfindungsgemäßen Modulatormaterial und solchen Faktoren definieren, die früher sowohl von den Anmeldern als auch von anderen Fachkollegen isoliert wurden. Natürlich sind die nachstehend dargelegten spezifischen Materialien und Techniken nur beispielhaft und können variieren, so daß die nachstehenden Ausführungen als Erläuterung und nicht als Beschränkung der vorliegenden Erfindung gegeben werden.

Beispiel 1

In dem vorliegenden Beispiel wird die Isolierung des erfindungsgeinäßen Modulatormaterials aus 3T3-L1-Zellen dargelegt. Die Untersuchung des Isolats zeigt, daß es ein 17 Kilodalton-Protein ist, das an Adipocyten und mehrere andere Zelltypen mittels spezifischer Rezeptoren mit hoher Affinität bindet.

MATERIALIEN UND METHODEN

3T3-L1-Zellkultur und Biotest. 3T3-L1-Zellen wurden auf Linbro-Platten (Flow Laboratories, Inc., McLean, Virginia) mit 24 Vertiefungen in einer Dichte von 100.000 Zellen pro Vertiefung in Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium (DME (Gibco Laboratories, Grand Island, New York), supplementiert mit 10% Kälberserum, plattiert und bei 37ºC in einer 10%igen CO&sub2;-Umgebung gehalten. Das Medium wurde jeden zweiten Tag gewechselt. Nach einer Woche wurden die Zellen durch 48-stündige Inkubation in einem mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), 10 ug/ml Rinderinsulin, 0,5 mM Methylisobutylxanthin und 1,0 uM Dexamethason supplementierten Medium differenziert. Die differenzierten Zellen wurden in dem Medium, das 10% FBS und 50 ng/ml Rinderinsulin (jeden zweiten Tag gewechselt) enthielt, gehalten, bis sie für den Biotest oder die Bindungsstudien eine Woche später gebraucht wurden.
Die zu untersuchenden Proben wurden in Volumina von ≥ 0,1 ml in die einzelnen Vertiefungen der differenzierten 3T3- L1-Zellen gegeben, von denen jede 1,0 ml Medium enthielt, und in einen Inkubator mit 10% CO&sub2; bei 37ºC 12 bis 18 Stunden gegeben. Am Ende dieser Inkubation wurde das Medium abgesaugt und durch 0,5 ml DME, enthaltend 10% FBS, 50 ng/ml Insulin und 10 E/ml Heparin ersetzt. Nach einer Stunde bei 37ºC wurde die durch Heparin freisetzbare LPL- Aktivität nach dem Verfahren von Nilsson-Ehle und Schotz gemessen.
Der Prozentsatz der gesamten LPL-Suppression (PTS) in einer Probe mit einer LPL-Aktivität x wurde wie folgt definiert: PTS = (C-x/C-m)·100, worin C die LPL-Aktivität ist, die in den Vertiefungen der 3T3-L1-Zellen erzeugt wurde, die nicht dem rohen Mediator exponiert wurden, und m die LPL-Aktivität des heparinisierten Mediums allein ist. Um eine Testvariabilität von Tag zu Tag zu vermeiden, wurden die Ergebnisse einer unbekannten Probe mit einem Standardpräparat der rohen Mediatorsubstanz, die in allen Biotests eingeschlossen ist, verglichen. Dieses Standardpräparat des rohen Mediators wurde in Aliquote in kleine Reagensgläser aufgeteilt und bei -80ºC gelagert. 1 E Bioaktivität wurde als die Menge an Cachectin definiert, die eine PTS ergab, die der, die durch Zugabe von 1,0 ul des Standards zu dem 1,0-ml-Testsystem erzielt wurde, äquivalent war. Die Verwendung einer Standardlösung des rohen Mediators sicherte auch eine lineare Abschätzung der Menge der Bioaktivität, die in unbekannten Proben vorhanden war.

Produktion des Mediators

RAW 264.7-Zellen wurden bis zur Konfluenz in RPMI gezüchtet, das bei 37ºC in einer 5% CO&sub2;- Umgebung gehalten wurde. Vor der Induktion der Sekretion des Mediators wurden die RAW 264.7-Zellen ausgiebig mit Hank's ausgewogener Salzlösung (Gibco Laboratories), die mit 25 mM HEPES auf einen pH-Wert von 7,4 gepuffert war (Research Organics, Inc., Cleveland, Ohio) gewaschen, um verunreinigende Serumproteine zu entfernen. Jeder Kolben wurde mit 100 ml RPMI 1640-Medium, das 1 ug/ml E. coli LPS (Difco Laboratories, Inc., Detroit, Michigan) und 50 mM HEPES, pH 7,4, enthielt, stimuliert. Nach 22-stündiger Inkubation bei 37ºC wurde das Medium durch ein 0,22 um-Filter filtriert und bei -20ºC gefroren.

Reinigung des Mediators

855 ml gelagertes gefrorenes Medium wurden aufgetaut und unter 50 psi Stickstoff bei 4ºC unter Verwendung einer gerührten Zelle mit einem PM-10- Filter (Amicon Corp., Danvers, Massachusetts) eingeengt. Nach einer Einengung auf 2% des anfänglichen Volumens wurde die zurückgehaltene Proteinlösung wiederholt mit destilliertem Wasser verdünnt und erneut eingeengt, um die Probe vor der isoelektrischen Fokussierung zu entsalzen.
Die isoelektrische Fokussierung wurde bei 4ºC in einer wassergekühlten Säule mit einer 400 ml-Kapazität durchgeführt. Ein Glyceringradient wurde in dieser Säule hergestellt, wobei die Proteinprobe in der Mitte wie folgt aufgeschichtet wurde: ein linearer Gradient von Glycerin von 40 bis 21% (Vol./Vol.) wurde zugesetzt; die Probe wurde mit einer peristaltischen Pumpe aufgetragen; und ein Glyceringradient von 19 bis 0% (Vol./Vol.) wurde über die Probe aufgeschichtet. Sowohl die oberen als auch die unteren Segmente des Gradienten enthielten Servalyte®, pH 3-10 (Serva Fine Biochemicals, Inc., Garden City Park, New York) in einer Verdünnung von 1 : 16 mit Wasser. Die Probe wurde durch Vermischen des salzfreien Konzentrats (55 ml Vol.) mit 4,3 ml Servalyte®, pH 3-10, und 16,7 g Glycerin hergestellt. Die Anodenlösung (am unteren Ende der Säule) war 0,01 M Imidodiessigsäure in 40% Glycerin, und die Kathodenlösung (am oberen Ende der Säule) war 0,01 M Ethylendiamin in H&sub2;O. Die Trennung wurde mit einer Anfangsstromstärke von 18 mA und einer Anfangsspannung von 630 V durchgeführt. Die Spannung wurde mit abnehmender Stromstärke während des Lauf s erhöht, aber die Leistungsausgabe wurde auf 16 W beschränkt.
Nach 24 Stunden wurde die Säule unter Schwerkraft in 150 Tropfen-Fraktionen entleert. Die präzipitierten Proteine wurden durch 20-minütige Zentrifugation bei 3000 g bei 4ºC entfernt. Ein Tropfen Phenolrotlösung wurde jedem dekantierten Überstand zugesetzt, und die sauren Proben wurden durch Zugabe einer gesättigten dreibasischen Natriumphosphatlösung neutralisiert, während die basischen Proben durch Zugabe einer 30%igen Phosphorsäurelösung neutralisiert wurden. Die Cachectinbioaktivität wurde durch Testen von 2 ul jeder Fraktion entsprechend dem Spitzenwert der Bioaktivität, welche für die weitere Reinigung vereinigt wurden, bestimmt.
Die vereinigten Spitzenfraktionen wurden bei 4ºC gegen mehrere Wechsel von Dulbeccos Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) (Gibco Laboratories) dialysiert, um die Ampholyte und das Glycerin zu entfernen. Das dialysierte Material (mit einem Volumen von 94 ml) wurde über eine Concanavalin A (Con A)-Sepharose®-Säule (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden) mit einem Bettvolumen von 2,0 ml eine Stunde lang bei 4ºC geleitet. Weitere 10 ml PBS wurden dann durch das Harz laufengelassen und mit dem Rest des Filtrats vereinigt. Das Filtrat wurde gegen 2 Wechsel von destilliertem Wasser bei 4ºC dialysiert und lyophilisiert.
Die Probe wurde in 2 ml einer Lösung, die 30 mM Tris-HCl- Puffer, pH 6,8, 5% Glycerin, 1 mM β-Mercaptoethanol, und 0,002% Bromphenolblau enthielt, erneut aufgelöst und dann einer Elektrophorese unter nicht-naturierenden Bedingungen unterworfen. Die Probe wurde auf das Sammelgel eines 1,5 mm·14,2 cm·13,6 cm Stabgels mit einem 6-13%-igen linearen Polyacrylamidgradienten aufgebracht. Ein Tris- Glycin-Puffersystem wurde wie folgt verwendet: der Kathodenpuffer war 38 mM Tris-Base und 40 mM Glycin; der Anodenpuffer war 63 mM Tris-Base und 50 mM HCl; der Puffer des Sammelgels war 0,125 M Tris-HCl, pH 6,8; und der Puffer des Trenngels war 0,375 M Tris-HCl, pH 8,8 (Endkonzentrationen). Zusätzlich zu Acrylamid (29,2%) enthielt die Monomerenlösung 0,8% Bis-acrylamid. Um die Verunreinigungen zu entfernen, wurde die Monomerenlösung über Nacht mit einem Amberlite® MB-1-Harz (Mallinckrodt, Inc., St Louis, Missouri) gerührt.
Die Probe wurde bei 4ºC mit einer konstanten Stromstärke von 20 mA elektrophoretisch untersucht, bis der Bromphenolblaumarker das Ende des Gels erreicht hatte. Nach Beendigung der Elektrophorese wurde 1 cm Gel von den Seitenrändern des Stabs entfernt, da Spannungsartefakte eine nicht-horizontale Wanderung in diesen Regionen verursachten, und der Rest des Gels wurde horizontal in 2 mm-Abständen geschnitten. Das Protein wurde aus jeder Scheibe gewonnen, indem man es in 2 ml einer 50 mM Ammoniumbicarbonatlösung in einem Polypropylenreagensglas über eine Zeitspanne von 12 Stunden bei 4ºC unter sanftem Schütteln diffundieren ließ. Die Elektroelution wurde in einem röhrenförmigen Gelapparat gegen eine Dialysemembran mit einem Ausschlußvolumen von 3500 Dalton, wie von Francis, R.T., Jr., et al., J. CHROMATOGR., 298 : 115 (1984) beschrieben, durchgeführt.
Die so erhaltenen Fraktionen wurden auf ihre Aktivität getestet und einer Polyacrylamidgelelektrophorese in einem denaturierenden System, das Natriumdodecylsulfat enthielt (SDS-PAGE), in Gelen mit einem linearen 10-15%igen Gradienten unter nicht-reduzierenden und reduzierenden Bedingungen unterworfen, um die Reinheit zu bewerten. Die Proteinbanden wurden durch Silberfärbung, wie früher von Wray, E., et al., ANAL. BIOCHEM. 118 : 197 (1981) beschrieben, sichtbar gemacht.

Analytische Säulenchromatographie

Die Gelfiltration wurde unter Verwendung von feingradigem Sephadex® G-75 (Pharmacia Fine Chemicals) in einer 7 mm·1 m Glassäule, die mit 0,1 M Ammoniumbicarbonat, pH 7,8, äquilibriert war, durchgeführt. Harnstoff mit Enzymreinheit (Bethesda Research Laboratories, Bethesda, Maryland) wurde der Probe und dem Elutionspuffer in Versuchen zugesetzt, deren Ziel die Bestimmung der Größe der Untereinheit von Cachectin war, und die Fraktionen wurden einzeln gegen PBS vor dem Biotest dialysiert.

Untersuchungen mit radioiodiertem Cachectin

Gereinigtes Cachectin wurde nach dem Iodogenverfahren radioaktiv markiert. Das freie Iodid wurde durch Sephadex® G-25-Filtration mit anschließender umfangreicher Dialyse entfernt. Die Bindungsstudien wurden unter Verwendung von Linbro- Platten mit 24 Vertiefungen, die die jüngst differenzierten 3T3-L1-Zellen (4·10&sup5; Zellen pro 0,2 ml System) enthielten, durchgeführt. Die für die Bindungsstudien verwendete Lösung bestand aus DME-Medium, das 10% FBS, 50 ng/ml Insulin und 50 mM HEPES-Puffer, pH 7,4, enthielt. Variierende Mengen des markierten Cachectins wurden dieser Lösung zugesetzt. Außer anders angegeben, wurden diese Inkubationen 4 Stunden lang auf Eis unter langsamem Rühren durchgeführt. Die einzelligen Schichten wurden dann 3 mal mit 1,0 ml Medium gewaschen, mit 1,0 1 M NaOH solubilisiert, und in einem Gammazähler eine ausreichend lange Zeitspanne ausgezählt, um einen Standardfehler < 5% zu ergeben.
Die Muskelzellinie C2 (ein freundliches Geschenk von Dr. Helen Blau der Stanford University Medical School, Palo Alto, Kalifornien) wurde ebenfalls auf Cachectinbindung analysiert. Die Zellen wurden bis zur Konfluenz in Linbro- Platten mit 24 Vertiefungen gezüchtet. Die Platten wurden mit Kälberhautcollagen (Calbiochem-Behring Corp., La Jolla, Kalifornien) durch Autoclavieren von 50 mg Collagen in 35 ml Wasser und Aufbringen der sterilen Lösung in jede der 24 Vertiefungen pro Platte vorbehandelt. Die Lösung wurde dann abgesaugt, und die Platten wurden unter UV- Licht in einem Laminar-Flow-Abzug trocknen gelassen. Das verwendete Wachstumsmedium war DME, supplementiert mit 20% FBS und 0,5% Hühnerembryonenextrakt (Gibco Laboratories). Die Kulturen wurden bei 37ºC in einer 5% CO&sub2;-Umgebung gehalten. Das Medium wurde täglich ausgewechselt, und die Zellen wurden zur Bildung von Myotubuli bei Erreichen der Konfluenz durch Zugabe von DME, enthaltend 2% Pferdeserum (Gibco Laboratories), induziert. Nach 48 Stunden wurden die Zellen für die Bindungsstudien verwendet. Die Messung der Cachectinbindung an die C2-Myotubuli wurde identisch dem für die 3T3-L1-Zellen beschriebenen Verfahren durchgeführt.
Weibliche NCS-Mäuse wurden aus dem Laboratory Animal Research Center der Rockefeller University bezogen. Die Mauserythrocyten (RBC) wurden durch Filtration von heparinisiertem Mausblut über eine Säule mit mikrokristalliner Cellulose, wie vorstehend beschrieben, erhalten. Die Milzlymphocyten wurden durch Ficoll®-Hypaque (Pharmacia Fine Chemicals)-Sedimentation erhalten. Die Messungen der Cachectinbindung an die Erythrocyten und Lymphocyten wurden unter Verwendung der gleichen Verfahren, die im Falle der 3T3-L1-Zellen angewendet wurden, durchgeführt. Jedoch wurde die Inkubation mit dem markierten Cachectin in 1,5- ml Eppendorf®-Röhrchen (Brinkmann Instruments, Inc., Westbury, New York) durchgeführt. 4·10&sup7; Maus-RBC und 1·10&sup7; Maus-Lymphocyten wurden in jedem Bindungstest verwendet. Es wurde durch dreimalige Zentrifugation bei 4ºC unter Verwendung einer Mikrofuge (Beckman Instruments, Inc., Fullerton, Kalifornien) gewaschen. Die Zellpellets wurden direkt ausgezählt.
Rohe Hepatocytenmembranen wurden durch Homogenisieren von 2 g Mausleber (Feuchtgewicht) in 10 ml 5 mM HEPES, pH 7,4, hergestellt. Das Homogenat wurde auf 50 ml mit dem gleichen Puffer verdünnt, und bei 200 g bei 4ºC 5 Minuten lang zentrifugiert. Der Überstand wurde in 2 ml-Aliquote aufgeteilt und bei 48000 g in einer 10-minütigen Zentrifugation pelletiert. Die so erhaltenen Pellets wurden jeweils in 0,5 ml DME, supplementiert mit 10% FBS, dem markiertes Cachectin (1 ng/ml) zugesetzt worden war, mit oder ohne unmarkiertem Cachectin (300 ng/ml) suspendiert. Die Bindung wurde 4 Stunden lang bei 4ºC eintreten gelassen. Die Membranen wurden dann 3 mal mit frischem Medium durch Zentrifugation bei 48000 g gewaschen. Die Pellets wurden auf Radioaktivität ausgemessen.
Test der Interleukin 1 (IL-1)-Aktivität. Diese wurden, wie vorstehend beschrieben, unter Verwendung von rekombinantem IL-1 als Standardpräparat, durchgeführt.

Proteinbestimmung

Abschätzungen der Proteinkonzentration wurden mittels eines im Handel erhältlichen Proteinreagenses auf Coomassie®-Basis (Bio-Rad Laboratories, Richmond, Kalifornien) durchgeführt.

ERGEBNISSE

Herstellung des Cachectins aus RAW 264.7-Zellen und Charakteristika der Rohlösung

Etwa 105 E Cachectinbioaktivität in 50 ml Medium konnte aus einem konfluenten Kolben, der 108 RAW 264.7-Zellen enthielt, erhalten werden. Die spezifische Aktivität des rohen Mediators wurde routinemäßig zu etwa 4·10&sup5; E/mg Protein beobachtet. Sehr wenig zusätzliches Cachectin konnte durch längere Inkubation der Zellen mit LPS oder durch erneute Stimulierung mit frischem, LPS-enthaltendem Medium, erhalten werden. Im Gegensatz dazu wurde ein Abfall der spezifischen Aktivität beobachtet, wenn solche Versuche unternommen wurden.
Kein Verlust der Bioaktivität wurde im Verlauf mehrerer Wochen nach der Lagerung des Rohpräparats bei einem neutralen pH-Wert bei -20ºC oder im Verlauf von fünf Tagen bei 4ºC beobachtet. Jedoch wurde festgestellt, daß die Bioaktivität bei saurem pH-Wert labil ist, wobei die Halbwertszeit 24 Stunden bei 4ºC bei pH 5,0 beträgt. Die Labilität bei niedrigem pH-Wert konnte durch Zugabe von 20% Glycerin vermindert werden. Aus diesem Grund wurde die isoelektrische Fokussierung eher in Glycerin als in Saccharose durchgeführt, und dieser Schritt wurde möglichst rasch durchgeführt.

Einengung und isoelektrische Fokussierung

Die Bioaktivität wurde ausschließlich mit dem Retentat in Zusammenhang gebracht, wenn die Druckdialyse unter den beschriebenen Bedingungen durchgeführt wurde. Die Isolierung nach einer 50-fachen Einengung betrug im allgemeinen > 90%, und war gelegentlich, wie in der nachstehenden Tabelle I angegeben, erhöht. Die Daten in Tabelle I stammen aus einer repräsentativen Isolierung. Tabelle 1 Stufe Volumen Gesamtaktivität Gesamtprotein Spezifische Aktivität fache Reinigung Ausbeute Nicht-eingeengtes Rohprodukt Eingeengtes Rohprodukt Isoelektrische Fokussierung Con A-Sepharose® Nicht-Denaturierend
Die isoelektrische Fokussierung des eingeengten Materials zeigte eine Bioaktivität mit einem isoelektrischen Punkt von 4,7 (Fig. 1). Die Ampholyte selbst stören den biologischen Test nicht. Die Gewinnung der Bioaktivität nach der isoelektrischen Fokussierung war variabel (10-60%) und hing in einem großen Ausmaß von der Gesamtmenge des der Säule zugesetzten Proteins ab. Der Verlust an Bioaktivität während der isoelektrischen Fokussierung schien das Ergebnis einer gleichzeitigen Ausfällung von Cachectin mit anderen Proteinen, die in dem Rohkonzentrat vorhanden waren, zu sein, da schlechte Ausbeuten im Zusammenhang mit Trennungen von großen Proteinmengen und der Bildung großer Mengen an Niederschlag standen. Spätere Versuche, in denen radioaktiv markiertes gereinigtes Cachectin der rohen Mediatorsubstanz als Tracer vor der isoelektrischen Fokussierung zugesetzt wurde, unterstützten diese Schlußfolgerung. Die Gewinnung wurde durch Zugabe einer kleinen Probe auf die Säule (50 mg Gesamtprotein oder weniger), die Verwendung eines Glyceringradienten und eine kurze Trennungszeit (24 Stunden oder weniger) mit sofortiger Neutralisation der Proben nach der Fraktionierung maximiert.

Con-A-Sepharose®-Chromatographie

Mehrere Proteinarten wurden affinitätschromatographisch auf Con A-Sepharose® mit einem kleinen oder keinem Verlust der Bioaktivität entfernt. Die Verwendung größerer Mengen an Con A-Sepharose® führte zu niedrigeren Ausbeuten an Cachectinaktivität, möglicherweise wegen der hydrophoben Wechselwirkung mit dem Harz, da die Aktivität durch Zugabe von 0,1 M α-Methylmannosid nicht freigesetzt werden konnte.

PAGE

Nach der PAGE unter nicht-denaturierenden Bedingungen fand sich die gesamte Bioaktivität an einer Stelle auf dem Gel im Zusammenhang mit einer einzelnen Proteinbande (Fig. 2, 3). Bei dieser Stufe konnten nur 10-20% der Bioaktivität aus dem geschnittenen Gel entweder durch Elektroelution oder durch Diffundierenlassen des Proteins in einen verdünnten Ammoniumbicarbonatpuffer gewonnen werden. Längere Diffusionszeiten, wiederholte Extraktion und die Verwendung größerer Volumina an Puffer zeigten nur eine geringe Auswirkung. Es wurde gefunden, daß die Isolierung durch das Aufbringen einer hochkonzentrierten Probe auf das Gel und durch die Verwendung eines gereinigten Acrylamidmonomeren bei der Herstellung des Gels maximiert werden konnte.

SDS-PAGE-Analyse des elektrophoretisch gereinigten Cachectins

Die offensichtliche Homogenität des isolierten Produkts wurde durch Elektrophorese in einem SDS-PAGE-System bestätigt. Das gereinigte Protein, das im Zusammenhang mit der Cachectinaktivität stand, wurde auf SDS-Gele auf gebracht und ergab eine Einzelbande mit einem Molekulargewicht von 17000 (Fig. 3). Wenn Mikrogrammengen an gereinigtem Cachectin elektrophoretisch in SDS-Gelen untersucht wurden, konnte die Bioaktivität aus nicht-fixierten Scheiben durch Elektroelution gewonnen werden. Die Aktivität fiel mit der Anwesenheit des Proteins mit einem Molekulargewicht von 17000 zusammen. Keine Bioaktivität wurde aus den anderen Gelregionen erhalten (Fig. 4).

Molekulargewicht des gereinigten Cachectins

Wenn Rohkonzentrate an Cachectin durch Sephadex® G-75-Gelfiltration analysiert wurden, zeigte das Bioaktivitätelutionsprofil ein Molekulargewicht von 170000 an. Eine Molekulargewichtsabschätzung von 17000 (Dextranskala) wurde jedoch erhalten, wenn die Rohkonzentrate durch Gelfiltration in Gegenwart von 6 M Harnstoff getrennt wurden, was die Bildung von nicht-kovalenten Multimeren oder Aggregaten mit anderen Proteinen nahelegt (Daten nicht gezeigt).
Wenn das gereinigte Cachectin auf SDS-Gelen analysiert wurde, zeigten sowohl reduzierte als auch nicht-reduzierte Proben ein offensichtliches Molekulargewicht von 17000. Die Gelfiltration von gereinigtem Cachectin auf Sephadex® G-75-Säulen ergab ein geschätztes Molekulargewicht von 35000, was das Vorhandensein von nicht-kovalenten Dimeren anzeigt (Daten nicht gezeigt).

Radioiodierung und Bindungsstudien

Das gereinigte Hormon wurde mit ¹²&sup5;I nach dem Iodogenverfahren radioaktiv markiert. Etwa 70% der Bioaktivität wurden gewonnen, wobei die anfängliche spezifische Aktivität etwa 1·10&sup6; cpm/ug Protein betrug. Das markierte Material wurde der SDS-PAGE unterworfen, und die Messung der in Scheiben geschnittenen Gele zeigte, daß der Hauptteil der Radioaktivität mit dem Protein mit einem Molekulargewicht von 17000 assoziiert war. Versuche, das Protein unter Verwendung von Chloramin T zu markieren, führten zu einem vollständigen Verlust der Bioaktivität.
Das gereinigte radioiodierte Hormon wurde rasch und spezifisch von den gezüchteten 3T3-L1-Adipocyten sowohl bei 37ºC als auch bei 0ºC gebunden (vergleiche Fig. 5A und 5B). Die Zugabe von 25000 E/ml nicht-markiertem Cachectin verhinderte die Bindung durch das markierte Protein zu allen Untersuchungszeitpunkten. Ein Gleichgewicht wurde innerhalb von 2-3 Stunden unter den beschriebenen Bedingungen erreicht. Eine zeitabhängige Abnahme der Menge des gebundenen Markers wurde bei 37ºC beobachtet, was möglicherweise eine Rezeptor-vermittelte Endocytose wiederspiegelt.
Die Bindungseigenschaften wurden mit einer Scatchard-Analyse untersucht (Fig. 6A). Die Daten legen das Vorhandensein von etwa 10&sup4; hochaffinen Stellen pro Zelle und eine Assoziationskonstante (Ka) von 3·10&sup9; nahe. Sowohl differenzierte 3T3-L1-Zellen als auch undifferenzierte "Präadipocyten" besaßen Rezeptoren mit ähnlicher Affinität und Dichte. Die Muskelzellinie C2 besaß auch einen spezifischen Cachectinrezeptor. Wieder wurden etwa 10&sup4; hochaffine Stellen pro Zelle und ein Ka-Wert von 3·10&sup9; beobachtet (Fig. 6B). Lebermembranpräparate der Maus zeigten auch eine spezifische Cachectinbindung. Andererseits fehlten den Erythrocyten und Lymphocyten nachweisbare Mengen an Cachectinrezeptor (< 200 Kopien pro Zelle).

Test auf die IL-1-Aktivität

Hinsichtlich der ähnlichen Größe, des Ursprungsgewebes und der Endotoxininduzierbarkeit schien es möglich, daß das isolierte Protein mit IL-1 identisch war. Die große Menge an Cachectin, die von RAW 264.7-Zellen produziert wurde, legt nahe, daß dies nicht der Fall war, insbesondere da gefunden wurde, daß die Zellen sehr wenig IL-1 produzierten, wie durch die Aktivität des Leukocyten-aktivierenden Faktors (LAF) unter den Bedingungen, die zur Stimulierung von Cachectin verwendet wurden, gemessen wurde. Gereinigten Cachectinpräparaten fehlte die LAF-Aktivität, wenn sie über einen weiten Konzentrationsbereich bis zu 1 nM unter Bedingungen, bei denen rekombinantes IL-1 bei 10&supmin;¹¹ M nachgewiesen werden konnte, getestet wurden. Ferner konkurrierten mikromolare Konzentrationen von hochgereinigtem rekombinantem IL-1 nicht mit dem radioiodierten Cachectin bezüglich der Rezeptorbindung. Es scheint daher, daß sich Cachectin von IL-1 unterscheidet.

DISKUSSION

In dem vorstehenden Versuch wurde das gereinigte Protein aus dem Makrophagenmediator isoliert, und es wurde gefunden, daß es ein monomeres Molekulargewicht von 17000 auf SDS-Gelen und einen isoelektrischen Punkt von 4,7 besitzt.
Unter nicht-denaturierenden Bedingungen liegt das gereinigte Protein offensichtlich als ein Dimeres vor.
1 E Bioaktivität entspricht etwa 2·10&supmin;¹&sup5; mol an isoliertem Monomeren. So ist in einer 2 pM-Lösung des Modulatormaterials Cachectin leicht mittels des beschriebenen biologischen Tests nachweisbar. Diese Abschätzung der spezifischen Aktivität muß als minimal gelten, da eine unbekannte Menge des Proteins während der Reinigung biologisch inaktiviert hätte werden können.
Die Isolierung von Cachectin wurde durch die Verwendung der Mausmakrophagenzellinie RAW 264.7 erleichtert, die die Produktion des Proteins für die Analyse und Reinigung in großem Umfang erlaubte. Zusätzlich zum Vorhandensein als eine homogene Population konnten die Zellen in einem serumfreien Medium während der Endotoxinstimulierung gehalten werden. Die RAW 264.7-Zellinie wurde durch Transformation von peritonealen Mauszellen durch das Abelson-Leukämievirus erzeugt. Die Zellen ähneln morphologisch und funktionell Makrophagen. Sie besitzen Rezeptoren für das Komplement und die Fc-Fragmente von IgG und können Neutralrot, opsonisierte RBC und Latexkügelchen phagocytosieren. Eine ausgeprägte Ähnlichkeit zwischen der Cachectinaktivität, die von RAW 264.7-Zellen produziert wurde, und die von Thioglycollat-stimulierten peritonealen Makrophagen stimuliert wurde, wurde zuvor nachgewiesen.
Die SDS-PAGE-Analyse des von LPS-stimulierten und nichtstimulierten RAW 264.7-Zellen abgeleiteten Kulturmediums zeigte, daß Cachectin eines der hauptsächlichen Endotoxininduzierbaren sekretorischen Proteine ist. Es macht 1 bis 5% der gesamten Proteine, die von stimulierten RAW 264.7- Zellen sezerniert werden, aus und ist als eine deutliche Bande mit einem Molekulargewicht von 17000 auf SDS-Gelen deutlich sichtbar. Einem Medium aus nicht-stimulierten Zellen fehlt die Cachectinbioaktivität und die Bande mit einem Molekulargewicht von 17000 vollständig. Basierend auf Abschätzungen der spezifischen Aktivität des gereinigten Cachectins würde scheinen, daß das Protein mit einem Molekulargewicht von 17000 den Hauptteil an Bioaktivität, wenn nicht die gesamte Bioaktivität, die in dem konditionierten Zellmedium vorhanden ist, ausmacht. Während die mögliche Verwandtschaft des Modulatormaterials mit anderen Monokinen (z. B. Interferonen, Glucocorticoid-antagonisierendem Faktor und anderen Bioaktivitäten, die von den Makrophagen produziert werden) noch nicht vollständig bewertet wurde, geht aus den vorstehend dargelegten Daten zur Bioaktivität klar hervor, daß das Modulatormaterial Cachectin sich von IL-1 unterscheidet, trotz ähnlicher Molekulargewichte und isoelektrischer Punkte.
Unter Verwendung von markiertem Cachectin wurde das Vorhandensein von spezifischen Cachectinrezeptoren auf differenzierten 3T3-L1-Zellen und Präadipocyten, C2-Muskelzellen und Leberzellmembranen der Maus nachgewiesen. Andererseits wurden Rezeptoren nicht auf Mauserythrocyten oder - lymphocyten nachgewiesen. Die Rezeptordichte auf 3T3-L1- Zellen und auf C2-Zellen betrug etwa 10&sup4; pro Zelle. Der Ka-Wert, der Grad der Rezeptorbesetzung, kann als Funktion der Cachectinkonzentration bestimmt werden. Scheinbar reicht die Besetzung von nur 5% der auf einer 3T3-L1-Zelle vorhandenen Rezeptoren (erzielt bei einer Konzentration von 2·10&supmin;¹¹ M) aus, um eine 70-80%ige Unterdrückung von LPL hervorzurufen. Dieser Typ von Verwandtschaft wurde bei vielen anderen Hormon-Rezeptor-Bindungssystemen festgestellt.
Obwohl der Makrophage keine charakteristische endokrine Zelle ist, kann er das Monokin Cachectin produzieren, das als ein Hormon im klassischen Sinne beschrieben werden kann, da es von einer spezifischen Zellgruppe produziert wird und über einen hochaffinen Rezeptor das Verhalten anderer Zelltypen beeinflußt. Als solches bietet es ein Beispiel für die endokrinen Fähigkeiten der reticuloendothelialen Zellen. Angesichts der Tatsache, daß Muskel-, Leber- und Fettgewebe Cachectinrezeptoren besitzen, wird ein weiter Bereich biologischer Antworten vermutet.
Die vorstehenden Ergebnisse legen auch nahe, daß Cachectin dazu dienen kann, die Energiereserven von einem Säugetier, das mit einer akuten Infektion konfrontiert ist, zu mobilisieren, um den erhöhten metabolischen Bedarf zu decken. Bei chronischem Hervorrufen, wie bei parasitären Infektionen, kann Cachectin zu dem Protein- und Lipidkatabolismus beitragen, der schließlich den Wirt in einen Zustand der Kachexie bringt.
Weitere Untersuchungen, die nach den vorstehenden Experimenten durchgeführt wurden, hatten das Ziel, die spezifische Struktur des Modulatormaterials Cachectin zu identifizieren. Diese Untersuchungen wurden auch von Beutler et al. berichtet und sind in dem nachstehenden Beispiel 2 dargelegt.

BEISPIEL 2

Bei ursprünglicher Reinigung aus RAW 264.7 (Mausmakrophagenzellen) wurde gezeigt, daß Cachectin einen pI-Wert von 4,7, eine Größe der Untereinheit von 17 kd besaß und nicht-kovalente Multimere bildete. Ein Cachectinrezeptor wurde auf nicht-tumorigenen gezüchteten Zellen und auf normalen Lebermembranen der Maus identifiziert.
In dem vorliegenden Beispiel erhellten Untersuchungen, bei denen eine neue Reinigungstechnik mit hoher Ausbeute verwendet wurde, weitere Einzelheiten der Struktur des Mauscachectins. Es wurde beobachtet, daß ein hoher Homologiegrad zwischen der N-terminalen Sequenz des Mauscachectins und der N-terminalen Sequenz, die jüngst für den Tumornecrosefaktor (TNF) bestimmt wurde, und die in Pennica, D., et al., NATURE, 312 : 724-729 (1984) und Shirai, T., et al., NATURE, 313 : 803-806 (1985) beschrieben ist, vorliegt. Gereinigtes Cachectin besitzt auch eine starke TNF-Aktivität in vitro.
Die Verfahren und die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind nachstehend dargelegt.

MATERIALIEN UND METHODEN

Die Cachectinbioaktivität (LPL-Unterdrückung) wurde unter Verwendung von 3T3-L1-Zellen, wie vorstehend beschrieben, getestet. Die TNF-Aktivität wurde unter Verwendung des Standardcytotoxizitätstests mit Actinomycin D-behandelten L-929-Zellen gemessen.
Ein 50-faches Konzentrat von rohem Cachectin, abgeleitet aus Lipopolysaccharid-stimulierten RAW 264.7-Zellen wurde unter Verwendung einer PM-10-Membran in einer gerührten Zelle (Amicon Corp.; Danvers, Massachusetts), wie vorstehend in dem vorstehenden Beispiel 1 beschrieben, hergestellt. Vor der Entfernung der Probe aus der Ultrafiltrationszelle, wurde Octylglucosid (Sigma; St. Louis, Missouri) bis zu einer Konzentration von 1% (Gew./Vol.) zugesetzt. Die Zugabe eines nicht-ionischen Detergenses war wesentlich, um eine hohe Ausbeute in den anschließenden Stufen zu erzielen.
Die Probe wurde durch ein 0,22 u-Filter geleitet und auf eine Mono-Q-Säule (Hochleistungsanionenaustausch) (FPLC; Pharmacia; Uppsala, Schweden) aufgebracht. Etwa 60% des gesamten Proteins liefen direkt durch die Säule. Cachectin eluierte als ein scharfer Peak bei einer Konzentration von 0,38 M Tris-Cl, pH 7,8 (Fig. 7). Etwa 80% des Hormons wurden in 3 Fraktionen gewonnen.

Mono-Q-(FPLC-Anionenaustausch)Chromatographie

Roh-konzentriertes RAW 264.7-Medium, welches Octylglucosid als Dispersionsmittel enthielt, wurde auf die Säule aufgebracht. Cachectin wurde unter Verwendung eines 0,3 M bis 0,5 M Tris-Cl-Gradienten (Sigma Chemical Co.; St. Louis, Missouri), welcher bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,33 ml/min über 34 Minuten lief, eluiert. Die optische Dichte (280 nm) ist als ausgefüllter Punkt angegeben. Die gestrichelte Linie zeigt die Molarität des bei der Elution verwendeten Tris-Cl-Puffers an. Die quergestreifte Fläche zeigt die Verteilung der Cachectinbioaktivität, ausgedrückt in linearen Einheiten, an (jeder Punkt entspricht dem Ergebnis eines einzelnen biologischen Tests). Eingesetzte Photographie: ein mit Silber angefärbtes SDS-Polyacrylamid-Gradientgel (10% bis 15% Acrylamid), welches die Trennung des Rohmaterials und die anschließenden Säulenfraktionen (1 ul pro Bahn) zeigt. Die Molekulargewichtsmarker sind in den ganz linken Bahnen angegeben. Der Pfeil zeigt die Bande, die dem Cachectin entspricht, an (MG = 17 kd).
Etwa 60% des Gesamtproteins eluieren in der nicht-zurückgehaltenen Fraktion (nicht gezeigt). Der Spitzenwert der Cachectinbioaktivität eluiert bei einer Konzentration von 0,38 M Tris-Cl. Die drei Fraktionen mit der höchsten Aktivität wurden zur weiteren Reinigung vereinigt.

Superose® 12 FPLC-Gelfiltration-Chromatograhie

Die vereinigten Fraktionen aus der Mono-Q-Fraktionierung wurden gefriergetrocknet, in destilliertem Wasser erneut aufgelöst und auf die Säule aufgebracht. Die Chromatographie wurde in 0,1 M Ammoniumacetat bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,3 ml/min durchgeführt. Ein Probenvolumen von 0,2 ml wurde bei jeder Trennung verwendet.
Die ausgefüllten Punkte geben die OD bei 280 nm an. Der quergestreifte Balken zeigt das Vorhandensein von Cachectin an, bewertet durch die Messung der Bioaktivität. Die Pfeile zeigen die Elutionsposition der Molekulargewichtsmarker an, die auf die Superosesäule aufgebracht wurden. Eingesetzte Photographie: SDS-Polyacrylamidgradientgel (10% bis 15% Acrylamid), welches das elektrophoretische Muster aufeinanderfolgender Fraktionen (1 ul Aliquot pro Bahn) aus der Superose® 12-Gelfiltration zeigt. L und P, Molekulargewichtsstandards; Q vereinigte Mono-Q-Fraktionen (Ausgangsmaterial für die Superose®-12-Trennung).
Diese Fraktionen wurden vereinigt, gefriergetrocknet und in 0,4 ml destilliertem Wasser erneut aufgelöst. Die Probe wurde dann einer Hochleistungsgelfiltrationschromatographie (Superose® 12; Pharmacia) (Fig. 8) unterworfen.
Cachectin eluierte beständig bei einer Position entsprechend einem Molekulargewicht von 87 kd, was einer pentameren Struktur entspricht. Das Molekül dissoziert leicht in Gegenwart nicht-ionischer Detergentien. Es ist unklar, ob eine pentamere Konformation für die Bioaktivität wesentlich ist.
Die abfallende Kante des Cachectinpeaks wurde auf mehr als 95% rein geschätzt, und enthielt etwa 10&sup7; E Cachectinbioaktivität/mg Protein, genau wie die homogenen Lösungen, die mittels des älteren Reinigungsverfahrens erzeugt wurden, das verwendet wurde, um die anfängliche Mediatorsubstanz herzustellen. Die TNF-Aktivität wurde in diesem Präparat getestet. Etwa 1,2·10&sup7; E/mg Protein wurden in gereinigten Proben gemessen, verglichen mit 3,7·10&sup4; E/mg Protein in einer Probe des Rohmaterials. Es wurde berichtet, daß die spezifische Aktivität von gereinigtem menschlichem TNF 2,9·10&sup7; E/mg Protein beträgt.
Die verbleibenden Cachectin-reichen Superose® 12-Fraktionen, die für die Bestimmungen der Aminosäurezusammensetzung und der Sequenz verwendet werden sollen, wurden weiter durch Umkehrphasenchromatographie unter Verwendung einer C8-Säule (Supelco; Bellafonte, Pennsylvania), wie früher von Pan, Y-C.E., et al., J. CHROMATOG. 297 : 13-19 (1984) beschrieben, gereinigt. Cachectin eluierte bei einer Konzentration von 30-40% Acetonitril. 40 pmol des hochgereinigten Proteins wurden mit 6N HCl hydrolysiert und zur Analyse der Bestandteile verwendet. 200 pmol wurden zur Sequenzierung verwendet. Ein Waters (Milford, Massachusetts)-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HP- LC)-System und ein Applied Biosystems (Foster City, Kalifornien)-Mikrosequenator, Modell 470 A, wurden bei diesen Verfahren verwendet.
Die Aminosäurezusammensetzung des Mauscachectins wird in der nachstehenden Tabelle II mit der Zusammensetzung des menschlichen TNFs (bestimmt durch Sequenzierung der DNA) verglichen, wobei die letztere der von Pennica, et al., a.a.O., berichteten entspricht. Starke Ähnlichkeiten sind sofort offensichtlich. Beide Proteine sind insgesamt sauer und hydrophob. Identische Anzahl an Threonin-, Valin-, Alanin-, Histidin-, Arginin- und Cysteinresten sind jeweils vorhanden. Tabelle II
* Die Ziffern in Klammern beziehen sich auf die von Pennica et al., a.o., für den menschlichen TNF ermittelte Zusammensetzung.
ND: nicht bestimmt
Auf ähnliche Weise ist die Anordnung der N-terminalen Aminosäuresequenz des Mauscachectins (obere Linie) in vergleichender Ausrichtung mit der entsprechenden Sequenz des menschlichen TNFs (untere Linie) kennzeichnend. Zweideutige Reste sind mit einem "?" angegeben. Einander entsprechende Reste sind unterstrichen.

Mauscachectin

H&sub2;N-Leu-Arg-Ser-Ser-Ser-Glu-Asn-Ser-Ser-Asp-Pro-Pro-Val- Ala-?-

Menschlicher TNF

H&sub2;N-Val-Arg-Ser-Ser-Ser-Arg-Thr-Pro-Ser-Asp-Lys-Pro-Val-Ala-HisMauscachectin Val-Val-Ala-Asn . . .

Menschlicher TNF

Val-Val-Ala-Asn . . .
Eine Durchsicht der vorstehenden Sequenzanalyse zeigte eine auffallende Homologie zwischen den N-terminalen Sequenzen des Mauscachectins und des menschlichen TNFs. Alle außer fünf der ersten neunzehn Reste entsprechen einander. Diese Daten legten zusammen mit dem cytolytischen Effekt von gereinigtem Cachectin auf L-929 Zellen nahe, daß eine einzige Proteinart für die Cachectin- und die TNF-Aktivität von konditioniertem Maus-Makrophagen-Medium verantwortlich sein könnte. Ferner erscheint dieses Protein hoch konserviert zu sein.
Auf der Basis der Leistungsfähigkeit der vorstehenden Untersuchungen und wie vor stehend diskutiert wurde die volle Identität der Modulators bestimmt, und ein Vergleich zwischen den vorstehend dargelegten Fragmentsequenzen und der in Fig. 23 gezeigten vollen Sequenz zeigt sowohl Ähnlichkeiten als auch Unterschiede. Eine weitere Analyse dieser jüngsten Information ist folglich gegenwärtig im Gange.
Es wurde früher gezeigt, daß Cachectin von einem spezifischen Rezeptor gebunden wird, der in etwa 10.000 Kopien pro Zelle auf gezüchteten 3T3-L1-Adipocyten und C2-Myotubuli vorhanden ist. Der Ka-Wert der Hormon-Rezeptor-Wechselwirkung wurde zu 3·10&sup9; M&supmin;¹ mit einer Scatchard-Analyse bestimmt. Normale Lebermembranen der Maus binden ebenfalls Cachectin auf konkurrierende Weise. Eine Abnahme der enzymatischen Aktivität wird unmittelbar nach Zugabe des Hormons beobachtet und stammt offensichtlich aus der spezifischen Hemmung der LPL-Biosynthese. Die Proteinnettosynthese und die Lebensfähigkeit der Zelle bleiben unbeeinflußt.
Wie früher diskutiert, besitzt das erfindungsgemäße Modulatormaterial auch eine Anzahl von Aktivitäten, die in Kombination ein deutliches Mosaik von Eigenschaften bilden, die das Modulatormaterial definieren. Bestimmte Aktivitäten des Modulatormaterials unterscheiden es von den bekannten Materialien.
Insbesondere unterdrückt das Modulatormaterial im wesentlichen vollständig das anabole Enzym Lipoprotein-Lipase und diese Unterdrückung variiert - wie vor stehend und nachstehend gezeigt - mit der Konzentration. Der Modulator verhindert auch die Differenzierung der Fettzellen und erhöht die Glucoseaufnahme und den Glucosetransport in Muskelzellen. Diese zuletzt genannten Aktivitäten finden sich auch bei der Vorläufer-Mediatorsubstanz, fehlen aber Interleukin-1.
Im Gegensatz dazu unterscheidet das Modulatormaterial sich von seinem Mediatorvorläufer durch seine fehlende Fähigkeit, entweder die Fettsäure-Synthetase oder die Acetyl- Coenzym-A-Carboxylase zu hemmen oder die Aktivität der hormonempfindlichen Lipase zu erhöhen. Sowohl das Modulatormaterial als auch sein Vorläufer unterscheiden sich von Interleukin 1 durch das Fehlen einer Leukocyten-Aktivator- Aktivität und das Fehlen der Fähigkeit, Fieber bei Mäusen zu induzieren oder einen Proteinabbau zu verursachen.
Abgesehen von den vorstehenden Eigenschaften besitzt das Modulatormaterial auch die Fähigkeit, bei Mäusen einen Gewichtsverlust zu verursachen und zeigt die Fähigkeit, Antikörper gegen sich selbst zu erzeugen, um einen Wirt gegen einen Endotoxin-induzierten Schock zu schützen. Alle diese Aktivitäten sind in den nachstehenden Beispielen erläutert.

Beispiel 3

Wie vorstehend und oben gezeigt, unterdrücken die früher entdeckte Mediatorsubstanz und das erfindungsgemäße Modulatormaterial Cachectin beide die Aktivität des Enzyms Lipoprotein-Lipase (LPL). Diese Fähigkeit wurde in Versuchen gefunden, die mit speziellen gezüchteten Adipocyten (3T3- L1-Zellen) durchgeführt wurden, bei denen eine solche Hemmung als im wesentlichen vollständig bestimmt wurde. Insbesondere wurde eine Hemmung von größer als 95% berichtet.
Im Gegensatz dazu wurde festgestellt, daß das als Interleukin 1 identifizierte Material eine gewisse Hemmung auf die Aktivität der Lipoprotein-Lipase ausübt; jedoch wurde beobachtet, daß diese Aktivität begrenzt ist und von der Konzentration des verabreichten Interleukin 1 unabhängig ist. Umgekehrt und wie in Beutler et al., a.a.O., festgestellt, wurde sowohl von Cachectin als auch der Mediatorsubstanz bestimmt, daß sie die Fähigkeit besitzen, im wesentlichen vollständig die LPL-Aktivität zu hemmen. Um diese Beobachtungen zu substantiieren, wurden bestimmte Versuche mit einer Menge an rekombinantem Interleukin 1 (rIL-1) und mit gereinigtem Cachectin (Beutler et al., a.a.O.) durchgeführt, um diese Hypothese zu bestätigen. Das durchgeführte experimentelle Verfahren ist nachstehend angegeben.

Materialien und Methoden

Zellkultur

3T3-L1-Zellen wurden bis zur Konfluenz auf Linbro-Platten mit 24 Vertiefungen gezüchtet und unter Bildung von Adipocyten, wie früher von Mahoney J.R., Jr., et al., J. IMMUNOL. 134 : 1673 (1985) beschrieben, differenziert. In Kürze, die Zellen wurden in einer Dichte von 10&sup5;/ml in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DME), enthaltend 10% Kälberserum, plattiert. Dieses Medium wurde jeden zweiten Tag ausgewechselt. Eine Woche nachdem die Kulturen die Konfluenz erreicht hatten, wurden sie gegenüber DME, enthaltend 10% fötales Rinderserum (FBS), 10 ug/ml Rinderinsulin, 0,05 M Methylisobutylxanthin und 1,0 uM Dexamethason für eine Zeitspanne von 48 Stunden exponiert. Danach wurden sie in DME, enthaltend 10% FBS und 50 ng/ml Rinderinsulin, gehalten, welches jeden zweiten Tag ausgewechselt wurde. DME wurde von Gibco (Grand Island, New York) bezogen, und das definierte Kälberserum und das charakterisierte fötale Rinderserum wurden von Hyclone Laboratories (Logan, Utah) bezogen. Die Zellen wurden vier Tage nach der Differenzierung für den Rezeptortest oder für den biologischen Test zur LPL- Suppression eine Woche nach der Differenzierung verwendet.

Rezeptortest

Kompetitive Rezeptorstudien wurden unter Verwendung des gleichen radioaktiv markierten Materials, das zuvor zur Charakterisierung des Cachectin-Rezeptors in Beutler et al., a.a.O., verwendet wurde, durchgeführt. Der Cachectin-Rezeptortest wurde ausführlich in Beutler et al. J. EXP. MED., 161 : 984-995 (1985) beschrieben und wurde hier verwendet, um die Fähigkeit von IL-1, das radioaktiv markierte Cachectin von seinem spezifischen Rezeptor zu verdrängen, zu testen. In Kürze, einschichtige 3T3-L1-Zellen, hergestellt wie vorstehend beschrieben, wurden mit DME, enthaltend 10% FBS und 50 mM HEPES, pH 7,4, und etwa 10-11 uM radioaktiv markiertem Cachectin-Tracer überschichtet. Die nichtmarkierten Lösungen von IL-1 oder Cachectin (positive Kontrolle) wurden zugesetzt, um eine Reaktion ohne Konkurrenz ablaufen zu lassen. Das Endvolumen in jedem System betrug 0,2 ml. Die Reaktion wurde bei 0ºC für eine Zeitspanne von vier Stunden auf einem Rundschüttler durchgeführt. Am Ende dieser Inkubation wurden die einzelligen Schichten dreimal mit dem gleichen HEPES- gepufferten Medium gewaschen, mit 1,0 ml 1 M NaOH solubilisiert und in einem Packard-Gamma-Counter eine ausreichend lange Zeitspanne, um einen Standardfehler < 5% zu erzielen, ausgezählt.

Biologischer Test der LPL-Suppression durch Cachectin und IL-1

3T3-L1-Zellen, hergestellt auf Linbro-Platten mit 24 Vertiefungen, wie vorstehend beschrieben, wurden mit genau 1,0 ml DME, supplementiert mit 10% FBS und 50 ng/ml Insulin, überschichtet. Gereinigte Präparate von Cachectin oder rekombinantem IL-1 wurden jeder Vertiefung zugesetzt und gründlich vermischt. Die Zellen wurden für eine Zeitspanne von 16 Stunden vor dem Test auf die heparinfreisetzbare LPL-Aktivität inkubiert. Die einzelligen Zellschichten zur Kontrolle, die keinem der beiden Mediatoren exponiert wurden, wurden in alle Tests aufgenommen.

LPL-Test

Das Medium wurde aus den einzelligen Zellschichten, die wie vorstehend beschrieben behandelt worden waren, abgesaugt. 0,5 ml DME, enthaltend 10% FBS, 50 ng/ml Insulin und 10 E/ml Heparin, wurden dann jeder einzelligen Schicht zugesetzt. Nach einer Stunde wurden 75 ul des Mediums auf die LPL-Aktivität gemäß dem Verfahren von Nilsson-Ehle und Schotz untersucht. Die prozentuale LPL-Suppression (bezüglich der zur Kontrolle verwendeten einzelligen Schichten, die keinem der beiden Mediatoren exponiert worden waren) wurde wie vorstehend in Beutler et al., a.a.O., beschrieben, berechnet.

Rekombinantes IL-1

Dies war eine freundliche Gabe von Dr. Peter Lomedico (Dept. of Molecular Genetics, Hoffmann-La Roche, Inc.). Das Monokin (Konzentration etwa 100 uM) wurde als eine Lösung in 5 M Guanidin-HCl bereitgestellt. Guanidin-HCl hatte bei Verdünnung auf submillimolare Konzentrationen keinen Einfluß auf die LPL-Expression in dem beschriebenen System.

Antiserum gegen IL-1

Dieses Antiserum, das in Ziegen gegen-Maus IL-1 erzeugt worden war, wurde freundlicherweise von Dr. Steven Mizel zur Verfügung gestellt.

Neutralisation von IL-1

Aufeinanderfolgende zweifache Verdünnungen von Antiserum in DME, enthaltend 50 mM HEPES, pH 7,4, und 10% FBS, wurden über den angegebenen Bereich durchgeführt. Gereinigtes rekombinantes IL-1 wurde bis zu einer Endkonzentration von 50 pM zugesetzt. Nach einer Stunde auf Eis wurden 15 ul Aliquote der Lösung den einzelligen Zellschichten zugesetzt, wodurch eine Endkonzentration an IL-1 von 0,75 pM erhalten wurde. Die Tests auf die LPL-Suppression wurden wie üblich nach einer 16stündigen Inkubation durchgeführt.

Gereinigtes Cachectin

Präparate des gereinigten Hormons wurden wie vorstehend in Beutler et al., a.a.O., beschrieben, hergestellt. Die Radioiodierung wurde nach dem Iodogen-Verfahren durchgeführt; eine anfängliche spezifische Aktivität von 1 uCi/ug wurde erzielt, und 70% der anfänglichen Bioaktivität wurden gewonnen.

ERGEBNISSE

Unterdrückung der LPL-Aktivität durch gereinigtes rekombinantes IL-1

Die Zugabe von rIL-1 zu 3T3-L1-Zellen unterdrückte teilweise die LPL-Aktivität. Wie in Fig. 9 gezeigt, konnte IL-1 die LPL-Aktivität in Konzentrationen im Femtomol-Bereich unterdrücken. Daher konnten in dem beschriebenen System etwa 10&supmin;¹&sup8; mol des Hormons nachgewiesen werden. Jedoch konnten selbst uM-Konzentrationen des Hormons LPL um nicht mehr als 50% unter den beschriebenen Bedingungen unterdrücken, wohingegen eine Gesamtunterdrückung von 90 bis 95% durch nM-Konzentrationen von Cachectin erzielt werden konnte. Gelegentliche Chargen von 3T3-L1-Zellen zeigten eine größere Empfindlichkeit gegenüber rIL-1; typischerweise war maximal eine Unterdrückung von 50% erreichbar, und in keinem Falle überschritt die Unterdrückung jemals 85%.
Wenn Cachectin und IL-1 beide den gezüchteten 3T3-L1-Zellen zugesetzt wurden, erschienen ihre Wirkungen additiv und unabhängig. Wenn beispielsweise eine ausreichende Menge an IL-1 zur Erzielung einer 50%igen Unterdrückung (die maximale Antwort) zusammen mit einer ausreichenden Menge an Cachectin für eine 50%ige Unterdrückung zugesetzt wurde, wurde eine Unterdrückung von etwa 75% beobachtet (Daten nicht gezeigt). Der synergistische Effekt wurde nie beobachtet.

Hemmung der LPL-Unterdrückung durch rekombinantes IL-1 unter Verwendung eines spezifischen Ziege-αIL-1-Serums

Wenn 0,75 pM IL-1 den gezüchteten 3T3-L1-Zellen zugesetzt wurden, wurde eine 80%ige LPL-Unterdrückung erzielt (die maximale Antwort in diesem Versuch). Die Vorinkubation von rIL-1 mit einem spezifischen neutralisierenden Antiserum beseitigte diese Antwort vollständig. Die Zugabe von abnehmenden Mengen des Serums führte zu mittleren Werten der Unterdrückung (Fig. 10). Keine direkte Wirkung des Serums auf die LPL-Expression konnte über den Bereich an Konzentrationen, der zur Neutralisation verwendet wurde, nachgewiesen werden (Daten nicht gezeigt). Es scheint daher, daß die LPL-Unterdrückung durch das verwendete rIL-1-Präparat in der Tat dem Vorhandenseins des Monokins zuzuschreiben ist und nicht auf verunreinigende bakterielle Proteine oder Reagentien, die zur Isolierung von IL-1 verwendet wurden, zurückzuführen ist.

Mangelnde Fähigkeit von IL-1 mit radioaktiv markiertem Cachectin um die 3T3-L1-Rezeptorstellen zu konkurrieren

Wie vorstehend beschrieben kann radioaktiv markiertes Cachectin an einen hochaffinen Rezeptor, der auf den 3T3- L1-Zellen sowie auf anderen Geweben (Beutler et al., a.a.O.) vorhanden ist, binden und wird leicht durch nM- Konzentrationen des nichtmarkierten Hormons verdrängt. Die Zugabe von 0,1 uM und 1,0 uM Konzentrationen von gereinigtem rekombinantem IL-1 verursachten keine signifikante Verdrängung des Tracer-Cachectin in diesem Radiorezeptortest (Fig. 11). So scheint, daß, während IL-1 eine Unterdrückung von LPL in 3T3-L1-Zellen hervorruft, es diese ohne Bindung an den Cachectin-Rezeptor ausübt.
Es ist jedoch offensichtlich, daß das Muster der LPL-Unterdrückung durch Interleukin-1 sich entweder von dem erfindungsgemäßen Mediator oder von Cachectin unterscheidet, von denen beide eine > 95%ige Unterdrückung von LPL in Adipocyten erzielen können. Die Unterdrückung von LPL durch Cachectin und durch IL-1 ist additiv und unabhängig. In Gegenwart einer maximal unterdrückenden Konzentration von IL-1 kann eine weitere Unterdrückung durch Zugabe von Cachectin erzielt werden. Zusätzlich scheint, wie vorstehend erwähnt, IL-1 den Cachectin-Rezeptor nicht zu teilen.

Vergleich mit IL-2

Wie in Dinarello, a.a.O., diskutiert, unterscheidet sich der von dem Autor als Interleukin 1 identifizierte Faktor von anderen Faktoren, von denen ebenfalls bekannt ist, daß sie eine gewisse immunregulatorische Aktivität ausüben, und von denen einige als Interleukin 2 identifiziert wurden. Interleukin 2, früher als T-Zellwachstumsfaktor bekannt, wird von T-Zellen produziert und besitzt die Aktivität, ein direktes Wachstumssignal an die Lymphocyten zu senden. Die Produktion von IL-2 wird auch in einigen Fällen in vivo von IL-1 kontrolliert. Es ist daher von Interesse, zu bestimmen, ob IL-2 die gleiche Aktivität wie IL-1 bezüglich der Unterdrückung der LPL ausübt.
Folglich haben in Beutler et al, J. EXP. MED., 161 : 984- 995, die Autoren festgestellt, daß sie die LPL unterdrückende Aktivität von IL-2 untersucht hatten, und sie hatten gefunden, daß diese nichtexistent war. Offensichtlich teilt IL-2 diese Eigenschaft nicht mit IL-1 und ist folglich auf ähnliche Weise sowohl von der rohen Mediatorsubstanz als auch ihrem Isolat, dem erfindungsgemäßen Modulatormaterial Cachectin, unterscheidbar.
Zusammenfassend, während die Mediatorsubstanz, ihr Isolat Cachectin und IL-1 alle eine unterdrückende Wirkung auf die LPL ausüben, ist die Wirkung, die von der Mediatorsubstanz und von Cachectin ausgeübt wird, sowohl strukturell als auch funktionell unterschiedlich, was nahelegt, daß die Materialien selbst in ähnlicher Weise unterschiedlich sind. Ferner unterscheiden sich alle drei Materialien von IL-2, so daß getrennte Identitäten für jedes der getesteten Materialien angenommen werden müssen.

BEISPIEL 4

In der Stammanmeldung, Publikationsnr. US-A-4603106, wurden die Wirkungen der zuvor offenbarten Mediatorsubstanz auf die Enzyme CoA-Carboxylase und Fettsäure-Synthetase untersucht, und es wurde bestimmt, daß die Mediatorsubstanz beide Enzyme hemmte, indem sie ihre Synthese störte. In dem vorliegenden Versuch wurde das Testsystem von Beispiel II der vorstehenden Anmeldung eingerichtet und für jeweils Interleukin 1 und Cachectin wiederholt. Gereinigtes Interleukin 1 und Cachectin wurden wie in Beutler und Cerami, a.a.O., offenbart, hergestellt und wurden anstelle des konditionierten Mediums aus präparierten peritonealen Exudatzellen der Maus, das in Gegenwart von Endotoxin gezüchtet worden war, verwendet.
Folglich wurden die 3T3-L1-Zellen jeweils gegenüber Interleukin 1 und Cachectin exponiert und für insgesamt zwanzig Stunden inkubiert, wobei Bestimmungen der Acetyl-CoA-Carboxylase und der Fettsäure-Synthetase-Aktivitäten nach drei, sechs bzw. zwanzig Stunden vorgenommen wurden. In jedem Falle zeigten die Digitonin-freigesetzten Cytosolfraktionen der mit den jeweiligen Faktoren inkubierten Zellen keine Abnahme in der Aktivität des jeweiligen Enzyms, und es wurde daher ermittelt, daß weder Interleukin 1 noch das erfindungsgemäße Modulatormaterial Cachectin irgendeine unterdrückende Wirkung auf die anabolen Enzyme Acetyl-CoA-Carboxylase und/oder Fettsäure-Synthetase besaßen. So unterscheidet sich daher das erfindungsgemäße Modulatormaterial offensichtlich von dem rohen Mediator, ist aber ähnlich dem Interleukin 1.

BEISPIEL 5

Dieses Beispiel ist Untersuchungen entnommen, die von einem der genannten Anmelder und Mitarbeitern durchgeführt wurden, die in unveröffentlichten Entdeckungen in einem Artikel mit dem Titel "A Murine Model for Cachexia in Chronic Disease: Endotoxin Induced Macrophage Secretory Protein Activates Catabolism in 3T3-L1 Fatty Fibroblasts" aufbereitet wurden. Bei dieser Untersuchung wurde die Rolle der rohen Mediatorsubstanz bezüglich der Hemmung des Fettzellmetabolismus weiter untersucht, indem man sich auf die Wirkung konzentrierte, die der Mediator auf die katabole Aktivität der Mobilisierung und Freisetzung von Triacylglycerin durch die Zellen haben könnte. Diese lipolytische Aktivität wurde direkt und bezüglich der Aktivität sowohl der hormonempfindlichen Lipase als auch cAMP gemessen und es wurde gefunden, daß der Mediator eine signifikante Wirkung auf die Rate und das Ausmaß der Lipolyse und die Aktivität der hormonempfindlichen Lipase hatte, aber daß die cAMP-Spiegel und -Aktivität im wesentlichen unbeeinträchtigt waren. Die für diese Untersuchung angewendeten Verfahren sind nachstehend wiedergegeben.

MATERIALIEN UND VERSCHIEDENE METHODEN

Die verschiedenen Reagentien, Materialien und Verfahren wurden gemäß früher berichteten Arbeiten auf diesem Gebiet verwendet. So wurden Isoproterenol, ACTH, [³²P] Pi, LPL und peritoneale Maus-Makrophagen alle aus herkömmlichen Quellen entweder erhalten oder hergestellt. Radioimmunoassays auf cAMP wurden, wie von Watkins et al., J. BIOL. CHEM., 257 : 14719 (1982) beschrieben, durchgeführt.

3T3-L1-Zellkultur

3T3-L1-Präadipocyten wurden, wie früher von Pekala et al., PRO. NATL. ACAD. SCI. USA, 80 : 2743 (1983) beschrieben, in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium, welches 10% fötales Rinderserum enthielt, gezüchtet. Die Differenzierung wurde zwei Tage nach Konfluenz durch Supplementieren des Mediums mit 0,5 mM Isobutylmethylxanthin, 1 uM Dexamethason und 10 ug Insulin pro ml induziert. Achtundvierzig Stunden später wurde dieses Medium entnommen und durch ein Medium, das nur mit 10% fötalem Rinderserum und Insulin supplementiert war, ersetzt. Nach vier Tagen, als mehr als 90% der Zellen den Adipocyten-Phänotyp exprimierten, wurde das Medium gewechselt und die Zellen wurden in Abwesenheit von Insulin vierzehn Tage lang gehalten.

Lipolyse

Die Lipolyse wurde als Glycerinfreisetzung gemäß Pinter et al., ARCH. BIOCHEM. BIOPHYS. 121 : 404 (1967) bewertet. Die Zellen wurden mit Krebs-Ringer-Phosphatpuffer mit 2% Rinderserum-Albumin (Fraktion V), pH 7,4, gewaschen, dann in 2,0 ml des gleichen Mediums ein bis zwei Stunden bei 37ºC inkubiert. Die Inkubation wurde durch Entnahme von Medium und dessen Einstellung auf 10% Trichloressigsäure beendet. Das Gemisch wurde bei 2500 UpM zehn Minuten lang zentrifugiert und der Glyceringehalt des Überstands unter Verwendung eines gekoppelten Enzymsystems nach Extraktion der Trichloressigsäure mit Ether bestimmt. Eine Probe (0,167 ml) wurde in eine Küvette, enthaltend 0,14 mM ATP, 1,2 mM Phosphoenolpyruvat, 0,20 mM NADH, 1,5 Einheiten Glycerinkinase (Candida mycoderma), 1,35 Einheiten Pyruvatkinase (Kaninchenmuskel) und 2,8 Einheiten Lactat-Dehydrogenase (Rinderherz) gegeben. Die Menge des Glycerins in der Probe ist dem oxidierten NADH proportional. Die Glycerinfreisetzung wird als Gesamtzahl nmol, freigesetzt pro Zeiteinheit, entweder pro 106 Zellen oder pro mg Protein angegeben. Unter den vorstehenden Bedingungen war die Glycerinfreisetzung mindestens drei Stunden lang konstant.

Wirkung des Mediators oder von Isoproterenol auf die Glycerinfreisetzung

400 ul konditioniertes Medium aus den Endotoxin-behandelten peritonealen Maus-Makrophagen wurde für verschiedene Zeitspannen zu 3,5 ml Kulturmedium differenzierter 3T3-L1-Zellen (4,2·10&sup6; Zellen/Schale) gegeben. Diese Menge reicht aus, um die Aktivität der Lipoprotein-Lipase um 90% nach fünfzehn Stunden zu unterdrücken. Am Ende der Inkubation wurde das Medium entfernt, die einzelligen Schichten wurden zweimal mit Krebs-Ringer- Phosphatpuffer, enthaltend 2% BSA, gewaschen und die Glycerinfreisetzung wurde ein bis zwei Stunden lang überwacht.
In mit Isoproterenol durchgeführten Studien wurden die einzelligen Schichten zweimal mit Krebs-Ringer-Phosphatpuffer, enthaltend 2% BSA, gewaschen und in dem gleichen Puffer inkubiert. Sättigungsspiegel von Isoproterenol (3 uM) wurden zugesetzt und die Glycerinfreisetzung in das Inkubationsgemisch wurde ein bis zwei Stunden lang überwacht.

Herstellung von Zellextrakten und Test auf die hormonempfindliche Lipase

Ein löslicher Zellextrakt, enthaltend die hormonempfindliche Lipase, wurde wie von Kawamura et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, 78 : 732 (1981) beschrieben, hergestellt. Zuerst wurde das Medium ausgetauscht und die einzelligen Schichten wurden mit Medium, welches 10 Einheiten/ml Heparin enthielt, sechzig Minuten lang inkubiert. Das Medium wurde entfernt, und die einzelligen Schichten wurden zweimal mit Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung, pH 7,4, und einmal mit 10 mM Tris-HCl/1 mM EDTA/0,25 M Saccharose, pH 7,4, gewaschen. Die Zellen wurden abgekratzt und eine Minute lang bei 1000·g zentrifugiert. Die zusammengepackten Zellen wurden in 2 Volumina 10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1 mM EDTA, 0,25 M Saccharose homogenisiert und eine Stunde lang bei 40.0000·g zentrifugiert. Der Überstand wurde auf eine Heparin-Sepharose®-A- finitätssäule gegeben, um die Lipoprotein-Lipase zu adsorbieren. Der Effluent enthielt die lipolytische Aktivität, die durch Zugabe von Serum nicht aktiviert wurde, was das Fehlen der Lipoprotein-Lipase anzeigt.
0,07 ml Proben des Extrakts wurden in 5 mM Magnesiumaceat/0,5 mM ATP/0,01 mM cAMP/l mM EDTA/25 mM Tris-HCl, pH 8, in einem Gesamtvolumen von 0,1 ml fünf Minuten lang bei 30ºC inkubiert, um die Lipase zu aktivieren. Der Test wurde durch Zugabe von 0,7 ml Substratgemisch, enthaltend 0,3 mM [³H]-Triolein (7,5·10&sup5; cpm/umol), 50 mM Natriumphosphat, 5 mg/ml Rinderserum-Albumin und 2 mM EDTA, pH 7,0, gestartet. Nach 30minütiger Inkubation wurden 3 ml des Extraktionsgemisches, bestehend aus Methanol, Chloroform und Heptan (1,41 : 1,25 : 1,00), zugesetzt. Die tritiierte Ölsäure wurde von dem veresterten Oleat durch Flüssig/Flüssigverteilung abgetrennt, und die Radioaktivität wurde wie von Kawamura et al., a.a.O., beschrieben, bestimmt.

ERGEBNISSE

Wirkung des Mediatorproteins auf die zelluläre Lipolyse

Frühere Arbeiten hatten eine ausgeprägte Gewichtsabnahme der epididymalen Fettpolster von Mäusen gezeigt, welche entweder dem Endotoxin oder dem konditionierten Medium aus den Endotoxin-behandelten Makrophagen (Kawakami, M., Pekala, P.H., und Cerami, A., unveröffentlichte Daten) exponiert worden waren. Diese Beobachtung entsprach einer Aktivierung der Lipolyse, was zur Entleerung des gespeicherten Triacylglycerins führt, was gleichzeitig mit der Unterdrückung der Lipogenese einhergeht, die ursprünglich bezüglich der rohen Mediatorsubstanz offenbart wurde. Während einer fünfzehnstündigen Exposition gegenüber dem Mediator wurde die Lipolyse durch Glycerinfreisetzung gemessen, und diese nahm stufenweise bis zu etwa 150% über dem Grundwert zu. Der zeitliche Rahmen, der für die maximale Aktivierung der Glycerinfreisetzung benötigt wird, ist dem ähnlich, der für die maximale Unterdrückung der membranständigen Lipoprotein-Lipase beobachtet wird. Nach siebzehnstündiger Exposition gegenüber dem Mediator nahm die Aktivität der hormonempfindlichen Lipase, gemessen in löslichen Zellextrakten, um 60 bis 70% zu, wie in der nachstehenden Tabelle III gezeigt ist.

TABELLE III

Wirkung eines Makrophagen-Mediators auf die hormonempfindliche Lipase von 3T3-L1-Fettfibroblasten

Die Zellen wurden zur Differenzierung induziert und wie in den experimentellen Verfahren beschrieben, gehalten. Eine lösliche Fraktion, enthaltend die hormonempfindliche Lipase, wurde aus Kontrollzellen und aus Zellen, die siebzehn Stunden lang einem konditionierten Medium aus Endotoxin-behandelten peritonealen Maus-Makrophagen exponiert worden waren, hergestellt. Der Extrakt wurde entweder direkt untersucht oder fünf Minuten lang in Gegenwart von cAMP und ATP vor dem Test, wie in den experimentellen Verfahren beschrieben, inkubiert. Die Werte sind die Mittelwerte ± Standardabweichung aus vier Versuchen. Aktivität der hormonempfindlichen Lipase nmol/h/mg Protein Kontrollzellen Mit dem Mediator behandelte Zellen Keine cAMP
Die Inkubation der Kontrollextrakte in Gegenwart von cAMP und ATP führte zu einer Verdoppelung der Lipaseaktivität. Keine solche Stimulierung wurde jedoch beobachtet, wenn die aus den mit dem Mediator behandelten Zellen hergestellten Extrakte wie vorstehend inkubiert wurden. Bei dem gleichen Versuch wurden die Zellen gegenüber Sättigungsspiegeln des β-adrenergen Antagonisten Isoproterenol (3 Mm) [Watkins et al., J. BIOL. CHEM., 257 : 14719 (1982)] exponiert, und sie zeigten ein Maximum der Glycerinfreisetzung von 310 nmol/h/mg Protein. Dies ist einem Maximum in dem mit dem Mediator behandelten Zellen von 315 nmol/h/mg Protein, wie in der nachstehenden Tabelle IV dargelegt, vergleichbar.

Tabelle IV

Maximale Rate der Glycerinfreisetzung aus 3T3-L1-Fettfibroblasten

3T3-L1-Zellen wurden dem Mediator siebzehn Stunden lang oder Isoproterenol eine Stunde lang exponiert, und die Glycerinfreisetzung wurde, wie in den experimentellen Verfahren beschrieben, bestimmt. Die Werte sind die Mittelwerte ± Standardabweichungen aus vier Versuchen. Behandlung nmol/h/mg Protein nmol/h/10&sup6; Zellen Kontrolle Mediator 3 M Isoproterenol
Als Vergleich wurden jeweils gereinigtes Cachectin, hergestellt gemäß der vorliegenden Offenbarung, und Interleukin 1 mit 3T3-L1-Zellen, die zur Differenzierung induziert worden waren, unter den gleichen Bedingungen, wie sie bezüglich des von den Endotoxin-behandelten peritonealen Maus-Makrophagen abgeleiteten Mediums beschrieben wurden, inkubiert. Danach wurden lösliche Fraktionen, die die hormonempfindliche Lipase enthielten, auf gleiche Weise hergestellt, und sie wurden direkt untersucht, wobei gefunden wurde, daß die Aktivität der hormonempfindlichen Lipase, ausgedrückt in nmol/h/mg Protein die gleiche war wie die der Kontrollzellen, wie in der vorstehenden Tabelle IV dargelegt.
Aus den vorstehenden Daten kann gefolgert werden, daß während die rohe Mediatorsubstanz die Lipolyse und die Aktivität der hormonempfindlichen Lipase zu stimulieren scheint, diese Aktivität weder durch das erfindungsgemäße Modulatormaterial noch durch die bekannten Faktoren, die als Interleukin 1 identifiziert und wiedergegeben werden, gezeigt wird.

BEISPIEL 6

Dieses Beispiel stammt aus einer Untersuchung von Torti et al., a.a.O., die durchgeführt wurde, um die Mechanismen zu beleuchten, gemäß denen die zuvor entdeckte Mediatorsubstanz die Aktivität der lipogenen Enzyme in Adipocyten hemmt. Die Wirkungen der konditionierten Medien von Endotoxin-stimulierten Makrophagen-Kulturen auf eine stabile adipogene Zellinie (TA1) wurden unter Verwendung von cDNA- Clonen von Genen untersucht, dessen Expression während der Adipocyten-Differenzierung zunimmt, wie in Chapman et al., J. BIOL. CHEM., 259 : 15548-15555 (1984) beschrieben. Es wurde gezeigt, daß der Mediator reversibel und spezifisch die Entwicklungsexpression von fettinduzierbaren Genen hemmt, und daß dies durch Hemmung transkriptionellen Aktivierung dieser Gene erfolgt. Ferner vermindern sich, wenn die reifen Adipocyten dem Mediator exponiert werden, die mPNAs dieser während der Adipogenese induzierten Gene und erreichen rasch die Spiegel vor der Differenzierung.
TA1-Zellen entwickeln eine typische Adipocyten-Morphologie etwa drei Tage nach der Konfluenz in einzelligen Gewebskulturschichten, wie in Chapman et al., a.a.O., beschrieben. Parallel zu diesem morphologischem Nachweis der Differenzierung wurden mehrere Gene, dessen Expression erst nach der Differenzierung offensichtlich ist, identifiziert (Clone 1, 10, 28, 47). Diese fettinduzierbaren mRNAs werden hauptsächlich oder vollständig als Folge einer transkriptionellen Aktivierung exprimiert. Um zu bewerten, welcher Einfluß der erfindungsgemäße Mediator auf die koordinierte Induktion dieser Fettgene haben könnte, wurde der Mediator zu TA1-Zellen vor der Konfluenz und zu Zellen am Tag, am dem sie die Konfluenz erreichten, gegeben. Die aus diesen und Kontrollzellen sechs Tage nach der Konfluenz isolierte Gesamt-RNA wurde mit radioaktiv markierten cDNAs von Genen abgesucht, deren Expression in Adipocyten, aber nicht in Präadipocyten beobachtet wurde. Wie aus Figur 12 hervorgeht, verhindert die Behandlung mit dem Mediator die Anhäufung von fettinduzierbaren mRNAs. Die Li- Pidanhäufung wird ebenfalls vollständig durch Behandlung mit dem Mediator gehemmt. Die Adipocyten-Zellkulturen TA1, die mit dem Mediator behandelt wurden, wurden für ganze dreiundzwanzig Tage ohne das Erscheinen von Neutrallipiden gehalten, was durch eine Sudan III-Färbung offensichtlich ist (Daten nicht gezeigt). Jedoch kehrt bei Entfernung des Mediators aus den Medien die Adipocyten-Morphologie zurück, ebenso die Expression der fettinduzierbaren Gene, z. B. Clon 1 (Fig. 13).
Diese Hemmung der Genexpression ist keine allgemeine Wirkung des Mediators. Beispielsweise bleibt, wie aus Fig. 12 hervorgeht, der Spiegel an β-Actin-mRNA unbeeinflußt. Zusätzlich beeinflußt die Behandlung der Präadipocyten- Kulturen mit dem Mediator das Zellwachstum oder die Lebensfähigkeit nicht. In einer Reihe von Versuchen, die im Aufbau denjenigen von Fig. 12 ähnlich waren, wurde die Zellproliferation durch Zählen der Zellen und durch ³H- Thymidineinbau bestimmt. Die mit einer Kontrolle und dem Mediator behandelten Kulturen waren bezüglich der Zunahme der Zellzahl und der Abnahme des ³H-Thymidineinbaus bei Konfluenz ununterscheidbar. Die Lebensfähigkeit der Zellen, bestimmt durch Trypanblau-Ausschluß und einen clonalen Wachstumstest, war bei den mit der Kontrolle und dem Mediator behandelten Zellen ebenfalls äquivalent (Daten nicht gezeigt).
Um zu bewerten, ob die vermittelte Hemmung der Anhäufung der fettspezifischen mRNA transkriptionell reguliert wird, wurden Kerntranskriptionstests durchgeführt. Die Fig. 14 zeigt, daß die normale entwicklungsmäßige Zunahme der Gentranskription für die Clone 1 und 28 durch den Mediator gehemmt wird. Anschließend wurden ähnliche Ergebnisse für die cDNAs aus Glycerinphosphat-Dehydrogenase (Geschenk von B. Spiegleman) und Clon 47 erhalten (Daten nicht gezeigt). Bei weiteren Versuchen nimmt die Abnahme des GPD-mRNA- Spiegels nach der Zugabe des Mediators parallel mit der GPD-Enzymaktivität ab (Daten nicht gezeigt). Die Behandlung mit dem Mediator verursacht jedoch keine nicht-spezifische Verringerung der Transkriptionsaktivität: die Transkriptionsraten von β-Actin in Zellen vor der Konfluenz, differenzierten Adipocyten und mit dem Mediator während der Differenzierung behandelten Zellen sind äquivalent (Fig. 14).
Bei erwachsenen Säugetieren proliferieren die Adipocyten wenig oder überhaupt nicht. So stellt die Hemmung der Expression der Fettgene während der Differenzierung, wenn der Mediator zu TA1-Zellen vor der Konfluenz gegeben wird, wahrscheinlich kein realistisches Modell für Kachexie bei Säugetieren dar, obwohl diese für das Verständnis, wie diese Fettgene koordinativ in der Entwicklung reguliert werden, nützlich ist. Um zuverlässiger dieser Zellen als Modell für die in vivo-Situation zu verwenden, wurden reife Adipocyten-Kulturen eingerichtet, und der Mediator wurde diesen Zellen zugesetzt. Nach vier- bis sechstägiger Exposition gegenüber dem Mediator verloren die meisten Zellen ihre Neutrallipide. In typischen Versuchen würden 70 bis 80% der Zellen mit großen Lipidtröpfchen beladen werden, wenn der Mediator zuerst diesen Kulturen zugesetzt werden würde. Sechs Tage später würden etwa 10% der Zellen mittels Sudan III-Anfärbungen identifizierbare Triglyceride besitzen. Wie aus Fig. 15 hervorgeht, treten Veränderungen der fettspezifischen RNAs rascher ein als die Lipidmobilisierung. Zwölf bis vierundzwanzig Stunden nach der Zugabe des Mediator zu reifen TA1-Adipocyten wird eine mehr als 90%ige Abnahme der Spiegel von solchen RNAs beobachtet. So scheint eine dramatische und koordinierte Veränderung der Genexpression von primärer Bedeutung für die Mediator-induzierte Mobilisierung von Lipiden zu sein.
Die Legende der Figuren, die die spezifischen Verfahren, aus denen die Daten gewonnen wurden, beschreiben, sind nachstehend angegeben.

Fig. 12

TA1-Zellen, eine stabile adipogene Zellinie, abgeleitet aus mit 5-Azacytidin behandelten 10T/2C18-Zellen wurden in Eagles-Basalmedium, supplementiert mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum, gezüchtet. 10&supmin;&sup6; M Dexamethason war in den Medien die ersten drei Tage nach der Konfluenz vorhanden und 5 ug/ml Rinderinsulin für die ersten sechs Tage nach der Konfluenz. Konditionierte Medien aus der Makrophagen-Zellinie RAW 264 wurden zuerst den Präadipocyten-Kulturen zwei Tage vor der Konfluenz in einer Konzentration von 10 ul/ml zugesetzt, welche 90% der Lipoprotein-Lipase-Aktivität in gezüchteten Adipocyten hemmt. Die Zellen wurden mit einer Resupplementierung von Hormonen am Tag 0 (Konfluenz) und am Tag 3 ernährt. Die Zellen wurden am Tag 6 geerntet. Die Gesamt-RNA wurde nach den Verfahren von Chirgwin et al., BIOCHEMISTRY, 18 : 5294- 5299 (1979) isoliert und auf Nitrocellulose mit einem Dot- Blot-Gerät (BRL) aufgebracht. Nick-translatierte cDNA- Clone der Gene, dessen Expression nur in differenzierten TAI-Adipocyten beobachtet wird (Clone 1, 10, 47 und Glycerinphosphat-Dehydrogenase), sowie ein β-Actin-cDNA-Clon (Geschenk von P. Gunning und L. Kedes) wurden verwendet, um diese Filter unter Hybridisierungsbedingungen wie früher in Chapman et al., a.a.O., beschrieben, abzusuchen. Die Filter wurden gewaschen, dann einem XARS-Film bei - 70ºC mit einem Verstärkerschirm exponiert.

Fig. 13

Die Dot-Blots wurden wie in Fig. 12 beschrieben durchgeführt. Der Mediator (K) war in den Medien zu den angegeben Zeiten vorhanden. Die RNAs wurden mit der cDNA von Clon 1 sechs, neun und zwölf Tage nach der Konfluenz analysiert.

Fig. 14

Die Transkriptionstests wurden unter Verwendung des von Vannice et al., PROC. NATL. ACAD. SCI., USA, 81: 4241-4245 (1984) und Israel und Whitlock, J. BIOL. CHEM., 259 : 5400-5402 (1984) mit einer Modifikation nach Knight et al. für die Fettzellen durchgeführt. Die gezüchteten Zellen wurden bei 4ºC abgeschreckt, das Medium wurde abgesaugt und mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen. Ein ml hypotoner Puffer (20 mM Tris/HCl, pH 8,0, 4 mM MgCl&sub2;, 6 mM CaCl&sub2;, 0,5 nM Dithiothreit) wurde den Platten zugesetzt. Nach fünf Minuten wurde 1 ml Lysepuffer (0,6 M Saccharose, 0,2% NP-40 und 0,5 mM Dithiothreit) zugesetzt, und die Zellen wurden von den Gefäßen für die Gewebskultur abgekratzt. Nach einer Homogenisierung nach Dounce wurden die Zellkerne bei 500 g pelletiert, einmal in Resuspensionspuffer (0,25 M Saccharose, 10 mM Tris/HCl, pH 8,0, 10 mM MgCl&sub2;, 1 mM Dithiothreit) gewaschen, repelletiert, dann in 50 mM HEPES pH 8,0, 90 mM NH&sub4;Cl, 5 mM MgCl&sub2;, 0,5 mM MnCl&sub2;, 2 mM Dithiothreit, 0,1 mM EDTA, 0,4 mM jeweils ATP, CTP, GTP, 10% Glycerin und 10 ug/ml Rinderserum-Albumin resuspendiert. Die Zellkerne wurden mit ³²P-UTP (600 Ci/mmol, ICN) in einer Konzentration von 2 mCi/ml vierzig Minuten bei 25ºC unter sanftem Schütteln inkubiert.
Die RNA wurde aus den Zellkernen, wie von Smith et al. CELL, 15 : 615-626 (1978) beschrieben, mit einer Modifikation nach Knight et al., geerntet und mit linearisierten cDNAs hybridisiert, die auf Nitrocellulosefilter aufgebracht worden waren und zwei Stunden lang bei 80ºC in einem Vakuumofen gebacken. Die Bedingungen zur Prähybridisierung und Hybridisierung auf dem Filter waren diejenigen von Friedman et al., CELL, 38: 745-755 (1984). Die Hybridisierungen wurden drei Tage lang bei 42ºC mit etwa 15·10&sup6; cpm pro Reaktionsgemisch, aufgebracht in 150 ul Volumina auf die Dots der Fettzellen-cDNAs für die Clone 1 und 28 sowie als β-Actin und pEMBL-Plasmidkontrollen, durchgeführt.

Fig. 15A

Zehn ul/ml der Mediatorsubstanz wurden am Tag 6 den Adipocyten-Kulturen, die wie in Fig. 12 beschrieben differenziert wurden, zugesetzt. Die Gesamt-RNA wurde aus den Zellen zu den angegebenen Zeiten nach Exposition gegenüber dem Mediator isoliert und auf Nitrocellulose mit einem Dot-Blot-Gerät (Schleicher und Schuell) aufgebracht. Die Filter wurden mit den angegebenen cDNAs abgesucht, gewaschen, autoradiographisch untersucht und unter Verwendung eines Hoeffer GS300-Densitometers, der mit einem Aufzeichnungsintegrator verbunden war (Hewlett-Packard) gescannt. Die gezeigten Punkte wurden bezüglich der Unterschiede in der Menge der aufgebrachten RNA unter Verwendung einer cDNA-Sonde gegen die gesamte zelluläre RNA normalisiert.

Fig. 15B

Für diese Northern-Analysen wurden 12 ug Gesamt-RNA auf eine Endkonzentration von 2,2 M Formaldehyd, 30% Formamid, 10 mM NaH&sub2;PO&sub4;, pH 7,0, gebracht und fünfzehn Minuten lang bei 56ºC erhitzt. Die Proben wurden in einem 1,0%igen Agarose-Formaldehyd-Gel mit einer Endkonzentration von 2,2 M Formaldehyd, 20 mM MOPS, pH 7,0, 5,0 mM Natriumacetat und 1 mM EDTA, wie in Maniatis et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual"; (Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory), S. 202- 203 (1982) beschrieben, elektrophoretisch untersucht. Die Gele wurden 3 Minuten lang in destilliertem Wasser gewaschen, anschließend dann 2·30 Minuten lang in 10 mM Na&sub3;PO&sub4; (pH 7,4) und 1 mM EDTA gewaschen und dann auf Nitrocellulose überführt. Die Insertion zeigt eine typische Northern-Analyse, die mit der DNA von Clon 47 abgesucht wurde.
Die vorstehend beschriebenen Versuche wurden sowohl mit dem rohen konditionierten Medium der Endotoxin-stimulierten Makrophagen entsprechend der früher entdeckten Mediatorsubstanz als auch mit dem jüngst zur Homogenität gereinigten Protein Cachectin nach Beutler et al., a.a.O., durchgeführt. Vergleichstests wurden mit Interleukin 1 (rekombinantes Maus-IL-1, ein Geschenk von P. Lomedico, Hoffmann-La Roche) durchgeführt, und es wurde gefunden, daß IL-1 die Adipocyten-Differenzierung nicht hemmt. Somit üben sowohl die Mediatorsubstanz als auch das erfindungsgemäße Modulatormaterial Cachectin eine suppressive Wirkung auf die Adipocyten-Differenzierung aus.

BEISPIEL 7

Bei diesem Versuch wurde die Aktivität der Aufnahme und der Metabolismus der Glucose durch die Muskelzellen untersucht. Es wurde die Theorie aufgestellt, daß der gleiche Faktor, der die katabolen Aktivitäten, die einen Schock begleiten, der als Antwort auf invasive Reize eintritt, fördert, auch zu einer gewissen kausalen Wirkung auf den Verbrauch der Glucose beitragen könnte oder eine solche besitzen könnte, die zu der Hypoglykämie, die ebenfalls während eines Schocks vorhanden ist, führt.
Als Stützung dieser Hypothese wurde beobachtet, daß ein Rohpräparat der Mediatorsubstanz bei intraperitonealer Injektion eine Hypoglykämie bei Endotoxin-resistenten C3H/HeJ-Mäusen verursachte, und daß kleine Mengen sowohl des rohen Mediators als auch des erfindungsgemäßen Modulators Cachectin den 2-Desoxyglucosetransport erhöhten. Es wurde daher vermutet, daß der rohe Mediator und der erfindungsgemäße Modulator eine Rolle bei der Regulierung des Metabolismus als Antwort auf eine Infektion spielen könnten, und eine Vergleichsstudie wurde durchgeführt, welche die rohe Mediatorsubstanz, den erfindungsgemäßen Modulator Cachectin und Interleukin 1 einschloß, um die Aufnahme und den Transport der Glucose in L6-Muskelzellen zu messen. Die Verfahren und Ergebnisse folgen nachstehend.

MATERIALIEN

Endotoxin (Lipopolysaccharid) aus E. coli 0127:B8, isoliert nach dem Verfahren von Westphal, wurde von Difco Labs (Detroit, Michigan) bezogen. Das Zellkulturmedium und das Kälberserum wurden von GIBCO Labs (Grand Island, New York) und das fötale Kälberserum von Sterile Systems, Inc., (Logan, Utah) bezogen. ³-Isobutylmethylxanthin wurde von Aldrich Chemical (Milwaukee, Wisconsin) bezogen; Dexamethason und das CPK-Testkit stammte von Sigma Chemical Company (St. Louis, Missouri), Insulin von Eli Lilly (Indianapolis, Indiana); Glycerintri-[9,10(n)-³H]-oleat, U-¹&sup4;C-Glucose und ²-Desoxy-D[1-³H]-glucose stammten von Amersham Corp. (Arlington Heights, Illinois), 2-Methyl- (3H)isobuttersäure stammte von New England Nuclear (Boston, Massachusetts), Triolein stammte von Nu Check Prep, Inc. (Elysian, Minnesota); Acetylpyridinadenindinucleotid und Lactat-Dehydrogenase stammten von Boehringer-Mannheim (Indianapolis, Indiana).

VERFAHREN

3T3-L1-Zellkultur

3T3-L1-Präadipocyten wurden wie vorstehend beschrieben in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DME), welches 10% fötales Kälberserum enthielt, gezüchtet. Die Differenzierung, die zu dem Adipocyten-Phänotyp führte, wurde induziert. Zwei Tage nach der Konfluenz wurde das Medium mit 0,5 mM Isobutylmethylxanthin, 1 uM Dexamethason und 10 ug Insulin pro ml supplementiert. Achtundvierzig Stunden später wurde das Isobutylmethylxanthin-, Dexamethason- und Insulin-enthaltende Medium abgezogen und durch ein Medium, das Insulin in einer verringerten Konzentration von 50 ng pro ml enthielt, ersetzt.

L6-Zellkultur

Die Myoblasten-Zellinie, L6, wurde freundlicherweise von Dr. David Schubert, Salk Institute, San Diego, California, zur Verfügung gestellt. Die Zellen wurden in 10%igem fötalem Rinderserum-DME bei 37ºC in 5% CO&sub2; gehalten, mit Trypsin nach Standardverfahren versetzt und in Dichten von 5·10³ Zellen/ml ausplattiert. Die Konfluenz wurde nach einer Woche erreicht. Die Differenzierung in Myotubuli wurde durch Behandlung mit Insulin (10 mg/ml) vierundzwanzig Stunden, nachdem die Zellen die Konfluenz erreicht hatten, erleichtert.

Herstellung von peritonealen Exudatzellen und der Mediatorsubstanz

Peritoneale Exudatzellen wurden durch peritoneale Waschung aus NCS/SPF-Mäusen (25 bis 33 g; Rockefeller University Breeding Colony) erhalten, denen intraperitoneal steriles Brewer-Thioglycolat-Medium (Difco Labs, Detroit, Michigan; 3 ml pro Maus) fünf Tage vor dem Ernten injiziert worden war. Die unter Verwendung dieses Verfahrens erhaltenenen Exudatzellen sind in erster Linie Makrophagen mit einigen verunreinigenden Lymphocyten.
Die Zellen (4·10&sup9; Zellen pro cm²) wurden in serumfreiem RPMI 1640-Medium drei Stunden, nachdem die nichtadhärenten Zellen durch dreimaliges Waschen mit normaler Kochsalzlösung entfernt worden waren, inkubiert. Die an den Gefäßen hängenden Zellen waren in erster Linie Makrophagen. Diese Zellen wurden weiter in serumfreiem RPMI 1640-Medium in Gegenwart oder Abwesenheit von 5 ug/ml Endotoxin zur in vivo-Verwendung oder 0,1 ug/ml zur in vitro-Verwendung zwanzig Stunden lang inkubiert. Das Kulturmedium wurde nach der Inkubation entfernt und fünf Minuten lang bei 1000 g bei 4ºC zentrifugiert. Der Überstand des von den dem Endotoxin exponierten Zellen erhaltenen konditioniertem Mediums enthielt die Mediatorsubstanz. Kein Aktivitätsunterschied wurde während der einmonatigen Lagerung der konditionierten Mediums bei -80ºC beobachtet.

2-Desoxyglucose-Transport

Die Anhäufung von 2-Desoxyglucose in L6-Zellen wurde nach einer Modifikation des Verfahrens für die 3T3-L1-Zellen gemessen. Die L6-Zellen wurden bis zur Konfluenz in 6 cm- Gewebskulturgefäßen gezüchtet und bei Konfluenz zum Test in Myoblasten verwendet oder mit Insulin für Tests in Nyotubuli differenziert. Der Makrophagen-Mediator, der teilgereinigte Mediator oder das Lipopolysaccharid wurden etwa vierundzwanzig Stunden oder, wie angegeben, vor der dreimaligen Waschung der Platte mit 2 ml Krebs-Ringer-HEPES (128 mM NaCl, 5,2 mM KCl, 1,4 mM CaCl&sub2;, 1 mM MgSO&sub4;, 10 mM HEPES, pH 7,4) (KRH) zugesetzt. Insulin und/oder Cytochalasin wurden wie angegeben zugesetzt, und die Platten wurden 30 Minuten lang inkubiert, bevor 2-Desoxy-³H-Glucose (2 uCi/uM, 0,2 mM) zugesetzt wurde. Nach zehn Minuten wurden die Platten dreimal mit kalter (4ºC) 25 mM Glucose-KRH gewaschen. Der Puffer wurde abgesaugt, und 1,5 ml 10%iges Natriumdodecylsulfat wurde der Platte zugesetzt und bei Raumtemperatur 30 Minuten lang zur Solubilisierung der Zellen stehen gelassen. Die Zellen wurden von der Platte durch Abkratzen entfernt und mit einer Pipette suspendiert. Das so erhaltene Gemisch wurde mit einer mittleren Spannungseinstellung in einem Branson-Beschallungsgerät zweimal zehn Sekunden lang beschallt und auf Radioaktivität durch Flüssigszintillationszählung analysiert.
Das gereinigte IL-1 wurde wie in den vorstehenden Experimenten erhalten und wurde mit L6-Zellen, wie vorstehend unter Bezugnahme auf den Mediator oder dessen Isolat beschrieben, inkubiert.

ERGEBNISSE

Im allgemeinen erniedrigten sowohl die Mediatorsubstanz als auch ihr Isolat den 2-Desoxyglucose-Transport durch die L6-Myoblasten und Tubuli um das Siebenfache in dem Fall, in dem hohe Konzentrationen des Mediators verwendet wurden, was ebenfalls erkennen läßt, daß diese Wirkung konzentrationsabhängig ist. Zum Vergleich besaß das Medium, in dem kein IL-1 vorhanden war, keine Wirkung.
Beispielsweise zeigte die Messung der Aufnahme von 2-Desoxyglucose auf zehn Minuten Inkubation, welche in dem vierundzwanzig Stunden-Intervall durchgeführt wurde, eine Aufnahme durch die Kontrollzellen mit einem Wert von 12,5 ± 3,8, wobei gereinigtes Cachectin einen Wert von 30,3 ± 0,01 zeigte, während die Zellen in Kontakt mit dem IL-1- Medium einen Wert von -3,4 ± 0,26 zeigten. Als weitere Referenz wurde eine Probe mit dem bekannten Glucose-Transport-Protagonisten Insulin mit den Zellen vierundzwanzig Stunden lang inkubiert und stimulierte die Aufnahme von 2- Desoxyglucose auf 53,9 ± 3 4. So ist klar, daß während die rohe Mediatorsubstanz und das erfindungsgemäße Isolat die Glucoseaufnahme nicht in gleichem Ausmaß wie Insulin beeinflussen, zumindest in dieser Untersuchung beide Materialien signifikante Stimulatoren des Glucosetransports sind und in einen klarem Gegensatz zu IL-1 gestellt werden können, dem diese Fähigkeit fehlt.
Zusammenfassend zeigt das vorstehende Experiment an, daß sowohl der erfindungsgemäße Modulator Cachectin als auch sein Vorläufermediator die Aktivität, den Glucosetransport in Muskelzellen zu stimulieren, besitzen, während Interleukin 1 diese Eigenschaft nicht besitzt.

BEISPIEL 8

In dem kontinuierlichen Bemühen, die Aktivitäten und Eigenschaften sowohl der rohen Mediatorsubstanz als auch ihres Isolats, Cachectin, zu identifizieren, wurde eine Untersuchung zum Gewichtsverlust im Zusammenhang mit der Verabreichung des Mediators und seines Isolats in vivo durchgeführt, wobei die Wirkungen auf den Verlust der Körpermasse und der Futteraufnahme an C3H/HeJ-Mäusen (Endotoxin-resistent) beobachtet wurden.
Ein Vergleich wurde hier auch bezüglich der Wirkungen der jeweiligen Faktoren auf die Erzeugung von Fieber gemacht. Aus einer Durchsicht der Literatur bezüglich Interleukin 1 und insbesondere des vorstehend diskutierten Artikels von Dinarello, a.a.O., wurde gefunden, daß Interleukin 1 bei Mäusen Fieber erzeugt. Vergleiche Dinarello, a.a.O., Seiten 65-66 und die früheren vorstehend zitierten Fachleute. Die Daten und Ergebnisse sowohl bezüglich des Gewichtsverlustes als auch der Induktion von Fieber sind nachstehend dargelegt.

MATERIALIEN UND METHODEN

Herstellung des Makrophagen-Mediators

Peritoneale Exudatzellen wurden durch peritoneale Waschung von NCS oder C3H/HeN-Mäusen (männlich, 20-25 g), denen sechs Tage zuvor 3 ml steriles Brewer-Thioglycolat-Medium injiziert worden war, erhalten und mit Kochsalzlösung, wie früher von Kawakami et al., J. EXP. MED. 154 : 631 (1981) beschrieben, gewaschen. Zellen (2·10&sup6; Zellen/ul) wurden in RPMI 1640 (Gibco) resuspendiert und drei Stunden lang in 10 cm-Petrischalen gehalten. Nichtadhärente Zellen wurden durch dreimaliges Waschen mit dem gleichen Medium entfernt. Die verbleibenden adhärenten Makrophagen wurden 20 bis 24 Stunden lang in serumfreiem RPMI 1640-Medium, enthaltend 5 ug/ml Endotoxin und 50 ug/ml Gentamycinsulfat, inkubiert. Das Makrophagen-Kulturmedium wurde gewonnen, zentrifugiert und die Lösung wurde bei -78ºC gelagert. Der Proteingehalt des Präparats betrug 15 bis 18 ug/ml mit einer spezifischen Aktivität von etwa 300 E/mg. Die Einheit wurde als die Menge des Makrophagenfaktors bestimmt, die 50% der Lipoprotein-Lipase-Aktivität bei differenzierten 3T3-L1-Zellen unter festgelegten Bedingungen unterdrücken kann. Nicht durch Endotoxin aktivierte Makrophagen zeigten keine Aktivität, die Lipoprotein-Lipase zu unterdrücken.
Die Lösung des Makrophagen-Sekretionsprodukts wurde ebenfalls mit einem Amicon-Konzentrator unter Verwendung einer PM 10-Membran eingeengt. Drei konzentrierte Lösungen wurden hergestellt (zwei-, fünf- und zehnfach konzentrierter als die Ausgangslösung zur Injektion in die Tiere).

Injektionen des Mediators

C3H/HeJ-Mäuse (männlich, 18-25 g) erhielten täglich zwei intraperitoneale Injektionen der vorstehend beschriebenen Lösungen. Die Futteraufnahme wurde unter Verwendung metabolischer Käfige gemessen. Die Körpermasse wurde durch tägliches Wiegen der Tiere gemessen. Während dieser Zeitspanne wurde die Temperatur der Tiere ebenfalls täglich überwacht.

LEGENDEN DER FIGUREN

Die folgenden Legenden der Figuren beschreiben die Daten zum Gewichtsverlust und die Art, auf die sie erzeugt oder gewonnen wurden.
Die Fig. 16 erläutert die Wirkung des Makrophagen-Mediators auf die Futteraufnahme. Fünf Gruppen von C3H/HeJ-Mäusen (sechs Mäuse pro Gruppe) erhielten zweimal täglich intraperitoneale Injektionen (je 0,5 ml) der folgenden Lösungen (C) RPMI 1640, enthaltend 50 ug/ml Endotoxin (Kontrolle), (1) Endotoxin-aktiviertes Makrophagen-Kulturmedium (Makrophagen-Mediator), (2) zweifach konzentrierter Makrophagen-Mediator, (3) fünffach konzentrierter Makrophagen-Mediator, (4) zehnfach konzentrierter Makrophagen- Mediator. Die durchschnittliche Futteraufnahme der Tiere in jeder Gruppe zum Tag 0 wurde als 100% genommen. Metabolische Käfige (3 Tiere pro Gruppe) wurden verwendet.
Die Fig. 17 erläutert die relative Veränderung der Körpermasse der Tiere entsprechend dem Versuch in Fig. 16. Der Durchschnitt der Körpermasse der Tiere in jeder Gruppe am Tag 0 wurde als 100% genommen.
Die Fig. 18 zeigt die Wirkung der Absetzung des Makrophagen-Mediators auf die Körpermasse. Diese Gruppen von C3H/HeJ-Mäusen (fünf Mäuse pro Gruppe) erhielten zweimal täglich Injektionen (je 0,5 ml) der folgenden Lösungen (C) RPMI 1640, enthaltend 50 ug/ml Endotoxin (Kontrolle), (A) zehnfach konzentrierter Makrophagen-Mediator (eine Maus in dieser Gruppe verstarb am zweiten Tag). Fünffach konzentrierter Makrophagen-Mediator. Die durchschnittliche Körpermasse der Tiere in jeder Gruppe am Tag 0 wurde als 100% genommen.

ERGEBNISSE

Mäuse, die die Mediatorsubstanz aus den Endotoxin-aktivierten Makrophagen erhielten, zeigten eine zweiphasige Abnahme der Futteraufnahme, die dosisabhängig war (Fig. 16). Anfänglich erniedrigten alle Gruppen von Mäusen, die den Mediator erhielten, drastisch ihre Futteraufnahme. Auf diese akute Phase, die zwei Tage lang andauerte, folgte die zweite Phase, in der die Mäuse entweder ihre Futteraufnahme auf den Spiegel der Kontrollen (niedrige Dosis) erhöhten oder ihre Futteraufnahme weiterhin limitierten (hohe Dosis). Diese zweite Phase war von der Menge des injizierten Makrophagen-Mediators abhängig. Die Gruppe, die die höchste Dosis des Mediators erhielt, zeigte eine dramatische Abnahme der Futteraufnahme (60%), bis sie am dritten Tag nach der anfänglichen Dosis starben. Die Wasseraufnahme in allen Gruppen war der Futteraufnahme vergleichbar (Daten nicht gezeigt).
Die Veränderung in der Körpermasse der Tiere in dem vorausgehenden Versuch ist in Fig. 17 gezeigt. Die Körpermasse, wie die Futteraufnahme, nahm dosisabhängig biphasisch bezüglich der Mediatorkonzentration ab. Mäuse, die die geringste Dosis des Mediators erhielten, verloren weiterhin trotz normaler Futteraufnahme Gewicht, verglichen mit den Kontrollmäusen. Mäuse, die höhere Dosen erhielten, verloren bis zu 15% ihrer anfänglichen Körpermasse. Bei den höchsten verwendeten Dosen starben alle sechs Mäuse nach zweitägiger Behandlung. Die Futteraufnahme war für die sechs Mäuse in der Kontrollgruppe, die eine tägliche Dosis von 200 ug Endotoxin erhielten, normal.
Der im Zusammenhang mit dem Makrophagen-Mediator beobachtete auszehrende Effekt konnte durch Unterbrechung seiner Verabreichung umgekehrt werden (Fig. 18). Zwei Lösungen des Makrophagen-Mediators ähnlich den zwei Lösungen mit hohen Konzentrationen, die in dem Experiment von Fig. 17 verwendet wurden, wurden zwei Gruppen von Mäusen (drei Mäuse pro Gruppe) injiziert, aber auf zwei Tage mit der höchsten Dosis beschränkt (Kurve A1) oder zehn Tage lang mit einer weniger konzentrierten Lösung fortgesetzt (Kurve A2). Außer einer Maus, die in der zuerst genannten Gruppe nicht überlebte, kehrten alle anderen Mäuse zu dem anfänglichen Körpergewicht zurück.
Um eine mögliche bakterielle Verunreinigung aus zuschließen, wurde das Blut der injizierten Tiere gezüchtet und als steril befunden. Die Gesamtuntersuchung und die mikropathologischen Untersuchungen der Tiere, die den Makrophagen-Mediator erhielten, zeigten keine auffälligen Besonderheiten.
Bestimmte Aspekte der vorstehenden Versuche zum Gewichtsverlust wurden mit verringerten Mengen des Modulatormaterials durchgeführt, und während formale Daten nicht gewonnen wurden und wie vorstehend dargelegt wurden, wurde von den Autoren beobachtet, daß das Modulatormaterial eine äquivalente Fähigkeit, einen Gewichtsverlust bei Mäusen hervorzurufen, zeigte.
Während der Verabreichungsspanne des Mediators, während der die Futteraufnahme gemessen wurde, wurde die Temperatur der Tiere ebenfalls gemessen, und es wurde beobachtet, daß sie konstant blieb und nicht anstieg. Die einzige Temperaturveränderung trat innerhalb des letzten Tags vor dem Tod ein. Zu dieser Zeit wurden die Tiere moribund und die erwartete Temperaturabnahme wurde festgestellt. Das Cachectin-Isolat erzeugte bei Injektion in C3H/HeJ-Mäuse ebenfalls kein Fieber.
Basierend auf den Ergebnissen der Temperaturmessungen wurde gefolgert, daß während Interleukin 1 die Entwicklung von Fieber beeinflußt, eine solche Aktivität weder bezüglich des Modulatormaterials noch seines Vorläufers, der Mediatorsubstanz, vorhanden ist.

BEISPIEL 9

Eine weitere Aktivität, die beim Vergleich zwischen der Mediatorsubstanz, seinem Isolat Cachectin und Interleukin 1 betrachtet wurde, ist die Aktivität, Protein abzubauen. Wie die Erzeugung von Fieber wurde Proteinabbau in der Literatur als eine von Interleukin 1 ausgeübte Aktivität identifiziert. Vergleiche Dinarello, a.a.O., Seiten 71-72 und insbesondere Unterüberschrift A. auf Seite 72. Es wurde daher wünschenswert, zu bestimmen, ob die Mediatorsubstanz und ihr Isolat, das erfindungsgemäße Modulatormaterial, ähnliche Aktivitäten zeigten. Folglich wurden Muskelstreifen mit der erfindungsgemäßen Mediatorsubstanz bzw. ihrem Isolat in ähnlichen Mengen, in denen gereinigtes IL-1 verabreicht worden war, inkubiert. Danach wurden die Muskelstreifen beobachtet, jedoch wurde keine Muskelproteolyse gefunden. Auf dieser Basis wurde bestimmt, daß weder die Mediatorsubstanz noch das Modulatormaterial im Unterschied zu Interleukin 1 am Proteinabbau beteiligt waren.

BEISPIEL 10

Unter den nützlichen Verwendungen, die der erfindungsgemäße Modulator haben könnte, wurde postuliert, daß der Modulator verwendet werden könnte, um Antikörper zu erzeugen, die dann therapeutisch eingesetzt werden können, wie zur Hemmung oder Verhinderung eines Schocks, der durch bestimmte bakterielle Infektionen induziert wird. In einer unveröffentlichten Untersuchung, die von Beutler, Milsark und Cerami, durchgeführt wurde und als Punkt (6) unter Verwandten Veröffentlichungen aufgeführt ist, wurde ein spezifisches polyclonales Kaninchen-Antiserum gegen murines Cachectin entwickelt, und BALB/c-Mäuse wurde passiv damit sowohl vor, gleichzeitig während als auch nach der Verabreichung von E. coli-Lipopolysaccharid (LPS) immunisiert. Die Verfahren und Ergebnisse sind nachstehend dargestellt.

MATERIALIEN UND METHODEN

Das Modulator-Material Cachectin wurde wie vorstehend in Beispiel 2 beschrieben gereinigt. Das gereinigte Protein wurde zur Verwendung zur Immunisierung durch Elektrophorese in einem SDS-Polyacrylamidstabgel hergestellt. Das Gel wurde nach Beendigung der Elektrophorese geschnitten und etwa 5 ug homogenes Protein (immer noch in der Gelscheibe enthalten) wurden in 1,0 ml 0,05 M Ammoniumacetatlösung und 1,0 ml vollständigem Freundschem Adjuvans emulgiert. Einem weiblichen New Zealand White-Kaninchen wurde an mehreren subkutanen Stellen dieses Material injiziert. Vier zusätzliche Injektionen wurden in monatlichen Intervallen unter Verwendung von 2 bis 5 ug Cachectin, hergestellt wie vorstehend, unter Verwendung von unvollständigem Freundschem Adjuvans durchgeführt. Dem Kaninchen wurden vier und sechs Tage nach der abschließenden Injektion Blut entnommen. Das Immunserum wurde auf seine Fähigkeit, mit ¹²&sup5;I nach dem Iodogenverfahren markiertes Cachectin auszufällen, getestet (Fig. 19). Etwa 50% des Tracers wurden unter Verwendung einer 1 : 30.000 Verdünnung des Serums ausgefällt. Das Präimmunserum war nicht-reaktiv. Die Spezifität der Immunseren und der Präimmunseren wurden durch Immunblotting analysiert (Fig. 20). Eine einzelne Hauptart, entsprechend dem Mauscachectin, wurde markiert, wenn die Blot-Transfers von Medium aus zuvor mit LPS inkubierten RAW 264.7-Zellen dem Immunserum exponiert wurden. Das Präimmunserum zeigte keine Reaktivität. Weder das Immunserum noch das Präimmunserum enthielten mit LPS reaktive Antikörper, wie nach dem Verfahren von Neter et al., J. IMMUNOL., 76 : 377 (1956) oder durch Immunblotting von LPS getestet wurde.
Wenn das Immunserum männlichen BALB/c-Mäusen durch intraperitoneale Injektion eineinhalb Stunden vor der intraperitonealen Injektion von 400 ug LPS verabreicht wurde, wurde eine signifikante Schutzwirkung nachgewiesen (siehe nachstehende Tabelle V), verglichen mit der Mortalitätsrate, die bei den Kontrollmäusen, die mit Präimmunseren oder Nicht-Immunseren behandelt wurden. Nach der Verabreichung des LPS erschienen die Mäuse in allen Gruppen krank und zeigten eine febrile Antwort (Daten nicht gezeigt). So beseitigte das Immunserum nicht die pyrogene Wirkung von LPS. Ein ähnlicher Schutzgrad wurde beobachtet, wenn IgG, das aus Immunserum hergestellt wurde, den Mäusen vor der LPS-Injektion verabreicht wurde. Andererseits schützte das aus dem Nicht-Immunserum hergestellte IgG die Mäuse nicht (Daten nicht gezeigt).
Um den Schutzgrad, der durch das Immunserum gewährleistet wird, zu bewerten, wurden variierende Dosen von LPS Mäusen verabreicht, die entweder 50 ul Nicht-Immunserum oder 50 ul Immunserum fünf Stunden zuvor erhalten hatten (Fig. 21). Es ist offensichtlich, daß der LD&sub5;&sub0;-Wert von LPS bei mit Immunserum behandelten Tieren signifikant höher ist als der LD&sub5;&sub0;-Wert für Kontrollmäuse, die mit Nicht-Immunserum behandelt wurden.
Es wurde gefunden, daß der Zeitpunkt, zu dem das Antiserum verabreicht wird, relativ zu dem Zeitpunkt der Verabreichung von LPS von kritischer Bedeutung hinsichtlich des Hervorrufens eines Schutzeffektes ist. Mäusen, denen das Immunserum drei oder sechs Stunden vor der Verabreichung von LPS injiziert wurde, ging es signifikant besser als solchen, die passiv zum Zeitpunkt der LPS-Injektion oder mehrere Stunden danach immunisiert wurden (Fig. 22). Diese Entdeckung legt nahe, daß das Endotoxin eine Cachectinproduktion bald nach Verabreichung hervorruft, und daß Cachectin seine tödliche Schädigung innerhalb einer sehr kurzen Zeit ausübt. In Kaninchen wird Cachectin innerhalb der Minuten, die der intravenösen Verabreichung von LPS folgen, produziert, und Plasmaspitzenspiegel werden nach zwei Stunden mit einem raschen anschließenden Abfall der Spiegel beobachtet. Daher wird in diesem Modell das Tier hohen Hormonspiegeln nur kurz exponiert. Innerhalb dieses Zeitintervalls müssen die effektiven Antikörperkonzentrationen vorhanden sein, wenn ein Schutz erzielt werden soll.
Die vorstehend angegeben Daten beweisen die Rolle des Cachectins bezüglich der Vermittlung der tödlichen Wirkungen von LPS. Cachectin ist klar nur einer der Mediatoren, der für die zahlreichen pathologischen Wirkungen, die von LPS hervorgerufen werden, verantwortlich ist, da passiv immunisierte Mäuse febril werden und weiterhin krank und gestreßt erscheinen. Es ist beispielsweise möglich, daß Cachectin zusammen mit anderen Mediatoren (z. B. Interleukin 1, Interferone und Lymphotoxin) wirkt, um die tödliche Wirkung von LPS hervorzurufen.
Es ist wichtig, festzuhalten, daß Mäuse gegenüber den Wirkungen von LPS relativ resistent sind, verglichen mit den meisten anderen Säugetieren. Kaninchen beispielsweise sind etwa 1000fach empfindlicher. In LPS-empfindlichen Arten spielt Cachectin vermutlich eine hervorragendere Rolle als Mediator des Schocks. Die Immunisierung gegen Cachectin könnte dann vermutlich einen höheren Schutzgrad ergeben.
Die mögliche Nützlichkeit einer passiven Immunisierung mit Antiseren gegen Cachectin bei Tieren mit einem durch Blutvergiftung induzierten Schock (oder möglicherweise durch andere Ursachen induzierten Schocks) benötigt eine weitere Erforschung. Eine offensichtliche Folge ist die Möglichkeit, daß Mittel, die die Synthese oder Bindung von Cachectin an seinen Rezeptor beeinflussen, in dieser Umgebung von Nutzen sein könnten, ohne das Immunsystem des Wirts zu fordern.
Die folgenden Legenden der Figuren bieten weitere Einzelheiten bezüglich der verwendeten Verfahren und der Darstellung ihrer Ergebnisse.

LEGENDEN DER FIGUREN

Die Fig. 19 ist eine graphische Darstellung der Immunpräzipitation von mit ¹²&sup5;I-markiertem murinem Cachectin. Das Immunserum (ausgefüllte Kreise) wurde, wie im Text beschrieben, hergestellt. Das Präimmunserum wurde von dem gleichen Tier erhalten. Die Immunpräzipitationsreaktionen wurden in konischen Polypropylenröhrchen durchgeführt. Die Serumproben wurden auf die angegebenen Endkonzentrationen unter Verwendung von Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung, enthaltend 1% RIA-Grad Rinderserum-Albumin (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri) verdünnt (PBS/BSA). 0; kein Serum zugesetzt. 2 ul (etwa 0,2 ng; 1,4· 10&sup4; CPM) der Lösung mit dem markierten Cachectin, die wie vorstehend beschrieben hergestellt wurde, wurden mit 20 ul verdünntem Serum vermischt. Die Lösungen wurden fünf Stunden lang bei 4ºC inkubiert. Zu dieser Zeit wurden 10 ul einer 1 : 5 Suspension eines gewaschenen bakteriellen S. aureus-Adsorbenten (Miles Laboratories, Inc., Elkhart, Indiana) in destilliertem Wasser jedem Röhrchen zugesetzt. Nach 30 Minuten wurde 1,0 ml PBS/BSA jedem Röhrchen zugesetzt. Die Proben wurden rasch vermischt und die Immunpräzipitate wurden unter Verwendung einer Beckman-Mikrofuge sedimentiert. Die Überstände wurden abgesaugt, und die Pellets wurden unter Verwendung eines Packard-Autogamma- Szintillationsspektrometers, Modell 578, ausgezählt. Die Ergebnisse sind als Prozent präzipitierte eingegebene CPM ausgedrückt. Nicht-Immunseren aus anderen Kaninchen (Daten nicht gezeigt) konnten ebenfalls kein markiertes Cachectin ausfällen.
Die Fig. 20 ist eine Autoradiographie eines Western-Blots von rohem konditioniertem RAW 264.7-Zellmedium und von LPS. Bahn 1 (a und b): 50 ug E. coli-Stamm 0127:B8 LPS (Difco; Detroit, Michigan). Bahnen 2-6 (a) und 2-5 (b): 25 ul LPS-stimuliertes konditioniertes RAW 264.7 Zellmedium (Maus-Makrophagen) (enthaltend etwa 40 ug Gesamtprotein), hergestellt und 50fach konzentriert, wie zuvor in Beispiel 1 beschrieben. Die Proben wurden auf ein 10-15% SDS- Polyacrylamid-Gradientengel gegeben. Nach Beendigung der Elektrophorese wurde das Protein auf Nitrocellulosepapier (Schleicher und Schuell, Inc., Keene, New Hampshire) unter Verwendung einer Elektroblotting-Vorrichtung (Bio-rad Laboratories, Richmond, Kalifornien) überführt. Immunseren (a) und Präimmunseren (b) wurden auf den Nitrocelluloseblot in Verdünnungen von 1 : 300 aufgebracht, und die reaktiven Banden wurden mit ¹²&sup5;I-markiertem Protein A (New England Nuclear Corp., Boston, Massachusetts) identifiziert. Die in (a) sichtbare Bande entspricht genau im Molekulargewicht dem murinen Cachectin, wenn das gereinigte radioiodierte Protein elektrophoretisch untersucht und parallel als Marker überführt wird. Keine reaktiven Proteine zeigen sich, wenn vor der Immunisierung gewonnenes Serum auf den Blot aufgebracht wird.
Die Fig. 21 ist eine graphische Darstellung der Abschätzung der Endotoxin-LD&sub5;&sub0; in Mäusen mit Immunseren und Nicht-Immunseren. Männliche BALB/c-Mäuse (19-21 g) wurden willkürlich in elf Gruppen eingeteilt, von denen jede fünfzehn bis siebzehn Mitglieder enthielt. In vier Gruppen (Dreiecke) wurden die Mäuse mit einer intraperitonealen Injektion von 200 ul Immunserum, verdünnt 1 : 4 mit steriler isotoner Kochsalzlösung, vorbehandelt. In den verbleibenden sieben Gruppen (offene Kreise) wurden die Mäuse mit dem gleichen Volumen eines 1 : 4 verdünnten Nicht-Immunserums vorbehandelt. Nach fünf Stunden wurden den Mäusen intraperitoneale Injektionen variierender Mengen des E. coli-Stamms 0127:B8 LPS, aufgelöst in steriler Kochsalzlösung, gegeben. Das Überleben wurde in allen Gruppen achtundvierzig Stunden nach der LPS-Injektion verfolgt. Die Kurven wurden den Daten angepaßt, und eine Berechnung des LD&sub5;&sub0;-Werts wurde wie von Bliss, Q., J. PHARMACOL., 11 : 192 (1938) und Litchfield, et al., J. PHARMACOL. EXP. THER., 96 : 99 (1949) beschrieben, durchgeführt. Die horizontalen Balken zeigten die 95% Konfidenzgrenzen für die LD&sub5;&sub0;-Bestimmungen an (91 ug für mit Nicht-Immunserum behandelte Mäuse und 227 ug für mit Immunserum behandelte Mäuse). Die Verabreichung größerer Volumina an Immunserum an Mäuse (bis zu 200 ul) verbessert das Überleben nicht weiter (Daten nicht gezeigt).
Die Fig. 22 zeigt eine Kaplan-Meier-Überlebens-Darstellung nach der LPS-Behandlung. 80 männliche BALB/c- Mäuse (19-21 g) wurden willkürlich in fünf Gruppen zu jeweils sechzehn Mitgliedern eingeteilt. Die Mäuse wurden durch intraperitoneale Injektion von 200 ul Anti- Cachectin-Serum entweder sechs oder drei Stunden vor, gleichzeitig mit oder drei bis sechs Stunden nach intraperitonealer Injektion von 400 ug E. coli-Stamm 0127:B8 LPS (Difco; Detroit, Michigan) geschützt. Genau überprüfte Bestimmungen des Überlebens wurden zu den angegebenen Zeitpunkten nach der LPS-Injektion durchgeführt. Das Überleben war optimal, wenn die Mäuse sechs Stunden vor der LPS-Verabreichung vorbehandelt wurden (A). Eine signifikante Abnahme des Überlebens bezüglich dieser Werte wurde festgestellt, wenn den Mäusen Anti-Cachectin-Serum zum Zeitpunkt der LPS-Verabreichung (C), drei Stunden nach der LPS-Verabreichung (D) oder sechs Stunden nach der LPS- Verabreichung (E) verabreicht wurde. Tests der Null- Hypothese, daß die zeitbezogene Überlebenswahrscheinlichkeit in jeder Gruppe gleich der in der sechs Stunden vor der LPS-Verabreichung geschützten Gruppe war, wurden unter Verwendung des Gehan-Verfahrens (vergleiche Gehan, BIOMETRIKA, 52 : 203 (1965)) durchgeführt; p-Werte (einseitige Normalverteilung) sind für jede Kurve angegeben. Serumvolumen (1)¹ immun nicht- immun

Tabelle V

¹Weibliche BALB/c-Mäuse (20-24 g) wurden willkürlich in sechs Gruppen eingeteilt und durch intraperitoneale Injektion mit Serum aus immunisierten oder nicht-immunisierten Kaninchen eineinhalb Stunden vor der intraperitonealen Injektion von 400 ug E. coli-Stamm 0127:B8 LPS vorbehandelt. Die Serumproben wurden mit steriler isotoner Kochsalzlösung verdünnt und in einem Endvolumen von 0,2 ml pro Maus injiziert. LPS wurde auch in steriler Kochsalzlösung verdünnt und in einem Volumen von 0,2 ml injiziert. Die Sterblichkeit wurde täglich aufgezeichnet, und der Versuch galt als vollständig, wenn keine Todesfälle in jeder Gruppe für eine Zeitspanne von drei Tagen beobachtet wurden. Die vorstehenden Ziffern geben die Anzahl der Überlebenden sieben Tage nach der LPS-Injektion an.
²doppelseitige t-Verteilung.
Aus dem vorstehenden Beispiel geht hervor, daß das erfindungsgemäße Modulatormaterial in der Tat die therapeutischen Fähigkeiten, die ihm theoretisch zuzuschreiben waren, besitzt. So kann in dem Ausmaß, in dem das Modulatormaterial oder sein Bindungspartner geeignet verabreicht wird, eine Beseitigung oder Linderung der ungünstigen Zustände erzielt werden, die kausal mit dem unerwünschten Grad verknüpft sind, in dem der zelluläre und systemische Zustand des Patienten in entweder dem anabolen oder katabolen Zustand bleibt. Der Modulator stellt daher ein effektives therapeutisches Mittel dar, dessen volles Potential noch nicht festgestellt wurde.

Claims

1. Arzneimittel zur Behandlung einer Kachexie und eines Schockzustandes bei Menschen, umfassend:

(a) eine pharmazeutisch wirksame Menge eines anti- Cachectin-Antikörpers, und

(b) einen pharmazeutisch verträglichen Träger.

2. Arzneimittel nach Anspruch 1, wobei das Cachectin erhältlich ist aus tierischen Makrophagenzellen, die mit einem Reizmittel inkubiert wurden, das einen invasiven Reiz begleitet.

3. Arzneimittel nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Cachectin von Zellen stammt, die durch clonale Vermehrung hergestellt werden.