JPH04500970A - マクロファージ由来炎症メディエーター （ｍｉｐ―２） - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 マクロファージ由来炎症メディエータ−（ＭＩＰ−２）関連刊行物 本出願人等は本発明の要旨に関連する幾つかの論文の著者または共同著者である 。これらの論文は米国特許第４．６０３．１０６号に列挙されている論文を補足 するものでその早期の各論文は参考として本明細書に引用する。（Ｉ）〔出願人 セラミとＢ、ビュートレ＋、Ｊ、マホネー、Ｎ、し　トランおよびＰ、ベカレと の共著〕”Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃａｃｈｅｃｔｉｎ、　ａ　Ｌｉ ｐｏｐｒｏｔｅｉｎ　Ｌｉｐａｓｅ−３ｕｐｐｒｅｓｓｉｎｇＨｏｒｍｏｎｅ　 ５ｅｃｒｅｔｅｄ　Ｂｙ　Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ−Ｉｎｄｕｃｅｄ　Ｒａｗ　２６ ４．７　Ｃｅ１ｌｓ　’　。

Ｊ、　ＥＸＰ、　ＭＥＤ、１６１　＋　９８４−９９５　（１９８５年５月）； （２）〔出願人セラミとＭ、カワカミ、Ｊ、Ｒ，マホマホネー、Ｎ、レトラン、 Ｗ、ヴインおよびＹ、イケダとの共著〕”Ｌｉｐｏｐｏｌｙ−ｓａｃｃｈａｒｉ ｄｅ−Ｔｒｅａｔｅｄ　ＲＡＷ　２６４．７　Ｃｅ１ｌｓ　Ｐｒｏｄｕｃｅ　ａ 　Ｍｅｄｉａｔｏｒｌｌｈｉｃｈ　Ｉｒ＋ｈｉｂｉｔｓ　Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉ ｎ　Ｌｉｐａｓｅ　Ｉｎ　３　Ｔ　３−　Ｌ　Ｉ　Ｃｅ１ｌｓ”　。

Ｊ、　ＩＭＭＩＩＮＯＬ、　１３４　（３）　：　１６７３−１６７５　（１９ ８５年３月）；　（３）［出願人セラミとＰ、Ｊ、ホテツ、Ｎ、レトラン。

およびＡ、　Ｈ，フェアラブとの共著］　”Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎいｐａｓｅ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　３　Ｔ　３　Ｃｅ１ｌｓ　ｂｙ　ａ　ｌ（ａｅ ｍａｔｏ−ｐｒｏｔｏｚｏａｎ−ＩｎｄｕｃｅｄＭｅｄｉａｔｏｒ　Ｆｒｏｍ　 Ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ　Ｅｘｕｄａｔｅ　Ｃｅ１ｌｓ”　、ＰＡＲＡＳＩＴＥ　 ＩＭＭＩＪＮＯＬ。

（Ｏｘｆ、）６：２０３　（１９８４）：　（４）Ｃ出願人セラミとＢ、ビュー トレー、Ｄ、グリーンウォールド、Ｊ、Ｄ、ヒュメス１Ｍ。

チャンＹ、　、　Ｃ，Ｅ、パン、ｊ、マチマンおよびＲ，ウレビッチとの共著］ 　”Ｉｄｅｎｔｉｆｙ　ｏｆ　Ｔｕｍｏｒ　Ｎｅｃｒｏｓｉｓ　Ｆａｃｔｏｒ　 ａｎｄ　Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−Ｓｅｃｒｅｔｅｄ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｃａｃｈｅ ｃｔｉｎ　”　、　ＮＡＴＩＩＲＥ　３　ｉ　６　：　５５２−５５４（１９８ ５）；　（５）　Ｃ出願人セラミとＢ、ビュートレー、Ｐ、Ｍ。

トーチ、Ｂ、ディックマンおよびＣ，Ｍ、ＩＪンゴールドとの共著〕”Ａ　Ｍａ ｃｒｏｐｈａｇｅ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｉｎｈｉｂｉｔｓ　Ａｄｉｐｏｃｙｔｅ　Ｇ ｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　：Ａｎ　Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｍｏｄｅｌ　６ｆ 　Ｃａｃｈｅｘｉａ　”　、５ＣＩＥＮＣＥ　２２９　：　８６７−８６９　＜ １９８５）；　（６）［出願人セラミとＢ、ビュートレーおよびｒ、ｗ、ミルサ 、−りとの共著〕　“Ｐａ５ｓｉｖｅ　１ｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎＡｇａｉｎｓ ｔ　Ｃａｃｈｅｃｔｉｎ／Ｔｕｍｏｒ　Ｎｅｃｒｏｓｉｓ　Ｆａｃｔｏｒ　（Ｔ ＮＦ）　ＰｒｏｔｅｃｔｓＭｉｃｅ　Ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　Ｌｅｔｈａｌ　Ｅｆｆ ｅｃｔ　ｏｆ　Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ″、　５ＣＩＥＮＣＥ　２２９　：８６９− ８７１　（１９８５）；　（７）　［出願人セラミ、ウォルペおよびシェリーと Ｂ、ビュートレー、Ｇ、ダバテリス、Ｄ、Ｇ。

ヘッセ、　Ｈ，Ｔ、　ヌビュエン、Ｌ、　Ｙ、モルダワアー、　Ｃ，Ｆ。

ナサーンおよびＳ、Ｆ、ローリイとの共著〕、　“ＭａｃｒｏｐｈａｇｅｓＳｅ ｃｒｅｔｅ　ａ　Ｎｏｖｅｌ　ｔｌｅｐａｒｉｎ−Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｐｒｏｔｅ ｉｎ　ｗｉｔｈ　Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙａｎｄ　Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ　Ｃ ｈｅｍｏｋｉｎｅｔｉｃ　Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ″、Ｊ、ＥＸＰ。

ＭＥＤ、１６７：５７０−５８１　（１９８８）；　（８）［出願人ウォルペ、 セラミおよびテカムーオルソンとＧ、ダバテリス、Ｋ。

ヘームセン、Ｃ，ロイドケ、Ｃ，ガレガス、Ｐ、コイトおよびＪ。

メリーウイーザーとの共著］　、”Ｔｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　Ｃｈａｒａｃｔｅ ｒｉｚａｔｉｏｎｏｆ　ａ　ｃＤＮＡ　ｆｏｒ　Ｍｕｒｉｎｅ　Ｍａｃｒｏｐｈ ａｇｅ　Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ　Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＩＰ）。

＾Ｎｏｖｅｌ　Ｍｏｎｏｋｊｎｅ　ｗｉｔｈ　Ｉｎｆｌａｍｒｎａｔｏｒｙ　ａ ｎｄ　Ｃｈｅｍｏｋｉｎａｔｉｃ　Ｐｒｏ−ｐｅｒｔｉｅｓ　’　、Ｊ、ＥＸＰ 、　ＭＥＤ、　、↓６７　：１９３９−１９４４（１９８８年６月）；　（９） ［各出願人とＣ，ガレゴス、Ｄ、ピュアー、Ｇ、ダバテリス、Ｆ、マシアズおよ びり、コイトとの共著］　、”Ｒｅ５ｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｔｗｏ　 Ｃｏｎｐｏｎｅｎｔｓ　ｏｆ　ＭａｃｒｏｐｈａｇｅＩｎｆｌａｒＤｍａｔｏｒ ｙ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　１　、　ａｎｄ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　Ｃｈａｒａｃ ｔｅｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆＯｎｅ　ｏｆ　Ｔｈｏｓｅ　Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ、 　Ｍ　Ｉ　Ｐ　−１β”　、Ｊ、ＥＸＰ、ＭＥＤ。

１６８：２２５１−２２５９　（１９８８年１２月）；および（１０）〔出願人 ウオルペ、セラミおよびシェリーとり、ジオルス、Ｇ。

タバテリスおよびＲ，ユルトとの共著〕、　“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　 ａｎｄＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ　Ｉｎ ｆｌａｍｍａｔｏｒｙ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　２　″。

本発明に至る研究はナシッナルインスチチューツオブヘールス（ｔｈｅ　Ｎａｔ ｉｏｎｏｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅｓ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ）およびＯ，クツエラ ー財団の認可に一部基づく。

主里皇宣員 本発明は、一般に動物宿主への感染のような侵入性刺激物質およびその効果と相 応する作用の分析および処理方法に関し、とりわけ、そのような侵入性刺激物に 対しての宿主応答において沈降し得る物質の同定に関する。

幾つかの共通の生理学的および生物学的障害は、バクテリア、ウィルス、または 原虫感染；腫瘍；または内毒素のような種々の侵入性刺激物に応答する動物宿主 において並びに自然発生的状態において観察され得る０例えば、これらの応答に は発熱、白血球症、過脂肪血症、食物摂取減退（食物欠乏症）、活力減退、膚痩 （悪液質）、並びに筋肉、白血球および肝臓代謝における他の変調がある。特に 、トリノマノゾーマフ゛ルセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ　ｂｒｕｃｅｉ）を感 染させたウサギの悪液質の生物学的メカニズムを明らかにするための最近の研究 は、最小の寄生虫症を有する動物が死にかけ、血漿超低密度リボたん白質（ＶＬ ＤＬ）の著しい上昇を伴って極端な高トリグリセリド症を示したことを警告した 。Ｃ，Ａ、　ローサーおよびＡ、セラミ、台ＯＬ、　ＢＩＯＣＨＥ門、　ＰＡＩ ？ＡＳＩＴＯＬ、上：３１−３８　（１９８０）を参照されたい。高グリセリド 症状は上記の実験的感染を伴った重篤な悪液質素質の点で注目し得るものであっ た。血ｆｉＶＬＤＬの上昇は末梢組織リポたん白質リパーゼ（ＬＰＬ）活性の喪 失に起因した明化欠陥（Ｃｌｅａｒｉｎｇ　ｄｅｆｅｃｔ）に由来することが示 された。

ＬＰＬ活性低下は他の人々によっても観察されており、この状態はヒトの身体が ショック状にあるときに生じることが示されている。　Ｅ、　Ｂ、マン等、”　 Ｔｈｅ　Ｌｉｐｉｄｓ　ｏｆ　Ｓｅｒｕｍ　ａｎｄ　Ｌｉｖｅｒ　１ｎＰａｔｉ ｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　Ｈｅｐａｔｉｃ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ″、　ＣＬＩＮ、　Ｉ ＮＶＥＳＴ、２４　：　６２３以下（１９４５）を参照されたい；また、ジョン １．ガリン等、＠Ｓｅｒｕｍ　Ｌｉｐｉｄｓ　ｊｎ　Ｉｎｆｅｃｔｔｏｎ　”　 Ｉｌｌ、ＥＮＧＬ、Ｊ、ＭＥＤ、２　８　１　：１０８１−１０８６　（１９６ ９年１１月１３日）；Ｄ、ファースチ等、”　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　Ｔｈｒｅ ｅ　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ　ｏｎ　ＳｅｒｕｍＬｉｐｉｄ ｓ　ｏｆ　Ｒａｂｂｉｔｓ　’　、Ｊ、　ＢＡＣＴＥＲＩＯＬ、　９５　：　１ ６１５以下（１９６８）　；Ｓ、Ｅ、グロスパーク等、”　Ｈｙｐｅｒｌｉｐａ ｅｍｉａ　Ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ　ＶｉｒａｌＩｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ 　Ｃｈｉｃｋｅｎ　Ｅｗｌｂｒｙｏ：　Ａ　Ｎｅｗ　Ｓｙｎｄｒｏｍｅ　”　＋ 　ＮＡＴＵＲＥ（ロンドン＞２０８：９５４以下（１９６５）；ロバートム。ヒ ルシュ等、”　Ｈｙｐｅｒｌｉｐｉｄｅｍｉａ、　Ｆａｔｔｙ　Ｌｉｖｅｒ　ａ ｎｄ　Ｂｒｏｍｓｕｌｆｏ−ｐｈｔｈａｌｅｉｎ　Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ　ｉｎ　 Ｒａｂｂｉｔｓ　Ｉｎｊｅｃｔｅｄ　Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓｌｙ　ｗｉｔｈＢ ａｃｔｅｒｉａｌ　！！ｎｄｏｔｏｘｉｎ　、　Ｊ、　ＬＩＰＩＤ、　ＲＥＳ、 　５６３−５６８　（１９６４）；オサムサカグチ等、＠Ａｌｔｅｒｎａｔｉｏ ｎｓ　ｏｆ　Ｌｉｐｉｄ　Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ　ｉｎＭｉｃｅ　Ｉｎｊｅｃｔ ｅｄ　ｗｉｔｈ　Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎｓ　、ＭＩＣＩＩＯＢＩＯＬ、　ＩＭＭＬ ＩＮＯＬ、　２３　（２）ニア１−８５　（１９７９）ｉＲ，Ｆ、カムシュミド 、’　Ｔｈｅ　Ａｃｔｉｖｉｔｙｏｆ　Ｐａｒｔｉａｌｌｙ　Ｐｕｒｉｆｉｅｄ 　Ｌｅｕｋｏｃｙｔｉｃ　Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ　Ｍｅｄｉａｔｏｒ　１ｎＥｎ ｄｏｔｏｘｉｎ　Ｒｅ５ｒｓｔａｎｔ　Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ　Ｍｉｃｅ　”　ＩＪ、 　ＬＡＢ、　ＣＬＩＮ、　ＭＥＤ。

９５：６１６以下（１９８０）；およびラルフＦ、カムシュミツ）％　”Ｌｅｕ ｋｏｃｙｔｉｃ　Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ　Ｍｅｄｉａｔｏｒ”　、Ｊ、ＲＥＴ、 ＳＯＣ，２３（４）：２８７−２９７　（１９７Ｂ）も参照されたい。

さらに、感染への宿主応答において含まれているようである“メディエータ−” の同定および存在を議論している公表物は本出願人等によって公知であり；特に 、次の論文が挙げられる（それらの内容は参考として本明細書に引用する：サイ ベＪ、　Ｄ、等、Ｊ、　ＥＸＰ、−ＥＤ、　、上ｌ襄＝５９７−６０６（１９７ ６）；バーネイＣ，Ｃ，等、リブトンＪ、Ｍ、（曙）、ＦＥＶＥＲ：　ＩＮＴＥ ＲＮＡＴＩＯＮＡＬ　ＳＹＭＰＯ３ＩＵＭ、　テキサス州ダラス、１９７９年４ 月１１−１２日、　ＸＨ＋　２６３　Ｐ、　Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ：二ｚ−ヨ ーク、イラストレーション０−８９００４−４５１−１　（０８８７７）。

０（０）、ＰＰ、１１１．−１２２　（１９８０）；および、デイナレロＣ，Ａ 、　、＠Ｈｕｍａｎ　Ｌｅｕｋｏｃｙｔｉｃ　Ｐｙｒｏｇｅｎ：　Ｐｕｒｉｆｉ ｃａｔｉｏｎ　ａｎｄＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ａ　Ｒａｄｉｏｉｍｍｕ ｎｏａｓｓａｙ　”　、ＰＲＯＣ，ＮＡＴＬ、　ＡＣＡＤ。

上記の論文およびカムンユミントによるまたはカムシュミットとの共著の論文の 著者の各々より同定され研究された因子はすべてインターロイキン−１（ＩＬ− １）として同定されている単一群の因子を含むことが決定されている。この決定 はＲＥＶＩＥＷＳ　０ＦＩＮＦＥＣ月０１１５　ＤＩＳＥＡＳＥＳ、νｏ１．　 ６．隘１　（１９８４年１−２月）で公表されたチャールスＡ、ジナレロによる 論文において集成されており、その内容も参考として本明細書に引用する。

ＬＰＬ活性の同様な欠乏はエノエリンアコリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌ ｉ）リポ多糖類（Ｌ　Ｐ　Ｓ　’）投与後のＣ３Ｈ／ＨｅＮマウスにおいて本出 願人等によって注目された。これに封し、Ｌ　Ｐ　Ｓに対し遺伝子的に耐性のあ るＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスにおいてはＬＰＬ活性の喪失は示唆されていない。この エンドトキシン誘起ＬＰＬ欠乏に対する低抗性はＬＰＳを２時間前に注入したエ ンドトキシン感受性動物から得られた血清の投与により阻止できた。同様に、抵 抗性は感受性マウスから得られたエンドトキシン刺激チオグリコレート誘起腹膜 マクロファージからの状態調節培地を注入することによって克服できた。これら の知見は現在米国特許ＩＬ４，６０３．１０６号である米国特許出願筒４１４， ０９８号において十分に詳細に開示されており、その記載は参考として本明細書 に引用する。

上記の研究は“メディエータ−°または“複数のメディエータ−”が存在し動物 宿主のエネルギー貯蔵細胞の一般的な同化活性に有意の効果を有するであろうと の確信により促進された。そのようなメディエータ−は活性低下が例えば宿主が 感染侵入物への応答におけるようなシラツクとして知られる状態に到った場合に 観察されるある種の同化酵素の活性に対する抑制効果を発揮することが推定され た。結果として、エンドトキシン感受性およびエンドトキシン不感受性マウスで のエンドトキシン刺激腹暎マウス浸出性細胞により産生されたメディエータ−と 同化酵素活性の測定のためのそのような薬剤の研究を介しての展開との相関は最 初に出願し放棄した米国特許出願筒２９９，９３２号に開示されており、その記 載は参考として本明細書に引用する。

上記の系のさらなる研究は３Ｔ３−Ｌ、“前脂肪細胞°モデル系と関連してなさ れており、上記１メディエータ−”に対する抗体の開発方法およびそのための物 質並びに他の診断法は米国特許出願筒３５１，２９０号に開示されており、該米 国出願は参考として本明細書に引用するが現在放棄されている。その後、引き続 いての米国特許出願筒４１４，０９８号（現在、米国特許第４．６０３．１０６ 号）において、マクロファージ細胞のエンドトキシン刺激由来のメディエータ− 物質が同化酵素リポタン白質リパーゼ、アセチルコ酵素Ａカルボキシラーゼおよ び脂肪酸シンセターゼを抑制する活性を示し、さらに、赤芽球由来細胞の増殖お よび分化を抑制した。

ビュートレー等の論文（１）および（４）、および米国特許出願筒７６６．８５ ２号に開示されたさらなる研究は早期に同定されたメディエータ−物質が多くの 活性を有するさらなるたん白質成分を含有し、この成分は当該技術においてイン ターロイキン−１およびインターロイキン−２として同定され公知であるメジエ ータ−物質および他の因子の両方とは区別される発見に至った（上記文献および 米国特許出願の記載は参考として本明細書に引用する）。

文献（７）〜（９）および米国特許出願筒１０４．８２７号において開示された さらなる研究（これらの文献および米国特許出願の記載は参考として本明細書に 引用する）は特異性ある活性を示すメディエータ−物質中のさらなる因子（ＭＩ Ｐ−１）の存在を確立した。

引き続いて、本発明の炎症サイトカインＭＩＰ−２が単離精製され、その特異的 な活性が米国特許出願筒２４０，０７９において開示されいるように明らかにさ れた。それ以来、本発明のサイトカインの完全な配列がそのｃＤＮＡのクローニ ングに続いて決定され、該サイトカインの発現が追求されている０本出願は本発 明者等の研究の結果として現在入手できるようになったこのサイトカインに関す るさらなる情報を包含せんとするものである。

ＭＩＰ−２は相同性多遺伝子群の１員である。たん白質配列（一般にクローニン グしたｃＤＮＡから予想される）において最高の相同性を有するこの群の構成員 にはＭＧＳＡとＫＣがある。

ＭＧＳＡ　（リノチモンド等、ＥＭＢＯＪ、７　：　２０２５（１９８８））は ヒトメラノーマ細胞から分泌した潜在的分裂促進活性を有するオートクリン増殖 因子であり、ヒト但遺伝子の産生物である〔アユソウィフツ等、ＰＲＯＣ，ＮＡ Ｔ、ＡＣＡＤ、ＳＣＩ。

ＵＳＡ８４ニア１８Ｂ　（１９８７））。ＭＧＳＡはＭＩＰ−２に対してアミノ 酸配列において６１．８％の同一性を有し、ＭＧＳＡのハムスター相同性の予想 たん白質配列はＭＩＰ−２に対して６８．４％の同一性を有する。マウスＫＣ遺 伝子産生物はＰＤＧＥにより誘起され、ヒ）ＭＧＳＡ／ｇｒｏ遺伝子のマウス相 同性であると考えられる（ＭＩＰ−２に対して６６．３％のアミノ酸同一性）。

リベス等［ＰＲＯＣ，ＮＡＴＬ、ＡＣＡＤ、ＵＳＡ８５　：９７０４、（１９８ ８）］はＡｃｔ−２のバキュロウィルス（ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）発現、マウ スＭＩＰ−１βの推定ヒト相同性を開示し、そのコードしたたん白質が分泌され ることを示唆し、成熟Ｎ−末端配列を同定しているけれども、本出願人等は組換 えＭＩＰ−２の発現についての従来技術を知らない。

ＭＩＰ−１およびＭｌ−２遺伝子群の各員は発現されているが、ＭＩＰ−２発現 に対してのこれら結果の相関は凝がわし０゜各文献は次のように要約される。Ｊ Ｅ、即ち、ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１βに対して相同性を有するたん白質を コードするｃＤＮＡはＣＯ３−１細胞中で発現されて約１２ＫＤａのポリペプチ ドコアをコードすることが確認されている（ロリング等、ＰＲＯＣ，ＮＡＴＬ、 ＡＣＡＤ、ＳＣ１，ＵＳＡ旦二：　３７３８．１９８８）。ＫＣ１即ち、ＭＩＰ −２に対して相同性を有するたん白質をコードするｃＤＮＡはＣＯ３−１細胞中 で発現されて分泌たん白質をコードすることが示唆されている［オキコンド等、 Ｊ、ＢＩＯＬ、ＣＨＥＭ、え亙４：４１３３　（１９８９）］。

“ムロンバッチ等、Ｊ、ＢＩＯＬ、ＣＨＥＭ、２６１　ニア１９（１９８６）” により報告された結合組織活性化ペプチド−■（ＣＴＡＰ）　、および“ルース ターおよびラベツチ、Ｊ、ＥＸＰ。

ＭＥＤ、１６６：１０８４　（１９８７）”により報告されたＩＰ−１０、即ち 、ＭＩＰ−２遺伝子群の両横成員は、それぞれ、酵母およびＥ、　ｃｏｌｉ中で のα−因子融合として発現されている。最後に、“リンドレイ等、ＰＲＯＣ，Ｎ ＡＴ、ＡＣＡＤ、ＳＣＩ。

ＵＳＡ８５：９１９９　（１９８５）　″はＥ、　ｃｏｌｉ中でＮＡＦ。

ＭＩＰ−２群の一員を発現している。精製および復元後、この組換えたん白質は 天然分子と同し生活性を有することが見い出された。

光ｍ蔓 本発明の第１の局面によれば、メディエータ−物質から単離した炎症サイトカイ ンＭＩＰ−２が開示され、これは精製したたん白質を含み基本的な生理学的条件 下ではカチオン性である０本発明の炎症サイトカインは高塩濃度下においてもヘ パリンに結合する能力を示して皮下投与したとき多形核細胞浸潤に特徴を有する 局所型炎症を誘起し、化学運動性活性を殆んとまたは全く示さないけれども極め て活性な走化剤である。しかしながら、本発明の炎症サイトカインは米国特許第 ４，６０３，１０６号に開示されたメディエータ−物質から単離した他の因子に 共通するある種の活性を欠落している。

特に、本発明の炎症サイトカインは同化酵素リボたん白質リパーゼ（Ｌ　Ｐ　Ｌ ）の活性を抑制する能力を有せず、カケクチン／ＴＮＦ−感受性Ｌ９２９細胞の 細胞毒性を引き起すこと、エンドトキシン耐性Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ胸腺細胞の芽球化 を刺激することまたはチオグリコレート誘起マウスマクロファージ細胞の産生を 誘起することはできない。本発明の炎症サイトカインにはないこれらの特性はす べて公知の因子カケクチン／ＴＮＦとインターロイキン−１（ＩＬ−１）によっ て発揮され、従って、本発明の炎症サイトカインはこれら公知因子とは区別され る。

本発明の炎症サイトカインが示す最も著しい肯定的な活性はヘパリンに結合する 能力および多形核（ＰＭＮ）細胞浸潤に特徴を有する局所型炎症を誘起する能力 のようである。従って、本発明の単離体が宿主侵入への反応カスケード中で示す 正確な役割はまだ明確でないけれども、その宿主侵入に対しての移動に伴うある 種の活性および状態の誘起における本発明の単離体の関係は明白である。従って 、本発明の炎症サイトカインは侵入性または特発性の種々の刺激を促進し得る本 発明の炎症サイトカインの活性化によるそのような刺激を同定し恐らくは差別化 する診断手段としての用途の可能性を有する。

本発明の炎症サイトカインは先ず同定され特性決定されてドデンル硫酸ナトリウ ム（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）上で単一鎖の６キロダルトンたん白質を含有し、このた ん白質はゲル濾過でモノマーまたはダイマーとして移動することが見い出された 。第２図に示した部分的Ｎ−末端アミノ酸配列データはＶＩＰ−２がサイトカイ ン群の１員であり、その原型は血小板因子４（ＰＦ４）であることを明らかにし た。

上述したように、本発明の炎症サイトカインは侵入性刺激を伴う物質によるマク ロファージ細胞の刺激により調製できる。とりわけ、種々の源に由来し得るマク ロファージ細胞のサンプルはエンドトキシンまたはトリパノゾーマのような刺激 剤物質と一緒にインキュベートして米国特許第４，６０３．１０６号に開示され たメディエータ−物質を産生させ得る。そのようなインキュベーションは２０時 間までの時間長で生し、正確な時間限定はインキュベージ；ンに用いる特定の細 胞によって変化するであろう。

本発明の炎症サイトカインのさらなる性質にはそのウサギ中で発熱を誘起しない 能力またはインビトロでのヒト好中球でのスーパーオキサイド形成または呼吸破 壊を誘起しない能力がある。

そのようなインキュベーションに続いて、培地を遠心によるような適当に処理し て粗メディエーター物質を含有する上清を回収し得る０次いで、このメディエー タ−物質は濾過または沈降によるようにさらに処理し得る。その後、粗メディエ ーター物質は一連の公知の単離処理に供し得、それによってこの炎症サイトカイ ンを回収できる０本発明は応用可能な公知の遺伝子複製技術を包含するこの炎症 サイトカインの別の調製手段も当然意図するものであり、従って、本発明はその 範囲内にそのような合成的調製物も包含するものとする。

上述したように、本発明はまたマウス中で決定したときの第６図で示すＮＨ２末 端部分アミノ酸共通配列を示す上述の活性および特徴を有する精製たん白質も包 含する。ＶＩＰ−２のｃ　ＤＮＡはクローニングされており、第７図で示すよう に、分子量７９０８およびプレカーサーペプチドの翻訳分子量１０，６２２．５ ２を有する長さにおいて７４個のアミノ酸を有する成熟たん白質を予想する。

従って、本発明は上述の活性と特徴を示しかつマウスで決定したとき下記および 第７図で示す成熟アミノ酸配列を示す本発明のサイトカインを含む精製ペプチド の同定も包含する。

ＧＬＹ　ＡＬＡ　ＶＡＬ　ＶＡＬ　ＡＬＡ　ＳＥＲＧＬＵ　ＬＥＤ　ＡＲＧ　Ｃ ＹＳ　ＧＬＮ　ＣＹＳ　ＬＥＤ　ＬＹＳＴＨＲＬＥＤ　ＰＲＯＡＲＧ　ＶＡＬ　 ＡＳＰ　ＰＨＥ　ＬＹＳ　ＡＳＮ　ＩＬＥ　ＧＬＮ　ＳＥＲＬＥＤ　５ＥＲＶＡ Ｌ　ＴＩＩＲＰＲＯＰＲＯＧＬＹ　ＰＲＯ１（ＩＳ　ＣＹＳ　ＡＬＡ　ＧＬＮ　 ＴＨＲＧＬＵ　ＶＡＬ　ＩＬＥＡＬＡ　ＴＨＲＬＥＤ　ＬＹＳ　ＧＬＹ　ＧＬＹ 　ＧＬＮ　ＬＹＳ　ＶＡＬ　ＣＹＳ　ＬＥＵ　ＡＳＰ　ＰＲＯＧＬＵＡＬＡ　Ｐ ＲＯＬＥＵ　ＶＡＬ　ＧＬＮ　ＬＹＳ　ＩＬＥ　ＩＬＥ　ＧＬＮ　ＬＹＳ　ＩＬ Ｅ　ＬＥＩＩ　ＡＳＮ　ＬＹＳＧＬＹ　ＬＹＳ　ＡＬＡ　ＡＳＮ 前述したように、上記の配列は公知因子のいずれとも顕著な類領性を含まず、従 って、本発明の炎症サイトカインは公知因子とは区別し得ることを確実にしてい る。上記ｃＤＮＡアミノ酸配列の単離は後で詳細するような組換え遺伝子法によ るこのサイトカインの再生産を容易にする。即ち、本発明は本発明の炎症サイト カインまたはその同族体をコードするＤＮＡ配列を提供し、この配列は組換えＤ ＮＡ技術により宿主系中で発現ベクターを構築するのに使用できる。

本発明はさらに本発明の炎症サイトカインが奏する活性を誘起するその能力に基 づいて特発性または侵入性刺激物を検出する方法を包含する。特に、侵入性刺激 物はヘパリンに結合し得る物質を誘起しかつ好中球浸潤および走化性により局所 型炎症を誘起し得るその能力によって同定し検出することができた。この方法に おいて、例えば、ＲＡＷ２６４．７細胞系由来のマクロファージを、対照として 、エンドトキシン、トリバノゾーマまたはその他の多くの公知刺激剤物質で処理 しこれら刺激剤に暴露し、一方で、対応する細胞サンプルを感染性刺激物の予想 部位からの物質の抽出物で処理しあるいはこれら抽出物に暴露することができた 。すべてのサンプルは、その後、上述した方法に従ってインキュベートし次いで これも上述した分離技術手順に供し、それによって、得られた対照および未知サ ンプル由来の単離物を試験比較して開発した炎症サイトカインが同一かまたは幾 分類似であるかを決定できた。

同様な形で、上記炎症サイトカインを中和するのに有効な潜在的薬物をスクリー ニングするアッセイ系を調製し得る。ある場合においては、試験薬物を刺激マク ロファージサンプルに投与してその炎症サイトカインの産生に対しての効果を測 定できた。別の方法においては、本発明の炎症サイトカインを該サイトカインが 活性であることが知られている細胞試験系に導入し、さらに見込み薬物も同じ細 胞培養物に導入し、その後、培養物を上記見込み薬物単独添加と比較した本発明 の炎症サイトカインの活性において、あるいは添加量の公知炎症サイトカインの 効果において生じ得る変化を試験観察し得る。

本発明はまた本発明の炎症サイトカインの活性および存在を測定することによる 動物中の刺激型、自生的または特発性の病理学的症状を検知する方法に関する。

さらに詳細には、本発明の炎症サイトカインの活性を後述するアッセイ法により 適当に標識した量の本発明のサイトカインの使用によって直接追試する。また、 本発明のサイトカインは標識し血清のような培地中に導入できる結合性パートナ −即ち抗体を上昇させるのに用いて培地中の本発明炎症サイトカインの存在を試 験しそれによって培地を採取した宿主の状態を確めることができる。

即ち、本発明の炎症サイトカインおよび本発明のサイトカインに対して上昇させ 得た抗体は、例えば、放射性物質の添加、ホウ水素化ナトリウムによる還元また は放射性沃素標識によって標識した本発明の炎症サイトカインに対する抗体を用 いるラジオイムノアッセイのようなイムノアッセイを包含する種々の診断法にお いて使用できる。

イムノアッセイにおいては、対照量の本発明の炎症サイトカイン、その抗体等を 調製し、酵素、特異的結合性パートナ−および／または放射性元素で標識し、次 いで、侵入を受けたとみなされる動物の血液サンプルに導入し得る。標識物質ま たはその結合性パートナ−がサンプル内の部位と反応する機会を有したのち、得 られた塊状物を公知の方法によって試験し得るが、その方法は結合させた標識の 性質により変化し得る。

アイソトープ＋４０．　Ｉｌｌ　ｌ　、　３Ｂ４．　＋２５　Ｊおよび３″′Ｓ のような放射性ラベルを用いる場合には、公知の商業的に入手可能な計数手順を 用い得る。標識が酵素である場合には、検出は当該技術において公知の現在使用 されている熱量法、分光測光法、螢光測光法またはガス定量法のいずれかを用い て行い得る０本発明は本発明の炎症サイトカインの存在度合の定量分析を行うた めの試験キットの形で調製できるアッセイ基も包含する。この系または試験キッ トはラベルを本発明の炎症サイトカインに結合させる上述の放射性および／また は酵素的方法の１つで調製した標識成分；および１種以上の追加の免疫化学試剤 （その少なくとも１つは標識成分、その結合性パートナ−１測定すべき成分の１ つまたはその結合性パートナ−のいずれかと結合し得る遊離または固定化リガン ドである）を含み得る。

さらなる実施態様においては、本発明方法は本発明の炎症サイトカインの活性、 本発明の炎症サイトカインに対する抗体に基づいたあるいは同じまたは拮抗活性 を有することを測定された試剤または他の薬剤に基づいたある種の治療方法に関 する。第１の治療方法は炎症および発熱のような動物中での本発明の炎症サイト カインの活性の拡大の防止に関し、該サイトカインに対する抗体、該サイトカイ ンの産生および／または活性を調節し得る薬剤、または該サイトカインに対して のアンタゴニスト（拮抗剤）として作用し得る該サイトカインに対する抗体でな い薬剤を、個々にまたは互いの混合物の形で、宿主中のこれら状態の展開を防止 するのに有効な量で投与することを含む。

さらに詳細には、本明細書で一般的に述べる治療方法は有効量の本発明の炎症サ イトカインに対する抗体、または例えば本発明のさらなる局面に従って調製し使 用した薬物スクリーニングアッセイによって発展させた他の同等に有効な薬物を 含み得る薬剤組成物の投与による炎症および発熱の治療方法を包含する。

この治療方法の変形的実施ｌｌＬｉ様は最初に本発明の炎症サイトカインの存在 および活性を積出し次いで上記の適当な薬剤組成物を投与することを包含し得る 。

第２の治療方法は本発明のサイトカインの炎症活性の利点、特に、感染のような 侵入性刺激物に対する応答における好中球の移動および動員を引き起すその能力 を採用することである。従って、本発明の炎症サイトカインは、例えば、組織損 傷が生じた場所で展開させ得る感染部位への投与に適する調製物の形で調製でき る。

そのような場合、本発明のサイトカインは滅菌溶液中で調製し損傷または創傷に 潅注液の１部としであるいは薬剤組成物のような直接投与により伝達でき、後者 の投与順路としては局所または非経口経路が意図される。当然のこととして、本 発明の炎症サイトカインは公知の方法により同等に有効な薬剤または薬物を調製 するのにも使用でき、これらの薬剤または薬物は本発明の炎症サイトカイン自体 と同し方法および同し目的で投与するのに適する薬剤組成物として調合し得る。

従って、本発明の主たる目的は哺乳動物における侵入性刺激物に対する宿主応答 に伴うある種の特徴および活性を示す純粋形の炎症サイトカインを提供すること である。

本発明のもう１つの目的は組換え手段を包含する上記炎症サイトカインの調製方 法を提供することである。

本発明のもう１つの目的は侵入性、自然発生性または特発性の病理学的状態の存 在が凝かわれる哺乳動物中の上記炎症サイトカインの存在を検出する方法を提供 することである。

本発明のもう１つの目的は哺乳動物中の上記炎症サイトカインの活性を凝能化す るがその悪影響を転化するのに潜在的に有効な薬物、薬剤等の物質をスクリーニ ングする方法およびそれに伴うアッセイ系を提供することである。

本発明のさらに別の目的は上記炎症サイトカインの量または活性を調節してその ような存在または活性の悪しき結果を変化させるような哺乳動物の治療方法を提 供するることである。

本発明のさらに別の目的は上記炎症サイトカインの量または活性を増強させて侵 入性、自然発生性または特発性の病理学的状態の悪しき結果を処置または回避す るような哺乳動物の治療方法を提供することである。

本発明のさらに別の目的は上記炎症サイトカインまたはその結合性パートナ−を 含むまたはこれらに基づいた、あるいはその産生を調節するまたは上記炎症サイ トカインの活性を擬態するまたはこの活性と拮抗する薬剤または薬物に基づいた 治療方法で使用するための薬剤組成物を提供することである。

他の目的および利点は以下の例示的な図面に関連して進める具体的な説明によっ て当業者にとって明らかとなろう。

型皿■呈阜左脱里 第１図はＭＩＰ−２の精製の電気泳動図である。各分子量マーカーの最終位置（ キロダルトンでの）はこの１０−１８χＮａＤｏｄＳＯ４−ＰＡＧＡ系中でカケ クチン／ＴＮＦとＭＩＰ−１の位置に沿って左側に示しである。４つのレーンは ＭＩＰ−２精製の連続的段階を示す：レーン１はＲＡＷ２６４．７細胞からの濃 縮し透析濾過した粗上滑であり；レーン２はＲＡＷ２６４．７上清のＭｏｎｏＱ （アニオン交換）カラムクロマトグラフィからの溶出液であり；レーン３はヘパ リン−セファローズで精製した後のプールしたピーク画分であり；レーン４はス ーパロース１２（ゲル濾過）で精製したのちの純粋ＶＩＰ−２画分である。

第２図はＭＩＰ−２および血小板因子４群の他の各構成員の部分Ｎ　Ｈｚ末端ア ミノ酸配列を示す。各配列は文献から入手し一定に保有されたシスティン残基に 対して配列した。ＰＢＰ　（血小板基本たん白質）はβ−スロンボグロブリンと ＣＴＡＰＩＩＩのプレカーサーである。ボックス状に囲んだアミノ酸は血小板因 子４群の種々の構成員間で一定に保有されている。小文字の接頭文字は種を示す 二ｍ−マウス、ｈ＝ヒト、ｂ−ウシ、ｒ＝クラットＣ＝ニワトリ、ｈａｍ−ハム スター。

第３図はＭＩＰ〜２で得られた部分Ｎ　Ｈ２末端アミノ酸配列に相応する領域で の本発明の配列の同一性の比較を示す表である。

各配列はＦＡＳＴＰプログラムを用いて比較した。比較は第２図で配列したよう なＭＩＰ−２で入手できる部分に相応する各配列部分についてのみ行った。Ｉ　 ｎｓ、　＝微少量。

第４図はＭＩＰ−２と血小板因子４群の他の構成員との間の関係を特徴付するイ ムノプロット分析を示す。（Ａ）ＭＩＦ’−２のイムノプロットに用いたゲルの 複製の銀染色。（Ｂ）ＭＩＰ−２のイムノプロット：レーン訃・・・・・精製Ｍ ＩＰ−２，レーン２・・・・・・エンドトキシン刺ｆｆ１ＲＡＷ２６４．７細胞 からの上清；レーン３・・・・・・刺激なしのチオグリコレート誘起マウス腹腔 マクロファージからの上清；レーン４・・・・・・エンドトキシン刺激チオグリ コレート誘起マウス腹腔マクロファージからの上清；レーン５・・・・・・精製 ＮＡＰ−またん白質；レーン６・・・・・・プラスミドのみを移入したＣｏＳ細 胞からの上清：レーン７・・・・・・ヒトｇｒｏ遺伝子を含有するプラスミドを 移入したＣＯ８細胞からの上清；レーン訃・・・・・ハムスターｇｒ。

遺伝子を含有するプラスミドを移入したＣＯ８細胞からの上清。

レーン７と８はイムノプロットにおいて逆転している（４ｂ）。

第５図はＭＩＰ−２に対しての応答におけるヒト多形核走化性および化学運動性 のグラフである。走化性（暗色棒）はＭＩＰ−２をチャンバーの下の方のウェル のみに導入することによって測定した。化学運動性（明色棒）は同し濃度のＭＩ Ｐ−２を上部および下部の各チャンバーに導入することによって測定した。　ｆ Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ　（ｆ　ＭＬＰ）は１０−’Ｍの濃度で測定した。

第６図は本発明の炎症サイトカインの部分Ｎ末端配列図である。

第７図はＭＩＰ−２の完全ヌクレオチド配列を示す、プレカーサーペプチドの予 想翻訳分子量は１０，６２２．５２である０位置１から始まる成熟ペプチド配列 は長さにおいて７４個のアミノ酸である。

詳１じ口先肌 本発明によれば、当該技術の熟練の範囲における通常の分子生物学、微生物学お よび組換えＤＮＡ技術を用い得る。そのような技術は文献において十分に開示さ れている０例えば、マニアティス、フリノシュおよびサムブロックの”　Ｍｏ１ ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　″ 　（１９８２）　；　”ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　ＰｒａｃｔｉｃａｌＡ ｐｐｒｏａｃｈ　”　、Ｖｏｌ、Ｉおよび■（Ｄ、　Ｎ、グローバー編、１９８ ５）；”Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　”　（Ｍ、Ｊ 、ガイド編、１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　ＨｙｂｒｉｄｉｚａＬｉ ｏｎ”　（Ｂ、Ｄ、ハームスおよびＳ、Ｊ。

ヒギンズ編、１９８５　）　；　”　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ａｎｄ　Ｔ ｒａｎｓｌａｔｉｏｎ　’（Ｂ、Ｄ、ハームスおよびＳ、Ｊ、ヒギンズ編、１９ ８４）；”Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　″　（Ｒ，１，フレッシ ュニー編、１９８６）　ｉ”　Ｉａ＋ｍｏｂｉＨｚｅｄ　Ｃｅ１ｌｓ　Ａｎｄ　 Ｅｎｚｙｒｍｅｓ　″　（ＩＲＬブレス社、１９８６）　；Ｂ、パーパル、”　 Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ｇｕｉｄｅ　Ｔｏ門ｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎ ｇ″（１９８４）を参照されたい。

従って、本明細書で使用する場合、次の各用語は以下に示す意義を有するものと する。

本明細書で使用するときの“刺激”なる用語は感染のような侵入性事象及び損傷 によって生ずる状態、並びに、例えば、細胞または代謝不整または他の原因に由 来し得る特発性または自然発生性の状態に適用するものとする。

本出願および請求の範囲全体に亘って使用するときの“炎症サイトカイン”、° マクロファージ炎症たん白質２１および“旧Ｐ−２”は第２図および第６図で示 す部分Ｎ末端配列データ、第７図で示す成熟ペプチド配列、および本明細書およ び請求の範囲で示す活性プロフィルを有するたん白質物質を称する。従って、本 明細書で示したのと同様の配列を有し実質的に等価のまたは変形した活性を示す たん白質も同様に意図するものとする。これらの変形は、例えば、部位特異的変 異誘発から得られる変形のような意図的なものであり得るかあるいはＶＩＰ−２ 産生体である宿主中の突然変異を介して得られたちのような偶発的なものであり 得る。また、″炎症サイトカイン′、“マクロファージ炎症たん白質２”および “ＭＩＰ−２”なる用語は、その範囲に、本明細書で特定的に開示したたん白質 並びにすべての実質的に相同性の同族体および対立変形体をも包含するものとす る。

“レプリコン”はＤＮＡ複製の自律性単位としてインビボにおいて作用する、即 ち、それ自身の制御下で複製可能である任意の遺伝子要素（例えば、プラスミド 、染色体、ウィルス）である。

゛ベクター”は他のＤＮＡセグメントを結合させて結合セグメントの複製を行う ようにし得るプラスミド、ファージまたはコスミドのようなレプリコンである。

“ＤＮＡ分子”はチオキンリボヌクレオチド（アデニン、グアニン、チミンまた はチトシン）のその華−鎖形または二重鎖へワックスのいずれかの重合体形を称 する。この用語は分子の一次および二次構造にのみ関しており分子を何ら特定の 三次形状に限定するものではない、即ち、この用語は、なかんづく、線状ＤＮＡ 分子（例えば、制限フラグメント）、ウィルス、プラスミドおよび染色体中で見 い出される二重鎖ＤＮＡを包含する。特定の二重＠ＤＮＡ分子の構造に言及する 場合、配列はＤＮＡの転写してないストランド（即ち、ｍＲＮＡに相同性の配列 を有するストランド）に沿った５′から３′への方向の配列のみを与える通常の 仕様によって記載できる。

ＤＮＡ“コード用配列゛はインビボにおいて適当な調節配列の制御下に置いたと きポリペプチドに転写し翻訳する二重鎖ＤＮＡ配列である。上記コード用配列の 境界は５′　（アミノ）末端での開始コドンと３′　（カルボキシル）末端での 翻訳停止コドンにより決定される。コード用配列には、原梳配列、真核ｍＲＮＡ がらのｃＤＮＡ、真核（例えば、動物）ＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列、および 均一合成りＮＡ配列があるがこれに限定するものではない。ポリアデニル化信号 および転写末端配列はコード用配列に対し３′側にある。

転写および翻訳制御配列は宿主細胞中でコード用配列の発現を与えるプロモータ ー、エンハンサ−、ポリアデニル化信号、ターミネータ−等のＤＮＡ調節配列で ある。

“プロモーター配列”は細胞中のＲＮＡポリメラーゼに結合し下流（３′方向） のコード用配列の転写を開始し得るＤＮＡ調節領域である。本発明を明確にする 目的においては、プロモーター配列はその３′末端で転写開始部位によって境界 付されて背景以上の検知し得るレベルで転写を開始するに必要な最少数のベース または要素を含有するように上流（５′方向）に延びている。このプロモーター 配列内には、転写開始部位（ヌクレアーゼＳｌでマツピングすることにより好都 合に形成された）並びにＲＮＡポリメラーゼの結合に応答性のたん白質結合性ド メイン（共通配列）が見い出されるであろう。真核プロモーターは、しばしば（ 常にではないが）、”ＴＡＴＡ”ボックスと“ＣＴＡ”ボックスを含有するであ ろう。原核プロモーターは−１０および一３５共通配列以外にシ十インーダルガ ルノ配列を含有する。

コード配列はＲＮＡポリメラーゼがコード用配列をｍＲＮＡに転写し、次いでこ のｍＲＮＡをコード用配列によりコードされたたん白質に翻訳される時に細胞中 で転写および翻訳制御配列の“制御下”にある。

“信号配列”はコード用配列の前に含まれ得る。この配列はポリペプチドに対し てＮ末端のシグナルペプチドをコードし、このシグナルペプチドは宿主細胞に連 結してポリペプチドを細胞表面に向けるかポリペプチドを培地中に分泌し、この シグナルペプチドはたん白質が宿主細胞を去る前に宿主細胞によって切り取られ る。信号配列は原核動物および真核動物に対して天然の種々のたん白質に付随し て見い出される。例えば、α−因子、即ち、天然の酵母たん白質は酵母から分泌 され、その信号配列は培地中に分泌される非相同性たん白質に結合させ得る（米 国特許第４．５４６．０８２号；ＥＰＯ第０１１６２０１号、１９８３年１月１ ２日付公開、米国特許出願第５２２．９０９号、１９８３年８月１２日付出願を 参照されたい）。

さらに、α−因子先導体およびその同族体はサツカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏ ｍｙｃｅｓ）およびタルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）のような 種々の酵母から非相同性のたん白質を分泌することが見い出されている（１９８ ８年１２月２３日付で出願されたＥＰＯ８８３１２３０６，９号、１９８７年１ ２月３０８付で出願された米国特許出願第１３９．６８２号；および１９８９年 ２月１日付で公開されたＥＰＯ公開第０３０１６６９号）。

細胞は外因性または非相同性ＤＮＡによりそのようなりＮＡが細胞の内部に導入 されたときに“形質転換”される、形質転換用ＤＮＡは細胞のゲノムを構成する 染色体ＤＮＡ中に組り込まれ（共有結合され）でも良くされなくても良い、原核 生物、例えば、酵母および哺乳動物細胞においては、形質転換用ＤＮＡはプラス ミドのようなエピソーム要素上に維持し得る。真核生物においては、安定な形質 転換細胞は形質転換用ＤＮＡが染色体に組込まれて娘細胞により染色体複製を介 して遺伝されるような細胞である。

この安定性は真核細胞が形質転換用ＤＮＡを含有する娘細胞の集団を含む細胞系 またはクローンを確立する能力によって示される。

“クローン”は単一細胞または有糸分裂による共通祖先に由来する１群の細胞で ある。′細胞系”は多くの世代においてインビトロで安定増殖が可能である一次 細胞の１つのクローンである。

２つのＤＮＡ配列は少なくとも約７５％（好ましくは少な（とも約８０％最も好 ましくは少なくとも約９０または９５％）のヌクレオチドが限定した長さのＤＮ Ａ配列と一致したときに“実質的に相同性”である。実質的に相同性である配列 は各配列を配列データバンクで入手できる標準のソフトウェアを用いて比較する ことによっであるいは、例えば、その特定の系用に形成された緊縮条件下でのサ ザンハイプリント化実験において同定し得る。適当なハイブリッド化条件を限定 するのは当該技術の熟練の範囲内である。例えば、マニアチス等（前出）　、Ｄ 　Ｎ　Ａ　ＣＩｏｎｉｎｇ、　Ｖｏｌ。

■およびｎ（前出）　；　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉ ｏｎ　（前出）を参照されたい。

ＤＮＡ構築物の“非相同性”領域は天然のより大きい分子においては見い出され ていないより大きいＤＮＡ分子内のＤＮＡの同定可能なセグメントである。即ち 、非相同性領域が哺乳動物遺伝子をコードするとき、その遺伝子はゲノムまたは 源生物中の哺乳動物ゲノムＤＮＡ−ｔ−隣接しないＤＮＡによって隣接されるで あろう、非相同性コード用配列のもう１つの例はコード用配列自体が天然におい て見い出されていない構築物（例えば、ゲノムコード用配列がイントロン、また は天然遺伝子と異なるコドンを有する合成配列を含有するＣＤＮＡ）である。対 立変異体または天然産の突然変異事物は本明細書で定義したようなりＮＡの非相 同性領域を生しない。

“Ａ２　じＡ′は単一たん白質、ＤＮＡ分子、ベクター等である）を含む組成物 は、組成物中の少なくとも約７５％のたん白質、ＤＮＡ、ベクター（ＡとＢが属 する種のカテゴリーによるが）１Ａ”であるときには、°Ｂ″　（“Ｂ”は１種 以上の不純たん白質、ＤＮＡ分子、ベクター等を含む）を実質的に含まない、好 ましくは、“Ａ″は組成物中で少なくとも約９０重量％のＡ十Ｂ種を含み、最も 好ましくは少なくとも約９９Ｍ量％を含む、また、実質的に不純物を含まない組 成物は興味ある種の活性または特徴を有する単−分子量種のみを含有する。

゛抗体”は特異的なエピトープを結合する抗体またはそのフラグメントを包含す る任意の免疫グロブリンである。この用語は、なかんづく、ポリクローナル、モ ノクローナルおよびキメラ抗体を包含し、最後のキメラ抗体は米国特許第４，８ １６，３９７号および第４．８１６，５６７号にさらに詳細に記載されている。

本発明により調製された無イントロンＤＮＡは、天然産ヒト遺伝子がイントロン を含有するものと信しられていることから、新規である。従って、“無イントロ ン１なる用語はヒトまたはウシ細胞の染色体中で天然に生ずるＤＮＡ配列を除外 する。本発明はまた上記のＤＮＡ配列に由来し得る無イントロンｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ を包含する。

主要な局面において、本発明は、本明細書において刺激剤物質と称される物質（ これは微生物、ウィルス、ある種の１ｌｒＩ！、原虫、およびエンドトキシンの ような他の毒物のような侵入性刺激物を特徴的に伴う）または特発性状態によっ て刺激されたマクロファージまたはマクロファージ細胞系において存在すること が見い出された新発見の特定の因子（以下、炎症サイトカイン、マクロファージ 炎症たん白質２またはＭＩＰ−２と称す）の単離および同定に関する。米国特許 第４．６０３，１０６号に開示されているメディエータ−物質によるように、従 来のメディエータ−物質の一成分であると決定されている本発明の炎症サイトカ インは哺乳動物の組織内で生ずる炎症のようなある種の状態（これは刺激したま たは自然発生的病理状態の哺乳動物の反応を反映している）を引き起すことがで きるようである。

特に、本発明の炎症サイトカインは皮下投与したとき多形核細胞浸潤に特徴を有 する局所型炎症を誘起することができるようである。また、該サイトカインはヒ ト多形核白血球用の潜在的走化剤であるが、インビトロにおいてヒト好中球中で の化学運動性または酸化性破壊を殆んどまたは全く誘起しない；その状態は哺乳 動物宿主が侵入性刺激物に対しての動員中に含まれるサイトカインの影響を反映 するものである０本発明の炎症サイトカインが発揮する完全かつ正確な役割は明 らかでないけれども、以前に同定された他の因子およびまだ明らかにされていな い因子と組合せた本発明のサイトカインは宿主の免疫系と他の身体組織および器 官との間の連絡系の１部として機能しているものと理論付される。

本発明の炎症サイトカインのヘパリンに対して結合する能力は該サイトカインが ＦＧＦまたはＰＤＧＦのようなある種のヘパリン結合性生長因子に相応するとい う考えを与え得る。しかしながら、本発明の炎症サイトカインが平滑筋細胞に対 して分裂促進性でないというデータはこれら公知の生長因子と異なることを示唆 している。従って、現時点で確かなことは本発明のサイトカインが侵入に対する ような宿主応答の１部として知られている炎症応答の発展に係っているというこ とでる。

本発明の炎症サイトカインはＮａＤｏｄＳＯｎ　−Ｐ　Ａ　Ｇ　Ｅ上での約６． ０００ダルトンの分子量と約ｔｏ、ｏｏｏダルトンの見掛は分子量を有するゲル 濾過カラムからの両分とを有するたん白質を含むことが確認されている。ＭＩＰ −２のｃＤＮＡはクローニングされていて予想分子量７，９０８を有する長さに おいて７４個のアミノ酸を有する成熟たん白質を予想している。ＭＩＰ−１およ びカケクチン／ＴＮＦとは対照的に、ＭＩＰ−２はカチオン性であり、ｐＨ８， ０で平衡させたアニオン交換カラムには結合しない。さらに、該成熟たん白質の Ｎ末端部分アミノ酸配列および完全配列の決定は本発明の炎症サイトカインの特 異的たん白質構造が他の公知の因子のたん白質構造と異なることを確実にしてい る。従って、本発明の炎症サイトカインと従来技術の公知因子との間の構造的お よび機能的差異は両方とも実施例１で示したデータによって確認されているよう に存在している。

さらに詳細には、本発明の炎症サイトカインは、高塩濃度、例えば、約０．７　 Ｍでヘパリンに結合し得る点で、上記で既略した特徴と一緒にある種の他の特徴 を有しコロニー刺激性因子活性を示している。本発明のサイトカインは、また、 同化酵素リボたん白質リパーゼ（ＬＰＬ）を抑制し得ず、カケクチン／ＴＮＦ感 受性Ｌ９２９細胞で刺激し得す、エンドトキシン耐性Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ胸腺細胞の 芽球形成を刺激し得すまたは一部チオグリコレート誘起マウスマクロファージ細 胞によるカケクチン／ＴＮＦの肘を誘起し得ないようなその不能力のような本発 明のサイトカインが有しない活性において区別され得る。これらの活性のすべて は一般的な特徴と活性が侵入に対する宿主応答における関与物として同定されて いる他の公知のマクロファージ由来メディエータ−因子によって発揮されるもの である。さらに、本発明の炎症サイトカインはＭＩＰ−１のような他の因子とは ウサギ中の発熱を誘起し得ないあるいはヒト好中球中でのスーパーオキサイド形 成または呼吸破壊を誘起し得ないその不能力によって区別し得るものである。

上記で存在する活性プロフィルは、従って、本発明の炎症サイトカインを公知の 因子から区別し、本明細書で提示したアミノ酸配列データと関連して、本発明の 炎症サイトカインが実際に他のマクロファージ由来メディエータ−因子と異なる ことを確実にしている。

前述したように、第２図で示す一部アミノ酸配列および第７図で示す完全配列は 単に例示的なものであり、同様な配列が実質的に等価のまたは改善された活性を 有するたん白質を与え得る。これらの変形体は、例えば、部位特異性変異形成に より得られた変形体のような意図的なものであり得るかあるいはＭＩＰ−２産生 体である宿主中の変異から得られた変形体のような偶発的なものであり得る。こ れらの変形体はすべて上述したようなＭＩＰ−２活性が保持されている限り本発 明に包含される。従って、本明細書で述べたようなＭＩＰ−２の定義には第２図 および第７図の配列と実質的に等価の配列を有するたん白質並びにその範囲内の 実質的に相同性の同族体および対立変形体も包含される。

本発明の炎症サイトカインの調製は本明細書の前で簡単に述べており、種々の細 胞を侵入性刺激からの刺激剤物質と一緒にインキュベーシヨンを開始することに よる天然物質の場合の仕様が可能であることを確認している。特に、細胞系ＲＡ Ｗ２６４．７を用いて所望物質の産生を開始させ、それにより、本発明の炎症サ イトカインを単離できる。マウスマクロファージ細胞系ＲＡ　Ｗ２６４．７は本 発明の炎症サイトカインの単離を分析および精製を行うのに十分な量で容易にし ている。

当然のこととして、本発明の炎症サイトカインを後で単離する物質または本発明 の炎症サイトカイン自体を発現するための他の細胞系または他の原料も本発明に 包含され、従って、本発明は限定的でない。

前述したように、当該技術において周知である多くの組換え技術の包括的な原理 に従って実施できる遺伝子複製によるような別法も本発明に従って意図される。

従って、ＭＩＰ−２核酸配列はｍＲＮＡの逆転写物をスクリーニングすることに よるあるいは任意の細胞からのゲノムライブラリーをスクリーニングすることに よるような組換えＤＮＡ法による推論アミノ酸配列からも得ることができる。こ のＤＮＡはまた普通に利用できる技術およびＤＮＡ合成装置を用いてこのＤＮＡ を合成することによっても得ることができる０合成は、特異的な制限部位をＤＮ Ａの調製時に導入することができそれによって天然原料には存在していない制限 部位を含有するベクター中での遺伝子の使用を容易にするので有利である。さら にまた、ＤＮＡ中での任意の所望の部位修飾も、変異形成によりＤＮＡをさらに 修飾する必要なしに、合成により導入できる。

ヒト、マウスまたは他の源からの本発明の炎症サイトカインをコードするＤＮＡ を単離する一般的手順は、適当な細胞または組織から単離したｃＤＮＡライブラ リーを構築し；相同性配列を含有する該ｃＤＮＡライブリラー中マー中−ンを検 出するためのポリペプチド鎖のたん白質をコードする標識ＤＮＡプローブでスク リーニングすることである。また、上記ＤＮＡを上記ｃ　ＤＮＡ（ｍＲＮＡから の）とサブクローンのポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）増幅によって単離し標識Ｄ ＮＡプローブでスクリーニングし；次いで各クローンを制限酵素分析および核酸 シーケンシングによって分析して全長クローンを同定することもできる。全長ク ローンがライブラリーに存在しない場合、種々のクローンからの適当なフラグメ ントを回収し各クローンに共通する制限部位で結合させて全長分子をコードする クローンを組立てることができる。

適切で好ましいＤＮＡプローブは後の実施例において示している。ＭＩＰ−２ｃ ＤＮＡの５′末端から消失する任意の配列はｍＲＮＡをテンプレートとして使用 するＭＩＰ−２配列を相補する合成オリゴヌクレオチドの３′伸長（いわゆるプ ライマー伸長）によって得ることができ、また相同性配列は第７図で示したマウ ス配列由来の公知ｃＤＮＡから供給できる。このことは実施例２においてもっと 詳細に述べる；しかしながら、本明細書で開示するようなマウスＭＩＰ−２をコ ードする無イントロンＤＮＡおよびそのリーダー配列が１度提供されると、当該 技術における普通の熟練者は他の正確なハイブリット他用プローブを開示した配 列から調製して所望の遺伝子を容易に調製し得ることを悟るのが実際である。

ベクターはＭＩＰ−２ポリペプチドをコードするＤＮＡの操作を簡素化してさら なる加工のための大量のＤＮＡの調製（クローニングベクター）のためあるいは ＭＴＰ−２ポリペプチドの発現（発現ベクター）のために使用する。ベクターは プラスミド、つ゛イルス（ファージを含む）、および組込み可能なりＮＡフラグ メント、即ち宿主ゲノムに組換えにより組込み可能なフラグメントを含む、クロ ーニングベクターは発現制御配列を含有する必要はない。しかしながら、制御配 列は発現ベクターには必要であり、これらの制御配列には転写プロモーター、転 写を制御する任意成分としてのオペレーター配列、適当なリポソーム結合性部位 をコードする配列（原核生物発現において）、および転写と翻訳の終結を制御す る配列のような転写および翻訳制御配列がある０発現ベクターは好ましくは選択 遺伝子を含んでＭｒＰ−２の安定な発現を容易にするかおよび／または形質転換 体を同定すべきである。

しかしながら、発現を維持する選択遺伝子は真核生物宿主細胞を用いる共形質転 換系での分離ベクターにより供給し得る。

発現においては、適切なベクターは意図した発現宿主と適合性ある種に由来する レプリコン（非組込み性ベクターでの使用のための複製の起ｆＡ）および制御配 列を一般に含有するであろう。本明細書で使用するときの“複製可能な”ベクタ ーなる用語はそのようなレプリコン並びに宿主ゲノムへの組込みにより複製した ベクターを含有するベクターを包含するものとする。次いで、細胞をＭＩＰ−２ コードＤＮＡを含有するベクターで形質転換または移入し、ここで、形質転換宿 主細胞として同定する。これらの形質転換宿主から発現させたＭＩＰ−２は、使 用する宿主細胞および発現したペプチド中の適当なプロセフンング信号、例えば 、相同性または非相同性のシグナル配列の存在により、細胞内に付着するかある いは細胞周辺腔または培養上清中に分泌するであろう。

発現に適する宿主細胞は原核生物または真核生物細胞であり得る。原核生物には グラム陰性またはグラム陽性生物、例えば、Ｅ、ｃｏｌｉまたはバチルススブチ リス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）がある。

真核細胞には酵素、バキュロウィルス、または哺乳動物起源の確立細胞系のよう な高級真核生物細胞がある。

宿主細胞用の発現ベクターには通常複製の起源（それが組込み用ベクターである 限りにおいて）、リポソーム結合性部位と一緒のＭＩＰ−２コ一ド配列からのプ ロモーター局在上流、および転写終結配列がある。当業者はこれら配列のあるも のがある種の宿主での発現には必要でないことを知っているであろう。微生物と 共に使用する非組込性発現ベクターは宿主が認識する複製の起源を含有すること のみを必要とし、そのプロモーターは宿主および選択遺伝子中で機能するであろ う。

発現ベクターは本発明に従って構築してＭＩＰコード配列を適当な調節配列を有 するベクター中に存在させるようにし、制御配列に対しての上記コード配列の位 置および配向を上記コード配列が制御配列の“制御”下で転写し翻訳される（即 ち、制御配列でＤＮＡ分子に結合するＲＮＡポリメラーゼが上記コード配列を転 写する）ようにする。制御配列は上述のクローニングベクターのようなベクター に挿入前にコード配列に結合させ得る。また、コード配列はすでに制御配列き適 当な制ｖａ部位を含有している発現ベクターに直接クローニングすることもでき る。原核生物および酵母でのＭＩＰ−２の発現においては、制御配列はコード配 列に必然的に非相同性であろう。宿主細胞が原核生物である場合、コード配列が イントロン（例えば、ｃＤＮＡ）を含まないことも必要である。使用する宿主細 胞が哺乳動物細胞である場合、制御配列はＭ［’コード配列に対し非相同性また は相同性であり得、該コード配列はイントロンまたはｃＤＮＡを含有するゲノム ＤＮＡであり得る。

発現ベクターは宿主生物によりＢＸ！）されるプロモーターを含有すべきである 。原生動物組換えＤＮＡ発現において用いられる普通に公知で入手できるプロモ ーターにはβ−ラクタマーゼ（ベニシリナーゼ）とラクトースプロモーター系、 トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系とｔａｃプロモーターがあある。これ らが普通使用されるけれども、他の公知の微生物プロモーターも適する。

原核動物以外に、酵母のような真核細胞もＭＩＰ−２コードベクターで形質転換 できる。酵母ベクターは、一般に、複製の起源または自律複製配列（ＡＲ３）、 （非組込み性である場合の）プロモーター、ＭＩＰ−２をコードするＤＮＡ、ポ リアデニル化および転写終結用の配列、および選択遺伝子を含有するであろう。

本発明において特に興味あるのは、ビシア（Ｐｉｃｈｉａ）、　クリュイベロミ セス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、サツカロミセス、シソ゛サツカロミセス （Ｓｃｈ　ｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）およびカンジダ（Ｃａｎｄｉｄ ａ）の各属種内の酵母種である。特に興味があるのはサツカロミセス種のＳ、セ ある。属りリュイベロミセスにおいて興味ある種にはに、ラクチス（Ｋ、　Ｉａ ｃｔｉｓ）があり、属ピシアにはＰ、パストリス（Ｐ、　ｐａｓｔｏｒｉｓ）が ある。酵母の分類は将来変り得るので、本発明の目的においては、酵母はＢｉｏ ｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ　ｏｆ　Ｙｅａｓｔ　（Ｆ、　Ａ、ス キナー、Ｓ、　Ｍ、バスモアおよびＲ，Ｒ，ダベンボート編、１９８０）（ＳＯ Ｃ，ＡＰＰ、ＢＡＣＴＥＲＩＯＬ、ＳＹＭＰ、５ＥＲＩＥＳＮα９）に記載され ているように定義する。上記以外にも、当該技術における通常の熟練者は酵母の 生物学および酵母遺伝子の操作に馴れているものと思われる。例えば、Ｂｉｏｃ ｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓストッパニー編、１９７　Ｂ）　 ；　Ｔｈｅ　Ｙｅａｓｔｓ　（Ａ、　Ｈ，Ｏ−スおよびＪ、Ｓ、ハリソン編、第 ２判、１９８７　）　；　Ｔｈｅ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏ　ｏｆ　ｔｈ ｅ　Ｙｅａｓｔ　Ｓａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓ　（ストラセーン等編、１９８１ ）を参照されたい。これら文献の記載は参考として本明細書に引用する。

酵母ベクター中の適当なプロモーターには、エノローゼ、３−ホスホグリセレー トキナーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソ キナーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコー ス−６−ホスフェートイソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルベ ートキナーゼ、トリオセホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラ ーゼ、およびグルコキナーゼのような解糖酵素用のプロモーターがある。

増殖条件により制御される転写のさらなる利点を存する他の酵母プロモーターは アルコールデヒドロゲナーゼ１または２、イソサイトクロムＣ１アシッドホスフ ァターゼ、並びにマルトースおよびガラクトース利用に応答性の酵素のプロモー ター領域である。

昆虫を包含するせき推動物または無せき推動物からのより高級な真核細胞培養物 も使用でき、その増殖手順は公知である。例えば、Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｃｕ１ｔｕｒ ｅ、　Ａｃａｃｊｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ社、クルゼおよびバダーリン編、　（１ ９７３）を参照されたい。

高等真核動物中でのＭＩＰ−２発現に適する宿主細胞には次のものがある：ＳＶ ４０　（ＣＯ５−７、ＡＴＣＣＣＲＬ　１６５１）で形質転換したサル腎臓ＣＶ Ｉ系；仔ハムスター腎臓細胞（ＢＯＸ　。

ＡＴＣＣＣＲＬ　１０）ｉチャイニーズハムスター卵巣細胞−ＤＨＦＲ（ウルラ ーブおよびカシン、ＰＮＡＳ　（ＵＳＡ）７７　：４２１６　（１９８０）に記 載〕　；マウスセルトリ（Ｓｅｒｔｏｌｉ）細胞ＣＴＭ４、マザーＪ、Ｐ、、Ｂ ｉｏｌ、　Ｒｅｐｒｏｄ、２３　：　２４３−２５１（１９８０）］；サル腎臓 細胞（ＣＶＩ　ＡＴＣＣＣＣＬ７０）；アフリカみどリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ −７６、ＡＴＣＣＣＲＬ−１５８７）；ヒトけい管がん腫細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴ ＣＣＣＣＬ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣＣＣＬ３４）；バッファロ ーラット肝臓細胞（ＢＲＬ３Ａ、ＡＴＣＣＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ］ ３８、ＡＴＣＣＣＣＬ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ　Ｇ２、ＨＢ８０６６）； マウス乳房腫瘍（ＭＭＴＯ６０６５２、ＡＴＣＣＣＣＬ５１）；ラットへパト＝ ７細胞［、ＨＴＣＸＭｌ、５４、バウマンＭ０等、Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏ１８ ５　：　１−８　（１９８０）　〕およびＴＲＩ細胞〔マザーＪ、　Ｐ。

等、Ａｎｎａｌｓ　Ｎ、Ｙ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、３８３　：　４４−６８　 （１９８２）　］。

普通使用されるプロモーターはポリオーマ、アデノウィルス、およびサルウィル ス４０　（ＳＶ４０）に由来する。原核細胞よりも真核細胞中で発現させたとき の方が、組換えＭＩＰ−２はグリコジル化に基づきより高い分子量を有し得るこ とが認められるであろう。従って、予想分子量７．９０８よりも大きい分子量を 有するＭＩＰ−２の部分または完全グリコジル化形、およびその不グリコシル化 形も本発明の範囲に属するものとする。

多くの原核細胞発現ベクターは当該技術において公知である。

例えば、米国特許第４．４４０．．９５９号、第４．４３６．８１５号、第４． ４３１．７４０号、第４．４３１．７３９号、第４．４２８．９４１号、第４． ４２５．４３７号、第４．４１８．１４９号、第４．４］１．９９４号、第４． ３６６、２４６号、第４．３４２．８３２号を参照されたい。また、英国特許公 告、Ｇ　Ｂ　２．１２１．０５４号、Ｇ　Ｂ　２．００８．１２３号、Ｇ　Ｂ　 ２．００７．６７５号、およびＥＰＯ公開第１０３．３９５号も参照されたい。

好ましい原核細胞発現系はＥ、コリである。

他の好ましい発現ベクターは真核細胞系で使用するものである。

例示的な真核細胞発現系は当該技術において周知のワタシニアウイルスを用いる 系である０例えば、マケント等、（１９８４）Ｊ　、　Ｖｉｒｏｌ、４９　：　 ８５７　；　”　ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　、Ｖｏ１．　Ｉｔ、１９１−２１１ （前出）、ＰＣＴ公開階ｗｏ　８６１０７５９３号を参照されたい。酵母発現ベ クターも当該技術において公知である０例えば、米国特許第４．４４６，２３５ 号、第４，４４３．５３９号、第４，４３０，４２８号を参照されたい。また、 ヨーロッパ特許公開第１０３，４０９号、第１００．５６１号、第９６，４９１ 号も参照されたい、もう１つの好ましい発現系はベクターｐＨ３１であり、これ はチャイニーズハムスター卵巣細胞を形質転換する。ＰＣＴ公開階、ＷＯ３７１ ０２０６２号参照、＠乳動物組織はジヒドロホレートリダクターゼ（Ｄ　ＨＦ　 Ｒ）またはチミジンキナーゼのような選択性マーカーをコードするＤＮＡおよび ＭＩＰ−２をコードするＤＮＡと共形質転換し得る。

野性型ＤＨＦＲ遺伝子を用いる場合、ＤＨＦＲを欠乏する宿主細胞を用いること が好ましい、即ち、ハイポキサンチン、グリシンおよびチミジンを含まないｈｇ ｔ培地中で成功裏に移入するためのマーカーとしてのＤＨＦＲコード配列の使用 を可能にする。この場合の適切な宿主細胞は、“ウルラーブおよびカシン、１９ ８０、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ２Σ迂（ＵＳＡ）　７７　：　４’２１ ６　”に開示されていようにして調製し増殖させたｐＨＦＲ活性のないチャイニ ーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系である。昆虫細胞での使用のためのバキュ ロウィルス由来の発現ベクターは当該技術において公知であり入手可能である。

ルックローおよびスマーズ、旺赳肋ヨ旦■、６．ｐ、４７−５５参照。

使用する発現系および宿主にもよるが、ＭＩＰ−２は上記および実施例２で記載 した発現ベクターのような外因性または非相同性ＤＮＡ構築物で転質転換した宿 主細胞をＭＩＰ−またん白質が発現される条件下で増殖することによって産生さ せる。次いで、ＭＩＰ−２を宿主細胞から単離し精製する。発現系がＭＩＰ−２ を増殖培地中に分泌する場合、そのたん白質は無細胞培地から直接精製できる。

ＭＴＰ−またん白質が分泌されない場合には、細胞溶解物から単離する。適当な 増殖条件および回収方法の選択は当該技術の熟練の範囲である。

組換え的に調製したＭＩＰ−２は公知の手順に従って形質転換細胞より回収でき る。好ましいのは、形質転換細胞からＭＩＰ−２の分泌を与える発現ベクターを 用いることであり；かくして、細胞は遠心により分離できる。ＭＩＰ−２はサイ ズ排除、イオン交換クロマトグラフ、ＨＰＬＣ等（これらに限定するものではな い）を包含する一般のたん白質精製法によって典型的に精製される。

ＭＴＰ−２のコード配列を調製し単離されると、この配列は任意の適当なベクタ ーにクローニングしそれによってＭＩＰ−２コ一ド配列を含有しない細胞を実質 的に含まない（例えば、虻ライブラリークローンを含まない）細胞組成物中に維 持する。数多くのクローニングベクターが当業者にとって公知である。クローニ ング用の組換えＤＮＡベクターと該ベクターが形質転換し得る宿主細胞の例には 種々のバタテリオファージラムダベクター（Ｅ、　ｃｏｌｉ）　、ｐＢＲ３２２ （Ｅ、　ｃｏｌｉ）、ｐＡＣＹＣ１７？（Ｅ。

ｃｏｌｉ）、　ｐＫＴ　２３０　（グラム陰性菌）、ｐＧＶｌ　１０６　（グラ ム陰性菌）、ｐＬＡＦＲｌ　（グラム陰性菌）、ｐＭＥ２９０（非Ｅ。

（ｏｌｉｌミグラム菌）　、ｐ）（Ｖ　１４　（Ｅ、　ｃｏｌｉおよびバチラス スブチリス）、ｐＢＤ９　（バチラス）、ｐｌＪ６１　（ストレプトミセス）、 ｐＵＣ６（ストレプトミセス）、アクチノファージ、φＣ３１（ストレプトミセ ス）、ＭＩＰ５　（サツカロミセス）、ＹＣｐ１９（サツカロミセス）、ＹＥｐ ２４　（サツカロミセス）、ｐＣ１／１　（サツカロミセス）、ＸＲｐ１７　（ サツカロミセス）、およびウシパピローマウィルス（動物細胞）がある、一般的 には、Ｄ　Ｎ　Ａ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：　Ｖｏｌ、　Ｉおよび■（前出）；Ｔ、 マニアティス等（前出）；Ｂ、パーパル（前出）　；ボタティン等（１９７９） 、ＧＥＮＥ８　：　１７−２４　；ブレーク等、（１９８４）ＰＲＯＣ。

ＮＡＴＬ、ＡＣＡＤ、ＳＣＴ、ＵＳＡ８１　：　４６４２−４６４６；シュニラ カム等、（１９８２）　、Ｊ、ＭＯＬ、Ｂ）ＯＬ、１５８：１５７を参照された い。

また、ＭＩＰ−２は通常のペプチド合成により、メリフィールド（Ｍｅｒｒｉ　 ｆ　１ｅｌｄ）合成の原理を用い、このメリフィールド合成方法を用いるように 設計された市販の自動装置を用いることによっても調製できる。通常のペプチド 合成を用いて調製したペプチドも通常のアフィニティクロマトグラフ、ゲル濾過 および／またはＲＰ−ＨＰＬＣを用いて精製し得る。

さらにヌクレオチド配列からは、ＭＩＰ−２同族体も本発明の範囲に属するもの とする。フラグメントのような同族体はＭＩＰ−２のペプシン消化によって調製 できる。変異体のような他の同族体はＭＩＰ−２コ一ド配列の標準の部位特異性 変異形成により調製できる。“ＭＩＰ−２活性“を示す同族体は公知のインビボ および／またはインビトロアンセイで同定し得る。

前述したように、ＭＩＰ−２をコードするＤＮＡ配列はクローニングするよりも むしろ合成的に調製できる。このＤＮＡ配列はＭＴＰ−２アミノ酸配列用の適当 なコドンを有するように設計し得る。一般的には、その配列を発現に用いる場合 、意図する宿主とって好ましいコドンを使用するであろう、完全配列は標準方法 で調製した重複オリゴヌクレオチドから組立てて全コード配列とする。例えば、 ′エツジ、匣曳匹主旦２ニア５６　（１９８１）；合成りＮＡ配列はＭＩＰ−２ 同族体または′変異体”を発現する遺伝子の好都合な構築を可能にする。また、 変異体をコードするＤＮＡは天然ＭＩＰ−２遺伝子またはｃＤＮＡの部位特異性 変異形成により調製でき、変異体は通常のポリペプチド合成を用いて直接合成す ることもできる。

部位特異性変異形成は一般に完全コード発現からの同族体を創生ずるのに用いる 。部位特異性変異形成は所望の変異体を示す限られた不整合を除いては変異形成 すべき単−鎮ファージＤＮＡに相補性のプライマー合成オリゴヌクレオチドを用 いて行う。要するに、合成オリゴヌクレオチドを上記ファージに相補性のストラ ンドの合成を指示するプライマーとして用い、得られた二釧ＤＮＡをファージ支 持宿主微生物中に形質転換させる。形質転換微生物の培養物を寒天上に塗抹しフ ァージを潜伏させる単一細胞からのプラーグ形成を行う。

理論的には、５０％の新規プラーグが単一鎖としての変異形を有するファージを 含有し；５０％が元の配列を有するであろう。

得られたプラーグは、正確な整合のハイブリッド化を行うが元のストランドとの 不整合はハイブリッド化を防止するに十分な温度で、キナーゼ合成プライマーで ハイブリッド化する。上記プローブとハイブリッド化したプラーグを収集し、培 養し、ＤＮＡを回収する。

たん白質への非天然アミノ酸の部位特異性導入の一般的方法は、“クリストファ ーＪ、ナレン、スペンサーＪ、アンソニ一一カヒル、ミッチェルＣ，グリフイス 、ベーターＧ、シュルツ、５ＣＩＥＮＣＥ２４４：１８２−１８８　（１９８９ 年４月）″に記載されている。

この方法は非天然アミノ酸を含む同族体を創生ずるのに使用できる。

本発明の炎症サイトカインは実施例１で記載するようにマウス中で単離し分析し た。ヒト炎症サイトカイン（ＭＩＰ−２）は、マウスＶＩＰ−２がヒト好中球に 対して効果を有するので、マウスＭＩＰ−２と類似すると推定される。本明細書 で述べるように、この炎症サイトカインの活性は該炎症サイトカインを＆Ｉｌ′ ｍ感染部位に投与して好中球の該部所への伝達を促進することにより利用し得る 。

前述したように、本発明の炎症サイトカインまたはその結合性パートナ−１また は該サイトカインに対して擬態または拮抗性を示すあるいはその産生に対しての 制御を示す他のりガントまたは薬剤は、適当なキャリヤーを含みＩＪ１ｍ感染ま たは他の病理学的不順を有する患者にその治療のために種々の方法で投与のに有 効な強度の薬剤組成物として調製できる。種々の投与方法を使用でき、その方法 としては、軟こうまたは外科におけるような局所的適用並びに外科スポンジ、バ ンド、ガーゼパッド等の他局所適用がある。また、そのような組成物は、身体損 傷領域を洗浄するのに用いる潅注液への伝達、カテテール化等を包含する、皮下 、静脈内および腹腔内注射のような非経口法によっても投与できる。この炎症サ イトカインの平均量は変化し得、特に、権限ある医師または獣医の推奨および指 示に従うべきである。

また、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方を包含する抗体、お よび本発明の炎症サイトカインの産生および活性を調節する薬物はある種の治療 上の用途を有し得、炎症および発熱のような炎症サイトカインの作用に帰因する 後感染の効果を処理する目的で使用し得る。特に、本発明の炎症サイトカインは 、例えば、融合させたマウスひ臓リンパ球細胞とミエローマ細胞とを用いるハイ ブリドーマ技術のような公知の方法により、種々の細胞培地中でそれ自体に対す るポリクローナルおよびモノクローナル抗体の両方を産生させるのに使用できる 。

ハイブリドーマによりモノクローナル抗体を調製する一般的方法論は周知である 。不死の抗体産生性細胞系はまたＢ−リンパ球のオンコジーンＤＮＡによる直接 形質転換またはニブスティン−バールウィルスによる形質転換のような融合以外 の方法によっても作製できる。例えば、Ｍ、シュレイヤー等、“Ｈｙｂｒｉｄｏ ｍａＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　”　（１９８０）　；ハンマーリング等、”　Ｍｏ ｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　Ａｎｄ　Ｔ−ｃｅｌｌ　Ｈｙｂｒｉｄ ｏｍａｓ″　（１９８１）　″；ケネフト等、’　Ｍｏｎｏｃ］ｏｎａｌ　Ａｎ ｔｉｂｏｄｉｅｓ　”　（１９８０）を参照されたい。

また、米国特許第４，３４１，７６１号、第４，３９９．１２１号、第４．４２ ７，７８３号、第４，４４４，８８７号、第４，４５１，５７０号、第４，４６ ６．９１７号、第４，４７２，５００号、第４，４９Ｌ６３２号、第４，４９３ ．８９０号も参照されたい。

ＭＩＰ−２に対して産生させたモノクローナルのパネルは、種々の性質、即ち、 アイソタイプ、エピトープ、アフィニティ等についてスクリーニングできる。特 に興味あるのはＶＩＰ−２の活性を中和するモノクローナル抗体である。高アフ ィニティ抗体も天然またはＭｉ換えＭＩＰ−２のイムノアフィニチイ精製におい て有用である。

得られた抗体もまた適当な薬剤組成物に調製して望ましくない状態を変化させ治 療するのに投与できる。そのような薬剤組成物を使用するための正確な量、投与 間隔および投与方法は医療技術において公知の事実に従ってまた権限ある医師ま たは獣医師の特定の指示に基づいて変化し得る。

本発明はまた侵入性刺激物の存在を、本発明の炎症サイトカインが示す活性を誘 起するその刺激物の能力を参考にして検出する方法を包含する種々の診断用途に も関する。前述したように、本発明の炎症サイトカインは種々の公知方法にそれ 自体に対しての抗体を産生させるのに使用でき、そのような抗体はその後単離し て凝しい哺乳動物宿主中の上記炎症サイトカインの存在の試験におけるように使 用できる。

本発明の炎症サイトカインに対する抗体は周知のハイブリドーマ技術を包含する 標準方法によって産生させ単離し得る。便宜上、本発明の炎症サイトカインに対 する抗体はＡｂ、と称し、他の種で産生じた抗体はＡｂ２と称する。

哺乳動物における炎症サイトカイン活性の存在はそのような測定に適用できる通 常の免疫学的手順により確認し得る。多くの有用な方法が公知である。特に有用 である３つのそのような方法は検出可能な標識で標識した本発明の炎症サイトカ イン、検出可能な標識で標識した抗体Ａｂ、、または検出可能な標識で標識した 抗体Ａｂａのいずれかを用いる。各方法は次の等式により要約され、式中、星印 は粒子を標識したことを示し、“ｃｙｔ”は炎症サイトカインを示す。

Ａ、Ｃｙｔ”　＋　Ａｂ＋＝Ｃｙｔ”Ａｂ＋Ｂ、Ｃｙｔ　十Ａ　ｂ”　＝　Ｃｙ ｔＡ　ｂ＋拳Ｃ，Ｃｙｔ　＋Ａｂ＋＋Ａｂ２”　＝ＣｙｔＡｂ＋Ａｈ２゜これら の方法およびその応用は当業者にとってすべて馴みであり、従って、本発明の範 囲内において使用できる。“拮抗”法、即ち、方法Ａは米国特許第３．６５４． ０９０号および第３．８５０．７５２号に記載されている。方法Ｃ１即ち“ザン ドイッチ”法は米国特許第３１、００６号（再発行）および第４．０１６．０４ ３号に開示されている。

′２抗抗”またはＤＡ　Ｓ　Ｉ”法のような上記以外の他の方法も公知である。

各場合において、本発明の炎症サイトカインは１種以上の抗体または結合性パー トナ−との複合体を形成し、この複合体の１員を検出可能な標識で標識する。複 合体が形成したという事実および必要に応じてのその量を標識の検出に適用でき る公知の方法によって測定し得る。

上記から理解されるであろうことはＡｂ２の特徴的性質はＡ　ｂ　＋と反応する であろうということである。何となれば、１つの哺乳動物種で産生したＡｂ、を 抗体Ａｂ２を産生するための抗原として他の種において使用しているからである 。例えば、Ａｂ２はウサギ抗体を抗原として用いてヤギ中で産生させ得る。従っ て、Ａｂ、はヤギ中で産生させた抗ウサギ抗体である。これを説明し特許請求す る目的で、Ａ　ｂ　＋を一次または抗炎症サイトカイン抗体と称し、Ａｂ。

は二次または抗−Ａｂ、抗体と称する。

これらの試験において最も普通に用いられる標識は放射性元素、酵素、紫外線に 暴露したとき蛍光を発する化学物およびその他である。

多くの蛍光物質は公知であり標識として使用できる。これらには、例えば、フル オレスセイン、ローダミンおよびオーラミンがある。特に検出性の物質はヤギで 調製しイソチオンアネートを介してフルオレスセインでコンジゲートさせた抗ウ サギ抗体である。

本発明の炎症サイトカインまたはその結合性パートナ−も放射性元素によりある いは酵素により標識できる。放射性標識は任意の商業的に入手できる計数法によ り検出できる。好ましいアイソトープは”Ｃ，”’Ｉ、　３Ｈ，”’Ｉおよび３ ５３から選択できる。

酵素標識も同様に有用であり、現在使用されている熱量計、分光測光法、蛍光測 光法またはガス定量法のずれかによって検出できる。酵素はカルボジイミド、ジ イソシアネート、グルタルアルデヒド等の橋かけ分子との反応により使用する粒 子にコンジュゲートさせる。これらの法で使用できる多くの酵素は公知であり使 用できる。好ましいのはバーオキシダーぜ、β−グルクロニナーゼ、β−Ｄ−グ ルコシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ウリアーゼ、グルコースオキシダー ゼ＋パーオキシダーゼ、およびアルカリ性ホスファターゼである。米国特許第３ ，６５４．０９０号、第３．８５０，７５２号および第４，０１６，０４３号は 別の標識物質および方法を開示している例として引用する。

本発明に従って開発し使用した特定のアッセイ系はレセプターアッセイとして公 知である。レセプターアッセイにおいては、アッセイすべき物質を適当に標識し 、次いで、ある種の細胞試験コロニーを一定量の標識および未標識物質と共にイ ンキュベートし、その後、結合性試験を行って標識物質が細胞レセプターに結合 している度合を測定する。この方法において、物質量のアフイニティの差異を確 認できる。

従って、精製量の本発明の炎症サイトカインを放射性標識し、その後、結合性試 験を、例えば、最新に分化した好中球を用いて実施できるであろう。次いで、種 々の量の標識および未標識の炎症サイトカインを含有する溶液を調製し、次いで 、細胞サンプルを接種し、その後、インキュベートする。得られた細胞単一層を 洗浄し、溶解し、標識誤差を〈５％を得るに十分な時間でガンマ−カウンターで 計数する。このデータをスカフチャー）　（Ｓｃａｔ−ｃｈａｒｄ）分析に供し 、その後、物質活性に関する観察および計算を行う。上記は例示であるけれども 、レセプターアッセイを実施し利用するＬｉ様を例示しており、この場合、アッ セイした物質の細胞結合能力が著しい特徴として作用している。

本発明のさらなる実施態様においては、医療スペシャリスによる使用に適する商 業的試験キ７）を調製して凝しい哺乳動物中の炎症サイトカインの存在または不 存在を測定できる。上述の試験方法によれば、１つの分類のそのようなキットは 少なくとも標識炎症サイトカインまたはその結合性パートナ−１例えば、該サイ トカインに対して特異的な抗体、および指示書（勿論、使用する方法、例えば、 “拮抗′、“サントイフチ“、“ＤＡＳＰ”等によるが）を含むであろう、キッ トはまたバフファー、安定剤等のような補助的な試剤も含有し得る。

従って、試験キットは侵入性刺激物に対する哺乳動物宿主の反応の指示物として 調製でき、次のものを含む。

ｆａｌ　本発明の炎症サイトカインまたはこのサイトカインに対して特異性の結 合性パートナ−を検出可能な標識に対して直接または間接的に結合させて得られ た所定量の少なくとも１種の標識した免疫化学的に反応性の成分； （ｂｌ　他の試剤；および （ｃ）　３３キ、トの使用のための指示書。

さらに詳細には、上記の診断用試験キットは次のものを含み得る： （８１一般に固相に結合してイムノソルベントを形成するか、あるいは適当なタ ッグに結合した既知量の上述のような炎症サイトカイン（または結合性パートナ −）または複数のそのような最終生成物等（またはそれらの結合性パートナ−） ；（′ｂ）必要に応じての、他の試剤；およびＦＣｌ　３３試験キツトの使用の ための指示書。

さらなる変形においては、試験キットは上述の目的において調製し使用でき、所 定のプロトコール（例えば、“拮抗”、“サンドインチ”、“２抗体”等）に従 って操作し、次のものを含む：（８１本発明の炎症サイトカインを検出可能な標 識に結合させることによって得られた標識成分； 山）少なくとも１つの試剤がリガンドまたは固定リガンドであって、このリガン ドは （ｉ）上記標識成分子ａｔと結合し得るリガンド；（１１）上記標識成分＋８１ の結合性パートナ−と結合し得るリガンド； （ｉｉｉ　）測定すべき成分＋ａｌの少なくとも１つと結合し得るリガンド；お よび （ｉｖ）測定すべき成分子ａｌの少なくとも１つの結合性パートナ−の少なくと も１つと結合し得るリガンド；からなる群より選ばれる、１種以上の追加の免疫 化学試剤；および （Ｃ１上記炎症サイトカインとその特異的結合性パートナ−との免疫化学反応の １種以上の成分の検出および／または測定するためのプロトコールを行うための 指示書。

上記によれば、本発明の炎症サイトカインの合成、放出または活性を調節するの に有効な可能性ある薬物をスクリーニングするアッセイ系を調製できる。第１の 方法においては、試験薬物を刺激マクロファージサンプルに投与し本発明の炎症 サイトカインの産生に対する効果を測定する。別の方法においては、本発明の炎 症サイトカインを好中球のような細胞試験系に導入し、上記薬物も得られた細胞 培養物中に導入し、その後、培養物を試験して上記薬物の添加に基づくか公知の 炎症サイトカインの添加量の効果に基づ（本発明の炎症サイトカインの活性の何 らかの変化を観察し得る。

以下の実施例は、本発明の炎症サイトカインの単離および同定、その活性に関し ての観察、本発明の炎症サイトカインと本出願人等および当該分野の他の人々の 両方により早期に同定された他の因子との活性の差異と類似性両方の明確化、並 びにサイトカインＶＩＰ−２のクローニング、シーケンシングおよび発現を示す ものである。当然のこととして、以下で述べる特定の材料および方法は単に例示 であり変化し得、従って、以下は例示として提供され本発明を限定するものでは ない。

実施例１ 以下の実験は本発明の炎症サイトカインを同定し特性決定するために行った。先 ずメディエータ物質を培養し、炎症サイトカインを単離し、次いで、その構造を 部分的に決定し、その後、１群の試験をその活性を明らかにし、また、可能な限 り、他の公知のマクロファージ由来因子との同一性を確立または明白にするため ハムスターまたはヒトｇｒｏ遺伝子を含有するプラスミドまたは対照プラスミド 単独を移入したＣＯ８細胞からの上清はＡ、アニソビッツとＲ，サガーにより贈 与された。部分精製ヒ）ＮＡＰ−またん白質はＪ、バンダーメから贈与され、精 製ヒ）ＮＡＰ−またん白質はＴ、ヨシムラとＥ、レオナードにより贈与された。

すべての他の試剤はシグマ社（ミズリー州セントルイス）力Ａら入キックストン ）より入手した。エンドトキシン耐性Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ株のマウスはジャクソンラ ボラトリーズ社（メイン州パルハーバマウスマクロファージ細胞系ＲＡＷ２６４ ．７およびカケクチン／ＴＮＦ感受性細胞系Ｌ９２９はアメリカンタイプカルチ ャーコレクション（メリーランド州ロックビル）から入手し、それぞれ、ＲＰＭ １１６４０およびダルベア　−１（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’　ｓ）の変性ＭＥＭ（Ｄ ＭＥＭ）　、ギブコ社、ニューヨーク州グランドアイランド）中に維持した。両 培地には２０ｍＭのヘベス（Ｈｅｐｅｓ）と１０％のウシ胎児血清（ハイクロー ン社、エタ州ローガン）を加えた。刺激ＲＡＷ２６４．７上清の調製のために、 各細胞を１５０關組織培養皿（ファルコン社）でＲＰＭｒ＋１０％ウシ胎児血清 中で集密状になるまで増殖させた。各細胞をハングの平衡塩溶液中で５回洗浄し 、培地を１μｇ　／　ｍ　１のりポポリサッカライド（ＬＰＳＷ、　Ｅ。

ｃｏｌｉｏ　１２７　；　Ｂ８．ディフコ社、ミシガン州デトロイト）加能血清 ＲＰＭＴで置換した。各細胞は３７℃で１６〜１８時間インキュベートし、上清 を０．２２μｍフィルターで濾過した。

ＭＩＰ−２の精製 ＭＩＰ−２をＭＩＰ−１について従来開示された方法論［Ｓ。

Ｄ、ウオルペ、Ｇ、ダバテリス、Ｂ、シェリー、Ｂ、ビュートレー、Ｄ、　Ｇ、 ヘッセ、Ｈ，Ｔ、ネガエン、Ｌ、Ｌ、モルダウアー、Ｃ，Ｆ、ナサーン、Ｓ、Ｆ 、ローリ−１およびＡ、セラミ（１９８８）　、　Ｊ、　ＥＸＰ、　ＭＥＤ、、 １６７　：　５７０−５８１〕を用いて精製した。精製度はドデシル硫酸ナトリ ウム（Ｎａ口ｏｄ　５Ｏ４−ＰＡＧＥ）により銀染色で追試した。要するに、エ ンドトキシン刺激ＲＡＷ２６４．７細胞からの２１の状態調節上清を濃縮し、２ ０ｍＭ）リス−Ｈ（ｌバッファー、ｐＨｇ、ｏに対して透析濾過し、モノＱＩＯ ／１０（アニオン交換）カラム（ファルマシアＬＫＢバイオテクノロジー社、ニ ューシャーシー州う−ハイ）に適用した。９０％以上のＭＩＰ−２がカラムに結 合してないことを観察し流出液中で回収した。

ピークＭＩＰ−２含有フラクションを２０ｍＭ）リス−ＨＣｌバッファー、ｐＨ ８，０で平衡させたヘパリン共役セファローズ（ファルマシアＬＫＢ）に適用し 、同じバッファー中で０〜２ＭＮａＣ１直線状勾配で溶出させた。ＭＩＰ−２は 約０．７５　Ｍ　ＮａＣＡで溶出した。ピークフラクションを３．０００ダルト ン分子量カットオフのセントリコン限外濾過装置（アミコン社、マサチューセッ ツ州デンバーズ）中で濃縮し、１００ｍＭ酢酸アンモニウムで平衡させたセファ ローズ１２〔ゲル濾過（ファルマシアＬＫＢ））カラムに適用した。２１のＲＡ Ｗ２６４，７状態調節培地（これは約１００ｍｇの総たん白質に等しい）から、 ０．５ｍｇ量のＭＩＦ−２が、ウシガンマ−グロブリンを標準として用いてブラ ッドフォードたん白質アッセイ　（バイオラッド社、ニューヨーク州ロックビレ センター）によって確認したとき、一般に単離された。比較として、約２１Ｔ１ ｇのＭＩＰ−１と１ｍｇのカケクチン／ＴＮＦが同じようなバッチの状態調節培 地から精製できた。

イムノプロット分析 ＭＴＰ−２に対する抗血清を、完全フロインドアジュバント中で乳化させた１０ μｇの精製たん白質を１回、１ケ月後不完全フロインドアジュバント中の１０μ ｇの精製たん白質を１回皮下注射したウサギ中で産生させた。抗血清を第２回免 疫の１週間後に収集した。約５０ｎｇの純ＭＩＰ−２またはＮＡ、Ｐ−またん白 質、またはおよそ等量の適当なベクターを移入したＣＯ８細胞と無血清上滑から のヒトまたはハムスターｇｒｏたん白質を１０〜１８％直線状勾配ゲルでＮａ　 Ｄｏｄ　５Ｏａ−ＰＡＧＥに供し、トランスブロッ各プロットは５％ドライミル ク（アルファ社）中で１〜２時間ブロックし１：１００に希釈した抗血清中で１ 時間室温でインキュベートした。各プロットを０．０５％のトウィーン２０と０ ．０５％のチメロサールを含有するリン酸緩衝塩水中で３回洗浄し、結合抗体を アルカリ性ホスホターゼコンジュゲート第２抗体（プロメガバイオチク社、ウィ スコン州メジソン）で検出した。

ＰＭＮ　ヒ　および活性ヒ 走化性のアッセイを従来開示されたようにして行った（Ｓ、　Ｄ。

ウォルペ、Ｇ、タバテリス、Ｂ、シェリー、Ｂ、ビュートレー、Ｄ、Ｇ、ヘノセ 、Ｈ，Ｔ、ネガエン、Ｌ、Ｌ、モルダウアー、Ｃ６Ｆ、ナサン、Ｓ、Ｆ、ローリ 、およびＡ、セラミ（１９８８）、Ｊ。

ＥＸＰ、　？ＩＥＤ、、±６７　；５７０−５８１）、要するに、走化性は２５ μｆの化学誘引物質Ｃｆ　Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ　（１０−”Ｍ）　、Ｍ　Ｉ 　Ｐ−２またはバフファー２、ゲイ（Ｇｅｙ）の平衡塩溶液、ｐＨ７，４および ２％ＢＳＡ））を下部ウェルに入れ、上部ウェルを４５μｌの１．Ｉ　Ｘ　１０ ’　ＰＭＮ　（フィルコン−ハイバーブ密度勾配遠心およびデキストランセジメ ンテーションにより単離した）含をバッファーで満した。２つのウェルを３μＭ ポアサイズの硝酸セルロースＩｌｌ（ＳＭ］、１３０２；サートリアスバランセ ス社、ニューヨーク州ウェストバリー）で分離した。各チャンバーを湿潤５％二 酸化炭素、９５％周四周囲空気チャンバー中５分間、３７℃でインキュベートし た。膜を除き、染色し、ＰＭＮの膜へ移行した数を自動オブトマンクスイメージ ングシステム（オプトマックス社、ニューハンプシャー州ポリス）を用いて１３ ０μＭｔでノ１０μＭ毎に計数した。ランダムな移行も走化性の勾配を上部およ び下部チャンバーにおいて等濃度を含有させることによって消滅させる条件下で 測定した。

付着ＰＭＮからＨ，Ｏ，の放出を誘起するＭＩＰ−２の能力を従来開示されたよ うにしてアッセイした（Ｓ、Ｄ、ウォルペ、Ｇ。

ダバデリス、Ｂ、シェリー、Ｂ、ビュートレー、Ｄ、　Ｇ、ヘッセ、Ｈ，Ｔ、ネ ガエン、Ｌ、Ｌ、　モルダワアー、Ｃ，Ｆ、　＋す：／、Ｓ。

Ｆ、Ｄ−リー、およびＡ、　セラミ（１９８８）　、Ｊ、　ＥＸＰ、　ＭＥ口、 。

銀染色Ｎａ　Ｄｏｄ　５Ｏ４−ＰＡＧＥゲルから判断したとき、９０％以上のＭ ［’−２がモノＱカラムの流出液中に残った（第１図）。この一般精製工程は介 在性ＭＩＰ−１およびカケクチン／ＴＮＦを除去するのに十分であった。従来が ら示唆されたように（ウォルベ等、前出）、これら２つのたん白質は上記の負荷 条件下でモノＱカラムに結合し約０．３７Ｍ　ＮａＣｆで溶出する。ヘバリンー アフィニティクロマトグラフとゲル濾過の２つの連続工程はＭＩＰ−またん白質 を同質に精製するのに十分であった（第１図）。

ＭＩＰ−２はヘパリン−セファロースカラムから約０．７５ＭＮａＣＲで溶出し ゲル濾過上で見掛は分子量１０．０００ダルトンで浸透した。

精製ＭＴＰ−２の部分ＮＨ，末端アミノ酸配列データの分析は特異な配列を明ら かにした。ｄ−ＦΔＳ”ｌ−ＰプログラムＣＤ。

Ｊ６　リップ７７およびＷ、Ｒ，ハーフ７　（１９８５）　、５ＣＩＥＮＣＥ。

２２７：１４３５−１４４１１を用いるテ′イホフ（Ｄａｙｈｏｆｆ）バンク中 に存在する他の配列との比較は血小板因子４に対しての配列相関性を有するたん 白質群に対しての類似性を明らかにした。第２図はＭＩＰ−２の部分ＮＨ，末端 アミノ酸配列および一定に保有されたシスティン残基により配列されたこの群の 種々の構成員を示す。第３図はＭＩＦ−２で得た部分アミノ酸配列に相応する領 域上での％配列同一性の比較を示す。ＭＩＰ−２に対して観察体は単一塩基変化 に由来し得るアミノ酸変化を考慮したとき両ケースにおいて８８％まで増大する 。

予想マウスＫＣ遺伝子産生物（“ＫＣ″）は、Ｍｌ−２の部分配列と同じ領域で 比較したとき、より近い関係（ＫＣにおいてはヒ）ｇｒｏに対して６５．６％の 同一性およびハムスターに対して８１．２％の同一性、一方、ＭＩＰ−２におい てはそれぞれ、６２．５％と６８．７％）を示した。同様の結果は比較を完全配 列においてたとき６８％の同一性であった。

イムノプロット分析 ＭＩＰ−２と血小板因子４群の他の構成員との関係をさらに特徴付するために、 ウサギポリクローナル抗血清をＭＩＰ−２に対して産生させた。この抗血清はエ ンドトキシン刺１１ｉ１ｋＲＡＷ２６４．７細胞またはチオグリコレート誘起マ ウスマクロファージからの無血清上清に対してモノ特異的に反応したが非刺激細 胞からの上清中のいかなるたん白質も認識しなかった。ＭＩＰ−２に対する抗体 によるそのようなプロットの例は第４図のａおよびｂ部に示している。前免疫血 清も反応性を示さなかった。特に、ＶＩＰ−２に対する抗血清はＭＩＰ−１また はカケクチン／ＴＮＦと交差反応しなかった（例えば、第４図のレーン２参照） 。ウサギ抗＝ＭＩＰ−２はヒトｂよびハムスターエエ！と弱く交差反応したが精 製ヒ）ＮＡＰ−］たん白質とは交差反応しなかった（第４図）。

同様に、他の研究室からの部分精製ヒトＮＡＰ−１（Ｊ、バンダーメより供給さ れた）との交差反応は見られなかった。さらに、ヒトミュロ卓球細胞系ＨＬ６０ は１０−’Ｍホルボールミリスチル酸による刺激後交差反応性たん白質を分泌し 、抗ＭＩＰ−２抗体とヒトＮＡＰ−またん白質との反応性の欠如は種特異性より はむしろ免疫学的相関を欠くことに基づいていることをさらに示唆した。ＨＬ６ ０細胞からの交差反応性物質の性質は研究中である。

ＰＭＮ老化性および活性化 ＰＦ、群の他の構成員はＰＭＮに対して走化性でありまたＰにＮを活性化するの で、ＭＩＰ−２のこれら細胞上での効果を試験した。ＭＩＰ−２は１０％ｇ７層 ！でヒトＰＭＮに対して著しく走化性であり、また１　００％ｇ／ｍｆｆ１以上 の濃度でｆＭｅｔ　−Ｌｅｕ　−ＰｈｅよりもＰＭＮに対してより走化性であっ た（第５図）。等濃度のＭＩＰ−２を膜の両面に加えたときは、浸透の増大は見 られなかった。即ち、試験した１度でのＭＩＰ−２の活性はランダム浸透の促進 よりはむしろ細胞の特異的浸透の刺激に基づいているようである。

ＰＭＮはＭｌ当り１０％ｇ〜１μｇ範囲のＭ　Ｉ　Ｐ　−２７ｓ度で処理したと き酸化破壊（過酸化水素の発生により測定したとき）を受けなかった。

これらのインビトロアッセイに加えて、ＭＩＰ−２をエンドトキシン耐性Ｃ３Ｈ ／ＨｅＪマウスのフソトバフドにｌｏｏｎｇ注入することによりインビボで試験 した。この注入はＭＩＰ−１において従来示唆されたのと同様な強度の白血球浸 潤を誘起した。

挟−肚 ＭＩＰ−２はＮａ　Ｄｏｄ　ＳＯ，−ＰＡＧＥ上で約６，０００ダルトンの分子 量を有し、ゲル濾過カラムから約１０，０００の見掛は分子量を有して分画する 。ＭｒＰ−１はまたカケクチン／ＴＮＦと対照的に、ＭＩＰ−２はカチオン性で あり、ｐＨ８，０に平衡させたアニオン交換カラムに結合しない、この性質はこ れら活性の分離とその後のＭＩ＋”２の精製を簡単にした。介在性たん白質の大 部分をアニオン交換で除去したのち、ＭＩＰ−２は順次の約０．７５ＭＮａＣｌ で溶出するヘパリンアフィニティクロマトグラフとゲル濾過により均質に精製し た。

ＭＩＰ−２は極めて活性な走化剤であるが試験した投与量では化学運動活性を殆 んどまたは全く誘起しない。１０％ｇ／＠ｊ！（１，７ｘ　１　（Ｉ’Ｍ）で、 ＭＩＰ−２はヒトＰＭＮ類に対して著しく走化性であり、１００％ｇ／ｌｌＡ　 （１，７Ｘ　１０−”Ｍ）以上の濃度で、ＶＩＰ−２は最適濃度１０−ＩＩＭで のｆＭｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅよりも高い白血球指数を示す。各試験はＭＩＰ−２ がβ−グルクロニダーゼでなくシンザイムの放出によるＰＭＮの脱顆粒も誘起し 得る。

しかしながら、マウスＭＩＰ−２はヒトＰＭＮ中で呼吸破壊を誘起しなかった。

このことが種特異性に基づくかあるいは分子固有の性質に基づくかはまだ明らか でない。

ＰＭＮ上の上記の効果は多くの研究者によるまた種々の次のように称される各ヒ ト単核細胞から単離されたたん白質でなされた観察と同様である：“３１０Ｃ” 、“ＭＤＮＣＦ”、“ＭＯＮＡＰ″、”ＮＡＦ”または“ＧＣＰ”　〔シュミッ トＪ、およびウニイスマンＣ，（１９８７）　、Ｊ、ＩＭＭＵＮ、工且且：２５ ０−２５６；ヨシムラＴ１．マツシタに、、オッベンハイムＪ、Ｊ、　、および レオナードＥ、Ｊ、（１９８７）；Ｊ、ＩＭＭＵＮ、１３９ニア８８−７９３： ヨシムラＴ、、マツシタに、、タナカＳ、、ロビンソンＥ、Ａ、　、アッペラＥ 、、オッベンハイムＪ、Ｊ、　、およびレオナードＥ、Ｊ、（１９８７）　、　 ＰＲＤＣ，ＮＡＴＬ、　ＡＣＡＤ、　５ＣＩＵＳＡ　８４　：９２３−９２３７ 　；シュローダ−Ｊ、Ｍ、、モロヴイッＵ、モリタＥ、、およびグリストファー スＥ、（１９８７）。

Ｊ、ＩＭＭＵＮ、１３９：３４７４−３４８３；ウォルツＡ、。

ベベリＰ、、アシュアーＨ９，およびバギオリニＭ、（１９８？）。

Ｂ！ＯＣＨ，ＢＩＯＰＨＹＳ、　ＲＥＳ、　Ｃ０ＭＭ、　１４９　：　７５５− ７６１　；ベベリＰ、。

ウォルツＡ、、デウォルドＢ、およびバッギオニリＭ、　（１９８８）。

Ｊ、　ＥＸＰ、　Ｍｅｄ、　１６７　：　１５４７−１５５９　；バンダーメＪ 、ピーメンＪ、Ｖ、、　オツベンネッ力−Ｇ、およびビリュアＡ、（１９８８） 、Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１６７　：　１３６４−１３７６　〕このたん白 質は“好中球活性化たん白質−１”　（ＮＡＰ−１）として現在公知である、Ｍ ｒＰ−２とＮＡＰ−１の性質の直接的な類似性の故に、ＭＩＰ−２はＮＡＰ−１ のマウス等傷物であり得る可能性が考慮された。この関係は配列と免疫学的分析 の両方に基づいた場合ではないようである。ＦＡＳＴＰプログラムを用いたＰＦ −４群とＭＩＰ’−２とのＮ末端配列との比較はＮＡＰ−１と４７％の同一性を 示すがヒトおよびハムスターｇｒｏとはそれぞれ６３％と６９％の同一性を示す 。この関係はイムノプロットの結果と良く一致しており、イムノプロットの結果 はハムスターおよびヒトｇｒｏｔ”は交差反応性を示すが２つの異なる研究室か らのＮＡＩ”−１とは交差反応を示さなかった。

また、ＭＩＰ−２はｇｒｏのマウス等価物であるようではない、何故ならば、予 想したマウスＫＯ遺伝子産生物はｌＬ土に対して特にハムスターエエユの場合に おいて幾分高い配列同一性を示すからである。従って、本出願人等はＭＩＰ−２ はＩＬ上またはＫＣと近く相関するがこれらとは離れた新規な遺伝子産生物であ ると結論付した。

興味あるのはエエユおよびＫＣ遺伝子は夫々細胞増殖の制御について研究中に見 い出されたということである。エエユ遺伝子は形質転換細胞からのＤＮＡの差別 ハイブリッド化により単離し〔アユソウインツム１．バードウエルし、およびサ ガーＲ（１９Ｂ？）　。

ＰＲＯＣ，ＮＡＴＬ、　ＡＣＡＤ、　ＳＣ１，ＵＳＡ　８４　：　７１８　Ｂ　 −７１９２）　ｉＫＣ遺伝子は血小板由来成長因子で処理した細胞からの差別ハ イブリッド化により単離した〔コツクランＢ、Ｈ，，レフフェルＡ。

Ｃ１およびスチレスＣ，Ｄ、（１９８３）、ＣＥＬＬ　３３：９３９−９４７〕 。しかしながら、エエユ遺伝子による細胞の移入は形質転換に導びかなかった〔 アユソウィソッＡ、、バードウェルし。

およびサガーＲ（１９Ｂ　？　）　、　ＰＲＯＣ，ＮＡＴＬ、　ＡＣＡ［１，Ｓ Ｃ１，ＵＳＡ　８４ニア１８８−７１９２）、同様に、Ｍ　Ｉ　Ｐ　−２または ＭＩＰ−１＋制限量の血清または血漿による密度抑制型３Ｔ３ｍｌ！芽球の処理 も３Ｈチミジンの取り込みを増大させなかった。

大嵐五ヱ 以下はＭＩＰ−２のクローニングと発現を示す、マウスＭＩＰ−２のｃＤＮＡの クローニングは次のようであった。ＭＩＰ−２の部分ＮＨ，末端配列のアミノ酸 ９〜１４に相応する縮重オリゴヌクレオチドプローブブールを合成した。この部 分配列の部分は残りの配列と比較したときそのより小さいコドン縮退性故に選択 した。得られたプローブは長さにおいてオリゴマー１７ヌクレオチドの１２８倍 の縮重ブールであった。

ｃＤＮＡ５イ’：ｆ５　！Ｊ−は、タハテリス等、Ｊ、ＥＸＰ、　ＭＥＤ、　１ ６７　：１９３９−１９４１（１９８８）＄よびシェーリー等、Ｊ、　ＥＸＰ、 　ＭＥＤ。

から単離した。塗布ライブラリーの複製ニトロセルロースフィルターリフト（５ Ｘ１０５プラーグ）を４２℃で５ＸＳＳＣ，ｌｘデンハート２０ｍｍリン酸ナト リウムバッファー、ｐＨ６，５，５０％ホルマミド、１０％硫酸デキストラン、 ０．１％ＳＤＳ、０．１ｍｇ／　ｍ　ｌ音波処理サケ精子ＤＮＡおよび５　Ｘ　 Ｉ　Ｏ’　ｃｐｍ／ｍｌ／　”Ｐ−ＡＴＰ５’末端標識合成オリゴヌクレオチド プローブプール縮退中でハイブリッド化した。ハイブリッド化の後、各フィルタ ーをウッド等、ＰＲＯＣ，ＮＡＴＬ、　ＡＣＡＤ、ＳＣ１，ロ５Ａ８２：１５８ ５（１９８５）に記載されたＴＭＡＣ洗浄手順を用いて洗浄した。

複製フィルター上で陽性であったプラーグを第２ラウンドの低密度塗布およびス クリーニングに供した。４つの独立の陽性ファージクローンを単離し、これらク ローンよりＤＮＡをさらなる分析のために調製した。ｃＤ　Ｎ　Ａ　ｎ入物はＥ ｃｏＲＩによる消化により除去し、Ｍ１３ファージベクターにサブクローン化し た。ＤＮＡシーケンシングはサンガー等、ＰＲＯＣ，ＮＡＴＬ、ＡＣＡＤ、　Ｓ ＣＩ、　ＵＳＡ　７４：５４６３　（１９７７）のジジオキシ鎖終結法により行 った。挿入物の１つのヌクレオチド配列を決定し、精製天然ＭＩＰ−２のアミノ 末端ンーケンシングから決定したアミノ酸配列を含む分泌型たん白質をコードし ていることを見い出した。上記ｃＤＮＡクローンの配列および予想たん白質配列 は第７図に示す。

発現プラスミドＰＹＭＩＰ４００の構築このプラスミドはＭＩＰ−２の成熟コー ド配列に結合したα因子リーダーをコードする。ＭＩＰ−２成熟コ一ド配列は上 記で決定したＭＩＰ−２ｃＤＮＡに由来した。ＧＡＰＤＨプロモーター配列、α 因子リーダー配列およびα因子転写ターミネータ−はプラスミドｐＧＡ１１に由 来しており、その構築は１９８９年７月１９日付で公開されたヨーロッパ特許公 開第３２４．２７４号に記載されており、その記載は参考として本明細書に引用 する。

ＢｇｌＩｒ部位はインビトロ変異形成によりＭＩＰ−２のカルボキシ末端をコー ドするヌクレオチド配列に導入して発現ベクターへのクローニングを容易にした 。変異性プライマーは次のようであった： ５’　−ＣＡＡＡＡＧＡＴＣＴＴＧＡＡＣＡＡＡＧ−３’（本は元のｃＤＮＡ配 列からの変化を示す）上記変形ｃＤＮＡ配列の確認後、ファージＲＦを調製しＢ ｇｌＩおよびＢｇｌｍで消化した。成熟ＭＩＰ−２の殆んどをコードする１９６ ６ｂｐフラグメント（２個のＮ末端および９個のｅ末端アミノ酸を欠落する）を 単離した。１９８９年７月１９日付で公開されたヨーロッパ特許公開ＩＥ３２４ ，２７４号に記載されたプラスミドｐＧ　Ａ　Ｉ　＋をＫｐｍＩで消化し次のア ダプターに結合させた。

このアダプターは３個のα因子リーダーカルボキシ末端アミノ酸、ＬｙｓＡｒｇ 加工部位および成熟ＭＩＰ’−２の最初の３個のアミノ酸をコードしている。

Ｋｐｎｌ−Ｂａｌｌアダプター ５’　ＣＣＴＴＧＧＡＴＡＡＡＡＧＡＧＣＴＧＴＴＧＴＧＧ　３’３’　ＣＡＴ ＧＧＧＡＡＣＣＴＡＴＴＴＴＣＴＣＧＡＣＡＡＣＡＣＣ５’５ａｌＩによる消化 に続いて、次のＢｇｌ　Ｕ−３ａｌｌアダプターを加えた。このアダプターはＭ ＩＰ−２の８個のカルボキシ末端アミノ酸と翻訳停止コドンをコードしている。

ＢｇｌＩｒ　−５ａｌ　Ｉアダプター ５’ＧＡＴＣＴＴＧＡＡＣＡＡＡＧＧＣＡＡＧＧＣＴＡＡＣＴＧＡＴＡＧＣＧＴ ＣＧ　５’３’　ＡＡＣＴＴＧＴＴＴＣＣＧＴＴＣＣＧＡＴＴＧＡＣＴＡＴＣＧ ［：ＡＧＣＡＧＣＴ　３’上記の修飾ベクターはゲル精製し上記の１９６６　ｂ ｐ　Ｂａ１ｌ　−Ｂｇｌｌｌフラグメントに結合させ、その後、プラスミドｐＭ ＩＰ４００を単離するためのスクリーニングを行う。次いで、プラスミドを単離 し、各アダプターと交差するそのヌクレオチド配列を確認し、その後、このプラ スミドからのＢａｍＨＩ発現カセットを単離しｐＡＢ２４のＢａ１ＴＩＨＩ中に クローニングして発現プラスミドｐＹＭＩＰ４００を得る。

ＭｒＰ−２の発現 Ｓ、セレビシェ（Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓａｉｅ）枠Ｍ　Ｂ　２−１　（Ｉｅｕ２ −３．　Ｉｅｕ２−１１２、　ｈｉｓ３−１１．　ｈｉｓ３−１５．　ｕｒａ３ ム、　ｐｅｐ４ム、　（：ＡＮ’、　ｏｉｒ’）をｕｒａ原栄養に用いた標準の 手順および形質転換体によりプラスミドｐＹＭＩＰ４００で形質転換させる。発 現は個々の形質転換体の単一コロニーをロイシン選択性培地中に接種し４８時間 増殖させることによって分析する。次いで、培養物を遠心し、細胞をウラシルを 含まない培地中に再懸濁させｕｒａ選択性培地中に２０倍希釈させる。培養物は 約７２時間増殖させ、次いで収穫し、無細胞上清を調製した。状態調節培地を５ ＤＳ−ＰＡＧＥによりＭＩＰ−２の存在について分析し次いでクーマーシー染色 しイムノブロッティングを行う。

本発明は本発明の精神またはその本質的特徴から逸脱することなしに他の形で具 現化しあるいは他の方法で実施し得る。従って、本明細書の記載はすべての点で 例示を目的とするもので限定するものでなく、本発明の範囲は請求の範囲に示さ れており、均等の意味および範囲内のすべての変形は請求の範囲内に属するもの とする。

浄書（内容に変更なし） ／　ｔｓ−）　ｍ　（＋−ｔ−Ｌ ｂＰＦ−４ｒＰＦ−４ｈＰＢＰ　ｃ９Ｅ３　ｈＮＡＰ−１ｈｌＰｌｏ　ｈＧｒｏ 　ｈａｍＧｒｏ　＋ｎＫＣｍＭＩＰ−２ｈＰＦ−４６８，７６５，６５３，５２ ６，６３９，２３７３］、３　３７　３３．３　３９．２ｂＰＦ−４−６０６６ ，６３０３９，２３３，３４４，４３９，２４２，８４０，７ｒＰＦ−４−−５ ５，１３３，３４６，４３２，１３９，２４２，８４６，４４１，３ｈＰＢＰ　 −５３，５５７，１３２，１６０，７５５，５６２，９５３，５ｃ９Ｅ３　−− 　Ｓｏ　２７．２　４８．３　４Ｂ、３　Ｓ４．８４１．９ｈＮＡＰ−１−２６ ，６４６，６４６，６Ｓｏ　４６．６ｈ＋Ｐ１０　−−　１ｎｓ、　Ｉｎｓ、Ｉ ｎｓ、　Ｉｎｓ。

ｈｅｒｏ　−６５，６６５，６６２，５ｈａｍＧｒｏ　−一　ε１．２　６８． ７ｍＫｃ　−５９，３ ＦＩＧ、３ 浄書（内容に変更なし） ＡＬＡ　ＶＡＬ　ＶＡＬ　ＡＬＡ　ＳＥＲＧＬＵ　ＬＥＵ　ＡＲＧ　ＣＹＳ　Ｇ ＬＮ　ＣＹＳ　ＬＥＵ　ＬＹＳ　ＴＨＲＬＥＵ　ＰＲＯＦ　Ｉ　Ｇ、　６ ＣＴＧＣＴＧＴＣππ詰ＣＧＧ触Ｇ琺Ｃ焦ＧＡＧ島Ｇ蟻球ＷＤ―ひＧユｃｃｃ算 −ＧＣＡＡＧＧＣＡＣＡＧＴＧＣＣτ丁ＧＣττ入Ｘ八入ττＧτττＴＧτＣ ＡＴＧへＣτＴτＴＣＧ丁ＧτＣττＧ入ＡＣ丁ＧＧＡＣ手続補正書（方ん。

３．２２ 平成　年　月　日 特許庁長官　深　沢　亘　殿　圓 １゛１件０７示　九へ１鼎。５／１ｏ。３８□５９′５２、発明の名称　マクロ ファージ由来炎症メディエータ−（ＭＩＰ−２） ３、補正をする者 事件との関係　出　願　人 名　称　ザ　ロックフェラー　ユニヴアーシティ（ほか１名） ５、補正命令の日付　平成３年１１月５日Ｉ＋ＩＩＩ爛Ｉ呻−＾−【−！−−争 ＰＣＴ／ＵＳ　８９１０３７９Ｂ−一＾−，，，，１，，，ＰＣＴ／ＬＩＳ８９ １０３７９Ｂ

Claims (42)

【特許請求の範囲】
1. １．ヘパリンに結合し得る純粋形のたん白質を含み、皮下投与させたとき多形核 細胞浸潤に特徴を有する局所型炎症を誘起し、多形核細胞中でインビトロ化学運 動性を殆んどまたは全く誘起しないで強いインビトロ走化活性を有し得るが、同 化酵素リポたん白質リパーゼの活性を抑制し、カケクチン／ＴＮＦ感受性細胞の 細胞毒性を生じ、エントトキシン耐性Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ胸腺細胞の芽球形成を刺激 しまたは一次チオグリコレート誘起マウスマクロファージ細胞によるカケクチン ／ＴＮＦの産生を誘起する能力は欠如している炎症サイトカイン。
2. ２．前記サイトカインが生理学的条件下でカチオン性であり高塩濃度においてヘ パリンに結合する請求の範囲１記載の炎症サイトカイン。
3. ３．前記サイトカインがウサギの発熱を誘起し得ずあるいはヒト好中球中でイン ビトロでスーパーオキサイド形成または呼吸破壊を誘起し得ない請求の範囲１記 載の炎症サイトカイン。
4. ４．前記サイトカインが侵入性刺激を伴い得るような刺激剤物質とインキユベー トし得る動物マクロファージ細胞に由来し得る請求の範囲１記載の炎症サイトカ イン。
5. ５．第７図に示した７４個のアミノ酸配列に実質的に相同性アミノ酸配列を含む 請求の範囲１記載の炎症サイトカイン。
6. ６．検出可能な標識で標識した請求の範囲１または５のいずれか１項記載の炎症 サイトカイン。
7. ７．標識を酵素、蛍光を発する化学剤および放射性元素から選択する請求の範囲 ６記載の炎症サイトカイン。
8. ８．他のポリペプチドを実質的に含まない成熟マクロファージ炎症たん白質２（ ｍＭＩＰ−２）を含む組成物。
9. ９．第７図で示したｍＭＩＰ−２の７４個のアミノ酸配列と実質的に相同性のア ミノ酸配列を含むポリペプチド。
10. １０．レプリコンとｍＭＩＰ−２をコードする非相同性コード配列を含むＤＮＡ 分子。
11. １１．転写および翻訳制御配列の制御下ｍＭＩＰ−２のコード配列を含み、上記 の制御配列が宿主細胞中で上記コード配列の発現を行い得、上記転写および翻訳 制御配列の少なくとも１つが上記コード配列に非相同性であるＤＮＡ分子。
12. １２．前記コード配列がイントロンによって遮断されてない請求の範囲１０記載 のＤＮＡ分子。
13. １３．請求の範囲１０記載のＤＮＡ分子によって形質転換されてない細胞を実質 的に含まない請求の範囲１０記載のＤＮＡ分子によって形質転換された細胞の組 成物。
14. １４．原核生物細胞である請求の範囲１３記載の細胞。
15. １５．哺乳動物細胞である請求の範囲１３記載の細胞。
16. １６．酵母細胞である請求の範囲１３記載の細胞。
17. １７．請求の範囲１１記載のＤＮＡ分子により形質転換した細胞の組成物を前記 ｍＭＩＰ−２を発現させる条件下で培養し、発現したｍＭＩＰ−２を回収するこ とを特徴とするｍＭＩＰ−２の産生方法。
18. １８．細胞が原核細胞である請求の範囲１７記載の方法。
19. １９．細胞が真核細胞である請求の範囲１７記載の方法。
20. ２０．細胞が酵母である請求の範囲１７記載の方法。
21. ２１．ヘパリンに結合し得、皮下投与させたとき多形核細胞浸潤に特徴を有する 局所型炎症を誘起しかつ多形核細胞中で、インビトロ化学運動性を殆んどまたは 全く誘起しないで強いインビトロ走化活性を有し得るが、同化酵素リポたん白質 リパーゼの活性を抑制し、カケクチン／ＴＮＦ感受性細胞の細胞毒性を生じ、エ ンドトキシン耐性Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ胸腺細胞の芽球形成を刺激しまたは一次チオグ リコレート誘起マウスマクロファージ細胞によるカケクチン／ＴＮＦの産生を誘 起する能力は欠如している炎症サイトカインの調製方法において、Ａ．哺乳動物 から細胞サンプルを集めること；Ｂ．この細胞の一部を哺乳動物への侵入事件に 伴う刺激剤物質とインキュベートすること； Ｃ．上記細胞を誘発させて上記炎症サイトカインを産生させること；および Ｄ．上記炎症サイトカインを上記細胞の塊状物から収穫した上清から単離するこ と； を特徴とする上記調製方法。
22. ２２．前記刺激剤物質は、エンドトキシンを含む請求の範囲２１記載の方法。
23. ２３．炎症サイトカインに対する抗体であってこの抗体を産生させる上記炎症サ イトカインがヘパリンに結合し得る純粋形のたん白質を含み、皮下投与させたと き多形核細胞浸潤に特徴を有する局所型炎症を誘起し、多形核細胞中でインビト ロ化学運動性を殆んどまたは全く誘起しないで強いインビトロ走化活性を有し得 るが、同化酵素リポたん白質リパーゼの活性を抑制し、カケクチン／ＴＮＦ感受 性細胞の細胞毒性を生じ、エンドトキシン耐性Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ胸腺細胞の芽球形 成を刺激しまたは一次チオグリコレート誘起マウスマクロファージ細胞によるカ ケクチン／ＴＮＦの産生を誘起する能力は欠如していることを特徴とする上記抗 体。
24. ２４．ポリクローナル抗体を含む請求の範囲２３記載の抗体。
25. ２５．モノクローナル抗体を含む請求の範囲２３記載の抗体。
26. ２６．請求の範囲２５記載のモノクローナル抗体を産生する不死細胞。
27. ２７．検出可能な標識で標識した請求の範囲２３記載の抗体。
28. ２８．標識が酵素、蛍光を発する化学剤および放射性元素から選択される請求の 範囲２７記載の抗体。
29. ２９．ヘパリンに結合し得、皮下投与させたとき多形核細胞浸潤に特徴を有する 局所型炎症を誘起しかつ多形核細胞中でインビトロ化学運動性を殆んどまたは全 く誘起しないで強いインビトロ走化活性を有し得るが、同化酵素リポたん白質リ パーゼの活性を抑制し、カケクチン／ＴＮＦ感受性細胞の細胞毒性を生じ、エン ドトキシン耐性Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ胸腺細胞の芽球形成を刺激しまたは一次チオグリ コレート誘起マウスマクロファージ細胞によるカケクチン／ＴＮＦの産生を誘起 する能力は欠如している炎症サイトカインの存在を測定する方法において、上記 炎症サイトカインを、 Ａ．上記炎症サイトカインの少なくとも１つのサンプルを、相応する数の異なる 公知の侵入性刺激物に暴露させた動物細胞から調製すること； Ｂ．上記炎症サイトカインサンプルに対し特異性の少なくとも１つの相応する抗 体または結合性パートナーを調製すること；Ｃ．検出可能な標識を上記炎症サイ トカインサンプルおよびこのサンプルに対する上記抗体または結合性パートナー からなる群から選ばれた物質上に付着させること；Ｄ．標識していない工程Ｃか らの物質からなる群から選ばれた物質、および上記炎症サイトカインが凝われる 哺乳動物からの生物学的サンプルとを適当な基質上に固定すること；Ｅ．工程Ｃ の標識サンプルを上記生物学的サンプルおよび上記固定物質と接触せせること； Ｆ．上記固定物質に結合させた工程Ｃの物質を上記固定物質に結合してない工程 Ｃの物質から分離すること；およびＧ．上記結合物質を上記標識物質の存在につ いて試験すること；によって測定することを特徴とする上記測定方法。
30. ３０．ヘパリンに結合し得、皮下投与させたとき多形核細胞浸潤に特徴を有する 局所型炎症を誘起しかつ多形核細胞中でインビトロ化学運動性を殆んどまたは全 く誘起しないで強いインビトロ走化活性を有し得るが、同化酵素リポたん白質リ パーゼの活性を抑制し、カケクチン／ＴＮＦ感受性細胞の細胞毒性を生じ、エン ドトキシン耐性Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ胸腺細胞の芽球形成を刺激しまたは一次チオグリ コレート誘起マウスマクロファージ細胞によるカケクチン／ＴＮＦの産生を誘起 する能力は欠如している炎症サイトカインの測定部位の測定方法において、上記 炎症サイトカインの結合部位を、 Ａ．上記炎症サイトカインの少なくとも１つのサンプルを相応する数の異なる公 知の侵入性刺激物から調製すること；Ｂ．検出可能な標識を上記炎症サイトカイ ンサンプル上に付着させること； Ｃ．上記標識炎症サイトカインサンプルを該サイトカインの結合部位が凝われる 哺乳動物からの生物学的サンプルと接触ささせること；および Ｄ．上記生物学的サンプルを上記標識炎症サイトカインサンプルの存在について 結合試験において試験すること；によって測定することを特徴とする上記測定方 法。
31. ３１．哺乳動物中の与えられた侵入性刺激物に伴う炎症サイトカインの存在を測 定する方法を含む請求の範囲２９記載の方法。
32. ３２．侵入性刺激物が感染である請求の範囲３１記載の方法。
33. ３３．侵入性刺激物がバクテリア感染、ウイルス感染、原虫感染腫瘍哺乳動物細 胞および毒素から選ばれる請求の範囲３１記載の方法。
34. ３４．哺乳動物中の侵入性または特発性刺激物の存在を測定する方法を含む請求 の範囲２９記載の方法。
35. ３５．哺乳動物体内の細胞上の炎症サイトカインのレセプターと反応し得る炎症 サイトカインの産生および／または活性を調節する薬物の能力を試験する方法に おいて、上記レセプターを有する試験細胞のコロニーを上記炎症サイトカインを 含有する増殖培地で培養し、上記薬物を試験下に加え、その後、上記試験細胞コ ロニー上での上記薬物と上記レセプターとの反応性を測定することを含み、上記 炎症サイトカインがヘパリンに結合し得るたん白質を含み、皮下投与させたとき 多形核細胞浸潤に特徴を有する局所型炎症を誘起しかつ、多形核細胞中でインビ トロ化学運動性を殆んどまたは全く誘起しないで強いインビトロ走化活性を有し 得るが、同化酵素リポたん白質リパーゼの活性を抑制し、カケクチン／ＴＮＦ感 受性細胞の細胞毒性を生じ、エンドトキシソ耐性Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ胸腺細胞の芽球 形成を刺激しまたは一次チオグリコレート誘起マウスマクロファージ細胞による カケクチン／ＴＮＦの産生を誘起する能力は欠如していることを特徴とする上記 方法。
36. ３６．ヘパリンに結合し得、皮下投与させたとき多形核細胞浸潤に特徴を有する 局所型炎症を誘起しかつ、多形核細胞中でインビトロ化学運動性を殆んどまたは 全く誘起しないで強いインビトロ走化活性を有し得るが、同化酵素リポたん白質 リパーゼの活性を抑制し、カケクチン／ＴＮＦ感受性細胞の細胞毒性を生じ、エ ンドトキシン耐性Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ胸腺細胞の芽球形成を刺激しまたは一次チオグ リコレート誘起マウスマクロファージ細胞によるカケクチン／ＴＮＦの産生を誘 起する能力は欠如している炎症サイトカインを接種した観察可能な細胞試験コロ ニーを含むことを特徴とする、炎症サイトカインの産生および／または活性を調 節する能力について薬物または他の試剤をスクリーニングするためのアッセイ系 。
37. ３７．Ａ．炎症サイトカインまたはこれに対する特異的結合パートナーを検出可 能な標識に直接または間接的に結合させることによって得られた少なくとも１つ の標議した免疫化学的に反応性の成分、上記炎症サイトカインがヘパリンに結合 し得るたん白質を含み、皮下投与させたとき多形核細胞浸潤に特徴を有する局所 型炎症を誘起しかつ、多形核細胞中でインビトロ化学運動性を殆んどまたは全く 誘起しないで強いインビトロ走化活性を有し得るが、同化酵素リポたん白質リパ ーゼの活性を抑制し、カケクチン／ＴＮＦ感受性細胞の細胞毒性を生じ、エンド トキシン耐性Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ胸腺細胞の芽球形成を刺激しまたは一次チオグリコ レート誘起マウスマクロファージ細胞によるカケクチン／ＴＮＦの産生を誘起す る能力は欠如していること； Ｂ．他の試剤；および Ｃ．キットを使用するための指示書 を含む、血清または水性培地中の炎症サイトカインを指示するための試験キット 。
38. ３８．哺乳動物に、炎症サイトカインに特異性の抗体、上記炎症サイトカインの 産生を抑制し得る薬剤、上記炎症サイトカインに対してアンタゴニストとして作 用し得る上記炎症サイトカインに対する抗体でない薬剤、およびこれらの混合物 からなる群がら選ばれた炎症軽減量の物質を投与することを含み、上記炎症サイ トカインがヘパリンに結合し得るたん白質を含み、皮下投与させたとき多形核細 胞浸潤に特徴を有する局所型炎症を誘起し、多形核細胞中でインビトロ化学運動 性を殆んどまたは全く誘起しないで強いインビトロ走化活性を有するが、同化酵 素リポたん白質リパーゼの活性を抑制し、カケクチン／ＴＮＦ感受性細胞の細胞 毒性を生じ、エンドトキシン耐性Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ胸腺細胞の芽球形成を刺激しま たは一次チオグリコレート誘起マウスマクロファージ細胞によるカケクチン／Ｔ ＮＦの産生を誘起する能力は欠如していることを特徴とする哺乳動物の炎症の治 療方法。
39. ３９．哺乳動物に、炎症サイトカインに特異性の抗体、上記炎症サイトカインの 産生を抑制し得る薬剤、上記炎症サイトカインに対してアンタゴニストとして作 用する上記炎症サイトカインに対する抗体でない薬剤、およびこれらの混合物か らなる群から選ばれた物質を炎症および／または発熱を解消するのに有効な量で 投与することを含み、上記炎症サイトカインがヘパリンに結合し得るたん白質を 含み、皮下投与させたとき多形核細胞浸潤に特徴を有する局所型炎症を誘起し、 多形核細胞中でインビトロ化学運動性を殆んどまたは全く誘起しないで強いイン ビトロ走化活性を有するが、同化酵素リポたん白質リパーゼの活性を抑制し、カ ケクチン／ＴＮＦ感受性細胞の細胞毒性を生じ、エンドトキシン耐性Ｃ３Ｈ／Ｈ ｅＪ胸腺細胞の芽球形成を刺激しまたは一次チオグリコレート誘起マウスマクロ ファージ細胞によるカケクチン／ＴＮＦの産生を誘起する能力は欠如しているこ とを特徴とする哺乳動物の炎症および／または発熱の予防方法。
40. ４０．哺乳動物に、炎症サイトカイン、この炎症サイトカインの産生および／ま たは活性を促進させ得る薬剤、上記炎症サイトカインの活性を擬態し得る薬剤、 およびこれらの混合物からなる群から選ばれた疾患軽減量の物質を投与すること を含み、上記炎症サイトカインがヘパリンに結合し得るたん白質を含み、皮下投 与させたとき多形核細胞浸潤に特徴を有する局所型炎症を誘起し、多形核細胞中 でインビトロ化学運動性を殆んどまたは全く誘起しないで強いインビトロ走化活 性を有するが、同化酵素リポたん白質リパーゼの活性を抑制し、カケクチソ／Ｔ ＮＦ感受性細胞の細胞毒性を生じ、エンドトキシン耐性Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ胸腺細胞 の芽球形成を刺激しまたは一次チオグリコレート誘起マウスマクロファージ細胞 によるカケクチン／ＴＮＦの産生を誘起する能力は欠如していることを特徴とす る哺乳動物の感染性および非感染性疾患の治療方法。
41. ４１．Ａ．炎症サイトカインに対する抗体、この炎症サイトカインの産生を抑制 し得る薬剤、上記炎症サイトカインの活性を拮抗し得る上記炎症サイトカインに 対する抗体でない薬剤、およびこれらの混合物、またはこれらに対する特異的な 結合パートナーからなる群より選ばれた治療上有効な量の物質、上記炎症サイト カインがヘパリンに結合し得るたん白質を含み、皮下投与させたとき多形核細胞 浸潤に特徴を有する局所型炎症を誘起し、多形核細胞中でインビトロ化学運動性 を殆んどまたは全く誘起しないで強いインビトロ走化活性を有するが、同化酵素 リポたん白質リパーゼの活性を抑制し、カケクチン／ＴＮＦ感受性細胞の細胞毒 性を生じ、エンドトキシン耐性Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ胸腺細胞の芽球形成を刺激しまた は一次チオグリコレート誘起マウスマクロファージ細胞によるカケクチン／ＴＮ Ｆの産生を誘起する能力は欠如していること；および Ｂ．薬学上許容し得るキャリヤー を含む哺乳動物の炎症および／または発熱の治療用薬剤組成物。
42. ４２．Ａ．炎症サイトカイン、この炎症サイトカインの産生および／または活性 を促進し得る薬剤、上記炎症サイトカインの活性を擬態し得る薬剤およびこれら の混合物からなる群から選ばれた治療上有効量の物質、上記炎症サイトカインが ヘパリンに結合し得るたん白質を含み、皮下投与させたとき多形核細胞浸潤に特 徴を有する局所型炎症を誘起し、多形核細胞中でインビトロ化学運動性を殆んど または全く誘起しないで強いインビトロ走化活性を有するが、同化酵素リポたん 白質リパーゼの活性を抑制し、カケクチン／ＴＮＦ感受性細胞の細胞毒性を生じ 、エンドトキシン耐性Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ胸腺細胞の芽球形成を刺激しまたは一次チ オグリコレート誘起マウスマクロファージ細胞によるカケクチン／ＴＮＦの産生 を誘起する能力は欠如していること；および Ｂ．薬学上許容し得るキャリヤー とを含む哺乳動物の感染性および非感染性疾患への治療用薬剤組成物。