JPH08169840A - ヒトインターロイキン６阻害剤 - Google Patents
ヒトインターロイキン６阻害剤Info
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- JPH08169840A JPH08169840A JP7221018A JP22101895A JPH08169840A JP H08169840 A JPH08169840 A JP H08169840A JP 7221018 A JP7221018 A JP 7221018A JP 22101895 A JP22101895 A JP 22101895A JP H08169840 A JPH08169840 A JP H08169840A
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- cells
- interleukin
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
- C07K14/4703—Inhibitors; Suppressors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 新規なヒトインターロイキン６阻害剤の提
供。 【解決手段】 ヒト前骨髄白血病細胞系ＨＬ−６０の上
澄みから単離させたヒトインターロイキン６阻害活性物
質。
供。 【解決手段】 ヒト前骨髄白血病細胞系ＨＬ−６０の上
澄みから単離させたヒトインターロイキン６阻害活性物
質。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は一般的には新規なサ
イトカイン・アンタゴニスト製剤に関する。本発明はさ
らに詳細には、組織培養液から単離できそして試験管内
でインターロイキン６アンタゴニスト活性があることが
見い出されたインターロイキン６阻害剤の調製、特性決
定及び使用に関する。
イトカイン・アンタゴニスト製剤に関する。本発明はさ
らに詳細には、組織培養液から単離できそして試験管内
でインターロイキン６アンタゴニスト活性があることが
見い出されたインターロイキン６阻害剤の調製、特性決
定及び使用に関する。
【０００２】
【発明の背景】ヒトの健康及び病気に対するインターロ
イキン６（ＩＬ−６）の影響が集中的に研究されてい
る。高レベルのＩＬ−６が細菌及びウイルス感染症、損
傷、自己免疫障害及び腫瘍形成に罹患した個体群の血流
及び／又は体液中に見い出されてきている。ＩＬ−６の
レベルと症状の激しさとの相関性並びに動物モデルにお
ける抗ＩＬ−６抗体の有益な効果により、サイトカイン
が幾つかの病気適応において病態生理的役割を果し得る
ことが示唆されている。したがって、ＩＬ−６のアンタ
ゴニストは治療上の用途を有し得る。
イキン６（ＩＬ−６）の影響が集中的に研究されてい
る。高レベルのＩＬ−６が細菌及びウイルス感染症、損
傷、自己免疫障害及び腫瘍形成に罹患した個体群の血流
及び／又は体液中に見い出されてきている。ＩＬ−６の
レベルと症状の激しさとの相関性並びに動物モデルにお
ける抗ＩＬ−６抗体の有益な効果により、サイトカイン
が幾つかの病気適応において病態生理的役割を果し得る
ことが示唆されている。したがって、ＩＬ−６のアンタ
ゴニストは治療上の用途を有し得る。
【０００３】特異的な天然ＩＬ−６アンタゴニストはい
まだ記載されていない。Ｐｏｒｔｉｅｒら（Ｂｌｏｏ
ｄ，８１（１１）：３０７６−８２（１９９３））は、
γ−インターフェロン（γ−ＩＦＮ）がＩＬ−６依存性
骨髄腫細胞増殖を阻害するが、γ−ＩＦＮは他の種類の
試験管内アッセイではＩＬ−６活性を阻害しないことを
見い出した。
まだ記載されていない。Ｐｏｒｔｉｅｒら（Ｂｌｏｏ
ｄ，８１（１１）：３０７６−８２（１９９３））は、
γ−インターフェロン（γ−ＩＦＮ）がＩＬ−６依存性
骨髄腫細胞増殖を阻害するが、γ−ＩＦＮは他の種類の
試験管内アッセイではＩＬ−６活性を阻害しないことを
見い出した。
【０００４】Ｂｒａｋｅｎｈｏｆｆら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．，２６９（１）：８６−９３（１９９４））
は、生物学的に不活性なＩＬ−６突然変異体を作出した
が、このＩＬ−６突然変異体は８０ ｋＤ ＩＬ−６Ｒ
には結合したがｇｐ１３０には結合しなかったため、シ
グナル・トランスダクションを防止した。これら突然変
異タンパク質は、ＩＬ−６アンタゴニストとして働き、
天然のＩＬ−６がＩＬ−６レセプター・サブユニットに
結合することを防止する。しかしながら、これらの突然
変異タンパク質の潜在的な抗原性は治療上の用途にとっ
て障害となっていた。
Ｃｈｅｍ．，２６９（１）：８６−９３（１９９４））
は、生物学的に不活性なＩＬ−６突然変異体を作出した
が、このＩＬ−６突然変異体は８０ ｋＤ ＩＬ−６Ｒ
には結合したがｇｐ１３０には結合しなかったため、シ
グナル・トランスダクションを防止した。これら突然変
異タンパク質は、ＩＬ−６アンタゴニストとして働き、
天然のＩＬ−６がＩＬ−６レセプター・サブユニットに
結合することを防止する。しかしながら、これらの突然
変異タンパク質の潜在的な抗原性は治療上の用途にとっ
て障害となっていた。
【０００５】Ｋｌｅｉｎら（Ｂｌｏｏｄ，７８：１１９
８−１２０４（１９９１））は、ネズミ抗ＩＬ−６抗体
の白血病患者への投与が骨髄中の骨髄腫細胞増殖を阻害
することを見い出した。しかしながら、ネズミ抗体は外
来タンパク質であるため、抗原性を有する可能性があ
る。
８−１２０４（１９９１））は、ネズミ抗ＩＬ−６抗体
の白血病患者への投与が骨髄中の骨髄腫細胞増殖を阻害
することを見い出した。しかしながら、ネズミ抗体は外
来タンパク質であるため、抗原性を有する可能性があ
る。
【０００６】生物工学的に作出された可溶性８０ ｋＤ
レセプターの誘導体は、循環ＩＬ−６には結合するがｇ
ｐ１３０には結合せず、ＩＬ−６アンタゴニストとして
働き、その結果シグナル・トランスダクションを防止す
ると、仮定された（Ｊ．Ｂａｕｅｒ， Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，２（３＆
４）：２８５−２９８（１９９１））。しかしながら、
これらタンパク質は、治療に用いられる場合に異物とし
て認識されそしてなお抗原となり得るエピトープを有す
るかもしれない。またＢａｕｅｒは多発性骨髄腫の治療
のために抗ヒトＩＬ−６抗体を用いた臨床試験をはじめ
たことを述べている（同上）。この時点で臨床試験の結
果は知られていない。
レセプターの誘導体は、循環ＩＬ−６には結合するがｇ
ｐ１３０には結合せず、ＩＬ−６アンタゴニストとして
働き、その結果シグナル・トランスダクションを防止す
ると、仮定された（Ｊ．Ｂａｕｅｒ， Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，２（３＆
４）：２８５−２９８（１９９１））。しかしながら、
これらタンパク質は、治療に用いられる場合に異物とし
て認識されそしてなお抗原となり得るエピトープを有す
るかもしれない。またＢａｕｅｒは多発性骨髄腫の治療
のために抗ヒトＩＬ−６抗体を用いた臨床試験をはじめ
たことを述べている（同上）。この時点で臨床試験の結
果は知られていない。
【０００７】単球／マクロファージは、サイトカイン及
びサイトカイン阻害剤の両者、例えばＲｏｂｅｒｔらが
呼吸合胞体ウイルス（ＲＳＶ）感染単球中に見い出した
ＩＬ−１阻害剤（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１６３：５１
１−５１９（１９８６））及びＩＬ−１レセプター・ア
ンタゴニスト・タンパク質（Ｊａｎｓｏｎら．，Ｊ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．，１４７（１２）：４２１８−４２２３
（１９９１））を、産生することが知られている。本発
明において、我々はそのような細胞がまたＩＬ−６阻害
剤を分泌する可能性を研究した。ヒト末梢血液単球の一
貫した供給を確立するのが困難であるので、我々は前骨
髄白血病細胞系、ＨＬ−６０を用いた。ＨＬ−６０のホ
ルボールジエステルによる処理は、マクロファージの数
種の特性を発揮する細胞への分化を誘発した（Ｈａｌｌ
ら，Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７６：５８−６８
（１９８３））。一方、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳ
Ｏ）又はレチノイン酸（ＲＡ）処理の結果、顆粒球経路
に沿って分化した（Ｌｅｆｔｗｉｃｈら，Ｃａｎ（ｃ．
Ｒｅｓ．，４６：３７８９−３７９２）。我々は、ＨＬ
−６０細胞のホルボールジエステルへの暴露がＩＬ−６
阻害剤の分泌を特異的に誘発することを見い出した。こ
のＩＬ−６阻害剤は明らかに新規なヒトタンパク質であ
るようである。ＨＬ−６０細胞系はヒトのものであるの
で、ＩＬ−６阻害剤はヒトアミノ酸配列を含み、それ故
生体内で抗原性を示さないはずである。このことはＩＬ
−６アンタゴニストの従来例に対する改良となるであろ
う。
びサイトカイン阻害剤の両者、例えばＲｏｂｅｒｔらが
呼吸合胞体ウイルス（ＲＳＶ）感染単球中に見い出した
ＩＬ−１阻害剤（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１６３：５１
１−５１９（１９８６））及びＩＬ−１レセプター・ア
ンタゴニスト・タンパク質（Ｊａｎｓｏｎら．，Ｊ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．，１４７（１２）：４２１８−４２２３
（１９９１））を、産生することが知られている。本発
明において、我々はそのような細胞がまたＩＬ−６阻害
剤を分泌する可能性を研究した。ヒト末梢血液単球の一
貫した供給を確立するのが困難であるので、我々は前骨
髄白血病細胞系、ＨＬ−６０を用いた。ＨＬ−６０のホ
ルボールジエステルによる処理は、マクロファージの数
種の特性を発揮する細胞への分化を誘発した（Ｈａｌｌ
ら，Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７６：５８−６８
（１９８３））。一方、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳ
Ｏ）又はレチノイン酸（ＲＡ）処理の結果、顆粒球経路
に沿って分化した（Ｌｅｆｔｗｉｃｈら，Ｃａｎ（ｃ．
Ｒｅｓ．，４６：３７８９−３７９２）。我々は、ＨＬ
−６０細胞のホルボールジエステルへの暴露がＩＬ−６
阻害剤の分泌を特異的に誘発することを見い出した。こ
のＩＬ−６阻害剤は明らかに新規なヒトタンパク質であ
るようである。ＨＬ−６０細胞系はヒトのものであるの
で、ＩＬ−６阻害剤はヒトアミノ酸配列を含み、それ故
生体内で抗原性を示さないはずである。このことはＩＬ
−６アンタゴニストの従来例に対する改良となるであろ
う。
【０００８】
【発明の概要】本発明の阻害剤製剤は、ＨＬ−６０細胞
系から得ることができることそしてゲル瀘過クロマトグ
ラフィーにより測定される場合に約１０，０００〜３
０，０００ダルトンの分子量を有することにより特性決
定される阻害剤を含んでなる。阻害剤は、また、ブルー
・セファロース（Ｂｌｕｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）（商
標）に結合可能でかつそれから溶離可能であり、陰イオ
ン交換樹脂に結合可能でかつそれから溶離可能であり、
そして逆相クロマトグラフィー樹脂に結合可能でかつそ
れから溶離可能である。阻害剤は、Ｂ９細胞系のＩＬ−
６依存性増殖を抑制する。阻害活性はトリプシン消化に
より５０倍より大きく低減される。そして、刺激中のＨ
Ｌ−６０細胞系のシクロヘキシミドによる処理は、細胞
上澄みの阻害活性を完全に除去する。活性は酸及び熱処
理に対して抵抗性である。
系から得ることができることそしてゲル瀘過クロマトグ
ラフィーにより測定される場合に約１０，０００〜３
０，０００ダルトンの分子量を有することにより特性決
定される阻害剤を含んでなる。阻害剤は、また、ブルー
・セファロース（Ｂｌｕｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）（商
標）に結合可能でかつそれから溶離可能であり、陰イオ
ン交換樹脂に結合可能でかつそれから溶離可能であり、
そして逆相クロマトグラフィー樹脂に結合可能でかつそ
れから溶離可能である。阻害剤は、Ｂ９細胞系のＩＬ−
６依存性増殖を抑制する。阻害活性はトリプシン消化に
より５０倍より大きく低減される。そして、刺激中のＨ
Ｌ−６０細胞系のシクロヘキシミドによる処理は、細胞
上澄みの阻害活性を完全に除去する。活性は酸及び熱処
理に対して抵抗性である。
【０００９】ブルー・セファロース上のクロマトグラフ
ィー、陰イオン交換樹脂クロマトグラフィー及び逆相ク
ロマトグラフィーにより、阻害剤は刺激されたＨＬ−６
０上澄みから部分的に単離できる。
ィー、陰イオン交換樹脂クロマトグラフィー及び逆相ク
ロマトグラフィーにより、阻害剤は刺激されたＨＬ−６
０上澄みから部分的に単離できる。
【００１０】阻害剤は試験管内での細胞機能に対するＩ
Ｌ−６の効果の研究に有用であることが見い出され、そ
して、やがて増大したＩＬ−６レベルにより特徴づけら
れる障害の治療に治療上有用であることが見い出され
た。
Ｌ−６の効果の研究に有用であることが見い出され、そ
して、やがて増大したＩＬ−６レベルにより特徴づけら
れる障害の治療に治療上有用であることが見い出され
た。
【００１１】以下、添付図面を引用しながら、本発明の
阻害剤の挙動を説明する。
阻害剤の挙動を説明する。
【００１２】図１はＨＬ−６０細胞中のＩＬ−６阻害剤
の誘発に関する。ＨＬ−６０培養物を、ＰＭＡ（１０ｎ
ｇ／ｍＬ）、ＰＤＢｕ（１３０ｎｇ／ｍＬ）、Ａ２３１
８７（５０ｎｇ／ｍＬ）、ＤＭＳＯ（１．２％ ｖ／
ｖ）、ＰＭＡ及びＡ２３１８７、或いはエタノール（Ｅ
ｔＯＨ、１％ ｖ／ｖ）で２４時間処理した。ＰＤＢｕ
（１３０ｎｇ／ｍＬ）を用いたか或いは用いなかった２
４時間誘発の５日前に、ＲＡ（１０ｎＭ）を添加した。
細胞を洗浄し、そしてＲＰＭＩ−２中に１ ｘ１０6
細胞／ｍＬで再懸濁した。３日間のインキュベーション
の後、室温で１０分間２００ ｘ ｇで遠心して無細胞
の培養液を調製し、そしてＢ９細胞アッセイでＩＬ−６
活性の阻害を分析した。
の誘発に関する。ＨＬ−６０培養物を、ＰＭＡ（１０ｎ
ｇ／ｍＬ）、ＰＤＢｕ（１３０ｎｇ／ｍＬ）、Ａ２３１
８７（５０ｎｇ／ｍＬ）、ＤＭＳＯ（１．２％ ｖ／
ｖ）、ＰＭＡ及びＡ２３１８７、或いはエタノール（Ｅ
ｔＯＨ、１％ ｖ／ｖ）で２４時間処理した。ＰＤＢｕ
（１３０ｎｇ／ｍＬ）を用いたか或いは用いなかった２
４時間誘発の５日前に、ＲＡ（１０ｎＭ）を添加した。
細胞を洗浄し、そしてＲＰＭＩ−２中に１ ｘ１０6
細胞／ｍＬで再懸濁した。３日間のインキュベーション
の後、室温で１０分間２００ ｘ ｇで遠心して無細胞
の培養液を調製し、そしてＢ９細胞アッセイでＩＬ−６
活性の阻害を分析した。
【００１３】図２はＵ３７３細胞の増殖に対するＩＬ−
６阻害剤の効果に関する。ＨＬ−６０細胞（１ ｘ １
０6 細胞／ｍＬ）をＰＭＡ（１０ｎｇ／ｍＬ）で２４
時間処理した。細胞を洗浄し、ＲＰＭＩ−２中に再懸濁
し、そして３日間インキュベートした。遠心により培養
液を調製し、そしてＩＬ−１αを用いたか或いは用いな
いで、Ｕ３７３アッセイで分析した。抗ＩＬ−１（１μ
ｇ／ウエル）を対照として用いた。
６阻害剤の効果に関する。ＨＬ−６０細胞（１ ｘ １
０6 細胞／ｍＬ）をＰＭＡ（１０ｎｇ／ｍＬ）で２４
時間処理した。細胞を洗浄し、ＲＰＭＩ−２中に再懸濁
し、そして３日間インキュベートした。遠心により培養
液を調製し、そしてＩＬ−１αを用いたか或いは用いな
いで、Ｕ３７３アッセイで分析した。抗ＩＬ−１（１μ
ｇ／ウエル）を対照として用いた。
【００１４】図３は細胞密度及びＰＭＡ濃度の最適化に
関する。ＨＬ−６０培養物を表示された細胞密度で確立
し、そしてＲＰＭＩ−２中のＰＭＡの表示された濃度で
２４時間インキュベートした。細胞を採取し、洗浄し、
そして最初の細胞密度で再懸濁した。２４時間後、無細
胞組織培養液をＩＬ−６の存在下、Ｂ９アッセイで分析
した。細胞密度（Ａ）及びＰＭＡ濃度（Ｂ）の、阻害剤
の発現に対する効果を示す。
関する。ＨＬ−６０培養物を表示された細胞密度で確立
し、そしてＲＰＭＩ−２中のＰＭＡの表示された濃度で
２４時間インキュベートした。細胞を採取し、洗浄し、
そして最初の細胞密度で再懸濁した。２４時間後、無細
胞組織培養液をＩＬ−６の存在下、Ｂ９アッセイで分析
した。細胞密度（Ａ）及びＰＭＡ濃度（Ｂ）の、阻害剤
の発現に対する効果を示す。
【００１５】図４はＨＬ−６０上澄みのスパロース（Ｓ
ｕｐｅｒｏｓｅ）１２（商標）ＨＲ１０／３０クロマト
グラフィーに関する。ＴＣＦをＹＭ３膜で約１７倍に濃
縮し、そして５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０
（出発緩衝液）中に透析瀘過した。０．５ｍＭの濃縮液
をカラムにかけた。カラム緩衝液は１０ｍＭトリス、１
５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．８であった。カラム流速
は０．５ｍＬ／分であり、そして１ｍＬの画分を回収し
た。画分の阻害活性をＢ９アッセイで直接テストした。
ｕｐｅｒｏｓｅ）１２（商標）ＨＲ１０／３０クロマト
グラフィーに関する。ＴＣＦをＹＭ３膜で約１７倍に濃
縮し、そして５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０
（出発緩衝液）中に透析瀘過した。０．５ｍＭの濃縮液
をカラムにかけた。カラム緩衝液は１０ｍＭトリス、１
５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．８であった。カラム流速
は０．５ｍＬ／分であり、そして１ｍＬの画分を回収し
た。画分の阻害活性をＢ９アッセイで直接テストした。
【００１６】図５はＨＬ−６０上澄みのモノ（Ｍｏｎ
ｏ）Ｑ（商標）クロマトグラフィーに関する。ＴＣＦを
ＹＭ３膜で約１７倍に濃縮し、そして出発緩衝液中に透
析瀘過した。カラムを２０ｍＭ トリス、ｐＨ７．５で
平衡にした。濃縮したＴＣＦをトリス緩衝液で１：２に
希釈し、そして０．５ｍＬをカラムにかけた。２０ｍＭ
トリス、１ＭＮａＣｌ、ｐＨ７．５を含む最終緩衝液を
用いた直線勾配で、タンパク質を溶離した。０．５ｍＬ
の画分をＢＳＡ含有試験管中に回収した。阻害活性を分
析するために、０．４ｍＬの画分を４〜８倍に濃縮し、
そしてＲＰＭＩ−１６４０で透析瀘過した。
ｏ）Ｑ（商標）クロマトグラフィーに関する。ＴＣＦを
ＹＭ３膜で約１７倍に濃縮し、そして出発緩衝液中に透
析瀘過した。カラムを２０ｍＭ トリス、ｐＨ７．５で
平衡にした。濃縮したＴＣＦをトリス緩衝液で１：２に
希釈し、そして０．５ｍＬをカラムにかけた。２０ｍＭ
トリス、１ＭＮａＣｌ、ｐＨ７．５を含む最終緩衝液を
用いた直線勾配で、タンパク質を溶離した。０．５ｍＬ
の画分をＢＳＡ含有試験管中に回収した。阻害活性を分
析するために、０．４ｍＬの画分を４〜８倍に濃縮し、
そしてＲＰＭＩ−１６４０で透析瀘過した。
【００１７】図６はＨＬ−６０上澄みのブルー・セファ
ロース（Ｂｌｕｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）（商標）クロ
マトグラフィーに関する。ＴＣＦをＹＭ１０膜で約８７
倍に濃縮し、そして出発緩衝液中に透析瀘過した。濃縮
したＴＣＦを５０ｍＬのカラム上にかけ、そしてカラム
を出発緩衝液で洗浄した。次に出発緩衝液中の０〜１Ｍ
ＮａＣｌの直線勾配をかけた後、５０ｍＭリン酸ナト
リウム、４Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０中の５０％エチレ
ングリコールで溶離した。１０ｍＬの画分を回収した。
Ｂ９アッセイにおける使用に際して、回収した画分の試
料をを４〜８倍に濃縮し、そしてＲＰＭＩ−１６４０中
に透析瀘過した。
ロース（Ｂｌｕｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）（商標）クロ
マトグラフィーに関する。ＴＣＦをＹＭ１０膜で約８７
倍に濃縮し、そして出発緩衝液中に透析瀘過した。濃縮
したＴＣＦを５０ｍＬのカラム上にかけ、そしてカラム
を出発緩衝液で洗浄した。次に出発緩衝液中の０〜１Ｍ
ＮａＣｌの直線勾配をかけた後、５０ｍＭリン酸ナト
リウム、４Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０中の５０％エチレ
ングリコールで溶離した。１０ｍＬの画分を回収した。
Ｂ９アッセイにおける使用に際して、回収した画分の試
料をを４〜８倍に濃縮し、そしてＲＰＭＩ−１６４０中
に透析瀘過した。
【００１８】図７はブルー・セファロース（Ｂｌｕｅ
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）（商標）クロマトグラフから溶離
したＨＬ−６０阻害活性物の逆相クロマトグラフィーに
関する。阻害活性物を含む、ブルー・セファロース（商
標）クロマトグラフからの画分を２種類のプール中に併
合した。この２種類のプールのうち、第１のプール
（Ａ）は直線勾配の約９００ｍＭ ＮａＣｌで溶離した
ものであり、第２のプール（Ｂ）は５０％エチレングリ
コール、４Ｍ ＮａＣｌで溶離したものである。これら
プールを約１００倍に濃縮し、そして別々に、水中の１
％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で平衡にした
２ｍＬのＰｒｏＲＰＣ（商標）逆相カラムにかけた。カ
ラムを出発緩衝液で洗浄し、そして１％（ｖ／ｖ）ＴＦ
Ａ中のＨＰＬＣグレードアセトニトリルの２０％（ｖ／
ｖ）〜８０％（ｖ／ｖ）の直線勾配で溶離した。画分
（０．３ｍＬ）を回収し、蒸発乾固し、そしてＢ９アッ
セイで分析するために０．１ｍＬのＨ2Ｏ中に再懸濁し
た。
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）（商標）クロマトグラフから溶離
したＨＬ−６０阻害活性物の逆相クロマトグラフィーに
関する。阻害活性物を含む、ブルー・セファロース（商
標）クロマトグラフからの画分を２種類のプール中に併
合した。この２種類のプールのうち、第１のプール
（Ａ）は直線勾配の約９００ｍＭ ＮａＣｌで溶離した
ものであり、第２のプール（Ｂ）は５０％エチレングリ
コール、４Ｍ ＮａＣｌで溶離したものである。これら
プールを約１００倍に濃縮し、そして別々に、水中の１
％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で平衡にした
２ｍＬのＰｒｏＲＰＣ（商標）逆相カラムにかけた。カ
ラムを出発緩衝液で洗浄し、そして１％（ｖ／ｖ）ＴＦ
Ａ中のＨＰＬＣグレードアセトニトリルの２０％（ｖ／
ｖ）〜８０％（ｖ／ｖ）の直線勾配で溶離した。画分
（０．３ｍＬ）を回収し、蒸発乾固し、そしてＢ９アッ
セイで分析するために０．１ｍＬのＨ2Ｏ中に再懸濁し
た。
【００１９】図８は逆相クロマトグラフィーで単離した
ＨＬ−６０阻害活性物の逆相クロマトグラフィーに関す
る。ブルー・セファロース（Ｂｌｕｅ Ｓｅｐｈａｒｏ
ｓｅ）（商標）プールＡ及びＢの逆相クロマトグラフィ
ーからの活性画分を併合し、０．１％ＴＦＡ中の２０〜
８０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル勾配を用いて２ｍＬの
ＰｒｏＲＰＣ（商標）カラムで再びクロマトグラフィー
にかけた。図７に記載されているようにして画分のＩＬ
−６阻害活性を分析した。
ＨＬ−６０阻害活性物の逆相クロマトグラフィーに関す
る。ブルー・セファロース（Ｂｌｕｅ Ｓｅｐｈａｒｏ
ｓｅ）（商標）プールＡ及びＢの逆相クロマトグラフィ
ーからの活性画分を併合し、０．１％ＴＦＡ中の２０〜
８０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル勾配を用いて２ｍＬの
ＰｒｏＲＰＣ（商標）カラムで再びクロマトグラフィー
にかけた。図７に記載されているようにして画分のＩＬ
−６阻害活性を分析した。
【００２０】図９はＨＬ−６０阻害剤の熱処理に関す
る。以下の試料を１５分間１００℃で加熱し、次にＢ９
アッセイで阻害活性をテストした。(1)ブルー・セファ
ロース（Ｂｌｕｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）（商標）ピー
ク２： 未希釈、(2)ブルー・セファロース（商標）ピ
ーク２： １：１０、(3)ブルー・セファロース（商
標）ピーク２： １：１００、(4)ブルー・セファロー
ス（商標）ピーク２： １：１０００、(5)抗ＩＬ−
６、５．０μｇ／ｍＬ、(6)抗ＩＬ−６、０．５μｇ／
ｍＬ、(7)抗ＩＬ−６、５０ｎｇ／ｍＬ、(8)抗ＩＬ−
６、５ｎｇ／ｍＬ、(9)ＲＰＭＩ−２： 未希釈、(10)
ＲＰＭＩ−２： １：１０、(11)ＲＰＭＩ−２：１：１
００、(12)ＲＰＭＩ−２： １：１０００。
る。以下の試料を１５分間１００℃で加熱し、次にＢ９
アッセイで阻害活性をテストした。(1)ブルー・セファ
ロース（Ｂｌｕｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）（商標）ピー
ク２： 未希釈、(2)ブルー・セファロース（商標）ピ
ーク２： １：１０、(3)ブルー・セファロース（商
標）ピーク２： １：１００、(4)ブルー・セファロー
ス（商標）ピーク２： １：１０００、(5)抗ＩＬ−
６、５．０μｇ／ｍＬ、(6)抗ＩＬ−６、０．５μｇ／
ｍＬ、(7)抗ＩＬ−６、５０ｎｇ／ｍＬ、(8)抗ＩＬ−
６、５ｎｇ／ｍＬ、(9)ＲＰＭＩ−２： 未希釈、(10)
ＲＰＭＩ−２： １：１０、(11)ＲＰＭＩ−２：１：１
００、(12)ＲＰＭＩ−２： １：１０００。
【００２１】図１０はＨＬ−６０阻害剤のトリプシン消
化に関する。１０ｋＤの分子量のカットオフ・フィルタ
ーを使用して、ＩＬ−６阻害活性物を含む５００μＬの
ブルー・セファロース（Ｂｌｕｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓ
ｅ）（商標）プールを０．１Ｍの重炭酸アンモニウム、
ｐＨ８．０（消化緩衝液）中に透析瀘過した。試料（２
５０μＬ／試料）を添加して、既に消化緩衝液中で洗浄
しそして３７℃で３．５時間インキュベートした固定化
トリプシンのペレットを分離した。トリプシン消化物を
遠心して回収し、無菌瀘過し、そしてＢ９アッセイで未
処理試料と比較した。
化に関する。１０ｋＤの分子量のカットオフ・フィルタ
ーを使用して、ＩＬ−６阻害活性物を含む５００μＬの
ブルー・セファロース（Ｂｌｕｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓ
ｅ）（商標）プールを０．１Ｍの重炭酸アンモニウム、
ｐＨ８．０（消化緩衝液）中に透析瀘過した。試料（２
５０μＬ／試料）を添加して、既に消化緩衝液中で洗浄
しそして３７℃で３．５時間インキュベートした固定化
トリプシンのペレットを分離した。トリプシン消化物を
遠心して回収し、無菌瀘過し、そしてＢ９アッセイで未
処理試料と比較した。
【００２２】図１１はＨＬ−６０阻害剤の酸処理に関す
る。ＩＬ−６阻害活性物を含むブルー・セファロース
（Ｂｌｕｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）（商標）プールを、
０．１％トリフルオロ酢酸／１００％アセトニトリル、
ｐＨ≦２又は滅菌水のいずれかで１：２に希釈した。蒸
発乾固後、１００μＬのＲＰＭＩ中で再構成し、無菌瀘
過し、そしてＢ９アッセイで分析した。
る。ＩＬ−６阻害活性物を含むブルー・セファロース
（Ｂｌｕｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）（商標）プールを、
０．１％トリフルオロ酢酸／１００％アセトニトリル、
ｐＨ≦２又は滅菌水のいずれかで１：２に希釈した。蒸
発乾固後、１００μＬのＲＰＭＩ中で再構成し、無菌瀘
過し、そしてＢ９アッセイで分析した。
【００２３】図１２はＨＬ−６０阻害剤の合成に対する
シクロヘキシミドの効果に関する。ＨＬ−６０細胞（１
０6／ｍＬ）をＰＭＡ（１０ ｎｇ／ｍＬ）で処理し
た。２４時間後に付着性細胞をＲＰＭＩ−２中で洗浄
し、そして非付着性細胞を除去した。次に、ＲＰＭＩ−
２又は１００μｇ／ｍＬのシクロヘキシミドを含むＲＰ
ＭＩ−２のいずれかの中で、２組の培養物をインキュベ
ートした。さらに２４時間後、ＴＣＦを除去し、そして
細胞を洗浄してシクロヘキシミドを除去した。細胞をＲ
ＰＭＩ−２中でさらに２日間インキュベートし、その際
に、Ｂ９アッセイで阻害活性を分析するためのＴＣＦを
採取した。シクロヘキシミドの除去を確実にするため
に、分析に先立って、全ＴＣＦ試料を透析瀘過した。
シクロヘキシミドの効果に関する。ＨＬ−６０細胞（１
０6／ｍＬ）をＰＭＡ（１０ ｎｇ／ｍＬ）で処理し
た。２４時間後に付着性細胞をＲＰＭＩ−２中で洗浄
し、そして非付着性細胞を除去した。次に、ＲＰＭＩ−
２又は１００μｇ／ｍＬのシクロヘキシミドを含むＲＰ
ＭＩ−２のいずれかの中で、２組の培養物をインキュベ
ートした。さらに２４時間後、ＴＣＦを除去し、そして
細胞を洗浄してシクロヘキシミドを除去した。細胞をＲ
ＰＭＩ−２中でさらに２日間インキュベートし、その際
に、Ｂ９アッセイで阻害活性を分析するためのＴＣＦを
採取した。シクロヘキシミドの除去を確実にするため
に、分析に先立って、全ＴＣＦ試料を透析瀘過した。
【００２４】試薬類 ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）、ホルボ
ールジブチレート（ＰＤＢｕ）、Ａ２３１８７、全−ト
ランス−レチノイン酸（ＲＡ）及びジメチルスルホキシ
ド（ＤＭＳＯ）をＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃ
ｏ．社から購入した。ＰＭＡ、ＰＤＢｕ、Ａ２３１８７
及びＲＡの原液を−２０℃でエタノール中で貯蔵した。
すべての試薬を光から防護し、そして使用直前に適切な
媒体で希釈した。組換えヒトＩＬ−６をＧｅｎｚｙｍｅ
社から購入した。抗ＩＬ−６、抗ＩＬ−１α、抗ＩＬ−
１β及び組換えヒトＩＬ−１αをＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ
ｓ社から購入した。
ールジブチレート（ＰＤＢｕ）、Ａ２３１８７、全−ト
ランス−レチノイン酸（ＲＡ）及びジメチルスルホキシ
ド（ＤＭＳＯ）をＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃ
ｏ．社から購入した。ＰＭＡ、ＰＤＢｕ、Ａ２３１８７
及びＲＡの原液を−２０℃でエタノール中で貯蔵した。
すべての試薬を光から防護し、そして使用直前に適切な
媒体で希釈した。組換えヒトＩＬ−６をＧｅｎｚｙｍｅ
社から購入した。抗ＩＬ−６、抗ＩＬ−１α、抗ＩＬ−
１β及び組換えヒトＩＬ−１αをＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ
ｓ社から購入した。
【００２５】細胞培養物 阻害活性を作出するために２種のＨＬ−６０細胞系（Ａ
ＴＣＣ ＃ ＣＣＬ−２４０）を用いた。第１の細胞系
は高レベルのＩＬ−６を分泌し、そして第２の細胞系は
２０ｐｇ／ｍＬ以下のＩＬ−６を分泌した。細胞系を、
１０％熱不活化ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ社）（ＲＰＭＩ
−１０）で強化したＲＰＭＩ−１６４０（Ｇｉｂｃｏ
社）中で維持した。細胞を、Ｃａ2+及びＭｇ2+不含ダル
ベッコ・リン酸緩衝溶液（ＤＰＢＳ−ＣＭＦ、Ｇｉｂｃ
ｏ）で洗浄し、そして適切な誘発剤を含むＲＰＭＩ−１
６４０中に再懸濁した。組織培養液（ＴＣＦ）を採取
し、そしてＢ９アッセイで阻害活性を測定した。
ＴＣＣ ＃ ＣＣＬ−２４０）を用いた。第１の細胞系
は高レベルのＩＬ−６を分泌し、そして第２の細胞系は
２０ｐｇ／ｍＬ以下のＩＬ−６を分泌した。細胞系を、
１０％熱不活化ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ社）（ＲＰＭＩ
−１０）で強化したＲＰＭＩ−１６４０（Ｇｉｂｃｏ
社）中で維持した。細胞を、Ｃａ2+及びＭｇ2+不含ダル
ベッコ・リン酸緩衝溶液（ＤＰＢＳ−ＣＭＦ、Ｇｉｂｃ
ｏ）で洗浄し、そして適切な誘発剤を含むＲＰＭＩ−１
６４０中に再懸濁した。組織培養液（ＴＣＦ）を採取
し、そしてＢ９アッセイで阻害活性を測定した。
【００２６】ＩＬ−６分泌細胞系を用いて、最適な誘発
剤及び細胞濃度を求めるための最初の実験を行った。続
いての実験で、ホルボールジエステル（例えばＰＭＡ，
ＰＤＢｕ等）刺激後に非分泌ＨＬ−６０系がＩＬ−６阻
害剤を産生したことが例証された。ゲル瀘過により、Ｉ
Ｌ−６非分泌型で合成された阻害剤がＩＬ−６分泌型で
合成された阻害剤と同一の分子量を有することがわかっ
た。ＩＬ−６の存在による異常な結果を回避するため
に、ＡＴＣＣから入手可能な非分泌細胞系を用いて、特
性決定及び精製研究を行った。
剤及び細胞濃度を求めるための最初の実験を行った。続
いての実験で、ホルボールジエステル（例えばＰＭＡ，
ＰＤＢｕ等）刺激後に非分泌ＨＬ−６０系がＩＬ−６阻
害剤を産生したことが例証された。ゲル瀘過により、Ｉ
Ｌ−６非分泌型で合成された阻害剤がＩＬ−６分泌型で
合成された阻害剤と同一の分子量を有することがわかっ
た。ＩＬ−６の存在による異常な結果を回避するため
に、ＡＴＣＣから入手可能な非分泌細胞系を用いて、特
性決定及び精製研究を行った。
【００２７】ＩＬ−６依存性Ｂ９アッセイ Ｂ９ネズミハイブリドーマ細胞系（Ｐ．Ｓｃｕｄｅｒ
ｉ，Ｍｉｌｅｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ；
Ｗｅｓｔ Ｈａｖｅｎ，ＣＮ）を少なくとも１単位／ｍ
ＬのＩＬ−６で強化したＲＰＭＩ−１０中で維持した。
アッセイにおける使用に際して、細胞を、９６−ウエル
・プレート（Ｃｏｒｎ社）中の５％ ＦＢＳ含有ＲＰＭ
Ｉ（ＲＰＭＩ−５）（１００ μＬ／ウエル）に５ ｘ
１０４細胞／ｍＬで接種した。試験用試料から２０μ
Ｌ（粗ＴＣＦ）又は１０μＬ（カラム画分）の容量を添
加した。ウエルの半分はＲＰＭＩ−５中の２単位／ｍＬ
のＩＬ−６を１００μＬ受け取り、他方の半分は１００
μＬのＲＰＭＩ−５を受け取った。ＩＬ−６特異的効果
の測定を確実にするために、抗ＩＬ−６を０．５〜１μ
ｇ／ウエルで対照ウエルに添加した。３〜４日間のイン
キュベーションの後、細胞増殖を3Ｈ−チミジン（3Ｈ−
Ｔｄｒ、ＤｕＰｏｎｔ−ＮＥＮ）の取り込み又はＭＴＳ
のテトラゾリウム（Ｐｒｏｍｅｇａ社）の水可溶性ホル
マザンへの変換のいずれかにより測定した。3Ｈ−Ｔｄ
ｒの取り込みについては、細胞を０．５μＣｉ／ウエル
の3Ｈ−Ｔｄｒで５時間ラベルし、トムテック・オート
トラップ（Ｔｏｍｔｅｃ Ａｕｔｏｔｒａｐ）を用いて
フィルター上に採取し、そして１２０５ ＢＳ ベータ
プレート（Ｂｅｔａｐｌａｔｅ）（ＬＫＢ−Ｗａｌｌａ
ｃ社）を用いて3Ｈ取り込みを測定した。細胞増殖の非
放射性検出については、細胞力価９６ＡＱ非放射性細胞
増殖アッセイ（Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ ９６ ＡＱ Ｎ
ｏｎ−ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉ
ｆｅｒａｔｉｏｎＡｓｓａｙ）（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を
用いた。試料を３回分析し、そして阻害パーセントを次
のようにして平均値から算出した。
ｉ，Ｍｉｌｅｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ；
Ｗｅｓｔ Ｈａｖｅｎ，ＣＮ）を少なくとも１単位／ｍ
ＬのＩＬ−６で強化したＲＰＭＩ−１０中で維持した。
アッセイにおける使用に際して、細胞を、９６−ウエル
・プレート（Ｃｏｒｎ社）中の５％ ＦＢＳ含有ＲＰＭ
Ｉ（ＲＰＭＩ−５）（１００ μＬ／ウエル）に５ ｘ
１０４細胞／ｍＬで接種した。試験用試料から２０μ
Ｌ（粗ＴＣＦ）又は１０μＬ（カラム画分）の容量を添
加した。ウエルの半分はＲＰＭＩ−５中の２単位／ｍＬ
のＩＬ−６を１００μＬ受け取り、他方の半分は１００
μＬのＲＰＭＩ−５を受け取った。ＩＬ−６特異的効果
の測定を確実にするために、抗ＩＬ−６を０．５〜１μ
ｇ／ウエルで対照ウエルに添加した。３〜４日間のイン
キュベーションの後、細胞増殖を3Ｈ−チミジン（3Ｈ−
Ｔｄｒ、ＤｕＰｏｎｔ−ＮＥＮ）の取り込み又はＭＴＳ
のテトラゾリウム（Ｐｒｏｍｅｇａ社）の水可溶性ホル
マザンへの変換のいずれかにより測定した。3Ｈ−Ｔｄ
ｒの取り込みについては、細胞を０．５μＣｉ／ウエル
の3Ｈ−Ｔｄｒで５時間ラベルし、トムテック・オート
トラップ（Ｔｏｍｔｅｃ Ａｕｔｏｔｒａｐ）を用いて
フィルター上に採取し、そして１２０５ ＢＳ ベータ
プレート（Ｂｅｔａｐｌａｔｅ）（ＬＫＢ−Ｗａｌｌａ
ｃ社）を用いて3Ｈ取り込みを測定した。細胞増殖の非
放射性検出については、細胞力価９６ＡＱ非放射性細胞
増殖アッセイ（Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ ９６ ＡＱ Ｎ
ｏｎ−ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉ
ｆｅｒａｔｉｏｎＡｓｓａｙ）（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を
用いた。試料を３回分析し、そして阻害パーセントを次
のようにして平均値から算出した。
【００２８】
【数１】
【００２９】非放射性アッセイでの阻害パーセントを求
めるために、上記式中ＣＰＭの代わりにＯ．Ｄ．値を用
いた。
めるために、上記式中ＣＰＭの代わりにＯ．Ｄ．値を用
いた。
【００３０】ＩＬ−１依存性Ｕ３７３アッセイ Ｕ３７３（ヒト星状細胞腫／グリア芽腫）細胞系に対す
るＩＬ−１の増殖促進効果が他の研究者らにより報告さ
れている（Ｌａｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ．，１３８（９）：２９１３−２９−６（１９
８７））。アッセイにおける使用に際して、Ｕ３７３−
ＭＧ細胞（ＡＴＣＣ ＃ ＨＴＢ １７）をＲＰＭＩ−
１０中で集密状態まで増殖させた。試験の１日前に、細
胞をトリプシンで処理し、そして１ ｘ １０４ 細胞
／ウエルを１％ ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ（ＲＰＭＩ
−１）中の９６−ウエル・プレートに接種した。次に試
験試料、すなわち２０μＬの組織培養液（ＴＣＦ）（５
単位／ｍＬのＩＬ−１αを含有したもの又は含有しない
もの）を、２００μＬ／ウエルの総容量で添加した。適
切な容量のＲＰＭＩ−１を添加してネガティブ対照とし
た。細胞を２日間培養し、そして０．５μＣｉ／ウエル
の3Ｈ−Ｔｄｒを終端の５時間に添加した。細胞を採取
しそして3Ｈの取り込みを測定した。
るＩＬ−１の増殖促進効果が他の研究者らにより報告さ
れている（Ｌａｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ．，１３８（９）：２９１３−２９−６（１９
８７））。アッセイにおける使用に際して、Ｕ３７３−
ＭＧ細胞（ＡＴＣＣ ＃ ＨＴＢ １７）をＲＰＭＩ−
１０中で集密状態まで増殖させた。試験の１日前に、細
胞をトリプシンで処理し、そして１ ｘ １０４ 細胞
／ウエルを１％ ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ（ＲＰＭＩ
−１）中の９６−ウエル・プレートに接種した。次に試
験試料、すなわち２０μＬの組織培養液（ＴＣＦ）（５
単位／ｍＬのＩＬ−１αを含有したもの又は含有しない
もの）を、２００μＬ／ウエルの総容量で添加した。適
切な容量のＲＰＭＩ−１を添加してネガティブ対照とし
た。細胞を２日間培養し、そして０．５μＣｉ／ウエル
の3Ｈ−Ｔｄｒを終端の５時間に添加した。細胞を採取
しそして3Ｈの取り込みを測定した。
【００３１】カラムクロマトグラフィー ＰＭＡ誘発ＨＬ−６０培養液上澄みを表示された緩衝液
中に透析瀘過し、そしてＹＭ１０又はＹＭ３膜（Ａｍｉ
ｃｏｎ社）で限外瀘過した。濃縮した上澄みをクロマト
グラフィー樹脂にかけて図に示したように溶離した。Ｉ
Ｌ−６阻害活性をアッセイするために、画分を０．２２
μｍフィルターを通して瀘過し、そして溶離緩衝液がＢ
９アッセイと不適合である場合には、ＲＰＭＩ−１６４
０で透析瀘過した。特記がなければ、全樹脂はＰｈａｒ
ｍａｃｉａ社から購入したものである。
中に透析瀘過し、そしてＹＭ１０又はＹＭ３膜（Ａｍｉ
ｃｏｎ社）で限外瀘過した。濃縮した上澄みをクロマト
グラフィー樹脂にかけて図に示したように溶離した。Ｉ
Ｌ−６阻害活性をアッセイするために、画分を０．２２
μｍフィルターを通して瀘過し、そして溶離緩衝液がＢ
９アッセイと不適合である場合には、ＲＰＭＩ−１６４
０で透析瀘過した。特記がなければ、全樹脂はＰｈａｒ
ｍａｃｉａ社から購入したものである。
【００３２】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ 電気泳動に供すべき試料を、非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
緩衝液で１：２に希釈し、そして５〜１０分間１００℃
で煮沸した。２０μＬの希釈試料を１０〜２０％勾配Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥゲル（ＢｉｏＲａｄ社）にかけて２００
Ｖで約４５分間電気泳動した。ゲルをクーマシーブルー
Ｒ−２５０で染色するか又は銀染色した。
緩衝液で１：２に希釈し、そして５〜１０分間１００℃
で煮沸した。２０μＬの希釈試料を１０〜２０％勾配Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥゲル（ＢｉｏＲａｄ社）にかけて２００
Ｖで約４５分間電気泳動した。ゲルをクーマシーブルー
Ｒ−２５０で染色するか又は銀染色した。
【００３３】
実施例１ 試験管内でＨＬ−６０細胞の分化を調節することが知ら
れている種々の化合物の効果を図１に要約した。ＲＰＭ
Ｉ−１６４０ １ｍＬの当たり０．５〜２ ｘ１０6
ＨＬ−６０細胞を、１０ｎｇ／ｍＬのＰＭＡ又は１３０
ｎｇ／ｍＬのＰＤＢｕ（両者が単球分化を誘発すること
が知られている）で処理した。２４時間後に、細胞は付
着性になり、空胞化されそして増殖を停止した。細胞を
ＲＰＭＩ−２に移し、そして３日後に、Ｂ９アッセイで
測定したところ，ＩＬ−６阻害剤はＰＭＡ又はＰＤＢｕ
のいずれかで処理した細胞の培養液中に見い出された
が、顆粒球分化を誘発するＤＭＳＯ又はＲＡで処理した
細胞の培養液中には見い出されなかった。幾つかの細胞
系では、カルシウムイオノフォアとホルボールエステル
類が相乗的に細胞活性を誘導した。しかしながら、ＰＭ
Ａとカルシウムイオノフォア（Ａ２３１８７）との同時
刺激が、ＰＭＡのみで誘発された場合よりも阻害剤のレ
ベルを増大させなかったことを我々は見い出した。Ａ２
３１８７のみの場合も検出可能な阻害剤を作出しなかっ
た。
れている種々の化合物の効果を図１に要約した。ＲＰＭ
Ｉ−１６４０ １ｍＬの当たり０．５〜２ ｘ１０6
ＨＬ−６０細胞を、１０ｎｇ／ｍＬのＰＭＡ又は１３０
ｎｇ／ｍＬのＰＤＢｕ（両者が単球分化を誘発すること
が知られている）で処理した。２４時間後に、細胞は付
着性になり、空胞化されそして増殖を停止した。細胞を
ＲＰＭＩ−２に移し、そして３日後に、Ｂ９アッセイで
測定したところ，ＩＬ−６阻害剤はＰＭＡ又はＰＤＢｕ
のいずれかで処理した細胞の培養液中に見い出された
が、顆粒球分化を誘発するＤＭＳＯ又はＲＡで処理した
細胞の培養液中には見い出されなかった。幾つかの細胞
系では、カルシウムイオノフォアとホルボールエステル
類が相乗的に細胞活性を誘導した。しかしながら、ＰＭ
Ａとカルシウムイオノフォア（Ａ２３１８７）との同時
刺激が、ＰＭＡのみで誘発された場合よりも阻害剤のレ
ベルを増大させなかったことを我々は見い出した。Ａ２
３１８７のみの場合も検出可能な阻害剤を作出しなかっ
た。
【００３４】ＰＭＡ添加後２４時間以内に、培養液内に
ＩＬ−６阻害剤が検出され、そして誘発剤の除去後さら
に４８時間分泌が継続した。ＰＭＡのみでＢ９細胞増殖
を刺激できそしてＨＬ−６０培養液の一次採取物が１０
ｎｇ／ｍＬの残存ＰＭＡを含むという事実にもかかわら
ず、この採取物の粗上澄み中に阻害活性がなお観察され
た。
ＩＬ−６阻害剤が検出され、そして誘発剤の除去後さら
に４８時間分泌が継続した。ＰＭＡのみでＢ９細胞増殖
を刺激できそしてＨＬ−６０培養液の一次採取物が１０
ｎｇ／ｍＬの残存ＰＭＡを含むという事実にもかかわら
ず、この採取物の粗上澄み中に阻害活性がなお観察され
た。
【００３５】実施例２ Ｂ９細胞のＩＬ−６刺激増殖を阻害する他に、ＨＬ−６
０誘導阻害剤はＢ９細胞の内生（ＩＬ−６非依存性）増
殖を抑制した。抗ＩＬ−６のみがＩＬ−６刺激増殖に影
響を及ぼした。ＨＬ−６０誘導活性物がチミジン取り込
みの阻害剤又は細胞増殖の非特異的阻害剤であるという
可能性を排除するために、Ｕ３７３細胞に対する効果を
分析した。Ｕ３７３細胞の増殖をＩＬ−６ではなくＩＬ
−１で刺激した。図２を参照せよ。１ ｘ １０6 Ｈ
Ｌ−６０細胞／ｍＬを１０ｎｇ／ｍＬのＰＭＡで２４時
間処理した。細胞をＲＰＭＩ−２中に移し、そしてさら
に３日間インキュベートした。上澄みを回収してＵ３７
３アッセイで分析した。Ｕ３７３アッセイで測定したと
ころ、ＰＭＡ誘発ＨＬ−６０細胞の培養液中にはＩＬ−
１刺激増殖の阻害剤も細胞増殖の非特異的阻害剤も検出
されなかった。事実、おそらく上澄み中のＩＬ−１の存
在により、ＨＬ−６０培養液がＵ３７３細胞の増殖を刺
激することがわかった。抗ＩＬ−１を用いた対照実験は
予測どおりの結果を与えた。さらに、ＨＬ−６０阻害剤
はＣＴＬＬ細胞のＩＬ−２依存性又は非特異的増殖を阻
害しなかった。
０誘導阻害剤はＢ９細胞の内生（ＩＬ−６非依存性）増
殖を抑制した。抗ＩＬ−６のみがＩＬ−６刺激増殖に影
響を及ぼした。ＨＬ−６０誘導活性物がチミジン取り込
みの阻害剤又は細胞増殖の非特異的阻害剤であるという
可能性を排除するために、Ｕ３７３細胞に対する効果を
分析した。Ｕ３７３細胞の増殖をＩＬ−６ではなくＩＬ
−１で刺激した。図２を参照せよ。１ ｘ １０6 Ｈ
Ｌ−６０細胞／ｍＬを１０ｎｇ／ｍＬのＰＭＡで２４時
間処理した。細胞をＲＰＭＩ−２中に移し、そしてさら
に３日間インキュベートした。上澄みを回収してＵ３７
３アッセイで分析した。Ｕ３７３アッセイで測定したと
ころ、ＰＭＡ誘発ＨＬ−６０細胞の培養液中にはＩＬ−
１刺激増殖の阻害剤も細胞増殖の非特異的阻害剤も検出
されなかった。事実、おそらく上澄み中のＩＬ−１の存
在により、ＨＬ−６０培養液がＵ３７３細胞の増殖を刺
激することがわかった。抗ＩＬ−１を用いた対照実験は
予測どおりの結果を与えた。さらに、ＨＬ−６０阻害剤
はＣＴＬＬ細胞のＩＬ−２依存性又は非特異的増殖を阻
害しなかった。
【００３６】
【結果】最初の研究を拡張し、阻害剤の誘発のための最
良条件を求めた。０．５〜２．０ ｘ １０6 細胞／
ｍＬの範囲に及ぶＨＬ−６０細胞密度並びに１〜１０ｎ
ｇ／ｍＬのＰＭＮ濃度を用いた場合に、最適阻害剤産生
が観察された。
良条件を求めた。０．５〜２．０ ｘ １０6 細胞／
ｍＬの範囲に及ぶＨＬ−６０細胞密度並びに１〜１０ｎ
ｇ／ｍＬのＰＭＮ濃度を用いた場合に、最適阻害剤産生
が観察された。
【００３７】阻害剤の特性決定 カラムクロマトグラフィー ：阻害剤をさらに特性決定し
そして汚染タンパク質から阻害活性物を分別するため
に、ＩＬ−６非分泌ＨＬ−６０細胞系を用いた。サイズ
排除、陰イオン交換、ブルー・セファロース（Ｂｌｕｅ
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）（商標）及び逆相クロマトグラ
フィーを用いた。大規模の精製を簡素化する為に、細胞
を無血清ＲＰＭＩ−１６４０中で誘発した。
そして汚染タンパク質から阻害活性物を分別するため
に、ＩＬ−６非分泌ＨＬ−６０細胞系を用いた。サイズ
排除、陰イオン交換、ブルー・セファロース（Ｂｌｕｅ
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）（商標）及び逆相クロマトグラ
フィーを用いた。大規模の精製を簡素化する為に、細胞
を無血清ＲＰＭＩ−１６４０中で誘発した。
【００３８】おおよその阻害剤の分子量を測定するため
に、ＴＣＦを３０ｋＤ膜を通して限外瀘過した。１０ｋ
Ｄ膜による濃縮後、活性物は瀘液中に見い出された。こ
のことは、阻害剤の分子量は３０ｋＤ未満であるが１０
ｋＤより大きいことを示している。
に、ＴＣＦを３０ｋＤ膜を通して限外瀘過した。１０ｋ
Ｄ膜による濃縮後、活性物は瀘液中に見い出された。こ
のことは、阻害剤の分子量は３０ｋＤ未満であるが１０
ｋＤより大きいことを示している。
【００３９】阻害剤をさらに特性決定するために、濃縮
しそして透析瀘過したＴＣＦをスパロース（Ｓｕｐｅｒ
ｏｓｅ）１２（商標）ゲル瀘過カラムでクロマトグラフ
した。図４を参照せよ。約２０ｋＤに対応する位置で活
性物が溶離された。ＩＬ−６はＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓ
ｙｓｔｅｍｓ社）で測定された。
しそして透析瀘過したＴＣＦをスパロース（Ｓｕｐｅｒ
ｏｓｅ）１２（商標）ゲル瀘過カラムでクロマトグラフ
した。図４を参照せよ。約２０ｋＤに対応する位置で活
性物が溶離された。ＩＬ−６はＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓ
ｙｓｔｅｍｓ社）で測定された。
【００４０】ＨＬ−６０ＴＣＦを濃縮し、そしてモノ
（Ｍｏｎｏ）Ｑ（商標）陰イオン交換カラムにかけた。
図５を参照せよ。モノＱ（商標）カラムからの画分につ
いて阻害活性物を分析し、そして活性物が１７５ｍＭ
ＮａＣｌで溶離することが見い出された。ＤＥＡＥ−セ
ファセル（Ｓｅｐｈａｃｅｌ）（商標）から、阻害活性
物が１５０ｍＭ ＮａＣｌで溶離することが見い出され
た。
（Ｍｏｎｏ）Ｑ（商標）陰イオン交換カラムにかけた。
図５を参照せよ。モノＱ（商標）カラムからの画分につ
いて阻害活性物を分析し、そして活性物が１７５ｍＭ
ＮａＣｌで溶離することが見い出された。ＤＥＡＥ−セ
ファセル（Ｓｅｐｈａｃｅｌ）（商標）から、阻害活性
物が１５０ｍＭ ＮａＣｌで溶離することが見い出され
た。
【００４１】ブルー・セファロース（商標）を既にサイ
トカインを単離するために用いたので、ＩＬ−６阻害剤
を含むＴＣＦをこの樹脂でクロマトグラフした。図６を
参照せよ。用いた条件下では、ＴＣＦ中のタンパク質の
バルクはカラムに結合しなかった。阻害活性物は、約９
００ｍＭ ＮａＣｌ（プールＡ）の幅広ピークで、又は
引き続く５０％エチレングリコール／４Ｍ ＮａＣｌ
（プールＢ）中に溶離した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、
ブルー・セファロース（商標）からの阻害ピーク画分は
複合タンパク質を含んでいることがわかった。
トカインを単離するために用いたので、ＩＬ−６阻害剤
を含むＴＣＦをこの樹脂でクロマトグラフした。図６を
参照せよ。用いた条件下では、ＴＣＦ中のタンパク質の
バルクはカラムに結合しなかった。阻害活性物は、約９
００ｍＭ ＮａＣｌ（プールＡ）の幅広ピークで、又は
引き続く５０％エチレングリコール／４Ｍ ＮａＣｌ
（プールＢ）中に溶離した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、
ブルー・セファロース（商標）からの阻害ピーク画分は
複合タンパク質を含んでいることがわかった。
【００４２】阻害剤をさらに精製するために、Ｃ１／Ｃ
８逆相クロマトグラフィー（ＰｒｏＲＰＣ（商標））を
用いた。図７を参照せよ。ブルー・セファロース（商
標）プールＡ（図７Ａ）又はプールＢ（図７Ｂ）からの
ＩＬ−６阻害活性物は約４０％アセトニトリルで溶離す
ることが見い出された。これら試行からの活性物画分を
併合し、そして分離能を向上させるために浅い勾配を用
いて、ＰｒｏＲＰＣ（商標）で再クロマトグラフした
（図８）。阻害活性物は約３２％アセトニトリルで溶離
した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（１０〜２０％勾配ゲル）
により、複合タンパク質バンドの存在が示された。した
がって、ＴＣＦから阻害剤を有意に精製することは達成
されたが、阻害剤はまだ均質にまで精製されていない。
８逆相クロマトグラフィー（ＰｒｏＲＰＣ（商標））を
用いた。図７を参照せよ。ブルー・セファロース（商
標）プールＡ（図７Ａ）又はプールＢ（図７Ｂ）からの
ＩＬ−６阻害活性物は約４０％アセトニトリルで溶離す
ることが見い出された。これら試行からの活性物画分を
併合し、そして分離能を向上させるために浅い勾配を用
いて、ＰｒｏＲＰＣ（商標）で再クロマトグラフした
（図８）。阻害活性物は約３２％アセトニトリルで溶離
した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（１０〜２０％勾配ゲル）
により、複合タンパク質バンドの存在が示された。した
がって、ＴＣＦから阻害剤を有意に精製することは達成
されたが、阻害剤はまだ均質にまで精製されていない。
【００４３】特性決定：抗ＩＬ−６で観察されたのとは
対照的に、ブルー・セファロース（商標）から溶離され
た阻害剤の部分的に精製されたプールを１００℃で１５
分間加熱した結果、阻害活性を有意に低減しなかった
（図９参照）。ブルー・セファロース（商標）プールの
固定化トリプシン処理により、阻害活性は６４倍低減し
た（図１０参照）。ＴＣＦをアセトニトリル中の０．１
％トリフルオロ酢酸でｐＨ≦２で処理した結果、活性が
３倍低減した（図１１参照）。公知のタンパク質合成阻
害剤であるシクロヘキシミドによるＰＭＡ刺激後にＨＬ
−６０細胞をインキュベートした結果、Ｂ９アッセイで
阻害活性が完全に抑制された（図１２参照）。上記実験
の結果は、見られた阻害がＨＬ−６０ＴＣＦ中に存在す
るタンパク質の結果であることを強く示唆する。
対照的に、ブルー・セファロース（商標）から溶離され
た阻害剤の部分的に精製されたプールを１００℃で１５
分間加熱した結果、阻害活性を有意に低減しなかった
（図９参照）。ブルー・セファロース（商標）プールの
固定化トリプシン処理により、阻害活性は６４倍低減し
た（図１０参照）。ＴＣＦをアセトニトリル中の０．１
％トリフルオロ酢酸でｐＨ≦２で処理した結果、活性が
３倍低減した（図１１参照）。公知のタンパク質合成阻
害剤であるシクロヘキシミドによるＰＭＡ刺激後にＨＬ
−６０細胞をインキュベートした結果、Ｂ９アッセイで
阻害活性が完全に抑制された（図１２参照）。上記実験
の結果は、見られた阻害がＨＬ−６０ＴＣＦ中に存在す
るタンパク質の結果であることを強く示唆する。
【００４４】
【議論】Ｂ９ハリブリドーマ細胞のＩＬ−６刺激増殖の
阻害剤は、マクロファージ種族に向かって分化するよう
に誘発されたＨＬ−６０細胞の培養液中で検出された。
ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）及び非親
油性ジエステルホルボールジブチレート（ＰＤＢｕ）は
阻害活性の誘発剤として有効であった。誘発剤濃度及び
細胞密度、例えば１〜１０ｎｇ／ｍＬＰＭＡ及び０．５
〜２．０ ｘ １０6細胞／ｍＬ、は、阻害剤発現の最
適化のための臨界的パラメーターであることが分かっ
た。レチノイン酸（ＲＡ）及びジメチルスルホキシド
（ＤＭＳＯ）を用いた顆粒球経路に添ったＨＬ−６０細
胞の分化は、検出可能なレベルの阻害剤を誘発しなかっ
た。ＰＭＡを用いた又は用いなかったイオノフォアＡ２
３１８７への細胞の暴露或いはＲＡとＰＭＡの組み合わ
せへの細胞の暴露（単球細胞系の活性化を高めると報告
されている条件）は、阻害剤の発現に対して有意な効果
を生じなかった。
阻害剤は、マクロファージ種族に向かって分化するよう
に誘発されたＨＬ−６０細胞の培養液中で検出された。
ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）及び非親
油性ジエステルホルボールジブチレート（ＰＤＢｕ）は
阻害活性の誘発剤として有効であった。誘発剤濃度及び
細胞密度、例えば１〜１０ｎｇ／ｍＬＰＭＡ及び０．５
〜２．０ ｘ １０6細胞／ｍＬ、は、阻害剤発現の最
適化のための臨界的パラメーターであることが分かっ
た。レチノイン酸（ＲＡ）及びジメチルスルホキシド
（ＤＭＳＯ）を用いた顆粒球経路に添ったＨＬ−６０細
胞の分化は、検出可能なレベルの阻害剤を誘発しなかっ
た。ＰＭＡを用いた又は用いなかったイオノフォアＡ２
３１８７への細胞の暴露或いはＲＡとＰＭＡの組み合わ
せへの細胞の暴露（単球細胞系の活性化を高めると報告
されている条件）は、阻害剤の発現に対して有意な効果
を生じなかった。
【００４５】ＨＬ−６０誘導活性は、Ｕ３７３細胞の増
殖の、ＩＬ−１依存性又は自然発生的な速度に対して阻
害効果を生じなかった。これらデータは、活性物がチミ
ジン取り込みの阻害剤もしくはＩＬ−１作用の阻害剤で
も又は細胞増殖の非特異的阻害剤でもないことを示唆す
る。それにもかかわらず、Ｂ９細胞のＰＭＡへの暴露に
より誘発された、増大した速度の他に、ＩＬ−６阻害剤
は、添加ＩＬ−６の不存在下で観察されたＢ９細胞増殖
の自然発生的な速度を抑制した。抗ＩＬ−６はＢ９細胞
の自然発生的増殖に影響を及ぼさないが、サイトカイン
の内生の合成はオートクライン増殖効果を生じ、そして
そのようなオートクライン効果は抗体による阻害に対し
て不応性となり得る。ＰＭＡがＢ９細胞増殖を刺激する
メカニズムは不明であるが、Ｂ９細胞は他の公知のサイ
トカイン類には応答しないのでこのメカニズムはＩＬ−
６の内生の合成に依存する。ＨＬ−６０誘導活性物が添
加されたそして内生の両方のＩＬ−６の特異的阻害剤で
あるらしいと、我々は仮に結論づける。阻害活性物を、
相当高濃度のＩＬ−６を含むＨＬ−６０上澄み中に見い
出すことができることに注意することは興味深い。この
観察は、レセプター拮抗作用とは異なるメカニズムを示
唆し、このメカニズムは自然発生的な及びＰＭＡ誘導の
Ｂ９細胞増殖に対する、抗ＩＬ−６及びＨＬ−６０阻害
剤の分化効果と一致するであろう。
殖の、ＩＬ−１依存性又は自然発生的な速度に対して阻
害効果を生じなかった。これらデータは、活性物がチミ
ジン取り込みの阻害剤もしくはＩＬ−１作用の阻害剤で
も又は細胞増殖の非特異的阻害剤でもないことを示唆す
る。それにもかかわらず、Ｂ９細胞のＰＭＡへの暴露に
より誘発された、増大した速度の他に、ＩＬ−６阻害剤
は、添加ＩＬ−６の不存在下で観察されたＢ９細胞増殖
の自然発生的な速度を抑制した。抗ＩＬ−６はＢ９細胞
の自然発生的増殖に影響を及ぼさないが、サイトカイン
の内生の合成はオートクライン増殖効果を生じ、そして
そのようなオートクライン効果は抗体による阻害に対し
て不応性となり得る。ＰＭＡがＢ９細胞増殖を刺激する
メカニズムは不明であるが、Ｂ９細胞は他の公知のサイ
トカイン類には応答しないのでこのメカニズムはＩＬ−
６の内生の合成に依存する。ＨＬ−６０誘導活性物が添
加されたそして内生の両方のＩＬ−６の特異的阻害剤で
あるらしいと、我々は仮に結論づける。阻害活性物を、
相当高濃度のＩＬ−６を含むＨＬ−６０上澄み中に見い
出すことができることに注意することは興味深い。この
観察は、レセプター拮抗作用とは異なるメカニズムを示
唆し、このメカニズムは自然発生的な及びＰＭＡ誘導の
Ｂ９細胞増殖に対する、抗ＩＬ−６及びＨＬ−６０阻害
剤の分化効果と一致するであろう。
【００４６】我々が知る限りにおいて、天然起源のＩＬ
−６阻害剤は今日まで記述されていない。本明細書中で
用いられるように、天然起源のヒト阻害剤は、ＩＬ−６
の作用を阻害するヒト細胞由来の、非遺伝子工学的に作
出された化合物を意味する。可溶性ＩＬ−６レセプター
は報告されているが、ＩＬ−６活性を阻害するよりはむ
しろ刺激することが見い出されてきている。他の可溶性
サイトカインレセプター類がアンタゴニストであること
が知られているので、このことはユニークな観察であ
る。アゴニスト活性は、ＩＬ−６レセプターの配置; 低
いアフィニティーでＩＬ−６に結合する一次の細胞外８
０ｋＤサブユニット、並びにＩＬ−６／８０ｋＤ複合体
に結合した後に、ＩＬ−６に対する８０ｋＤレセプター
のアフィニティーを増大させそしてシグナル変換を生じ
させるｇｐ１０３によるものであるらしい。おそらくは
可溶性レセプター−ＩＬ−６複合体が認識されそしてｇ
ｐ１０３により結合されそしてＩＬ−６シグナルが変換
されるのであろう。
−６阻害剤は今日まで記述されていない。本明細書中で
用いられるように、天然起源のヒト阻害剤は、ＩＬ−６
の作用を阻害するヒト細胞由来の、非遺伝子工学的に作
出された化合物を意味する。可溶性ＩＬ−６レセプター
は報告されているが、ＩＬ−６活性を阻害するよりはむ
しろ刺激することが見い出されてきている。他の可溶性
サイトカインレセプター類がアンタゴニストであること
が知られているので、このことはユニークな観察であ
る。アゴニスト活性は、ＩＬ−６レセプターの配置; 低
いアフィニティーでＩＬ−６に結合する一次の細胞外８
０ｋＤサブユニット、並びにＩＬ−６／８０ｋＤ複合体
に結合した後に、ＩＬ−６に対する８０ｋＤレセプター
のアフィニティーを増大させそしてシグナル変換を生じ
させるｇｐ１０３によるものであるらしい。おそらくは
可溶性レセプター−ＩＬ−６複合体が認識されそしてｇ
ｐ１０３により結合されそしてＩＬ−６シグナルが変換
されるのであろう。
【００４７】例えば全身性エリテマトーデスや慢性関節
リウマチのような自己免疫疾患において、ＩＬ−６の過
剰発現が記録され、そしてサイトカインが腫瘍性形質細
胞の増殖因子であることが知られている。自己免疫疾患
に対するＩＬ−６アンタゴニストの効果は報告されてい
ないが、病原論におけるサイトカインの役割は入手可能
なデータに基づいて提唱されている。形質細胞性白血病
患者中のネズミモノクローナル抗体を用いた短期間臨床
応答が注目されており、このことにより、ＩＬ−６機能
の効率的な阻害は現在の治療法に対して有益な付属的治
療法となるであろうことが示唆されている。
リウマチのような自己免疫疾患において、ＩＬ−６の過
剰発現が記録され、そしてサイトカインが腫瘍性形質細
胞の増殖因子であることが知られている。自己免疫疾患
に対するＩＬ−６アンタゴニストの効果は報告されてい
ないが、病原論におけるサイトカインの役割は入手可能
なデータに基づいて提唱されている。形質細胞性白血病
患者中のネズミモノクローナル抗体を用いた短期間臨床
応答が注目されており、このことにより、ＩＬ−６機能
の効率的な阻害は現在の治療法に対して有益な付属的治
療法となるであろうことが示唆されている。
【００４８】上記の実験は本発明を説明するために意図
され、当業者により変形し得るものと考えられる。した
がって、本発明の範囲は上記特許請求の範囲のみにより
制限されるべきであると意図される。
され、当業者により変形し得るものと考えられる。した
がって、本発明の範囲は上記特許請求の範囲のみにより
制限されるべきであると意図される。
【００４９】本発明の主な特徴または態様は以下の通り
である。
である。
【００５０】１．ヒトインターロイキン６依存性細胞機
能のヒト阻害剤を含んでなる、天然起源の阻害剤製剤。
能のヒト阻害剤を含んでなる、天然起源の阻害剤製剤。
【００５１】２．製剤がＨＬ−６０細胞から誘導される
上記１の製剤。
上記１の製剤。
【００５２】３．シクロヘキシミドとＨＬ−６０細胞の
インキュベーションにより、阻害が除去される上記２の
阻害剤製剤。
インキュベーションにより、阻害が除去される上記２の
阻害剤製剤。
【００５３】４．ＨＬ−６０細胞がホルボールジエステ
ル類で処理された上記２の阻害剤製剤。
ル類で処理された上記２の阻害剤製剤。
【００５４】５．トリプシンを用いる処理により、細胞
増殖アッセイで測定される場合にインターロイキン６の
該阻害が５０倍に等しいか或いは５０倍より大きく低減
される上記１の阻害剤製剤。
増殖アッセイで測定される場合にインターロイキン６の
該阻害が５０倍に等しいか或いは５０倍より大きく低減
される上記１の阻害剤製剤。
【００５５】６．ゲル瀘過クロマトグラフィーで測定さ
れる場合、阻害剤の分子量が約１０，０００ダルトン及
び３０，０００ダルトンの間である上記１の阻害剤製
剤。
れる場合、阻害剤の分子量が約１０，０００ダルトン及
び３０，０００ダルトンの間である上記１の阻害剤製
剤。
【００５６】７．阻害剤が、約８００ｍＭより高いＮａ
Ｃｌ濃度でそして約６．５〜７．５のｐＨでシバクロン
ブルー樹脂から溶離する上記１の阻害剤製剤。
Ｃｌ濃度でそして約６．５〜７．５のｐＨでシバクロン
ブルー樹脂から溶離する上記１の阻害剤製剤。
【００５７】８．阻害剤が、約１４０ｍＭより高いＮａ
Ｃｌ濃度でそして約７．０〜８．０のｐＨで陰イオン交
換樹脂から溶離する上記１の阻害剤製剤。
Ｃｌ濃度でそして約７．０〜８．０のｐＨで陰イオン交
換樹脂から溶離する上記１の阻害剤製剤。
【００５８】９．阻害剤が、約３０〜５０％のアセトニ
トリル濃度でＣ１／Ｃ８逆相樹脂から溶離する上記１の
阻害剤製剤。
トリル濃度でＣ１／Ｃ８逆相樹脂から溶離する上記１の
阻害剤製剤。
【００５９】１０． Ａ． ＨＬ−６０細胞系から得る
ことができ、 Ｂ． ゲル瀘過クロマトグラフィーで測定される場合に
１０，０００ダルトン及び３０，０００ダルトンの間の
分子量を有し、 Ｃ． インターロイキン６依存性細胞系のインターロイ
キン６依存性増殖を抑制することが可能であり、 Ｄ． シバクロンブルー・リンクト樹脂に結合可能であ
りかつ該樹脂から溶離可能であり、 Ｅ． 陰イオン交換樹脂樹脂に結合可能でありかつ該樹
脂から溶離可能であり、 Ｆ． 逆相樹脂に結合可能でありかつ該樹脂から溶離可
能である、ことにより特性決定される阻害剤を含んでな
る阻害剤製剤。
ことができ、 Ｂ． ゲル瀘過クロマトグラフィーで測定される場合に
１０，０００ダルトン及び３０，０００ダルトンの間の
分子量を有し、 Ｃ． インターロイキン６依存性細胞系のインターロイ
キン６依存性増殖を抑制することが可能であり、 Ｄ． シバクロンブルー・リンクト樹脂に結合可能であ
りかつ該樹脂から溶離可能であり、 Ｅ． 陰イオン交換樹脂樹脂に結合可能でありかつ該樹
脂から溶離可能であり、 Ｆ． 逆相樹脂に結合可能でありかつ該樹脂から溶離可
能である、ことにより特性決定される阻害剤を含んでな
る阻害剤製剤。
【００６０】１１．阻害剤が、約８００ｍＭより高いＮ
ａＣｌ濃度でそして約６．５〜７．５のｐＨでシバクロ
ンブルー樹脂から溶離する上記１０の阻害剤製剤。
ａＣｌ濃度でそして約６．５〜７．５のｐＨでシバクロ
ンブルー樹脂から溶離する上記１０の阻害剤製剤。
【００６１】１２．阻害剤が、約１４０ｍＭより高いＮ
ａＣｌ濃度でそして約７．０〜８．０のｐＨで陰イオン
交換樹脂から溶離する上記１０の阻害剤製剤。
ａＣｌ濃度でそして約７．０〜８．０のｐＨで陰イオン
交換樹脂から溶離する上記１０の阻害剤製剤。
【００６２】１３．阻害剤が、約３０〜５０％のアセト
ニトリル濃度でＣ１／Ｃ８逆相樹脂から溶離する上記１
０の阻害剤製剤。
ニトリル濃度でＣ１／Ｃ８逆相樹脂から溶離する上記１
０の阻害剤製剤。
【００６３】１４．トリプシンを用いる処理により、増
殖の抑制が５０倍より大きく低減される上記１０の阻害
剤製剤。
殖の抑制が５０倍より大きく低減される上記１０の阻害
剤製剤。
【００６４】１５．シクロヘキシミドと該ＨＬ−６０細
胞のインキュベーションにより、増殖の抑制が除去され
た上記１０の阻害剤製剤。
胞のインキュベーションにより、増殖の抑制が除去され
た上記１０の阻害剤製剤。
【００６５】１６．１００℃で１５分間の加熱により、
増殖の抑制が影響されない上記１０の阻害剤製剤。
増殖の抑制が影響されない上記１０の阻害剤製剤。
【００６６】１７．酸を用いる処理により増殖の抑制が
２倍に等しいか或いは２倍り大きく低減される上記１０
の阻害剤製剤。
２倍に等しいか或いは２倍り大きく低減される上記１０
の阻害剤製剤。
【００６７】１８．インターロイキン６依存性細胞系が
Ｂ９である上記１０の阻害剤製剤。
Ｂ９である上記１０の阻害剤製剤。
【００６８】１９．ＨＬ−６０細胞がホルボールジエス
テル類で処理される上記１０の阻害剤製剤。
テル類で処理される上記１０の阻害剤製剤。
【００６９】２０．インターロイキン６阻害剤の産生を
誘発するのに十分な条件下で、ＨＬ−６０細胞をホルボ
ールエステル類と接触させる工程を含んでなる上記１の
阻害剤の調製方法。
誘発するのに十分な条件下で、ＨＬ−６０細胞をホルボ
ールエステル類と接触させる工程を含んでなる上記１の
阻害剤の調製方法。
【図１】ＨＬ−６０細胞中のＩＬ−６阻害剤の誘発を表
すグラフである。
すグラフである。
【図２】Ｕ３７３細胞の増殖に対するＩＬ−６阻害剤の
効果を表すグラフである。
効果を表すグラフである。
【図３】細胞密度及びＰＭＡ濃度の最適化を表すグラフ
である。
である。
【図４】ＨＬ−６０上澄みのスパロース（Ｓｕｐｅｒｏ
ｓｅ）１２（商標）ＨＲ １０／３０クロマトグラフィ
ーによる溶離パターンを表すグラフである。
ｓｅ）１２（商標）ＨＲ １０／３０クロマトグラフィ
ーによる溶離パターンを表すグラフである。
【図５】ＨＬ−６０上澄みのモノ（Ｍｏｎｏ）Ｑ（商
標）クロマトグラフィーによる溶離パターンを表すグラ
フである。
標）クロマトグラフィーによる溶離パターンを表すグラ
フである。
【図６】ＨＬ−６０上澄みのブルー・セファロース（Ｂ
ｌｕｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）（商標）クロマトグラフ
ィーによる溶離パターンを表すグラフである。
ｌｕｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）（商標）クロマトグラフ
ィーによる溶離パターンを表すグラフである。
【図７】ブルー・セファロース（Ｂｌｕｅ Ｓｅｐｈａ
ｒｏｓｅ）（商標）クロマトグラフから溶離したＨＬ−
６０阻害活性物の逆相クロマトグラフィーによる溶離パ
ターンを表すグラフである。
ｒｏｓｅ）（商標）クロマトグラフから溶離したＨＬ−
６０阻害活性物の逆相クロマトグラフィーによる溶離パ
ターンを表すグラフである。
【図８】逆相クロマトグラフィーで単離したＨＬ−６０
阻害活性物の逆相クロマトグラフィーによる溶離パター
ンを表すグラフである。
阻害活性物の逆相クロマトグラフィーによる溶離パター
ンを表すグラフである。
【図９】ＨＬ−６０阻害剤の熱処理を表すグラフであ
る。
る。
【図１０】ＨＬ−６０阻害剤のトリプシン消化を表すグ
ラフである。
ラフである。
【図１１】ＨＬ−６０阻害剤の酸処理を表すグラフであ
る。
る。
【図１２】ＨＬ−６０阻害剤の合成に対するシクロヘキ
シミドの効果を表すグラフである。
シミドの効果を表すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 スーザン・ケイ・フアリス アメリカ合衆国カリフオルニア州94110サ ンフランシスコ・アパートメント１・ドロ レスストリート1289 (72)発明者 ケネス・ジエイ・レンバツク アメリカ合衆国カリフオルニア州94526ダ ンビル・パークヒルロード662
Claims (4)
- 【請求項１】 ヒトインターロイキン６依存性細胞機能
のヒト阻害剤を含んでなる、天然起源の阻害剤製剤。 - 【請求項２】 製剤がＨＬ−６０細胞から誘導される請
求項１記載の製剤。 - 【請求項３】 Ａ． ＨＬ−６０細胞系から得ることが
でき、 Ｂ． ゲル瀘過クロマトグラフィーで測定される場合に
１０，０００ダルトン及び３０，０００ダルトンの間の
分子量を有し、 Ｃ． インターロイキン６依存性細胞系のインターロイ
キン６依存性増殖を抑制することが可能であり、 Ｄ． シバクロンブルー・リンクト樹脂に結合可能であ
りかつ該樹脂から溶離可能であり、 Ｅ． 陰イオン交換樹脂樹脂に結合可能でありかつ該樹
脂から溶離可能であり、 Ｆ． 逆相樹脂に結合可能でありかつ該樹脂から溶離可
能である、 ことにより特性決定される阻害剤を含んでなる阻害剤製
剤。 - 【請求項４】 インターロイキン６阻害剤の産生を誘発
するのに十分な条件下で、ＨＬ−６０細胞をホルボール
エステル類と接触させる工程を含んでなる請求項１記載
の阻害剤の調製方法。
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