DE3855747T2 - Biologische materialien, deren herstellung und verwendung in der therapie - Google Patents
Biologische materialien, deren herstellung und verwendung in der therapieInfo
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Description
- Die Erfindung betrifft Interleukin-1-Inhibitoren (IL-1-INHs), die selektiv die Interleukin-1-Aktivität inhibieren. Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Reinigung dieser IL-1-INHs aus Urin und zur Herstellung dieser IL-1-INHs durch Wirte, die mit rekombinanten DNA-Molekülen transformiert sind, die die Inhibitoren codierende DNA-Sequenzen umfassen, und Verfahren zur Behandlung sowie Mittel, die durch IL-1-INHs gekennzeichnet sind. Diese Verfahren und Agentien sind im Rahmen immunsuppressiver und gegen Entzündungen gerichteter Indikationen und Therapien anwendbar.
- Interleukin-1 (IL-1) ist ein Protein-Cytokin, das vorwiegend durch Zellen der Makrophagen/Monozyten-Reihe hergestellt wird. Es gibt zwei unterschiedliche IL-1-Gene, die IL-1-Polypeptide codieren konnen: IL-1α und IL-1β; vgl. P. Auron et al., "Nudeotide Sequence of Human Monocyte Interleukin-1 Precursor cDNA", Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81 (1984), Seite 7907; C. March et al., "Cloning, Sequences And Expression Of Two Distinct Human Interleukin "Complementary DNA's α and β", Nature 315 (1985), Seite 641. Untersuchungen ihrer entsprechenden biologischen Aktivitäten mit rekombinantem IL-1α und -β haben bisher darauf hingewiesen, daß beiden Formen von IL-1 zahlreiche biologische Aktivitäten gemeinsam sind.
- IL-1 weist mehrere unterschiedliche biologische Aktivitäten auf. Eine dieser Aktivitäten - die Aktivität eines Lymphozyten-aktivierenden Faktors (LAF) - führt dazu, daß IL-1 ein Vermittler bei der Immunantwort ist, und als solcher stimuliert IL-1 die Reifung, Differenzierung und das Wachstum vieler Zelltypen, wie unreifer T- und B-Lymphozyten; vgl. P. Auron et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1981, siehe oben. Eine weitere der IL-1-Aktivitäten - die Aktivität als Faktor mit Wirkung auf mononukleare Zellen (MCF) - bewirkt, daß IL-1 eine zentrale Rolle bei der Regulation unterschiedlicher entzündlicher Antworten spielt (vgl. C. Dinarello, "An Update of Human Interleukin 1", J. Clin. Immun. 5 (1985), Seite 287), und als solches stimuliert IL-1 mehrere Zellen, z.B. Fibroblasten und Chondrocyten, so daß diese Prostaglandin E&sub2; (PGE&sub2;) bzw. Collagenase bilden. Diese Antworten sind an der Pathogenese von Gelenkkrankheiten, wie rheumatoide Arthritis, oder von Krankheiten beteiligt, die mit der Zerstorung von Gewebe verbunden sind; vgl. J. Dayer, "Cytokines and Other Mediators in Rheumatoid Arthritis", Springer Semin. Immunopath 7 (1984), S. 387. Außerdem ist bekannt, daß IL-1 die Bildung von IL-2 induziert, das an der T-Zell-Proliferation beteiligt ist; vgl. J. W. Lowenthal et al., "IL-1 Dependent Induction Of Both IL-2 Secretion and IL-2- Receptor Expression By Thymoma Cells", J. Imm. 137 (1986), Seiten 1226-1231. Schließlich ist ebenfalls bekannt, daß IL-1 Moleküle auf endothelialen Zellen stimuliert, so daß diese weiße Blutzellen fangen; vgl. J. Oppenheim et al., "There is More Than One Interleukin 1", Immun. Today 7 (1986), Seite 45.
- Somit wäre es interessant, einen IL-1-Inhibitor zu identifizieren und zu isolieren, der die Antigen-spezifische T-Zell- und B-Zell- Proliferation unterdrückt und die Prostaglandin- und Collagenase-Synthese durch Fibroblasten unterdrückt. Eine solche Verbindung ließe sich bei der Behandlung von Stärungen einsetzen, an denen immunologische und entzündliche Antworten beteiligt sind. Außerdem wäre es wünschenswert, einen IL-1-Inhibitor zu isolieren, der die IL-1-vermittelte IL-2-Bildung zu unterdrücken vermag. Im weiteren ist es von Interesse, eine Verbindung zu identifizieren, die selektiv die Wirkungen von IL-1 inhibiert, ohne dabei gleichzeitig andere Proteine zu hemmen, z.B. Tumornekrose- Faktoren, wie TNF-α, die mehrere biologische Eigenschaften mit IL-1 gemeinsam haben, d.h. PGE&sub2;- und Collagenase-Bildung durch menschliche Hautfibroblasten (vgl. J. Dayer et al., "Cachectin/Tumor Necrosis Factor Stimulates Collagenase and Prostaglandin E&sub2; Production by Human Synovial Cells and Dermal Fibroblasts", J. Exp. Med. 162 (1985), Seite 2163) oder die Induktion der Fibroblasten-Proliferation (vgl. P. Seckinger et al., "A Urine Inhibitor of Interleukin 1 Activity Affects Both Interleukin 1 α And β But Not Tumor Necrosis Factor α", J. Immun. 139 (1987), Seite 1541).
- Gegenwärtig wirken Verbindungen, von denen inhibierende Wirkungen auf IL-1 berichtet wurden, wie Prostaglandine, primär als nicht-selektive Inhibitoren. Es wurde auch berichtet, daß der Urin von Patienten mit Fieber einen selektiven 20-30kD Inhibitor von IL-1 enthält; vgl. Z. Liao et al., "Identification Of a Specific Interleukin 1 Inhibitor In The Urine Of Febrile Patients", J. Exp. Med. 159 (1984), Seite 126; Z. Liao et al., "Characterization Of A Human Interleukin 1 Inhibitor" J. Immunol., 134 (1985), S. 3882. Liao weist nicht darauf hin, daß diese Aktivität in einer anderen als der verunreinigten Form vorliegt, oder daß sie die MCF-Aktivität von IL-1, die Bindung von IL-1 an die Rezeptoren von Zielzellen oder die Fibroblasten-Proliferation in Gegenwart von IL-1 inhibiert. Die Liao-Verbindung inhibiert nicht die Synthese von PGE&sub2; oder Collagenase (vgl. Horn et al., "Argumentation Of IL-1-indured Fibroblast PGE&sub2; Produktion By A Urine-Derived IL-1 Inhibitor", J. Immunol. 138 (1987), Seiten 3290-94).
- Eine zweite Verbindung, von der IL-1-inhibierende Wirkungen berichtet wurden, wird durch menschliche Monozyten hergestellt, die an anhaftenden Immunkomplexen gezüchtet wurden; vgl. W. Arend et al., "Effects of Immune complexes On Production By Human Monocytes of Interleukin or an Interleukin 1 Inhibitor", J. Immun. 134 (1985), Seite 3868. Jedoch ist der Bericht von Arend unklar im Hinblick auf die Frage, ob die Verbindung sowohl die LAF- als auch die MCF-Aktivität von IL-1 hemmt (vgl. Seite 3874). Jedenfalls berichtet die Veröffentlichung von Arend nicht, daß die Verbindung im wesentlichen rein ist, oder daß sie die Bindung von IL-1 an die Rezeptoren von Zielzellen blockiert oder die Fibroblasten-Proliferation in Gegenwart von IL-1 inhibiert.
- Eine dritte Verbindung, von der IL-1-inhibierende Wirkungen berichtet wurden, soll in sehr unreiner Form vorliegen, und ihr Wirkungsmechanismus wurde nicht beschrieben; vgl. J.F. Balavome et al., "Prostaglandin E&sub2; And Collagenase Production By Fibroblasts And Synovial Cells Is Regulated By Urine-derived Human Interleukin 1 And Inhibitor(s)", J. Clin. Invest. 78 (1986), Seite 1120.
- Auf andere Verbindungen, die möglicherweise IL-1 inhibieren, wurde verwiesen in Rosenstreich et al., Einstein O.J. Med. 5 (1987), Seiten 126-136 ("Rosenstreich"); Sandborg et al., Clin. Exp. Immunol. 66 (1986), Seiten 312-319 ("Sandborg") und Brown et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986), Seiten 9119-9123 ("Brown").
- Rosenstreich ist ein Übersichtsartikel über IL-1 und Inhibitoren von IL-1 und bespricht die Ergebnise von Arend, Balavoine und Liao.
- Sandborg verweist auf ein Protein, das IL-1/LAF inhibiert und die IL-1- vermittelte Fibroblasten-Proliferation eher stimuliert als inhibiert. Brown verweist auf den Fieber-Inhibitor von Liao, siehe oben, und Uromodulin, ein Protein das eher an IL-1 als an seine Rezeptoren bindet.
- Die vorliegende Erfindung löst die vorstehend erläuterten Aufgaben durch die Bereitstellung von im wesentlichen reinen IL-1-Inhibitoren ("IL-1-INHs") die selektiv die IL-1-LAF- und IL-1-MCF-Aktivitäten inhibieren, die IL-1-vermittelte Bildung von IL-2 inhibieren, die IL-1-vermittelte Fibroblasten-Proliferation inhibieren und an die IL-1-Rezeptoren auf Zielzellen binden, für die Verwendung in immunsuppressiven oder entzündungshemmenden Mitteln, Verfahren und Therapien. Die erfindungsgemäßen IL-1-INHs inhibieren nicht die TNFα-vermittelte Bildung von PGE&sub2; und Collagenase in Zielzellen. Die erfindungsgemäßen IL-1-INHs sind somit für eine Reihe von Mitteln und Verfahren für immunsuppressive und entzündungshemmende Anwendungen geeignet. Die erfindungsgemäßen IL-1- INHs sind dadurch gekennzeichnet, daß sie Polypeptide mit einem Molekulargewicht von etwa 25 kD gemäß SDS/PAGE sind und einen isoelektrischen Punkt gemäß chromatographischer Fokussierung von 4,7 haben.
- Die Anmeldung offenbart ein Verfahren zur Herstellung dieser IL- 1-INHs durch die Reinigung aus natürlichen Quellen. Diese Reinigung umfaßt die Schritte der Konzentration von rohem Urin von Patienten mit Fieber, die Ausfällung des rohen IL-1-INH aus dem Urin und die Abtrennung des IL-1-INH von den anderen Proteinen dieses Präzipitats durch Ionenaustausch-Chromatographie, hydrophobe Chromatographie, Gelfiltration und/oder Immunabsorption.
- Eine zweite und bevorzugte Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung dieser IL-1-INHs ist die rekombinante Herstellung solcher Inhibitoren. In solchen Verfahren werden DNA-Sequen zen, die die erfindungsgemäßen IL-1-INHs codieren, rekombinante DNA-Moleküle, die durch diese Sequenzen gekennzeichnet sind, und verschiedene einzellige Wirte, die mit diesen DNA-Sequenzen und -Molekülen transformiert sind, zur Herstellung der erfindungsgemäßen IL-1-INHs (mit oder ohne einem zusätzlichen N-terminalen Methionin) oder von Teilen davon durch Fermentation der transformierten Wirte verwendet. Es wird darauf hingewiesen, daß das erfindungsgemäße IL-1-INH-Polypeptid, das eine IL- 1-INH-Aktivität aufweist, verschiedene andere Aminosäure-Substitutionen, -Additionen oder -Deletionen in der Aminosäuresequenz von IL-1-INH umfassen kann.
- Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Anwendung der erfindungsgemäßen IL-1-INHs zur Bestimmung der molekularen Strukturen und der Lage der aktiven IL-1-INH-Stellen und die Verwendung dieser Information für den Entwurf von Fragmenten und Peptiden zur Verwendung als IL-1-INHs in immunsuppressiven oder entzündungshemmenden Mitteln und Verfahren der Erfindung.
- Figur 1 zeigt das Aktivitätsprofil von IL-1-INH aus Urin, das durch den QAE-Sepharose-Schritt erhalten wurde.
- Figur 2 zeigt das Aktivitätsprofil von IL-1-INH aus Urin, das durch den DEAE-Sepharose-Schritt erhalten wurde.
- Figur 3 zeigt das Aktivitätsprofil von IL-1-INH aus Urin der AcA54-Filtrations fraktion.
- Figur 4 zeigt die Dosisantwort der vereinigten IL-1-INH-Fraktionen aus Urin nach jedem Reinigungsschritt, gemessen in IL-1/LAF- und IL- 1/Rezeptor-Bindungstests.
- Figur 5 zeigt die IL-1-INH-Aktivität, gemessen im IL-1/LAF-Test.
- Figur 6 zeigt die IL-1-INH-Aktivität, gemessen im IL-1/MCF-Test.
- Figur 7 zeigt, daß IL-1-INH die HrTNFα-induzierte Bildung von PGE&sub2; nicht beeinträchtigt.
- Figur 8 zeigt die IL-1-INH-Aktivität, gemessen im IL-1/Fibroblasten-Proliferationstest.
- Figur 9 zeigt die spezifische IL-1-INH-Aktivität, gemessen nach jedem Reinigungsschritt im IL-1-Rezeptor-Bindungstest, LAF-Test, EL- 4/CTLL-Test und im MCF-Test.
- Zum besseren Verständnis der Erfindung wird die nachfolgende genaue Beschreibung gegeben.
- In der Beschreibung werden die folgenden Begriffe verwendet:
- MCF - "Faktor von mononuklearen Zellen". Die "MCF-Aktivität" von IL-1 bestimmt seine Fähigkeit, die Prostaglandin E- und Collagenase-Bildung in zahlreichen Zielzellen, z.B. Fibroblasten, Synovial-Zellen, zu stimulieren.
- LAF - "Lymphozyten-aktivierender Faktor". Die "LAF-Aktivität" von IL-1 bestimmt seine Fähigkeit, die Proliferation und Differenzierung von T- und B-Lymphozyten zu stimulieren.
- CTLL - "Cytotoxische T-Lymphozyten-Zellinie". CTLL-Zellen werden mit EL-4-Zellen cokultiviert und zum Test der stimulatorischen Wirkung von IL-1 auf die Bildung von IL-2 aus EL-4-Zellen verwendet; das IL-2 stimuliert sodann die Proliferation der CTLL-Zellen, die meßbar ist.
- Die Erfindung betrifft im wesentlichen reine IL-1-INHs. "Im wesentlichen reine" IL-1-INHs sind, wie erfindungsgemäß angegeben, im we sentlichen frei von Hauptverunreinigungen, insbesondere von Apolipoprotein A1 und Retinol-bindendem Protein, und wandern als Einzelbande in der SDS/PAGE.
- Die erfindungsgemäßen IL-1-INHs inhibieren selektiv die IL-1 LAF- und IL-1-MCF-Aktivitäten, inhibieren die IL-1-vermittelte IL-2-Bildung durch EL-4-Zellen, inhibieren die IL-1-vermittelte Fibroblasten- Proliferation und binden an die IL-1-Rezeptoren von Zielzellen. Eine derartige selektive Inhibition ist definiert als Fähigkeit, die IL-1- vermittelte Aktivität zu blockieren, ohne andere Verbindungen mit einigen IL-1 ähnlichen Aktivitäten blockieren zu können, wie menschliches rekombinantes TNFα (hrTNFα), das ein Vermittler der PGE&sub2;- und Collagenase-Bildung ist. Diese Spezifität ist ein wichtiger Faktor für die selektive Blockierung von IL-1, ohne mit der erforderlichen Wirkung anderer Vermittler des Immunsystems zu interferieren. Wir haben diese Spezifität unserer IL-1-INHs nachgewiesen durch Vergleich der Wirkung der erfindungsgemäßen IL-1-INHs auf die Aktivität von IL-1 auf hrTNFα und dabei die IL-1/MCF- und Fibroblasten-Proliferationstests angewendet.
- In besonders bevorzugten Ausführungsformen haben die erfindungsgemäßen IL-1-INHs ein Molekulargewicht von etwa 25 kD gemäß SDS-PAGE und einen durch Chromatofokussierung bestimmten isoelektrischen Punkt von 4,7.
- Die erfindungsgemäßen IL-1-INHs sind dazu in der Lage, eine IL- 1-vermittelte Antwort im LAF-Test, MCF-Test, EL-4/cytotoxischen T-Lymphozyten-Test ("EL-4/CTLL") und Fibroblasten-Proliferationstest zu inhibieren. Im IL-1/LAF-Test wird die Inhibition der IL-1α- oder -β-induzierten T-Zell-Proliferation gemessen durch den Nachweis einer Reduktion des [³H]-Thymidin-Einbaus in Gegenwart verschiedener Verdünnungen eines erfindungsgemäßen IL-1-INHs. Im IL-1/MCF-Test wird die Inhibition der IL-1-vermittelten PGE&sub2;-Bildung durch einen doppelten Antikörper-Radioimmunoassay gemessen, wobei anti-PGE&sub2;-Serum in Gegenwart verschiedener Verdünnungen des erfindungsgemäßen IL-1-INHs verwendet wird. Das durch einen Radioimmunoassay nachgewiesene Absinken von PGE&sub2; im Medium weist auf die IL-1-INH-Aktivität hin. Im EL-4/CTLL-Test wird die Inhibition der IL-1-vermittelten IL-2-Bildung in Gegenwart verschiedener Verdünnungen des erfindungsgemäßen IL-1-INH gemessen. Die Inhibition wird beobachtet als Reduktion der Aufnahme von ³H1-Thymidin ([³H]-TdR), das als Maß für die Proliferation von CTLL-Zellen verwendet wird. Eine Proliferation geschieht nur in Gegenwart von IL-1, das IL-2 in einer dosisabhängigen Weise induziert. Im Fibroblasten-Proliferationstest wird die Inhibition der [³H]-TdR-Aufnahme durch IL-1-induzierte Fibroblasten in Gegenwart verschiedener Verdünnungen eines erfindungsgemäßen IL-1-INH gemessen. Wie vorstehend beschrieben, binden die erfindungsgemäßen IL-1 INHs insbesondere an IL-1-Rezeptoren auf Zielzellen. Diese Bindung wurde durch eine Reihe von IL-1-Bindungstests nachgewiesen. Zuerst wurde die Wirkung steigender Konzentrationen von IL-1-INH auf die Bindung von markiertem IL-1 an Rezeptoren auf Zielzellen gemessen. Es wurde beobachtet, daß höhere Konzentrationen von IL-1-INH die Menge von gebundenem markierten IL-1 herabsetzten. Sodann wurde ein Überschuß von nicht markiertem IL-1-INH zugegeben und die Wirkung dieses Überschusses auf das an eine Zielzelle gebundene, markierte IL-1 beobachtet. Dieser Test hat gezeigt, daß überschüssiges IL-1-INH erfolgreich mit dem an die Oberfläche der Zielzellen gebundenen, markierten IL-1 konkurriert und dieses ersetzt. Außerdem wurde ein Überschuß von Retinol-bindendem Protein zugegeben und beobachtet, daß dies nicht die Bindung des IL-1-INH an die Zielzellen verhindert. Dieser Test zeigte, daß die erfindungsgemäßen IL- 1-INH spezifisch mit IL-1,um die Bindung an die IL-1-Rezeptoren auf Zielzellen konkurrieren.
- Diese Erfindung betrifft auch ein Reinigungsverfahren zur Isolierung eines erfindungsgemäßen IL-1-INH aus natürlichen Quellen, z.B. aus Patienten mit hohem Fieber oder aus Aids-Patienten, die an opportunistischen Infektionen leiden. Dieses Verfahren umfaßt mehrere Schritte. Im allgemeinen sind diese Schritte (1) Konzentration von Urin; (2) Ausfällung von rohem IL-1-INH aus dem konzentrierten Urin und Abtrennung des IL-1-INH von den anderen Proteinen dieses Präzipitats durch mindestens eine Ionenaustausch-Chromatographie, hydrophobe Chromatographie, Gelfiltration und/oder Immunabsorption.
- In der bevorzugten Ausführungsform dieses Verfahrens wird zunächst roher Urin von Patienten mit Fieber in üblicher Weise konzentriert, z.B. durch Ultrafiltration. Sodann wird eine rohe Fraktion, die den IL-1-INH enthält, aus der konzentrierten Urinmenge mit Ammoniumsulfat ausgefällt. Nach dem Entfernen des Ammoniumsulfats durch Dialyse werden die die IL-1-INH-Aktivität enthaltenden Fraktionen von anderen Proteinen durch Ionenaustausch-Chromatographie abgetrennt. Insbesondere werden in der besonders bevorzugten Ausführungsform zwei Anionenaustauscher - eine Diethyl-(2-hydroxypropyl)-aminoethyl-Sepharose-Säule ((QAE) -Sepharose-Säule) und eine Diethylaminoethyl-Sepharose-Säule ((DEAE)-Sepharose-Säule) - unabhängig voneinander oder in Kombination verwendet, wobei die DEAE-Sepharose-Säule vorzugsweise nach der QAE-Sepharose-Säule eingesetzt wird. Zur Beobachtung der Aktivität der verschiedenen Fraktionen werden LAF- und Rezeptor-Bindungstests durchgeführt. In dieser erfindungsgemäßen Ausführungsform werden die aktiven IL-1-INH-Fraktionen sodann in Abhängigkeit von ihrem Molekulargewicht mit einer Gelfiltration, besonders bevorzugt mit einem AcA54-Gel, fraktioniert, wobei die aktiven Fraktionen wieder wie vorstehend beschrieben ausgewählt werden. Die ausgewählten Fraktionen sind gekennzeichnet durch ein Molekulargewicht von etwa 25 kD und dadurch, daß sie mindestens 90 % des Proteingehalts darstellen. Hauptsächliche Kontaminationen sind das Apolipoprotein A1 und das Retinol-bindende Protein. Obwohl sich diese Kontaminationen in unterschiedlicher Weise entfernen lassen, werden vorzugsweise monodonale oder polyclonale Antikörper in einem Immunabsorptionsverfahren verwendet, die gegen das Apolipoprotein und das Retinolbindende Protein gebildet wurden.
- Die vorstehenden aktiven IL-1-INH-Fraktionen werden weiterhin durch hydrophobe Chromatographie an einer Phenyl-Sepharose-Säule gereinigt, die Proteine in Abhängigkeit von ihren hydrophoben Eigenschaften fraktioniert. Beispielsweise sind das Apolipoprotein A1 und das Retinolbindende Protein hydrophober als erfindungsgemäße Proteine und werden daher durch die Säule zurückgehalten.
- Mit dem vorstehend beschriebenen, bevorzugten Verfahren steigt die spezifische Aktivität des erfindungsgemäßen IL-1-INH, d.h. die für eine halbmaximale Hemmung erforderliche IL-1-INH-Menge, nach jedem Reinigungsschritt; vgl. Figur 9. Es wurde ein IL-1-Rezeptor-Bindungstest, ein LAF-Test, ein EL-4/CTLL-Test und ein MCF-Test zur Messung dieser spezifischen Aktivität verwendet. Ebensogut hätten aber auch andere Tests verwendet werden können.
- Das mit dem vorstehenden Verfahren oder bevorzugten Verfahren gereinigte IL-1-INH kann direkt für die immunsuppressiven und entzündungshemmenden Mittel und Verfahren dieser Erfindung verwendet werden. Vorzugsweise werden solche gereinigten Proteine jedoch als Quelle für Aminosäure-Sequenzdaten verwendet, um DNA-Sondenmoleküle zur Verwendung bei der Isolierung und Selektion einer für ein erfindungsgemäßes IL-1-INH codierenden DNA-Sequenz zu entwerfen. Solche DNA-Sequenzen, diese enthaltenden rekombinanten DNA-Moleküle und mit ihnen transformierte einzellige Wirte können sodann zur Rerstellung großer Mengen der erfindungsgemäßen IL-1-INHs, die im wesentlichen frei von anderen menschlichen Proteinen sind, zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Mitteln und Therapien eingesetzt werden.
- Genauer gesagt werden die Aminosäure-Sequenzen verschiedener Teile und Fragmente des gereinigten IL-1-INH bestimmt. Sodann werden diese Sequenzen und die dafür codierenden DNA-Sequenzen für den Entwurf einer Reihe von DNA-Sondenmolekülen, die möglicherweise geeignet sind für das Absuchen verschiedener DNA-Banken auf DNA-Sequenzen, die für die erfindungsgemäßen IL-1-INHs codieren, verwendet. Solche Banken umfassen chromosomale Genbanken und DNA- oder cDNA-Banken, die aus Gewebe oder Zellinien hergestellt worden sind, von denen nachgewiesen wurde, daß sie die erfindungsgemäßen IL-1-INHs bilden; zu solchen Zellinien gehören die dem Fachmann bekannten Monocyten-Zellinien.
- Als Mittel zur Herstellung von cDNA und letztlich für die Clonierung und Expression von IL-1-INH-Polypeptiden wird Poly A&spplus;-mRNA aus einer IL-1-INH-bildenden Zellquelle isoliert, wie stimulierte Makrophagen, wobei in üblicher Weise verfahren wird, z.B. wie von Land et al., "5-Terminal Sequences Of Eukaryotic mRNA Can Be Cloned With High Efficiency", Nucleic Acids Research, 9 (1981), Seiten 2251-2266; Okayama und Berg, "High Efficiency Cloning Of Full-Length cDNA", Mol. and Cell. Biol., 2 (1982), Seiten 161-170; und von Maniatis et al., in "Molecular doning" (Herausgeber Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York), (1982), Seiten 229-246 beschrieben wurde. Sodann wird in üblicher Weise aus der vorstehend isolierten Poly A&spplus;-mRNA eine cDNA-Bank konstruiert, z.B. wie von Wickens et al., "Synthesis Of Double-Stranded DNA Complementary To Lysozyme, Ovomucoid And Ovalhuman mRNAs", J. Biol. Chem., 253 (1978), Seite 2483-2495; Maniatis et al., in "Molecular doning" (Herausgeber Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York), (1982), Seite 229-246; und von V. Gubler et al., "A Simple And Very Efficient Method For Generating cDNA Libraries", Gene 25 (1983), Seite 263-269, beschrieben.
- Es gibt verschiedene Möglichkeiten für das Absuchen einer Bank von Clonen auf einen don, der ein bestimmtes rekombinantes DNA-Molekül enthält, d.h. eines, das eine IL-1-INH-Insertion enthält. Beispielsweise können auf Grundlage einer partiellen Aminosäure-Sequenz des gereinigten IL-1-INH DNA-Sondenmoleküle konstruiert werden, die eine Reihe von synthetischen DNA-Fragmenten umfassen, die für ausgewählte Bereiche der erfindungsgemäßen IL-1-INHs codieren. Verfahren zur Bestimmung von Aminosäure-Sequenzen sind dem Fachmann bekannt. Nach der Bestimmung der Aminosäure-Sequenzen verschiedener Bereiche des IL-1-INH können Gruppen degenerierter IL-1-INH-Sondenmoleküle chemisch nach der üblichen Phosphoramid-DNA-Synthese-Technik zur Verwendung beim Absuchen einer Vielzahl von DNA-Banken synthetisiert werden, um verwandte DNA-Sequenzen durch Hybridisierung zu selektieren. Die DNA-Sondenmoleküle werden sodann am 5'-Ende mit ³²P unter Verwendung von ³²P-ATP und T4-Polynucleotid-Kinase im wesentlichen wie von A. M. Maxam und W. Gilbert beschrieben markiert; vgl. "A New Method For Sequencing DNA", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), Seiten 560-564. Diese DNA-Sondenmoleküle werden sodann zum Absuchen von cDNA-Banken oder genomischen Banken verwendet, d.h. von aus den monocytischen Leukämie-Zellinien U937, THP-1 und HL60 abgeleiteten cDNA-Banken in üblicher Weise auf DNA-Sequenzen, die die erfindungsgemäßen IL-1-INHs codieren. Diese ausgewählten Sequenzen können sodann für die Expression von IL-1-INHs in mit ihnen transformierten prokaryontischen und eukaryontischen Wirten in an sich bekannter Weise manipuliert werden. Sie sind ebenso als Sondenmoleküle zum Absuchen für die Selektion anderer verwandter DNA-Sequenzen geeignet, die für IL-1- INHs von Säugern codieren.
- Die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen und DNA-Moleküle können in einer großen Anzahl von Wirt/Vektor-Kombinationen exprimiert werden. Beispielsweise können verwendbare Vektoren aus Segmenten chromosomaler, nicht-chromosomaler und synthetischer DNA-Sequenzen bestehen, wie verschiedenen bekannten Derivaten von SV40 und bekannten bakteriellen Plasmiden, z.B. Plasmiden von E. coli einschließlich colE1, pCR1, pBR322, pMB9 und RP4; Phagen DNAs, z.B. den zahlreichen Derivaten von Phagen, z.B. NM 989 und anderen DNA-Phagen, z.B. M13 und anderen filamentären, einzelsträngigen DNA-Phagen; in Hefe verwendbaren Vektoren, wie dem 2µ Plasmid; in eukaryontischen Zellen verwendbaren Vektoren, wie in tierischen Zellen verwendbaren Vektoren, wie solchen, die von SV-40, Adenovirus und Retrovirus abgeleitete DNA-Sequenzen enthalten, und Vektoren, die von Kombinationen von Plasmiden und Phagen-DNAs abgeleitet sind, wie Plasmiden, die zur Anwendung von Phagen-DNA modifiziert wurden, oder an deren Derivaten davon.
- Solche Expressionsvektoren sind auch gekennzeichnet durch mindestens eine Expressionskontrollsequenz, die funktionell mit der in den Vektor inserierten IL-1-INH-DNA-Sequenz verbunden ist, um die Expression der donierten DNA-Sequenz zu steuern und zu regulieren. Beispiele verwendbarer Expressionskontrollsequenzen sind das lac-System, das trp-System, das tac-System, das trc-System, die Hauptoperator- und Promotorbereiche des λ-Phagen, der Kontrollbereich des fd-Hüllproteins, die glykolytischen Promotoren von Hefe, z.B. der Promotor der 3-Phosphorglycerat-Kinase, die Promotoren der sauren Phosphatase von Hefe, z.B. Pho5, die Promotoren der α-Paarungsfaktoren der Hefe und von Polyoma, Adenovirus, Retrovirus und Simian-Virus abgeleitete Promotoren, z.B. die frühen und späten Promotoren von SV40 und andere Sequenzen, von denen bekannt ist, daß sie die Expression von Genen in prokaryontischen oder eukaryon tischen Zellen und ihren Viren steuern, oder Kombinationen davon.
- Zu solchen verwendbaren Expressionsvektoren gehören Vektoren, die die Expression der clonierten IL-1-INH-DNA-Sequenzen in eukaryontischen Zellen, wie tierischen und menschlichen Zellen, ermöglichen; vgl. z.B. P. J. Southern und P. Berg, J. Mol. Appl. Genet. 1 (1982), Seiten 327-341; S. Subramani et al., Mol. Cell. Biol. 1 (1981), Seiten 854-864; R. J. Kaufmann und P. A. Sharp, "Amplification And Expression Of Sequences Cotransfected with A Modular Dihydrofolate Reductase Complementary DNA Gene", J. Mol. Biol. 159 (1982), Seiten 601-621; R. J. Kaufmann und P. A. Sharp, Mol. Cell. Biol., 159 (1982), Seiten 601-664; S. I. Scahill et al., "Expression And Characterization Of The Product Of A Human Immune Interferon DNA Gene in Chinese Hamster Ovary Cells", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983), Seiten 4654-4659; G. Urlaub und L. A. Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980), Seiten 4216-4220.
- Außerdem können in jedem spezifischen Expressionsvektor unterschiedliche Stellen für die Insertion der erfindungsgemäßen IL-1-INH- DNA-Sequenzen ausgewählt werden. Diese Stellen werden üblicherweise nach der Restriktionsendonuclease bezeichnet, die sie schneidet. Sie sind dem Fachmann bekannt. Es wird darauf hingewiesen, daß ein für die Erfindung verwendbarer Expressionsvektor nicht eine Restriktionsendonuclease- Stelle für die Insertion des ausgewählten DNA-Fragments aufweisen muß. Stattdessen kann der Vektor mit dem Fragment auf andere Weise verbunden werden. Der Expressionsvektor und insbesondere die darin für die Insertion eines ausgewählten DNA-Fragments ausgewählte Stelle und ihre funktionelle Bindung darin an eine Expressionskontrollsequenz wird durch eine Reihe von Faktoren bestimmt, z.B. die Anzahl einem bestimmten Restriktionsenzym zugänglicher Stellen, die Größe des zu exprimierenden Proteins, die Zugänglichkeit des gewünschten Proteins für einen proteolytischen Abbau durch Enzyme der Wirtszelle, die Kontamination oder Bindung des zu exprimierenden Proteins durch Wirtszellproteine, die während der Reinigung schwierig abzutrennen sind; Expressionsmerkmale, wie die Lage von Start- und Stop-Codons im Verhältnis zu Vektorsequenzen und von anderen Faktoren, die dem Fachmann bekannt sind. Die Auswahl eines Vektors und einer Insertionsstelle für eine DNA-Sequenz wird durch ein Abwägen dieser Faktoren bestimmt, wobei nicht jede Auswahl für einen bestimmten Fall gleichermaßen wirksam ist.
- Verwendbare Expressionswirte umfassen bekannte eukaryontische und prokaryontische Wirte, wie Stämme von E.coli, wie E.coli SG-936, E.coli HB 101, E.coli W3110, E.coli X1776, E.coli X2282, E.coli DHI und E.coli MRC1, Pseudomonas, Bacillus, wie Bacillus subtilis, Streptomyces, Hefen und andere Pilze, tierische Zellen, wie COS-Zellen und CHO-Zellen, und menschliche Zellen und Pflanzenzellen in Gewebekultur.
- Natürlich erreicht man nicht mit allen Wirt/Expressionsvektor- Kombinationen die gleiche Ausbeute bei der Expression der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen oder bei der Produktion der erfindungsgemäßen IL-1- INH-ähnlichen Polypeptide. Jedoch kann eine bestimmte Auswahl einer Wirt/Expressions-Vektor-Kombination durch den Fachmann unter Berücksichtigung der vorstehend angegebenen Grundsätze getroffen werden, ohne dabei vom Bereich der Erfindung abzuweichen. Beispielsweise sollte die Auswahl auf dem Abwägen einer Reihe von Faktoren beruhen. Zu diesen gehören beispielsweise die Kompatibilität von Wirt und Vektor, die Toxizität der von der DNA-Sequenz codierten Proteine für den Wirt, die Einfachheit der Gewinnung des gewünschten Proteins, die Expressionseigen schaften der DNA-Sequenzen und der mit ihnen funktionell verbundenen Expressionskontrollsequenzen, die biologische Sicherheit, die Kosten und die Faltung, Form oder jede andere erforderliche Modifikation des gewünschten Proteins nach der Expression. Die durch Fermentation der mit den erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen transformierten prokaryontischen und eukaryontischen Wirte gebildeten IL-1-INHs lassen sich sodann in den immunsuppressiven und entzündungshemmenden Mitteln und Verfahren der Erfindung verwenden.
- Die erfindungsgemäßen IL-1-INHs können auch analysiert werden, um ihre aktiven Zentren zu bestimmen zur Herstellung von Fragmenten oder von Peptiden, einschließlich synthetischer Peptide, die die Aktivität der IL-1-INHs aufweisen. Zu den bekannten Verfahren zur Bestimmung solcher aktiven Zentren gehören Röntgenkristallographie, Kernmagnetresonanz, zirkulärer Dichroismus, UV-Spektroskopie und die gerichtete Mutagenese. Dementsprechend sind diese Fragmente oder Peptide auch Teil dieser Erfindung und können für immunsuppressive oder entzündungshemmende Ziele und Verfahren davon verwendet werden.
- Die Verabfolgung der erfindungsgemäßen IL-1-INH-Polypeptide oder der davon abgeleiteten oder synthetisierten Peptide oder die Verwendung ihrer Aminosäure-Sequenzen oder ihrer Salze oder pharmazeutisch verträglicher Derivate davon kann nach allen üblichen und verträglichen Arten der Verabfolgung von Agentien erfolgen, die eine immunsuppressive oder entzündungshemmende Aktivität aufweisen. Dazu gehören die orale, parenterale, subkutane, intravenöse, intralesionale oder örtliche Verabfolgung. Bevorzugt werden die örtliche, intralesionale oder intravenöse Injektion.
- Die bei diesen Therapien verwendeten Mittel können auch in einer Reihe von Formen vorliegen. Dazu gehören beispielsweise feste, halbfeste und flüssige Dosierungsformen, wie Tabletten, Pillen, Puder, flüssige Lösungen oder Suspensionen, Zäpfchen, injizierbare und infundierbare Lösungen. Die bevorzugte Form hängt von der beabsichtigten Verabfolgungsart und von der therapeutischen Anwendung ab. Die Mittel umfassen vorzugsweise auch übliche pharmazeutisch verträgliche Träger und andere medizinische Agentien, Träger, Zusatzstoffe, Exzipientien, etc., z.B. menschliches Serumalbumin oder Plasmapräparate. Vorzugsweise liegen die erfindungsgemäßen Mittel als Dosierungseinheit vor und sie werden üblicherweise einmal oder mehrmals pro Tag verabfolgt.
- Damit die hier beschriebene Erfindung besser verstanden werden kann, werden die nachfolgenden Beispiele vorgelegt. Es wird darauf hingewiesen, daß diese Beispiele nur der Veranschaulichung dienen sollen und nicht dahingehend aufzufassen sind, daß sie die vorliegende Erfindung in irgendeiner Weise auf die darin genannten speziellen Ausführungsformen beschränken.
- 100 Liter vereinigter Urin aus Patienten mit hohem Fieber 038,5ºC) ohne Urininfektionen werden mit einem Amicon-Ultrafiltrations- Hohlfaser-Apparat bei 4ºC auf 2 Liter konzentriert. Die erhaltene Lösung hat eine spezifische Aktivität von 12 Einheiten/mg Protein, bestimmt nach dem in Beispiel 2 beschriebenen IL-1-Rezeptor-Test, 166 Einheiten/mg Protein, bestimmt nach dem in Beispiel 3 beschriebenen LAF-Test, 32 Einheiten/mg Protein, bestimmt nach dem in Beispiel 4 beschriebenen EL-4/CTLL-Test, und 125 Einheiten/mg Protein, bestimmt nach dem in Beispiel 5 beschriebenen MCF-Test. Eine "Einheit" wird als die Menge IL-1- INH in µg definiert, die eine halbmaximale Hemmung in jedem biologischen Test hervorruft; vgl. Figur 9.
- Zunächst wird die konzentrierte Urinmenge mit festem Ammoniumsulfat gesättigt. Dies geschieht durch langsame Zugabe des Ammoniumsulfats unter konstantem Rühren bei 4ºC, bis eine Ammoniumsulfat-Sättigung von 40 % erreicht wird. Sodann wird das Präzipitat aus der Lösung durch 1-stündige Zentrifugation in einer Sorvall RC-58 (E. I. Du Pont, New Town, Conn.) mit einem Festwinkel-GSA-Rotor bei 10000 UpM entfernt. Sodann wird das Pellet verworfen und der Überstand auf 80 % Ammoniumsulfat-Sättigung eingestellt und 1 Stunde bei 10000 UpM zentrifugiert. Sodann wird das erhaltene Pellet in 20 mM Natriumphosphat (pH 7,2) mit 150 mM NaCl (650 ml) resuspendiert. Sodann wird die Lösung 24 Stunden gegen 145 Liter 10 mM Tris HCl (pH 8), 2 mM EDTA und 5 mM Benzamidin HCl zweimal dialysiert, um das Ammoniumsulfat zu entfernen.
- Anschließend wird die IL-1-INH-Aktivität in den vereinigten Fraktionen von anderen Proteinen abgetrennt. Dies geschieht unter Rückgriff auf die starke Bindungsaffinität von IL-1-INH an zwei unterschiedliche Anionenaustauscher. Jeder Anionenaustauscher wird allein oder in Kombination verwendet, wobei die DEAE-Sepharose-Säule vorzugsweise nach der QAE-Sepharose-Säule verwendet wird.
- Obwohl dem Fachmann viele Anionenaustausch-Chromatogräphie- Systeme bekannt sind, wird zunächst eine QAE-Sepharose-Säule mit einem Durchmesser von 5 cm x 45 cm verwendet (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, New Jersey). Nach dem Auftragen der vorstehend erhaltenen dialysierten Lösung wird die Säule gewaschen, bis die nicht gebundenen Proteine eluiert sind (optische Dichte bei 280 nm). Sodann werden die gebundenen Proteine mit vier Säulenvolumina eines Salzgradienten von bis 0,8 M NaCl, gelöst in Equilibrierungspuffer, eluiert. Der Säulendurchfluß betrug 120 ml/Stunde. Die Aktivität der verschiedenen Fraktionen wurde nach dem LAF- und dem Rezeptor-Bindungstest beobachtet (vgl. unten); vgl. Figur 1. Die Fraktionen mit der biologischen Aktivität von IL1 INH eluierten bei etwa 150 mM NaCl. Die vereinigten aktiven Fraktionen hatten eine spezifische Aktivität von 33 Einheiten/mg Protein, bestimmt nach dem in Beispiel 2 beschriebenen IL-1-Rezeptor-Bindungstest, 63 Einheiten/mg Protein, bestimmt nach dem in Beispiel 3 beschriebenen LAF-Test, 27 Einheiten/mg Protein, bestimmt nach dem in Beispiel 4 beschriebenen EL-4/CTLL-Test, und 200 Einheiten/mg Protein, bestimmt nach dem in Beispiel 5 beschriebenen MCF-Test; vgl. Figur 9.
- Die aktiven vereinigten Fraktionen wurden gegen 10 mM Tris HCl (pH 7) dialysiert und auf eine DEAE-Sepharose-Säule mit schnellem Durchfluß aufgetragen, 2,5 cm x 30 cm (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, New Jersey). Die mit den aktiven vereinigten Fraktionen beladene Säule wurde mit Equilibrierungspuffer (10 mM Tris HCl, pH 7) gewaschen, bis die optische Dichte bei 280 nm etwa 0 betrug. Sodann wurde das gebundene Protein mit einem Gradienten von 0 bis 0,2 M NaCl, gelöst im Equilibrierungspuffer, eluiert. Der Gradient hatte das 10-fache Volumen der Säule.
- Der Säulendurchfluß betrug 78 ml/Stunde. Die Aktivität der verschiedenen Fraktionen wurde erneut wie vorstehend beschrieben beobachtet. Diese Elution ergab die Elution der die IL-1-INH-Aktivität enthaltenden Fraktionen am Ende des 90 mM NaCl-Waschschrittes. Figur 2 zeigt das Aktivitätsprofil des IL-1-Inhibitors aus Urin an DEAE-Sepharose, wobei die inhibitorische Aktivität durch (A) den IL-1/LAF-Test und (B) den IL-1- Rezeptor-Bindungstest verfolgt wurde (siehe unten).
- Sodann wurden die aktiven vereinigten Fraktionen auf 6 ml mit einem Amicon-Ultrafiltrationsgerät und einer YM-10-Membran konzentriert. Die erhaltene Lösung hatte eine spezifische Aktivität von 50 Einheiten/mg Protein, bestimmt nach dem IL-1-Rezeptor-Bindungstest (vgl. unten), 125 Einheiten/mg Protein, bestimmt nach dem LAF-Test (vgl. unten), 40 Einheiten/mg Protein, bestimmt nach dem EL-4/CTLL-Test (vgl. unten), und 500 Einheiten/mg Protein, bestimmt nach dem MCF-Test (vgl. unten); vgl. Figur 9.
- Natürlich hätten auch andere Anionenaustauschsäulen verwendet werden können, ohne vom Bereich der Erfindung abzuweichen.
- Das wie vorstehend gewonnene Konzentrat wurde sodann zweimal mit einer Gelfiltration in Abhängigkeit vom Molekulargewicht fraktioniert. Obwohl dem Fachmann eine Reihe geeigneter Gelfiltrationssysteme bekannt sind, wurde ein AcA54-Gel (LKB, Schweden) mit einem Trennungsbereich von 6000 bis 70000 D ausgewählt. Die Aktivität der Fraktionen wurde erneut wie vorstehend beschrieben beobachtet; vgl. Figur 3. Die erhaltenen ver Einheiten/mg Protein, bestimmt mit dem IL-1-Rezeptor-Bindungstest (siehe unten), 526 Einheiten/mg Protein, bestimmt durch den LAF-Test (siehe unten), 333 Einheiten/mg Protein, bestimmt durch den EL-4/CTLL-Test (siehe unten), 1110 Einheiten/mg Protein, bestimmt durch den MCF-Test (siehe unten) (vgl. Figur 9), und ein Molekulargewicht von etwa 25 kD. Auch hier wird darauf hingewiesen, daß ebensogut andere Filtrationssysteme hätten verwendet werden können.
- Figur 4 zeigt die Dosisantwort der verschiedenen IL-1-INH-Pools aus Urin (A) im IL-1/LAF-Test und (B) im IL-1/Rezeptor-Bindungstest, die nachstehend beschrieben sind. Nach jedem Reinigungsschritt, d.h. konzentrierter Urin; QAE-Sepharose; DEAE-Sepharose; und AcA54 (zweimal) verringerte sich die Konzentration (µg/ml) von für die Inhibition erforderlichem IL-1-INH, was auf ein reineres Protein hinweist.
- Nach dem üblichen Verfahren des automatisierten Edman-Abbaus wurden die aktiven vereinigten Fraktionen der Gelfiltration durch Aminosäuresequenzierung untersucht. Dabei wurde beobachtet, daß die beiden Hauptkontaminationen, die mindestens 90 % des Proteingehalts ausmachen, Apolipoprotein A1 und das Retinol-bindende Protein waren. Obwohl verschiedene Verfahren zur Entfernung dieser Proteine zur Verfügung stehen, wurden die Immunabsorption und die hydrophobe Chromatographie gewählt.
- Somit wurden dann aus den aktiven vereinigten IL-1-INH-AcA54- Fraktionen die Hauptkontaminationen durch Immunabsorption abgetrennt. Monodonale und polyclonale Antikörper gegen das Retinol-bindende Protein und gegen Apolipoprotein A1 wurden in üblicher Weise durch Immunisierung hergestellt. Sodann wurden die Immunglobuline G (IgGs) durch Präzipitation mit 40%-iger Ammoniumsulfat-Sättigung partiell gereinigt. Das IgG-Pellet wurde in 0,2 M Natriumphosphat resuspendiert und gegen den gleichen Puffer dialysiert. Sodann wurde die IgG-Menge an Vinylsulfon-aktivierte Agarose, wie von den Herstellern beschrieben, gekoppelt (KEM-EN-TEC, Biotechnology Corp., Dänemark). Nach dem Equilibrieren des Immunabsorbens mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung wurden die Kontaminationen des IL-1-INH-Pools durch mehrfaches Durchleiten des Pools durch das Immunabsorbens absorbiert, bis das gesamte Retinol-bindende Protein und Apolipoprotein A1 vollständig absorbiert war. Dies wurde durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) bestimmt. Die erhaltene Lösung hatte eine spezifische Aktivität von 3334 Einheiten/mg Protein, bestimmt mit dem IL-1-Rezeptor-Bindungstest (siehe unten), 2500 Einheiten/mg Protein, bestimmt mit dem LAF-Test (siehe unten), 1250 Einheiten/mg Protein, bestimmt mit dem EL-4/CTLL-Test (siehe unten), 2160 Einheiten/mg Protein, bestimmt mit dem MCF-Test (siehe unten), (vgl. Figur 9) und zeigte eine einzelne Bande in der SDS/PAGE.
- Der immunabsorbierte IL-1-Inhibitor-Pool wurde auf 1 M NaCl durch Zugabe eines Volumens von 2 M NaCl, gelöst in 10 mM Tris HCl, pH 7, eingestellt und auf Phenyl-Sepharose aufgetragen (0,5 x 5 cm, dieses Harz wurde von Pharmacia Fine Chemicals, Schweden, erhalten). Das Harz wurde vorher mit 10 mM Tris HCl, pH 7, enthaltend 0,2 M NaCl (Equilibrierungspuffer), equilibriert. Nach dem Beladen wurde die Säule mit 3 Säulenvolumina zur Equilibrierung gewaschen, um alle nicht gebundenen Proteine zu eluieren, und die gebundenen Proteine wurden mit einem Gradienten von 0,2 M NaCl bis 0 M, gelöst in 10 mM Tris HCl, pH 7, eluiert. Der gesamte Gradient betrug das 50-fache des Säulenvolumens. Der Säulendurchfluß betrug 30 ml/Stunde. Die IL-1-Inhibitor-Aktivität wurde bei etwa 0,160 M NaCl eluiert und ergab ein Protein mit einem Molekulargewicht von 25 kD mit einem pI-Wert von 4,7. Die so erhaltene Lösung hatte eine spezifische Aktivität von 38461 Einheiten/mg Protein, bestimmt nach dem in Beispiel 2 beschriebenen IL-1-Rezeptor-Bindungstest, 2500 Einheiten/mg Protein, bestimmt nach dem in Beispiel 3 beschriebenen LAF-Test, 35020 Einheiten/mg Protein, bestimmt nach dem in Beispiel 4 beschriebenen E1-4/CTLL-Test, 30303 Einheiten/mg Protein, bestimmt nach dem in Beispiel 5 beschriebenen MCF-Test, (vgl. Figur 9) und zeigte eine einzelne Bande in der SDS/PAGE.
- Zur Bestimmung der Bindungseigenschaften des IL-1-INH an den IL- 1-Rezeptor auf EL-4-6.1-Zielzellen wurde zunächst geprüft, ob IL-1-INH mit der Bindung von [¹²&sup5;I]-IL-1 an die Zielzellen interferiert. IL-1 wurde mit ¹²&sup5;I nach dem Chloramin-T-Verfahren markiert (Lowenthal et al., "Binding and Internalization of Interleukin-1 by T-Cells", J. Exp. Med. 164, Seite 1060) und mit einem Überschuß von nicht markiertem IL-1- INH coinkubiert, worauf es an einem Ölgradienten gewaschen wurde. Mit einem Gamma-Zähler wurde sodann das von den Zellen zurückbehaltene Material gemessen. Dabei wurde gefunden, daß eine Erhöhung der Konzentration von IL-1-INH die Menge von an die Oberfläche der Zielzellen gebundenen [¹²&sup5;I]-IL-1 reduzierte.
- Außerdem wurde überprüft, ob IL-1-INH mit der Bindung von [¹²&sup5;I]-IL-1-INH an die Zielzellen interferiert, ob die Bindung von [¹²&sup5;I]-IL-1-INH durch nicht markiertes IL-1 kompetiert werden kann oder ob die Bindung von [¹²&sup5;I]-IL-1-INH an die Zielzellen mit Retinol-bindendem Protein oder Apolipoprotein A1 kompetiert werden kann. Mit [¹²&sup5;I] wurde IL-1-INH nach dem Verfahren von Bolton und Hunter markiert; vgl. Bolton und Hunter, "The labelling Of Proteins To High specific Radioactivities By conjugation to a ¹²&sup5;I-Containing Acylating Agent", Biochem. J., 133 (1973), Seite 529. Die Inkubation des Materials mit EL- 4-6.1-Zielzellen und das anschließende Waschen an einem Ölgradienten und die Analyse in einer SDS/PAGE zeigten, daß eine Spezies von etwa 25 kD an die EL-4-Zellen bindet. Es wurde beobachtet, daß die Coinkubation des [¹²&sup5;I]-IL-1-INH mit einem Überschuß nicht markiertem IL-1-INH die Bindung der markierten 25 kD-Art verhinderte. Außerdem wurde das E[¹²&sup5;I]-IL- 1-INH mit 50 Nanogramm nicht markiertem IL-1β coinkubiert. Dabei wurde gefunden, daß dieses die Bindung der markierten 25 kD-Art verhinderte. Das [¹²&sup5;1]-IL-1-INH wurde auch mit 1 µg immungereinigtem, Retinol-bindendem Protein und mit 1 µg rekombinantem Apolipoprotein A1 coinkubiert, und es wurde gefunden, daß dies nicht die Bindung der markierten 25 kD Art verhinderte. Somit bindet die im markierten IL-1-INH-Präparat enthaltene 25 kD-Art an die Oberfläche intakter EL-4-6.1-Zellen, und diese Bindung wird durch nicht markierten Inhibitor und durch IL-1 verdrängt, jedoch nicht durch Retinol-bindendes Protein oder Apolipoprotein A1.
- Die inhibitorische Aktivität von IL-1-INH in einem IL-1/LAF- Test, gemessen durch die Thymocyten-(T-Zell)-Proliferation in einer C&sub3;H/HeJ-Maus, wurde nachgewiesen; vgl. J. M. Dayer et al., "Human Recombinant IL-1 Stimulates Collagenase And Prostaglandin E2 Production By Human Synovial Cells", J. Clin. Invest. 77 (1986), Seite 645. Die Thymocyten-Zellen wurden 72 Stunden mit PHA (1 µg/ml) in Gegenwart von entweder hrIL-1α (vgl. P. Wingfield et al., "Purification and Characterization Of Human Interleukin-1 Expressed In E.coli", Eur. J. Biochem. 165 (1987), Seite 537) oder von IL-1β (vgl. P. Wingfield et al., "Purification And Characterization Of Human Interleukin-1β Expressed In Recombinant E.coli", Eur. J. Biochem. 160 (1986), Seite 491) bei unterschiedlichen Endkonzentrationen im Bereich von 20 pg/ml bis 2000 pg/ml hrIL-1 costimuliert; vgl. Figur 5. Eine vollständige Inhibition der costimulierten hIL-1α oder HIL-1β Thymocyten-Proliferation wurde erhalten, wenn die IL-1-INH-Fraktionen aus Beispiel 1(e) zu den Zellen gegeben wurden. Die inhibitorische Aktivität wurde bei drei Verdünnungen von IL-1-INH beobachtet: 1/20, 1/40 und 1/80.
- Da die Zugabe von IL-1-INH zu PHA-stimulierten Zellen in Abwesenheit von hrIL-1 den Einbau von [³H]-TDR nicht beeinträchtigte, wurde bestimmt, daß die Inhibition nicht auf einer cytotoxischen oder nichtspezifischen Wirkung, sondern auf der Inhibition der biologischen Aktivität von IL-1 beruht.
- Die inhibitorische Aktivität von IL-1-INH wurde bestimmt anhand der Beobachtung, ob es die Fähigkeit von II-1α oder IL-1β zur Induktion der Bildung von IL-2 in El-4-Zellen inhibieren kann; vgl. z.B. A.J.H. Gearing et al., "A Simple Sensitive Bioassay For IL-1 Which is Unresponsive to 10³ U/ml Of IL-2", J. Immun. Met. 99 (1987), Seite 7. Dies wird gemessen durch Cokultivierung eines Subclons von EL-4-Zellen, der Thymidin nicht aus dem umgebenden Medium aufnehmen kann, mit CTLL-2-Zellen und durch Beobachten, ob die CTLL-2-Zellen proliferieren.
- Die EL-4-6.1 c10-Zellen und CTLL-2-Zellen wurden zusammen bei einer Konzentration von 10&sup4; Zellen jedes Typs pro Mikrotiterplattenvertiefung (Platte mit 96 Vertiefungen) in Gegenwart von IL-1α oder IL-1β bei etwa 1 Picogramm/ml zusammen mit dem IL-1-INH aus Beispiel 1(e) gezüchtet. Nach 18 Stunden Cokultivieren wurde 1 Micro-Curie [³H]-TdR zugegeben und weitere 6 Stunden bei 37ºC in feuchter Atmosphäre inkubiert. Die Zellen wurden auf einer "MASH"-Zellerntevorrichtung auf Glasfiber streifen geerntet, getrocknet und mit einer Scintillationsmischung zum Zählen in einem Beta-Zählgerät vorbereitet. Es wurde eine vollständige Inhibition des [³H]-TdR-Einbaus bei IL-1-INH-Verdünnungen von 1/20, 1/40 und 1/80 erhalten.
- Außerdem wurde die inhibitorische Aktivität von IL-1-INH in einem IL-1/MCF-Test durch Messung an aus menschlicher Säuglingsvorhaut erhaltenen Fibroblasten gezeigt; vgl. J. Dayer et al., "Participation Of Monocyte Macrophage And Lymphocyte In The Production Of A Factor That Stimulates Collagenase And Prostaglandin Release By Rheumatoid Synovial Cells", J. Clin. Invest. 64 (1979), Seite 1386; J. Dayer et al., "Induction Of Human Interleukin-1 mRNA Measured By Collagenase And Prostaglandin E2-Stimulating Activity In Rheumatoid Synovial Cells", Eur. J. Immunol. 14 (1984), Seite 898. Die Fibroblasten wurden mit hrIL- 1α oder hrIL-1β bei denselben Konzentrationen wie im IL-1/LAF-Test stimuliert und die inhibitorische Aktivität bei denselben Endverdünnungen von IL-1-INH wie im IL-1/LAF-Test beobachtet. Nachdem die Zellen 72 stunden gezüchtet worden waren, wurde die Prostaglandin E&sub2;-Bildung in den Überständen der Fibroblasten durch einen doppelten Antikörper-Radioimmunoassay gemessen, wobei ein anti-Prostaglandin E&sub2;-Antiserum verwendet wurde; vgl. J. Dayer (1979), siehe oben. Wie in Figur 6 angegeben, wurde eine Dosisantwort der Prostaglandin E&sub2;-Bildung bis zu einer Konzentration von 100 pg/ml entweder durch hrIL-1α oder durch hrIL-1β beobachtet. Diese biologische Aktivität konnte durch Zugabe der IL-1-INH- Fraktionen aus Beispiel 1(e) inhibiert werden. Es wurde bestimmt, daß IL-1-INH erneut wirksam gegen hrIL-1α und hrIL-1β ist.
- Sodann wurde der vorstehende Test mit hrTNFα (vgl. A. Marmenout et al., "Molecular Cloning and Expression of TNF And Comparison With Mouse TNF", Eur. J. Biochem. 152 (1985), Seiten 515-522) anstelle von hrIL-1 durchgeführt, um die Spezifität von IL-1-INH zu bestimmen, da TNFα ebenso ein Vermittler der Prostaglandin E&sub2;- und Collagenase-Bildung ist. Wie in Figur 7 angegeben, wurde die hrTNF-vermittelte Prostaglandin E&sub2;-Bildung nicht signifikant durch die Zugabe des IL-1-INH beeinträchtigt, wodurch die Spezifität des IL-1-INH gezeigt wird.
- Außerdem wurde die biologische Aktivität von IL-1 in Gegenwart des IL-1-INH aus Beispiel 1(e) im Fibroblasten-Proliferationstest ermittelt, wobei der [³H]-TdR-Einbau gemessen wurde. Nach dem Züchten menschlicher Vorhautfibroblasten in Eagle'schem MEM, angereichert mit 10 mM HEPES, 100 Einheiten/ml Penicillin, 100 µg/ml Streptomycin, 1 % Glutamin, 1 % nicht essentielle Aminosäuren und 2 % FCS, wurden die Zellen in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen (2000 Zellen/Vertiefung) ausplattiert und 24 Stunden in einem Brutschrank bei 5 % CO&sub2; und 37ºC gezüchtet. Nach dem Entfernen des Mediums wurden die Fibroblasten entweder durch Zugabe von hrIL-1α oder hrIL-1β stimuliert und IL-1-INH wurde in denselben Verdünnungen wie bei den vorstehenden Tests zugegeben. Es wurde 48 Stunden gewartet und sodann wurden die Zellen 16 Stunden mit [³H]-TdR inkubiert. Das Medium wurde von den Zellen entfernt, die sodann mit PBS gewaschen und weitere 15 Minuten bei 37ºC mit Trypsin behandelt wurden. Mit einer Zellerntevorrichtung (Skatron, Lier, Norwegen) wurden die Zellen auf Glasfiltern gesammelt (Skatron, Inc., Sterling, Virginia, USA), mit Wasser gewaschen, luftgetrocknet und der cpm-Einbau mit einem Scintillationszähler bestimmt. Wie in Figur 8 angegeben, war die Fibroblasten-Proliferation dosisabhängig für hrIL-1α und hrIL-1β. Ein maximaler [³H]-TdR-Einbau wurde mit 250 pg/ml hrIL-1α oder β erhalten. Die Zugabe der inhibitorischen AcA54-Fraktion ergab ebenfalls ein vollständiges Absinken der hrIL-1-induzierten Proliferation. Es wurde auch eine vollständige Reversibilität der Inhibition durch Erhöhung der IL-1-Konzentrationen oder durch Verdünnung des IL-1-INH erzielt.
- Außerdem wurde die Spezifität dieser Inhibition durch Stimulierung der Fibroblasten mit hrTNFα bestimmt, das die Fibroblasten-Proliferation in einer dosisabhängigen Weise zu Konzentrationen von 250 pg/ml induziert. Die Zugabe der inhibitorischen AcA54-Fraktion ergab keine Hemmung der biologischen Aktivität von hrTNFα. Dies bestätigt die Spezifität des IL-1-INH.
- Gemäß Beispiel 1(e) eluierte, vereinigte Proteinfraktionen wurden auf eine PBE 94-Chromatofokussierungssäule (Pharmacia Fine Chemical, Schweden, 2,5 x 10 cm) aufgetragen, die vorher mit 25 mM Imidazol (pH 7,5) equilibriert wurde. Es wurde Polypuffer 74 HCL, pH 4, zugegeben, der eine Elution der gebundenen Proteine in Abhängigkeit von ihren isoelektrischen Punkten bewirkte. Der pI des IL-1-INH wurde als 4,7 bestimmt.
- Vorstehend wurde eine Reihe von erfindungsgemäßen Ausführungsformen beschrieben. Es ist jedoch klar, daß die grundlegenden Konstruktionen geändert werden können, um weitere Ausführungsformen bereitzustellen, bei denen die Verfahren und Mittel dieser Erfindung verwendet werden.
- Deshalb wird der Schutzumfang der Erfindung durch die nachfolgenden Patentansprüche definiert und nicht nur durch die speziellen Ausführungsformen, die beispielhaft dargelegt wurden.
Claims (13)
1. Im wesentlichen reiner IL-1-INH, der als Einzelbande auf
einem SDS/PAGE wandert und im wesentlichen frei ist von
Apolipoprotein A1 und Retinol-bindendem Protein, wobei
der IL-1-INH charakterisiert ist durch:
(a) eine inhibitorische Wirkung auf die LAF-Aktivität
von IL-1,
(b) eine inhibitorische Wirkung auf die MCF-Aktivität
von IL-1,
(c) eine inhibitorische Wirkung auf die IL-1-vermittelte
Fibroblastenproliferation,
(d) eine inhibitorische Wirkung auf die IL-1-Bindung an
IL-1-Rezeptoren,
(e) eine nicht-inhibitorische Wirkung auf die
TNFα-vermittelte Produktion von PGE&sub2; und Collagenase, und
(f) eine spezifische Aktivität von mindestens 1,2 x 10³
Einheiten/mg in einem IL-1-vermittelten
IL-2-Produktionstest.
2. IL-1-INH nach Anspruch 1, wobei der IL-1-INH bei der
SDS-PAGE ein Molekulargewicht von etwa 25 000 D hat.
3. IL-1-INH nach Anspruch 2, wobei der IL-1-INH bei der
Chromatographischen Fokussierung einen isoelektrischen
Punkt von 4,7 hat.
4. IL-1-INH nach Anspruch 1, wobei der IL-1-INH eine
spezifische Aktivität von mindestens 3,8 x 10&sup4; Einheiten/mg
in einem IL-1-Rezeptor-Bindungstest aufweist.
5. IL-1-INH nach Anspruch 1, wobei der IL-1-INH eine
spezifische Aktivität von mindestens 6,2 x 10&sup4; Einheiten/mg
in einem IL-1/LAF-Test aufweist.
16. IL-1-INH
nach Anspruch 1, wobei der IL-1-INH eine
spezifische Aktivität von mindestens 3,5 x 10&sup4; Einheiten/mg
in einem EL-4/CTLL-Test aufweist.
7. IL-1-INH nach Anspruch 1, wobei der IL-1-INH eine
spezifische Aktivität von mindestens 3,0 x 10&sup4; Einheiten/mg
in einem IL-1/MCF-Test aufweist.
8. Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten
DNA-Moleküls, das durch eine DNA-Sequenz gekennzeichnet ist, die
einen IL-1-INH nach einem der Ansprüche 1 bis 7 codiert,
wobei die folgenden Schritte durchgeführt werden:
(a) Bestimmen der Aminosäuresequenz eines gereinigten
IL-1-INH,
(b) Herstellung einer Reihe von
Oligonucleotidsondenmolekülen aufgrund der Aminosäuresequenz von Schritt
(a),
(c) Absuchen einer DNA- oder cDNA-Bank,
(d) Selektion von Olonen, die unter üblichen Bedingungen
mit den Sondenmolekülen hybridisieren, und
(e) Untersuchung der selektierten Clone durch
Sequenzierung oder Expression, um zu bestimmen, ob sie eine
für einen IL-1-INH codierende DNA-Sequenz enthalten.
9. Rekombinantes DNA-Molekül, umfassend eine DNA-Sequenz,
die bei der Expression einen IL-1-INH nach einem der
Ansprüche 1 bis 7 codiert.
10. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 9, das außerdem
eine Expressionskontrollsequenz enthält, wobei die
Expressionskontrollsequenz funktionell mit der DNA-Sequenz
verbunden ist, die in dem rekombinanten DNA-Molekül den
IL-1-INH codiert.
11. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 10, wobei die
Expressionskontrollsequenz ausgewählt ist aus dem lac-
System, dem trp-System, dem tac-System, dem trc-System,
den Hauptoperator- und Promotorbereichen von Phagen, dem
Kontrollbereich des fd-Hüllproteins, den frühen und
späten Promotoren für SV40, Polyoma-, Adenovirus- und
Simianvirus-Promotoren, dem Promotor der
3-Phosphoglyceratkinase, den Promotoren der sauren Phosphatase von
Hefe, dem Promotor der α-Paarungsfaktoren von Hefe und
Kombinationen davon.
12. Verfahren zur Herstellung eines IL-1-INH nach einem der
Ansprüche 1 bis 7, umfassend die Züchtung eines
einzelligen Wirtes, der mit einem rekombinanten DNA-Molekül
nach den Ansprüchen 10 oder 11 transformiert ist.
13. Arzneimittel, umfassend eine therapeutisch wirksame
Menge eines IL-INH nach einem der Ansprüche 1 bis 7.
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