DE68928124T2

DE68928124T2 - Makrophagenabgeleiteter entzündungsmediator(mip-2)

Info

Publication number: DE68928124T2
Application number: DE68928124T
Authority: DE
Inventors: Anthony Shelter Island Ny 11964 Cerami; Patricia A. San Anselmo Ca 94960 Olson-Tekamp; Barbara New York Ny 10021 Sherry; Stephen D. New York Ny 10044 Wolpe
Original assignee: Rockefeller University; Chiron Corp
Current assignee: Rockefeller University; Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 1988-09-02
Filing date: 1989-09-01
Publication date: 1997-10-16
Anticipated expiration: 2009-09-02
Also published as: AU623698B2; EP0763543A3; JP2001213803A; DE68928124D1; WO1990002762A1; US6103234A; ATE154364T1; JPH04500970A; EP0394409A1; AU4416889A; EP0763543A2; EP0394409B1; US5717074A

Description

Von Makrophagen abstammender inflammatorischer Mediator (MIP-2)

Verwandte Veröffentlichungen

Die Anmelder sind Autoren oder Co-Autoren von mehreren Aufsätzen, die auf den Gegenstand der vorliegenden Erfindung gerichtet sind. Diese Aufsätze ergänzen die Aufsätze, die in dem US-Patent Nr. 4,603,106 aufgeführt sind: (1) [Der Anmelder Cerami mit den Co-Autoren B. Beutler, J. Mahoney, N. Le Trang und P. Pekala] "Purification of Cachectin, a Lipoprotein Lipase-Suppressing Hormone Secreted By Endotoxin-Induced RAW 264.7 Cells", J. EXP. MED. 161:984-995 (Mai, 1985); (2) [Der Anmelder Cerami mit den Co-Autoren M. Kawakami, J.R. Mahoney, N, Le Trang, W. Vine und Y. Ikeda] "Lipopolysaccharide-Treated RAW 264.7 Cells Produce a Mediator Which Inhibits Lipoprotein Lipase in 3T3-L1 Cells", J. IMMUNOL. 134 (3):1673-1675 (März, 1985); (3) [Der Anmelder Cerami mit den Co-Autoren P.J. Hotez, N. Le Trang und A.H. Fairlamb] "Lipoprotein Lipase Suppression in 3T3-L1 Cells by a Haematoprotozoan-Induced Mediator From Peritoneal Exudate Cells." PARASITE IMMUNOL. (Oxf.) 6:203 (1984); (4) [Der Anmelder Cerami mit den Co-Autoren B. Beutler, D. Greenwald, J.D. Hulmes, M. Chang Y.-C.E. Pan, J. Mathison und R. Ulevitch] "Identity of Tumor Necrosis Factor and Macrophage-Secreted Factor Cachectin", NATURE 316:552-554 (1985); (5) [Der Anmelder Cerami mit den Co-Autoren B. Beutler, F.M. Torti, B. Dieckmann und G.M. Ringold] "A Macrophage Factor Inhibits Adipocyte Gene Expression: An In Vitro Model of Cachexia" SCIENCE 229:867-869 (1985); (6) [Der Anmelder Cerami mit den Co-Autoren B. Beutler und I.W. Milsark] "Passive Immunization Against Cachectin/Tumor Necrosis Factor (TNF) Protects Mice Fron the Lethal Effect of Endotoxin", SCIENCE 229:869-871 (1985); (7) [Die Anmelder Cerami, Wolpe und Sherry mit den Co-Autoren B. Beutler, G. Davatelis, D.G. Hesse, H.T. Nbuyen, L.I. Moldawer, C.F. Nathan und S.F. Lowry], "Macrophages Secrete a Novel Heparin-Binding Protein with Inflammatory and Neutrophil Chemokinetic Properties", J. EXP. MED. 167:570-581 (1988); (8) [Die Anmelder Wolpe, Cerami und Tekamp-Olson mit den Co-Autoren G. Davatelis, K. Hemsen, C. Luedke, C. Gallegos, D. Coit und J. Merryweather], "Cloning and Characterization of a cDNA for Murine Macrophage Inflammatory Protein (MTP), A Novel Monokine with Inflammatory and Chemokinetic Properties", J. EXP. MED., 167:1939-1944 (Juni, 1988); (9) [Die Anmelder mit den Co-Autoren C. Gallegos, D. Bauer, G. Davatelis, F. Masiarz und D. Coit], "Resolution of the Two Components of Macrophage Inflammatory Protein 1, and doning and Characterization of One of Those Components, MIP- 1β", J. EXP. MED. 168:2251-2259 (Dezember, 1988); und (10) [Die Anmelder Wolpe, Cerami und Sherry mit den Co-Autoren D. Juers, G. Davatelis und R. Yurt], "Identification and Characterization of Macrophage Inflammatory Protein 2", PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 86:612-616 (Januar, 1989).
Die zu der vorliegenden Erfindung führende Forschung wurde zum Teil durch Unterstützungen der National Institutes of Health und der Rockefeller Foundation finanziert.

Hintergrund der Erfindung

Die vorliegende Erfindung ist allgemein auf Stoffe und damit verbundene Verfahren für die Analyse und die Behandlung der Auswirkungen und des entsprechenden Verlaufs von invasiven Stimuli wie bei einer Infektion von tierischen Wirten gerichtet, und betrifft insbesondere die Identifizierung von Stoffen, die an der Wirtsantwort gegen solche invasiven Stimuli teilnehmen können.
Mehrere bekannte physiologische und biochemische Störungen sind bei verschiedenartigen Säugetierwirten, die auf die verschiedensten invasiven Stimuli wie auf eine bakterielle, virale oder protozoale Infektion; Tumore; oder Endotoxämie; als auch bei idiopathischen Zuständen reagieren, beobachtet worden. Diese Reaktionen schließen zum Beispiel Fieber, Leukozytose, Hyperlipidämie, verringerte Nahrungsaufnahme (Anorexie), verringerte Aktivität, Auszehrung (Kachexie), und andere Veränderungen beim Muskel-, weißen Blutzell- und Lebermetabolismus ein. Insbesondere zeigten jüngste Studien, die auf die Erklärung der biochemischen Mechanismen von Kachexie in Kaninchen, die mit Trypanosoma brucei infiziert waren, gerichtet waren, daß Tiere mit einer geringen parasitären Belastung krank werden und eine außergewöhnliche Hypertriglyceridämie mit einer deutlichen Erhöhung des Plasmalipoproteins von sehr geringer Dichte (VLDL, very low density lipoprotein) zeigten. Siehe C.A. Rouser und A. Cerami, MOL. BIOCHEM. PARASITOL. 1:31-38 (1980). Der hypertriglyceridämische Zustand war hinsichtlich der schweren Auszehrungsdiathese, die diese experimentelle Infektion begleitete, bemerkenswert. Von der Erhöhung des Plasma VLDL hat man gezeigt, daß diese auf einen Klärdefekt (clearing defect), der durch einen Verlust der peripheren Lipoproteinlipase (LPL) Aktivität des Gewebes verursacht wird, zurückzuführen ist.
Die verringerte LPL Aktivität wurde auch von anderen beobachtet, und es wurde bemerkt, daß dieser Zustand vorkam, wenn sich der menschliche Körper in einem Schockzustand befand. Siehe E.B. Man, et al., "The Lipids of Serum and Liver in Patients with Hepatic Diseases", CLIN. INVEST. 24, 623, et seq. (1945); siehe auch John I. Gallin, et al., "Serum Lipids in Infection", N. ENGL. J. MED. 261, 1081-1086 (13. November 1969); D. Farstchi, et al., "Effects of Three Bacterial Infections on Serum Lipids of Rabbits", J. BACTERIOL. 95, 1615, et seq. (1968); S.E. Grossberg, et al., "Hyperlipaemia Following Viral Infection in the Chicken Embryo: A New Syndrome", NATURE (London) 208, 954, et seq. (1965); Robert L. Hirsch, et al., "Hyperlipidemia, Fatty Liver and Bromsulfophthalein Retention in Rabbits Injected Intraveneously with Bacterial Endotoxin", J. LIPID. RES. 563-568 (1964); und Osamu Sakaguchi, et al., "Alternations of Lipid Metabolism in Mice Injected With Endotoxins", MICROBIOL. IMMUNOL. 23 (2) 71- 85 (1979); R.F. Kampschmidt, "The Activity of Partially Purified Leukocytic Endogenous Mediator in Endotoxin Resistant C3H/HeJ Mice", J. LAB. CLIN. MED. 95 616, et seg. (1980); und Ralph F. Kampschmidt, "Leukocytic Endogenous Mediator", J. RET. SOC. 23 (4) 287-297 (1978).
Außerdem sind den Anmeldern Veröffentlichungen bekannt, die die Identifizierung und das Vorhandensein von "Mediatoren", die bei der Wirtsantwort auf eine Infektion beteiligt zu sein scheinen, diskutieren; und insbesondere werden die folgenden Aufsätze, deren Texte hiermit unter Bezugnahme aufgenommen sind, aufgeführt: Sipe, J.D., et al., J. EXP. MED., 150:597-606 (1979); und Barney, C.C., et al., LIPTON, J.M. (Hrsg.), FEVER: INTERNATIONAL SYMPOSIUM, Dallas, Texas, 11.-12. April 1979 XII + 263P. Raven Press: New York, Illus. ISBN 0-89004-451-1 (08877), 0 (0), Seiten 111-112 (1980); und Dinarello, C.A., "Human Leucocytic Pyrogen : Purification and Development of a Radioimmunoassay", PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, 74(10) 4624-4627 (Oktober, 1977). Bei sämtlichen Faktoren, die von jedem dieser Autoren in den oben erwähnten Aufsätzen und in den Aufsätzen, die von Kampschmidt verfaßt oder mitverfaßt wurden, identifiziert und untersucht wurden, wurde bestimmt, daß diese eine einzelne Gruppe von Faktoren umfassen, die als Interleukin-1 (IL-1) identifiziert wurden. Diese Bestimmung wurde in einem Aufsatz von Charles A. Dinarello, veröffentlicht in REVIEWS OF INFECTIOUS DISEASES, Band 6, Nr. 1 (Januar- Februar, 1984) dokumentiert, dessen Text hiermit unter Bezugnahme auch aufgenommen ist.
Ein ähnlicher Mangel an LPL Aktivität wurde von den Anmeldern bei C3H/HeN-Mäusen nach Verabreichung von Lipopolysaccharid aus Escherichia coli (LPS) bemerkt. Im Gegensatz dazu war ein Verlust der LPL-Aktivität bei C3H/HeJ-Mäusen, die gegenüber LPS genetisch resistent sind, nicht nachweisbar. Diese Resistenz gegenüber einem Endotoxin-induzierten LPL-Mangel konnte durch die Verabreichung von Serum, das von Endotoxin-empfindlichen Tieren, denen zwei Stunden zuvor LPS injiziert worden war, erhalten wurde, umgangen werden. Ebenso konnte die Resistenz durch die Injektion von konditioniertem Medium von Endotoxinstimulierten Thioglycolat-stimulierten peritonealen Makrophagen, die aus empfindlichen Mäusen erhalten wurden, umgangen werden. Diese Ergebnisse wurden in der Anmeldung mit dem Aktenzeichen Nr. 414,098, nun das US-Patent Nr. 4,603,106 genau beschrieben, wobei deren Offenbarung hiermit unter Bezugnahme aufgenommen ist.
Die obige Arbeit wurde von dem Glauben veranlaßt, daß der "Mediator" oder die "Mediatoren" existieren, und es wurde vermutet, daß diese(r) eine bedeutende Wirkung auf die allgemeine anabolische Aktivität von energiespeichernden Zellen bei dem tierischen Wirt haben (hat). Es wurde vermutet, daß ein solcher "Mediator" eine auf die Aktivität von bestimmten anabolischen Enzymen, deren verringerte Aktivität zum Beispiel beobachtet wird, wenn die Wirte als Reaktion auf eine infektiöse Invasion in einen Zustand, der als Schock bekannt ist, übergehen, unterdrückende Wirkung ausübte. Demzufolge wurden die Wirkung des Mediators, der von Endotoxinstimulierten peritonealen Mausexsudatzellen hergestellt wurde, auf Endotoxin-empfindliche und ebenso auf Endotoxinunempfindliche Mäuse, und die Entwicklung über eine solche Untersuchung eines Mittels für die Messung der anabolischen Enzymaktivität in der ersten eingereichten zurückgezogenen Anmeldung mit dem Aktenzeichen Nr. 299,932 beschrieben, die hiermit unter Bezugnahme aufgenommen ist.
Eine weitere Untersuchung von diesem System wurde in Verbindung mit dem 3T3-L1 "Präadipozyten" Modellsystem durchgeführt, und die entsprechende Entwicklung von Verfahren und damit verbundenen Stoffen für die Entwicklung von Antikörpern gegen den "Mediator" und andere diagnostische Verfahren wurde dann in der Anmeldung mit dem Aktenzeichen Nr. 351,290 beschrieben, die hiermit unter Bezugnahme aufgenommen und nun zurückgezogen ist. Danach wurde in einer nachfolgenden Anmeldung mit dem Aktenzeichen Nr. 414,098, nun das US-Patent Nr. 4,603,106 festgestellt, daß der Mediatorstoff, der über die Endotoxinstimulation von Makrophagenzellen erhältlich ist, die Aktivitäten zeigte, die anabolischen Enzyme Lipoproteinlipase, Acetyl-Coenzym A-Carboxylase und die Fettsäure-Synthetase zu supprimieren, und weiter das Wachstum und die Differenzierung von erythroiden Zellen (erythroid-committed cells) inhibierte.
Weitere Arbeit, die in den Aufsätzen (1) und (4) von Beutler et al., und der Anmeldung mit dem Aktenzeichen Nr. 766,852, deren Offenbarung hiermit unter Bezugnahme aufgenommen ist, dargelegt ist, hat zu der Entdeckung geführt, daß der früher identifizierte Mediatorstoff eine weitere Proteinkomponente enthielt, die eine Anzahl von Aktivitäten besitzt, die diesen sowohl von dem Mediatorstoff als auch von den anderen Faktoren, die im Stand der Technik identifiziert wurden und die als Interleukin-1 und Interleukin-2 bekannt sind, unterschieden. Zusätzliche Arbeit, die in den Aufsätzen (7)-(9) und der Stammanmeldung mit dem Aktenzeichen Nr. 104,827, deren Offenbarung hiermit unter Bezugnahme aufgenommen ist, dargelegt ist, stellte das Vorhandensein eines zusätzlichen Faktors (MIP- 1) bei dem Mediatorstoff fest, wobei der Faktor ein unterscheidbares Aktivitätenprofil zeigt.
Nachfolgend wurde das vorliegende inflammatorische Cytokin MIP- 2 isoliert und gereinigt und dessen besondere Aktivitäten, wie in der unmittelbaren Stammanmeldung mit dem Aktenzeichen Nr. 240,079 dargelegt, aufgeklärt. Nach diesem Zeitpunkt ist die vollständige Sequenz des vorliegenden Cytokins bestimmt worden, der die Klonierung von dessen cDNA folgte, und die Expression des Cytokins wurde durchgeführt. Mit der vorliegenden Anmeldung ist beabsichtigt, daß diese die zusätzlichen Informationen in bezug auf das Cytokin, das nun als ein Ergebnis der Untersuchungen der Erfinder hier verfügbar ist, umfaßt.
MIP-2 ist ein Mitglied einer homologen Multigenfamilie. Die Mitglieder dieser Familie, die die größte Homologie bei der Proteinsequenz (die im allgemeinen über die klonierte cDNA vorhergesagt wird) haben, schließen MGSA und KC ein. MGSA (Richmond et al., EMBO J. 7:2025 (1988) ist ein autokriner Wachstumsfaktor mit wirksamer mitogener Aktivität, der von humanen Melanomzellen sekretiert wird und der das Produkt des humanen gro Genes ist (Anisowicz et al., PROC. NAT. ACAD. SCI. USA 84:7188 (1987). MGSA weist eine Identität von 61,6% bei der Aminosäuresequenz zu MIP-2 auf, und von dem MG des humanem MGSA wird angegeben, daß es nach der Reduktion auf der SDS-PAGE annähernd 13 bis 16 kD beträgt; die vorhergesagte Proteinsequenz des Hamsterhomologons von MGSA weist eine Identität von 68,4% zu MIP-2 auf. Das Maus KC Genprodukt wird durch PDGF induziert, und man nimmt an, daß es das Maushomologon des humanen MGSA/gro Gens ist (eine Aminosäureidentität von 66,3% bezüglich MIP-2).
Die Anmelder hier kennen keinen älteren Stand der Technik bezüglich der Expression von rekombinantem MIP-2 bekannt, obwohl Lipes et al,. (PROC. NATL. ACAD. USA 85: 9704, 1988) eine Bakulovirusexpression von Act-2 cDNA, einem vermeintlichen humanen Homologon des Maus MIP-1β, beschrieben hat, um zu zeigen, daß das kodierte Protein sekretiert wurde und um die reife N-terminale Sequenz zu bestimmen.
Die Mitglieder der MIP-1 und MIP-2 Genfamilien wurden exprimiert, aber die Relevanz von diesen Ergebnissen für die MIP-2 Expression ist fraglich. Die Literatur wird wie folgt zusammengefaßt. JE, eine cDNA, die ein Protein mit Homologie zu MIP-1α und MIP-1β kodiert, wurde in COS-1 Zellen exprimiert, um zu bestätigen, daß es einen Polypeptidkern mit annähernd 12 kDa kodiert (Rollins et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 85: 3738, 1988). KC, eine cDNA, die ein Protein mit Homologie zu MIP-2 kodiert, wurde von Oguendo et al., J. BIOL. CHEM. 264: 4133 (1989) in COS-1 Zellen exprimiert, um zu zeigen, daß es ein sekretiertes Protein kodiert. Das Bindegewebe-aktivierende Peptid-III (CTAP, Connective Tissue Activating Peptide), von dem Mullenbach et al., J. BIOL. CHEM. 261: 719 (1986) berichteten, und IP-10, von dem Luster und Ravetch, J. EXP. MED. 166: 1084 (1987) berichteten, die beide Mitglieder der MIP-2 Genfamilie sind, wurden als eine α-Faktorfusion jeweils in Hefe und E.coli exprimiert. Schließlich haben Lindley et al., PROC. NAT. ACAD. SCI. USA 85: 9199 (1985) NAF, ein Mitglied der MIP-2 Familie, in E.coli exprimiert. Nach der Reinigung und Renaturierung fand man, daß dieses rekombinante Protein die gleiche Bioaktivität besitzt, die für das native Molekül identifiziert wurde.

Zusammenfassung der Erfindung

Gemäß dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird das inflammatorische Cytokin MIP-2, das aus dem Mediatorstoff isoliert wurde, offenbart, und es umfaßt ein Protein, das gereinigt wurde und das unter basischen physiologischen Bedingungen kationisch ist. Das inflammatorische Cytokin der vorliegenden Erfindung zeigt die Fähigkeit sogar bei hohen Salzkonzentrationen an Heparin zu binden, eine, wenn subkutan verabreicht, lokalisierte Entzündung, die durch einen Einstrom von polymorphkernigen Zellen gekennzeichnet ist, zu induzieren, und es ist ein äußerst aktives chemotaktisches Mittel, wobei es wenig oder keine chemokinetische Aktivität induziert. Dem vorliegenden inflammatorischen Cytokin fehlen jedoch bestimmte Aktivitäten, die anderen Faktoren, die aus dem Mediatorstoff, der in dem US-Patent Nr. 4,603,106 offenbart ist, isoliert wurden, gemein sind.
Insbesondere fehlt dem vorliegenden inflammatorischen Cytokin die Fähigkeit, die Aktivität des anabolischen Enzyms Lipoproteinlipase (LPL) zu supprimieren, und es ist nicht in der Lage, die Cytotoxizität von Cachectin/TNF-empfindlichen L929-Zellen zu verursachen, die Blastogenese von Endotoxinresistenten C3H/HeJ Thymozyten zu stimulieren, oder die Herstellung von Cachectin/TNF durch primäre Thioglycolat stimulierte Mausmakrophagenzellen zu induzieren. Diese letzteren Eigenschaften, die sämtlichst dem vorliegenden inflammatorischen Cytokin fehlen, werden von den bekannten Faktoren Cachectin/TNF und Interleukin-1 (IL-1) gezeigt, und dadurch unterscheidet sich das vorliegende inflammatorische Cytokin von diesen.
Die bedeutendsten positiven Aktivitäten, die von dem vorliegenden inflammatorischen Cytokin gezeigt werden, scheinen die Fähigkeit, an Heparin zu binden, und die Fähigkeit, eine lokalisierte Entzündung, die durch den Einstrom von polymorphkernigen (PMN) Zellen gekennzeichnet ist, zu induzieren, zu sein. Demzufolge ist, während die genaue Rolle, die das vorliegende Isolat bei der Reaktionskaskade gegen die Invasion des Wirtes spielt, noch unbestimmt ist, dessen Teilnahme an der Stimulierung von bestimmten Aktivitäten und Zuständen, die mit der Mobilisierung gegen die Wirtsinvasion verbunden sind, eindeutig. Demzufolge besitzt das inflammatorische Cytokin das Potential zur Verwendung als diagnostisches Mittel, um verschiedenartige Stimuli zu identifizieren und vielleicht zwischen diesen zu differenzieren, ob diese invasiv oder idiopathisch sind, über die Aktivierung des vorliegenden inflammatorischen Cytokins, das solche Stimuli fordern kann.
Das vorliegende inflammatorische Cytokin wurde anfänglich identifiziert und charakterisiert, und man fand, daß es bei Natriumdodecylsulfat (SDS-PAGE) ein einzelkettiges, 6 Kilodalton Protein umfaßt, das bei der Gelfiltration als Monomer oder Dimer läuft. Die Daten der N-terminalen Aminosäureteilsequenz zeigen, wie in FIGUR 2 dargestellt, daß MIP-2 ein Mitglied einer Familie von Cytokinen ist, deren Archetypus der Plättchenfaktor 4 (PF&sub4;, Platelet Factor 4) ist.
Wie oben ausgeführt kann das vorliegende inflammatorische Cytokin durch die Stimulation von Makrophagenzellen mit einem Stoff, der einen invasiven Stimulus begleitet, hergestellt werden. Insbesondere kann eine Probe von Makrophagenzellen, die aus den unterschiedlichsten Quellen stammen kann, mit einem Stimulatorstoff wie einem Endotoxin oder Trypanosomen inkubiert werden, um den Mediatorstoff, der in dem US-Patent Nr. 4,603,106 offenbart ist, herzustellen. Eine solche Inkubation kann für einen Zeitraum von bis zu 20 Stunden erfolgen, und die genauen Zeitgrenzen variieren mit der speziellen Zelle, die für die Inkubation ausgewählt wurde.
Weitere Eigenschaften des vorliegenden inflammatorischen Cytokins schließen dessen fehlende Fähigkeit ein, Fieber bei Kaninchen zu induzieren, oder in vivo eine Superoxidbildung oder einen respiratorischen Burst in humanen Neutrophilen zu induzieren.
Nach einer solchen Inkubation kann das Medium entsprechend, wie durch Zentrifugation, um einen den rohen Mediatorstoff enthaltenden Überstand zu gewinnen, behandelt werden. Der Mediatorstoff kann dann wie durch Filtration oder Abscheidung weiter behandelt werden. Danach kann der rohe Mediatorstoff einer Reihe von bekannten Isolierungstechniken unterworfen werden, worauf das inflammatorische Cytokin erhalten werden kann. Die vorliegende Erfindung umfaßt natürlich alternative Mittel für die Herstellung des inflammatorischen Cytokins, einschließlich, wenn anwendbar, bekannter genetischer Replikationstechniken, und demzufolge ist beabsichtigt, daß die Erfindung solche synthetischen Herstellungen durch ihrem Umfang abdeckt.
Wie oben aufgeführt umfaßt die vorliegende Erfindung auch ein gereinigtes Protein mit den oben angegebenen Aktivitäten und Eigenschaften, das die wie in Mäusen bestimmte NH&sub2;-terminale Aminosäurekonsensusteilsequenz, wie in FIGUR 6 dargestellt, aufweist. Die cDNA für MIP-2 wurde kloniert und sagt, wie in FIGUR 7 dargestellt, ein reifes Protein mit 74 Aminosäuren in der Länge mit einem Molekulargewicht von 7908 und einem translatierten Molekulargewicht von 10.622,52 für das Vorläuferpeptid voraus.
Demzufolge umfaßt die vorliegende Erfindung auch die Identifizierung des gereinigten Peptids, das das vorliegende Cytokin, das die oben erwähnten Aktivitäten und Eigenschaften zeigt, umfaßt, und das die wie in Mäusen bestimmte reife Aminosäuresequenz, die unten und in FIGUR 7 dargestellt ist, aufweist.
Wie vorher ausgeführt, besitzt die vorstehende Sequenz keine auffallende Ähnlichkeit mit irgendeiner der bekannten Faktoren und führt demzufolge dazu, daß das vorliegende inflammatorische Cytokin von diesen unterscheidbar ist. Die Isolierung der obigen cDNA Aminosäuresequenz erleichtert die Neuherstellung von diesem Cytokin mittels rekombinanter genetischer Techniken wie sie im folgenden genau diskutiert werden. Somit stellt die Erfindung die das vorliegende inflammatorische Cytokin oder Analoga desselben kodierende DNA-Sequenz bereit, die verwendet werden kann, um Vektoren für die Expression bei Wirtssystemen mittels rekombinanter DNA-Techniken zu konstruieren.
Die Erfindung ermöglicht es, die idiopathischen oder invasiven Stimuli auf der Basis von deren Fähigkeit, die Aktivitäten, die von dem vorliegenden inflammatorischen Cytokin beeinflußt werden, hervorzurufen, nachzuweisen. Insbesondere können invasive Stimuli aufgrund ihrer Fähigkeit, einen Stoff zu induzieren, der in der Lage ist, an Heparin zu binden und eine lokalisierte Entzündung mit neutrophilem Einstrom und Chemotaktizität (Chemotacticity) zu induzieren, identifiziert und nachgewiesen werden. Bei diesem Verfahren können Makrophagenzellen, die zum Beispiel von der RAW 264.7 Zellinie abstammen mit/gegenüber einer Anzahl von bekannten Stimulatorstoffen wie Endotoxin, Trypanosomen oder ähnlichem als Kontrolle behandelt/ausgesetzt werden, während parallel dazu zelluläre Proben mit oder gegenüber einem Extrakt eines Stoffes aus den mutmaßlichen Stellen des infektiösen Stimulus behandelt oder ausgesetzt werden. Alle Proben können danach gemäß den oben beschriebenen Verfahren inkubiert werden und danach einer Abfolge von Trennungstechniken, die auch definiert sind, unterworfen werden, worauf Proben der erhaltenen Isolate, die aus der Kontrolle und den unbekannten Proben stammen, verglichen werden können, um zu bestimmen, ob das inflammatorische Cytokin, wenn welches entstand, identisch oder auch ähnlich ist.
In ähnlicher Weise kann ein Untersuchungssystem zum Screening von möglichen Drogen, die wirksam sind, um dem inflammatorischen Cytokin entgegenzuwirken, hergestellt werden. In einem Beispiel kann die Testdroge einer stimulierten Makrophagenprobe verabreicht werden, um deren Wirkung auf die Herstellung des inflammatorischen Cytokins zu bestimmen. Bei einem alternativen Verfahren kann das inflammatorische Cytokin in ein zelluläres Testsystem eingebracht werden, bei dem von dem Cytokin bekannt ist, daß es aktiv ist, und die voraussichtliche Droge kann auch in dieselbe Zellkultur eingebracht werden, und die Kultur kann danach untersucht werden, um jegliche Änderungen in der Aktivität des inflammatorischen Cytokins verglichen mit der Zugabe der voraussichtlichen Droge allein oder die Wirkung von zugegebenen Mengen des bekannten inflammatorischen Cytokins zu untersuchen.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht es auch, das Vorhandensein voll stimulierten, spontanen oder idiopathischen pathologischen Zuständen in Säugetieren nachzuweisen, indem man die Aktivität und das Vorhandensein des inflammatorischen Cytokins der vorliegenden Erfindung mißt. Insbesondere kann die Aktivität des inflammatorischen Cytokins mittels der später diskutierten Untersuchungstechniken unter der Verwendung einer geeignet markierten Menge des Cytokins direkt nachgewiesen werden. Alternativ kann das Cytokin verwendet werden, um Bindungspartner oder Antikörper hervorzurufen, die wiederum markiert und in ein Medium wie Serum eingebracht werden können, um das Vorhandensein des inflammatorischen Cytokins darin zu untersuchen, und um dadurch den Zustand des Wirtes, dem das Medium entnommen wurde, zu beurteilen.
Somit sind sowohl das inflammatorische Cytokin als auch jegliche Antikörper, die dagegen hervorgerufen werden können, für die Verwendung in Verbindung mit verschiedenartigen diagnostischen Techniken, einschließlich Immunoassays, wie einem Radioimmunoassay, unter Verwendung von zum Beispiel einem Antikörper gegen das inflammatorische Cytokin, der entweder über radioaktive Bindung, Reduktion mit Natriumborhydrid oder Radioiodierung markiert worden ist, geeignet.
In einem Immunoassay kann eine Kontrollmenge des inflammatorischen Cytokins, dessen Antikörper oder ähnliches bereitgestellt und mit einem Enzym, einem spezifischen Bindungspartner und/oder einem radioaktiven Element markiert werden und kann dann in eine Blutprobe eines Säugetieres, von dem angenommen wird, daß es einer Invasion ausgesetzt ist, eingebracht werden. Nachdem der markierte Stoff oder dessen (deren) Bindungspartner die Möglichkeit hatte, mit den Bindungsstellen innerhalb der Probe zu reagieren, kann das erhaltene Aggregat mittels bekannter Techniken, die mit der Natur der angebrachten Markierung variieren, untersucht werden.
In dem Beispiel, wo eine radioaktive Markierung wie die Isotope ¹&sup4;C, ¹³¹I, ³H, ¹²&sup5;I und ³&sup5;S verwendet werden, können bekannte, gegenwärtig verfügbare Zählverfahren verwendet werden. In dem Beispiel, wo die Markierung ein Enzym ist, kann der Nachweis über jedes der gegenwärtig verwendeten kolorimetrischen, spektrophotometrischen, fluorospektrophotometrischen oder gasometrischen Techniken, die im Stand der Technik bekannt sind, durchgeführt werden. Die vorliegende Erfindung umfaßt ein Untersuchungssystem, das in der Form eines Testkits für die quantitative Analyse des Ausmaßes des Vorhandenseins des inflammatorischen Cytokins hergestellt werden kann. Das System oder das Testkit kann eine markierte Komponente, die über eine der hier diskutierten radioaktiven und/oder enzymatischen Techniken hergestellt ist, das Koppeln einer Markierung an das inflammatorische Cytokin; und eine oder mehrere zusätzliche immunchemische Reagenzien, wobei wenigstens eines davon ein freier oder immobilisierter Ligand ist, der in der Lage ist, entweder mit der markierten Komponente, deren Bindungspartner, eine der Komponenten, die bestimmt werden sollen, oder deren (dessen) Bindungspartner(n) zu binden, umfassen.
Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung ist es, bestimmte therapeutische Verfahren, die auf die Aktivität des inflammatorischen Cytokins, Antikörper gegen das inflammatorische Cytokin, oder auf Mittel oder andere Drogen, von denen bekannt ist, daß sie die gleiche oder eine antagonistische Aktivität besitzen, gestützt werden, zu verwirklichen. Ein erstes therapeutisches Verfahren ist mit der Verhinderung der Erscheinungsformen der Aktivitäten des inflammatorischen Cytokins in Säugetieren, wie Entzündung und Fieber, verbunden und umfaßt die Verabreichung von entweder einem Antikörper gegen das Cytokin, einem Mittel, das in der Lage ist, die Herstellung und/oder Aktivität des Cytokins zu modulieren, oder einem Mittel, das kein Antikörper gegen das Cytokin ist, das in der Lage ist, als ein Antagonist gegen das Cytokin zu wirken, entweder einzeln oder in Mischung miteinander in einer Menge, die wirksam ist, um die Entwicklung von solchen Zuständen bei dem Wirt zu verhindern.
Genauer gesagt können die therapeutischen Verfahren, auf die hier allgemein Bezug genommen wird, einschließen das Verfahren zur Behandlung von Entzündung und Fieber durch die Verabreichung von pharmazeutischen Zusammensetzungen, die umfassen können wirksame Mengen von Antikörpern gegen das inflammatorische Cytokin, oder andere gleichwirksame Drogen, entwickelt zum Beispiel über einen Screeningtest für Drogen, hergestellt und verwendet gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung.
Eine alternative Ausführungsform von diesem therapeutischen Verfahren könnte zu Beginn den Nachweis des Vorhandenseins und der Aktivität des inflammatorischen Cytokins und danach die Verabreichung der geeigneten pharmazeutischen Zusammensetzung einschließen.
Ein zweites therapeutisches Verfahren versucht den Vorteil der inflammatorischen Aktivität des Cytokins und insbesondere, dessen Fähigkeit, die Bewegung und Mobilisierung von Neutrophilen als Antwort auf invasive Stimuli wie einer Infektion zu verursachen, zu nutzen. Demzufolge kann das inflammatorische Cytokin in einer geeigneten Formulierung für die Verabreichung am Infektionsort, der zum Beispiel dort entstehen kann, wo ein Gewebetrauma aufgetreten ist, hergestellt werden. In einem solchen Beispiel kann das inflammatorische Cytokin in einer sterilen Lösung hergestellt und in das Trauma oder die Wunde als Teil einer Spülflüssigkeit oder durch direkte Verabreichung wie in einer pharmazeutischen Zusammensetzung verabreicht werden, wobei die letztere Verabreichungsform topische und parenterale Wege umfaßt. Natürlich kann das inflammatorische Cytokin verwendet werden, um gleichwirksame Mittel oder Drogen über bekannte Verfahren herzustellen, die dann in pharmazeutischen Zusammensetzungen, die für die Verabreichung auf die gleiche Weise und für den gleichen Zweck wie für das inflammatorische Cytokin selbst geeignet sind, formuliert werden können.
Demzufolge ist es eine Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung, ein inflammatorisches Cytokin in gereinigter Form bereitzustellen, das bestimmte Eigenschaften und Aktivitäten, die mit der Wirtsantwort gegen invasive Stimuli in Säugetieren verbunden sind, zeigt.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Verfahren zur Herstellung des inflammatorischen Cytokins, einschließlich rekombinanter Mittel, bereitzustellen.
Es ist noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, pharmazeutische Zusammensetzungen für die Verwendung bei therapeutischen Verfahren, die das inflammatorische Cytokin oder dessen (deren) Bindungspartner, oder Mittel oder Drogen, die die Herstellung kontrollieren, oder die die Aktivitäten des inflammatorischen Cytokins nachahmen oder diesen entgegenwirken, umfassen oder darauf basieren, bereitzustellen.
Andere Aufgaben und Vorteile werden für die Fachleute aus einer Betrachtung der nachfolgenden Beschreibung, die unter Bezugnahme auf die folgenden erläuternden Abbildungen fortfährt, klar werden.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

FIGUR 1 ist eine elektrophoretische Geldarstellung der Reinigung von MIP-2. Die Endpositionen der Molekulargewichtsmarker (in Kilodalton) sind gemeinsam auf der linken Seite gemeinsam mit den Positionen von Cachectin/TNF und MIP-1 bei diesem 10 bis 18% NaDodSO&sub4;-PAGE Systems gezeigt. Die vier Spuren zeigen aufeinanderfolgende Stufen der Reinigung von MIP-2: Spur 1 - konzentrierter und diafiltrierter roher Überstand von RAW 264.7 Zellen; Spur 2 - Säulendurchfluß von Mono Q (Anionenaustausch) Säulenchromatographie des RAW 264.7 Überstandes; Spur 3 - vereinigte Spitzenfraktionen nach Reinigung über Heparin-Sepharose; Spur 4 - reine MIP-2 Fraktionen nach Reinigung über Superose 12 (Gelfiltration).
FIGUR 2 zeigt die NH&sub2;-terminalen Aminosäureteilsequenzen von MIP-2 und anderen Mitgliedern der Plättchenfaktor 4 Familie. Die Sequenzen wurden der Literatur entnommen und über die konservierten Cysteinreste ausgerichtet. PBP (Platelet Basic Protein, Plättchen basisches Protein) ist der Vorläufer für β- Thromboglobulin und CTAP III. Die eingerahmten Aminosäuren sind zwischen den verschiedenartigen Mitgliedern der Plättchenfaktor 4 Familie konserviert. Die in Kleinbuchstaben gehaltenen Präfixe betreffen die Arten: m = Maus, h = Mensch, b = Rind, r = Ratte, c = Huhn, ham = Hamster.
FIGUR 3 ist eine Tabelle, die einen Vergleich der prozentualen Sequenzidentität in dem Bereich, der der NH&sub2;-terminalen Aminosäureteilsequenz, die für MIP-2 erhalten wurde, entspricht, zeigt. Die Sequenzen wurden unter Verwendung des FASTP Programms verglichen. Die Vergleiche gelten nur für den Bereich jeder Sequenz, der dem entspricht, der für MIP-2, wie in Fig. 2 angeordnet, erhältlich ist. Ins. = unbedeutend.
FIGUR 4 zeigt eine Immunoblotanalyse, die die Beziehung zwischen MIP-2 und anderen Mitgliedern der Plättchenfaktor 4 Familie kennzeichnet. (A) Die Silberanfärbung eines Doppels des Gels, das für den Immunoblot von MIP-2 verwendet wurde. (B) Immunoblot von MIP-2: Spur 1 - Gereinigtes MIP-2; Spur 2 - Überstand von Endotoxin-stimulierten RAW 264.7 Zellen, Spur 3 - Überstand von nichtstimulierten Thioglycolat-stimulierten peritonealen Mausmakrophagen; Spur 4 - Überstand von Endotoxin- stimulierten, Thioglycolat-stimmulierten peritonealen Mausmakrophagen; Spur 5 - gereinigtes NAP-1 Protein; Spur 6 - Überstand von COS-Zellen, die mit dem Plasmid allein transfektiert sind; Spur 7 - Überstand von COS-Zellen, die mit dem Plasmid, das das humane gro Gen enthält, transfektiert sind; Spur 8 - Überstand von COS-Zellen, die mit dem Plasmid, das das Hamster gro Gen enthält, transfektiert sind. Spuren 7 und 8 sind auf dem Immunoblot (4b) umgekehrt angeordnet.
FIGUR 5 ist eine graphische Darstellung von menschlicher polymorphkerniger Chemotaxis und Chemokinese als Reaktion auf MIP-2. Die Chemotaxis (dunkle Balken) wurde gemessen, indem man MIP-2 nur in den unteren Napf der Kammer einbrachte. Die Chemokinese (helle Balken) wurde gemessen, indem man die gleiche Konzentration von MIP-2 in die oberen und unteren Kammern einbrachte. fMet-Leu-Phe (fMLP) wurde in einer Konzentration von 10&supmin;&sup8; M verwendet.
FIGUR 6 ist eine Darstellung der N-terminalen Teilsequenz des inflammatorischen Cytokins der vorliegenden Erfindung.
FIGUR 7 zeigt die vollständige Nucleotidsequenz eines cDNA Klons für MIP-2. Das vorhergesagte translatierte Molekulargewicht des Vorläuferpeptides beträgt 10.622,52. Die reife Peptidsequenz, die bei Position 1 beginnt, beträgt 74 Aminosäuren in der Länge.

Genaue Beschreibung

Gemäß der vorliegenden Erfindung können herkömmliche molekularbiologische, mikrobiologische und rekombinante DNA- Techniken, die im Fachwissen liegen, angewandt werden. Solche Techniken sind vollständig in der Literatur beschrieben. Siehe z.B. Maniatis, Fritsch & Sambrook, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (1982); "DNA Cloning: A Practical Approach" Bände I und II (D.N. Glover Hrsg. 1985); "Oligonudeotide Synthesis" (M.J. Gait Hrsg. 1984); "Nucleic Acid Hybridization" (B.D. Hames & S.J. Higgins Hrsg. 1985) "Transcription And Translation" (B.D. Hames & S.J. Higgins Hrsg. 1984); "Animal Cell Culture" (R.I. Freshney Hrsg. 1986); "Immobilized Cells And Enzymes" (IRL Press, 1986); B. Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning" (1984).
Deshalb sollen die folgenden Begriffe, wenn sie hier auftreten, die unten aufgeführten Bedeutungen haben.
Es ist beabsichtigt, den Begriff "Stimulus" und dessen Plural, wie hier verwendet, auf invasive Ereignisse wie eine Infektion, als auch auf Zustände, die durch eine Verletzung verursacht sind, und auf idiopathische oder spontane Zustände, die zum Beispiel aus zellulären oder metabolischen Störungen oder anderen Ursachen hervorgehen können, anzuwenden.
Die Begriffe "inflammatorisches Cytokin", "Makrophageninflammatorisches Cytokin 2" und "MIP-2", wie in der vorliegenden Anmeldung und den Ansprüchen durchgehend verwendet, betrifft ein Proteinmaterial mit den N-terminalen Teilsequenzdaten, die in den FIGUREN 2 und 6 dargestellt sind, die reife Peptidsequenz, die in FIGUR 7 dargestellt ist, und das Aktivitätenprofil, das hier und in den Ansprüchen dargestellt ist. Demzufolge werden Proteine mit ähnlichen Sequenzen wie denen, die hier aufgeführt sind, die aber im wesentlichen eine gleichwertige oder geänderte Aktivität zeigen, ebenso umfaßt. Diese Veränderungen können wohlüberlegt sein, wie zum Beispiel Veränderungen, die über gezielte Mutagenese erhalten wurden, oder die zufällig sein können, wie solche, die über Mutationen bei den Wirten, die MIP-2 Hersteller sind, erhalten werden. Von den Begriffen "inflammatorisches Cytokin", "Makrophagen-inflammatorisches Protein 2" und "MIP-2" ist auch beabsichtigt, daß sie in ihrem Rahmen die Proteine, die spezifisch hier aufgeführt sind als auch alle anderen im wesentlichen homologen Analoga und allelische Variationen umfassen.
Ein "Replikon" ist jedes genetische Element (z.B. Plasmid, Chromosom, Virus), das in vivo als eine unabhängige Einheit der DNA-Replikation fungiert; d.h. in der Lage ist, die Replikation unter der eigenen Kontrolle durchzuführen.
Ein "Vektor" ist ein Replikon wie ein Plasmid, Phage oder Cosmid, an das ein anderes DNA-Segment angebracht werden kann, so daß es die Replikation des angebrachten Segmentes zustande bringt.
Ein "DNA-Molekül" bezieht sich auf die polymere Form von Desoxyribonucleotiden (Adenin, Guanin, Thymin oder Cytosin) entweder auf deren einzelsträngige Form oder auf eine doppelsträngige Helix. Dieser Begriff bezieht sich nur auf die Primär- und Sekundärstruktur des Moleküls und schränkt diesen nicht auf irgendwelche besonderen tertiären Formen ein. Somit umfaßt dieser Begriff doppelsträngige DNA, die unter anderem in linearen DNA-Molekülen (z.B. in Restriktionsfragmenten), Viren, Plasmiden und Chromosomen gefunden wird. Wenn die Struktur von besonderen doppelsträngigen DNA-Molekülen diskutiert wird, können die Sequenzen, die hier gemäß der normalen Konvention, daß man die Sequenz nur in der 5' bis 3' Richtung entlang des nichttranskribierten DNA-Stranges (d.h. des Stranges mit einer Sequenz, die homolog zur mRNA ist) angibt, beschrieben werden.
Eine DNA "kodierende Sequenz" ist eine doppelsträngige DNA- Sequenz, die in vivo transkribiert und in ein Polypeptid translatiert wird, wenn sie unter der Kontrolle von geeigneten regulatorischen Sequenzen angeordnet ist. Die Grenzen der kodierenden Sequenz werden durch ein Startkodon am 5' (Amino) Terminus und ein Translationsstopkodon am 3' (Carboxyl) Terminus bestimmt. Eine kodierende Sequenz kann, ist aber nicht darauf begrenzt, prokaryotische Sequenzen, cDNA von eukaryotischer mRNA, genomische DNA-Sequenzen von eukaryotischer (z.B. Säugetier) DNA, und sogar synthetische DNA-Sequenzen umfassen. Ein Polyadenylierungssignal und eine Transkriptionsterminationssequenz wird gewöhnlicherweise 3' zu der kodierenden Sequenz angeordnet.
Die transkriptionalen und translationalen Kontrollsequenzen sind regulatorische DNA Sequenzen wie Promotoren, Enhancer, Polyadenylierungssignale, Terminatoren und ähnliches, die die Expression einer kodierenden Sequenz in einer Wirtszelle bewirken.
Eine "Promotorsequenz" ist ein regulatorischer DNA Bereich, der in der Lage ist, eine RNA-Polymerase in einer Zelle zu binden und die Transkription einer stromabwärts (3' Richtung) kodierenden Sequenz zu initiieren. Für Definitionszwecke der vorliegenden Erfindung ist die Promotorsequenz an ihrem 3' Terminus von der Transkriptionsinitiationsstelle gebunden und dehnt sich stromaufwärts (5' Richtung) aus, um die minimale Anzahl von Basen oder Elementen, die notwendig sind, um eine Transkription auf Leveln, die über dem Hintergrund nachweisbar sind, zu initiieren, einzuschließen. Innerhalb der Promotorsequenz werden eine Transkriptionsinitiationsstelle (die herkömmlicherweise über die Kartierung mit der Nuklease S1 definiert ist) als auch eine Protein-bindende Domäne (Consensussequenzen), die für die Bindung der RNA-Polymerase verantwortlich sind, gefunden. Eukaryotische Promotoren werden häufig, aber nicht immer, "TATA"-Boxen und "CAT"-Boxen enthalten. Prokaryotische Promotoren enthalten zusätzlich zu den -10 und -35 Consensussequenzen Shine-Dalgarno-Sequenzen.
Eine kodierende Sequenz ist in einer Zelle "unter der Kontrolle" von transkriptionalen und translationalen Kontrollsequenzen, wenn die RNA-Polymerase die kodierende Sequenz in mRNA transkribiert, die dann in das Protein, das durch die kodierende Sequenz kodiert wird, translatiert wird.
Eine "Signalsequenz" kann vor der kodierenden Sequenz eingeschlossen werden. Diese Sequenz kodiert ein Signalpeptid, N-terminal vor dem Polypeptid, das der Wirtszelle mitteilt, das Polypeptid an die Zelloberfläche zu führen oder das Polypeptid in das Medium zu sekretieren, und dieses Signalpeptid wird von der Wirtszelle, bevor das Protein die Zelle verläßt, abgetrennt. Die Signalsequenzen findet man mit unterschiedlichsten Proteinen, die aus Prokaryoten und Eukaryoten stammen, verbunden. Zum Beispiel wird der Alpha Faktor, ein natürliches Hefeprotein, aus der Hefe sekretiert, und dessen Signalsequenz kann an heterologe Proteine, die in das Medium sekretiert werden sollen, angebracht werden (Siehe US-Patent 4,546,082, EPO 0 116 201, Veröffentlichungsdatum 12. Januar 1983; US-Patentanmeldung Aktz. Nr. 522,909, eingereicht am 12. August 1983). Weiterhin hat man gefunden, daß der Leader des Alpha-Faktors und dessen Analoga heterologe Proteine aus unterschiedlichen Hefen wie Saccharomyces und Kluyveromyces sekretieren (EPO 88312306.9, eingereicht am 23. Dezember 1988; US-Patentanmeldung Aktz. Nr. 139,682, eingereicht am 30. Dezember 1987 und EPO Veröff. Nr. 0 301 669, Veröffentlichungstag 1. Februar 1989).
Eine Zelle wurde durch exogene oder heterologe DNA "transformiert", wenn eine solche DNA in das Innere der Zelle eingebracht wurde. Die transformierende DNA kann oder kann nicht in die chromosomale DNA, die das Genom der Zelle bildet, integriert (kovalent gebunden) werden. In Prokaryoten, Hefe und Säugetierzellen kann zum Beispiel die transformierende DNA auf einem episomalen Element wie einem Plasmid gehalten werden. Hinsichtlich eukaryotischer Zellen ist eine stabil transformierte Zelle eine, bei der die transformierende DNA in das Chromosom eingebaut wurde, so daß diese an die Tochterzellen über Chromosomenreplikation vererbt wird. Diese Stabilität wird durch die Fähigkeit der eukaryotischen Zelle gezeigt, Zellinien oder Klone, die aus einer Population von Tochterzellen, die die transformierende DNA enthalten, besteht, zu etablieren. Ein "Klon" ist eine Population von Zellen, die von einer einzelnen Zelle oder einem gemeinsamen Vorfahr über Mitose abstammen. Eine "Zellinie" ist ein Klon einer primären Zelle, die in vitro zu einem stabilen Wachstum über viele Generationen in der Lage ist.
Zwei DNA-Sequenzen sind "im wesentlichen homolog", wenn wenigstens annähernd 75% (bevorzugt wenigstens annähernd 80%, und am bevorzugtesten wenigstens annähernd 90 oder 95%) der Nukleotide über die definierte Länge der DNA-Sequenzen paaren. Die Sequenzen, die im wesentlichen homolog sind, können durch Vergleichen der Sequenzen unter Verwendung von Standardsoftware, die in Sequenzdatenbanken erhältlich ist, oder in einem Southern Hybridisierungsexperiment unter zum Beispiel stringenten Bedingungen, die für das spezielle System definiert sind, identifiziert werden. Das Definieren der geeigneten Hybridisierungsbedingungen liegt innerhalb des Fachwissens. Siehe z.B. Maniatis et al., oben; DNA Cloning, Vols. I & II, oben; Nucleic Acid Hybridization, oben.
Ein "heterologer" Bereich des DNA-Konstruktes ist ein identifizierbarer Abschnitt der DNA innerhalb eines größeren DNA-Moleküls, der in der Natur mit dem größeren Molekül nicht in Verbindung gefunden wird. Somit wird, wenn der heterologe Bereich ein Säugetiergen kodiert, das Gen gewöhnlicherweise von DNA flankiert, die die genomische DNA des Säugetiers in dem Genom des Ursprungsorganismusses nicht flankiert. Ein anderes Beispiel einer heterologen kodierenden Sequenz ist ein Konstrukt, wo die kodierende Sequenz selbst nicht in der Natur gefunden wird (z.B. eine cDNA, wo die genomische kodierende Sequenz Introns enthält, oder synthetische Sequenzen mit Kodons, die von dem ursprünglichen Gen verschieden sind). Allelische Variationen oder natürlicherweise auftretende Mutationsereignisse ergeben keinen heterologen Bereich der DNA, wie hier definiert.
Eine "A" umfassende Zusammensetzung (wobei "A" ein einzelnes Protein, DNA-Molekül, Vektor, etc. ist) ist im wesentlichen frei von "B" (wobei "B" ein oder mehrere verunreinigende Proteine, DNA-Moleküle, Vektoren, etc umfaßt), wenn wenigstens 75 Gew.-% des Proteins, der DNA, des Vektors (abhängig von der Kategorie der Arten, zu der A und B gehören) in der Zusammensetzung "A" ist. Bevorzugt umfaßt "A" wenigstens annähernd 90 Gew.-% von den A+B Arten in der Zusammensetzung, am bevorzugtesten wenigstens annähernd 99 Gew.-%. Es ist auch bevorzugt, daß eine Zusammensetzung, die im wesentlichen frei von einer Verunreinigung ist, nur eine Art mit einem einzigen Molekulargewicht mit der Aktivität oder der Eigenschaft der interessierenden Art enthält.
Ein "Antikörper" ist jedes Immunglobulin, einschließlich Antikörpern oder Fragmenten davon, die ein spezifisches Epitop binden. Der Begriff umfaßt unter anderem polyklonale, monoklonale und chimäre Antikörper, wobei die zuletzt erwähnten in den US-Patenten Nr. 4,816,397 und 4,816,567 weiter genau beschrieben sind.
Die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellte Intronfreie DNA ist neu, da geglaubt wird, daß die natürlicherweise auftretenden menschlichen Gene Introns enthalten. Daher schließt der Begriff "Intron-frei" die DNA-Sequenzen, die natürlicherweise in den Chromosomen von menschlichen oder Rinderzellen vorkommen; aus. Die vorliegende Erfindung schließt auch die Intron-freien cDNA-Sequenzen, die aus den hier offenbarten DNA-Sequenzen erhältlich sind, ein.
In einem primären Aspekt betrifft die Erfindung die Isolierung und Identifizierung eines neu entdeckten speziellen Faktors, der im folgenden als inflammatorisches Cytokin, Makrophageninflammatorisches Protein 2 oder MIP-2 bezeichnet ist, von dem man fand, daß er in Makrophagen oder Makrophagenzellinien, die mit Stoffen, die hier als Stimulatorstoffe, die kennzeichnenderweise einen invasiven Stimulus wie Bakterien, Virus, bestimmte Tumoren, Protozoen und andere Toxine wie Endotoxin, oder einen idiopathischen Zustand begleiten, bezeichnet werden, stimuliert werden, vorhanden ist. Wie bei dem in dem US-Patent Nr. 4,603,106 offenbarten Mediatorstoff scheint das vorliegende inflammatorische Cytokin, von dem man bestimmt hat, daß es ein Bestandteil des früheren Mediatorstoffes ist, in der Lage zu sein, bestimmte Zustände wie eine Entzündung, die sich in den Geweben eines Säugetieres entwickelt, welches die Reaktion eines Säugetieres in einem stimulierten oder spontan pathologischen Zustand wiedergibt, zu verursachen.
Insbesondere scheint das inflammatorische Cytokin geeignet zu sein, eine lokalisierte Entzündung zu induzieren, wenn es subkutan verabreicht wird, wobei die Entzündung durch den Einstrom von polymorphkernigen Zellen gekennzeichnet ist. Auch ist das Cytokin für menschliche polymorphkernige Leukozyten ein wirksames chemotaktisches Mittel, wobei es in vitro wenig oder keine Chemokinese oder einen oxidativen Burst in humanen Neutrophilen induziert, wobei die Zustände den Einfluß eines Cytokins, das bei der Mobilisierung des Säugetierwirtes gegen einen invasiven Stimulus beteiligt ist, wiedergeben. Während die vollständige und genaue Rolle, die von dem vorliegenden inflammatorischen Cytokin gespielt wird, unklar ist, wird angenommen, daß das Cytokin in Verbindung mit anderen zuvor identifizierten Faktoren und solchen, die noch aufgeklärt werden müssen, als ein Teil eines Kommunikationssystems zwischen dem Immunsystem des Wirtes und anderen Körpergeweben und Organen fungiert.
Die Fähigkeit des vorliegenden inflammatorischen Cytokin, an Heparin zu binden, gab Anlaß zu der Überlegung, daß das Cytokin bestimmten Heparin-bindenden Wachstumsfaktoren wie FGF oder PDGF entsprechen könnte. Die Daten, die jedoch zeigen, daß das inflammatorische Cytokin nicht für glatte Muskelzellen mitogen ist, legen einen Unterschied zu diesen bekannten Wachstumsfaktoren nahe. Demzufolge ist zum augenblicklichen Zeitpunkt sicher, daß das Cytokin der vorliegenden Erfindung an der Entwicklung der inflammatorischen Reaktion, von der bekannt ist, daß sie ein Teil der Wirtsantworten wie gegen eine Invasion ist, teilnimmt.
Von dem vorliegenden inflammatorischen Cytokin wurde bestätigt, daß es ein Protein umfaßt, das ein Molekulargewicht von annähernd 6.009 Dalton auf der NAaDodSO&sub4;-PAGE hat und daß es von einer Gelfiltrationssäule mit einem apparenten Molekulargewicht von annähernd 10.000 Dalton eluiert. Die cDNA für MIP-2 wurde kloniert und sagt ein reifes Protein mit 74 Aminosäuren in der Länge und einem vorhergesagten Molekulargewicht von 7.908 voraus. Im Gegensatz zu MIP-1 und Cachectin/TNF ist MIP-2 kationisch und bindet nicht an eine bei pH 8,0 äquilibrierte Anionenaustauschersäule. Weiterhin bestätigt die Bestimmung der N-terminalen Aminosäureteilsequenz und der vollständigen Sequenz des reifen Proteins, daß sich die spezifische Proteinstruktur des vorliegenden inflammatorischen Cytokins von der anderer bekannter Faktoren unterscheidet. Demzufolge bestehen sowohl strukturelle als auch funktionelle Unterschiede zwischen dem vorliegenden inflammatorischen Cytokin und den bekannten Faktoren aus dem Stand der Technik, wie es auch durch die in Beispiel 1 dargestellten Daten bestätigt wird.
Insbesondere besitzt das inflammatorische Cytokin der vorliegenden Erfindung bestimmte andere Eigenschaften in Verbindung mit denen, die oben erwähnt sind, dahingehend, daß es in der Lage ist, an Heparin bei hohen Salzkonzentrationen, wie z.B. annähernd 0,7 M, zu binden, und daß es eine Koloniestimulierende Faktoraktivität zeigt. Das Cytokin unterscheidet sich auch in solchen Aktivitäten, die fehlen, wie dessen Ungeeignetheit, das anabolische Enzym Lipoproteinlipase (LPL) zu supprimieren, die Cytotoxizität von Cachectin/TNF- empfindlichen L929-Zellen zu bewirken, die Blastogenese von Endotoxin-resistenten C3H/HeJ Thymocyten zu stimulieren oder die Herstellung von Cachectin/TNF bei primären Thioglycolatstimulierten Mausmakrophagenzellen zu induzieren. Diese letzteren Aktivitäten werden sämtlichst von den anderen bekannten von Makrophagen-abstammenden Mediatorfaktoren, deren allgemeine Eigenschaften und Aktivitäten diese als Teilnehmende bei der Wirtsreaktion gegen eine Invasion identifiziert haben, gezeigt. Weiterhin ist das vorliegende inflammatorische Cytokin von anderen Faktoren wie MIP-1 über dessen Ungeeignetheit, Fieber bei Kaninchen zu induzieren, oder die Superoxidbildung oder den respiratorischen Burst in menschlichen Neutrophilen zu induzieren, unterscheidbar.
Das oben dargestellte Aktivitätsprofil unterscheidet dementsprechend das vorliegende inflammatorische Cytokin von solchen bekannten Faktoren und bestätigt in Verbindung mit den hier dargestellten Aminosäuresequenzdaten, daß das vorliegende inflammatorische Cytokin in der Tat von den anderen von Makrophagen-abstammenden Mediatorfaktoren verschieden ist.
Wie vorher ausgeführt, sind die in FIGUR 2 gezeigte primäre Aminosäuresequenz und die in FIGUR 7 gezeigte vollständige Sequenz nur veranschaulichend, und ähnliche Sequenzen können zu Proteinen führen, die eine im wesentlichen äquivalente oder gesteigerte Aktivität aufweisen. Diese Veränderungen können wohlüberlegt sein, wie zum Beispiel solche über gezielte Mutagenese erhaltenen Modifikationen, oder können zufällig sein, wie solche, die über Mutationen bei Wirten, die MIP-2 Hersteller sind, erhalten werden. Solche Modifikationen werden sämtlichst in der vorliegenden Erfindung, solange wie die oben definierte MIP-2 Aktivität beibehalten wird, eingeschlossen. Dementsprechend umfaßt die Definition von MIP-2, wie hier und an anderer Stelle in der Beschreibung ausgeführt, Proteine mit einer Aminosäuresequenz, die im wesentlichen äquivalent zu denen aus den Figuren 2 und 7 sind, als auch andere im wesentlichen homologen Analoga und allelische Variationen innerhalb des Betrachtungsumfanges.
Die Herstellung des inflammatorischen Cytokins wurde in Kürze zuvor hier diskutiert, und ist, wie bestätigt, im Fall des natürlichen Stoffes dazu in der Lage, durch die Initiation der Inkubation einer Vielzahl von Zellen mit Stimulatorstoffen aus invasiven Stimuli abzulaufen. Insbesondere kann die Zellinie RAW 264.7 verwendet werden, um die Herstellung des Stoffes, aus dem das inflammatorische Cytokin isoliert werden kann, zu initiieren. Die Mausmakrophagenzellinie RAW 264.7 hat die Isolation des inflammatorischen Cytokins in Mengen, die groß genug sind, um eine Analyse und Reinigung zu ermöglichen, erleichtert. Natürlich sind auch andere Zellinien oder andere Quellen für die Herstellung entweder des Materials, aus dem das inflammatorische Cytokin anschließend isoliert wird, oder des inflammatorischen Cytokins selbst hier eingeschlossen, und die vorliegende Erfindung ist dementsprechend nicht begrenzt.
Wie zuvor hier diskutiert, werden alternative Mittel wie die genetische Replikation die in Übereinstimmung mit vielen der im Stand der Technik gut bekannten generischen Prinzipien der Rekombinationstechnik durchgeführt werden können, gemäß der vorliegenden Erfindung hier umfaßt.
Dementsprechend können MIP-2 Nukleinsäuresequenzen aus der abgeleiteten Aminosäuresequenz über rekombinante DNA-Verfahren wie über ein Screening von reversen Transkripten von mRNA oder über ein Screening genomischer Libraries von jeder Zelle erhalten werden. Die DNA kann auch über die Synthese der DNA unter Verwendung der gewöhnlicherweise verfügbaren Techniken und eines DNA-Synthesegeräts erhalten werden. Die Synthese kann vorteilhaft sein, da einzigartige Restriktionsschnittstellen zum Zeitpunkt der Herstellung der DNA eingeführt werden können, wodurch man die Verwendung des Genes bei Vektoren, die Restriktionsschnittstellen, die in der natürlichen Quelle nicht weiter vorhanden sind, enthalten, erleichtert. Weiterhin kann in die DNA jede gewünschte Schnittstellenmodifikation durch die Synthese eingeführt werden, ohne daß ein Bedarf entsteht, die DNA über Mutagenese weiter zu modifizieren.
Ein allgemeines Verfahren für die Isolation von für das vorliegende inflammatorische Cytokin kodierender DNA aus menschlichen, Maus- oder aus anderen Quellen ist es, eine cDNA Library aus mRNA, die aus den geeigneten Zellen oder Gewebe isoliert wurde, herzustellen; und diese mit markierten DNA- Sonden, die für Bereiche der Polypeptidkette kodieren, zu durchsuchen, um Klone in der cDNA Library nachzuweisen, die homologe Sequenzen enthalten. Alternativ kann man die DNA über die Vervielfältigung der cDNA (aus mRNA) mittels der Polymerasekettenreaktion (Polymerase Cham Reaction, PCR)) isolieren und subklonieren und mit markierten DNA-Sonden durchsuchen; und dann die Klone über Restriktionsenzym-Analysen und Nukleinsäuresequenzierung analysieren, um so Klone mit vollständigen Länge (full-length-Klone) zu identifizieren. Wenn full-length-Klone in der Library nicht vorhanden sind, können geeignete Fragmente aus den verschiedenartigen Klonen gewonnen und an den den Klonen gemeinsamen Restriktionsschnittstellen ligiert werden, um einen für ein Molekül mit vollständiger Länge kodierenden Klon zusammenzusetzen.
Eine geeignete und bevorzugte DNA-Sonde ist in den beiliegenden Beispielen dargestellt. Es können jegliche Sequenzen, die am 5' Ende der MIP-2 cDNA fehlen, durch die 3'-Verlängerung der synthetischen Oligonukleotide, die komplementär zu MIP-2 Sequenzen sind, unter Verwendung von mRNA als Matrize (die sogenannte Primerverlängerung) erhalten werden, oder homologe Sequenzen können von bekannten cDNAs, die, wie in FIGUR 7 gezeigt, aus Maussequenzen abgeleitet sind, zur Verfügung gestellt werden. Dieses wird genauer in Beispiel 2 beschrieben; es wird jedoch erkannt, daß der Durchschnittsfachmann, der einmal mit der Intron-freien DNA, die für Maus MIP-2 kodiert, und dessen Leadersequenzen, wie zuvor hier beschrieben, versehen ist, erkennt, daß andere genau hybridisierenden Sonden äus den beschriebenen Sequenzen hergestellt werden können, um das gewünschte Gen leicht zu erhalten.
Die Vektoren werden verwendet, um die Manipulation der DNA, die für das MIP-2 Polypeptid kodiert, entweder für die Herstellung von großen Mengen an DNA für die weitere Bearbeitung (Klonierungsvektoren) oder für die Expression des MIP-2 Polypeptides (Expressionsvektoren) zu vereinfachen. Die Vektoren umfassen Plasmide, Viren (einschließlich Phagen) und integrierbare DNA-Abschnitte, d.h. Abschnitte, die in das Wirtsgenom durch Rekombination integrierbar sind. Die Klonierungsvektoren müssen keine Expressionskontrollsequenzen enthalten. Es werden jedoch Kontrollsequenzen in einem Expressionsvektor benötigt, und diese Kontrollsequenzen umfassen transkriptionale und translationale Kontrollsequenzen wie einen transkriptionalen Promotor, eine wahlweise Operatorsequenz, um die Transkription zu kontrollieren, eine Sequenz, die für geeignete Ribosomenbindestellen (für die prokaryotische Expression) kodiert, und Sequenzen, die die Termination der Transkription und der Translation kontrollieren. Der Expressionsvektor sollte bevorzugt ein Selektionsgen enthalten, um die stabile Expression von MIP-2 zu erleichtern, die und/oder um Transformanten zu identifizieren. Das Selektionsgen für die Erhaltung der Expression kann jedoch auf einem gesonderten Vektor in Kotransformations-Systemen unter Verwendung von eukaryotischen Wirtszellen zur Verfügung gestellt werden.
Für die Expression geeignete Vektoren werden allgemein ein Replikon (Ursprung der Replikation, für die Verwendung bei sich nicht integrierenden Vektoren) und Kontrollsequenzen, die von den Spezies abgeleitet sind, die mit dem beabsichtigten Expressionswirt kompatibel sind. Mit dem Begriff "replizierbarer" Vektor wie hier verwendet, ist beabsichtigt, Vektoren, die solche Replikons enthalten als auch Vektoren, die über die Integration in das Wirtsgenom repliziert werden, zu umfassen. Die Zellen werden dann mit Vektoren, die die für MIP- 2 kodierende DNA enthalten, transformiert oder transfektiert und werden nun als transformierte Wirtszellen bezeichnet. Das MIP-2, das von diesen transformierten Wirten exprimiert wird, wird entweder intrazellulär abgelagert oder in den periplasmatischen Raum oder in den Kulturüberstand sekretiert, was von der ausgewählten Wirtszelle und dem Vorhandensein von geeigneten Verarbeitungssignalen in dem exprimierten Peptid wie z.B. von homologen oder heterologen Signalsequenzen abhängt.
Geeignete Wirtszellen für die Expression können prokaryotische oder eukaryotische Zellen sein. Die Prokaryoten schließen Gramnegative oder Gram-positive Organismen wie zum Beispiel E. coli oder Bacillus subtilis ein. Die eukaryotischen Zellen schließen Hefe, Baculovirus oder höhere eukaryotische Zellen wie die etablierten Zellinien eines Säugetierursprunges ein.
Die Expressionsvektoren für Wirtszellen umfassen normalerweise einen Ursprung der Replikation (wenn es nicht ein sich integrierender Vektor ist), einen Promotor, der stromaufwärts von der für MIP-2 kodierenden Sequenz mit einer Ribosomen- Bindestelle gemeinsam angeordnet ist, eine Polyadenylierungsstelle, und eine transkriptionale Terminationssequenz. Die Fachleute werden wissen, daß bestimmte dieser Sequenzen bei der Expression bei bestimmten Wirten nicht benötigt werden. Ein sich nicht integrierender Expressionsvektor erfordert für die Verwendung bei Mikroorganismen nur einen Ursprung der Replikation, der von dem Wirt erkannt wird, einen Promotor, der bei dem Wirt arbeiten wird, und ein Selektionsgen.
Ein Expressionsvektor wird gemäß der vorliegenden Erfindung konstruiert, so daß die für MIP kodierende Sequenz in dem Vektor mit den geeigneten regulatorischen Sequenzen angeordnet ist, wobei die Anordnung und Orientierung der kodierenden Sequenz hinsichtlich der Kontrollsequenzen so erfolgt, daß die kodierende Sequenz unter der "Kontrolle" der Kontrollsequenzen (d.h. die RNA-Polymerase, die an das DNA-Molekül bei den Kontrollsequenzen bindet, transkribiert die kodierende Sequenz) transkribiert und translatiert wird. Die Kontrollsequenzen können an die kodierende Sequenz vor der Einfügung in einen Vektor, wie den oben beschriebenen Klonierungsvektoren, ligiert werden. Alternativ kann die kodierende Sequenz direkt in einen Expressionsvektor, der bereits die Kontrollsequenzen und eine geeignete Restriktionsschnittstelle enthält, kloniert werden. Für die Expression von MIP-2 in Prokaryoten und Hefe werden die Kontrollsequenzen notwendigerweise heterolog hinsichtlich der kodierenden Sequenz sein. Wenn die Wirtszelle ein Prokaryot ist, ist es auch notwendig, daß die kodierende Sequenz frei von Introns (z.B. cDNA) ist. Wenn die ausgewählte Wirtszelle eine Säugetierzelle ist, können die Kontrollsequenzen heterolog oder homolog zu der für MIP kodierenden Sequenz sein, und die kodierende Sequenz kann entweder Introns enthaltende genomische DNA oder cDNA sein.
Die Expressionsvektoren müssen einen Promotor enthalten, der von dem Wirtsorganismus erkannt wird. Die gemeinhin bekannten und verfügbaren Promotoren, die bei der prokaryotischen rekombinanten DNA-Expression verwendet werden, beinhalten die β-Lactamase (Penicillinase) und Lactosepromotorsysteme, ein Tryptophan (trp) Promotorsystem und den tac Promotor. Während diese gemeinhin verwendet werden, sind andere bekannte mikrobiologische Promotoren auch geeignet.
Zusätzlich zu Prokaryoten können eukaryotische Zellen wie Hefe mit für MIP-2 kodierenden Vektoren transformiert werden. Hefevektoren werden allgemein einen Ursprung der Replikation oder eine autonom replizierende Sequenz (ARS, Autonomously Replicating Sequence), (wenn nicht integrierend), einen Promotor, die für MIP-2 kodierende DNA, Sequenzen für die Polyadenylierung und die Transkriptionstermination, und eine Selektionsgen enthalten.
Von besonderem Interesse für die vorliegende Erfindung sind Hefearten innerhalb der Gattungen Pichia, Kluyveromycesa Saccharomyces, Schizosaccharomyces und Candida. Von besonderem Interesse sind die Saccharomycesarten S. cerevisiae, S. carlsbergensis, S. diastaticus, S. douglasii, S.kluyveri, S. norbensis und S. oviformis. Arten von besonderem Interesse in der Gattung Kluyveromyces schließen K. lactis ein, und in der Gattung Pichia schließen P. pastoris ein. Da die Klassifikation von Hefe in der Zukunft sich ändern könnte, wird für die Zwecke dieser Erfindung die Hefe definiert wie beschrieben in Biology and Activities of Yeast (F.A. Skinner, S.M. Passmore und R.R. Davenpoort, Hrsg. 1980) (SOC. APP. BACTERIOL. SYMP. SERIES NO. 9). Zusatzlich zum Vorstehenden werden die Fachleute vermutlich mit der Biologie von Hefe und der Manipulation der Hefegenetik vertraut sein. Siehe zum Beispiel Biochemistry and Genetics of Yeast (M. Bacila, B.L. Horecker und A.O.M. Stoppani Hrsg. 1978); The Yeasts (A.H. Rose und J.S. Harrison Hrsg., 2te Ausgb., 1987); The Molecular Biology of The Yeast Saccharomyces (Strathern et al. Hrsg. 1981). Die Offenbarung der vorstehenden Dokumente sind hiermit unter Bezugnahme aufgenommen.
Die geeigneten Promotorsequenzen in Hefevektoren beinhalten die Promotoren für die glycolytischen Enzyme wie Enolase, 3- Phosphoglyceratkinase, Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose- 6-phosphatisomerase, 3-Phosphoglyceratmutase, Pyruvatkinase, Triosephosphatisomerase, Phosphoglucoseisomerase und Glucokinase.
Andere Hefepromotoren, die den zusätzlichen Vorteil von einer durch Wachstumsbedingungen kontrollierten Transkription aufweisen, sind die Promotorbereiche für Alkoholdehydrogenase 1 oder 2, Isocytochrome C, saure Phosphatase als auch Enzyme, die für die Maltose- und Galactoseverwertung verantwortlich sind.
Höhere eukaryotische Zellkulturen können entweder von Vertebraten- oder Invertebratenzellen, einschließlich Insekten verwendet werden, und die Verfahren für die Züchtung davon sind bekannt. Siehe zum Beispiel Tissue Culture, Academic Press, Kruse und Patterson, Herausgeber (1973).
Geeignete Wirtszellen für die Expression von MIP-2 in höheren Eukaryoten umfassen: Affennieren CVI-Linie, transformiert mit SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); Babyhamsternierenzellen (BHK, ATCC CRL 10); Chinesische Hamster Ovarzellen-DHFR (beschrieben von Urlaub und Chasin, PNAS (USA) 77: 4216 (1980)); Maus Sertolizellen (TM4, Mather, J.P., Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980); Affennierenzellen (CVI ATCC CCL 70); African Green Monkey-Nierenzellen (VERO-76, ATCC CRL-1587); menschliche zervikale Karzinomazellen (HELA, ATCC CCL 2), Hundenierenzellen (MDCK, ATCC CCL 34); Buffalo Rattenleberzellen (BRL 3A, ATCC CRL 1442); menschliche Lungenzellen (W138, ATCC CCL 75); menschliche Leberzellen (Hep G2, HB 8065); Maus Mammatumor (MMT 060652, ATCC CCL 51); Rattenhepatomazellen (HTC, M1, 54, Baumann, M., et al., J. Cell. Biol. 85: 1-8 (1980)) und TRI- Zellen (Mather, J.P., et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383: 44-68 (1982)). Gewöhnlich verwendete Promotoren stammen vom Polyoma, Adenovirus 2, und Simianvirus 40 (SV40) ab. Es wird bekannt Elein, daß, wenn die Expression in eukaryotischen denn in prokaryotischen Zellen erfolgt, das rekombinante MIP-2 ein größeres Molekulargewicht aufgrund von Glycosylierung haben kann. Es ist daher beabsichtigt, das teilweise oder vollständig glycosylierte Formen von MIP-2 mit Molekulargewichten, die größer als das vorhergesagte Molekulargewicht von 7.908 sind, als auch deren unglykosylierten Formen innerhalb des Rahmens dieser Erfindung liegen.
Eine Anzahl von prokaryotischen Expressionsvektoren ist im Stand der Technik bekannt. Siehe z.B. die US-Patente Nr. 4,440,859; 4,436,815; 4,431,740; 4,431,739; 4,428,941; 4,425,437; 4,418,149; 4,411,994; 4,366,246; 4,342,832; siehe auch U.K. Veröff. Nrn. GB 2,121,054; GB 2,008,123; GB 2,007,675; und die Europäische Veröff. Nr. 103,395. Bevorzugte prokaryotische Expressionssysteme sind in E.coli.
Andere bevorzugte Expressionsvektoren sind solche für die Verwendung bei eukaryotischen Systemen. Ein beispielhaftes eukaryotisches Expressionssystem ist das, das den Vacciniavirus verwendet, der im Stand der Technik gut bekannt ist. Siehe z.B. Macket et al. (1984) J.Virol. 49:857; "DNA Cloning", Bd. II; Seiten 191-211, oben, POT Veröff. Nr. WO 86/07593. Expressionsvektoren für Hefe sind im Stand der Technik bekannt. Siehe z.B. die US-Patent Nrn. 4,446,235; 4,443,539; 4,430,428; siehe auch die Europäischen Veröff. Nrn. 103,409; 100,561; 96,491. Ein anderes bevorzugtes Expressionssystem ist der Vektor pHS1, der die chinesischen Hamsterovarzellen transformiert. Siehe PCT Veröff. Nr. WO 87/02062. Säugetiergewebe kann mit DNA, die für einen selektionierbaren Marker wie Dihydrofolatreduktase (DHFR) oder Thymidinkinase kodiert, und mit für MIP-2 kodierende DNA kotransformiert werden.
Wenn das Wildtyp DHFR-Gen verwendet wird, ist es bevorzugt, eine Wirtszelle auszuwählen, die hinsichtlich DHFR defizient ist, wobei man die Verwendung der für DHFR-kodierenden Sequenz als Marker für die erfolgreiche Transfektion in hgt&supmin; Medium, dem Hypoxanthin, Glycin und Thymidin fehlt, ermöglicht. Eine geeignete Wirtszelle ist in diesem Fall die hinsichtlich der DHFR-Aktivität defiziente chinesische Harnsterovar(CHO)zellinie, die, wie von Urlaub und Chasin, 1980, Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) 77: 4216 beschrieben, hergestellt und gehalten wird. Es sind vom Baculovirus abstammende Expressionsvektoren für die Verwendung bei Insektenzellen im Stand der Technik bekannt und verfugbar. Siehe Lucklow und Summers, Biotechnology, 6, Seiten 47-55.
Abhängig von dem Expressionssystem und dem ausgewählten Wirt wird MIP-2 von wachsenden Wirtszellen, die mit einem exogenen oder heterologen DNA-Konstrukt wie einem oben und in Beispiel 2 hier beschriebenen Expressionsvektor transformiert sind, unter Redingungen, bei denen das MIP-2 Protein exprimiert wird, hergestellt. Das MIP-2 wird dann von den Wirtszellen isoliert und gereinigt. Wenn das Expressionssystem MIP-2 in das Wachstumsmedium sekretiert, kann das Protein direkt aus zellfreiem Medium gereinigt werden. Wenn das MIP-2 Protein nicht sekretiert wird, wird es aus den Zellysaten isoliert. Die Auswahl der geeigneten Wachstumsbedingungen und des Gewinnungsverfahrens sind im Stand der Technik bekannt.
Das rekombinant hergestellte MIP-2 kann von transformierten Zellen gemäß der bekannten Verfahren gewonnen werden. Bevorzugt wird ein Expressionsvektor verwendet, der die Sekretion von MIP-2 aus den transformierten Zellen bewirkt, wobei die Zellen durch Zentrifugation abgetrennt werden können. MIP-2 wird typischerweise mittels allgemeiner Proteinreinigungstechniken, einschließlich, aber nicht darauf begrenzt, Größenausschluß, Ionenaustauschchromatographie, HPLC und ähnlichem gereinigt.
Sobald eine für MIP-2 kodierende Sequenz hergestellt oder isoliert wurde, kann diese in jeden geeigneten Vektor kloniert werden und dadurch in einer Zusammensetzung von Zellen, die im wesentlichen frei von Zellen ist, die keine für MIP-2 kodierende Sequenz enthalten (z.B. frei von anderen Libraryklonen), gehalten werden. Zahlreiche Klonierungsvektoren sind dem Fachmann bekannt. Die Beispiele von rekombinanten DNA- Vektoren für die Klonierung und die Wirtszellen, die diese transformieren können, umfassen die verschiedenartigen Bakteriophagen Lambdavektoren (E. coli), pBR322 (E. coli), pACYC177 (E. coli), pKT230 (Gram-negative Bakterien), pGV1106 (Gram-negative Bakterien), pLAFR1 (Gram-negative Bakterien), pME290 (nicht-E. coli Gram-negative Bakterien), pHV14 (E. coli und Bacillus subtilis), pBD9 (Bacillus), pIJ61 (Streptomyces), pUC6 (Streptomyces), Actinophage, C31 (Streptomyces), YIp5 (Saccharomyces), YCp19 (Saccharomyces), YEp24 (Saccharomyces), pC1/1 (Saccharomyces), XRp17 (Saccharomyces), und Rinder Papillomavirus (Säugetierzellen). Siehe allgemein DNA Cloning: Bd. I & II oben; T. Maniatis et al., oben; B. Perbal, oben; Botstein et al. (1979) GENE 8: 17-24; Brake et al. (1984) PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 81: 4642-4646; Stnichcomb et al. (1982) J. MOL. BIOL. 158: 157.
Alternativ kann MIP-2 über die herkömmliche Peptidsynthese wie zum Beispiel unter Verwendung der Prinzipien der Merrifield- Synthese und unter Verwendung von im Handel erhältlichen automatischen Geräten, die dafür ausgelegt sind, die Verfahren der Merrifield-Synthese anzuwenden, hergestellt werden. Die unter Verwendung der herkömmlichen Peptidsynthese hergestellten Peptide können unter Verwendung der herkömmlichen Affinitätschromatographie, der Gelfiltration und/oder RP-HPLC gereinigt werden.
Bei den Nucleotidsequenzen ist weiter beabsichtigt, daß MIP-2 Arlaloga innerhalb des Rahmens der vorliegenden Erfindung liegen. Analoga wie Abschnitte können zum Beispiel durch Pepsinverdau von MIP-2 hergestellt werden. Andere Analoga wie mutierte Proteine können über die normale gezielte Mutagenese von für MIP-2 kodierenden Sequenzen hergestellt werden. Analoga, die "MIP-2 Aktivität" zeigen, können über bekannte in vivo und/oder in vitro Teste identifiziert werden.
Wie oben erwähnt, kann eine für MIP-2 kodierende DNA-Sequenz eher synthetisch als kloniert hergestellt werden. Die DNA- Sequenz kann mit den geeigneten Kodons für die MIP-2 Aminosäuresequenz ausgestattet werden. Im allgemeinen wird man die bevorzugten Kodons für den geplanten Wirt auswählen, wenn die Sequenz für die Expression verwendet werden soll. Die vollständige Sequenz wird aus überlappenden Oligonudeotiden, die über Standardverfahren hergestellt werden, zusammengesetzt und zu einer vollständigen kodierenden Sequenz zusammengesetzt. Siehe z.B. Edge Nature 292:756 (1981); Nambair, et al., Science 223:1299 (1984); Jay etal. J. Biol. Chem. 259: 6311 (1984).
Die synthetischen DNA-Sequenzen ermöglichen eine bequeme Konstruktion von Genen, die MIP-2 Analoga oder "mutierte Proteine" exprimieren. Alternativ kann für mutierte Proteine kodierende DNA über die gezielte Mutagenese von natürlichen MIP-2 Genen oder cDNAs hergestellt werden, und die mutierten Proteine können direkt unter Verwendung einer herkömmlichen Polypeptidsynthese hergestellt werden.
Die gezielte Mutagenese wird allgemein verwendet, um Analoga von einer vollständigen kodierenden Sequenz zu erzeugen. Die gezielte Mutagenese wird unter Verwendung eines synthetischen Primer-Oligonucleotids, das komplementär zu einer einzeisträngigen Phagen-DNA ist, die mit der Ausnahme von bestimmten Fehlpaarungen, die die gewünschte Mutation darstellen, mutiert werden soll, durchgeführt. In Kürze, das synthetische Oligonucleotid wird als ein Primer verwendet, um die Synthese eines Stranges, der komplementär zu dem Phagen ist, zu steuern, und die sich ergebende doppelsträngige DNA wird in ein Phagen-tragendes Wirtsbakterium transformiert. Die Kulturen dieser transformierten Bakterien werden in Top Agar ausplattiert, wobei man die Plaquebildung aus einzelnen Zellen, die den Phagen enthalten, ermöglicht.
Theoretisch werden 50% der neuen Plaques den Phagen als Einzelstrang in der mutierten Form enthalten; 50% werden die ursprüngliche Sequenz enthalten. Die sich ergebenden Plaques werden mit einem phosphorylierten synthetischen Primer bei einer Temperatur, die die Hybridisierung einer exakten Paarung zuläßt, hybridisiert, wobei aber die Fehlpaarungen mit dem ursprünglichen Strang ausreichend sind, um eine Hybridisierung zu verhindern. Die Plaques, die mit der Sonde hybridisieren, werden dann herausgesucht, kultiviert und die DNA wird gewonnen.
Ein allgemeines Verfahren für den positionsspezifischen Einbau von nichtnatürlichen Aminosäuren in Proteine wird bei Christopher J. Noren, Spencer J. Anthony-Cahill, Michael C. Griffith, Peter G. Schultz, SCIENCE 244: 182-188 (April 1989) beschrieben. Dieses Verfahren kann verwendet werden, um Analoga mit nichtnatürlichen Aminosäuren zu erzeugen.
Das inflammatorische Cytokin wurde gemäß der vorliegenden Erfindung bei Mäusen, wie in Beispiel 1 ausgeführt, isoliert und analysiert. Das humane inflammatorische Cytokin (MIP-2) ist vermutlich dem Maus MIP-2 ähnlich, da das Maus MIP-2 eine Wirkung auf menschliche Neutrophile hat. Wie hier offenbart, kann diese Aktivität des inflammatorischen Cytokins durch Verabreichung des inflammatorischen Cytokins an die Stellen der Gewebeinfektion genutzt werden, um die Freisetzung von Neutrophilen an dieser Stelle zu fördern.
Wie zuvor diskutiert, kann das inflammatorische Cytokin oder dessen (deren) Bindungspartner oder andere Liganden oder Mittel, die entweder eine Nachahmung oder eine Gegenwirkung gegen das Cytokin oder eine Kontrolle über dessen Herstellung ausüben, in pharmazeutischen zusammensetzungen mit einem geeigneten Träger und in einer Stärke, die für die Verabreichung über verschiedenartige Mittel an einen Patienten mit einer Gewebeinfektion oder einer anderen pathologischen Störung wirksam ist, für die Behandlung davon, hergestellt werden. Die unterschiedlichsten Verabreichungstechniken können verwendet werden, wobei unter diesen topische Verabreichungen wie in Salben oder auf chirurgischen und anderen topischen Vorrichtungen wie chirurgischen Schwämmen, Bandagen, Tupfer und ähnliche sind. Auch können solche Zusammensetzungen über parenterale Techniken wie subkutane, intravenöse und intraperitoneale Injektionen, einschließlich der Freisetzung aus einer Waschflüssigkeit, die verwendet wird, um die Wundbereiche des Körpers zu waschen, Katheterisierungen und ähnliches verabreicht werden. Die durchschnittlichen Mengen des inflammatorischen Cytokins können variieren und sollten insbesondere auf die Empfehlungen und Verschreibungen eines qualifizierten Arztes oder Veterinärmediziners basiert werden.
Auch können Antikörper, die sowohl polyklonale als auch monoklonale Antikörper einschließen, und Drogen, die die Herstellung oder Aktivität des inflammatorischen Cytokins modulieren, bestimmte therapeutische Anwendungen haben und können daher für die Zwecke zur Behandlung der Wirkungen einer Postinfektion, die der Wirkung des inflammatorischen Cytokins, wie Entzündung und Fieber, zuzuordnen ist, verwendet werden.
Insbesondere kann das inflammatorische Cytokin verwendet werden, um sowohl polyklonale als auch monoklonale Antikörper gegen es selbst in den verschiedensten zellulären Medien über bekannte Techniken wie die Hybridomatechnik unter Verwendung von zum Beispiel fusionierten Mausmilzlymphozyten und Myelomazellen herzustellen.
Das allgemeine Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern mittels Hybridoma ist gut bekannt. Unsterbliche Antikörper-produzierende Zellinien können auch über Techniken, die von der Fusion verschieden sind, wie der direkten Transformation von B-Lymphozyten mit onkogener DNA oder der Transfektion mit dem Ebstein-Barr Virus erzeugt werden. Siehe z.B. M. Schreier et al., "Hybridoma Techniques" (1980); Hammerling et al., "Monoclonal Antibodies and T-cell Hybridomas" (1981); Kennett et al., "Monoclonal Antibodies" (1980); siehe auch US-Patent Nrn. 4,341,761; 4,399,121; 4,427,783; 4,444,887; 4,451,570; 4,466,917; 4,472,500; 4,491,632; 4,493,890.
Die Platten mit den monoklonalen Antikörpern, die gegen MIP-2 Peptide hergestellt wurden, können auf verschiedenartige Eigenschaften durchsucht werden, z.B. Isotyp, Epitop, Affinität, etc. Von besonderem Interesse sind monoklonale Antikörper, die die Aktivität von MIP-2 neutralisieren. Solche Antikörper können leicht in den MIP-2 Aktivitätstests identifiziert werden. Antikörper mit großer Affinität sind auch bei der Immunoaffinitätsreinigung von natürlichem oder rekombinantem MIP-2 verwendbar.
Die sich ergebenden Antikörper können auch in einer geeigneten pharmazeutischen Zusammensetzung hergestellt und verabreicht werden, um den ungewünschten Zustand abzuwenden oder zu behandeln. Die genauen Mengen, Verabreichungsabstände und die Verabreichungstechniken hinsichtlich solcher pharmazeutischer Zusammensetzung können in Übereinstimmung mit denen, die im medizinischen Stand der Technik bekannt sind, und hinsichtlich der spezifischen Anweisung eines qualifizierten Arztes oder Veterinärmediziners variieren.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch unterschiedliche diagnostische Anwendungen einschließlich Verfahren für den Nachweis des Vorhandenseins von invasiven Stimuli in bezug auf deren Fähigkeit, die Aktivitäten, die durch das vorliegende inflammatorische Cytokin beeinflußt werden, hervorzurufen. Wie zuvor erwähnt, kann das inflammatorische Cytokin verwendet werden, um Antikörper gegen es selbst mittels unterschiedlicher bekannter Techniken herzustellen, und solche Antikörper können dann isoliert und in Tests für das Vorhandensein des inflammatorischen Cytokins bei verdächtigen Säugetierwirten verwendet werden.
Der (die) Antikörper gegen das inflammatorische Cytokin kann (können) über Standardverfahren einschließlich der gut bekannten Hybridomatechniken hergestellt und isoliert werden. Aus Gründen der Bequemlichkeit wird (werden) der (die) Antikörper gegen das inflammatorische Cytokin hier als Ak&sub1; und der (die) Antikörper, der (die) in anderen Arten erzeugt wurde(n), als Ak&sub2; bezeichnet.
Das Vorhandensein der Aktivität des inflammatorischen Cytokins in Säugetieren kann über die gewöhnlichen immunologischen Verfahren, die auf solche Untersuchungen anwendbar sind, bestimmt werden. Eine Anzahl von verwendbaren Verfahren sind bekannt. Drei dieser Verfahren, die besonders verwendbar sind, verwenden entweder das inflammatorische Cytokin, das mit einer nachweisbaren Markierung markiert ist, einen Antikörper Ak&sub1;, der mit einer nachweisbaren Markierung markiert ist, oder einen Antikörper Ak&sub2;, der mit einer nachweisbaren Markierung markiert ist. Die Verfahren können durch die folgenden Gleichungen, wobei das Sternchen den markierten Partikel anzeigt und "Cyt" für das inflammatorische Cytokin steht, zusammengefaßt werden:
A. Cyt* + Ak&sub1; = Cyt*Ak&sub1;
B. Cyt + Ak* = CytAk&sub1;*
C. Cyt + Ak&sub1; + Ak&sub2;* = CytAk&sub1;Ak&sub2;*
Die Verfahren und deren Anwendung sind allen Fachleuten bekannt und können dementsprechend innerhalb des Rahmens der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Das "kompetitive" Verfahren, Verfahren A, wird in den US-Patenten Nrn. 3,654,090 und 3,850,752 beschrieben. Das Verfahren C, das "Sandwich"- Verfahren, wird in den US-Patent Nrn. RE 31,006 und 4,016,043 beschrieben. Es sind noch andere Verfahren wie der "doppelte Antikörper" oder das "DASP"-Verfahren bekannt.
In jedem Beispiel bildet das inflammatorische Cytokin mit einem oder mehreren Antikörper(n) oder Bindungspartnern Komplexe und ein Mitglied des Komplexes ist mit einer nachweisbaren Markierung markiert. Die Tatsache, daß ein Komplex gebildet wurde und, wenn gewünscht, die Menge davon kann über bekannte Verfahren, die für den Nachweis der Markierungen geeignet sind, bestimmt werden.
Ans dem obigen wird ersichtlich daß es eine kennzeichnende Eigenschaft von Ak&sub2; ist, daß dieser mit Ak&sub1; reagiert. Das ist deshalb so, weil der in einer Säugetierart erzeugte Ak&sub1; in einer anderen Art als Antigen verwendet wurde, um die Antikörper Ak&sub2; zu erzeugen. Zum Beispiel kann der Ak&sub2; in Ziegen unter Verwendung von Kaninchen-Antikörpern als Antigene erzeugt werden. Der Ak&sub2; wäre dann ein anti-Kaninchenantikörper, der in Ziegen erzeugt wurde. Für die Zwecke dieser Beschreibung und Ansprüche wird der Ak&sub1; als primärer oder antiinflammatorischer Cytokinantikörper bezeichnet und der Ak&sub2; wird als sekundärer oder anti-Ak&sub1; Antikörper bezeichnet.
Die für diese Studien gewöhnlicherweise verwendeten Markierungen sind radioaktive Elemente, Enzyme, Chemikalien, die fluoreszieren, wenn sie mit ultraviolettern Licht bestrahlt werden, und andere.
Eine Anzahl von Fluoreszenzstoffen sind bekannt und können als Markierungen verwendet werden. Diese umfassen zum Beispiel Fluorescein, Rhodamin und Auramin. Ein besonderes Nachweismaterial ist ein anti-Kaninchenantikörper, der in Ziegen erzeugt wurde, und mit Fluorescein über ein Isothiocyanat gekoppelt wurde.
Das inflammatorische Cytokin oder dessen (deren) Bindungspartner kann (können) auch mit einem radioaktiven Element oder mit einem Enzym markiert sein. Die radioaktive Markierung kann über jedes der gegenwärtig verfügbaren Zählverfahren nachgewiesen werden. Die bevorzugten Isotope können aus ¹&sup4;C, ¹³¹I, ³H, ¹²&sup5;I und ³&sup5;S ausgewählt werden.
Die Enzymmarkierungen sind ebenso verwendbar und können durch jedes der gegenwärtig verwendeten kolorimetrischen, spektrophotometrischen, fluorospektrophotometrischen oder gasometrischen Techniken nachgewiesen werden. Das Enzym wird an den ausgewählten Partikel über eine Reaktion mit Brückenmolekülen wie Carbodiimide, Diisocyanate, Glutaraldehyd und ähnliches gekoppelt. Viele Enzyme, die bei diesen Verfahren verwendet werden können, sind bekannt und können verwendet werden. Die Bevorzugten sind Peroxidase, β-Glucuronidase, β-D- Glucosidase, β-D-Galactosidase, Urease, Glucose-Oxidase plus Peroxidase und alkalische Phosphatase. Die US-Patente Nrn. 3,654,090; 3,850,752 und 4,016,043 werden als Beispiel für deren Offenbarung von alternativen Markierungsmaterial und -verfahren benannt.
Ein besonderes Testsystem, das gemäß der vorliegenden Erfindung entwickelt und verwendet wurde, ist als ein Rezeptortest bekannt. In einem Rezeptortest wird das Material, das untersucht werde soll, geeignet markiert, und dann werden bestimmte zelluläre Testkolonien mit einer Menge von sowohl markiertem als auch nichtmarkiertem Material beimpft, wonach Bindungsstudien durchgeführt werden, um das Ausmaß, in dem das markierte Material an die Zellrezeptoren bindet, zu bestimmen. Auf diesem Weg können Unterschiede in der Affinität zwischen Materialien bestimmt werden.
Dementsprechend kann eine gereinigte Menge des inflammatorischen Cytokins radiomarkiert werden, wonach Bindungsstudien unter Verwendung von zum Beispiel kürzlich differenzierten Neutrophilen ausgeführt würden. Es würden dann Lösungen hergestellt werden, die verschiedenartige Mengen von markiertem und nichtmarkiertem inflammatorischen Cytokin enthalten, und die Zellproben würden dann beimpft und danach inkubiert werden. Die sich ergebenden Zellmonoschichten würden dann gewaschen, aufgelöst und dann in einem Gammacounter für einen Zeitraum, der ausreichend ist, um einen Standardfehler von < 5% zu ergeben, gezählt werden. Diese Daten würden dann einer Skatkarte-Analyse unterworfen werden, wonach Überlegungen und Schlußfolgerungen hinsichtlich der Aktivität des Stoffes gezogen werden können. Während das Vorstehende beispielhaft ist, veranschaulicht es die Art, in der ein Rezeptortest, in dem Beispiel, wo die zelluläre Bindungsfähigkeit des untersuchten Stoffes als eine unterscheidende Eigenschaft dienen kann, durchgeführt und verwendet werden kann.
In einer weiteren Ausführungsform dieser Erfindung können im Handel erhältliche Testkits, die für die Verwendung durch einen medizinischen Fachmann geeignet sind, hergestellt werden, um das Vorhandensein oder das Nichtvorhandensein eines inflammatorischen Cytokins bei einem verdächtigen Säugetierwirt zu bestimmen. Gemäß der oben diskutierten Untersuchungstechniken wird eine Klasse von solchen Kits wenigstens das markierte inflammatorische Cytokin oder dessen Bindungspartner wie zum Beispiel einen dagegen spezifischen Antikörper enthalten, und Anweisungen, die natürlich von dem ausgewählten Verfahren wie z.B. "kompetitiv", "Sandwich", "DASP" und ähnlichem abhängt. Die Kits können auch zusätzliche Reagenzien wie Puffer, Stabilisatoren, etc. enthalten.
Dementsprechend kann ein Testkit für den Nachweis der Reaktion eines Säugetierwirtes gegenüber invasiven Stimuli hergestellt werden, umfassend:
(a) eine vorherbestimmte Menge von wenigstens einer markierten immunchemisch reaktiven Komponente, die durch die direkte oder indirekte Anbringung des vorliegenden inflammatorischen Cytokins oder eines spezifischen Bindungspartners dagegen an eine nachweisbare Markierung erhalten wird;
(b) andere Reagenzien; und
(c ) Anweisungen für die Verwendung des Kits.
Genauer gesagt, kann das diagnostische Testkit umfassen:
(a) eine bekannte Menge des oben beschriebenen inflammatorischen Cytokins (oder eines Bindungspartners), allgemein an eine feste Phase gebunden, um ein Immunosorbent zu bilden, oder alternativ an eine geeignete Markierung oder mehrerer solcher End-Produkte, etc. (oder deren Bindungspartner) gebunden ist, jeweils eins von jedem;
(b) wenn notwendig, andere Reagenzien; und
(c ) Anweisungen für die Verwendung des Testkits.
In einer weiteren Abwandlung kann das Testkit hergestellt und für die oben angegebenen Zwecke verwendet werden, das gemäß einem vorherbestimmten Protokoll (z.B. "kompetitiv", "Sandwich", "doppelter Antikörper", etc.) verfährt, und umfaßt:
(a) eine markierte Komponente, die über die Kopplung des inflammatorischen Cytokins an eine nachweisbare Markierung erhalten wurde;
(b) eine oder mehrere zusätzliche immunchemische Reagenzien, wobei wenigstens ein Reagens ein Ligand oder ein immobilisierter Ligand ist, wobei der Ligand aus der Gruppe ausgewählt wird, die besteht aus:
(i) einem Liganden, der geeignet ist, mit der markierten Komponente (a) zu binden;
(ii) einem Liganden, der in der Lage ist, mit einem Bindungspartner der markierten Komponente (a) zu binden;
(iii) einem Liganden, der in der Lage ist, mit wenigstens einer der Komponente(n), die bestimmt werden soll(en), zu binden; und
(iv) einem Liganden, der in der Lage ist, mit wenigstens einem der Bindungspartner oder wenigstens einer der Komponente(n), die bestimmt werden soll(en), zu binden; und
(c ) Anweisungen für die Durchführung eines Protokolls für den Nachweis und/oder der Bestimmung von einer oder mehreren Kömponenten einer immunchemischen Reaktion zwischen dem inflammatorischen Cytokin und einem spezifischen Bindungspartner dagegen.
In Übereinstimmung mit dem Obigen kann ein Testsystem für das Screening von möglichen Drogen, die wirksam sind, die Synthese, Freisetzung oder Aktivität des inflammatorischen Cytokins zu modulieren, hergestellt werden. Bei einem ersten Verfahren kann die Testdroge einer stimulierten Makrophagenprobe verabreicht werden, um deren Wirkung auf die Herstellung des inflammatorischen Cytokins zu bestimmen. Bei einem alternativen Verfahren kann das inflammatorische Cytokin in ein zelluläres Testsystem wie Neutrophile eingebracht werden, und die voraussichtliche Droge kann auch in die sich ergebende Zellkultur eingebracht werden, und die Kultur wird danach untersucht, um irgendwelche Änderungen in der Aktivität des inflammatorischen Cytokins zu beobachten, die entweder auf die Zugabe der voraussichtlichen Droge allein oder auf die Wirkung von zugegebenen Mengen des bekannten inflammatorischen Cytokins, zurückzuführen sind.
Die folgenden Beispiele beschreiben die Einzelheiten der Isolation und der Identifizierung des vorliegenden inflammatorischen Cytokins, wobei die Beobachtungen, die hinsichtlich von dessen Aktivität angemerkt wurden, sowohl die Ünterschiede als auch die Ähnlichkeiten in der Aktivität zwischen dem vorliegenden inflammatorischen Cytokin und solchen Faktoren, die sowohl von den Anmeldern als auch von anderen auf diesem Gebiet früher identifiziert wurden, definieren, und die Klonierung, Sequenzierung und Expression des Cytokins MIP-2. Natürlich sind die spezifischen Materialien und Techniken, die im folgenden aufgeführt sind, nur beispielhaft und können variieren, so daß das Folgende als veranschaulichend aber nicht als für die vorliegende Erfindung beschränkend dargelegt ist.

BEISPIEL 1

Die folgenden Experimente wurden durchgeführt, um das inflammatorische Cytokin der vorliegenden Erfindung zu identifizieren und zu charakterisieren. Zu Beginn wurde der Mediatorstoff kultiviert, das inflammatorische Cytokin wurde isoliert und dessen Struktur wurde teilweise bestimmt, wonach eine Reihe von Untersuchungen in der Bemühung durchgeführt wurden, dessen Aktivitäten aufzuklären und, wenn möglich, die Identität mit anderen bekannten von Makrophagen-abstammenden Faktoren festzustellen oder zu widerlegen.

MATERIALIEN UND VERFAHREN

Materialien - Die Überstände von COS-Zellen, die mit dem Plasmid, das das Hamster- oder menschliche gro Gen enthält, oder dem Kontrollplasmid allein transfektiert waren, wurden von A. Anisowicz und R. Sager zur Verfügung gestellt. Teilweise gereinigtes menschliches NAP-1 Protein war ein Geschenk von J. Van Damme, und gereinigtes humanes NAP-1 Protein wurde von T. Yoshimura und E. Leonard bereitgestellt. Alle anderen Reagenzien wurde von Sigma (St. Louis, MO) erhalten.
Tiere - C3H/HeN Mäuse wurden vom Charles River (Kingston, NY) erhalten. Die Mäuse des Endotoxin-resistenten C3H/HeJ Stammes wurden von den Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) bezogen.
Zellkultur - Die Mausmakrophagenzellinie RAW 264.7 und die Cachectin/TNF-empfindliche Zellinie L929 wurden von der American Type Culture Collection (Rockville, MD) bezogen und entsprechend in RPMI 1640 und Dulbecco's modified MEM ((DMEM) GIBCO, Grand Island, NY) gehalten. Beide Medien wurden mit 20 mM Hepes und 10% fötalem Rinderserum (Hyclone, Logan, UT) ergänzt. Für die Herstellung von stimulierten RAW 264.7 Überständen wurden die Zellen in 150 mm Gewebekulturplatten (Falcon) in RPMI mit 10% fötalem Rinderserum gezüchtet, bis sie Konfluenz erreichten. Die Zellen wurden fünfmal in Hanks' Balanced Salt Solution gewaschen, und das Medium wurde durch serumfreies RPMI, das mit 1 µg/ml an Lipopolysaccharid (LPS W, E. coli 0127:B8, Difco, Detroit, MI) ergänzt war, ersetzt. Die Zellen wurden bei 37ºC für 16-18 Stunden inkubiert, und die Überstände wurden durch 0,22 µm Filter filtriert.
Reinigung von MIP-2 - MIP-2 wurde unter Verwendung des zuvor für MIP-1 beschriebenen Verfahrens gereinigt (S.D. Wolpe, G. Davatelis, B. Sherry, B. Beutler, D.G. Hesse, H.T. Nguyen, L.L. Moldawer, C.F. Nathan, S.F. Lowry, & A. Cerami (1988) J. EXP. MED., 167:570-581). Der Grad der Reinigung wurde über Natriumdodecylsulfat (NaDodSO&sub4;-PAGE) mit Silberanfärbung kontrolliert. In Kürze, zwei Liter von konditioniertem Überstand von Endotoxin-stimulierten RAW 264.7 Zellen wurden konzentriert und gegen 20 mM Tris-HCl Puffer, pH 8, diafiltriert, und auf eine Mono Q 10/10 (Anionenaustauscher) Säule (Pharmacia LKB Biotechnology, Rahway, NJ) gegeben. Von mehr als 90% des MIP-2 beobachtete man, daß es nicht an die Säule band, und es wurde im Durchfluß wiedergewonnen.
Die MIP-2 enthaltenden Spitzenfraktionen wurden auf eine Heparin-konjugierte Sepharose (Pharmacia LKB) Säule, die mit 20 mM Tris-HCl Puffer pH 8,0 äquilibriert war, gegeben, und mit einem linearen 0-2 M NaCl Gradienten in dem gleichen Puffer eluiert. Das MIP-2 eluierte bei annähernd 0,75 M NaCl. Die Spitzenfraktionen wurden in einer Centricon Ultrafiltrationsvorrichtung mit einem molekularen Ausschlußgewicht von 3.000 Dalton Camicon Corp., Danvers, MA) konzentriert und auf eine Superose 12 (Gelfiltration [Pharmacia LKB]) Säule, die mit 100 mM Ammoniumacetat äquilibriert war, gegeben. Aus 2 Litern an RAW 264.7 konditioniertem Medium (welches annähernd 100 mg Gesamtprotein entspricht) wurde im allgemeinen eine Menge von 0,5 mg MIP-2 isoliert, wie über einen Bradford Proteintest (Biorad, Rockville Center, NY) unter Verwendung von Rinder-Gammaglobulin als Standard bestimmt wurde. Im Vergleich konnten annähernd 2 mg an MIP-1 und 1 mg an Cachectin/TNF aus einem ähnlichen Ansatz an konditioniertem Medium gereinigt werden.
Immunoblot-Analyse - Antiseren gegen MIP-2 wurden in Kaninchen, denen einmal subkutan 10 µg des gereinigten Proteins, das in vollständigem Freundschen Adjuvans emulgiert war, und einmal einen Monat später mit 10 µg des gereinigten Proteins in unvollständigem Freundschen Adjuvans injiziert, hergestellt. Die Antiseren wurden eine Woche nach der zweiten Immunisierung gesammelt. Ungefähr 50 ng von reinem MIP-2 oder NAP-1 Protein, oder annähernd äquivalente Mengen an menschlichem oder Hamster gro-Protein aus den serumfreien Überständen von COS-Zellen, die mit dem geeigneten Vektor transfektiert waren, wurden einer NaDodSO&sub4;-PAGE in einem 10-18% linearen Gradientengel unterworfen und auf Nitrozellulose unter Verwendung eines Transblot-Gerätes (Biorad) überführt. Die Blots wurden mit 5% Trockenmilch (Alba) für 1-2 Stunden abgesattigt und in 1:100 verdünntem Antiserum für 1 Stunde bei Zimmertemperatur inkubiert. Die Blots wurden dreimal in Phosphat-gepufferter Salzlösung, die 0,05% Tween 20 und 0,05% Thimerosal enthält, gewaschen, und gebundener Antikörper wurde mit einem alkalische Phosphatase-gekoppelten Zweitantikörper (Promega Biotec, Madison, WI) nachgewiesen.
PMN-Chemotaxis und Aktivierung - Der Test für die Chemotaxis wurde wie zuvor beschrieben (S.D. Wolpe, G. Davatelis, B. Sherry, B. Beutler, D.G. Hesse, H.T. Nguyen, L.L. Moldawer, C.F. Nathan, S.F. Lowry, & A. Cerami (1988), J. EXP. MED., 167:570-581) durchgeführt. In Kürze, die Chemotaxis wurde untersucht durch Anordnen von 25 µl eines chemotaktischen Stoffes (Chemoattractant) (fMet-Leu-Phe [10&supmin;&sup8; M], MIP-2 oder Puffer], Gey's Balanced Salt Solution, pH 7,4 und 2% BSA]) in den unteren Näpfen, und die oberen Näpfe wurden mit 45 µl des Puffers, der 1,1 X 10&sup4; PMNs (die über Ficoll-Hypaque Dichtegradientenzentrifugation und Dextransedimentation isoliert wurden) enthält, befüllt. Die zwei Näpfe wurden durch eine Zellulosenitratmembran mit einer Porengröße von 3 µM (SM 11302; Sartonus Balances, Westbury, NY) getrennt. Die Kammern wurden bei 37ºC in einer feuchten 5% Kohlenstoffdioxid, 95% Raumluftkammer für 45 Minuten inkubiert. Die Membranen wurden entnommen und gefärbt, und die Anzahl von PMNs, die in die Membran wanderten, wurden alle 10 µM bis 130 µM unter Verwendung eines automatisierten Optomax Imaging Systems (Optomax, Inc., Hollis, NH) gezählt. Die zufällige Wanderung wurde auch unter den Bedingungen bestimmt, bei denen der Gradient des chemotaktischen Mittels durch Einbringen von gleichen Konzentrationen in die oberen und unteren Kammern zerstört wurde.
Die Fähigkeit von MIP-2, die Freisetzung von H&sub2;O&sub2; aus anhaftenden PMNs zu stimulieren, wurde, wie zuvor beschrieben, untersucht (S.D. Wolpe, G. Davatelis, B. Sherry, B. Beutler, D.G, Hesse, H.T. Nguyen, L.L. Moldawer, C.F. Nathan, S.F. Lowry, & A. Cerami (1988), J. EXP. MED., 167:570-581).

ERGEBNISSE

Reinigung von MIP-2 - Wie auf silberangefärbten NaDodSO&sub4;-PAGE Gelen beurteilt, verblieben mehr als 90% des MIP-2 in dem Durchfluß der Mono Q Säule (FIGUR 1). Diese Einstufenreinigungsstufe war ausreichend, um das verunreinigende MIP-1 und Cachectin/TNF zu entfernen. Wie zuvor gezeigt (Wolpe, et al., oben) binden diese beiden Proteine unter diesen Beladungsbedingungen an die Mono Q Säule und eluieren bei annähernd 0,37 M NaCl. Zwei nachfolgende Stufen einer Heparin-Affinitätschromatographie und einer Gelfiltration waren ausreichend, um das MIP-2 Protein bis zur Homogenität (FIGUR 1) zu reinigen. Das MIP-2 eluierte von der Heparin- Sepharose-Säule bei annähernd 0,75 M NaCl und wanderte mit einem apparenten Molekulargewicht von 10.000 Dalton bei der Gelfiltration.
Die Analyse der NH&sub2;-terminalen Aminosäureteilsequenzdaten des gereinigten MIP-2 (FIGUR 2) zeigte eine einzigartige Sequenz. Der Vergleich mit anderen Sequenzen, die in der Dayhoff Bank vorhanden sind, unter Verwendung des d-FAST-P Programms (D.J. Lipman und W.R. Pearson (1985), SCIENCE, 227:1435-1441) enthüllte Ähnlichkeiten zu einer Proteinfamilie mit einer Sequenzverwandtschaft zu Plättchenfaktor 4. FIGUR 2 zeigt die NH&sub2;-terminalen Aminosäureteilsequenzen von MIP-2 und verschiedenartigen Mitgliedern dieser Familie, die über einen konservierten Cysteinrest angeordnet sind. FIGUR 3 zeigt einen Vergleich der Sequenzidentität in Prozent über den Bereich, der der Aminosäureteilseqüenz, die für MIP-2 erhalten wurde, entspricht. Die engste Verwandtschaft, die zu MIP-2 beobachtet wurde, bestand mit der für das gro Genprodukt vorhergesagten Aminosäuresequenz Die MIP-2 Sequenz ist zu 62.5% identisch mit humanem gro und zu 68,7% identisch mit Hamster gro. Diese Verwandtschaft steigert sich in beiden Fällen auf 88%, wenn Aminosäurenaustausche, die über einen einzelnen Basenaustausch erfolgen können, in Betracht gezogen werden.
Die Ähnlichkeit bei der Aminosäuresequenz zwischen MIP-2 und gro legte nahe, daß MIP-2 das Mausäquivalent von gro sein könnte. Das vorhergesagte Maus-KC-Genprodukt ("KC") zeigt jedoch eine engere Verwandtschaft (65,6% Identität zu menschlichem gro und 81,2% Identität zu Hamster gro für KC verglichen mit entsprechend 62,5% und 68,7% für MIP-2), wenn man den gleichen Bereich der Teilsequenz für MIP-2 vergleicht. Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten, wenn die Vergleiche über die gesamte Sequenz durchgeführt wurden, wobei KC zu 68% identisch mit menschlichem gro und zu 85% mit Hamster gro war. Menschliches und Hamster gro waren zu 68% identisch, wenn man Eine miteinander über deren gesamte Sequenz verglich.
Immunoblot-Analyse - Um die Beziehung zwischen MIP-2 und den azideren Mitgliedern der Plättchenfaktor 4 Familie weiter zu charakterisieren, wurde ein Kaninchen polyklonales Antiserum gegen MIP-2 erzeugt. Das Antiserum reagierte monospezifisch mit serumfreien Überständen von Endotoxin-stimulierten RAW 264.7 Zellen oder von Thioglycolat-stimulierten Mausmakrophagen, aber es erkannte keine Proteine in den Überständen von unstimulierten Zellen. Ein Beispiel eines solchen Blots mit einem Antikörper gegen MIP-2 ist in den Teildarstellungen a und b von FIGUR 4 gezeigt. Das Serum vor der Immunisierung zeigte auch keine Reaktivität. Insbesondere kreuzreagierte das Antiserum gegen MIP-2 nicht mit MIP-1 oder Cachectin/TNF (siehe zum Beispiel Spur 2 von FIGUR 4). Der Kaninchen anti-MIP-2 kreuzreagierte leicht mit menschlichem und Hamster gro, aber kreuzreagierte nicht mit gereinigtem menschlichen NAP-1 Protein (FIGUR 4). Ähnlich wurde keine Kreuzreaktion mit teilweise gereinigtem menschlichen NAP-1 aus einem anderen Labor gesehen (von J. Van Damme zur Verfügung gestellt). Außerdem sekretierte die Myelomonocytenzellinie HL60 nach der Stimulation mit 10&supmin;&sup7; M Phorbolmyristinsäure ein kreuzreagierendes Protein, was weiter nahelegt, daß der Mangel der Reaktivität des anti-MIP-2 Antikörpers mit dem menschlichen NAP-1 Protein auf das Fehlen ßiner immunologischen Verwandtschaft denn auf eine Artenspezifität zurückzuführen ist. Die Natur des kreuzreagierenden Stoffes aus HL60-Zellen wird untersucht.
PMN-Chemotaxis und Aktivierung - Da von anderen Mitgliedern der PF 4 Familie gezeigt wurde, daß sie für PMNs chemotaktisch sind und diese aktivieren, wurde die Wirkung von MIP-2 bei diesen Zellen untersucht. MIP-2 wirkte bei 10 ng/ml bedeutend chemotaktisch bei menschlichen PMNs und wirkte chemotaktischer auf PMNs als fMet-Leu-Phe bei Konzentrationen von mehr als 100 ng/ml (FIGUR 5). Wenn gleiche Konzentrationen von MIP-2 auf beiden Seiten der Membran zugegeben wurden, wurde kein Anstieg bei der Wanderung beobachtet. Somit scheint die Aktivität von MIP-2 bei den untersuchten Konzentrationen auf die Stimulation einer gerichteten Wanderung von Zellen denn auf die Verstärkung einer zufälligen Wanderung zurückzuführen zu sein.
Die PMNs führten keinen oxydativen Burst durch (wie über die Herstellung von Wasserstoffperoxid gemessen wurde), wenn man sie mit Konzentrationen von MIP-2, die in dem Bereich von 10 ng bis 1 µg pro ml lagen, behandelte.
Zusätzlich zu diesen invitro Testen wurde das MIP-2 in vivo durch Injektion von 100 ng in die Fußballen von Endotoxinresistenten C3H/HeJ Mäusen untersucht. Diese Injektion induzierte einen Leukocyteneinstrom, der in dem Ausmaß zu dem vergleichbar war, der zuvor für MIP-1 gezeigt wurde.

DISKUSSION

MIP-2 hat ein Molekulargewicht von annähernd 6.000 Dalton auf der NaDodSO&sub4;-PAGE und eluiert von einer Gelfiltrationssäule mit einem apparenten Molekulargewicht von annähernd 10.000 Dalton. Im Gegensatz zu MIP-1 oder Cachectin/TNF ist MIP-2 kationisch und bindet nicht an eine Anionenaustauschersäule, die bei pH 8,0 äquilibriert ist. Diese Eigenschaft macht die Trennung dieser Aktivitäten und die nachfolgende Reinigung von MIP-2 relativ einfach. Nach der Abtrennung der Mehrheit der kontaminierenden Proteine über den Anionenaustausch wurde MIP-2 bis zur Homogenität über eine aufeinander folgende Heparinaffinitätschromatographie, wobei es bei annähernd 0,75 M NaCl eluiert, und eine Gelfiltration gereinigt.
MIP-2 ist ein äußerst aktives chemotaktisches Mittel, aber es induziert wenig oder keine chemokinetische Aktivität bei den untersuchten Dosierungen. Bei 10 ng/ml (1,7 X 10&supmin;&sup9; M) ist MIP-2 bedeutend chemotaktisch bei menschlichen PMNs und bei Konzentrationen von größer als 100 ng/ml (1,7 X 10&supmin;&sup8; M) zeigt MIP-2 einen größeren leukotaktischen Index als fMet-Leu-Phe bei der optimalen Konzentration von 10&supmin;&sup8; M des letzteren. Untersuchungen zeigen, daß MIP-2 auch die Degranulierung von PMNs mit der Freisetzung von Lysozym, aber nicht von β- Glucüronidase induzieren kann. Maus MIP-2 induzierte jedoch nicht den respiratorischen Burst bei menschlichen PMNs. Es ist bis jetzt noch nicht klar, ob dies auf eine Artenspezifität oder auf eine innewohnende Eigenschaft des Moleküls zurückzuführen ist.
Die obigen Wirkungen auf PMNs sind ähnlich zu den Beobachtungen, die mit einem Protein, das von menschlichen mononukleären Zellen von einer Anzahl von Forschern isoliert wurde, gemacht wurden und das verschiedenartig bezeichnet wurde als "310C", "MDNCF", "MONAP", "NAF" oder "GCP" [Schmid, J. & Weissmann, C. (1987) J. IMMUN. 139:250-256; Yoshimura, T., Matsushima, K., Oppenheim, J.J. & Leonard, E.J. (1987) J. Imm. 139:788-793; Yoshimura, T., Matsushima, K., Tanaka, S., Robinson, E.A., Appella, E., Oppenheim, J.J. und Leonard, E.J. 1987. PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 84:923-9237; Schroder, J.M., Mrowietz, U., Morita, E. & Christophers, E. (1987) J. IMMUN. 139:3474-3483; Walz, A., Peveri, P., Aschauer, H. & Baggiolini, M. (1987) BIOCH. BIOPHYS. RES. COMM. 149: 755-761; Peveri, P., Walz A., Dewald, B. und Baggiolini, M. (1988) J. EXP. Med. 167:1547-1559; Van Damme, J., Beeumen, J.V., Opdennakker, G. und Billiau, A. (1988) J. EXP. MED. 167:1364-1376.] Dieses Protein ist nun als "Neutrophile aktivierendes Protein-1" (NAP- 1) bekannt. Aufgrund der auffallenden Ähnlichkeit hinsichtlich der Eigenschaften von MIP-2 und NAP-1 wurde die Möglichkeit in Betracht gezogen, daß MIP-2 das Mausäquivalent von NAP-1 sein könnte. Diese Verwandtschaft scheint, basierend sowohl auf der Sequenz als auch der immunologischen Analysen, nicht der Fall zu sein. Der Vergleich der N-terminalen Sequenz von MIP-2 mit der PF-4 Familie zeigt unter Verwendung des FASTP-Programms eine 47% Identität mit NAP-1, aber eine 63% und 69% Identität mit entsprechend menschlichen und Hamster gro. Diese Verwandtschaft stimmt gut mit den Ergebnissen der Immunoblots überein, die eine Kreuzreaktivität mit Hamster und menschlichem gro, aber keine mit NAP-1 aus zwei verschiedenen Laboratorien zeigten.
Es scheint auch unwahrscheinlich zu sein, daß MIP-2 das Mausäquivalent von gro ist, da das vorhergesagte Maus-KC- Genprodukt eine sogar höhere Sequenzidentität zu gro, insbesondere im Fall von Hamster gro, zeigt. Der Anmelder schließt demzufolge, daß das MIP-2 ein neues Genprodukt ist, das nahe verwandt mit, aber verschieden von gro oder KC ist.
Es ist von Interesse, daß die gro und KC-Gene ursprünglich in den Untersuchungen über die Kontrolle des Zellwachstums gefunden wurden. Das gro Gen wurde über eine differentielle Hybridisierung von DNA aus transformierten Zellen isoliert [Anisowicz, A., Bardwell, L. und Sager, R. (1987) PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 84:P7188-7192]; Das KC-Gen wurde über differentielle Hybridisierung von DNA aus Zellen, die mit dem Platelet-derived Growth Factor behandelt waren, isoliert [Cochran, B.H., Reffel, A.C. und Stiles, C.D. (1983) CELL 33:939-947]. Die Transfektion von Zellen mit dem gro Gen führt jedoch nicht zur Transformation [Anisowicz, A., Bardwell, L. und Sager, R. (1987) PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 84:P7188-7192]. Ähnlich verstärkt die Behandlung von Dichte-inhibierten 3T3 Fibroblasten mit MIP-2 oder MIP-2 plus begrenzter Mengen an Serum oder Plasma nicht die Aufnahme von 3H Thymidin.

BEISPIEL 2

Das folgende stellt die Klonierung und Expression von MIP-2 dar. Die Klonierung der cDNA für Maus MIP-2 erfolgte wie folgt. Ein degenerierter Oligonukleotidsondenpool, der den Aminosäuren 9-14 der NH&sub2;-terminalen Teilsequenz von MIP-2 entspricht, wurde synthetisiert. Dieser Bereich der Teilsequenz wurde, aufgrund von dessen geringerer Kodondegenerierung, wenn man diese mit dem Rest der Sequenz vergleicht, ausgewählt. Die sich ergebende Sonde war ein 128-fach degenerierter Pool mit Oligomeren mit 17 Nukleotiden in der Länge.
Eine cDNA Library wurde aus Poly(A)&spplus; RNA, die aus E. coli Lipopolysaccharid-stimulierten RAW 264.7 Zellen isoliert wurde, konstruiert, wie von Davatelis et al., J. EXP. MED. 167:1939- 1941 (1988) und Sherry et al., J. EXP. MED. 168:2251-2259 (1988) gelehrt. Duplikate Nitrozellulosefilterabhebungen der ausplattierten Library (5 X 10&sup5; Plaques) wurden bei 42ºC in 5xSSC, 1x Denhardt's, 20 mm Natriumphosphatpuffer, pH 6,5, 50% Formamid, 10% Dextransulfat, 0,1% SDS, 0,1 mg/ml beschallter Lachssperma-DNA und mit 5 x 10&sup4; cpm pro ml pro Degenerierung eines ³²P-ATP 5'-endmarkiertem synthetischen Oligonukleotidsondenpools hybridisiert. Nach der Hybridisierung wurden die Filter gewaschen, wobei man das TMAC-Waschverfahren, das bei Wood etal. PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 82:1585 (1985) beschrieben ist, verwendet. Die Plaques, die auf duplikaten Filtern positiv waren, wurden einem zweiten Durchgang mit einer Ausplattierung bei geringer Dichte und einem Screening unterworfen. Vier unabhängige positive Phagenklone, aus denen die DNA für die weitere Analyse hergestellt wurde, wurden isoliert. Die cDNA-Einfügungen wurden durch Verdau mit EcoRI ausgeschnitten und in den M13 Phagenvektor subkloniert. Die DNA-Sequenzierung wurde mittels des Didesoxykettenabbruchverfahrens von Sanger et al. PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 74:5463 (1977) durchgeführt. Die Nukleotidsequenz wurde von einer der Einfügungen bestimmt, und 2.5 man fand, daß diese ein sekretiertes Protein kodiert, das die Aminosäuresequenz, die über die aminoterminale Sequenzierung des gereinigten nativen MIP-2 bestimmt wurde, umfaßt. Die Sequenz des cDNA-Klons und der vorhergesagten Proteinsequenz sind in FIGUR 7 gezeigt.

Konstruktion des Expressionsplasmids pYMIP400

Dieses Plasmid kodiert einen α-Faktorleader, der an die reife kodierende Sequenz von MIP-2 gebunden ist. Die reife für MIP-2 kodierende Sequenz wurde von der oben bestimmten MIP-2 cDNA abgeleitet. Die GAPDH-Promdtorsequenz, die α- Faktorleadersequenz und der α-Faktortranskriptionsterminator wurden von dem Plasmid pGAI1 erhalten, dessen Konstruktion in der Europaischen Veröffentlichung Nr. 324,274, veröffentlicht am 19. Juli 1989, beschrieben ist, dessen Offenbarung hiermit unter Bezugnahme aufgenommen ist.
Eine BGlII-Schnittstelle wurde durch invitro Mutagenese in die Nukleotidsequenz, die für den Carboxylterminus des MIP-2 kodiert, eingeführt, um die Klonierung in den Expressionsvektor zu erleichtern. Der mutagene Primer war:
(* bezeichnet den Basenaustausch aus der urprünglichen cDNA- Sequenz)
Nach der Bestätigung der geänderten cDNA-Sequenz wurde der Phage RF hergestellt und mit BalI und BglII verdaut. Es wurde ein 1966 Bp Abschnitt, der das meiste des reifen MIP-2 kodiert (wobei die Sequenz, die die 2 N-terminalen und 9 C-terminalen Aminosäuren kodiert, fehlt) isoliert. Das Plasmid pGAI1, das in der Europäischen Veröffentlichung Nr. 324,274, veröffentlicht am 19. Juli 1989, beschrieben ist, wurde mit KpnI verdaut und mit dem folgenden Adapter, der die 3 Carboxyl-terminalen Aminosäuren des Alphafaktorleaders, die LysArg- Bearbeitungsstelle und die ersten drei Aminosäuren des reifen MIP-2 kodiert, verbunden. Adapter
Nach dem Verdau mit SalI, wurde der BglII - SalI Adapter, der für die 8 Carboxyl-terminalen Aminosauren von MIP-2 als auch für Translationsstopkodons kodiert, addiert. Adapter
Der modifizierte Vektor wurde gelgereinigt und mit dem oben beschriebenen 1966 Bp BalI-BglII Abschnitt verbunden, wonach ein Screening, um das Plasmid pMIP400 zu isolieren, durchgeführt wurde. Das Plasmid wurde dann isoliert und dessen Nukleotidsequenz über die Adaptoren bestatigt, wonach die BamH1-Expressionskassette aus diesem Plasmid isoliert und in BamH1-Schnittstelle des pAB24 kloniert wurde, um das Expressionsplasmid pYMIP400 zu ergeben.

Expression von MIP-2

Der S. cerevisiae Stamm MB2-1 (leu1-3, leu2-112, his3-11, his3- 15, ura3 , pep4 , CANr, ciro) wird mit dem Plasmid pYMIP400 über Standardverfahren transformiert, und die Tranformanten wurden auf Ura-Prototrophie selektioniert. Die Expression wird durch Beimpfung eines Leucin-Selektionsmedium mit einzelnen Kolonien der einzelnen Tranformanten und einem Anzüchten für 48 Stunden untersucht. Die Kulturen werden danach zentrifugiert, die Zellen werden in einem Medium, dem Uracil fehlt, resuspendiert und 20-fach in dem Ure-Selektionsmedium verdünnt. Die Kulturen werden für annahernd 72 Stunden angezüchtet, dann abgeerntet und zellfreie Überstände hergestellt. Das konditionierte Medium wird auf das Vorhandensein von MIP-2 über SDS-PAGE, gefolgt von einer Coomassie-Anfärbung und einem Immunblotten analysiert.
Diese Erfindung kann auf andere Weisen oder auf anderen Wegen durchgeführt werden. Die vorliegende Offenbarung wird daher in jeglicher Hinsicht als veranschaulichend und nicht beschränkend betrachtet, wobei der Umfang der Erfindung durch die angefügten Ansprüche angezeigt wird.

Claims

1. Ein inflammatorisches Cytokin, MIP-2, in gereinigter Form, das bei hohen Salzkonzentrationen an Heparin bindet, unter physiologischen Bedingungen kationisch ist, und, wenn subkutan verabreicht, eine lokalisierte Entzündung, die durch den Einstrom von polymorphkernigen Zellen gekennzeichnet ist, induziert, gekennzeichnet dadurch: daß es ein Molekulargewicht von annähernd 6 Kilodalton über SDS PAGE hat und eine wirksame in vitro chemotaktische Aktivität bei Dosen von 10 ng/ml oder größer aufweist, wobei wenig oder keine in vitro Chemokinese bei Dosen voll 10 ng/ml oder weniger bei polymorphkernigen Zellen induziert wird, während es nicht die Fähigkeit besitzt, die Aktivität des anabolischen Enzyms Lipoproteinlipase zu supprimieren, die Cytotoxizität von Cachectin/TNF-empfindlichen Zellen zu bewirken, die Blastogenese von Endotoxin-resistenten C3H/HeJ Thymozyten zu stimulieren oder die Herstellung von Cachectin/TNF bei primären Thioglycolat-stimulierten Mausmakrophagenzellen zu induzieren.

2. Das inflammatorische Cytokin gemäß Anspruch 1, wobei das Cytokin von einer Gelfiltrationssäule mit einem apparenten Molekulargewicht von annähernd 10.000 Dalton eluiert.

3. Das inflammatorische Cytokin gemäß Anspruch 1, wobei das Cytokin nicht in der Lage ist, Fieber bei Kaninchen oder die Bildung von Superoxid oder in vitro einen respiratorischen Burst bei humanen Neutrophilen zu induzieren.

4. Das inflammatorische Cytokin gemäß Anspruch 1, wobei das Cytokin von tierischen Makrophagenzellen, die mit einem Stimulatormaterial, das einen invasiven Stimulus begleiten könnte, inkubiert wurden, erhältlich ist.

5. Das inflammatorische Cytokin gemäß Anspruch 1, das eine Aminosäuresequenz, die im wesentlichen zu der 73 Aminosäurenlangen Sequenz, die in Figur 7 dargestellt ist, äquivalent ist, umfaßt.

6. Das inflammatorische Cytokin gemäß einem der Ansprüche 1 oder 5, das mit einer nachweisbaren Markierung markiert ist.

7. Das inflammatorische Cytokin gemäß Anspruch 6, wobei die Markierung aus Enzymen, Chemikalien, die fluoreszieren, und radioaktiven Elementen ausgewählt wird.

8. Das inflammatorische Cytokin gemäß Anspruch 1, das menschlich ist.

9. Das inflammatorische Cytokin gemäß Anspruch 1, das bei einer Konzentration von 0,7 M NaCl Heparin bindet.

10. Eine Zusammensetzung, die ein reifes inflammatorisches Cytokin gemäß Anspruch 1, das im wesentlichen frei von anderen Polypeptiden ist, umfaßt.

11. Ein DNA-Molekül, das ein Replikon und eine heterologe kodierende Sequenz, die das Cytokin gemäß Anspruch 1 kodiert, umfaßt.

12. Ein DNA-Molekül, das eine für das Cytokin gemäß Anspruch 1 kodierende Sequenz unter der Kontrolle von transcriptionalen und translationalen Kontrollsequenzen, die in der Lage sind, die Expression der kodierenden Sequenz in einer Wirtszelle zu bewirken, umfaßt, wobei wenigstens eine der tränscriptionalen und translationalen Kontrollsequenzen zu der kodierenden Sequenz heterolog ist.

13. Das DNA-Molekül gemäß Anspruch 11, wobei die kodierende Sequenz nicht von Introns unterbrochen ist.

14. Eine Zusammensetzung von Zellen, die mit dem DNA- Molekül gemäß Anspruch 11 transformiert sind, die im wesentlichen frei von Zellen, die nicht mit dem DNA-Molekül transformiert sind, ist.

15. Die Zellen gemäß Anspruch 14, wobei diese prokaryotische Zellen sind.

16. Die Zellen gemäß Anspruch 14, wobei diese eukaryotische Zellen sind.

17. Die Zellen gemäß Anspruch 14, wobei diese Hefezellen sind.

18. Ein Verfahren zum Herstellen von mMIP-2, das das Kultivieren der Zusammensetzung von Zellen, die mit einem DNA- Molekül gemäß Anspruch 12 transformiert sind, unter Bedingungen, unter denen das mMIP-2 exprimiert wird, und ein Gewinnen des exprimierten mMIP-2 umfaßt.

19. Das Verfahren gemäß Anspruch 16, wobei die Zellen prokaryotisch sind.

20. Das Verfahren gemäß Anspruch 18, wobei die Zellen prokaryotisch sind.

21. Das Verfahren gemäß Anspruch 20, wobei die Zellen Hefe sind

22. Eine pharmazeutische Zusammensetzung für die Behandlung von infektiösen und nichtinfektiösen Erkrankungen bei Säugetieren, umfassend:

(A) - eine therapeutisch wirksame Menge eines Stoffes, der aus der Gruppe ausgewählt wird, die besteht aus: dem inflammatorischen Cytokin gemäß Anspruch 1, einem im wesentlichen homologen Analogon desselben, das in der Lage ist, die Aktivität des inflammatorischen Cytokins nachzuahmen, und Mischungen davon; und

(B) - einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.