JP2001213803A - マクロファージ由来炎症メディエーター（ｍｉｐ−２） - Google Patents
マクロファージ由来炎症メディエーター（ｍｉｐ−２）Info
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C07K14/522—Alpha-chemokines, e.g. NAP-2, ENA-78, GRO-alpha/MGSA/NAP-3, GRO-beta/MIP-2alpha, GRO-gamma/MIP-2beta, IP-10, GCP-2, MIG, PBSF, PF-4, KC
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- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
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- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/21—Chemokines, e.g. MIP-1, MIP-2, RANTES, MCP, PF-4
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- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/22—Colony stimulating factors (G-CSF, GM-CSF)
Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 炎症サイトカインに対する抗体に基づいた或
いは同じ又は拮抗活性を有する薬剤に基づいたある種の
治療方法の提供。 【解決手段】 図の７３個のアミノ酸配列又はそのアミ
ノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置
換若しくは付加されたアミノ酸配列を有する炎症サイト
カインに対する抗体、この炎症サイトカインの産生を抑
制し得る薬剤、上記炎症サイトカインの活性を拮抗し得
る上記炎症サイトカインに対する抗体でない薬剤、及び
これらの混合物、又はこれらに対する特異的な結合パー
トナーからなる群より選ばれた治療上有効な量の物質、
及び薬学上許容し得るキャリヤーを含む哺乳動物の炎症
又は発熱の治療用薬剤組成物。
いは同じ又は拮抗活性を有する薬剤に基づいたある種の
治療方法の提供。 【解決手段】 図の７３個のアミノ酸配列又はそのアミ
ノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置
換若しくは付加されたアミノ酸配列を有する炎症サイト
カインに対する抗体、この炎症サイトカインの産生を抑
制し得る薬剤、上記炎症サイトカインの活性を拮抗し得
る上記炎症サイトカインに対する抗体でない薬剤、及び
これらの混合物、又はこれらに対する特異的な結合パー
トナーからなる群より選ばれた治療上有効な量の物質、
及び薬学上許容し得るキャリヤーを含む哺乳動物の炎症
又は発熱の治療用薬剤組成物。
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、一般に動物宿主へ
の感染のような侵入性刺激物質およびその効果と相応す
る作用の分析および処理方法に関し、とりわけ、そのよ
うな侵入性刺激物に対しての宿主応答において沈降し得
る物質の同定に関する。
の感染のような侵入性刺激物質およびその効果と相応す
る作用の分析および処理方法に関し、とりわけ、そのよ
うな侵入性刺激物に対しての宿主応答において沈降し得
る物質の同定に関する。
【０００２】
【従来の技術】関連刊行物 本出願人等は本発明の要旨に関連する幾つかの論文の著
者または共同著者である。これらの論文は米国特許第4,
603,106 号に列挙されている論文を補足するものでその
早期の各論文は参考として本明細書に引用する。（1)
〔出願人セラミとＢ．ビュートレー，Ｊ．マホネー，
Ｎ．レ トランおよびＰ．ペカレとの共著〕“Purificat
ion of Cachectin, a Lipoprotein Lipase-Suppressing
Hormon Secreted By Endotoxin-Induced Raw 264.7 Ce
lls", J. EXP. MED.161 : 984-995（１９８５年５月) ;
(2) 〔出願人セラミとＭ．カワカミ，Ｊ．Ｒ．マホマ
ホネー, Ｎ．レ トラン，Ｗ．ヴィンおよびＹ．イケダ
との共著〕”Lipopoly-Saccharide-Treated RAW 264.7
Calls Produce a Mediator Which Inhibits Lipoprotei
n Lipase in ３Ｔ３−Ｌ１ Calls ", J. IMMUNOL. １３
４（3)：１６７３−１６７５（１９８５年３月）；（3)
〔出願人セラミとＰ．Ｊ．ホテツ，Ｎ．レ トラン，お
よびＡ．Ｈ．フェアラブとの共著〕“Lipoprotein Lipa
se Suppressionin ３Ｔ３ Cells by a Haemato-protozo
an-Induced Mediator From PeritonealExudate Cells",
PARASITE IMMUNOL. (Oxf.) ６：２０３（１９８４）；
（4)〔出願人セラミとＢ．ビュートレー，Ｄ．グリーン
ウォールド，Ｊ．Ｄ．ヒュメス，Ｍ．チャンＹ．，Ｃ．
Ｅ．パン，Ｊ．マチソンおよびＲ．ウレビッチとの共
著〕“Identify of Tumor Necrosis Factor and Macrop
hage-Secreted Factor Cachectin", NATURE ３１６：
５５２−５５４（１９８５）；（5)〔出願人セラミと
Ｂ．ビュートレー，Ｆ．Ｍ．トーチ，Ｂ．ディックマン
およびＣ．Ｍ．リンゴールドとの共著〕“A Macrophage
Factor Inhibits Adipocyte Gene Expression: An In
Vitro Model of Cachexia", SCIENCE ２２９：８６７−
８６９（１９８５）；（6)〔出願人セラミとＢ．ビュー
トレーおよびＩ．Ｗ．ミルサークとの共著〕“Passive
Immunization Against Cachectin/Tumor Necrosis Fact
or (TNF) Protects Mice From the Lethal Effect of E
ndotoxin", SCIENCE ２２９：８６９−８７１（１９８
５）；（7)〔出願人セラミ，ウォルペおよびシェリーと
Ｂ．ビュートレー，Ｇ．ダバテリス，Ｄ．Ｇ．ヘッセ，
Ｈ．Ｔ．ヌビュエン、Ｌ．Ｙ．モルダワァー，Ｃ．Ｆ．
ナサーンおよびＳ．Ｆ．ローリイとの共著〕，“Macrop
hages Secrete a Novel Heparin-Binding Protein with
Inflammatoryand Neutrophil Chemokinetic Propertie
s", Ｊ．ＥＸＰ．ＭＥＤ．１６７：５７０−５８１（１
９８８）；（8)〔出願人ウォルペ，セラミおよびテカム
ーオルソンとＧ．ダバテリス，Ｋ．ヘームセン，Ｃ．ロ
イドケ，Ｃ．ガレガス，Ｐ．コイトおよびＪ．メリーウ
ィーザーとの共著〕，“Cloning and Characterization
of a cDNA for Murine Macrophage Inflammatory Prote
in (MIP), A Novel Monokine with Inflammatory and C
hemokinetic Properties",Ｊ．ＥＸＰ．ＭＥＤ., １６
７：１９３９−１９４４（１９８８年６月）；（9)〔出
願人とＣ．ガレゴス，Ｄ．ビュアー，Ｇ．ダバテリス，
Ｆ．マシアズおよびＤ．コイトとの共著〕，“Resoluti
on of the Two Components of Macrophage Inflammator
y Protein1, and Cloning and Characterization of On
e of Those Components, ＭＩＰ−1β”，Ｊ．ＥＸＰ．
ＭＥＤ．１６８：２２５１−２２５９（１９８８年１２
月）；および（10) 〔出願人ウオルペ，セラミおよびシ
ェリーとＤ．ジォルス，Ｇ．タバテリスおよびＲ．ユル
トとの共著〕，“Identification and Characterizatio
n of Macrophage Inflammatory Protein 2 ", PROC. NA
TL. ACAP. SCI. USA８６：６１２−６１６（１９８９年
１月）。本発明に至る研究はナショナルインスチチュー
ツオブヘールス（the NationalInstitutes of Health)
およびロックフェラー財団の認可に一部基づく。
者または共同著者である。これらの論文は米国特許第4,
603,106 号に列挙されている論文を補足するものでその
早期の各論文は参考として本明細書に引用する。（1)
〔出願人セラミとＢ．ビュートレー，Ｊ．マホネー，
Ｎ．レ トランおよびＰ．ペカレとの共著〕“Purificat
ion of Cachectin, a Lipoprotein Lipase-Suppressing
Hormon Secreted By Endotoxin-Induced Raw 264.7 Ce
lls", J. EXP. MED.161 : 984-995（１９８５年５月) ;
(2) 〔出願人セラミとＭ．カワカミ，Ｊ．Ｒ．マホマ
ホネー, Ｎ．レ トラン，Ｗ．ヴィンおよびＹ．イケダ
との共著〕”Lipopoly-Saccharide-Treated RAW 264.7
Calls Produce a Mediator Which Inhibits Lipoprotei
n Lipase in ３Ｔ３−Ｌ１ Calls ", J. IMMUNOL. １３
４（3)：１６７３−１６７５（１９８５年３月）；（3)
〔出願人セラミとＰ．Ｊ．ホテツ，Ｎ．レ トラン，お
よびＡ．Ｈ．フェアラブとの共著〕“Lipoprotein Lipa
se Suppressionin ３Ｔ３ Cells by a Haemato-protozo
an-Induced Mediator From PeritonealExudate Cells",
PARASITE IMMUNOL. (Oxf.) ６：２０３（１９８４）；
（4)〔出願人セラミとＢ．ビュートレー，Ｄ．グリーン
ウォールド，Ｊ．Ｄ．ヒュメス，Ｍ．チャンＹ．，Ｃ．
Ｅ．パン，Ｊ．マチソンおよびＲ．ウレビッチとの共
著〕“Identify of Tumor Necrosis Factor and Macrop
hage-Secreted Factor Cachectin", NATURE ３１６：
５５２−５５４（１９８５）；（5)〔出願人セラミと
Ｂ．ビュートレー，Ｆ．Ｍ．トーチ，Ｂ．ディックマン
およびＣ．Ｍ．リンゴールドとの共著〕“A Macrophage
Factor Inhibits Adipocyte Gene Expression: An In
Vitro Model of Cachexia", SCIENCE ２２９：８６７−
８６９（１９８５）；（6)〔出願人セラミとＢ．ビュー
トレーおよびＩ．Ｗ．ミルサークとの共著〕“Passive
Immunization Against Cachectin/Tumor Necrosis Fact
or (TNF) Protects Mice From the Lethal Effect of E
ndotoxin", SCIENCE ２２９：８６９−８７１（１９８
５）；（7)〔出願人セラミ，ウォルペおよびシェリーと
Ｂ．ビュートレー，Ｇ．ダバテリス，Ｄ．Ｇ．ヘッセ，
Ｈ．Ｔ．ヌビュエン、Ｌ．Ｙ．モルダワァー，Ｃ．Ｆ．
ナサーンおよびＳ．Ｆ．ローリイとの共著〕，“Macrop
hages Secrete a Novel Heparin-Binding Protein with
Inflammatoryand Neutrophil Chemokinetic Propertie
s", Ｊ．ＥＸＰ．ＭＥＤ．１６７：５７０−５８１（１
９８８）；（8)〔出願人ウォルペ，セラミおよびテカム
ーオルソンとＧ．ダバテリス，Ｋ．ヘームセン，Ｃ．ロ
イドケ，Ｃ．ガレガス，Ｐ．コイトおよびＪ．メリーウ
ィーザーとの共著〕，“Cloning and Characterization
of a cDNA for Murine Macrophage Inflammatory Prote
in (MIP), A Novel Monokine with Inflammatory and C
hemokinetic Properties",Ｊ．ＥＸＰ．ＭＥＤ., １６
７：１９３９−１９４４（１９８８年６月）；（9)〔出
願人とＣ．ガレゴス，Ｄ．ビュアー，Ｇ．ダバテリス，
Ｆ．マシアズおよびＤ．コイトとの共著〕，“Resoluti
on of the Two Components of Macrophage Inflammator
y Protein1, and Cloning and Characterization of On
e of Those Components, ＭＩＰ−1β”，Ｊ．ＥＸＰ．
ＭＥＤ．１６８：２２５１−２２５９（１９８８年１２
月）；および（10) 〔出願人ウオルペ，セラミおよびシ
ェリーとＤ．ジォルス，Ｇ．タバテリスおよびＲ．ユル
トとの共著〕，“Identification and Characterizatio
n of Macrophage Inflammatory Protein 2 ", PROC. NA
TL. ACAP. SCI. USA８６：６１２−６１６（１９８９年
１月）。本発明に至る研究はナショナルインスチチュー
ツオブヘールス（the NationalInstitutes of Health)
およびロックフェラー財団の認可に一部基づく。
【０００３】発明の背景 本発明は、一般に動物宿主への感染のような侵入性刺激
物質およびその効果と相応する作用の分析および処理方
法に関し、とりわけ、そのような侵入性刺激物に対して
の宿主応答において沈降し得る物質の同定に関する。
物質およびその効果と相応する作用の分析および処理方
法に関し、とりわけ、そのような侵入性刺激物に対して
の宿主応答において沈降し得る物質の同定に関する。
【０００４】幾つかの共通の生理学的および生物学的障
害は、バクテリア、ウイルス、または原虫感染；腫瘍；
または内毒素のような種々の侵入性刺激物に応答する動
物宿主において並びに自然発生的状態において観察され
得る。例えば、これらの応答には発熱、白血球症、過脂
肪血症、食物摂取減退（食物欠乏症）、活力減退、瘠痩
（悪液質）、並びに筋肉、白血球および肝臓代謝におけ
る他の変調がある。特に、トリパノゾーマブルセイ（Tr
ypanosoma brucei) を感染させたウサギの悪液質の生物
学的メカニズムを明らかにするための最近の研究は、最
小の寄生虫症を有する動物が死にかけ、血漿超低密度リ
ポたん白質（ＶＬＤＬ）の著しい上昇を伴って極端な高
トリグリセリド症を示したことを警告した。Ｃ．Ａ．ロ
ーサーおよびＡ．セラミ，MOL. BIOCHEM. PARASITOL.
１：３１−３８（１９８０）を参照されたい。高グリセ
リド症状は上記の実験的感染を伴った重篤な悪液質素質
の点で注目し得るものであった。血漿ＶＬＤＬの上昇は
抹消組織リポたん白質リバーゼ（ＬＰＬ）活性の喪失に
起因した明化欠陥（Clearing defect)に由来することが
示された。
害は、バクテリア、ウイルス、または原虫感染；腫瘍；
または内毒素のような種々の侵入性刺激物に応答する動
物宿主において並びに自然発生的状態において観察され
得る。例えば、これらの応答には発熱、白血球症、過脂
肪血症、食物摂取減退（食物欠乏症）、活力減退、瘠痩
（悪液質）、並びに筋肉、白血球および肝臓代謝におけ
る他の変調がある。特に、トリパノゾーマブルセイ（Tr
ypanosoma brucei) を感染させたウサギの悪液質の生物
学的メカニズムを明らかにするための最近の研究は、最
小の寄生虫症を有する動物が死にかけ、血漿超低密度リ
ポたん白質（ＶＬＤＬ）の著しい上昇を伴って極端な高
トリグリセリド症を示したことを警告した。Ｃ．Ａ．ロ
ーサーおよびＡ．セラミ，MOL. BIOCHEM. PARASITOL.
１：３１−３８（１９８０）を参照されたい。高グリセ
リド症状は上記の実験的感染を伴った重篤な悪液質素質
の点で注目し得るものであった。血漿ＶＬＤＬの上昇は
抹消組織リポたん白質リバーゼ（ＬＰＬ）活性の喪失に
起因した明化欠陥（Clearing defect)に由来することが
示された。
【０００５】ＬＰＬ活性低下は他の人々によっても観察
されており、この状態はヒトの身体がショック状にある
ときに生じることが示されている。Ｅ．Ｂ．マン等、
“TheLipids of Serum and Liver in Patients with He
patic Diseases", CLIN. INVEST. ２４：６２３以下
（１９４５）を参照されたい；また、ジョンＩ．ガリン
等、“Serum Lipids in Infection", N. ENGL. J. MED.
２８１：１０８１−１０８６（１９６９年１１月１３
日）；Ｄ．ファースチ等、“Effects of Three Bacteri
al Infections on Serum Lipids of Rabbits", J. BAC
TERIOL. ９５：１６１５以下（１９６８）：Ｓ．Ｅ．グ
ロスバーク等、“Hyperlipaemia FollowingViral Infec
tion in the Chicken Embryo: A New Syndrome", NATU
RE （ロンドン）２０８：９５４以下（１９６５）；ロ
バートＬ．ヒルシュ等、“Hyperlipidemia, Fatty Live
r and Bromsulfo-phthalein Retention in Rabbits Inj
ectedIntravenously with Bacterial Endotoxin", J. L
IPID. RES. ５６３−５６８（１９６４）；オサムサカ
グチ等、“Alternations of Lipid Metabolism in Mice
Injected with Endotoxins", MICROBIOL. IMMUNOL. ２
３（2)：７１−８５（１９７９）；Ｒ．Ｆ．カムシュミ
ト，“The Activity of Partially Purified Leukocyti
c Endogenous Mediator in Endotoxin Resistant Ｃ３
Ｈ／HeJ Mice",J. LAB. CLIN. MED.９５；６１６以下
（１９８０）；およびラルフＦ．カムシュミット、“Le
ukocytic Endogenous Mediator",J. RET. SOC.２３
（4)：２８７−２９７（１９７８）も参照されたい。
されており、この状態はヒトの身体がショック状にある
ときに生じることが示されている。Ｅ．Ｂ．マン等、
“TheLipids of Serum and Liver in Patients with He
patic Diseases", CLIN. INVEST. ２４：６２３以下
（１９４５）を参照されたい；また、ジョンＩ．ガリン
等、“Serum Lipids in Infection", N. ENGL. J. MED.
２８１：１０８１−１０８６（１９６９年１１月１３
日）；Ｄ．ファースチ等、“Effects of Three Bacteri
al Infections on Serum Lipids of Rabbits", J. BAC
TERIOL. ９５：１６１５以下（１９６８）：Ｓ．Ｅ．グ
ロスバーク等、“Hyperlipaemia FollowingViral Infec
tion in the Chicken Embryo: A New Syndrome", NATU
RE （ロンドン）２０８：９５４以下（１９６５）；ロ
バートＬ．ヒルシュ等、“Hyperlipidemia, Fatty Live
r and Bromsulfo-phthalein Retention in Rabbits Inj
ectedIntravenously with Bacterial Endotoxin", J. L
IPID. RES. ５６３−５６８（１９６４）；オサムサカ
グチ等、“Alternations of Lipid Metabolism in Mice
Injected with Endotoxins", MICROBIOL. IMMUNOL. ２
３（2)：７１−８５（１９７９）；Ｒ．Ｆ．カムシュミ
ト，“The Activity of Partially Purified Leukocyti
c Endogenous Mediator in Endotoxin Resistant Ｃ３
Ｈ／HeJ Mice",J. LAB. CLIN. MED.９５；６１６以下
（１９８０）；およびラルフＦ．カムシュミット、“Le
ukocytic Endogenous Mediator",J. RET. SOC.２３
（4)：２８７−２９７（１９７８）も参照されたい。
【０００６】さらに感染への宿主応答において含まれて
いるようである“メディエーター”の同定および存在を
議論している公表物は本出願人等によって公知であり；
特に次の論文が挙げられる（それらの内容は参考として
本明細書に引用する：サイペＪ．Ｄ．等、J. EXP. ME
D., １５０：５９７−６０６（１９７６）；バーネィ
Ｃ．Ｃ．等、リプトンＪ．Ｍ．（編）、FEVER INTERNAT
IONAL SYMPOSIUM,テキサス州ダラス、１９７９年４月１
１−１２日，XII ＋２６３Ｐ．Raven Press : ニューヨ
ーク、イラストレーション０−８９００４−４５１−１
（０８８７７），０（０），PP. １１１−１２２（１９
８０);および、ディナレロＣ．Ａ.,“Human Leukocytic
Pyrogen: Purificaation and Development of a Radio
immunoassay", PROC. NATL. ACAD. SCT. USA, ７４（１
０）：４６２４−４６２７（１９７７年１０月）。
いるようである“メディエーター”の同定および存在を
議論している公表物は本出願人等によって公知であり；
特に次の論文が挙げられる（それらの内容は参考として
本明細書に引用する：サイペＪ．Ｄ．等、J. EXP. ME
D., １５０：５９７−６０６（１９７６）；バーネィ
Ｃ．Ｃ．等、リプトンＪ．Ｍ．（編）、FEVER INTERNAT
IONAL SYMPOSIUM,テキサス州ダラス、１９７９年４月１
１−１２日，XII ＋２６３Ｐ．Raven Press : ニューヨ
ーク、イラストレーション０−８９００４−４５１−１
（０８８７７），０（０），PP. １１１−１２２（１９
８０);および、ディナレロＣ．Ａ.,“Human Leukocytic
Pyrogen: Purificaation and Development of a Radio
immunoassay", PROC. NATL. ACAD. SCT. USA, ７４（１
０）：４６２４−４６２７（１９７７年１０月）。
【０００７】上記の論文およびカムシュミットによるま
たはカムシュミットとの共著の論文の著者の各々より同
定され研究された因子はすべてインターロイキン−１
（１Ｌ−１）として同定されている単一群の因子を含む
ことが決定されている。この決定はREVIEWS OF INFECTI
OUS DISEASES. Vol. 6, No.1（１９８４年１−２月）で
公表されたチャールスＡ．ジナレロによる論文において
集成されており、その内容も参考として本明細書に引用
する。
たはカムシュミットとの共著の論文の著者の各々より同
定され研究された因子はすべてインターロイキン−１
（１Ｌ−１）として同定されている単一群の因子を含む
ことが決定されている。この決定はREVIEWS OF INFECTI
OUS DISEASES. Vol. 6, No.1（１９８４年１−２月）で
公表されたチャールスＡ．ジナレロによる論文において
集成されており、その内容も参考として本明細書に引用
する。
【０００８】ＬＰＬ活性の同様な欠乏はエシェリシアコ
リ（Escherichia coli) リポ多糖類（ＬＰＳ）投与後の
Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウスにおいて本出願人等によって注目
された。これに対し、ＬＰＳに対し遺伝子的に耐性のあ
るＣ３Ｈ／ＨeJマウスにおいてはＬＰＬ活性の喪失は示
唆されていない。このエンドトキシン誘起ＬＰＬ欠乏に
対する低抗性はＬＰＳを２時間前に注入したエンドトキ
シン感受性動物から得られた血清の投与により阻止でき
た。同様に、抵抗性は感受性マウスから得られたエンド
トキシン刺激チオグリコレート誘起腹膜マクロファージ
からの状態調節培地を注入することによって克服でき
た。これらの知見は現在米国特許第4,603,106 号である
米国特許出願第414,098 号において十分に詳細に開示さ
れており、その記載は参考として本明細書に引用する。
リ（Escherichia coli) リポ多糖類（ＬＰＳ）投与後の
Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウスにおいて本出願人等によって注目
された。これに対し、ＬＰＳに対し遺伝子的に耐性のあ
るＣ３Ｈ／ＨeJマウスにおいてはＬＰＬ活性の喪失は示
唆されていない。このエンドトキシン誘起ＬＰＬ欠乏に
対する低抗性はＬＰＳを２時間前に注入したエンドトキ
シン感受性動物から得られた血清の投与により阻止でき
た。同様に、抵抗性は感受性マウスから得られたエンド
トキシン刺激チオグリコレート誘起腹膜マクロファージ
からの状態調節培地を注入することによって克服でき
た。これらの知見は現在米国特許第4,603,106 号である
米国特許出願第414,098 号において十分に詳細に開示さ
れており、その記載は参考として本明細書に引用する。
【０００９】上記の研究は“メディエーター”または
“複数のメディエーター”が存在し動物宿主のエネルギ
ー貯蔵細胞の一般的な同化活性に有意の効果を有するで
あろうとの確信により促進された。そのようなメディエ
ーターは活性低下が例えば宿主が感染侵入物への応答に
おけるようなショックとして知られる状態に到った場合
に観察されるある種の同化酵素の活性に対する抑制効果
を発揮することが推定された。結果として、エンドトキ
シン感受性およびエンドトキシン不感受性マウスでのエ
ンドトキシン刺激腹膜マウス浸出性細胞により産生され
たメディエーターと同化酵素活性の測定のためのそのよ
うな薬剤の研究を介しての展開との相関は最初に出願し
放棄した米国特許出願第299,932 号に開示されており、
その記載は参考として本明細書に引用する。
“複数のメディエーター”が存在し動物宿主のエネルギ
ー貯蔵細胞の一般的な同化活性に有意の効果を有するで
あろうとの確信により促進された。そのようなメディエ
ーターは活性低下が例えば宿主が感染侵入物への応答に
おけるようなショックとして知られる状態に到った場合
に観察されるある種の同化酵素の活性に対する抑制効果
を発揮することが推定された。結果として、エンドトキ
シン感受性およびエンドトキシン不感受性マウスでのエ
ンドトキシン刺激腹膜マウス浸出性細胞により産生され
たメディエーターと同化酵素活性の測定のためのそのよ
うな薬剤の研究を介しての展開との相関は最初に出願し
放棄した米国特許出願第299,932 号に開示されており、
その記載は参考として本明細書に引用する。
【００１０】上記の系のさらなる研究は３Ｔ３−Ｌ1
“前脂肪細胞”モデル系と関連してなされており、上記
“メディエーター”に対する抗体の開発方法およびその
ための物質並びに他の診断法は米国特許出願第351,290
号に開示されており、該米国出願は参考として本明細書
に引用するが現在放棄されている。その後、引き続いて
の米国特許出願第414,098 号（現在、米国特許出願第4,
603,106 号）において、マクロファージ細胞のエンドト
キシン刺激由来のメディエーター物質が同化酵素リボタ
ン白質リパーゼ、アセチルコ酵素Ａカルボキシラーゼお
よび脂肪酸シンセターゼを抑制する活性を示し、さら
に、赤芽球由来細胞の増殖および分化を抑制した。
“前脂肪細胞”モデル系と関連してなされており、上記
“メディエーター”に対する抗体の開発方法およびその
ための物質並びに他の診断法は米国特許出願第351,290
号に開示されており、該米国出願は参考として本明細書
に引用するが現在放棄されている。その後、引き続いて
の米国特許出願第414,098 号（現在、米国特許出願第4,
603,106 号）において、マクロファージ細胞のエンドト
キシン刺激由来のメディエーター物質が同化酵素リボタ
ン白質リパーゼ、アセチルコ酵素Ａカルボキシラーゼお
よび脂肪酸シンセターゼを抑制する活性を示し、さら
に、赤芽球由来細胞の増殖および分化を抑制した。
【００１１】ビュートレー等の論文（1)および（4)、 お
よび米国特許出願第766,852 号に開示されたさらなる研
究は早期に同定されたメディエーター物質が多くの活性
を有するさらなるたん白質成分を含有し、この成分は当
該技術においてインターロイキン−１およびインターロ
イキン−２として同定され公知であるメディエーター物
質および他の因子の両方とは区別される発見に至った
（上記文献および米国特許出願の記載は参考として本明
細書に引用する）。文献（7)〜（9)および米国特許出願
第104,827 号において開示されたさらなる研究（これら
の文献および米国特許出願の記載は参考として本明細書
に引用する）は特異性ある活性を示すメディエーター物
質中のさらなる因子（Ｍ１Ｐ−１）の存在を確立した。
よび米国特許出願第766,852 号に開示されたさらなる研
究は早期に同定されたメディエーター物質が多くの活性
を有するさらなるたん白質成分を含有し、この成分は当
該技術においてインターロイキン−１およびインターロ
イキン−２として同定され公知であるメディエーター物
質および他の因子の両方とは区別される発見に至った
（上記文献および米国特許出願の記載は参考として本明
細書に引用する）。文献（7)〜（9)および米国特許出願
第104,827 号において開示されたさらなる研究（これら
の文献および米国特許出願の記載は参考として本明細書
に引用する）は特異性ある活性を示すメディエーター物
質中のさらなる因子（Ｍ１Ｐ−１）の存在を確立した。
【００１２】引き続いて、本発明の炎症サイトカインＭ
ＩＰ−２が単離精製され、その特異的な活性が米国特許
出願第240,079 において開示されているように明らかに
された。それ以来、本発明のサイトカインの完全な配列
がそのｃＤＮＡのクローニングに続いて決定され、該サ
イトカインの発現が追求されている。本出願は本発明者
等の研究の結果として現在入手できるようになったこの
サイトカインに関するさらなる情報を包含せんとするも
のである。
ＩＰ−２が単離精製され、その特異的な活性が米国特許
出願第240,079 において開示されているように明らかに
された。それ以来、本発明のサイトカインの完全な配列
がそのｃＤＮＡのクローニングに続いて決定され、該サ
イトカインの発現が追求されている。本出願は本発明者
等の研究の結果として現在入手できるようになったこの
サイトカインに関するさらなる情報を包含せんとするも
のである。
【００１３】ＭＩＰ−２は相同性多遺伝子群の１員であ
る。たん白質配列（一般にクローニングしたｃＤＮＡか
ら予想される）において最高の相同性を有するこの群の
構成員にはＭＧＳＡとＫＣがある。ＭＧＳＡ〔リッチモ
ンド等、ＥＭＢＯＪ．７：２０２５（１９８８）〕はヒ
トメラノーマ細胞から分泌した潜在的分裂促進活性を有
するオートクリン増殖因子であり、ヒトgro遺伝子の産
生物である〔アニソウイッツ等、ＰＲＯＣ．ＮＡＴ．Ａ
ＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ８４：７１８８（１９８
７）〕。ＭＧＳＡはＭＩＰ−2 に対してアミノ酸配列に
おいて６1.８％の同一性を有し、ＭＧＳＡのハムスター
相同性の予想たん白質配列はＭＩＰ−２に対して６8.４
％の同一性を有する。マウスＫＣ遺伝子産生物はＰＤＧ
Ｅにより誘起され、ヒトＭＧＳＡ／gro 遺伝子のマウス
相同性であると考えられる（ＭＩＰ−２に対して６6.３
％のアミノ酸同一性）。
る。たん白質配列（一般にクローニングしたｃＤＮＡか
ら予想される）において最高の相同性を有するこの群の
構成員にはＭＧＳＡとＫＣがある。ＭＧＳＡ〔リッチモ
ンド等、ＥＭＢＯＪ．７：２０２５（１９８８）〕はヒ
トメラノーマ細胞から分泌した潜在的分裂促進活性を有
するオートクリン増殖因子であり、ヒトgro遺伝子の産
生物である〔アニソウイッツ等、ＰＲＯＣ．ＮＡＴ．Ａ
ＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ８４：７１８８（１９８
７）〕。ＭＧＳＡはＭＩＰ−2 に対してアミノ酸配列に
おいて６1.８％の同一性を有し、ＭＧＳＡのハムスター
相同性の予想たん白質配列はＭＩＰ−２に対して６8.４
％の同一性を有する。マウスＫＣ遺伝子産生物はＰＤＧ
Ｅにより誘起され、ヒトＭＧＳＡ／gro 遺伝子のマウス
相同性であると考えられる（ＭＩＰ−２に対して６6.３
％のアミノ酸同一性）。
【００１４】リペス等〔ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡ
Ｄ．ＵＳＡ８５：９７０４、（１９８8)〕はＡct−２の
バキュロウイルス（baculovirus)発現、マウスＭＩＰ−
１βの推定ヒト相同性を開示し、そのコードしたたん白
質が分泌されることを示唆し、成熟Ｎ−末端配列を同定
しているけれども、本出願人等は組換えＭＩＰ−２の発
現についての従来技術を知らない。
Ｄ．ＵＳＡ８５：９７０４、（１９８8)〕はＡct−２の
バキュロウイルス（baculovirus)発現、マウスＭＩＰ−
１βの推定ヒト相同性を開示し、そのコードしたたん白
質が分泌されることを示唆し、成熟Ｎ−末端配列を同定
しているけれども、本出願人等は組換えＭＩＰ−２の発
現についての従来技術を知らない。
【００１５】ＭＩＰ−１およびＭＩＰ−２遺伝子群の各
員は発現されているが、ＭＩＰ-2発現に対してのこれら
結果の相違は疑がわしい。各文献は次のように要約され
る。ＪＥ、即ち、ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ-1βに対し
て相同性を有するたん白質をコードするｃＤＮＡはＣＯ
Ｓ−１細胞中で発現されて約１２ＫＤa のポリペプチド
コアをコードすることが確認されている（ロリンズ等、
ＰＲＯＣ，ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ ＳＣＩ．ＵＳＡ８５：
３７３８、１９８８）。ＫＣ、即ち、ＭＩＰ-2に対して
相同性を有するたん白質をコードするｃＤＮＡはＣＯＳ
−１細胞中で発現されて分泌たん白質をコードすること
が示唆されている〔オキュンド等、Ｊ．ＢＩＯＬ．ＣＨ
ＥＭ．２６４：４１３３（１９８９）〕。 “ ムロンバ
ッチ等、J.ＢＩＯＬ．ＣＨＥＭ．２６１：７１９（１９
８６）”により報告された結合組織活性化ペプチド−II
I （ＣＴＡＰ）、および“ルースターおよびラベッチ、
Ｊ．ＥＸＰ．ＭＥＤ．１６６：１０８４（１９８７）”
により報告されたＩＰ−10、即ち、ＭＩＰ−２遺伝子群
の両構成員は、それぞれ、酵母およびＥ．coli中でのα
−因子融合として発現されている。最後に、“リンドレ
イ等、ＰＲＯＣ．ＮＡＴ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ８
５：９１９９（１９８５）”はＥ．coli中でＮＡＦ，Ｍ
ＩＰ−２群の一員を発現している。精製および復原後、
この組み換えたん白質は天然分子と同じ生活性を有する
ことが見い出された。
員は発現されているが、ＭＩＰ-2発現に対してのこれら
結果の相違は疑がわしい。各文献は次のように要約され
る。ＪＥ、即ち、ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ-1βに対し
て相同性を有するたん白質をコードするｃＤＮＡはＣＯ
Ｓ−１細胞中で発現されて約１２ＫＤa のポリペプチド
コアをコードすることが確認されている（ロリンズ等、
ＰＲＯＣ，ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ ＳＣＩ．ＵＳＡ８５：
３７３８、１９８８）。ＫＣ、即ち、ＭＩＰ-2に対して
相同性を有するたん白質をコードするｃＤＮＡはＣＯＳ
−１細胞中で発現されて分泌たん白質をコードすること
が示唆されている〔オキュンド等、Ｊ．ＢＩＯＬ．ＣＨ
ＥＭ．２６４：４１３３（１９８９）〕。 “ ムロンバ
ッチ等、J.ＢＩＯＬ．ＣＨＥＭ．２６１：７１９（１９
８６）”により報告された結合組織活性化ペプチド−II
I （ＣＴＡＰ）、および“ルースターおよびラベッチ、
Ｊ．ＥＸＰ．ＭＥＤ．１６６：１０８４（１９８７）”
により報告されたＩＰ−10、即ち、ＭＩＰ−２遺伝子群
の両構成員は、それぞれ、酵母およびＥ．coli中でのα
−因子融合として発現されている。最後に、“リンドレ
イ等、ＰＲＯＣ．ＮＡＴ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ８
５：９１９９（１９８５）”はＥ．coli中でＮＡＦ，Ｍ
ＩＰ−２群の一員を発現している。精製および復原後、
この組み換えたん白質は天然分子と同じ生活性を有する
ことが見い出された。
【００１６】
【発明が解決しようとする課題及び課題を解決するため
の手段】本発明の第１の局面によれば、メディエーター
物質から単離した炎症サイトカインＭＩＰ−２が開示さ
れ、これは精製したたん白質を含み基本的な生理学的条
件下ではカチオン性である。本発明の炎症サイトカイン
は高塩濃度下においてもヘパリンに結合する能力を示し
て皮下投与したとき多形核細胞浸潤に特徴を有する局所
型炎症を誘起し、化学運動性活性を殆んどまたは全く示
さないけれども極めて活性な走化剤である。しかしなが
ら、本発明の炎症サイトカインは米国特許第4,603,106
号に開示されたメディエーター物質から単離した他の因
子に共通するある種の活性を欠落している。
の手段】本発明の第１の局面によれば、メディエーター
物質から単離した炎症サイトカインＭＩＰ−２が開示さ
れ、これは精製したたん白質を含み基本的な生理学的条
件下ではカチオン性である。本発明の炎症サイトカイン
は高塩濃度下においてもヘパリンに結合する能力を示し
て皮下投与したとき多形核細胞浸潤に特徴を有する局所
型炎症を誘起し、化学運動性活性を殆んどまたは全く示
さないけれども極めて活性な走化剤である。しかしなが
ら、本発明の炎症サイトカインは米国特許第4,603,106
号に開示されたメディエーター物質から単離した他の因
子に共通するある種の活性を欠落している。
【００１７】特に、本発明の炎症サイトカインは同化酵
素リポたん白質リパーゼ（ＬＰＬ）の活性を抑制する能
力を有せず、カケクチン／ＴＮＦ−感受性Ｌ９２９細胞
の細胞毒性を引き起すこと、エンドトキシン耐性Ｃ３Ｈ
／ＨｅＪ胸腺細胞の芽球化を刺激することまたはチオグ
リコレート誘起マウスマクロファージ細胞の産生を誘起
することはできない。本発明の炎症サイトカインにはな
いこれらの特性はすべて公知の因子カケクチン／ＴＮＦ
とインターロイキン−１(IＬ−１）によって発揮され、
従って、本発明の炎症サイトカインはこれら公知因子と
は区別される。本発明の炎症サイトカインが示す最も著
しい肯定的な活性はヘパリンに結合する能力および多形
核（ＰＭＮ）細胞浸潤に特徴を有する局所型炎症を誘起
する能力のようである。従って、本発明の単離体が宿主
侵入への反応カスケード中で示す正確な役割はまだ明確
でないけれども、その宿主侵入に対しての移動に伴うあ
る種の活性および状態の誘起における本発明の単離体の
関係は明白である。従って、本発明の炎症サイトカイン
は侵入性または特発性の種々の刺激を促進し得る本発明
の炎症サイトカインの活性化によるそのような刺激を同
定し恐らくは差別化する診断手段としての用途の可能性
を有する。
素リポたん白質リパーゼ（ＬＰＬ）の活性を抑制する能
力を有せず、カケクチン／ＴＮＦ−感受性Ｌ９２９細胞
の細胞毒性を引き起すこと、エンドトキシン耐性Ｃ３Ｈ
／ＨｅＪ胸腺細胞の芽球化を刺激することまたはチオグ
リコレート誘起マウスマクロファージ細胞の産生を誘起
することはできない。本発明の炎症サイトカインにはな
いこれらの特性はすべて公知の因子カケクチン／ＴＮＦ
とインターロイキン−１(IＬ−１）によって発揮され、
従って、本発明の炎症サイトカインはこれら公知因子と
は区別される。本発明の炎症サイトカインが示す最も著
しい肯定的な活性はヘパリンに結合する能力および多形
核（ＰＭＮ）細胞浸潤に特徴を有する局所型炎症を誘起
する能力のようである。従って、本発明の単離体が宿主
侵入への反応カスケード中で示す正確な役割はまだ明確
でないけれども、その宿主侵入に対しての移動に伴うあ
る種の活性および状態の誘起における本発明の単離体の
関係は明白である。従って、本発明の炎症サイトカイン
は侵入性または特発性の種々の刺激を促進し得る本発明
の炎症サイトカインの活性化によるそのような刺激を同
定し恐らくは差別化する診断手段としての用途の可能性
を有する。
【００１８】本発明の炎症サイトカインは先ず同定され
特性決定されてドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ）上で単一鎖の６キロダルトンたん白質を含有し、
このたん白質はゲル濾過でモノマーまたはダイマーとし
て移動することが見い出された。第２図に示した部分的
Ｎ−末端アミノ酸配列データはＭＩＰ−２がサイトカイ
ン群の１員であり、その原型は血小板因子４（ＰＦ4)で
あることを明らかにした。
特性決定されてドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ）上で単一鎖の６キロダルトンたん白質を含有し、
このたん白質はゲル濾過でモノマーまたはダイマーとし
て移動することが見い出された。第２図に示した部分的
Ｎ−末端アミノ酸配列データはＭＩＰ−２がサイトカイ
ン群の１員であり、その原型は血小板因子４（ＰＦ4)で
あることを明らかにした。
【００１９】上述したように、本発明の炎症サイトカイ
ンは侵入性刺激を伴う物質によるマクロファージ細胞の
刺激により調製できる。とりわけ、種々の源に由来し得
るマクロファージ細胞のサンプルはエンドトキシンまた
はトリパノゾーマのような刺激物質と一緒にインキュベ
ートして米国特許第4,603,106 号に開示されたメディエ
ーター物質を産生させ得る。そのようなインキュベーシ
ョンは２０時間までの時間長で生じ、正確な時間限定は
インキュベーションに用いる特定の細胞によって変化す
るであろう。
ンは侵入性刺激を伴う物質によるマクロファージ細胞の
刺激により調製できる。とりわけ、種々の源に由来し得
るマクロファージ細胞のサンプルはエンドトキシンまた
はトリパノゾーマのような刺激物質と一緒にインキュベ
ートして米国特許第4,603,106 号に開示されたメディエ
ーター物質を産生させ得る。そのようなインキュベーシ
ョンは２０時間までの時間長で生じ、正確な時間限定は
インキュベーションに用いる特定の細胞によって変化す
るであろう。
【００２０】本発明の炎症サイトカインのさらなる性質
にはそのウサギ中で発熱を誘起しない能力またはインビ
トロでのヒト好中球でのスーパーオキサイド形成または
呼吸破壊を誘起しない能力がある。そのようなインキュ
ベーションに続いて、培地を遠心によるような適当に処
理して粗メディエーター物質を含有する上清を回収し得
る。次いで、このメディエーター物質は濾過または沈降
によるようにさらに処理し得る。その後、粗メディエー
ター物質は一連の公知の単離処理に供し得、それによっ
てこの炎症サイトカインを回収できる。本発明は応用可
能な公知の遺伝子複製技術を包含するこの炎症サイトカ
インの別の調製手段も当然意図するものであり、従っ
て、本発明はその範囲内にそのような合成的調製物も包
含するものとする。
にはそのウサギ中で発熱を誘起しない能力またはインビ
トロでのヒト好中球でのスーパーオキサイド形成または
呼吸破壊を誘起しない能力がある。そのようなインキュ
ベーションに続いて、培地を遠心によるような適当に処
理して粗メディエーター物質を含有する上清を回収し得
る。次いで、このメディエーター物質は濾過または沈降
によるようにさらに処理し得る。その後、粗メディエー
ター物質は一連の公知の単離処理に供し得、それによっ
てこの炎症サイトカインを回収できる。本発明は応用可
能な公知の遺伝子複製技術を包含するこの炎症サイトカ
インの別の調製手段も当然意図するものであり、従っ
て、本発明はその範囲内にそのような合成的調製物も包
含するものとする。
【００２１】上述したように、本発明はまたマウス中で
決定したときの第６図で示すＮＨ2末端部分アミノ酸共
通配列を示す上述の活性および特徴を有する精製たん白
質も包含する。ＭＩＰ−２のｃＤＮＡはクローニングさ
れており、第７図で示すように、分子量７９０８および
プレカーサーペプチドの翻訳分子量１0,622.52を有する
長さにおいて７３個のアミノ酸を有する成熟たん白質を
予想する。
決定したときの第６図で示すＮＨ2末端部分アミノ酸共
通配列を示す上述の活性および特徴を有する精製たん白
質も包含する。ＭＩＰ−２のｃＤＮＡはクローニングさ
れており、第７図で示すように、分子量７９０８および
プレカーサーペプチドの翻訳分子量１0,622.52を有する
長さにおいて７３個のアミノ酸を有する成熟たん白質を
予想する。
【００２２】従って、本発明は上述の活性と特徴を示し
かつマウスで決定したとき下記および第７図で示す成熟
アミノ酸配列を示す本発明のサイトカインを含む精製ペ
プチドの同定も包含する。
かつマウスで決定したとき下記および第７図で示す成熟
アミノ酸配列を示す本発明のサイトカインを含む精製ペ
プチドの同定も包含する。
【００２３】 ALA VAL VAL ALA SER GLU LEU ARG CYS GLN CYS LEU LYS THR LEU PRO ARG VAL ASP PHE LYS ASN ILE GLN SER LEU SER VAL THR PRO PRO GLY PRO HIS CYS ALA GLN THR GLU VAL ILE ALA THR LEU LYS GLY GLY GLN LYS VAL CYS LEU ASP PRO GLU ALA PRO LEU VAL GLN LYS ILE ILE GLN LYS ILE LEU ASN LYS GLY LYS ALA ASN
【００２４】前述したように、上記の配列は公知因子の
いずれとも顕著な類似性を含まず、従って、本発明の炎
症サイトカインは公知因子とは区別し得ることを確実に
している。上記ｃＤＮＡアミノ酸配列の単離は後で詳細
するような組換え遺伝子法によるこのサイトカインの再
生産を容易にする。即ち、本発明は本発明の炎症サイト
カインまたはその同族体をコードするＤＮＡ配列を提供
し、この配列は組換えＤＮＡ技術により宿主系中で発現
ベクターを構築するのに使用できる。
いずれとも顕著な類似性を含まず、従って、本発明の炎
症サイトカインは公知因子とは区別し得ることを確実に
している。上記ｃＤＮＡアミノ酸配列の単離は後で詳細
するような組換え遺伝子法によるこのサイトカインの再
生産を容易にする。即ち、本発明は本発明の炎症サイト
カインまたはその同族体をコードするＤＮＡ配列を提供
し、この配列は組換えＤＮＡ技術により宿主系中で発現
ベクターを構築するのに使用できる。
【００２５】本発明はさらに本発明の炎症サイトカイン
が奏する活性を誘起するその能力に基づいて特発性また
は侵入性刺激物を検出する方法を包含する。特に、侵入
性刺激物はヘパリンに結合し得る物質を誘起しかつ好中
球浸潤および走化性により局所型炎症を誘起し得るその
能力によって同定し検出することができた。この方法に
おいて、例えば、ＲＡＷ２６4.７細胞系由来のマクロフ
ァージを、対照として、エンドトキシン、トリパノゾー
マまたはその他の多くの公知刺激剤物質で処理しこれら
刺激剤に暴露し、一方で、対応する細胞サンプルを感染
性刺激物の予想部位からの物質の抽出物である処理しあ
るいはこれら抽出物に暴露することができた。すべての
サンプルは、その後、上述した方法に従ってインキュベ
ートし次いでこれも上述した分離技術手順に供し、それ
によって、得られた対照および未知サンプル由来の単離
物を試験比較して開発した炎症サイトカインが同一かま
たは幾分類似であるかを決定できた。
が奏する活性を誘起するその能力に基づいて特発性また
は侵入性刺激物を検出する方法を包含する。特に、侵入
性刺激物はヘパリンに結合し得る物質を誘起しかつ好中
球浸潤および走化性により局所型炎症を誘起し得るその
能力によって同定し検出することができた。この方法に
おいて、例えば、ＲＡＷ２６4.７細胞系由来のマクロフ
ァージを、対照として、エンドトキシン、トリパノゾー
マまたはその他の多くの公知刺激剤物質で処理しこれら
刺激剤に暴露し、一方で、対応する細胞サンプルを感染
性刺激物の予想部位からの物質の抽出物である処理しあ
るいはこれら抽出物に暴露することができた。すべての
サンプルは、その後、上述した方法に従ってインキュベ
ートし次いでこれも上述した分離技術手順に供し、それ
によって、得られた対照および未知サンプル由来の単離
物を試験比較して開発した炎症サイトカインが同一かま
たは幾分類似であるかを決定できた。
【００２６】同様な形で、上記炎症サイトカインを中和
するのに有効な潜在的薬物をスクリーニングするアッセ
イ系を調製し得る。ある場合においては、試験薬物を刺
激マクロファージサンプルに投与してその炎症サイトカ
インの産生に対しての効果を測定できた。別の方法にお
いては、本発明の炎症サイトカインを該サイトカインが
活性であることが知られている細胞試験系に導入し、さ
らに見込み薬物も同じ細胞培養物に導入し、その後、培
養物を上記見込み薬物単独添加と比較した本発明の炎症
サイトカインの活性において、あるいは添加量の公知炎
症サイトカインの効果において生じ得る変化を試験観察
し得る。
するのに有効な潜在的薬物をスクリーニングするアッセ
イ系を調製し得る。ある場合においては、試験薬物を刺
激マクロファージサンプルに投与してその炎症サイトカ
インの産生に対しての効果を測定できた。別の方法にお
いては、本発明の炎症サイトカインを該サイトカインが
活性であることが知られている細胞試験系に導入し、さ
らに見込み薬物も同じ細胞培養物に導入し、その後、培
養物を上記見込み薬物単独添加と比較した本発明の炎症
サイトカインの活性において、あるいは添加量の公知炎
症サイトカインの効果において生じ得る変化を試験観察
し得る。
【００２７】本発明はまた本発明の炎症サイトカインの
活性および存在を測定することによる動物中の刺激型、
自生的または特発性の病理学的症状を検知する方法に関
する。さらに詳細には、本発明の炎症サイトカインの活
性を後述するアッセイ法により適当に標識した量の本発
明のサイトカインの使用によって直接追試する。また、
本発明のサイトカインは標識し血清のような培地中に導
入できる結合性パートナー即ち抗体を上昇させるのに用
いて培地中の本発明炎症サイトカインの存在を試験しそ
れによって培地を採取した宿主の状態を確めることがで
きる。
活性および存在を測定することによる動物中の刺激型、
自生的または特発性の病理学的症状を検知する方法に関
する。さらに詳細には、本発明の炎症サイトカインの活
性を後述するアッセイ法により適当に標識した量の本発
明のサイトカインの使用によって直接追試する。また、
本発明のサイトカインは標識し血清のような培地中に導
入できる結合性パートナー即ち抗体を上昇させるのに用
いて培地中の本発明炎症サイトカインの存在を試験しそ
れによって培地を採取した宿主の状態を確めることがで
きる。
【００２８】即ち、本発明の炎症サイトカインおよび本
発明のサイトカインに対して上昇させ得た抗体は、例え
ば、放射性物質の添加、ホウ水素化ナトリウムによる還
元または放射性沃素標識によって標識した本発明の炎症
サイトカインに対する抗体を用いるラジオイムノアッセ
イのようなイムノアッセイを包含する種々の診断法にお
いて使用できる。
発明のサイトカインに対して上昇させ得た抗体は、例え
ば、放射性物質の添加、ホウ水素化ナトリウムによる還
元または放射性沃素標識によって標識した本発明の炎症
サイトカインに対する抗体を用いるラジオイムノアッセ
イのようなイムノアッセイを包含する種々の診断法にお
いて使用できる。
【００２９】イムノアッセイにおいては、対照量の本発
明の炎症サイトカイン、その抗体等を調製し、酵素、特
異的結合性パートナーおよび／または放射性元素で標識
し、次いで、侵入を受けたとみなされる動物の血液サン
プルに導入し得る。標識物質またはその結合性パートナ
ーがサンプル内の部位と反応する機会を有したのち、得
られた塊状物を公知の方法によって試験し得るが、その
方法は結合させた標識の性質により変化し得る。
明の炎症サイトカイン、その抗体等を調製し、酵素、特
異的結合性パートナーおよび／または放射性元素で標識
し、次いで、侵入を受けたとみなされる動物の血液サン
プルに導入し得る。標識物質またはその結合性パートナ
ーがサンプル内の部位と反応する機会を有したのち、得
られた塊状物を公知の方法によって試験し得るが、その
方法は結合させた標識の性質により変化し得る。
【００３０】アイソトープ14Ｃ， 131Ｉ， 3Ｈ， 125Ｉ
および35Ｓのような放射性ラベルを用いる場合には、公
知の商業的に入手可能な計数手順を用い得る。標識が酵
素である場合には、検出は当該技術において公知の現在
使用されている熱量法、分光測光法、蛍光測光法または
ガス定量法のいずれかを用いて行い得る。本発明は本発
明の炎症サイトカインの存在度合の定量分析を行うため
の試験キットの形で調製できるアッセイ系も包含する。
この系または試験キットはラベルを本発明の炎症サイト
カインに結合させる上述の放射性および／または酵素的
方法の１つで調製した標識成分；および１種以上の追加
の免疫化学試剤（その少なくとも１つは標識成分、その
結合性パートナー、測定すべき成分の１つまたはその結
合性パートナーのいずれかと結合し得る遊離または固定
化リガンドである）を含み得る。
および35Ｓのような放射性ラベルを用いる場合には、公
知の商業的に入手可能な計数手順を用い得る。標識が酵
素である場合には、検出は当該技術において公知の現在
使用されている熱量法、分光測光法、蛍光測光法または
ガス定量法のいずれかを用いて行い得る。本発明は本発
明の炎症サイトカインの存在度合の定量分析を行うため
の試験キットの形で調製できるアッセイ系も包含する。
この系または試験キットはラベルを本発明の炎症サイト
カインに結合させる上述の放射性および／または酵素的
方法の１つで調製した標識成分；および１種以上の追加
の免疫化学試剤（その少なくとも１つは標識成分、その
結合性パートナー、測定すべき成分の１つまたはその結
合性パートナーのいずれかと結合し得る遊離または固定
化リガンドである）を含み得る。
【００３１】さらなる実施態様においては、本発明の方
法は本発明の炎症サイトカインの活性、本発明の炎症サ
イトカインに対する抗体に基づいたあるいは同じまたは
拮抗活性を有することを測定された試剤または他の薬剤
に基づいたある種の治療方法に関する。第１の治療方法
は炎症および発熱のような動物中での本発明の炎症サイ
トカインの活性の拡大の防止に関し、該サイトカインに
対する抗体、該サイトカインの産生および／または活性
を調節し得る薬剤、または該サイトカインに対してのア
ンタゴニスト（拮抗剤）として作用し得る該サイトカイ
ンに対する抗体でない薬剤を、個々にまたは互いの混合
物の形で、宿主中のこれら状態の展開を防止するのに有
効な量で投与することを含む。
法は本発明の炎症サイトカインの活性、本発明の炎症サ
イトカインに対する抗体に基づいたあるいは同じまたは
拮抗活性を有することを測定された試剤または他の薬剤
に基づいたある種の治療方法に関する。第１の治療方法
は炎症および発熱のような動物中での本発明の炎症サイ
トカインの活性の拡大の防止に関し、該サイトカインに
対する抗体、該サイトカインの産生および／または活性
を調節し得る薬剤、または該サイトカインに対してのア
ンタゴニスト（拮抗剤）として作用し得る該サイトカイ
ンに対する抗体でない薬剤を、個々にまたは互いの混合
物の形で、宿主中のこれら状態の展開を防止するのに有
効な量で投与することを含む。
【００３２】さらに詳細には、本明細書で一般的に述べ
る治療方法は有効量の本発明の炎症サイトカインに対す
る抗体、または例えば本発明のさらなる局面に従って調
製し使用した薬物スクリーニングアッセイによって発展
させた他の同等に有効な薬物を含み得る薬剤組成物の投
与による炎症および発熱の治療方法を包含する。この治
療方法の変形的実施態様は最初に本発明の炎症サイトカ
インの存在および活性を検出し次いで上記の適当な薬剤
組成物を投与することを包含し得る。
る治療方法は有効量の本発明の炎症サイトカインに対す
る抗体、または例えば本発明のさらなる局面に従って調
製し使用した薬物スクリーニングアッセイによって発展
させた他の同等に有効な薬物を含み得る薬剤組成物の投
与による炎症および発熱の治療方法を包含する。この治
療方法の変形的実施態様は最初に本発明の炎症サイトカ
インの存在および活性を検出し次いで上記の適当な薬剤
組成物を投与することを包含し得る。
【００３３】第２の治療方法は本発明のサイトカインの
炎症活性の利点、特に、感染のような侵入性刺激物に対
する応答における好中球の移動および動員を引き起すそ
の能力を採用することである。従って、本発明の炎症サ
イトカインは、例えば、組織損傷が生じた場所で展開さ
せ得る感染部位への投与に適する調製物の形で調製でき
る。そのような場合、本発明のサイトカインは滅菌溶液
中で調製し損傷または創傷に灌注液の１部としてあるい
は薬剤組成物のような直接投与により伝達でき、後者の
投与順路としては局所または非経口経路が意図される。
当然のこととして、本発明の炎症サイトカインは公知の
方法により同等に有効な薬剤または薬物を調製するのに
も使用でき、これらの薬剤または薬物は本発明の炎症サ
イトカイン自体と同じ方法および同じ目的で投与するの
に適する薬剤組成物として調合し得る。
炎症活性の利点、特に、感染のような侵入性刺激物に対
する応答における好中球の移動および動員を引き起すそ
の能力を採用することである。従って、本発明の炎症サ
イトカインは、例えば、組織損傷が生じた場所で展開さ
せ得る感染部位への投与に適する調製物の形で調製でき
る。そのような場合、本発明のサイトカインは滅菌溶液
中で調製し損傷または創傷に灌注液の１部としてあるい
は薬剤組成物のような直接投与により伝達でき、後者の
投与順路としては局所または非経口経路が意図される。
当然のこととして、本発明の炎症サイトカインは公知の
方法により同等に有効な薬剤または薬物を調製するのに
も使用でき、これらの薬剤または薬物は本発明の炎症サ
イトカイン自体と同じ方法および同じ目的で投与するの
に適する薬剤組成物として調合し得る。
【００３４】従って、本発明の主たる目的は哺乳動物に
おける侵入刺激物に対する宿主応答に伴うある種の特徴
および活性を示す純粋形の炎症サイトカインを提供する
ことである。本発明のもう１つの目的は組換え手段を包
含する上記炎症サイトカインの調製方法を提供すること
である。
おける侵入刺激物に対する宿主応答に伴うある種の特徴
および活性を示す純粋形の炎症サイトカインを提供する
ことである。本発明のもう１つの目的は組換え手段を包
含する上記炎症サイトカインの調製方法を提供すること
である。
【００３５】本発明のもう１つの目的は侵入性、自然発
生性または特発性の病理学的状態の存在が凝がわれる哺
乳動物中の上記炎症サイトカインの存在を検出する方法
を提供することである。本発明のもう１つの目的は哺乳
動物中の上記炎症サイトカインの活性を擬態化するがそ
の悪影響を転化するのに潜在的に有効な薬物、薬剤等の
物質をスクリーニングする方法およびそれに伴うアッセ
イ系を提供することである。
生性または特発性の病理学的状態の存在が凝がわれる哺
乳動物中の上記炎症サイトカインの存在を検出する方法
を提供することである。本発明のもう１つの目的は哺乳
動物中の上記炎症サイトカインの活性を擬態化するがそ
の悪影響を転化するのに潜在的に有効な薬物、薬剤等の
物質をスクリーニングする方法およびそれに伴うアッセ
イ系を提供することである。
【００３６】本発明のさらに別の目的は上記炎症サイト
カインの量または活性を調節してそのような存在または
活性の悪しき結果を変化させるような哺乳動物の治療方
法を提供することである。本発明のさらに別の目的は上
記炎症サイトカインの量または活性を増強させて侵入
性、自然発生性または特発性の病理学的状態の悪しき結
果を処置または回避するような哺乳動物の治療方法を提
供することである。
カインの量または活性を調節してそのような存在または
活性の悪しき結果を変化させるような哺乳動物の治療方
法を提供することである。本発明のさらに別の目的は上
記炎症サイトカインの量または活性を増強させて侵入
性、自然発生性または特発性の病理学的状態の悪しき結
果を処置または回避するような哺乳動物の治療方法を提
供することである。
【００３７】本発明のさらに別の目的は上記炎症サイト
カインまたはその結合性パートナーを含むまたはこれら
に基づいた、あるいはその産生を調節するまたは上記炎
症サイトカインの活性を擬態するまたはこの活性と拮抗
する薬剤または薬物に基づいた治療方法で使用するため
の薬剤組成物を提供することである。他の目的および利
点は以下の例示的な図面に関連して進める具体的な説明
によって当業者にとって明らかとなろう。
カインまたはその結合性パートナーを含むまたはこれら
に基づいた、あるいはその産生を調節するまたは上記炎
症サイトカインの活性を擬態するまたはこの活性と拮抗
する薬剤または薬物に基づいた治療方法で使用するため
の薬剤組成物を提供することである。他の目的および利
点は以下の例示的な図面に関連して進める具体的な説明
によって当業者にとって明らかとなろう。
【００３８】
【発明の実施の形態】本発明によれば、当該技術の熟練
の範囲における通常の分子生物学、微生物学および組換
えＤＮＡ技術を用い得る。そのような技術は文献におい
て十分に開示されている。例えば、マニアティス、フリ
ッシュおよびサムブロックの“Molecular Cloning : A
Laboratory Manual"（１９８２）；“DNA Cloning: A P
ractical Approach", Vol.ＩおよびII（Ｄ．Ｎ．グロー
バー編、１９８５）；“Oligonucleotide Synthesis"
（Ｍ．Ｊ．ガイト編、１９８４）；“Nucleic Acid Hyb
ridization" （Ｂ．Ｄ．ハームスおよびＳ．Ｊ．ヒギン
ズ編、１９８５）；“Transcription And Translation"
（Ｂ．Ｄ．ハームスおよびＳ．Ｊ．ヒギンズ編、１９８
４）；“Animal Cell Culture"（Ｒ．Ｉ．フレッシュニ
ー編、１９８６）；“Immobilized Cells And Enzymes"
（ＩＲＬプレス社、１９８６）；Ｂ．パーバル、“A Pr
actical Guide To Molecular Cloning"(１９８４）を参
照されたい。
の範囲における通常の分子生物学、微生物学および組換
えＤＮＡ技術を用い得る。そのような技術は文献におい
て十分に開示されている。例えば、マニアティス、フリ
ッシュおよびサムブロックの“Molecular Cloning : A
Laboratory Manual"（１９８２）；“DNA Cloning: A P
ractical Approach", Vol.ＩおよびII（Ｄ．Ｎ．グロー
バー編、１９８５）；“Oligonucleotide Synthesis"
（Ｍ．Ｊ．ガイト編、１９８４）；“Nucleic Acid Hyb
ridization" （Ｂ．Ｄ．ハームスおよびＳ．Ｊ．ヒギン
ズ編、１９８５）；“Transcription And Translation"
（Ｂ．Ｄ．ハームスおよびＳ．Ｊ．ヒギンズ編、１９８
４）；“Animal Cell Culture"（Ｒ．Ｉ．フレッシュニ
ー編、１９８６）；“Immobilized Cells And Enzymes"
（ＩＲＬプレス社、１９８６）；Ｂ．パーバル、“A Pr
actical Guide To Molecular Cloning"(１９８４）を参
照されたい。
【００３９】従って、本明細書で使用する場合、次の各
用語は以下に示す意義を有するものとする。本明細書で
使用するときの“刺激”なる用語は感染のような侵入性
事象及び損傷によって生ずる状態、並びに、例えば、細
胞または代謝不整または他の原因に由来し得る特発性ま
たは自然発生性の状態に適用するものとする。
用語は以下に示す意義を有するものとする。本明細書で
使用するときの“刺激”なる用語は感染のような侵入性
事象及び損傷によって生ずる状態、並びに、例えば、細
胞または代謝不整または他の原因に由来し得る特発性ま
たは自然発生性の状態に適用するものとする。
【００４０】本出願および請求の範囲全体に亘って使用
するときの“炎症サイトカイン”、“マクロファージ炎
症たん白質２”および“ＭＩＰ−２”は第２図および第
６図で示す部分Ｎ末端配列データ、第７図で示す成熟ペ
プチド配列、および本明細書および請求の範囲で示す活
性プロフィルを有するたん白質物質を称する。従って、
本明細書で示したのと同様の配列を有し実質的に等価の
または変形した活性を示すたん白質も同様に意図するも
のとする。これらの変形は、例えば、部位特異的変異誘
発から得られる変形のような意図的なものであり得るか
あるいはＭＩＰ−２産生体である宿主中の突然変異を介
して得られたもののような偶発的なものであり得る。ま
た、“炎症サイトカイン”、“マクロファージ炎症たん
白質２”および“ＭＩＰ−２”なる用語は、その範囲
に、本明細書で特定的に開示したたん白質並びにすべて
の実質的に相同性の同族体および対立変形体をも包含す
るものとする。
するときの“炎症サイトカイン”、“マクロファージ炎
症たん白質２”および“ＭＩＰ−２”は第２図および第
６図で示す部分Ｎ末端配列データ、第７図で示す成熟ペ
プチド配列、および本明細書および請求の範囲で示す活
性プロフィルを有するたん白質物質を称する。従って、
本明細書で示したのと同様の配列を有し実質的に等価の
または変形した活性を示すたん白質も同様に意図するも
のとする。これらの変形は、例えば、部位特異的変異誘
発から得られる変形のような意図的なものであり得るか
あるいはＭＩＰ−２産生体である宿主中の突然変異を介
して得られたもののような偶発的なものであり得る。ま
た、“炎症サイトカイン”、“マクロファージ炎症たん
白質２”および“ＭＩＰ−２”なる用語は、その範囲
に、本明細書で特定的に開示したたん白質並びにすべて
の実質的に相同性の同族体および対立変形体をも包含す
るものとする。
【００４１】“レプリコン”はＤＮＡ複製の自律性単位
としてインビボにおいて作用する、即ち、それ自身の制
御下で複製可能である任意の遺伝子要素（例えば、プラ
スミド、染色体、ウイルス）である。“ベクター”は他
のＤＮＡセグメントを結合させて結合セグメントの複製
を行うようにして得るプラスミド、ファージまたはコス
ミドのようなレプリコンである。
としてインビボにおいて作用する、即ち、それ自身の制
御下で複製可能である任意の遺伝子要素（例えば、プラ
スミド、染色体、ウイルス）である。“ベクター”は他
のＤＮＡセグメントを結合させて結合セグメントの複製
を行うようにして得るプラスミド、ファージまたはコス
ミドのようなレプリコンである。
【００４２】“ＤＮＡ分子”はデオキシリボヌクレオチ
ド（アデニン、グアニン、チミンまたはチトシン）のそ
の単一鎖形または二重鎖ヘリックスのいずれかの重合体
形を称する。この用語は分子の一次および二次構造にの
み関しており分子を何ら特定の三次形状に限定するもの
ではない。即ち、この用語は、なかんづく、線状ＤＮＡ
配列分子（例えば、制限フラグメント）、ウイルス、プ
ラスミドおよび染色体中で見い出される二重鎖ＤＮＡを
包含する。特定の二重鎖ＤＮＡ分子の構造に言及する場
合、配列はＤＮＡの転写してないストランド（即ち、ｍ
ＲＮＡに相同性の配列を有するストランド）に沿った
５′から３′への方向の配列のみを与える通常の仕様に
よって記載できる。
ド（アデニン、グアニン、チミンまたはチトシン）のそ
の単一鎖形または二重鎖ヘリックスのいずれかの重合体
形を称する。この用語は分子の一次および二次構造にの
み関しており分子を何ら特定の三次形状に限定するもの
ではない。即ち、この用語は、なかんづく、線状ＤＮＡ
配列分子（例えば、制限フラグメント）、ウイルス、プ
ラスミドおよび染色体中で見い出される二重鎖ＤＮＡを
包含する。特定の二重鎖ＤＮＡ分子の構造に言及する場
合、配列はＤＮＡの転写してないストランド（即ち、ｍ
ＲＮＡに相同性の配列を有するストランド）に沿った
５′から３′への方向の配列のみを与える通常の仕様に
よって記載できる。
【００４３】ＤＮＡ“コード用配列”はインビボにおい
て適当な調節配列の制御下に置いたときポリペプチドに
転写し翻訳する二重鎖ＤＮＡ配列である。上記コード用
配列の境界は５′（アミノ）末端での開始コドンと３′
（カルボキシル）末端での翻訳停止コドンにより決定さ
れる。コード用配列には、原核配列、真核ｍＲＮＡから
のｃＤＮＡ、真核（例えば、動物）ＤＮＡからのゲノム
ＤＮＡ配列、および均一合成ＤＮＡ配列があるがこれに
限定するものではない。ポリアデニル化信号および転写
末端配列はコード用配列に対し３′側にある。
て適当な調節配列の制御下に置いたときポリペプチドに
転写し翻訳する二重鎖ＤＮＡ配列である。上記コード用
配列の境界は５′（アミノ）末端での開始コドンと３′
（カルボキシル）末端での翻訳停止コドンにより決定さ
れる。コード用配列には、原核配列、真核ｍＲＮＡから
のｃＤＮＡ、真核（例えば、動物）ＤＮＡからのゲノム
ＤＮＡ配列、および均一合成ＤＮＡ配列があるがこれに
限定するものではない。ポリアデニル化信号および転写
末端配列はコード用配列に対し３′側にある。
【００４４】転写および翻訳制御配列は宿主細胞中でコ
ード用配列の発現を与えるプロモーター、エンハンサ
ー、ポリアデニル化信号、ターミネーター等のＤＮＡ調
節配列である。
ード用配列の発現を与えるプロモーター、エンハンサ
ー、ポリアデニル化信号、ターミネーター等のＤＮＡ調
節配列である。
【００４５】“プロモーター配列”は細胞中のＲＮＡポ
リメラーゼに結合し下流(3′方向）のコード用配列の転
写を開始し得るＤＮＡ調節領域である。本発明を明確に
する目的においては、プロモーター配列はその３′末端
で転写開始部位によって境界付されて背景以上の検知し
得るレベルで転写を開始するに必要な最少数のベースま
たは要素を含有するように上流(5′方向）に延びてい
る。このプロモーター配列内には、転写開始部位（ヌク
レアーゼＳＩでマッピングすることにより好都合に形成
された）並びにＲＮＡポリメラーゼの結合に応答性のた
ん白質結合性ドメイン（共通配列）が見い出されるであ
ろう。真核プロモーターは、しばしば（常にではない
が）、“ＴＡＴＡ”ボックスと“ＣＴＡ”ボックスを含
有するであろう。原核プロモーターは−１０および−３
５共通配列以外にシャイン−ダルガルノ配列を含有す
る。
リメラーゼに結合し下流(3′方向）のコード用配列の転
写を開始し得るＤＮＡ調節領域である。本発明を明確に
する目的においては、プロモーター配列はその３′末端
で転写開始部位によって境界付されて背景以上の検知し
得るレベルで転写を開始するに必要な最少数のベースま
たは要素を含有するように上流(5′方向）に延びてい
る。このプロモーター配列内には、転写開始部位（ヌク
レアーゼＳＩでマッピングすることにより好都合に形成
された）並びにＲＮＡポリメラーゼの結合に応答性のた
ん白質結合性ドメイン（共通配列）が見い出されるであ
ろう。真核プロモーターは、しばしば（常にではない
が）、“ＴＡＴＡ”ボックスと“ＣＴＡ”ボックスを含
有するであろう。原核プロモーターは−１０および−３
５共通配列以外にシャイン−ダルガルノ配列を含有す
る。
【００４６】コード配列はＲＮＡポリメラーゼがコード
用配列をｍＲＮＡに転写し、次いでこのｍＲＮＡをコー
ド用配列によりコードされたたん白質に翻訳される時に
細胞中で転写および翻訳制御配列の“制御下”にある。
用配列をｍＲＮＡに転写し、次いでこのｍＲＮＡをコー
ド用配列によりコードされたたん白質に翻訳される時に
細胞中で転写および翻訳制御配列の“制御下”にある。
【００４７】“信号配列”はコード用配列の前に含まれ
得る。この配列はポリペプチドに対してＮ末端のシグナ
ルペプチドをコードし、このシグナルペプチドは宿主細
胞に連結してポリペプチドを細胞表面に向けるかポリペ
プチドを培地中に分泌し、このシグナルペプチドはたん
白質が宿主細胞を去る前に宿主細胞によって切り取られ
る。信号配列は原核動物および真核動物に対して天然の
種々のたん白質に付随して見い出される。例えば、α−
因子、即ち、天然の酵母たん白質は酵母から分泌され、
その信号配列は培地中に分泌される非相同性たん白質に
結合させ得る（米国特許第4,546,082 号；ＥＰＯ第0 11
6 201 号、１９８３年１月１２日付公開；米国特許出願
第522,909 号、１９８３年８月１２日付出願を参照され
たい）。さらに、α−因子先導体およびその同族体はサ
ッカロミセス（Saccharomyces)およびクルイベロミセス
（Kluyveromyces)のような種々の酵母から非相同性のた
ん白質を分泌することが見い出されている（１９８８年
１２月２３日付で出願されたＥＰＯ８８３１２３０6.９
号；１９８７年１２月３０日付で出願された米国特許出
願第139,682 号；および１９８９年２月１日付で公開さ
れたＥＰＯ公開第０３０１６６９号）。
得る。この配列はポリペプチドに対してＮ末端のシグナ
ルペプチドをコードし、このシグナルペプチドは宿主細
胞に連結してポリペプチドを細胞表面に向けるかポリペ
プチドを培地中に分泌し、このシグナルペプチドはたん
白質が宿主細胞を去る前に宿主細胞によって切り取られ
る。信号配列は原核動物および真核動物に対して天然の
種々のたん白質に付随して見い出される。例えば、α−
因子、即ち、天然の酵母たん白質は酵母から分泌され、
その信号配列は培地中に分泌される非相同性たん白質に
結合させ得る（米国特許第4,546,082 号；ＥＰＯ第0 11
6 201 号、１９８３年１月１２日付公開；米国特許出願
第522,909 号、１９８３年８月１２日付出願を参照され
たい）。さらに、α−因子先導体およびその同族体はサ
ッカロミセス（Saccharomyces)およびクルイベロミセス
（Kluyveromyces)のような種々の酵母から非相同性のた
ん白質を分泌することが見い出されている（１９８８年
１２月２３日付で出願されたＥＰＯ８８３１２３０6.９
号；１９８７年１２月３０日付で出願された米国特許出
願第139,682 号；および１９８９年２月１日付で公開さ
れたＥＰＯ公開第０３０１６６９号）。
【００４８】細胞は外因性または非相同性ＤＮＡにより
そのようなＤＮＡが細胞の内部に導入されたときに“形
質転換”される。形質転換用ＤＮＡは細胞のゲノムを構
成する染色体ＤＮＡ中に組み込まれ（共有結合され）て
も良くされなくても良い。原核生物、例えば、酵母およ
び哺乳動物細胞においては、形質転換用ＤＮＡはプラス
ミドのようなエピソーム要素上に維持し得る。真核生物
においては、安定な形質転換細胞は形質転換用ＤＮＡが
染色体に組込まれて娘細胞により染色体複製を介して遺
伝されるような細胞である。この安定性は真核細胞が形
質転換用ＤＮＡを含有する娘細胞の集団を含む細胞系ま
たはクローンを確立する能力によって示される。“クロ
ーン”は単一細胞または有系分裂による共通祖先に由来
する１群の細胞である。“細胞系”は多くの世代におい
てインビトロで安定増殖が可能である一次細胞の１つの
クローンである。
そのようなＤＮＡが細胞の内部に導入されたときに“形
質転換”される。形質転換用ＤＮＡは細胞のゲノムを構
成する染色体ＤＮＡ中に組み込まれ（共有結合され）て
も良くされなくても良い。原核生物、例えば、酵母およ
び哺乳動物細胞においては、形質転換用ＤＮＡはプラス
ミドのようなエピソーム要素上に維持し得る。真核生物
においては、安定な形質転換細胞は形質転換用ＤＮＡが
染色体に組込まれて娘細胞により染色体複製を介して遺
伝されるような細胞である。この安定性は真核細胞が形
質転換用ＤＮＡを含有する娘細胞の集団を含む細胞系ま
たはクローンを確立する能力によって示される。“クロ
ーン”は単一細胞または有系分裂による共通祖先に由来
する１群の細胞である。“細胞系”は多くの世代におい
てインビトロで安定増殖が可能である一次細胞の１つの
クローンである。
【００４９】２つのＤＮＡ配列は少なくとも約７５％
（好ましくは少なくとも約８０％最も好ましくは少なく
とも約９０または９５％）のヌクレオチドが限定した長
さのＤＮＡ配列と一致したときに“実質的に相同性”で
ある。実質的に相同性である配列は各配列を配列データ
バンクで入手できる標準のソフトウェアを用いて比較す
ることによってあるいは、例えば、その特定の系用に形
成された緊縮条件下でのサザンハイブリッド化実験にお
いて同定し得る。適当なハイブリッド化条件を限定する
のは当該技術の熟練の範囲内である。例えば、マニアチ
ス等（前出）、ＤＮＡ Cloning, Vol. IおよびII（前
出）： Nucleic Acid Hybridization(前出）を参照され
たい。
（好ましくは少なくとも約８０％最も好ましくは少なく
とも約９０または９５％）のヌクレオチドが限定した長
さのＤＮＡ配列と一致したときに“実質的に相同性”で
ある。実質的に相同性である配列は各配列を配列データ
バンクで入手できる標準のソフトウェアを用いて比較す
ることによってあるいは、例えば、その特定の系用に形
成された緊縮条件下でのサザンハイブリッド化実験にお
いて同定し得る。適当なハイブリッド化条件を限定する
のは当該技術の熟練の範囲内である。例えば、マニアチ
ス等（前出）、ＤＮＡ Cloning, Vol. IおよびII（前
出）： Nucleic Acid Hybridization(前出）を参照され
たい。
【００５０】ＤＮＡ構築物の“非相同性”領域は天然の
より大きい分子においては見い出されていないより大き
いＤＮＡ分子内のＤＮＡの同定可能なセグメントであ
る。即ち、非相同性領域が哺乳動物遺伝子をコードする
とき、その遺伝子はゲノムまたは原生物中の哺乳動物ゲ
ノムＤＮＡを隣接しないＤＮＡによって隣接されるであ
ろう。非相同性コード用配列のもう１つの例はコード用
配列自体が天然において見い出されていない構築物（例
えば、ゲノムコード用配列がイントロン、または天然遺
伝子と異なるコドンを有する合成配列を含有するｃＤＮ
Ａ）である。対立変異体または天然産の突然変異事物は
本明細書で定義したようなＤＮＡの非相同性領域を生じ
ない。
より大きい分子においては見い出されていないより大き
いＤＮＡ分子内のＤＮＡの同定可能なセグメントであ
る。即ち、非相同性領域が哺乳動物遺伝子をコードする
とき、その遺伝子はゲノムまたは原生物中の哺乳動物ゲ
ノムＤＮＡを隣接しないＤＮＡによって隣接されるであ
ろう。非相同性コード用配列のもう１つの例はコード用
配列自体が天然において見い出されていない構築物（例
えば、ゲノムコード用配列がイントロン、または天然遺
伝子と異なるコドンを有する合成配列を含有するｃＤＮ
Ａ）である。対立変異体または天然産の突然変異事物は
本明細書で定義したようなＤＮＡの非相同性領域を生じ
ない。
【００５１】“Ａ”（“Ａ”は単一たん白質、ＤＮＡ分
子、ベクター等である）を含む組成物は、組成物中の少
なくとも約７５％のたん白質、ＤＮＡ、ベクター（Ａと
Ｂが属する種のカテゴリーによるが）“Ａ”であるとき
には、“Ｂ”（“Ｂ”は１種以上の不純たん白質、ＤＮ
Ａ分子、ベクター等を含む）を実質的に含まない。好ま
しくは、“Ａ”は組成物中で少なくとも約９０重量％の
Ａ＋Ｂ種を含み、最も好ましくは少なくとも約９９重量
％を含む。また、実質的に不純物を含まない組成物は興
味ある種の活性または特徴を有する単一分子量種のみを
含有する。
子、ベクター等である）を含む組成物は、組成物中の少
なくとも約７５％のたん白質、ＤＮＡ、ベクター（Ａと
Ｂが属する種のカテゴリーによるが）“Ａ”であるとき
には、“Ｂ”（“Ｂ”は１種以上の不純たん白質、ＤＮ
Ａ分子、ベクター等を含む）を実質的に含まない。好ま
しくは、“Ａ”は組成物中で少なくとも約９０重量％の
Ａ＋Ｂ種を含み、最も好ましくは少なくとも約９９重量
％を含む。また、実質的に不純物を含まない組成物は興
味ある種の活性または特徴を有する単一分子量種のみを
含有する。
【００５２】“抗体”は特異的なエピトーブを結合する
抗体またはそのフラグメントを包含する任意の免疫グロ
ブリンである。この用語は、なかんづく、ポリクローナ
ル、モノクローナルおよびキメラ抗体を含有し、最後の
キメラ抗体は米国特許第4,816,397 号および第4,816,56
7 号にさらに詳細に記載されている。
抗体またはそのフラグメントを包含する任意の免疫グロ
ブリンである。この用語は、なかんづく、ポリクローナ
ル、モノクローナルおよびキメラ抗体を含有し、最後の
キメラ抗体は米国特許第4,816,397 号および第4,816,56
7 号にさらに詳細に記載されている。
【００５３】本発明により調製された無イントロンＤＮ
Ａは、天然産ヒト遺伝子がイントロンを含有するものと
信じられていることから、新規である。従って、“無イ
ントロン”なる用語はヒトまたはウシ細胞の染色体中で
天然に生ずるＤＮＡ配列を除外する。本発明はまた上記
のＤＮＡ配列に由来し得る無イントロンｃＤＮＡを包含
する。
Ａは、天然産ヒト遺伝子がイントロンを含有するものと
信じられていることから、新規である。従って、“無イ
ントロン”なる用語はヒトまたはウシ細胞の染色体中で
天然に生ずるＤＮＡ配列を除外する。本発明はまた上記
のＤＮＡ配列に由来し得る無イントロンｃＤＮＡを包含
する。
【００５４】主要な局面において、本発明は、本明細書
において刺激剤物質と称される物質（これは微生物、ウ
イルス、ある種の腫瘍、原虫、およびエンドトキシンの
ような他の毒物のような侵入性刺激物を特徴的に伴う）
または特発性状態によって刺激されたマクロファージま
たはマクロファージ細胞系において存在することが見い
出された新発見の特定の因子（以下、炎症サイトカイ
ン、マクロファージ炎症たん白質２またはＭＩＰ−２と
称す）の単離および同定に関する。米国特許第4,603,10
6 号に開示されているメディエーター物質によるよう
に、従来のメディエーター物質の一成分であると決定さ
れている本発明の炎症サイトカインは哺乳動物の組織内
で生ずる炎症のようなある種の状態（これは刺激したま
たは自然発生的病理状態の哺乳動物の反応を反映してい
る）を引き起すことができるようである。
において刺激剤物質と称される物質（これは微生物、ウ
イルス、ある種の腫瘍、原虫、およびエンドトキシンの
ような他の毒物のような侵入性刺激物を特徴的に伴う）
または特発性状態によって刺激されたマクロファージま
たはマクロファージ細胞系において存在することが見い
出された新発見の特定の因子（以下、炎症サイトカイ
ン、マクロファージ炎症たん白質２またはＭＩＰ−２と
称す）の単離および同定に関する。米国特許第4,603,10
6 号に開示されているメディエーター物質によるよう
に、従来のメディエーター物質の一成分であると決定さ
れている本発明の炎症サイトカインは哺乳動物の組織内
で生ずる炎症のようなある種の状態（これは刺激したま
たは自然発生的病理状態の哺乳動物の反応を反映してい
る）を引き起すことができるようである。
【００５５】特に、本発明の炎症サイトカインは皮下投
与したとき多形核細胞浸潤に特徴を有する局所型炎症を
誘起することができるようである。また、該サイトカイ
ンはヒト多形核白血球用の潜在走化剤であるが、インビ
トロにおいてヒト好中球中での化学運動性または酸化性
破壊を殆んどまたは全く誘起しない；その状態は哺乳動
物宿主が侵入性刺激物に対しての動員中に含まれるサイ
トカインの影響を反映するものである。本発明の炎症サ
イトカインが発揮する完全かつ正確な役割は明らかでな
いけれども、以前に同定された他の因子およびまだ明ら
かにされていない因子と組合せた本発明のサイトカイン
は宿主の免疫系と他の身体組織および器官との間の連絡
系の１部として機能しているものと理論付される。
与したとき多形核細胞浸潤に特徴を有する局所型炎症を
誘起することができるようである。また、該サイトカイ
ンはヒト多形核白血球用の潜在走化剤であるが、インビ
トロにおいてヒト好中球中での化学運動性または酸化性
破壊を殆んどまたは全く誘起しない；その状態は哺乳動
物宿主が侵入性刺激物に対しての動員中に含まれるサイ
トカインの影響を反映するものである。本発明の炎症サ
イトカインが発揮する完全かつ正確な役割は明らかでな
いけれども、以前に同定された他の因子およびまだ明ら
かにされていない因子と組合せた本発明のサイトカイン
は宿主の免疫系と他の身体組織および器官との間の連絡
系の１部として機能しているものと理論付される。
【００５６】本発明の炎症サイトカインのヘパリンに対
して結合する能力は該サイトカインがＦＧＦまたはＰＤ
ＧＦのようなある種のヘパリン結合性生長因子に相応す
るという考えを与え得る。しかしながら、本発明の炎症
サイトカインが平滑筋細胞に対して分裂促進性でないと
いうデータはこれら公知の生長因子と異なることを示唆
している。従って、現時点で確かなことは本発明のサイ
トカインが侵入に対するような宿主応答の１部として知
られている炎症応答の発展に係っているということであ
る。
して結合する能力は該サイトカインがＦＧＦまたはＰＤ
ＧＦのようなある種のヘパリン結合性生長因子に相応す
るという考えを与え得る。しかしながら、本発明の炎症
サイトカインが平滑筋細胞に対して分裂促進性でないと
いうデータはこれら公知の生長因子と異なることを示唆
している。従って、現時点で確かなことは本発明のサイ
トカインが侵入に対するような宿主応答の１部として知
られている炎症応答の発展に係っているということであ
る。
【００５７】本発明の炎症サイトカインNaDodS4 −ＰＡ
ＧＥ上での約6,000 ダルトンの分子量と約10,000ダルト
ンの見掛け分子量を有するゲル濾過カラムからの画分と
を有するたん白質を含むことが確認されている。ＭＩＰ
−２のｃＤＮＡはクローニングされていて予想分子量7,
９０８を有する長さにおいて７３個のアミノ酸を有する
成熟たん白質を予想している。ＭＩＰ−１およびカケク
チン／ＴＮＦとは対照的に、ＭＩＰ−２はカチオン性で
あり、pH8.0 で平衡させたアニオン交換カラムには結合
しない。さらに、該成熟たん白質のＮ末端部分アミノ酸
配列および完全配列の決定は本発明の炎症サイトカイン
の特異的たん白質構造が他の公知の因子のたん白質構造
と異なることを確実にしている。従って、本発明の炎症
サイトカインと従来技術の公知因子との間の構造的およ
び機能的差異は両方とも実施例１で示したデータによっ
て確認されているように存在している。
ＧＥ上での約6,000 ダルトンの分子量と約10,000ダルト
ンの見掛け分子量を有するゲル濾過カラムからの画分と
を有するたん白質を含むことが確認されている。ＭＩＰ
−２のｃＤＮＡはクローニングされていて予想分子量7,
９０８を有する長さにおいて７３個のアミノ酸を有する
成熟たん白質を予想している。ＭＩＰ−１およびカケク
チン／ＴＮＦとは対照的に、ＭＩＰ−２はカチオン性で
あり、pH8.0 で平衡させたアニオン交換カラムには結合
しない。さらに、該成熟たん白質のＮ末端部分アミノ酸
配列および完全配列の決定は本発明の炎症サイトカイン
の特異的たん白質構造が他の公知の因子のたん白質構造
と異なることを確実にしている。従って、本発明の炎症
サイトカインと従来技術の公知因子との間の構造的およ
び機能的差異は両方とも実施例１で示したデータによっ
て確認されているように存在している。
【００５８】さらに詳細には、本発明の炎症サイトカイ
ンは、高塩濃度、例えば、約0.７Ｍでヘパリンに結合し
得る点で、上記で既略した特徴と一緒にある種の他の特
徴を有しコロニー刺激性因子活性を示している。本発明
のサイトカインは、また、同化酵素リボたん白質リパー
ゼ（ＬＰＬ）を抑制し得ず、カケクチン／ＴＮＦ感受性
Ｌ９２９細胞で刺激し得ず、エンドトキシン耐性Ｃ３Ｈ
／ＨｅＪ胸腺細胞の芽球形成を刺激し得ずまたは一次チ
オグリコレート誘起マウスマクロファージ細胞によるカ
ケクチン／ＴＮＦの産生を誘起し得ないようなその不能
力のような本発明のサイトカインが有しない活性におい
て区別され得る。これらの活性のすべては一般的な特徴
と活性が侵入に対する宿主応答における関与物として同
定されている他の公知のマクロファージ由来メディエー
ター因子によって発揮されるものである。さらに、本発
明の炎症サイトカインはＭＩＰ−１のような他の因子と
はウサギ中の発熱を誘起し得ないあるいはヒト好中球中
でのスーパーオキサイド形成または呼吸破壊を誘起し得
ないその不能力によって区別し得るものである。
ンは、高塩濃度、例えば、約0.７Ｍでヘパリンに結合し
得る点で、上記で既略した特徴と一緒にある種の他の特
徴を有しコロニー刺激性因子活性を示している。本発明
のサイトカインは、また、同化酵素リボたん白質リパー
ゼ（ＬＰＬ）を抑制し得ず、カケクチン／ＴＮＦ感受性
Ｌ９２９細胞で刺激し得ず、エンドトキシン耐性Ｃ３Ｈ
／ＨｅＪ胸腺細胞の芽球形成を刺激し得ずまたは一次チ
オグリコレート誘起マウスマクロファージ細胞によるカ
ケクチン／ＴＮＦの産生を誘起し得ないようなその不能
力のような本発明のサイトカインが有しない活性におい
て区別され得る。これらの活性のすべては一般的な特徴
と活性が侵入に対する宿主応答における関与物として同
定されている他の公知のマクロファージ由来メディエー
ター因子によって発揮されるものである。さらに、本発
明の炎症サイトカインはＭＩＰ−１のような他の因子と
はウサギ中の発熱を誘起し得ないあるいはヒト好中球中
でのスーパーオキサイド形成または呼吸破壊を誘起し得
ないその不能力によって区別し得るものである。
【００５９】上記で存在する活性ブロフィルは、従っ
て、本発明の炎症サイトカインを公知の因子から区別
し、本明細書で提示したアミノ酸配列データと関連し
て、本発明の炎症サイトカインが実際に他のマクロファ
ージ由来メディエーター因子と異なることを確実にして
いる。
て、本発明の炎症サイトカインを公知の因子から区別
し、本明細書で提示したアミノ酸配列データと関連し
て、本発明の炎症サイトカインが実際に他のマクロファ
ージ由来メディエーター因子と異なることを確実にして
いる。
【００６０】前述したように、第２図で示す一次アミノ
酸配列および第７図で示す完全配列は単に例示的なもの
であり、同様な配列が実質的に等価のまたは改善された
活性を有するたん白質を与え得る。これらの変形体は、
例えば、部位特異性変異形成により得られた変形体のよ
うな意図的なものであり得るかあるいはＭＩＰ−２産生
体である宿主中の変異から得られた変形体のような偶発
的なものであり得る。これらの変形体はすべて上述した
ようなＭＩＰ−２活性が保持されている限り本発明に包
含される。従って、本明細書で述べたようなＭＩＰ−２
の定義には第２錫および第７図の配列と実質的に等価の
配列を有するたん白質並びにその範囲内の実質的に相同
性の同族体および対立変形体も包含される。
酸配列および第７図で示す完全配列は単に例示的なもの
であり、同様な配列が実質的に等価のまたは改善された
活性を有するたん白質を与え得る。これらの変形体は、
例えば、部位特異性変異形成により得られた変形体のよ
うな意図的なものであり得るかあるいはＭＩＰ−２産生
体である宿主中の変異から得られた変形体のような偶発
的なものであり得る。これらの変形体はすべて上述した
ようなＭＩＰ−２活性が保持されている限り本発明に包
含される。従って、本明細書で述べたようなＭＩＰ−２
の定義には第２錫および第７図の配列と実質的に等価の
配列を有するたん白質並びにその範囲内の実質的に相同
性の同族体および対立変形体も包含される。
【００６１】本発明の炎症サイトカインの調製は本明細
書の前で簡単に述べており、種々の細胞を侵入性刺激か
らの刺激剤物質と一緒にインキュベーションを開始する
ことによる天然物質の場合の仕様が可能であることを確
認している。細胞系ＲＡＷ２６4.７を用いて所望物質の
産生を開始させ、それにより、本発明の炎症サイトカイ
ンを単離できる。マウスマクロファージ細胞系ＲＡＷ２
６4.７は本発明の炎症サイトカインの単離を分析および
精製を行うのに十分な量で容易にしている。当然のこと
として、本発明の炎症サイトカインを後で単離する物質
または本発明の炎症サイトカイン自体を発現するための
他の細胞系または他の原料も本発明に包含され、従っ
て、本発明は限定的でない。
書の前で簡単に述べており、種々の細胞を侵入性刺激か
らの刺激剤物質と一緒にインキュベーションを開始する
ことによる天然物質の場合の仕様が可能であることを確
認している。細胞系ＲＡＷ２６4.７を用いて所望物質の
産生を開始させ、それにより、本発明の炎症サイトカイ
ンを単離できる。マウスマクロファージ細胞系ＲＡＷ２
６4.７は本発明の炎症サイトカインの単離を分析および
精製を行うのに十分な量で容易にしている。当然のこと
として、本発明の炎症サイトカインを後で単離する物質
または本発明の炎症サイトカイン自体を発現するための
他の細胞系または他の原料も本発明に包含され、従っ
て、本発明は限定的でない。
【００６２】前述したように当該技術において周知であ
る多くの組換え技術の包括的な原理に従って実施できる
遺伝子複製によるような別法も本発明に従って意図され
る。従って、ＭＩＰ−２核酸配列はｍＲＮＡの逆転写物
をスクリーニングすることによるあるいは任意の細胞か
らのゲノムライブラリーをスクリーニングすることによ
るような組換えＤＮＡ法による推論アミノ酸配列からも
得ることができる。このＤＮＡはまた普通に利用できる
技術およびＤＮＡ合成装置を用いてこのＤＮＡを合成す
ることによっても得ることができる。合成は、特異的な
制限部位をＤＮＡの調製時に導入することができそれに
よって天然原料には存在していない制限部位を含有する
ベクター中での遺伝子の使用を容易にするので有利であ
る。さらにまた、ＤＮＡ中での任意の所望の部位修飾
も、変異形成によりＤＮＡをさらに修飾する必要なし
に、合成により導入できる。
る多くの組換え技術の包括的な原理に従って実施できる
遺伝子複製によるような別法も本発明に従って意図され
る。従って、ＭＩＰ−２核酸配列はｍＲＮＡの逆転写物
をスクリーニングすることによるあるいは任意の細胞か
らのゲノムライブラリーをスクリーニングすることによ
るような組換えＤＮＡ法による推論アミノ酸配列からも
得ることができる。このＤＮＡはまた普通に利用できる
技術およびＤＮＡ合成装置を用いてこのＤＮＡを合成す
ることによっても得ることができる。合成は、特異的な
制限部位をＤＮＡの調製時に導入することができそれに
よって天然原料には存在していない制限部位を含有する
ベクター中での遺伝子の使用を容易にするので有利であ
る。さらにまた、ＤＮＡ中での任意の所望の部位修飾
も、変異形成によりＤＮＡをさらに修飾する必要なし
に、合成により導入できる。
【００６３】ヒト、マウスまたは他の源からの本発明の
炎症サイトカインをコードするＤＮＡを単離する一般的
手順は、適当な細胞または組織から単離したｃＤＮＡラ
イブラリーを構築し；相同性配列を含有する該ｃＤＮＡ
ライブラリー中でクローンを検出するためのポリペプチ
ド鎖のたん白質をコードする標識ＤＮＡプローブでスク
リーニングすることである。また、上記ＤＮＡを上記ｃ
ＤＮＡ(mＲＮＡからの）とサブクローンのポリメラーゼ
鎖反応（ＰＣＲ）増幅によって単離し標識ＤＮＡプロー
ブでスクリーニングし；次いで各クローンを制限酵素分
析および核酸シーケンシングによって分析して全長クロ
ーンを同定することもできる。全長クローンがライブラ
リーに存在しない場合、種々のクローンからの適当なフ
ラグメントを回収し各クローンに共通する制限部位で結
合させて全長分子をコードするクローンを組立てること
ができる。
炎症サイトカインをコードするＤＮＡを単離する一般的
手順は、適当な細胞または組織から単離したｃＤＮＡラ
イブラリーを構築し；相同性配列を含有する該ｃＤＮＡ
ライブラリー中でクローンを検出するためのポリペプチ
ド鎖のたん白質をコードする標識ＤＮＡプローブでスク
リーニングすることである。また、上記ＤＮＡを上記ｃ
ＤＮＡ(mＲＮＡからの）とサブクローンのポリメラーゼ
鎖反応（ＰＣＲ）増幅によって単離し標識ＤＮＡプロー
ブでスクリーニングし；次いで各クローンを制限酵素分
析および核酸シーケンシングによって分析して全長クロ
ーンを同定することもできる。全長クローンがライブラ
リーに存在しない場合、種々のクローンからの適当なフ
ラグメントを回収し各クローンに共通する制限部位で結
合させて全長分子をコードするクローンを組立てること
ができる。
【００６４】適切で好ましいＤＮＡプローブは後の実施
例において示している。ＭＩＰ−２ｃＤＮＡの５′末端
から消失する任意の配列はｍＲＮＡをテンプレートとし
て使用するＭＩＰ−２配列を相補する合成オリゴヌクレ
オチドの３′伸張（いわゆるプライマー伸長）によって
得ることができ、また相同性配列は第７図で示したマウ
ス配列由来の公知ｃＤＮＡから供給できる。このことは
実施例２においてもっと詳細に述べる：しかしながら、
本明細書で開示するようなマウスＭＩＰ−２をコードす
る無イントロンＤＮＡおよびそのリーダー配列が１度提
供されると、当該技術における普通の熟練者は他の正確
なハイブリット化用プローブを開示した配列から調製し
て所望の遺伝子を容易に調製し得ることを悟るのが実際
である。
例において示している。ＭＩＰ−２ｃＤＮＡの５′末端
から消失する任意の配列はｍＲＮＡをテンプレートとし
て使用するＭＩＰ−２配列を相補する合成オリゴヌクレ
オチドの３′伸張（いわゆるプライマー伸長）によって
得ることができ、また相同性配列は第７図で示したマウ
ス配列由来の公知ｃＤＮＡから供給できる。このことは
実施例２においてもっと詳細に述べる：しかしながら、
本明細書で開示するようなマウスＭＩＰ−２をコードす
る無イントロンＤＮＡおよびそのリーダー配列が１度提
供されると、当該技術における普通の熟練者は他の正確
なハイブリット化用プローブを開示した配列から調製し
て所望の遺伝子を容易に調製し得ることを悟るのが実際
である。
【００６５】ベクターはＭＩＰ−２ポリペプチドをコー
ドするＤＮＡの操作を簡素化してさらなる加工のための
大量のＤＮＡの調製（クローニングベクター）のためあ
るいはＭＩＰ−２ポリペプチドの発現（発現ベクター）
のために使用する。ベクターはプラスミド、ウイルス
（ファージを含む）、および組込み可能なＤＮＡフラグ
メント、即ち宿主ゲノムに組換えにより組込み可能なフ
ラグメントを含む。クローニングベクターは発現制御配
列を含有する必要はない。しかしながら、制御配列は発
現ベクターには必要であり、これらの制御配列には転写
プロモーター、転写を制御する任意成分としてのオペレ
ーター配列、適当なリボソーム結合性部位をコードする
配列（原核生物発現において）、および転写と翻訳の終
結を制御する配列のような転写および翻訳制御配列があ
る。発現ベクターは好ましくは選択遺伝子を含んでＭＩ
Ｐ−２の安定な発現を容易にするかおよび／または形質
転換体を同定すべきである。しかしながら、発現を維持
する選択遺伝子は真核生物宿主細胞を用いる共形質転換
系での分離ベクターにより供給し得る。
ドするＤＮＡの操作を簡素化してさらなる加工のための
大量のＤＮＡの調製（クローニングベクター）のためあ
るいはＭＩＰ−２ポリペプチドの発現（発現ベクター）
のために使用する。ベクターはプラスミド、ウイルス
（ファージを含む）、および組込み可能なＤＮＡフラグ
メント、即ち宿主ゲノムに組換えにより組込み可能なフ
ラグメントを含む。クローニングベクターは発現制御配
列を含有する必要はない。しかしながら、制御配列は発
現ベクターには必要であり、これらの制御配列には転写
プロモーター、転写を制御する任意成分としてのオペレ
ーター配列、適当なリボソーム結合性部位をコードする
配列（原核生物発現において）、および転写と翻訳の終
結を制御する配列のような転写および翻訳制御配列があ
る。発現ベクターは好ましくは選択遺伝子を含んでＭＩ
Ｐ−２の安定な発現を容易にするかおよび／または形質
転換体を同定すべきである。しかしながら、発現を維持
する選択遺伝子は真核生物宿主細胞を用いる共形質転換
系での分離ベクターにより供給し得る。
【００６６】発現においては、適切なベクターは意図し
た発現宿主と適合性ある種に由来するレプリコン（非組
込みベクターでの使用のための複製の起源）および制御
配列を一般に含有するであろう。本明細書で使用すると
きの“複製可能な”ベクターなる用語はそのようなレプ
リコン並びに宿主ゲノムへの組込みにより複製したベク
ターを含有するベクターを包含するものとする。次い
で、細胞をＭＩＰ−２コードＤＮＡを含有するベクター
で形質転換または移入し、ここで、形質転換宿主細胞と
して同定する。これらの形質転換宿主から発現させたＭ
ＩＰ−２は、使用する宿主細胞および発現したペプチド
中の適当なプロセッシング信号、例えば、相同性または
非相同性のシグナル配列の存在により、細胞内に付着す
るかあるいは細胞周辺腔または培養上清中に分泌するで
あろう。
た発現宿主と適合性ある種に由来するレプリコン（非組
込みベクターでの使用のための複製の起源）および制御
配列を一般に含有するであろう。本明細書で使用すると
きの“複製可能な”ベクターなる用語はそのようなレプ
リコン並びに宿主ゲノムへの組込みにより複製したベク
ターを含有するベクターを包含するものとする。次い
で、細胞をＭＩＰ−２コードＤＮＡを含有するベクター
で形質転換または移入し、ここで、形質転換宿主細胞と
して同定する。これらの形質転換宿主から発現させたＭ
ＩＰ−２は、使用する宿主細胞および発現したペプチド
中の適当なプロセッシング信号、例えば、相同性または
非相同性のシグナル配列の存在により、細胞内に付着す
るかあるいは細胞周辺腔または培養上清中に分泌するで
あろう。
【００６７】発現に適する宿主細胞は原核生物または真
核生物細胞であり得る。原核生物にはグラム陰性または
グラム陽性生物、例えば、Ｅ．coliまたはバチルススブ
チリス（Bacillus subtills)がある。真核細胞には酵
素、バキュロウイルス、または哺乳動物起源の確立細胞
系のような高級真核生物細胞がある。
核生物細胞であり得る。原核生物にはグラム陰性または
グラム陽性生物、例えば、Ｅ．coliまたはバチルススブ
チリス（Bacillus subtills)がある。真核細胞には酵
素、バキュロウイルス、または哺乳動物起源の確立細胞
系のような高級真核生物細胞がある。
【００６８】宿主細胞用の発現ベクターには通常複製の
起源（それが組込み用ベクターである限りにおいて）、
リボソーム結合性部位と一緒のＭＩＰ−２コード配列か
らのプロモーター局在上流、および転写終結配列があ
る。当業者はこれら配列のあるものがある種の宿主での
発現には必要でないことを知っているであろう。微生物
と共に使用する非組込性発現ベクターは宿主が認識する
複製の起源を含有することのみを必要とし、そのプロモ
ーターは宿主および選択遺伝子中で機能するであろう。
起源（それが組込み用ベクターである限りにおいて）、
リボソーム結合性部位と一緒のＭＩＰ−２コード配列か
らのプロモーター局在上流、および転写終結配列があ
る。当業者はこれら配列のあるものがある種の宿主での
発現には必要でないことを知っているであろう。微生物
と共に使用する非組込性発現ベクターは宿主が認識する
複製の起源を含有することのみを必要とし、そのプロモ
ーターは宿主および選択遺伝子中で機能するであろう。
【００６９】発現ベクターは本発明に従って構築してＭ
ＩＰコード配列を適当な調節配列を有するベクター中に
存在させるようにし、制御配列に対しての上記コード配
列の位置および配向を上記コード配列が制御配列の“制
御”下で転写し翻訳される（即ち、制御配列でＤＮＡ分
子に結合するＲＮＡポリメラーゼが上記コード配列を転
写する）ようにする。制御配列は上述のクローニングベ
クターのようなベクターに挿入前にコード配列に結合さ
せ得る。また、コード配列はすでに制御配列と適当な制
限部位を含有している発現ベクターに直接クローニング
することもできる。原核生物および酵母でのＭＩＰ−２
の発現においては、制御配列はコード配列に必然的に非
相同性であろう。宿主細胞が原核生物である場合、コー
ド配列がイントロン（例えば、ｃＤＮＡ）を含まないこ
とも必要である。使用する宿主細胞が哺乳動物細胞であ
る場合、制御配列はＭＩＰコード配列に対し非相同性ま
たは相同性であり得、核コード配列はイントロンまたは
ｃＤＮＡを含有するゲノムＤＮＡであり得る。
ＩＰコード配列を適当な調節配列を有するベクター中に
存在させるようにし、制御配列に対しての上記コード配
列の位置および配向を上記コード配列が制御配列の“制
御”下で転写し翻訳される（即ち、制御配列でＤＮＡ分
子に結合するＲＮＡポリメラーゼが上記コード配列を転
写する）ようにする。制御配列は上述のクローニングベ
クターのようなベクターに挿入前にコード配列に結合さ
せ得る。また、コード配列はすでに制御配列と適当な制
限部位を含有している発現ベクターに直接クローニング
することもできる。原核生物および酵母でのＭＩＰ−２
の発現においては、制御配列はコード配列に必然的に非
相同性であろう。宿主細胞が原核生物である場合、コー
ド配列がイントロン（例えば、ｃＤＮＡ）を含まないこ
とも必要である。使用する宿主細胞が哺乳動物細胞であ
る場合、制御配列はＭＩＰコード配列に対し非相同性ま
たは相同性であり得、核コード配列はイントロンまたは
ｃＤＮＡを含有するゲノムＤＮＡであり得る。
【００７０】発現ベクターは宿主生物により認識される
プロモーターを含有すべきである。原生動物組換えＤＮ
Ａ発現において用いられる普通に公知で入手できるプロ
モーターにはβ−ラクタマーゼ（ベニシリナーゼ）とラ
クトースプロモーター系、トリプトファン（trp)プロモ
ーター系とtac プロモーターがある。これらが普通使用
されるけれども、他の公知の微生物プロモーターも適す
る。
プロモーターを含有すべきである。原生動物組換えＤＮ
Ａ発現において用いられる普通に公知で入手できるプロ
モーターにはβ−ラクタマーゼ（ベニシリナーゼ）とラ
クトースプロモーター系、トリプトファン（trp)プロモ
ーター系とtac プロモーターがある。これらが普通使用
されるけれども、他の公知の微生物プロモーターも適す
る。
【００７１】原核動物以外に、酵母のような真核細胞も
ＭＩＰ−２コードベクターで形質転換できる。酵母ベク
ターは、一般に、複製の起源または自律複製配列（AR
S)、（非組込み性である場合の）プロモーター、ＭＩＰ
−２をコードするＤＮＡ、ポリアデニル化および転写終
結用の配列、および選択遺伝子を含有するであろう。本
発明において特に興味あるのは、ピシア（Pichia）、ク
リュイベロミセス（Kluyveromyces)、サッカロミセス、
シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces)およびカン
ジダ（Candida)の各属種内の酵母種である。特に興味が
あるのはサッカロミセス種のＳ．セレビシエ（S. cerev
isiae)、Ｓ．カルスベルゲンシス（S.carlsbergensis)
、Ｓ．ジアスタチカス（S. diastaticus）、Ｓ．ドー
ラシィ（S. douglasii）：Ｓ．クルイベリ（S. kluyver
i)、Ｓ．ノルベンシス（ S.norbensis ）、およびＳ．
オビホルビス（S. oviformis) である。属クリュイベロ
ミセスにおいて興味ある種にはＫ．ラクチス（K. lacti
s)があり、属ピシアにはＰ．パストリス（P. pastoris)
がある。酵母の分類は将来変り得るので、本発明の目的
においては、酵母はBiology and Activities of Yeast
（Ｆ．Ａ．スキナー、Ｓ．Ｍ．パスモアおよびＲ．Ｒ．
ダベンポート編、１９８０）（ＳＯＣ．ＡＰＰ．ＢＡＣ
ＴＥＲＩＯＬ．ＳＹＭＰ．ＳＥＲＩＥＳ No.9）に記載
されているように定義する。上記以外にも、当該技術に
おける通常の熟練者は酵母の生物学および酵母遺伝子の
操作に馴れているものと思われる。例えば、Biochemist
ry and Genetics of Yeast （Ｍ．バシラ、Ｂ．Ｌ．ホレ
ッカー、およびＡ．Ｏ．Ｍ．ストッバニー編、１９７
８) ; The Yeasts（Ａ．Ｈ．ロースおよびＪ．Ｓ．ハリ
ソン編、第２判、１９８７) ; The Molecular Biology
of the Yeast Saccharomyces（ストラセーン等編、１９
８１）を参照されたい。これら文献の記載は参考として
本明細書に引用する。
ＭＩＰ−２コードベクターで形質転換できる。酵母ベク
ターは、一般に、複製の起源または自律複製配列（AR
S)、（非組込み性である場合の）プロモーター、ＭＩＰ
−２をコードするＤＮＡ、ポリアデニル化および転写終
結用の配列、および選択遺伝子を含有するであろう。本
発明において特に興味あるのは、ピシア（Pichia）、ク
リュイベロミセス（Kluyveromyces)、サッカロミセス、
シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces)およびカン
ジダ（Candida)の各属種内の酵母種である。特に興味が
あるのはサッカロミセス種のＳ．セレビシエ（S. cerev
isiae)、Ｓ．カルスベルゲンシス（S.carlsbergensis)
、Ｓ．ジアスタチカス（S. diastaticus）、Ｓ．ドー
ラシィ（S. douglasii）：Ｓ．クルイベリ（S. kluyver
i)、Ｓ．ノルベンシス（ S.norbensis ）、およびＳ．
オビホルビス（S. oviformis) である。属クリュイベロ
ミセスにおいて興味ある種にはＫ．ラクチス（K. lacti
s)があり、属ピシアにはＰ．パストリス（P. pastoris)
がある。酵母の分類は将来変り得るので、本発明の目的
においては、酵母はBiology and Activities of Yeast
（Ｆ．Ａ．スキナー、Ｓ．Ｍ．パスモアおよびＲ．Ｒ．
ダベンポート編、１９８０）（ＳＯＣ．ＡＰＰ．ＢＡＣ
ＴＥＲＩＯＬ．ＳＹＭＰ．ＳＥＲＩＥＳ No.9）に記載
されているように定義する。上記以外にも、当該技術に
おける通常の熟練者は酵母の生物学および酵母遺伝子の
操作に馴れているものと思われる。例えば、Biochemist
ry and Genetics of Yeast （Ｍ．バシラ、Ｂ．Ｌ．ホレ
ッカー、およびＡ．Ｏ．Ｍ．ストッバニー編、１９７
８) ; The Yeasts（Ａ．Ｈ．ロースおよびＪ．Ｓ．ハリ
ソン編、第２判、１９８７) ; The Molecular Biology
of the Yeast Saccharomyces（ストラセーン等編、１９
８１）を参照されたい。これら文献の記載は参考として
本明細書に引用する。
【００７２】酵母ベクター中の適当なプロモーターに
は、エノローゼ、３−ホスホグリセレートキナーゼ、グ
リセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナー
ゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、
ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフェー
トイソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピ
ルベートキナーゼ、トリオセホスフェートイソメラー
ゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナ
ーゼのような解糖酵素用のプロモーターがある。
は、エノローゼ、３−ホスホグリセレートキナーゼ、グ
リセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナー
ゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、
ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフェー
トイソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピ
ルベートキナーゼ、トリオセホスフェートイソメラー
ゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナ
ーゼのような解糖酵素用のプロモーターがある。
【００７３】増殖条件により制御される転写のさらなる
利点を有する他の酵母プロモーターはアルコールデヒド
ロゲナーゼ１または２、イソサイトクロムＣ、アシット
ホスファターゼ、並びにマルトースおよびガラクトース
利用に応答性の酵素のプロモーター領域である。昆虫を
包含するせき椎動物または無せき椎動物からのより高級
な真核細胞培養物も使用でき、その増殖手順は公知であ
る。例えば、Tissus Culture, AcademicPress社、クル
ゼおよびパターソン編、（１９７３）を参照されたい。
利点を有する他の酵母プロモーターはアルコールデヒド
ロゲナーゼ１または２、イソサイトクロムＣ、アシット
ホスファターゼ、並びにマルトースおよびガラクトース
利用に応答性の酵素のプロモーター領域である。昆虫を
包含するせき椎動物または無せき椎動物からのより高級
な真核細胞培養物も使用でき、その増殖手順は公知であ
る。例えば、Tissus Culture, AcademicPress社、クル
ゼおよびパターソン編、（１９７３）を参照されたい。
【００７４】高等真核動物中でのＭＩＰ−２発現に適す
る宿主細胞には次のものがある：ＳＶ４０（ＣＯＳ−
７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１）で形質転換したサル腎
臓ＣＶＩ系；仔ハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ
ＣＲＬ１０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞−Ｄ
ＨＦＲ〔ウルラーブおよびカシン、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）
７７：４２１６（１９８０）に記載〕；マウスセルトリ
(Sertoli) 細胞〔ＴＭ4、マザーＪ．Ｐ., Biol. Repro
d. ２３：２４３−２５１（１９８０）〕；サル腎臓細
胞（ＣＶＩ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０);アフリカみどりザ
ル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５
８７）；ヒトけい管がん腫細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ
ＣＣＬ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣ
Ｌ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ３Ａ、
ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、
ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈep Ｇ２、
ＨＢ８０６６）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ０６０６５
２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ラットヘパトーマ細胞
〔ＨＴＣ、Ｍ１、５４、バウマンＭ．等、J. Cell Biol
８５；１−８（１９８０）〕およびＴＲＩ細胞〔マザー
Ｊ．Ｐ．等、Annals N. Y.Acad. Sci. ３８３：４４
−６８（１９８２）〕。普通使用されるプロモーターは
ポリオーマ、アデノウイルス、およびサルウイルス４０
（ＳＶ４０）に由来する。原核細胞よりも真核細胞中で
発現させたときの方が、組換えＭＩＰ−２はグリコシル
化に基づきより高い分子量を有し得ることが認められる
であろう。従って、予想分子量7,９０８よりも大きい分
子量を有するＭＩＰ−２の部分または完全グリコシル化
形、およびその不グリコシル化形も本発明の範囲に属す
るものとする。
る宿主細胞には次のものがある：ＳＶ４０（ＣＯＳ−
７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１）で形質転換したサル腎
臓ＣＶＩ系；仔ハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ
ＣＲＬ１０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞−Ｄ
ＨＦＲ〔ウルラーブおよびカシン、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）
７７：４２１６（１９８０）に記載〕；マウスセルトリ
(Sertoli) 細胞〔ＴＭ4、マザーＪ．Ｐ., Biol. Repro
d. ２３：２４３−２５１（１９８０）〕；サル腎臓細
胞（ＣＶＩ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０);アフリカみどりザ
ル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５
８７）；ヒトけい管がん腫細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ
ＣＣＬ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣ
Ｌ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ３Ａ、
ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、
ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈep Ｇ２、
ＨＢ８０６６）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ０６０６５
２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ラットヘパトーマ細胞
〔ＨＴＣ、Ｍ１、５４、バウマンＭ．等、J. Cell Biol
８５；１−８（１９８０）〕およびＴＲＩ細胞〔マザー
Ｊ．Ｐ．等、Annals N. Y.Acad. Sci. ３８３：４４
−６８（１９８２）〕。普通使用されるプロモーターは
ポリオーマ、アデノウイルス、およびサルウイルス４０
（ＳＶ４０）に由来する。原核細胞よりも真核細胞中で
発現させたときの方が、組換えＭＩＰ−２はグリコシル
化に基づきより高い分子量を有し得ることが認められる
であろう。従って、予想分子量7,９０８よりも大きい分
子量を有するＭＩＰ−２の部分または完全グリコシル化
形、およびその不グリコシル化形も本発明の範囲に属す
るものとする。
【００７５】多くの原核細胞発現ベクターは当該技術に
おいて公知である。例えば米国特許第4,440,859 号、第
4,436,815 号、第4,431、740 号、第4,431,739 号、第4,
428,941 号、第4,425,437 号、第4,418,149 号、第4,41
1,994 号、第4,366,246 号、第4,342,832 号を参照され
たい。また、英国特許公告、ＧＢ2,121,054 号、ＧＢ2,
008,123 号、ＧＢ2,007,675 号、およびＥＰＯ公開第10
3,395 号も参照されたい。好ましい原核細胞発現系は
Ｅ．コリである。
おいて公知である。例えば米国特許第4,440,859 号、第
4,436,815 号、第4,431、740 号、第4,431,739 号、第4,
428,941 号、第4,425,437 号、第4,418,149 号、第4,41
1,994 号、第4,366,246 号、第4,342,832 号を参照され
たい。また、英国特許公告、ＧＢ2,121,054 号、ＧＢ2,
008,123 号、ＧＢ2,007,675 号、およびＥＰＯ公開第10
3,395 号も参照されたい。好ましい原核細胞発現系は
Ｅ．コリである。
【００７６】他の好ましい発現ベクターは真核細胞系で
使用するものである。例示的な真核細胞発現系は当該技
術において周知のワクシニアウイルスを用いる系であ
る。例えば、マケット等、（１９８４）J. Virol. ４
９：８５７；“DNA Cloning", Vol. II, １９１−２１
１（前出）；ＰＣＴ公開 No.０８６／０７５９３号を参
照されたい。酵母発現ベクターも当該技術において公知
である。例えば、米国特許第4,446,235 号、第4,443,53
9 号、第4,430,428 号を参照されたい。また、ヨーロッ
パ特許公開第103,409 号、第100,561 号、第96,491号も
参照されたい。もう１つの好ましい発現系はベクターｐ
ＨＳ１であり、これはチャイニーズハムスター卵巣細胞
を形質転換する。ＰＣＴ公開 No.Ｗ０８７／０２０６２
号参照。哺乳動物組織はジヒドロホレートリダクターゼ
（ＤＨＦＲ）またはチミジンキナーゼのような選択性マ
ーカーをコードするＤＮＡおよびＭＩＰ−２をコードす
るＤＮＡと共形質転換し得る。
使用するものである。例示的な真核細胞発現系は当該技
術において周知のワクシニアウイルスを用いる系であ
る。例えば、マケット等、（１９８４）J. Virol. ４
９：８５７；“DNA Cloning", Vol. II, １９１−２１
１（前出）；ＰＣＴ公開 No.０８６／０７５９３号を参
照されたい。酵母発現ベクターも当該技術において公知
である。例えば、米国特許第4,446,235 号、第4,443,53
9 号、第4,430,428 号を参照されたい。また、ヨーロッ
パ特許公開第103,409 号、第100,561 号、第96,491号も
参照されたい。もう１つの好ましい発現系はベクターｐ
ＨＳ１であり、これはチャイニーズハムスター卵巣細胞
を形質転換する。ＰＣＴ公開 No.Ｗ０８７／０２０６２
号参照。哺乳動物組織はジヒドロホレートリダクターゼ
（ＤＨＦＲ）またはチミジンキナーゼのような選択性マ
ーカーをコードするＤＮＡおよびＭＩＰ−２をコードす
るＤＮＡと共形質転換し得る。
【００７７】野性型ＤＨＦＲ遺伝子を用いる場合、ＤＨ
ＦＲを欠乏する宿主細胞を用いることが好ましい、即
ち、ハイポキサンチン、グリシンおよびチミジンを含ま
ないhgt培地中で成功裏に移入するためのマーカーとし
てのＤＨＦＲコード配列の使用を可能にする。この場合
の適切な宿主細胞は、“ウルラーブおよびカシン、１９
８０、Proc. Nat. Acad. Sci（ＵＳＡ）７７：４２１
６”に開示されているようにして調製し増殖させたｐＨ
ＦＲ活性のないチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）
細胞系である。昆虫細胞での使用のためのバキュロウイ
ルス由来の発現ベクターは当該技術において公知であり
入手可能である。ルックローおよびスマーズ、Biotechn
ology, ６、ｐ．４７−５５参照。
ＦＲを欠乏する宿主細胞を用いることが好ましい、即
ち、ハイポキサンチン、グリシンおよびチミジンを含ま
ないhgt培地中で成功裏に移入するためのマーカーとし
てのＤＨＦＲコード配列の使用を可能にする。この場合
の適切な宿主細胞は、“ウルラーブおよびカシン、１９
８０、Proc. Nat. Acad. Sci（ＵＳＡ）７７：４２１
６”に開示されているようにして調製し増殖させたｐＨ
ＦＲ活性のないチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）
細胞系である。昆虫細胞での使用のためのバキュロウイ
ルス由来の発現ベクターは当該技術において公知であり
入手可能である。ルックローおよびスマーズ、Biotechn
ology, ６、ｐ．４７−５５参照。
【００７８】使用する発現系および宿主にもよるが、Ｍ
ＩＰ−２は上記および実施例２で記載した発現ベクター
のような外因性または非相同性ＤＮＡ構築物で形質転換
した宿主細胞をＭＩＰ−２たん白質が発現される条件下
で増殖することによって産生させる。次いで、ＭＩＰ-2
を宿主細胞から単離し精製する。発現系がＭＩＰ−２を
増殖培地中に分泌する場合、そのたん白質は無細胞培地
から直接精製できる。ＭＩＰ−２たん白質が分泌されな
い場合には、細胞溶解物から単離する。適当な増殖条件
および回収方法の選択は当該技術の熟練の範囲である。
ＩＰ−２は上記および実施例２で記載した発現ベクター
のような外因性または非相同性ＤＮＡ構築物で形質転換
した宿主細胞をＭＩＰ−２たん白質が発現される条件下
で増殖することによって産生させる。次いで、ＭＩＰ-2
を宿主細胞から単離し精製する。発現系がＭＩＰ−２を
増殖培地中に分泌する場合、そのたん白質は無細胞培地
から直接精製できる。ＭＩＰ−２たん白質が分泌されな
い場合には、細胞溶解物から単離する。適当な増殖条件
および回収方法の選択は当該技術の熟練の範囲である。
【００７９】組換え的に調製したＭＩＰ−２は公知の手
順に従って形質転換細胞より回収できる。好ましいの
は、形質転換細胞からＭＩＰ−２の分泌を与える発現ベ
クターを用いることであり；かくして、細胞は遠心によ
り分離できる。ＭＩＰ−２はサイズ排除、イオン交換ク
ロマトグラフ、ＨＰＬＣ等（これらに限定するものでは
ない）を包含する一般のたん白質精製法によって典型的
に精製される。
順に従って形質転換細胞より回収できる。好ましいの
は、形質転換細胞からＭＩＰ−２の分泌を与える発現ベ
クターを用いることであり；かくして、細胞は遠心によ
り分離できる。ＭＩＰ−２はサイズ排除、イオン交換ク
ロマトグラフ、ＨＰＬＣ等（これらに限定するものでは
ない）を包含する一般のたん白質精製法によって典型的
に精製される。
【００８０】ＭＩＰ−２のコード配列を調製し単離され
ると、この配列は任意の適当なベクターにクローニング
しそれによってＭＩＰ−２コード配列を含有しない細胞
を実質的に含まない（例えば、他のライブラリークロー
ンを含まない）細胞組成物中に維持する。数多くのクロ
ーニングベクターが当業者にとって公知である。クロー
ニング用の組換えＤＮＡベクターと該ベクターが形質転
換し得る宿主細胞の例には種々のバクテリオファージラ
ムダベクター（Ｅ．coli）、ｐＢＲ３２２ (E.coli
）、ｐＡＣＹＣ１７７（Ｅ．coli）、ｐＫＴ２３０
（グラム陰性菌）、ｐＧＶ１１０６（グラム陰性菌）、
ｐＬＡＦＲ１（グラム陰性菌）、ｐＭＥ２９０（非Ｅ．
coliグラム陰性菌)、ｐＨＶ１４（Ｅ．coliおよびバチラ
ススブチリス)、ｐＢＤ９（バチラス）、ｐＩＪ６１（ス
トレプトミセス）、ｐＵＣ６（ストレプトミセス）、ア
クチノファージ、φＣ３１（ストレプトミセス）、ＹＩ
ｐ5 （サッカロミセス）、ＹＣｐ１９（サッカロミセ
ス)、ＹＥｐ２４（サッカロミセス)、ｐＣ１／１（サッカ
ロミセス）、ＸＲｐ１７（サッカロミセス）、およびウ
シパビローマウイルス（動物細胞）がある。一般的に
は、ＤＮＡ Cloning : Vol. IおよびII（前出）；Ｔ．
マニアティス等（前出）；Ｂ．パーバル（前出）；ボタ
ティン等（１９７９）、ＧＥＮＥ８：１７−２４；ブレ
ーク等、（１９８４）ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．
ＳＣＴ．ＵＳＡ８１：４６４２−４６４６；シュニッカ
ム等、（１９８２）、Ｊ．ＭＯＬ．ＢＩＯＬ．１５８：
１５７を参照されたい。
ると、この配列は任意の適当なベクターにクローニング
しそれによってＭＩＰ−２コード配列を含有しない細胞
を実質的に含まない（例えば、他のライブラリークロー
ンを含まない）細胞組成物中に維持する。数多くのクロ
ーニングベクターが当業者にとって公知である。クロー
ニング用の組換えＤＮＡベクターと該ベクターが形質転
換し得る宿主細胞の例には種々のバクテリオファージラ
ムダベクター（Ｅ．coli）、ｐＢＲ３２２ (E.coli
）、ｐＡＣＹＣ１７７（Ｅ．coli）、ｐＫＴ２３０
（グラム陰性菌）、ｐＧＶ１１０６（グラム陰性菌）、
ｐＬＡＦＲ１（グラム陰性菌）、ｐＭＥ２９０（非Ｅ．
coliグラム陰性菌)、ｐＨＶ１４（Ｅ．coliおよびバチラ
ススブチリス)、ｐＢＤ９（バチラス）、ｐＩＪ６１（ス
トレプトミセス）、ｐＵＣ６（ストレプトミセス）、ア
クチノファージ、φＣ３１（ストレプトミセス）、ＹＩ
ｐ5 （サッカロミセス）、ＹＣｐ１９（サッカロミセ
ス)、ＹＥｐ２４（サッカロミセス)、ｐＣ１／１（サッカ
ロミセス）、ＸＲｐ１７（サッカロミセス）、およびウ
シパビローマウイルス（動物細胞）がある。一般的に
は、ＤＮＡ Cloning : Vol. IおよびII（前出）；Ｔ．
マニアティス等（前出）；Ｂ．パーバル（前出）；ボタ
ティン等（１９７９）、ＧＥＮＥ８：１７−２４；ブレ
ーク等、（１９８４）ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．
ＳＣＴ．ＵＳＡ８１：４６４２−４６４６；シュニッカ
ム等、（１９８２）、Ｊ．ＭＯＬ．ＢＩＯＬ．１５８：
１５７を参照されたい。
【００８１】また、ＭＩＰ−２は通常のペプチド合成に
より、メリフィールド(Merrifield)合成の原理を用い、
このメリフィールド合成方法を用いるように設計された
市販の自動装置を用いることによっても調製できる。通
常のペプチド合成を用いて調製したペプチドも通常のア
フィニティクロマトグラフ、ゲル濾過および／またはＲ
Ｐ−ＨＰＬＣを用いて精製し得る。
より、メリフィールド(Merrifield)合成の原理を用い、
このメリフィールド合成方法を用いるように設計された
市販の自動装置を用いることによっても調製できる。通
常のペプチド合成を用いて調製したペプチドも通常のア
フィニティクロマトグラフ、ゲル濾過および／またはＲ
Ｐ−ＨＰＬＣを用いて精製し得る。
【００８２】さらにヌクレオチド配列からは、ＭＩＰ−
２同族体も本発明の範囲に属するものとする。フラグメ
ントのような同族体はＭＩＰ−２のペプシン消化によっ
て調製できる。変異体のような他の同族体はＭＩＰ−２
コード配列の標準の部位特異性変異形成により調製でき
る。“ＭＩＰ−２活性”を示す同族体は公知のインビボ
および／またはインビトロアッセイで同定し得る。
２同族体も本発明の範囲に属するものとする。フラグメ
ントのような同族体はＭＩＰ−２のペプシン消化によっ
て調製できる。変異体のような他の同族体はＭＩＰ−２
コード配列の標準の部位特異性変異形成により調製でき
る。“ＭＩＰ−２活性”を示す同族体は公知のインビボ
および／またはインビトロアッセイで同定し得る。
【００８３】前述したように、ＭＩＰ−２をコードする
ＤＮＡ配列はクローニングするよりもむしろ合成的に調
製できる。このＤＮＡ配列はＭＩＰ−２アミノ酸配列用
の適当なコドンを有するように設計し得る。一般的に
は、その配列を発現に用いる場合、意図する宿主にとっ
て好ましいコドンを使用するであろう。完全配列は標準
方法で調製した重複オリゴヌクレオチドから組立てて全
コード配列とする。例えば、“エッジ、Nature ２９
２：７５６（１９８１）；ナムベア等、Science２２
３：１２９９（１９８４）；ジェイ等、J. Biol. Chem.
２５９：６３１１（１９８４）を参照されたい。
ＤＮＡ配列はクローニングするよりもむしろ合成的に調
製できる。このＤＮＡ配列はＭＩＰ−２アミノ酸配列用
の適当なコドンを有するように設計し得る。一般的に
は、その配列を発現に用いる場合、意図する宿主にとっ
て好ましいコドンを使用するであろう。完全配列は標準
方法で調製した重複オリゴヌクレオチドから組立てて全
コード配列とする。例えば、“エッジ、Nature ２９
２：７５６（１９８１）；ナムベア等、Science２２
３：１２９９（１９８４）；ジェイ等、J. Biol. Chem.
２５９：６３１１（１９８４）を参照されたい。
【００８４】合成ＤＮＡ配列はＭＩＰ−２同族体または
“変異体”発現する遺伝子の好都合な構築を可能にす
る。また、変異体をコードするＤＮＡは天然ＭＩＰ−２
遺伝子またはｃＤＮＡの部位特異性変異形成により調製
でき、変異体は通常のポリペプチド合成を用いて直接合
成することもできる。
“変異体”発現する遺伝子の好都合な構築を可能にす
る。また、変異体をコードするＤＮＡは天然ＭＩＰ−２
遺伝子またはｃＤＮＡの部位特異性変異形成により調製
でき、変異体は通常のポリペプチド合成を用いて直接合
成することもできる。
【００８５】部位特異性変異形成は一般に完全コード発
現からの同族体を創生するのに用いる。部位特異性変異
形成は所望の変異体を示す限られた不整合を除いては変
異形成すべき単一鎖ファージＤＮＡに相補性のプライマ
ー合成オリゴヌクレオチドを用いて行う。要するに、合
成オリゴヌクレオチドを上記ファージに相補性のストラ
ンドの合成を指示するプライマーとして用い、得られた
二重鎖ＤＮＡをファージ支持宿主微生物中に形質転換さ
せる。形質転換微生物の培養物を寒天上に塗抹したファ
ージを潜伏させる単一細胞からのプラーグ形成を行う。
現からの同族体を創生するのに用いる。部位特異性変異
形成は所望の変異体を示す限られた不整合を除いては変
異形成すべき単一鎖ファージＤＮＡに相補性のプライマ
ー合成オリゴヌクレオチドを用いて行う。要するに、合
成オリゴヌクレオチドを上記ファージに相補性のストラ
ンドの合成を指示するプライマーとして用い、得られた
二重鎖ＤＮＡをファージ支持宿主微生物中に形質転換さ
せる。形質転換微生物の培養物を寒天上に塗抹したファ
ージを潜伏させる単一細胞からのプラーグ形成を行う。
【００８６】理論的には、５０％の新規プラーグが単一
鎖としての変異形を有するファージを含有し；５０％が
元の配列を有するであろう。得られたプラーグは、正確
な整合のハイブリッド化を行うが元のストランドとの不
整合はハイブリッド化を防止するに十分な温度で、キナ
ーゼ合成プライマーでハイブリッド化する。上記プロー
ブとハイブリッド化したプラーグを収集し、培養し、Ｄ
ＮＡを回収する。
鎖としての変異形を有するファージを含有し；５０％が
元の配列を有するであろう。得られたプラーグは、正確
な整合のハイブリッド化を行うが元のストランドとの不
整合はハイブリッド化を防止するに十分な温度で、キナ
ーゼ合成プライマーでハイブリッド化する。上記プロー
ブとハイブリッド化したプラーグを収集し、培養し、Ｄ
ＮＡを回収する。
【００８７】たん白質への非天然アミノ酸の部位特異性
導入の一般的方法は、“クリストファーＪ．ナレン、ス
ペンサーＪ．アンソニー−カヒル、ミッチェルＣ．グリ
フィス、ペーターＧ．シュルツ、ＳＣＩＥＮＣＥ２４
４：１８２−１８８（１９８９年４月）”に記載されて
いる。この方法は非天然アミノ酸を含む同族体を創生す
るのに使用できる。
導入の一般的方法は、“クリストファーＪ．ナレン、ス
ペンサーＪ．アンソニー−カヒル、ミッチェルＣ．グリ
フィス、ペーターＧ．シュルツ、ＳＣＩＥＮＣＥ２４
４：１８２−１８８（１９８９年４月）”に記載されて
いる。この方法は非天然アミノ酸を含む同族体を創生す
るのに使用できる。
【００８８】本発明の炎症サイトカインは実施例１で記
載するようにマウス中で単離し分析した。ヒト炎症サイ
トカイン（ＭＩＰ−２）は、マウスＭＩＰ−２がヒト好
中球に対して効果を有するので、マウスＭＩＰ−２と類
似すると推定される。本明細書で述べるように、この炎
症サイトカインの活性は該炎症サイトカインを組織感染
部位に投与して好中球の該部所への伝達を促進すること
により利用し得る。
載するようにマウス中で単離し分析した。ヒト炎症サイ
トカイン（ＭＩＰ−２）は、マウスＭＩＰ−２がヒト好
中球に対して効果を有するので、マウスＭＩＰ−２と類
似すると推定される。本明細書で述べるように、この炎
症サイトカインの活性は該炎症サイトカインを組織感染
部位に投与して好中球の該部所への伝達を促進すること
により利用し得る。
【００８９】前述したように、本発明の炎症サイトカイ
ンまたはその結合性パートナー、または該サイトカイン
に対して擬態または拮抗性を示すあるいはその産生に対
しての制御を示す他のリガンドまたは薬剤は、適当なキ
ャリヤーを含み組織感染または他の病理学的不順を有す
る患者にその治療のために種々の方法で投与するのに有
効な強度の薬剤組成物として調製できる。種々の投与方
法を使用でき、その方法としては、軟こうまたは外科に
おけるような局所的適用並びに外科スポンジ、バンド、
ガーゼパッド等の他局所適用がある。また、そのような
組成物は、身体損傷領域を洗浄するのに用いる灌注液へ
の伝達、カテーテル化等を包含する、皮下、静脈内およ
び腹腔内注射のようてな非経口法によっても投与でき
る。この炎症サイトカインの平均量は変化し得、特に、
権限ある医師または獣医の推奨および指示に従うべきで
ある。
ンまたはその結合性パートナー、または該サイトカイン
に対して擬態または拮抗性を示すあるいはその産生に対
しての制御を示す他のリガンドまたは薬剤は、適当なキ
ャリヤーを含み組織感染または他の病理学的不順を有す
る患者にその治療のために種々の方法で投与するのに有
効な強度の薬剤組成物として調製できる。種々の投与方
法を使用でき、その方法としては、軟こうまたは外科に
おけるような局所的適用並びに外科スポンジ、バンド、
ガーゼパッド等の他局所適用がある。また、そのような
組成物は、身体損傷領域を洗浄するのに用いる灌注液へ
の伝達、カテーテル化等を包含する、皮下、静脈内およ
び腹腔内注射のようてな非経口法によっても投与でき
る。この炎症サイトカインの平均量は変化し得、特に、
権限ある医師または獣医の推奨および指示に従うべきで
ある。
【００９０】また、ポリクローナル抗体およびモノクロ
ーナル抗体の両方を包含する抗体、および本発明の炎症
サイトカインの産生および活性を調節する薬物はある種
の治療上の用途を有し得、炎症および発熱のような炎症
サイトカインの作用に起因する後感染の効果を処理する
目的で使用し得る。特に、本発明の炎症サイトカイン
は、例えば、融合させたマウスひ臓リンパ球細胞とミエ
ローマ細胞とを用いるハイブリドーマ技術のような公知
の方法により、種々の細胞培地中でそれ自体に対するポ
リクローナルおよびモノクローナル抗体の両方を産生さ
せるのに使用できる。
ーナル抗体の両方を包含する抗体、および本発明の炎症
サイトカインの産生および活性を調節する薬物はある種
の治療上の用途を有し得、炎症および発熱のような炎症
サイトカインの作用に起因する後感染の効果を処理する
目的で使用し得る。特に、本発明の炎症サイトカイン
は、例えば、融合させたマウスひ臓リンパ球細胞とミエ
ローマ細胞とを用いるハイブリドーマ技術のような公知
の方法により、種々の細胞培地中でそれ自体に対するポ
リクローナルおよびモノクローナル抗体の両方を産生さ
せるのに使用できる。
【００９１】ハイブリドーマによりモノクローナル抗体
を調製する一般的方法論は周知である。不死の抗体産生
性細胞系はまたＢ−リンパ球のオンコジーンＤＮＡによ
る直接形質転換またはエプスティン−バールウイルスに
よる形質転換のような融合以外の方法によっても作製で
きる。例えば、Ｍ．シュレイヤー等、“Hybridoma Tech
niques"（１９８０）；ハンマーリング等、“Monoclona
l Antibodies And T-cell Hybridomas" （１９８１）
“；ケネット等、“Monoclonal Antibodies"（１９８
０）を参照されたい。また、米国特許第4,341,761 号、
第4,399,121 号、第4,427,783 号、第4,444,887 号、第
4,451,570 号、第4,466,917 号、第4,472,500 号、第4,
491,632 号、第4,493,890 号も参照されたい。
を調製する一般的方法論は周知である。不死の抗体産生
性細胞系はまたＢ−リンパ球のオンコジーンＤＮＡによ
る直接形質転換またはエプスティン−バールウイルスに
よる形質転換のような融合以外の方法によっても作製で
きる。例えば、Ｍ．シュレイヤー等、“Hybridoma Tech
niques"（１９８０）；ハンマーリング等、“Monoclona
l Antibodies And T-cell Hybridomas" （１９８１）
“；ケネット等、“Monoclonal Antibodies"（１９８
０）を参照されたい。また、米国特許第4,341,761 号、
第4,399,121 号、第4,427,783 号、第4,444,887 号、第
4,451,570 号、第4,466,917 号、第4,472,500 号、第4,
491,632 号、第4,493,890 号も参照されたい。
【００９２】ＭＩＰ−２に対して産生させたモノクロー
ナルのパネルは、種々の性質、即ちアイソタイプ、エピ
トープ、アフィニティ等についてスクリーニングでき
る。特に興味あるのはＭＩＰ−２の活性を中和するモノ
クローナル抗体である。高アフィニティ抗体も天然また
は組換えＭＩＰ−２のイムノアフィニティ精製において
有用である。
ナルのパネルは、種々の性質、即ちアイソタイプ、エピ
トープ、アフィニティ等についてスクリーニングでき
る。特に興味あるのはＭＩＰ−２の活性を中和するモノ
クローナル抗体である。高アフィニティ抗体も天然また
は組換えＭＩＰ−２のイムノアフィニティ精製において
有用である。
【００９３】得られた抗体もまた適当な薬剤組成物に調
製して望ましくない状態を変化させ治療するのに投与で
きる。そのような薬剤組成物を使用するための正確な
量、投与間隔および投与方法は医療技術において公知の
事実に従ってまた権限ある医師または獣医師の特定の指
示に基づいて変化し得る。
製して望ましくない状態を変化させ治療するのに投与で
きる。そのような薬剤組成物を使用するための正確な
量、投与間隔および投与方法は医療技術において公知の
事実に従ってまた権限ある医師または獣医師の特定の指
示に基づいて変化し得る。
【００９４】本発明はまた侵入性刺激物の存在を、本発
明の炎症サイトカインが示す活性を誘起するその刺激物
の能力を参考にして検出する方法を包含する種々の診断
用途にも関する。前述したように、本発明の炎症サイト
カインは種々の公知方法にそれ自体に対しての抗体を産
生させるのに使用でき、そのような抗体はその後単離し
て凝しい哺乳動物宿主中の上記炎症サイトカインの存在
の試験におけるように使用できる。
明の炎症サイトカインが示す活性を誘起するその刺激物
の能力を参考にして検出する方法を包含する種々の診断
用途にも関する。前述したように、本発明の炎症サイト
カインは種々の公知方法にそれ自体に対しての抗体を産
生させるのに使用でき、そのような抗体はその後単離し
て凝しい哺乳動物宿主中の上記炎症サイトカインの存在
の試験におけるように使用できる。
【００９５】本発明の炎症サイトカインに対する抗体は
周知のハイブリドーマ技術を包含する標準方法によって
産生させ単離し得る。便宜上、本発明の炎症サイトカイ
ンに対する抗体はＡb1と称し、他の種で産生した抗体Ａ
b2と称する。
周知のハイブリドーマ技術を包含する標準方法によって
産生させ単離し得る。便宜上、本発明の炎症サイトカイ
ンに対する抗体はＡb1と称し、他の種で産生した抗体Ａ
b2と称する。
【００９６】哺乳動物における炎症サイトカイン活性の
存在はそのような測定に適用できる通常の免疫学的手順
により確認し得る。多くの有用な方法が公知である。特
に有用である３つのそのような方法は検出可能な標識で
標識した本発明の炎症サイトカイン、検出可能な標識で
標識した抗体Ａb1、または検出可能な標識で標識した抗
体Ａb2のいずれかを用いる。各方法は次の等式により要
約され、式中、星印は粒子を標識したことを示し、“Ｃ
yt”は炎症サイトカインを示す。
存在はそのような測定に適用できる通常の免疫学的手順
により確認し得る。多くの有用な方法が公知である。特
に有用である３つのそのような方法は検出可能な標識で
標識した本発明の炎症サイトカイン、検出可能な標識で
標識した抗体Ａb1、または検出可能な標識で標識した抗
体Ａb2のいずれかを用いる。各方法は次の等式により要
約され、式中、星印は粒子を標識したことを示し、“Ｃ
yt”は炎症サイトカインを示す。
【００９７】Ａ．Ｃyt* ＋ Ａb1 ＝ Ｃyt* Ａb1 Ｂ．Ｃyt ＋ Ａb * ＝ ＣytＡb1 * Ｃ．Ｃyt ＋ Ａb1 ＋ Ａb2 * ＝ＣytＡb1Ａb2 *
【００９８】これらの方法およびその応用は当業者にと
ってすべて馴みであり、従って、本発明の範囲内におい
て使用できる。“拮抗”法、即ち、方法Ａは米国特許第
3,654,090 号および第3,850,752 号に記載されている。
方法Ｃ即ち“サンドイッチ”法は米国特許第31,006号
（再発行）および第4,016,043 号に開示されている。
“２抗体”または“ＤＡＳＰ”法のような上記以外の他
の方法も公知である。各場合において、本発明の炎症サ
イトカインは１種以上の抗体または結合性パートナーと
の複合体を形成し、この複合体の１員を検出可能な標識
で標識する。複合体が形成したという事実および必要に
応じてのその量を標識の検出に適用できる公知の方法に
よって測定し得る。
ってすべて馴みであり、従って、本発明の範囲内におい
て使用できる。“拮抗”法、即ち、方法Ａは米国特許第
3,654,090 号および第3,850,752 号に記載されている。
方法Ｃ即ち“サンドイッチ”法は米国特許第31,006号
（再発行）および第4,016,043 号に開示されている。
“２抗体”または“ＤＡＳＰ”法のような上記以外の他
の方法も公知である。各場合において、本発明の炎症サ
イトカインは１種以上の抗体または結合性パートナーと
の複合体を形成し、この複合体の１員を検出可能な標識
で標識する。複合体が形成したという事実および必要に
応じてのその量を標識の検出に適用できる公知の方法に
よって測定し得る。
【００９９】上記から理解されるであろうことはＡb2の
特徴的性質はＡb1と反応するであろうということであ
る。何となれば、１つの哺乳動物種で産生したＡb1を抗
体Ａb2を産生するための抗原として他の種において使用
しているからである。例えばＡb2はウサギ抗体を抗原と
して用いてヤギ中で産生させ得る。従って、Ａb2はヤギ
中で産生させた抗ウサギ抗体である。これを説明し特許
請求する目的で、Ａb1を一次または抗炎症サイトカイン
抗体と称し、Ａb2は二次または抗−Ａb1抗体と称する。
特徴的性質はＡb1と反応するであろうということであ
る。何となれば、１つの哺乳動物種で産生したＡb1を抗
体Ａb2を産生するための抗原として他の種において使用
しているからである。例えばＡb2はウサギ抗体を抗原と
して用いてヤギ中で産生させ得る。従って、Ａb2はヤギ
中で産生させた抗ウサギ抗体である。これを説明し特許
請求する目的で、Ａb1を一次または抗炎症サイトカイン
抗体と称し、Ａb2は二次または抗−Ａb1抗体と称する。
【０１００】これらの試験において最も普通に用いられ
る標識は放射性元素、酵素、紫外線に暴露したとき蛍光
を発する化学的およびその他である。多くの蛍光物質は
公知であり標識として使用できる。これらには、例え
ば、フルオレスセイン、ローダミンおよびオーラミンが
ある。特に検出性の物質はヤギで調製しイソチオシアネ
ートを介してフルオレスセインでコンジゲートさせた抗
ウサギ抗体である。
る標識は放射性元素、酵素、紫外線に暴露したとき蛍光
を発する化学的およびその他である。多くの蛍光物質は
公知であり標識として使用できる。これらには、例え
ば、フルオレスセイン、ローダミンおよびオーラミンが
ある。特に検出性の物質はヤギで調製しイソチオシアネ
ートを介してフルオレスセインでコンジゲートさせた抗
ウサギ抗体である。
【０１０１】本発明の炎症サイトカインまたはその結合
性パートナーも放射性元素によりあるいは酵素により標
識できる。放射性標識は任意の商業的に入手できる計数
法により検出できる。好ましいアイソトープは14Ｃ,
131Ｉ, 3Ｈ， 125Ｉおよび35Ｓから選択できる。酵素
標識も同様に有用であり、現在使用されている熱量計、
分光測光法、蛍光測光法またはガス定量法のいずれかに
よって検出できる。酵素はカルボジイミド、ジイソシア
ネート、グルタルアルデヒド等の橋かけ分子との反応に
より使用する粒子にコンジュゲートさせる。これらの法
で使用できる多くの酵素は公知であり使用できる。好ま
しいのはパーオキシダーゼ、β−グルクロニナーゼ、β
−Ｄ−グルコシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ウ
リアーゼ、グルコースオキシダーゼ＋パーオキシダー
ゼ、およびアルカリ性ホスファターゼである。米国特許
第3,654,090 号、第3,850,752 号および第4,016,043 号
は別の標識物質および方法を開示している例として引用
する。
性パートナーも放射性元素によりあるいは酵素により標
識できる。放射性標識は任意の商業的に入手できる計数
法により検出できる。好ましいアイソトープは14Ｃ,
131Ｉ, 3Ｈ， 125Ｉおよび35Ｓから選択できる。酵素
標識も同様に有用であり、現在使用されている熱量計、
分光測光法、蛍光測光法またはガス定量法のいずれかに
よって検出できる。酵素はカルボジイミド、ジイソシア
ネート、グルタルアルデヒド等の橋かけ分子との反応に
より使用する粒子にコンジュゲートさせる。これらの法
で使用できる多くの酵素は公知であり使用できる。好ま
しいのはパーオキシダーゼ、β−グルクロニナーゼ、β
−Ｄ−グルコシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ウ
リアーゼ、グルコースオキシダーゼ＋パーオキシダー
ゼ、およびアルカリ性ホスファターゼである。米国特許
第3,654,090 号、第3,850,752 号および第4,016,043 号
は別の標識物質および方法を開示している例として引用
する。
【０１０２】本発明に従って開発し使用した特定のアッ
セイ系はレセプターアッセイとして公知である。レセプ
ターアッセイにおいては、アッセイすべき物質を適当に
標識し、次いで、ある種の細胞試験コロニーを一定量の
標識および未標識物質と共にインキュベートし、その
後、結合性試験を行って標識物質が細胞レセプターに結
合している度合を測定する。この方法において、物質間
のアフィニティの差異を確認できる。
セイ系はレセプターアッセイとして公知である。レセプ
ターアッセイにおいては、アッセイすべき物質を適当に
標識し、次いで、ある種の細胞試験コロニーを一定量の
標識および未標識物質と共にインキュベートし、その
後、結合性試験を行って標識物質が細胞レセプターに結
合している度合を測定する。この方法において、物質間
のアフィニティの差異を確認できる。
【０１０３】従って、精製量の本発明の炎症サイトカイ
ンを放射性標識し、その後、結合性試験を、例えば、最
新に分化した好中球を用いて実施できるであろう。次い
で、種々の量の標識および未標識の炎症サイトカインを
含有する溶液を調製し、次いで、細胞サンプルを接種
し、その後、インキュベートする。得られた細胞単一層
を洗浄し、溶解し、標識誤差を＜５％を得るに十分な時
間でガンマーカウンターで計数する。このデータをスカ
ッチャート（Scatchard)分析に供し、その後、物質活性
に関する観察および計算を行う。上記は例示であるけれ
ども、レセプターアッセイを実施し利用する態様を例示
しており、この場合、アッセイした物質の細胞結合能力
が著しい特徴として作用している。
ンを放射性標識し、その後、結合性試験を、例えば、最
新に分化した好中球を用いて実施できるであろう。次い
で、種々の量の標識および未標識の炎症サイトカインを
含有する溶液を調製し、次いで、細胞サンプルを接種
し、その後、インキュベートする。得られた細胞単一層
を洗浄し、溶解し、標識誤差を＜５％を得るに十分な時
間でガンマーカウンターで計数する。このデータをスカ
ッチャート（Scatchard)分析に供し、その後、物質活性
に関する観察および計算を行う。上記は例示であるけれ
ども、レセプターアッセイを実施し利用する態様を例示
しており、この場合、アッセイした物質の細胞結合能力
が著しい特徴として作用している。
【０１０４】本発明のさらなる実施態様においては、医
療スペシャリストによる使用に適する商業的試験キット
を調製して疑しい哺乳動物中の炎症サイトカインの存在
または不存在を測定できる。上述の試験方法によれば、
１つの分類のそのようなキットは少なくとも標識炎症サ
イトカインまたはその結合性パートナー、例えば、該サ
イトカインに対して特異的な抗体、および指示書（勿
論、使用する方法、例えば“拮抗”、“サンドイッ
チ”、“ＤＡＳＰ”等によるが）を含むであろう。キッ
トまたバッファー、安定剤等のような補助的な試剤も含
有し得る。
療スペシャリストによる使用に適する商業的試験キット
を調製して疑しい哺乳動物中の炎症サイトカインの存在
または不存在を測定できる。上述の試験方法によれば、
１つの分類のそのようなキットは少なくとも標識炎症サ
イトカインまたはその結合性パートナー、例えば、該サ
イトカインに対して特異的な抗体、および指示書（勿
論、使用する方法、例えば“拮抗”、“サンドイッ
チ”、“ＤＡＳＰ”等によるが）を含むであろう。キッ
トまたバッファー、安定剤等のような補助的な試剤も含
有し得る。
【０１０５】従って、試験キットは侵入性刺激物に対す
る哺乳動物宿主の反応の指示物として調製でき、次のも
のを含む。 (a) 本発明の炎症サイトカインまたはこのサイトカイン
に対して特異性の結合性パートナーを検出可能な標識に
対して直接または間接的に結合させて得られた所定量の
少なくとも１種の標識した免疫化学的に反応性の成分： (b) 他の試剤；および (c) 該キットの使用のための指示書。
る哺乳動物宿主の反応の指示物として調製でき、次のも
のを含む。 (a) 本発明の炎症サイトカインまたはこのサイトカイン
に対して特異性の結合性パートナーを検出可能な標識に
対して直接または間接的に結合させて得られた所定量の
少なくとも１種の標識した免疫化学的に反応性の成分： (b) 他の試剤；および (c) 該キットの使用のための指示書。
【０１０６】さらに詳細には、上記の診断用試験キット
は次のものを含み得る： (a) 一般に固相に結合してイムノソルベントを形成する
か、あるいは適当なタッグに結合した既知量の上述のよ
うな炎症サイトカイン（または結合性パートナー）また
は複数のそのような最終生成物等（またはそれらの結合
性パートナー）； (b) 必要に応じての、他の試剤；および (c) 該試験キットの使用のための指示書。
は次のものを含み得る： (a) 一般に固相に結合してイムノソルベントを形成する
か、あるいは適当なタッグに結合した既知量の上述のよ
うな炎症サイトカイン（または結合性パートナー）また
は複数のそのような最終生成物等（またはそれらの結合
性パートナー）； (b) 必要に応じての、他の試剤；および (c) 該試験キットの使用のための指示書。
【０１０７】さらなる変形においては、試験キットは上
述の目的において調製し使用でき、所定のプロトコール
（例えば、“拮抗”、“サンドイッチ”（“２抗体”
等）に従って操作し、次のものを含む： (a) 本発明の炎症サイトカインを検出可能に標識に結合
させることによって得られた標識成分； (b) 少なくとも１つの試剤がリガンドまたは固定リガン
ドであって、このリガンドは （ｉ）上記標識成分(a) と結合し得るリガンド； （ii）上記標識成分(a) の結合性パートナーと結合し得
るリガンド； (iii) 測定すべき成分(a) の少なくとも１つと結合し得
るリガンド；および （iv）測定すべき成分(a) の少なくとも１つの結合性パ
ートナーの少なくとも１つと結合し得るリガンド；から
なる群より選ばれる、１種以上の追加の免疫化学試剤；
および (c) 上記炎症サイトカインとその特異的結合性パートナ
ーとの免疫化学反応の１種以上の成分の検出および／ま
たは測定するためのプロトコールを行うための指示書。
述の目的において調製し使用でき、所定のプロトコール
（例えば、“拮抗”、“サンドイッチ”（“２抗体”
等）に従って操作し、次のものを含む： (a) 本発明の炎症サイトカインを検出可能に標識に結合
させることによって得られた標識成分； (b) 少なくとも１つの試剤がリガンドまたは固定リガン
ドであって、このリガンドは （ｉ）上記標識成分(a) と結合し得るリガンド； （ii）上記標識成分(a) の結合性パートナーと結合し得
るリガンド； (iii) 測定すべき成分(a) の少なくとも１つと結合し得
るリガンド；および （iv）測定すべき成分(a) の少なくとも１つの結合性パ
ートナーの少なくとも１つと結合し得るリガンド；から
なる群より選ばれる、１種以上の追加の免疫化学試剤；
および (c) 上記炎症サイトカインとその特異的結合性パートナ
ーとの免疫化学反応の１種以上の成分の検出および／ま
たは測定するためのプロトコールを行うための指示書。
【０１０８】上記によれば、本発明の炎症サイトカイン
の合成、放出または活性を調節するのに有効な可能性あ
る薬物をスクリーニングするアッセイ系を調製できる。
第１の方法においては、試験薬物を刺激マクロファージ
サンプルに投与し本発明の炎症サイトカイン産生に対す
る効果を測定する。別の方法においては、本発明の炎症
サイトカインを好中球のような細胞試験系に導入し、上
記薬物も得られた細胞培養物中に導入し、その後、培養
物を試験して上記薬物の添加に基づくか公知の炎症サイ
トカインの添加量の効果に基づく本発明の炎症サイトカ
インの活性の何らかの変化を観察し得る。
の合成、放出または活性を調節するのに有効な可能性あ
る薬物をスクリーニングするアッセイ系を調製できる。
第１の方法においては、試験薬物を刺激マクロファージ
サンプルに投与し本発明の炎症サイトカイン産生に対す
る効果を測定する。別の方法においては、本発明の炎症
サイトカインを好中球のような細胞試験系に導入し、上
記薬物も得られた細胞培養物中に導入し、その後、培養
物を試験して上記薬物の添加に基づくか公知の炎症サイ
トカインの添加量の効果に基づく本発明の炎症サイトカ
インの活性の何らかの変化を観察し得る。
【０１０９】以下の実施例は、本発明の炎症サイトカイ
ンの単離および同定、その活性に関しての観察、本発明
の炎症サイトカインと本出願人等および当該分野の他の
人々の両方により早期に同定された他の因子との活性の
差異と類似性両方の明確化、並びにサイトカインＭＩＰ
−２のクローニング、シーケンシングおよび発現を示す
ものである。当然のこととして、以下で述べる特定の材
料および方法は単に例示であり変化し得、従って、以下
は例示として提供され本発明を限定するものではない。
ンの単離および同定、その活性に関しての観察、本発明
の炎症サイトカインと本出願人等および当該分野の他の
人々の両方により早期に同定された他の因子との活性の
差異と類似性両方の明確化、並びにサイトカインＭＩＰ
−２のクローニング、シーケンシングおよび発現を示す
ものである。当然のこととして、以下で述べる特定の材
料および方法は単に例示であり変化し得、従って、以下
は例示として提供され本発明を限定するものではない。
【０１１０】実施例１ 以下の実験は本発明の炎症サイトカインを同定し特性決
定するために行った。先ずメディエータ物質を培養し、
炎症サイトカインを単離し、次いで、その構造を部分的
に決定し、その後、１群の試験をその活性を明らかに
し、また、可能な限り、他の公知のマクロファージ由来
因子との同一性を確立または明白にするために行った。
定するために行った。先ずメディエータ物質を培養し、
炎症サイトカインを単離し、次いで、その構造を部分的
に決定し、その後、１群の試験をその活性を明らかに
し、また、可能な限り、他の公知のマクロファージ由来
因子との同一性を確立または明白にするために行った。
【０１１１】材料および方法 材料 ハムスターまたはヒトgro遺伝子を含有するプラスミド
または対照プラスミド単独を移入しＣＯＳ細胞からの上
清はＡ．アニソビッツとＲ．サガーにより贈与された。
部分精製ヒトＮＡＰ−１たん白質はＪ．バンダーメから
贈与され、精製ヒトＮＡＰ−１たん白質はＴ．ヨシムラ
とＥ．レオナートにより贈与された。すべての他の試剤
はシグマ社（ミズリー州セントルイス）から入手した。
または対照プラスミド単独を移入しＣＯＳ細胞からの上
清はＡ．アニソビッツとＲ．サガーにより贈与された。
部分精製ヒトＮＡＰ−１たん白質はＪ．バンダーメから
贈与され、精製ヒトＮＡＰ−１たん白質はＴ．ヨシムラ
とＥ．レオナートにより贈与された。すべての他の試剤
はシグマ社（ミズリー州セントルイス）から入手した。
【０１１２】動物 Ｃ３Ｈ／ＨｅＨマウスはチャーレスリバー社（ニューヨ
ーク州キングストン）より入手した。エンドトキシン耐
性Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ株のマウスはジャクソンラボラトリー
ズ社（メイン州バルハーバー）より入手した。
ーク州キングストン）より入手した。エンドトキシン耐
性Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ株のマウスはジャクソンラボラトリー
ズ社（メイン州バルハーバー）より入手した。
【０１１３】細胞培養 マウスマクロファージ細胞系ＲＡＷ２６4.７およびカケ
クチン／ＴＮＦ感受性細胞系Ｌ９２９はアメリカンタイ
プカルチャーコレクション（メリーランド州ロックビ
ル）から入手し、それぞれ、ＲＰＭＩ１６４０およびダ
ルベッコ(Dulbecco's)の変性ＭＥＭ（ＤＭＥＭ）、ギブ
コ社、ニューヨーク州グランドアイランド）中に維持し
た。両培地には２０ｍＭのヘペス（Hepes)と１０％のウ
シ胎児血清（ハイクローン社、エタ州ローガン）を加え
た。刺激ＲＡＷ２６4.７上清の調製のために、各細胞を
１５０mm組織培養皿（ファルコン社）でＲＰＭＩ＋１０
％ウシ胎児血清中で集密状になるまで増殖させた。各細
胞をハンクの平衡塩溶液中で５回洗浄し、培地を１μg/
mlのリポポリサッカライド（ＬＰＳＷ．Ｅ．coli０１２
７；Ｂ８、ディフコ社、ミシガン州デトロイト）加無血
清ＲＰＭＩで置換した。各細胞は３７°Ｃで１６〜１８
時間インキュベートし、上清を0.２２μm フィルターで
濾過した。
クチン／ＴＮＦ感受性細胞系Ｌ９２９はアメリカンタイ
プカルチャーコレクション（メリーランド州ロックビ
ル）から入手し、それぞれ、ＲＰＭＩ１６４０およびダ
ルベッコ(Dulbecco's)の変性ＭＥＭ（ＤＭＥＭ）、ギブ
コ社、ニューヨーク州グランドアイランド）中に維持し
た。両培地には２０ｍＭのヘペス（Hepes)と１０％のウ
シ胎児血清（ハイクローン社、エタ州ローガン）を加え
た。刺激ＲＡＷ２６4.７上清の調製のために、各細胞を
１５０mm組織培養皿（ファルコン社）でＲＰＭＩ＋１０
％ウシ胎児血清中で集密状になるまで増殖させた。各細
胞をハンクの平衡塩溶液中で５回洗浄し、培地を１μg/
mlのリポポリサッカライド（ＬＰＳＷ．Ｅ．coli０１２
７；Ｂ８、ディフコ社、ミシガン州デトロイト）加無血
清ＲＰＭＩで置換した。各細胞は３７°Ｃで１６〜１８
時間インキュベートし、上清を0.２２μm フィルターで
濾過した。
【０１１４】ＭＩＰ−２の精製 ＭＩＰ−２をＭＩＰ−１について従来開示された方法論
〔Ｓ．Ｄ．ウォルペ、Ｇ．ダバテリス、Ｂ．シェリー、
Ｂ．ピュートレー、Ｄ．Ｇ．ヘッセ、Ｈ．Ｔ．ネガエ
ン、Ｌ．Ｌ．モルダウァー、Ｃ．Ｆ．ナサーン、Ｓ．
Ｆ．ローリー、およびＡ．セラミ（１９８８）、J. EX
P. MED., １６７：６７０−５８１〕を用いて精製し
た。精製度はドデシル硫酸ナトリウム（Na Dod SO4−PA
GE) により銀染色で追試した。要するに、エンドトキシ
ン刺激ＲＡＷ２６4.７細胞からの２リットルの状態調節
上清を濃縮し、２０ mＭトリス−ＨＣl バッファー、pH
8.0に対して透析濾過し、モノＱ１０／１０（アニオン
交換）カラム（ファルマシアＬＫＢバイオテクノロジー
社、ニュージャージー州ラーハイ）に適用した。９０％
以上のＭＩＰ−２がカラムに結合してないことを観察し
流出液中で回収した。
〔Ｓ．Ｄ．ウォルペ、Ｇ．ダバテリス、Ｂ．シェリー、
Ｂ．ピュートレー、Ｄ．Ｇ．ヘッセ、Ｈ．Ｔ．ネガエ
ン、Ｌ．Ｌ．モルダウァー、Ｃ．Ｆ．ナサーン、Ｓ．
Ｆ．ローリー、およびＡ．セラミ（１９８８）、J. EX
P. MED., １６７：６７０−５８１〕を用いて精製し
た。精製度はドデシル硫酸ナトリウム（Na Dod SO4−PA
GE) により銀染色で追試した。要するに、エンドトキシ
ン刺激ＲＡＷ２６4.７細胞からの２リットルの状態調節
上清を濃縮し、２０ mＭトリス−ＨＣl バッファー、pH
8.0に対して透析濾過し、モノＱ１０／１０（アニオン
交換）カラム（ファルマシアＬＫＢバイオテクノロジー
社、ニュージャージー州ラーハイ）に適用した。９０％
以上のＭＩＰ−２がカラムに結合してないことを観察し
流出液中で回収した。
【０１１５】ピークＭＩＰ−２含有フラクッションを２
０ mＭトリス−ＨＣl バッファー、pH 8.0で平衡させた
ヘパリン共役セファローズ（ファルマシアLKB)に適用
し、同じバッファー中で０〜２Ｍ NaCl直線状勾配で溶
出させた。ＭＩＰ−２は約0.７５Ｍ NaClで溶出した。
ピークフラクションを3,000 ダルトン分子量カットオフ
のセントリコン限外濾過装置（アミコン社、マサチュー
セッツ州デンバーズ）中で濃縮し、１００ mＭ酢酸アン
モニウムで平衡させたセファローズ１２〔ゲル濾過（フ
ァルマシアＬＫＢ）〕カラムに適用した。２リットルの
ＲＡＷ２６4.７状態調節培地（これは約１００mgの総た
ん白質に等しい）から、0.５mg量のＭＩＰ−２が、ウシ
ガンマーグロブリンを標準として用いてブラッドフォー
ドたん白質アッセイ（バイオラッド社、ニューヨーク州
ロックビレセンター）によって確認したとき、一般に単
離された。比較として、約２mgのＭＩＰ−１と１mgのカ
ケクチン／ＴＮＦが同じようなバッチの状態調節培地か
ら精製できた。
０ mＭトリス−ＨＣl バッファー、pH 8.0で平衡させた
ヘパリン共役セファローズ（ファルマシアLKB)に適用
し、同じバッファー中で０〜２Ｍ NaCl直線状勾配で溶
出させた。ＭＩＰ−２は約0.７５Ｍ NaClで溶出した。
ピークフラクションを3,000 ダルトン分子量カットオフ
のセントリコン限外濾過装置（アミコン社、マサチュー
セッツ州デンバーズ）中で濃縮し、１００ mＭ酢酸アン
モニウムで平衡させたセファローズ１２〔ゲル濾過（フ
ァルマシアＬＫＢ）〕カラムに適用した。２リットルの
ＲＡＷ２６4.７状態調節培地（これは約１００mgの総た
ん白質に等しい）から、0.５mg量のＭＩＰ−２が、ウシ
ガンマーグロブリンを標準として用いてブラッドフォー
ドたん白質アッセイ（バイオラッド社、ニューヨーク州
ロックビレセンター）によって確認したとき、一般に単
離された。比較として、約２mgのＭＩＰ−１と１mgのカ
ケクチン／ＴＮＦが同じようなバッチの状態調節培地か
ら精製できた。
【０１１６】イムノブロット分析 ＭＩＰ−２に対する抗血清を、完全フロイントアジュバ
ント中で乳化させた10μg の精製たん白質を１回、１ケ
月後不完全フロイントアジュバント中の10μgの精製た
ん白質を１回皮下注射したウサギ中で産生させた。抗血
清を第２回免疫の１週間後に収集した。約５０ngの純Ｍ
ＩＰ−２またはＮＡＰ−１たん白質、またはおよそ等量
の適当なベクターを移入したＣＯＳ細胞と無血清上清か
らのヒトまたはハムスターgroたん白質を１０〜１８％
直線状勾配ゲルでNa Dod SO4−PAGEに供し、トランスプ
ロット装置（バイオラッド社）を用いてニトロセルロー
ズに移した。各プロットは５％ドライミルク（アルファ
社）中で１〜２時間ブロックし１：１００に希釈した抗
血清中で１時間室温でインキュベートした。各プロット
を0.０５％のトウィーン２０と0.０５％のチメロサール
を含有するリン酸緩衝塩水中で３回洗浄し、結合抗体を
アルカリ性ホスホターゼコンジュゲート第２抗体（プロ
メガバイオテク社、ウィスコン州メジソン）で検出し
た。
ント中で乳化させた10μg の精製たん白質を１回、１ケ
月後不完全フロイントアジュバント中の10μgの精製た
ん白質を１回皮下注射したウサギ中で産生させた。抗血
清を第２回免疫の１週間後に収集した。約５０ngの純Ｍ
ＩＰ−２またはＮＡＰ−１たん白質、またはおよそ等量
の適当なベクターを移入したＣＯＳ細胞と無血清上清か
らのヒトまたはハムスターgroたん白質を１０〜１８％
直線状勾配ゲルでNa Dod SO4−PAGEに供し、トランスプ
ロット装置（バイオラッド社）を用いてニトロセルロー
ズに移した。各プロットは５％ドライミルク（アルファ
社）中で１〜２時間ブロックし１：１００に希釈した抗
血清中で１時間室温でインキュベートした。各プロット
を0.０５％のトウィーン２０と0.０５％のチメロサール
を含有するリン酸緩衝塩水中で３回洗浄し、結合抗体を
アルカリ性ホスホターゼコンジュゲート第２抗体（プロ
メガバイオテク社、ウィスコン州メジソン）で検出し
た。
【０１１７】ＰＭＮ走化性および活性化 走化性のアッセイを従来開示されたようにして行った
〔Ｓ．Ｄ．ウォルペ、G.タバテリス、Ｂ．シェリー、
Ｂ．ビュートレー、Ｄ．Ｇ．ヘッセ、Ｈ．Ｔ．ネガエ
ン、Ｌ．Ｌ．モルダウァー、Ｃ．Ｆ．ナサン、Ｓ．Ｆ．
ローリ、およびＡ．セラミ（１９８８）、J. EXP. ME
D., １６７；５７０−５８１〕。要するに、走化性は２
５μl の化学誘引物質〔 f Met−Leu −Phe (10
-8Ｍ）、ＭＩＰ−２またはバッファー２、ゲイ(Gey) の
平衡塩溶液、pH7.４および２％ＢＳＡ）〕を下部ウェル
に入れ、上部ウェルを４５μl の1.１×１０4 ＰＭＮ
（フィルコン−ハイパーグ密度勾配遠心およびデキスト
ランセジメンテーションにより単離した）含有バッファ
ーで満した。２つのウェルを３μＭポアサイズの硝酸セ
ルロース膜（ＳＭ１１３０２；サートリアスバランセス
社、ニューヨーク州ウェストバリー）で分離した。各チ
ャンバーを湿潤５％二酸化炭素、９５％周囲空気チャン
バー中で４５分間、３７°Ｃでインキュベートした。膜
を除き、染色し、ＰＭＮの膜へ移行した数を自動オプト
マックスイメージングシステム（オプトマックス社、ニ
ューハンプシャー州ホリス）を用いて１３０μＭまでの
１０μＭ毎に計数した。ランダムな移行も走化性の勾配
を上部および下部チャンバーにおいて等濃度を含有させ
ることによって消滅させる条件下で測定した。
〔Ｓ．Ｄ．ウォルペ、G.タバテリス、Ｂ．シェリー、
Ｂ．ビュートレー、Ｄ．Ｇ．ヘッセ、Ｈ．Ｔ．ネガエ
ン、Ｌ．Ｌ．モルダウァー、Ｃ．Ｆ．ナサン、Ｓ．Ｆ．
ローリ、およびＡ．セラミ（１９８８）、J. EXP. ME
D., １６７；５７０−５８１〕。要するに、走化性は２
５μl の化学誘引物質〔 f Met−Leu −Phe (10
-8Ｍ）、ＭＩＰ−２またはバッファー２、ゲイ(Gey) の
平衡塩溶液、pH7.４および２％ＢＳＡ）〕を下部ウェル
に入れ、上部ウェルを４５μl の1.１×１０4 ＰＭＮ
（フィルコン−ハイパーグ密度勾配遠心およびデキスト
ランセジメンテーションにより単離した）含有バッファ
ーで満した。２つのウェルを３μＭポアサイズの硝酸セ
ルロース膜（ＳＭ１１３０２；サートリアスバランセス
社、ニューヨーク州ウェストバリー）で分離した。各チ
ャンバーを湿潤５％二酸化炭素、９５％周囲空気チャン
バー中で４５分間、３７°Ｃでインキュベートした。膜
を除き、染色し、ＰＭＮの膜へ移行した数を自動オプト
マックスイメージングシステム（オプトマックス社、ニ
ューハンプシャー州ホリス）を用いて１３０μＭまでの
１０μＭ毎に計数した。ランダムな移行も走化性の勾配
を上部および下部チャンバーにおいて等濃度を含有させ
ることによって消滅させる条件下で測定した。
【０１１８】付着ＰＭＮからＨ2 Ｏ2 の放出を誘起する
ＭＩＰ−２の能力を従来開示されたようにしてアッセイ
した（Ｓ．Ｄ．ウォルベ、Ｇ．ダバデリス、Ｂ．シェリ
ー、B.ビュートレー、Ｄ．Ｇ．ヘッセ、Ｈ．Ｔ．ネガエ
ン、Ｌ．Ｌ．モルダワァー、Ｃ．Ｆ．ナサン、Ｓ．Ｆ．
ローリー、およびＡ．セラミ（１９８８）、J. EXP.ME
D., １６７；５７０−５８１）。
ＭＩＰ−２の能力を従来開示されたようにしてアッセイ
した（Ｓ．Ｄ．ウォルベ、Ｇ．ダバデリス、Ｂ．シェリ
ー、B.ビュートレー、Ｄ．Ｇ．ヘッセ、Ｈ．Ｔ．ネガエ
ン、Ｌ．Ｌ．モルダワァー、Ｃ．Ｆ．ナサン、Ｓ．Ｆ．
ローリー、およびＡ．セラミ（１９８８）、J. EXP.ME
D., １６７；５７０−５８１）。
【０１１９】結 果 ＭＩＰ−２の精製 銀染色 Na Dod SO4 − PAGE ゲルから判断したとき、９
０％以上のＭＩＰ−２がモノＱカラムの流出液中に残っ
た（第１図）。この一般精製工程は介在性ＭＩＰ−１お
よびカケクチン／ＴＮＦを除去するのに十分であった。
従来から示唆されたように（ウォルペ等、前出）、これ
ら２つのたん白質は上記の負荷条件下でモノＱカラムに
結合し約0.３７Ｍ NaCl で溶出する。ヘパリン−アフィ
ニティクロマトグラフとゲル濾過の２つの連続工程はＭ
ＩＰ−２たん白質を同質に精製するのに十分であった
（第１図）。ＭＩＰ−２はヘパリン−セファロースカラ
ムから約0.７５Ｍ NaCl で溶出しゲル濾過上で見掛け分
子量10,000ダルトンで浸透した。
０％以上のＭＩＰ−２がモノＱカラムの流出液中に残っ
た（第１図）。この一般精製工程は介在性ＭＩＰ−１お
よびカケクチン／ＴＮＦを除去するのに十分であった。
従来から示唆されたように（ウォルペ等、前出）、これ
ら２つのたん白質は上記の負荷条件下でモノＱカラムに
結合し約0.３７Ｍ NaCl で溶出する。ヘパリン−アフィ
ニティクロマトグラフとゲル濾過の２つの連続工程はＭ
ＩＰ−２たん白質を同質に精製するのに十分であった
（第１図）。ＭＩＰ−２はヘパリン−セファロースカラ
ムから約0.７５Ｍ NaCl で溶出しゲル濾過上で見掛け分
子量10,000ダルトンで浸透した。
【０１２０】精製ＭＩＰ−２の部分ＮＨ2 末端アミノ酸
配列データの分析は特異な配列を明らかにした。ｄ−Ｆ
ＡＳＴ−Ｐプログラム〔Ｄ．Ｊ．リップマンおよびＷ．
Ｒ．パーソン（１９８５）、SCIENCE.２２７：１４３５
−１４４１〕を用いるディホフ（Dayhoff)バンク中に存
在する他の配列との比較は血小板因子４に対しての配列
相関性を有するたん白質群に対しての類似性を明らかに
した。第２図はＭＩＰ−２の部分ＮＨ2 末端アミノ酸配
列および一定に保有されたシステイン残基により配列さ
れたこの群の種々の構成員を示す。第３図はＭＩＰ−２
で得た部分アミノ酸配列に相応する領域上での％配列同
一性の比較を示す。ＭＩＰ−２に対して観察された最も
近い関係はgro遺伝子産生物の予想アミノ酸配列におい
てであった。ＭＩＰ−２配列はヒトgroと６2.５％同一
性であり、ハムスターgroと６8.７％の同一性であっ
た。この関係は単一塩基変化に由来し得るアミノ酸変化
を考慮したとき両ケースにおいて８８％まで増大する。
配列データの分析は特異な配列を明らかにした。ｄ−Ｆ
ＡＳＴ−Ｐプログラム〔Ｄ．Ｊ．リップマンおよびＷ．
Ｒ．パーソン（１９８５）、SCIENCE.２２７：１４３５
−１４４１〕を用いるディホフ（Dayhoff)バンク中に存
在する他の配列との比較は血小板因子４に対しての配列
相関性を有するたん白質群に対しての類似性を明らかに
した。第２図はＭＩＰ−２の部分ＮＨ2 末端アミノ酸配
列および一定に保有されたシステイン残基により配列さ
れたこの群の種々の構成員を示す。第３図はＭＩＰ−２
で得た部分アミノ酸配列に相応する領域上での％配列同
一性の比較を示す。ＭＩＰ−２に対して観察された最も
近い関係はgro遺伝子産生物の予想アミノ酸配列におい
てであった。ＭＩＰ−２配列はヒトgroと６2.５％同一
性であり、ハムスターgroと６8.７％の同一性であっ
た。この関係は単一塩基変化に由来し得るアミノ酸変化
を考慮したとき両ケースにおいて８８％まで増大する。
【０１２１】ＭＩＰ−２とgro間のアミノ酸配列の類似
性はＭＩＰ−２がマウス等価性のgro等価性のgroであり
得ることを示唆した。しかしながら、予想マウスＫＣ遺
伝子産生物（“ＫＣ”）は、ＭＩＰ−２の部分配列と同
じ領域で比較したとき、より近い関係（ＫＣにおいては
ヒトgroに対して６5.６％の同一およびハムスターに対
して８1.２％の同一性、一方、ＭＩＰ−２においてはそ
れぞれ、６2.５％と６8.７％）を示した。同様の結果は
比較を完全配列において行ったときにも得られた。ＫＣ
はヒトgroに対して６８％の同一性でありハムスターgro
に対して８５％の同一性であった。ヒトおよびハムスタ
ーgroは互いにそれらの完全配列で比較したとき６８％
の同一性であった。
性はＭＩＰ−２がマウス等価性のgro等価性のgroであり
得ることを示唆した。しかしながら、予想マウスＫＣ遺
伝子産生物（“ＫＣ”）は、ＭＩＰ−２の部分配列と同
じ領域で比較したとき、より近い関係（ＫＣにおいては
ヒトgroに対して６5.６％の同一およびハムスターに対
して８1.２％の同一性、一方、ＭＩＰ−２においてはそ
れぞれ、６2.５％と６8.７％）を示した。同様の結果は
比較を完全配列において行ったときにも得られた。ＫＣ
はヒトgroに対して６８％の同一性でありハムスターgro
に対して８５％の同一性であった。ヒトおよびハムスタ
ーgroは互いにそれらの完全配列で比較したとき６８％
の同一性であった。
【０１２２】イムノブロット分析 ＭＩＰ-2と血小板因子４群の他の構成員との関係をさら
に特徴付するために、ウサギポリクローナル抗血清をＭ
ＩＰ−２に対して産生させた。この抗血清はエンドトキ
シン刺激ＰＡＷ２６4.７細胞またはチオグリコレート誘
起マウスマクロファーシからの無血清上清に対してモノ
特異的に反応したが非刺激細胞からの上清中のいかなる
たん白質も認識しなかった。ＭＩＰ−２に対する抗体に
よるそのようなプロットの例は第４図のａおよびｂ部に
示している。前免疫血清も反応性を示さなかった。特
に、ＭＩＰ−２に対する抗血清はＭＩＰ−１またはカケ
クチン／ＴＮＦと交差反応しなかった（例えば、第４図
のレーン２参照）。ウサギ抗−ＭＩＰ−２はヒトおよび
ハムスターgroと弱く交差反応したが精製ヒトＮＡＰ−
１たん白質とは交差反応しなかった（第４図）。同様
に、他の研究室からの部分精製ヒトＮＡＰ−１（Ｊ．バ
ンダーメより供給された）との交差反応は見られなかっ
た。さらに、ヒトミエロ単球細胞系ＨＬ６０は１０-7Ｍ
ホルボールミリスチル酸による刺激後交差反応性たん白
質を分泌し、抗ＭＩＰ−２抗体とヒトＮＡＰ−１たん白
質との反応性の欠如は種特異性よりはむしろ免疫学的相
関を欠くことに基づいていることをさらに示唆した。Ｈ
Ｌ６０細胞からの交差反応性物質の性質は研究中であ
る。
に特徴付するために、ウサギポリクローナル抗血清をＭ
ＩＰ−２に対して産生させた。この抗血清はエンドトキ
シン刺激ＰＡＷ２６4.７細胞またはチオグリコレート誘
起マウスマクロファーシからの無血清上清に対してモノ
特異的に反応したが非刺激細胞からの上清中のいかなる
たん白質も認識しなかった。ＭＩＰ−２に対する抗体に
よるそのようなプロットの例は第４図のａおよびｂ部に
示している。前免疫血清も反応性を示さなかった。特
に、ＭＩＰ−２に対する抗血清はＭＩＰ−１またはカケ
クチン／ＴＮＦと交差反応しなかった（例えば、第４図
のレーン２参照）。ウサギ抗−ＭＩＰ−２はヒトおよび
ハムスターgroと弱く交差反応したが精製ヒトＮＡＰ−
１たん白質とは交差反応しなかった（第４図）。同様
に、他の研究室からの部分精製ヒトＮＡＰ−１（Ｊ．バ
ンダーメより供給された）との交差反応は見られなかっ
た。さらに、ヒトミエロ単球細胞系ＨＬ６０は１０-7Ｍ
ホルボールミリスチル酸による刺激後交差反応性たん白
質を分泌し、抗ＭＩＰ−２抗体とヒトＮＡＰ−１たん白
質との反応性の欠如は種特異性よりはむしろ免疫学的相
関を欠くことに基づいていることをさらに示唆した。Ｈ
Ｌ６０細胞からの交差反応性物質の性質は研究中であ
る。
【０１２３】ＰＭＮ走化性および活性化 ＰF4群の構成員はＰＭＮに対して走化性でありまたＰＭ
Ｎを活性化するので、ＭＩＰ−２のこれら細胞上での効
果を試験した。ＭＩＰ−２は１０ng／mlでヒトＰＭＮに
対して著しく走化性であり、また１００ng／ml以上の濃
度で f Met-Leu−Phe よりもＰＭＮに対してより走化性
であった（第５図）。等濃度のＭＩＰ−２を膜の両面に
加えたときは、浸透の増大は見られなかった。即ち、試
験した濃度でのＭＩＰ−２の活性はランダム浸透の促進
よりはむしろ細胞の特異的浸透の刺激に基づいているよ
うである。
Ｎを活性化するので、ＭＩＰ−２のこれら細胞上での効
果を試験した。ＭＩＰ−２は１０ng／mlでヒトＰＭＮに
対して著しく走化性であり、また１００ng／ml以上の濃
度で f Met-Leu−Phe よりもＰＭＮに対してより走化性
であった（第５図）。等濃度のＭＩＰ−２を膜の両面に
加えたときは、浸透の増大は見られなかった。即ち、試
験した濃度でのＭＩＰ−２の活性はランダム浸透の促進
よりはむしろ細胞の特異的浸透の刺激に基づいているよ
うである。
【０１２４】ＰＭＮはml当り１０ng〜１μg 範囲のＭＩ
Ｐ−２濃度で処理したとき酸化破壊（過酸化水素の発生
により測定したとき）を受けなかった。これらのインビ
トロアッセイに加えて、ＭＩＰ−２をエンドトキシン耐
性Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスのフットパッドに１００ng注入
することによりインビボで試験した。この注入はＭＩＰ
−１において従来示唆されたのと同様な強度の白血球浸
潤を誘起した。
Ｐ−２濃度で処理したとき酸化破壊（過酸化水素の発生
により測定したとき）を受けなかった。これらのインビ
トロアッセイに加えて、ＭＩＰ−２をエンドトキシン耐
性Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスのフットパッドに１００ng注入
することによりインビボで試験した。この注入はＭＩＰ
−１において従来示唆されたのと同様な強度の白血球浸
潤を誘起した。
【０１２５】検討 ＭＩＰ−２は Na Dod SO4 −PAGB上で約6,000 ダルトン
の分子量を有し、ゲル濾過カラムから約10,000の見掛け
分子量を有して分画する。ＭＩＰ−１はまたカケクチン
／ＴＮＦと対照的に、ＭＩＰ−２はカチオン性であり、
pH 8.0に平衡させたアニオン交換カラムに結合しない。
この性質はこれら活性の分離とその後のＭＩＰ−２の精
製を簡単にした。介在性たん白質の大部分をアニオン交
換で除去したのち、ＭＩＰ−２は順次の約0.７５Ｍ NaC
l で溶出するヘパリンアフィニティクロマトグラフとゲ
ル濾過により均質に精製した。
の分子量を有し、ゲル濾過カラムから約10,000の見掛け
分子量を有して分画する。ＭＩＰ−１はまたカケクチン
／ＴＮＦと対照的に、ＭＩＰ−２はカチオン性であり、
pH 8.0に平衡させたアニオン交換カラムに結合しない。
この性質はこれら活性の分離とその後のＭＩＰ−２の精
製を簡単にした。介在性たん白質の大部分をアニオン交
換で除去したのち、ＭＩＰ−２は順次の約0.７５Ｍ NaC
l で溶出するヘパリンアフィニティクロマトグラフとゲ
ル濾過により均質に精製した。
【０１２６】ＭＩＰ−２は極めて活性な走化性であるが
試験した投与量では化学運動活性を殆んどまたは全く誘
起しない。１０ng／ml（1.７×１０-9Ｍ）で、ＭＩＰ−
２はヒトＰＭＮ類に対して著しく走化性であり、１００
ng／ml（1.７×１０-8Ｍ）以上の濃度で、ＭＩＰ−２は
最適濃度１０-8Ｍでの f Met−Leu −Phe よりも高い白
血球指数を示す。各試験はＭＩＰ−２がβ−グルクロニ
ダーゼでなくリソザイムの放出によるＰＭＮの脱顆粒も
誘起し得る。しかしながら、マウスＭＩＰ−２はヒトＰ
ＭＮ中で呼吸破壊を誘起しなかった。このことが種特異
性に基づくかあるいは分子固有の性質に基づくかはまだ
明らかでない。
試験した投与量では化学運動活性を殆んどまたは全く誘
起しない。１０ng／ml（1.７×１０-9Ｍ）で、ＭＩＰ−
２はヒトＰＭＮ類に対して著しく走化性であり、１００
ng／ml（1.７×１０-8Ｍ）以上の濃度で、ＭＩＰ−２は
最適濃度１０-8Ｍでの f Met−Leu −Phe よりも高い白
血球指数を示す。各試験はＭＩＰ−２がβ−グルクロニ
ダーゼでなくリソザイムの放出によるＰＭＮの脱顆粒も
誘起し得る。しかしながら、マウスＭＩＰ−２はヒトＰ
ＭＮ中で呼吸破壊を誘起しなかった。このことが種特異
性に基づくかあるいは分子固有の性質に基づくかはまだ
明らかでない。
【０１２７】ＰＭＮ上の上記の効果は多くの研究者によ
るまた種々の次のように称される各ヒト単核細胞から単
離されたたん白質でなされた観察と同様である： “３
１０Ｃ”、“ＭＤＮＣＦ”、“ＭＯＮＡＰ”、“ＮＡ
Ｆ”、または“ＧＣＰ”〔シュミット Ｊ．およびウェ
イスマンＣ．（１９８７）、Ｊ．ＩＭＭＵＮ．１３９：
２５０−２５６；ヨシムラＴ., マツシタＫ., オッペ
ンハイムＪ．Ｊ., およびレオナードＥ．Ｊ．（１９８
７）：Ｊ．ＩＭＭＵＮ．１３９：７８８−７９３；ヨシ
ムラＴ., マツシタＫ., タナカＳ., ロビンソンＥ．
Ａ., アッペラＥ., オッペンハイムＪ．Ｊ., および
レオナードＥ．Ｊ．（１９８７）、PROC.NATL. ACAD. S
CI. USA ８４：９２３−９２３７；シュローダーＪ．
Ｍ.,モロヴィツＵ．モリタＥ., およびクリストファー
ズＥ.(１９８７）、Ｊ．ＩＭＭＵＮ．１３９：３４７４
−３４８３；ウォルツＡ., ペベリＰ., アシュアー
Ｈ.,およびバギオリニＭ．（１９８７）、BIOCH. BIOPH
YS. RES. COMM.１４９：７５５−７６１；ペベリＰ.,
ウォルツＡ., デウォルドＢ．およびバッギオニリＭ．
（１９８８），Ｊ．Exp. Med. １６７：１５４７−１５
５９；バンダーメＪ．ピーメンＪ．Ｖ., オッペンネッ
カーＧ．およびビリュアＡ．（１９８８）、J.Exp. Me
d. １６７：１３６４−１３７６〕
るまた種々の次のように称される各ヒト単核細胞から単
離されたたん白質でなされた観察と同様である： “３
１０Ｃ”、“ＭＤＮＣＦ”、“ＭＯＮＡＰ”、“ＮＡ
Ｆ”、または“ＧＣＰ”〔シュミット Ｊ．およびウェ
イスマンＣ．（１９８７）、Ｊ．ＩＭＭＵＮ．１３９：
２５０−２５６；ヨシムラＴ., マツシタＫ., オッペ
ンハイムＪ．Ｊ., およびレオナードＥ．Ｊ．（１９８
７）：Ｊ．ＩＭＭＵＮ．１３９：７８８−７９３；ヨシ
ムラＴ., マツシタＫ., タナカＳ., ロビンソンＥ．
Ａ., アッペラＥ., オッペンハイムＪ．Ｊ., および
レオナードＥ．Ｊ．（１９８７）、PROC.NATL. ACAD. S
CI. USA ８４：９２３−９２３７；シュローダーＪ．
Ｍ.,モロヴィツＵ．モリタＥ., およびクリストファー
ズＥ.(１９８７）、Ｊ．ＩＭＭＵＮ．１３９：３４７４
−３４８３；ウォルツＡ., ペベリＰ., アシュアー
Ｈ.,およびバギオリニＭ．（１９８７）、BIOCH. BIOPH
YS. RES. COMM.１４９：７５５−７６１；ペベリＰ.,
ウォルツＡ., デウォルドＢ．およびバッギオニリＭ．
（１９８８），Ｊ．Exp. Med. １６７：１５４７−１５
５９；バンダーメＪ．ピーメンＪ．Ｖ., オッペンネッ
カーＧ．およびビリュアＡ．（１９８８）、J.Exp. Me
d. １６７：１３６４−１３７６〕
【０１２８】このたん白質は“好中球活性化たん白質−
１”（ＮＡＰ−１）として現在公知である、ＭＩＰ−２
とＮＡＰ−１の性質の直接的な類似性の故に、ＭＩＰ−
２はＮＡＰ−１のマウス等価物であり得る可能性が考慮
された。この関係は配列と免疫学的分析の両方に基づい
た場合ではないようである。ＦＡＳＴＰプログラムを用
いたＰＦ−４群とＭＩＰ−２とのＮ末端配列との比較は
ＮＡＰ−１と４７％の同一性を示すがヒトおよびハムス
ターgroとはそれぞれ６３％と６９％の同一性を示す。
この関係はイムノブロットの結果と良く一致しており、
イムノブロットの結果はハムスターおよびヒトgroとは
交差反応性を示すが２つの異なる研究室からのＮＡＰ−
１とは交差反応を示さなかった。
１”（ＮＡＰ−１）として現在公知である、ＭＩＰ−２
とＮＡＰ−１の性質の直接的な類似性の故に、ＭＩＰ−
２はＮＡＰ−１のマウス等価物であり得る可能性が考慮
された。この関係は配列と免疫学的分析の両方に基づい
た場合ではないようである。ＦＡＳＴＰプログラムを用
いたＰＦ−４群とＭＩＰ−２とのＮ末端配列との比較は
ＮＡＰ−１と４７％の同一性を示すがヒトおよびハムス
ターgroとはそれぞれ６３％と６９％の同一性を示す。
この関係はイムノブロットの結果と良く一致しており、
イムノブロットの結果はハムスターおよびヒトgroとは
交差反応性を示すが２つの異なる研究室からのＮＡＰ−
１とは交差反応を示さなかった。
【０１２９】また、ＭＩＰ−２はgroのマウス等価物で
あるようではない、何故ならば、予想したマウスＫＣ遺
伝子産生物はgroに対して特にハムスターgroの場合にお
いて幾分高い配列同一性を示すからである。従って、本
出願人等はＭＩＰ−２はgroまたはＫＣと近く相関する
がこれらとは離れた新規な遺伝子産生物であると結論付
した。
あるようではない、何故ならば、予想したマウスＫＣ遺
伝子産生物はgroに対して特にハムスターgroの場合にお
いて幾分高い配列同一性を示すからである。従って、本
出願人等はＭＩＰ−２はgroまたはＫＣと近く相関する
がこれらとは離れた新規な遺伝子産生物であると結論付
した。
【０１３０】興味あるのはgroおよびＫＣ遺伝子は夫々
細胞増殖の制御について研究中に見い出されたというこ
とである。gro遺伝子は形質転換細胞からのＤＮＡの差
別ハイブリッド化により単離し〔アニソウィッツＡ.,
バードウェルＬ.,およびサガーＲ（１９８７），PROC.
NATL. ACAD. SCI. USA ８４：７１８８−７１９２〕；
ＫＣ遺伝子は血小板由来成長因子で処理した細胞からの
差別ハイブリッド化により単離した〔コックランＢ．
Ｈ., レッフェルＡ．Ｃ. およびスチレン C. D.（１９
８３），ＣＥＬＬ３３：９３９−９４７〕。しかしなが
ら、gro遺伝子による細胞の移入は形質転換に導びかな
かった〔アニソウィッツＡ., バードウェルＬ．および
サガーＲ（１９８７），PROC. NATL. ACAD. SCI. USA
８４：７１８８−７１９２〕。同様に、ＭＩＰ−２また
はＭＩＰ−１＋制限量の血清または血漿による密度抑制
型３Ｔ３繊維芽球の処理も 3Ｈチミジンの取り込みを増
大させなかった。
細胞増殖の制御について研究中に見い出されたというこ
とである。gro遺伝子は形質転換細胞からのＤＮＡの差
別ハイブリッド化により単離し〔アニソウィッツＡ.,
バードウェルＬ.,およびサガーＲ（１９８７），PROC.
NATL. ACAD. SCI. USA ８４：７１８８−７１９２〕；
ＫＣ遺伝子は血小板由来成長因子で処理した細胞からの
差別ハイブリッド化により単離した〔コックランＢ．
Ｈ., レッフェルＡ．Ｃ. およびスチレン C. D.（１９
８３），ＣＥＬＬ３３：９３９−９４７〕。しかしなが
ら、gro遺伝子による細胞の移入は形質転換に導びかな
かった〔アニソウィッツＡ., バードウェルＬ．および
サガーＲ（１９８７），PROC. NATL. ACAD. SCI. USA
８４：７１８８−７１９２〕。同様に、ＭＩＰ−２また
はＭＩＰ−１＋制限量の血清または血漿による密度抑制
型３Ｔ３繊維芽球の処理も 3Ｈチミジンの取り込みを増
大させなかった。
【０１３１】実施例２ 以下はＭＩＰ−２のクローニングと発現を示す。マウス
ＭＩＰ−２のｃＤＮＡのクローニングは次のようであっ
た。ＭＩＰ−２の部分ＮＨ2 末端配列のアミノ酸９〜１
４に相応する縮重オリゴヌクレオチドプローブプールを
合成した。この部分配列の部分は残りの配列と比較した
ときそのより小さいコドン縮退性故に選択した。得られ
たプローブは長さにおいてオリゴマー１７ヌクレオチド
の１２８倍の縮重プールであった。
ＭＩＰ−２のｃＤＮＡのクローニングは次のようであっ
た。ＭＩＰ−２の部分ＮＨ2 末端配列のアミノ酸９〜１
４に相応する縮重オリゴヌクレオチドプローブプールを
合成した。この部分配列の部分は残りの配列と比較した
ときそのより小さいコドン縮退性故に選択した。得られ
たプローブは長さにおいてオリゴマー１７ヌクレオチド
の１２８倍の縮重プールであった。
【０１３２】ｃＤＮＡライブラリーは、ダバテリス等、
J. EXP. MED.１６７：１９３９−１９４１（１９８８）
およびシェーリー等、J. EXP. MED.１６８：２２５１−
２２５９（１９８８）において教示しているようなＥ．
coli リポポリサッカライド刺激ＲＡＷ２６4.７細胞か
ら単離した。塗布ライブラリーの複数ニトロセルロース
フィルターリフト（５×１０5 プラーグ）を４２°Ｃで
５×ＳＳＣ、１×デンハート２０mmリン酸ナトリウムバ
ッファー、pH 6.5、５０％ホルマミド、１０％硫酸デキ
ストラン、0.１％ＳＤＳ，0.１mg／ml音波処理サケ精子
ＤＮＡおよび５×１０6 cpm／ml／32Ｐ−ＡＴＰ５′末
端標識合成オリゴヌクレオチドプローブプール縮退中で
ハイブリッド化した。ハイブリッド化の後、各フィルタ
ーをウッド等、PROC. NATL. ACAD. SCI. USA ８２：１
５８５（１９８５）に記載されたＴＭＡＣ洗浄手順を用
いて洗浄した。複製フィルター上で陽性であったプラー
グを第２ラウンドの低密度塗布およびスクリーニングに
供した。４つの独立の陽性ファージクローンを単離し、
これらクローンよりＤＮＡをさらなる分析のために調製
した。ｃＤＮＡ挿入物はＥcoＲＩによる消化により除去
し、Ｍ１３ファージベクターにサブクローン化した。Ｄ
ＮＡシーケンシングはサンガー等、PROC. NATL. ACAD.
SCI. USA ７４：５４６３（１９７７）のジジオキシ鎖
終結法により行った。挿入物の１つのヌクレオチド配列
を決定し、精製天然ＭＩＰ−２のアミノ末端シーケンシ
ングから決定したアミノ酸配列を含む分泌型たん白質を
コードしていることを見い出した。上記ｃＤＮＡクロー
ンの配列および予想たん白質配列は第７図に示す。
J. EXP. MED.１６７：１９３９−１９４１（１９８８）
およびシェーリー等、J. EXP. MED.１６８：２２５１−
２２５９（１９８８）において教示しているようなＥ．
coli リポポリサッカライド刺激ＲＡＷ２６4.７細胞か
ら単離した。塗布ライブラリーの複数ニトロセルロース
フィルターリフト（５×１０5 プラーグ）を４２°Ｃで
５×ＳＳＣ、１×デンハート２０mmリン酸ナトリウムバ
ッファー、pH 6.5、５０％ホルマミド、１０％硫酸デキ
ストラン、0.１％ＳＤＳ，0.１mg／ml音波処理サケ精子
ＤＮＡおよび５×１０6 cpm／ml／32Ｐ−ＡＴＰ５′末
端標識合成オリゴヌクレオチドプローブプール縮退中で
ハイブリッド化した。ハイブリッド化の後、各フィルタ
ーをウッド等、PROC. NATL. ACAD. SCI. USA ８２：１
５８５（１９８５）に記載されたＴＭＡＣ洗浄手順を用
いて洗浄した。複製フィルター上で陽性であったプラー
グを第２ラウンドの低密度塗布およびスクリーニングに
供した。４つの独立の陽性ファージクローンを単離し、
これらクローンよりＤＮＡをさらなる分析のために調製
した。ｃＤＮＡ挿入物はＥcoＲＩによる消化により除去
し、Ｍ１３ファージベクターにサブクローン化した。Ｄ
ＮＡシーケンシングはサンガー等、PROC. NATL. ACAD.
SCI. USA ７４：５４６３（１９７７）のジジオキシ鎖
終結法により行った。挿入物の１つのヌクレオチド配列
を決定し、精製天然ＭＩＰ−２のアミノ末端シーケンシ
ングから決定したアミノ酸配列を含む分泌型たん白質を
コードしていることを見い出した。上記ｃＤＮＡクロー
ンの配列および予想たん白質配列は第７図に示す。
【０１３３】発現プラスミドＰＹＭＩＰ４００の構築 このプラスミドはＭＩＰ−２の成熟コード配列に結合し
たα因子リーダーをコードする。ＭＩＰ−２成熟コード
配列は上記で決定したＭＩＰ−２ｃＤＮＡに由来した。
ＧＡＰＤＨプロモーター配列、α因子リーダー配列およ
びα因子転写ターミネーターはプラスミドｐＧＡＩ１に
由来しており、その構築は１９８９年７月１９日付で公
開されたヨーロッパ特許公開第324,274 号に記載されて
おり、その記載は参考として本明細書に引用する。Ｂgl
II 部位はインビトロ変異形成によりＭＩＰ-2のカルボ
キシ末端をコードするヌクレオチド配列に導入して発現
ベクターへのクローニングを容易にした。変異性プライ
マーは次のようであった：
たα因子リーダーをコードする。ＭＩＰ−２成熟コード
配列は上記で決定したＭＩＰ−２ｃＤＮＡに由来した。
ＧＡＰＤＨプロモーター配列、α因子リーダー配列およ
びα因子転写ターミネーターはプラスミドｐＧＡＩ１に
由来しており、その構築は１９８９年７月１９日付で公
開されたヨーロッパ特許公開第324,274 号に記載されて
おり、その記載は参考として本明細書に引用する。Ｂgl
II 部位はインビトロ変異形成によりＭＩＰ-2のカルボ
キシ末端をコードするヌクレオチド配列に導入して発現
ベクターへのクローニングを容易にした。変異性プライ
マーは次のようであった：
【０１３４】
【０１３５】上記変形ｃＤＮＡ配列の確認後、ファージ
ＲＦを調製しＢgl IおよびＢgl IIで消化した。成熟Ｍ
ＩＰ−２の殆んどをコードする１９６６bpフラグメント
（２個のＮ末端および９個のｅ末端アミノ酸を欠落す
る）を単離した。１９８９年７月１９日付で公開された
ヨーロッパ特許公開第324,274 号に記載されたプラスミ
ドｐＧＡＩ1 をＫpm I で消化し次のアダプターに結合
させた。このアダプターは３個のα因子リーダーカルボ
キシ末端アミノ酸、Ｌys Ａrg加工部位および成熟ＭＩ
Ｐ−２の最初の３個のアミノ酸をコードしている。
ＲＦを調製しＢgl IおよびＢgl IIで消化した。成熟Ｍ
ＩＰ−２の殆んどをコードする１９６６bpフラグメント
（２個のＮ末端および９個のｅ末端アミノ酸を欠落す
る）を単離した。１９８９年７月１９日付で公開された
ヨーロッパ特許公開第324,274 号に記載されたプラスミ
ドｐＧＡＩ1 をＫpm I で消化し次のアダプターに結合
させた。このアダプターは３個のα因子リーダーカルボ
キシ末端アミノ酸、Ｌys Ａrg加工部位および成熟ＭＩ
Ｐ−２の最初の３個のアミノ酸をコードしている。
【０１３６】 ＫpnＩ−ＢalＩアダプター ５′ CCTTGGATAAAAGAGCTGTTGTGG ３′ ３′CATGGGAACCTATTTTCTCGACAACACC ５′
【０１３７】ＳalＩによる消化に続いて、次のＢgl II
−ＳalＩアダプターを加えた。このアダプターはＭＩＰ
−２の８個のカルボキシ末端アミノ酸と翻訳停止コドン
をコードしている。
−ＳalＩアダプターを加えた。このアダプターはＭＩＰ
−２の８個のカルボキシ末端アミノ酸と翻訳停止コドン
をコードしている。
【０１３８】 Ｂgl II − ＳalＩ アダプター ５′GATCTTGAACAAAGGCAAGGCTAACTGATAGCGTCG ５′ ３′ AACTTGTTTCCGTTCCGATTGACTATCGCAGCAGCT ３′
【０１３９】上記の修飾ベクターはゲル精製し上記の１
９６６bp ＢalＩ−Ｂgl II フラグメントに結合させ、
その後、プラスミドｐＭＩＰ４００を単離するためのス
クリーニングを行う。次いで、プラスミドを単離し、各
アダプターと交差するそのヌクレオチド配列を確認し、
その後、このプラスミドからのＢamＨＩ発現カセットを
単離しｐＡＢ２４のＢamＨＩ中にクローニングして発現
プラスミドｐＹＭＩＰ４００を得る。
９６６bp ＢalＩ−Ｂgl II フラグメントに結合させ、
その後、プラスミドｐＭＩＰ４００を単離するためのス
クリーニングを行う。次いで、プラスミドを単離し、各
アダプターと交差するそのヌクレオチド配列を確認し、
その後、このプラスミドからのＢamＨＩ発現カセットを
単離しｐＡＢ２４のＢamＨＩ中にクローニングして発現
プラスミドｐＹＭＩＰ４００を得る。
【０１４０】ＭＩＰ−２の発現 Ｓ．セレビシエ（S. cerevisaie)枠ＭＢ２−１（leu2-
3, leu2-112, his3-11,his3-15, ura3 ▲，pep4▲, AC
Nr , oir0 ) を ura原栄養に用いた標準の手順および
形質転換体によりプラスミド pＹＭＩＰ４００で形質転
換させる。発現は個々の形質転換体の単一コロニーをロ
イシン選択性培地中に接種し４８時間増殖させることに
よって分析する。次いで、培養物を遠心し、細胞をウラ
シルを含まない培地中に再懸濁させura 選択性培地中に
２０倍希釈させる。培養物は約７２時間増殖させ、次い
で集積し、無細胞上清を調製した。状態調節培地をＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥによりＭＩＰ−２の存在について分析し次
いでクーマーシー染色しイムノブロッティングを行う。
3, leu2-112, his3-11,his3-15, ura3 ▲，pep4▲, AC
Nr , oir0 ) を ura原栄養に用いた標準の手順および
形質転換体によりプラスミド pＹＭＩＰ４００で形質転
換させる。発現は個々の形質転換体の単一コロニーをロ
イシン選択性培地中に接種し４８時間増殖させることに
よって分析する。次いで、培養物を遠心し、細胞をウラ
シルを含まない培地中に再懸濁させura 選択性培地中に
２０倍希釈させる。培養物は約７２時間増殖させ、次い
で集積し、無細胞上清を調製した。状態調節培地をＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥによりＭＩＰ−２の存在について分析し次
いでクーマーシー染色しイムノブロッティングを行う。
【０１４１】本発明は本発明の精神またはその本質的特
徴から逸脱することなしに他の形で具現化しあるいは他
の方法で実施し得る。従って、本明細書の記載はすべて
の点で例示を目的とするもので限定するものでなく、本
発明の範囲は請求の範囲に示されており、均等の意味お
よび範囲のすべての変形は請求の範囲内に属するものと
する。
徴から逸脱することなしに他の形で具現化しあるいは他
の方法で実施し得る。従って、本明細書の記載はすべて
の点で例示を目的とするもので限定するものでなく、本
発明の範囲は請求の範囲に示されており、均等の意味お
よび範囲のすべての変形は請求の範囲内に属するものと
する。
【図１】 ＭＩＰ−２の精製の電気泳動図である。各分
子量マーカーの最終位置（キロダルトンでの）はこの１
０−１８％ NaDodSO4 −ＰＡＧ系中でカケクチン／ＴＮ
ＦとＭＩＰ−１の位置に沿って左側に示してなる。４つ
のレーンはＭＩＰ−２の連続的段階を示す：レーン１は
ＲＡＷ２６4.７細胞からの濃縮し透析濾過した粗上清で
あり；レーン２はＲＡＷ２６4.７上清のＭono Ｑ（アニ
オン交換）カラムクロマトグラフィからの溶出液であ
り；レーン３はヘパリン−セファローズで精製した後の
プールしたピーク画分であり；レーン４はスーパロース
１２（ゲル濾過）で精製したのちの純粋ＭＩＰ−２画分
である。
子量マーカーの最終位置（キロダルトンでの）はこの１
０−１８％ NaDodSO4 −ＰＡＧ系中でカケクチン／ＴＮ
ＦとＭＩＰ−１の位置に沿って左側に示してなる。４つ
のレーンはＭＩＰ−２の連続的段階を示す：レーン１は
ＲＡＷ２６4.７細胞からの濃縮し透析濾過した粗上清で
あり；レーン２はＲＡＷ２６4.７上清のＭono Ｑ（アニ
オン交換）カラムクロマトグラフィからの溶出液であ
り；レーン３はヘパリン−セファローズで精製した後の
プールしたピーク画分であり；レーン４はスーパロース
１２（ゲル濾過）で精製したのちの純粋ＭＩＰ−２画分
である。
【図２】 ＭＩＰ−２および血小板因子４群の各構成員
の部分ＮＨ2 末端アミノ酸配列を示す。各配列は文献か
ら入手し一定に保有されたシスティン残基に対して配列
した。ＰＢＰ（血小板基本たん白質）β−スロンボグロ
ブリンとＣＴＡＰ III のプレカーサーである。ボック
ス状に囲んだアミノ酸は血小板因子４群の種々の構成員
間で一定に保有されている。小文字の接頭文字は種を示
す：ｍ＝マウス、ｈ＝ヒト、ｂ＝ウシ、ｒ＝ラット、ｃ
＝ニワトリ、 ham＝ハムスター。
の部分ＮＨ2 末端アミノ酸配列を示す。各配列は文献か
ら入手し一定に保有されたシスティン残基に対して配列
した。ＰＢＰ（血小板基本たん白質）β−スロンボグロ
ブリンとＣＴＡＰ III のプレカーサーである。ボック
ス状に囲んだアミノ酸は血小板因子４群の種々の構成員
間で一定に保有されている。小文字の接頭文字は種を示
す：ｍ＝マウス、ｈ＝ヒト、ｂ＝ウシ、ｒ＝ラット、ｃ
＝ニワトリ、 ham＝ハムスター。
【図３】 ＭＩＰ−２で得られた部分ＮＨ4 末端アミノ
酸配列に相応する領域での本発明の配列の同一性の比較
を示す表である。各配列はＦＡＳＴＰプログラムを用い
て比較した。比較は第２図で配列したようなＭＩＰ−２
で入手できる部分に相応する各配列部分についてのみ行
った。Ｉns. ＝微少量。
酸配列に相応する領域での本発明の配列の同一性の比較
を示す表である。各配列はＦＡＳＴＰプログラムを用い
て比較した。比較は第２図で配列したようなＭＩＰ−２
で入手できる部分に相応する各配列部分についてのみ行
った。Ｉns. ＝微少量。
【図４】 ＭＩＰ−２と血小板因子４群の他の構成員と
の間の関係を特徴付するイムノブロット分析を示す。
（Ａ）ＭＩＰ−２のイムノブロットに用いたゲルの複製
の銀染色。（Ｂ）ＭＩＰ−２のイムノブロット：レーン
１……精製ＭＩＰ−２；レーン２……エンドトキシン刺
激ＲＡＷ２６4.７細胞からの上清；レーン３……刺激な
しのチオグリコレート誘起マウス腹腔マクロファージか
らの上清；レーン４……エンドトキシン刺激チオグリコ
レート誘起マウス腹腔マクロファージからの上清；レー
ン５……精製ＮＡＰ−１たん白質；レーン６……プラス
ミドのみを移入したＣＯＳ細胞からの上清；レーン７…
…ヒトgro遺伝子を含有するプラスミドを移入したＣＯ
Ｓ細胞からの上清；レーン８……ハムスターgro遺伝子
を含有するプラスミドを移入したＣＯＳ細胞からの上
清。レーン７と８はイムノブロットにおいて逆転してい
る（４ｂ）。
の間の関係を特徴付するイムノブロット分析を示す。
（Ａ）ＭＩＰ−２のイムノブロットに用いたゲルの複製
の銀染色。（Ｂ）ＭＩＰ−２のイムノブロット：レーン
１……精製ＭＩＰ−２；レーン２……エンドトキシン刺
激ＲＡＷ２６4.７細胞からの上清；レーン３……刺激な
しのチオグリコレート誘起マウス腹腔マクロファージか
らの上清；レーン４……エンドトキシン刺激チオグリコ
レート誘起マウス腹腔マクロファージからの上清；レー
ン５……精製ＮＡＰ−１たん白質；レーン６……プラス
ミドのみを移入したＣＯＳ細胞からの上清；レーン７…
…ヒトgro遺伝子を含有するプラスミドを移入したＣＯ
Ｓ細胞からの上清；レーン８……ハムスターgro遺伝子
を含有するプラスミドを移入したＣＯＳ細胞からの上
清。レーン７と８はイムノブロットにおいて逆転してい
る（４ｂ）。
【図５】 ＭＩＰ−２に対しての応答におけるヒト多形
核走化性および化学運動性のグラフである。走化性（暗
色棒）はＭＩＰ−２をチャンバーの下の方のウェルのみ
に導入することによって測定した。化学運動性（明色
棒）は同じ濃度のＭＩＰ−２を上部および下部の各チャ
ンバーに導入することによって測定した。fMet−Ｌeu−
Ｐhe（ｆＭＬＰ）は１０-8Ｍの濃度で測定した。
核走化性および化学運動性のグラフである。走化性（暗
色棒）はＭＩＰ−２をチャンバーの下の方のウェルのみ
に導入することによって測定した。化学運動性（明色
棒）は同じ濃度のＭＩＰ−２を上部および下部の各チャ
ンバーに導入することによって測定した。fMet−Ｌeu−
Ｐhe（ｆＭＬＰ）は１０-8Ｍの濃度で測定した。
【図６】 本発明の炎症サイトカインの部分Ｎ末端配列
図である。
図である。
【図７】 ＭＩＰ−２の完全ヌクレオチド配列を示す。
プレカーサーペプチドの予想翻訳分子量は１0,６２2.５
２である。位置１から始まる成熟ペプチド配列は長さに
おいて７３個のアミノ酸である。
プレカーサーペプチドの予想翻訳分子量は１0,６２2.５
２である。位置１から始まる成熟ペプチド配列は長さに
おいて７３個のアミノ酸である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 14/52 Ｃ０７Ｋ 16/24 16/24 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ａ６１Ｋ 37/02 // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 ウォルプ スティーヴン ディー アメリカ合衆国 ニューヨーク州 10044 ニューヨーク メイン ストリート 436−625 (72)発明者 セラミ アントニー アメリカ合衆国 ニューヨーク州 11964 シェルター アイランド ラム アイラ ンド ドライヴ （番地なし) (72)発明者 シェリー バーバラ アメリカ合衆国 ニューヨーク州 10021 ニューヨーク イースト エイティフォ ース ストリート ４シー325 (72)発明者 オルソン−テカンプ パトリシア エイ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94960 サン アンセルモ カミノ ド ヘラ 80
Claims (1)
- 【請求項１】 以下のA及びBを含む哺乳動物の炎症また
は発熱の治療用薬剤組成物: A. 炎症サイトカインに対する抗体、この炎症サイトカ
インの産生を抑制し得る薬剤、上記炎症サイトカインの
活性を拮抗し得る上記炎症サイトカインに対する抗体で
ない薬剤、及びこれらの混合物、またはこれらに対する
特異的な結合パートナーからなる群より選ばれた治療上
有効な量の物質(上記炎症サイトカインはヘパリンに結
合し得るたん白質を含み、皮下投与させたとき多形核細
胞浸潤に特徴を有する局所型炎症を誘起し、多形核細胞
中でインビトロ化学運動性を殆んどまたは全く誘起しな
いで強いインビトロ走化活性を有するが、同化酵素リポ
たん白質リパーゼの活性を抑制し、カケクチン／ＴＮＦ
感受性細胞の細胞毒性を生じ、エンドトキシン耐性Ｃ３
Ｈ／ＨｅＪ胸腺細胞の芽球形成を刺激しまたは一次チオ
グリコレート誘起マウスマクロファージ細胞によるカケ
クチン／ＴＮＦの産生を誘起する能力は欠如しており、
下記の７３個のアミノ酸配列または下記の７３個のアミ
ノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置
換若しくは付加されたアミノ酸配列を含む)；及び B. 薬学上許容し得るキャリヤー。 -27 Met GCTTCCTCGGGCACTCCAGACTCCAGCCACACTTCAGCCTAGCGCC ATG -20 Ala Pro Pro Thr Cys Arg Leu Leu Ser Ala Ala Leu Val Leu Leu GCC CCT CCC ACC TGC CGG CTC CTC AGT GCT GCA CTG GTC CTG CTG -10 1 Leu Leu Leu Ala Thr Asn His Gln Ala Thr Gly Ala Val Val Ala CTG CTG CTG GCC ACC AAC CAC CAG GCT ACA GGG GCT GTT GTG GCC 10 Ser Glu Leu Arg Cys Gln Cys Leu Lys Thr Leu Pro Arg Val Asp AGT GAA CTG CGC TGT CAA TGC CTG AAG ACC CTG CCA AGG GTT GAC 20 30 Phe Lys Asn Ile Gln Ser Leu Ser Val Thr Pro Pro Gly Pro His TTC AAG AAC ATC CAG AGC TTG AGT GTG ACG CCC CCA GGA CCC CAC 40 Cys Ala Gln Thr Glu Val Ile Ala Thr Leu Lys Gly Gly Gln Lys TGC GCC CAG ACA GAA GTC ATA GCC ACT CTC AAG GGC GGT CAA AAA 5O 60 Val Cys Leu Asp Pro Glu Ala Pro Leu Val Gln Lys Ile Ile Gln GTT TGC CTT GAC CCT GAA GCC CCC CTG GTT CAG AAA ATC ATC CAA 70 73 Lys Ile Leu Asn Lys Gly Lys Ala Asn OP AAG ATA CTG AAC AAA GGC AAG GCT AAC TGA CCTGGAAAGGAGGAGCCTGGG CTGCTGTCCCTCAACGGAAGAACCAAAGAGAAAGAAAAAAACAAACAGCACCCGGGAAGC CTGGATCGTACCTGATGTGCCTCGCTGTCTGAGAGTTCACTTATTTATTTATCTATGTAT TTATTTATTTATTAATTCCATTGCCCAGATGTTGTTATGTTTATTATGATATTTAAAGAT ATCGATTCGCTAATTCACTGTAATATCTTAAAAGGTCATTTTAATATGTTAAAGTTTATT TTAATAATGTTTAATGTGTTCAATTAAAGTTATTTAACTTATATAGTTGGAAGGTGATAC ATTTTTAAACCTATTTATTCATTAGTTTCTGGGGAGAGGGTGAGTTGGGAACTAGCTACA TCCCACCCACACAGTGAAAGAGACTGGGGATAAGGGGTGGGGGTGGGGACAAATAGATGC AGTCGGATGGCTTTCATGGAAGTAGTGTGCATGTTCACATCATTTTTTTGTAAGCACCGA GGAGAGTAGAACAGCTGTTATTTAGGTTTCAGTGTTTGTAAACTGTATGTACAACATTTT TGATGCTGGATTTCAATGTAATGTTGTGAGTAACCCTTGGACATTTTATGTCTTCCTCGT AAGGCACAGTGCCTTGCTTAGCAATTGTTTTGTCATGCCTTTTCGTGTCTTGAAGTGGAC ACATTTATTTATTCATGTATTTTTACAAATAACAAAAAATAAAAACGTCTGTTAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAA
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