JPH10327862A - 生物的材料の生産方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明のＩＬ−１ ＩＮＨの情報を断片およ
びペプチドの設計に使用して、本発明の免疫抑制または
抗炎症組成物および方法へのＩＬ−１ ＩＮＨとしての
使用方法を提供する。 【解決手段】 本発明の方法は、(a) 精製したＩＬ−１
ＩＮＨのアミノ酸配列を決定し、(b) 工程(a) のアミ
ノ酸配列を基礎とするオリゴヌクレオチドプローブのプ
ールを作成し、(c) ＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリー
のスクリーニングを行い、(d) 通常の条件下でプローブ
にハイブリダイズするクローンを選択し、(e) 配列決定
又は発現により選択クローンを分析し、それらがＩＬ−
１ ＩＮＨをコードするＤＮＡ配列を含有するか否かを
決定する工程からなることを特徴とする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、インターロイキン
１活性を選択的に阻害するインターロイキン１阻害剤
（ＩＬ−１ ＩＮＨ）に関する。また、本発明は、尿か
らこの種のＩＬ−１ＩＮＨを精製する方法、およびこの
阻害剤をコードするＤＮＡ配列からなる組換えＤＮＡ分
子で形質転換された宿主によってこの種のＩＬ−１ Ｉ
ＮＨを生産する方法に関し、この種のＩＬ−１ＩＮＨを
特徴とする処置方法および組成物に関する。これらの方
法および薬剤は、免疫抑制および抗炎症の用途および治
療に有用である。

【０００２】

【従来の技術】インターロイキン１（ＩＬ−１）は、主
としてマクロファージ／単球系統の細胞によって生産さ
れる蛋白質サイトカインである。ＩＬ−１ポリペプチド
をコードし得る２つの別個のＩＬ−１遺伝子が存在する
−−ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βである［ピー・オーロ
ンら、「ヒト単球インターロイキン−１前駆体ｃＤＮＡ
のヌクレオチド配列」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
81, p. 7909 (1984)、シー・マーチら、「２つの別個の
ヒトインターロイキン１全ＤＮＡαおよびβのクローン
化、配列並びに発現」、Nature, 315, p. 641 (198
5)］。組換えＩＬ−１αおよびβを使用するこれらそれ
ぞれの生物活性の研究により、果たして、双方の形態の
ＩＬ−１は多様な生物活性を分け合うことが示された。

【０００３】ＩＬ−１は幾種かの独特の生物活性を有す
る。これらの１つの活性−−リンパ球活性化因子（ＬＡ
Ｆ）−−は、結果的にＩＬ−１に対し、免疫応答メディ
エータたるを与え、かくして、ＩＬ−１は、多くの細胞
型の成熟化、分化並びに成長を刺激する。例えば、未成
熟ＴおよびＢリンパ球［ピー・オーロンら、Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA, 81, 上記］である。他のＩＬ−１
の活性−−単核細胞因子（ＭＣＦ）活性−−は、結果的
にＩＬ−１に対し、逆行的炎症応答の制御における中心
的役割を演ずることを与え［シー・ディナレロ、「ヒト
インターロイキン１の今日」、J. Clin. Immun., 5, p.
287(1985)］ると共に、かくして、ＩＬ−１は、例えば
繊維芽細胞および軟骨細胞のような幾種かの細胞を刺激
し、それぞれプロスタグランジンＥ2 （ＰＧＥ2 ）およ
びコラーゲナーゼを生産する。これらの応答は、リュー
マチ性関節炎のような併発疾患または組織の崩壊に随伴
する疾患の病因に包含される［ジェイ・ダイヤー、「リ
ューマチ性関節炎におけるサイトカインおよび他のメデ
ィエータ」、Spring Semin. Immunopath, 7, p. 387(19
84)］。更に、ＩＬ−１は、ＩＬ−２の生産を誘導する
ことが知られており［ジェイ・ダブリュ・ロエンサール
ら、「胸腺腫細胞によるＩＬ−２分泌およびＩＬ−２レ
セプタ発現双方のＩＬ−１依存性誘導」、J. Imm., 13
7, pp. 1226-1231 (1986) ］、これはＴ−細胞の増殖に
関する。最後に、ＩＬ−１は、内皮細胞上の分子を刺激
して白血球細胞を捕獲することも知られている［ジェイ
・オッペンハイムら、「１つ以上のインターロイキン１
が存在する」、Immun. Today, 7,p. 45 (1986) ］。

【０００４】したがって、抗原特異的Ｔ−細胞およびＢ
−細胞増殖を抑制すると共に繊維芽細胞によるプロスタ
グランジンおよびコラーゲナーゼ合成を抑制するＩＬ−
１阻害剤を同定し単離することは興味深い。この種の化
合物は、免疫および炎症応答に関する疾患の処置に有用
たり得る。なお、更に、ＩＬ−１媒介ＩＬ−２生産を抑
制し得るＩＬ−１阻害剤を単離することが望ましい。他
の蛋白質を同時に阻害することなくＩＬ−１の活性を選
択的に阻害する化合物の同定には更に興味がある。例え
ば、ＴＮＦ−αのような腫瘍壊死因子であり、これは、
ＩＬ−１の幾種かの生物的特性を分け合う。すなわち、
ヒト皮膚繊維芽細胞によるＰＧＥ2 およびコラーゲナー
ゼ生産［ジェイ・ダイヤーら、「カケクチン／腫瘍壊死
因子は、ヒト滑液細胞および皮膚繊維芽細胞によるコラ
ーゲナーゼおよびプロスタグランジンＥ2 生産を刺激す
る」、J. Exp. Med., 162, p. 2163 (1985) ］または繊
維芽細胞増殖の誘導［ピー・セッキンガら、「インター
ロイキン１活性の尿の阻害剤は、インターロイキン１α
およびβの双方に影響を与えるが、腫瘍壊死因子αには
影響を与えない」、J. Immun. 139, p. 1541 (1987) ］
である。

【０００５】現在では、プロスタグランジンのようなＩ
Ｌ−１に対して阻害効果を示すとして報告されている化
合物は、主として非選択的阻害剤として作用する。熱性
患者の尿は、ＩＬ−１の20〜30kDの選択的阻害剤を含有
することも報告されている［ゼット・リアオら、「熱性
患者の尿中の特異的インターロイキン１阻害剤の同
定」、J. Exp. Med., 159, p. 126 (1984)］。リアオ
は、この化合物が極めて粗製の形態以外にあるか、また
は、これがＩＬ−１のＭＣＦ活性を阻害するか、標的細
胞のレセプタへのＩＬ−１の結合を阻害するか、ＩＬ−
１の存在下で繊維芽細胞の増殖を阻害するかについては
示唆していない。ＩＬ−１阻害効果を有すると報告され
た第二の化合物［ダブリュ・アレンドら、「ヒト単球に
よるインターロイキンまたはインターロイキン１阻害剤
の生産に対する免疫複合体の効果」、J.Immun., 134,
p. 3868 (1985)］は、付着免疫複合体上で培養されたヒ
ト単球によって生産される。しかしながら、アレンドの
報告は、この化合物がＩＬ−１のＬＡＦおよびＭＣＦ活
性の双方を阻害するか否かの点で不明瞭である（第3874
頁を参照するとよい）。いずれにしろ、アレンドによる
報文は、この化合物が実質的に純粋か否か、これがＩＬ
−１の標的細胞レセプタへの結合を遮断するか、又はＩ
Ｌ−１の存在下で繊維芽細胞の増殖を阻害するか否かに
ついては報告していない。ＩＬ−１阻害効果を有すると
報告された第三の化合物［ジェイ−エフ・バラボイン
ら、「繊維芽細胞および滑液細胞によるプロスタグラン
ジンＥ2 およびコラーゲナーゼ生産は、尿より誘導され
たヒトインターロイキン１および阻害剤によって制御さ
れる」、J. Clin.Invest. 78, p. 1120 (1986)］は、極
めて粗製の形態であることが示唆され、その作用様式は
記述されていない。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、実質的に純
粋なＩＬ−１阻害剤（「ＩＬ−１ ＩＮＨ」）を提供す
ることにより前記した問題を解決する。これは、ＩＬ−
１ ＬＡＦおよびＩＬ−１ ＭＣＦ活性を選択的に阻害
し、ＩＬ−２のＩＬ−１媒介生産を阻害し、ＩＬ−１媒
介繊維芽細胞増殖を阻害し、標的細胞上でＩＬ−１レセ
プタに結合し、免疫抑制または抗炎症組成物、方法並び
に治療に使用する。本発明によるＩＬ−１ＩＮＨは、標
的細胞におけるＰＧＥ2 およびコラーゲナーゼのＴＮＦ
α媒介生産を阻害しない。よって、本発明のＩＬ−１
ＩＮＨは、免疫抑制および抗炎症用途のための種々の組
成物および方法に有用である。本発明のＩＬ−１ ＩＮ
Ｈは、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ上で約25kDの分子量とクロマト
フォーカシングによって決定された4.7 の等電点とを有
するポリペプチドであることを特徴とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】これらのＩＬ−１ ＩＮ
Ｈを生産する本発明の方法の１つの態様は、天然起源か
らの精製である。この種の精製は、熱性患者の粗製尿を
濃縮し、尿から粗製ＩＬ−１ ＩＮＨを沈澱させ、１ま
たはそれ以上のイオン交換クロマトグラフ、疎水性クロ
マトグラフ、ゲル濾過並びに免疫吸着によりこの沈澱物
の他の蛋白質からＩＬ−１ ＩＮＨを分画する工程から
なる。

【０００８】これらのＩＬ−１ ＩＮＨを生産する本発
明の方法の第二のおよび好適な態様は、この種の阻害剤
の組換えによる生産である。この種の方法では、本発明
のＩＬ−１ ＩＮＨをコードするＤＮＡ配列、これらの
配列を特徴とする組換えＤＮＡ分子並びにこれらのＤＮ
Ａにより形質転換された単細胞宿主および分子を用い
て、（付加的なN-末端メチオニンを用いるか、用いるこ
となく）本発明のＩＬ−１ ＩＮＨまたはその一部を形
質転換された宿主の醗酵により生産する。ＩＬ−１ Ｉ
ＮＨ活性を示す本発明によるＩＬ−１ ＩＮＨポリペプ
チドは、ＩＬ−１ＩＮＨのアミノ酸配列に対する種々の
他のアミノ酸置換、付加または欠失を包含し得ることを
理解すべきである。

【０００９】本発明の他の目的は、本発明のＩＬ−１
ＩＮＨを用いて活性ＩＬ−１ ＩＮＨ部位の分子構造お
よび配置を決定し、その情報を断片およびペプチドの設
計に使用して、本発明の免疫抑制または抗炎症組成物お
よび方法へのＩＬ−１ ＩＮＨとしての使用を図ること
である。

【００１０】

【発明の実施の形態】ここに記載する発明が十分に理解
されるべく、以下の詳細な説明を記載する。

【００１１】説明では、以下の用語を用いる：ＭＣＦ −−「単核細胞因子」。ＩＬ−１の「ＭＣＦ活
性」が、例えば繊維芽細胞、滑液細胞のような種々の標
的細胞におけるプロスタグランジンＥおよびコラーゲナ
ーゼ生産を刺激するその能力を規定する。ＬＡＦ −−「リンパ球活性化因子」。ＩＬ−１の「ＬＡ
Ｆ」活性が、ＴおよびＢリンパ球の増殖および分化を刺
激するその能力を規定する。 ＣＴＬＬ−−「細胞毒性Ｔ−リンパ球細胞ライン」。Ｃ
ＴＬＬ細胞をＥＬ−４細胞と共にインキュベートし、Ｅ
Ｌ−４細胞によるＩＬ−２の生産に対するＩＬ−１の刺
激効果をアッセイするのに使用した。その後ＩＬ−２
は、ＣＴＬＬＸＥ細胞の増殖を刺激するが、これは測定
可能である。

【００１２】本発明は、実質的に純粋なＩＬ−１ ＩＮ
Ｈに関する。本発明により規定される「実質的に純粋
な」ＩＬ−１ ＩＮＨは、主要な共存物質、特にアポリ
ポ蛋白質Ａ１およびレチノール結合蛋白質を実質的に含
有せず、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ上で単一バンドとして移動す
る。

【００１３】本発明のＩＬ−１ ＩＮＨは、ＩＬ−１
ＬＡＦおよびＩＬ−１ ＭＣＦ活性を選択的に阻害し、
ＥＬ−４細胞によるＩＬ−１媒介ＩＬ−２生産を阻害
し、ＩＬ−１媒介繊維芽細胞増殖を阻害し、標的細胞上
のＩＬ−１レセプタに結合する。この種の選択的阻害
は、ＩＬ−１媒介活性をブロックする能力を有するとし
て定義されるが、ＩＬ−１に類似する幾種かの活性を有
する他の化合物をブロックする能力を欠く。例えば、ヒ
ト組換えＴＮＦα（ｈｒＴＮＦα）があるが、これはＰ
ＥＧ2 およびコラーゲナーゼ生産のメディエータであ
る。この特異性は、免疫系の他のメディエータの必要な
活性を妨害することなくＩＬ−１を選択的にブロックす
るのに重要な因子である。本ＩＬ−１ ＩＮＨのこの特
異性を、ＩＬ−１の活性に対する本発明のＩＬ−１ Ｉ
ＮＨの効果をｈｒＴＮＦαと比較することにより示し、
ＩＬ−１／ＭＣＦおよび繊維芽細胞増殖アッセイを使用
する。

【００１４】最も好適には、本発明のＩＬ−１ ＩＮＨ
はＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で約25kDの分子量を有し、クロマ
トフォーカシングによる測定として4.7 の等電点を有す
る。

【００１５】本発明のＩＬ−１ ＩＮＨは、ＬＡＦアッ
セイ、ＭＣＦアッセイ、ＥＬ−４／細胞毒性Ｔ−リンパ
球アッセイ（「ＥＬ−４／ＣＴＬＬ」）並びに繊維芽細
胞増殖アッセイにおいてＩＬ−１媒介応答を阻害し得
る。ＩＬ−１／ＬＡＦアッセイにおいては、ＩＬ−１α
またはβ誘導Ｔ−細胞増殖の阻害を、種々に希釈した本
発明のＩＬ−１ ＩＮＨの存在下で［Ｈ3 ］チミジンの
取り込みのレベルの減少を検出することにより測定す
る。ＩＬ−１／ＭＣＦアッセイにおいては、ＩＬ−１媒
介ＰＧＥ2 生産の阻害を、種々に希釈した本発明のＩＬ
−１ ＩＮＨの存在下でＰＧＥ2 に対する抗血清を使用
する二重抗体ラジオイムノアッセイにより測定する。ラ
ジオイムノアッセイにより検出される培地へのＰＧＥ2
の減少は、ＩＬ−１ ＩＮＨ活性を示す。ＥＬ−４／Ｃ
ＴＬＬアッセイにおいては、ＩＬ−１媒介ＩＬ−２生産
の阻害を、種々に希釈した本発明のＩＬ−１ ＩＮＨの
存在下で測定する。阻害は、ＣＴＬＬ細胞の増殖の測定
として使用する［Ｈ3 ］チミジン（［Ｈ3 ］−ＴｄＲ）
の取り込みのレベルの減少として観察する。増殖は、投
与−応答様式でＩＬ−２を誘導するＩＬ−１の存在下で
のみ生起する。繊維芽細胞増殖アッセイにおいては、Ｉ
Ｌ−１誘導繊維芽細胞による［Ｈ3 ］−ＴｄＲの取り込
みの阻害を、種々に希釈した本発明のＩＬ−１ ＩＮＨ
の存在下で測定する。

【００１６】前記したように、本発明のＩＬ−１ ＩＮ
Ｈは、標的細胞上でＩＬ−１レセプタに特異的に結合す
る。この結合は、一連のＩＬ−１結合アッセイを使用す
ることにより示される。第一に、ラベルしたＩＬ−１の
結合に際し、標的細胞上のレセプタに対するＩＬ−１
ＩＮＨの増加する濃度の効果を測定した。高濃度のＩＬ
−１ ＩＮＨは、結合したラベル ＩＬ−１の量を減少
させることを認めた。次に、過剰の非ラベルのＩＬ−１
ＩＮＨを添加し、標的細胞に結合したラベルしたＩＬ
−１に対するその過剰の効果を観察した。このアッセイ
は、過剰のＩＬ−１ ＩＮＨは、標的細胞の表面に結合
したラベルしたＩＬ−１と成功裡に競合し置換すること
を示した。更に、過剰のレチノール結合蛋白質を添加
し、これが、標的細胞に対するＩＬ−１ ＩＮＨの結合
を妨害しないことを観察した。このアッセイは、本ＩＬ
−１ ＩＮＨがＩＬ−１と特異的に競合して標的細胞上
でＩＬ−１レセプタに結合することを示した。

【００１７】本発明は、天然起源（例えば高度熱性患者
または日和見感染に罹患したＡＩＤＳ患者）から本発明
のＩＬ−１ ＩＮＨを単離する精製方法にも関する。こ
の方法は幾種かの工程からなる。一般に、これらの工程
の概要は、(1) 尿を濃縮し、(2) 濃縮した尿から粗製Ｉ
Ｌ−１ ＩＮＨを沈澱させると共に、少くともイオン交
換クロマトグラフ、疎水性クロマトグラフ、ゲル濾過な
らびに免疫吸着の１つによりこの沈澱物の他の蛋白質か
らＩＬ−１ ＩＮＨを分画するものである。

【００１８】この方法の好適な態様では、標準的手順、
例えば限外濾過を使用して熱性患者から粗製尿をまず濃
縮する。次に、硫酸アンモニウムを使用してこの濃縮し
た尿のプールからＩＬ−１ ＩＮＨを含有する粗製画分
を沈澱させた。透析により硫酸アンモニウムを除去した
後、イオン交換クロマトグラフを使用して他の蛋白質か
らＩＬ−１ ＩＮＨ活性を含有する画分を分離する。特
に、この最も好適な態様では、２つの陰イオン交換樹脂
−−ジエチル−（２−ヒドロキシプロピル）アミノエチ
ルセファロース（（ＱＡＥ）−セファロースカラム）お
よびジエチルアミノエチル−セファロースカラム（（Ｄ
ＥＡＥ）−セファロースカラム）−−を単独または組合
せて用いるが、好ましくはＤＥＡＥセファロースカラム
をＱＡＥセファロースカラムの後とする。種々の画分の
活性を監視すべく、ＬＡＦおよびレセプタ結合アッセイ
を用いた。本発明のこの態様では、ＩＬ−１ ＩＮＨ活
性画分を次に、ゲル濾過を使用する分子量に基いて分画
し（最も好ましくはＡｃＡ５４ゲルによる）、前記した
ようにして再度活性画分を選択する。選択された画分
は、約25kDの分子量および少くとも90％の蛋白質含量を
示すことを特徴とする。主要な共存物は、アポリポ蛋白
質Ａ１およびレチノール結合蛋白質である。これらの共
存物は種々の方法によって除去し得るにも拘らず、好ま
しくは、免疫吸着の方法により、アポリポ蛋白質および
レチノール結合蛋白質に対して与えられたモノクローナ
ルまたはポリクローナル抗体を用いる。

【００１９】前記ＩＬ−１ ＩＮＨ活性画分を、フェニ
ル−セファロースカラム（これは蛋白質をその疎水性に
よって分画する）上での疎水性クロマトグフによって更
に精製する。例えば、アポリポ蛋白質Ａ１およびレチノ
ール結合蛋白質は、本発明の蛋白質より疎水性であり、
したがってカラム上に保持される。

【００２０】前記説明した好適な方法を使用し、本発明
のＩＬ−１ＩＮＨの比活性、すなわち、最大の半分の阻
害を与えるのに必要なＩＬ−１ ＩＮＨの量は、それぞ
れの精製工程の後に増加した。図９を参照するとよい。
ＩＬ−１レセプタ結合アッセイ、ＬＡＦアッセイ、ＥＬ
−４／ＣＴＬＬアッセイ並びにＭＣＦアッセイを使用し
てこの比活性を測定した。しかしながら、幾種かの他の
アッセイも同様に使用し得る。

【００２１】前記方法または好適な方法で精製したＩＬ
−１ ＩＮＨは、本発明の免疫抑制および抗炎症組成物
並びに方法に直接使用し得る。しかしながら、寧ろこの
種の精製蛋白質をアミノ酸配列データの供給源として使
用してＤＮＡプローブの設計を可能とし、本発明のＩＬ
−１ ＩＮＨをコードするＤＮＡ配列の単離および選択
への使用を図った。その後、この種のＤＮＡ配列、これ
らを含む組換えＤＮＡ分子、並びにこれらにより形質転
換された単細胞宿主を用いて、実質的に他のヒト蛋白質
を含有しない本発明のＩＬ−１ ＩＮＨを大量に生産
し、本発明の組成物および治療への使用を図った。

【００２２】更に詳しくは、精製したＩＬ−１ ＩＮＨ
の種々の蛋白質および断片のアミノ酸配列を決定した。
その後、これらの配列およびこれらをコードするとして
推論されたＤＮＡ配列を使用し、本発明のＩＬ−１ Ｉ
ＮＨをコードするＤＮＡ配列の種々のＤＮＡライブラリ
をスクリーニングするのに潜在的に有用な一連のＤＮＡ
プローブを設計する。この種のライブラリには、染色体
遺伝子バンクおよびＤＮＡまたは本発明のＩＬ−１ Ｉ
ＮＨを生産することが示される組織または細胞ラインか
ら調製されたｃＤＮＡライブラリが包含され、この種の
細胞ラインには、当業界でよく知られた単球細胞が包含
される。

【００２３】ｃＤＮＡを調製し、最終的にＩＬ−１ Ｉ
ＮＨポリペプチドをクローン化し発現させる手段とし
て、ＩＬ−１ ＩＮＨ生産細胞供給源からポリＡ+ ｍＲ
ＮＡを単離する。例えば、刺激されたマクロファージで
ある。従来の手順を使用するが、例えば、次に記載され
たものとする。ランドら、「真核ｍＲＮＡの５−末端配
列は高い効率でクローン化し得る」、Nucleic Acid Res
earch, 9, pp. 2251-66(1981)、オカヨマとベルグ、
「全長さｃＤＮＡの高効率クローン化」、Mol. andCel
l. Biol., 2, pp. 161-70 (1982)、並びにマニアティス
ら、「Molecular Cloning 」中（コールド・スプリング
・ハーバ・ラボラトリ編、コールド・スプリング・ハー
バ、ニューヨーク）、pp. 229-46 (1982) 。次に、前記
単離されたポリＡ+ ｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリを
構成する。従来の手順を使用するが、例えば次に記載さ
れたものとする。ウィケンスら、「リゾチーム、オボム
コイド並びにオーバルヒューマンｍＲＮＡに相補的な二
本鎖ＤＮＡの合成」、J. Biol.Chem., 253, pp. 2483-9
5 (1978) 、マニアティスら、「Molecular Cloning 」
中（コールド・スプリング・ハーバ・ラボラトリ編、コ
ールド・スプリング・ハーバ、ニューヨーク）、pp. 22
9-46 (1982) 、並びにブイ・グブラら、「ｃＤＮＡライ
ブラリを作製する単純かつ極めて効率的な方法」、Gen
e, 25, pp. 263-69(1983) 。

【００２４】特定の組換えＤＮＡ分子を含有するもの、
すなわち、ＩＬ−１ ＩＮＨ挿入物を含有するもののク
ローンのライブラリをスクリーニングする幾種かのアプ
ローチが存在する。例えば、本精製ＩＬ−１ ＩＮＨの
部分アミノ酸配列を基礎とし、本発明のＩＬ−１ ＩＮ
Ｈの選択部分をコードする一連の合成ＤＮＡ断片からな
るＤＮＡプローブを構成することができる。アミノ酸配
列を決定する技術は、当業界でよく知られている。ＩＬ
−１ ＩＮＨの種々の領域のアミノ酸配列を決定したな
らば、縮退ＩＬ−１ ＩＮＨプローブのプールを化学的
に合成し得るが、従来のホスホアミドＤＮＡ合成技術を
使用し、種々のＤＮＡライブラリのスクリーニングへの
使用を図り、ハイブリダイゼーションにより関連するＤ
ＮＡ配列を選択する。その後、32Ｐ−ＡＴＰおよびＴ４
ポリヌクレオチドキナーゼを使用して32ＰによるＤＮＡ
プローブの５′エンドラベルを行う。主として、エー・
エム・マキサムとダブリュ・ギルバート、「ＤＮＡ配列
決定の新しい方法」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 7
4, pp. 560-64 (1977) によって記載されている。その
後、これらのＤＮＡプローブを使用し、ｃＤＮＡまたは
染色体ライブラリのスクリーニングを行う。例えば、単
球白血病細胞ラインU937、ＴＨＰ−Ｉ並びにＨＬ60であ
り、従来の方法を使用し、本発明のＩＬ−１ ＩＮＨを
コードするＤＮＡ配列について行う。その後、これらの
選択された配列を加工して、これらにより形質転換され
た原核および真核宿主におけるＩＬ−１ ＩＮＨの発現
を図るが、当業界でよく知られた技術による。また、こ
れらは、哺乳動物ＩＬ−１ ＩＮＨをコードする他の関
連するＤＮＡ配列を選択するスクリーニングのプローブ
としても有用である。

【００２５】本発明のＤＮＡ配列およびＤＮＡ分子は、
広範な宿主／ベクタの組合せを使用して発現し得る。例
えば、有用なベクタは染色体、非染色体並びに合成ＤＮ
Ａ配列の断片よりなり、例えば、ＳＶ40の種々の公知誘
導体および公知細菌プラスミド、例えば、ｃｏｌＥ１、
ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９並びにＲＰ４；ファ
ージＤＮＡ、例えば、ファージの種々の誘導体、例え
ば、ＮＭ９８９、および他のＤＮＡファージ、例えば、
Ｍ１３、および他の線状一本鎖ＤＮＡファージ；２μプ
ラスミドのような酵母に有用なベクタ；真核細胞に有用
なベクタ、例えば、動物細胞に有用なベクタ、例えば、
ＳＶ−４０アデノウィルスを含有するものおよびレトロ
ウィルス誘導ＤＮＡ配列並びにプラスミドおよびファー
ジのＤＮＡの組合せから誘導されたベクタ、例えば、フ
ァージＤＮＡまたはその誘導体を用いるよう改変された
プラスミドである。

【００２６】この種の発現ベクタも、少くとも１つの発
現調節配列を特徴とし、ベクタに挿入されたＩＬ−１
ＩＮＨ ＤＮＡ配列に機能的に連結され、そのクローン
化ＤＮＡ配列の発現の調節および制御を図る。有用な発
現調節配列の例には、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ｔａｃ系、
ｔｒｃ系、ファージλの主要オペレータおよびプロモー
タ領域、ｆｄコート蛋白質の調節領域、酵母の解糖系プ
ロモータ、例えば、３−ホスホグリセレートキナーゼの
プロモータ、酵母酸性ホスファターゼのプロモータ、例
えば、Ｐｈｏ５、酵母α−交配因子のプロモータ、並び
にポリオーマ、アデノウィルス、レトロウィルス、並び
にシミアンウィルスから誘導されたプロモータ、例え
ば、初期および後期プロモータまたはＳＶ４０、並びに
原核および真核細胞の遺伝子の発現を調節することが知
られている他の配列並びにそれらのウィルスまたはそれ
らの組合せがある。

【００２７】この種の有用な発現ベクタの内、真核宿主
でのクローン化ＩＬ−１ ＩＮＨＤＮＡ配列の発現を可
能とするベクタが存する。例えば、動物およびヒト細胞
［例えば、サザーンとピー・ベルグ、J. Mol. Appl. Ge
net., 1, pp. 327-41 (1982)、エス・サブラマニら、Mo
l. Cell. Biol., 1, pp. 854-64 (1981)、アール・ジェ
イ・カウフマンとピー・エー・シャープ、「モジュラ・
ジヒドロ葉酸レダクターゼ相補的ＤＮＡ遺伝子により共
感染された配列の増幅および発現」、J. Mol. Biol., 1
59, pp. 601-21 (1982) 、アール・ジェイ・カウフマン
とピー・エー・シャープ、Mol. Cell. Biol., 159, pp.
601-64 (1982)、エス・アイ・スカヒルら、「チャイニ
ーズ・ハムスター・オバリー細胞におけるヒト免疫イン
ターフェロンＤＮＡ遺伝子の産物の発現と特徴」Proc.
Natl. Acad. Sci. USA., 80, pp. 4654-59 (1983) 、ジ
ー・ウルラウブとエル・エー・チャシン、Proc. Natl.A
cad. Sci. USA., 77, pp. 4216-20 (1980) ］である。

【００２８】更に、それぞれの特定の発現ベクタ内に
て、本発明のＩＬ−１ ＩＮＨ ＤＮＡ配列を挿入する
種々の部位を選択し得る。これらの部位は、これらを切
断する制限エンドヌクレアーゼにより通常は設計され
る。これらは、当業者によってよく認識されている。本
発明に有用な発現ベクタは、選択されたＤＮＡ断片を挿
入する制限エンドヌクレアーゼ部位を有する必要はない
ことを理解すべきである。その代りに、このベクタは、
他の手段によって断片に連結し得る。この発現ベクタ、
および特にその中で選択されたＤＮＡ断片の挿入のため
に選択される部位並びにその中の発現調節配列への機能
的連結は、種々の因子により決定される。例えば、特定
の制限酵素に感受性の部位の数、発現すべき蛋白質の大
きさ、宿主細胞酵素による蛋白質分解に対する所望の蛋
白質の感受性、精製の途中で除去するのが困難な宿主細
胞蛋白質による共存または発現すべき蛋白質への結合、
発現特性、例えば、ベクタ配列に関しての開始および停
止コドンの位置、並びに当業者によって認識される他の
因子である。ベクタおよびＤＮＡ配列の挿入部位の選択
は、これらの因子のバランスによって決定され、必ずし
も全ての選択が、与えられた場合に対して等しく有効で
はない。

【００２９】有用な発現宿主には、周知の真核および原
核宿主が包含される。例えば、イー・コリの種、例え
ば、イー・コリＳＧ−９３６、イー・コリＨＢ１０１、
イー・コリＷ３１１０、イー・コリＸ１７７６、イー・
コリＸ２２８２、イー・コリＤＨＩ、並びにイー・コリ
ＭＲＣ１、シュードモナス、枯草菌、例えば、バシラス
・サティリス（Bacillus subtilis ）、ストレプトミセ
ス、酵母並びに他の真菌類、動物、例えば、ＣＯＳ細胞
およびＣＨＯ細胞、並びにヒト細胞並びに組織培養にお
ける植物細胞である。

【００３０】勿論、必ずしも全ての宿主／発現ベクタの
組合せが、本発明のＤＮＡ配列の発現に際し、または本
発明のＩＬ−１ ＩＮＨ様ポリペプチドの生産に際し、
等しい効率で機能するものではない。しかしながら、宿
主／発現ベクタの組合せの特定の選択は、本発明の範囲
を逸脱することなくここに記載した原理をすべからく熟
考した後に当業者によって為され得る。例えば、選択
は、多数の因子のバランスに基くべきである。これらに
は、例えば、宿主とベクタとの和合性、ＤＮＡ配列によ
ってコードされる蛋白質の宿主に対する毒性、所望の蛋
白質の回収の容易性、ＤＮＡ配列およびこれらに機能的
に連結された発現調節配列の発現特性、生物的安全性、
コスト並びに折り畳み、形態または他の全ゆる必要な所
望の蛋白質の発現後改変が包含される。

【００３１】その後、本発明のＤＮＡ配列により形質転
換された原核または真核宿主の醗酵によって生産される
ＩＬ−１ ＩＮＨを、本発明の免疫抑制および抗炎症組
成物並びに方法に用いることができる。

【００３２】また、本発明のＩＬ−１ ＩＮＨを分析し
てＩＬ−１ ＩＮＨの活性を有する合成ペプチドが包含
される断片またはペプチドを生産するこれらの活性部位
を決定することもできる。この種の活性部位を決定する
公知の方法の中には、Ｘ線結晶解析、核磁気共鳴、円偏
光二色性、ＵＶ分光分析並びに部位特異的突然変異があ
る。よって、これらの断片およびペプチドも本発明の一
部であり、その免疫抑制または抗炎症標的並びに方法に
用いることができる。

【００３３】本発明のＩＬ−１ ＩＮＨポリペプチド、
またはこれらから誘導または合成されるか、またはこれ
らのアミノ酸配列を使用するペプチド、またはこれらの
塩または薬学的に許容し得るこれらの誘導体の投与は、
免疫抑制または抗炎症活性を示す薬剤の投与について従
来受け入れられた全ゆる方法を介して行うことができ
る。これらには、経口、非経口、皮下、静脈内、病巣内
または局所投与が包含される。局所、病巣内または静脈
内投与が好適である。

【００３４】これらの治療に使用される組成物も、種々
の形態とし得る。これらには、例えば、固体、準固体並
びに液体投与形態が包含され、例えば、タブレット、ピ
ル、粉末、液体溶液または懸濁液、座薬、注射および注
入溶液がある。好適な形態は、意図する投与の様式並び
に治療用途に依存する。また、この組成物は、好ましく
は、従来の薬学的に許容し得るキャリヤを包含し、他の
治療薬剤、キャリヤ、アジュバント、賦形剤等、例え
ば、ヒト血清アルブミンまたは血漿調製物を包含し得
る。好ましくは、本発明の組成物は、単位投与の形態と
し、通常は１日に１回以上投与する。

【００３５】ここに記載した本発明がより十分に理解さ
れるべく、以下の実施例を記載する。これらの実施例は
説明の目的のためのみであり、如何なる様式において
も、ここに記載する特定の態様に本発明を限定すると解
釈すべきでないことを理解すべきである。

【００３６】

【実施例】

実施例１：ＩＬ−１ ＩＮＨの精製 a)ヒト尿由来の蛋白質の濃縮 ４℃にて、100 リットルのプールした尿（尿感染症を有
さない高度熱性患者（＞38.5℃）由来）を用い、アミコ
ン限外濾過ホロー・ファイバ装置により２リットルに濃
縮した。得られた溶液は、実施例２で記載するＩＬ−１
レセプタアッセイによる測定で12Ｕ／mg蛋白質、実施例
３で記載するＬＡＦアッセイによる測定で166 Ｕ／mg蛋
白質、実施例４で記載するＥＬ−４／ＣＴＬＬアッセイ
による測定で32Ｕ／mg蛋白質、実施例５で記載するＭＣ
Ｆアッセイによる測定で125 Ｕ／mg蛋白質の比活性を有
していた。「Ｕ」または単位は、それぞれのバイオアッ
セイで最大の半分の阻害を与えるＩＬ−１ ＩＮＨ（μ
g ）の量として定義する。図９を参照するとよい。

【００３７】b)ヒト尿由来の蛋白質の沈澱 まず、固体硫酸アンモニウムを用いて、濃縮した尿のプ
ールを飽和させた。一定に撹拌しつつ４℃にて硫酸アン
モニウム飽和40％に達するまで硫酸アンモニウムを徐々
に添加することによった。次に、溶液から沈澱物を除去
したが、ソルバールＲＣ−５Ｂ（イー・アイ・デュ・ポ
ン、ニュー・タウン、コーン）中での遠心分離により、
10,000rpm で１時間固定角ＧＳＡロータを使用した。次
に、ペレットを除去し、上澄を80％飽和硫酸アンモニウ
ムに調整し、10,000rpm で１時間遠心分離を行った。そ
の後、得られたペレットを、150 mMのＮａＣｌ（650 m
l）を用い20mMのリン酸ナトリウム（pH7.2 ）中に再懸
濁した。その後、この溶液を、10mMTris・HCl （pH
８）、２mMＥＤＴＡ並びに５mMベンザミジンＨＣｌに対
して24時間透析し、硫酸アンモニウムを除去した。

【００３８】c)イオン交換クロマトグラフ 次に、この合せた画分中のＩＬ−１ ＩＮＨ活性を他の
蛋白質から分離したが、２つの異なる陰イオン交換樹脂
に対するＩＬ−１ ＩＮＨの強い結合親和力の使用を図
ることによった。それぞれの陰イオン交換樹脂を、単独
または組合せて用いたが、ＤＥＡＥセファロースカラム
は、好ましくはＱＡＥセファロースカラムの後とした。

【００３９】1)ジエチル−（２−ヒドロキシプロピル）
アミノエチル （ＱＡＥ）セファロースカラム 多数の陰イオン交換クロマトグラフ系が当業者によく知
られているが、最初にＱＡＥ−セファロースカラムの使
用を選択した。直径５cm×45cm（ファルマシア・ファイ
ン・ケミカルズ、ピスカタウェイ、ニュー・ジャージ
ー）である。前記透析した溶液を装填した後、未結合蛋
白質が溶出されるまでカラムを洗浄した（280 nmの光学
密度）。結合した蛋白質を溶出させた。カラムの４倍容
量の塩勾配を用い、平衡化緩衝液に溶解した０〜0.8 Ｍ
ＮａＣｌとした。カラムの流速は、120 ml／時間とし
た。種々の画分の活性をモニタしたが、ＬＡＦおよびレ
セプタ結合アッセイ（後記）を使用した。図１を参照す
るとよい。ＩＬ−１ ＩＮＨの生物活性を示す画分は、
150 mMＮａＣｌ付近に溶出された。合せた活性画分は、
実施例２に記載するＩＬ−１レセプタ結合アッセイによ
る測定として33Ｕ／mg蛋白質、実施例３に記載するＬＡ
Ｆアッセイによる測定として63Ｕ／mg蛋白質、実施例４
に記載するＥＬ−４／ＣＴＬＬアッセイによる測定とし
て27Ｕ／mg蛋白質、実施例５に記載するＭＣＦアッセイ
による測定として200 Ｕ／mg蛋白質の比活性を有してい
た。図９を参照するとよい。

【００４０】2)ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）セフ
ァロースカラム 活性なプールを10mMTris・HCl （pH７）に対して透析
し、ＤＥＡＥ−セルロース高流速カラム、2.5 cm×30cm
（ファルマシア・ファインケミカルス、ピスカタウェ
イ、ニュー・ジャージー）上に装填した。活性なプール
を装填したカラムを平衡化緩衝液（10mMTris・HCl 、pH
７）により洗浄し、光学密度（280 nMにおける）をほぼ
０とした。その後、平衡化緩衝液に溶解した０〜0.2 Ｍ
ＮａＣｌ勾配により結合した蛋白質を溶出した。勾配
は、カラムの容量の10倍とした。カラムの流速は78ml／
時間とした。また、前記したように、種々の画分の活性
をモニタした。この溶出は、90mMＮａＣｌ洗浄工程の終
りにＩＬ−１ ＩＮＨ活性を含有する画分の溶出を与え
た。図２は、ＤＥＡＥセファロース上での尿のＩＬ−１
阻害剤の活性プロフィールを示す。図中、阻害活性は、
(A) ＩＬ−１／ＬＡＦアッセイおよび(B) ＩＬ−１レセ
プタ結合アッセイ（下記）に従った。

【００４１】次に、ＹＭ−10膜を使用するアミコン限外
濾過装置により活性プールを６mlに濃縮した。得られた
溶液は、ＩＬ−１レセプタ結合アッセイ（下記）による
測定として50Ｕ／mg蛋白質、ＬＡＦアッセイ（下記）に
よる測定として125 Ｕ／mg蛋白質、ＥＬ−４／ＣＴＬＬ
アッセイ（下記）による測定として40Ｕ／mg蛋白質、Ｍ
ＣＦアッセイ（下記）による測定として500 Ｕ／mg蛋白
質の比活性を有していた。図９を参照するとよい。

【００４２】勿論、本発明の範囲を逸脱することなく、
他の陰イオン交換カラムも選択し得ることを理解すべき
である。

【００４３】d)ウルトロゲルＡｃＡ５４ 次に、前記したように調製した濃縮物を２回分画した
が、ゲル濾過を使用する分子量によるものとした。多数
の適切なゲル濾過系が当業者によく知られているが、分
画範囲6000−70,000ダルトンを有するＡｃＡ５４ゲル
（ＬＫＢ、スウェーデン）の使用を選択した。また、前
記したように、画分の活性をモニタした。図３を参照す
るとよい。得られた活性画分のプールは、ＩＬ−１レセ
プタ結合アッセイ（下記）による測定として1666Ｕ／mg
蛋白質、ＬＡＦアッセイ（下記）による測定として526
Ｕ／mg蛋白質、ＥＬ−４／ＣＴＬＬアッセイ（下記）に
よる測定として333 Ｕ／mg蛋白質、ＭＣＦアッセイ（下
記）による測定として1110Ｕ／mg蛋白質の比活性を有し
（図９を参照するとよい）、約25kDの分子量を有してい
た。また、他の濾過系も使用し得ることを理解すべきで
ある。

【００４４】図４は、(A) ＩＬ−１／ＬＡＦアッセイお
よび(B) 後期するＩＬ−１／レセプタ結合アッセイによ
る種々の尿ＩＬ−１ ＩＮＨプールの投与−応答（dose
-responce ）を示す。それぞれの精製工程の後、すなわ
ち、尿の濃縮、ＱＡＥ−セファロース、ＤＥＡＥ−セフ
ァロース、並びにＡｃＡ５４（２回）の後、阻害を達成
するのに必要なＩＬ−１ ＩＮＨの濃度（μg ／ml）は
減少し、より純粋な蛋白質となることを示した。

【００４５】e)ネガティブ免疫吸着 アミノ酸配列決定によりゲル濾過からの活性プールを分
析した。自動エドマン分解の従来の方法を使用し、少く
とも90％の蛋白質含量を示す２つの主要な共存物が、ア
ポリポ蛋白質ＡＩおよびレチノール結合蛋白質であるこ
とを認めた。これらの蛋白質を除去するには種々の方法
が利用可能であるが、免疫吸着および疎水性クロマトグ
ラフを選択した。

【００４６】よって、次に、主要な共存物をＩＬ−１
ＩＮＨのＡｃＡ５４活性プールから免疫吸着によって分
離した。レチノール結合蛋白質およびアポリポ蛋白質Ａ
Ｉに対するモノクローナルおよびポリクローナル抗体
は、免疫化の標準的な方法を使用して作製した。その
後、イムノグロブリンＧｓ（ＩｇＧｓ）を40％流酸アン
モニウム飽和を用いる沈澱により部分精製した。ＩｇＧ
ペレットを0.2 Ｍのリン酸ナトリウムに再懸濁し、同じ
緩衝液に対して透析した。次に、このＩｇＧプールをビ
ニルスルホン活性化アガロースと共役させた。製造者
（ＫＥＭ−ＥＮ−ＴＥＣ、バイオテクノロジー・コー
プ、デンマーク）により記載されたように行った。免疫
吸着体を平衡化した後、リン酸塩緩衝塩類溶液を用い、
ＩＬ−１ ＩＮＨプールからの共存物を吸着させた。こ
のプールに何回か免疫吸着体を通過させ、全ゆるレチノ
ール結合蛋白質およびアポリポ蛋白質ＡＩが完全に吸着
されるまで行うことにより、測定として、ナトリウム・
ドデシル硫酸−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ）によった。得られた溶液は、ＩＬ−１レ
セプタ結合アッセイ（下記）による測定として3334Ｕ／
mg蛋白質、ＬＡＦアッセイ（下記）による測定として25
00Ｕ／mg蛋白質、ＥＬ−４／ＣＴＬＬアッセイ（下記）
による測定として1250Ｕ／mg蛋白質、ＭＣＦアッセイ
（下記）による測定として2160Ｕ／mg蛋白質の比活性を
有し（図９を参照するとよい）、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ上で
単一のピークを示した。

【００４７】f)フェニル−セファロース 免疫吸着したＩＬ−１阻害剤プールを１ＭＮａＣｌに調
整し（10mMTris・HClpH７に溶解した１容の２ＭＮａＣ
ｌを添加することによった）、フェニルセファロース
（0.5 ×５cm、この樹脂はファルマシア・ファイン・ケ
ミカルス・スウェーデンから得た）に装填した。樹脂は
予め0.21ＭＮａＣｌを含有する10mMTris・HCl 、pH７
（平衡化緩衝液）を用いて平衡化させた。装填後、３カ
ラム容量の平衡を用いてカラムを洗浄し、全ての未結合
蛋白質を溶出させ、10mMTris・HCl 、pH７に溶解した0.
2 ＭＮａＣｌ〜０Ｍの勾配により結合して蛋白質を溶出
させた。全勾配は、カラム容量の50倍とした。カラムの
流速は30ml／時間とした。ＩＬ−１阻害剤活性は、0.16
0 ＭＮａＣｌ付近で溶出され、25Kda M.W.の蛋白質を与
え、4.7 のＰＩを有していた。得られた溶液は、実施例
２に記載するＩＬ−１レセプタ結合アッセイによる測定
として38461 Ｕ／mg蛋白質、実施例３に記載するＬＡＦ
アッセイによる測定として2,500 Ｕ／mg蛋白質、実施例
４に記載するＥＬ−４／ＣＴＬＬアッセイによる測定と
して35,020Ｕ／mg蛋白質、実施例５に記載するＭＣＦア
ッセイによる測定として30,303Ｕ／mg蛋白質の比活性を
有し（図９を参照するとよい）、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ上で
単一のピークを示した。

【００４８】実施例２：ＩＬ−１ ＩＮＨのレセプタ結
合能力 ＥＬ−４−６．１標的細胞上のＩＬ−１レセプタに対す
る本ＩＬ−１ ＩＮＨの結合特性を決定すべく、まず、
標的細胞に対する［125 Ｉ］−ＩＬ−１の結合によりＩ
Ｌ−１ ＩＮＨが妨害されるか否かを見るべく試験を行
った。125 Ｉを用いてＩＬ−１をラベルした。クロラミ
ンＴ方法［ロウェンサルら、「Ｔ細胞によるインターロ
イキン−１の結合および内面化」、J. Exp. Med., 164,
p. 1060］によった。これを、過剰の非ラベルＩＬ−１
ＩＮＨと共にインキュベートし、その後、油勾配上で
洗浄した。ガンマ・カウンタを使用し、次に、細胞によ
り保持された物質を測定し、ＩＬ−１ ＩＮＨの濃度の
増加により、標的細胞の表面に結合される［125 Ｉ］−
ＩＬ−１の量が減少することを認めた。

【００４９】更に試験を行い、ＩＬ−１ ＩＮＨが、標
的細胞への［125 Ｉ］−ＩＬ−１ＩＮＨの結合を妨害す
るか否か、［125 Ｉ］−ＩＬ−１ ＩＮＨの結合が、非
ラベルＩＬ−１によって競合され得るか否か、標的細胞
に対する［125 Ｉ］−ＩＬ−１ ＩＮＨの結合が、レチ
ノール結合蛋白質またはアポリポ蛋白質ＡＩによって競
合され得るか否かを見た。［125 Ｉ］を用い、ボルトン
とフンタの方法によってＩＬ−１ ＩＮＨをラベルした
［ボルトンとフンタ、「125 Ｉ含有アシル化剤との共役
による蛋白質の高特異的放射能活性ラベル化」、Bioche
m. J., 133,p. 529 (1973) ］。この材料とＥＬ−４−
６．１標的細胞とのインキュベートを行った後、油勾配
上で洗浄し、ＳＤＳ ＰＡＧＥ上での分析を行い、約25
kDの分子種がＥＬ−４細胞に結合することを認めた。過
剰の非ラベルＩＬ−１ ＩＮＨと共に［125 Ｉ］−ＩＬ
−１ ＩＮＨをインキュベートすると、ラベルした25kD
分子種の結合が妨害されることを認めた。また、［125
Ｉ］−ＩＬ−１−ＩＮＨを50ナノグラムの非ラベルＩＬ
−１βと共にインキュベートし、これにより、ラベルし
た25kD分子種の結合が妨害されることを認めた。また、
［125 Ｉ］−ＩＬ−１ ＩＮＨを１μg の免疫精製レチ
ノール結合蛋白質および１μg の組換えアポリポ蛋白質
ＡＩと共にインキュベートし、これにより、ラベルした
25kD分子種の結合が妨害されないことを認めた。よっ
て、ラベルしたＩＬ−１ ＩＮＨ調製物中に存在する25
kD分子種は、インタクトのＥＬ−１−６．１細胞の表面
に結合し、この結合は、非ラベルの阻害剤により、ま
た、ＩＬ−１により競合されるが、レチノール結合蛋白
質またはアポリポ蛋白質ＡＩによっては競合されない。

【００５０】実施例３：ＩＬ−１／ＬＡＦアッセイ Ｃ3 Ｈ／ＨｅＪマウスにおけるチモサイト（Ｔ−細胞）
増殖による測定として、ＩＬ−１／ＬＡＦアッセイにお
けるＩＬ−１ ＩＮＨの阻害活性を示した［ジェイ・エ
ム・ダイヤら、「ヒト組換えＩＬ−１は、ヒト滑液細胞
によるコラーゲナーゼおよびプロスタグランジンＥ2 の
生産を刺激する」、J. Clin Invest., 77, p. 645 (198
6)］。ＰＨＡ（１μg ／ml）を用いて72時間に渡りチモ
サイト（thymocyte ）細胞を共に刺激した。ｈｒＩＬ−
１α［ピー・ウィングフィールドら、「イー・コリ中で
発現したヒトインターロイキン−１の精製および特
徴」、Eur. J. Biochem, 165, p. 537 (1987) ］または
ＩＬ−１β［ピー・ウィングフィールドら、「イー・コ
リ中で発現したヒトインターロイキン−１βの精製およ
び特徴」、Eur. J. Biochem, 160, p. 491 (1986) ］の
存在下で、異なる終濃度（20pg／ml〜2,000 pg／mlの範
囲）のｈｒＩＬ−１とした。これを図５に示す。細胞に
対し実施例１(e) に由来するＩＬ−１ ＩＮＨ画分を添
加した場合、共に刺激したｈＩＬ−１αまたはｈＩＬ−
１βチモサイトの増殖の完全な阻害を得た。阻害活性
は、ＩＬ−１ ＩＮＨの３つの希釈、１／20、１／40並
びに１／80でモニタした。

【００５１】ｈｒＩＬ−１非存在下でのＰＨＡ刺激細胞
へのＩＬ−１ ＩＮＨの添加は［Ｈ3 ］−ＴｄＲの取り
込みに影響を与えないため、阻害は、細胞毒性または非
特異的効果によるものではなく、ＩＬ−１の生物活性の
阻害によるものであると決定した。

【００５２】実施例４：ＥＬ−４／ＣＴＬＬアッセイ ＩＬ−１ ＩＮＨの阻害活性を決定した。ＥＬ−４細胞
中でＩＬ−２の生産を誘導するＩＬ−１αまたはＩＬ−
１βの能力が阻害されるか否かを観察することによった
［例えば、エー・ジェイ・エッチ・ギヤリングら、「10
3 Ｕ／mlのＩＬ−２に応答しないＩＬ−１についての単
純な高感度バイオアッセイ」、J. Immun. Met., 99, p.
7 (1987) を参照するとよい］。これは、周囲の培地か
らチミジンを取り込むことのできないＥＬ−４細胞のサ
ブクローンをＣＴＬＬ−２細胞と共に培養し、ＣＴＬＬ
−２細胞が増殖するか否かを観察することにより測定し
た。

【００５３】ＥＬ−４．６．１ｃ１０細胞およびＣＴＬ
Ｌ−２細胞を共に培養し、マイクロタイタの穴（96穴プ
レート）当り104 のそれぞれの種類の細胞濃度とし、約
１ピコグラム／mlのＩＬ−１αまたはＩＬ−１βの存在
下とし、実施例１(e) に由来するＩＬ−１ ＩＮＨを共
存させた。共存培養の18時間後に１ミクロキューリの
［Ｈ3 ］−ＴｄＲを添加し、湿潤雰囲気下にて37℃で６
時間更にインキュベートした。ＭＡＳＨ細胞回収装置に
よりガラス・ファイバ・ストリップ上に細胞を回収し、
乾燥し、シンチレーション・カクテルを用いて調製し、
ベータ・カウンタ中でのカウントを図った。１／20、１
／40並びに１／80のＩＬ−１ ＩＮＨの希釈で、［Ｈ3
］−ＴｄＲ取り込みの完全な阻害を得た。

【００５４】実施例５：ＩＬ−１／ＭＣＦアッセイ 更に、ＩＬ−１／ＭＣＦアッセイにおけるＩＬ−１ Ｉ
ＮＨの阻害活性を示した。ヒト幼児包皮から得られた繊
維芽細胞により測定した［ジェイ・ダイヤら、「リュウ
マチ性滑液細胞によるコラーゲナーゼおよびプロスタグ
ランジン放出を刺激する因子の生産におけるマクロファ
ージおよびリンパ球の関与」、J. Clin.Invest., 64,
p. 1386 (1976)、ジェイ・ダイヤら、「リウマチ性滑液
細胞におけるコラーゲナーゼおよびプロスタグランジン
Ｅ2 刺激活性により測定したヒトインターロイキン−１
ｍＲＮＡの誘導」、Eur. J. Immunol., 14, p. 898 (19
84) ］。ＩＬ−１／ＬＡＦアッセイと同様の濃度でｈｒ
ＩＬ−１αまたはｈｒＩＬ−１βを用いて繊維芽細胞を
刺激し、ＩＬ−１／ＬＡＦアッセイと同様の最終希釈で
阻害活性をモニタした。72時間細胞を培養した後、二重
抗体ラジオイムノアッセイより繊維芽細胞上澄における
プロスタグランジンＥ2 生産を測定し［ジェイ・ダイヤ
(1979)、上記］、プロスタグランジンＥ2 に対する抗血
清を使用した。図６に示すように、ｈｒＩＬ−１αまた
はｈｒＩＬ−１βのいずれによっても、100 pg／mlの濃
度までプロスタグランジンＥ2 生産の投与応答を認め
た。実施例１(e) に由来するＩＬ−１ ＩＮＨ画分を添
加することによりこの生物活性を阻害することができ
た。ＩＬ−１ ＩＮＨは、ｈｒＩＬ−１αおよびｈｒＩ
Ｌ−１βに対して同様に有効であると決定した。

【００５５】その後、ｈｒＩＬ−１をｈｒＴＮＦα［エ
ー・マーメノウトら、「ＴＮＦの分子クローン化および
発現並びにマウスのＴＮＦとの比較」、Eur. J. Bioche
m, 152, pp. 515-22 (1985) ］と置換して前記アッセイ
を行った。ＴＮＦαも、プロスタグランジンＥ2 および
コラーゲナーゼ生産のメディエータだからである。図７
に示すように、ｈｒＴＮＦ誘導プロスタグランジンＥ2
生産は、本ＩＬ−１ＩＮＨの添加によって顕著な影響を
受けず、本ＩＬ−１ ＩＮＨの特異性を示した。

【００５６】実施例６：繊維芽細胞増殖アッセイ 更に、［Ｈ3 ］ＴｄＲの取り込みにより測定する繊維芽
細胞増殖アッセイを使用し、実施例１(e) に由来するＩ
Ｌ−１ＩＮＨの存在下でＩＬ−１の生物活性をアッセイ
した。10mMＨＥＰＥＳ、ペニシリン100 Ｕ／ml、ストレ
プトマイシン100 μg ／ml、１％グルタミン、１％非必
須アミノ酸並びに２％ＦＣＳを補填したイーグルのＭＥ
Ｍ中にて、ヒト包皮繊維芽細胞を培養後、細胞を96穴プ
レート（2000細胞／穴）に接種し、５％ＣＯ2 インキュ
ベータ中にて37℃で24時間培養した。培地を除去した
後、ｈｒＩＬ−１αまたはｈｒＩＬ−１βを添加するこ
とにより繊維芽細胞を刺激し、前記アッセイと同様の希
釈でＩＬ−１ ＩＮＨを添加した。48時間待機し、更に
16時間［Ｈ3 ］ＴｄＲにより細胞をパルスした。細胞か
ら培地を除去し、その後これをＰＢＳを用いて洗浄し、
更に15分37℃にてトリプシン処理を行った。細胞回収装
置（スカトロン、リエル、ノルーウェイ）を用い、ガラ
ス・フィルタ（スカトロン、インコ、ステーリング、バ
ージニア、U.S.A.）上に細胞を集め、水で洗浄し、風乾
し、シンチレーション・カウンタを使用してcpm 取り込
みを決定した。図８に示すように、繊維芽細胞の増殖
は、ｈｒＩＬ−１αおよびｈｒＩＬ−１βについて投与
依存性であった。250 pg／mlのｈｒＩＬ−１αまたはβ
を用いて最大の［Ｈ3 ］ＴｄＲの取り込みを得た。Ａｃ
Ａ５４阻害画分の添加により、ｈｒＩＬ−１誘導増殖の
完全な減少が得られた。また、ＩＬ−１濃度を増加させ
ることにより、またはＩＬ−１ ＩＮＨを希釈すること
により阻害の完全な逆行を達成した。

【００５７】また、ｈｒＴＮＦαを用いて繊維芽細胞を
刺激することによりこの阻害の特異性を決定したが、こ
れは、250 pg／mlの濃度まで投与依存性の様式で繊維芽
細胞増殖を誘導した。ＡｃＡ５４阻害画分の添加によっ
ては、ｈｒＴＮＦαの生物活性の阻害は得られなかっ
た。これにより、ＩＬ−１ ＩＮＨの特異性が確認され
た。

【００５８】実施例７：等電点の決定 実施例１(e) から溶出された蛋白質のプールを使用し、
予め25mMのイミダゾール（pH7.5 ）で平衡化したＰＢＥ
クロマトフォーカシング（ファルマシア・ファイン・ケ
ミカル、スウェーデン）カラム（2.5 ×10cm）に装填し
た。ポリバッファ74ＨＣｌ、pH４を添加した。これは結
合蛋白質の溶出を与えるが、その等電点に依存する。Ｉ
Ｌ−１ ＩＮＨのpIは4.7 であると決定した。

【００５９】本発明の多数の態様を前記したが、この基
本的な構成を改変して本発明の方法および組成物を利用
する他の態様を提供し得ることは明らかである。

【００６０】したがって、本発明の範囲は、ここに記載
する請求の範囲によって規定され、例として示した特定
の態様によらないことを銘記すべきである。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＱＡＥセファロース工程により得られた尿のＩ
Ｌ−１ ＩＮＨの活性プロフィールを示す説明図であ
る。

【図２】ＤＥＡＥセファロース工程により得られた尿の
ＩＬ−１ ＩＮＨの活性プロフィールを示す説明図であ
る。

【図３】ＡｃＡ５４濾過画分の尿のＩＬ−１ ＩＮＨの
活性プロフィールを示す説明図である。

【図４】それぞれの精製工程後の尿のＩＬ−１ ＩＮＨ
プールの投与−応答を示す説明図であって、ＩＬ−１／
ＬＡＦおよびＩＬ−１／レセプタ結合アッセイにて測定
したものである。

【図５】ＩＬ−１／ＬＡＦアッセイにて測定したＩＬ−
１ ＩＮＨ活性を示す説明図である。

【図６】ＩＬ−１／ＭＣＦアッセイにて測定したＩＬ−
１ ＩＮＨ活性を示す説明図である。

【図７】ＩＬ−１ ＩＮＨがｈｒＴＮＦα−誘導ＰＧＥ
2 生産に影響を与えないことを示す説明図である。

【図８】ＩＬ−１／繊維芽細胞増殖アッセイにて測定し
たＩＬ−１ ＩＮＨ活性を示す説明図である。

【図９】それぞれの精製工程後のＩＬ−１レセプタ結合
アッセイ、ＬＡＦアッセイ、ＥＬ−４／ＣＴＬＬアッセ
イ並びにＭＣＦアッセイにて測定したＩＬ−１ ＩＮＨ
比活性を示す説明図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 マーゼイ，ゴンザーロ ジョゼ スイス国、1201 ジュネーブ、リュー ネ カール 11 (72)発明者 ショー，アラン リード スイス国、1227 ジュネーブ、ケ デュ シュバル ブラン 19

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＩＬ−１ ＩＮＨをコードするＤＮＡ配
   列を特徴とする組換えＤＮＡ分子を生産する方法であっ
   て、前記ＩＬ−１ ＩＮＨがヒト由来であり、ＳＤＳ／
   ＰＡＧＥにおいて単一バンドとして泳動されかつアポリ
   ポ蛋白質Ａおよびレチノール結合蛋白質を実質的に含ま
   ないことを特徴とし、前記方法は、(a) 精製したＩＬ−
   １ ＩＮＨのアミノ酸配列を決定し、(b) 工程(a) のア
   ミノ酸配列を基礎とするオリゴヌクレオチドプローブの
   プールを作成し、(c) ＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリ
   ーのスクリーニングを行い、(d) 通常の条件下でプロー
   ブにハイブリダイズするクローンを選択し、(e) 配列決
   定又は発現により選択クローンを分析し、それらがＩＬ
   −１ ＩＮＨをコードするＤＮＡ配列を含有するか否か
   を決定する工程からなることを特徴とする組換ＤＮＡ分
   子の生産方法。
2. 【請求項２】 ＩＬ−１ ＩＮＨがヒト由来であり、Ｓ
   ＤＳ／ＰＡＧＥにおいて単一バンドとして泳動されかつ
   アポリポ蛋白質Ａおよびレチノール結合蛋白質を実質的
   に含まないことを特徴とする、前記ＩＬ−１ ＩＮＨを
   発現に際してコードするＤＮＡ配列からなる組換えＤＮ
   Ａ分子。
3. 【請求項３】 発現調節配列を更に含み、前記発現調節
   配列がＤＮＡ分子中にてＩＬ−１ ＩＮＨをコードする
   ＤＮＡ配列に機能的に連結されていることを特徴とする
   請求項２記載の組換えＤＮＡ分子。
4. 【請求項４】 発現調節配列が、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、
   ｔａｃ系、ｔｒｃ系、ファージの主要オペレータおよび
   プロモータ領域、ｆｄコート蛋白質の調節領域、ＳＶ４
   ０の初期および後期プロモータ、ポリオーマ、アデノウ
   ィルスおよびサルのウィルスに由来するプロモータ、３
   −ホスホグリセレートキナーゼのプロモータ、酵母酸性
   ホスファターゼのプロモータ、酵母α−交配因子のプロ
   モータ並びにこれらの組合せよりなる群から選択される
   ことを特徴とする請求項３記載の組換えＤＮＡ分子。
5. 【請求項５】 ＩＬ−１ ＩＮＨを生産する方法であっ
   て、前記ＩＬ−１ＩＮＨがヒト由来であり、ＳＤＳ／Ｐ
   ＡＧＥにおいて単一バンドとして泳動されかつアポリポ
   蛋白質Ａおよびレチノール結合蛋白質を実質的に含まな
   いことを特徴とし、前記方法は、請求項３または４に記
   載の組換えＤＮＡ分子により形質転換された単一細胞性
   宿主を培養する工程からなるＩＬ−１ ＩＮＨの生産方
   法。