JPH029391A - 大食細胞誘導炎症性神経細胞 - Google Patents

大食細胞誘導炎症性神経細胞

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JPH029391A
JPH029391A JP88249724A JP24972488A JPH029391A JP H029391 A JPH029391 A JP H029391A JP 88249724 A JP88249724 A JP 88249724A JP 24972488 A JP24972488 A JP 24972488A JP H029391 A JPH029391 A JP H029391A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＜ＯＱ連ある記事〉 本出願人は本発明の主題に関係ある多数の記事の著者ま
たは共著者である。これらの記事は米国特許第４，６０
３，１００号に掲記された２事の補填内容であり、先の
記事を参考として水用ｍ書に掲記しである。（１）、［
本出願人のセラミ及びボイトラ−はＪ、マホニー、Ｎ、
う、トランク及びＰ。
テカラの共著者である］「菌体内毒素誘引型ＭＡＷ２６
４．７細胞で分泌される悪法毒性、リボプロティン・リ
パーゼ消去ホルモンの清浄化Ｊ、Ｊ、ＥＸＩ”、　ＭＥ
Ｄ、　１６１　　９８４−９９５　　（１９８５年５月
）　；（２）（本出願人がＪ−Ｒ・マホーニー、し・う
・ｉ・ラング、Ｗ・パイン、Ｙ・イケダとの共著者であ
る）　「リボポリサツカリド５［ＩＦＩ！したＲＡＷ２
６、４７細胞が３Ｔ３−Ｌ１１１胞内のりボブロチイン
・リパーゼを抑止する神経細胞を発生する。Ｊ。
Ｊ争ＩＭＭＬＪＮＯＬ、　１３４　、　　（３）、　１
６７３−１６７５（１９８５年３月）：　（３）本出願
人のセラミがＰ・Ｊ・ホテッツ、Ｌ・う・トランク、△
・Ｓ・ヌエアラムとの共著者である）「腹膜滲出物ｍ胞
からの血液原生動物誘引神経細胞により３Ｔ３−Ｌｌ細
胞内とリボプロティン・リパーゼの抑±ＪＰΔＭＡＳＩ
ＴＥ　　ＩＭＭＵＮＯＬ（オックスフＡ−ド’）　６　
：　２０３　　（１９８４年）：　（３）本出願人のセ
ヤミ及びボイトラーがＤ・グリーンワルド、　Ｊ−Ｄ・
ハルムス１Ｍ・ラング・Ｙ、　−Ｃ，Ｔタン、Ｊ・マキ
ソン及びＲ・ニレピッチとの共著者である。）　「腫瘍
壊死因子及び大食１ｓ胞滲出因子悪液質性の確ｍｌ、Ｎ
ΔＴＬＩ　ＲＥ３１６　：　５５２−５５４　。
（１９８５年）：　（５）本出願人のセラミ及びボイト
ラーがＦ−Ｍ・トルーチ、Ｂ・ピンクマン及びＴ・Ｍ・
リンボルドの共著者である。）　「大食１１１１１因子
が脂肪質遺伝子出現を抑止する。：悪液質のガラス賀モ
チＡｚｒＳＣＩＥＮＣＥ　　２２９　：８６７−８６９
　、　　（１９８５年）：　（６）本出願人のセラミ及
びボイトラーがＩ−Ｗ・ミルザークの共著者である）「
悪液質性／！！ｌＷＡ壊死因子（ＴＮＦ）がネズミを菌
体内毒素の致命的作用から保護する。ＪＳＣＩＥＮＣＥ
２２９　　：８１１＞９−８７１　　（１８８５年）；
　　（７）本出願人のセラミ、ボイトラー及びＳ−Ｄ・
ウオルブがＤ・ダパテルス、Ｂ・シェリー、Ｄ−Ｇ・ヘ
ッセ、トドＴ・ヌエン、Ｌ・トモルダーワ、Ｃ・Ｆ・ナ
サン及びＳ−Ｆ・ローリ−との共著者である）１大食Ｉ
ＩＩ胞が炎症性及び好巾球機能六進特性で新規なヘパリ
ン結合蛋白質を滲出させる。）ｒＪ−ＥＸＰ、　ＭＥＤ
　　１６７　：５７０−５８１　　（１９８８年）；　
（８）本出願人のセラミ及びウオルプがＧ・デバテニス
、Ｐ・テカンブ・Ｊ−／レソン、Ｋ・エルムセン、Ｃ・
ルーフ、Ｃ・ガレゴス、Ｐ・コイト及びＪ・メリウエザ
ーの共著者である。）「ネズミ・ノミ大食ＩＩＩ胞炎症
性蛋白質（ＶＩＰ）に対するｃＤＮＡのクローニングと
特性化、炎症性特性とＩＩ能八へ特性による新規な単連
ｆｊＪＪ、Ｊ−ＥＳＰ−ＭＥＤ、　１６７　　：　１９
３９−１９４４（１９８８年）　：及び（９）〔本出願
人のセラミとウオルブが８・シャーリ−２Ｐ・テカンブ
ーオルソン、Ｃ・ユヤレゴス、Ｂ・バウアー、Ｏ・デバ
テリス、Ｆ・マンアルツ及びＴ・ホイトと共著者である
。）　（大食細脂炎症性蛋白質−１の２成分の溶解、こ
れら２成分の１つの成分のり０−ニングと特性、ＭＩＰ
−１βＪ、Ｊ−ＥＦＰ−ＭＥＤ、（Ｉｎ　　Ｐｒｅｓｓ
）（１９８８年）先に掲記した記事内容は全て本川ＩＩ
書では参考として入れである。
本発明にいたる研究の資金は部分的には米ａ東局とロッ
クフェラー財団の授与によった。
〈発明の経緯〉 本発明は一般に動物の宿主に対づる感染と如き侵入性刺
激の効果とその対応する作用の分析及び治療に関する１
料及びその関連ある方法に関するもので、更に詳細には
こうした侵入性刺激に対する宿主の反応に関与出来るＩ
ＩＦ＋の確認に関するものである。
多くの通常の生理学的及び生化学的配列上の無秩序が突
発性疾患状態におけるのと同様、バクテリア感染、ビー
ルス感染または原生堵物感染；腫瘍または菌体内毒素と
いった各種侵入性刺激に応答ザる各秤乳房の宿主に観察
されている。例えば。
これらの反応には発熱β白血球増加、リポイド過多血症
１良物摂取低減化〈無食欲）、運動低減化。
消耗（悪液質）、及び筋肉、白血球細胞及び肝臓の新陳
代謝にＪ３ける他の一時的異変が含まれる。
特に、トリバ、シーマ・ツエツエ・バエで感染した兎の
菌体内Ｒ素の生化学機構を明らかにすることを狙いにし
ている最近の研究で１１０低の宿主をＲ１Ｊる初物が死
にかけており、茗しいハイパートリグリオエリメディア
（ｈｙｐｅｒｔｒｉｇｌｙｏｃｒｉｄｅｍｉａ）を示し
、極めて低密度のリボプロティン（ＶＬＤＬ）のプラズ
マを著しく増加させたことに注目した。Ｃ・Δ・ルーリ
ー及びＡ・セラミ、ＭＯＬ。
ＣＩＯＣＩＩＥＭ、ＰＡＲＡＳ　ＩＴＯＮ、１　：３ｌ
−３８（１９８６年、参照。こと実験的な感染に伴なう
著しい消耗素因に鑑み、ノイバートリグリオエリメディ
ク状態が著しかった。プラグマＱＬＤＬの増加は周わり
の組織のリボプロティン・リパーゼ（Ｌ、、、　Ｐ　Ｌ
　）作用の損失によりもたらされた浄化上の大魚に起因
したものであることが示された。
低減化されたＬＰ＋−作用が他者により観察されており
、この状態は１人体がショック状態にあった時存在づる
ことに注目されている。Ｅ、　Ｆ３．マン等の：肝臓疾
患のある患者の抗導素と肝臓のリボイｌ−”　ｒｃＬ　
ＩＮ、［ＮＶＥＳＴ、２４　Ｇ２３［（１９４５年）参
照。ジョン・トガリン等の：　！ｆＩ染におＧｊる抗毒
素リポイドｊ　、Ｎ　−ＥＮＧ［、Ｊ。
Ｍ　［Ｄ　、　２８１１０８１−１０８６　＜　１９６
９升、１１１１１３０）；［）・ファースチ等の「鬼の
抗毒素リポイドに対する３３種類のバクテリア感染の効
果Ｊ、Ｊ−ＢΔＣ０ＥＲＩＡＬβ９５１６１５以後（１
９６８年）；Ｓ、Ｅ。
グロスバーブ等のｒ鶏の胎児のウィルス感染に続くリポ
イド多面症：新症候群Ｊ、ＮＡＴＵＲＥ（Ｄンドン２０
８８５／ｌ以後（１９６５年）　−Ｏバート・し・ヒル
シ等の「バクテリア菌体内ｍ免を皮下投与した兎にお番
ノるリポイド多血症、脂肪肝及びプルモサルフオフタレ
イン保持Ｊ、Ｊ−ＬＩＰＩＤ。
ＭＥＳ、　５５６３−５６８　　（１９６４年）：ナカ
グチ・オリム等のｒ菌体内ｉ！ＪＭを投与したマウスに
おＧＪるリポイド・新陳代謝の交替Ｊ、ＭＩＣＲＯＢＩ
ＯＬ、ＩＭＭＵＮＯＬ、２３（２）７１−７５（１９７
９年）：Ｒ，Ｆ、カムブシュミツトの「菌体内毒素抗性
Ｃ３Ｈ／　ｌ−１ｅ　Ｊマウスにおける部分的に純粋化
された白血球内因性神経細胞の作用Ｊ、Ｊ、ＬＡＢ。
ＣＬ　Ｉ　Ｎ、　ＭＥＤ、　８５　（ｉ１Ｇ以１１（１
９８０年）　；及びラルフ・Ｆ・カンブシュミツトの「
白血球内因性神経ｍ胞Ｊ　、　Ｊ、　ＲＥＴ、　ＳＯＣ
，２３（４）　２８７２’１７　、　　（１９７８年）
を参照。
更に、感染に対する宿主の反応に含まれると思われる「
神経！Ｒ胞」の確認と存在について検討している刊行物
を本出願人は知っており、特に、以下の記事は参考とし
て本川１１［１書にその内容が含まれている。リーイブ
・Ｊ−Ｄ等のＪ、ＥＸＰ、ＭＥｆ）、　１５０　：　５
９７−（ｉ０６　　（１９７９年）；バーニー、Ｃ１Ｃ
等、ＬＩＰＴＯＮ、Ｊ、Ｍ、（Ｅｄ、）、ＦＥＶＩＥＲ
：ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ　　ＳＹＭＰＯ３Ｉ　Ｕ
Ｍ、ダラス、テキサス州、　１８７９年４月１１１２日
、　Ｘ　Ｉ　１　＋、２６３　Ｐ、レーバン・ブレス：
二↓−コーク、イリノイ、　　ｌ５ＢＮ　　０−８９０
０４−４５１−１　（０８８７７）　、　Ｏ（０）　、
　Ｄｐｌｌｌ　−１２２（１９８０年）　；ダイナレロ
・Ｃ−Ａ、ｒヒト白血球ピロゲン：レントゲン線免疫の
純粋化と発展」。
ＰＲＯＣ，ＮＡＳＬ、ＡＣＡＤ、ＮＣ１，ＵＳＡ７４　
（１０）　４Ｇ２４−３６２７　（１９７７年１０月）
。前掲の記事とカムシュミットによる著作または共苔に
よる記事中で各若者により確認され調査された因子は全
てインターロイギン−１（ＩＬ−１）として認定された
因子の甲−グループ化を含むＪ、う決定された。この決
定についてｔよチャールズ・Ａ・ジナレロによる記事中
で文書化されてＪ３す、感染症の検討、第６巻、第１号
（１９８４イｆ１月−２月）にて発行してあり、その内
容ら参考として木用ｍ占中に含まれている。
Ｌ　Ｐ　１作用の同様の欠陥について腸内ＩＩｒＡ類コ
リ　リポポリサッカライド（Ｌ　Ｐ　Ｓ　）の投与（Ｕ
にＣ３Ｈ／　Ｃｅ　Ｊマウスにおいて本出願人により注
目された。対比的に、ＬＰＬ作用の！１失【よＬＰＳに
対して遺伝的に抗性のあるＣ　３　Ｈ／　Ｈｃ　Ｊマウ
スで１１見られなかった。菌体内毒素誘引ＬＰＬ欠陥に
対するこの抗性は２時間前にＬＰＳを投与した菌体内毒
素に反応する動物から得られたリポイドの投与によって
妨げられた。同様に、抗性１ま反応するマウスから得ら
れた菌体内毒素＃１１激を受けるチオグリコール酸塩誘
引腹膜大食細胞がら調質薬剤を注入することにより克服
出来た。これらの発見内容については出願用３１４，０
９８号で現在の米国特；１第４，６０３，１０６号に一
層訂細に説明された。
その開示内容については参考として本川ｍ’ｉｌＪ中に
記載しである。
前掲の研究はｒ神ｌ！細胞」または複数個の神経１１１
１１１Ｊが存在し且つ動物宿主内にエネルギー貯蔵細胞
の一般的新陳代謝作用に対し著しい効果とあることが予
期されるよう本出願人の信念で促進された。こうしたｒ
神経１１１１ａｊは一部の同化酵素の作用にマイナスの
効果をもたらし１例えば宿主が侵入に応答してショック
として知られる状態に入る場合その低減化された作用が
ＩＩ察されることが予期された。その結果、菌体内毒素
反応及び菌体内毒素非反応マウスと同様、菌体内１１６
１激腹Ｅｌマウス滲出物細胞により作成される神経細胞
と同化酵素作用の測定に対する試薬の調査を通じての開
発の関係については参考として水明ａ刃に含まれている
先に提出し放棄した出願用２９９，９３２　ｐに述べら
れた。
このシステムの別の調査について３Ｔ３−Ｌｌ「ブＬ／
７ジボサイｌ−（Ｐｒｅａｄｉｐｎｃｙｔａ）　Ｊ　Ｅ
デル・システムと共にさされ、：「神経細胞Ｊに対する
抗体のｒＭ発に関連ある方法、材料及び伯の診断方法の
対応する１β１発が出願用２５１，２９０号にのべられ
た。これも参考として本川ｍ−ｓ中に含まれているが現
在放棄されている。しかる後、後続と出願用４１４．０
９８号、現在の米国特許用４．１３０３．１０６号では
本出願人は大食細胞の菌体内毒素刺激からＹｌられた神
経細胞物質が腹膜酵素リボプロティン・リパーゼ、アセ
ヂルコ酵素Ａカルボキシラーゼ、脂肪酸シンセターゼを
消去する作用を呈し、更に赤染［ｌ胞の成長と差別化を
呈することを確立した。
開示内容が参考として本川ｓ書に含まれている出願用７
６６．８５２１のボイトラー等による記事〈１）及び（
４）に記載しである別の研究は結果的に神経Ｉ８胞物質
と先行技術においてインターロイキン１、インター０イ
キン２として知られている他の因子から識別した多数の
作用を有する別の蛋白質要素が含まれることが発見され
た。ボイトラー等及び１ｍ示内容が参考として本川ＩＩ
書中に含まれている特許出願用１０４，８２７号による
記事（ｆ）に記載の別の研究では顕著な作用の側面を示
す神経細胞物質内に付加的な因子（ＭｒＰ−１＞の存在
を確立した。
その時以来、ＶＩＰ−１が′ｆ！素のペプヂド内に溶解
され、現在、Ｍ［’−１α及びＭｆＰ−１βと称してい
るこうした２種類のペプチドのＮ−ターミナル・シーケ
ンスが比較された。従って１本願は新たに発見されたペ
プチド分離物、ＭＩＰｌの作用、これらの分離物を適用
出来る診断用及び治療用の両方に適用することに向けら
れている。
〈発明の要約〉 本発明の第１局面によれば、神経細胞物質の新たに発見
された分離物である炎症性サイトキンが開示され、１ｉ
＠粋化された且つ生理学的条件下において陰イオン性で
ある蛋白質を含んでいる。本発明の炎症性サイトキンは
高塩分濃度においてもヘパリンと結合する能力を有し、
皮下投与時に多形核細胞の浸潤を特徴とする局部的にふ
くらみを誘引し、試験管の中での多形核細胞ｖ１能六進
を誘引する。然し乍ら１本発明の炎症性サイｔ・キンは
米国特許用４，６０３．１０６号に開示された神経ｌＩ
胞物賀から分離された他の因子に共通している一部の作
用に欠けている。
特に１本発明の炎症性号イトキンは、同化酵素リボプロ
ティン・リバーぜ（ＬＰＬ）のｎ用を抑止り−る能力に
欠け、悪法＊ｆＩ／ＴＮＦ反応し９２９Ｉｌｌ胞の菌体
内毒素の発生、１凌体内涛素抵抗Ｃ３１１／Ｉｌ−１ｅ
Ｊ素の芽胞生殖の刺激を出来ずまたは一次シオグリコー
酸塩マウス大食細胞による悪法資性／ＴＮＦの発生誘引
をすることが出来ない。これら後前の特性は全て本発明
の炎症性サイト↓ンにはなく、公知の因子悪法ＴＨ１／
ＴＮＦ及びインターロイキン−１（ｒＬ−１で提示され
、かくして本発明の炎症性ナイトキンを顕著なものとじ
ている。
？示された確実な作用の中で、ヘパリンと結合し多形核
（ρＭＮ）Ｉｌｌ胞の浸潤を特徴とする局部的なふくら
みを誘引する能力が最も手習であるように思われる。従
って１本発明の分離体が宿主の侵入に対する反応のカス
ケードで作用する正確な役７１１１は定義付けが依然不
明であるが、宿主の侵入に対する移動性と関連がある作
用及び条件の一部分の誘引に参加づ゛ることは明らかで
ある。従って炎症性サイトキン刺激が促進出来る本発明
の炎症性サイｌ−Ｐンの励起により、１１１１１１５１
性または誘引性であり、各種刺激間の確認をし、おそら
くはイの差違を付けるよう診所工具としての使用潜在力
を有している。
本発明の炎症性サイトキンは低塩分バッファー内で約１
０６ダルトン以上の＾分子量を持つ塊を形成する傾向を
以ってドデシル硫酸塩す１−リウム（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
）の存在下でポリアクリルアミド・ゲル・電気泳動上で
決定される大略８，０００ダルトンの見かけ分子ｍを定
める一部のポリペブブド・セグメントを含むよう最初部
分的に確認され、特徴付けされＤつ発見された。特に、
本発明の炎症性サイトキンはゲルろ過で評価すると２×
１０６ダルトン以上の粒状物を形成することに注目され
た。従って１本用ｐＡ古の第３図に去される如く、子猫
的な部分Ｎ−ターミナル・アミノ酸一致シーケンス・デ
ータはその時点に先に説明し／Ｃ蛋白質と何んら重要な
同質性を？しなかった。決定された部分的ベブヂド・シ
ーケンスに１Ａづく公知のｃＤＮ△クローニング技法に
より、完全に並准されたベブヂド・シーケンスがｊヱ成
された。このシーケンスは大略８キロ・ダルトンの分子
ｍを有づることが判明した。Ｍ　Ｉ　１１−１はクロマ
トフオーカシングにより大略４．６のｐｌを？すること
が示された。
本発明の炎症性サイトキンの他の特性には兎肉に発熱を
誘因し且つ試験管中のヒトの好中球に過酸化物の形成ま
たは呼吸バーストを誘引する能力が含まれている。これ
らの特性については本明細用で捉示したデータに例示し
である。
本発明はまた。約８．０００ダルトンのほぼ同一の見か
け要素分子間で５ＤＳ−ＰＡＧＥ上に対として移る純粋
化された元のＭＩＰ−１の解決法に向けられている。Ｓ
Ｏ８の存在においてヒドロキシラバタイトにクロマトグ
ラフィーを使って２つの要素を成功裡に分離した。各要
素の部分的Ｎ−ターミナル・シーケンス分析は２つの蛋
白質がそのＮ−ターミナル・シーケンスにおいて極めて
類似し一部のアミノ酸の存在とイＸ装置に差があること
を明らかにした。特に、ＳＤＳ上の低分子吊バンドにχ
・１応する蛋白質（ここで：ｒＭＩｒ’−１αＪとＩＦ
　’Ｊる）は本発明２１）の第１４Δ図に示されたｎ１
分的なＮ−ターミナル・アミノ酸ジ−タンスをイｉし。
一方、Ｑ分子ｆｊ）バンド（ｒＭＩＰ−１β」と称する
）は第１４［３図に示されたＮ−ターミナル・シーケン
スを発生した。Ｍ［Ｐ１α及びＭＩＰ−１βに対するｃ
ＤＮＡはクローン処理され、各ベプｆ−ド廿索の完全な
アミノ酸シーケンスの予測を可能にし、Ｊ当ｃＤＮΔ及
び飽和アミノ酸シーケンス【よ各々第１０図及び第１５
図に表しである。
ＭＩＰ−１αに対するｃＤＮＡは７８８９の予測された
分子間で長さが６９個のアミノ酸の飽和蛋白質を予測し
ている。Ｎ−グリコシレージコンに対する見力１ｔＪの
箇所は存在しない。ＶＩＰ−１βに対するｃＤＮＡはこ
れも１８３２ダル１−ンの予測された分子間で長さが６
９個のアミノ酸の飽和蛋白！１を予測している。５３な
いし５５の位δに１つの潜在的なＮ−グリコシレージョ
ン箇所（Ａｓｎ−ｐｒｏ−３ｃｒ）が存在している。
先に説明した如くβ本発明の炎症性サイト１ン１ま侵入
性刺激材を伴なう如き材料で動物の細胞の刺激を行うこ
とが可能である。１ｈに、各種供給源から得ることが出
来る大食細胞のリンプルは米国特許用４，６１３．１０
６号に開示された神経細胞物質を作成するよう菌体内毒
素または１−リビノゾーマの如き刺激材料で培養可能で
ある。こうした培養は２０時間の時間にわたり発生出来
、正確な時間の限界は培養に対しで選択された特定の細
胞で変化する。
こうした培養に引続き、！！！体は元の神経ｗｉｎ物質
を含む表面浮遊物を除去すべく遠心分離作用により適当
な処理を受ける。神経細胞物質は次にフィルター処理ま
たは沈でｌυ処理を受ける。しかる復元の神経ＩＩＩ胞
物質は公知の一連の分離作用を受けそこで炎症性り゛イ
トキンを回収出来る。本発明は通常、適用可能であれば
公知の遺伝子役牛技法を含む炎症性サイトキンの準備を
行う別の手段で意図しており、従って１本発明はその範
囲内でこうした合成的準備を対争とする意図がある。
先に注記した如く１本発明にはまたβマウスで決定され
た如き以下に２載する且つ第１０図及び第１５図に示さ
れた飽和アミノ酸シーケンスを表示する先に注記した作
用と特性を組合せて提示づる。
本発明のサイトキンの純粋化されたベプブード要素の確
認も含まれている。
狡上旦ニュ旦 ＾［＾　ＰＲＯ丁ＹＲＧＬＹ　　ＡＬＡ　ＡＳＰ　　Ｔ
ＩＩＲＰＲＯＴＩＩＲ八ＬＡ　　ＣＹＳＣＹＳ　ＰＩＩ
Ｅ　ＳＩＲＴＹＲＳＥＲＡＲＧ　ＬＹＳ　ＩＬＥ　ＰＲ
Ｏ＾ＲＧ　ＧＬＮＰＩＩＥ　　ＩＬＥ　　ＶＡＬ　　Ａ
ＳＰ　　ＴＹＲＰＩＩＥ　　ＧＬｔｌ　　ＴＩＩＲＳＥ
ＲＳＥＲＬ［ＵＣＹＳ　ＳＥＲＧＬＮ　ＰＲＯＧＬＹ　
ＶＡＬ　ＩＬＥ　ＰＩＩＥ　ＬＥＵ　ＴＩＩＲＬＹＳ八
Ｒへ　　ＡＳＷ　　ＡＲＧ　　ＧＬＮ　　ＩＬＥ　　Ｃ
ＹＳ　　ＡＬＡ　　八ＳＰ　　ＳＥＲＬＹＳ　　ＧＬＵ
ＴＩＩＲｒＲＰ　　ＶＡＬ　　Ｇ１．Ｎ　　ＧＬｔＪ　
　ＴＹＲＩＬＥ　　ＴＩＩＲＡＳＰ　　Ｌｕ１ｌ　　Ｇ
１．ｌＩＬ［Ｕ　　ＡＳＮ　　ＡＬＡ ■ユ」ヒニ１旦 ＾１．＾　ＰＩＩＯＨＬＴ　Ｇ１．Ｙ　Ｓ［ＲＡＳＰ　
ＰＲＯＰＲＯＴＩＩＲＳＥＲＣＹＳＣＹＳ　　ＰＩＩＥ
　　Ｓ［ＲＴＹＲ丁１１ＲＳ［ＲＡＲＧ　　ＧＬＮ　　
Ｌ［Ｕ　　ｌｌｌ５　　八ＲＧＳ［ＲＰＩｌ［ＶＡＬ　
ＮＥＴ　ＡＳＰ　ＴＹＲＴＹＲＧＬＵ　ＴＩＩＲＳＥＲ
５Ｅ１１ｔｃｕ　ＣＹＳ　ＳＩＲＬＹＳ　ｐｎｏ＾ＬＡ
　ＶＡＬ　ＶＡＬ　ＰＩＩＥ　ＬＥＵ　ＴＩＩＲＬＹＳ
　　ＡＲＧ　　ＧＩＪ　　ＡＲＧ　　ＧＬＮ　　ＩＬＥ
　　ＣＹＳ　　ＡＬＡ　　ＡＳＮ　ＰＩＩＯ５ＩＲＧＬ
（Ｉ　ＰＲＯＴＲＰ　ＶＡＬ　ＴＩＩＲＧＬＵ　ｒＹＲ
ＨＥｒ　ＳＦｎ　ＡＳＰ　Ｌ［ｔｌＧＬＯＬＥＤ　　Ｍ
ＳＮ 先に述べた如＜、′＃ｇ述のシーケンスは公知の神経ｍ
胞囚子といずれにも何ら類似性を有しておらず、従って
本発明の炎症性サイトキンは顕著性のあることが確立さ
れる。前掲のアミノ酸シーケンスの最近の分離とＭＲＮ
Ａシーケンスの開発で慣用的な組替え遺伝子技術による
このサイトキンの再生が容易にされた。
本発明には更に本発明の炎症性サイドキンまたはこのサ
イトキンが影響を及ぼす作用を誘引するｌ力を基に突発
性または侵入性１１１ｍ材を確認する方法が含まれてい
る。特に、こうした刺激材は。
ヘパリンと結合し、好中球浸潤及び機能人道により局部
的ふくらみを誘引する神経細胞を誘引する能力により確
認出来且つ検出出来た。この点に関して例えばＲＡ　Ｗ
２Ｂ５．７　ｍ胞うインから得られた人＊ｍｉはυ１１
載として菌体内毒素、ノリバノゾーマ等といった多数の
公知の刺激材で接種出来。
一方、平行なＩｌｌ飽のサンプルが感染刺激材の所定の
位置から得られた材料の抽出物で接種出来た。
全てのサンプルは先に説明した方法に従ってその後培養
可能とされ、しかる後、これも定え付けされた分離技法
のシーケンスに従って処理され、そこで！、＋１６１１
サンプルと未知のサンプルから得られる結果的に生じた
分離体の試験を比較して炎症性り一イ］−↑ンがあれば
そのＩｍ５’！されたサイドキンか同一であるかまたは
類似しているかを決定出来た。
代替的に、炎症性サイトキンの改変されたＭＲＮＡレベ
ルは本川Ｉｌｌ　内で開示されたｃＤＮＡシーケンスを
使用する当技術で使用されている技法により検出出来た
。
同様の様式で、炎症性サイトキンを模倣し若しくは反作
用Ｊるのに有効な潜在的薬剤の集団検診用分析システム
を準備出来る。−例においては。
試験薬品は炎症性サイトキンの生産時に（の効果を決定
する目的から刺激された大食ｍ胞サンプルに投与出来る
。別の方法では、炎症性サイトキンは細胞試験システム
内に導入出来、この場合、サイトキンは活性があるとし
て知られており、予測される薬品はまた。同じＩＩＪＩ
培養液に導入出来。
こと１８養液はしかる侵予測薬品甲独の添加と比較して
炎症性サイトキンの作用上の変化または公知の炎症性サ
イトキンの添加される串の効果上の変化を見るため調査
可能である。
本発明はまた１本発明の炎症性ナイトキンの作用と存在
を測定することにより乳房内の刺激された自発的なまた
は突発性の病理学的状態の存在を決定する方法に関する
ものである。更に詳細には炎症性サイ１〜キンの作用は
サイ＋−ｔンの適当にラベル付けされた川の使用を通じ
て以後説明する集団検診技法で直接随時可能である。代
替的に、サイ１−１−ン番ま結合パートナ−または抗体
を発生させる目的に使用出来、抗体は逆に炎症性サイト
キンが内部に存在するか否かを示し、こうして媒体が取
り出された宿主の状態を評ｆＡする目的からラベル（＝
ｊけされ１１つ抗’Ｆｊｆｉの如き媒体内に導入可能で
ある。
従って、炎症性１ナイト４ン及びこのサイトキンに対し
発止可能な抗体（、を水ん化ホウ素・す１−リウムによ
る敢射竹添加、減少または放射性］−ド化によりラベル
付けされた炎症性（ノイドキンに対重る抗体を一例とし
て使用するレントゲン線免疫集団検診の如き免疫集団検
診を含む、各秤診所技法ど組合って使用可能である。
例丞的な免疫集団検診においては、炎症性サイトキン、
この抗体等のＫＡ　６０　但は酵素、特定の結合パート
ナ−及び／′または放射性元素で準備され且つラベル付
（Ｊがされ９次に、侵入を受けていると考えられている
乳房の血液サンプル内に導入可能とされる。ラベル付け
された８流またはこの結合バー１−１−がリンプル内の
位置で反応する機会を１！？だ後、結果的に生ずる質は
休は取り付けられたラベルのｔ１１質によって変化する
公知の技法により調査される。
アイソトープ１４　　１３１　　３　　１２５　　及び
Ｃ−１゛計　ｌ ３５ｓの如さ放射性ラベルが使用される場合には公知の
現在適用可能な４数方法を利用出来る。ラベルが酵素で
ある場合には現在利用されているカレリー・メートル、
スペクトロフォトメトリック。
螢光スペクトロフォトン１−リック又はヤスメ１−リッ
ク法等、当技術で知りえている任意の方払により達成可
能である。
本発明には炎症性り゛イトキンの存在する範囲をのＭ鶴
に分析する試験キットの形態になった状態で準備可能な
分析システムが含まれる。このシステムまたは試験キッ
トはラベルを炎症性サイトキンに接続する木用Ｉ１１山
で説明した放射性及び／または酵素技法のいずれか１つ
で準備されるラベル付番〕要素ニラベル付ｔノ要素、そ
の結合パートナ−決定される要素またはその結合パート
ナ−の１つと結合出来る少なくとも１つが自由配位子ま
たは固定配位子である１個以上の付加的な免疫化学試薬
を含むことが出来る。
別の実施態様においては本発明は炎症性サイト炎症性サ
イトキンーキンに対する抗体の作用に基ずさ、または同
じまたは拮抗作用を有するよう決定される他の薬剤また
は薬品に依存する一部の治療法に関するものである。第
１使用方法は、ふくらみ及び発熱といった乳房内の炎症
サイ１−キンの作用が表われるのを防止することにＩ！
ｌ連性があり。
ナイトキンに対する抗体、サイ１〜キンの発生及び／、
ｉたは作用を調整出来る薬剤、宿主内でのふくらみと発
熱といった状態と’ｈ’ＩＱを防止するのに有効な出を
以って個別にまたは相Ｈに混合した状態でサイトキンに
対する配位子７オタゴニストとして作用出来るサイトキ
ンに対する抗体でない薬剤を含む。
史に詳細には本明細書で仝体内に説明している治療方法
は炎症性サイトキンに対する抗体の有効ｍ、または本発
明の他の局面に従って準備され且つ使用される薬剤スク
リーニング分析により一例として開発される伯の同じ様
に有効な薬剤を含むことが出来る製薬成分の投与により
ふくらみ及び発熱を治療づる方法を含むことが出来よう
。この治療方法と別の実施態様は炎症性サイトキンの存
在と作用を最初に検出し、しかる後、適当な製薬成分を
投与することが含まれよう。
別の治療方法では量ナイトキンの炎を性作用、特に感染
の如き侵入性刺激に応答して好中球の運動及び移動性を
生じさせる能準を利用することを求めている。従って１
例えば１組織の外傷が生じた場合に進行する感染箇所に
投与する過通な組成に単繊出来る。こうした場合、炎症
性サイトキンは滅菌溶液の形態で準備され、洗浄流体の
一部としてまたはＩｙｊ薬組成において局処杼路と非杼
口軽路の投薬といった直接的投薬により外傷または像部
分に付けられる。通常、炎症晋ナイトキンは炎症性サイ
ト１ン自体に対する同じ様式及び同じ目的にて投薬に適
した製薬組成に公式化出来る公知の方法により同等に有
効な薬剤または薬品を発生させる目的で使用可能である
。
従って９本発明の主たる目的は乳房内の侵入刺激に対す
る宿主応答とｒ１１１連ある一部の特性と作用を呈する
純粋化された形態の炎症性サイトキンを提供することに
ある。
本発明の伯の目的は炎症性１ナイトキンの準備方を人を
提供づることにある。
本発明の他の目的は感染の如き刺激性、自発性または突
発性病理状態の存在が考えられる乳房内の炎症性サイト
キンの存在を検出する方法を提供することにある。
本発明の他の目的は乳房内の炎症性１ノ゛イトキンの作
用を模倣するかまたはマイナスの彰讐と戦うのに潜在的
に有効な薬品、薬剤等といった物質のスクリーニング方
法及び関連ある分析システムを提供することにある。
本発明の更に他の目的はこうした存在または作用の結論
を変えるべく炎症性サイトキンの聞または作用をｖ制御
する乳房の治療方法を提供することにある。
本発明の更に他の目的は刺激性、自発性または突発性病
理状態のマイナスの効果を治療し又は防止するよう炎症
性サイトキンの吊または作用を促進させる乳房治療方法
を提供することにある。
本発明の更に他の目的は炎症性サイ１−キン又はその結
合パートナ−を含むそれに基づき若しくは炎症性サイト
キンの作成を制即し又は炎症性サイトキンの作用を模倣
するか又はそれに逆う薬剤または薬品に基づく治療方法
で使用する製桑組成を提供することにある。
伯の諸口的と諸利点については以下と例示的図面を参照
することで以下に続く説明を検ｉ４　′！Ｊることから
当技術の熟知者には明らかとなろう。
本発明の主要局面において本発明はバクテリア。
ウィルス、一部の腫瘍、プＯｌ−シアの如き侵入性刺激
及び菌体内１ｒＪ素または突発性状態を特徴的に伴なう
本川１１：で説明した刺激剤の如き材料で刺激される大
食細胞または大食１１胞ライン内に存在しまたはそれに
より隠されることが判明している炎症性号イトキンまた
は大食ＩＩＩ胞炎症性蛋白質。
ＭＩＰ−１として以後説明する特徴の因子の分離と確認
に関するものである。本発明はまた。ＭＩＰ−１をその
成分ベブシド、ＭＩＰ−１α及びＭＩＰ−１βに分解す
ることに関する。米国特許用４．６０３，１０６号に開
示された神経細胞物質にｒＭ連して、前者の神経細胞物
質の要素として決定された本発明の炎１性サイトキンは
、刺激されたまたは自発性の病理状態における乳房と反
応を表わすふくらみといった一部の状態を乳房の組織内
に進撤させることが出来るようである。
特に、炎症性サイトキンは皮下投与時に多形核細胞浸潤
を特徴とする局部的炎症を誘引出来る。
また、サイトキンは侵入性刺激に対して乳房の宿主によ
り移動に含まれるサイトキンの１１９を表わす試論管内
の多形核細胞の機能六進を生ずる。本発明の炎症性ナイ
トキンによりもたらされる完全■つ正確な役割は不明瞭
であるが、先に確認された他の因子及び更に解決１べき
因子と関連付けてこのサイトキンは宿主の免疫システム
と他の肉体組織及び器官の閂の連絡システムの一部とし
て１能することが理論付けられている。
ヘパリンと結合する本発明の炎症性１ナイトキンの能力
はサイ！・キンがＦＧＦまたはＰＤＧＦの如き一部のヘ
パリン結合成茶因子に対応するとの考えを生ぜしめた。
然し乍ら、炎症性サイドキンか滑らかな筋肉ｌｌ１ｖｉ
に対して有糸分裂したいことを示すデータはこれら公知
の成長因子とは異なることを示唆している。従ってこの
時点で明らかなことは本発明のサイト１ンが刺激に対し
てと同様。
宿主の応答の一部分として知られている炎症性応答の進
展に参画することである。
先に示した如く１本発明の炎症性奢ナイトキンは約４．
６の等電位点（ｐｌ）を有する蛋白質を含むことが確認
されている。炎症性サイトキンは大略ａ、　ｏｏｏダル
トンのほぼ同一のサブユニツ！・分子ｆｌ’（を有する
対どして分館可能であり、以侵の事例に記載されている
分離状態に導いた調査の結渠により評価される如＜、２
Ｘ１０’ダルトン以上の各種分子間を右するマルヂマー
を形成出来る。これらの調査はまた。Ｎ−ターミナル・
ペプチド・シ−ケンスを確認し、しかる後、公知の遺伝
子衛生技法により開発されたフル・シーケンスが９本発
明の炎症性サイ１−ヤンの特定のペプチド・シーケンス
が他の公知の神Ｉ￥ｍ胞因子のシーケンスとは異＜ｒる
ことを確認している。従って５本発明の炎症性リイｌ−
２１−ンど先行技術の公知の神経細胞因子の間の構造上
及び機能上の相違点が事例で記載されたデータにより確
認された如く存在している。
史にｔｉｔ細には１本発明の炎症性サイトキンは先に概
説したものと関連して他の一部の特性を右しているので
、高塩分濃度１例えば大略０．７ＭにＪ３いてヘパリン
と結合出来る。本発明の炎症性サイ１−キンの別の特徴
は生理学的条件下で陰イオン性であることにある。この
１ノイドキンはまた。同化酵素リボプロティン・リパー
ゼ（ＬＰＬ）の抑止。
悪液質性／ＴＮＦ反応Ｌ９２９１［１胞の細胞応素性の
発生、菌体内湾未抵抗Ｃ３Ｈ／　ｌ−１ｅ　Ｊ酵素の芽
胞生殖の刺激または一次ブオグリコール酸塩投与マウス
大食細胞による悪液質性／ＴＮＦの発生を誘引すること
が出来ない点が欠けるこれらの作用において顕著性があ
る。これら後名の作用は全て一般的特徴と作用でこれら
を刺激に対する宿主の反応に関’５−４るものとして確
認した他の公知の大食細Ｉ１１誘尋神経ｍ胞囚子により
分割されたものである。これは従って本発明の炎症性サ
イトキンを公知の因子とＬＬ異なるものどじ２本明細書
に示されたＣＤ　Ｎ　Ａ及び蛋白質とシーケンス・デー
タと関連して本発明の炎症性サイ１−ンキが実際に他の
大食細胞誘導神経細胞因子とは異なることを確認してい
る。
本発明による炎症性り゛イトニ１ンは本明細２１の事例
にて記載された如くマ・クス内で分離され１分析された
。事例で記載した実験の完了後に行われた炎症性サイト
↑ンの顕著なポリペプチドに対するメツセージのクロー
ニングとｃＤＮＡのシーケンシングの別の研究結果、ペ
プチドのＭ　Ｉ　Ｐ−１α及びＭＩＰ−１βの完全なシ
ーケンスが解明され。
それらのシーケンスについて各々本明細内の第１０図及
び第１５図に表わしである。従って精製された炎症性蛋
白質が各々６９のアミノ酸の２個のシーケンスにより定
められることが決定された。
（：　Ｄ　Ｎ　Ａライブラリーが菌体内Ｉｔ胞刺激ＲΔ
Ｗ２６４１細胞から準備され、ＶＩＰ−１の：「主要」
部分Ｎ−ターミブル・アミノ酸シーケンスを基に２周の
合成多形核プールを使ってスクリーン処理された。こう
してりしｌ−ン処理されたＣＤＮＡは現在Ｍ　ｆ　Ｐ　
−１αとして知られでいるペプチド鎖に対応して示しで
ある。Ｍ　Ｉ　Ｐ　−１βに対するＣＤＮＡは回（、に
の方法を使ってクローン処理されたが、使用されろ多形
核プールは７個のアミノ酸残１、（の３個がＭ　Ｉ　Ｉ
）−１αのり・１応する残基と異なっている分子の一部
分からＫＩＪられた。
ＭＩＰ−１αに対りるＣＤＮＡは予測される分子１＋１
７８８９を有り−る長さが６９個のアミノ酸の飽和蛋白
？＋Ｔを予測している。Ｎ−グリコシレージョンにχ・
１する児かｔノの箇所は存在しない。ＭＩＰ−１βに対
するＣＤＮＡｌ、ｔ　Ｉりニア５３−５５において１つ
の潜在的Ｎ−グリコシレージコン箇所（Δｓ　ｎ−ｐ　
ｒｏ−３ｅｒ）が存在する予測された分子い１８３２ダ
ル１−ンをイ」する長さが６９個のアミノ酸の飽和蛋白
１１も予測している。ＭＩＰ−１βはＭ　Ｉ　Ｐ　−１
αより僅かに人さい分子としてＳ　ＯＳ　−Ｐ　Ａ　Ｇ
　Ｅ　Ｊ−に移ｅ−するので、これがグリコシレート化
されることが出来る。Ｎ結合されたグリコレ−ジョンに
対するΔ５ｎ−Ｘ−８ｅｒ、７ｈｒ信号内の位置Ｘにお
けるプロリンは結果的にその箇所において！ｊえられれ
るまたは与えられたいグリコシレージコンにないことが
知られている。これは後者グリコシレート化される場合
ＭＩＰ−１αとＭＪＰ１βの間の分子場の差が比較的小
さいことによる。
この開示された蛋白質の紺替え形態を表わ１め現在実験
が行われている。マ・クスのＭＩＰ−１はヒトの好中球
に作用するので、ヒ１−の炎症性）ノイトヤンＭ　ｌ−
Ｉ　Ｐ　−１はおそらくマウスのＭＩＰ−１に類似して
いる。木用１［１１で開示された如く炎症Ｆ１１ナイト
キンのこの作用は好中球を、該当箇所に与えるのを促進
するため組織の感染箇所に炎症性４ノイｌ−ＦンをＩＱ
与づることで組込むことが出来る。
炎症性１ｙイｉ〜キンの遺伝子再生には当技術で良く知
られている組峙え技術の多くの一般的原理が含まれてお
り、従って、こうした技術と詳細な定義は不必要である
と思われるので９本明細力では示されていない。然し乍
ら１本発明は公知の組替え技術も使って本発明の炎症性
サイトキンの準備特に第１０図及び第１５図に記載され
たアミノ酸シーケンスを右づる材料を処理する。炎症性
号イトキンの準備については本明細力の先の方でｆｌ！
Ｉｌｉに説明されたが、これは侵入性刺激の如き刺ｆａ
月利で各種細胞の任意の細胞を培ａ開始することにより
２つの局面にて実施出来ることが確認されている。
特に、細胞ラインＲＡＷ２６４．７は炎症性サイトキン
を分類出来る神経細胞物質の生成を開始する目的に利用
可能である。ネズミ大食細胞ラインＲＡＷ　２６４．７
は分析と精製を可能にするのに充分な吊にて炎症性サイ
トキンの分離を容易にした。通常。
炎症性サイトキンがしかる後分離される材料（神経細胞
物質）または炎症性サイドキン及びその構成ペプチドを
発生さぜる他の細胞ラインまたは他の供給源は水用１１
１Ｆｊで意図されており９本発明は従って制限されない
。従って、遺伝子再生といった別の手段は本用細店では
本発明に従って意図されている。
先に説明した如く、炎症性サイトキン、その成分たるペ
プチド、（の結合バーＩ−ナーまたはサイトキンに擬病
または拮抗作用を与えるかまたはその生成を制御する他
の配位子または薬剤は組Ｊ１感染または他の病理的配列
無秩序と治療のためのこれらの疾病とある患者に各種手
段によって投与づるのに有効な適当なキャリアーど強度
で製薬組成にてｒＩ！備出来る。各種投与技法が利用可
能であり。
その中で、軟青内にまたは手術用及び１手術用スポンジ
、包帯、ガーＵ、パッド等と如き他の局処的添剛物上と
いった局処的付与がある。また、こうした組成は１体の
負傷領域、カテーテル挿入術等の如き部分を洗浄するの
に使用される洗浄流体を送出することを含む皮Ｆ投与、
静脈内投与及び腹膜腔内投与といった非経口技法により
投与出来る。炎症性サイトキン及び／または前述した関
係ある薬剤と平均量が変化出来、特に、有資格医師また
はベテランの推薦及び予測を基にすべきである。
前述し且つ先に示した如く、炎症性ナイトキンの作成と
作用を調１する抗体及び薬品番よ成る治療適用を有する
ことが出来ｎつ従って炎症及び発熱といった炎症性サイ
＋−１−ンの作用に貢献し得る効果を処理する目的で利
用可能である。特に、炎症性サイ］−キンは１例えば、
溶解したマウスひ臓すンパ！／ａ胞及び骨髄細胞腫を利
用する混成技法といった公知の技法により各種乳房内に
抗体自体を作り出す目的で使用出来る。従って、結果的
に生ずる抗体は適当なりＪ薬組成にて準備出来、望まし
くない状ｆ＆を防いだりまたは処理するため投り出来る
。こうした製薬成分を考慮に入れている投与の正確なｍ
、投与間隔及び投与方法は医療技術で公知の内容に従っ
て変化しｎつ有資格医師またはベテランの特定の処方に
従って変化する。
本発明はまた１本発明の炎症性サイトキンによりｙｅｇ
を受ける作用を引き出す能力を参照して侵入性刺激の存
在を決定する方法を含む各種診所適用に圓するものであ
る。先に述べた如く、炎症性脅ナイトキンは各種公知の
技法により抗体自体を作成する目的で使用出来、こうし
た抗体は疑わしい乳房内に炎症性サイトキンの存在を試
験する際に利用出来且つ利用出来る。
炎症性り゛イトキンのペプチドに対する抗体は良く知ら
れている国威技法を含む標準的方法により作り出され１
つ分離される。便宜上、炎症性サイ１〜キンに対する抗
体は本川ｍ−ｓではＢ　ｂ　ｉと称し。
他の種にて作り出された抗体はＡｂ２と称する。
乳房内での炎症性サイドキン作用の存在はこうした決定
に適用可能な通常の病理学的方法により確認出来る。多
数の有用な方法が知られている。
待にイｉ用なこうした３種類の方法では検出可能ラベル
にてラベル付けされた炎症性サイ１−キン、検出可能ラ
ベルが付けられた抗体△ｂ１または検出可能ラベルが付
けられた抗体Ａ　ｂ　２を利用している。これらの方法
はアスタリスクが粒子にラベル付けされたことを示し、
ｒｃｙｔＪが炎症性サイトキンを表わしている以下の式
にて要約出来る。
Ａ　　Ｃｙ　ｔ　：ｌ：　＋　Ａ　ｂ　１＝　Ｇ　ｙ　
ｔ　：ｋ　Ａ　ｂ　１ｎ　　Ｃｙ　ｔ　　＋　Ａ　ｂ　
＊　＝　Ｃｙ　ｔ　Ａ　ｂ　１＊ＣＣｙｔ　　＋△ｂ　
＋Ａｂ２＊ −ＣｙｔＡｂ１Ａｂ２＊ 方法及びその適用については全て当技術の熟知省には４
【じみであり、水用ｍ占には例示的なものとして示され
２本発明の範囲内で利用出来る方法を制限しない乙ので
ある。「競合する」方法である方法へは米国特許用３，
６５４，０８０号及び同第３、７５０．６５２　号に述
べられている。「リンドイッヂ」法である方法Ｃは米国
特許用３１，００６号及び同第４．０１６，０４３号に
述べである。「ダブル抗体」またはｒｃＡｓＰＪ法でい
った伯の方法が知られている。
各事例において、炎症性サイトキンは１個以上の抗体ま
たは結合パートナ−と共に複合体を形成しこの複合体の
１つの要素に検出可能ラベルが付けられる。７０合体が
形成され、所望ならばその砧はラベルの検出に適用可能
な公知の方法により決定出来る。
Ａｂ　　の特性ｔよＡｂ１と反応する点にあることが前
１８の内容から叩解されよう。これ１．！成る乳房種内
にて成育した抗体がＡ　ｂ　２の如き抗体を生育させる
抗原として他の種内にて使用されたことによる。例えば
、Ａｂ２は抗原として兎の抗体を使用している羊肉で生
育出来る。従って５△ｂ２は羊肉で生ｒＹされる杭用抗
体となる。この説明と特許請求の範囲のＩ］内的上　Ａ
　ｂ　２は一次または抗炎症性［ナイト−１ンと称し、
Ａｂ２は二次または抗Ｂｂ１抗体と称する。
これらの研究に対し最す言過に採用されるラベル＋、１
１１１射性元素、酵素、紫外線に露された際螢光を発す
る薬品及び他のらのである。
多数の螢光材料が知られており、ラベルとして使用出来
る。これらには例えばムルオレシン、ロザミン及びアラ
ラミンが含まれる。特別の検出材料は、羊肉で準備され
てイソチオシアン８１１塩を通じてフルＡレシンと結合
する杭用抗体である。
炎症性サイトキンのペプチドまたはその結合パートナ−
は放射性元素または酵素をラベル付けすることも出来る
。放射性ラベルは現在利用可能な計数方法のいずれかの
方法で検出出来る。好ましいアイソトープは１４　　２
３１　　３　　　１２５　　及Ｃ′　　　Ｉ゛　１１＝
　　　　１ び３５ｓから選択出来る。
酵素ラベルも同様に有用であり、これは現在利用される
比色計法１分光光度計法、！ｒ！光分光光度計法または
ガスＦｌｊｌ法のいずれかにより検出出来る。ＭＲは、
カルポジ・イミド、ジイソシアネート、グルタアルデヒ
ゾ答どいった架橋分子との反応にＪ：りその選択された
粒子と結合される。それらの方法において使用出来る多
くの酵素が知られてＪｊす、利用可能である。好適なも
のは、ベルＡＶシダーズ、β−グルクロニダーゼ、β−
Ｄ−グルコシダーピ、β−Ｄ−ヤラクトシダーぜ、ウレ
アーゼ、グルコース、オキシダーゼ・プラス・ベロオキ
シダーぜ及びアルカリン・フォスフ？ターピである。別
のラベル付け４４ＦＩと方法を開示するため一例として
米国特許用３．６５４．０９０号：＠第３、８５０．７
５２号及び同第４，０１６，０４３号を参照する。
本発明に従って開発され且つ利用される特？１の分析シ
ステムは受容体分析として知られている。
受容体分析の場合１分析づべき材料に適当なラベル付け
がされ２次にラベル付けされた材料とラベル付けされな
い材料両者の成る出により成る細胞試験コロニーが培養
され、しかる後、そのラベル付けされた材料がｌｌｌ１
胞受容体に結合する度合を決定ずべく結合研究が行われ
る。この様にして。
両方とｕｙｉ同志の適合性の違いが確認出来る。
従って、炎症性サイトキンの成る精製された１が放射性
ラベル付けをされ、しかる後１例えば最近分化された好
中球を使って結合研究が実施されよう。次に、ラベル付
けされた炎症性１ノイドキンとラベル付けされない炎症
性サイト４：ンの各種石を含有する溶液が準備され１次
に未知サンプルが接種され、しかる侵培養される。次に
、結果的に生ずる細胞の中隔が洗浄され、溶解され１次
に。
５％の標準誤差を生むような充分な時間長さにわたって
ガンマ計数お内で計数される。これらのデータは次にス
カツチＶ−ド分析を受け、しかる後月料の作用に関する
ｔ１２察と結論を引き出すことが出来る。前掲のプロト
コルは例示的なものであるが、これは分析される材料の
ＩＩＩｒｃ１結合能力が顕箸な特性として作用出来る場
合に受容体分析を実施出来且つ利用出来る様式を例示し
ている。
本発明の別の実施態様においては、疑わしい乳房内での
炎症性サイトキンの存在または不在を決定する目的から
医療専門家による使用に適した商用試験キットが準備出
来る。例えば、こうしたキットの成る種類には炎症性サ
イトキンまたはその結合パートナ−から選択された例え
ばそれに固有の抗体等選択された成るラベルの付けられ
る要素及び勿論、＠えば１８合する」、「サンドイツヂ
Ｊ、ｒｃＡＲＰＪ等の各方法から選択された方法に従っ
ての処方が少なくとも含まれよう。これらのキットには
また。バッファー、安定浸潤といった周辺と配位子も含
まれよう。
従って、Ｆ！Ｉ人性刺激に対する乳房宿主の反応を示す
目的から （ａ）本発明の炎症性サイトキンまたはこの特定の結合
パートナ−を検出可能ラベルに直接的または間接的に付
けることにより得られる少なくとも１つのラベル（４け
された免疫化学的に反応する成分の所定の吊； （ｂ）他の配位子： （Ｃ）前記キットの使用指示 から成る試験キットを準備出来る。
更に詳細には１診所用試験キットは。
（ａ）一般に免疫溶剤を作成ずべく固体相に限定されま
たは別の方式で各々適当なタグまたは複数個とこうした
最ｎｌ！！品等（またはその結合パートナ−）に限定さ
れた＠述の如き炎症性サイトキン（または結合パートナ
−）、の既知ｍ；（１））必要があれば、他の配位子：
及び（Ｃ）前記試験キットの使用指示 を含むことが出来る。
別の改変例においては、所定のプロトコルに従って作動
する（例えば、「競合」、ｒサンドイッヂＪ、「ダブル
抗体Ｊ等）前述した目的のため準備され且つ使用出来る
試験キットが。
（ａ）炎症性サイトキンを検出可能ラベルに結合するこ
とで得られたラベル付けされる要素：（ｂ）（１）ラベ
ル付けされた要素（ａ）と結合出来る配位子； （１）ラベル付けされた要素、ａ）の結合パートナ−と
結合出来る配位子； （ｉ）決定すべき要素の少なくとも１つの要素と結合出
来る配位子； （ｌｖ）決定すべき要素と少なくとも１つの要素の結合
パートナ−の少な（とも１つのパートナ−と結合出来る
配位子；及び から成るグループから選択される配位子また番よ固定配
位子を少なくとも１つの試薬としている１種以上の付加
的な免疫化学的試薬；及び（Ｃ）炎症性り”イトキンと
この特定の結合パートナ−の間の免疫化学的反応の１梯
以上の成分の検出及び／または決定に対するプロトコル
の性能に関する指示 かう成っている。
前掲の内容によれば、炎症性サイトキンの合成。
リリースまたは作用を調整するのに有効な潜在的薬剤を
スクリーニングする分析システムら準備出来る。第１ｆ
ｉ法においては、炎症性サイトキンの生成に際し試ｌｊ
Ｉ薬剤の効果を決定する目的からこれを刺激された大食
ａ胞シンプルに投与出来た。
別の方法においては、炎症性サイトキンは好中球の如き
ＨＪ胞試験システム内に導入出来、予想される薬剤はま
たｍ胞培孜液内に尋人出来、その培養液はしかる侵、こ
の予想される薬剤単独の追加からまたは既知炎症サイ１
−４；ンの追加量の効果から生ずる炎症性サイトキンの
作用上の変化を１１２ｒＸすべく調べることが出来る。
第８Δ図及び第８Ｂ図に示された飽和アミノ酸シーケン
スは本発明で有用な蛋白質の例示的なものに過ぎず、第
８Ａ図及び第８Ｂ図に記載されたものと比較して実質上
向等または改変された作用をａする同様のシーケンスも
こうした蛋白質となる。これらの改変例は１例えば、箇
所指示された突然変異を通じて得られる改変の如く考え
られ。
またはＶＩＰ−１方ｒｋである宿主内の突然変異を通じ
て得られる改変は不慮のものである。先に定めた如＜、
ＶＩＰ−１同様の作用が保持される限り、これらの改変
は全て１本発明に含まれる。従って１本川ｔＩＡｔＩＪ
で使用されているＭＨＰ−１と「炎症性リーイｌ−キン
ｊという用語の定義は第７Δ図及び第８Ｂ図に個別にま
たは組合って示されたものと実？２　［’￥　Ｌいアミ
、／酸シーケンスを有するベプヂド要素を備えた蛋白７
１を特に含む。
同様に、「刺激性」という用語とその複数形は負１ｆｌ
に起因する状態と同様感染といった刺激性事や及び例え
ば１ＩＡＩＩｌ性または新陳代用異常または他の原因に
よる突発性または自発性状態に適用される。
先に示した如く、以下の事例は１本発明の炎症性サイト
キンの分類と確認１本発明の炎症性サイドキンと本出願
人及び当技術の他者により先に確認された因子の間の作
用上と相違点と類似点を定めている作用について注記し
たＩＱ察内容の詳細を記載している。通常、以侵説明す
る特定の材料と技法は例示的に過ぎず、変わり得るので
以下の内容は例示的なものとし本発明を制限しないもの
である。
Ｘ蓋１ 本発明の炎症性サイトキンを確認し１つ更に特徴付ける
目的で以下の実験が実施された。最初。
神＃Ｖ細胞物質がｉ、ｉ　？ｉされ、炎症性サイト４−
ンが分１１１１され１次にその構造が決定され、しかる
債、その作用を明らかにし、可能であれば他の公知の大
食細胞誘導因子による確認をする努力において試験のバ
ッテリーが行われた。
庄仕立り韮 ■　カリフォルニア州１メリービルのヂャイロン社から
精製組替えヒト悪液質性／ＴＮＦを入手した。精製され
た組合えヒトＩＬ−１αはＰ・ロメデウコ博士（ホフマ
ン・うａツチェ、ナットレ、ニューシャーシー州）の気
前の良い１竺フトであった。薬品は全て商業的供給者か
ら入手出来る最高級のものであった。
＠３１　　Ｃ３１−１／ＨｅＪマウスはチャールズ・リ
バー（キングストン、ニューヨーク）から入手した。
菌体内毒素抵抗０３　）１／Ｈｅ　Ｊひずみを持つマウ
スをジャクソン・ラボラトリーズ（バー・ハーバ−、Ｍ
Ｅ）から入手した。
監庭且ｌ遣　マウス大食細胞ラインＲＡ　Ｗ２Ｂ５．７
及び悪液質性／ＴＮＦ反応細胞ラインＬ９２９をアメリ
カン・タイプ培養液コワクション（ロックビル、１Ｖｔ
Ｄ）から入手し、各々ＲＰＭ　１１６４０またはダルデ
ッコの改変ＭＥＭ　（（ＤＭＥＭ）Ｇ　Ｉ　ＢＣＯ，グ
ランドアイランド、ＮＹ）内に維持した。
両方の媒体には２０ｍ　Ｍへパス及び１０％へタルボビ
ン抗市素（ナイフ［１−ン、ローガン、ＬＪＴ）を補填
した。縛激を受けるＲ　Ａ　Ｗ２Ｂ５．７表面浮遊物の
作成のため、［ＩＩｌをそれが流動１Ｊる迄ＲＰＭＩプ
レス１０％のへタルボビン抗毒素内の１５００ｍ＋組織
培酋液皿（ファルコン）那で成長させた。ｍ＋ｍをバン
クの残留塩分溶液内で５回洗浄し、培体をリボポリサツ
カリド（＋−ＰＳＷ、Ｅ・コリ０１２７　：　１３８、
ディスコ、デトロイト、Ｍｌ）の１μｇ／ｍ１を補填し
た抗毒素の無いｌ”（ＰＭと置換した。
細胞を３１℃にて１６−１８時間培養し２表面浮遊物を
０．２２μｍのフィルターでフィルター処理した。
Ｍ　Ｉ　Ｐユニｍ　　表面浮遊物の神経ＩＩＩ胞物質１
にたいし５リツトルを１０，０００ダルトン分子損のキ
テトオフを有づるＤＣ２中空ファイバー濃縮化システム
（アミコン社、レキシントン、ＭＡ）内で１６−４０倍
に濃縮し、同一装置を使って２０ｍＭトリス・バッファ
ー、ｐｔ−＋ａ。０の６リツトルに対しフィルター処理
した。エフチルヨリコサイドを濃縮化され付加された表
面浮遊物に１％（Ｗ／Ｖ）の最終濃度迄加え、混合物を
２０ｍＭ１〜リス・バッファー、ｐｔ−１８，０で従前
に平衡化された七ノＱ１０／１０〔陰イオン交換（〕〕
？−マシ７２０−ウエイＮ　、Ｊ　”）　）に適用し、
Ｉ３速蛋白７１液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ，）
？−マシア）装置に接続した。溶離のため同じピッファ
ー内でＯｃｍいし１ＭＮａＣＩの１１４ｍ１（総容積）
の直線状勾配（及び２ｍ１／分の流偵）を使用した。
各部分のサンプルを還元状態下において１０−１５％ま
たは一１８％直線状勾配スラグ・ゲル内にドデシル硫化
物す１−リウム（ＳＯ８−ＰＡＧＥ＞を含有する変性シ
ステム内のポリアクリルアミドゲル電気泳動に露した。
分子ＦＲ１３準（［３ＲＬ社、ベツフイーダ、ＭＤ）を
平行して使用した。ＭＩＰ−１を含有する部分が悪液質
性／ＴＮＦと同じ領域内で溶離し、大略８０００と分子
性の特性対として容易に認識された。
（ＳＤＳ−ＫＡＧＥ及び銀色シミとして評価される）部
分を含むピークのＭｒｐ−１がプールされ、濃縮され、
　１００　ｍＭ酢酸アンモニアで従前に平衡化された高
性能ゲルろ過カラム（スーパーローズ１２：ファーマシ
ア）上で分留された。ＶＩＰ−１がカラムの空隙容積内
に回収されＮＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀色シミで判定すると
ｌ＠度８５％以上であった。この様にして精製されたＶ
ＩＰ−１は大略０．２ｎｇ　ＬＰＳ／μｇ　ＶＩＰ−１
を含有した。
ヘパ言゛　　ロマ　　−フィー　ヘパリンと結合するＶ
ＩＰ−１の能力も分析するためヘパリン活用セファロー
ズ（ファーマシア）を使用した。ゲル８ｍｌを充填した
Ｃ　／　１０２０カラム（ファーマシア）をＦＰＬＣＩ
ｉｆｉに付け、　２０ｍＭ、　トＩＪス。
ｐＨ８，０で平衡化した。１２倍に濃縮しフィルター処
理したＲＡＷ２Ｇ４．７　　表面浮遊物（前と同様）の
２ｍｌをカムラに適用し、同じバッファー内にＯないし
２Ｍ　　Ｎａ１ｌの直線状勾配をｒＢｌｌＩＩのため使
用した。
クロマトツー−力゛１シン　　モノＱクロマトグラフィ
ーからの部分を含むビークＭｒｐ−ｉの８μ９が２５ｍ
Ｍビス／トリス］・１０％ビテイン（Ｗ／Ｖ）、１）８
７．１内で平衡化され、同じバッファー内で従前に平衡
化されたモノＰカムラに適用された。蛋白質が１０％の
ビテイン（ｐＨ４，０）を有するポリバッファー１４（
ファーマシア）二用蒸溜水ｉ：１０）の直線状勾配でＷ
ＩｌｌｌｌＬ、た。結果的に７にだいし４の降下するｐ
Ｈ勾配が得られた。
ｉ１１！Ｌｌ［標準的なものとしてＢＳＡ　（バイオラ
ンド、リッチモンド、ＣＡ）を使用する分析装置（ブラ
ッドフォード、Ｍ、ＡＮＡＬ、８１０Ｇ＋−１，７２：
２４８−２５４　　（１９７６年））により蛋白質含有
量を測定した。
直生丘亙皇史亙　メーカー側の指示に従ってクロ〔ジェ
ニック・リミダス分析（ホワイトテーカ−Ｍ、Ａ、バイ
オ・プロダクツ、ウォーカーズヒルＭ）を使用して決定
した。
？　　、シーノンシンｔ　ロックフェラー大学蛋白質シ
ーケンシング設備を使って精製ＶＩＰ−１をシーケンス
処理した。コンピューター中プログラムｄ−ＦＡＳＴ−
Ｐを使って均質なアミノ酸シーケンスを求めてデイホフ
蛋白質シーケンス・バンクを調査した。
１　　　　　　　　　多形核白血球（ＰＭＮ）浸ｍがグ
５ンシタイン、Ｒ，Ｄ、等、Ｊ−ＯＬＩＮ・ＩＮＶＥＳ
Ｔ・７７　：　１０２０−１０２７　（１９８６年）に
よりフートバッド投与を利用して評価された。要約する
と、雌のＣ３Ｈ／ＨｅＪｖウス（６−１２３！１問）を
フエノバルビタール（２５ｍ９７に９体重１−ｐ）で軽
く麻酔した。ｔｏ−１０モルＮ−７オルミルメチオニル
ロイシルフエニルアラニン（ｆ’ＭＬＰ）を含有するＯ
、ｏｓｍ　Ｉの皮下フットバッド投与：組替えヒトＩＬ
−１α組特えヒ１−悪法質性／ＴＮＦの１０．１００又
は１０００ｎ　’Ｊ　：又は０．１％のフエタールボピ
ン抗ＩＮを有するＩｔ　ＰＭ　１１６４０内のマウスＭ
ＩＰ−１．前と同様精製）の１゜１０，１００又ハ１１
０００ｎを受取るよう動物をランダムにした。０．１％
のフエタルボビン抗毒素を有するＲ　Ｐ　Ｍ　１１６４
０１独で制御体として作用した。多くの場合マウスは片
方の足の裏に試験物質を受入れ、対向する横の足に１ｌ
ＩｌｔｌＤ体キャリアーを受入れた。他の場合にはラン
ダム化されたブロック・デザインが採用された。
マウスは投与に引続き４詩間拷問を受け、４肢が１０％
バッファー・ホルマリン内に固定された。４肢が石灰質
除去され、パラフィン内に埋設され。
足の実の簿い部分がヘマトキシリンとイオジンで汚され
た。
試験−ＰＭＮ　ｅ　　　ヘパリン処理された静脈内を健
康なボランティアから入手した。細度分析により判定さ
れた９５％ＰＭＮ以上を含有する白血球がヌイコルーハ
イペーク密度勾配遠心及びデクストラン沈澱により分離
された（クレンブナーＭＳ等、Ｊ、ＣＬＩＮ、ＩＮＶＥ
ＳＴ　　６４：９６Ｑ〜１００２　（１９７４年））。
残留エリスロサイトがヒボトニック・サリンと共にセイ
シスで除去された。
ｌＩＩ胞はゲイの残留塩分溶液（Ｇ［３ＳＳ、　ｐＨ７
，４）及び２％ボビン抗７ｕ素フルブミン（ＢＳＡ）内
に−ｒ２．！＋Ｘ１０６細胞／ｍｌの最終温度迄再懸濁
されＩζ。
試験管内機能ＩＬ進がボイデンの説明した技法（ボイデ
ン、Ｓ、Ｖ、Ｊ、ＥＸＰ、ＭＥＤ、８５　：３５３−４
６６　　（１９６２年））の改変を使って分析された。
めくら容器室の底壁には試験化合物叩ちｆ’ＭＬ　ｌ）
　（１０’Ｍ）　、　Ｖ　Ｉ　Ｐ−１またはバッファ単
独を含有づるダツフ７−の２５μｍが充填され上部容器
には１．Ｉ　ＸＩＯ’　ＰＭＮを含有１１るＧ［３ＳＳ
／ＢＲＡの３５μｍが充填された。２個と容器は孔寸法
が３μｍのセルロース・ナイトレート膜て分離された。
（ＳＭ　　１１３０２．サルトリアス、ウェストベリー
、ＣＴ）室は湿気を与えた５％Ｇ　Ｏ２〜９５７内空気
室内で４５分間、３７℃にて培養された。ｒｐＩ述した
プロトコルに従って膜を除去し、汚染した。
（ヘッセ、Ｄ、Ｇ、等、Ｊ、ＣＬＩＮ、１ＮＶＥＳ　Ｔ
　、　７３　：　１０７８−１０８５　（１９８４年）
）股肉に移動するＰＭＮの個数が白１ｊＪ　Ａブトマッ
クス・イメージング・システム（Ａブトマックス社、ポ
リス、ＮＨ）を使って１３０μＭ迄各１０μＭ旬にｉｌ
数された。
金膜に対し移ｖＪが３個のランザムに選択されたフィル
ドにて数量化され各サンプルが３回試験された。ＧＢＳ
Ｓｉｔ独（０％）及Ｕ正（１）　ｆ　Ｍ　Ｌ　ＰｉＪｌ
ｔｌｌｌ（１００％）と対比的にＩｆｆ／ＩＩ−八進が
（％で表わされた）股肉へ移動された平均距離として定
められた。
機能人選データはＩＩＩＩｔ１１１機能八進応答の％（
人選±平均（ＳＥＭ）の標準誤差）として表わされる。
ＨＩ　Ｐ　−１に対する応答を室の帝壁内のＲＢＳＳ単
独のものに対するものと比較するため変数の一方分析（
八ＮＯＶ△）が使用された。
’　　　　　　１１−スの　　　固有のヒトＰＭＮ又は
七ノサイトからＨ２Ｏ２のリリースを刺激するＶＩＰ−
１の能力が最近詳細に述べられた方法で試験された（Ｎ
ａｔｈａｎ、ｃ、ｔ’：、１９８７年、ＪＣＬＡＮ、Ｉ
ＮＶＥＳＴ（ｉｎ　　ｐｒｅｓｓ））要約すると、ＰＭ
Ｎとヘパリン処理又はクエン酸塩処理した血液内の単細
胞白血球がノイトロフイル・アイソレーション・メディ
アム（バラカード・インスツルメント社、ドーナーズ・
グローブ。
ＩＬ）内で分離され、洗浄され、フエタル・ボビン抗応
索が従前に被覆され過剰に洗浄された底部がＷらな直径
６ｍのポリツチレン組織培蓬溶液鼎内で容おあたり１．
５　ＸＩＯＰＭＮ又は２Ｘ１０５単＋ｉ　ｍ　ｍにて別
々にプレート処理された。分析８合物は２．４ｎＭスコ
ボレデイン、０．５μ９ホースラｆイッシトペローＦシ
ダース、１ｍ１ｙｊアジド・ナトリウム及び指示試薬を
３７℃にてグルコースを右づるクレブス・リンガ−リン
酸塩バッファーの０１３ｍ１の最終容積内に含有した。
１４２０２による酸化に起因するスコボレテインの螢光
性の損失がプレート読取り螢光針内に１５分又は３０分
の開隔にて記録されマイクロ・コンピューターによりｎ
　Ｍ　　ｌ−１２０２に変換された（デ・う・バルブ。
Ｊ等、Ｊ、　　ＩＭＭＵＮ、ＭＥＴＨＯＤＳ７８：３２
３　　：３３６　　（１９８５年）） −Ｉ　　　　　　　　　　Ｆバイオ　　　先に説明した
如くフイトヘマグリチニンの適量存在下にて芽胞生殖を
行うようＣ３Ｈ／　ｌ−１ｅ　Ｊ　ｌ素を刺激する能力
によりＩＬ−１作用に対しＶＩＰ−１が分析された。（
′Ｅルドウォーター、Ｌ、Ｌ等Ｊ。
ＩＭＭＵＮ、　１３８　　：４２７０−３２７４（１９
８７年）　）悪液質性／ＴＮＦ作用がアクヂノマイシン
Ｄ処理されたＬ９２９マウスｎＭｒｆｉ！ａ！Ｙａを殺
す能力によって分析された。〔オクトローブ、ＪＭ、等
αＰＲＯＣ，ＳＯＣ，ＥＸＰ、Ｂ　ＩＯＬ、ＭＥＤ。
１６０　　：　３５４−３５８　　（１９７９年））、
１μ！Ｆ／ｍｌアクチノマイシンＤを含有しＶＩＰ−１
の増量を図るＤＭＥ媒体内の８６ウエル・プレート（フ
ァルコン）の各ウェル内に大略５０．０００の１９２９
１８胞がプレート処理された。１４−１６時間後１色原
体（３−（４，５−ジメチルチアゾール２−Ｙｌ）−２
，５〜ジフエニルテトラゾリユム・ブ［Ｊマイト（Ｍｌ
Ｔ））が添加され、細胞は更に４時間培養された。
公知の方法（モスマンＴ、Ｊ、ＩＭＭＵＮ、Ｍｌ三ＴＨ
ＯＤＳ　　６５：５５−［３３（１９８５年））ノａ２
ニＪ：りこの時間中に色原体を低減化するようｍ胞の能
力により細胞の生活能力が評価された。、媒体が吸引さ
れ、細胞がイソプロパツール内で０．０４Ｎ塩化水索酸
により分離された。１容梢の二重蒸溜水を添加した後１
色原体の減少範囲が、自動ＤＬＩＳＡ−プレート・リー
ダーを使用して０．０．５７０／６９０のプレートを読
むことにより測定され９組台えヒト悪液質性／ＴＮＦの
場合と同様に得られた標準的な細胞毒素性曲線と比較さ
れた。
前述した如＜、３Ｔ３−Ｌ１１１１胞上のリボプロティ
ン・リパーゼの消去により悪液質性／ＴＮＦも分析され
た〔ボイトラー、Ｂ１等９、）、ＥＸＰ。
ＭＥＤ　　１６１　　：９８４−９９５　　（１９８５
年）〕。大食細胞の１次培養液内に悪液質性／ＴＮＦを
誘引するＶＩＰ−１の能力はチオグリコレート・ブロス
（Ｄ　Ｉ　ＦＣＯ）　２ｍ　ｌ　（Ｄ　ｉ　ｐ投与ｖ大
ｌＮ１１ａｌｉｌ激し腹膜洗浄により細胞を４ないし６
８問回収することにより評価された。細胞は洗浄され、
抗毒素の無いＲＰＭＩ内で再！！濁され、２４ウエルの
組織培養プレート内で１０６細胞／ウエルにてプレート
処理された。試験物質、ＬＰＳ、０６０００１−１βｇ
／ｍｌ　：ＭＩＰ−１，１βｇ／ｍｌ　）が添加され、
細胞は３７℃にて２８時間培養された。Ｉｌｌ胞の無い
表面浮遊物が集められ前述の如＜Ｌ８２９１［１胞上の
細胞内毒素により悪液質性／ＴＮＦ作用の分析がなされ
た。
Ｍ　　Ｐ−１α　びＭ　　Ｐ−１の　　　スーパーロー
ズ１２上で高性埜ゲルろ過クロマトグラフィーからの部
分を含有するＶＩＰ−１がプールされ。
ＰＭ−１０膜を使ってかく乱細胞内で濃縮化され（アミ
コン社、ヂンバースβＭＡ）０．０１Ｍリン酸塩ナトリ
ウム・バッファー、ｐＨ６，４に対しろ過された。次に
、ＶＩＰ−１の２つの成分が公知の方法に従って５Ｏ８
−ヒドロキシルアパタイト・クロマトグラフィーにより
溶解された（モスＢ及びＥ、Ｎ、ローセンプラム、Ｊ、
Ｂ　ＩＯＬ、ＣＣ１１Ｅ、　２４７　：５１９４．　　
（１９７２年）〕要約すると、１％ＳＤＳ及び１％メル
カプトエタノールを含有する０、０１Ｍリン酸塩ナトリ
ウム・バッフｙ＋、ｐＨ６，４内でＶＩＰ−１の５００
μりの割切れる値が平衡化され、ｓｍ水中に２分間置か
れた。サンプルハ０．１％ＳＯ８及び１．０　ｍＭＤＴ
Ｔ　（バッファーＡ）を有する０、０１Ｍリン酸塩ナト
リウム・バッファー　（ｐＨ６，４）で直ちに１０倍に
希釈され、バッファーＡ内にて予め平衡化されたヒドロ
キシルアパタイト・カラム（バイオ・ゲルＨＰＨＴ、バ
イオ・ラッド、リッチモンドβＣＡ）に直接適用された
。０．１％ＳＤＳ及び１．０ｍＭＤＴＴを含有する０、
０１Ｍないし０．２５Ｍリン酸塩ナトリウム・バッファ
ー　（ｌｌｅ、４）から２５ｍ１のｒｉ線状勾配が溶離
に対して使用された。
電−ンＳ″　　Ｍ［Ｐ−１α及びＭＩＰ−１βのＮ−タ
ーミナル・アミノ酸シーケンス分析が適用されたバイオ
・システムズ・ガス相シーケンサ−で行われた。デイホ
フ蛋白質シーケンス・バンクでｄ−ＦＡＳＴ−Ｐコンピ
ューター・プログラムを使って均質アミノ酸シーケンス
の調査が行われた。
久丘庶１旦ヱ上　ＭＩＰ−１α及びＭＩＰ−１βの水治
療プロットが公知アルゴリズムの改変によって演輝され
た。〔ホップ、Ｔ、Ｐ、及びに、Ｒ。
ウッズＰＲＯＣ，ＮＡＴＬ、ＡＣＡＤ、ＳＣＩ。
Ｕ、　Ｓ、　Ａ２Ｂ：３８２４（１９８１年））ｃ　　
　　−１−（７）　　　　ＬＰＳＮｔｌｌｋＲＡＷ２Ｇ
４．７細胞からｃＤＮＡライブラリーが先に述べた如く
得られた（Ｇ、デバテリス、Ｐ、テカンブ・オルツン、
Ｓ、Ｄ、ウオルプ、に、ヘルムセン。
Ｃ，０イク、Ｃ，ガレゴス、Ｄ、コイト、ＳＤ。
メリーウェザ−及びＡ、セラミ、Ｊ、ＥＸＰ、ＭＥ　Ｄ
　、　１６７　：　１９３９−１９４４　（１９８８年
）〕。要約すると、　１ＩＡＷ２６４．７１１１１１の
合流単層がＨＢＳＳ内で５回洗浄され、１．０βｇ／ｍ
ｌ　　ＬＰＳを含有する抗毒素の無いＲＰＭ　Ｉ　１６
４０培養媒体で被覆された。３７℃で２時間にわたり培
養した後、全ＲＮＡが６Ｍチオシアン酸塩グアニジン内
に抽出された（ウルユツチ、Ａ、Ｊシャイン、Ｊ、チル
グウイン、Ｒ，ビクテット、Ｅ、テイツシ性−Ｗ、Ｊ。
ルツター及びＨ，Ｍグツドマン、５ＣＩＥＮＣＥ１８６
　：　１３１３　（１９７７年）〕。次に、ポリ（Ａ＞
＋ＲＮＡが公知の方法の改変に従ってオリゴ（ｄＴ）セ
ルロース・クロマトグラフィーの２サイクルにより分離
された（マニイチス、Ｔ、Ｅ、Ｆ、フリッチュ及びＪ、
ｆツムブロック、「分子クローニング　ラボラトリ−・
マニュアルＪコールド・スプリング・ハーバー−ラボラ
ノリー、コベルド・スプリング・ハーバ−、ＮＹ、　ｐ
１９７　　（１９８２年））。
公知の方法に従って二重ストランド型ｃＤＮΔがポリ（
Ａ）ト選択されたＲＮＡから準備された。
（ガブラー、Ｕ、及びＢ、Ｊ、ホフマン、ＧＥＮＥ、　
２５：２６３　　（１９８３年＞　）　内１１２ＳＥｃ
ｏＲ１ｔ：ｆＪ所がメチル処理され、ＥＣＯＲ１リンカ
−が添加され、ｃＤＮＡがバクテリア刊胞うヨダ７ｔ１
０のＥＣＯＲｌｇ：１１所内に挿入された〈ヒュン、Ｔ
、Ｖ。
Ｒ，Ａ、ヤング及びＲ，Ｗ、デービス、ＤＮＡクローニ
ング：実際的アプローチ、Ｄ、Ｍ、グローブス等、ＩＲ
Ｌプレス、オックスフォード、２４９（１９７５年）。
プローブ・　−ルの　、　「主要」シーケンスに対応す
る２個のオリゴノヌクレオチド・プローブ・プールが部
分アミノ・ターミナル・シーケンスのアミノ酸＃　２２
−３０に対してＤＮＡ３：３０１（１９８４年）のワー
ナー・Ｂ、Ｄ、Ｍ、Ｅ、ワーナ、Ｇ、Δ、カーンズ、Ｌ
、り、Ｓ、ブラウン・シマー及びＭ、Ｓ、ウルディに従
って合成された。
ポリペブーｆ−ドのこの部分はシーケンスの残りの部分
と対比した場合ロートン・ディクショプリー内にその低
い変質があるので選択された。結果的に生ずるプローブ
・プールは長さが２６のヌクレオデートの２個の５１２
倍変質プールである。
ＭＩＰ−１βの部分的Ｎ−ターミナル・シーケンスのア
ミノ酸２−８に対応するＡリゴヌクレＡチードは１）Ｎ
Ａ、　３　：４０１　　（１９８４鋒）のワーナー＋３
．Ｄ、Ｍ、Ｅ、ワーナー、Ｇ、Ａ、カーンズ。
し、り、Ｓ、ブラウン・シマー及びＭ、Ｓ、ウルディア
の改変にて述べられた如く合成された。この特定のシー
ケンスはＭＩＰ−１αとＭｌＦ’−１βシーケンスの間
の最低の兄かけの一致の領域であることから選択された
。
ライブラリーのスクリーニング：　Ｍ　ＨＰ−１αに関
して、ライブラリーの低密度プレート、５×１０３Ｄｆ
Ｕ／プレート）のニトロセルロース・フィルター・リフ
トが３２ｐ−ＡＴＰにューイングランド・ニュースリア
、ボストン、ＭΔ）でラベル付けされた５’　−ｅｎｄ
であった合成プローブ・プールを使ってハイブリッド化
された。ハイブリッド化に続いて、リフトはウッド等（
１０）の方法を使って洗浄された。数回のスクリーニン
グ後。
１８ｆＡの組替え１１Ｄ１１１クローンが分離されＤＮ
Ａ分離に対しヂルクで生長された。
ＶＩＰ−１βに１ηして、プレー１〜化ライブラリー、
（４Ｘ１０５プレート）の二ｍニトロセルロース・フィ
ルター・リフトが、４ＸＳＳＣ，２Ｘデンハルト溶液、
　４０ｍＭリン酸塩ナトリウム・ダツツ７−．　ｐｌ−
１７，０、０，３ｍｇ／ｍ　ｌのソニケート化すルモン
・スパームＤＮＡ、０．１％ＳＤＳ及び３２Ｄ−ＡＴＰ
　　５’　ｅｎｄラベ／ｌｚイ＝Ｊ　＋ｆ合成オＩＪ　
コヌクレオチード・プローブ・プールの２．５−５Ｘ１
０’　ｃａｍ／ｍ　ｌ　／変質内にて４２℃にて一晩で
ハイブリッド化された。ハイブリッド化に続き、フィル
ターが洗浄され、最終的な洗浄は中程度のきびしさの下
に行われ、２ＸＳＳＣ，０，１％ＳＯ３゜５０℃にて行
われた。二ｍフィルター上で正のプレート低密度プレー
トとスクリーニングの第２ラウンドを受けた。この様に
して２個の独立した正の細胞クローンが別の分析のため
ＤＮＡの準備されたものから分離された。
ＤＮＡシーケンス′　　分析づべきｃＤＮＡインサート
は］］１３細胞ベクトル内にサブ・クローン処理され、
ｒ）ＮΔシーケンシングがリンが−等のジデオキシ鎖タ
ーミネーシ］ン法によりｔｒわれた。
（Ｆ、　ｌナンガー及びＳ、ニツケレン、Ｒ，クールソ
ン、ＰＲＯＣ，ＮＡＴＬ、ＡＣΔＤ、ＳＣＩ。
Ｕ、Ｓ、　　△、　７４　：　５４６３　（１９７７年
）〕ブ［］ット・ハイブリツ°　　　　公知の方法の適
合により北側プロットのハイブリッド化が行われた〔シ
ーラフ。１−１．０．ダイアモンド、Ｊ、Ｍ。
ウオズー二及び１］、ボイドカー、ＢＩＪＣＨＥＭＩ　
Ｓ　Ｔ　ＲＹ　、　　１６　：　４７４３　（１９７７
年））ＬＰＳＭ激された１つ非刺激ＲＡＷ２６４．７の
総ＲＮΔの細胞は１２％アガローズ・ゲルを通じて電気
泳動され。
ニド【］Ｌフルロース・フィルターに移送された。
二ｍ　　合成オリゴノヌクレオチード・ブライマーが（
γＥ３２ｐ）　ＡＴＰ　（３０００Ｑ　ｉ　／ｍ−Ｅル
。
アメリカン社、アーリントン・ハイツ、ｒＬ）及びＴ４
ボリヌクレオチード・キナーゼを使ってｅｎｄラベル付
けされた。プライマー延長法は公知方法の改変であった
。〔ウォーカー、Ｍ、Ｄ、Ｔ。
ケドルンド、Ａ、Ｍ、ボーレット及びＷ、Ｊ、ルツター
ＮΔＴＬＪＲＥ　　ＬＯＮＤ、２０６：５５７（１９８
３年）〕。
佐里 胚に２２１辺１１　刺激されたＲＡＷ２６４．７１［１
胞が七）Ｑ（ａイオン交換）クロマトグラフィーにより
部分化された場合、ＶＩＰ−１は銀色シミ付け（第１図
）俄のＮＯ’３−ＰＡＧＥ上の約８０００ザルトンの顕
著な対として表われた。ＨＩＰ−１は部分または悪液質
性／ＴＮＦの２個内で再生可能に溶離され、ｌ！色シミ
付けにより判定されたものと大略同じｍ発生された。
クロマトフオー力ツシングは、モノＯＲ製されたＶＩＰ
−１が悪液質性／ＴＮＦより僅かに高いせず）に対応し
た。
ＭＨＰ−１を更にｖＪ製する目的から粒状化する利点が
得られた。Ｍ　１−Ｉ　Ｐ　−１の粒状化は原材料の濃
縮中及び七ノＱ（データ図示往ず）上のろ過または分化
前に発生することがＩＪ察された。リン酸塩バッファー
処理されたサリン内のゲルろ過により分化された場合、
ＭＩＰ−１は大略２００００ダルトンから空隙容積内の
溶離する材料（２２Ｘ１０　　ザルトン：データ図示せ
ず）にわたる各種分子量のマルチマーを形成した。１０
０１Ｍ酢酸アンモニアにおいて、この傾向は拡大され、
大部分の蛋白質がへ分子ｍ部分（第２図、で溶離した。
これらの状態下において、ＮＤＳ−ＫＡＧＥ及び銀色シ
ミ付けにより判定された８５％純度以上のＶＩＰ−１が
（ｑられた。
精製されたＭＨＰ−１（第３図）の部分的なＮ−ターミ
ナル・アミノ酸シーケンス・デ〜りは単一の主要シーケ
ンスを示したが、２個の別々のバッチのシーケンスはＮ
−ターミナル領域に多数の特定位ｄに固有のマイナー・
アミノ酸を示した。
このシーケンス拳データのコンピュータ・ペース分析は
先に述べた蛋白質のいずれとも充分な均質性を明らかに
しなかった。
ヘパ１゛に　　　Ｍ　　　−１の−ＭＩＰ−１の精製中
に、ヘパリン（第４図）に対する一致性が注目された。
１２倍に濃縮されたＲＡＷ２６４．７表面浮遊物の２ｍ
ｌがカラムに付けられ０ないし２Ｍ　　ＮａＣ１の直線
状勾配で溶離されるとＭＨＰ−１は５ＤＳ−ＰＡＧＥ、
銀色シミ付け、大略０．１にて溶離することで検出可能
な２個の主要蛋白質の１つであった。
１１１煎立■二且２２０μｇ／ｍｌの高い濃度において
、精製ＭＨＰ−１はＣ３Ｉ］／　Ｈｅ　Ｊ　Ｍ索の芽胞
生殖を刺激しなかった。一方０組替えヒト■Ｌ−１は１
０Ｄｇ／ｍｌ　（データ図示ｔ！ｆ）ｐＨ７）低さの濃
度でこの分析では活性があった。同様に。
ｐｊ’ｍされたＭ　Ｉ　Ｐ−１は１μ９／ｍ＋（７）１
度ニ１３いてもアクチノマイシンＤの存在下でＬ９２９
を殺さず、一方１組台えヒト悪液質性／ＴＮＦは１５ｐ
ｙ／ｍｌ（データ図示せず）程度の低い値の１度で殺す
ことが出来なかった。更に、精製されたＭＩＰ−１は３
Ｔ３−Ｌ１細胞（データ図示せず）内にリボプロティン
・リバーぜのダウン・レギュレーションを誘引しなかっ
た。１μｇ／ｍｌにおいて、精製Ｍ１ゴＰ−１は１０μ
ｇ／ｍｌのポリミキシンＢ（データ図示せず）の存在下
で一次ブオグリコレル酸塩侵入マウス大食ｌ１ｌＩ１１
により悪液質性／ＴＮＦ生成を誘引しなかった。
前述した［１−１−及び悪液質性／ＴＮＦ状作用は次い
で、ＭＩＩＰ−１は０３Ｈ／１ｌｅＪｖウスの足の夷に
皮下１９与した際４時間で局部的ふくらみの反応を誘引
した。ＶＩＰ−１の？（ｌｏｎｇが投与された時生じた
最大のふくらみは主としてＰＭＮ白血球浸１１１（第５
図、写真Ａ）を特長とした。
制御応答のキャリア投与に関するものを写真Ｂに示す。
ＶＩＰ−１で見られる好中球浸潤の度合はｆ’ＭＬＰの
、０−１０モルが投与された場合程顕著ではなかった（
第５図、写真Ｃ）然し乍ら、好中球浸潤の度合は組合え
悪液質性／ＴＮＦのＩｏｎ　ｇで！１５２１されたもの
と対比出来た。組替えヒトＩＬ−１はこれらの薬剤（デ
ータ図示せず）の投与時に４　Ｎ、ｊ間において何んら
炎「酔反応を出さなかった。
）（ＩＰ−１は試験管内のヒト好中球内にａ能几進を誘
引した。パーセントが負とＧＢＳＳ　（０％）とＩＬの
ｆ　Ｍ　Ｌ　Ｐ　　ＩＱ’ｌｙｌ制御体）（１００％）
に対し相対的に移動が増加づる際提供される。１００ｍ
５７／ｍｌに等しいまたはこれ以上の部位において。
１−４　Ｉ　Ｐ　−１は好中球移動における茗しい増加
ももたらした。（ΔＮＯＶ△によりｐ＜０．０１）ポリ
マイシンＦ３の含有（１０μｇ／ｍ＋）はＭＩＰ−１α
引機能八進に何んら効果がなかった。更に、こと分析で
は、　１０−１０００ｎ　ｇ／　ｍ　ｌの８０度におけ
る１−Ｐ　Ｓは活性がなかった（データ図示せず）。
ｒｌＬ−１αでない組替え悪液質性／ＴＮＦは１［１ｒ
ｃｉが抗毒素または余剰ｍ胞マトリックス蛋白質でａ覆
された表面に付着されることも条件に、ｉＮ延した著し
く高い呼吸突発をヒトＰＭＮ内にトリガーさせる（ナサ
ン、　Ｃ，Ｆ、　１９８７．　Ｊ、　ＣＬ　ＩＮＩＮＶ
ＥＳＴ（ｉｎ　　ｐｒｅｓｓ）。同様に。
≧１μび／ｍｌにおけるＭ［ρ−１は４回の実験で）−
＋　２Ｊ　２を解放リベく接着ＰＭＮをトリガーした。
実験と中の１つを第７図に図示する。平行培養液内で試
験された悪液質性／ＴＮＦと比較して。
Ｍ　Ｉ　Ｐ　、−１に対する反応は更に〃延され（悪液
質性／ＴＮＦにつき６０分のラグ対１５のラグ）、最大
の保持割合は低かった（悪液質性／ＴＮＦについて１０
１０６Ｐあたり１．２ｎ−Ｅル／分対３．０　及ｔＦＰ
Ｍ△に対して２．１）。然し乍ら１反応１存続時間ｔｉ
ｔ良かったく悪法ｔ１性／ＴＮＦに対して１時間と比較
して２．５時間）そのため解放されたｌ−１２０２のａ
Ｕｔは同様であった。ＶＩＰ−１はヘパリンと結合する
ので、ヘパリン処理された血液よりむしろクエン酸処理
から分離されるＰＭＮでも実験が行われ、同様の結果が
得られた。（図示せざる）ＶＩＰ−１または悪液質性１
０ＮＦ（すＩ）−ン。
Ｃ，Ｆ、１９８７．Ｊ、ＣＬ　ＩＮ、Ｉ　ＮＶＥＳＴ。
（ｉｎ　　ｐｒｅｓｓ））もＨＨ２ｏ２の甲１１１１Ｉ
ｌｊからの解放トリガ〜をしなかった。
■ 先に示したデータは、炎症性サイトキンＭＩＰ−１が先
に説明した蛋白質に対し著しいシーケンス一致を有して
いたいが、悪液質性／ＴＮＦ及びＩＬ−１の如き炎症性
神経細胞の鶴型的な重なる特性の金品の特性を共有して
いる。
Ｍ［Ｐｌはその１１１連ある物理的特性を基にして分離
された。先に示した如＜、ＶＩＰ−１は５ＤＳ−ＫＡＧ
Ｅ上の約８０００ダルトンの対として移！ＪＪするが、
これはゲルろ過により判定された場合２　Ｘ　１０６ダ
ルトンを越える高分子量の粒状物を容易に形成する４部
紛的アミノ酸シーケンス・データは多数の位置において
「バイナーｊ置換にて１つの：主要」シーダンスを示す
。
蛋白質が陰イオン性である条件下においてヘパリンにＶ
ＩＰ−１が結合することが特定の相互作用を示唆してい
る。これは更に、ＭＩＰ−１が高塩分濃度においてヘパ
リンと結合する２ｇ４と主要大食Ｉｌｌ胞隠ぺい蛋白質
の１つであるという観察により強調される。ＶＩＰ−１
は大食Ｉ８胞、マスト細胞及び好中球の炎症性浸潤の調
整にあたって成る役割を宋たすことが出来る。ＭＩＰ−
１は浸潤中にベースメント膜プロテオグリカンと反応出
来る。
本願で？示した発見内容は悪液質性／ＴＮＦまたはＭ　
Ｉ　Ｐ−１が炎症性反応を誘引出来るとする示唆に一致
している。悪液質性／ＴＭＦは好中球１能冗進を誘引す
るよう先に示された。（上がり。
ｒ、ｓ、等、１９８７．８ＬＯＯＤ（ｉｎ　　ｐｒｅｓ
Ｓ）；ミング、Ｗ、Ｊ等、Ｊ、ｒＭＭＩＪＮ、２３８　
：１４６９−２４７４　（１８８７）　’Ｉ他に作用（
シャラヒー２Ｍ。
Ｒ，、Ｊ、　　ｌ　ＭＭＬＪＮ、　１３５　　：　１０
６９−２０７３（１９８５）；及び遊水０Ｍ等　Ｂ　Ｉ
　０Ｃ１１，Ｂ　Ｉ　０ＰＩＩＹＳ。
ＲＥＳ、ＣＯＭＭｔＪＮα１３７　：　１０９４−１１
００　（１９８Ｇ＞）。本発明の研究では、ＭＩＰ−１
はまた。好中球１能冗進を誘引出来ることが示された。
他に。
本発明で使用された投与量では悪液質性／ＳＮＦ及びＭ
　Ｉ　Ｐ　１．−１が各々試験管中の炎症と同様の度合
を示した。他の文献では組替えＩ　Ｌ　−１が試験管内
で炎症性反応を誘引出来ることを示したが（グラシュタ
イン、Ｒ，Ｄ、、等、Ｊ、ＣＬＩＮ。
Ｉ　Ｎ　Ｖ　Ｅ　Ｓ　Ｔ７７　：　１０２０−１０２７
　（１９８６）　）　、本発明ではこうした効果は見出
されなかった。本発明で使用された組替えヒトＩＬ−１
αは刊行されている実験で使用されたマウスＩＬ−１α
よりこの点で活性の劣ることがある。（グランシュタイ
ン。
Ｒ，Ｄ、等、Ｊ、ＣＬＩＮ、ＩＮＶＥＳＴ７７：使用さ
れる投与品において１９２９１１Ｊｌｌ内毒素性分析に
Ｊ：り検出される悪液質性／ＴＮＦＩ１１ｔＪ４性がな
かったので、ＶＩＰ−１の効果が投与的にその悪液質性
／ＴＮＦの汚染に起因することはあり得ない。更に、Ｍ
ｌ−ＩＰ−１は悪液質性／ＴＮＦを生成する一次ヂオグ
リコール酸塩侵入大食細胞を誘引しなかった。菌体内毒
素の汚染は機能几進効果の説明には無関係とされ、１ｍ
能八人選ポリミキシン８の存在によって影響されなかっ
た。ＬＰＳ自体はＭＨＰ−１分析で存在したものより高
いｌ１ｒ１１において１機能亢進効果を呈しなかった。
Ｍ　ｌ−Ｉ　Ｐ　−１により誘引された炎症は菌体内毒
素汚染の低イレベ／Ｌ／　（０，２ｎｆｆ　　Ｌｐｓ、
”μｙ　　ＭＩＰ−１）での準１ａ薬にて菌体内Ｒ素低
抗Ｃ３Ｈ／　Ｉ−１ｅ　Ｊひずみがマウス内に観察され
た。
先に説明した如く１元のハウスＭ［Ｐ−１は大略８００
０ダルトンのサブユニット分子量とほぼ同じ値の対とし
て分離されている。２個のＭ　Ｉ　Ｐ−０は５ＤＳ−Ｐ
ＡＧＥにより成る程度分離されるが。
その電気泳動の移動性が類似しているので指薬的５ＤＳ
−ＫＡＧＥは精製の非実際的手段として使われた。元の
ＶＩＰ−１（対）はＮＤＳ−ヒドロキシルアパタイト・
クロマトグラフィーにさらされた。この技術は同様の電
気泳動移動性の蛋白質サブユニットを成功裡に分離させ
る目的で使用された（Ｂ、モス及びＥ、Ｎ、ローセンプ
ラム、ＪＢ　ＩＯＬ、　ＣＨＥＭ、　２４７　：５１９
４（１９７２）　）。第１３図から理解出来る如＜、Ｓ
ＯＳの存在下でヒドロキシルアパタイト・カラム上の元
のＶＩＰ−１の分化に続いて２個の顕著な蛋白質ピーク
が？Ｍ察される。最初のピークは０．２４Ｍリン酸塩ナ
トリウムにおいて溶離し、第２ピークは０．２７Ｍリン
酸塩ナトリウムで溶離する。Ｎターミナル・アミノ酸と
カラム分化の５ＤＳ−ＰＡＧＥ、９析は、第１ピークが
ここでＭ［Ｐ−１αとして参照したＶＩＰ−１の低分子
ａバンドに対応し、一方、第２ピークがＭｌｒ’−１β
として参照した高分子Ｍバンドに対応することを明らか
にした。この技術を使って、各要素はＮターミナル・ア
ミノ酸シーケンス分析に対し純粋な形ｆ！！　（ＳＤＳ
−ＰＡＧＥで判定した〉９５％）で得られた。
マウスＶＩＰ−１αの分子ａｍ造を刺激する目的でＭ［
Ｐ−１ａに対するシーケンス・コーディングを含むＣＤ
ＮΔクローンが分離された。第１段階にして、マウス大
食細飽ラインＲＡ　Ｗ２Ｂ５．７がＬＰＳにより刺激さ
れた。Ｌ　Ｐ　Ｓ　１ｉｌＪ激後ＲＡＷ１ａ４．７　Ｉ
ＩＩ胞はＭＨＰ−１αの供給源となることが示されたの
で、ＭＩＰ−１α　ｍＲＮＡはこれらのＬＰＳｉ引１８
ＪＢ内で刺激されるものと予測される。
ラムダ・オリゴ・ｄＴ−り０マドグラフイーの２サイク
ルにより総ＲＡＮからポリ（Ａ）＋ＲＮ八が準備され、
ＣＤＮＡライブラリーがラムダクｔ１０内に構築された
。クローニッグ効率はポリ（Ａ）＋ＲＡＮの１０６クロ
ーン／μグであった。
ライブラリーは増幅され０組替えプレートと６０％以上
で１０００ｐ　ｂ以上のインサートを含むよう示された
。精製されたＶＩＰ−１の一致する部分的Ｎ１１２ター
ミナル・アミノ酸シーケンスに基づいた２個の合成コリ
ゴノヌクレオチド・プールを使用してライブラリーの低
密度ブレーティングの二ノロセル０−ス拳フィルター・
ユツトがスクリーニングされた。Ｒ，Ｄウオルプ、Ｇデ
バデルス、Ｂ。
シェリー、Ｂ、トイトラ−、Ｄ、Ｇ、ヘッセ、１−ＩＴ
ヌエン、Ｌ、Ｌ、モルドワー、Ｃ，Ｆ、ナサーン、Ｓ、
Ｆ、ローレイ及びＡ、セラミ、Ｊ、ＥＸＰ、　ＭＥＤ、
　１６７　：５７Ｇ　　（１９８７）。各プールは良さ
が２６のツクレオチドの５１２倍と遺伝子プールで構成
された。（第９図） 初１１ライブラリー・スクリーニング後に、正のプレー
トが新鮮なバクテリア・ローン上にス１〜リークされ、
２次スクリーニングが差動プレート・ハイブリッド化に
より行われた。２次ストリークのレプリカ・リフトは３
２ｐラベル＋Ｊけされたブール＃１またはプール＃２に
ハイブリッド化された◎０ＮＡ１０Ｎ△ハイブリッドの
溶融温度（Ｔ）は実験式Ｔ−ＩＱ、Ｇ（ｌ　ｏｇ、　Ｎ
ｅ＋）　＋０．４１．％。
Ｇ　＋　Ｃ，）　）　＋８１．５−５００　／均質ｂ　
ｐａｒｍｔＨＩｌ来るので、プローブ・プールの１つが
２６ｂｌ）均質を桔にしたハイブリッドの異なる溶融温
度を過ぎて効果的に消去された。Ａ−Ｔ対ａ−Ｃベース
対の好適溶融を無くすテトラメチルアン［二ｒクム塩化
物洗浄技術を使用することにより（Ｗ、ウッド。
１０、〕、ジシシャー、Ｌ、Ａ、ラスキー及びＲｏＭ、
ローン、ＫＲＯＣ，ＮＡＴＬ、ＡＣＡＤ、ＳＣ１，ＶＳ
Δ、８２：　１５８５．１９８５．　）溶融温度（Ｔｍ
）は単にハイブリッドの良さに依存することになる。
差動ハイブリッド化数回の棲、プローブ・ブール＃１は
ＭＨＰ−１αに対する最大にきびしい条件下でハイブリ
ッド化する１０’以外の１８個の組替えＩ［１１１１ク
ローンを発生した。プレートは全て精製され、ＤＮＡが
各々から準備された。組合え細胞クローン５２が最大Ｃ
ＤＮＡ　　Ｅｃｏ−Ｒ１インサートの約７５０ｂｐのも
のを含み、別の特性に対して選択された。ｎ１分的に重
なるりθ−ン３２の相互の５′シークンスの２６２ｂｐ
と同様ｃＤＮ△クローン５２の完全なヌクレオチド・シ
ーケンスが決定され、第１０図に示す。後でのクローニ
ングにて分離された接菌のクローンはクローン５２より
小さい［ＥｃｏＲＩインリートを有したが、大きい５′
ｅｎｄ部分、従って小さいポリ（△）ゾールをｆ−７し
てした。７６３ｂｐのＭＩＰ−１αヌクレオチド・シー
ケンスはヌクレオチド２から始まる１１！−′Ａ−ブン
・リーディング・フレームも予測している。
位ｎ１から始まる飽和蛋白質シーケンスは長さが６９の
アミノ酸であり、間装されたＭ　ＨＰ　−１蛋白質のＮ
Ｈ２ターミナル分析により定められるｒ主ＤＩシーケン
スを含む（Ｓ、Ｄ、ウオルブ、Ｇ。
デビッテルス、Ｂ、シェリー、ＢボイトラーβＤ。
Ｇ、ヘッセ、Ｈ，Ｔ、ヌエン、Ｌ、Ｌ、モルダワ、Ｃ，
Ｆ、ノーリ°−ン、Ｓ、Ｆ、ローレイ及びΔ。
ｔ５ミ、　Ｊ、　ＥＸＰ、　ＭＥＤ、　１６７二５７０
　　（１９８７）　）シーケンス内に存在する第１メブ
オニンが位置２３に見出される。これは以下のｆｇＪ″
ｅ１１．：基ずいたＭＩＰ−１αに対する開始メヂオニ
ンに要求される。
推定されるプレシーケンス（−２３だいし−１）の構造
上と分析は、典型的な信号シーケンス（即ち。
α−へリックス及び疎水性コア）の特性を有している。
（Ｄ、バールマン及びＨ６０，ハルボルソン、　　Ｊ、
　　Ｎ０ＬＥ、　　８　　ｒＯＬ、　　１６７　二３９
１　　　（１９８３）　　）予測される開始ΔＳＧは相
対的位置−３にプリンをＦＴシ、このプリン１．ｉ変換
限界効率上に固有の効果を右づるよう示しである。（Ｍ
、コザスク、ＣＥ　Ｌ　Ｌ、　４４：２８３　　（１９
８６）史に、６９９ベルテプレ一トｍ　ＩＩ　Ｎ　Ａの
変換開始箇所の周わりのＡ、Ｃ。
ＴＧの調査で、９１％が位置−３においてプリンも有し
、６１％がその位置で八を有していた（Ｍ、コ會ｆツク
、ＮＬＩＣＬＥＩＣＡＣＩＩ）Ｓ　　ＲＥＳ。
１５　：　８１２５　（１９８７）　）ｃＤＮＡクロー
ンから欠ＧＪる５′シーケンスの吊を決定するため１次
延長分析も行われた。ラベル付けされたオリゴノヌクレ
オヅード・ブライマー（第１６図）がしＰＳ刺激された
Ｒ　Ａ　Ｗ２Ｂ５．７ポリ（Ａ）→−ＲＮ△にハイブリ
ッド化され、逆のトランスクリターぜで長くされた。ハ
イブリッド化侵。
９８±２のヌクレオチドの延長ブライマーが得られたく
データ図示じず）。２５のヌクレオチドのブライマー長
さとシーケンス５゛を差し引いた俊１本出願人が以前決
定した（６１のヌクレオチド）もので、公知のシーケン
スは完全長さのＣＤＮ△に満たない１０−１４ヌクレオ
チドであると結論付けることが出来る。イン・フレーム
ＡＵＧがこのクローン処理された領域内に存在すること
は可能であるが、３４６のシーケンス・ベルテプレート
ｒｎ　ＲＮ△の１４のみが長さ１９ヌクレオチド以下の
５′ノンコーデイング・シーケンスを有することは相当
あり１ｑないように思われる。（Ｍ、コザック、　Ｎｔ
ＪＣしＥ　ＩＣＡＣＩＤＳ　　ＲＥＳ１５ニア１２５（
１９８７゜従って、５′未変換シーケンスは今日迄シー
ケンス処理されたベルテプレート５′の大部分と１０−
１００ヌクレオチド良さ内にある約８２のヌクレオチド
であると予測出来る。
提案されたプレＭＩＰ−１αは９２アミノ酸ある。
Ｎ−リンクされたグリコシーレーションに対するＡｓｎ
−Ｘ−３ｅｒ、Ｔｈｒ箇所は分子内ニナイ。
７個のシスティン、プレシーケンス内に４個の又飽和シ
ーケンス内に４個ある。プレＭＩＰ−１αのコドン使用
は他の６６のシーケンス飽和マウス細胞に対し決定され
たものと同じである。最初、ペプチドはｄ−ファスト−
Ｐ・プログラム・均質サーチによりその時点に定められ
た蛋白質に重要なシーケンスを有していなかった。同様
にＤＮＡシーケンスは負の結果と細胞バンクのシーケン
スが比較された。
３′の非変換領域にはｂ　ｐ　７１１ないし７１Ｇにお
いて甲−と一致したボリアデニリレーション箇所がある
。公知のサイトキン一致３′非変換シーケンスには１つ
のミスマツチがある４個のシーケンスもある。又、３′
−非変換一致サイトキン・シーケンス（ＴＡＴＴ）。が
存在している。ｎ−２で１つのミスマツチが許される場
合これらのシーケンスの４つのシーケンスが見出された
。カプト等により定められたシーケンスとリーブス等に
より定められたシーケンスの間にこれら３つにオーバー
ラツプがある。
Ｍｒｐ−ｉは誘引可能な蛋白質であるので。
ＲＡＷ２Ｇ４．７　ｇ胞ＤＮＡ内の北プロット・ハイブ
リッド化によりマウスＭＩＰ−１αの表現を研究された
。第１１図に示される如＜、ＬＰＳＸ引細胞からの総Ｍ
ＮＡは８００ｂｐの予測サイズで正のハイブリッド化バ
ンドを？し、一方、非誘引ＩＩ胞からの総ＲＮＡはその
箇所または他の箇所にて正の信号の極めて小さい値を示
した。これら同じ細胞（第１２図）内の菌体内ｒｉ４素
によるマウスＭＩＰ−１αｍＲＮＡの誘引の時１１１研
究において、マウスＭ［’−１αはＬＰＳ刺激と８−１
６時間の、ＬＰＳ刺激侵のピークで検出された。この時
間経過はその個々プラスミヌドプロープが同じプロット
にハイブリッド化された際０ＮＦ−α／悪液質性または
ＩＬ−１α　ｍＲＮＡが表われるちとと異なっている。
フトゲンに応答してヒトトンシラー・リンボサイトによ
り発生されるｍＲＮＡが報告された。デイホフ蛋白質デ
ータ・ベースまたはジエネバンク遺伝子シーケンス・デ
ータ・ベースにはシーケンスはリストされていないが、
その蛋白質とマウスＶＩＰ−１αの間には７５．３％の
アミノ酸シーケンスがある。これらの蛋白質の関係は知
られていない。
Ｎターミナル・シーケンス分析でＭ　Ｉ　Ｉ）　−１（
ここではＶＩＰ−１βと称する）の高分子覆要素の結果
を第１４Ｂ図に示す。元の一致Ｎ−ターミナル・アミノ
酸シーケンス内の位２２３及び１に観察される「マイナ
ー」残留物はＭ　ｌ−Ｉ　Ｐ　−１βとＭＩＰ−１αの
闇のアミノ酸シーケンス差に対応している。第１４Ｃ図
において０元のＮ−ターミナル・アミノ酸一致シーケン
スを比較のため与えである。
ＶＩＰ−１βに対するコーディング・シーケンスを含む
ｃＤＮＡクローンが分離され特性化された。これを達成
するためＣＤＮＡライブラリーでＬ　Ｐ　Ｓ　ＩＩ激さ
れたＲ　Ａ　Ｗ２Ｂ５．７細胞のものが準備された。ｃ
ＤＮＡライブラリーをスクリーン処理するため使用され
るオリゴノヌクレオチド・プローブ・プールが第２４Ｂ
図にアンダーラインされたシーケンスに対し発生された
。これら７ｇのＶＩＰ−１βアミノ酸の３１１ＪはＭＩ
Ｐ−１αの対応するシーケンスは異なっている。ライブ
ラリーをスクリーニング処理するため利用されるプロー
ブ・ＣＣＣＸＣＣ−３’であった。第３位置選択（４；
）はクローン処理されたマウス細胞に対し報告されたコ
ドン使用を塁にされた。
ラベル付けされたプローブ・プールを利用するコードン
使用に基づき、ライブラリーは中程度のストリッジエン
シーの条件下でスクリーン処理された。２つの独立した
クローンがスクリーン処理された４Ｘ１０５組替え細胞
プレート外で分離された。分離されたクローンのＤＮＡ
シーケンシング時に、５ｅｒ５コドンの第３位置に対す
るＣの選択は正確に−「であり、かくして実際のＭＩＰ
−１βシーケンスにプローブ・プール・シーケンスのい
ずれかを完全に一致させることにならない。従って、ラ
イブラリー内のＶＩＰ−１βシ一ケンス表示は前掲のプ
ローブ・プールによりハイブリッド化を括に予測される
。ＭＩＰ−１α及びＭＩＰ−１βの比較可能領域に固有
のユニークなオリゴノヌクレオチド・プローブの後続の
スクリーニング処理はＭＩＰ−１αシーケンスより５倍
以下に余剰になっていることを示１゜ プレート精製化に続き、２個の正の組替え細胞からのイ
ン１ノ゛−トＤＮＡ　（＝７００　ｂｐ）がＭＩＰ１α
　ｃＤＮＡブ〔１−ブに対しクロス・ハイブリッド化し
て示された。インサートｃＤＮＡは各組替細胞数から分
離され、完企むヌクレオチドシーケンスが決定されたｍ
１３内にりＯ−ン化された。
２個のヌクレオチド・シーケンスは５′非変換シーケン
スの長さのみが異なっている。長いヌクレオチド・シー
ケンスを第１５図に示１゜ＶＩＰ−１αは６５０ベース
対である。（これはブライマー延長により分析は完全な
ｃＤＮＡシーケンスより知い１１−１２ヌクレオチド程
度である。）Ｍ［Ｐ−１βのヌクレオチド・シーケンス
はイン・フレーム停止コードン後にシーケンスの５′端
部に遭遇づる第１　ＴＡＧコードンから始まる単１オー
ブンリーディングを含む。この］−トンにより指定され
たメチオニンはαヘユツクスと中央に位置付けられた疎
水性領域を含む特性を備えた単一シーケンス（残留−２
３及び−１）を定める。この△ＴＧコードンを包囲する
シーケンスは高いオイカリオトの多数のｍＲＮＡでハ有
される一致シークンスに合致づる。
ＴＧＡターミネーシコン・ｌ−リベットは開始コードン
の下流側の９１のコードンに位置付けである。
Ｍ［Ｐ−１βの３′非変換領域は３１５ヌクレオブード
で構成され、多くのエイ力すオチックｍＲＮＡ内のポリ
アゾニレ−ジョンの箇所に先行するネキサヌクレオヂド
△へＴＡΔ（ヌクレオブード＋２８３〜＋２８８）を含
む。
多くの刺部性蛋白質の特性である公知の３′非変換サイ
トキン３′一致シーケンスと正確に一致するヌクレオチ
ド＋１１４〜＋１８１に単一シーケンスが存在する。そ
の他、この一致シーケンス（ヌクレオチド＋１６５ない
し＋１７５及びヌクレオチド＋１８５〜→−１９２）に
対し甲−の不一致を有する２個の付加的なシーケンスが
ある。
位置１から始まる元の蛋白質シーケンスは長さが６９の
アミノ酸である。ｃＤＮ△クローンから決定された飽和
蛋白質の分子ｍは５ＤＳ−ＤＡＧＥ予測される分子１と
一致する１８３２ダルトンである。
クローン処理されたＤＮＡから予測されるアミノ酸シー
ケンスは精製された元のＶＩＰ−１βのＮ−ターミナル
・アミノ酸シーケンシングから得られる最初の１３アミ
ノ酸と一致する。
１−ＩＩＰ−１βはアミノｆｉ５３ないし５５（Ａｓｎ
−Ｐｒｏ−８ｅｒ）における飽和蛋白質に存在ηる単一
のＮリンクされたグリコシレージョン箇所を備えている
。元のＶＩＰ−１が実際にこの位置においてグリコシレ
ート化されるか否か決定されていないが、Ｎリンクされ
たグリコシレージョンに対づる一致△５ｎ−Ｘ−８ｅｒ
、Ｔｈｒ信号内の位置Ｘにおけるプロリンが結宋的にそ
の箇所で与えられまたはグリコシレージョンされない。
２ｇ４の蛋白質の予測される極性プロフィールを予測し
ているＭｒＰ−１α及びＭＩＰ−１βに対する水留プロ
ットを第１６図に示す。Ｍｌ−ＩＰ−１α及びＶＩＰ−
１β内の局部的極性が驚くべきことに類似していること
が第１６図から明らかである。
ハウスＨ１−１β　ｃＤＮ△の仝体内ヌクレオチド・シ
ーケンスがＭＩＰ−１α　ｃＤＮ△シーケンスと同様、
ジエネ・バンク・ヌクレオチド・データ・ベース内のシ
ーケンス（［コーデント。
ブライメート、他の乳房、及び他のベルテプレート・ラ
イブラリー）と比較された。ＭＩＰ−１β及びＭＩＰ−
１α　ｃＤＮΔは５６．１％で同一である。ジエネバン
クで見出された唯一の用型な均質はそのｍＲＮＡがだ液
プロ七−ターＰＭ△またはカイトヘマグルチンで刺激さ
れたことを基にＴ細胞リンボサイトｃＤＮＡライブラリ
ーから分館されたヒトｌ［）７８ＣＤＮＡであった。マ
ウスＶＩＰ１βはヒトし［）　７８ｃ　Ｄ　ＮΔに重な
る５９２ヌクレオチド内で６１．１％の一致を示し、マ
ウスＭＩＰ１αは更に高い均質を示し、７４６で６ヌク
レオチドのＡ−バーラップが示された。
予測されたＶＩＰ−１βのアミノ酸シーケンスがｐ−７
？スト−Ｄコンピューター一致アルゴリズムを使ってデ
イホフ・データーベース内のシーケンスに対する一致性
が試験され、驚くべき高い均質性が見出された。然し乍
ら、　ＰＤＧＦ、１ｍ−１または二重ストランドＲＮＡ
１″誘引出来るマウス・ザイトキンＬＩＥ）に対するマ
ウスＭＩＰ１β、マウスＭ［Ｐ−１α、ヒトＬ１）　１
Ｂの予測される蛋白質シーケンスとマウスＴｉｔ胞励起
蛋白質）ＴＣＡ３）との比較はこれらの蛋白質が著しく
均質であることを示している。ＭＪＰ−１βの減少され
たアミノ酸シーケンスはＭＩＰ−１αに対し５９劃％、
ＬＤ７８．ＪＥ、ＴＣＡ３に対し各々予測されるアミノ
酸シーケンスに５８．１％、　３８．９％及び３１．９
％の一致が見られる。これら全てのシーケンスに共通す
るのは飽和ペプチド・シーケンスの各シーケンスにＪ３
ける４個の保存された遺伝子の存在である。おもしろい
ことに、マウスＭＨＰ−αの予測されたアミノ酸シーケ
ンスはマウスＭ１１Ｐ　−１β（５９，８％一致）の予
測アミノ酸シーケンスに対する場合よりヒトＬＤ７８（
７５，４％の一致）のものより一層均質である。従って
、これらの蛋白質は炎症性及び／または刺徴反応に含ま
れるペプチドのグループを定めるシーケンス上の同一性
を共用する。
【図面の簡単な説明】
第１図はＲＡＷ２６４．７　ＨＩ３の表面浮遊物から炎
症性サイトキンの準儀９回収を行うグラフと電気泳動ゲ
ルを組合せて表わす。ＲＡ　Ｗ２Ｂ５．７からの濃縮、
ろ過された表面浮遊物の分別上ノＱで行われた。表面浮
遊物、神経細胸物質、２リットルが２０倍に濃縮され、
２０ｍＭトリＨＣ１，ＤＨ８，０の６リツトルに対して
ろ過された。濃縮された表面面浮遊物が七ノＱに適用さ
れ同じバッファー内で０ないし１ＭのＮａＣ１の直線勾
配で洗別された。 ＶＩＰ−１（＊）は大略０．３７Ｍ　Ｎ　ａ　Ｃ１にて
悪液質派性／ＴＮＦ　（＊＊）の僅かに前に洗別された
。 インサートは示された部分からの５０μｍが適用された
１０−１５％５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。 第２図は本発明の炎症性サイトキンの別のゲル分離と精
製をグラフと電気泳動ゲルにて組合せて示す。七ノＱか
らの部分をビークＶＩＰ−１が２００μｍに濃縮され１
００ｍＭ酢酸アンモニアでスーパーローズ１２カラム均
衡に適用された。ＭＩＰ〜１（＊）はボイド容積内で溶
離され、Ｒ液性／丁ＮＦ　（＊＊）から充分に分離され
た。インサートは示された部分からの５０μｍ割り切れ
る値が通用された１０−１８％５Ｏ８−ＰＡＧＥを示す
。ダツガーはマーカーとして使用された精！ＪＶＩＰ−
１を示す。 第３図は本発明の炎症性号イトキンの最初の３１個の位
置の一致した部分アミノ酸シーケンスを表わす。カッコ
内の残りは「マイナーＪ１ｊ５塁が材料の責なるバッヂ
で異なるシーケンスにで再生可能的にＩＩＩられた位置
を示す。 第４図は本発明の炎症性サイトキンをヘパリンに結合し
溶離するグラフと電気泳動ゲルを組合せて示す。１２倍
に濃縮しろ過したＬＰＳ刺激したＲＡ　Ｗ２Ｂ５．７表
面浮遊物の２ｍｌをヘパリンセファローズ・カラムに適
用し、　０．０２Ｍ　　ノリｌ−Ｉ　Ｃｌバッファ＋、
ｐｌ（７，８内でＯたいし２Ｍ　　ＮａＣｌの直線勾配
にて溶離した。２つの主要ピークが観察された。ＶＩＰ
−１（＊）は０．６−０．７５ＭＮａＣｌに対応する第
２ピークにて溶離した。インリ・−トは示された部分か
らの５０Ｍｍ割切れる値が適用された１０−１８％アク
リルアミドＷ４調庶５ＤＳ−ＰＡＧＥを示す。 第５図は制御体と悪液質性／ＳＮＦの対比投与と共に本
発明の炎症サイトキンの皮下投与に続き４時開固定した
Ｃ３ト１／Ｈｅ　Ｊフートバッドの顕ｖａ鎖写真を示す
。組織がバッファー処理されたホルマリン内に固定され
、ヘマトキシリン・イオージョンで汚染された。倍率は
４００倍である。写真へ−通常のヒスドロジーを表わす
ジャム投与写真Ｂ−１ｏｏ　ｎ９　　ＶＩＰ−１：好中
球及びバスト細胞の中程度の浸潤　写真ＣＣ−１００ｎ
悪液質性／１ＮＦ：好中球の中程度の浸潤　写真Ｄ１０
””　シルｒ　Ｍ　ｌ−Ｐ　：ヌＡ−カル・ネタロシス
による過！Ｏ１浸潤 第６図は本発明の炎症性サイトキンによる好中球ＩＭｆ
ｍ几進の誘引に対する試験結果をグラフ的に表わす。デ
ータは５回の実験の制御移動応答の平均％を表わづ′。 値はゲイの基本塩分溶液の負の制御２１Ｉ（０％）及び
１０−８Ｍ　　ｆ’　Ｍ　ｌ−Ｐ正のυｊ＠（１００％
）に対する好中球移動の％増加として表わしである。 ＊＝％のｎ能人選応答対ＧＢＳＳ単独での著しい増加を
示すＶＩＰ−１の濃度（ＡＮＯＶＡによるｐ＜０．０１
＞ 第７図はヒトの好中球（ＰＭＮ’　Ｓ）による１１２０
２解放を刺激するため炎症性サイトキンの能力に対する
試験結果をグラフ的に示す。抗毒素１！！覆マキクロ・
デス１−板容器内で培養したヒトＰＭＮ’　Ｓが時間０
においてＰＶＡ（１００ｒｌ／ｍ１）（・）９組替え悪
液質性／ＴＮＦ（１０ｍ５７／ｍ１）（△）、ＶＩＰ−
１（１０００ｎｇ／ｍ１）（０）またはバッファー甲独
（制ｔ１］）の等容積（ム）で処理した。Ｈ２Ｊ２リリ
ースは次の４．５時間（！！Ａ液質性／ＴＮＦに対し２
時間）にわたり監視された。値は４回の同様の実験の１
つに、１３ける３倍に対し平均（直上ＳＥＭである。 第８Δ図はネズミの細胞から最初に回収したＭＩＰ−１
αのｃＤＮＡで表わした飽和アミノ酸シーケンスを表わ
す。 第８８図はネズミのｍｒｒａから最初に回収したＭＩＰ
−１βのＣＤＮΔで表わした飽和アミノ酸シーケンスを
表わす。 第９図はＭ　ｒ　Ｐ−１αのｃＤＮ△クローニングで示
される５１２倍の衰退プローブ・プールを示づ。 ベース下側のアスタリスクは２個のブ【］−ブ・プール
の間の一定のベース変化を示す。 第１０図はＭＩＰ−１αに対するＣ　ｌ）　ＮΔクロー
ンの完全な好中球シーケンスを表わす。アンダーライン
が付番プられたシーケンスは主たる延長実験で使用され
た多形核の補合シーケンスを示す。ブリカーソル・ペプ
チドの予測された並進分子Ｍは１０、３４６である。位
置１から始まる飽和ペプチド・シーケンスは長さが６９
のアミノ酸であり憂測分子吊は７８８９である。 第１１図は１＜△Ｗ２Ｇ４．７細胞からの合計ＲＮへの
北側のシミである変換されたネズミの大食１ｉｌ胞ライ
ンの放射線写真である。この細胞は２μｇ／ｍ１で抗毒
素の無い媒体内で６時間にわたりＬＰＳにて刺激された
。制御細胞はＬＰＳの添加されない抗高索の無い媒体と
して６時間与えられた。 各レーン内にロードされたＲＮＡの合計量を図面に示づ
−０ 第１２図は１ｊ）Ｓによる１【ΔＷ２６４．７　ｍＲＮ
ｌｔ引の時閂経′Ａ１１ＩＩ究を表わす。時間経過は時
間数で測定しである。３個のプローブは全てα−（３２
ｐ）ｄＣＴＰでラベル付けされたプラスミツドｃＤＮＡ
クローンであった。 第１３図はＳ　ＯＳ−ヒドロキシルアパタイト・クロ７
トグラフイーによるＶＩＰ−１の成分ペプチドへの分解
をグラフ的に示す。ＶＩＰ−１（５００μｇ）が前述と
如＜５ＯＳ−ヒドロキシルアバタイ１−に適用され分割
された。０．５ｍｌの部分が集められ、５Ｏ８−ＫＡＧ
Ｅで分析されブラケットで示される如くプールされた。 （１＝ＭＩＰ−１α：２−ＭＩＰ−１β） 第１４図はＮ−ターミナル・アミノ酸シーケンスを示す
る（△（精製ＭＩＰ−１αのＮ−ターミナル・アミノ酸
シーケンス：（Ｂ）精ＶＭＩＰ−１βのＮ−ターミナル
・アミノ酸シーケンス、アンダーラインした残基（２−
β）は多形核プローブ・プールを作る目的に使用された
。（Ｃ）精製された元のＭＩＰ−１に対し報告された元
のＮ−ターミナル・アミノ酸一致シーケンス。マイナー
残基に対応するアミノ酸残基がカッコ内に示しである。 第１５図はＭＩＰ−１βに対するｃＤＮＡり［１−ンの
完全なニュータレオタイド・シーケンスを小す。予測さ
れた変換分子量は１０，１６９ダルトンである。位置１
から始まる飽和蛋白質シーケンスは長さが６９のアミノ
酸であり、　７８３２ダルトンの予測分子Ｍを有してい
る。 第１６図はホップとウッドの計算式を適合させるコトニ
よすｎ１ｔＬサレタＭ　Ｉ　Ｐ−１ａ（−−−）及 びＭ　ＨＰ　−１β の良さに沿った概算さ れている局部内水治療をグラフ的に示す。 特 訂 出 願 人 ザ ロックフェラー ユニバーシティ Ｆ　Ｉ　Ｇ、　２ 図面の浄ｉ３（内容に変更なしン Ｆ　Ｉ　Ｇ、　ｌ ＦＩＧ、４ Ｈｏｕｒｓ ＦＩＧ、６ ＦＩＧ、９ ＡＬＡ　ＰＲＯＴＹＲＧＬＹ　ＡＬＡ　ＡＳＰ　ＴＨＲ
ＰＲＯＴＨＲＡＬＡ　ＣＹＳ　ＣＹＳ　　Ｐｌ（Ｅ　Ｓ
ＥＲＴＹＲ５ＥＲＡＲＧ　　ＬＹＳ　　工ＬΣ　ＰＲＯ
ＡＲＧ　ＧＬＮ　ＰＨＥ　　工ＬＥ　ＶＡＬ　ＡＳＰ　
ＴＹＲＰＨＥ　ＧＩ、Ｕ　ＴＨＲＳＥＲ５ＥＲＬＥＵ　
ＣＹＳ　ＳＥＲＧＬＮ　ＰＲＯＧＬＹ　ＶＡＬ　工ＬＥ
　ＰＨＥ　ＬＪ：Ｕ　ＴＨＲＬＹＳ　ＡＲＧ　ＡＳＮ　
ＡＲＧ　ＧＬＮ工ＬＥ　　ＣＹＳ　ＡＬＡ　ＡＳＰ　Ｓ
ＥＲＬＹＳ　ＧＬＵ　ＴＨＲＴＲＰ　ＶＡＬ　ＧＬＮ　
ＧＬＵ　ＴＹＲ工ＬＥ　ＴＨＲＡＳＰＬＥＵ　　ＧＬＵ
　　ＬＥＵ　ＡＳＮＡＬＡＡＬＡ　ＰＲＯＭＥＴ　ＧＬ
Ｙ　ＳＥＲＡＳＰ　ＰＲＯＰＲＯＴＨＲＳＥＲＣＹＳ　
ＣＹＳ　ＰＨＥ　ＳＥＲＴＹＲ’ｒ）ｒＲ５ＥＲＡＲＧ
　ＧＬＮ　ＬＥＵ　Ｈ工Ｓ　ＡＲＧ　ＳＥＲＰＨＥ　Ｖ
ＡＩ、ＭＥＴ　ＡＳＰ　ＴＹＲＴＹＲＧＬＵ　ＴＨＲ５
ＥＲ５ＥＲ’ＬＥＴＪ　ＣＹＳ　ＳＥＲＬＹＳ　ＰＲＯ
ＡＬＡ　ＶＡＬ　ＶＡＬ　ＰＩＥ　ＬＥＵ　ＴＫＲＬＹ
Ｓ　ＡＲＧ　ＧＬＹ　ＡＲＧＧＬＮ　工ＬＥ　ＣＹＳ　
ＡＬＡ　ＡＳＮ　ＰＲＯＳＥＲＧＬＵ　ＰＲＯＴＲＰ　
ＶＡＬ　ＴＨＲＧＬＵ　ＴＹＲＭＥＴ　５ＥＲＡＳＰ　
　ＬＥＵ　ＧＬＵ　　ＬＥＵ　Ａ；ＮＦＩＧ、８Ｂ ＡＡ（、ＣＡＧＣＡＧＣＣＡＧＴＡＣＣＡＧＴＣＣＣＴ
ＴＴＴＣＴＧＴＴＣＴＧＣＴＧＡＣＭＧＣＴＣ＾ＣＣＣ
ＴＣＴＧＴＣＡＣＣＴＧＲＡＷ＋ ＡＷ− ８Ｓ ８Ｓ− 〜２．０にし −１，６ｋｂ ＴＡＡＣＡＡＧＴＡＡＡＡＡＡ Ｆ　Ｉ　Ｇ、　１２ ５Ｏ５−Ｈｙｄｒｏｘｙｌａｐａｔｉｔｅ　Ｃｈｒｏｍ
ａｔｏｇｒａｐｈｙＦ　Ｉ　Ｇ、　１３ Ｈｕｒｉｎｃ　ＨＩＰ１β Ｔｒａｎｓｌａｔａｄ　Ｍｏ１．　’　Ｗｅｉａｈｔ−
１０１６９，４７■ Ｇ。 第４頁の続き ・［相］ｒｏｔ、　ＣＩ−’ 識別記号 庁内整理番号 優先権主張 ［相］発明者 ［相］１９８８年９月２１日［相］米国（ＵＳ）［相］
２３８，９３７ステフアン　デイ、ウ　　アメリカ合衆
国　ニューヨーク州　１００４４．ニューヨークルブ　
　　　　　　　　　　エイビーティ、　４３６．メイン
　ストリート　師手 続 ４件１奮１ 正置 手続補正棗（方式） ％式％ 弁珂す ５６補正命令の日付（自発補正） 昭和　　年　　Ｊｌ　　　１」 ！、１ 川 政 昭和６３年１２月２０日 ２）図面 ナーさ ′？′） 補　　　　正　　　　古 第２図（図面代用写真）は本発明の炎症性す１、明ＩＩ
！力の第１１６頁第１１行目から第１１８頁第１５行目
までを下記の如く補正する。 記 ［第１図（図面代用写真）はＲＡＷ２６４．７細胞の表
面浮遊物から炎症性サイトキンの準備１回収を行うグラ
フと電気泳＃Ｊゲルのオシ１コ波形を組合せて表わす。 ＲＡＷ２１３４．７からのＱ縮、ろ遇された表面浮遊物
の分別ＥノＱで行われた。 表面浮遊物、神経細胞物質、２リツトルが２０倍ニ濃縮
され、２０ｍＭトリ）ｌ　Ｃ１、ｏ　１−１８．０の６
リツトルに対してろ過された。濃縮された表面面ｔＩＴ
ｔ物が七ノＱに適用され同じバッフ？−内で０ないし１
ＭのＮａＣ１の直線勾配で洗別された。ＶＩＰ−１（：
Ｉ：）は大略０．３７Ｍ　Ｎ　ａ　Ｃ１にて悪液質派性
／ＴＮＦ　（＊＊）の僅かに前に洗別された。インサー
１−は示された部分からの５０μｍが適用された１０−
１５％５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。 ［１）ゲルのオシロ波形を組合せて丞す。七ノＱからの
部分をビークＶＩＰ−１が２００μｍに濃縮され１００
ｒｒ＋ｌｙｌ酢酸アンモニアでスーパーローズ１２カラ
ム均衡に適用された。ＶＩＰ−１（＊）はボイド容積内
で溶離され、悪法性／丁ＮＦ（＊＊）から充分に分離さ
れた。インリートは示された部分からの５０μｍ割り切
れる値が適用された１０−１８％Ｓ　ＯＳ　−Ｐ　Ａ　
Ｇ　Ｅを示す。ダッガーはマーカーどして（重用された
精ＷＭ［１つ−１を小１゜ 第３図は本発明の炎症性サイトキンの最初の３１個の位
置の一致した部分アミノ酸シーケンスを表わす。カッコ
内の残りは「マイナー４１残基が材料の！Ｉｌｉ！なる
バッチで異なるシーケンスにて再生可能的に得られた位
置を示す。 第４図（図面代用写真）１１本発明の炎症性サイトキン
をヘパリンに結合し溶離するグラフと電気泳動ゲルのオ
シロ波形を組合せて示す。１２４Ｒに濃縮しろ過したＬ
ＰＳ刺激したＲΔＷ２６１１．７表面浮遊物の２ｍｌを
ヘパリンセファローズ・カラムに適用し、　０．０２Ｍ
　　ノリＨＣＩバッフ７＋、　ｐＩ−１７，８内でＯた
いし２Ｍ　　ＮａＣ１の直線勾配にて溶離した。２つの
ｔ要ピークが観察された。ＶＩＰ−１（＊）は０．６−
０．７５Ｍ　　ＮａＣｌに対応する第２ピークにて溶離
した。イン１ナートは示された部分からの５０μｍ割切
れる値が適用された１０−１８％アクリルアミド階調度
５ＤＳ−ＰＡＧＥを示す。 第５図△乃至第５図Ｄ（図面代用写真）は制御体と悪液
質性／ＳＮＦの対比投与と共に本発明の炎症サイトキン
の皮下投与に続き４時開固定したＣ　３　Ｈ／　Ｈｅ　
Ｊフートパッドの生物の形態を示す。組織がバッフ？−
処理されたホ」２、明細書の第１２１頁第４行目から同
頁第１３行目までをＦ記の如く補ｔＥする。 記 「第１１図（図面代用写真）はＲＡ　Ｗ２Ｂ５．７　［
１胞からの合計ＲＮ△の北側のシミである変換されたネ
ズミの大食ｍ胞うインのＸ線写真である。 この細胞は２μｇ７ｍ＋で抗毒素の無い媒体内で６時間
にわたりＬＰＳにて刺激された。１ｂＱａｌｌ細胞はＬ
ＰＳの添加されない抗毒素の無い媒体として６時間与え
られた。各レーン内にロードされたＲＮＡの合計量を図
面に示す。 第１２図（図面代用写真）はＬＰＳによるＲＡＷ２６４
．７ｍＲＮＡ誘引のＸ線写真で時間経過研究を表わす。 時間経過は時間数で」 ３、図面の浄書（内容に変更なし）を別紙の如く提出す
る。 ４、今回の指令書で補正を命じられました明ｌＩ閤の浄
書は昭和６３年１２月５日付で提出済みであります。 特許出願人　　　　ザ　ロックフェラ−ユニバーシティ

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １）ヘパリンに結合出来、皮下投与した際多形核細胞の
    浸潤を特徴とする局部的な炎症を誘発出来試験管内に多
    形核細胞機能亢進を誘発させることが出来、一方、同化
    酵素リポプロテイン・リパーゼの活動の抑止、悪液質性
    ／ＴＮＦ反応細胞の細胞毒素性の発生、菌体内毒素抗性
    Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ胸腺細胞の芽胞生殖の促進、又は一次チ
    オグリコール酸塩誘引マウス大食細胞により悪液質性／
    ＴＮＦの発生を誘引する能力を欠くことが出来る純粋化
    された形態の蛋白質から成る炎症性サイトキン。 ２）前記サイトキンが生理的条件下で陰イオン性であり
    、高塩分濃度にてヘパリンに結合し、低塩分バッファー
    で約１０＾６ダルトンより高い高分子量の塊を形成する
    傾向があり請求項１記載の炎症性サイトキン。 ３）前記サイトキンが兎を発熱出来且つ過酸化物の生成
    または試験管内のヒトの好中球に呼吸突発を誘引出来る
    請求項１記載の炎症性サイトキン。 ４）前記サイトキンが侵入的刺激を伴なうような刺激剤
    で培養可能な動物の細胞から誘導出来る請求項１記載の
    炎症性サイトキン。 ５）前記サイトキンがクロナール反覆により発生される
    細胞から得られる請求項１記載の炎症性サイトキン。 ６）実質上第１０図に示されたものと同一のアミノ酸シ
    ーケンスを有する請求項１記載の炎症性サイトキン。 ７）実質上第８Ｂ図に示されたものと同じアミノ酸シー
    ケンスを有する請求項１記載の炎症性サイトキン。 ８）前記サイトキンや実質上第８Ａ図及び第８Ｂ図に示
    されたものと同じアミノ酸シーケンスを有するペプチド
    対を含む請求項１記載の炎症性サイトキン。 ９）着脱自在のラベルがラベル付けしてある請求項１記
    載の炎症性サイトキン。 １０）ラベルが酵素である請求項９記載の炎症性サイト
    キン。 １１）ラベルがペルオキシタース、β−グルクロニダー
    ゼ、β−Ｄ−グルコシターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダー
    ゼ、ウレアース、グルコスオキシダース・プヤス・ペル
    オキシダース、ガラクト−ゼオキシダース・プラス・ペ
    ルオキシダース及びアルカリ性リン酸塩から成るグルー
    プより選択する請求項１０記載の炎症性サイトキン。 １２）ラベルが紫外線に露されると螢光を発する薬品で
    ある請求項９記載の炎症性サイトキン。 １３）薬品がフルオレスセイン、ロタミン及びアウラミ
    ンから成るグループより選択される請求項１２記載の炎
    症性サイトキン。 １４）ラベルが放射性元素である請求項９記載の炎症性
    サイトキン。 １５）放射性元素が１４＿Ｃ、１２５＿Ｉ、１３１＿Ｉ
    、２５＿Ｓ及び３＿Ｈから成るグループより選択される
    請求項１４記載の炎症性サイトキン。 １６）ヘパリンに結合出来、皮下投与した際多形核細胞
    の浸潤を特徴とする局部的ふくらみを誘引出来、試験管
    内に多形核細胞機能亢進を誘引出来る一方、同化酵素リ
    ポプロテイン・リパーゼの活動の抑止、菌体内毒素抵抗
    Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ胸線細胞の芽胞生殖の刺激、または一次
    ツオグリコール酸塩誘引マウス大食細胞による悪液質性
    −ＴＮＦの発生を誘引する能力を欠くことが出来る炎症
    性サイトキンを準備する方法であつて、 Ａ乳房から細胞のサンプルを集めること； Ｂ乳房に対する侵入作用と関連ある刺激材料で前記細胞
    の一部分を培養すること； Ｃ前記炎症性サイトキンを発生するよう前記細胞を誘引
    すること；及び Ｄ前記炎症性サイトキンを前記細胞の塊から集めた表面
    浮遊物から分離させることから 成る方法。 １７）前記炎症性サイトキンが生理学的条件下で陰イオ
    ン性であり高塩分濃度でヘパリンと結合し低塩分バッフ
    ァーの約１０＾６ダルトン以上の高分子間の塊を形成す
    る傾向がある請求項１６記載の方法。 １８）前記炎症性サイトキンが兎に発熱誘引出来且つ試
    験管内のヒトの好中球に過酸化物の生成または呼吸突発
    を誘引出来る請求項１６記載の方法。 １９）前記炎症性サイトキンが侵入性刺激剤を伴う刺激
    材料で培養出来る動物の細胞から得られる請求項１６記
    載の方法。 ２０）前記刺激材料が内毒素を含む請求項１６記載の方
    法。 ２１）前記炎症性サイトキンが実質上第８Ａ図に示され
    たものと同じアミノ酸シーケンスを有する請求項１６記
    載の方法。 ２２）前記炎症性サイトキンが実質的に第８Ｂ図に示さ
    れたものと同じアミノ酸シーケンスを有する請求項１６
    記載の方法。 ２３）前記炎症性サイトキンが実質上第８Ａ図及び第８
    Ｂ図に示されたものと同じアミノ酸シーケンスを有する
    ペプチド対を含む請求項１６記載の方法。 ２４）ヘパリンと結合出来、皮下投与した際多形核細胞
    浸潤を特徴とする局部的ふくらみを誘引出来且つ試験管
    内に多形核細胞機能亢進を誘引出来る一方、同化酵素リ
    ポプロテイン・リパーゼの活動の抑止、悪液質性／ＴＮ
    Ｆ反応細胞の細胞毒素性の発生、菌体内毒素抵抗性Ｃ３
    Ｈ／ＨｅＪ胸線細胞の芽胞生殖促進または一次チオグリ
    コール酸塩投与マウス大食細胞による悪液質性／ＴＮＦ
    の発生誘引をする能力を欠けることが出来る純粋な形態
    の蛋白質から成る炎症性サイトキンに対し培養される抗
    体。 ２５）前記炎症性サイトキンが生理的条件下で陰イオン
    であり、高塩分濃度にてヘパリンに結合し低塩分バッフ
    ァーの約１０＾６ダルトン以上の高分子量の塊を形成す
    る傾向がある請求項２４記載の抗体。 ２６）前記炎症性サイトキンが兎内に発熱を誘引出来、
    試験管内のヒトの好中球に過酸化物の生成または呼吸突
    発を誘引出来る請求項２４記載の抗体。 ２７）前記炎症性サイトキンが侵入刺激剤を伴う刺激材
    料で培養される動物の細胞から得ることが出来る請求項
    ２４記載の抗体。 ２８）前記炎症性サイトキンが実質上第８Ａ図で述べた
    ものと同じアミノ酸シーケンスを有する請求項２４記載
    の抗体。 ２９）前記炎症性サイトキンが実質上第８Ｂ図で述べた
    ものと同じアミノ酸シーケンスを有する請求項２４記載
    の抗体。 ３０）前記炎症性サイトキンが実質上第７Ａ図及び第８
    Ｂ図で述べたものと同じアミノ酸シーケンスを有するペ
    プチド対を含む請求項２４記載の抗体。 ３１）着脱可能なラベルをラベル付けされた請求項２４
    記載の抗体。 ３２）ラベルが酵素である請求項３１記載の抗体。 ３３）ラベルがペルオキシダーズ、β−グルクロニダー
    ゼ、β−Ｄ−グルコシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダー
    ゼ、ウレアース、グルコースオキシダーゼ・プラス・ペ
    ルオキシダーズ、ガラクトーゼ、オキシダーゼ・プラス
    ・ペルオキシダーズ及びアルカリ性リン酸塩から成るグ
    ループから選択した請求項３２記載の抗体。 ３４）ラベルが紫外線に露された際螢光を発する薬品で
    ある請求項３１記載の抗体。 ３５）薬品がフルオレシン、ルダミン、イウラミンから
    成るグループより選択された請求項２７記載の抗体。 ３６）ラベルが放射性元素である請求項２４記載の抗体
    。 ３７）放射性元素が１４＿Ｃ、１２５＿Ｉ、１３１＿Ｉ
    、３５＿Ｓ及び３＿Ｈから成るグループから選択された
    請求項３６記載の抗体。 ３８）前記抗体が侵入刺激剤に露される乳房と抗毒素内
    に存在している請求項２４記載の抗体。 ３９）ヘパリンと結合出来る炎症性サイトキンの存在を
    測定し、皮下投与した際多形核細胞の浸潤を特徴とする
    局部的ふくらみを誘引出来且つ試験管内に多形核細胞機
    能亢進を誘引する一方、同化酵素リポプロテイン・リパ
    ーゼの活性を抑止し、悪液雲性／ＴＮＦ反応細胞の細胞
    毒素性の発生、菌体内毒素抵抗Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ胸線細胞
    の芽胞生殖の刺激または一次チオグリコール酸塩投与マ
    ウス大食細胞による悪液質性〜ＴＮＦの発生誘引する能
    力を欠く方法であって、前記炎症性サイトキンが、Ａ特
    に知られている侵入刺激剤の対応する個数に露された動
    物の細胞から前記炎症性サイトキンの少なくとも１つの
    サンプルを準備すること； Ｂ前記炎症性サイトキンのサンプルに向けられる少なく
    とも１個の対応する抗体または 結合パートナーを準備すること； Ｃ前記炎症性サイトキン・サンプルと前記抗体または結
    合パートナーから成るグループより選択した材料に検出
    可能性ラベルを付けること； Ｄラベル付けされない段階Ｃからの材料及び前記炎症性
    サイトキンが適当な基材上で見出される乳房からとられ
    る生理学的サンプルから成るグループより選択された材
    料を固定すること； Ｅ段階Ｃからのラベル付けされた材料を前記生理学的サ
    ンプルと接触させ且つ固定材料に接触させること； Ｆ前記固定材料に結合される段階Ｃからの材料を前記固
    定材料に結合されない段階Ｃからの材料と分離すること
    ；及び Ｇ前記ラベル付けされた材料の存在について前記結合さ
    れた材料を調べること から成る方法。 ４０）ヘパリンと結合出来、皮下投与した際多形核細胞
    の浸潤を特徴とする局部的ふくらみを誘引出来且つ試験
    管内に多形核細胞機能亢進を誘引出来る一方、同化酵素
    リポプロテイン・リパーゼの活性抑止、悪液毒性／ＴＮ
    Ｆ反応細胞の細胞毒素性の発生、菌体内毒素反応Ｃ３Ｈ
    ／ＨｅＪ胸線細胞の芽胞生殖の刺激または一次チオグリ
    コール酸塩投与マウス大食細胞による悪液質性／ＴＮＦ
    の発生の誘引をする能力を欠くことが出来る炎症性サイ
    トキンに対する結合箇所を測定する方法であつて前記炎
    症性サイトキンに対する結合箇所が、Ａ個別に知られて
    いる侵入刺激剤の対応する個数から前記炎症性サイトキ
    ンの少なくとも１つのサンプルを準備すること； Ｂ着脱可能なラベルを前記炎症性サイトキン・サンプル
    に付けること； Ｃラベル付けされた炎症性サイトキン・サンプルを前記
    サイトキンに対する結合箇所が予測される乳房からの生
    理学的サンプルに接触させること；及び Ｄ前記ラベル付けされた炎症性サイトキン・サンプルの
    存在に対し結合作用において前記生理学的サンプルを調
    べることにより測定されるようにした方法。 ４１）乳房内の所定の侵入刺激剤と組合された炎症性サ
    イトキンの存在を測定する方法から成る請求項３９記載
    の方法。 ４２）乳房内の侵入または特発性刺激剤の存在を決定す
    る方法から成る請求項３９記載の方法。 ４３）前記侵入刺激剤が感染になつている請求項３９記
    載の方法。 ４４）前記侵入刺激剤がバクテリア感染、ビールス性感
    染、原生動物感染、腫瘍性乳房細胞及び毒素から成るグ
    ループより選択される請求項３９記載の方法。 ４５）前記炎症性サイトキンがＡ乳房細胞のコロニーを
    分離すること； Ｂ前記刺激材料が前記細胞を刺激して前記炎症性サイト
    キンを発生させるのに充分な時間にわたり前記細胞に前
    記刺激材料を投与すること； Ｃ前記炎症性サイトキンを前記細胞から分離すること により準備される請求項３９記載の方法。 ４６）前記刺激材料が菌体内導素を含む請求項４５記載
    の方法。 ４７）前記菌体内毒素がリポポリサツカリドを含む請求
    項４６記載の方法。 ４８）炎症性サィトキンを含む生長媒体内に受容体を有
    する試験細胞のコロニーを培養し、試験用薬品を加え、
    しかる後試験細胞の前記コロニー上の前記受容体による
    前記薬品の反応を測定することから成る乳房体内の細胞
    に対する炎症性サイトキンの前記受容体と反応出来る炎
    症性サイトキンの発生及び／または活性を刺激する薬品
    の能力を試験する方法であって、前記炎症性サイトキン
    が、ヘパリンと結合出来、皮下投与時に多形核細胞浸潤
    を特徴とする局部的ふくらみを誘引出来且つ試験管内に
    多形核細胞機能亢進を誘引出来る一方同化酵素リポプロ
    テイン・リパーゼの活性の抑止、悪液質性／ＴＮＦ反応
    細胞の細胞毒素性の発生、菌体内酵素抵抗Ｃ３Ｈ／Ｈｅ
    Ｊ胸線細胞の芽胞生殖の刺激または一次チオグリコール
    酸塩投与マウス大食細胞による悪液質性／ＴＮＦの発生
    誘引能力を欠くことが出来るようにした方法。 ４９）前記炎症性サイトキンが生理学的条件下において
    陰イオン性であり、高塩分濃度においてヘパリンと結合
    し、低塩分バツフアー内で約１０＾６ダルトン以上の高
    分子間の塊を形成する傾向がある請求項４８記載の方法
    。 ５０）前記炎症性サイトキンが兎内に発熱を誘引出来且
    つ試験管内のヒトの好中球内に過酸化物生成または呼吸
    突発を誘引出来る請求項４８記載の方法。 ５１）前記炎症性サイトキンが侵入刺激剤を伴なう如き
    刺激材料で培養出来る動物の細胞から得られる請求項４
    ８記載の方法。 ５２）炎症性サイトキンがクロナール復成により発生さ
    れる細胞から得られる請求項４８記載の方法。 ５３）ヘパリンと結合出来、皮下投与時に多形核細胞浸
    潤を特徴とする局部的ふくらみを誘引出来且つ試験管内
    に多形核細胞機能亢進を誘引出来る一方、同化酵素リポ
    プロテイン・リパーゼの活性抑止、悪液質性／ＴＮＦ反
    応細胞の細胞毒素性の発生、菌体内毒素抵抗Ｃ３Ｈ／Ｈ
    ｅＪ胸線細胞の芽胞生殖の刺激または一次チオグリコー
    ル酸塩投与マウス大食細胞による悪液質性／ＴＮＦの発
    生誘引能力を欠くことが出来る蛋白質から成る炎症性サ
    イトキンを接種した観察可能な細胞試験コロニーを含む
    炎症性サイトキンの発生及び−または活性を調整する能
    力に対し薬品と他の薬剤を集団検診する分析システム。 ５４）前記サイトキンが生理学的条件下で陰イオン性で
    あり、高塩分濃度においてヘパリンと結合し且つ低塩分
    バツフアー内で約１０＾６ダルトン以上の高分子量の塊
    を形成する傾向のある請求項５３記載の分析システム。 ５５）前記サイトキンが兎内に発熱を誘引出来且つ試験
    管内のヒトの好中球に過酸化物を生成または呼吸特発を
    誘引出来る請求項５３記載の分析システム。 ５６）前記炎症性サイトキンが侵入刺激剤を伴なう如き
    刺激材料で培養され得る動物の細胞から得ることが出来
    る請求項５３記載の分析システム。 ５７）前記炎症性サイトキンがクロナール復生により作
    成される細胞で得られる請求項５３記載の分析システム
    。 ５８）抗毒素または水性媒体内にて炎症性サイトキンを
    示す試験キットであつて Ａヘパリンと結合出来、皮下投与時に多形核細胞浸潤も
    特徴とする局部的ふくらみを誘引出来且つ試験管内に多
    形核細胞機能亢進を誘引出来る一方、同化酵素リポプロ
    テイン・リパーゼの活性の抑止、悪液質性／ＯＮＦ反応
    細胞の細胞毒素性の発生β菌体内導素抵抗Ｃ３Ｈ／Ｈｅ
    Ｊ胸線細胞の芽胞生殖の刺激または一次チオグリコール
    酸塩投与マウス大食細胞による悪液質性／ＴＮＦの生成
    誘引をする能力を欠くことが出来る炎症性サイトキンま
    たは当該サイトキンに対する特定の結合パートナーを検
    出可能レベルに直接的または間接的に付けることで得ら
    れる少なくとも１個のラベル付きの免疫化学反応成分の
    所定量。 Ｂ他の試薬 Ｃ前記キットの使用指示 から成る試験キット。 ５９）前記炎症性サイトキンや生理学的条件下において
    陰イオン性であり、高塩分濃度においてヘパリンと結合
    し、低塩分バッファー内で約１０＾６ダルトン以上の高
    分子量の塊を形成する傾向がある請求項５８記載の試験
    キット。 ６０）前記炎症性サイトキンが兎内に発熱誘引出来且つ
    試験管内のヒトの好中球に過酸化物の生成または呼吸突
    発を誘引出来る請求項５８記載の試験キット。 ６１）前記炎症性サイトキンが侵入刺激剤を伴なう如き
    刺激材料で培養可能な動物の細胞から得ることが出来る
    請求項５８記載の試験キット。 ６２）前記炎症性サイトキンがクロナール復生により発
    生される細胞から得られる請求項５８記載の試験キット
    。 ６３）ラベルが酵素である請求項５８記載の試験キット
    。 ６４）炎症性サイトキンに対する抗体、前記炎症性サイ
    トキンの形成を禁止出来る薬剤、前記炎症性サイトキン
    に対する拮抗剤として作用出来る前記炎症性サイトキン
    に対する抗体でない薬剤から成るグループより選択され
    た材料の炎症性及び／または解熱量を乳房に投与するこ
    とから成り、前記炎症性サイトキンが、ヘパリンと結合
    出来、皮下投与時に多形核細胞浸潤を特徴とする局部的
    ふくらみを誘引出来且つ試験管内に多形核機能亢進を誘
    引出来る一方、同化酵素リポプロテイン・リパーゼの活
    性抑止、悪液質性／ＴＮＦ反応細胞の細胞導素性の発生
    、菌体内毒素抵抗Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ酵素の芽胞生殖の刺激
    または一次チオグリコール酸塩投与マウス大食細胞によ
    る悪液質性／ＴＮＦの発生誘引を欠くことが出来る蛋白
    質を含むことから成る乳房の炎症及び／または発熱を治
    療する方法。 ６５）前記炎症性サイトキンが生理学的条件下で陰イオ
    ン性であり、高塩分濃度においてヘパリンと結合し、低
    塩分バッファーにて約１０＾６ダルトン以上の分子量の
    塊を形成する傾向がある請求項６４記載の方法。 ６６）前記サイトキンが兎内に発熱誘引出来且つ試験管
    内のヒトの好中球内に過酸化物の生成または呼吸突発を
    誘引出来る請求項６４記載の方法。 ６７）前記炎症性サイトキンが侵入刺激剤を伴なう如き
    刺激材料で培養可能な動物の細胞から得ることが出来る
    請求項６４記載の方法。 ６８）前記炎症性サイトキンがクロナール復生により発
    生される細胞から得られる請求項６４記載の方法。 ６９）炎症性サイトキンに対する抗体、前記炎症性サイ
    トキンの生成を禁止出来る薬剤、前記炎症性サイトキン
    の活性に拮抗することが出来る前記炎症性サイトキンに
    対する抗体でない薬剤、前記炎症及び／または前記発熱
    を防止するのに有効な量のこれら薬剤の混合物から成る
    グループより選択した材料を投与することから成り、前
    記炎症性サイトキンが、ヘパリンと結合出来β皮下投与
    時に多形核細胞浸潤を特徴とする局部的ふくらみを誘引
    出来且つ試験管内に多形核細胞機能亢進を誘引出来る一
    方、同化酵素リポプロテイン・リパーゼの活性抑止、悪
    液質性／ＴＮＦ反応細胞の細胞毒素性の発生、菌体内毒
    素抵抗Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ胸線細胞の芽胞生殖の発生、また
    は一次チオグリコール酸塩投与マウス大食細胞による悪
    液質性／ＯＮＦの発生誘引が出来る蛋白質から成る、乳
    房内の炎症及び／または発熱の発生を防止する方法。 ７０）前記炎症性サイトキンが生理学的条件下で陰イオ
    ン性であり、高塩分濃度によつてヘパリンと結合し、低
    塩分バッファー内の約１０＾６ダルトン以上の高分子量
    の塊を形成する傾向がある請求項６９記載の方法。 ７１）前記炎症性サイトキンが兎内に発熱誘引出来且つ
    試験管内のヒトの好中球に過酸化物の生成または呼吸突
    発を誘引出来る請求項６９記載の方法。 ７２）前記炎症性サイトキンがクロナール復生で発生さ
    れる細胞から得られる請求項６９記載の方法。 ７３）前記炎症性サイトキンが侵入刺激剤を伴なう如き
    刺激材料で培養可能な動物の大食細胞から得ることが出
    来る請求項６９記載の方法。 ７４）炎症性サイトキン、前記炎症性サイトキンの発生
    及び／または活動を促進出来る薬剤。 前記炎症性サイトキンの活動を模倣出来る薬剤及びこれ
    らの薬剤の混合物から成るグループより選択した材料の
    治療鶴に有効な量を乳房に投与することから成り、前記
    炎症性サイとキンが、ヘパリンと結合出来、皮下投与時
    に多形核細胞浸潤を特徴とする局部的なふくらみを誘引
    し且つ試験管内に多形核細胞機能亢進を誘引出来る一方
    、同化酵素リポプロテイン・リパーゼの活性抑止、悪液
    質性／ＴＮＦ反応細胞の細胞毒素性の発生、菌体内毒素
    抵抗Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ胸線細胞の芽胞生殖の刺激または一
    次チオグリコール酸塩投与マウス大食細胞による悪液質
    性／ＴＮＦの発生誘引を行う能力を欠くことが出来る蛋
    白質から成る、乳房内の腫瘍性疾病及び非腫瘍性疾病を
    治療する方法。 ７５）前記炎症性サイトキンが生理学的条件下で陰イオ
    ン性であり、高塩分濃度にてヘパリンと結合し、低塩分
    バツファー内で約１０＾６ダルトン以上の高分子量の塊
    を形成する傾向がある請求項７４記載の方法。 ７６）前記炎症性サイトキンが兎内に発熱誘引出来且つ
    試験管内のヒトの好中球に過酸化物生成または呼吸突発
    を誘引出来る請求項７４記載の方法。 ７７）前記炎症性サイトキンが侵入刺激性を伴なう如き
    刺激材料で培養可能な動物の細胞から得ることが出来る
    請求項７４記載の方法。 ７８）前記炎症性サイトキンがクロナール復生により作
    成される細胞から得られる請求項７４記載の方法。 ７９）乳房内の炎症及び／または発熱を治療する薬剤成
    分であって、 Ａ炎症性サイトキンに対する抗体、前記炎症性サイトキ
    ンの発生を禁止出来る薬剤、前記炎症性サイトキンの活
    性を解消出来る前記炎症性サイトキンに対する抗体でな
    い薬剤及びこれらの混合物から成るグループから選択さ
    れた材料の製薬的に有効な量を含み、前記炎症性サイト
    キンが、ヘパリンと結合出来、皮下投与時に多形核細胞
    浸潤を特徴とする局部的なふくらみを誘引し且つ試験管
    内に多形核細胞機能亢進を誘引出来る一方、同化酵素リ
    ポプロテイン・リパーゼの活性抑止β悪液質性／ＴＮＦ
    反応細胞の細胞毒素性の活性、抗体内毒素抵抗Ｃ３Ｈ／
    ＨｅＪ酵素の芽胞生殖の促進、または 一次チオグリコール酸塩投与マウス大食細胞による悪液
    質性／ＴＮＦまたはこれに対する特定の結合パートナー
    の生成を誘引する能力を欠くことが出来る蛋白質を含む
    こと；及びＢ製薬的に有効なキャリア から成る製薬成分。 ８０）前記炎症性サイトキンが生理学的条件下において
    陰イオン性であり、高塩分濃度にてヘパリンと結合し低
    塩分バッファー内で約１０＾６ダルトン以上の高分子量
    の塊を形成する傾向がある請求項１９記載の成分。 ８１）前記炎症性サイトキンが兎内に発熱を誘引出来且
    つ試験管内のヒトの好中球過酸化物の生成または呼吸突
    発を誘引出来る請求項７９記載の成分。 ８２）前記炎症性サイトキンが侵入刺激性を伴なう如き
    刺激材料で培養可能な動物の細胞から得ることが出来る
    請求項７９記載の成分。 ８３）前記炎症性サイトキンがクロナール復生により作
    成される細胞から得られる請求項７９記載の成分。 ８４）乳房の腫瘍性疾病と非腫瘍性疾病の治療を行う製
    薬成分であって、 Ａ炎症性サイトキン、前記炎症性サイトキンの作成及び
    ／または活性を促進出来る薬剤、前記炎症性サイトキン
    の活性を模倣出来る薬剤及びこれらの薬剤の混合物から
    成るグループから選択された材料の製薬的に有効な量を
    含み前記炎症性サイトキンが、ヘパリンと結合出来、皮
    下投与時に多形核細胞浸潤を特徴とする局部的ふくらみ
    を誘引し且つ 試験管内に多形核細胞機能亢進を誘引出来る一方、同化
    酵素リポプロテイン・リパーゼの活性抑止、悪液質性／
    ＴＮＦ反応細胞の細胞毒素性の発生、菌体内毒素抵抗Ｃ
    ３Ｈ／ＨｅＪ酵素の芽胞生殖と促進または一次チオグリ
    コール酸塩投与マウス大食細胞による悪液質性／ＴＮＦ
    、またはこれに対する特定の結合パートナーを生成する
    ことを誘引出来る能力を欠くことが出来る蛋白質を含む
    こと； Ｂ製薬的に有効なキャリア から成る製薬成分。 ８５）前記炎症性サイトキンが生理学的条件下において
    陰イオン性であり、高塩分濃度においてヘパリンと結合
    し低塩分バツフアー内で約１０＾６ダルトン以上の高分
    子量の塊を形成する傾向がある請求項８４記載の成分。 ８６）前記炎症性サイトキンが兎内に発熱誘引出来且つ
    試験管内のヒトの好中球に過酸化物の形成または呼吸突
    発を誘引出来る請求項８４記載の成分。 ８７）前記炎症性サイトキンが侵入刺激を伴なう如き刺
    激材料で培養可能な動物の細胞から得ることが出来る請
    求項８４記載の成分。 ８８）前記炎症性サイトキンがクロナール復生で作成さ
    れる細胞から得られる請求項８４記載の成分。
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