JPS62116599A - 医薬組成物 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
（産業上の利用分野）
本発明は、例えば動物宿主に対する感染などの、侵入刺
激の効果の分析、治療及び操作のための物質並びに関連
する方法に関し、特に、このような侵入刺激に対する宿
主応答に関する物質の同定に関する。 （従来の技術） 細菌、ビールス及び厚生動物などの感染、腫瘍及び内生
毒素などの種々の侵入刺激に対する応答として、様々の
哺乳類宿主にいくつかの共通の生理学的、生化学的障害
があられれることが観察されている。例えばこのような
応答には、発熱、白血球増加、血中脂肪分子ｌ？！酵素
増多１食物取り込みの減退（悪液質）及び活性、筋肉。 白血球及び肝臓代謝におけるその他の変異が含まれる。 特にトラパノゾーマブルセラに感染したウサＶにおける
悪液質の生化学橢構を解明するための細菌の研究の結果
、最小限の寄生体を有する動物は、曲死の状態となり極
度のハイバートリグリセリデミアの症状を示し、血漿の
著しい上臂及び極めて低濃度のリボプロティン（ＶＬＤ
Ｌ ）を伴うことが注目された。Ｃ，Ａ、 ／レーザー
及びＡ、セラミによるＭｏ１． Ｂ（ＯＣｌｌ［Ｈ，Ｐ
へ１（へ５ＩＴＯ＋１＠、３１−３８ページ、 １９８
０年、参照、ハイパートリグリセリデミア症状は、この
実験感染に附随する極度の衰弱素質からみて注しＩすべ
きものである。血％”ＪＶＬＤｌ、の上ｎは、抹消組織
りボプロデインワンパーピ（ＬＰＬ）活性の損失に起因
する開化欠如（ｃｌｅａｒｉｎｇ ｄｅｆｅｃｔ ）に
よるものであることがわかった。 １−Ｐ１活性は他の研究者によっても観察されており、
この状態は、人体がショック症状にある時に存在したこ
とが注意された叶、Ｂ、マンばかによる“肝臓病にお
激の効果の分析、治療及び操作のための物質並びに関連
する方法に関し、特に、このような侵入刺激に対する宿
主応答に関する物質の同定に関する。 （従来の技術） 細菌、ビールス及び厚生動物などの感染、腫瘍及び内生
毒素などの種々の侵入刺激に対する応答として、様々の
哺乳類宿主にいくつかの共通の生理学的、生化学的障害
があられれることが観察されている。例えばこのような
応答には、発熱、白血球増加、血中脂肪分子ｌ？！酵素
増多１食物取り込みの減退（悪液質）及び活性、筋肉。 白血球及び肝臓代謝におけるその他の変異が含まれる。 特にトラパノゾーマブルセラに感染したウサＶにおける
悪液質の生化学橢構を解明するための細菌の研究の結果
、最小限の寄生体を有する動物は、曲死の状態となり極
度のハイバートリグリセリデミアの症状を示し、血漿の
著しい上臂及び極めて低濃度のリボプロティン（ＶＬＤ
Ｌ ）を伴うことが注目された。Ｃ，Ａ、 ／レーザー
及びＡ、セラミによるＭｏ１． Ｂ（ＯＣｌｌ［Ｈ，Ｐ
へ１（へ５ＩＴＯ＋１＠、３１−３８ページ、 １９８
０年、参照、ハイパートリグリセリデミア症状は、この
実験感染に附随する極度の衰弱素質からみて注しＩすべ
きものである。血％”ＪＶＬＤｌ、の上ｎは、抹消組織
りボプロデインワンパーピ（ＬＰＬ）活性の損失に起因
する開化欠如（ｃｌｅａｒｉｎｇ ｄｅｆｅｃｔ ）に
よるものであることがわかった。 １−Ｐ１活性は他の研究者によっても観察されており、
この状態は、人体がショック症状にある時に存在したこ
とが注意された叶、Ｂ、マンばかによる“肝臓病にお
【
する血清及び肝臓のリピド″ＣＬＩＮ、 ＩＮＶＥＳ
Ｔ、 ２４号、６２３ページ以下、 １９４５年：又シ
コン１．ガリンほかによる゛感染にお【Ｊる面清すピド
” 、 Ｎ、ＥＭＧＬ、Ｊ、ＨＥＤ、２８１号、１０８
１−１０８６ページ、 １９６９．１１．１３； Ｄ、
ファルスチはか、“つ号ギの血清リビドに及ぼす三種の
細菌感染の効果” 、 Ｊ、ＢＡＣ［：Ｒ１０Ｌ、９５
号、 １６１５ページ以下。 １９６８年： Ｓ、Ｅ、グロスベルブはか、゛ニワトリ
胚におけるビールス感染による過類詣質血症：新しい症
候、 ＮＡＴＩＩＩＩＥ（口＞トン＞ 、 ２０８号
、９５４ページ以下、 １９Ｇ５年；ロバート［、ヒル
シュはか、゛細菌性内山素を静脈内注射したウサギにお
ける過類脂質血症、脂肪肝及びブロムスルフＡフタレー
ン停滞” 、 Ｊ、ＬｒＰＩＤ、ＲｒＳ、 ５号、
５６３−５６８ページ、 １９６４年；オザム サカグ
チはか、“内Ｆ＋ｊ索を注ｍしたマウスにおけるリピド
代謝の交代”、 ＨＩＣＲＯＢＩＯＬ、 ＩＨＨＩＩＮ
ＯＬ、２３号（２） ７１−８５ページ、 １９７９
年：Ｒ，Ｆ、カムシュミット、゛内毒素耐性Ｃ３１１／
１ｌｅＪマウスにおける部分的に精製された白血球内生
メディエータの活性”、Ｊ、Ｌ＾Ｂ、ＣＩ−ＩＮ、ＨＥ
ｏ、 ９５号、６１６ページ以下、 １９８０年；ラル
フＦ、カムシュミット、白血球内生メディエータの活性
”、 Ｊ、ＲＥＴ、ＳＯＣ，２３（４１号、 ２８７
−２９７ページ、 １９７８年：を参照。 更に出願人には、感染に対し宿主応答に関係するように
見える“メディエータ（中間物質或いは媒介物１ｇｉ＞
の同定及び存在を論じた文献が知られている；特に以下
の論文を参考のために列挙する：サイブＪ、Ｄほか、Ｊ
、ＥＸＰ、ＨＥＤ、、 １５０号、 ５９７−６０
６ページ、 １９７９年；バーニー、 Ｃ，Ｃ。 １、ｔｌｆｉ、 ＬＩＰＩＯＮ、 Ｊ、Ｈ，（Ｅｄ、
） 、 ＦＥＶＥＩｔ ： ＩＮＴＥＲ−Ｎ＾Ｔｌ０Ｎ
八Ｌ ５ＹＨＰＯ３ＩＵＨ、テキザス州ダラス。 １９７９、 ４月 １１−１２日、 ＸＩＩ＋２６３ベ
ージ； ＲａｖｅｎＰｒｅｓｓ： 二１−３−り、 ｌ
ｌ１ａｓ、ｌ５ＢＮ ０−８９００４−４５１−１（０
８８７７） 、 ０（０）、 １１１−１２２ページ
、 １９８０年；ディナレロ、Ｃ，Ａ、、 “ヒト白
血球性発熱質：放射線免疫アッセイの純化及び発展”
、 ＰＲＯＣ。 ＮＡＴＬ、 八ＣＡＤ、５Ｃ１−，ＵＳＡ、７４（１
０）号、 ４６２４−４６２７ページ（１９７７年
１０月）。上述論文の筆各、カムシュミットによる論文
の’ｆ１６及び共同執筆者のそれぞれによって同定され
研究された因子のすべては、インターロイキン１として
同定される因子の単一群を含むことが確認された。この
確認はチャールスＡ、ディナロによる論文、 ＲＥＶＩ
ＥＷＳＯＦ ＩＮＦＥＣＴＩＯｌｌＳ ＤＩＳＥＡＳＥ
Ｓ、第６巻、１号（１９８４年１月−２月）に文書化さ
れており、その内容も参考迄に組み込まれている。 出願人は、ＬＰＬ活性の同様の欠如が大腸菌リポポリサ
ッカライド（ＬＰＳ）の投与１ｃ３Ｈ／１ｌｅＮマウス
にみられることに注目した。これと対照的に、ＬＰＬ活
性のｌ員失は、通常ＬＰＳ ｌ、：耐性のあるＣ ３１
１ ／ ｔｌ ｅ Ｊマウスには見られなかった。内毒
素誘ｉ ＬＰＬ欠如に対−づ゛るこの抵抗性は、２日前
にＬＰＳを注射した内毒素感応動物から得られた血清を
投与することにより欺くことがＣきる。同様に抵抗性は
、感応マウスから得られた、内山素刺激チオグリコレー
ト引き出し腹腔マクロファージを注射することにより克
服される。これらの発見は同時係属の親出願である米国
特許出願第４１４，０９８号に詳細に記載されており、
その内容は参考に本願に組み込まれている。 以上の研究は、“°メディエータパが存在すること、そ
して動物宿主のエネルギー貯蔵細胞の全体的な同化活性
に茗しい影響を及ぼすと考えられることを、確信する発
明者達の信念により促進された。この“メディエータ”
はある種の同化酵素の活性に抑制効果を及ぼすことが考
えられ、その活性減少は、感染侵入の応答として、動物
宿主がショックとして知られる状態に入る場合に観察さ
れた。その結束の、内毒素刺激腹腔マウス滲出Ｉｌｌ胞
により生成されるメディエータの内毒素感応マウス及び
内ｔＢ素不感応マウスに及ぼす影響の関係、及び同化酵
素活性測定のための試薬の、このような研究による開発
、については生に放棄された米国特許出願第２９９，９
３２号に記載されている。 この系の研究が更に３＋３−１１ ”前脂肪１ｆＩＵ胞
°′型の系に関連して進められ、′メディエータ″に封
する抗体の開発のための方法及び材料にかかわる研究、
及びその診断手順については、放棄された米国出願第３
５１．２９０号に記載されている。 その後の米国出願第４１４，０９８号において、マクロ
ファージ細胞の内毒素刺激に由来するメディエータ物質
は、同化酵素であるリポプロティンリバーぜ、アセチル
コエンジムへカルボヤシラーじ及び脂肪酸シンセターげ
を抑制する活性を示したこと、また赤血球関与細胞の成
長及び分化を抑圧ザることを確証した。 最後に述べた特許出願の出願模の研究により、先に同定
されたメディエータ物質はその内に、分離及び検査の結
果、多くの活性を有する蛋白成分を含有しており、これ
は、メディエータ物質、及び当稟省にインターロイキン
１ （ＴＬ−１）及びインターロイキン２（ＩＬ−２）
として同定され知られている他の因子とも異なるもので
あることの発見に至った。従って本発明は、この新しく
発見された蛋白質分離物及びその活性、ならびにこの分
離物による診断的及び治療的な適用にかかわる。 （本発明の要約） 本発明の第一の局面においては、メディエータ物質（中
間物質）の、新しく発見された分離物が開示され、この
分離物は、同化酵素であるリポプロティンリパーゼ（Ｌ
ＰＬ）の活性を実質的に完全に抑制する能力を発揮する
蛋白質を含み、また、脂肪細胞の分化を阻止し、筋肉細
胞におけるグルコースの取り込みを増大させることがで
きる。しかしながらこの蛋白質は白血球試活活性に欠け
、この特徴は、集合的にインターロイキン１と呼ばれる
既知因子と区別されるものである。その肯定的な活性と
して、このモジュレータ物質はもつとも署しクシＰＬ活
性を抑制し、これはインターロイキン２と異なるもので
あり、そのため悪液質の羅患にかかわると考えられる。 以上の特性を有する特定の蛋白質が分離され、これは分
子けがほぼ１７キロダルトンであり、ｐｌがほぼ４８で
あることがわかった。 既に１本べたように、このモジュレータ物質は侵入刺激
を伴う物質でマクロファージ細胞を刺激することにより
調製される。特に、種々の入手先から１ｑられたマクロ
ファージ細胞の標本を、内毒素やトリパノゾーマのよう
な刺激物質で培養し、同時継続米ｌ特許出願第４丁４，
０９８号に開示されるメディエータ物質を生成する。こ
の培養は２４時時間でのある時間をかけて行われ、正確
な時間は培養に選択される細胞により変る。 この培養の後、培地は遠心分離法により適切に処理され
て、粗メディエータ物質を含む上澄液をとる。次いでメ
ディエータ物質をこの上澄液から、例えば硫酸アンモニ
ウムの４０−６０％溶液を用いて沈澱させる。その後、
粗メディエータ物質を一連の分離手順１例えば等電焦点
化及びゲル電気泳動、を施し、その後モジュレータ物質
を回収する。本発明は、当然に、ｔシュレータ物質調製
の別の手段をも含んでおり、これは、適用可能な場合に
は公知の遺伝学的再現法を含み、従って本発明は、この
ような合成的な調製法ちを意図している。 より詳しくは、本発明のモジュレータ物７１は、ヒ１へ
にみられる腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）として知られる公知
蛋白質と、検査及びＧ１究によりある程度類似性を右す
るように見えるポリペプチドを含む。 従って、本発明はまた、マウスについて決定され以下に
、及び第２３図に示されるアミノ酸連鎖を右してあられ
れる特徴及び上述活性を有する蛋白質をも含む。 １、ＥＵ ＡＲＧ ＳＥＲＳＥＲ５ＥＩＩ ＧＬ
Ｎ ＡＳＮ ５ＥＩＩ ＳＥＲＡＳＰＬＹＳ
ＰＲＯＶＡＬ ＡＬＡ ＩＩＴｓ ＶＡＬ Ｖ
ＡＬ Ａ１．Ａ ＡＳＮ ｌｌｌ５ＧＬＮ Ｖ
ＡＬ ＧＬＵ ＧＬＵ ＧＬＮ ＬＥＵ Ｇ
Ｌｔｌ ＴｒｌＰ ＬＥＵ ５ＥＩＩＧＬＮ
ＡＩｔＧ ＡＬＡ ＡＳＮ へ１八 ＬＥＩＩ
Ｌｕ１ｌ ＾１＾ ＡＳＮ Ｇｌ−ＹＨＥ Ｔ
八ＳＰ １−Ｅｌｌ １−ＹＳ ＡＳＰ ＡＳ
Ｎ ＧＬＮ ＬＥＵ ＶＡＬ ν＾ＬＰＲＯ＾
Ｌ△ ＡＳＰ ＧＬＹ １−ＥＩ ＴＹＲＬＥＩ
Ｉ ＶＡＬ ｒＹＲ５ｒＲＧＬＮ ＶＡＬ Ｌ
［Ｕ ＰＩＩＥ ＬＹＳ ＧＬＹ ＧＩＮ
ＧＬＹ ＣＹＳ ＰＲＯＡＳＰ 丁ＹＲＶＡＬ
ＬＵＵ ＬＥＩＩ １＋１Ｒｌｌｌ５ 丁＋１
ＲＶＡＬ Ｓ［ＲＡＲＧ ＰＩＩＥ ＡＬＡ
ＩＬＥ ＳＥＲｔＹＩｌｌ Ｇ１．Ｎ ＧＬＵ
ＬＹＳ ＶＡＬＡＳＮ Ｌ［Ｕ ＬＥｔｌ
Ｓ［ＲＡＬＡ ＶＡＬ ＬＹＳ Ｓ［ＲＰＩＩＩ
ＯＣＹＳＰＩＩＯＬＹＳ ＡＳＰ ＴＩＩＲＰＲＯ
ＧＬＵ Ｇ１．Ｙ ＡＬＡ Ｇ１．Ｕ Ｌｕ１
ｌＬＹＳ ＰＩｔＯＴＩｔＰ ＴＹＲＧＬｔｌ
ＰＩｔＯＩＬ［ＴＹＲＬＥＩＩ Ｇ１．ＹＧＬＹ
ＶＡＬ ＰＩＩＥ ＧＬＮ Ｌ［Ｕ ＧＬＵ
ＬＹＳ ＧＬＹ 八ＳＰ ＧＬＮＬＥＩＩ
ＳＥＲＡｔ−Ａ ＧＬＵ ＶＡし 八ＳＮ ＬＥ
ＩＩ ＰＩＩＯＬＹＳ ＴＹＲＬｒＵ ＡＳＰ
ＰＨＥ ＡＬＡ Ｇｌｕｔ ＳＩＲＧＬＹ
ＧＬＮ ＶＡＬ ＴＹＲＩ’ｌｌＥ ＡＲＧ
ＶＡＬ ＩＬＥ ＡＬＡ ［Ｅ（１以上の連鎖は、
後に示すように公知のヒトＴＮＦ連鎖とある点で類似し
、またある点で区別される。更に、上記アミノ酸連鎖と
ｍＲＮＡ連鎖の最近の分離によって、従来の組換型遺伝
子工学技術によるモジュレータ物質の再生が可能になっ
た。 本発明は更に、このｆ：シュレータ物質により影ヤ！を
受ける活性を抑制する侵入刺激の能力を調べることによ
り、侵入刺激を検出する方法を含む。特に侵入刺激は、
ＬＰＩ 話慴を抑制し、脂肪細胞分化を防止し、或いは
筋肉細胞にお（］るグル〕］−ス取り込みを増大する侵
入刺激の能力により検出される。この方法において、例
えばＲＡＭ２６４．７細胞系に由来するマクロファージ
細胞は、内ｌｉ素、１−リバノゾーマ等の多数の刺激物
質を、比較例として、接種され、一方これと平行して、
細胞標本に感染刺激推定部位からの抽出物を注射する。 この後ずぺての標本は上述の方法により培養され、次い
で同じく上記の方法を用いて一連の分離手順が行なわれ
、比較例及び未知標本から得られる分離物の試験結果を
比較して、発生したモジュレータ物質が（もしあるとず
れば）同一であるか或いは類似するらのであるか、を比
較した。 同様にして、モジュレータ物質の効力を消すために有効
と考えられる薬剤のスクリーニングのためのアッセイ系
を調製した。ある場合には、試験薬剤は刺激を受りたマ
クロファージ標本に対し、モジュレータ物質の生成に及
ぼす効果を決定するために投与することができる。別の
手に１においては、モジュレータ物質は、例えば３Ｔ３
−１．１系などの細胞試験系に導入することができ、予
想される薬剤を生成細胞１８養体に導入し、次にこの１
８苔休に対し、予想される薬剤を中独に添加することに
より、或いは既知モジュレータ物質の添加量の効果によ
って、しシュレータ物質に生ずる変化を観察する。 本発明はまた、本発明によるモジュレータ物質の活性及
び存在を測定することにより、哺乳動物における侵入刺
激の存在を検出する方法に関する。より特定すると、モ
ジュレータ物質の活性は、適切にラベルしたけのこの物
質を使用することにより後に説明したアッセイ法により
直接に調べることができる。或いは、モジュレータは、
ラベルに例えば血清などの培地に導入することのできる
結合パートナ−或いは抗体を作るように使用することが
でき、それによりモジュレータ物質の存在を試験し、か
くして培地をとりだした宿主の感染状態を検定すること
ができる。 このようにして、モジュレータ物質及びこれに対して生
成した抗体の双方を様々の診断技術と関連して使用する
ことができ、このような診断技術は、放射能添加、ホウ
化水素ナトリウムによる還元、或いは放射線ヨウ素処理
法でラベルされているモジュレータ物質に対する抗体を
使用づ゛るような、例えば放射線免疫アッセイを含む免
疫アッセイ法があげられる。 免疫アッセイにおいて、調整子の七ジル−タ物質、その
抗体等を調製し、醇累、特巽結合パートナ−及び／或い
は放射性元素をラベルし、これを侵入を受けていると考
えられる哺乳動物の血液試料中に導入する。ラベルした
物質或いはその結合パートナ−が標本中のレセプタ位冑
と反応ηる礪会をもった後、生成物を公知検出方法（こ
れはラベル処理が行なわれるラベルの性質により変る）
により検査する。 同位元索 Ｃ，１，ｔ−１，１，Ｓ のような放射能ラベルが使用される場合、公知の、現在
採用されているカウント法が利用さ゛れる。ラベルが酵
素である場合、検出は、当業者に知られている比色法１
分光法、蛍光法、気体定準法のいずれかによって行４１
われる。 本発明は、モジュレータ物質活性の定量分析のための試
験キラ１−の形のアッセイ系を含む。 この系或いは試験キットは、上述の放射線技術及び／も
しくはＭＭ技術を用いてラベルをモジュレータ物質にラ
ベルすることにより得たラベルした成分；及び一種もし
くは数種の免疫化学反応剤；とからなり、前記化学反応
剤の少なくとも一種は、前記ラベルした成分、その結合
パートナ−８決定される成分の−・種或いはその結合パ
ー［〜ナー、のいずれかと結合することのできる遊離配
位子もしくは不働態配位イである。 別の実施態様において、本発明は哺乳動物に４３けるシ
ョックの発生防止に関係するある治療方法に関わり、こ
の方法は、モジュレータ物質の存在及びシコック促進活
性の検出、及びその１！２シヨツクの発生防止に十分な
量の、［シュレークに対する抗体を投与することを含む
。よりＴｉ定すると、ここで言及される治療法は、同化
Ｐ？を素１−ＰＩの活性に及ぼリモジュレータ物質の直
接的で茗しい効果に鑑み、モジュレータ物質に対する抗
体の投与による悪液質治療方法を含む。 また、モジュレータ物質は適当な形態で調製され、侵入
刺激に応答してモジュール物質の存在により生ずる悪液
質或いはショックなどの症状にりＮ１シ、哺乳動物を免
疫化するために投与される。更に、侵入刺激に応答して
モジュレータ物質の合成ができなくなるように、動物を
ｖＡ寮し、適訳し、或いは遺伝工学的に改良することが
できる。 従って、動物の肥満症治療方法が含まれ、この方法は、
有効量のモジュレータ物質を適当な組成物の形で投与す
ることを含む。同様に、モジレータ物質或いはその結合
パートナ−を含む薬剤組成物が考えられ、これは、有効
量の成分を要理的に受り入れられるを担体及び／もしく
は他の添加物と共に含んでなる。 本発明の更に別の局面は、腫瘍性の新生物細胞の治療に
本発明モジュレータ物質を補足的に適用することにかか
わる。本発明のモジュレータ物質と腫瘍壊死因子（ＴＮ
Ｆ）との間にＶＡ察される類似性があることから、この
モジュレータ物質はＴＮＦのある秤の活性、叩も腫瘍細
胞を溶解する能力を有することが考えられる。従って本
発明はまた、腫瘍細胞〕ロニ〜を攻′泡し殺滅するため
モジュレータ物質及び／もしくはその適当な配位子を治
療的に投与することを含む。このような場合、モジュレ
ータ物質は適当な吊で、同様な態様でＴＮＦに関し採用
されている処置に加えて投与され、１１Ｉ胞殺滅を行う
ようにする。 正確な投与量、投与方法その他の詳細は、特定腫瘍形態
学に関連して、ＴＮＦについて採用するこれら要木を考
慮して熟練した国名により決定される。 （本発明の目的） 従って、本発明の主たる目的は、哺乳動物におけるある
同化酵素活性に抑制的な効果を与える、モジュレータ物
質の調製方法を提供することである。 本発明の別の目的は、例えば感染などの侵入刺激が存在
づ゛ることが疑われる哺乳動物において、モジュレータ
物質の存在を検出する方法を提供することである。 本発明の更に別の目的は、哺乳動物におけるモジュレー
タ物質の有害な影費とたたかうために効果があると思わ
れる薬剤等の物質をスクリーニングする方法、及び関連
するアッセイ系を提供することである。 本発明の更に別の目的は、モジュレータ物質の活性の有
害な効果を和らげるかそらＶるため、この活性を調製す
る哺乳動物の処理方法を提供することである。 本発明の更に別の目的は、モジュレータ物質或いはその
結合パートナ−をベースとする、治療方法のための薬剤
組成物を提供することである。 本発明の更に別の目的は、本発明のモジュレータ物質を
利用する腫瘍組織の治療方法及び組成物を提供すること
である。 本発明のその他の目的及び利益は、添附図面と関連して
説明される以下の記載を参照することにより、当業者に
は明らかになるであろう。 （本発明の説明） 本発明はその一つの局面においては、本明細害において
七ジル−タ物質もしくはカシエフチン（ｃａｃｈｃｃｔ
ｌｎ）と記載する特定因子の分離及び同定に関し、この
モジュレータ物質もしくはカシエフチンとは、例えばバ
クテリア、ビールス、ある種の腫瘍、プロ１−シア、及
び例えば内ｉｂ素などのその他の毒素のような侵入性刺
激を特徴的に伴う刺激物質と記載する物質により刺激を
受けるマクロファージ（大食細胞）及びマクロファージ
細胞系に存在することが知られている。親出願である米
国特許出願第４１４．Ｏ’Ｊ８号に１１１示される中間
物質に対し、本発明のモジュレータ物質は前記中間物質
の一つの成分であることが確認されでおり、この［ジコ
レータ物質はｌｉ乳類細胞のある種のものに新陳代謝を
生じさけ、それにより層比状態から異化状態に変化さけ
て宿主を侵入性刺激に対し身（８えさせる能力を右Ｊる
ように見える。 特に本発明によるモジュレータ物質は同化酵素リポプロ
ティンリパーゼ（Ｌ、ＰＬ）を作用を抑圧するようであ
り、かくしてこのことは宿主の免疫系とそのエネルギー
貯蔵組織の連通系の一部としての作用を果すことを示唆
している。このモジュレータ物質はまた脂肪細胞の分化
を阻害するようであり、筋肉細胞中のグリコーズの取り
込みを増大するから、理論上、侵入刺激に応じ作用して
脂肪組織、筋肉などのエネルギー貯蔵組織に対し影費を
及ぼし、それにより侵入物とたたかうエネルギーの差し
迫った必要に応するようにすると考えられる。このよう
にしてモジュレータ物質は宿主の細胞活性の異化状態へ
の変換を促進して、侵入物とたたかうエネルギーを供給
しうるようにする。侵入が短期間である場合には宿主は
迅速に回復し消費したエネルギーを補充する。しかし侵
入が連続的であるが慢性的な性質のものである場合には
エネルギーの消尽、悪液質、ショック、そして最終的に
は死に至る。 本発明のモジュレータ物質の一つの態様においては、分
子間がほぼ１７，０００ダルトンであり等電点がほぼ４
．７−４．８である蛋白質を含むことが確認された。こ
の特定されたモジュレータ物質は二〇１体或いはそれ以
上の多母体で存在しており、このことは、その分離につ
いての研究結果から確認されており、実施例■及び■に
記載されている。この試験結果では更にモジュレータ物
質が、ｍ胞の＾い親和性を有する特定の需要体と相互作
用して結合することが確められた。 特に実施例工のデータは、細胞あたりほぼ１０４のＢ親
和性結合部位の存在、及び対応する結合定数（Ｋａ）が
３×１０９であることを示唆している。後に記載するよ
うに、このことは、本発明のモジュレータ物質の活性及
び特に結合機構が明らかに際立っているため、本発明モ
ジュラ−物質と公知技術による既知因子との間の構造的
及び機能的な相違を示唆するものである。モジュレータ
物質の別の特徴は、内毒素に基づくショックを阻止する
ために有効な抗体を発現させることができることである
。このことは実施例Ｘに示されている。 以上に述べた活性のｔよか、本発明のモジュレータ物質
はある活性をもたないという点でも特徴ずけられる。特
に本発明のモジュレータ物質はメディエータ物質（中間
物質）に比し、同化Ａｔ’素アセヂルコエンジム（補Ｍ
素）Δカルボギシラーピと脂肪酸シンセターゼのいずれ
がを抑圧１°る能力をもたないか、或いは赤色細胞の成
長及び分化を阻止する点で異なっている。同様にこのモ
ジュレータ物質は公知因子であるインターロイキン１に
対し、白血球活性剤活性をもたない点でことなっている
。またこのモジュレータはマウスにおける発熱、或いは
筋肉蛋白質劣化を生じさせる能力が欠けているようであ
る。 モジュレータ物質とそのプリカーサ（前駆物質）である
メディエータ物質の双方の特徴を同定するために役立つ
活性の以上のような相違は、後に記載する実施１９１に
極めて詳細に記載されている。 〔シュレータ物質の調製については、先にごく簡単に論
じられており、種々の細胞の培養を開始することにより
、侵入性刺激を生ずる刺激物質を処理しうろことが確認
されている。特に１８１胞系ＲＡＷ２６４．７はプリカ
ーサであるメディエータ物質の調製を開始するために利
用することができ、このメディエータ物質からモジュレ
ータ物質を分離することができる。特に、後に詳細に説
明するようにマウスのマクロファージ細胞系ＲＡ計６４
．７を使用することによって、分析及び精製をするため
に十分なｌの分列を行うことができる。当然のことでは
あるが他の細胞系を用いてモジュレータ物質を分離する
だめのプリカーサであるメディエータ物質、もしくはモ
ジュレータ物質それ自体を調製することができ、本発明
はこのような可能性を除外するものではない。従って別
の手段、例えば遺伝子工学的再現による方法も本発明で
は考慮されている。 本発明によるモジュレータ物質は実施例■に示丈ように
マウスを用いて分Δ１され分析された。 その結果と１〜にみられるような公知の蛋白質腫瘍壊死
因子（ＴＮＦ）に若干類似することがわかった。実施例
■に見られるような実験の完了後の研究により、このモ
ジュレータ蛋白質の完全な連鎖の説明が可能になり、こ
の連鎖は第２３図に呈示さ゛れている。かくして成熟し
たモジュレータ蛋白質連鎖は１５６アミノ酸として定れ
される。 更にこのアミノ酸連鎖に関連するモジュレータの１ＩＩ
Ｉｔ ｔ４ 八を同定され、この開示された蛋白質の組
換型を調製するために採用された。採用された方法は、
内毒素誘導ＲＡＷ２ｆ３４．７細胞からｍＲＮ八を分離
し、ｍＲＮ＾を含む適当なベクター（！ｌ！介体）を調
製し、これを次に大腸菌に導入した。転換は、組換型ブ
ラズミドＤＮＡを用いて高い効率で生じた（即１う、μ
Ｃ００Ｎ＾あたりほぼ１０８組換型細菌）その後合成オ
リゴヌクレオヂドプローブ（長さ４５ｎｐ）が形成され
、溶解パクデリアコロニーによる位置雑種によりｃＤＮ
Ａライブラリーでスクリーニングするために使用され、
連鎖化はジデオキシヌクレオチド法により行われた。 以下の手順は未公開実験の仮枠であり、当業名にはよく
知られた組換型技術の一般原則の多くを採用しているも
のであることがわかるであろう。従って本発明はこのモ
ジュレータ物質の調製にかかわるものであるが、より詳
しくは、公知組換型技術による第２３図に示したアミノ
酸連鎖を有する物質の調製にかかわる。 実施例■に示したモジュレータのアミノ酸連鎖はヒトの
ＴＮＦに類似しているが、多くの特定アミノ酸単位に差
のあることは、蛋白質相互の間に類似性と共に相違点も
あることを示唆している。特に、マウス細胞の刺激に由
来するモジュレータ物質は、人間の腫瘍壊死因子（ＴＮ
Ｆ ）に関して最近得られた公知構造ｆ−夕との比較に
よる実施例■の研究から類似性と相違点とがわかり、相
違点は主としであるアミノ酸残基の数及び性質に由来す
るものであることがわかった。研究の結果更に、マウス
におけるしシュレータ物質のある活性が、ヒトのＴＮＦ
の耐腫瘍性能力に類似する能力であることを示唆してい
ることがねかつＩζ。 かくして本発明の別の局面においては、ある治療能力を
イイするモジュレータ物質が提供され、この治療能力は
、なかでも腫瘍細胞知能の治療について述べた活性のほ
か、非腫瘍竹細胞における同化酵素にかかわる活性を含
む。従って第一の局面においては、本発明は、腫瘍発生
細胞の治療方法を包含し、この方法は、その治療のため
適当な形態と態様で一定［ｉｌのモジュレータ物質を投
与することからなる。 モジュレータ物質或いはその結合体もしくはその伯の配
位子は薬剤組成物の形で調製され、適当なキャリアを含
み、腫瘍を右する息者に対しその治療のため種々の方法
で投与しうるような、適当な強度を右ηるように形成さ
れる。種々の投与方法を採用することができ、例えば皮
下注射、静脈性０４及び腸腔内注射、カテーテル法など
の非軽口投与法が含まれる。モジュレータ物質の平均投
与予は様々であり、特に資格ある医者の判断と処方を基
準にしなりればならない。 これに関連して、このモジュレータ物ｒｉ１は、先に概
略を述べたように非腫瘍発生／ｆｉｌｆ１１についての
治療効果も有し、従って例えば悪ｆ２質、ショックなど
の治療にも使用することができる。 特にこのモジュレータ物質は種々の闘乳動物と抗体自体
をつくりだすことが°でき、この場合、例えば溶解した
ネズミ牌臓リンパ球及び骨髄腫細胞を利用したハイブリ
トーン法のような公知の方法を採用することができる。 生成した抗体を次に適当な薬剤組成物に調製し、侵入性
刺激物を有する宿主に投与して悪液質を防ぐか治療１−
るようにする。 同様にこのモジュレータ物質は動物体に接種しうるのに
適した形にＡ装し、先述のようくべ疾病状態に対して免
疫をもたせるｊ；うにしてもよい。ある用途はｔｚ業用
動物に適用するものである。ｌＪらウシに、適当な薬剤
組成物に調製した免疫笥を接種し、それにより感染した
萌に体重の１０失に対して免疫があるにうにしてもよい
。 更にこれに関連して内毒素耐性マウスの研究により［シ
ュレータ物質の別の治療適用可能性が考えられた。この
適用について、動物は、侵入刺激に応じたモジュレータ
物質の生成に対する抵抗性をｇ４ｉ９にして観察され選
択される。免疫化につぎ、このことは農業用動物に同様
に実際的な適用可能性を付！Ｘｊするちのであり、例え
ばモジュレータ物質を合成することができるという基準
に填づいて選択された雌牛は、細菌或いはビールスの感
染を受けている間引続きミルクを出すことができる。別
の適用ｂ■能性は、動物を頂伝学的に改良してモジュレ
ータ物質の合成に抵抗性のあるようにするものである。 このことは、組換型のモジュレータ物質の調製に関し先
に述べたような公知の遺伝学的技術により行うことがで
きる。 以Ｆに）ホべたような腫瘍治療用途に関し、薬剤組成物
の正確な投与ト（１，投与間隔及び投与方法は、医療に
通じた人、資格ある医師の指示により変動してよい。 同様に悪液７１の治療についてもモジ」−レータ物質及
びモジｌレータ物質に対する抗体の双方を調製づ−るこ
とができ、ショック状態の冶ｆ仝に用いることができる
。投与は先述したような態様で行う。正確な投り吊及び
投与間隔は、被投与名の年齢９体重、全体的な健康状態
及びモジル−タ物質の濃度等を考慮して資格ある医師に
より決定されてよい。 別の治療用途は、モジュレータ物質の決定的な抑圧効果
を利用するものであり、従ってモジｌレータ物質は肥満
症の治療に用いられる。このような場合、適当な薬剤組
成物に調製されたモジュレータ物質は資格ある医師の処
方通りに肥満状態の患者に投与され脂肪分を除去し、そ
れににより肥満状態を軽減する。 本発明はまた様々の診断用途に適用され、これは、本発
明のモジュレータ物質により影費を受りる活性を限定す
る侵入性刺激を検出する方法を含む。既に、述べたよう
に、モジュレータ物質は種々の方法によってそれ自体の
抗体を作るために使用することができ、このような抗体
は分離して、疑わしい浦乳類宿主におけるモジュレータ
物質の存在を試験するために使用することがＣぎる。 しシュレータ物質に対する抗体は、よく知らｈｔζバイ
ブリド−７？人を含む標準的な方法でつくって分離する
ことができる。抗体はあたかも抗体に対する抗原である
かのように、別の秤に使用ザることもできる。いずれの
型の抗体もモジュレータ物質活性の存在と程度を決定す
るために使用することができる。便宜のため、モジｌレ
ータ物質に対する抗体を以下の説明ではＡｂ、と記載し
、別の種に適用される抗体をＡｌ１２と記載する。 侵入性刺激を保有していることが疑われでいる宿」−に
おりる［ジルレータ物質活性の存在（よ、このような目
的に適用される通常の免疫学的手順により確められる。 多くの有用な手順が知られている。特に有用な三種の手
順においては、検出可能イ１ラベルでラベルしたモジル
−タ物質が利用されるか、検出可能なラベルをラベルし
た抗体Ａｔ）ｌ 、もしくは検出可能なラベルでラベル
しＩご抗体Ａｂ２が利用される。これらの手順は以下の
式に要約される。式中の星印（１；）は粒子がラベルさ
れていること、また“’Ｎｏｄ”はモジｌレータ物質を
指ず： △、 ＨＯｄ ” ＋ΔＩ）＋ ＝ＨＯｄ ” Ａｂ＋
１３、Ｈｏｄ−＋ 八ｌ］＋ ＝ＨＯｄＡｂ １
＊Ｃ，Ｎｏｄ → Ａｂｌ 十 八ｂ２
＝ＨＯｄＡｂ Ｉ Ａｂ、 ”これらの手順及びその
適用はすべて当業者にはよく知られているものであるか
ら、本発明の範囲内で利用でさる。“競合的″な手順で
ある上記への手順は米国特許第３．６５４．０９０号及
び３、８５０．７５２号に記載されている。゛慣ナンド
イッヂ″の手順Ｃは米国再発行特許第３１，００６号及
び米国特許第４．０１６．０４３弓に記載されている。 これ以外の手順、例えば°゛二’ｔＫ体″法或い（ま“
″Ｄ八へＰ”法などら知られている。 い−リ゛れの場合でｂＴ：シュレータ物質は抗体もしく
は結合パー１ヘブーと複合体を形成し、複合体の一構成
体は検出可能なラベルでラベルされている。複合体が形
成されていること、及び必要な場合その１ｎがどれ位か
、はラベル検出に適用される公知の方法で決定すること
ができる。 以上の説明からΔｂ２の特徴的な性質は、これが＾ｂｌ
と反応することであることがわかる。これは、ある哺
乳類でつくられたＡｂ＋が抗体＾ｂ２を生成するための
抗原として別の種の哺乳類動物に使用されたからである
。例えば、Ａｂ２は抗原として＾ｂ１を用いて山羊で生
成することができるが、この＾ｂ２は従って抗ウサギ抗
体となりうる。このことの説明の便宜のためＡｂ＋ を
モジュレータ物質抗体と記載し、＾ｂ２をモジュレータ
物質抗体と反応する抗体、もしくは゛抗−抗体″と記載
する。 これらの研究のためにもつともよく使われるラベルはｔ
ｌｌ用性元素、酵素、紫外線にざらされた時には蛍光を
発する化学薬品等である。 ラベルとして使用することのできる多くの蛍光物質が知
られている。これらは、例えばフルオレセイン、ローダ
ミン及びオーラミンである。 特定された検出物質は、山羊中につくられイソヂオシア
ネートれによりフルオレセインと共役結合する抗つリギ
抗体である。 モジュレータ物質或いはその結合パートナ−らまた放射
性元素或いは酵素でラベルすることができる。放射性元
素は今日入手することのできるいずれかのカウンｌ一手
段によって検出可能である。好ましい同（り元素 Ｃ，
Ｉ、 Ｈ。 １２５ 、、及び３５ｓである。 酵素ラベルも同様に有用であり、現右利用することので
きる比色法９分光光磨法、蛍光分光度法或いは気体定量
法によって検出可能である。 酵素は、例えばカルボジイミド類、ジイソシアネート類
、ゲルタールアルデヒド等の架橋分子との反応により、
選ばれた粒子と共役結合１゛る。 これらの手順に利用することのできる多くの酵素が知ら
れている。 好ましいものはパーオキシダーゼ、β−グルクロンダー
ぜ、β−Ｄ−グルコシダーゼ、β−Ｄ−ガラクｌ−シダ
ーぜ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ、とパーオ
キシダーゼ、酸）４スフアターぜである１、米国特許第
３．６５４．０９０号。 第３．８５０．７５２号及び第４，０１６，０４３号は
例としてラベル物質及びその方法について開示している
。 本発明に従って開発され利用されるアッセイ（検定）系
はレセプタアッセイとして知られている方法である。レ
セプタアッセイにおいては、アッセイ（検定）される物
ｎ Ｌ、Ｌ適切にラベルされ、次いである細胞質試験コ
ロニー、例えば３Ｔ３−１１細胞系が先ず分化され、次
いである量のラベルされた物質が接種される。その後、
ラベルされた物質がどの程度細胞しけブタに結合したか
を決定ザるための研究がなされる。このようにして物質
相互の間の差異がｒｌｌＦ１課される。この手順は特に
後に５１丞する実施例■に述べられている。 かくして、実施例■に詳細に示されているように、ある
（ｊｌのモジュレータ物質が放０＝１色元累でラベルさ
れ、その後最近分化した３Ｔ３−Ｌ１１胞を用いて結合
度の研究が行われる。種々の量のラベルしたモジュレー
タ物質を含む溶液が！′１製され、細胞標本に接種され
その後培養された。 １（７られた＠Ｉ Ｉｔ’ｄ甲層を洗浄し、溶解し、標
準誤Ｚ″が５％以下となるのに十分な時間ガンマカｆク
ンターでカラン１−シた。このデータを次にスキ１！ッ
チＶ−ド（５ｃａｔｃｈａｒｄ ）分析処理し、そノ復
物質活性に関する観察及び結論が出された。以上の手順
は例示的なものであるけれども、アッセイされる物質の
細胞結合能力が特性となる場合にしけブタアラレイがど
のように行われ利用されるかが叩解されよう。 本発明の別の態様においては、医療専門家に使用される
のに増した商業的な試験キットが装造され、これは疑わ
しいへ１ｉ乳類宿主にＪハノるモジュレータ物質活性の
存否を決定するために使用される。上述した試験方法に
従いこのようなギッ１−の一種は少なくともラベルした
モジュレータ物？１もしくはその結合パー１− ノー
−、及びこれに特５′４性のある抗体を含む。別のちの
は少なくともへｂｌ とラベルしたＡｂ２を含む。史に
別のものは少なくともＡｂｌ と更に、もらろん選択さ
れる方法、例えば“′競合法″、゛サンドイッチ法”
、 ”ＤＡＳＰ法“°９等の方法に従い指示書を含む
。このキラ１〜は例えば緩衝剤、安定剤等の補助反応剤
を含んでいてもよい。 かくして、侵入性刺激に対する桶乳動物宿主の反応を顕
示するための試験キットは下記を含む： （イ）モジュレータ物質もしくはこれに特異性のある結
合パーｉ−ナーを、直接或いは間接に、検出可能ラベル
でラベルすることにより得られる所定５′Ｉの、少なく
とも一種のラベルした免疫化学反応成分； （ロ）他の反応剤；及び （ハ）４−ットの指示書。 より特定すると、診断キットは下記を含む：（イ）免疫
溶剤を生成するため一般的に固体相に結合されるか、或
いは適当なタグ札などの最終使用形態に結合されている
公知間の上記モジュレータ物質（もしくはその結合パー
１−ナー）； （［ｌ）必要によりその他の反応剤；及び（ハ）このよ
うな試験キットの使用説明書別の実施態様においては、
試験キットは共）本の目的を達成するために作られ使用
され、所定の処方（例えば゛競合法°′、゛サンドイッ
ヂ法ｆＴ、ＬＬ二川用体法″等）に従って作用するもの
であって下記を含む： （イ）モジュレータ物質を検出可能ラベルに結合するこ
とにより得られるラベルされた索子； （ロ）一種もしくは数種の補足的な免疫化学反応剤であ
って、そのうちの少なくとも一種は配位子もしくは不動
配位子であり下記の群： （１）ラベルされた素子（イ）と結合することのできる
＾ご位子； （ｆｉ）ラベルされた素子（イ）の結合パート太−と結
合することのできる配位子：（ｉｉｉ＞決定される成分
の少なくとも一種と結合することのできる配位子； （ｉｖ）決定される成分の少なくとも一種の結合パート
ナ−の少なくとも一種と結合することのできる配位子；
のうらがら選ばれる配位子である反応剤； （ハ）Ｆシュレータ物質とこれに特異性のある結合パー
トナ−との免疫化学反応による一種もしくは数純の素子
の検出及び／らしくは決定のため、処理を行うための指
示店。 以上のように、モジュレータ物質と反作用するのに有効
な潜在的な薬剤をスクリーニングするためのアッセイ系
が調製される１、第１手順では、試験薬剤が刺激を受り
たマクロファージ標本に投与されて、モジル−タ物質の
生成に及ぼす効果を決定する。別の手順では、モジュレ
ータ物質は３Ｔ３−ＬＩ系のような細胞試験系に導入さ
れ、考えられる薬剤が生成する細胞培養体中に導入され
このｍ Ｆ３首体は、薬剤の添加により、或いは公知モ
ジュレータ物ｖ１の添加１１１の効果がら、モジュレー
タ物質活性の変化が観察される。 既に述べたように、以下の実施例はＥシュレータ物質の
分離及び同定の詳細を示すものであると共に、このモジ
ュレータ物質と、出願人或いは当業界の人々によって既
に特定されている因子との間の活性の相違及び類似性を
示づ′ような活性にかかわるＩＩＱ察が示されている。 当然のことながら以下に示すような特定の物質及び方法
は単に説明のためだ１ノのものであり、従って以下の例
は本発明を限定するものではない。 （実施例） 凋旌Ｍユ 本実施例においては、３Ｔ３−Ｌｌｉｌｌ胞からのモジ
ル−タ物質の分離が行われる３４分離物の研究の結果、
これは１７キロダルトンの蛋白質であって、特定の畠親
和竹レセプタによＶ〕脂肪細胞及びいくつかの伯の細胞
型に結合するものであることがわかった。 割几又髪刀ユ ｕと月旦ｎ１″″ びバイオアッセイ： ３Ｔ３−１
−１細胞を１ウエルあたり１００，０００細胞の密度で
２４ウエルのリンプロプレート（フローラボラトリーズ
、インナーボレーテッド社製、バージニア州マクリーン
）に培養した。培地は１０％雌牛血清を補充したダルベ
コ社の修正イーグル培地（ギブコラボラトリーズ社製、
ニューヨーク州グランドアイランド）を用いた。 ３７℃で１０％ＣＯ２雰囲気中においた。培地は１日お
きに取替えた。１週間後、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ
） 、１０μｑ／１！のウシインシュリン、０．５ｍＨ
メチルイソブチルキサンチン及び１０ｎＭデキリメタゾ
ンを補充した培地で４８時間培養することにより細胞は
分化した。分化した細胞は、１０％ＦＢＳ及び５０ｎｇ
／ｌｆウシインシュリンを含む培地（１日おきに取替え
た）中で、１週間後バイオアッセイ或いは結合検査のた
めに使用するまで保持した。 ０．１ｘｉの８量のアッセイされる標本が、それぞれ１
．Ｏｉｆの培地を含む分化３Ｔ３−１１細胞の夫々のウ
ェルに適用され、１２乃至１８時間３７℃で、１０％ら
２Ｉ８養器中に７ｊかれた。この培７１の終用に培地は
吸引され、１０％ｒＢｓ 、 ５０ｎ（＋／ １１−１
’ンシ１リン及び１０ ＩＩ ／ ｘｉヘパリンを含有
Ｊる０、５’ｌｌの０１４［と交換した。３７℃で１時
間後、ヘパリン解放可能なＬＰＬ活性を、ニルソンーエ
ール及びシ］ツツ（Ｎｉｌｓｓｏｎ−Ｅｈｌｅ ａｎｄ
５ｃｈＯｔｚｌ法により測定した。 ＬＰＩ−活性Ｘを有する標本中の全ＬＰＩ抑圧比率（Ｐ
ＴＳ） ｔよ次のように定義された。 ＰＴＳ ＝ （
Ｃ−Ｘ／Ｃ−１）Ｘ１００ 、ここで、Ｃは粗メディエ
ータ（中間物質）にさらされていない３Ｔ３−Ｌ１細胞
のつＴルによりつくられるＬＰＩ活性であり、ま／＝ｍ
はヘパリン化培地中独のＬＰｌ、活性である。日毎のア
ッセイ変化を避けるため、この未知標本結果を、すべて
のバイオアッセイに含まれる粗中間物質の標準試料と比
較した。粗メディエータ物質のこの標準試料は小さな管
に部分標本化され、−８０℃で保蔵された。バイオ活性
の１ｕは、１０１！アツセイ系に標準試料１．０μノを
添加した場合に対応するＰ［Ｓを産出するカシエフチン
の聞と規定された。粗メディエータ物質の標準溶液の使
用もまた、未知標本に存在ＪるバイオｆＪ ！ｊｌの量
の直線的な予想量を確認するものであった。 メディエータのｌｔ￥ｉ：Ｒへ計６４．７細胞を生成さ
せ、５％Ｃｏ２雰囲気中で３７℃に保持したＲＰｌ中に
合流させた。メディエータ分泌の誘発前に、ＲＡＷ２８
４．７細胞を、ｐ１１７．４の２５ｍＮヘーベス（ｌｌ
ｅｐｃｓ）（リサーチオーガニツクス、イン］−ボレイ
テッド社製、オハイオ州クリーブランド）で緩衝させた
ハンクス（ｆｌａｎｋｓ）平衡食塩溶液（ギブコラボラ
トリーズ打￥Ｊ）で洗浄し、汚染自消蛋白質を除去した
。それぞれのフラスコを、１μｑ／ｍの大腸菌ＬＰＳ
（ディフコ ラボラｌ−リーズ相製、ミシガン州デトロ
イト）とｐＨ７，４の５０ｍＮへ一ブスを含有する１
００ ｉｆのＲＰＨＴ１６４０培地で刺へした。３７℃
で２２時間培養した後、培地を０．２２μｍのフィルタ
ーで濾過し、−２０’Ｃで凍結した。 メディエータの１・ｊ：８５５ｙｆの凍結貯蔵培地を融
解し、ＰＨ−１０フイルター（アミコンコーボレーシコ
ン礼製、７１１チューセツツ州ダンバース）ににす、撹
拌セルを用いて４°Ｃｒ５０ｐｓｉの窒素雰囲気化で濃
縮した。最初の８量の２％に濃縮した後、得られた蛋白
質溶液を蒸留水で繰返し希釈し、等１焦点化する前に標
本の脱塩化をりるように再濃縮した。 等１焦点化は、４００ν！の容量をもつ水冷コラム中で
４℃の温度下で行われた１、このコラム中で、中心部に
蛋白質標本が層化するようにしてグリセロール勾配が以
下のように調製された：４０乃至２１％（容量／容量）
のグリセロールの直線勾配が加えられた；標本（よぜ／
υ動性ポンプで供給された；１９乃至０％（容量／容ω
）のグリセロール勾配が、標本上に層化された１、勾配
の上半分及び下半分の両方に、水で１＝１６に希釈され
たｐ１１３−１０のサーバライｌ−［５ｅｒｖａｌｙｔ
、ｃ） （サーバファインバイオケミカフ１１社製、
ニュー三１−り州ガーデンシディバーク）を含むように
した。標本はその無塩淵厚液（５５ν！容帛）を４３１
１のサーバライｌ−，ｐＨ１３−１０，及び１６７０の
グリセロールと温合することにより調製した。陽極溶液
〈コラム底部）は４０％グリセ［Ｉ−ルに溶かしたＯ、
０４）ｌのイシドジ酢酸であり、陰極溶液（コラム上部
）は１」２０に溶かした０、０１Ｍ玉チレンジアミンで
あった。分−１は初期′市流１８ｍＡ。 初朋雷圧６３０Ｖで行われた。電圧は、処理中電流が低
下すると増大したが、出力は＋６Ｗを越えないようにし
た。 ２４時間後、コラムから重力により １５０滴の断片が
導出された。沈澱した蛋白質は、４℃で２０分間にわた
り３．０００（Ｉの遠心分離ににり除去された。フェノ
ールレッド溶液の滴がそれぞれの上澄液に添加され、酸
性標本は、飽和三塩基りん酸ナトリウム液を添加するこ
とにより中和され、１７ｊ基性標本は３０％りん酸溶液
の添加により中和された。カシエフチンバイオ活性は、
それぞれの断片のバイオ活性のピークに対応する２μ）
をアッセイづ−ることにより決定され、ピーク断片は更
に精％ｔｌ−るためにプールされた。 プールされたピーク断片は、両性電解質及びグリセロー
ルを除去するために、ダルベコのりん酸１ｎ緩ｋ［食塩
水（ＰＢＳ） （ギブコラボラ１〜リーズ社製）を用
いて数回にわたり透析した。透析された物質（容積９４
ｉｆ）を、ベッド容積が２０７１どしてコンカナバリン
△（ＣＯＮ＾）レファローゼコラム（ファーマシアファ
インケミカルズ礼装、スウェーデンウプサラ）に通過さ
けた。補足的に１０１！のＰＢＳを、この樹脂に通過さ
せるようにし、濾過残留物と共にプールした。、濾液を
４℃の蒸留水を用いて２回透析し、凍結乾燥した。 ｐＨＧ、８の３０ＩＩＭ トリー１１０１緩衝液、５％
グリセロール、１ｍＨのβ−メルカゾトエタノール及び
０００２％のブロムフェノールブルーを含有する２１！
溶液中で標本を再溶解し、非変質状態で゛ｄｆ気泳動さ
せた。この標本を、６−１３％の直線ポリアクリルアミ
ド勾配の、１．５１１１１１Ｘ １４．２Ｃ１１Ｘ１３
６１径の手法ゲルからなる積重ねゲルを通した。トリグ
リセリン緩衝系は次のように使用された：陰極緩衝液は
３８１１Ｈトリ塩基及び４０ｍＭグリセリンであっｌこ
；陽極緩衝液は６釦Ｈトリ塩基及び５０ｍＨＩＩｃ＋で
あった；積重ねゲル緩衝剤はｐ１１６８の０．４２５１
−−１１ｃＬであった：また分離ゲル緩＋Ｐｉ液ハＤｌ
１８．８（ｍ終部Ｕ ） （１） ０．３７５Ｍ ト’
） −ｔｌＣｌ−であった。アクリルアミド（２９２％
）に加え、この七ツマー溶液は０８％のビス−アクリル
アミドを含んでいた。不純物を除去するために、この七
ツマー溶液はアンバーライト）ＩＢ−１樹脂（マリンフ
ロート看製、ミズーリ州セントルイス）を用いて一晩撹
拌された。 標本は、ブロムフェノールブルーマーカーゲル底に達す
るまで２０ｍＡの定常電流で４℃の４叶で電気泳動した
。電気泳動終了後、１ＣＴＩｌのゲルを手法ゲルの側縁
から除去した。何故なら′電圧によってこれら側縁戚に
水平でない移動が生じたからである。残るゲルは２加間
隔で水平にスライスした。夫々のスライス片をポリプ［
〕ピレン管中の２１！の５０ｍＨ手炭酸アン七ニウム溶
液中で１２時間ゆるやかに撹拌して拡散させることによ
り、スライス片から蛋白７１が回収された。 電気溶餠は、フランシス、１１．Ｔ．、ジュニアほかに
よりＪ 、 ＣＩＩＲＯＨ＾ＴＯＧｆｔ． 、 ２９８
・１１５． １９８４年，に記載されているようにして
、管状ゲル装置中で３、５００ダルトンのカットオフ透
析膜を用いて行われた。 かくして１ワられた断片はその活性がアッセイされ、純
度を測定するため、Ｊト還元及び還元状態で１０−１５
％の直線勾配ゲル中に硫酸ドデシルナトリウム（ ＳＯ
Ｓ−ＰＡＧＥ ）を含有する非変質系において、ポリア
クリルアミドゲル電気泳動が行われた。蚤白質帯は、レ
イ、 Ｅ （Ｗｒａｙ，ＩＥ）ほかによりＡＮ＾ｌ 、
８１０ＣＨ［Ｈ、１１８：１９７． １９８１年，に
記載されているようにして、銀痕跡により視覚化された
。 ′ コラムクロマト ラフイ：ゲル瀘化は、ｐＨ７．８
の０． １ｔｎＨ重炭酸アンモニウムで平行させた、７
ｍｍＸ１ｍのガラスコラム中の１１グレードのしファデ
ックスＱ−７５（ファーマシアフ？インケミカルズ社Ｉ
胃）を用いて実施した。カシエフチンサブユニットの大
きさを決定するための実験において、酵素グレード尿素
（ベロダリザーチラボラ１〜リーズ社製、メリーランド
州ベセダ）を標本及び溶離液に添加し、断片は、バイオ
アラレイのｊｉｆｆに個別にＰＢＳｒＪ析した。 ｔり川［ヨｅ素 カシエフチンによる！１：精製された
カシエフチンはヨード法により放射性ラベルをした。遊
離ヨウ素は、セファデックスＧ−２５ゲルによる濾過及
び透析により除去した。 結合検査は、最近分化した３Ｔ３−Ｌ１細胞（０，２ｍ
ｆ径あＩこり４Ｘ１０Ｊｌｌ［胞）を含む２４−ウェル
リンプロプレー１−を用いて実施した。結合検査のため
に使用される溶液は、１０％ＦＢＳ 、 ５０ｎｇ／ｙ
ｆインシュリン、及びＤｌ＋７．４の５０ｍＨへ−ペス
緩ゆ１液を含有するＤＨＥ １８地からなる。種々の闇
のラベルしたカシエフチンがこの溶液に添加された。特
に注意することがない限り、ｊ８養は氷の上で４日間、
ゆるやかに撹拌しつつ実施された。次に細胞単層が、１
０の１Ｈの−０１１で溶液化した１０１ノの培地で３回
洗浄され、ガンマカウンターを用いて標準誤差かく５％
となるのに十分な時間カラン１〜された。 筋肉細胞ラインＣ２（スタンフォード大学メディカルス
クールのへレンブラウ教授の手による。 カリフォルニア州バロアルト）ちまたカシ１クブン結合
のため分析された。細胞を成長させて、２４−ウェルの
リンプロプレー１−に合流するようにした。プレートは
雌牛皮膚コラーゲン（カルバイオケムーベーリングコー
ポレーション４゜カリフォルニア州うジョラ）を用いて
予備処理した。予備処理は、３５１１水中で５０７ノ１
ｇのコラーゲンをオートクレーブ処理し、殺菌溶液を、
プレーｊ−あたり２４のウェルのそれぞれに適用でるこ
とにより行われた。次に溶液を吸引し、プレートを、積
層流フード中の紫外線により乾燥するにまかせた。使用
された成長培地は、２０％ＦＢＳ及び０．５％ニワｌ−
り肝油出液（ギブコラボラトリーズ社）を補充したＤＨ
Ｅであった。培養体は、５％ら２雰囲気中で３７℃に保
持された。措）ａ（ま毎日変えられ、細胞は、２％ウマ
血清（ギブコラボラトリーズネ」）を含むＤＨ［を添加
することにより合流するようになった時に、筒管を精製
するように誘導された。４８時間後、ｍ胞は結合検査の
ために使用された。０２筋管に結合するカシエフチンの
測定は、３１３−Ｌｌｌｉ［１１胞について記；戒した
のと同様の方法で行われた。 ＮＣ３１ｆｌｔマウスがロックフェラー大学のラボラ１
−リー アニー？ル リサーチ センターから得られた
。マウスの赤血球（ＲＢＣ）が、既に述べたようにヘパ
リン化マウス血液を微結晶セルローズを濾過さぼること
により得られた。牌臓リンパ球は、フィコール−ハイバ
ック（）７−マシアフアインケミカルズ礼）による沈澱
法によって１９られた。赤血球及びリンパ球に結合する
力シエクヂンの測定は、３Ｔ３−１１細胞の場合に採用
されたのと同様の手順により行われた。しかしながら、
ラベルしたカシエフチンの培養が１．５１のエツベンド
ルフ管（プリンクマン インストルメンツ社、ニューヨ
ーク州ウェストベリー）中で行われた。４ｘｉｏ’マウ
スＲＢＣ及び１×１０７マウスリンパ球がそれぞれの結
合アッセイで使用された。マイクロフユージ（ベツクマ
ンインストルメンツ社、カリフォルニア州フラーｌ〜ン
）を用いて４℃で３度遠心分離処理を行うことにより洗
浄が完了した。細胞のベレッｌ〜は直接にカランｌ−さ
れた。 相肝細胞膜は、ｐＨ７，４の５ｎＭヘーぺ、４１０１ｆ
中に、２ｑのマウス肝臓（湿重量）を均質化ザることに
より得られた。このホモジネート（均質体）を同じ緩衝
液で５０ν！に希釈し、５分間４℃ぐ、２００Ｑで遠心
分離した。Ｆ澄液を２７１１の一定部分に分割し、１０
分間のスピンで４８．０００ Ｑにベレット化した。Ｖ
ｌられたベレットはそれぞれ０゜５１！の、１０％「Ｂ
Ｓを補充したＤＩＥに懸濁化し、これにラベルしたカシ
エフチン＜１ｎｇ／ｘｉ＞を、ラベルしていないカシ■
クブーン（３００ｏｇ／ｒｆ ）とＪｔに、或いはこれ
を含めることなく添加した１、結合は４℃で４１１！１
間で生じるようにした。膜、４８．０００ｏの遠心分離
により、新鮮む１８地を用いて３回洗浄した。ベレット
はその敢Ｑ４活竹が力ラン１〜された。 インターロイキン１（ＩＬ−１盾」、のアツセイ：これ
（よ、標準試料として組換型１１−１を用いて既に述べ
たようにして行われた。 此肛亘豊広淀；蛋白質濶度の測定ｔよ、市販のコーマツ
シーベースによる蛋白質反応剤（バイオラド ラボラト
リーズ社、カリフォルニア州すッヂモンド）を用いて行
われた。 旌里 ＲへＷ２６４．７ からのカシェ欠しλ立盈ｌ盈互
★゛−にお１する’ｆ＠：５ｏｉｌの培地中の一１０５
Ｕのカシエフチンのバイオ活性が、１０８ＲＡＷ２６４
．７細胞を含む融合性フラスコから得られた。この粗メ
ディエータの特徴的な活性は、−４ｘ １０５Ｕ／ｍａ
蛋白質であることが定期的に観察された。 極く少量の補足的なカシエフチンは、細胞をＬＰＳど共
に長く培養することにより、或いはＬＰＳを含む新鮮な
培地で再刺激することにより１ｑられた。対照的に特有
な活性の片鱗は、このような試みがなされた時に観察さ
れた。 中性ｐＨで一２０℃で粗試料を数週間保蔵した後でも、
或いは４℃で５日間保蔵した後でも、バイオ活性の旧失
みられなかっｌ、：、、シかしながらバイオ活性はｌＳ
！２竹、 ａｌｌでは不安定であることが観察されてお
り、ａｌｌ５．０で４℃で２４時間後には゛ト分になっ
ていた。低い１）１１にお（）る不安定性は、２０％グ
リセロールを添加することによって減少する。このため
、等１焦点化は、サッカローゼよりもグリセロール中で
行われ、この処即はできるだけ迅速に行う。 ｒ び入゛１−一 ：バイオ活性は、述べてきたよ
うな条何下で圧力透析が行われる場合には保有物質と排
他的に結合している。５０倍濃縮化後の回収率は通常〉
９０％であり、表１に見られるようにしばしば極めて高
くなる。人工のデータは代表的な分離法の場合の数値で
ある。 表■ 手順 容積 全活性 全蛋白質
特異活性 精製 回収率Ｍ１ｕ １
１１ｇＵ／ｍａ ＄未濃縮組体
８５５ ２．５ｘｌＯ’ ５３．９
４．６ｘ１０５ ・・・ １００淵縮粗休
５４ ２．７ｘ１０１３８．９
６．９ｘ１０５１．５ １０８等電流点化
９４ １．５ｘ１０７３．８８ ３．９Ｘ１０
Ｇ８．５ ６０コン−Ａセファローゼ １０４
１．４ｘ１０７２．７８ ５．０ｘ１０６１１
５Ｇ非変質化 １．ｌＸ１
０６０．０３ １．８Ｘ＋Ｏ’ ８０ ２
濶縮化物質の等定焦点処理によりバイオ活性の等電点は
４．７であることがわかった（第１図）。両性電解質そ
れ自体はバイオアッセイを干渉しない。等電焦点化後の
バイオ活性の回収率は変ｆ）Ｊ Ｌ （１０−６０％）
、士としてコラムに添加される蛋白質の全量に依存した
。等主焦点化中のバイオ活性の低下は、粗濃縮物中に存
在する伯の蛋白７１とカシエフチンとの」を回向な沈澱
反応の結果であるＪ：うに見えた。何故なら収率の低ざ
は、蛋白質の大ｆｉ１の分離及び沈澱物の天量の精製と
関連しでいたからである。等主焦点化前に、粗メディエ
ータ物質に添加されるトレーサとしての放射性ラベル精
製カシエクヂンにかかわる後の実験は、この結論を支持
するものであった。９量の標本（蛋白質全量が５０ｍｇ
或いはこれ以下）をコラムに添加、グリセロール勾配の
使用、及び分離時間を短くすることにより（２４時間或
いはそれ以下）、また分画化復標本を直らに中和するこ
とにより、回収率は最大となった。 コンＡ−セ’７７０−ズ Ｃｏｎ 八−３ｅ ｒａｒｏ
ｓｃり止しΣ叉うｌヱ：いくつかの蛋白質種が、バイオ
活性の損失が殆どないか全くないコンＡ−セファ０−ズ
による親和性クロマ１−グラフィににり除去された。コ
ンＡ−セファローズを天吊に使用した場合には、カシエ
フチン活性の回復は低いものであった。これは多分この
樹脂との疎水性相互反応によるしのであろう。何故イ≧
ら、活性はＯ，ＩＨのα−メヂルマノサイドの添加によ
っては解放されなかったからである。 ページ：１１変質状態下でページ（ＰＡＧＥ）後、巾−
の蛋白質帯域と関連した、ゲル上のある位置でバイオ活
性のすべてが観察された（第２，３図）。この段階でバ
イオ活性の１０−２０％のみが、電気泳動によって或い
は蛋白質を希釈重炭酸アンモニウム緩衝液中に蛋白質を
拡散さけ゛ることによって、スライスしたゲルから回復
した。拡散時間を長くすること、抽出を繰り返すこと、
及び多聞の緩衝液を使用することは、殆ど効果がなかっ
た。回復は、高濃度の標本をゲルに適用することにより
、また精製アクリルアミドモノマーをゲル試料に使用す
ることにより最大となった。 ｔ″″゛ 鉛に９ されたカシエフチンのＳＯ３−ハ貼
且ｌ：分離物の見掛けの均質性は、５ＯＳ−Ｐ Ａ、Ｇ
Ｅ系における電気泳動によって確認された。 ＳＯＳゲルに適用された、カシエフチン活性と関連する
精製蛋白質は、分子量１７．０００の唯一の帯域をもっ
ていた（第３図）。粘装カシエクチンのマイクログラム
■がＳＯＳゲル中で電気泳動処理されると、バイオ活性
は電気溶出によって固定されていないスライスから回復
した。この活性は１７，０００の分子量の蛋白質の存在
と一致していた；バイオ活性はゲルの他の域からは得ら
れなかった（第４図）。 ′ カシエフ ンの′吊：カシエクチンの粗濃縮物をセ
ファデックス（５ｅｐｈａｄｅｘ ） Ｇ−７５ゲル濾
過により分析したところ、バイオ活性溶離プロフィルは
、分子ｈ１が＞ ７０．０００であることを示した。し
かし粗濃縮物が６Ｍ尿素の存在下でゲル濾過により分離
された時、１７，０００ （デキストランスケール）の
分子ｍが得られ、このことは他の蛋白質との非共役マル
チマー或い（ま凝固体の生成を示唆している（データは
示されていない）。 精製カシエフチンがＳＯＳゲル上で分析された時、還元
標本及びノド還元標本共に、１７，０００の見掛は分子
量を示した。セファックスＧ−７５コラムによる精製力
シェフチンのゲル濾過によってｉｔ Ｈされた分子量は
３５，０００であり、このことは非共役二量体の存在を
示している（データは示されていない）。 ｔＪ１ｇＡ線ヨ ）処理 び 今の研カニ精製ホルピン
がヨウ素法により ■を放射線ラベルされた。〜７０
％のバイオ活性が回収され、最初の特異活性は〜１ ｘ
１０６ｃｐｍ／μｇ蛋白質であった。 このラベルされた物質を５Ｏ８−ＰＡＧＥ処理をして、
スライスしたゲルを測定したところ、放射能の殆どは分
子ｆｆＩｔ１７，０００の蛋白質と関連していた。 クロールアミンＴを使用した蛋白質をラベルする試みは
、バイオ活性の完全なｎ失に終った。 精製した、放射線ヨウ素化ホルモンは迅速かつ特異的に
、３７℃及び０℃の両方で培ａ３Ｔ３−１１脂肪細胞と
結合した（第５八図及び５Ｂ図参照）。 ラベルしないカシエフチンの２５．０００１１／ｙｆを
添加した結果は、検査したすべての時点でラベルした蛋
白質による結合を阻害した。説明した条件下で、２−３
時間以内に平行状態になった。結合したラベル最の、時
間に依存する減少が３７℃で観察され、これはおそらく
レセプタにより媒介されるエンドザイ＋−−シスを反映
している。 結合特性はスギ１７ツチ１１−ド（５ｃａｔｃｈａｒｄ
）分析により検査されたく第６八図）。このデータは細
胞あたり〜１０４高親和性位置の存在及び３×１０９の
関連定数（ｋａ）を示唆している。分化３１’３−１１
細胞及び未分化゛前脂肪細胞″の双方が、同様の親和力
及び密度を有するレセプタを保有していた。筋肉細胞系
Ｃ２も特異カシエフチンレセプタを保有しており、この
場合にも細胞あたり〜１０“高親和性位置と、３ ｘ
１０９のにａが観察された（第６８図）。マウス肝臓膜
試料もまた特異カシエフチン結合を示した。一方、赤血
球及びリンパ球は検出可能な量のカシエフチンレセプタ
が欠けていた（細胞あたり＜ ２０（１＋ピー）。 ＩＬ−１汗 のアッセイ：同様の大きさ、組織発生及び
内毒素、Ａ導性の観点から、分離される蛋白質がＩＬ−
１と同じであるように化えられた。 ｒｔＡ吋６４，７朋ロ胞により精製する多ｌ′Ｉｌのカ
シ１クチンは、しかしこれがそうではないことを示唆す
るものであった。特に、カシエフチンを引き出すために
使用される条件下でロイコサイト活竹化囚子（ＬＡＦ）
活性により測定されるように、細胞はごく（午かの１ｌ
−ＩＬか生成しないことがわかったからである。 精製カシエフチン試料は、組換型ＩＬ−１がｉＱ−１１
Ｍで検出されるような条件下で、１ｍＨまでの広い範囲
の濃度にわたってアッセイされた時にＬＡＦ活性が欠け
ていた。更に、高度に精製された組換型Ｉ［−１のマイ
クロモル濃度のものは、レセプタ結合について放射線ヨ
ウ素化カシエフチンに匹敵するちのではなかった。従っ
てカシエフチンはＩシー１から区別されるように見える
。 厳１ 以上の実験において、精製蛋白質がマクロファージ誘導
メディエータから分離され、これは単一の分子間がＳＯ
Ｓゲル上で１７，０００であり、等電点が４．７′Ｃ″
あることがわかった。非変質状態で、精製蛋白質は明ら
かに二量体として存在した。 １Ｕのバイオ活性は分離上ツマ−の〜２×Ｉ Ｑ−１５
モルに対応する。従ってモジュレータ物質ぐあるカシエ
フチンの２ｐＨ溶液は以上のバイオアッセイ法により容
易に検出可能Ｃある１、特異活性のこの推定は最少にし
なければならない。 なぜなら未知の量の蛋白質が精製中生物学的に不活性に
なるかもしれなかったからである。 カシエフチンの分離はネズミマクロファージ細胞系ＲＡ
Ｍ２６４．７の使用によって容易になり、この細胞は分
析及び精１のための蛋白質の天吊生産を可能にするもの
であった。この１０胞は均質であることに加え、内毒素
刺激中血清を含まない培地中に保持することができた。 ＲＩＶ２６４．７１胞系は、アベルソン白血病ビールス
によるマウス腹腔細胞の変成により生産することができ
た。 この細胞はマクロファージと形態学的及び職能的に類似
する。この細胞はＩｇＧの補体及びＦＣ断片のためのし
けブタを有し、良作用中性赤、オプソニンＲＢＣ、ラテ
ックスビーズを受は入れることができる。ＩｔＡＩ４２
６４．７＠胞によりつくられるカシエフチン活性と、チ
オグリコレート−引き出し腹腔マクロファージによる活
性との間の茗しい類似性についでは、既に実証されてい
る。 ＬＰＳ−刺激を受りたＩｔ／Ｖ２Ｇ４．７細胞もしくは
刺激を受けなかった細胞に由来する培地の５Ｏ３−ＰＡ
ＧＥ分析の結果は、カシエフチンが内毒素誘導型の分泌
性蛋白質の一種であることがわがった。これは刺激を受
（〕たＲＡ計６４７細胞から分泌される蛋白質仝ｈ１の
１−５％を構成し、ＳＯＳゲル上で、明瞭な１７，００
０の分子Φ帯域として見える。刺激を受けなかった細胞
からの培地は完全にカシエフチンバイオ活性及び１７，
０００の分子吊帯域が欠けている。精製カシエフチンの
特異活性の見積りに基ずき、１７，０００分子ｍの蛋白
質が、調製細胞培地に存在するバイオ活性の全部でなく
とも殆どの理由になっているように見える。他のｔツカ
イン（例えばインターフェロン、グルココーチコイド−
拮抗因子、或いはその他ンクロフ７−ジによりつくられ
るバイオ活性）に対するモジュレータ物質の関係は−［
分に検定されていないが、以上に提示したバイオ活性デ
ータがら、しジ：ｌレータ物質であるカシエフチンが、
Ｉ［−１とはその分子間及び等電点における類似性にも
かかわらず相違している。 ラベルされたカシエフチンを用いて、カシエフチンに罰
する特異レセプタの存在が分化３Ｔ３−Ｌ１細胞及び前
脂肪細胞、０２筋肉細胞、マウス肝臓細胞膜で実証され
た。一方、レセプタは、マウス赤血球及びリンパ球には
検出されなかった。 ３Ｔ３−Ｌｌ細胞及びＣ２細胞のレセプタ）１度は細胞
あたり １０’であった。Ｋａ、レセプタ瀕度、はカシ
〕クチン濃度の函数として示すことができた。 ３Ｔ３−１１細胞中のレセプタ瀕度が僅かに５％（２Ｘ
１０−１１Ｍについて得られた）で、ＬＰＬの７０−８
０％抑制を得るために十分である。この型の関係は、多
くの他のホルモンレ廿ブター結合系で観察された。 マクロファージは特徴的な内分泌細胞でないけれども、
これはＬツカインであるカシエフチンをつくりだすこと
ができ、これは古典的な意味ではホル七ンど記載されて
いる。何故ならこれは細胞の特定の群、及び影響により
、高親和性レセプタを通じ、他の細胞型の挙動にＪ：り
つくられるものであるからである。そのため、これは細
網内皮組繊細胞の内分泌の一つの例を呈示づ゛る。筋肉
、肝臓及び脂肪性組織がカシェフタのレレブタを有する
、という事実から、広範囲の生物学的応答が考えられる
。 以上の結果は、カシエフチンが、急激な感染に応答して
哺乳動物がそのエネルギーを、増大する代謝のために動
ｍするのに貢献する役割をも示唆するものである。゛Ｍ
生虫感染の場合のにうに慢性的な場合、カシエフチンは
、最終的に宿主の悪液質状態を和らげる蛋白質及びリビ
ドの異化作用に貢献する。 上述実験後に行なわれたその他の研究は、モジュレータ
物質の特定構造を解明するものである。ボイトラーほか
によっても報告されるこれらの研究ｔよ以下の実施例Ｈ
に記載される。 支五五１ ｆｔｌＷ ２６４．７ （マウス マクロファーシュ
）から精製された時には、カシエフチンはＣＩ（が４Ｔ
であり唐ナブユニット寸法は１７ｋｄであり、非共有結
合マルチマー（ｍｕｌｔｉｍｏｒ）を生成することを示
していた。カシエフチンのし廿ブタ（受容体）は非腫瘍
性培養細胞であり正常なマウス肝臓膜であることが確め
られた。 本実施例において、高収率の精製法を採用した研究の結
果、マウスカシエフチンの構造がより詳しく解明された
。高度の相同性がマウスカシエフチンのＮ−末端連鎖と
、最近ヒト腫瘍壊死因子（ＴＮＦンについて決定され、
ベニ力、Ｄ、。 ホカ１．：にすＮＡＴＵｆｌＥ、 ３１２号： ７
２４−７２９ページ。 １９８４年、及び王、シライほかによりＮＡＴＵＩｔＥ
。 ３１３号、 ８０３−８０６ページ、 １９８５年に
報告されているＮ−末端連鎖との間にあることがわかっ
た。精製カシエフチンはまた試験管内において効力ある
ＴＮＦ活性を有している。 このような研究の手順及び結果を以下に示す。 彬粍反髪万丑 カシエフチンバイオ活性（ＬＰＬ抑圧）は、既に述べた
ような３Ｔ３、−Ｌｌｌ胞を用いてアッセイされた。Ｔ
ＮＦ活性はアクチノマイシンＤ処即り一９２９細胞を用
いて標ｔ＄細胞もアッセイ法により測定された。 リポボリナツカライド刺１１１１ＲＡＷ ２６４．７細
胞に由来する粗カシエクチンの５０倍濃縮液が、実施例
■において記載されたような撹拌ｌｌ１１１１１中のＰ
Ｈ−１０膜（アミコン社、マサチューセッツ州ダンパー
）を用いて調製された、標本を超−過細胞から除去する
前に、オクチルグルコシド（シグマ社、ミズーリ州セン
トルイス）が１％（Ｗ／Ｖ）の濃縮液に添加された。非
イオン性遅延剤の添加は、次の処理において高回収率を
達成するためには必須である。 標本は０２２μフイルターを通過し、モノＱ（高性能陰
イオン交換）コラム（「ＰＩ−Ｃ；）７−マシア社、ス
ウェーデン国つプサラ）に適用された。全蛋白質のほぼ
６０％がコラムを直接的に通過した。カシエフチンは、
ｐｕ７．ａの０．３８）１のトリ塩素の濃厚液中で鋭い
ピークどじで溶離した（第７図）。はぼ８０％のホルマ
ンが三つの分画どして回収された。 モノ ｒＰＬＣイオン クロマトグラフ工二：オ
クチルグルコシドを分散剤として含有する濃縮粗１？八
Ｗ２６７、４培地がコラムに適用された。 カシエフチンは、０．３Ｈ乃至０．５ＨトリーＣ２（シ
グマ ケミカル社、ミズーリ州セントルイス）勾配を使
用して、流速０．３３ｙｆ／分、３４分間にわたって溶
出させた。光学的密度（２８０ｍｍ）は実線により表示
される。点線は溶出に使用されるトリー０２緩衝液のモ
ル濃度である。網状線（クロスハツチ）或いはカシエフ
チンバイオ活性の分イｂを示し、線で示されている（夫
々の点はそれぞれのバイアアッセイの結果を示す）、。 差込み図：銀痕跡ＳＯＳポリアクリルアミド勾配ゲル（
１０％〜１５％アクリルアミド）は粗物買の分離と連続
するコラム分画、レーンあたり１μノを示す）。分子電
！マーカーは一番左のレーンに示されている。矢印はカ
シエフチン（分子１ｊｌ＝１７ｋｄ）に対応する帯域を
示す。 全蛋白７１のほぼ６０％は非保持分画（図示せず）とし
て溶出した。カシエフチンバイオ活性のピークは０．３
８８ トリーＣＩの濃度で溶出する。もっとも高い活性
を有する三つの分画は更に精製するためにプールした。 スーパーローズ１２ （ＦＰＬＣゲル濾過）クロマトグ
ラフィ：モノＱ分画化からのプールした分画を凍結乾燥
し、熱温水に再溶解し、コラムに適用した。クロマトグ
ラフィは流３０．３ｘｌ／分で、０．１Ｈ１！￥酸アン
モニウム中で実施した。０．２猷の標本量が夫々の分離
に使用された。 実線は２８０龍におけるＯＤを示す。網状線は、バイオ
活性測定により検定されるカシエフチンの存在を示す。 矢印は、スーパーローズ塔に適用される分子？マーカー
の溶出域を示す。挿入図： ＳＤＳポリアクリルアミド
勾配ゲル（１０〜１５％アクリルアミド）は、スーパー
ローズ１２ゲル濾過により得られる連続する分画くレー
ンあたり１μノ部分）の電気泳動輪郭を示すＯＬ及びＰ
は標準分子量；Ｑはプールされたモノ０分画くスーパー
ローズ１２分離の出発材料）。 これら分画はプールされ、凍結乾燥され、０．４ｘｌの
熱温水中で再溶解された。標本を次に高性能ゲル濾過ク
ロマトグラフィ（スーパーローズ１２：ファーマシア社
製）処理したく第８図）カシエフチンは、五組構造に一
致する８７ｋｄの分子量に対応した位置に常に溶出した
。分子は非イオン系遅延剤の存在下に容易に解離する。 五組構造がバイオ活性に必須のものであるかどうかは明
らかではない。 カシエフチンビークの痕跡端は９５％以上純粋であると
考えられ、最初のメディエータ物質（中間物質）を調製
するために使用される旧来の精製法により製造される均
質溶液と同様にほぼ１０７Ｕのカシエフチンバイオ活性
／ＩＩＴｇ蛋白質を含有していた。ＴＭＦ活性はこの試
料によりアッセイされた。はぼ１２×１０７Ｕ／Ｔｌ１
ｇの蛋白質が精製標本中に測定され、粗物質の標本中の
３．７Ｘ１０’ Ｕ／［蛋白質と比較された。精製ヒト
丁ＮＦの特異活性は２．９Ｘ１０’ Ｕ／■蛋白質であ
ると報告されている。 アミノ酸組成物とその連鎖の決定に使用されるための、
残ったカシエフチンに富むスーパー［１−ズ１２分画は
、パン、Ｖ−Ｃ，ＥほかによりＪ。 ＣＩＩＲＯＨＡＴＯＧ、 ２９７号： １３−１９ペ
ージ、 １９８４年に既に記４＆されているｃ８コラム
（スペルコ社、ペンシルバニア州ベラフォンテ）を使用
して、逆相クロマトグラフィにより更に精製された。カ
シエフチンは、３０−４０％アクリロニトリルの濃度で
溶出した。４０ｐモルの高度に精製された蛋白質を６Ｎ
のトＩ ＣＩで加水分解し、組成分析に使用した。２０
０ｐモルを連鎖に使用したウォーターズ社（マサチュー
セッツ州ミルフォード）の高性能液体クロマトグラフィ
（ＨＰＬＣ）系、及びアプライド バイオシステムズ社
（カリフォルニア州）Ａ−スター市）のマイクロシーフ
ェンシング装置、 ４７０Ａ型、がこれらの手順に採用
された。 マウス力シエクブンのアミノ酸組成物が第■表に、ヒｌ
〜ＴＮＦの組成物（ＤＮＡ連鎖により決定）と比較され
ており、少者はベニ力はが〈既述）により報告されてい
るものである。強い類似性が一児して明らかである。両
蛋白質はなかｌｖずく酸性及び疎水性である。スレオニ
ン（ｔｈｒ） 。 バリン（ｖａｔ） 、アラニン（ａｌａ） 、ヒスデシ
ン（ｈｉｓ） 、アルギニン（ａｒａ） 、及びシステ
ィン（ｃｙｓ）の残りの同じ数値が両名に見られる。 第 ■ 表 ａｓｎ／ａｓｐ １６（７１５）” ｌｅｕ
１７（１８）ｔｈｒ ６（６） 、ｔｙｒ
８（７）ｓｅｒ １２（１３） ｐｈｅ ６（４
）Ｑｌｎ／Ｇｌｕ ２０（１０／１０） ｈｉｓ
３（３）（ｌｌｙ １３（１１） ｌｙｓ １０
（６）ｖａｌ １３（１３） ａｒＱ ５（５）
ａｌａ １３（１３） ｐｒｏ ＮＯ（１０）ｍ
ｅｔ ２（０） ｃｙｓ ２（２）ｉｌｅ ５
（８） ｔｒｙｐ ＮＤ（２）本かっこ内の数はヒ
トＴＮＦについてベニ力はか（既述）により決定された
組成物にかかわる。 また、”ＮＤ”は、決定されなかった数である。 同様に、マウスカシエフチンのＮ−末端アミノ酸連ｆａ
（−格上の行）の性質は、ヒトＴＮＦの対応する連鎖（
一番上の行）と比較的一致していることがわかった。あ
いまいな残塁は′？″で示される。一致している残基を
下線で示しである。 マウスカシエフチン Ｈ２Ｎ −ｔａｕ−ａｒ −ｓｅｒ−ｓｅｒ−ｓｅｒ−
ｇｌｕ−ａｓｎ−ｓｅｒ−ｓｃｒ−ａｓｏ−ｐｒｏ−肛
立江但二Ｉａ−？ −ヒトＴＮＦ Ｈ２Ｎ−ｖａｌ−ａｒ −ｓｅｒ−ｓｃｒ−ｓｅｒ−ａ
ｒｇ−ｔｈｒ−ｐｒｏ−５ｅｒ−ａｓｐ−Ｉｙｓ−狸ｍ
！Ｑ±−ａｌａ−ｈｉｓ−上記連鎖分析によれは、マウ
スカシエフチンとヒトＴＮＦのＮ−末端連鎖との間に強
い相同関係がある。最初の１９の残塁のうち５個を除き
一致している。Ｌ−９：２９細胞に対する精製カシエフ
チンのｆｉＩＩ１１溶解効果と共に上記データを考えて
みると、単一の蛋白質種がカシエフチンと、ネズミのマ
クロファージ調製培地の１旧活性の原因となっていると
考えられる。更にこの蛋白質は高度に保存されているよ
うである。 上述研究の結果からまた既に先に述べたように、モジュ
レータの完全な同定が行われ、上記の分画連鎖及び第２
３図に示す完全な連鎖との比較によって類似点と相違点
の双方が明らかになった。このもっとも新しい情報のよ
り詳しい分析は、従って現在進行中である。 カシエフチンは、培１３Ｔ３−Ｌｌ脂肪細胞及び０２筋
管の１細胞あたりほぼｉｏ、ｏｏｏコピーで存在する特
異レセプタに結合されることが既に実証された。ホルモ
ン−レセプタ相互作用のにａは、スキャツチャード（５
ｃａｔｃｈｕｄ）分析により３Ｘ１０９Ｍ−１であるこ
とがわかった。正常なマウス肝臓膜もまたカシエフチン
を有効に結合する。 酵素活性の低下はホルモンの低下後直ちに観察され、こ
れは明らかにＬＰＬバイオ合成の特異抑制の結果である
。正味の蛋白質合成及び細胞不安定性は影響を受けない
。 既に論じたように、本モジュレータ物質は、このモジュ
レータ物質を特徴ずける明らかな特性を複合して形成す
る多くの活性をも右している。このモジュレータ物質活
性のいくつかは、公知物質と相違さぼる。 特にこのモジュレータ物質は、同化酵素リポプロティン
リパーゼを実質的に完全に抑制し、この抑制は既に或い
は後に記載するように濃度によって変化する。モジュレ
ータはまた脂肪細胞の分化を阻止し、グルコースの取り
込みを増大して筋肉細胞に運ぶ。後者の活性はプリカー
サであるメディエータ物質（中間物質）にみられるが、
インターロイキン１には欠けている。 これと対照的に、モジュレータ物質はそのメディエータ
ブレカーサに対し、脂肪酸シンセターげ或いはアセチル
Ｃｏ酵素Ａカルボキシラーゼを抑制する能力が欠（プて
いるか、或いはホルモン感性リバーげの活性を増大する
能力が欠けていることによって区別される。モジュレー
タ物質とそのプリカーサとはインターロイキン１に対し
ロイコサイト活性化が欠けていること、またマウスに発
熱を引き起す能力もしくは蛋白質劣化を生じさせる能力
が欠けていることによって区別される。 一ヒ述特徴のほか、モジュレータ物質はまたマウスの体
噛減を生じさせる能力も有し、また宿主を内毒素による
ショックから保護するためのそれ自体の抗体を生成する
能力をもっことを実シ［する。これら活性のすべては以
下の実施例で説明される。 【盈五Ｉ 既に述べたように先に発明したメディエータ物質及びこ
のモジュレータ物質であるカシエフチンの双方共、酵素
リボプロティンリバーげ（ＬＰＬ）の活性を抑圧する。 この能力は、特定の培養された脂肪細胞（３Ｔ３−Ｌｌ
ｌ［１胞）について行なわれた実験で見出され、この実
験においてこのような抑制は実質的に完全であることが
確かめられた。特に９５％より高い抑制が報告された。 これと対照的に、インターロイキン１と同定された物質
はリポプロティンリパーゼの活性をある程度抑制したこ
とがわかったが、しかしこの効果は限定されたものであ
り、投与されるインターロイキン１の濃度に依存しない
ものであった。ボイツーはかく既述）に述べられている
ように、これと対照的にカシエフチン及びメディエータ
物質は、ＬＰＬ活性を実質的に完全に抑制する能力をも
っていることがわかった。これらの観察を実証するため
に、ある量の組換型インターロイキン１（ｒＩＬ−１）
及び精製力シェフチンを用いていくつかの実験を行い、
この仮説を確認した。行った実験手順は以下の通りであ
る。 扛１」αＬ１迭 ｉ１Ｌ！ ： ３Ｔ３−Ｌ１細胞を成長させて２４−ウ
ェルリンプロプレートに合流させ、分化させて、マホー
ニー Ｊ、 Ｒ，ジュニアほかによりＪ、 ＩＨＨＵＮ
ＯＬ、１３４号、 １６７３ページ、 １９８５年、に
記載されているにうに脂肪１１１１１１１を生成するよ
うにした。簡単にいうと、細胞を、１０％雌牛血清を含
むダルベコ修正イーグル培地（ＯＮＥ）に１０５／１１
の密度でプレート処理した。この培地を一日おきに代え
た。培養体が合流に達した一週間復、１０％ウシ胎児血
清、１０μｇ／ｌ！ウシインシュリン。 ０、０５Ｈメチルイソブチルキサンチン、及び１０μＭ
デキサメタシンを含むＤＨＥに４８時間さらした。その
後、これを、１０％ＦＢＳ及び５０ｎａ／ｘｆウシイン
シユリンを含むＤＨ［に保持し、−日おきに代えた。Ｏ
ＮＥはＶブ」社にューヨーク州グランドアイランド）か
ら購入し雌牛血清と定義されており、特徴的なウシ胎児
血清はハイクローン ラボラトリーズ（ユタ州ローガン
）から購入した。細胞は分化して４日後にレセプタアッ
セイに使用されるか、分化して１週間後にＬＰＬ抑制の
バイオアッセイに使用された。 レセプタアッレイ：レセブタにかかわる研究は、ボイト
ラーはか（既述）に記載されるような、カシエフチンレ
セプタの特徴化に使用したと同じ放射線ラベルをした物
質を使用して行なわれた。カシエクチンレセブタ７ツセ
イについてはホイテルほかによりＪ、ＥＸＰ、Ｈ［Ｄ、
、１６１＠。 ９８４−９９５ページ、 １９８５年に詳しく記載され
ており、ここでは、放射線ラベルをしたカシエフチンを
その特異レセプタから置き代えるためのＩＬ−１の能力
を試験するために使用された。簡単には、上述のように
調製された３Ｔ３−１．１細胞単層に、１０％ＦＢＳ及
びＩ）１１７．４の５０１１ＩＨヘーブス、及びぼぼ１
０−１１μＭの放射線ラベルをしｌこ力シェフチントレ
ーサを含むＯＮＥを重ねた。ラベルしていないＩＬ−１
，もしくはカシエフチン（積極比較例）の溶液が添加さ
れた。夫々の系の最終容積は０．２欝であった。反応は
Ｏ″Ｃぐ４日間、揺動シェーカー上で行なわれた。この
培養の終りに、細胞単層を３回同じヘーブス緩衝培地で
洗浄し、１．０１１ｆ、１ＭのＮａ０Ｉ＋で溶解し、パ
ラカードガンマ力τクンターで、標準誤差かく５％とな
るために十分な時間カウントした。 カシエフチン及びＩ［−１による１、ＰＬ抑圧のバイオ
アッセイ：２４ウエルのリングロブレート中で先述のよ
うに調製した３Ｔ３−Ｌ１細胞の、に層に、１０％Ｆ［
ｌＳ及び５０％ｇ／ｙｆインシュリンを補充したＤＨ［
の正確に１．ｏｘｌを導入した。カシエフチン又は組換
えＩＬ−１の精製試料を夫々のウェルに添加し、完全に
混合した。いずれのメディエータにもさらされていない
比較細胞単層を、すべてのアッセイに含めるようにした
。 ＬＰＬアッセイ二以上のように処理した細胞単層から培
地を吸引した。１０％ＦＢＳ 、 ５０ｎａ／厭インシ
ユリン、及び１００／１１ヘパリンを含むＤＭＥの０，
５ν！を次に夫々単層に添加した。１時間接、ニルソン
ーエール及びショップの方法に従って７５μｊの培地を
、ＬＰＬ活性についてアッセイした。ＬＰＩ−抑圧パー
セント（メディエータのいずれかにさらされない比較単
層に関して）は、ボイトラーはか（既述）に記載されて
いるＪζうにして計口された。 １１λ旦」：これは、ビータ−ロメディ］ｌｔｖ士（ボ
フマンラ ロッシュ社９分子逍伝学部〉の御好意による
ものである。モノ力イン（はぼ１００μＭＯ度）を５Ｈ
グアニジンＨ（Ｊの溶液とした。グアニジントＩ（Ｊは
サブミリモル濃度に希釈された時には、叙上の系にＪ３
けるＬＰＬに影響を及ぼさなかった。 Ｉ Ｌ−１に・する−血゛−二山羊で得られたネズミＴ
Ｌ−１に対するこの抗血清はスチーブン ミズル教授の
御好意により得られた。 比」匹患且進： ５０ｍＮへ−ベス、 ｐＨ７，４、及
び１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥに抗血清を既に述べた
時間にねたつで希釈した。精製組換え１１−１を５０ｐ
Ｈの最終濃度液中に添加した。氷上で１時間後、溶液の
１５μ〕分を細胞！ｌｌｉ層に添加し、最終Ｉ［−１濶
度を０．７５ＤＨとした。ＬＰＬ抑制のアッセイは、１
６時間の培Ｍ後通常のように行われた。 稈Ａ ｒ された絹 えニジ−１によるＬＰＬ゛ −の ３
，１：組換えＩＬ−１を３Ｔ３−１１細胞に添加するこ
とによって、１−ＰＬ活性は部分的に抑制された。第９
図に示すように、ＩＬ−１は、フェムト（Ｆｅ１ｌｌＤ
ｔ）モル範囲の濃度でＬＰＬ活性を抑制することができ
た。 かくして叙上の系においてほぼ１０１８モルのホルモン
を検出することができた。しかしながらホルモンのμＭ
の濃度ではこの条件で５０％以上はＬＰＬを減すること
ができなかったが、９０乃至９５％の抑制は、カシエフ
チンのｎＨｉ１３度で達成することができた。３Ｔ３−
Ｌ１細胞を時々分【ノて加えることにより、ｒ ＩＬ−
１に対しより高い感応性が得られ、一般的には５０％抑
制が可能な最大限であり、いずれの場合でも抑制効果が
８５％を越えることはなかった。 カシエフチンと１１−１の双方が培養３Ｔ３−Ｌｌ細胞
に添加された時、これらの効果は補足的であり、相互に
依存関係はないように見えた。例えば５０％抑制（最大
感応性）を得るために十分な猶のＩＬ−１を、５０％抑
制を得るために十分な場のカシエフチンと共に添加した
ところ、はぼ７５％の抑制が観察された。相乗効果は観
察されなかった。 特−Ｗヤ′αＩＬ−１１をｉ する組 え１１−１によ
るＬＰＬＩｌｌの 宇： ０．７５ｐＨの［１−１を
培養３■３−１１細胞に添加した時、８０％のＬＰＬ抑
制が得られたくこの実験における最大感応）・コ（１）
ｒＩＬ−１を特異中和抗血清と予備培養すφことにより
・この反応は完全になくなった。減少組の血清を添加す
ることにより、中間レベルの抑制が得られた（第１０図
）。中和に使用した濃度範囲では、ＬＰＬ表徴に血清の
直接的な影響は見られなかった（データは示されていな
い）。従って使用されるｒＩＬ−１試料によるＬＰＬ抑
制は、確かにモノ力インの存在に帰因するものであり、
汚染細菌蛋白質、或いはＩＬ−１の分離に採用される反
応剤によるものでないように考えられる。 べたように、放射線ラベルしたカシエフチンは、３Ｔ３
−Ｌｌｌ［１胞のみならず他の組織にも存在する高親和
性レセプタ（ボイトラーほか、既述）に対して結合する
ことができ、またｎＨｉｌ１度のラベルしないホルモン
により容易に置き代えられる。 ０１μＭ及び１０μＭＥ１度の精製組換えＩＬ−１の添
加により、この放射線レセプタアツセイにおいては、ト
レー蚤ナカシエクチンの著しい置き代えは生じなかった
く第１１図）。従ってＩＬ−１は、３Ｔ３−Ｌｌにお【
ノるＬＰＬの抑制を引出寸一方、カシエクチンレセブタ
に結することなく抑制することができると考えられる。 しかしながら、インターロイキン１によるＬＰＬ抑制の
パターンは、アジポサイトにおりる１、ＰＬの９５％以
上の抑制が共に可能な本発明のメディエータ或いはカシ
エフチンのパターンと異なっている。カシエフチンによ
るＬＰＬの抑制及びＩ［−１によるＬＰＬの抑制は補足
的であり依存関係にない； ＩＬ−１の最大抑制濃度の
存在下でも、カシエフチンの添加により更に抑制が達成
される。 几二支豊北上：ディナレロ（既述）が論じているように
、インターロイキン１と同定された因子は、ある免疫調
整活性効果を有する他の因子（そのあるものはインター
ロイキン２と確認されている）と異なっている。以ＭＱ
はＴ＠胞成長因子として知られているインターロイキン
２ハＴ １８１１１によりつくられ、リンパ球に対し直
接成長信号を送る活性を有する。ＴＬ−２の製造は、ま
た、ある場合には生体内でＩＬ−１により制御される。 ＬＰＬ抑制に関し、■し−２がＩ［−１と同じ活性を有
するかどうかを確認することは、従って興味あることで
ある。 従ってボイトラーホカハＪ、［ＸＰ、ＨＥＤ、、１６１
号。 ９８４−９９５ページにおいてＩＬ−２のＩ−ＰＬ抑制
活性を調べ、これが存在しないことを知った。明らかに
ＩＬ−２はこの特徴をＩＬ−１と共有してＪ３らず、従
って同様に、粗メディエータ物質と、その分離物である
本発明のモジュレータ物質、即ちカシエフチンとの双方
と区別することができる。 要約すると、メディエータ物質、その分離カシエフチン
及びＩＬ−１のすべてはＬＰＬに対して抑制効果を有す
るが、メディエータ物質とカシエフチンとによる効果は
Ｉ［−１のそれと構造的かつ機能的に異なり、このこと
はこれら物質自体が異なっていることを示唆している。 更にこれら三種の物質はＩ［−２と異なっており、その
ため別々の特徴が試験される物質それぞれについて考え
られる。 友五土１ 米国特許出願用４１４．Ｏ’１８号において、先述メデ
ィエータ物質がｌ１１ｇ１素アセチルＣｏＡカルボキシ
ラーゼ及び脂肪酸シンテターゼに及ぼす効果が研究され
、メディエータ物質は両酵素の合成に干渉することによ
ってこれらを阻害することが確められた。この実験では
、前記第４１４，０９８号の実施例■のアッセイ系がと
りあげられ、インターロイキン１とカシエフチンのそれ
ぞれについて適用が行われた。精製ＩＬ−１及びカシエ
フチンがボイトラー及びけラミ（既述）に開示されてい
るようにｗ４製され、調製培地で得ら礼た内Ｒ′ｌｆｉ
の存在下に培養されたマウス腹腔滲出液細胞内に使用さ
れた。 かくして、３Ｔ３−Ｌ細胞はＩＬ−１とカシエフチンの
それぞれにさらされ、４２４時間培養され、アセチルら
Δカルレボキシラーゼと脂肪酸シンテターゼ活性の測定
が３時間、６Ｒ間及び２０時間後のそれぞれに行なわれ
た。いずれの場合にも、夫々の因子で培養した細胞の、
ジギトニン解放シトツル分画はどちらの酵素の活性も減
少させることはなく、従ってＩＬ−１もモジュレータ物
質であるカシエフチンも同化酵素であるアセチルらＡカ
ルボキシラーゼ及び／もしくは脂肪酸シンテターゼに抑
制効果を及ぼすことはないことがわかった。従ってこの
ようにしてこのモジュレータ物質は、明らかに粗メディ
エータと区別されるが、インターロイキン１と類似性を
有していることがわかる。 支立叢ヱ この実施例は、゛慢性疾病における悪液質のネズミモデ
ル： ３Ｔ３−Ｌ１脂肪性線維芽細胞における内Ｒ索誘
導マクロファージ分泌蛋白質賦活異化作用”なる論文に
来会ｎ事実としてまとめられており、本出願人及び共同
研究者の一人によって行＜ｋわれた研究がら央粋したも
のである。 この研究において、脂肪細胞新陳代謝阻害に及ぼす粗メ
ディエータ物質の役割は更に研究され、特にメディエー
タがトリアジルグリピロールの細胞による解放に基づく
異化活性に及ぼす効果に焦点があてられた。この脂肪分
解活性は直接に測定され、ホルモン感応リパーピとＣＡ
）ＩＰの活性が参照され、その結果、メディエータは脂
肪分解及びホルモン感応リパーゼの活性の役割及び節回
に著しい効果を及ぼすこと、しかしｃＡＨＰレベルと活
性は実際上影響を受けないことがわかった。この研究で
採用された手順は以下の通りである。 ご び干々の 〃 種々の反応剤・材料及び手順が、この分野において従前
報告されている作業に利用されているようにして、採用
された。かくしてイソプロテレノール、八ＣＴ１１．
（３２Ｐ ） Ｐｉ、 ＬＰＬ及びマウス腹腔マクロ
ファージが慣用入ｆ源から人手されるか、調製された。 ＣＡ）ＩＰの放射線免疫アッセイが、ワトキンはかによ
りＪ、ＢＩＯＬ、ＣＩＩＥＭ、 、 ２５７号、 １
４７１９！ｉ：ｊ、 １９８２年、に報告されているよ
うにして実施された。 ３Ｔ３−Ｉ ＩＩ Ｉｌｌ 培？ａ ： ３Ｔ３−Ｌ１
ブレアシホサイトがペカラホカニよすＰＲＯ，ＮＡＴＬ
、八ＣＡＤ、 Ｓｃ １． ＵＳＡ、 ８０号。 ２７４３ページ、 １９８３年、に記載されているよう
にして、１０％ウシ胎児血清を含むダルベコ修正イーグ
ル培地中で培養された。培地に、０．５ｍＨイソブチル
ーメチルキサンチン、１μＭデキサメタシン；及び培地
１１！あたりインシュリン１０μｇを補充することによ
り、合流後２日で分化が生じた。４８時間後この培地を
除去し、１０％ウシ胎児血清及びインシュリンのみを補
充した培地と取り替えた。４日後細胞の９０％以上がア
ジボサイト表現型を示した時、培地を代え、細胞をイン
シュリンなしに１４日間保持した。 ｌ１Ｌｌ１１ｉ！：脂肪分解は、ビンターほかにより、
ΔＩｔｅ１１． ＢＩＯＣＩＩＥＨ，ＢＩＯＰＨ３，１
２１号、 ４ｏ４ペー シ。 １９６１年、に示すようにして、グリセロール解放につ
いて測定した。細胞はＩ）１１７．４の２％ウシ血清ア
ルブミン（分画Ｖ）と共にタレブスリンガーりん酸塩緩
衝液で洗浄し、２．ｏｘｉの同じ培地中で１乃至２時間
３７℃で培養した。培養は培地を除去することによって
終アレ、これを１０％トリクロロ酢酸で調整した。この
混合物を１０分間２、５００ ｒ ｐｏｌ′ｃ遠心分離
遠心上リクロロ酢酸をエーテルで抽出した後、結合酵素
系を用いて上澄み液のグリセロール含ルを測定した：試
料（０，１６７１月を、０．１４１ＨのＡＴＰ 、 １
．２ｍＨのフォスフエノールピルビン酸塩、 ０．２
０ｉＨのＮ＾０１１゜１．５単位のグリセロキナーゼ（
カンジダ マイコデルマ）、１．３５単位のキナーゼピ
ルビン酸（ウサギ筋肉）、及び２．８単位のラクターゼ
デヒドロゲナー＋：！（ウシ心臓）を入れたキャベツト
に添加した。試料中のグリセ【コールのｍは酸化Ｎ＾０
１１に比例する。グリはロールの解放は、１０６１［１
１Ｂ！あたりもしくは田七白質あたりの単位時間に解放
される全ｎモルであると報告されている。上記条件下で
、グリセロールの解放は、少なくとも３時間一定であっ
た。 １セロ−ルー に は −イエー ロいはイソプロテ
レノールの ：内毒素処理マウス腹腔マクロファージ
１からの調整された培地（４００μ〕）が、種々の時間
間隔にわたって、分化３Ｔ３−１１細胞（４，２Ｘ１０
６細胞／皿）の培養培地（３，５ｙｆ）に添加された。 この巾は、１５時間後リポプロティンリパーゼの活性を
９０％抑制するために十分な駄である。培養の終りに培
地が除去され、２％ＢＳＡを含有するクレブス−リンガ
−りん酸塩緩衝液で細胞単層が洗浄され、グリセロール
解放が１乃至２時間監視された。 イソプロプレツールを用いて行った研究にＪ３いて、細
胞単層が、２％ＢＳＡを含有するクレブスリンガ−りん
酸塩緩衝液ｃ−２回洗浄され、同じ緩衝液で培養された
。飽和レベルのイソプロプレツール（３μＭ）が添加さ
れ、培養混合物中へのグリセロール解放が１乃至２時間
監視された。 １ １ の５ びホルモン感 リバー゛のアッセイ：
ホルモン感応リパーゼを含有する溶解細胞抽出液が、カ
ワムラはかによりｐｎｏｃ。 ＮＡ丁り、 八ＣＡＯ，ｓｃ ｉ 、 ＬＩＳ＾、７
８号、 ７３２ヘージ、 １９８１年、に記載され
ているようにして調製された。 先ず培地が代えられ、細胞単層が、ヘパリン（１０単位
／１１＞を含有する培地で６０分間培養された。培地を
除去し、細胞単層をＤ１１７．４のダルベコりん酸塩緩
衝食塩水で、一度はｐｔ１７．４ 、１０ｉＨのトリー
ＨＣｆ／１１Ｍの［：ＤＴＡ／ ０．２５ Ｍのシヨ糖
、で２度洗浄した。細胞を掻き落し、１分間１１００Ｏ
ｘで遠心分離した。パックした細胞をｔｏｍＨのトリー
ＨＣ１、ｐＨ７，４； １ ｍＨのＩＥＤＴ＾；及び０
．２５Ｍのシヨ糖：の２容中で均質化し、１時間、４０
、０００ｘｇで遠心分離した。上澄液をヘパリン−セフ
ァローズ親和性コラムに適用して、リポプロティンリパ
ーゼを吸着するようにした。発出液は、血清の添加によ
り活性化しない脂肪溶解活性を有し、これはリポプロテ
ィンリパーゼが存在しないことを示すものである。 抽出液標本（０，０７ｉｆ）を全Ｊ０．１１ｆの５ ｍ
Ｈｖグネシウムアセテー１−７０．５ｍＨの八ＴＰ１０
．０Ｉｎ＋ＨのｃＡＨＰ／Ｉｎ＋Ｈの［Ｏ丁Ａ／２５１
ｎ＾のトリｌ−１ｃＬ ＤＩ＋８ 、 に５分間３
０℃で培養し、リバーげを賦活化した。アッセイは、０
．３ｍＨＣ３１−Ｉ ） −トＩＪ ：ｔ Ｌ／イン７
．５ｘｌＯ５ｃｐｍ／μモル） 、５０ｍＨのりん酸ナ
ト１戸りム、ウシ血清アルブミン５ ＴＩＩＧ ／ ’
１１．２ｍＨの［：ＤＴＡ、 ｐｌ＋７、Ｏｌを含有す
る基質混合物（０，７ｉｆ）の添加により開始した。３
０分間の培ｒｉ後、メタノール。 クロロホルム、及びヘプタン（１，４１：１．２５ ：
１．０からなる抽出混合液の３１１を添加した。トリジ
エート（トリチウムを含有する）オレイン酸を、液／液
部分によりエステル化オレイン酸から分離し、放射能を
カワムラはかく既述）が記載しているようにして測定し
た。 １里 の に ぼすメ１イエ−ロチ ＬｚＬみ」：以前の実験により、内毒素又は内毒素処理
マクロファージからの調整培地にさらしたマウス精巣上
体脂肪パッドが著しい重１１減少を生じることが実シ［
された（Ｍ、カワカミ：ベカラ、 Ｐ、 ｌ−１，：セ
ラミ、Ａ０．来会間データ）。この観察は、粗メディエ
ータ物質についてもとちと開示された脂質生成抑制に対
応する貯蔵ｉ〜リアシルグリセロールの除去、に至る脂
肪分解活性を示している。メディエータに１５時間さら
す間に、グリセロール解放により測定される脂肪分解は
瀬次増大し、基準のほぼ１５０％になった。グリセロー
ル解放の最大活性のために必要な時間は、膜組織と結合
するリポプロティンリパーゼの最大抑制につい″Ｃ観察
される時間に対応する。メディエータに１７時間さらし
た後、溶＠細胞抽出液でアッセイすると、ホルモン感応
リパーゼ活性は以下の第■表に示すように６０−１０％
増加した。 細胞は分画するように誘導され、実験手順に記載された
ように保持された。ホルモン感応リパーゼを含有する溶
解可能分画が対照細胞、及び内毒素処理マウス腹腔マク
ロファージからの調整培地に１７時間さらされた細胞、
から得られた。 抽出液は直接にアッセイされるか、或いは、実験手順に
記載されたようにアッセイする面に、ｃＡＨＰ及びＡＴ
Ｐの存在下に５分間培養された。数値は、４種の実験の
平均上標準偏差である。 ホルモン感応リパーゼ活性 ｎ七ル／時間／［蛋白質 対照ＩａＩ胞 メディエータ処理細胞なし １４６±
１８ ２４０±４２ｃＡＨＰ ３０４±５４
２６３±３１ｃＡＨＰ及びＡＴＰ存在下
で対照抽出液を培養した結果、リパーゼ活性が２倍にな
った。しかしメディエータ処理細胞から調整した抽出液
の培待の場合には、このような刺激は観察されなかった
。 同じ実験において、飽和レベルのβ−アドレナリン作用
拮抗イソプロテレノール（３μＭ）（ワトキンスほか、
Ｊ、ＢＩＯＬ、 ＣＩＩＥＨ，，２５７号。 １４γ１９ページ、 １９８２年）にざらされた細胞は
、３１０ｎモル／時間／Ｔｌ１ｇ蛋白質のグリセロール
解敢最大値を示した。これは、以下の第１Ｖ表に示す３
１５ｎモル／時間／′ｆｆ１ｇ蛋白質のメディエータ処
理細胞の最大値に較べられる。 ＷＥ ｆＭ ｍ人！＄ ： ３Ｔ３−１１細胞をメディ
エータに対し１７時間、もしくはイソプロテレノールに
対し１時間さらし、グリセロール解放を、実験手順に記
載したようにして測定した。数値は４種の実験の平均値
上標準偏差である。 ９ＬＭ 旦ｉルＺ曜皿２四正亘亘 ｎモ
ル／時間／１０６刊肥対照例 １１８±
１５ ６１±１０メデイエータ
３１５±１８ １６４±１０３Ｍ
イソプロテレノール ３１０±２５
１６２±１２比較として、開示されたように調整され
た精製カシエフチン、及σＩＬ−１がそれぞれ、内毒素
処理マウス腹腔マクロファージに由来する培地について
記載されたのど同じ条件で分化させた３Ｔ３−１１細胞
で培養された。その後、ホルモン感応リバーぎを含有す
る溶解分画が同様の方法で調整され、直接にアッセイさ
れた。その結果、ｎモル／ １１．’ｉ間／■蛋白り１
で表わされたホルモン感応リパーゼ活性は上記第■表の
対照細胞のそれと同じであった。 以上のデータから、粗メディエータ物質は脂肪分解及び
ホルモン感応リパーゼの活性を刺激するように見える一
方、この活性は、本発明のモジュレータ物質、もしくは
公知の因子として固定されＩＬ−１として表わされてい
る物質のいずれによっても実証されていない、と結論ず
けることができる。 支直五Ｍ この実施例は、トルティはか（既述）の研究に由来する
ものであって、アジボサイトにおける脂肪生成酵素活性
を抑制する機能を果すメディエータ物質の機構を明らか
にするために行われた。安定した脂肪生成細胞系（Ｔへ
１ ）の内毒素刺激マクロファージ培養における調整培
地の効果は、チャプマンほかによりＪ、 ＢＩＯＬ、Ｃ
ＨＦ２．２５９号、 １５５４８−１５５５５ページ
、 １９８４年に記載されているように、脂肪細胞分化
の間圧比が増加する遺伝子のｃＤＮＡクローンを用いて
検査された。メディエータは、脂肪誘導遺伝子の発生圧
出を逆方向にかつ特異的に阻害し、このことは、これら
遺伝子の転写活性化を阻害することにより生ずるもので
あることがわかった。更に、成熟脂肪細胞がメディエー
タにざらされる時には、脂肪生成中に誘発されたこれら
遺伝子のｍ１ｔＮＡは減少し、Ｄ速に予備分化レベルに
近ずく。丁＾１細胞は、チャブマンはか（既述）が記載
しているように、組織培養体単層に合流後はぼ３日で典
型的な脂肪細胞形態を発生させる。分化の形態学的証拠
と並行して、分化後その圧出が明らかであるいくつかの
遺伝子が同定されたくクローンｉ 、 １０．２８．４
γ）、、これら脂肪誘導ｉＲＮ＾は、転写活性のため大
部分が或いはリベてか圧出される。これら脂肪遺伝子の
座標誘導に及ぼすメディエータの影響を測定するために
、メディエータを予備合流ＴＡ１ ｇ胞、及び合流に達
した日の後の細胞に添加した。これらから分離された全
ＲＮＡ及び、合流６日後の比較細胞を、その圧出が脂肪
細胞中に観察されるが前脂肪細胞中には観察されないよ
うな遺伝子の放（、Ｊ４線ラベルｃＤＨ八でプローブし
た。第１２図に示すように、メディエータ処理によって
脂肪誘導ｍＲＮ＾の蓄積が阻止される。リビド蓄積ちま
た、メディエータ処理によって完全に阻止される。メデ
ィエータによって処理されるＴへＩ脂肪細胞培養体は、
スダンＴＶ痕跡による中性リビドが出現することなく（
データは示されていない）、２３日間にもわたって保持
された。しかしながら、培地からメディエータを除去リ
ーると、脂肪細胞形態が、脂肪生成誘導遺伝子の発言、
即ちクローン１（第１３図）のように、復元した。 遺伝子発言の抑制はメディエータの一般的な効果ではな
い；例えば第１２図から明らかなように、β−アクチン
ｉＲＮ＾のレベルは影響を受けない。更に、メディエー
タによる前脂肪細胞培養体の処理は細胞の成長或いは生
育力に影響を与えるものではない。第１２図の実験に似
た構成の一連の実験において、細胞の増殖は細胞数のカ
ウントにより、ハ」−チミジン結合により測定された。 比較例及びメディエータ処理培養体は、合流点における
細胞数の増加及び３１１−チミジン結合減少によっては
区別することができない。 トリパンブルー排除及びクロナール成長アッセイによっ
て測定されるような細胞の成長力もまた比較例及びメデ
ィエータ処理細胞に等しい（データは示されていない）
。 脂肋特巽性ｍＲＮＡ蓄積のメディエータ阻害が転写的に
制御されるかどうかを測定するために、各転写アッセイ
が行われた。第１４図は、クローン１及び２８の遺伝子
転写における正常な発生増加がメディエータにより阻害
されることを示している。次いで、同様な結果がグリセ
ロフォスフェートデヒドロゲナーゼ（Ｂ、スビーグルマ
ンの行為による）及びクローン４７からのｃＤＮ＾につ
いて１ｑられた（データレよ示されていない）。補足的
な実験におけるメディエータ添加後ＧＰＤのｍＲＮ八レ
ムレベル減少ＧＰＤの酵素活性の減少と平行している（
データは示されていない）。しかしながらメディエータ
処理は、転写活性の非特異性減少の原因となるものでは
ない：前合流細胞２分化脂肪細胞、及び分化中メディエ
ータで処理した細胞におけるβ−アクチンの転写率は等
しい（第１４図）。 成熟した哺乳動物においては、脂肪細胞は、殆ど或いは
まったく増殖しない。かくしてメディエータが前合流Ｔ
Ａ１細胞に添加された時、分化中脂肪遺伝子発言の抑制
は、これら脂肪遺伝子が発育中座標的にいかに調整され
るかを理解するためには有用であるけれども、哺乳類悪
液質の現実的なモデルをおそらく表現するものではない
。生体内状況をモデル化するためこれら細胞をより忠実
に利用するよう、成熟脂肪１１１１１１培養体がつくら
れこの細胞にメディエータが添加された。メディエータ
に４乃至６日さらした後、多くの細胞はその中性リビド
を失った。典型的な実験において、細胞の７０−８０％
は、メディエータがこれら培養体に最初に添加された詩
人型すピド滴を有している；６日後、細胞のほぼ１０％
は同定可能トリグリセリドをスーダン■痕跡上に右する
。第１５図に示ずように、脂肪特異ｐｌＲＮＡの変質は
りピド可動化よりも迅速に生ずる。成熟ＴＡ１脂肪細胞
にメディエータ添加後１２乃至２４時間で、このような
ＲＮ＾レベルは９０％以上減少することが観察された。 かくして遺伝子発言の劇的かつ座標的な変質は、リピド
メディエータ誘導可動化に第一の重要性となっているよ
うにみえる。 これらのデータを集めた特定手順を示す図の説明は以下
の通りである。 剃バ５ ： １０Ｔ／２Ｃ１８細胞の５−アザシヂジン
処理に由来する安定した脂肪生成細胞系である丁ＡＩ細
胞が、１０％熱不活性化ウシつ児血清を補充したイーゲ
ルベ−ザル培地で生長した。１０ツＭメキサメクゾンが
、合流後最初の３日間培地中に存在し、合流後最初の６
日間５μｇ／１１ウシインシュリンが存在した。マクロ
フフ７−ジ細胞系ＲＡＷ２６４からの調整培地を、１０
μの濃度で合流２日前に予備脂肪細胞培養体にまず添加
した。 これは培養脂肪細胞のリポプロティンリパーゼ活性の９
０％を抑制した。細胞にはホルモンを０日（合流口）、
３０目に再補充した。細胞は６日目に回収した。全ＲＮ
＾が、チャーゲインほかによりＢＩＯＣＩＩＥＨＩＳＴ
ＲＹ、 １８号、 ５２９４−５２９９ページ。 １９１９年記載されている方法で分離し、点ブロワ１〜
装置（ＢｆｌＬ）中のニトロセルローズに適用した〇ニ
ックは、発言が分化丁＾１脂肪細胞のみに見られる遺伝
子のｃＤＮＡクローン（クローン１．ｉｏ。 ４７及びグリセロフエスフエートデヒドロゲナーげ）を
書き直し、またβ−アクチンｃＤＮ＾クローン（Ｐ、ガ
ニング及びり、ケーデスの行為による）を、チャブマン
はか（既述）に記載されている交雑条件下でこれらフィ
ルターを探査するために使用した。フィルターを洗浄し
、強化スクリーンを用いて、−７０℃でＸＡＲ５フィル
ムに露光した。 北封］：第１２図について記載されたようにして点プロ
ットが形成された。メディエータ（Ｋ）が、示された時
間に培地中に存在していた。 ＲＮＡは、合流優６，９及び１２２日目クローン１のｃ
ＤＮ八について分析された。 第１４図：転写アッセイが、バニスほかによりＰＲＯＣ
，Ｎ＾ＴＬ、八ＣＡＤ、Ｓｃ Ｉ 、、ＵＳＡ、８１号
、 ４２４１−４２４５ページ、 １９８４年、及び
イスラエルとホイットロツクによりＪ、 ８１叶、 Ｃ
ＩＩＥＨ，、２５９号、 ５４００−５４０２ページ、
１９８４年、に記載され、ナイトはかにより脂肪細胞
について修正されたような方法を使用して行なわれた。 培養細胞は４℃に冷却され、培地が吸引され、りんＷ１
塩緩衝食塩水で洗浄された。１１１の低張性緩衝液（２
０ｍＨのトリ／ ＨＣ１。 ｐＨ８，０；４ｍＭのｈｘ（Ｊ２； ６ｍＭ（７）Ｃａ
Ｃｆ２： ０．５ｍＭ１７）シラオスレイ１−−ル〉
がプレートに添加された。 ５介接、１１！の溶解緩衝液（０，６Ｈのショ糖。 ０、２％のＮＰ−４０，及び０．５ｍＭのジチオスレイ
１−−ル）が添加し、細胞を組織培養器から掻き落した
。ダウンス均質化の後、核が５００ｇのベレット化され
、再懸濁緩衝液（０，２５Ｍのシヨ糖：１０ｍＨのトリ
／Ｈ（Ｊ、 Ｄ１１８．Ｏ： １０＋１１８の−（Ｊ
： １ｍＭのジチオスレイトール）で一度洗浄され、
再ペレッ１〜化され、次いで５０１１１１４のへ−ブス
、ρ１１８．０ ：９０ＩＩＨのＮＨ４Ｃ９： ５１１
１８の−Ｃ１： ０．５ｍＨのＨｎＣ第２ ；２ｍＨ
のジヂオスレイトール： ０．１＋ＤＨのＥＤＴＡ
；それぞれ０．４１１１４の＾ＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ
： １０％グリセロール；及び１０Ｈｇ／ｘｉのウシ血
清アルブミン中で再懸濁した。核は２ｍＣ１／ｉｆの濃
度で３２Ｐ−ＵＴＰ（６０（ｌｃｉ／１ｍモル、 ＩＣ
ｔｌ）と共に、４０分間２５℃でゆるやかに揺動させな
がら培養した。 ＲＮＡは、スミスほかがＣＦＬＬ、 １５号、 ６１
５−６２６ページ、 １９７８年に記載しておりナイト
ほかにより修正した方法によって核から回収し、交雑さ
せて線状ｃＤＮ＾しとし、これはニトロセルローズフィ
ルターに適用し、真空オーブン中で、８０℃で２時間悦
いた。フィルターの予備交雑及び交雑条件はフリートマ
ンはかにより、ＣＥＬＬ、 ３８号。 ７４５−７５５ページ、 １９８４年に記載されている
通りであった。交雑は３日間、４２℃で、クローン１及
び２８、及びβ−アクチンとｐＥＨＢＬプラスシト比較
例について、脂肪ｃＤＮへの点に１５０μノの容積で、
反応混合物あたりほぼ１５Ｘ１０６Ｃｐｌで行った。 ｉｌｌ：メジエータ物質の１０μｍ／１！が、第１２図
に記載されたように分化した６８目脂肪ＩＩＩ 胞培養
体に添加された。全１１８へは、メディエータにさらさ
れた優指定した回数ビスから分離され、点プロット装置
（シュライヒ１７−及びジュール）によりニトロセルロ
ーズに適用した。 フィルターは指定したｃＤＮＡｒ″探査され、洗浄され
、ラジオオートグラムが作られ、レボーティングインテ
グレータにとりつけたホーフｙＧｓ３００型濃度計（ヒ
ユーレット−バラカード社製）を用いて走査された。示
された点は、細胞のＲＨＡを合計するようにｃＤＮＡプ
ローブを用いて適用１１Ｎ＾のけの差を標準に一致させ
た。 第１５Ｂ図：これらノーザン分析のため、１２μｑの仝
ＲＮ＾が最終濃度である２、２Ｈホルムアルデヒド、３
０％ホルムアミド、 １０１ＭのＮｈ Ｈ２ＰＯ４、Ｄ
１１７．０に導入され、５６℃で１５分間加熱された。 試料は、マニアチスほかにより“分子り０−ン：実験室
手順”にューヨーク州コールド スプリング ハーバｍ
：コールド スプリング ハーバ−ラボラトリ、 ２
０２−２０３ページ。 １９８２年）、に記載されているように２．２Ｈのホル
ムアルデヒド、２０ｍＨのＨＯＰＳ、 ＤＩ＋７．０
、 ５．０１Ｈの酢酸す（〜リウム及び１１のＩＥＯＴ
＾、の最終濶匪の１．０％アガローズホルムアルデヒド
ゲル中で電気泳動させた。ゲルは蒸留水で３分間洗浄し
、１０ｍＨのＮａＰＯ＋ （Ｄ１１７．４）及び１ｍ
ＨのＥＤＴＡで２回３０分間の洗浄を行い、次いでニト
ロセルローズに移した。挿入部は、クローン４７ＤＮＡ
でブＯ−ブした典型的なノーザン分析を示す。 以上に述べた実験は、先に発見されたメディエータ物質
に対応する内毒素刺激マクロファージの粗調整培地と、
ボイトラーはか（既述）により最近、均質化するまで精
製されたプロティンカシエフチンの双方を用いて実施さ
れた。比較試験がインク−０イキン１（マウス組換えＩ
ｔ−１，ホフマンーラロシュ社のＰ、ロメディコの行為
による）を用いて行われ、■シー１は脂肪細胞分化を抑
制しないことがわかった。かくしてメディエータ物質と
このモジュレータ物質カシエフチンの両方が脂肪細胞分
化に抑制的な影響を与える。 大】１九■ この実験においては、筋肉細胞によるグルコースの取り
込み及び新陳代謝の活性が研究された。侵入刺激に応じ
て生ずるショックに随判する異化活性を促進するのと同
じ因子が、同様にショック中に存在する低血糖を招束す
るグルコースの消費に影響を及ぼし或いはいくらか原因
的な効果を与えていることが推論された。 この仮訳を支持するものとして、皮下注射されるメディ
エータ物質の粗試石は、内毒素抗性Ｃ３１１／！ＩｃＪ
マウスにおける低血糖の原因となること、また、粗メデ
ィエータとモジュレータであるカシエフチンの双方が２
−デオキシグルコース移動を増加すること、が観察δれ
た。従って粗メディエータ及びこのモジュレータは、共
に、感染に応答する新陳代謝の制御にある役割を果して
いることが疑われ、粗メディエータ物質、このモジコレ
ー夕、カシェクヂン、と共にインターロイキン１を加え
て比較研究を行い、し６筋肉ａｔ胞に；Ｊ３
する血清及び肝臓のリピド″ＣＬＩＮ、 ＩＮＶＥＳ
Ｔ、 ２４号、６２３ページ以下、 １９４５年：又シ
コン１．ガリンほかによる゛感染にお【Ｊる面清すピド
” 、 Ｎ、ＥＭＧＬ、Ｊ、ＨＥＤ、２８１号、１０８
１−１０８６ページ、 １９６９．１１．１３； Ｄ、
ファルスチはか、“つ号ギの血清リビドに及ぼす三種の
細菌感染の効果” 、 Ｊ、ＢＡＣ［：Ｒ１０Ｌ、９５
号、 １６１５ページ以下。 １９６８年： Ｓ、Ｅ、グロスベルブはか、゛ニワトリ
胚におけるビールス感染による過類詣質血症：新しい症
候、 ＮＡＴＩＩＩＩＥ（口＞トン＞ 、 ２０８号
、９５４ページ以下、 １９Ｇ５年；ロバート［、ヒル
シュはか、゛細菌性内山素を静脈内注射したウサギにお
ける過類脂質血症、脂肪肝及びブロムスルフＡフタレー
ン停滞” 、 Ｊ、ＬｒＰＩＤ、ＲｒＳ、 ５号、
５６３−５６８ページ、 １９６４年；オザム サカグ
チはか、“内Ｆ＋ｊ索を注ｍしたマウスにおけるリピド
代謝の交代”、 ＨＩＣＲＯＢＩＯＬ、 ＩＨＨＩＩＮ
ＯＬ、２３号（２） ７１−８５ページ、 １９７９
年：Ｒ，Ｆ、カムシュミット、゛内毒素耐性Ｃ３１１／
１ｌｅＪマウスにおける部分的に精製された白血球内生
メディエータの活性”、Ｊ、Ｌ＾Ｂ、ＣＩ−ＩＮ、ＨＥ
ｏ、 ９５号、６１６ページ以下、 １９８０年；ラル
フＦ、カムシュミット、白血球内生メディエータの活性
”、 Ｊ、ＲＥＴ、ＳＯＣ，２３（４１号、 ２８７
−２９７ページ、 １９７８年：を参照。 更に出願人には、感染に対し宿主応答に関係するように
見える“メディエータ（中間物質或いは媒介物１ｇｉ＞
の同定及び存在を論じた文献が知られている；特に以下
の論文を参考のために列挙する：サイブＪ、Ｄほか、Ｊ
、ＥＸＰ、ＨＥＤ、、 １５０号、 ５９７−６０
６ページ、 １９７９年；バーニー、 Ｃ，Ｃ。 １、ｔｌｆｉ、 ＬＩＰＩＯＮ、 Ｊ、Ｈ，（Ｅｄ、
） 、 ＦＥＶＥＩｔ ： ＩＮＴＥＲ−Ｎ＾Ｔｌ０Ｎ
八Ｌ ５ＹＨＰＯ３ＩＵＨ、テキザス州ダラス。 １９７９、 ４月 １１−１２日、 ＸＩＩ＋２６３ベ
ージ； ＲａｖｅｎＰｒｅｓｓ： 二１−３−り、 ｌ
ｌ１ａｓ、ｌ５ＢＮ ０−８９００４−４５１−１（０
８８７７） 、 ０（０）、 １１１−１２２ページ
、 １９８０年；ディナレロ、Ｃ，Ａ、、 “ヒト白
血球性発熱質：放射線免疫アッセイの純化及び発展”
、 ＰＲＯＣ。 ＮＡＴＬ、 八ＣＡＤ、５Ｃ１−，ＵＳＡ、７４（１
０）号、 ４６２４−４６２７ページ（１９７７年
１０月）。上述論文の筆各、カムシュミットによる論文
の’ｆ１６及び共同執筆者のそれぞれによって同定され
研究された因子のすべては、インターロイキン１として
同定される因子の単一群を含むことが確認された。この
確認はチャールスＡ、ディナロによる論文、 ＲＥＶＩ
ＥＷＳＯＦ ＩＮＦＥＣＴＩＯｌｌＳ ＤＩＳＥＡＳＥ
Ｓ、第６巻、１号（１９８４年１月−２月）に文書化さ
れており、その内容も参考迄に組み込まれている。 出願人は、ＬＰＬ活性の同様の欠如が大腸菌リポポリサ
ッカライド（ＬＰＳ）の投与１ｃ３Ｈ／１ｌｅＮマウス
にみられることに注目した。これと対照的に、ＬＰＬ活
性のｌ員失は、通常ＬＰＳ ｌ、：耐性のあるＣ ３１
１ ／ ｔｌ ｅ Ｊマウスには見られなかった。内毒
素誘ｉ ＬＰＬ欠如に対−づ゛るこの抵抗性は、２日前
にＬＰＳを注射した内毒素感応動物から得られた血清を
投与することにより欺くことがＣきる。同様に抵抗性は
、感応マウスから得られた、内山素刺激チオグリコレー
ト引き出し腹腔マクロファージを注射することにより克
服される。これらの発見は同時係属の親出願である米国
特許出願第４１４，０９８号に詳細に記載されており、
その内容は参考に本願に組み込まれている。 以上の研究は、“°メディエータパが存在すること、そ
して動物宿主のエネルギー貯蔵細胞の全体的な同化活性
に茗しい影響を及ぼすと考えられることを、確信する発
明者達の信念により促進された。この“メディエータ”
はある種の同化酵素の活性に抑制効果を及ぼすことが考
えられ、その活性減少は、感染侵入の応答として、動物
宿主がショックとして知られる状態に入る場合に観察さ
れた。その結束の、内毒素刺激腹腔マウス滲出Ｉｌｌ胞
により生成されるメディエータの内毒素感応マウス及び
内ｔＢ素不感応マウスに及ぼす影響の関係、及び同化酵
素活性測定のための試薬の、このような研究による開発
、については生に放棄された米国特許出願第２９９，９
３２号に記載されている。 この系の研究が更に３＋３−１１ ”前脂肪１ｆＩＵ胞
°′型の系に関連して進められ、′メディエータ″に封
する抗体の開発のための方法及び材料にかかわる研究、
及びその診断手順については、放棄された米国出願第３
５１．２９０号に記載されている。 その後の米国出願第４１４，０９８号において、マクロ
ファージ細胞の内毒素刺激に由来するメディエータ物質
は、同化酵素であるリポプロティンリバーぜ、アセチル
コエンジムへカルボヤシラーじ及び脂肪酸シンセターげ
を抑制する活性を示したこと、また赤血球関与細胞の成
長及び分化を抑圧ザることを確証した。 最後に述べた特許出願の出願模の研究により、先に同定
されたメディエータ物質はその内に、分離及び検査の結
果、多くの活性を有する蛋白成分を含有しており、これ
は、メディエータ物質、及び当稟省にインターロイキン
１ （ＴＬ−１）及びインターロイキン２（ＩＬ−２）
として同定され知られている他の因子とも異なるもので
あることの発見に至った。従って本発明は、この新しく
発見された蛋白質分離物及びその活性、ならびにこの分
離物による診断的及び治療的な適用にかかわる。 （本発明の要約） 本発明の第一の局面においては、メディエータ物質（中
間物質）の、新しく発見された分離物が開示され、この
分離物は、同化酵素であるリポプロティンリパーゼ（Ｌ
ＰＬ）の活性を実質的に完全に抑制する能力を発揮する
蛋白質を含み、また、脂肪細胞の分化を阻止し、筋肉細
胞におけるグルコースの取り込みを増大させることがで
きる。しかしながらこの蛋白質は白血球試活活性に欠け
、この特徴は、集合的にインターロイキン１と呼ばれる
既知因子と区別されるものである。その肯定的な活性と
して、このモジュレータ物質はもつとも署しクシＰＬ活
性を抑制し、これはインターロイキン２と異なるもので
あり、そのため悪液質の羅患にかかわると考えられる。 以上の特性を有する特定の蛋白質が分離され、これは分
子けがほぼ１７キロダルトンであり、ｐｌがほぼ４８で
あることがわかった。 既に１本べたように、このモジュレータ物質は侵入刺激
を伴う物質でマクロファージ細胞を刺激することにより
調製される。特に、種々の入手先から１ｑられたマクロ
ファージ細胞の標本を、内毒素やトリパノゾーマのよう
な刺激物質で培養し、同時継続米ｌ特許出願第４丁４，
０９８号に開示されるメディエータ物質を生成する。こ
の培養は２４時時間でのある時間をかけて行われ、正確
な時間は培養に選択される細胞により変る。 この培養の後、培地は遠心分離法により適切に処理され
て、粗メディエータ物質を含む上澄液をとる。次いでメ
ディエータ物質をこの上澄液から、例えば硫酸アンモニ
ウムの４０−６０％溶液を用いて沈澱させる。その後、
粗メディエータ物質を一連の分離手順１例えば等電焦点
化及びゲル電気泳動、を施し、その後モジュレータ物質
を回収する。本発明は、当然に、ｔシュレータ物質調製
の別の手段をも含んでおり、これは、適用可能な場合に
は公知の遺伝学的再現法を含み、従って本発明は、この
ような合成的な調製法ちを意図している。 より詳しくは、本発明のモジュレータ物７１は、ヒ１へ
にみられる腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）として知られる公知
蛋白質と、検査及びＧ１究によりある程度類似性を右す
るように見えるポリペプチドを含む。 従って、本発明はまた、マウスについて決定され以下に
、及び第２３図に示されるアミノ酸連鎖を右してあられ
れる特徴及び上述活性を有する蛋白質をも含む。 １、ＥＵ ＡＲＧ ＳＥＲＳＥＲ５ＥＩＩ ＧＬ
Ｎ ＡＳＮ ５ＥＩＩ ＳＥＲＡＳＰＬＹＳ
ＰＲＯＶＡＬ ＡＬＡ ＩＩＴｓ ＶＡＬ Ｖ
ＡＬ Ａ１．Ａ ＡＳＮ ｌｌｌ５ＧＬＮ Ｖ
ＡＬ ＧＬＵ ＧＬＵ ＧＬＮ ＬＥＵ Ｇ
Ｌｔｌ ＴｒｌＰ ＬＥＵ ５ＥＩＩＧＬＮ
ＡＩｔＧ ＡＬＡ ＡＳＮ へ１八 ＬＥＩＩ
Ｌｕ１ｌ ＾１＾ ＡＳＮ Ｇｌ−ＹＨＥ Ｔ
八ＳＰ １−Ｅｌｌ １−ＹＳ ＡＳＰ ＡＳ
Ｎ ＧＬＮ ＬＥＵ ＶＡＬ ν＾ＬＰＲＯ＾
Ｌ△ ＡＳＰ ＧＬＹ １−ＥＩ ＴＹＲＬＥＩ
Ｉ ＶＡＬ ｒＹＲ５ｒＲＧＬＮ ＶＡＬ Ｌ
［Ｕ ＰＩＩＥ ＬＹＳ ＧＬＹ ＧＩＮ
ＧＬＹ ＣＹＳ ＰＲＯＡＳＰ 丁ＹＲＶＡＬ
ＬＵＵ ＬＥＩＩ １＋１Ｒｌｌｌ５ 丁＋１
ＲＶＡＬ Ｓ［ＲＡＲＧ ＰＩＩＥ ＡＬＡ
ＩＬＥ ＳＥＲｔＹＩｌｌ Ｇ１．Ｎ ＧＬＵ
ＬＹＳ ＶＡＬＡＳＮ Ｌ［Ｕ ＬＥｔｌ
Ｓ［ＲＡＬＡ ＶＡＬ ＬＹＳ Ｓ［ＲＰＩＩＩ
ＯＣＹＳＰＩＩＯＬＹＳ ＡＳＰ ＴＩＩＲＰＲＯ
ＧＬＵ Ｇ１．Ｙ ＡＬＡ Ｇ１．Ｕ Ｌｕ１
ｌＬＹＳ ＰＩｔＯＴＩｔＰ ＴＹＲＧＬｔｌ
ＰＩｔＯＩＬ［ＴＹＲＬＥＩＩ Ｇ１．ＹＧＬＹ
ＶＡＬ ＰＩＩＥ ＧＬＮ Ｌ［Ｕ ＧＬＵ
ＬＹＳ ＧＬＹ 八ＳＰ ＧＬＮＬＥＩＩ
ＳＥＲＡｔ−Ａ ＧＬＵ ＶＡし 八ＳＮ ＬＥ
ＩＩ ＰＩＩＯＬＹＳ ＴＹＲＬｒＵ ＡＳＰ
ＰＨＥ ＡＬＡ Ｇｌｕｔ ＳＩＲＧＬＹ
ＧＬＮ ＶＡＬ ＴＹＲＩ’ｌｌＥ ＡＲＧ
ＶＡＬ ＩＬＥ ＡＬＡ ［Ｅ（１以上の連鎖は、
後に示すように公知のヒトＴＮＦ連鎖とある点で類似し
、またある点で区別される。更に、上記アミノ酸連鎖と
ｍＲＮＡ連鎖の最近の分離によって、従来の組換型遺伝
子工学技術によるモジュレータ物質の再生が可能になっ
た。 本発明は更に、このｆ：シュレータ物質により影ヤ！を
受ける活性を抑制する侵入刺激の能力を調べることによ
り、侵入刺激を検出する方法を含む。特に侵入刺激は、
ＬＰＩ 話慴を抑制し、脂肪細胞分化を防止し、或いは
筋肉細胞にお（］るグル〕］−ス取り込みを増大する侵
入刺激の能力により検出される。この方法において、例
えばＲＡＭ２６４．７細胞系に由来するマクロファージ
細胞は、内ｌｉ素、１−リバノゾーマ等の多数の刺激物
質を、比較例として、接種され、一方これと平行して、
細胞標本に感染刺激推定部位からの抽出物を注射する。 この後ずぺての標本は上述の方法により培養され、次い
で同じく上記の方法を用いて一連の分離手順が行なわれ
、比較例及び未知標本から得られる分離物の試験結果を
比較して、発生したモジュレータ物質が（もしあるとず
れば）同一であるか或いは類似するらのであるか、を比
較した。 同様にして、モジュレータ物質の効力を消すために有効
と考えられる薬剤のスクリーニングのためのアッセイ系
を調製した。ある場合には、試験薬剤は刺激を受りたマ
クロファージ標本に対し、モジュレータ物質の生成に及
ぼす効果を決定するために投与することができる。別の
手に１においては、モジュレータ物質は、例えば３Ｔ３
−１．１系などの細胞試験系に導入することができ、予
想される薬剤を生成細胞１８養体に導入し、次にこの１
８苔休に対し、予想される薬剤を中独に添加することに
より、或いは既知モジュレータ物質の添加量の効果によ
って、しシュレータ物質に生ずる変化を観察する。 本発明はまた、本発明によるモジュレータ物質の活性及
び存在を測定することにより、哺乳動物における侵入刺
激の存在を検出する方法に関する。より特定すると、モ
ジュレータ物質の活性は、適切にラベルしたけのこの物
質を使用することにより後に説明したアッセイ法により
直接に調べることができる。或いは、モジュレータは、
ラベルに例えば血清などの培地に導入することのできる
結合パートナ−或いは抗体を作るように使用することが
でき、それによりモジュレータ物質の存在を試験し、か
くして培地をとりだした宿主の感染状態を検定すること
ができる。 このようにして、モジュレータ物質及びこれに対して生
成した抗体の双方を様々の診断技術と関連して使用する
ことができ、このような診断技術は、放射能添加、ホウ
化水素ナトリウムによる還元、或いは放射線ヨウ素処理
法でラベルされているモジュレータ物質に対する抗体を
使用づ゛るような、例えば放射線免疫アッセイを含む免
疫アッセイ法があげられる。 免疫アッセイにおいて、調整子の七ジル−タ物質、その
抗体等を調製し、醇累、特巽結合パートナ−及び／或い
は放射性元素をラベルし、これを侵入を受けていると考
えられる哺乳動物の血液試料中に導入する。ラベルした
物質或いはその結合パートナ−が標本中のレセプタ位冑
と反応ηる礪会をもった後、生成物を公知検出方法（こ
れはラベル処理が行なわれるラベルの性質により変る）
により検査する。 同位元索 Ｃ，１，ｔ−１，１，Ｓ のような放射能ラベルが使用される場合、公知の、現在
採用されているカウント法が利用さ゛れる。ラベルが酵
素である場合、検出は、当業者に知られている比色法１
分光法、蛍光法、気体定準法のいずれかによって行４１
われる。 本発明は、モジュレータ物質活性の定量分析のための試
験キラ１−の形のアッセイ系を含む。 この系或いは試験キットは、上述の放射線技術及び／も
しくはＭＭ技術を用いてラベルをモジュレータ物質にラ
ベルすることにより得たラベルした成分；及び一種もし
くは数種の免疫化学反応剤；とからなり、前記化学反応
剤の少なくとも一種は、前記ラベルした成分、その結合
パートナ−８決定される成分の−・種或いはその結合パ
ー［〜ナー、のいずれかと結合することのできる遊離配
位子もしくは不働態配位イである。 別の実施態様において、本発明は哺乳動物に４３けるシ
ョックの発生防止に関係するある治療方法に関わり、こ
の方法は、モジュレータ物質の存在及びシコック促進活
性の検出、及びその１！２シヨツクの発生防止に十分な
量の、［シュレークに対する抗体を投与することを含む
。よりＴｉ定すると、ここで言及される治療法は、同化
Ｐ？を素１−ＰＩの活性に及ぼリモジュレータ物質の直
接的で茗しい効果に鑑み、モジュレータ物質に対する抗
体の投与による悪液質治療方法を含む。 また、モジュレータ物質は適当な形態で調製され、侵入
刺激に応答してモジュール物質の存在により生ずる悪液
質或いはショックなどの症状にりＮ１シ、哺乳動物を免
疫化するために投与される。更に、侵入刺激に応答して
モジュレータ物質の合成ができなくなるように、動物を
ｖＡ寮し、適訳し、或いは遺伝工学的に改良することが
できる。 従って、動物の肥満症治療方法が含まれ、この方法は、
有効量のモジュレータ物質を適当な組成物の形で投与す
ることを含む。同様に、モジレータ物質或いはその結合
パートナ−を含む薬剤組成物が考えられ、これは、有効
量の成分を要理的に受り入れられるを担体及び／もしく
は他の添加物と共に含んでなる。 本発明の更に別の局面は、腫瘍性の新生物細胞の治療に
本発明モジュレータ物質を補足的に適用することにかか
わる。本発明のモジュレータ物質と腫瘍壊死因子（ＴＮ
Ｆ）との間にＶＡ察される類似性があることから、この
モジュレータ物質はＴＮＦのある秤の活性、叩も腫瘍細
胞を溶解する能力を有することが考えられる。従って本
発明はまた、腫瘍細胞〕ロニ〜を攻′泡し殺滅するため
モジュレータ物質及び／もしくはその適当な配位子を治
療的に投与することを含む。このような場合、モジュレ
ータ物質は適当な吊で、同様な態様でＴＮＦに関し採用
されている処置に加えて投与され、１１Ｉ胞殺滅を行う
ようにする。 正確な投与量、投与方法その他の詳細は、特定腫瘍形態
学に関連して、ＴＮＦについて採用するこれら要木を考
慮して熟練した国名により決定される。 （本発明の目的） 従って、本発明の主たる目的は、哺乳動物におけるある
同化酵素活性に抑制的な効果を与える、モジュレータ物
質の調製方法を提供することである。 本発明の別の目的は、例えば感染などの侵入刺激が存在
づ゛ることが疑われる哺乳動物において、モジュレータ
物質の存在を検出する方法を提供することである。 本発明の更に別の目的は、哺乳動物におけるモジュレー
タ物質の有害な影費とたたかうために効果があると思わ
れる薬剤等の物質をスクリーニングする方法、及び関連
するアッセイ系を提供することである。 本発明の更に別の目的は、モジュレータ物質の活性の有
害な効果を和らげるかそらＶるため、この活性を調製す
る哺乳動物の処理方法を提供することである。 本発明の更に別の目的は、モジュレータ物質或いはその
結合パートナ−をベースとする、治療方法のための薬剤
組成物を提供することである。 本発明の更に別の目的は、本発明のモジュレータ物質を
利用する腫瘍組織の治療方法及び組成物を提供すること
である。 本発明のその他の目的及び利益は、添附図面と関連して
説明される以下の記載を参照することにより、当業者に
は明らかになるであろう。 （本発明の説明） 本発明はその一つの局面においては、本明細害において
七ジル−タ物質もしくはカシエフチン（ｃａｃｈｃｃｔ
ｌｎ）と記載する特定因子の分離及び同定に関し、この
モジュレータ物質もしくはカシエフチンとは、例えばバ
クテリア、ビールス、ある種の腫瘍、プロ１−シア、及
び例えば内ｉｂ素などのその他の毒素のような侵入性刺
激を特徴的に伴う刺激物質と記載する物質により刺激を
受けるマクロファージ（大食細胞）及びマクロファージ
細胞系に存在することが知られている。親出願である米
国特許出願第４１４．Ｏ’Ｊ８号に１１１示される中間
物質に対し、本発明のモジュレータ物質は前記中間物質
の一つの成分であることが確認されでおり、この［ジコ
レータ物質はｌｉ乳類細胞のある種のものに新陳代謝を
生じさけ、それにより層比状態から異化状態に変化さけ
て宿主を侵入性刺激に対し身（８えさせる能力を右Ｊる
ように見える。 特に本発明によるモジュレータ物質は同化酵素リポプロ
ティンリパーゼ（Ｌ、ＰＬ）を作用を抑圧するようであ
り、かくしてこのことは宿主の免疫系とそのエネルギー
貯蔵組織の連通系の一部としての作用を果すことを示唆
している。このモジュレータ物質はまた脂肪細胞の分化
を阻害するようであり、筋肉細胞中のグリコーズの取り
込みを増大するから、理論上、侵入刺激に応じ作用して
脂肪組織、筋肉などのエネルギー貯蔵組織に対し影費を
及ぼし、それにより侵入物とたたかうエネルギーの差し
迫った必要に応するようにすると考えられる。このよう
にしてモジュレータ物質は宿主の細胞活性の異化状態へ
の変換を促進して、侵入物とたたかうエネルギーを供給
しうるようにする。侵入が短期間である場合には宿主は
迅速に回復し消費したエネルギーを補充する。しかし侵
入が連続的であるが慢性的な性質のものである場合には
エネルギーの消尽、悪液質、ショック、そして最終的に
は死に至る。 本発明のモジュレータ物質の一つの態様においては、分
子間がほぼ１７，０００ダルトンであり等電点がほぼ４
．７−４．８である蛋白質を含むことが確認された。こ
の特定されたモジュレータ物質は二〇１体或いはそれ以
上の多母体で存在しており、このことは、その分離につ
いての研究結果から確認されており、実施例■及び■に
記載されている。この試験結果では更にモジュレータ物
質が、ｍ胞の＾い親和性を有する特定の需要体と相互作
用して結合することが確められた。 特に実施例工のデータは、細胞あたりほぼ１０４のＢ親
和性結合部位の存在、及び対応する結合定数（Ｋａ）が
３×１０９であることを示唆している。後に記載するよ
うに、このことは、本発明のモジュレータ物質の活性及
び特に結合機構が明らかに際立っているため、本発明モ
ジュラ−物質と公知技術による既知因子との間の構造的
及び機能的な相違を示唆するものである。モジュレータ
物質の別の特徴は、内毒素に基づくショックを阻止する
ために有効な抗体を発現させることができることである
。このことは実施例Ｘに示されている。 以上に述べた活性のｔよか、本発明のモジュレータ物質
はある活性をもたないという点でも特徴ずけられる。特
に本発明のモジュレータ物質はメディエータ物質（中間
物質）に比し、同化Ａｔ’素アセヂルコエンジム（補Ｍ
素）Δカルボギシラーピと脂肪酸シンセターゼのいずれ
がを抑圧１°る能力をもたないか、或いは赤色細胞の成
長及び分化を阻止する点で異なっている。同様にこのモ
ジュレータ物質は公知因子であるインターロイキン１に
対し、白血球活性剤活性をもたない点でことなっている
。またこのモジュレータはマウスにおける発熱、或いは
筋肉蛋白質劣化を生じさせる能力が欠けているようであ
る。 モジュレータ物質とそのプリカーサ（前駆物質）である
メディエータ物質の双方の特徴を同定するために役立つ
活性の以上のような相違は、後に記載する実施１９１に
極めて詳細に記載されている。 〔シュレータ物質の調製については、先にごく簡単に論
じられており、種々の細胞の培養を開始することにより
、侵入性刺激を生ずる刺激物質を処理しうろことが確認
されている。特に１８１胞系ＲＡＷ２６４．７はプリカ
ーサであるメディエータ物質の調製を開始するために利
用することができ、このメディエータ物質からモジュレ
ータ物質を分離することができる。特に、後に詳細に説
明するようにマウスのマクロファージ細胞系ＲＡ計６４
．７を使用することによって、分析及び精製をするため
に十分なｌの分列を行うことができる。当然のことでは
あるが他の細胞系を用いてモジュレータ物質を分離する
だめのプリカーサであるメディエータ物質、もしくはモ
ジュレータ物質それ自体を調製することができ、本発明
はこのような可能性を除外するものではない。従って別
の手段、例えば遺伝子工学的再現による方法も本発明で
は考慮されている。 本発明によるモジュレータ物質は実施例■に示丈ように
マウスを用いて分Δ１され分析された。 その結果と１〜にみられるような公知の蛋白質腫瘍壊死
因子（ＴＮＦ）に若干類似することがわかった。実施例
■に見られるような実験の完了後の研究により、このモ
ジュレータ蛋白質の完全な連鎖の説明が可能になり、こ
の連鎖は第２３図に呈示さ゛れている。かくして成熟し
たモジュレータ蛋白質連鎖は１５６アミノ酸として定れ
される。 更にこのアミノ酸連鎖に関連するモジュレータの１ＩＩ
Ｉｔ ｔ４ 八を同定され、この開示された蛋白質の組
換型を調製するために採用された。採用された方法は、
内毒素誘導ＲＡＷ２ｆ３４．７細胞からｍＲＮ八を分離
し、ｍＲＮ＾を含む適当なベクター（！ｌ！介体）を調
製し、これを次に大腸菌に導入した。転換は、組換型ブ
ラズミドＤＮＡを用いて高い効率で生じた（即１う、μ
Ｃ００Ｎ＾あたりほぼ１０８組換型細菌）その後合成オ
リゴヌクレオヂドプローブ（長さ４５ｎｐ）が形成され
、溶解パクデリアコロニーによる位置雑種によりｃＤＮ
Ａライブラリーでスクリーニングするために使用され、
連鎖化はジデオキシヌクレオチド法により行われた。 以下の手順は未公開実験の仮枠であり、当業名にはよく
知られた組換型技術の一般原則の多くを採用しているも
のであることがわかるであろう。従って本発明はこのモ
ジュレータ物質の調製にかかわるものであるが、より詳
しくは、公知組換型技術による第２３図に示したアミノ
酸連鎖を有する物質の調製にかかわる。 実施例■に示したモジュレータのアミノ酸連鎖はヒトの
ＴＮＦに類似しているが、多くの特定アミノ酸単位に差
のあることは、蛋白質相互の間に類似性と共に相違点も
あることを示唆している。特に、マウス細胞の刺激に由
来するモジュレータ物質は、人間の腫瘍壊死因子（ＴＮ
Ｆ ）に関して最近得られた公知構造ｆ−夕との比較に
よる実施例■の研究から類似性と相違点とがわかり、相
違点は主としであるアミノ酸残基の数及び性質に由来す
るものであることがわかった。研究の結果更に、マウス
におけるしシュレータ物質のある活性が、ヒトのＴＮＦ
の耐腫瘍性能力に類似する能力であることを示唆してい
ることがねかつＩζ。 かくして本発明の別の局面においては、ある治療能力を
イイするモジュレータ物質が提供され、この治療能力は
、なかでも腫瘍細胞知能の治療について述べた活性のほ
か、非腫瘍竹細胞における同化酵素にかかわる活性を含
む。従って第一の局面においては、本発明は、腫瘍発生
細胞の治療方法を包含し、この方法は、その治療のため
適当な形態と態様で一定［ｉｌのモジュレータ物質を投
与することからなる。 モジュレータ物質或いはその結合体もしくはその伯の配
位子は薬剤組成物の形で調製され、適当なキャリアを含
み、腫瘍を右する息者に対しその治療のため種々の方法
で投与しうるような、適当な強度を右ηるように形成さ
れる。種々の投与方法を採用することができ、例えば皮
下注射、静脈性０４及び腸腔内注射、カテーテル法など
の非軽口投与法が含まれる。モジュレータ物質の平均投
与予は様々であり、特に資格ある医者の判断と処方を基
準にしなりればならない。 これに関連して、このモジュレータ物ｒｉ１は、先に概
略を述べたように非腫瘍発生／ｆｉｌｆ１１についての
治療効果も有し、従って例えば悪ｆ２質、ショックなど
の治療にも使用することができる。 特にこのモジュレータ物質は種々の闘乳動物と抗体自体
をつくりだすことが°でき、この場合、例えば溶解した
ネズミ牌臓リンパ球及び骨髄腫細胞を利用したハイブリ
トーン法のような公知の方法を採用することができる。 生成した抗体を次に適当な薬剤組成物に調製し、侵入性
刺激物を有する宿主に投与して悪液質を防ぐか治療１−
るようにする。 同様にこのモジュレータ物質は動物体に接種しうるのに
適した形にＡ装し、先述のようくべ疾病状態に対して免
疫をもたせるｊ；うにしてもよい。ある用途はｔｚ業用
動物に適用するものである。ｌＪらウシに、適当な薬剤
組成物に調製した免疫笥を接種し、それにより感染した
萌に体重の１０失に対して免疫があるにうにしてもよい
。 更にこれに関連して内毒素耐性マウスの研究により［シ
ュレータ物質の別の治療適用可能性が考えられた。この
適用について、動物は、侵入刺激に応じたモジュレータ
物質の生成に対する抵抗性をｇ４ｉ９にして観察され選
択される。免疫化につぎ、このことは農業用動物に同様
に実際的な適用可能性を付！Ｘｊするちのであり、例え
ばモジュレータ物質を合成することができるという基準
に填づいて選択された雌牛は、細菌或いはビールスの感
染を受けている間引続きミルクを出すことができる。別
の適用ｂ■能性は、動物を頂伝学的に改良してモジュレ
ータ物質の合成に抵抗性のあるようにするものである。 このことは、組換型のモジュレータ物質の調製に関し先
に述べたような公知の遺伝学的技術により行うことがで
きる。 以Ｆに）ホべたような腫瘍治療用途に関し、薬剤組成物
の正確な投与ト（１，投与間隔及び投与方法は、医療に
通じた人、資格ある医師の指示により変動してよい。 同様に悪液７１の治療についてもモジ」−レータ物質及
びモジｌレータ物質に対する抗体の双方を調製づ−るこ
とができ、ショック状態の冶ｆ仝に用いることができる
。投与は先述したような態様で行う。正確な投り吊及び
投与間隔は、被投与名の年齢９体重、全体的な健康状態
及びモジル−タ物質の濃度等を考慮して資格ある医師に
より決定されてよい。 別の治療用途は、モジュレータ物質の決定的な抑圧効果
を利用するものであり、従ってモジｌレータ物質は肥満
症の治療に用いられる。このような場合、適当な薬剤組
成物に調製されたモジュレータ物質は資格ある医師の処
方通りに肥満状態の患者に投与され脂肪分を除去し、そ
れににより肥満状態を軽減する。 本発明はまた様々の診断用途に適用され、これは、本発
明のモジュレータ物質により影費を受りる活性を限定す
る侵入性刺激を検出する方法を含む。既に、述べたよう
に、モジュレータ物質は種々の方法によってそれ自体の
抗体を作るために使用することができ、このような抗体
は分離して、疑わしい浦乳類宿主におけるモジュレータ
物質の存在を試験するために使用することがＣぎる。 しシュレータ物質に対する抗体は、よく知らｈｔζバイ
ブリド−７？人を含む標準的な方法でつくって分離する
ことができる。抗体はあたかも抗体に対する抗原である
かのように、別の秤に使用ザることもできる。いずれの
型の抗体もモジュレータ物質活性の存在と程度を決定す
るために使用することができる。便宜のため、モジｌレ
ータ物質に対する抗体を以下の説明ではＡｂ、と記載し
、別の種に適用される抗体をＡｌ１２と記載する。 侵入性刺激を保有していることが疑われでいる宿」−に
おりる［ジルレータ物質活性の存在（よ、このような目
的に適用される通常の免疫学的手順により確められる。 多くの有用な手順が知られている。特に有用な三種の手
順においては、検出可能イ１ラベルでラベルしたモジル
−タ物質が利用されるか、検出可能なラベルをラベルし
た抗体Ａｔ）ｌ 、もしくは検出可能なラベルでラベル
しＩご抗体Ａｂ２が利用される。これらの手順は以下の
式に要約される。式中の星印（１；）は粒子がラベルさ
れていること、また“’Ｎｏｄ”はモジｌレータ物質を
指ず： △、 ＨＯｄ ” ＋ΔＩ）＋ ＝ＨＯｄ ” Ａｂ＋
１３、Ｈｏｄ−＋ 八ｌ］＋ ＝ＨＯｄＡｂ １
＊Ｃ，Ｎｏｄ → Ａｂｌ 十 八ｂ２
＝ＨＯｄＡｂ Ｉ Ａｂ、 ”これらの手順及びその
適用はすべて当業者にはよく知られているものであるか
ら、本発明の範囲内で利用でさる。“競合的″な手順で
ある上記への手順は米国特許第３．６５４．０９０号及
び３、８５０．７５２号に記載されている。゛慣ナンド
イッヂ″の手順Ｃは米国再発行特許第３１，００６号及
び米国特許第４．０１６．０４３弓に記載されている。 これ以外の手順、例えば°゛二’ｔＫ体″法或い（ま“
″Ｄ八へＰ”法などら知られている。 い−リ゛れの場合でｂＴ：シュレータ物質は抗体もしく
は結合パー１ヘブーと複合体を形成し、複合体の一構成
体は検出可能なラベルでラベルされている。複合体が形
成されていること、及び必要な場合その１ｎがどれ位か
、はラベル検出に適用される公知の方法で決定すること
ができる。 以上の説明からΔｂ２の特徴的な性質は、これが＾ｂｌ
と反応することであることがわかる。これは、ある哺
乳類でつくられたＡｂ＋が抗体＾ｂ２を生成するための
抗原として別の種の哺乳類動物に使用されたからである
。例えば、Ａｂ２は抗原として＾ｂ１を用いて山羊で生
成することができるが、この＾ｂ２は従って抗ウサギ抗
体となりうる。このことの説明の便宜のためＡｂ＋ を
モジュレータ物質抗体と記載し、＾ｂ２をモジュレータ
物質抗体と反応する抗体、もしくは゛抗−抗体″と記載
する。 これらの研究のためにもつともよく使われるラベルはｔ
ｌｌ用性元素、酵素、紫外線にざらされた時には蛍光を
発する化学薬品等である。 ラベルとして使用することのできる多くの蛍光物質が知
られている。これらは、例えばフルオレセイン、ローダ
ミン及びオーラミンである。 特定された検出物質は、山羊中につくられイソヂオシア
ネートれによりフルオレセインと共役結合する抗つリギ
抗体である。 モジュレータ物質或いはその結合パートナ−らまた放射
性元素或いは酵素でラベルすることができる。放射性元
素は今日入手することのできるいずれかのカウンｌ一手
段によって検出可能である。好ましい同（り元素 Ｃ，
Ｉ、 Ｈ。 １２５ 、、及び３５ｓである。 酵素ラベルも同様に有用であり、現右利用することので
きる比色法９分光光磨法、蛍光分光度法或いは気体定量
法によって検出可能である。 酵素は、例えばカルボジイミド類、ジイソシアネート類
、ゲルタールアルデヒド等の架橋分子との反応により、
選ばれた粒子と共役結合１゛る。 これらの手順に利用することのできる多くの酵素が知ら
れている。 好ましいものはパーオキシダーゼ、β−グルクロンダー
ぜ、β−Ｄ−グルコシダーゼ、β−Ｄ−ガラクｌ−シダ
ーぜ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ、とパーオ
キシダーゼ、酸）４スフアターぜである１、米国特許第
３．６５４．０９０号。 第３．８５０．７５２号及び第４，０１６，０４３号は
例としてラベル物質及びその方法について開示している
。 本発明に従って開発され利用されるアッセイ（検定）系
はレセプタアッセイとして知られている方法である。レ
セプタアッセイにおいては、アッセイ（検定）される物
ｎ Ｌ、Ｌ適切にラベルされ、次いである細胞質試験コ
ロニー、例えば３Ｔ３−１１細胞系が先ず分化され、次
いである量のラベルされた物質が接種される。その後、
ラベルされた物質がどの程度細胞しけブタに結合したか
を決定ザるための研究がなされる。このようにして物質
相互の間の差異がｒｌｌＦ１課される。この手順は特に
後に５１丞する実施例■に述べられている。 かくして、実施例■に詳細に示されているように、ある
（ｊｌのモジュレータ物質が放０＝１色元累でラベルさ
れ、その後最近分化した３Ｔ３−Ｌ１１胞を用いて結合
度の研究が行われる。種々の量のラベルしたモジュレー
タ物質を含む溶液が！′１製され、細胞標本に接種され
その後培養された。 １（７られた＠Ｉ Ｉｔ’ｄ甲層を洗浄し、溶解し、標
準誤Ｚ″が５％以下となるのに十分な時間ガンマカｆク
ンターでカラン１−シた。このデータを次にスキ１！ッ
チＶ−ド（５ｃａｔｃｈａｒｄ ）分析処理し、そノ復
物質活性に関する観察及び結論が出された。以上の手順
は例示的なものであるけれども、アッセイされる物質の
細胞結合能力が特性となる場合にしけブタアラレイがど
のように行われ利用されるかが叩解されよう。 本発明の別の態様においては、医療専門家に使用される
のに増した商業的な試験キットが装造され、これは疑わ
しいへ１ｉ乳類宿主にＪハノるモジュレータ物質活性の
存否を決定するために使用される。上述した試験方法に
従いこのようなギッ１−の一種は少なくともラベルした
モジュレータ物？１もしくはその結合パー１− ノー
−、及びこれに特５′４性のある抗体を含む。別のちの
は少なくともへｂｌ とラベルしたＡｂ２を含む。史に
別のものは少なくともＡｂｌ と更に、もらろん選択さ
れる方法、例えば“′競合法″、゛サンドイッチ法”
、 ”ＤＡＳＰ法“°９等の方法に従い指示書を含む
。このキラ１〜は例えば緩衝剤、安定剤等の補助反応剤
を含んでいてもよい。 かくして、侵入性刺激に対する桶乳動物宿主の反応を顕
示するための試験キットは下記を含む： （イ）モジュレータ物質もしくはこれに特異性のある結
合パーｉ−ナーを、直接或いは間接に、検出可能ラベル
でラベルすることにより得られる所定５′Ｉの、少なく
とも一種のラベルした免疫化学反応成分； （ロ）他の反応剤；及び （ハ）４−ットの指示書。 より特定すると、診断キットは下記を含む：（イ）免疫
溶剤を生成するため一般的に固体相に結合されるか、或
いは適当なタグ札などの最終使用形態に結合されている
公知間の上記モジュレータ物質（もしくはその結合パー
１−ナー）； （［ｌ）必要によりその他の反応剤；及び（ハ）このよ
うな試験キットの使用説明書別の実施態様においては、
試験キットは共）本の目的を達成するために作られ使用
され、所定の処方（例えば゛競合法°′、゛サンドイッ
ヂ法ｆＴ、ＬＬ二川用体法″等）に従って作用するもの
であって下記を含む： （イ）モジュレータ物質を検出可能ラベルに結合するこ
とにより得られるラベルされた索子； （ロ）一種もしくは数種の補足的な免疫化学反応剤であ
って、そのうちの少なくとも一種は配位子もしくは不動
配位子であり下記の群： （１）ラベルされた素子（イ）と結合することのできる
＾ご位子； （ｆｉ）ラベルされた素子（イ）の結合パート太−と結
合することのできる配位子：（ｉｉｉ＞決定される成分
の少なくとも一種と結合することのできる配位子； （ｉｖ）決定される成分の少なくとも一種の結合パート
ナ−の少なくとも一種と結合することのできる配位子；
のうらがら選ばれる配位子である反応剤； （ハ）Ｆシュレータ物質とこれに特異性のある結合パー
トナ−との免疫化学反応による一種もしくは数純の素子
の検出及び／らしくは決定のため、処理を行うための指
示店。 以上のように、モジュレータ物質と反作用するのに有効
な潜在的な薬剤をスクリーニングするためのアッセイ系
が調製される１、第１手順では、試験薬剤が刺激を受り
たマクロファージ標本に投与されて、モジル−タ物質の
生成に及ぼす効果を決定する。別の手順では、モジュレ
ータ物質は３Ｔ３−ＬＩ系のような細胞試験系に導入さ
れ、考えられる薬剤が生成する細胞培養体中に導入され
このｍ Ｆ３首体は、薬剤の添加により、或いは公知モ
ジュレータ物ｖ１の添加１１１の効果がら、モジュレー
タ物質活性の変化が観察される。 既に述べたように、以下の実施例はＥシュレータ物質の
分離及び同定の詳細を示すものであると共に、このモジ
ュレータ物質と、出願人或いは当業界の人々によって既
に特定されている因子との間の活性の相違及び類似性を
示づ′ような活性にかかわるＩＩＱ察が示されている。 当然のことながら以下に示すような特定の物質及び方法
は単に説明のためだ１ノのものであり、従って以下の例
は本発明を限定するものではない。 （実施例） 凋旌Ｍユ 本実施例においては、３Ｔ３−Ｌｌｉｌｌ胞からのモジ
ル−タ物質の分離が行われる３４分離物の研究の結果、
これは１７キロダルトンの蛋白質であって、特定の畠親
和竹レセプタによＶ〕脂肪細胞及びいくつかの伯の細胞
型に結合するものであることがわかった。 割几又髪刀ユ ｕと月旦ｎ１″″ びバイオアッセイ： ３Ｔ３−１
−１細胞を１ウエルあたり１００，０００細胞の密度で
２４ウエルのリンプロプレート（フローラボラトリーズ
、インナーボレーテッド社製、バージニア州マクリーン
）に培養した。培地は１０％雌牛血清を補充したダルベ
コ社の修正イーグル培地（ギブコラボラトリーズ社製、
ニューヨーク州グランドアイランド）を用いた。 ３７℃で１０％ＣＯ２雰囲気中においた。培地は１日お
きに取替えた。１週間後、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ
） 、１０μｑ／１！のウシインシュリン、０．５ｍＨ
メチルイソブチルキサンチン及び１０ｎＭデキリメタゾ
ンを補充した培地で４８時間培養することにより細胞は
分化した。分化した細胞は、１０％ＦＢＳ及び５０ｎｇ
／ｌｆウシインシュリンを含む培地（１日おきに取替え
た）中で、１週間後バイオアッセイ或いは結合検査のた
めに使用するまで保持した。 ０．１ｘｉの８量のアッセイされる標本が、それぞれ１
．Ｏｉｆの培地を含む分化３Ｔ３−１１細胞の夫々のウ
ェルに適用され、１２乃至１８時間３７℃で、１０％ら
２Ｉ８養器中に７ｊかれた。この培７１の終用に培地は
吸引され、１０％ｒＢｓ 、 ５０ｎ（＋／ １１−１
’ンシ１リン及び１０ ＩＩ ／ ｘｉヘパリンを含有
Ｊる０、５’ｌｌの０１４［と交換した。３７℃で１時
間後、ヘパリン解放可能なＬＰＬ活性を、ニルソンーエ
ール及びシ］ツツ（Ｎｉｌｓｓｏｎ−Ｅｈｌｅ ａｎｄ
５ｃｈＯｔｚｌ法により測定した。 ＬＰＩ−活性Ｘを有する標本中の全ＬＰＩ抑圧比率（Ｐ
ＴＳ） ｔよ次のように定義された。 ＰＴＳ ＝ （
Ｃ−Ｘ／Ｃ−１）Ｘ１００ 、ここで、Ｃは粗メディエ
ータ（中間物質）にさらされていない３Ｔ３−Ｌ１細胞
のつＴルによりつくられるＬＰＩ活性であり、ま／＝ｍ
はヘパリン化培地中独のＬＰｌ、活性である。日毎のア
ッセイ変化を避けるため、この未知標本結果を、すべて
のバイオアッセイに含まれる粗中間物質の標準試料と比
較した。粗メディエータ物質のこの標準試料は小さな管
に部分標本化され、−８０℃で保蔵された。バイオ活性
の１ｕは、１０１！アツセイ系に標準試料１．０μノを
添加した場合に対応するＰ［Ｓを産出するカシエフチン
の聞と規定された。粗メディエータ物質の標準溶液の使
用もまた、未知標本に存在ＪるバイオｆＪ ！ｊｌの量
の直線的な予想量を確認するものであった。 メディエータのｌｔ￥ｉ：Ｒへ計６４．７細胞を生成さ
せ、５％Ｃｏ２雰囲気中で３７℃に保持したＲＰｌ中に
合流させた。メディエータ分泌の誘発前に、ＲＡＷ２８
４．７細胞を、ｐ１１７．４の２５ｍＮヘーベス（ｌｌ
ｅｐｃｓ）（リサーチオーガニツクス、イン］−ボレイ
テッド社製、オハイオ州クリーブランド）で緩衝させた
ハンクス（ｆｌａｎｋｓ）平衡食塩溶液（ギブコラボラ
トリーズ打￥Ｊ）で洗浄し、汚染自消蛋白質を除去した
。それぞれのフラスコを、１μｑ／ｍの大腸菌ＬＰＳ
（ディフコ ラボラｌ−リーズ相製、ミシガン州デトロ
イト）とｐＨ７，４の５０ｍＮへ一ブスを含有する１
００ ｉｆのＲＰＨＴ１６４０培地で刺へした。３７℃
で２２時間培養した後、培地を０．２２μｍのフィルタ
ーで濾過し、−２０’Ｃで凍結した。 メディエータの１・ｊ：８５５ｙｆの凍結貯蔵培地を融
解し、ＰＨ−１０フイルター（アミコンコーボレーシコ
ン礼製、７１１チューセツツ州ダンバース）ににす、撹
拌セルを用いて４°Ｃｒ５０ｐｓｉの窒素雰囲気化で濃
縮した。最初の８量の２％に濃縮した後、得られた蛋白
質溶液を蒸留水で繰返し希釈し、等１焦点化する前に標
本の脱塩化をりるように再濃縮した。 等１焦点化は、４００ν！の容量をもつ水冷コラム中で
４℃の温度下で行われた１、このコラム中で、中心部に
蛋白質標本が層化するようにしてグリセロール勾配が以
下のように調製された：４０乃至２１％（容量／容量）
のグリセロールの直線勾配が加えられた；標本（よぜ／
υ動性ポンプで供給された；１９乃至０％（容量／容ω
）のグリセロール勾配が、標本上に層化された１、勾配
の上半分及び下半分の両方に、水で１＝１６に希釈され
たｐ１１３−１０のサーバライｌ−［５ｅｒｖａｌｙｔ
、ｃ） （サーバファインバイオケミカフ１１社製、
ニュー三１−り州ガーデンシディバーク）を含むように
した。標本はその無塩淵厚液（５５ν！容帛）を４３１
１のサーバライｌ−，ｐＨ１３−１０，及び１６７０の
グリセロールと温合することにより調製した。陽極溶液
〈コラム底部）は４０％グリセ［Ｉ−ルに溶かしたＯ、
０４）ｌのイシドジ酢酸であり、陰極溶液（コラム上部
）は１」２０に溶かした０、０１Ｍ玉チレンジアミンで
あった。分−１は初期′市流１８ｍＡ。 初朋雷圧６３０Ｖで行われた。電圧は、処理中電流が低
下すると増大したが、出力は＋６Ｗを越えないようにし
た。 ２４時間後、コラムから重力により １５０滴の断片が
導出された。沈澱した蛋白質は、４℃で２０分間にわた
り３．０００（Ｉの遠心分離ににり除去された。フェノ
ールレッド溶液の滴がそれぞれの上澄液に添加され、酸
性標本は、飽和三塩基りん酸ナトリウム液を添加するこ
とにより中和され、１７ｊ基性標本は３０％りん酸溶液
の添加により中和された。カシエフチンバイオ活性は、
それぞれの断片のバイオ活性のピークに対応する２μ）
をアッセイづ−ることにより決定され、ピーク断片は更
に精％ｔｌ−るためにプールされた。 プールされたピーク断片は、両性電解質及びグリセロー
ルを除去するために、ダルベコのりん酸１ｎ緩ｋ［食塩
水（ＰＢＳ） （ギブコラボラ１〜リーズ社製）を用
いて数回にわたり透析した。透析された物質（容積９４
ｉｆ）を、ベッド容積が２０７１どしてコンカナバリン
△（ＣＯＮ＾）レファローゼコラム（ファーマシアファ
インケミカルズ礼装、スウェーデンウプサラ）に通過さ
けた。補足的に１０１！のＰＢＳを、この樹脂に通過さ
せるようにし、濾過残留物と共にプールした。、濾液を
４℃の蒸留水を用いて２回透析し、凍結乾燥した。 ｐＨＧ、８の３０ＩＩＭ トリー１１０１緩衝液、５％
グリセロール、１ｍＨのβ−メルカゾトエタノール及び
０００２％のブロムフェノールブルーを含有する２１！
溶液中で標本を再溶解し、非変質状態で゛ｄｆ気泳動さ
せた。この標本を、６−１３％の直線ポリアクリルアミ
ド勾配の、１．５１１１１１Ｘ １４．２Ｃ１１Ｘ１３
６１径の手法ゲルからなる積重ねゲルを通した。トリグ
リセリン緩衝系は次のように使用された：陰極緩衝液は
３８１１Ｈトリ塩基及び４０ｍＭグリセリンであっｌこ
；陽極緩衝液は６釦Ｈトリ塩基及び５０ｍＨＩＩｃ＋で
あった；積重ねゲル緩衝剤はｐ１１６８の０．４２５１
−−１１ｃＬであった：また分離ゲル緩＋Ｐｉ液ハＤｌ
１８．８（ｍ終部Ｕ ） （１） ０．３７５Ｍ ト’
） −ｔｌＣｌ−であった。アクリルアミド（２９２％
）に加え、この七ツマー溶液は０８％のビス−アクリル
アミドを含んでいた。不純物を除去するために、この七
ツマー溶液はアンバーライト）ＩＢ−１樹脂（マリンフ
ロート看製、ミズーリ州セントルイス）を用いて一晩撹
拌された。 標本は、ブロムフェノールブルーマーカーゲル底に達す
るまで２０ｍＡの定常電流で４℃の４叶で電気泳動した
。電気泳動終了後、１ＣＴＩｌのゲルを手法ゲルの側縁
から除去した。何故なら′電圧によってこれら側縁戚に
水平でない移動が生じたからである。残るゲルは２加間
隔で水平にスライスした。夫々のスライス片をポリプ［
〕ピレン管中の２１！の５０ｍＨ手炭酸アン七ニウム溶
液中で１２時間ゆるやかに撹拌して拡散させることによ
り、スライス片から蛋白７１が回収された。 電気溶餠は、フランシス、１１．Ｔ．、ジュニアほかに
よりＪ 、 ＣＩＩＲＯＨ＾ＴＯＧｆｔ． 、 ２９８
・１１５． １９８４年，に記載されているようにして
、管状ゲル装置中で３、５００ダルトンのカットオフ透
析膜を用いて行われた。 かくして１ワられた断片はその活性がアッセイされ、純
度を測定するため、Ｊト還元及び還元状態で１０−１５
％の直線勾配ゲル中に硫酸ドデシルナトリウム（ ＳＯ
Ｓ−ＰＡＧＥ ）を含有する非変質系において、ポリア
クリルアミドゲル電気泳動が行われた。蚤白質帯は、レ
イ、 Ｅ （Ｗｒａｙ，ＩＥ）ほかによりＡＮ＾ｌ 、
８１０ＣＨ［Ｈ、１１８：１９７． １９８１年，に
記載されているようにして、銀痕跡により視覚化された
。 ′ コラムクロマト ラフイ：ゲル瀘化は、ｐＨ７．８
の０． １ｔｎＨ重炭酸アンモニウムで平行させた、７
ｍｍＸ１ｍのガラスコラム中の１１グレードのしファデ
ックスＱ−７５（ファーマシアフ？インケミカルズ社Ｉ
胃）を用いて実施した。カシエフチンサブユニットの大
きさを決定するための実験において、酵素グレード尿素
（ベロダリザーチラボラ１〜リーズ社製、メリーランド
州ベセダ）を標本及び溶離液に添加し、断片は、バイオ
アラレイのｊｉｆｆに個別にＰＢＳｒＪ析した。 ｔり川［ヨｅ素 カシエフチンによる！１：精製された
カシエフチンはヨード法により放射性ラベルをした。遊
離ヨウ素は、セファデックスＧ−２５ゲルによる濾過及
び透析により除去した。 結合検査は、最近分化した３Ｔ３−Ｌ１細胞（０，２ｍ
ｆ径あＩこり４Ｘ１０Ｊｌｌ［胞）を含む２４−ウェル
リンプロプレー１−を用いて実施した。結合検査のため
に使用される溶液は、１０％ＦＢＳ 、 ５０ｎｇ／ｙ
ｆインシュリン、及びＤｌ＋７．４の５０ｍＨへ−ペス
緩ゆ１液を含有するＤＨＥ １８地からなる。種々の闇
のラベルしたカシエフチンがこの溶液に添加された。特
に注意することがない限り、ｊ８養は氷の上で４日間、
ゆるやかに撹拌しつつ実施された。次に細胞単層が、１
０の１Ｈの−０１１で溶液化した１０１ノの培地で３回
洗浄され、ガンマカウンターを用いて標準誤差かく５％
となるのに十分な時間カラン１〜された。 筋肉細胞ラインＣ２（スタンフォード大学メディカルス
クールのへレンブラウ教授の手による。 カリフォルニア州バロアルト）ちまたカシ１クブン結合
のため分析された。細胞を成長させて、２４−ウェルの
リンプロプレー１−に合流するようにした。プレートは
雌牛皮膚コラーゲン（カルバイオケムーベーリングコー
ポレーション４゜カリフォルニア州うジョラ）を用いて
予備処理した。予備処理は、３５１１水中で５０７ノ１
ｇのコラーゲンをオートクレーブ処理し、殺菌溶液を、
プレーｊ−あたり２４のウェルのそれぞれに適用でるこ
とにより行われた。次に溶液を吸引し、プレートを、積
層流フード中の紫外線により乾燥するにまかせた。使用
された成長培地は、２０％ＦＢＳ及び０．５％ニワｌ−
り肝油出液（ギブコラボラトリーズ社）を補充したＤＨ
Ｅであった。培養体は、５％ら２雰囲気中で３７℃に保
持された。措）ａ（ま毎日変えられ、細胞は、２％ウマ
血清（ギブコラボラトリーズネ」）を含むＤＨ［を添加
することにより合流するようになった時に、筒管を精製
するように誘導された。４８時間後、ｍ胞は結合検査の
ために使用された。０２筋管に結合するカシエフチンの
測定は、３１３−Ｌｌｌｉ［１１胞について記；戒した
のと同様の方法で行われた。 ＮＣ３１ｆｌｔマウスがロックフェラー大学のラボラ１
−リー アニー？ル リサーチ センターから得られた
。マウスの赤血球（ＲＢＣ）が、既に述べたようにヘパ
リン化マウス血液を微結晶セルローズを濾過さぼること
により得られた。牌臓リンパ球は、フィコール−ハイバ
ック（）７−マシアフアインケミカルズ礼）による沈澱
法によって１９られた。赤血球及びリンパ球に結合する
力シエクヂンの測定は、３Ｔ３−１１細胞の場合に採用
されたのと同様の手順により行われた。しかしながら、
ラベルしたカシエフチンの培養が１．５１のエツベンド
ルフ管（プリンクマン インストルメンツ社、ニューヨ
ーク州ウェストベリー）中で行われた。４ｘｉｏ’マウ
スＲＢＣ及び１×１０７マウスリンパ球がそれぞれの結
合アッセイで使用された。マイクロフユージ（ベツクマ
ンインストルメンツ社、カリフォルニア州フラーｌ〜ン
）を用いて４℃で３度遠心分離処理を行うことにより洗
浄が完了した。細胞のベレッｌ〜は直接にカランｌ−さ
れた。 相肝細胞膜は、ｐＨ７，４の５ｎＭヘーぺ、４１０１ｆ
中に、２ｑのマウス肝臓（湿重量）を均質化ザることに
より得られた。このホモジネート（均質体）を同じ緩衝
液で５０ν！に希釈し、５分間４℃ぐ、２００Ｑで遠心
分離した。Ｆ澄液を２７１１の一定部分に分割し、１０
分間のスピンで４８．０００ Ｑにベレット化した。Ｖ
ｌられたベレットはそれぞれ０゜５１！の、１０％「Ｂ
Ｓを補充したＤＩＥに懸濁化し、これにラベルしたカシ
エフチン＜１ｎｇ／ｘｉ＞を、ラベルしていないカシ■
クブーン（３００ｏｇ／ｒｆ ）とＪｔに、或いはこれ
を含めることなく添加した１、結合は４℃で４１１！１
間で生じるようにした。膜、４８．０００ｏの遠心分離
により、新鮮む１８地を用いて３回洗浄した。ベレット
はその敢Ｑ４活竹が力ラン１〜された。 インターロイキン１（ＩＬ−１盾」、のアツセイ：これ
（よ、標準試料として組換型１１−１を用いて既に述べ
たようにして行われた。 此肛亘豊広淀；蛋白質濶度の測定ｔよ、市販のコーマツ
シーベースによる蛋白質反応剤（バイオラド ラボラト
リーズ社、カリフォルニア州すッヂモンド）を用いて行
われた。 旌里 ＲへＷ２６４．７ からのカシェ欠しλ立盈ｌ盈互
★゛−にお１する’ｆ＠：５ｏｉｌの培地中の一１０５
Ｕのカシエフチンのバイオ活性が、１０８ＲＡＷ２６４
．７細胞を含む融合性フラスコから得られた。この粗メ
ディエータの特徴的な活性は、−４ｘ １０５Ｕ／ｍａ
蛋白質であることが定期的に観察された。 極く少量の補足的なカシエフチンは、細胞をＬＰＳど共
に長く培養することにより、或いはＬＰＳを含む新鮮な
培地で再刺激することにより１ｑられた。対照的に特有
な活性の片鱗は、このような試みがなされた時に観察さ
れた。 中性ｐＨで一２０℃で粗試料を数週間保蔵した後でも、
或いは４℃で５日間保蔵した後でも、バイオ活性の旧失
みられなかっｌ、：、、シかしながらバイオ活性はｌＳ
！２竹、 ａｌｌでは不安定であることが観察されてお
り、ａｌｌ５．０で４℃で２４時間後には゛ト分になっ
ていた。低い１）１１にお（）る不安定性は、２０％グ
リセロールを添加することによって減少する。このため
、等１焦点化は、サッカローゼよりもグリセロール中で
行われ、この処即はできるだけ迅速に行う。 ｒ び入゛１−一 ：バイオ活性は、述べてきたよ
うな条何下で圧力透析が行われる場合には保有物質と排
他的に結合している。５０倍濃縮化後の回収率は通常〉
９０％であり、表１に見られるようにしばしば極めて高
くなる。人工のデータは代表的な分離法の場合の数値で
ある。 表■ 手順 容積 全活性 全蛋白質
特異活性 精製 回収率Ｍ１ｕ １
１１ｇＵ／ｍａ ＄未濃縮組体
８５５ ２．５ｘｌＯ’ ５３．９
４．６ｘ１０５ ・・・ １００淵縮粗休
５４ ２．７ｘ１０１３８．９
６．９ｘ１０５１．５ １０８等電流点化
９４ １．５ｘ１０７３．８８ ３．９Ｘ１０
Ｇ８．５ ６０コン−Ａセファローゼ １０４
１．４ｘ１０７２．７８ ５．０ｘ１０６１１
５Ｇ非変質化 １．ｌＸ１
０６０．０３ １．８Ｘ＋Ｏ’ ８０ ２
濶縮化物質の等定焦点処理によりバイオ活性の等電点は
４．７であることがわかった（第１図）。両性電解質そ
れ自体はバイオアッセイを干渉しない。等電焦点化後の
バイオ活性の回収率は変ｆ）Ｊ Ｌ （１０−６０％）
、士としてコラムに添加される蛋白質の全量に依存した
。等主焦点化中のバイオ活性の低下は、粗濃縮物中に存
在する伯の蛋白７１とカシエフチンとの」を回向な沈澱
反応の結果であるＪ：うに見えた。何故なら収率の低ざ
は、蛋白質の大ｆｉ１の分離及び沈澱物の天量の精製と
関連しでいたからである。等主焦点化前に、粗メディエ
ータ物質に添加されるトレーサとしての放射性ラベル精
製カシエクヂンにかかわる後の実験は、この結論を支持
するものであった。９量の標本（蛋白質全量が５０ｍｇ
或いはこれ以下）をコラムに添加、グリセロール勾配の
使用、及び分離時間を短くすることにより（２４時間或
いはそれ以下）、また分画化復標本を直らに中和するこ
とにより、回収率は最大となった。 コンＡ−セ’７７０−ズ Ｃｏｎ 八−３ｅ ｒａｒｏ
ｓｃり止しΣ叉うｌヱ：いくつかの蛋白質種が、バイオ
活性の損失が殆どないか全くないコンＡ−セファ０−ズ
による親和性クロマ１−グラフィににり除去された。コ
ンＡ−セファローズを天吊に使用した場合には、カシエ
フチン活性の回復は低いものであった。これは多分この
樹脂との疎水性相互反応によるしのであろう。何故イ≧
ら、活性はＯ，ＩＨのα−メヂルマノサイドの添加によ
っては解放されなかったからである。 ページ：１１変質状態下でページ（ＰＡＧＥ）後、巾−
の蛋白質帯域と関連した、ゲル上のある位置でバイオ活
性のすべてが観察された（第２，３図）。この段階でバ
イオ活性の１０−２０％のみが、電気泳動によって或い
は蛋白質を希釈重炭酸アンモニウム緩衝液中に蛋白質を
拡散さけ゛ることによって、スライスしたゲルから回復
した。拡散時間を長くすること、抽出を繰り返すこと、
及び多聞の緩衝液を使用することは、殆ど効果がなかっ
た。回復は、高濃度の標本をゲルに適用することにより
、また精製アクリルアミドモノマーをゲル試料に使用す
ることにより最大となった。 ｔ″″゛ 鉛に９ されたカシエフチンのＳＯ３−ハ貼
且ｌ：分離物の見掛けの均質性は、５ＯＳ−Ｐ Ａ、Ｇ
Ｅ系における電気泳動によって確認された。 ＳＯＳゲルに適用された、カシエフチン活性と関連する
精製蛋白質は、分子量１７．０００の唯一の帯域をもっ
ていた（第３図）。粘装カシエクチンのマイクログラム
■がＳＯＳゲル中で電気泳動処理されると、バイオ活性
は電気溶出によって固定されていないスライスから回復
した。この活性は１７，０００の分子量の蛋白質の存在
と一致していた；バイオ活性はゲルの他の域からは得ら
れなかった（第４図）。 ′ カシエフ ンの′吊：カシエクチンの粗濃縮物をセ
ファデックス（５ｅｐｈａｄｅｘ ） Ｇ−７５ゲル濾
過により分析したところ、バイオ活性溶離プロフィルは
、分子ｈ１が＞ ７０．０００であることを示した。し
かし粗濃縮物が６Ｍ尿素の存在下でゲル濾過により分離
された時、１７，０００ （デキストランスケール）の
分子ｍが得られ、このことは他の蛋白質との非共役マル
チマー或い（ま凝固体の生成を示唆している（データは
示されていない）。 精製カシエフチンがＳＯＳゲル上で分析された時、還元
標本及びノド還元標本共に、１７，０００の見掛は分子
量を示した。セファックスＧ−７５コラムによる精製力
シェフチンのゲル濾過によってｉｔ Ｈされた分子量は
３５，０００であり、このことは非共役二量体の存在を
示している（データは示されていない）。 ｔＪ１ｇＡ線ヨ ）処理 び 今の研カニ精製ホルピン
がヨウ素法により ■を放射線ラベルされた。〜７０
％のバイオ活性が回収され、最初の特異活性は〜１ ｘ
１０６ｃｐｍ／μｇ蛋白質であった。 このラベルされた物質を５Ｏ８−ＰＡＧＥ処理をして、
スライスしたゲルを測定したところ、放射能の殆どは分
子ｆｆＩｔ１７，０００の蛋白質と関連していた。 クロールアミンＴを使用した蛋白質をラベルする試みは
、バイオ活性の完全なｎ失に終った。 精製した、放射線ヨウ素化ホルモンは迅速かつ特異的に
、３７℃及び０℃の両方で培ａ３Ｔ３−１１脂肪細胞と
結合した（第５八図及び５Ｂ図参照）。 ラベルしないカシエフチンの２５．０００１１／ｙｆを
添加した結果は、検査したすべての時点でラベルした蛋
白質による結合を阻害した。説明した条件下で、２−３
時間以内に平行状態になった。結合したラベル最の、時
間に依存する減少が３７℃で観察され、これはおそらく
レセプタにより媒介されるエンドザイ＋−−シスを反映
している。 結合特性はスギ１７ツチ１１−ド（５ｃａｔｃｈａｒｄ
）分析により検査されたく第６八図）。このデータは細
胞あたり〜１０４高親和性位置の存在及び３×１０９の
関連定数（ｋａ）を示唆している。分化３１’３−１１
細胞及び未分化゛前脂肪細胞″の双方が、同様の親和力
及び密度を有するレセプタを保有していた。筋肉細胞系
Ｃ２も特異カシエフチンレセプタを保有しており、この
場合にも細胞あたり〜１０“高親和性位置と、３ ｘ
１０９のにａが観察された（第６８図）。マウス肝臓膜
試料もまた特異カシエフチン結合を示した。一方、赤血
球及びリンパ球は検出可能な量のカシエフチンレセプタ
が欠けていた（細胞あたり＜ ２０（１＋ピー）。 ＩＬ−１汗 のアッセイ：同様の大きさ、組織発生及び
内毒素、Ａ導性の観点から、分離される蛋白質がＩＬ−
１と同じであるように化えられた。 ｒｔＡ吋６４，７朋ロ胞により精製する多ｌ′Ｉｌのカ
シ１クチンは、しかしこれがそうではないことを示唆す
るものであった。特に、カシエフチンを引き出すために
使用される条件下でロイコサイト活竹化囚子（ＬＡＦ）
活性により測定されるように、細胞はごく（午かの１ｌ
−ＩＬか生成しないことがわかったからである。 精製カシエフチン試料は、組換型ＩＬ−１がｉＱ−１１
Ｍで検出されるような条件下で、１ｍＨまでの広い範囲
の濃度にわたってアッセイされた時にＬＡＦ活性が欠け
ていた。更に、高度に精製された組換型Ｉ［−１のマイ
クロモル濃度のものは、レセプタ結合について放射線ヨ
ウ素化カシエフチンに匹敵するちのではなかった。従っ
てカシエフチンはＩシー１から区別されるように見える
。 厳１ 以上の実験において、精製蛋白質がマクロファージ誘導
メディエータから分離され、これは単一の分子間がＳＯ
Ｓゲル上で１７，０００であり、等電点が４．７′Ｃ″
あることがわかった。非変質状態で、精製蛋白質は明ら
かに二量体として存在した。 １Ｕのバイオ活性は分離上ツマ−の〜２×Ｉ Ｑ−１５
モルに対応する。従ってモジュレータ物質ぐあるカシエ
フチンの２ｐＨ溶液は以上のバイオアッセイ法により容
易に検出可能Ｃある１、特異活性のこの推定は最少にし
なければならない。 なぜなら未知の量の蛋白質が精製中生物学的に不活性に
なるかもしれなかったからである。 カシエフチンの分離はネズミマクロファージ細胞系ＲＡ
Ｍ２６４．７の使用によって容易になり、この細胞は分
析及び精１のための蛋白質の天吊生産を可能にするもの
であった。この１０胞は均質であることに加え、内毒素
刺激中血清を含まない培地中に保持することができた。 ＲＩＶ２６４．７１胞系は、アベルソン白血病ビールス
によるマウス腹腔細胞の変成により生産することができ
た。 この細胞はマクロファージと形態学的及び職能的に類似
する。この細胞はＩｇＧの補体及びＦＣ断片のためのし
けブタを有し、良作用中性赤、オプソニンＲＢＣ、ラテ
ックスビーズを受は入れることができる。ＩｔＡＩ４２
６４．７＠胞によりつくられるカシエフチン活性と、チ
オグリコレート−引き出し腹腔マクロファージによる活
性との間の茗しい類似性についでは、既に実証されてい
る。 ＬＰＳ−刺激を受りたＩｔ／Ｖ２Ｇ４．７細胞もしくは
刺激を受けなかった細胞に由来する培地の５Ｏ３−ＰＡ
ＧＥ分析の結果は、カシエフチンが内毒素誘導型の分泌
性蛋白質の一種であることがわがった。これは刺激を受
（〕たＲＡ計６４７細胞から分泌される蛋白質仝ｈ１の
１−５％を構成し、ＳＯＳゲル上で、明瞭な１７，００
０の分子Φ帯域として見える。刺激を受けなかった細胞
からの培地は完全にカシエフチンバイオ活性及び１７，
０００の分子吊帯域が欠けている。精製カシエフチンの
特異活性の見積りに基ずき、１７，０００分子ｍの蛋白
質が、調製細胞培地に存在するバイオ活性の全部でなく
とも殆どの理由になっているように見える。他のｔツカ
イン（例えばインターフェロン、グルココーチコイド−
拮抗因子、或いはその他ンクロフ７−ジによりつくられ
るバイオ活性）に対するモジュレータ物質の関係は−［
分に検定されていないが、以上に提示したバイオ活性デ
ータがら、しジ：ｌレータ物質であるカシエフチンが、
Ｉ［−１とはその分子間及び等電点における類似性にも
かかわらず相違している。 ラベルされたカシエフチンを用いて、カシエフチンに罰
する特異レセプタの存在が分化３Ｔ３−Ｌ１細胞及び前
脂肪細胞、０２筋肉細胞、マウス肝臓細胞膜で実証され
た。一方、レセプタは、マウス赤血球及びリンパ球には
検出されなかった。 ３Ｔ３−Ｌｌ細胞及びＣ２細胞のレセプタ）１度は細胞
あたり １０’であった。Ｋａ、レセプタ瀕度、はカシ
〕クチン濃度の函数として示すことができた。 ３Ｔ３−１１細胞中のレセプタ瀕度が僅かに５％（２Ｘ
１０−１１Ｍについて得られた）で、ＬＰＬの７０−８
０％抑制を得るために十分である。この型の関係は、多
くの他のホルモンレ廿ブター結合系で観察された。 マクロファージは特徴的な内分泌細胞でないけれども、
これはＬツカインであるカシエフチンをつくりだすこと
ができ、これは古典的な意味ではホル七ンど記載されて
いる。何故ならこれは細胞の特定の群、及び影響により
、高親和性レセプタを通じ、他の細胞型の挙動にＪ：り
つくられるものであるからである。そのため、これは細
網内皮組繊細胞の内分泌の一つの例を呈示づ゛る。筋肉
、肝臓及び脂肪性組織がカシェフタのレレブタを有する
、という事実から、広範囲の生物学的応答が考えられる
。 以上の結果は、カシエフチンが、急激な感染に応答して
哺乳動物がそのエネルギーを、増大する代謝のために動
ｍするのに貢献する役割をも示唆するものである。゛Ｍ
生虫感染の場合のにうに慢性的な場合、カシエフチンは
、最終的に宿主の悪液質状態を和らげる蛋白質及びリビ
ドの異化作用に貢献する。 上述実験後に行なわれたその他の研究は、モジュレータ
物質の特定構造を解明するものである。ボイトラーほか
によっても報告されるこれらの研究ｔよ以下の実施例Ｈ
に記載される。 支五五１ ｆｔｌＷ ２６４．７ （マウス マクロファーシュ
）から精製された時には、カシエフチンはＣＩ（が４Ｔ
であり唐ナブユニット寸法は１７ｋｄであり、非共有結
合マルチマー（ｍｕｌｔｉｍｏｒ）を生成することを示
していた。カシエフチンのし廿ブタ（受容体）は非腫瘍
性培養細胞であり正常なマウス肝臓膜であることが確め
られた。 本実施例において、高収率の精製法を採用した研究の結
果、マウスカシエフチンの構造がより詳しく解明された
。高度の相同性がマウスカシエフチンのＮ−末端連鎖と
、最近ヒト腫瘍壊死因子（ＴＮＦンについて決定され、
ベニ力、Ｄ、。 ホカ１．：にすＮＡＴＵｆｌＥ、 ３１２号： ７
２４−７２９ページ。 １９８４年、及び王、シライほかによりＮＡＴＵＩｔＥ
。 ３１３号、 ８０３−８０６ページ、 １９８５年に
報告されているＮ−末端連鎖との間にあることがわかっ
た。精製カシエフチンはまた試験管内において効力ある
ＴＮＦ活性を有している。 このような研究の手順及び結果を以下に示す。 彬粍反髪万丑 カシエフチンバイオ活性（ＬＰＬ抑圧）は、既に述べた
ような３Ｔ３、−Ｌｌｌ胞を用いてアッセイされた。Ｔ
ＮＦ活性はアクチノマイシンＤ処即り一９２９細胞を用
いて標ｔ＄細胞もアッセイ法により測定された。 リポボリナツカライド刺１１１１ＲＡＷ ２６４．７細
胞に由来する粗カシエクチンの５０倍濃縮液が、実施例
■において記載されたような撹拌ｌｌ１１１１１中のＰ
Ｈ−１０膜（アミコン社、マサチューセッツ州ダンパー
）を用いて調製された、標本を超−過細胞から除去する
前に、オクチルグルコシド（シグマ社、ミズーリ州セン
トルイス）が１％（Ｗ／Ｖ）の濃縮液に添加された。非
イオン性遅延剤の添加は、次の処理において高回収率を
達成するためには必須である。 標本は０２２μフイルターを通過し、モノＱ（高性能陰
イオン交換）コラム（「ＰＩ−Ｃ；）７−マシア社、ス
ウェーデン国つプサラ）に適用された。全蛋白質のほぼ
６０％がコラムを直接的に通過した。カシエフチンは、
ｐｕ７．ａの０．３８）１のトリ塩素の濃厚液中で鋭い
ピークどじで溶離した（第７図）。はぼ８０％のホルマ
ンが三つの分画どして回収された。 モノ ｒＰＬＣイオン クロマトグラフ工二：オ
クチルグルコシドを分散剤として含有する濃縮粗１？八
Ｗ２６７、４培地がコラムに適用された。 カシエフチンは、０．３Ｈ乃至０．５ＨトリーＣ２（シ
グマ ケミカル社、ミズーリ州セントルイス）勾配を使
用して、流速０．３３ｙｆ／分、３４分間にわたって溶
出させた。光学的密度（２８０ｍｍ）は実線により表示
される。点線は溶出に使用されるトリー０２緩衝液のモ
ル濃度である。網状線（クロスハツチ）或いはカシエフ
チンバイオ活性の分イｂを示し、線で示されている（夫
々の点はそれぞれのバイアアッセイの結果を示す）、。 差込み図：銀痕跡ＳＯＳポリアクリルアミド勾配ゲル（
１０％〜１５％アクリルアミド）は粗物買の分離と連続
するコラム分画、レーンあたり１μノを示す）。分子電
！マーカーは一番左のレーンに示されている。矢印はカ
シエフチン（分子１ｊｌ＝１７ｋｄ）に対応する帯域を
示す。 全蛋白７１のほぼ６０％は非保持分画（図示せず）とし
て溶出した。カシエフチンバイオ活性のピークは０．３
８８ トリーＣＩの濃度で溶出する。もっとも高い活性
を有する三つの分画は更に精製するためにプールした。 スーパーローズ１２ （ＦＰＬＣゲル濾過）クロマトグ
ラフィ：モノＱ分画化からのプールした分画を凍結乾燥
し、熱温水に再溶解し、コラムに適用した。クロマトグ
ラフィは流３０．３ｘｌ／分で、０．１Ｈ１！￥酸アン
モニウム中で実施した。０．２猷の標本量が夫々の分離
に使用された。 実線は２８０龍におけるＯＤを示す。網状線は、バイオ
活性測定により検定されるカシエフチンの存在を示す。 矢印は、スーパーローズ塔に適用される分子？マーカー
の溶出域を示す。挿入図： ＳＤＳポリアクリルアミド
勾配ゲル（１０〜１５％アクリルアミド）は、スーパー
ローズ１２ゲル濾過により得られる連続する分画くレー
ンあたり１μノ部分）の電気泳動輪郭を示すＯＬ及びＰ
は標準分子量；Ｑはプールされたモノ０分画くスーパー
ローズ１２分離の出発材料）。 これら分画はプールされ、凍結乾燥され、０．４ｘｌの
熱温水中で再溶解された。標本を次に高性能ゲル濾過ク
ロマトグラフィ（スーパーローズ１２：ファーマシア社
製）処理したく第８図）カシエフチンは、五組構造に一
致する８７ｋｄの分子量に対応した位置に常に溶出した
。分子は非イオン系遅延剤の存在下に容易に解離する。 五組構造がバイオ活性に必須のものであるかどうかは明
らかではない。 カシエフチンビークの痕跡端は９５％以上純粋であると
考えられ、最初のメディエータ物質（中間物質）を調製
するために使用される旧来の精製法により製造される均
質溶液と同様にほぼ１０７Ｕのカシエフチンバイオ活性
／ＩＩＴｇ蛋白質を含有していた。ＴＭＦ活性はこの試
料によりアッセイされた。はぼ１２×１０７Ｕ／Ｔｌ１
ｇの蛋白質が精製標本中に測定され、粗物質の標本中の
３．７Ｘ１０’ Ｕ／［蛋白質と比較された。精製ヒト
丁ＮＦの特異活性は２．９Ｘ１０’ Ｕ／■蛋白質であ
ると報告されている。 アミノ酸組成物とその連鎖の決定に使用されるための、
残ったカシエフチンに富むスーパー［１−ズ１２分画は
、パン、Ｖ−Ｃ，ＥほかによりＪ。 ＣＩＩＲＯＨＡＴＯＧ、 ２９７号： １３−１９ペ
ージ、 １９８４年に既に記４＆されているｃ８コラム
（スペルコ社、ペンシルバニア州ベラフォンテ）を使用
して、逆相クロマトグラフィにより更に精製された。カ
シエフチンは、３０−４０％アクリロニトリルの濃度で
溶出した。４０ｐモルの高度に精製された蛋白質を６Ｎ
のトＩ ＣＩで加水分解し、組成分析に使用した。２０
０ｐモルを連鎖に使用したウォーターズ社（マサチュー
セッツ州ミルフォード）の高性能液体クロマトグラフィ
（ＨＰＬＣ）系、及びアプライド バイオシステムズ社
（カリフォルニア州）Ａ−スター市）のマイクロシーフ
ェンシング装置、 ４７０Ａ型、がこれらの手順に採用
された。 マウス力シエクブンのアミノ酸組成物が第■表に、ヒｌ
〜ＴＮＦの組成物（ＤＮＡ連鎖により決定）と比較され
ており、少者はベニ力はが〈既述）により報告されてい
るものである。強い類似性が一児して明らかである。両
蛋白質はなかｌｖずく酸性及び疎水性である。スレオニ
ン（ｔｈｒ） 。 バリン（ｖａｔ） 、アラニン（ａｌａ） 、ヒスデシ
ン（ｈｉｓ） 、アルギニン（ａｒａ） 、及びシステ
ィン（ｃｙｓ）の残りの同じ数値が両名に見られる。 第 ■ 表 ａｓｎ／ａｓｐ １６（７１５）” ｌｅｕ
１７（１８）ｔｈｒ ６（６） 、ｔｙｒ
８（７）ｓｅｒ １２（１３） ｐｈｅ ６（４
）Ｑｌｎ／Ｇｌｕ ２０（１０／１０） ｈｉｓ
３（３）（ｌｌｙ １３（１１） ｌｙｓ １０
（６）ｖａｌ １３（１３） ａｒＱ ５（５）
ａｌａ １３（１３） ｐｒｏ ＮＯ（１０）ｍ
ｅｔ ２（０） ｃｙｓ ２（２）ｉｌｅ ５
（８） ｔｒｙｐ ＮＤ（２）本かっこ内の数はヒ
トＴＮＦについてベニ力はか（既述）により決定された
組成物にかかわる。 また、”ＮＤ”は、決定されなかった数である。 同様に、マウスカシエフチンのＮ−末端アミノ酸連ｆａ
（−格上の行）の性質は、ヒトＴＮＦの対応する連鎖（
一番上の行）と比較的一致していることがわかった。あ
いまいな残塁は′？″で示される。一致している残基を
下線で示しである。 マウスカシエフチン Ｈ２Ｎ −ｔａｕ−ａｒ −ｓｅｒ−ｓｅｒ−ｓｅｒ−
ｇｌｕ−ａｓｎ−ｓｅｒ−ｓｃｒ−ａｓｏ−ｐｒｏ−肛
立江但二Ｉａ−？ −ヒトＴＮＦ Ｈ２Ｎ−ｖａｌ−ａｒ −ｓｅｒ−ｓｃｒ−ｓｅｒ−ａ
ｒｇ−ｔｈｒ−ｐｒｏ−５ｅｒ−ａｓｐ−Ｉｙｓ−狸ｍ
！Ｑ±−ａｌａ−ｈｉｓ−上記連鎖分析によれは、マウ
スカシエフチンとヒトＴＮＦのＮ−末端連鎖との間に強
い相同関係がある。最初の１９の残塁のうち５個を除き
一致している。Ｌ−９：２９細胞に対する精製カシエフ
チンのｆｉＩＩ１１溶解効果と共に上記データを考えて
みると、単一の蛋白質種がカシエフチンと、ネズミのマ
クロファージ調製培地の１旧活性の原因となっていると
考えられる。更にこの蛋白質は高度に保存されているよ
うである。 上述研究の結果からまた既に先に述べたように、モジュ
レータの完全な同定が行われ、上記の分画連鎖及び第２
３図に示す完全な連鎖との比較によって類似点と相違点
の双方が明らかになった。このもっとも新しい情報のよ
り詳しい分析は、従って現在進行中である。 カシエフチンは、培１３Ｔ３−Ｌｌ脂肪細胞及び０２筋
管の１細胞あたりほぼｉｏ、ｏｏｏコピーで存在する特
異レセプタに結合されることが既に実証された。ホルモ
ン−レセプタ相互作用のにａは、スキャツチャード（５
ｃａｔｃｈｕｄ）分析により３Ｘ１０９Ｍ−１であるこ
とがわかった。正常なマウス肝臓膜もまたカシエフチン
を有効に結合する。 酵素活性の低下はホルモンの低下後直ちに観察され、こ
れは明らかにＬＰＬバイオ合成の特異抑制の結果である
。正味の蛋白質合成及び細胞不安定性は影響を受けない
。 既に論じたように、本モジュレータ物質は、このモジュ
レータ物質を特徴ずける明らかな特性を複合して形成す
る多くの活性をも右している。このモジュレータ物質活
性のいくつかは、公知物質と相違さぼる。 特にこのモジュレータ物質は、同化酵素リポプロティン
リパーゼを実質的に完全に抑制し、この抑制は既に或い
は後に記載するように濃度によって変化する。モジュレ
ータはまた脂肪細胞の分化を阻止し、グルコースの取り
込みを増大して筋肉細胞に運ぶ。後者の活性はプリカー
サであるメディエータ物質（中間物質）にみられるが、
インターロイキン１には欠けている。 これと対照的に、モジュレータ物質はそのメディエータ
ブレカーサに対し、脂肪酸シンセターげ或いはアセチル
Ｃｏ酵素Ａカルボキシラーゼを抑制する能力が欠（プて
いるか、或いはホルモン感性リバーげの活性を増大する
能力が欠けていることによって区別される。モジュレー
タ物質とそのプリカーサとはインターロイキン１に対し
ロイコサイト活性化が欠けていること、またマウスに発
熱を引き起す能力もしくは蛋白質劣化を生じさせる能力
が欠けていることによって区別される。 一ヒ述特徴のほか、モジュレータ物質はまたマウスの体
噛減を生じさせる能力も有し、また宿主を内毒素による
ショックから保護するためのそれ自体の抗体を生成する
能力をもっことを実シ［する。これら活性のすべては以
下の実施例で説明される。 【盈五Ｉ 既に述べたように先に発明したメディエータ物質及びこ
のモジュレータ物質であるカシエフチンの双方共、酵素
リボプロティンリバーげ（ＬＰＬ）の活性を抑圧する。 この能力は、特定の培養された脂肪細胞（３Ｔ３−Ｌｌ
ｌ［１胞）について行なわれた実験で見出され、この実
験においてこのような抑制は実質的に完全であることが
確かめられた。特に９５％より高い抑制が報告された。 これと対照的に、インターロイキン１と同定された物質
はリポプロティンリパーゼの活性をある程度抑制したこ
とがわかったが、しかしこの効果は限定されたものであ
り、投与されるインターロイキン１の濃度に依存しない
ものであった。ボイツーはかく既述）に述べられている
ように、これと対照的にカシエフチン及びメディエータ
物質は、ＬＰＬ活性を実質的に完全に抑制する能力をも
っていることがわかった。これらの観察を実証するため
に、ある量の組換型インターロイキン１（ｒＩＬ−１）
及び精製力シェフチンを用いていくつかの実験を行い、
この仮説を確認した。行った実験手順は以下の通りであ
る。 扛１」αＬ１迭 ｉ１Ｌ！ ： ３Ｔ３−Ｌ１細胞を成長させて２４−ウ
ェルリンプロプレートに合流させ、分化させて、マホー
ニー Ｊ、 Ｒ，ジュニアほかによりＪ、 ＩＨＨＵＮ
ＯＬ、１３４号、 １６７３ページ、 １９８５年、に
記載されているにうに脂肪１１１１１１１を生成するよ
うにした。簡単にいうと、細胞を、１０％雌牛血清を含
むダルベコ修正イーグル培地（ＯＮＥ）に１０５／１１
の密度でプレート処理した。この培地を一日おきに代え
た。培養体が合流に達した一週間復、１０％ウシ胎児血
清、１０μｇ／ｌ！ウシインシュリン。 ０、０５Ｈメチルイソブチルキサンチン、及び１０μＭ
デキサメタシンを含むＤＨＥに４８時間さらした。その
後、これを、１０％ＦＢＳ及び５０ｎａ／ｘｆウシイン
シユリンを含むＤＨ［に保持し、−日おきに代えた。Ｏ
ＮＥはＶブ」社にューヨーク州グランドアイランド）か
ら購入し雌牛血清と定義されており、特徴的なウシ胎児
血清はハイクローン ラボラトリーズ（ユタ州ローガン
）から購入した。細胞は分化して４日後にレセプタアッ
セイに使用されるか、分化して１週間後にＬＰＬ抑制の
バイオアッセイに使用された。 レセプタアッレイ：レセブタにかかわる研究は、ボイト
ラーはか（既述）に記載されるような、カシエフチンレ
セプタの特徴化に使用したと同じ放射線ラベルをした物
質を使用して行なわれた。カシエクチンレセブタ７ツセ
イについてはホイテルほかによりＪ、ＥＸＰ、Ｈ［Ｄ、
、１６１＠。 ９８４−９９５ページ、 １９８５年に詳しく記載され
ており、ここでは、放射線ラベルをしたカシエフチンを
その特異レセプタから置き代えるためのＩＬ−１の能力
を試験するために使用された。簡単には、上述のように
調製された３Ｔ３−１．１細胞単層に、１０％ＦＢＳ及
びＩ）１１７．４の５０１１ＩＨヘーブス、及びぼぼ１
０−１１μＭの放射線ラベルをしｌこ力シェフチントレ
ーサを含むＯＮＥを重ねた。ラベルしていないＩＬ−１
，もしくはカシエフチン（積極比較例）の溶液が添加さ
れた。夫々の系の最終容積は０．２欝であった。反応は
Ｏ″Ｃぐ４日間、揺動シェーカー上で行なわれた。この
培養の終りに、細胞単層を３回同じヘーブス緩衝培地で
洗浄し、１．０１１ｆ、１ＭのＮａ０Ｉ＋で溶解し、パ
ラカードガンマ力τクンターで、標準誤差かく５％とな
るために十分な時間カウントした。 カシエフチン及びＩ［−１による１、ＰＬ抑圧のバイオ
アッセイ：２４ウエルのリングロブレート中で先述のよ
うに調製した３Ｔ３−Ｌ１細胞の、に層に、１０％Ｆ［
ｌＳ及び５０％ｇ／ｙｆインシュリンを補充したＤＨ［
の正確に１．ｏｘｌを導入した。カシエフチン又は組換
えＩＬ−１の精製試料を夫々のウェルに添加し、完全に
混合した。いずれのメディエータにもさらされていない
比較細胞単層を、すべてのアッセイに含めるようにした
。 ＬＰＬアッセイ二以上のように処理した細胞単層から培
地を吸引した。１０％ＦＢＳ 、 ５０ｎａ／厭インシ
ユリン、及び１００／１１ヘパリンを含むＤＭＥの０，
５ν！を次に夫々単層に添加した。１時間接、ニルソン
ーエール及びショップの方法に従って７５μｊの培地を
、ＬＰＬ活性についてアッセイした。ＬＰＩ−抑圧パー
セント（メディエータのいずれかにさらされない比較単
層に関して）は、ボイトラーはか（既述）に記載されて
いるＪζうにして計口された。 １１λ旦」：これは、ビータ−ロメディ］ｌｔｖ士（ボ
フマンラ ロッシュ社９分子逍伝学部〉の御好意による
ものである。モノ力イン（はぼ１００μＭＯ度）を５Ｈ
グアニジンＨ（Ｊの溶液とした。グアニジントＩ（Ｊは
サブミリモル濃度に希釈された時には、叙上の系にＪ３
けるＬＰＬに影響を及ぼさなかった。 Ｉ Ｌ−１に・する−血゛−二山羊で得られたネズミＴ
Ｌ−１に対するこの抗血清はスチーブン ミズル教授の
御好意により得られた。 比」匹患且進： ５０ｍＮへ−ベス、 ｐＨ７，４、及
び１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥに抗血清を既に述べた
時間にねたつで希釈した。精製組換え１１−１を５０ｐ
Ｈの最終濃度液中に添加した。氷上で１時間後、溶液の
１５μ〕分を細胞！ｌｌｉ層に添加し、最終Ｉ［−１濶
度を０．７５ＤＨとした。ＬＰＬ抑制のアッセイは、１
６時間の培Ｍ後通常のように行われた。 稈Ａ ｒ された絹 えニジ−１によるＬＰＬ゛ −の ３
，１：組換えＩＬ−１を３Ｔ３−１１細胞に添加するこ
とによって、１−ＰＬ活性は部分的に抑制された。第９
図に示すように、ＩＬ−１は、フェムト（Ｆｅ１ｌｌＤ
ｔ）モル範囲の濃度でＬＰＬ活性を抑制することができ
た。 かくして叙上の系においてほぼ１０１８モルのホルモン
を検出することができた。しかしながらホルモンのμＭ
の濃度ではこの条件で５０％以上はＬＰＬを減すること
ができなかったが、９０乃至９５％の抑制は、カシエフ
チンのｎＨｉ１３度で達成することができた。３Ｔ３−
Ｌ１細胞を時々分【ノて加えることにより、ｒ ＩＬ−
１に対しより高い感応性が得られ、一般的には５０％抑
制が可能な最大限であり、いずれの場合でも抑制効果が
８５％を越えることはなかった。 カシエフチンと１１−１の双方が培養３Ｔ３−Ｌｌ細胞
に添加された時、これらの効果は補足的であり、相互に
依存関係はないように見えた。例えば５０％抑制（最大
感応性）を得るために十分な猶のＩＬ−１を、５０％抑
制を得るために十分な場のカシエフチンと共に添加した
ところ、はぼ７５％の抑制が観察された。相乗効果は観
察されなかった。 特−Ｗヤ′αＩＬ−１１をｉ する組 え１１−１によ
るＬＰＬＩｌｌの 宇： ０．７５ｐＨの［１−１を
培養３■３−１１細胞に添加した時、８０％のＬＰＬ抑
制が得られたくこの実験における最大感応）・コ（１）
ｒＩＬ−１を特異中和抗血清と予備培養すφことにより
・この反応は完全になくなった。減少組の血清を添加す
ることにより、中間レベルの抑制が得られた（第１０図
）。中和に使用した濃度範囲では、ＬＰＬ表徴に血清の
直接的な影響は見られなかった（データは示されていな
い）。従って使用されるｒＩＬ−１試料によるＬＰＬ抑
制は、確かにモノ力インの存在に帰因するものであり、
汚染細菌蛋白質、或いはＩＬ−１の分離に採用される反
応剤によるものでないように考えられる。 べたように、放射線ラベルしたカシエフチンは、３Ｔ３
−Ｌｌｌ［１胞のみならず他の組織にも存在する高親和
性レセプタ（ボイトラーほか、既述）に対して結合する
ことができ、またｎＨｉｌ１度のラベルしないホルモン
により容易に置き代えられる。 ０１μＭ及び１０μＭＥ１度の精製組換えＩＬ−１の添
加により、この放射線レセプタアツセイにおいては、ト
レー蚤ナカシエクチンの著しい置き代えは生じなかった
く第１１図）。従ってＩＬ−１は、３Ｔ３−Ｌｌにお【
ノるＬＰＬの抑制を引出寸一方、カシエクチンレセブタ
に結することなく抑制することができると考えられる。 しかしながら、インターロイキン１によるＬＰＬ抑制の
パターンは、アジポサイトにおりる１、ＰＬの９５％以
上の抑制が共に可能な本発明のメディエータ或いはカシ
エフチンのパターンと異なっている。カシエフチンによ
るＬＰＬの抑制及びＩ［−１によるＬＰＬの抑制は補足
的であり依存関係にない； ＩＬ−１の最大抑制濃度の
存在下でも、カシエフチンの添加により更に抑制が達成
される。 几二支豊北上：ディナレロ（既述）が論じているように
、インターロイキン１と同定された因子は、ある免疫調
整活性効果を有する他の因子（そのあるものはインター
ロイキン２と確認されている）と異なっている。以ＭＱ
はＴ＠胞成長因子として知られているインターロイキン
２ハＴ １８１１１によりつくられ、リンパ球に対し直
接成長信号を送る活性を有する。ＴＬ−２の製造は、ま
た、ある場合には生体内でＩＬ−１により制御される。 ＬＰＬ抑制に関し、■し−２がＩ［−１と同じ活性を有
するかどうかを確認することは、従って興味あることで
ある。 従ってボイトラーホカハＪ、［ＸＰ、ＨＥＤ、、１６１
号。 ９８４−９９５ページにおいてＩＬ−２のＩ−ＰＬ抑制
活性を調べ、これが存在しないことを知った。明らかに
ＩＬ−２はこの特徴をＩＬ−１と共有してＪ３らず、従
って同様に、粗メディエータ物質と、その分離物である
本発明のモジュレータ物質、即ちカシエフチンとの双方
と区別することができる。 要約すると、メディエータ物質、その分離カシエフチン
及びＩＬ−１のすべてはＬＰＬに対して抑制効果を有す
るが、メディエータ物質とカシエフチンとによる効果は
Ｉ［−１のそれと構造的かつ機能的に異なり、このこと
はこれら物質自体が異なっていることを示唆している。 更にこれら三種の物質はＩ［−２と異なっており、その
ため別々の特徴が試験される物質それぞれについて考え
られる。 友五土１ 米国特許出願用４１４．Ｏ’１８号において、先述メデ
ィエータ物質がｌ１１ｇ１素アセチルＣｏＡカルボキシ
ラーゼ及び脂肪酸シンテターゼに及ぼす効果が研究され
、メディエータ物質は両酵素の合成に干渉することによ
ってこれらを阻害することが確められた。この実験では
、前記第４１４，０９８号の実施例■のアッセイ系がと
りあげられ、インターロイキン１とカシエフチンのそれ
ぞれについて適用が行われた。精製ＩＬ−１及びカシエ
フチンがボイトラー及びけラミ（既述）に開示されてい
るようにｗ４製され、調製培地で得ら礼た内Ｒ′ｌｆｉ
の存在下に培養されたマウス腹腔滲出液細胞内に使用さ
れた。 かくして、３Ｔ３−Ｌ細胞はＩＬ−１とカシエフチンの
それぞれにさらされ、４２４時間培養され、アセチルら
Δカルレボキシラーゼと脂肪酸シンテターゼ活性の測定
が３時間、６Ｒ間及び２０時間後のそれぞれに行なわれ
た。いずれの場合にも、夫々の因子で培養した細胞の、
ジギトニン解放シトツル分画はどちらの酵素の活性も減
少させることはなく、従ってＩＬ−１もモジュレータ物
質であるカシエフチンも同化酵素であるアセチルらＡカ
ルボキシラーゼ及び／もしくは脂肪酸シンテターゼに抑
制効果を及ぼすことはないことがわかった。従ってこの
ようにしてこのモジュレータ物質は、明らかに粗メディ
エータと区別されるが、インターロイキン１と類似性を
有していることがわかる。 支立叢ヱ この実施例は、゛慢性疾病における悪液質のネズミモデ
ル： ３Ｔ３−Ｌ１脂肪性線維芽細胞における内Ｒ索誘
導マクロファージ分泌蛋白質賦活異化作用”なる論文に
来会ｎ事実としてまとめられており、本出願人及び共同
研究者の一人によって行＜ｋわれた研究がら央粋したも
のである。 この研究において、脂肪細胞新陳代謝阻害に及ぼす粗メ
ディエータ物質の役割は更に研究され、特にメディエー
タがトリアジルグリピロールの細胞による解放に基づく
異化活性に及ぼす効果に焦点があてられた。この脂肪分
解活性は直接に測定され、ホルモン感応リパーピとＣＡ
）ＩＰの活性が参照され、その結果、メディエータは脂
肪分解及びホルモン感応リパーゼの活性の役割及び節回
に著しい効果を及ぼすこと、しかしｃＡＨＰレベルと活
性は実際上影響を受けないことがわかった。この研究で
採用された手順は以下の通りである。 ご び干々の 〃 種々の反応剤・材料及び手順が、この分野において従前
報告されている作業に利用されているようにして、採用
された。かくしてイソプロテレノール、八ＣＴ１１．
（３２Ｐ ） Ｐｉ、 ＬＰＬ及びマウス腹腔マクロ
ファージが慣用入ｆ源から人手されるか、調製された。 ＣＡ）ＩＰの放射線免疫アッセイが、ワトキンはかによ
りＪ、ＢＩＯＬ、ＣＩＩＥＭ、 、 ２５７号、 １
４７１９！ｉ：ｊ、 １９８２年、に報告されているよ
うにして実施された。 ３Ｔ３−Ｉ ＩＩ Ｉｌｌ 培？ａ ： ３Ｔ３−Ｌ１
ブレアシホサイトがペカラホカニよすＰＲＯ，ＮＡＴＬ
、八ＣＡＤ、 Ｓｃ １． ＵＳＡ、 ８０号。 ２７４３ページ、 １９８３年、に記載されているよう
にして、１０％ウシ胎児血清を含むダルベコ修正イーグ
ル培地中で培養された。培地に、０．５ｍＨイソブチル
ーメチルキサンチン、１μＭデキサメタシン；及び培地
１１！あたりインシュリン１０μｇを補充することによ
り、合流後２日で分化が生じた。４８時間後この培地を
除去し、１０％ウシ胎児血清及びインシュリンのみを補
充した培地と取り替えた。４日後細胞の９０％以上がア
ジボサイト表現型を示した時、培地を代え、細胞をイン
シュリンなしに１４日間保持した。 ｌ１Ｌｌ１１ｉ！：脂肪分解は、ビンターほかにより、
ΔＩｔｅ１１． ＢＩＯＣＩＩＥＨ，ＢＩＯＰＨ３，１
２１号、 ４ｏ４ペー シ。 １９６１年、に示すようにして、グリセロール解放につ
いて測定した。細胞はＩ）１１７．４の２％ウシ血清ア
ルブミン（分画Ｖ）と共にタレブスリンガーりん酸塩緩
衝液で洗浄し、２．ｏｘｉの同じ培地中で１乃至２時間
３７℃で培養した。培養は培地を除去することによって
終アレ、これを１０％トリクロロ酢酸で調整した。この
混合物を１０分間２、５００ ｒ ｐｏｌ′ｃ遠心分離
遠心上リクロロ酢酸をエーテルで抽出した後、結合酵素
系を用いて上澄み液のグリセロール含ルを測定した：試
料（０，１６７１月を、０．１４１ＨのＡＴＰ 、 １
．２ｍＨのフォスフエノールピルビン酸塩、 ０．２
０ｉＨのＮ＾０１１゜１．５単位のグリセロキナーゼ（
カンジダ マイコデルマ）、１．３５単位のキナーゼピ
ルビン酸（ウサギ筋肉）、及び２．８単位のラクターゼ
デヒドロゲナー＋：！（ウシ心臓）を入れたキャベツト
に添加した。試料中のグリセ【コールのｍは酸化Ｎ＾０
１１に比例する。グリはロールの解放は、１０６１［１
１Ｂ！あたりもしくは田七白質あたりの単位時間に解放
される全ｎモルであると報告されている。上記条件下で
、グリセロールの解放は、少なくとも３時間一定であっ
た。 １セロ−ルー に は −イエー ロいはイソプロテ
レノールの ：内毒素処理マウス腹腔マクロファージ
１からの調整された培地（４００μ〕）が、種々の時間
間隔にわたって、分化３Ｔ３−１１細胞（４，２Ｘ１０
６細胞／皿）の培養培地（３，５ｙｆ）に添加された。 この巾は、１５時間後リポプロティンリパーゼの活性を
９０％抑制するために十分な駄である。培養の終りに培
地が除去され、２％ＢＳＡを含有するクレブス−リンガ
−りん酸塩緩衝液で細胞単層が洗浄され、グリセロール
解放が１乃至２時間監視された。 イソプロプレツールを用いて行った研究にＪ３いて、細
胞単層が、２％ＢＳＡを含有するクレブスリンガ−りん
酸塩緩衝液ｃ−２回洗浄され、同じ緩衝液で培養された
。飽和レベルのイソプロプレツール（３μＭ）が添加さ
れ、培養混合物中へのグリセロール解放が１乃至２時間
監視された。 １ １ の５ びホルモン感 リバー゛のアッセイ：
ホルモン感応リパーゼを含有する溶解細胞抽出液が、カ
ワムラはかによりｐｎｏｃ。 ＮＡ丁り、 八ＣＡＯ，ｓｃ ｉ 、 ＬＩＳ＾、７
８号、 ７３２ヘージ、 １９８１年、に記載され
ているようにして調製された。 先ず培地が代えられ、細胞単層が、ヘパリン（１０単位
／１１＞を含有する培地で６０分間培養された。培地を
除去し、細胞単層をＤ１１７．４のダルベコりん酸塩緩
衝食塩水で、一度はｐｔ１７．４ 、１０ｉＨのトリー
ＨＣｆ／１１Ｍの［：ＤＴＡ／ ０．２５ Ｍのシヨ糖
、で２度洗浄した。細胞を掻き落し、１分間１１００Ｏ
ｘで遠心分離した。パックした細胞をｔｏｍＨのトリー
ＨＣ１、ｐＨ７，４； １ ｍＨのＩＥＤＴ＾；及び０
．２５Ｍのシヨ糖：の２容中で均質化し、１時間、４０
、０００ｘｇで遠心分離した。上澄液をヘパリン−セフ
ァローズ親和性コラムに適用して、リポプロティンリパ
ーゼを吸着するようにした。発出液は、血清の添加によ
り活性化しない脂肪溶解活性を有し、これはリポプロテ
ィンリパーゼが存在しないことを示すものである。 抽出液標本（０，０７ｉｆ）を全Ｊ０．１１ｆの５ ｍ
Ｈｖグネシウムアセテー１−７０．５ｍＨの八ＴＰ１０
．０Ｉｎ＋ＨのｃＡＨＰ／Ｉｎ＋Ｈの［Ｏ丁Ａ／２５１
ｎ＾のトリｌ−１ｃＬ ＤＩ＋８ 、 に５分間３
０℃で培養し、リバーげを賦活化した。アッセイは、０
．３ｍＨＣ３１−Ｉ ） −トＩＪ ：ｔ Ｌ／イン７
．５ｘｌＯ５ｃｐｍ／μモル） 、５０ｍＨのりん酸ナ
ト１戸りム、ウシ血清アルブミン５ ＴＩＩＧ ／ ’
１１．２ｍＨの［：ＤＴＡ、 ｐｌ＋７、Ｏｌを含有す
る基質混合物（０，７ｉｆ）の添加により開始した。３
０分間の培ｒｉ後、メタノール。 クロロホルム、及びヘプタン（１，４１：１．２５ ：
１．０からなる抽出混合液の３１１を添加した。トリジ
エート（トリチウムを含有する）オレイン酸を、液／液
部分によりエステル化オレイン酸から分離し、放射能を
カワムラはかく既述）が記載しているようにして測定し
た。 １里 の に ぼすメ１イエ−ロチ ＬｚＬみ」：以前の実験により、内毒素又は内毒素処理
マクロファージからの調整培地にさらしたマウス精巣上
体脂肪パッドが著しい重１１減少を生じることが実シ［
された（Ｍ、カワカミ：ベカラ、 Ｐ、 ｌ−１，：セ
ラミ、Ａ０．来会間データ）。この観察は、粗メディエ
ータ物質についてもとちと開示された脂質生成抑制に対
応する貯蔵ｉ〜リアシルグリセロールの除去、に至る脂
肪分解活性を示している。メディエータに１５時間さら
す間に、グリセロール解放により測定される脂肪分解は
瀬次増大し、基準のほぼ１５０％になった。グリセロー
ル解放の最大活性のために必要な時間は、膜組織と結合
するリポプロティンリパーゼの最大抑制につい″Ｃ観察
される時間に対応する。メディエータに１７時間さらし
た後、溶＠細胞抽出液でアッセイすると、ホルモン感応
リパーゼ活性は以下の第■表に示すように６０−１０％
増加した。 細胞は分画するように誘導され、実験手順に記載された
ように保持された。ホルモン感応リパーゼを含有する溶
解可能分画が対照細胞、及び内毒素処理マウス腹腔マク
ロファージからの調整培地に１７時間さらされた細胞、
から得られた。 抽出液は直接にアッセイされるか、或いは、実験手順に
記載されたようにアッセイする面に、ｃＡＨＰ及びＡＴ
Ｐの存在下に５分間培養された。数値は、４種の実験の
平均上標準偏差である。 ホルモン感応リパーゼ活性 ｎ七ル／時間／［蛋白質 対照ＩａＩ胞 メディエータ処理細胞なし １４６±
１８ ２４０±４２ｃＡＨＰ ３０４±５４
２６３±３１ｃＡＨＰ及びＡＴＰ存在下
で対照抽出液を培養した結果、リパーゼ活性が２倍にな
った。しかしメディエータ処理細胞から調整した抽出液
の培待の場合には、このような刺激は観察されなかった
。 同じ実験において、飽和レベルのβ−アドレナリン作用
拮抗イソプロテレノール（３μＭ）（ワトキンスほか、
Ｊ、ＢＩＯＬ、 ＣＩＩＥＨ，，２５７号。 １４γ１９ページ、 １９８２年）にざらされた細胞は
、３１０ｎモル／時間／Ｔｌ１ｇ蛋白質のグリセロール
解敢最大値を示した。これは、以下の第１Ｖ表に示す３
１５ｎモル／時間／′ｆｆ１ｇ蛋白質のメディエータ処
理細胞の最大値に較べられる。 ＷＥ ｆＭ ｍ人！＄ ： ３Ｔ３−１１細胞をメディ
エータに対し１７時間、もしくはイソプロテレノールに
対し１時間さらし、グリセロール解放を、実験手順に記
載したようにして測定した。数値は４種の実験の平均値
上標準偏差である。 ９ＬＭ 旦ｉルＺ曜皿２四正亘亘 ｎモ
ル／時間／１０６刊肥対照例 １１８±
１５ ６１±１０メデイエータ
３１５±１８ １６４±１０３Ｍ
イソプロテレノール ３１０±２５
１６２±１２比較として、開示されたように調整され
た精製カシエフチン、及σＩＬ−１がそれぞれ、内毒素
処理マウス腹腔マクロファージに由来する培地について
記載されたのど同じ条件で分化させた３Ｔ３−１１細胞
で培養された。その後、ホルモン感応リバーぎを含有す
る溶解分画が同様の方法で調整され、直接にアッセイさ
れた。その結果、ｎモル／ １１．’ｉ間／■蛋白り１
で表わされたホルモン感応リパーゼ活性は上記第■表の
対照細胞のそれと同じであった。 以上のデータから、粗メディエータ物質は脂肪分解及び
ホルモン感応リパーゼの活性を刺激するように見える一
方、この活性は、本発明のモジュレータ物質、もしくは
公知の因子として固定されＩＬ−１として表わされてい
る物質のいずれによっても実証されていない、と結論ず
けることができる。 支直五Ｍ この実施例は、トルティはか（既述）の研究に由来する
ものであって、アジボサイトにおける脂肪生成酵素活性
を抑制する機能を果すメディエータ物質の機構を明らか
にするために行われた。安定した脂肪生成細胞系（Ｔへ
１ ）の内毒素刺激マクロファージ培養における調整培
地の効果は、チャプマンほかによりＪ、 ＢＩＯＬ、Ｃ
ＨＦ２．２５９号、 １５５４８−１５５５５ページ
、 １９８４年に記載されているように、脂肪細胞分化
の間圧比が増加する遺伝子のｃＤＮＡクローンを用いて
検査された。メディエータは、脂肪誘導遺伝子の発生圧
出を逆方向にかつ特異的に阻害し、このことは、これら
遺伝子の転写活性化を阻害することにより生ずるもので
あることがわかった。更に、成熟脂肪細胞がメディエー
タにざらされる時には、脂肪生成中に誘発されたこれら
遺伝子のｍ１ｔＮＡは減少し、Ｄ速に予備分化レベルに
近ずく。丁＾１細胞は、チャブマンはか（既述）が記載
しているように、組織培養体単層に合流後はぼ３日で典
型的な脂肪細胞形態を発生させる。分化の形態学的証拠
と並行して、分化後その圧出が明らかであるいくつかの
遺伝子が同定されたくクローンｉ 、 １０．２８．４
γ）、、これら脂肪誘導ｉＲＮ＾は、転写活性のため大
部分が或いはリベてか圧出される。これら脂肪遺伝子の
座標誘導に及ぼすメディエータの影響を測定するために
、メディエータを予備合流ＴＡ１ ｇ胞、及び合流に達
した日の後の細胞に添加した。これらから分離された全
ＲＮＡ及び、合流６日後の比較細胞を、その圧出が脂肪
細胞中に観察されるが前脂肪細胞中には観察されないよ
うな遺伝子の放（、Ｊ４線ラベルｃＤＨ八でプローブし
た。第１２図に示すように、メディエータ処理によって
脂肪誘導ｍＲＮ＾の蓄積が阻止される。リビド蓄積ちま
た、メディエータ処理によって完全に阻止される。メデ
ィエータによって処理されるＴへＩ脂肪細胞培養体は、
スダンＴＶ痕跡による中性リビドが出現することなく（
データは示されていない）、２３日間にもわたって保持
された。しかしながら、培地からメディエータを除去リ
ーると、脂肪細胞形態が、脂肪生成誘導遺伝子の発言、
即ちクローン１（第１３図）のように、復元した。 遺伝子発言の抑制はメディエータの一般的な効果ではな
い；例えば第１２図から明らかなように、β−アクチン
ｉＲＮ＾のレベルは影響を受けない。更に、メディエー
タによる前脂肪細胞培養体の処理は細胞の成長或いは生
育力に影響を与えるものではない。第１２図の実験に似
た構成の一連の実験において、細胞の増殖は細胞数のカ
ウントにより、ハ」−チミジン結合により測定された。 比較例及びメディエータ処理培養体は、合流点における
細胞数の増加及び３１１−チミジン結合減少によっては
区別することができない。 トリパンブルー排除及びクロナール成長アッセイによっ
て測定されるような細胞の成長力もまた比較例及びメデ
ィエータ処理細胞に等しい（データは示されていない）
。 脂肋特巽性ｍＲＮＡ蓄積のメディエータ阻害が転写的に
制御されるかどうかを測定するために、各転写アッセイ
が行われた。第１４図は、クローン１及び２８の遺伝子
転写における正常な発生増加がメディエータにより阻害
されることを示している。次いで、同様な結果がグリセ
ロフォスフェートデヒドロゲナーゼ（Ｂ、スビーグルマ
ンの行為による）及びクローン４７からのｃＤＮ＾につ
いて１ｑられた（データレよ示されていない）。補足的
な実験におけるメディエータ添加後ＧＰＤのｍＲＮ八レ
ムレベル減少ＧＰＤの酵素活性の減少と平行している（
データは示されていない）。しかしながらメディエータ
処理は、転写活性の非特異性減少の原因となるものでは
ない：前合流細胞２分化脂肪細胞、及び分化中メディエ
ータで処理した細胞におけるβ−アクチンの転写率は等
しい（第１４図）。 成熟した哺乳動物においては、脂肪細胞は、殆ど或いは
まったく増殖しない。かくしてメディエータが前合流Ｔ
Ａ１細胞に添加された時、分化中脂肪遺伝子発言の抑制
は、これら脂肪遺伝子が発育中座標的にいかに調整され
るかを理解するためには有用であるけれども、哺乳類悪
液質の現実的なモデルをおそらく表現するものではない
。生体内状況をモデル化するためこれら細胞をより忠実
に利用するよう、成熟脂肪１１１１１１培養体がつくら
れこの細胞にメディエータが添加された。メディエータ
に４乃至６日さらした後、多くの細胞はその中性リビド
を失った。典型的な実験において、細胞の７０−８０％
は、メディエータがこれら培養体に最初に添加された詩
人型すピド滴を有している；６日後、細胞のほぼ１０％
は同定可能トリグリセリドをスーダン■痕跡上に右する
。第１５図に示ずように、脂肪特異ｐｌＲＮＡの変質は
りピド可動化よりも迅速に生ずる。成熟ＴＡ１脂肪細胞
にメディエータ添加後１２乃至２４時間で、このような
ＲＮ＾レベルは９０％以上減少することが観察された。 かくして遺伝子発言の劇的かつ座標的な変質は、リピド
メディエータ誘導可動化に第一の重要性となっているよ
うにみえる。 これらのデータを集めた特定手順を示す図の説明は以下
の通りである。 剃バ５ ： １０Ｔ／２Ｃ１８細胞の５−アザシヂジン
処理に由来する安定した脂肪生成細胞系である丁ＡＩ細
胞が、１０％熱不活性化ウシつ児血清を補充したイーゲ
ルベ−ザル培地で生長した。１０ツＭメキサメクゾンが
、合流後最初の３日間培地中に存在し、合流後最初の６
日間５μｇ／１１ウシインシュリンが存在した。マクロ
フフ７−ジ細胞系ＲＡＷ２６４からの調整培地を、１０
μの濃度で合流２日前に予備脂肪細胞培養体にまず添加
した。 これは培養脂肪細胞のリポプロティンリパーゼ活性の９
０％を抑制した。細胞にはホルモンを０日（合流口）、
３０目に再補充した。細胞は６日目に回収した。全ＲＮ
＾が、チャーゲインほかによりＢＩＯＣＩＩＥＨＩＳＴ
ＲＹ、 １８号、 ５２９４−５２９９ページ。 １９１９年記載されている方法で分離し、点ブロワ１〜
装置（ＢｆｌＬ）中のニトロセルローズに適用した〇ニ
ックは、発言が分化丁＾１脂肪細胞のみに見られる遺伝
子のｃＤＮＡクローン（クローン１．ｉｏ。 ４７及びグリセロフエスフエートデヒドロゲナーげ）を
書き直し、またβ−アクチンｃＤＮ＾クローン（Ｐ、ガ
ニング及びり、ケーデスの行為による）を、チャブマン
はか（既述）に記載されている交雑条件下でこれらフィ
ルターを探査するために使用した。フィルターを洗浄し
、強化スクリーンを用いて、−７０℃でＸＡＲ５フィル
ムに露光した。 北封］：第１２図について記載されたようにして点プロ
ットが形成された。メディエータ（Ｋ）が、示された時
間に培地中に存在していた。 ＲＮＡは、合流優６，９及び１２２日目クローン１のｃ
ＤＮ八について分析された。 第１４図：転写アッセイが、バニスほかによりＰＲＯＣ
，Ｎ＾ＴＬ、八ＣＡＤ、Ｓｃ Ｉ 、、ＵＳＡ、８１号
、 ４２４１−４２４５ページ、 １９８４年、及び
イスラエルとホイットロツクによりＪ、 ８１叶、 Ｃ
ＩＩＥＨ，、２５９号、 ５４００−５４０２ページ、
１９８４年、に記載され、ナイトはかにより脂肪細胞
について修正されたような方法を使用して行なわれた。 培養細胞は４℃に冷却され、培地が吸引され、りんＷ１
塩緩衝食塩水で洗浄された。１１１の低張性緩衝液（２
０ｍＨのトリ／ ＨＣ１。 ｐＨ８，０；４ｍＭのｈｘ（Ｊ２； ６ｍＭ（７）Ｃａ
Ｃｆ２： ０．５ｍＭ１７）シラオスレイ１−−ル〉
がプレートに添加された。 ５介接、１１！の溶解緩衝液（０，６Ｈのショ糖。 ０、２％のＮＰ−４０，及び０．５ｍＭのジチオスレイ
１−−ル）が添加し、細胞を組織培養器から掻き落した
。ダウンス均質化の後、核が５００ｇのベレット化され
、再懸濁緩衝液（０，２５Ｍのシヨ糖：１０ｍＨのトリ
／Ｈ（Ｊ、 Ｄ１１８．Ｏ： １０＋１１８の−（Ｊ
： １ｍＭのジチオスレイトール）で一度洗浄され、
再ペレッ１〜化され、次いで５０１１１１４のへ−ブス
、ρ１１８．０ ：９０ＩＩＨのＮＨ４Ｃ９： ５１１
１８の−Ｃ１： ０．５ｍＨのＨｎＣ第２ ；２ｍＨ
のジヂオスレイトール： ０．１＋ＤＨのＥＤＴＡ
；それぞれ０．４１１１４の＾ＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ
： １０％グリセロール；及び１０Ｈｇ／ｘｉのウシ血
清アルブミン中で再懸濁した。核は２ｍＣ１／ｉｆの濃
度で３２Ｐ−ＵＴＰ（６０（ｌｃｉ／１ｍモル、 ＩＣ
ｔｌ）と共に、４０分間２５℃でゆるやかに揺動させな
がら培養した。 ＲＮＡは、スミスほかがＣＦＬＬ、 １５号、 ６１
５−６２６ページ、 １９７８年に記載しておりナイト
ほかにより修正した方法によって核から回収し、交雑さ
せて線状ｃＤＮ＾しとし、これはニトロセルローズフィ
ルターに適用し、真空オーブン中で、８０℃で２時間悦
いた。フィルターの予備交雑及び交雑条件はフリートマ
ンはかにより、ＣＥＬＬ、 ３８号。 ７４５−７５５ページ、 １９８４年に記載されている
通りであった。交雑は３日間、４２℃で、クローン１及
び２８、及びβ−アクチンとｐＥＨＢＬプラスシト比較
例について、脂肪ｃＤＮへの点に１５０μノの容積で、
反応混合物あたりほぼ１５Ｘ１０６Ｃｐｌで行った。 ｉｌｌ：メジエータ物質の１０μｍ／１！が、第１２図
に記載されたように分化した６８目脂肪ＩＩＩ 胞培養
体に添加された。全１１８へは、メディエータにさらさ
れた優指定した回数ビスから分離され、点プロット装置
（シュライヒ１７−及びジュール）によりニトロセルロ
ーズに適用した。 フィルターは指定したｃＤＮＡｒ″探査され、洗浄され
、ラジオオートグラムが作られ、レボーティングインテ
グレータにとりつけたホーフｙＧｓ３００型濃度計（ヒ
ユーレット−バラカード社製）を用いて走査された。示
された点は、細胞のＲＨＡを合計するようにｃＤＮＡプ
ローブを用いて適用１１Ｎ＾のけの差を標準に一致させ
た。 第１５Ｂ図：これらノーザン分析のため、１２μｑの仝
ＲＮ＾が最終濃度である２、２Ｈホルムアルデヒド、３
０％ホルムアミド、 １０１ＭのＮｈ Ｈ２ＰＯ４、Ｄ
１１７．０に導入され、５６℃で１５分間加熱された。 試料は、マニアチスほかにより“分子り０−ン：実験室
手順”にューヨーク州コールド スプリング ハーバｍ
：コールド スプリング ハーバ−ラボラトリ、 ２
０２−２０３ページ。 １９８２年）、に記載されているように２．２Ｈのホル
ムアルデヒド、２０ｍＨのＨＯＰＳ、 ＤＩ＋７．０
、 ５．０１Ｈの酢酸す（〜リウム及び１１のＩＥＯＴ
＾、の最終濶匪の１．０％アガローズホルムアルデヒド
ゲル中で電気泳動させた。ゲルは蒸留水で３分間洗浄し
、１０ｍＨのＮａＰＯ＋ （Ｄ１１７．４）及び１ｍ
ＨのＥＤＴＡで２回３０分間の洗浄を行い、次いでニト
ロセルローズに移した。挿入部は、クローン４７ＤＮＡ
でブＯ−ブした典型的なノーザン分析を示す。 以上に述べた実験は、先に発見されたメディエータ物質
に対応する内毒素刺激マクロファージの粗調整培地と、
ボイトラーはか（既述）により最近、均質化するまで精
製されたプロティンカシエフチンの双方を用いて実施さ
れた。比較試験がインク−０イキン１（マウス組換えＩ
ｔ−１，ホフマンーラロシュ社のＰ、ロメディコの行為
による）を用いて行われ、■シー１は脂肪細胞分化を抑
制しないことがわかった。かくしてメディエータ物質と
このモジュレータ物質カシエフチンの両方が脂肪細胞分
化に抑制的な影響を与える。 大】１九■ この実験においては、筋肉細胞によるグルコースの取り
込み及び新陳代謝の活性が研究された。侵入刺激に応じ
て生ずるショックに随判する異化活性を促進するのと同
じ因子が、同様にショック中に存在する低血糖を招束す
るグルコースの消費に影響を及ぼし或いはいくらか原因
的な効果を与えていることが推論された。 この仮訳を支持するものとして、皮下注射されるメディ
エータ物質の粗試石は、内毒素抗性Ｃ３１１／！ＩｃＪ
マウスにおける低血糖の原因となること、また、粗メデ
ィエータとモジュレータであるカシエフチンの双方が２
−デオキシグルコース移動を増加すること、が観察δれ
た。従って粗メディエータ及びこのモジュレータは、共
に、感染に応答する新陳代謝の制御にある役割を果して
いることが疑われ、粗メディエータ物質、このモジコレ
ー夕、カシェクヂン、と共にインターロイキン１を加え
て比較研究を行い、し６筋肉ａｔ胞に；Ｊ３
【プるグル
コースの取り込み及び移動を測定した。手順及び結果は
以下の通りである。 社■ ウエストファル法により分離したイー・コリ０、１２７
： Ｂ８からの内毒素（リポポリサッカライド）をデ
ィフコラブ社（ミシガン州デトロイト）から購入した。 細胞培養培地及びｍ牛血清はギブコラブ社にューヨーク
州グランドアイランド）から、またウシ胎児血清はステ
ライル システムズ社（ユタ州ローガン）から得た。３
−イソブチルメチルキサンチンはアルドリッヂケミカル
社（ウィスコンシン州ミルウォーキー）から；デキサメ
タシン及びＣＰにアッセイキットはシグマ ケミカル社
（ミズーリ州セントルイス）から：インシュリンはエリ
リリー社（インディアナ州インディアナポリス）；グ
リセロール トリ（９，１０（ｎ）−３８） ｔレイ＞
Ｗｔ、 Ｕ−１４Ｃ−グルコース及び２−デオキシ−Ｄ
（１−３）−１）グルコースはアメルシャム社（イリノ
イ州アーリントンハイツ）、２−メチル（３１１）イソ
ブチル酸はニューイングランド ニュークリア社（マサ
ブユーセッツ州ボストン）ニトリオレインは又チェック
ブレツノ社（ミネソタ州エリシアン）：アセヂルビリ
ジンアデニンジヌクレオチド及びラクテートデヒドロゲ
ナーぜはベーリンガーマンハイム社（インディアナ州イ
ンディアナポリス）から得た。 ム ３Ｔ３−Ｌｌ ： ３Ｔ３−Ｌｌｍ 脂ＭＢ
ａｌｌ ０１ ハ、１０％ウシ胎児血清をダルベコ修正
イーグル培地（［）ＨＥ培地）中で、既に記載したよう
に培養した。脂肪細胞表現型に至る分化が誘導された。 合流２日後、培地し、０．５１Ｈのイソブチルーメヂル
キサンチン、１μＭデキサメタシン及び１オあたり１０
μｑのインシュリンが補充された。４８時間後、イソブ
チル−メチルキサンチン、デキサメタシン及びインシュ
リンを含有するこの培地が除去され、その代りにインシ
ュリンを１！あたり５０ｎｇの減少濃度で含有する培地
が使用された。 ［６細胞培養 萌芽細胞系、［６，がカリフォルニア州
すンジエゴのサルク ィンスティチュ−１へのデビット
シューベルト博士の御好意で得られた。この細胞を５
％ＣＯＺ中において３７℃で、１０％ウシ胎児血清−叶
［中に保持され、標準手順によりトリプシンを加えられ
、５ｘｌＯ’ｗＵ胞／７！の濃度でプレート化された。 合流は一過問後生じた。節管への分化は、細胞が合流に
達した後、２４時間インシュリン（１０μＱ ／ ｘｉ
）で処理することにより促進された。 “甲 びメディエータ パの−１：腹腔滲出細胞
は、使用５１館に無菌ブリュワーのヂオグリコレート培
地（ディフコ ラグ−。 ミシガン州デトロイト；マウスあたり３１１）を腹腔的
注射したＮＣ８／ＳＰＦマウス（２５−３３（１；ロッ
クフェラー ユニバーシティ、ブリーディングコロニー
）から腹腔内洗浄することにより得られた。この手順を
採用して得られた滲出細胞はいくらか汚染リンパ球を含
／ｖだマクロファージを主としていた。 この細胞（４Ｘ １０５細胞／ｃ−ｄ＞は、３日間血清
のないＩｔＰＨ［−１６４０培地中で培養し、その後非
粘着性細胞は通常の食塩水で３回洗浄することにより除
去された。更に粘着する細胞は主としてマクロファージ
であった。この細胞を、生体内使用のための内毒素の５
μｑ／１１もしくは試験管内使用のための０．１μｇ／
ｘ１の存在下、もしくは不存在下に、血清のないＲＰ旧
−１６４０培地で更に２０時間培養した。培養培地は培
養後除去され、４℃で５分間１０００ｘ ｇで遠心分離
した。 内毒素にさらされた細胞から得られた調整培地の上澄み
液は、メディエータ物質を含有していた。調整培地を１
力月間−８０℃で保存した後、活性に相違はみられなか
った。 ２−デＡキシグルコーズ運搬二Ｌ６細胞中の２−デＡキ
シグルコーズの蓄積は、３Ｔ３−１１細胞についての修
正手順により測定された。［６細胞は６ｃ組織培養皿で
合流するように成良し、萌芽■Ｉ胞におけるアッセイの
ため合流時に使用されるか、節管におりるアッセイのた
めインシュリンで分化された。マクロファージメディエ
ータ、部分的に精製したメディエータ或いはりボボリサ
ッカライドが、２１１のクリブスーリンガーへ−ブス（
１２８ｍＨのｆｆ１ｃｊ、 ５．２ｎ＋ＨのＫ（Ｊ、
１．４ｍＨのＣａＣｊｚ 、 １ ｔｌｌＨの−
３０４、１０ｍＨのへ−ブス、ｐ１１７．４）（にＲ旧
を用いてプレートを３回洗浄する前にほぼ２４時間、も
しくは指定した時間添加された。インシュリン及び／も
しくはシトカラシンが指定したように添加され、プレー
トは、２−デオキシ−３Ｈ−グルコース（２μＣｉ／μ
Ｍ。 ０２ｍＨ）の添加前に３０分間培養された。１０分後、
プレートは冷たい〈４℃） ２５ｍＨグルコーズにＲＨ
で洗浄した。緩衝液は吸引され、１．５ｘｌの１０％硫
酸ドデシルナ１〜リウムをプレートに添加し、細胞を溶
解するため３０分間室温に放置した。細胞は掻きとりピ
ペットで懸濁させることにより、プレートから取り除い
た。生成する混合物は、１０秒間、２回、プランソンソ
ニケータ上で、中間動力でソニケート（５ＯｎｉＣａｔ
Ｑ）処理され、液体シンチレーションカウンタによりｆ
＆射能が測定された。 精製＋１−１がこれまでの実験のように得られ、メディ
エータ及びその分離物に関して述べたのと同様にして、
Ｌ６細胞と共に培養した。 級ｌ 一般的に、メディエータ物質とその分離物は共に２−デ
オキシグルコースの移動を、１６Ｍ芽細胞及び細管によ
り増加させ、メディエータの投与ｊｔが高い場合には７
倍にもなり、またこの硬化は投与量に依存する。これと
対称的に、Ｉ［−１が存在する培地や移動に影響を与え
ない。 例えば、２４時間間隔で、１０分あたりの培養により取
り込まれる２−デオキシグルコースを測定した結果、皮
革細胞の取り込みは１２．５±３．８であり、精製力シ
ェフチンは３０．３±０，０１である一方、ＩＬ−１培
地と接触する細胞は−３，４上０．２６であった。参考
のため、既知のグルコース移動にかかわる物質であるイ
ンシュリンを細胞で２４時間培養し２−デオキシグルコ
ースで取り込みを刺激して５３．９±３４とした。従っ
て、粗末メディエータ物質とこの分離物は、少なくとも
この研究においては、インシュリンと同程度にはグル］
−ズの取り込みに影響を与えないけれども、両物質共に
グルコース移動の著しい刺激物質であることは明らかで
あり、この能力に欠けるｒ［−１とは明確なえ１照をな
している。 結論として、上述実験は、モジュレータであるカシエク
ヂンとそのプリカーサであるメディエータは筋肉ｍ＋ａ
におけるグルコース移動を刺激する活性をちっており、
インターロイキン１はもっていないことを示している。 見旌璽ｊ 粗メディエータ物質とその分離物であるカシエフチン双
方の活性及び特性を調べる努力の一つとして、この例に
おいては、Ｃ３＋１／１ｌｅＪ（内毒素耐性）マウスに
おける体唄旧失及び食物取り込みに及ぼす影響を観察す
ることにより、メディエータとその分Ｉｆ！ＩＩ物の生
体内投与に関する体重減を研究した。 発熱の発生に及ぼすこれら夫々の因子の効果に関する皮
革研究をも行った。インターロイキン１に関し傑出した
文献を参照することにより、特にディナレロ（既述）に
よる論文から、■し−１はマウスの発熱の原因となるこ
とがわかった（ディナレロの６５−６６ページ、及びこ
れに引用される先行文献参照）。ｆｌ減及び発熱に関す
るデータ及び結果は以下の通りである。 腹腔滲出１細胞は、カワカミほかによりＪ、ＥＸＰＨＩ
ＥＤ、 １５４号、６３１ページ、 １９８１年、に記
載されているように、使用６日前に３１！の無菌ブリュ
ワーのチオグリコレート培地を汗則し、食塩水で洗浄し
たＮＣ３もしくはＣ３＋１／１ｌｅＮマウス（オス。 ２Ｏ−２５（１）の腹腔洗浄により得られた。細胞（２
×１０６細胞／μ））は、ＲＰＨ１１Ｇ４０ （ギブコ
社製）で再懸濁さけた。非粘着性細胞は、同じ培地で３
回洗浄して除去された。残る粘着性マクロフンｌ−ジは
、５μｑ／１！の内毒素及び５０μＱ ／ ｙ１の！ｉ
ｉ！１Ｍゲンタマイシンを含有する血清を含まないＲＰ
Ｈ１１６４０培地中で２０乃至２４時間培養された。 マクロファージ培養培地は回収され、遠心分離され、溶
液は一７８℃で貯蔵された。試料の蛋白質含量は１５−
１８μｇ／ｌ！であり、特異活性は約３０００／■であ
った。この単位は、限定された条件下で分化３Ｔ３−Ｌ
ｌ細的に及ぼすリポプロティンリパーゼ活性を５０％抑
＆＋１することが可能なマクロファージ因子のけである
ことがわかった。内毒素によって活性化されないマクロ
ファージは、リボプロティンリバーげ抑制活性を示さな
かった。 マクロファージ分泌生成物もまた、ＰＨ１０膜を用いた
７ミコン濃縮器により濃縮された。３回濃縮した溶液が
調製されたく動物に注射したもとの溶液より２倍、５倍
、及び１０倍縮少）。 メディエータの゛）Ｊｌ ： Ｃ３１１／ｌ１ｅＪマウ
ス（オス。 １８−２５０）に、上述溶液を毎日２回、腹腔的注射し
た。食物の取り込みは、代謝ケージを使用して測定した
。体重は、マウスを毎日秤愼することにより測定した。 この間体温も毎日監視した。 １画り皿」：以下の図面の説明は、体重減のデータ及び
実施態様のデータである。 第１６図は、食物取り込みに及ぼすマクロファージメデ
ィエータの効果を示す。５つの群のＣ３ｌＩ ／ Ｈｃ
Ｊマウス（１群あたり６匹のマウス）が（ｃ ） ５
０μｇ／ｌ！の内毒素を含むＲＰＨ１１６４０（比較例
）、（１）内毒素活性マクロファージ培養培地（マクロ
ファージメディエータ）、（２）マクロファージメディ
エータ２倍濃縮、（３）マクロファージメディエータ５
倍濃縮、（４）マクロファージメディエータ１０＠ＩＩ
Ｊ縮、の溶液、を１日２回、腹腔的注射された（−・匹
あたり０．５ｉｆ）。夫々の群のマウスの平均食物取り
込みは、０８目では１００％であった。代謝ケージ（一
群あたり３匹）が使用された。 第１７図は、第１６図の実験を施したマウスの体重の相
対的な変化を示す。０臼における各群のマウス体重の平
均を１００％とした。 第１８図は、体重に及ぼ音マクロファージメディエータ
中止の効果を示す。（３１１／ＨｃＪマウス（１群あた
り５匹）は、（Ｃ）５０４（Ｊ／ｌｆ内毒素を含むＲＰ
Ｈ１１ｆ３４０． （Ａ１） １０倍濃縮マクロファ
ージメディエータ（この群の１匹は２８目に死んだ）、
及び（Ａ２）５倍濶縮マイクロファージメディエータ）
、の溶液を１日２回（１匹あたり０．５ｉｆ）注射され
た。０日における各市のマウス体重の平均を１００％と
した。 結果 内毒素活性マイクロファージからのメディエータを注射
されたマウスは、投与ｂ１に依存する食品取り込みの減
少を示したく第１６図）。−・般にメディエータを投与
されたマウス群のすべては、その食物取り込み川が急激
に低下した。２日間続いたこの急激な状態は、マウスが
比較例（低投与量）のレベルまで食物取り込み吊を増加
するか、或いはその食物取り込み量の限界（高い投与量
）に至る第二状態に変った。この第二状態は、注Ｑ４さ
れたマクロファージメディエータのｆｄに依存する。メ
ディエータの投与へ１がもっとも高い群は、食物取り込
み量が劇的に低下しく６０％）、最初の投与后３日月に
死んだ。 すべての群におけ金水分取り込み帛は食物取り込み吊に
対応している（データは示されでいない）。 この実験におけるマウス体重の変化は第１７図に示され
ている。体重は、食物取り込み吊と同■）に、メディエ
ータ′Ｑ度に関し投与Ｒに依存して低下した。メディエ
ータの投与量がちつとも少ないマウスは、比較例のマウ
スに較べ、正常な食物取り込み量であったにもかかわら
ず体重減が継続した。投与量がより高いマウスは、最初
の体重の１５％が減少した。投与量がもつとも高い場合
には、６匹の７１クス１べてが、投与２０１１２に死ｌ
υだ。２００μＱの内毒素を毎日投与した比較Ｖ？４群
の６匹のマウスは、食物取り込みは正常であった３゜ マクロファージメディエータに関連するカシ１クチン効
果（ま、その投与中止により逆に八つた（第１８図）。 第１７図の実験に（重用した高温度の二種の溶液に類似
するマクロファージメディエータの二種の溶液が、二つ
の群のマウス（１ｎＹあたり３四）に注射されたが、も
つとも高い投与（曲線ＡＩ）は２日間に限定されるか、
或いは′ｆＡ縮度が低い溶液（曲線Ａ２）を１０日間に
わたって継続した。前各の群に属する１匹のマウスが生
き延びることができなかったほかは、すべてのマウスが
もとの体毛に戻った。 起りうる最近の汚染に対して安心しつるよう、注ｑ・１
シたマウスから血液が培養され、これが無菌であること
が確められた。マクロファージメディエータを投与され
たマウスの粗大−及び微小病理学的検査の結果、注目す
るような事実は発見されなかった。 上述体重減実験のある面は、モジュレータ物質の最を限
定して行い、正式のデータは集められなかったが、実験
者により、モジュレータ物質はマウスの体重減を生ずる
のと同様の効果を発揮することが観察された。 メディエータの投与期間中、そして食物取り込みの測定
中、マウスの体温も測定され、体温は一定のままであり
上昇しなかったことが観察された。体温における唯一の
変化は、死亡前の最１稔の日のものであり、この峙点で
マウスは瀕死の状態にあり予想される体温低下がみられ
た。 Ｃ３Ｈ／１ｌｅＪマウスに分離カシエフチンが注射され
た時にも、発熱はみられなかった。 体温測定の結果に基いて、インターロイキン１は熱の発
生に影響を与えるけれども、このような効果は、モジュ
レータ物質、或いはそのブリカーザであるメディエータ
物質のいずれにしても存在しない、という結論が得られ
た。 及直凰■ メディエータ物質、その分離カシエフチン、及びインタ
ーロイキン１相互の比較を、蛋白質劣化活性について行
った。発熱の促進と同様、蛋白質劣化は、文献には、イ
ンターロイキン１の一つの活性であることが記載されて
いる、デイナレロ（既述）、７１−７２ページ、特にγ
２ベージの副見出しＡ参照。従ってメディエータ物質・
及びその分離物であるモジュレータ物質が同様の特性を
有するかどうかを決定することは望ましいことである。 かくして筋肉片を、精製Ｈ−１の投与ωと同じＩ■のメ
ディエータ物質、及びその分離物のそれぞれと共に培養
した。その後筋肉片を観察したが、筋肉の蛋白質分解の
発生はみとめられなかった。これに基づき、メディエー
タ物質もモジュレータ物質も蛋白質劣化に関与せず、イ
ンターロイキンと相違があることが結論された。 犬流■】 このモジュレータを使用する用途のうちで、モジュレー
タが抗体を発生するように使用し、抗体は、例えばある
種の細菌感染によって生ずるショックの抑制或いはショ
ックをそらすような治療用途に使用できることが仮定さ
れた。ボイトラー、ミルサーク及びけラミによって行わ
れた未刊行検査において、特異ポリクロナールウサギ抗
血イ１がネズミカシＬクチンに対して生じ、ＢＡＬＢ／
Ｃマウスは、大腸菌リポポリサッカライド（ＬＰＳ）の
１Ω与前、投ち時、及び投与後に、これににり受動的に
免疫となった。手順及び結果は以下の通りである。 仕止及Ｕ五韮 モジュレータ物質であるカシエフチンは、実施例Ｈに既
に記載されたように精製された。精製蛋白質は、ＳＯ３
−ポリアクリルアミド系抜ゲル中で電気泳動さＵること
により、免疫化に使用するために調製した。ゲルは電気
泳動完了後スライスし、はぼ５μＱの均質蛋白質（なお
ゲルスライス中に含有されている）を、１ 、 Ｏｘｉ
の０、０５８酢酸アンモニウム溶液及び１．ｏｘｌのフ
ロイントの完全補助液中に乳濁化した。ニュージーラン
ドホワイ１−岨・ウサギに、複数の皮下位置にこの物質
を注（ト）した。フロイントの完全補助液を用いて上述
のように調製した２５μｑのカシ［クヂンを、１力月間
隔で、４回補足的に注！：１４ Ｌ ／ζ。ウサギは４
日間出血し、は柊的な注射ｌＧ ６日間出血した。免疫
血清は、ヨード法によリ、１２５Ｉをラベルしたカシエ
フチンを沈澱リ−る能力について試験された（第１９図
）。はぼ５０％のトレー量すが、血清の１ ： ３０，
０００希釈により沈澱した；予備免疫血清は反応しなか
った。免疫血清及び予備免疫血清の特異正を免疫プロッ
ティング法により分析した（第２０図）。ネズミカシエ
クチンに対応する単一の種が、［ＰＳで前に培養された
ＲＩＶ２６４．７差細胞からのプロット移動が免疫血清
にさらされた時に、ラベルされた。 予備免疫血清は反応を示さなかった。免疫血清も予備免
疫血清も、Ｊ、ＩＨＨＵＮＯＬ、、７６号、 ３７７
ページ、 １９５６年、に記載されたネーターほかの方
法、或いはＬＰＳの免疫プロッティング法により検定さ
れたような、ＬＰＳと反応する抗体を含んでいなかった
。 オスＢＡＬＢ／Ｃマウスに対し４００μ９のＬＰＳの腹
腔内注射の１．５時間前に、免疫血清を注射した時著し
い保護効果が見られ（第Ｖ表）、これは、予備免疫血清
或いは非免疫血清で処理した比較マウスについて観察さ
れた致死率と対照的である。、ＩＰｓの投与後、群の寸
べてのマウスは病気のようであり熱性の反応をなした（
データは示されていない）。かくして免疫血清はＬＰＳ
の発熱効果を間数せしめるもので／ｉかった。同様の防
護レベルは、免疫血清から調製されたＩ（ＩＧを、ＬＰ
Ｓの注（ト）前にマウスに投与した時にも観察された。 一方、非免疫血清から調製された■すＧはマウスを防護
するものでなかった（データは示されていない）。 免疫血清による防護の程度を検定するため、種々の帛の
ＬＰＳが、５時間前に５０μノの非免疫血清もしくは５
０μノ免疫血清を江ｑ４されたマウスに投与されたく第
２１図）。免疫けつんで処理されたマウスにおけるＬＰ
ＳのＬ［ｌｓｏは、非免疫血清で処理された比較例マウ
スのＬＤ％より著しく高いことは明らかである。 ＬＰＳ投与の時間に対し抗血清を投与される時間は、防
護効果を生じさせるために決定的な重要さをもつことが
わかった。ＬＰＳの投与３もしくは６時間前に免疫血清
を注射されたマウスは、ＬＰＳ注射時もしくはその数時
間後に受動的に免疫を受は）ζマウスよりも、著しく良
好である（第２２図）。この事実は、内毒素がカシエフ
チン生成をその投与後すぐに引き出すしのであること、
また力シェフチンはその致命傷をごく短時間に和らげる
ものであることを示唆している。 ウサギにおいては、ＬＰＳの静脈内投与後数分間でカシ
エフチンが生成され、ピークプラズマレベルが２時間後
に観察され、その後急激にレベル低下が生ずる。従って
この例においては、ウサギはごく短時間高レベルのホル
モンにさらされる；防護が達成されるとすればこの時間
間隔内に有効な抗体濃度が存在しなければならない。 以上に提示したデータは、ＬＰＳの致命的効果を媒介す
るカシエフチンの役割の証拠を与えるものである。カシ
エフチンは明らかに、ＬＰＳによる生ずる種々の病理学
的効果のメディエータとして唯一のものである。なぜな
ら受動的な免疫を受けたマウスは悲痛的となり病気のよ
うに見え、弱まるからである。カシエフチンは、ＬＰＳ
の致命的な効果を引きだずために例えば他のメディエー
タ（例えばインターロイキン１゜インターフェロン、及
びリンバトギシン）と１ｔＬ調して作用することもでき
る。 マウスは、他の大抵の一１１？シ動物に比較し、ＬＰＳ
の効果に比較的耐性があることに性急しなりればならな
い：例えばウサギは、はぼ１０００倍感応性が強い。Ｌ
ＰＳ感応性種においては、カシエフチンはショックの媒
介各としてより著しい役割をなす。カシエフチンに対す
る免疫化は、従ってより高いレベルの防護を導き出すと
考えられる。 敗血病（或いは多の原因）によるショックをうけた動物
におけるカシ１クチンに対する、抗血清による受動的免
疫化の考えうる用途は史に０１究の必要がある。明らか
な可能性は、カシエフチンの合成或いはそのレセプタへ
の結合を阻害しろる薬剤は、宿主の免疫系に苅り−る妥
協を考えることなく有用なものとなる、となりうろこと
である。 以下の図は、採用される手順及びその結果について、よ
り訂しい説明を与えるものである。 乳叫遺」： 第１９図は、 Ｉをラベルしたネズミカシエクヂン
の免疫沈澱を図で表わしたちのである。 免疫血清く実線）は既に記載したように調製された。予
備免疫血清は同じ動物から得られた。 免疫沈澱反応は円錐ポリプロピレン管中で行われた。血
清標本は、１％旧Ａグレードウシ血清アルブミン（シグ
マケミカル社、ミズーリ州セントルイス） （ＰＢＳ
／８３＾）を含有するダルベコのりん酸塩緩衝食塩水を
用いて、所定最終濃度となるように希釈された。０；血
清は添加されない。既に述べたようにして調製された２
μｊ（はぼ０．２ｎａ ； １．４ｘ １０’ ）の
ラベルしたカシェクヂン溶液が２０μノの希釈血清と混
合された。 この時点で洗浄Ｓ、オウレアス最近アブツーバンド（マ
イルスラボラトリーズ社、インディアナ州エルクハル１
〜）と熱温水との１：５懸濁液の１０ｔｌＪをそれぞれ
の管に添加した。３０分後、１、ＯｉｌのＰＢＳ／ＢＳ
Ａをそれぞれの管に添加した。 標本を迅速に混合し、免疫沈澱物をベツクマンマイクロ
フユージを用いて沈降させた。上澄み液を吸引し、ベレ
ットを、パラカード社のオートガンマ シンチレーショ
ン分光計、５７８型。 を用いて放射能を測定した。結果を沈澱ＣＰＨパーセン
トで示した。他のウリギからの非免疫血清くデータは示
されでいない）も、ラベルしたカシエフチンを沈澱させ
ることができない。 第２０図は、粗末ＩｔＡＷ２６４．７！ａｌ 胞Ｉ 製
培地、及ヒＬＰＳのウェスタンプロットのラジエオート
グラフである。レーン１（ａ及びｋ））：５０μｑ大賜
菌株０１２７ ： Ｂ８ＬＰＳ（ディフコ社、ミシガン
州デトロイト）。レーン２−６（ａ）及び２−５（ｂ）
：実施例１で示したように調製され５０倍に濃縮され
たＬＰＳ−刺激ＲＩＶ２６４．７１Ｂ胞（マウスマクロ
ファージ）調製培地（全蛋白質量はぼ４０μｇを含む）
の２５μ」。標本は、１０−１５％のＳＯ３−ホポポリ
アクリルアミド勾配ゲルに適用された。電気泳動完了後
、蛋白質が電磁プロッティング装置（バイオラドラボラ
トリーズ社、カリフォルニア州リッチ［ンド）を用いて
ニトロレルローズ紙（シュライヒャー アンド ジュー
ル社、ニューハンプシャー州キーン）に移された。免疫
（ａ）、及び予備免疫（ｂ）血清が、希釈率１ ：
３００でイトロレルローズプロットに適用され、反応帯
域は Ｉをラベルした蛋白質△にューイング ラン
ドニュークリア社、マサチューセッツ州ボストン）で同
定された。（ａ＞に見える帯域は、精製成用性ヨウ素蛋
白質が電気泳動処理され、マーカーとして平行に移され
た時には、分子ｍが正確にネズミ力シェクチンに対応し
ている。予備免疫血清がプロットに適用された時には、
反応性蛋白質は′ｆＡ察されない。 第２１図は、免疫血清及び非免疫血清を有するマウスに
おける内毒素ＬＤ５）の概亦のプロット図である。オス
ＢへＬＢ／Ｃマウス（１９−２１ｇ ）がランダムに１
１群にわけられ、夫々の群は１５乃至１７匹となるよう
にした。４つの群（三角）で、マウスは、免疫血清を無
菌等張良塩水に１：４で希釈した２００μノを腹腔的注
射することにより予備処理をした；残る７つの群（開放
円）で、マウスは同じ聞の１：４希釈非免疫血清で予備
処理をした。５時間後、無菌食塩水に溶解した大腸菌株
０１２７ ： Ｂ８ＬＰＳの種々のａの腹腔的注射を７
１クスに施した。生存は、ＬＰＳ注射注射４問ＬＤ５０
の計紳は、ブリスにより、Ｑ．、 Ｊ， ＰＩＩＡｌｔ
）ＩＡｃＯｌ．、 、 １４号，１９２ページ、 １９
３８年に、リッチフィールトホカニよすＪ．ＰＨ八へＨ
ＡＣＯＬ．ＥＸＰ．Ｔｌ１ＥＩ１． 。 ９６号，９９ページ、 １９４９年，に記載されている
ように行われた。水平軸は、ＬＤ５０決定の９５％信用
性限界を示している（非免疫血清で処理したマウスのた
めの９１μｑ，及び免疫血清で処理したマスウのための
２２１μｑ）。マウスに対し免疫血清をより多Ｑ （
２００μ）まで）投与したことによっては、生存が改善
されない（データは示されていない）。 第２２図は、ＬＰＳ処理に伴うカプランーマイア牛存プ
ロットを示Ｊ。８０匹のオスＢＡＬＢ／Ｃマウス（＋９
−２１Ｑ＞が、不規則に、１６匹ずつの５群に分けた。 大腸菌株０１２７ ： Ｂ８ＬＰＳ（ディフコ社、ミシ
ガン州デトロイト〉の４００μｑ腹腔内注射前６時間、
３時間、同時、及び３時間侵、６時間後に、２００μ）
の抗カシエクヂン血清２００μノを腹腔的注射すること
により、マウスを防護した。生存測定は、ＬＰＳ注射後
所定の時間点で行われた。生存率は、マウスに対し、Ｌ
ＰＳ投与６時間前に予備処理した場合（Ａ）にもっとも
よかった。これら数値に対する生存率の著しい低下は、
マウスに対し抗カシェクチン血清をＬＰＳ投与時（Ｃ）
に行った場合、或いはＬＰＳ投与投与３復 に行った場合にみられた。夫々の群における生存の時間
との関連確立が、ＬＰＳ投与６時間前防護群のそれと等
しい、という帰無仮説（ｎｕｌｌｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ
）の試験が、ゲハン法（ゲハンによるＢＩＯＨＥＴＲＩ
ＫＡ， ５２号，２０３ページ、 １９Ｑ５年参照）を
用いて行われた： ＰＩ （単−尾通常分布）は、夫々
の曲線について示されている。 血清容積（１）’：１０ ｓｏ ２００
免 疫 ３／１４ ６／１４
７／１４非免疫 ０／１４ １／
１４ ０／１４ｐ＜ ０．１’ ｐ＜ ０．０５
ｐ＜ ０．００１剃１． １ 、 メスＢＡＬＢ／Ｃ？
ウス（２０−２４ｇ＞ ヲ、不規則に６群に分け、免疫
ウサギ及び非免疫ウサギからの血清を、４００μＱの大
腸菌株０１２７ ：Ｂ８ＬＰＳの腹腔的注射をする１時
間前及び１時間半前に、腹腔的注射することにより予備
処理した。血清標本を無菌等張食塩水で希釈し、最終容
積が１匹のマウスあたり０２１！とじて注射した。ＬＰ
Ｓもまた無菌食塩水もまた希釈し、０．２１１の容積で
注射した。致死率を毎日記録し、死亡が、３日間にわた
っていずれの群でも観察されなかった時に、実躾は完全
なものになったと考えられた。上記の数値は、ＬＰＳ注
射注射７日士存マウスの数を表わしている。 ２、二重属人分布 上記の例から、本モジュレータ物質は、理論化された治
療可能性を確かに有していることは明らかである。かく
して、モジュレータ物質或いはその結合パートナ−が適
切に投与されている範囲において患者の同化ししくは異
化状態のかかわる細胞的及び組織的条件の望ましくない
程度と関連する病的条件の緩和或いは減少が達成される
。従ってモジュレータは有効な治療用ツールであるが、
その完全な可能性はまだ十分に明らかにされているわけ
ではない。 本発明は別の形態或いは方法でも、その基本的な特徴か
ら逸脱することなく具体化もしくは実施することができ
る。従って本発明の開示は、特許請求の範囲に記載され
る要件を説明するものであり、これを限定するものでな
く、均等な内容の変更はすべて本発明に含まれるもので
あることが理解されるべきである。
コースの取り込み及び移動を測定した。手順及び結果は
以下の通りである。 社■ ウエストファル法により分離したイー・コリ０、１２７
： Ｂ８からの内毒素（リポポリサッカライド）をデ
ィフコラブ社（ミシガン州デトロイト）から購入した。 細胞培養培地及びｍ牛血清はギブコラブ社にューヨーク
州グランドアイランド）から、またウシ胎児血清はステ
ライル システムズ社（ユタ州ローガン）から得た。３
−イソブチルメチルキサンチンはアルドリッヂケミカル
社（ウィスコンシン州ミルウォーキー）から；デキサメ
タシン及びＣＰにアッセイキットはシグマ ケミカル社
（ミズーリ州セントルイス）から：インシュリンはエリ
リリー社（インディアナ州インディアナポリス）；グ
リセロール トリ（９，１０（ｎ）−３８） ｔレイ＞
Ｗｔ、 Ｕ−１４Ｃ−グルコース及び２−デオキシ−Ｄ
（１−３）−１）グルコースはアメルシャム社（イリノ
イ州アーリントンハイツ）、２−メチル（３１１）イソ
ブチル酸はニューイングランド ニュークリア社（マサ
ブユーセッツ州ボストン）ニトリオレインは又チェック
ブレツノ社（ミネソタ州エリシアン）：アセヂルビリ
ジンアデニンジヌクレオチド及びラクテートデヒドロゲ
ナーぜはベーリンガーマンハイム社（インディアナ州イ
ンディアナポリス）から得た。 ム ３Ｔ３−Ｌｌ ： ３Ｔ３−Ｌｌｍ 脂ＭＢ
ａｌｌ ０１ ハ、１０％ウシ胎児血清をダルベコ修正
イーグル培地（［）ＨＥ培地）中で、既に記載したよう
に培養した。脂肪細胞表現型に至る分化が誘導された。 合流２日後、培地し、０．５１Ｈのイソブチルーメヂル
キサンチン、１μＭデキサメタシン及び１オあたり１０
μｑのインシュリンが補充された。４８時間後、イソブ
チル−メチルキサンチン、デキサメタシン及びインシュ
リンを含有するこの培地が除去され、その代りにインシ
ュリンを１！あたり５０ｎｇの減少濃度で含有する培地
が使用された。 ［６細胞培養 萌芽細胞系、［６，がカリフォルニア州
すンジエゴのサルク ィンスティチュ−１へのデビット
シューベルト博士の御好意で得られた。この細胞を５
％ＣＯＺ中において３７℃で、１０％ウシ胎児血清−叶
［中に保持され、標準手順によりトリプシンを加えられ
、５ｘｌＯ’ｗＵ胞／７！の濃度でプレート化された。 合流は一過問後生じた。節管への分化は、細胞が合流に
達した後、２４時間インシュリン（１０μＱ ／ ｘｉ
）で処理することにより促進された。 “甲 びメディエータ パの−１：腹腔滲出細胞
は、使用５１館に無菌ブリュワーのヂオグリコレート培
地（ディフコ ラグ−。 ミシガン州デトロイト；マウスあたり３１１）を腹腔的
注射したＮＣ８／ＳＰＦマウス（２５−３３（１；ロッ
クフェラー ユニバーシティ、ブリーディングコロニー
）から腹腔内洗浄することにより得られた。この手順を
採用して得られた滲出細胞はいくらか汚染リンパ球を含
／ｖだマクロファージを主としていた。 この細胞（４Ｘ １０５細胞／ｃ−ｄ＞は、３日間血清
のないＩｔＰＨ［−１６４０培地中で培養し、その後非
粘着性細胞は通常の食塩水で３回洗浄することにより除
去された。更に粘着する細胞は主としてマクロファージ
であった。この細胞を、生体内使用のための内毒素の５
μｑ／１１もしくは試験管内使用のための０．１μｇ／
ｘ１の存在下、もしくは不存在下に、血清のないＲＰ旧
−１６４０培地で更に２０時間培養した。培養培地は培
養後除去され、４℃で５分間１０００ｘ ｇで遠心分離
した。 内毒素にさらされた細胞から得られた調整培地の上澄み
液は、メディエータ物質を含有していた。調整培地を１
力月間−８０℃で保存した後、活性に相違はみられなか
った。 ２−デＡキシグルコーズ運搬二Ｌ６細胞中の２−デＡキ
シグルコーズの蓄積は、３Ｔ３−１１細胞についての修
正手順により測定された。［６細胞は６ｃ組織培養皿で
合流するように成良し、萌芽■Ｉ胞におけるアッセイの
ため合流時に使用されるか、節管におりるアッセイのた
めインシュリンで分化された。マクロファージメディエ
ータ、部分的に精製したメディエータ或いはりボボリサ
ッカライドが、２１１のクリブスーリンガーへ−ブス（
１２８ｍＨのｆｆ１ｃｊ、 ５．２ｎ＋ＨのＫ（Ｊ、
１．４ｍＨのＣａＣｊｚ 、 １ ｔｌｌＨの−
３０４、１０ｍＨのへ−ブス、ｐ１１７．４）（にＲ旧
を用いてプレートを３回洗浄する前にほぼ２４時間、も
しくは指定した時間添加された。インシュリン及び／も
しくはシトカラシンが指定したように添加され、プレー
トは、２−デオキシ−３Ｈ−グルコース（２μＣｉ／μ
Ｍ。 ０２ｍＨ）の添加前に３０分間培養された。１０分後、
プレートは冷たい〈４℃） ２５ｍＨグルコーズにＲＨ
で洗浄した。緩衝液は吸引され、１．５ｘｌの１０％硫
酸ドデシルナ１〜リウムをプレートに添加し、細胞を溶
解するため３０分間室温に放置した。細胞は掻きとりピ
ペットで懸濁させることにより、プレートから取り除い
た。生成する混合物は、１０秒間、２回、プランソンソ
ニケータ上で、中間動力でソニケート（５ＯｎｉＣａｔ
Ｑ）処理され、液体シンチレーションカウンタによりｆ
＆射能が測定された。 精製＋１−１がこれまでの実験のように得られ、メディ
エータ及びその分離物に関して述べたのと同様にして、
Ｌ６細胞と共に培養した。 級ｌ 一般的に、メディエータ物質とその分離物は共に２−デ
オキシグルコースの移動を、１６Ｍ芽細胞及び細管によ
り増加させ、メディエータの投与ｊｔが高い場合には７
倍にもなり、またこの硬化は投与量に依存する。これと
対称的に、Ｉ［−１が存在する培地や移動に影響を与え
ない。 例えば、２４時間間隔で、１０分あたりの培養により取
り込まれる２−デオキシグルコースを測定した結果、皮
革細胞の取り込みは１２．５±３．８であり、精製力シ
ェフチンは３０．３±０，０１である一方、ＩＬ−１培
地と接触する細胞は−３，４上０．２６であった。参考
のため、既知のグルコース移動にかかわる物質であるイ
ンシュリンを細胞で２４時間培養し２−デオキシグルコ
ースで取り込みを刺激して５３．９±３４とした。従っ
て、粗末メディエータ物質とこの分離物は、少なくとも
この研究においては、インシュリンと同程度にはグル］
−ズの取り込みに影響を与えないけれども、両物質共に
グルコース移動の著しい刺激物質であることは明らかで
あり、この能力に欠けるｒ［−１とは明確なえ１照をな
している。 結論として、上述実験は、モジュレータであるカシエク
ヂンとそのプリカーサであるメディエータは筋肉ｍ＋ａ
におけるグルコース移動を刺激する活性をちっており、
インターロイキン１はもっていないことを示している。 見旌璽ｊ 粗メディエータ物質とその分離物であるカシエフチン双
方の活性及び特性を調べる努力の一つとして、この例に
おいては、Ｃ３＋１／１ｌｅＪ（内毒素耐性）マウスに
おける体唄旧失及び食物取り込みに及ぼす影響を観察す
ることにより、メディエータとその分Ｉｆ！ＩＩ物の生
体内投与に関する体重減を研究した。 発熱の発生に及ぼすこれら夫々の因子の効果に関する皮
革研究をも行った。インターロイキン１に関し傑出した
文献を参照することにより、特にディナレロ（既述）に
よる論文から、■し−１はマウスの発熱の原因となるこ
とがわかった（ディナレロの６５−６６ページ、及びこ
れに引用される先行文献参照）。ｆｌ減及び発熱に関す
るデータ及び結果は以下の通りである。 腹腔滲出１細胞は、カワカミほかによりＪ、ＥＸＰＨＩ
ＥＤ、 １５４号、６３１ページ、 １９８１年、に記
載されているように、使用６日前に３１！の無菌ブリュ
ワーのチオグリコレート培地を汗則し、食塩水で洗浄し
たＮＣ３もしくはＣ３＋１／１ｌｅＮマウス（オス。 ２Ｏ−２５（１）の腹腔洗浄により得られた。細胞（２
×１０６細胞／μ））は、ＲＰＨ１１Ｇ４０ （ギブコ
社製）で再懸濁さけた。非粘着性細胞は、同じ培地で３
回洗浄して除去された。残る粘着性マクロフンｌ−ジは
、５μｑ／１！の内毒素及び５０μＱ ／ ｙ１の！ｉ
ｉ！１Ｍゲンタマイシンを含有する血清を含まないＲＰ
Ｈ１１６４０培地中で２０乃至２４時間培養された。 マクロファージ培養培地は回収され、遠心分離され、溶
液は一７８℃で貯蔵された。試料の蛋白質含量は１５−
１８μｇ／ｌ！であり、特異活性は約３０００／■であ
った。この単位は、限定された条件下で分化３Ｔ３−Ｌ
ｌ細的に及ぼすリポプロティンリパーゼ活性を５０％抑
＆＋１することが可能なマクロファージ因子のけである
ことがわかった。内毒素によって活性化されないマクロ
ファージは、リボプロティンリバーげ抑制活性を示さな
かった。 マクロファージ分泌生成物もまた、ＰＨ１０膜を用いた
７ミコン濃縮器により濃縮された。３回濃縮した溶液が
調製されたく動物に注射したもとの溶液より２倍、５倍
、及び１０倍縮少）。 メディエータの゛）Ｊｌ ： Ｃ３１１／ｌ１ｅＪマウ
ス（オス。 １８−２５０）に、上述溶液を毎日２回、腹腔的注射し
た。食物の取り込みは、代謝ケージを使用して測定した
。体重は、マウスを毎日秤愼することにより測定した。 この間体温も毎日監視した。 １画り皿」：以下の図面の説明は、体重減のデータ及び
実施態様のデータである。 第１６図は、食物取り込みに及ぼすマクロファージメデ
ィエータの効果を示す。５つの群のＣ３ｌＩ ／ Ｈｃ
Ｊマウス（１群あたり６匹のマウス）が（ｃ ） ５
０μｇ／ｌ！の内毒素を含むＲＰＨ１１６４０（比較例
）、（１）内毒素活性マクロファージ培養培地（マクロ
ファージメディエータ）、（２）マクロファージメディ
エータ２倍濃縮、（３）マクロファージメディエータ５
倍濃縮、（４）マクロファージメディエータ１０＠ＩＩ
Ｊ縮、の溶液、を１日２回、腹腔的注射された（−・匹
あたり０．５ｉｆ）。夫々の群のマウスの平均食物取り
込みは、０８目では１００％であった。代謝ケージ（一
群あたり３匹）が使用された。 第１７図は、第１６図の実験を施したマウスの体重の相
対的な変化を示す。０臼における各群のマウス体重の平
均を１００％とした。 第１８図は、体重に及ぼ音マクロファージメディエータ
中止の効果を示す。（３１１／ＨｃＪマウス（１群あた
り５匹）は、（Ｃ）５０４（Ｊ／ｌｆ内毒素を含むＲＰ
Ｈ１１ｆ３４０． （Ａ１） １０倍濃縮マクロファ
ージメディエータ（この群の１匹は２８目に死んだ）、
及び（Ａ２）５倍濶縮マイクロファージメディエータ）
、の溶液を１日２回（１匹あたり０．５ｉｆ）注射され
た。０日における各市のマウス体重の平均を１００％と
した。 結果 内毒素活性マイクロファージからのメディエータを注射
されたマウスは、投与ｂ１に依存する食品取り込みの減
少を示したく第１６図）。−・般にメディエータを投与
されたマウス群のすべては、その食物取り込み川が急激
に低下した。２日間続いたこの急激な状態は、マウスが
比較例（低投与量）のレベルまで食物取り込み吊を増加
するか、或いはその食物取り込み量の限界（高い投与量
）に至る第二状態に変った。この第二状態は、注Ｑ４さ
れたマクロファージメディエータのｆｄに依存する。メ
ディエータの投与へ１がもっとも高い群は、食物取り込
み量が劇的に低下しく６０％）、最初の投与后３日月に
死んだ。 すべての群におけ金水分取り込み帛は食物取り込み吊に
対応している（データは示されでいない）。 この実験におけるマウス体重の変化は第１７図に示され
ている。体重は、食物取り込み吊と同■）に、メディエ
ータ′Ｑ度に関し投与Ｒに依存して低下した。メディエ
ータの投与量がちつとも少ないマウスは、比較例のマウ
スに較べ、正常な食物取り込み量であったにもかかわら
ず体重減が継続した。投与量がより高いマウスは、最初
の体重の１５％が減少した。投与量がもつとも高い場合
には、６匹の７１クス１べてが、投与２０１１２に死ｌ
υだ。２００μＱの内毒素を毎日投与した比較Ｖ？４群
の６匹のマウスは、食物取り込みは正常であった３゜ マクロファージメディエータに関連するカシ１クチン効
果（ま、その投与中止により逆に八つた（第１８図）。 第１７図の実験に（重用した高温度の二種の溶液に類似
するマクロファージメディエータの二種の溶液が、二つ
の群のマウス（１ｎＹあたり３四）に注射されたが、も
つとも高い投与（曲線ＡＩ）は２日間に限定されるか、
或いは′ｆＡ縮度が低い溶液（曲線Ａ２）を１０日間に
わたって継続した。前各の群に属する１匹のマウスが生
き延びることができなかったほかは、すべてのマウスが
もとの体毛に戻った。 起りうる最近の汚染に対して安心しつるよう、注ｑ・１
シたマウスから血液が培養され、これが無菌であること
が確められた。マクロファージメディエータを投与され
たマウスの粗大−及び微小病理学的検査の結果、注目す
るような事実は発見されなかった。 上述体重減実験のある面は、モジュレータ物質の最を限
定して行い、正式のデータは集められなかったが、実験
者により、モジュレータ物質はマウスの体重減を生ずる
のと同様の効果を発揮することが観察された。 メディエータの投与期間中、そして食物取り込みの測定
中、マウスの体温も測定され、体温は一定のままであり
上昇しなかったことが観察された。体温における唯一の
変化は、死亡前の最１稔の日のものであり、この峙点で
マウスは瀕死の状態にあり予想される体温低下がみられ
た。 Ｃ３Ｈ／１ｌｅＪマウスに分離カシエフチンが注射され
た時にも、発熱はみられなかった。 体温測定の結果に基いて、インターロイキン１は熱の発
生に影響を与えるけれども、このような効果は、モジュ
レータ物質、或いはそのブリカーザであるメディエータ
物質のいずれにしても存在しない、という結論が得られ
た。 及直凰■ メディエータ物質、その分離カシエフチン、及びインタ
ーロイキン１相互の比較を、蛋白質劣化活性について行
った。発熱の促進と同様、蛋白質劣化は、文献には、イ
ンターロイキン１の一つの活性であることが記載されて
いる、デイナレロ（既述）、７１−７２ページ、特にγ
２ベージの副見出しＡ参照。従ってメディエータ物質・
及びその分離物であるモジュレータ物質が同様の特性を
有するかどうかを決定することは望ましいことである。 かくして筋肉片を、精製Ｈ−１の投与ωと同じＩ■のメ
ディエータ物質、及びその分離物のそれぞれと共に培養
した。その後筋肉片を観察したが、筋肉の蛋白質分解の
発生はみとめられなかった。これに基づき、メディエー
タ物質もモジュレータ物質も蛋白質劣化に関与せず、イ
ンターロイキンと相違があることが結論された。 犬流■】 このモジュレータを使用する用途のうちで、モジュレー
タが抗体を発生するように使用し、抗体は、例えばある
種の細菌感染によって生ずるショックの抑制或いはショ
ックをそらすような治療用途に使用できることが仮定さ
れた。ボイトラー、ミルサーク及びけラミによって行わ
れた未刊行検査において、特異ポリクロナールウサギ抗
血イ１がネズミカシＬクチンに対して生じ、ＢＡＬＢ／
Ｃマウスは、大腸菌リポポリサッカライド（ＬＰＳ）の
１Ω与前、投ち時、及び投与後に、これににり受動的に
免疫となった。手順及び結果は以下の通りである。 仕止及Ｕ五韮 モジュレータ物質であるカシエフチンは、実施例Ｈに既
に記載されたように精製された。精製蛋白質は、ＳＯ３
−ポリアクリルアミド系抜ゲル中で電気泳動さＵること
により、免疫化に使用するために調製した。ゲルは電気
泳動完了後スライスし、はぼ５μＱの均質蛋白質（なお
ゲルスライス中に含有されている）を、１ 、 Ｏｘｉ
の０、０５８酢酸アンモニウム溶液及び１．ｏｘｌのフ
ロイントの完全補助液中に乳濁化した。ニュージーラン
ドホワイ１−岨・ウサギに、複数の皮下位置にこの物質
を注（ト）した。フロイントの完全補助液を用いて上述
のように調製した２５μｑのカシ［クヂンを、１力月間
隔で、４回補足的に注！：１４ Ｌ ／ζ。ウサギは４
日間出血し、は柊的な注射ｌＧ ６日間出血した。免疫
血清は、ヨード法によリ、１２５Ｉをラベルしたカシエ
フチンを沈澱リ−る能力について試験された（第１９図
）。はぼ５０％のトレー量すが、血清の１ ： ３０，
０００希釈により沈澱した；予備免疫血清は反応しなか
った。免疫血清及び予備免疫血清の特異正を免疫プロッ
ティング法により分析した（第２０図）。ネズミカシエ
クチンに対応する単一の種が、［ＰＳで前に培養された
ＲＩＶ２６４．７差細胞からのプロット移動が免疫血清
にさらされた時に、ラベルされた。 予備免疫血清は反応を示さなかった。免疫血清も予備免
疫血清も、Ｊ、ＩＨＨＵＮＯＬ、、７６号、 ３７７
ページ、 １９５６年、に記載されたネーターほかの方
法、或いはＬＰＳの免疫プロッティング法により検定さ
れたような、ＬＰＳと反応する抗体を含んでいなかった
。 オスＢＡＬＢ／Ｃマウスに対し４００μ９のＬＰＳの腹
腔内注射の１．５時間前に、免疫血清を注射した時著し
い保護効果が見られ（第Ｖ表）、これは、予備免疫血清
或いは非免疫血清で処理した比較マウスについて観察さ
れた致死率と対照的である。、ＩＰｓの投与後、群の寸
べてのマウスは病気のようであり熱性の反応をなした（
データは示されていない）。かくして免疫血清はＬＰＳ
の発熱効果を間数せしめるもので／ｉかった。同様の防
護レベルは、免疫血清から調製されたＩ（ＩＧを、ＬＰ
Ｓの注（ト）前にマウスに投与した時にも観察された。 一方、非免疫血清から調製された■すＧはマウスを防護
するものでなかった（データは示されていない）。 免疫血清による防護の程度を検定するため、種々の帛の
ＬＰＳが、５時間前に５０μノの非免疫血清もしくは５
０μノ免疫血清を江ｑ４されたマウスに投与されたく第
２１図）。免疫けつんで処理されたマウスにおけるＬＰ
ＳのＬ［ｌｓｏは、非免疫血清で処理された比較例マウ
スのＬＤ％より著しく高いことは明らかである。 ＬＰＳ投与の時間に対し抗血清を投与される時間は、防
護効果を生じさせるために決定的な重要さをもつことが
わかった。ＬＰＳの投与３もしくは６時間前に免疫血清
を注射されたマウスは、ＬＰＳ注射時もしくはその数時
間後に受動的に免疫を受は）ζマウスよりも、著しく良
好である（第２２図）。この事実は、内毒素がカシエフ
チン生成をその投与後すぐに引き出すしのであること、
また力シェフチンはその致命傷をごく短時間に和らげる
ものであることを示唆している。 ウサギにおいては、ＬＰＳの静脈内投与後数分間でカシ
エフチンが生成され、ピークプラズマレベルが２時間後
に観察され、その後急激にレベル低下が生ずる。従って
この例においては、ウサギはごく短時間高レベルのホル
モンにさらされる；防護が達成されるとすればこの時間
間隔内に有効な抗体濃度が存在しなければならない。 以上に提示したデータは、ＬＰＳの致命的効果を媒介す
るカシエフチンの役割の証拠を与えるものである。カシ
エフチンは明らかに、ＬＰＳによる生ずる種々の病理学
的効果のメディエータとして唯一のものである。なぜな
ら受動的な免疫を受けたマウスは悲痛的となり病気のよ
うに見え、弱まるからである。カシエフチンは、ＬＰＳ
の致命的な効果を引きだずために例えば他のメディエー
タ（例えばインターロイキン１゜インターフェロン、及
びリンバトギシン）と１ｔＬ調して作用することもでき
る。 マウスは、他の大抵の一１１？シ動物に比較し、ＬＰＳ
の効果に比較的耐性があることに性急しなりればならな
い：例えばウサギは、はぼ１０００倍感応性が強い。Ｌ
ＰＳ感応性種においては、カシエフチンはショックの媒
介各としてより著しい役割をなす。カシエフチンに対す
る免疫化は、従ってより高いレベルの防護を導き出すと
考えられる。 敗血病（或いは多の原因）によるショックをうけた動物
におけるカシ１クチンに対する、抗血清による受動的免
疫化の考えうる用途は史に０１究の必要がある。明らか
な可能性は、カシエフチンの合成或いはそのレセプタへ
の結合を阻害しろる薬剤は、宿主の免疫系に苅り−る妥
協を考えることなく有用なものとなる、となりうろこと
である。 以下の図は、採用される手順及びその結果について、よ
り訂しい説明を与えるものである。 乳叫遺」： 第１９図は、 Ｉをラベルしたネズミカシエクヂン
の免疫沈澱を図で表わしたちのである。 免疫血清く実線）は既に記載したように調製された。予
備免疫血清は同じ動物から得られた。 免疫沈澱反応は円錐ポリプロピレン管中で行われた。血
清標本は、１％旧Ａグレードウシ血清アルブミン（シグ
マケミカル社、ミズーリ州セントルイス） （ＰＢＳ
／８３＾）を含有するダルベコのりん酸塩緩衝食塩水を
用いて、所定最終濃度となるように希釈された。０；血
清は添加されない。既に述べたようにして調製された２
μｊ（はぼ０．２ｎａ ； １．４ｘ １０’ ）の
ラベルしたカシェクヂン溶液が２０μノの希釈血清と混
合された。 この時点で洗浄Ｓ、オウレアス最近アブツーバンド（マ
イルスラボラトリーズ社、インディアナ州エルクハル１
〜）と熱温水との１：５懸濁液の１０ｔｌＪをそれぞれ
の管に添加した。３０分後、１、ＯｉｌのＰＢＳ／ＢＳ
Ａをそれぞれの管に添加した。 標本を迅速に混合し、免疫沈澱物をベツクマンマイクロ
フユージを用いて沈降させた。上澄み液を吸引し、ベレ
ットを、パラカード社のオートガンマ シンチレーショ
ン分光計、５７８型。 を用いて放射能を測定した。結果を沈澱ＣＰＨパーセン
トで示した。他のウリギからの非免疫血清くデータは示
されでいない）も、ラベルしたカシエフチンを沈澱させ
ることができない。 第２０図は、粗末ＩｔＡＷ２６４．７！ａｌ 胞Ｉ 製
培地、及ヒＬＰＳのウェスタンプロットのラジエオート
グラフである。レーン１（ａ及びｋ））：５０μｑ大賜
菌株０１２７ ： Ｂ８ＬＰＳ（ディフコ社、ミシガン
州デトロイト）。レーン２−６（ａ）及び２−５（ｂ）
：実施例１で示したように調製され５０倍に濃縮され
たＬＰＳ−刺激ＲＩＶ２６４．７１Ｂ胞（マウスマクロ
ファージ）調製培地（全蛋白質量はぼ４０μｇを含む）
の２５μ」。標本は、１０−１５％のＳＯ３−ホポポリ
アクリルアミド勾配ゲルに適用された。電気泳動完了後
、蛋白質が電磁プロッティング装置（バイオラドラボラ
トリーズ社、カリフォルニア州リッチ［ンド）を用いて
ニトロレルローズ紙（シュライヒャー アンド ジュー
ル社、ニューハンプシャー州キーン）に移された。免疫
（ａ）、及び予備免疫（ｂ）血清が、希釈率１ ：
３００でイトロレルローズプロットに適用され、反応帯
域は Ｉをラベルした蛋白質△にューイング ラン
ドニュークリア社、マサチューセッツ州ボストン）で同
定された。（ａ＞に見える帯域は、精製成用性ヨウ素蛋
白質が電気泳動処理され、マーカーとして平行に移され
た時には、分子ｍが正確にネズミ力シェクチンに対応し
ている。予備免疫血清がプロットに適用された時には、
反応性蛋白質は′ｆＡ察されない。 第２１図は、免疫血清及び非免疫血清を有するマウスに
おける内毒素ＬＤ５）の概亦のプロット図である。オス
ＢへＬＢ／Ｃマウス（１９−２１ｇ ）がランダムに１
１群にわけられ、夫々の群は１５乃至１７匹となるよう
にした。４つの群（三角）で、マウスは、免疫血清を無
菌等張良塩水に１：４で希釈した２００μノを腹腔的注
射することにより予備処理をした；残る７つの群（開放
円）で、マウスは同じ聞の１：４希釈非免疫血清で予備
処理をした。５時間後、無菌食塩水に溶解した大腸菌株
０１２７ ： Ｂ８ＬＰＳの種々のａの腹腔的注射を７
１クスに施した。生存は、ＬＰＳ注射注射４問ＬＤ５０
の計紳は、ブリスにより、Ｑ．、 Ｊ， ＰＩＩＡｌｔ
）ＩＡｃＯｌ．、 、 １４号，１９２ページ、 １９
３８年に、リッチフィールトホカニよすＪ．ＰＨ八へＨ
ＡＣＯＬ．ＥＸＰ．Ｔｌ１ＥＩ１． 。 ９６号，９９ページ、 １９４９年，に記載されている
ように行われた。水平軸は、ＬＤ５０決定の９５％信用
性限界を示している（非免疫血清で処理したマウスのた
めの９１μｑ，及び免疫血清で処理したマスウのための
２２１μｑ）。マウスに対し免疫血清をより多Ｑ （
２００μ）まで）投与したことによっては、生存が改善
されない（データは示されていない）。 第２２図は、ＬＰＳ処理に伴うカプランーマイア牛存プ
ロットを示Ｊ。８０匹のオスＢＡＬＢ／Ｃマウス（＋９
−２１Ｑ＞が、不規則に、１６匹ずつの５群に分けた。 大腸菌株０１２７ ： Ｂ８ＬＰＳ（ディフコ社、ミシ
ガン州デトロイト〉の４００μｑ腹腔内注射前６時間、
３時間、同時、及び３時間侵、６時間後に、２００μ）
の抗カシエクヂン血清２００μノを腹腔的注射すること
により、マウスを防護した。生存測定は、ＬＰＳ注射後
所定の時間点で行われた。生存率は、マウスに対し、Ｌ
ＰＳ投与６時間前に予備処理した場合（Ａ）にもっとも
よかった。これら数値に対する生存率の著しい低下は、
マウスに対し抗カシェクチン血清をＬＰＳ投与時（Ｃ）
に行った場合、或いはＬＰＳ投与投与３復 に行った場合にみられた。夫々の群における生存の時間
との関連確立が、ＬＰＳ投与６時間前防護群のそれと等
しい、という帰無仮説（ｎｕｌｌｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ
）の試験が、ゲハン法（ゲハンによるＢＩＯＨＥＴＲＩ
ＫＡ， ５２号，２０３ページ、 １９Ｑ５年参照）を
用いて行われた： ＰＩ （単−尾通常分布）は、夫々
の曲線について示されている。 血清容積（１）’：１０ ｓｏ ２００
免 疫 ３／１４ ６／１４
７／１４非免疫 ０／１４ １／
１４ ０／１４ｐ＜ ０．１’ ｐ＜ ０．０５
ｐ＜ ０．００１剃１． １ 、 メスＢＡＬＢ／Ｃ？
ウス（２０−２４ｇ＞ ヲ、不規則に６群に分け、免疫
ウサギ及び非免疫ウサギからの血清を、４００μＱの大
腸菌株０１２７ ：Ｂ８ＬＰＳの腹腔的注射をする１時
間前及び１時間半前に、腹腔的注射することにより予備
処理した。血清標本を無菌等張食塩水で希釈し、最終容
積が１匹のマウスあたり０２１！とじて注射した。ＬＰ
Ｓもまた無菌食塩水もまた希釈し、０．２１１の容積で
注射した。致死率を毎日記録し、死亡が、３日間にわた
っていずれの群でも観察されなかった時に、実躾は完全
なものになったと考えられた。上記の数値は、ＬＰＳ注
射注射７日士存マウスの数を表わしている。 ２、二重属人分布 上記の例から、本モジュレータ物質は、理論化された治
療可能性を確かに有していることは明らかである。かく
して、モジュレータ物質或いはその結合パートナ−が適
切に投与されている範囲において患者の同化ししくは異
化状態のかかわる細胞的及び組織的条件の望ましくない
程度と関連する病的条件の緩和或いは減少が達成される
。従ってモジュレータは有効な治療用ツールであるが、
その完全な可能性はまだ十分に明らかにされているわけ
ではない。 本発明は別の形態或いは方法でも、その基本的な特徴か
ら逸脱することなく具体化もしくは実施することができ
る。従って本発明の開示は、特許請求の範囲に記載され
る要件を説明するものであり、これを限定するものでな
く、均等な内容の変更はすべて本発明に含まれるもので
あることが理解されるべきである。
第１図は、等主焦点コラムから取り出された液体標本か
らとったモジュレータ物質のバイオアラレイ結果を示ず
グラフ： 第２図は、ゲル゛心気泳動後に行われたモジュレータ物
質標本の、バイオアッセイ結果を示すグラフであって、
ゲルのスライスがカッ１〜され、バイＡ活性が、重炭酸
アンモニウム溶液中に拡散させることにより、夫々のス
ライスから溶出した。バイオ活性単位は、ゲル底からの
、夫々のスライスの位置を基準としてブロツトシた。 第３図は、モジュレータ物質分離物分画の、５Ｏ３−Ｐ
ＡＧＥ分析結果を示すラジオＡートゲラム（放射性物質
描画記録）である。内街７ｃ誘導もしくは誘導しないＲ
Ａ計６４．７細胞１８苔体からの粗培地標本、及び精製
中間物を、１０− １５％線状ポリアクリルアミド勾配
ゲル中で゛心気泳動処理した。標本は、電気泳動前に蒸
留水で透析した。 以下の説明は、オートラジオグラムに示されるレーン（
列）の内容を示す： （１ ＞ ’ｌ５ＯｕＪの非誘
導ＲＡ讐２６４． ７細胞培地：（２）５０μノの誘う
ｊンＲＡ計６４７細胞培地；（３）等雷焦点化コラムか
らのプール分画の１０μｍ標本；（４）コン△ーレフ７
０ーズ濾液の２５μノ標木：（５）非変７ｒ１条件下で
ＰＡＧＥｆｆｉ理により１！７られるピーク分画の８０
μノ標本（均質力シェフチン）。矢印はカシエクヂンを
示し、これは非誘導細胞の培地には完全に欠けているが
、Ｍ ＮＪ細胞の培地の１要成分である。カシエクヂン
は、上記の精製工程により連続的に加えられる。すべて
のレーン（スペーサレーンを含む）で可視的な分子Ｍ帯
域はβ−メルカブトエタノール不純物であり、これは標
本それ自体には存在しない。 第４図は、本発明による精製モジュレータ物質の５Ｏ３
−ＰＡＧＥ分析結果を示すグラフである。、Ｖｉ製カシ
ェクチンの２０μｇ標本を、ＳＤＳ存在下で２分間煮沸
し、非変質条件下で１０−１５％線状ポリアクリルアミ
ドゲル中で電気泳動処理した。 このゲルの連続的な２−ｔｅｒｍｌスライスを電気溶出
し、電気溶出分画を、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥで
１ ： １００に希釈した。その１０μノをバイオ活
性についてアッセイした。 第５Ａ及び第５Ｂ図は、精製モジュレータ物質について
行った放射線ラベルの結合の研究結果を示リグラフ−（
゛ある。 第６八及び６Ｂ図は、本発明によるモジュレータ物質に
ついて行われた放射線ヨード化及び結合に関して、スキ
ャッヂャード分析の結果を示すグラフである。 第７図は、粗濃縮ＲＡＭ２６７、４培地について行われ
たモノ（ＱＦＰＬＣ陰イオン効果）クロマトグラフィに
対応するオートラジオグラムであって、挿入写真は、粗
物質と連続的なコラム分画の分離を示す宋痕跡ＳＯＳポ
リアクリルアミド勾配ゲルをあられす。 第８図は、最初に行われたモノーＱ分画化処理により得
られた分画のスーパーローズ１２（ｒＰＬＣゲル濾過）
を示ずオートラジオグラムである。 挿入写真は、この濾過に由来する）ＩＩ！続する分画の
電気泳動輪郭を示Ｔ ＳＤＳポリアクリルアミド勾配ゲ
ルを示す。 第９図は、精製ＩＬ−１及び本発明モジュレータ物質を
３Ｔ３−１１に添加した結果を示すグラフである。 第１０図は、培養３Ｔ３−Ｌｌｌ胞に対し組換ｑｒ＋−
を及びセギ中和抗血清を添加した結果を示すグラフであ
る。 第１１図は、［シュレータ物質結合の放射線レセプタア
ッセイ結果を示すグラフであって、部分ａにおいて、組
換型Ｉ［−１がラベルしたモジュレータに匹敵りるよう
にしてあり、部分すにおいては、ラベルされていないモ
ジュレータ物質が同じ系で匹敵するようにしである。結
合は、夫々のアッセイにおいて、３Ｔ３−１１細胞が結
合する加入ＣＰＨのパーセント表示であられれている。 かっこ０は結合平均、±ＳＥＮ 、を指η。 第１２図は、合流２日前に前脂１１７１ＩＩｌｌ胞培養
体にＲＡＷ２Ｇ４．７細胞からの培地が添加されている
ＴＡＩ細胞からの、ｍＲＮＡの分離結果を示す写真図で
ある。 第１３図は、第１２図と同様にして行われた点ブロワ１
へ試験の結果を示す写真図である。 第１４図は、脂肪細胞に特異性のあるｍＲＮΔＲＮＡ第
１す゛る［ジコレータの抑制か転写的に関連があるかど
うか、を決定するために行われた転′ワアッヒイに基ず
く点プロット試験の結果を示す写真図である。 第１５Ａ図は、第１２図に関連する手順により分化した
脂肪細胞培養体にモジュレータ物質を添加した結果を足
りグラフである。ＲＮＡは、モジュレータ物質にさらし
た後所定回数分離され、点プロット装置において二１〜
口セルローズに適用され、その後、このフィルターｔよ
所定ＣＯＭＡでプローブ探針され、洗浄され、オートラ
ジオグラム化され、その後走査された。 第１５Ｂ図は、ＩＩＮへのノーザン分析結果を示す写真
図であって、この場合、標本は７１Ｊローズホルムアル
デヒドグル中で先ず電気体１ＩＩＩＪ処叩され、蒸留水
、りん酸ブトリウム及び［Ｄ１八で洗浄した後、ゲルは
ニトロセルロースに移された。 第１６図は、比較的な、棺；物取り込み実験の結果を示
すグラフであって、比較マウスと、本発明モジュレータ
を１９与されたマウスとについＣ実際の食物取り込みを
測定したしのＣ・ある。 第１７図は、第１６図に示す相対的な食物取り込み実験
に参加したマウス体重の相対的な変化を示すグラフであ
る。 第１８図は、モジュレータ物質の投与を中止した場合に
おけるマウス体重に及ぼす影響を示すグラフである。 第１９図は、本発明によるモジュレータ物質の放射線ラ
ベル標本の免疫沈澱結果を示す。 第２０図は、免疫血清及び免疫血清を比較するための、
電気泳動後に行われたウェスタンブロワ１〜分析の結果
を承り写真図である。 第２１図は、免疫血清及び３１免疫萌ＩｆＩＸ清の投与
を受りたマウスにＪ３りる内毒素ＬＤ＝ｉの結果を示す
グラフである。 第２２図は、５群にわけられ、人膓菌のある足を投与６
時間前、３時間前、投与と同時、投与３時間後、及び６
時間後に抗モジュレータ血清を腹腔的投与したＢＡＬＢ
／Ｃマウスについて、ＬＰＳ処理後のカブランーマイア
生存率を丞すグラフである。 第２３図（よ、マウスから回収したモジュレータ物質の
アミノ酸連鎖である。 特許出願人 ザ ロックフェラーユニバーシティ ／（片１□ 代 理 人 里 川 政
名−、、≧′５＋駅駅冊す 寸 Ｎ ＯＣＤ （ｊ） ？
Ｎ Ｏｄ とン＋：汐碧訃亘 ＦＩＧ、９ ば １ｌｌＫＫ曾：原暇 −６−７０−１ｌ−１０−９−８ ＦＩＧ ＋１ＡＦＩＧ、ｌ ＩＢ ＦＩＧ、１２ ＦＩＧ、１３ ＦＩＧ、１４ Ｓ 輻に爽ｍ１哩 経通日数 ＦＩＧ、＋６ 紅色日数 ＦＩＧ、＋７ 子 ＄Ｉ Ｓ ） 〜ノ 血清８甑 （３−’） ＦＩＧ、１９ ＦＩＧ−２０ＡＦｉＧ、２０Ｂ 才俵与量（Ｐ３／マウス） ＦＩＧ、２１ ＦＩＧ、２２ ＬＥＵ ＡＲＧ ＳＥＲＳＥＲＳＥＲＧＬＮ Ａ
ＳＮ ５ＥＲＨＩＳ ＶＡＬ ＶＡＬ ＡＬＡ
ＡＳＮ ＨＩＳ ＧＬＮ ＶＡＬＬＥＵ
ＳＥＲＧＬＮ ＡＲＧ ＡＬＡ ＡＳＮ ＡＬ
Ａ ＬＥＵＬＥＵ ＬＹＳ ＡＳＰ ＡＳＮ
ＧＬＮ ＬＥＵ ＶＡＬ ＶＡＬＬＥＵ ＶＡ
Ｌ ＴＹＲＳＥＲＧＬＮ ＶＡＬ ＬＥＤ Ｐ
ＨＥＡＳＰ ＴＹＲＶＡＬ ＬＥＵ ＬＥＬＩ
ＴＨＲｌ−ｌｌ５ Ｔ）ＩＲ５ＥＲＴＹＲＧＬＮ
ＧＬＵ ＬＹＳ ＶＡＬ ＡＳＮ ＬＥＵＰＲ
ＯＣＹＳ ＰＲＯＬＹＳ ＡＳＰ ＴＨＲＰＲＯ
ＧＬＵＴＲＰ ＴＹＲＧＬＵ ＰＲＯＩＬＥ Ｔ
ＹＲＬＥＵ ＧＬＹＬＹＳ ＧＬＹ ＡＳＰ
ＧＬＮ ＬＥＬＩ ＳＥＲＡＬＡ ＧＬＵＬＥＵ
ＡＳＰ ＰＨＥ ＡＬＡ ＧＬＵ ＳＥＲ
ＧＬＹ ＧＬＮＡＬＡ ＬＥＵ ＦＩＧ、２３
らとったモジュレータ物質のバイオアラレイ結果を示ず
グラフ： 第２図は、ゲル゛心気泳動後に行われたモジュレータ物
質標本の、バイオアッセイ結果を示すグラフであって、
ゲルのスライスがカッ１〜され、バイＡ活性が、重炭酸
アンモニウム溶液中に拡散させることにより、夫々のス
ライスから溶出した。バイオ活性単位は、ゲル底からの
、夫々のスライスの位置を基準としてブロツトシた。 第３図は、モジュレータ物質分離物分画の、５Ｏ３−Ｐ
ＡＧＥ分析結果を示すラジオＡートゲラム（放射性物質
描画記録）である。内街７ｃ誘導もしくは誘導しないＲ
Ａ計６４．７細胞１８苔体からの粗培地標本、及び精製
中間物を、１０− １５％線状ポリアクリルアミド勾配
ゲル中で゛心気泳動処理した。標本は、電気泳動前に蒸
留水で透析した。 以下の説明は、オートラジオグラムに示されるレーン（
列）の内容を示す： （１ ＞ ’ｌ５ＯｕＪの非誘
導ＲＡ讐２６４． ７細胞培地：（２）５０μノの誘う
ｊンＲＡ計６４７細胞培地；（３）等雷焦点化コラムか
らのプール分画の１０μｍ標本；（４）コン△ーレフ７
０ーズ濾液の２５μノ標木：（５）非変７ｒ１条件下で
ＰＡＧＥｆｆｉ理により１！７られるピーク分画の８０
μノ標本（均質力シェフチン）。矢印はカシエクヂンを
示し、これは非誘導細胞の培地には完全に欠けているが
、Ｍ ＮＪ細胞の培地の１要成分である。カシエクヂン
は、上記の精製工程により連続的に加えられる。すべて
のレーン（スペーサレーンを含む）で可視的な分子Ｍ帯
域はβ−メルカブトエタノール不純物であり、これは標
本それ自体には存在しない。 第４図は、本発明による精製モジュレータ物質の５Ｏ３
−ＰＡＧＥ分析結果を示すグラフである。、Ｖｉ製カシ
ェクチンの２０μｇ標本を、ＳＤＳ存在下で２分間煮沸
し、非変質条件下で１０−１５％線状ポリアクリルアミ
ドゲル中で電気泳動処理した。 このゲルの連続的な２−ｔｅｒｍｌスライスを電気溶出
し、電気溶出分画を、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥで
１ ： １００に希釈した。その１０μノをバイオ活
性についてアッセイした。 第５Ａ及び第５Ｂ図は、精製モジュレータ物質について
行った放射線ラベルの結合の研究結果を示リグラフ−（
゛ある。 第６八及び６Ｂ図は、本発明によるモジュレータ物質に
ついて行われた放射線ヨード化及び結合に関して、スキ
ャッヂャード分析の結果を示すグラフである。 第７図は、粗濃縮ＲＡＭ２６７、４培地について行われ
たモノ（ＱＦＰＬＣ陰イオン効果）クロマトグラフィに
対応するオートラジオグラムであって、挿入写真は、粗
物質と連続的なコラム分画の分離を示す宋痕跡ＳＯＳポ
リアクリルアミド勾配ゲルをあられす。 第８図は、最初に行われたモノーＱ分画化処理により得
られた分画のスーパーローズ１２（ｒＰＬＣゲル濾過）
を示ずオートラジオグラムである。 挿入写真は、この濾過に由来する）ＩＩ！続する分画の
電気泳動輪郭を示Ｔ ＳＤＳポリアクリルアミド勾配ゲ
ルを示す。 第９図は、精製ＩＬ−１及び本発明モジュレータ物質を
３Ｔ３−１１に添加した結果を示すグラフである。 第１０図は、培養３Ｔ３−Ｌｌｌ胞に対し組換ｑｒ＋−
を及びセギ中和抗血清を添加した結果を示すグラフであ
る。 第１１図は、［シュレータ物質結合の放射線レセプタア
ッセイ結果を示すグラフであって、部分ａにおいて、組
換型Ｉ［−１がラベルしたモジュレータに匹敵りるよう
にしてあり、部分すにおいては、ラベルされていないモ
ジュレータ物質が同じ系で匹敵するようにしである。結
合は、夫々のアッセイにおいて、３Ｔ３−１１細胞が結
合する加入ＣＰＨのパーセント表示であられれている。 かっこ０は結合平均、±ＳＥＮ 、を指η。 第１２図は、合流２日前に前脂１１７１ＩＩｌｌ胞培養
体にＲＡＷ２Ｇ４．７細胞からの培地が添加されている
ＴＡＩ細胞からの、ｍＲＮＡの分離結果を示す写真図で
ある。 第１３図は、第１２図と同様にして行われた点ブロワ１
へ試験の結果を示す写真図である。 第１４図は、脂肪細胞に特異性のあるｍＲＮΔＲＮＡ第
１す゛る［ジコレータの抑制か転写的に関連があるかど
うか、を決定するために行われた転′ワアッヒイに基ず
く点プロット試験の結果を示す写真図である。 第１５Ａ図は、第１２図に関連する手順により分化した
脂肪細胞培養体にモジュレータ物質を添加した結果を足
りグラフである。ＲＮＡは、モジュレータ物質にさらし
た後所定回数分離され、点プロット装置において二１〜
口セルローズに適用され、その後、このフィルターｔよ
所定ＣＯＭＡでプローブ探針され、洗浄され、オートラ
ジオグラム化され、その後走査された。 第１５Ｂ図は、ＩＩＮへのノーザン分析結果を示す写真
図であって、この場合、標本は７１Ｊローズホルムアル
デヒドグル中で先ず電気体１ＩＩＩＪ処叩され、蒸留水
、りん酸ブトリウム及び［Ｄ１八で洗浄した後、ゲルは
ニトロセルロースに移された。 第１６図は、比較的な、棺；物取り込み実験の結果を示
すグラフであって、比較マウスと、本発明モジュレータ
を１９与されたマウスとについＣ実際の食物取り込みを
測定したしのＣ・ある。 第１７図は、第１６図に示す相対的な食物取り込み実験
に参加したマウス体重の相対的な変化を示すグラフであ
る。 第１８図は、モジュレータ物質の投与を中止した場合に
おけるマウス体重に及ぼす影響を示すグラフである。 第１９図は、本発明によるモジュレータ物質の放射線ラ
ベル標本の免疫沈澱結果を示す。 第２０図は、免疫血清及び免疫血清を比較するための、
電気泳動後に行われたウェスタンブロワ１〜分析の結果
を承り写真図である。 第２１図は、免疫血清及び３１免疫萌ＩｆＩＸ清の投与
を受りたマウスにＪ３りる内毒素ＬＤ＝ｉの結果を示す
グラフである。 第２２図は、５群にわけられ、人膓菌のある足を投与６
時間前、３時間前、投与と同時、投与３時間後、及び６
時間後に抗モジュレータ血清を腹腔的投与したＢＡＬＢ
／Ｃマウスについて、ＬＰＳ処理後のカブランーマイア
生存率を丞すグラフである。 第２３図（よ、マウスから回収したモジュレータ物質の
アミノ酸連鎖である。 特許出願人 ザ ロックフェラーユニバーシティ ／（片１□ 代 理 人 里 川 政
名−、、≧′５＋駅駅冊す 寸 Ｎ ＯＣＤ （ｊ） ？
Ｎ Ｏｄ とン＋：汐碧訃亘 ＦＩＧ、９ ば １ｌｌＫＫ曾：原暇 −６−７０−１ｌ−１０−９−８ ＦＩＧ ＋１ＡＦＩＧ、ｌ ＩＢ ＦＩＧ、１２ ＦＩＧ、１３ ＦＩＧ、１４ Ｓ 輻に爽ｍ１哩 経通日数 ＦＩＧ、＋６ 紅色日数 ＦＩＧ、＋７ 子 ＄Ｉ Ｓ ） 〜ノ 血清８甑 （３−’） ＦＩＧ、１９ ＦＩＧ−２０ＡＦｉＧ、２０Ｂ 才俵与量（Ｐ３／マウス） ＦＩＧ、２１ ＦＩＧ、２２ ＬＥＵ ＡＲＧ ＳＥＲＳＥＲＳＥＲＧＬＮ Ａ
ＳＮ ５ＥＲＨＩＳ ＶＡＬ ＶＡＬ ＡＬＡ
ＡＳＮ ＨＩＳ ＧＬＮ ＶＡＬＬＥＵ
ＳＥＲＧＬＮ ＡＲＧ ＡＬＡ ＡＳＮ ＡＬ
Ａ ＬＥＵＬＥＵ ＬＹＳ ＡＳＰ ＡＳＮ
ＧＬＮ ＬＥＵ ＶＡＬ ＶＡＬＬＥＵ ＶＡ
Ｌ ＴＹＲＳＥＲＧＬＮ ＶＡＬ ＬＥＤ Ｐ
ＨＥＡＳＰ ＴＹＲＶＡＬ ＬＥＵ ＬＥＬＩ
ＴＨＲｌ−ｌｌ５ Ｔ）ＩＲ５ＥＲＴＹＲＧＬＮ
ＧＬＵ ＬＹＳ ＶＡＬ ＡＳＮ ＬＥＵＰＲ
ＯＣＹＳ ＰＲＯＬＹＳ ＡＳＰ ＴＨＲＰＲＯ
ＧＬＵＴＲＰ ＴＹＲＧＬＵ ＰＲＯＩＬＥ Ｔ
ＹＲＬＥＵ ＧＬＹＬＹＳ ＧＬＹ ＡＳＰ
ＧＬＮ ＬＥＬＩ ＳＥＲＡＬＡ ＧＬＵＬＥＵ
ＡＳＰ ＰＨＥ ＡＬＡ ＧＬＵ ＳＥＲ
ＧＬＹ ＧＬＮＡＬＡ ＬＥＵ ＦＩＧ、２３
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、同化酵素であるリポプロティンリパーゼの活性を実
質的に完全に抑制し、脂肪細胞の分化を阻止し、筋肉細
胞のグルコース取り込みを増加させ、内毒素によるショ
ックから保護するそれ自身の抗体を生成する一方、白血
球賦活化活性を欠く蛋白質物質を含むモジュレータ物質
。 ２、前記モジュレータ物質が、侵入刺激を伴う刺激物質
で培養された動物マクロ−ファージ細胞に由来するもの
である特許請求の範囲第１項記載のモジュレータ物質。 ３、前記モジュレータ物質が、クローナル再現によりつ
くられる細胞に由来するものである特許請求の範囲第１
項記載のモジュレータ物質。 ４、下記のアミノ酸連鎖を有する特許請求の範囲第１項
記載のモジュレータ物質： 【アミノ酸配列があります】 ５、下記のアミノ酸連鎖を有する蛋白質： 【アミノ酸配列があります】 ６、検出可能ラベルでラベルされている特許請求の範囲
第１項記載のモジュレータ物質。 ７、ラベルが酵素である特許請求の範囲第６項記載のモ
ジュレータ物質。 ８、ラベルが、パーオキシダーゼ、β−グルクロニダー
ゼ、β−Ｄ−グルコシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダー
ゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼとパーオキシ
ダーゼ、ガラクトースオキシダーゼとパーオキシダーゼ
、及び酸フォスファターゼからなる群からなる特許請求
の範囲第７項記載のモジュレータ物質。 ９、ラベルが紫外線にさらされると蛍光を発する化学物
質である特許請求の範囲第６項記載のモジュレータ物質
。 １０、前記化学物質が、フルオレシシャイン、ローダミ
ン及びオーラミンからなる群から選ばれる特許請求の範
囲第９項記載のモジュレータ物質。 １１、ラベルが放射性元素である特許請求の範囲第６項
記載のモジュレータ物質。 １２、放射性元素が＾１＾４Ｃ、＾１＾２＾５Ｉ、＾１
＾３＾１Ｉ、＾３＾５Ｓ及び＾３Ｈからなる群から選ば
れる特許請求の範囲第１１項記載のモジュレータ物質。 １３、同化酵素であるリポプロティンリパーゼの活性を
実質的に完全に抑制し、脂肪細胞の分化を阻止し、筋肉
細胞のグルコース取り込みを増加させ、内毒素によるシ
ョックから保護するそれ自身の抗体を生成する一方、白
血球賦活化活性物質を欠くモジュレータ物質を、哺乳動
物における同化酵素の状態の検定に使用するために調製
する方法であって： イ、マクロファージ細胞の標本を哺乳動物から収集し； ロ、前記マクロファージ細胞の一部を哺乳動物の侵入事
態に関連する刺激物質で培養し； ハ、前記マクロファージ細胞を、前記モジュレータ物質
を生成するよう誘導し；そして、 ニ、前記モジュレータ物質を、前記マクロファージ細胞
体から得た上澄み液から分離する；ことを含むモジュレ
ータ物質の調製方法。 １４、前記モジュレータ物質が、侵入刺激を伴う刺激物
質で培養された動物マクロファージ細胞に由来するもの
である特許請求の範囲第１３項記載の方法。 １５、前記刺激物質が内毒素を含む特許請求の範囲第１
３項記載の方法。 １６、前記モジュレータ物質がクローナル再現によりつ
くられる細胞に由来する特許請求の範囲第１３項記載の
方法。 １７、前記モジュレータ物質が下記アミノ酸連鎖：【ア
ミノ酸配列があります】 を有することを特徴とする特許請求の範囲第１２項記載
の方法。 １８、侵入性刺激を受けた哺乳動物の血清中に存在する
モジュレータ物質に対する抗体であって、前記抗体がつ
くられるモジュレータ物質が、同化酵素であるリポプロ
ティンリパーゼの活性を実質的に完全に抑制し、脂肪細
胞の分化を阻止し、筋肉細胞のグルコース取り込みを増
加させ、内毒素によるショックから保護するそれ自身の
抗体を生成する一方、白血球賦活化活性物質を欠いてい
るモジュレータ物質であることを特徴とする、モジュレ
ータ物質に対する抗体。 １９、前記モジュレータ物質が、侵入性刺激を伴う刺激
物質で培養された動物マクロファージ細胞に由来するこ
とを特徴とする特許請求の範囲第１８項記載の抗体。 ２０、前記モジュレータ物質が、クローナル再現により
つくられる細胞に由来することを特徴とする特許請求の
範囲第１８項記載の抗体。 ２１、前記モジュレータ物質が下記アミノ酸連鎖：【ア
ミノ酸配列があります】 を有することを特徴とする特許請求の範囲第１８項記載
の抗体。 ２２、検出可能ラベルでラベルされている特許請求の範
囲第１８項記載の抗体。 ２３、ラベルが酵素である特許請求の範囲第２２項記載
の抗体。 ２４、ラベルが、パーオキシダーゼ、β−グルクロニダ
ーゼ、β−Ｄ−グルコシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダ
ーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼとパーオキ
シダーゼ、ガラクトースオキシダーゼとパーオキシダー
ゼ、及び酸フォスファターゼからなる群から選ばれるこ
とを特徴とする特許請求の範囲第２３項記載の抗体。 ２５、ラベルが紫外線にさらされると蛍光を発する化学
物質である特許請求の範囲第１８項記載の抗体。 ２６、化学物質がフルオレシャイン、ローダミン、及び
オーラミンからなる群より選ばれることを特徴とする特
許請求の範囲第２５項記載の抗体。 ２７、ラベルが放射性物質である特許請求の範囲第１８
項記載の抗体。 ２８、放射性元素が＾１＾４Ｃ、＾１＾２＾５Ｉ、＾１
＾３＾Ｉ、＾３＾５Ｓ、及び３Ｈからなる群より選ばれ
ることを特徴とする特許請求の範囲第２７項記載の抗体
。 ２９、前記抗体が、侵入刺激にさらされた哺乳動物の血
清中に存在する特許請求の範囲第１８項記載の抗体。 ３０、哺乳動物における侵入性刺激の存在を検出する方
法であって； 同化酵素であるリポプロティンリパーゼの活性を実質的
に完全に抑制し、脂肪細胞の分化を阻止し、筋肉細胞の
グルコース取り込みを増加させ、内毒素によるショック
から保護するそれ自身の抗体を生成する一方、白血球賦
活化活性物質を欠いているモジュレータ物質、の活性を
測定することを含む方法。 ３１、前記モジュレータ物質が、侵入刺激を伴う刺激物
質で培養された動物マクロファージ細胞に由来する特許
請求の範囲第３０項記載の方法。 ３２、前記モジュレータ物質が、クローナル再現により
つくられる細胞に由来する特許請求の範囲第３０項記載
の方法。 ３３、前記メディエータ物質の活性測定を：イ、前記モ
ジュレータ物質の少なくとも一つの標本を対応する数の
既知の明瞭を侵入刺激から調製し； ロ、前記モジュレータ物質標本から対応する数の抗体を
調製し： ハ、前記モジュレータ物質標本と前記抗体からなる群か
ら選ばれた物質に、検出可能ラベルを適用し； ニ、上記ハ、ロラベルした物質を、侵入が疑われる前記
哺乳動物からの生物学的標本に接触せしめ；そして、 ホ、前記生物学的標本を検査することにより、前記ラベ
ルした物質の存在を調べること； により行うことを特徴とする特許請求の範囲第３０項記
載の方法。 ３４、前記モジュレータ物質の活性測定を：イ、前記モ
ジュレータ物質の少なくとも一つの標本を対応する数の
、既知の明瞭な侵入刺激から調製し； ロ、前記モジュレータ物質標本に検出可能ラベルを適用
し； ハ、ラベルしたモジュレータ物質標本を、侵入が疑われ
る前記哺乳動物からの生物学的標本と接触せしめ、 ニ、前記生物学的標本を検査することにより、前記ラベ
ルしたモジュレータ物質標本の存在を調べること、 により行うことを特徴とする特許請求の範囲第３０項記
載の方法。 ３５、哺乳動物における所定侵入刺激と関連するモジュ
レータ物質の活性を測定する方法であって、前記モジュ
レータ物質が、同化酵素であるリポプロティンリパーゼ
の活性を実質的に完全に抑制し、脂肪細胞の分化を阻止
し、筋肉細胞のグルコース取り込みを増加させ、内毒素
によるショックから保護するそれ自身の抗体を生成する
一方、白血球賦活化活性が欠けている物質であり、前記
方法が： イ、前記侵入刺激と関連することが知られている刺激物
質から測定されるモジュレータ物質を調製し、； ロ、検出可能ラベルを前記モジュレータ物質に適用する
ことによりラベルした物質を生成し；ハ、前記侵入刺激
をもつことが疑われている哺乳動物からの血液、組織及
び体液のうちから選んだ生物学的標本を分離し； ニ、前記ラベルした物質を前記生物学的標本と接触させ
； ホ、前記生物学的標本を検査して前記ラベルした物質を
探査し、それにより前記モジュレータ物質の活性を決定
する ことを含むモジュレータ物質活性の測定方法。 ３６、前記モジュレータ物質が、侵入刺激を伴う刺激物
質で培養される動物マクロファージ細胞から由来するも
のである特許請求の範囲第３５項記載の方法。 ３７、前記モジュレータ物質が、クローナル再現により
つくられる特許請求の範囲第３５項記載の方法。 ３８、前記モジュレータ物質と反応する抗体であって、
前記モジュレータ物質と同様にして前記方法に使用され
る抗体を調製することを更に含む特許請求の範囲第３５
項記載の方法。 ３９、前記モジュレータ物質に対する抗体と反応する第
二世代の抗体を調製し、前記モジュレータ物質及びこれ
に対する抗体と同様に前記方法に使用する特許請求の範
囲第３８項記載の方法。 ４０、前記モジュレータ物質と反応する前記抗体の少な
くとも一つが、前記ラベルした物質に含まれる特許請求
の範囲第３８項記載の方法。 ４１、前記抗体の少なくとも一つに前記ラベルが適用さ
れる特許請求の範囲第４０項記載の方法。 ４２、前記第二世代抗体の少なくとも一つが前記ラベル
した物質に含まれる特許請求の範囲第３９項記載の方法
。 ４３、前記第二世代抗体の少なくとも一つに前記ラベル
が適用される特許請求の範囲第４２項記載の方法。 ４４、前記侵入刺激が感染である特許請求の範囲第３５
項記載の方法。 ４５、前記侵入刺激が、細菌感染、ビールス感染、原生
動物感染、哺乳動物腫瘍細胞、毒素からなる群のいずれ
かである特許請求の範囲第３５項記載の方法。 ４６、前記モジュレータ物質の調製を： イ、哺乳動物マクロファージ細胞のコロニーを分離し； ロ、前記マクロファージ細胞を、前記刺激物質により前
記マクロファージ細胞に前記モジュレータ物質をつくり
だすのに十分な時間、前記刺激物質で培養し；そして、 ハ、前記モジュレータ物質を前記マクロファージ細胞か
ら分離させる； ことにより行うことを特徴とする特許請求の範囲第３５
項記載の方法。 ４７、前記刺激物質が内毒素からなる特許請求の範囲第
４６項記載の方法。 ４８、前記内毒素がリポポリサッカライドからなる特許
請求の範囲第４７項記載の方法。 ４９、哺乳動物体の細胞におけるモジュレータ物質のレ
セプタと反応することのできるモジュレータ物質の活性
を抑制する薬剤効果の試験方法であって： モジュレータ物質を含む成長培地中に前記レセプタを有
する試験細胞コロニーを培養し、試験中の薬剤を加え、
その後試験細胞コロニーの前記レセプタに対する前記薬
剤の反応性を測定することからなり； 前記モジュレータ物質が、同化酵素であるリポプロティ
ンリパーゼの活性を実質的に完全に抑制し、脂肪細胞の
分化を阻止し、筋肉細胞のグルコース取り込みを増加さ
せ、内毒素によるショックから保護するそれ自身の抗体
を生成する一方、白血球賦活化活性をもたない蛋白質物
質からなる物質である； ことを特徴とするモジュレータ物質の活性抑制薬剤効果
試験方法。 ５０、前記モジュレータ物質が、侵入刺激を伴う刺激物
質で培養された動物マクロファージ細胞から由来する特
許請求の範囲第４９項記載の方法。 ５１、前記モジュレータ物質が、クローナル再現により
つくられた細胞に由来する特許請求の範囲第４９項記載
の方法。 ５２、モジュレータ物質の生成及び／もしくは活性を抑
制する薬剤効果をスクリーニング処理するアッセイ系で
あった、 モジュレータ物質を接種した観察可能な細胞試験コロニ
ーを含み、 前記モジュレータ物質が、同化酵素であるリポプロティ
ンリパーゼの活性を実質的に完全に抑制し、脂肪細胞の
分化を阻止し、筋肉細胞のグルコース取り込みを増加さ
せ、内毒素によるショックから保護するそれ自身の抗体
を生成する一方、白血球賦活化活性をもたない蛋白質物
質からなる アッセイ系。 ５３、前記モジュレータ物質が、侵入刺激を伴う刺激物
質で培養された動物マクロファージ細胞から由来する特
許請求の範囲第５２項記載のアッセイ系。 ５４、前記モジュレータ物質が、クローナル再現により
つくられる細胞から由来する特許請求の範囲第５２項記
載のアッセイ系。 ５５、血清もしくは水性培地中のモジュレータ物質の証
明のための試験キットにおいて： イ、モジュレータ物質もしくはこれに対する特異結合パ
ートナーを検出可能ラベルに直接もしくは間接に着合さ
せることにより得られる所定量の、少なくとも一種のラ
ベルされた免疫化学的反応阻止であって、前記モジュレ
ータ物質が、同化酵素であるリポプロティンリパーゼの
活性を実質的に完全に抑制し、脂肪細胞の分化を阻止し
、筋肉細胞のグルコース取り込みを増加させ、内毒素に
よるショックから保護するそれ自身の抗体を生成する一
方、白血球賦活化活性をもたない蛋白質物質からなるも
のであるようにした、免疫化学的反応素子； ロ、他の反応剤；及び ハ、前記キットの使用説明書； とを含む試験キット。 ５６、前記モジュレータ物質が、侵入刺激を伴う刺激物
質で培養した動物マクロファージ細胞から由来する特許
請求の範囲第５５項記載の試験キット。 ５７、前記モジュレータ物質が、クローナル再現により
つくられる細胞から由来する特許請求の範囲第５５項記
載の試験キット。 ５８、ラベルが酵素である特許請求の範囲第５５項記載
の試験キット。 ５９、リポプロティンリパーゼ活性を減少させることが
できる哺乳動物におけるモジュレータ物質を検出するた
めのキットであって、 少なくとも一つのモジュレータ物質抗体と、検出可能ラ
ベルをラベルされ、前記モジュレータ物質抗体と反応性
のある第二抗体、とを含んでなり、 前記モジュレータ物質が、同化酵素であるリポプロティ
ンリパーゼの活性を実質的に完全に抑制し、脂肪細胞の
分化を阻止し、筋肉細胞のグルコース取り込みを増加さ
せ、内毒素によるショックから保護するそれ自身の抗体
を生成する一方、白血球賦活化活性をもたない蛋白質物
質からなるものである、 モジュレータ物質検出キット。 ６０、前記モジュレータ物質が、侵入刺激を伴う刺激物
質で培養した動物マクロファージ細胞から由来するもの
である特許請求の範囲第５８項記載のキット。 ６１、前記モジュレータ物質が、クローナル再現により
生成する細胞から由来するものである特許請求の範囲第
５８項記載のキット。 ６２、ヒトのショックを治療する方法であって、ヒトに
対し、モジュレータ物質は特異性のある抗体のショック
減少量を投与することからなり、前記モジュレータ物質
が、同化酵素であるリポプロティンリパーゼの活性を実
質的に完全に抑制し、脂肪細胞の分化を阻止し、筋肉細
胞のグレコース取り込みを増加させ、内毒素によるショ
ックから保護するそれ自身の抗体を生成する一方、白血
球賦活化活性をもたない蛋白質からなるものである、 ショック治療方法。 ６３、前記モジュレータ物質が、侵入刺激を伴う刺激物
質を培養した動物マクロファージ細胞から由来するもの
である特許請求の範囲第６２項記載の方法。 ６４、前記モジュレータ物質が、クローナル再現により
つくられる細胞に由来するものである特許請求の範囲第
６２項記載の方法。 ６５、哺乳動物におけるショック及び／もしくは悪液質
の発生を防止する方法において： イ、前記哺乳動物におけるモジュレータ物質のショック
及び／もしくは悪液質活性の存在を検出する段階であっ
て、前記モジュレータ物質が、同化酵素であるリポプロ
ティンリパーゼの活性を実質的に完全に抑制し、脂肪細
胞の分化を阻止し、筋肉細胞のグルコース取り込みを増
加させ、内毒素によるショックから保護するそれ自身の
抗体を生成する一方、白血球賦活化活性をもたない蛋白
質からなるものであり； ロ、前記ショック及び／もしくは前記悪液質の発生をそ
らせるために有効な量の前記モジュレータ物質の抗体を
投与する段階； とからなるショック及び／もしくは悪液質発生防止方法
。 ６６、前記モジュレータ物質が、クローナル再現により
つくられる細胞から由来するものである特許請求の範囲
第６５項記載の方法。 ６７、前記モジュレータ物質が、侵入刺激を伴う刺激物
質で培養した動物マクロファージ細胞から由来するもの
である特許請求の範囲第６５項記載の方法。 ６８、前記モジュレータ物質が検出された後、前記抗体
を投与する代りに、 ロ、侵入刺激に応答して前記モジュレータ物質をつくる
素質を、前記哺乳動物について試験し； ハ、モジュレータ物質の生成に耐性がある前記哺乳動物
のいずれかを観察し、選び出し；そして、 ニ、選ばれた耐性ある哺乳動物を育成する、ことを行う
特許請求の範囲第６５項記載の方法。 ６９、前記モジュレータ物質が検出された後、前記抗体
を投与する代りに、前記哺乳動物を遺伝子工学的に改変
して、前記モジュレータ物質の生成に耐性のあるように
する特許請求の範囲第６５項記載の方法。 ７０、哺乳動物におけるリポプロティンリパーゼ活性を
減ずることができる、毒性レベルのモジュレータ物質を
有する動物もしくは患者の治療方法であって、 動物もしくは患者を、モジュレータ物質を中和させるた
めに有効な量のモジュレータ物質抗体で処理することか
らなり、 前記モジュレータ物質が、同化酵素であるリポプロティ
ンリパーゼの活性を完全に抑制し、脂肪細胞の分化を阻
止し、筋肉細胞のグルコース取り込みを増加させ、内毒
素によるショックから保護するそれ自身の抗体を生成す
る一方、白血球賦活化活性をもたない蛋白質からなる、
有毒レベルモジュレータ物質を有する動物又は患者の治
療方法。 ７１、前記モジュレータ物質が、侵入刺激を伴う刺激物
質で培養された動物マクロファージ細胞に由来する特許
請求の範囲第７０項記載の方法。 ７２、前記モジュレータ物質が、クローナル再現により
つくられる細胞に由来するものである特許請求の範囲第
７０項記載の方法。 ７３、哺乳動物における悪液質の治療方法であって、モ
ジュレータ物質に特異性のある抗体の悪液質減少有効量
を、哺乳動物に対して投与することからなり、 前記モジュレータ物質が、同化酵素であるリポプロティ
ンリパーゼの活性を完全に抑制し、脂肪細胞の分化を阻
止し、筋肉細胞のグルコース取り込みを増加させ、内毒
素によるショックから保護するそれ自身の抗体を生成す
る一方、白血球賦活化活性をもたない蛋白質からなる、
悪液質治療方法。 ７４、前記モジュレータ物質が、侵入刺激を伴う刺激物
質で培養した動物マクロファージ細胞に由来するもので
ある特許請求の範囲第７３項記載の方法。 ７５、前記モジュレータ物質が、クローナル再現により
つくられた細胞に由来するものである特許請求の範囲第
７３項記載の方法。 ７６、前記方法が、前記抗体を投与する前に、前記哺乳
動物中に前記モジュレータ物質の存在及び悪液質促進活
性を検出する段階、を含む特許請求の範囲第７３項記載
の方法。 ７７、哺乳動物における肥満症治療方法であって、体重
を減少するために有効な量のモジュレータ物質を投与す
ることからなり、 前記モジュレータ物質が、同化酵素であるリポプロティ
ンリパーゼの活性を実質的に完全に抑制し、脂肪細胞の
分化を阻止し、筋肉細胞のグルコース取り込みを増加さ
せ、内毒素によるショックから保護するそれ自身の抗体
を生成する一方、白血球賦活化活性をもたない蛋白質か
らなるものである、 肥満症治療方法。 ７８、前記モジュレータ物質が、侵入刺激を伴う刺激物
質で培養した動物性マクロファージ細胞に由来するもの
である特許請求の範囲第７７項記載の方法。 ７９、前記モジュレータ物質が、クローナル再現により
つくられる細胞に由来するものである特許請求の範囲第
７７項記載の方法。 ８０、前記モジュレータ物質が、下記アミノ酸連鎖を有
するものである特許請求の範囲第７７項記載の方法： 【アミノ酸配列があります】 【アミノ酸配列があります】 ８１、哺乳動物における腫瘍状態の治療方法であって、
腫瘍減少有効量の、モジュレータ物質に対し特異性を有
する抗体を投与することからなり、前記モジュレータ物
質が、同化酵素であるリポプロティンリパーゼの活性を
実質的に完全に抑制し、脂肪細胞の分化を阻止し、筋肉
細胞のグルコース取り込みを増加させ、内毒素によるシ
ョックから保護するそれ自身の抗体を生成する一方、白
血球賦活化活性をもたない蛋白質からなるものである、 腫瘍治療方法。 ８２、前記モジュレータ物質が、侵入刺激を伴う刺激物
質で培養した動物マクロファージ細胞に由来するもので
ある特許請求の範囲第８１項記載の方法。 ８３、前記モジュレータ物質が、クローナル再現により
つくられる細胞に由来するものである特許請求の範囲第
８１項記載の方法。 ８４、前記モジュレータ物質が、下記アミノ酸連鎖を有
する特許請求の範囲第８１項記載の方法：【アミノ酸配
列があります】 ８５、哺乳動物におけるショック及び／もしくは悪液質
の発生を防止する方法であって、 哺乳動物に対し、その免疫を与えるために適した形態で
有効な量のモジュレータ物質を投与することになり、 前記モジュレータ物質が、同化酵素であるリポプロティ
ンリパーゼの活性を実質的に完全に抑制し、脂肪細胞の
分化を阻止し、筋肉細胞のグルコース取り込みを増加さ
せ、内毒素によるショックから保護するそれ自身の抗体
を生成する一方、白血球賦活化活性をもたない蛋白質か
らなるものである。 ショック及び／もしくは悪液質発生防止方法。 ８６、前記モジュレータ物質が、侵入刺激を伴う刺激物
質で培養した動物マクロファージ細胞に由来するもので
ある特許請求の範囲第８５項記載の方法。 ８７、前記モジュレータ物質が、クローナル再現により
つくられる細胞に由来するものである特許請求の範囲第
８５項記載の方法。 ８８、ヒトにおける肥満症及び／もしくは腫瘍成長治療
のための医薬組成物において： イ、薬学的に有効な量のモジュレータ物質であって、同
化酵素であるリポプロティンリパーゼの活性を実質的に
完全に抑制し、脂肪細胞の分化を阻止し、筋肉細胞のグ
ルコース取り込みを増加させ、内毒素によるショックか
ら保護するそれ自身の抗体を生成する一方、白血球賦活
化活性をもたない蛋白質からなるものであるか、モジュ
レータ物質に対する特異結合パートナー；及び、 ロ、薬学的に有効な担体 とを含む肥満症及び／もしくは腫瘍成長治療のための医
薬組成物。 ８９、前記モジュレータ物質が、侵入刺激を伴う刺激物
質で培養された動物マクロファージ細胞から由来するも
のである特許請求の範囲第８８項記載の組成物。 ９０、前記モジュレータ物質が、クローナル再現により
つくられる細胞から由来するものである特許請求の範囲
第８８項記載の組成物。 ９１、前記モジュレータ物質もしくは前記結合パートナ
ーが、適当な形態で免疫化学的に有効な量存在しており
、前記組成物が、悪液質及びショックに対して哺乳動物
を免疫化するために有用である特許請求の範囲第８８項
記載の組成物。 ９２、ヒトにおける悪液質及びショック治療のための医
薬組成物であって： イ、薬学的に有効量の、モジュレータ物質に対する抗体
であって、前記モジュレータ物質が、同化酵素であるリ
ポプロティンリパーゼの活性を実質的に完全に抑制し、
脂肪細胞の分化を阻止し、筋肉細胞のグルコース取り込
みを増加させ、内毒素によるショックから保護するそれ
自身の抗体を生成する一方、白血球賦活化活性をもたな
い蛋白質からなるものであるか、もしくはこれに対する
特異結合パートナー；及び、 ロ、薬学的に有効に担体； とを含む悪液質及びショック治療のための医薬組成物。 ９３、前記モジュレータ物質が、侵入刺激を伴う刺激物
質で培養した動物マクロファージ細胞に由来するもので
ある特許請求の範囲第９２項記載の組成物。 ９４、前記モジュレータ物質が、クローナル再現により
つくられる細胞に由来するものである特許請求の範囲第
９２項記載の組成物。
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