JP2002507580A - 炎症媒介物質のアンタゴニスト - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 【解決手段】 本発明は、炎症性関節症又は炎症性疾患の治療又は予防用の医薬を製造における抗体又は小分子のようなＯＳＭのアンタゴニストの使用及びこのようなアンタゴニストのスクリーニングにおけるＯＳＭの使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】

本発明は、炎症性関節症又は炎症性疾患の治療又は予防のための医薬の製造に
おけるＯＳＭのアンタゴニストの使用、及びこのようなアンタゴニストのスクリ
ーニング法に関する。

【０００２】

【従来の技術】

慢性関節リウマチ（ＲＡ）は、滑膜の過形成及び単核細胞と多形核白血球（Ｐ
ＭＮ）による著しい細胞の浸潤を特徴とする関節性連結（ａｒｔｉｃｕｌａｒ
ｊｏｉｎｔｓ）に影響を及ぼす慢性炎症性疾患である。固有の細胞種と浸潤した
細胞種との複雑で、よく分かっていない相互作用が、メタロプロテアーゼ（ＭＭ
Ｐ）の慢性的な分泌を引き起こし、関節の軟骨、靭帯、及び肋軟骨下骨の破壊を
もたらす（Ｆｉｒｅｓｔｅｉｎ ＧＳ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ
Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ．４：３４８−５４，１９９２）。ＲＡ関節の病理
学を引き起こすと推測されている数多くの炎症促進性サイトカイン（ｐｒｏ−ｉ
ｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｃｙｔｏｋｉｎｅ）の中で、ＴＮＦαが中心的な役割
を果たしていることが示され、抗ＴＮＦα療法が明確な有益性を示している（Ｅ
ｌｌｉｏｔｔ ＭＪ． ｅｔ ａｌ． Ｌａｎｃｅｔ．３４４（８９３０）：１
１０５−１０，１９９４）。ＴＮＦαは、ＭＭＰｓの誘導（Ｄａｙｅｒ ＪＭ．
ｅｔ ａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃ
ｉｎｅ． １６２（６）：２１６３−８，１９８５）、他の炎症促進性サイトカ
インのアップレギュレーション（Ｈａｗｏｒｔｈ Ｃ． ｅｔ ａｌ． Ｅｕｒ
ｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２１（１０）：２
５７５−９，１９９１ ａｎｄ Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ ＣＡ． ｅｔ ａｌ．
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．１６３
（６）：１４３３−５０，１９８６）、及びＰＭＮの接着の増加及び内皮細胞透
過性細胞移動の増加（Ｓｍａｒｔ ＳＪ． Ｃａｓａｌｅ ＴＢ Ａｍｅｒｉｃ
ａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．２６６：Ｌ２３８−４５
，１９９４）を含む幾つかの病理的効果を媒介する。現在、ＴＮＦαは、炎症促
進性サイトカインカスケードの初発因子と考えられているが、その正の制御に関
しては、相対的に殆ど知られていない（Ｆｅｌｄｍａｎｎ Ｍ． ｅｔ ａｌ．
Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．１４：３９７−
４４０，１９９６）。

【０００３】 オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）（Ｒｏｓｅ ＴＭ． Ｂｒｕｃｅ ＡＧ． ＰＮ
ＡＳ ＵＳＡ ８８（１９）：８６４１−５，１９９１）は、ＩＬ−６、ＩＬ−
１１、白血病増殖阻止因子（ＬＩＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、及び
カルジオトロフィン１（ＣＴ−１）（Ｔａｇａ Ｔ． Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ Ｔ
． Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．１５：７９７
−８１９，１９９７）を含むサイトカインファミリーに属する２８ｋＤａの糖タ
ンパク質である。全てのメンバーは、ヘテロおよびホモダイマー受容体の複合フ
ァミリーの一員として、共通のシグナリング鎖ｇｐ１３０を有する（Ｇｒｏｔｚ
ｉｎｇｅｒ Ｊ． ｅｔ ａｌ． ［Ａｒｔｉｃｌｅ］ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．
２７（１）：９６−１０９，１９９７）。ＯＳＭは、ＬＩＦと共通のヘテロダイ
マー受容体（ＬＩＦｒ：ｇｐ１３０、タイプＩ）を共有し、ＯＳＭｒβ鎖及びｇ
ｐ１３０（タイプＩＩ）を含むそれ自身の固有の受容体も有する（Ｍｏｓｌｅｙ
Ｂ． ｅｔ ａｌ．［Ａｒｔｉｃｌｅ］ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏ
ｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２７１（５１）：３２６３５−３２６４３，
１９９６）。ＯＳＭは、細胞の増殖と分化に対する効果が以前から知られていた
（Ｈｏｒｎ Ｄ． ｅｔ ａｌ［Ｊｏｕｒｎａｌ Ａｒｔｉｃｌｅ］ Ｇｒｏｗ
ｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ．２（２−３）：１５７−６５，１９９０）。最近、ＯＳ
Ｍは、インビボでマウスに対して強力な炎症促進特性を有することも示され（Ｍ
ｏｄｕｒ Ｖ． ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ． １００：１
５８−１６８，１９９７）、ＩＬ−１との強力な協働作用によってエクソビボの
モデル系において関節の軟骨の分解を促進することが実証されている（Ｃａｗｓ
ｔｏｎ Ｔ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ＆ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓ
ｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ．２１５（１）：３７７−８５，１
９９５）。

【０００４】 ＯＳＭは、内皮細胞に延長したＰ−セレクチン（及びＥ−セレクチン）の増加
を誘導し（Ｙａｏ Ｌ． ｅｔ ａｌ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉ
ｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ． １８４（１）：８１−９２，１９９６）、
ヒト滑液繊維芽細胞中のウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子の活性を刺
激し（Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ＆
Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ．
１８０（２）：６５２−９、１９９１）、内皮細胞からのＩＬ−６の強力な誘
導物質である（Ｂｒｏｗｎ Ｔｊ． ｅｔ ａｌ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉ
ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ． １４７（７）：２１７５−８０，１９９１ Ｏｃｔ１）
。ＯＳＭは、最近、ＲＡの滑液及び滑膜中で計測されたが、ＯＡの滑液及び滑膜
では計測されず（Ｈｕｉ Ｗ． ｅｔ ａｌ． Ａｎｎａｌｓ Ｏｆ Ｔｈｅ
Ｒｈｅｕｍａｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ．５６（３）：１８４−１８７，１９９
７）、その産生は、マクロファージに限局していた（１９９７、Ｏｋａｍｏｔｏ Ｈ ｅｔ ａｌ． Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ ４
０（６）：１０９６−１１０５）及びＣａｗｓｔｏｎら（１９９８，Ａｒｔｈｒ
ｉｔｉｓ ａｎｄ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ ４１（１０）：１７６０−１７７１
）。現在まで、この分野におけるさらなる実験は、ＩＬ−６サブファミリーのメ
ンバーの類似性に基づく推論的なものである（Ｃａｒｒｏｌｌ Ｇ． ｅｔ ａ
ｌ Ｉｎｆｌａｍｍ．Ｒｅｓ．４７（１９９８）１−７）。

【０００５】

【発明の実施の形態】

本発明者らは、ＯＳＭがマクロファージでＴＮＦα分泌を誘導し得ることを発
見した。ＯＳＭは、ＭＭＰ−１と複合体を形成してこれを不活化し、それ故、コ
ラーゲンの放出を減少させると予想される組織メタロプロテアーゼ阻害剤−１（
ＴＩＭＰ−１）の産生をアップレギュレートすることを示唆する最近のデータ（
Ｎｅｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ １９９６， Ａ＆Ｒ ３９（４），５６０−５６６
）に反して、ＯＳＭがＴＮＦα分泌を誘導するという本発明者らの発見は、ＯＳ
Ｍが実際に軟骨の破壊を媒介する役割を果たしているかもしれないということを
示唆していた。この発見に基づいて、本発明者らは、他のＩＬ−６ファミリーの
メンバーを阻害することなく中和抗ＯＳＭ抗体の治療的投与だけで、マウスモデ
ルのコラーゲン誘発性関節炎を改善することができることを実証した。その後、
ＴＮＦαとＯＳＭの協働作用により、軟骨からのコラーゲンの放出が促進される
ことが、Ｔ．Ｃａｗｓｔｏｎらによって示された（１９９８、Ａｒｔｈｒｉｔｉ ｓ ａｎｄ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ，４１（１０）１７６０−１７７１）。

【０００６】 それ故、本発明によれば、炎症性関節症又は炎症性疾患の治療又は予防のため
の医薬の製造におけるＯＳＭのアンタゴニストの使用が提供される。とりわけＯ
ＳＭのアンタゴニストの使用は、軟骨からのコラーゲンの放出を阻害又は抑制す
るための医薬の製造においてなされる。本発明は、さらに、有効量のＯＳＭアン
タゴニストをこのような疾患に罹患した患者に投与することを備えた炎症性関節
症又は炎症性疾患の治療又は予防法を提供する。

【０００７】 アンタゴニストは、ＯＳＭとＯＳＭ受容体ｇｐ１３０又は他のＯＳＭ受容体、
ＯＳＭｒβ鎖若しくはＬＩＦｒとの相互作用を阻害し、あるいはこれらのタンパ
ク質のヘテロダイマーの形成を阻害し、このようにＯＳＭの結合とシグナリング
を阻害することにより、炎症促進性サイトカイン及び／又はＭＭＰの合成を減少
させることによって機能し得る。本発明のアンタゴニストは、それ故、ＯＳＭ若
しくは一以上のＯＳＭ受容体の何れかに対するリガンド（ｇｐ１３０、ＯＳＭｒ
β、又はＬＩＦｒ）、又はＯＳＭの生物学的活性に影響を与えるようにこれらの
相互作用を妨害することができる物質であり得る。以下、本明細書において、Ｏ
ＳＭに対するアンタゴニストという語は、ＯＳＭ自身に対するアンタゴニスト又
はその受容体の一つに対する受容体の何れかを意味するものと理解し得る。

【０００８】 本発明者らは、慢性関節リウマチの滑膜血管の内皮には、Ｐ−、及びＥ−セレ
クチンがｇｐ１３０、Ｉ型及びＩＩ型ＯＳＭ受容体のシグナリング要素と共存す
ることも実証した。理論に拘泥するものではないが、このことは、滑膜マクロフ
ァージによって産生されたＯＳＭは、ＲＡ血管内皮に、Ｐ及びＥ−セレクチンの
アップレギュレーションを介した白血球の補充の促進を引き起こさせるかもしれ
ないということを示している。特異的な抗体又はフコイダン（ｆｕｃｏｉｄａｎ
）（Ｌ−セレクチンのアゴニスト）の何れかによるＬ−セレクチンの連結反応が
ヒト単核細胞にＯＳＭの分泌させるという知見は、ＴＮＦαとＰ及びＥ−セレク
チンを作動させるためのＯＳＭのさらなる局部的供給源を与えることによって、
炎症性応答を増幅するという点で極めて重要である。

【０００９】 ＯＳＭとｇｐ１３０との相互作用に重要なアミノ酸残基が同定されている。Ｏ
ＳＭの公表されたアミノ酸配列（Ｍａｌｉｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌ
． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，９（７），２８４７−５３、ＥＭＢＬデータベース
のＤＮＡ配列エントリーＭ２７２８８、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔのタンパク質配列エ
ントリーＰ１３７２５）から、これらはＧ１２０、Ｑ１６及びＱ２０であり、Ｎ
１２３及びＮ１２４も役割を果たしているかもしれない（配列番号１２及び下記
参照）。最初の２５残基は、シグナルペプチドであり、成熟したタンパク質は、
配列ＡＡＩＧＳ（配列番号１３）から始まる。配列は、記載のごとく、成熟した
タンパク質の最初のアミノ酸から番号が付されている。

【００１０】 配列認識番号１２ 1 5 15 25 35 MGVLLTQRTL LSLVLALLFP SMASMAAIGS CSKEYRVLLG QLQKQTDLMQ DTSRLLDPYI 45 55 65 75 85 95 RIQGLDVPKL REHCRERPGA FPSEETLRGL GRRGFLQTLN ATLGCVLHRL ADLEQRLPKA 105 145 115 125 135 155 QDLERSGLNI EDLEKLQMAR PNILGLRNNI YCMAQLLDNS DTAEPTKAGR GASQPPTPTP 165 205 175 185 195 215 ASDAFQRKLE GCRFLHGYHR FMHSVGRVFS KWGESPNRSR RHSPHQALRK GVRRTRPSRK 225 227 GKRLMTRGQL PR それ故、本発明は、さらに、これらの特異的な残基の一以上、及び／又は ＯＳＭ上で規定するのに役立ってＯＳＭの生物活性を変化させる結合部位と相互
作用することができるアンタゴニスト又は物質を提供する。

【００１１】 本発明によって治療し得る炎症性関節症には、慢性関節リウマチ、乾癬性関節
炎、若年性関節炎、炎症性変形性関節症、及び／又は反応性関節炎が含まれる。
治療し得る炎症性疾患には、とりわけ、クローン病、潰瘍性大腸炎、胃炎、例え
ば、Ｈ．ピロリ感染から生じる胃炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患、アルツハイマー
病、多発性硬化症、及び乾癬が含まれる。

【００１２】 ＯＳＭのアンタゴニスト候補には、ＯＳＭと特異的に相互作用する小有機分子
、イオン、例えば、基質、できれば天然の基質、細胞膜の成分、受容体又は天然
のリガンド、その断片、又はペプチド若しくは他のタンパク質性分子が含まれ、
特に好ましいのは、ＯＳＭのＯＳＭ受容体への結合のみならず、修飾されたＯＳ
Ｍ分子の結合も阻害するであろう非シグナリング型ＯＳＭ変異体である。このよ
うなアンタゴニストは、タンパク質又はペプチドをコードするＤＮＡの形態であ
り得、前記アンタゴニストをインビボで発現するために供給され得る。アンタゴ
ニストは、インビボでネイティブのＯＳＭに対して標的化された抗体応答の誘導
を介してＯＳＭに対するアンタゴニスト効果をもたらすようにデザインされた、
このようなタンパク質又はペプチド分子又はＤＮＡを含むワクチンであり得る。
このようなアンタゴニストには、抗体、抗体由来の試薬、又はキメラ分子も含ま
れ得る。アンタゴニストの定義には、このような上記分子のうちの任意の分子の
構造的又は機能的模倣体（ｍｉｍｅｔｉｃ）が含まれる。ＤＮＡ又はＲＮＡアプ
タマーのような核酸分子も想定される。

【００１３】 好ましいアンタゴニストには、小有機分子が含まれる。このような化合物は、
任意のクラスの化合物に由来し得るが、上述した機序のうちの一つを介して、Ｏ
ＳＭの生物活性に影響を与える能力を基礎として選択され、生理的に許容される
、すなわち、無毒性であるか、又は許容可能なレベルの毒性若しくはその他の副
作用を示すであろう。有用なアンタゴニストを与え得る一つのクラスの化合物は
、Ｎ−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンー４イル）ベンズアミド）の
ようなリボヌクレオシドである；（Ｄａｖｏｌｌ ａｎｄ Ｋｅｒｒｉｄｇｅ，
Ｊ．Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．，２５８９，１９６１）。

【００１４】 他の好ましいアンタゴニストには、抗体若しくはその断片、又は抗体若しくは
その断片の結合を模倣するようにデザインされた人工構築物を含む抗体、それら
の断片、又は人工的構築物が含まれる。このような構築物は、Ｔｉｂｔｅｃｈ
１２、３７２−３７９（１９９４）の中でＤｏｕｇａｌｌらによって論述されて
いる。

【００１５】 抗体の定義には、組換えヒト抗体のような組換え抗体も含まれ、これらも使用
し得る。これらの抗体は改変され得る。すなわち、それらは、（ＷＯ８６／０１
５３３に記載されているような）ドナー抗体の可変ドメインとヒト抗体の定常ド
メインを含む「キメラ」抗体であり得、又は（ＥＰ−Ａ−０２３９４００に開示
されているような）抗体の可変ドメインのフレームワークでなくＣＤＲのみが異
なる種に由来する「ヒト化」抗体であり得る。相補性決定領域（ＣＤＲ）は、哺
乳類又は霊長類のモノクローナル抗体に由来し得る。改変された抗体の可変ドメ
インのフレームワーク、及び定常ドメインは、通常ヒトの抗体に由来する。この
ようなヒト化抗体は、ヒトに投与したときに、齧歯類に由来する抗体のような完
全な外来抗体に対してヒトが引き起こす免疫応答に比べて、大きな免疫応答を引
き起こさないはずである。

【００１６】 好ましいアンタゴニストには、完全な抗体、Ｆ（ａｂ’）_２断片、Ｆａｂ断片
、Ｆｖ断片、ＳｃＦｖ断片、他の断片、ＣＤＲペプチド及び模倣体が含まれる。
これらは、当業者によって取得／調製され得る。例えば、Ｆ（ａｂ’）_２及びＦ
ａｂ断片を取得するためには、（ＩｇＧ分子をそれぞれペプシン又はパパイン切
断に供することによる）酵素消化を使用することができる。以下の記載では、「
抗体」という語は、上記の可能性を全て含むものと理解しなければならない。

【００１７】 当業者であれば理解できるであろうが、具体的なタンパク質又はペプチドのア
ンタゴニストが本明細書で記載される場合には、このようなアンタゴニストの誘
導体も使用し得る。「誘導体」という語には、前記アンタゴニストに対して一以
上のアミノ酸が置換、欠失、又は挿入されているが、記載された結合活性をまだ
保有している記載されたアンタゴニストの変形物（ｖａｒｉａｎｔ）も含まれる
。好ましくは、これらの誘導体は、明記したアンタゴニストと実質的に同一のア
ミノ酸配列を有する。

【００１８】 アミノ酸配列の同一性の程度は、任意の二つの配列間の類似性が最良のセグメ
ントを見出すために、「ｂｅｓｔｆｉｔ」（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍ
ａｎ、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ、４
８２−４８９（１９８１））のようなプログラムを用いて計算することができる
。アラインメントは、Ｓｃｈｗａｒｚ ａｎｄ Ｄａｙｈｏｆ（１９７９） Ａ
ｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕ
ｒｅ，Ｄａｙｈｏｆ，Ｍ．Ｏ．，Ｅｄ ｐｐ ３５３−３５８に記載されている
ように、アミノ酸類似性のマトリックスを用いて達成されるスコアを最大にする
ことに基づく。

【００１９】 好ましくは、配列の同一性の程度は、少なくとも５０％、より好ましくは少な
くとも７５％である。少なくとも９０％又は少なくとも９５％の配列同一性が最
も好ましい。しかしながら、様々なアミノ酸は、多くの場合、タンパク質のある
特性を実質的に変化させずに、又はこれに悪影響を与えずに、類似の特性を有す
る他のアミノ酸に置換され得るので、必ずしも高度の配列同一性は必要でないこ
とが、当業者であれば理解できるであろう。これらは、時々、「保存された」ア
ミノ酸変化と称される。このため、アミノ酸グリシン、バリン、ロイシン、又は
イソロイシンは、多くの場合、相互に置換することができ、フェニルアラニン、
チロシン、及びトリプトファン（芳香属側鎖を有するアミノ酸）；リシン、アル
ギニン、及びヒスチジン（塩基性側鎖を有するアミノ酸）；アスパラギン酸及び
グルタミン酸（酸性側鎖を有するアミノ酸）；アスパラギン及びグルタミン（ア
ミド側鎖を有するアミノ酸）、並びにシステイン及びメチオニン（硫黄含有側鎖
を有するアミノ酸）を含む。このように、「誘導体」という語には、配列に対し
て一以上のこのような「保存的」変化を含むアミノ酸配列の変形物も含まれ得る
。

【００２０】 本発明には、記載された結合活性をなお保有した本発明のアンタゴニストの断
片又はそれらの誘導体も含まれる。好ましい断片は、少なくとも１０アミノ酸長
であるが、それよりも長いものであり得る（例えば、５０アミノ酸長まで、又は
１００アミノ酸長まで）。

【００２１】 本発明に使用するのに好ましいＯＳＭのさらなるアンタゴニストは、オリゴヌ
クレオチドリガンドである。指数的濃縮による系統的リガンド開発（ＳＥＬＥＸ
；ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ
ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｅｎｔｉｃｈｍｅｎｔ）は、標的タンパク質又は他の
分子に対する所望の活性について一本鎖オリゴヌクレオチドの莫大なライブラリ
ーをスクリーニングするプロトコールである（Ｔｕｅｒｋ ＆ Ｇｏｌｄ １９
９０ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９，５０５−５１０，Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．１
９９１ Ｍｅｔｈｓ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２ ７５−８６；Ｇｏｌｄ ｅｔ
ａｌ． １９９５ Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ６４，７６３−７９
７；Ｕｐｈｏｆ ｅｔ ａｌ．，１９９６ Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃ
ｔ．Ｂｉｏｌ．６，２８１−２８８）。このスクリーニングの産物は、標的タン
パク質に対して所望の活性、通常は高いアフィニティー結合を有するアプタマー
と呼ばれる単一のオリゴヌクレオチド配列である。ＳＥＬＥＸ操作は、通常、約
１０^１４〜１０^１５個のランダムオリゴヌクレオチド配列からなるＲＮＡ又はＤ
ＮＡライブラリーを用いて開始される。完全にランダム化されたオリゴヌクレオ
チドライブラリーでは、各分子は、その分子のヌクレオチド配列に完全に依存す
るであろう固有の四次構造を示すであろう。このため、標的タンパク質に対して
スクリーニングすれば、そのタンパク質に対するオリゴヌクレオチドの結合親和
性は、オリゴヌクレオチドの形状と前記標的タンパク質上のエピトープとの間の
適合性によって決定されるであろう。莫大な多様性を有するライブラリーから開
始する結果、通常、全体的な構造の相同性を有する他のタンパク質に比して標的
タンパク質に対する選択性を有し、標的タンパク質に対するサブｎＭ親和性を持
ったアプタマーを同定することができるであろう（Ｔｕｅｒｋ ＆ Ｇｏｌｄ
１９９０上記、Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ，１９９１上記；Ｇｏｌｄら、１９９５
上記；Ｕｐｈｏｆら、１９９６上記）。ＳＥＬＥＸ法を用いて、１００を超える
タンパク質及びドーパミン（Ｍａｎｎｉｒｏｎｉ ｅｔ ａｌ，１９９７ Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６，９７２６−９７３４）、サブスタンスＰ（Ｎｉｅ
ｕｗｌａｎｄｔ ｅｔ ａｌ，１９９５ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４，５
６５１−５６５９）、ヒト好中球エラスターゼ（Ｂｌｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，１
９９７ Ｃｕｒｒｅｎｔ ｂｉｏｌ．７，８７７−８８０）、血小板由来増殖因
子（ＰＤＧＦ）（Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ， １９９６ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ ３５，１４４１３−１４４２４）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）（Ｇｒ
ｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．２，６８３−６９５）
、トロンビン（Ｂｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｎａｔｕｒｅ ３５５，５
６４−６６）、及びＬ−セレクチン（Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， １
９９６ ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９３，５８８３−５８８７）を含む小分子に対して
ＲＮＡ又はＤＮＡアプタマーが作成されてきた。

【００２２】 多数のアプタマーが、生物活性、多くの場合、インビトロとインビボの両者で
の受容体拮抗作用又は酵素阻害を有することが実証されている。例えば、ヒト好
中球エラスターゼ（ｈＮＥ）に対して高い親和性と阻害活性を有するＲＮＡアプ
タマーは、混合ＳＥＬＥＸ（Ｂｌｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９９７上記）によっ
て作成された。インビボでの安定性を増加させるためのＳＥＬＥＸ後修飾の後に
、肺炎症のラットモデルでアプタマーをテストした（Ｂｌｅｓｓ ｅｔ ａｌ．
，１９９７上記）。第二の例では、ヒトＬ−セレクチンに対し、該タンパク質に
対してｎＭの親和性を有する４９ヌクレオチド長のＤＮＡアプタマーが作成され
た（Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９９６上記）。該アプタマーは、Ｅ
−セレクチンに比べて６００倍、Ｐ−セレクチンと比べて１０，０００倍のＬ−
セレクチンに対する選択性を示す。該アプタマーのＰＥＧ調合物を静脈内投与す
ることによって、放射能ラベルされたヒトＰＢＭＣのリンパ節への輸送が用量依
存的に阻害されたが、他の臓器への輸送は阻害されなかった（Ｈｉｃｋｅ ｅｔ
ａｌ．，１９９６ Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．９８，２６８８−２６
９２）。第三の例では、脈管形成におけるＶＥＧＦの役割を調べるために、高親
和性のＲＮＡアプタマーが、ヒトＶＥＧＦに対して作成された（Ｊｅｌｌｉｎｅ
ｋ ｅｔ ａｌ．， １９９４ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３，１０４５０
−１０４５６；Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５；Ｒｕｃｋｍａｎ ｅｔ
ａｌ．，１９９８．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２７３，２０５５６−２０５６７
；Ｗｉｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９８ Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．９
，５７３−５８２）。ＶＥＧＦアプタマーのリポソーム調合物は、ＶＥＧＥによ
って誘導されるインビトロでの内皮細胞の増殖とインビボでの血管透過性の増加
及び脈管形成を阻害した（Ｗｉｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９８上記）。それ
故、本発明に使用するためのＯＳＭのオリゴヌクレオチドリガンド又はＯＳＭ受
容体（ＯＳＭＲ、ＬＩＦＲ、ｇｐ１３０）が提供される。

【００２３】 本発明に使用する上記アプタマーを作成するためには、ＯＳＭ又は受容体をま
ず、スクリーニング用のプレートに結合させなければならない。続いて、Ｆｉｔ
ｚｗａｔｅｒとＰｏｌｉｓｋｙに従って（Ｍｅｔｈｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．
２６７，２７５−３０１）、ヒトＯＳＭに対するＲＮＡ又はＤＮＡアプタマーを
作成するために、選別と増幅のラウンド（すなわち、ＳＥＬＥＸ操作）の繰り返
しを行うことができる。ＲＮＡが最も大きな構造的多様性を与え、それ故、高親
和性分子を作成する可能性を与えるので、これらのアプタマーは、典型的には修
飾されたＲＮＡアプタマーである。高親和性アプタマーの作成に続いて、アプタ
マーの安定性を増加させるために、アプタマー（典型的には、アプタマーは、１
００マー以下である）を固相合成により適したコア配列に末端切断することによ
り、合成コストを下げるために、及びインビボで使用するための調合物を開発す
るために多数のポストＳＥＬＥＸ至適化プロトコールを実施し得る。

【００２４】 これらの操作の初めに、アプタマーは、活性に必要なコア配列まで分子の長さ
を減らすために末端切断され得る。多くの場合２０〜４０ヌクレオチド長の間の
短いコア配列は、合成するのが安価且つ早く、増加した生体利用性を有し得る。
コア配列の組成物に関する情報は、配列の相同性の比較から取得し得る。

【００２５】 しかしながら、末端切断実験では、活性が生じるのに必要とされる最少の配列
まで、連続的により短いアプタマーを合成するのが普通である。これには、通常
、固定された配列を除去することが含まれるが、固定された配列中のヌクレオチ
ドがアプタマーの親和性に寄与する例が多数存在する（Ｆｉｔｚｗａｔｅｒ ａ
ｎｄ Ｐｏｌｉｓｋｙ，１９９６上記；Ｒｕｃｋｍａｎ Ｊ， ｅｔ ａｌ（１
９９８） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，２０５５６−２０５６７．Ｇｒｅ
ｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５上記）。それ故、本発明は、選択されたアプタマ
ーの末端切断されたバージョン又は伸長されたバージョンであるアプタマー又は
選択されたアプタマーの配列と７０％を超える相同性を示すアプタマーを提供し
得る。

【００２６】 末端切断に続いて、リボヌクレアーゼ切断に対する保護によって、アプタマー
の安定性を向上させるために、多数の塩基の修飾実験を行い得る。インビトロ転
写に使用されるＴ７ポリメラーゼはこの修飾を耐えられないと思われるので、Ｓ
ＥＬＥＸの間には、２’修飾されたプリン塩基を含有させることはできない。こ
のため、ＳＥＬＥＸ後にアプタマーの安定性を増加させるためには、アプタマー
中のプリン塩基と２’修飾されたプリンとを置換するのが普通である。この修飾
は、通常、２’−０−メチルプリンの使用によって行われるが、２’−アミノプ
リン、又は２’−フルオロプリンを含む他の修飾されたプリンを使用してもよい
（Ｒｕｃｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８上記；Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，
１９９５上記）。ＳＥＬＥＸ後の該修飾は、親和性の喪失ももたらし得るので、
連続的な態様でこれを行わなければならない（Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９
９５上記）。

【００２７】 末端切断と安定化に続いて、化学的固体規模（ｓｏｌｉｄ ｓｃａｌｅ）の合
成によって合成され得る短い完全に修飾されたアプタマーを極めて大量に作成す
ることができる。アプタマーの５’末端には、アプタマーの使用を容易にするた
めに、又はインビボ供給用にアプタマーを調合するために、多くの分子を付加す
ることができる。これには、イメージングを助けるための被封入部分（ｃａｇｅ
ｄ ｍｏｉｅｔｙ）（Ｈｎａｔｏｗｉｃｈ Ｄ．Ｊ．（１９９６）Ｑ．Ｊ．Ｎｕ
ｃｌ．Ｍｅｄ．４０，２０２−８）、分子の検出を助けるためのフルオレセイン
（Ｇｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８ Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ． ７０，４５
４０−５）、リポソームへの挿入を助けるための脂肪基（Ｗｉｌｌｉｓ ｅｔ
ａｌ．，１９９８上記）、又は小分子薬物又はペプチドへの抱合（Ｃｈａｒｌｔ
ｏｎ Ｊ， ｅｔ ａｌ（１９９７ｂ）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６，３０
１８−３０２６）が含まれる。一般的には、アプタマーの５’末端への分子の付
加は、親和性又は特異性の喪失をもたらさない。

【００２８】 インビボでの半減期を向上させるために、アプタマーは、ポリエチレングリコ
ール（ＰＥＧ）分子の付加、又はリポソームへの取りこみによって修飾されてき
た。何れの場合でも、このような修飾は、インビボでの半減期の顕著な増加を引
き起こし得る（Ｗｉｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ，１９９８上記）。

【００２９】 リポソームとの調合に加えて、インビボでの血清安定性を増加させるために、
アプタマーは、２０ＫのＰＥＧと４０ＫのＰＥＧの両者と調合されてきた。ヒト
Ｌ−セレクチンに対してＤＮＡアプタマーが作成されてきた。インビボ安定性を
増加させるために、Ｎ末端のアミン部分を介して２０ＫのＰＥＧエステルがアプ
タマーに連結された。ＰＥＧ抱合アプタマーは、インビボでＳＣＩＤマウス中の
Ｌ−セレクチン依存性リンパ球の輸送を阻害することが実証された（Ｈｉｃｋｅ ｅｔ ａｌ．，１９９６上記）。それ故、本発明に使用するための、アプタマ
ーと担体分子、例えばＰＥＧとのコンジュゲートが提供される。この態様では、
アプタマーと担体は、例えば、Ｎ末端アミン部分を介して連結されるであろう。
加えて、アプタマーと輸送分子、例えばリポソームを含む本発明に使用するため
の調合物又は組成物が提供される。この態様では、アプタマーと担体の間には結
合はなくてもよく、アプタマーは、単に、担体全体に封入され、分散され、又は
分配され得る。

【００３０】 本研究で単離されたアプタマーは、血清、組織、又は他のエクソビボ試料中の
ヒトＯＳＭの存在を検出するための診断用分子として使用するために、又はイン
ビボでの全身イメージング研究でのヒトＯＳＭの検出のためにも修飾され得る（
Ｃｈａｒｌｔｏｎ Ｊ，ｅｔ ａｌ（１９９７） Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ
Ｂｉｏｌｏｇｙ ４，８０９−８１６．：Ｈｎａｔｏｗｉｃｈ，１９９６上記
）。ＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓ
ｏｒｔｉｎｇ）（Ｄａｖｉｓ ＫＡ．Ｅｔ ａｌ（１９９６）Ｎｕｃ． Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓ．２４，７０２−６．；Ｃｈａｒｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９
７上記）、ＥＬＯＮＡ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｉｎｋｅｄ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏ
ｔｉｄｅ Ａｓｓａｙｓ）アッセイ（Ｄｒｏｌｅｔ ＤＷ，ｅｔ ａｌ（１９９
６） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４，１０２１−１０２５）、及び他の
診断用途のような利用のための蛍光検出を補助するために、フルオレセイン又は
他の蛍光性検出基を、アプタマー分子の５’末端に付加することができる。ＭＡ
Ｇ３（Ｆｒｉｔｚｂｅｒｇ Ａ．Ｒ．， ｅｔ ａｌ Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ
１９８６：２７，１１１−６）のようなテクネチウム−９９ｍ（Ｔｃ９９ｍ）キ
レーティングペプチドケージの出現は、標的タンパク質の存在をインビボでイメ
ージングするために、広範な分子（Ｋｕｂｏ Ａ．ｅｔ ａｌ，（１９９８）Ｋ
ａｋｕ Ｉｇａｋｕ ３５，９０９−２８）と巨大分子（Ｔａｉｌｌｅｆｅｒ
Ｒ． ｅｔ ａｌ，（１９９５）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２２，４５３
−６４）の使用を著しく促進した（巨大分子（Ｐａｌｌｅｌａ Ｖ．Ｒ．，ｅｔ
ａｌ（１９９９）Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４０，３５２−６０））。イメージは、
γカメラの補助により可視化され、マウスからヒトまでの様々な種で達成されて
きた。Ｔｃ９９ｍキレーターの最近の修飾によって、穏やかの条件下で、より効
率的且つ安定な分子の標識化が可能となった（Ｈｎａｔｏｗｉｃｈ Ｄ．Ｊ．１
９９８ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ ３９，５６−６４）。一本鎖オリゴヌクレオチドを
放射能ラベルする方法が既に開発されており、このような未修飾の被標識オリゴ
ヌクレオチドのインビボでの挙動が、予備的に調べられている（Ｈｎａｔｏｗｉ
ｃｈ、１９９６上記）。

【００３１】 もちろん、本発明に使用するための全てのペプチド、タンパク質、又は核酸を
ベースとするアンタゴニストは、精製された形態、すなわち、その天然の状態で
、またはその製造の結果の何れかにおいて、このような分子に付随する物質がな
いことが好ましく、とりわけ、純度は、７０％を超えることが好ましく、８０％
又は９０％の純度を超えることがより好ましいことが理解されるであろう。

【００３２】 本発明のアンタゴニストは、単独で、又はステロイド（プレドニゾン等）、シ
クロホスファミド、シクロスポリンＡ、若しくはプリン類縁体（例えば、メトト
レキセート、６−メルカプトプリン等）、若しくは抗リンパ球抗体のような免疫
抑制剤と、あるいは、より好ましくは、ＣＤ４＋Ｔ細胞阻害物質、例えば抗ＣＤ
４抗体（好ましくは、遮断若しくは非除去（ｎｏｎ−ｄｅｐｌｅｔｉｎｇ）抗体
）、抗ＣＤ８抗体、抗ＣＤ２３抗体、ＴＮＦアンタゴニスト、例えば抗ＴＮＦ抗
体若しくはＴＮＦ阻害剤、例えば可溶性ＴＮＦ受容体、若しくはＮＳＡＩＤのよ
うな物質若しくは他のサイトカイン阻害剤のような耐性誘導、抗自己免疫、又は
抗炎症性物質と組合せて使用し得る。

【００３３】 本発明のアンタゴニストの適切な用量は、治療すべき疾病又は疾患、投与経路
、治療すべき個体の年齢及び体重、及びアンタゴニストの性質のような要素に応
じて変わるであろう。特定の用量に拘泥するものではないが、例えば、非経口投
与の場合、一日当り０．０１〜２０ｍｇ／ｋｇの用量の本発明の抗体（又は他の
大分子）（通常、上記の薬学的組成物の一部として存在する）が、典型的な成体
を治療するのに適切であり得ると思われる。より適切には、用量は、０．１〜５
ｍｇ／ｋｇ、例えば、０．１〜２ｍｇ／ｋｇであり得る。適切には、単位用量は
１〜４００ｍｇであるだろう。小有機分子の適切な用量は同様であり、オリゴヌ
クレオチドリガンドの適切な用量は、例えば０．１〜１０ｍｇ／ｋｇであるだろ
う。

【００３４】 本発明は、さらに、薬学的に許容される担体又は賦形剤、及び活性成分として
、本発明のアンタゴニスト、及び必要に応じて上述した他の治療剤を含む薬学的
組成物を提供する。本発明のアンタゴニスト、及びその薬学的組成物は、非経口
投与、すなわち、皮下、筋肉内、又は静脈内投与に特に有用であるが、アンタゴ
ニストの性質によっては、口腔、吸入、鼻内、局所又は関節内のような他のルー
トがより適切かもしれない。

【００３５】 経口投与用の組成物は、一般に、許容される担体、好ましくは水性担体に溶解
されたアンタゴニスト又はそのカクテルの溶液を含むであろう。様々な水性担体
、例えば、水、緩衝化された水、０．４％生理食塩水、０．３％グリシンなどを
使用することができる。これらの溶液は滅菌されており、一般的には、粒状物が
存在しない。これらの組成物は、従来の良く知られた滅菌手法によって滅菌し得
る。前記組成物は、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、毒性調整剤等、例えば、酢酸ナトリ
ウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウム等のよ
うな生理的条件に近似するのに必要とされる薬学的に許容される補助的物質を含
有し得る。これらの調合物中の抗体又は他のアンタゴニストの濃度は、例えば、
約０．５重量％未満から、通常の約１重量％又は少なくとも１重量％、１５又は
２０重量％まで、大きく変わることができ、選択した投与様式に従って、主とし
て、液体の容積、粘度等に基づいて選択されるであろう。

【００３６】 このように、筋肉内投与用の典型的な薬学的組成物は、１ｍＬの滅菌した緩衝
化された水、及び５０ｍｇのアンタゴニストを含有するように作成され得る。静
脈内注入用の典型的な組成物は、２５０ｍＬの滅菌リンゲル溶液、及び１５０ｍ
ｇの抗体、又は本発明の他のアンタゴニストを含有するように作成され得る。非
経口的に投与可能な組成物を調製する実際の方法は、当業者に公知、又は明白で
あると思われ、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍｃｅｕｔｉｃａｌ
Ｓｃｉｅｎｃｅ，１５ｔｈ ｅｄ．， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃ
ｏｍｐａｎｙ， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ（１９８０）に、
より詳細に記載されている。核酸アンタゴニスト用の適切な調合物は、上述され
ている。

【００３７】 抗体のような本発明のタンパク質アンタゴニストは、保存のために凍結乾燥す
ることができ、使用前に、適切な担体中で再生される。この手法は、従来の免疫
グロブリンによって有効であることが示されている。任意の適切な凍結乾燥及び
再生手法を利用することができる。当業者であれば、凍結乾燥及び再生が、様々
な程度の抗体活性の喪失をもたらし得ること（例えば、従来の免疫グロブリンを
用いると、ＩｇＭ抗体は、ＩｇＧ抗体に比べて、より大きな活性の喪失を有する
傾向がある）、及び使用レベルは補償のために調節しなければならないかもしれ
ないことを理解できるであろう。

【００３８】 単一の又は複数回の組成物の投与は、治療に当たる医師によって選択されてい
る用量レベルとパターンで実施することができる。どのような場合でも、薬学的
調合物は、患者を有効に治療するのに十分な量の本発明の抗体間又は他のアンタ
ゴニストを与えなければならない。

【００３９】 本発明の範囲には、ＯＳＭに結合するある物質が、炎症性疾患の治療に有用で
あり得るかどうかを決定するためのアッセイが含まれる。本発明には、それ故、
試験物質とＯＳＭを混合する工程、及び前記物質がＯＳＭとＯＳＭ受容体との相
互作用を妨害することができるかどうか、又はマーカー分子の識別的遺伝子発現
を通じてＯＳＭの生物活性に影響を与えるかどうかを決定する工程とを備えたＯ
ＳＭのアンタゴニストを同定するためのアッセイも含まれる。

【００４０】 上記本発明に使用するアンタゴニストを選別するためには、まずＯＳＭ、担体
上に存在する、若しくは結合部位が規定された（ｄｅｆｉｎｅｄ）態様の上記Ｏ
ＳＭの中心的結合残基（‘ＯＳＭ結合部分’）、又はＯＳＭ授与体を得なければ
ならない。ヒトＯＳＭをコードするｃＤＮＡは、ＥＭＢＬ配列に基づいて（受付
番号Ｍ２７２８８）合成的に作成され、適切な発現用ビークル中にクローニング
し、大腸菌のような適切な宿主を形質転換するために使用され得る。続いて、培
地からヒトＯＳＭタンパク質を精製し、スクリーニングのためにプレートに結合
される。

【００４１】 ＯＳＭ、ＯＳＭ結合部分、及び／又はＯＳＭ受容体は、例えば、細胞、無細胞
調製物、化学的ライブラリー、及び天然産物の混合物中で、小分子基質およびリ
ガンドの結合を評価するために使用され得る。それ故、本発明はＯＳＭのアンタ
ゴニストを同定するためのアッセイであって、ＯＳＭと試験物質を接触させる工
程と、結合を測定する工程とを備えたアッセイを提供する。これらの基質及びリ
ガンドは天然の基質であり得、リガンドは構造的又は機能的模倣体であり得る。
このような分子は、ＯＳＭのアンタゴニストの定義の中に含まれる。スクリーニ
ング法は、高情報量（ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ）を含み得る。例えば、
アンタゴニストをスクリーニングするには、ＯＳＭ受容体を発現している細胞か
ら、合成反応混合物、膜のような細胞コンパートメント、細胞のエンベロープ、
又は細胞壁、又は任意のそれらの調製物を調製し得る。続いて、候補分子の非存
在下又存在下で、該調製物を標識されたＯＳＭとインキュベートする。候補分子
がＯＳＭ受容体に結合する能力は、標識されたＯＳＭの結合の減少に反映される
。無償で、すなわちＯＳＭの機能的効果を誘導せずに結合する分子が、よいアン
タゴニストである可能性が最も高い。このアッセイでは、反対に、未標識のＯＳ
Ｍと共に標識したＯＳＭ受容体を使用してもよい。ＯＳＭアンタゴニストを同定
するために、ＥＬＩＳＡフォーマットを用いたさらなるスクリーニングを使用し
てもよく、そこでは、候補分子が、ｇｐ１３０−Ｆｃ融合タンパク質のようなＯ
ＳＭ受容体コンジュゲートのプレートに固定化されたＯＳＭへの結合を阻害する
能力が測定され、該アッセイにおいては、結合したｇｐ１３０−Ｆｃは、酵素標
識した抗Ｆｃ抗体と比色法アッセイによって検出される。

【００４２】 アンタゴニスト候補の機能的効果は、例えば、候補分子と細胞又は適切な細胞
調製物を相互作用させた後にレポーター系の活性を決定すること、及びその効果
をＯＳＭ又はＯＳＭに対して同じ効果を示す分子の効果と比較することによって
測定し得る。この点で有用であり得るレポーター系には、産物に転換された比色
標識基質、ＯＳＭ受容体の機能的活性の変化に応答するレポーター遺伝子、及び
本分野で公知の結合アッセイが含まれるが、これらに限定されない。

【００４３】 ここで、添付の図面のみを参照しながら例によって、本発明を記載する。

【００４４】 例１：エクソビボでの滑膜組織培養中のＯＳＭの検出 実験１： 滅菌した皮下針を用いて、慢性関節リウマチ、変形性関節症、又はバニオンを
有すると診断された患者から得た切除したばかりの滑膜組織を機械的に切開し、
約１ｍｍ^３の断片を得た。１０％の熱で不活化したＡＢ^＋雄の血清（Ｎｏｒｔｈ
Ｌｏｎｄｏｎ Ｂｌｏｏｄ Ｔａｎｓｆｕｓｉｏｎ Ｃｅｎｔｒｅ）、１０ｍ
Ｍ ｈｅｐｅｓ、１％ ピルビン酸ナトリウム、１％ 非必須アミノ酸（全てシ
グマから購入）、４ｍＭ Ｌ−グルタミン（Ｈｙｌｃｏｎｅ）、１００Ｕ／ｍＬ
のペニシリン＋１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を補
充したＲＰＭＩ １６４０（Ｓｉｇｍａ）（完全ヒト培地；ＣＨＭ）を添加した
９６穴の組織培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ）上の扁平な底部の２００μＬウェル
の中にこれらを置き、３７℃でインキュベートした。

【００４５】 第０、２、５、及び９日目に、１００μＬ／ウェルの培養上清試料を採集し、
２０℃で凍結した後、ＥＬＩＳＡによるＯＳＭの試験を行った（Ｑｕａｎｔｉｋ
ｉｎｅ Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）。データが図１に示されている。分泌された
ＯＳＭは、ＲＡ由来の滑膜試料中に検出されたが、変形性関節症又は非関節症の
対照患者由来の滑膜から得た試料中には検出されなかった。ＲＡ組織培養中のＯ
ＳＭレベルは、インキュベーションの５日目付近で最大であり、およそ１４００
ｐｇ／ｍＬの濃度に達し、９日目でも、なお８００ｐｇ／ｍＬを超えていた。

【００４６】 実験２： 滑膜組織をＰＢＳ中で洗浄し、脂肪組織を除去した。組織を小さな（１−４ｍ
ｍ）断片に切断するために滅菌した鋏を使用した。この組織は、使用前にＰＢＳ
中で洗浄した。該組織を秤量し、２４又は４８穴プレート（Ｃｏｓｔａｒ）中に
、１００ｍｇ／ｍＬで直接プレートした。３７℃及び５％ＣＯ_２下において、１
０％の加熱により不活化したＡＢ＋ヒト血清（シグマ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミ
ン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、２００Ｕ／ｍＬのペニシリン及び
２００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ
）、４８０Ｕ／ｍＬナイスタチン（シグマ）、５０μｇ／ｍＬゲンタマイシン（
Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、及び１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（Ｓｉｇｍ
ａ）が補充された、濾過滅菌したダルベッコの修正イーグル培地（シグマ）１．
５ｍＬ中で該組織を培養した。３日目に、上清を取り出し、対を成す抗体（Ｒ＆
Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、ＥＬＩＳＡ中でＯＳＭを試験した。

【００４７】 ＲＡ又は炎症性ＯＡを有する患者の膝の生検から得た滑膜組織培養物は、自発
的にＯＳＭを分泌する。３日間のインキュベーション期間後に、ＲＡ培養物から
の培養上清中のＯＳＭの平均レベルは２４６ｐｇ／ｍＬであり（レンジ３０〜９
８２、ｎ＝１２）、ＯＡ培養物からのＯＳＭの平均レベルは４７３ｐｇ／ｍＬ（
レンジ４４〜２００１、ｎ＝１４）であった。ＯＳＭは、炎症によって分泌され
たが、静止状態の滑膜組織によっては分泌されなかった（図２）。

【００４８】 例２ａ：ＴＨＰ−１細胞の分化 ヒトの前単球系ＴＨＰ−１細胞（ＥＣＡＣＣ）を一週間に二回、１０％の加熱
により不活化したＦＣＳ、１０ｍＭ ｈｅｐｅｓ、１％ 非必須アミノ酸（全て
Ｓｉｇｍａから購入）、４ｍＭ Ｌ−グルタミン（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００Ｕ
／ｍＬのペニシリン＋１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｈｙｃｌｏｎｅ
）（完全培地；ＣＭ）を補充したＲＰＭＩ中で経代した後、洗浄した細胞に１μ
ｇ／ｍＬのＰＭＡ（Ｓｉｇｍａ）を添加し、３７℃で３０分間インキュベートし
た。予め加温したＰＢＳ中で細胞を３回洗浄し、ＣＭ中に再懸濁し、９６穴の扁
平な底部のプレート（Ｃｏｓｔａｒ）中に、１．５×１０^５細胞／ｍＬで播種し
た。プレートを３７℃、５％ＣＯ_２で４８時間インキュベートした後、ＰＢＳで
洗浄し、培地を交換し、さらに２４時間インキュベートした。使用前に、細胞を
１回ＰＢＳ中で洗浄した。

【００４９】 例２ｂ：ＩＦＮγ刺激された血液単球の調製 ＰＢＳでヒトのバフィコート（Ｎｏｒｔｈ Ｌｏｎｄｏｎ Ｂｌｏｏｄ Ｔｒ
ａｎｓｆｕｓｉｏｎ Ｃｅｎｔｒｅ）を１：３に希釈し、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ
（Ｎｙｃｏｍｅｄ ＵＫ）上に重層し、室温で３０分間６００×ｇで遠心した。
採集したＰＢＭＣをＰＢＳ中で３回洗浄し、計数し、５×１０^６細胞／ｍＬにな
るように、８０ｍＬのＲＰＭＩ １６４０／１０％ＦＣＳ中に再懸濁した。２０
ｍＬを４つの１７５ｃｍ^２の各フラスコ中に置き、３７℃で一晩インキュベート
し、単球を接着せしめた。非接着性細胞を捨てて、４℃で１５分間、氷冷したベ
ルセン（ｖｅｒｓｅｎｅ）と共にインキュベートした後、接着性細胞を掻き取っ
た。ＰＢＳ中で細胞を二度洗浄し、６．９×１０^５／ｍＬになるように、ＲＰＭ
Ｉ １６４０＋１０％の熱で不活化したヒト血清（Ｓｉｇｍａ）中に再懸濁し、
９６穴の扁平な底部のプレート（Ｃｏｓｔａｒ）の各ウェル中に２５０μＬの細
胞懸濁物を置いた。プレートの半分に、１００ＩＵ／ｍＬのＩＦＮγを添加し（
Ｇｅｎｚｙｍｅ）、残りの半分は対照として残しておいた。プレートは、アッセ
イ前に３７℃、５％ＣＯ_２で一晩インキュベートした。

【００５０】 例２ｃ：ＴＮＦα放出の刺激： 凍結乾燥した、組換えヒトオンコスタチンＭ（ｒｈＯＳＭ）をＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔ
ｅｍｓから購入し、滅菌したＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）の中で１０
μｇ／ｍＬに希釈し、使用するまで−２０℃で分取試料を保存した。上述のよう
に調製した、マクロファージ、単球、又はＴｈｐ−１細胞のそれぞれにつき３つ
ずつのウェルに、ｒｈＯＳＭ、大腸菌由来のＬＰＳ、又はＣＭを添加し、上述の
ように調製し、３７℃、５％ＣＯ_２で７時間インキュベートした。上清を採取し
て、ＥＬＩＳＡによるＴＮＦαタンパク質をテストするまで−２０℃で凍結した
。ＴＮＦα ｍＲＮＡを同時アッセイするようにデザインされたアッセイでは、
細胞を上記のように４時間インキュベートし、ＰＢＳ中で一度洗浄し、ＲＮＡ抽
出緩衝液中で細胞溶解させた（ＲＮＡｚｏｌｅ）。

【００５１】 ＲＮＡは、以下のように検出した。製造者の指示にしたがって、全ＲＮＡを調
製し、ＤＥＰＣ処理した水の中において、−８０℃で保存した。ＲＴ−ＰＣＲの
場合、オリゴｄＴプライミング（ｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ ｓｙｎ
ｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて、約１
μｇのＲＮＡを逆転写し、以下のＴＮＦα用プライマー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ ａ
ｍｐｌｉｍｅｒｓ）：フォワード−ＧＡＧＴＧＡＣＡＡＧＣＣＴＧＴＡＧＣＣＣ
ＡＴＧＴＴＧＴＡＧＣＡ（配列番号１）リバース−ＧＣＡＡＴＧＡＴＣＣＣＡＡ
ＡＧＴＡＧＡＣＣＴＧＣＣＣＡＧＡＣ（配列番号２）を用いて、 得られたｃＤＮＡを３０サイクルのＰＣＲに供した。増幅産物（４４４ｂｐ）は
、アガロースゲル（２％）電気泳動によって分離され、エチジウムブロマイド染
色によって可視化した。

【００５２】 例２ｄ：ＯＳＭは単球系のヒト細胞にＴＮＦαの産生を誘導する ＰＭＡを用いてヒト前単球系Ｔｈｐ−１を分化するように誘導し、完全に洗浄
し、上述のように組換えヒトＯＳＭと共にインキュベートした。８時間の時点で
、培養の上清を除去し、製造者の指示に従って、特異的なＥＬＩＳＡ（ＴＮＦ
Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）によってＴＮＦαの産生をア
ッセイした。ＯＳＭは、用量に依存したＴＮＦαの放出を誘導し、１ｎｇ／ｍＬ
以上のＯＳＭで測定可能、２００−５００ｎｇ／ｍＬで最大であり、多くの場合
、２５００ｐｇ／ｍｌのＴＮＦαを超える分泌レベルに達した。代表的な実験が
、図２に示されている。上記のＲＴ−ＰＣＲによって測定されたＴＮＦαのメッ
センジャーの発現は、刺激されない対照細胞に比して、１００ｎｇ／ｍＬのＯＳ
Ｍと４時間インキュベートしたＴＨＰ−１細胞の中で非常に増加した（図３）。

【００５３】 重要なことは、ＯＳＭを予め煮沸するとＴＮＦαの分泌が完全に消失したので
、ＴＮＦαの誘導は、混在するエンドトキシンに由来するものではなかったとい
うことである（データは示していない）。また、特異工程を用いた免疫沈降によ
るＯＳＭの除去は、活性を消失せしめた（データは示されていない）。これらの
知見は、インターフェロンγで予め活性化したヒト血中単球、７日間の培養で分
化したヒト血中マクロファージを含むように拡張された。両細胞種ともに、ＯＳ
Ｍと共に８時間にわたって同時インキュベートすると、ＥＬＩＳＡによる測定に
よれば、ＴＮＦαを分泌した。単球による平均ＴＮＦα分泌は、１４４７ｐｇ／
ｍＬであり（レンジ１３７−４７０９ｐｇ／ｍＬ；ｎ＝４ドナー）、及びマクロ
ファージでは５４２ｐｇ／ｍＬであった（レンジ６２−１４２８ｐｇ／ｍＬ；ｎ
＝３ドナー） 例３ａ：軟骨分解アッセイ 屠殺後にウシの尾中隔軟骨を一晩４℃に保った。２ｍｍのスライスから直径２
ｍｍの円板を切除し、ＨＢＳＳで２回洗浄した。２ｍＭ グルタミン、１００μ
ｇ／ｍＬのストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、及び２．５μｇ
／ｍＬのアムホテリシンＢ（軟骨分解溶媒、ＣＤＭ）を補充した２５ｍＭ ＨＥ
ＰＥＳを含有する６００μＬの容量のＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ）の中で、２４穴の
プレート（Ｃｏｓｔａｒ）のウェル当たり３つの円板を３７℃、５％ＣＯ_２で２
４時間インキュベートした。６００μＬのＣＤＭのみ、２、１０、又は５０ｎｇ
／ｍＬのヒト組換えＴＮＦαのみ、１０ｎｇ／ｍＬのｒｈＯＳＭのみ（Ｒ＆Ｄ
ｓｙｓｔｅｍｓ）、又はＴＮＦα＋ＯＳＭの何れかの中で、４つずつのウェルの
中において軟骨を培養し、３７℃、５％ＣＯ_２で７日間インキュベートした。上
清を採取し、第１日と同一の試験試薬を含有する新鮮な培地と置換した。該実験
は、さらに７日間継続され、１４日目に全ての培地が除去され、５ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、及び５ｍＭ システイン塩酸塩を含有する０．１Ｍのリン酸緩衝液ｐＨ６．
５の中で、４．５ｍｇ／ｍＬのパパイン（Ｓｉｇｍａ）を用いて残りの軟骨を消
化し、６５℃で１６時間インキュベートして、軟骨断片の残存するヒドロキシプ
ロリン含量を決定した。１４日目までに培地中に放出されたＯＨ−プロリンの累
積的レベルを測定し、以下に示されているように、総放出の百分率として表した
。

【００５４】 例３ｂ：ヒドロキシプロリンアッセイ Ｂｅｒｇｍａｎｎ Ｉ ａｎｄ ｌｏｘｌｅｙ Ｒ．（１９６３） Ａｎａｌ
．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３５ １９６１−１９６５の方法のマイクロタイタープレー
ト修飾法を用いて、ヒドロキシプロリンの放出を（コラーゲンの分解の測定とし
て）アッセイした。酢酸クエン酸緩衝液（水１Ｌ当たり５７ｇ酢酸ナトリウム、
３７．５ｇのｔｒｉ−クエン酸ナトリウム、５．５ｇのクエン酸、３８５ｍＬの
プロパン−２−オール）で、クロラミンＴ（７％ｗ／ｖ）を１：４に希釈した。
ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒド（ＤＡＢ；３０ｍＬの６０％過塩素酸）中
２０ｇ）をプロパン−２−オールで１：３に希釈した。試料を６Ｍ ＨＣＬの中
で１０５℃で２０時間加水分解し、Ｓａｖａｎｔ Ｓｐｅｅｄ Ｖａｃ．を用い
て、真空下で、ＮａＯＨを用いて乾燥させることによって、加水分解物を中和し
た。残留物を水に溶かし、クロラミンーＴ試薬と共に、４０μＬの試料又は標準
（ヒドロキシプロリン；５−３０μｇ／ｍＬ）をマイクロタイタープレートに添
加した後、ＤＡＢ試薬（１５０μＬ）を４分後に添加した。該プレートを６５℃
まで３５分間加熱し、冷却し、５６０ｎｍの吸光度を決定した。

【００５５】 例３ｃ：ＯＳＭはＴＮＦαと協働してエクスビボで軟骨外植片からのＭＭＰ１と
コラーゲンの放出を増加させる 上述のように、ＯＳＭ若しくはＴＮＦαのみ（ともにＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ
から入手）、又はこれらの組合せの存在下又は不存在下において、ウシの鼻軟骨
を４つずつのウェルの中で１４日間培養した。

【００５６】 第７日目に培養上清の総コラーゲナーゼ活性を、第１４日目に放出されたコラ
ーゲンをアッセイした。図５のデータは、それぞれ１０ｎｇ／ｍＬ又は５０ｎｇ
／ｍＬで使用されたＯＳＭ又はＴＮＦα単独では、何れも顕著なＭＭＰ１の分泌
を誘導しなかったことを実証している。しかしながら、これらの濃度で使用され
たＯＳＭとＴＮＦαの組合せは、測定可能なＭＭ１の放出を誘導した。これらの
知見は、ＯＳＭとＴＮＦαとの顕著な協働作用を伴って、軟骨からのコラーゲン
の放出を増加させた。図４は、１０ｎｇ／ｍＬのＯＳＭ単独では、コラーゲンの
放出を誘導しなかったのに対して、使用した最高濃度のＴＮＦα（５０ｎｇ／ｍ
Ｌ）だけは、小さいが、実証可能な効果（１０％未満）を有していたことを示し
ている。しかしながら、５０又は１０ｎｇ／ｍＬの何れかのＴＮＦαと１０ｎｇ
／ｍＬの組合せは、それぞれ、８０％及び３０％を超えるコラーゲンの放出をも
たらした。

【００５７】 例４ａ：Ｌ−セレクチンを介したＰＢＭＣの刺激 上述のようにヒトのバフィコートから単核細胞を単離した。５×１０^５細胞を
０．５ｍＬの容量で播種し、３７℃、５％ＣＯ_２で、６０〜８０ｋＤの分子量の
フコイダン（Ｓｉｇｍａ）、抗Ｌ−セレクチンモノクローナル抗体、ＬＡＭ１−
３、及びＴＱ１、又はアイソタイプが合致した対照ＩｇＧ抗体（全てＣｏｕｌｔ
ｅｒから入手）と共に２４時間インキュベートした。製造者の指示に従って、特
異的なＥＬＩＳＡアッセイ（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）
を用いて上清のＯＳＭをアッセイした。

【００５８】 例４ｂ：Ｌ−セレクチンの連結はＯＳＭの分泌を誘導する 抗ヒトＬ−セレクチン抗体、（ＴＱ１又はＬＡＭ−１の何れか）、又はアイソ
タイプを合致させた対照抗体、及びＥＬＩＳＡによってＯＳＭをアッセイした培
養上清と共に健康なドナーからの単核細胞を２４時間インキュベートした。図６
のデータは、両抗Ｌ−セレクチン抗体を用いた用量依存的なＯＳＭの誘導を示し
ている。対照抗体は、最少の効果を有していた。続いて、Ｌ−セレクチンアゴニ
ストであるフコイダンが単核細胞培養からＯＳＭを誘導する能力を調べた。図７
は、フコイダンがＯＳＭ分泌の強力な刺激物質であり、ＲＡ及びＯＡの滑膜生検
培養物で見られたのと同様のレベルを誘導することを示している（例１、実験２
、図２）。

【００５９】 例５ａ：免疫組織化学 ＣＯ_２で冷却して液体ヘキサン中で新鮮なヒト組織試料を凍結して、使用まで
液体Ｎ_２の蒸気相中に保存した。３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰ
ＥＳ）（Ｍａｄｄｏｘ Ｐ． ｅｔ ａｌ Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｐａｔｈ． ４
０；１２５６−１２６０，１９８７）をコートしたガラススライド上に、７ｍｍ
のクリオスタット切片を切断し、２％パラホルムアルデヒド中、４℃ で１０分間固定した。０．０５％Ｈ_２Ｏ_２中で、内在性のペルオキシダーゼ活性
を２０分間ブロックした。未抱合の一次モノクローナル抗体は、以下の入手源：
ＣＤ６２Ｐ、ＣＬＢ、オランダ；ＣＤ６２Ｅ及びｇｐ１３０ Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔ
ｅｍｓ ＵＫから得た。一次抗体は、４５分間、室温で、至適希釈で適用した。
試験抗体と等しいタンパク質濃度で使用したネガティブコントロールの切片を抗
ＢｒｄＵモノクローナル抗体（ＳＩＧＭＡ）と共にインキュベートした。一次抗
体を標識するために、ビオチン化された二次抗体に続いて、ペルオキシダーゼラ
ベルされたＡＢＣ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｅｌｉｔｅ）を用いた。ＤＡＢ（３，３’ジ
アミノベンジジン）基質（ＳＩＧＭＡ）を用いてペルオキシダーゼを展開した。

【００６０】 例５ｂ：ＲＡの滑膜におけるセレクチンとＯＳＭ受容体の共分布 炎症性ＲＡの滑膜組織の凍結切片は、上記ｇｐ１３０、並びにＰ及びＥセレク
チンに対する特異抗体を用いて染色した。図８の顕微鏡写真は、ＲＡの血管内皮
がｇｐ１３０に対して強い陽性で染まることを実証している。

【００６１】 Ｐ−及びＥ−セレクチンの発現についてＲＡの滑膜を染色することによって、
血管内皮細胞に限局したｇｐ１３０と同一の染色パターンが明らかとなった（そ
れぞれ、図８及び図９）。図９では、血管周囲の単核細胞がＥ−セレクチンの染
色に付随して浸潤していることに注目されたい。対照一次抗体を用いた連続切片
の染色は、血管内皮細胞上では、ネガティブであった（図９） 例６ａ：コラーゲン誘導性関節炎の抗ＯＳＭ抗体処置 コラーゲン誘導性関節炎は、以前記載したように（Ｐｌａｔｅｒ−ｚｙｂｅｒ
ｋ Ｃ． Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ ９８：４４２−７ １９９
４ ａｎｄ Ｐｌａｔｅｒ−ｚｙｂｅｒｋ Ｃ． Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉ
ｎｅ １：７８１−５，１９９５）ネイティブのウシＩＩ型コラーゲン（ＣＩＩ
）を用いた免疫化によって、雄のＤＢＡ／１マウス（８−１２週齢）で誘導した
。ＣＩＩ免疫化の１６日後から、関節の赤さと膨張の徴候について、マウスを毎
日モニターした。臨床徴候が最初に現れてから、１週間に３回マウスを調べ、各
肢毎に、以下の視覚的スコア：０＝正常、０．５＝２以上の指に関節炎、１＝指
を含まない肢の僅かな膨張と紅斑、１．５＝１と同じだが指を含む、２＝指を含
まないより顕著な肢の紅斑を伴う膨張、２．５＝２と同じだが指を含む、３＝動
作障害を伴う著しい膨張、３．５＝３と同じだが指を含む、を用いて疾病の重症
度に段階を付けた。肢の厚さは、コンパスを用いて測定した（Ｐｒｏｃｔｅｓｔ
２Ｔ，Ｋｒｏｅｐｌｉｎ Ｌａｎｇｅｎｍｅｓｓｔｅｃｈｎｉｋ）。

【００６２】 臨床的に疾病が発症してから、１００ｍｇのヤギ抗マウスＯＳＭ抗体を腹腔内
投与することによって、ＣＩＩ免疫されたＤＢＡ／１マウスを処置した（Ｒ ａ
ｎｄ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ｃａｔ．ｎｏ．ＡＦ−４９５−ＮＡ）。上記のよう
に、疾病の進行を評価した。発症から１４日後に、頚椎脱臼によってマウスを屠
殺し、組織学的な検査のために肢を採集した。

【００６３】 例６ｂ：関節炎マウスの関節の組織学的な評価 脚の皮を剥ぎ、膝と肢を切除した。４日間（膝）又は１日間（肢）、１０％の
緩衝化されたホルマリンの中で関節を固定し、２５％の蟻酸の中で３日間脱灰し
、脱水し、パラフィン蝋の中に埋め込んだ。関節の矢状切片（５−７ｍｍ）から
蝋を除去し、（上記Ｐｌａｔｅｒ−ｚｙｂｅｒｋ Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉ
ｎｅに記載されているように）サフラニンＯ、ファーストグリーン／鉄ヘモキシ
リン対比染色で染色した。０（浸潤なし）から３（著しい浸潤と滑膜の過形成）
まで、滑膜炎をブラインドで段階付けした。軟骨のプロテオグリカンの枯渇の指
標となるサフラニンＯ染色強度の消失程度は、０（完全に染色された軟骨）から
３（軟骨の完全な枯渇及び消失）までのスケールでスコアを付けた。

【００６４】 例６ｃ：コラーゲン関節炎マウスの関節組織中のＯＳＭ ｍＲＮＡの検出 関節炎マウスと未処置対照動物を屠殺し、両肢と両足を切除し、液体窒素で瞬
間凍結した後、−８０℃で保存した。ウルトラツラックス（ｕｌｔｒａｔｕｒｒ
ａｘ）メカニカルホモゲナイザーを用いて、ＲＮＡｚｏｌｅ中で各脚を砕くこと
によって、ＲＮＡを調製した。粒状物は沈降させ、続いて、上清を１／１０容量
のクロロホルムと混合し、ＲＮＡを含有する水相を分離するために回転させた。
ＲＮＡｍａｔｅ（ＢｉｏＣｈａｉｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｅ Ｉｎｃ，Ｓａｎ Ｌｅ
ａｎｄｒｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて、ＲＮＡを沈降させて混在してい
るプロテオグリカンを除去した。７５％エタノール中で洗浄した後、ＤＥＰＣ−
水の中に全ＲＮＡを溶かし、Ｐｈａｒｍａｃｉａのｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ
ｃＤＮＡキット及びオリゴｄＴプライミングを用いて、逆転写した。マウスＯＳ
Ｍ配列（Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ Ａ． ｅｔ ａｌ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ
１５ １０５５−１０６３，１９９６）：ＧＧＧＴＧＴＣＣＴＡＣＣＡＡＧＧＡ
ＡＣＡ（配列番号３）、ＣＴＧＡＧＡＣＣＴＴＴＣＡＡＧＡＧＧＡＣ（配列番号
４）に由来する以下のプライマー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｃｕ
ｓｔｏｍ ｐｒｉｍｅｒｓ）を用いて、ＰＣＲ反応を行った。３０サイクルのＰ
ＣＲの後、アガロースゲル電気泳動を用いて反応産物（３７９ｂｐ）を検出した
。上述のように、関節炎マウスの肢のＯＳＭ ｍＲＮＡを検出するためにＲＴ−
ＰＣＲを用いた。図１０は、段階的に増加する臨床的疾病スコアを有する動物か
ら得た関節では、ＯＳＭ特異的ＰＣＲ産物のレベルは増加していたことを示して
いる。これに対して、対照動物では、ＯＳＭメッセージは、殆ど又は全く検出さ
れなかった。

【００６５】 例６ｄ：ＯＳＭの中和はコラーゲン誘導性関節炎を改善する 中和が関節炎の臨床徴候を改善し得るという仮説を直接試験するために、６匹
のマウスからなる群に最初に臨床的な関節炎が現れてから１日及び３日後に、Ｏ
ＳＭに対する中和ポリクローナル抗体１００μｇを２回腹腔内投与した。平行し
て、抗ＯＳＭの代わりに非免疫ヤギＩｇＧを用いて、６匹の関節炎マウスからな
る第二の群を同様に処置した。関節炎の臨床的重症度にスコアを付け、第二の抗
体を投与した後１１日のフォローアップ期間にわたって各肢の膨張を測定した。
対照ヤギＩｇＧで処置したマウスでは、肢の膨張の増加を伴って、進行性の関節
炎が発生した。

【００６６】 全く対照的に、抗ＯＳＭ抗体で処置したマウスは、臨床スコアと肢の膨張から
みて有意に重症でない関節炎を生じた（図１１）。また、関節炎の肢の数は、対
照ＩｇＧ処置動物に比べて、抗ＯＳＭ処置動物で有意に減少しており、この治療
用プロトコールが、既に確立した疾病を有する動物をさらなる疾病の進行から保
護するのに有効であったことを実証している。（データは示していない）。グル
ープ当たり７匹のマウスを用いて、同様に、この実験を繰り返し、ほぼ合致する
データを得た（データは示していない）。

【００６７】 抗ＯＳＭ抗体による処置から生じた臨床的重症度の減少は、疾病の発症から１
４日後に、関節炎の肢を死後組織学的に調べることによって確認された。１４日
目における対照ＩｇＧ又は抗ＯＳＭ抗体で処置したコラーゲン関節炎マウスの関
節の浸潤と軟骨の損傷を比較した組織学的データが、図１２〜１５に示されてい
る。対照ＩｇＧ処置マウスは、ＰＭＮと単核細胞による著しい関節の浸潤を示し
た（図１２）。これは、広範な好中球の浸潤を特徴とする関節の軟骨の表面破壊
を伴っていた（図１３）。対照的に、図１４と１５は、最小限の関節炎を有する
抗ＯＳＭ処置した動物の代表的な関節を示しており、細胞の浸潤レベルが顕著に
減少し、損傷されていない関節の軟骨が存在することを実証している。さらに、
軟骨と滑膜の組織病理学的な外見について、ブラインドで関節にスコアを付け、
正常、中程度、又は重度として報告した。処置群当たり合計７３の各関節を評価
した；データは表１に要約されている。対照ＩｇＧ処置群では僅か６％であった
のに比して、抗ＯＳＭで処置した動物では、検査した４７％の関節が正常である
か、又は穏やかな滑膜炎を示していた。同様に、抗ＯＳＭ処置マウスでは、対照
ＩｇＧ処置群の２１％に比べて、検査した関節の５８％が殆ど又は全く関節の損
傷を示さなかった。処置の１日目に関節の赤さと膨張の明瞭な徴候を有する２匹
の抗ＯＳＭ処置マウスの関節は、続いて、関節炎の完全な改善を示し、軟骨又は
滑膜の何れにも細胞の浸潤と目に見える異常を示さなかった（データは示してい
ない）。

【００６８】

【表１】 例７：小有機分子アンタゴニストの同定 明確な細胞毒性を引き起こさずにレポーター細胞株からのＯＳＭ誘導性生物学
的応答を阻害することによって、ＯＳＭの小有機分子アンタゴニストを同定した
。対照として、ＴＮＦα応答性細胞株に対する前記化合物の影響も試験した。

【００６９】 例７ａ：ヒトＯＳＭの発現及び精製 ＥＭＢＬのｈＯＳＭ（受付番号Ｍ２７２８８）配列からデザインした合成オリ
ゴヌクレオチドプライマー５’−ＧＣＡＴＡＧＧＡＴＣＣＧＣＧＧＣＴＡＴＡＧ
ＧＣＡＧＣＴＧＣＴＣＧ−３’（配列認識番号５）および５’−ＡＴＣＧＣＧＡ
ＡＴＴＣＣＴＡＣＣＧＧＧＧＣＡＧＣＴＧＴＣＣＣＣＴ−３’（配列認識番号６
）を用い、活性化された白血球のｃＤＮＡライブラリーからのポリメラーゼ連鎖
反応（ＰＣＲ）を使用して、２５アミノ酸のリーダー配列を除去したヒトＯＳＭ
（ｈＯＳＭ）をコードするＤＮＡ断片を増幅した。このＰＣＲ産物をｐＣＲ２．
１（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）中にサブクローニングしてｐＣＲ２．１ｈＯＳＭ
を得た。

【００７０】 「Ｑｕｉｃｋｃｈｎａｇｅ」位置指定突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅ
ｎｅ）を用いてＴＧの代わりにＡＣを挿入し、以下に図示された配列（配列番号
７）： BamHI ECORl AAA TCG GAT CTG ATC GAA GGT CGA CGG ATC CCC GGG AAT TCA TCG K S D L I E G R R I P G N S S（配列番号１４ ） Ｆａｃｔｏｒ Ｘａ を作り出すことによって、細菌発現ベクターｐＧＥＸ−３Ｘ（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ）中のＸａ因子内部に、ＳａｌＩ制限エンドヌクレアーゼ切断部位を作った。

【００７１】 ｐＣＲ２．１ｈＯＳＭ中のＯＳＭインサートの配列を確認した後、ＢｓｍＢｉ
制限エンドヌクレアーゼ部位（下線部）を含有するフォワードプライマー５'− ＧＡＴＡＣＧＡＴＣＧＴＣＴＣＡＴＣＧＡＧＣＧＧＣＴＡＴＡＧＧＣＡＧＣＴＧ
Ｃ−３'（配列番号８）、及びＥｃｏＲＩ部位（下線部）を含有するリバースプ ライマー５'−ＡＴＴＡＣＡＴＧＧＡＡＴＴＣＣＴＡＴＣＴＣＣＧＧＣＴＣＣＧ ＧＴＴＣＧＧ−３'（配列番号９）を用いて、該ベクターから成熟型のヒトＯＳ ＭをコードするＤＮＡをＰＣＲ増幅した。該ＰＣＲ産物は、リーダー配列がなく
、且つタンパク質の成熟化の時点で除去されるＣ末端の３１アミノ酸がない成熟
型のヒトＯＳＭを含有する。ＰＣＲ後に、増幅されたＤＮＡ断片を精製し、制限
酵素ＢｓｍＢＩとＥｃｏＲＩで消化し、ＳａｌＩとＥｃｏＲＩで制限消化された
修飾ｐＧＥＸ−３Ｘベクター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ：ＧＳＴをコードするＤＮＡ
を含有する）中にサブクローニングして、ｐＧＥＸ１９６と表記されるプラスミ
ドを作成した。配列を確認した後、大腸菌ＢＬＲ−ＤＥ３（Ｎｏｖａｇｅｎ）の
中にプラスミドｐＧＥＸ１９６を形質転換した。形質転換した細胞は、１００μ
ｇ／ｍＬのアンピシリンを補充した２×ＹＴ＋Ｇ培養液（トリプトン１６ｇ／Ｌ
；酵母抽出物 １０ｇ／Ｌ；ＮａＣｌ ５ｇ／Ｌ；ＮａＯＨによりｐＨ７．０；
２％グルコース）中で培養した。

【００７２】 精製されたタンパク質を調製するために、大腸菌ＢＬＲ−ＤＥ３中のｐＧＥＸ
１９６を一晩培養したものを１：１００に希釈し、Ａ_{６００ｎｍ}が０．８になる
までこの培養物を３７℃で増殖させた。０．１ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピル−
１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）を添加することによって、ＧＳＴ−ｈ
ＯＳＭ融合タンパク質の発現を誘導し、さらに２時間培養を続けた。

【００７３】 バッチ精製によって、大腸菌の培養からＧＳＴ−ｈＯＳＭを単離した。３００
０ｒｐｍで遠心することにより３Ｌの細菌培養を採取し、プロテイナーゼ阻害剤
錠（Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ）を含有する５０ｍＬの氷冷したＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐ
ｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）の中に生じた沈殿物を再懸濁した
。５ｍＬのリゾチームを添加し、細胞懸濁物を氷上で５分間インキュベートした
。細胞を４℃で音波処理して、１％ ＴｒｉｔｏｎＸ１００と１０ｍＭ ジチオ
スレイトールを添加した。続いて、溶解物を攪拌しながら４℃で１０分間混合し
た後、１４０００ｇで遠心した。グルタチオンアガロース（Ｓｉｇｍａ ｃａｔ
ｎｏ． Ｇ４５１０）に上清を加え、攪拌しながら４℃で３０分間混合した。
該懸濁物を軽く遠心し、上清を吸引除去し、沈降したアガロースを氷冷したＰＢ
Ｓで２度洗浄した。溶出用緩衝液（２０ｍＭ グルタチオン、１００ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ ｐＨ８．０、１００ｍＭ ＮａＣｌ；ここでもｐＨ８．０）を加え、氷上
で５分間、該懸濁物をインキュベートした。上清を集めて、ドデシル硫酸ナトリ
ウム／ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ―ＰＡＧＥ）によって、画分を
分析した後、クマシーブリリアントブルー色素で染色して、精製したタンパク質
の完全性を確認した。

【００７４】 Ｘａ因子とクマシーブリリアントブルー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によ
って示される最適な量のｈＯＳＭを産するトロンビンとを用いて、タンパク質分
解至適化実験をセットアップした。イオン交換クロマトグラフィーによってＧＳ
ＴとＯＳＭ産物の分離を達成し、Ｎ末端の配列決定と質量分析計によって精製し
たＯＳＭ産物を確認した。

【００７５】 例７ｂ：ＨｅｐＧ２ Ｂ６：ＯＳＭ誘導ｓＰＡＰアッセイ 以下に記載されているｓＰＡＰ（分泌胎盤アルカリホスファターゼ）ｃＤＮＡ
の上流にある６つの機能的ＳＴＡＴ３応答要素（ＲＥ）を安定的にＨｅｐＧ２細
胞株（ＥＣＡＣＣ）にトラスフェクトしてＨｅｐＧ２Ｂ６を形成させた。ＳＴＡ
Ｔ３（転写のシグナルトランスデューサー及びアクチベーター）は、ＩＬ−６サ
イトカインファミリー細胞間シグナリングカスケードの中間体である。細胞表面
受容体ＳＴＡＴ３の二量体化に続いて、リン酸化が行われた後、核の中のＤＮＡ ＲＥに結合し、下流のＤＮＡ（この構築物ではＤＮＡはｓＰＡＰである）を活
性化する。このように、この株は、オンコスタチンＭの中で一晩インキュベート
することによってｓＰＡＰの産生を引き起こすことができる。

【００７６】 ＳＴＡＴ応答性分泌胎盤アルカリホスファターゼ（ｓＰＡＰ）レポーター遺伝
子を以下のごとく構築した。まず、３コピーのパリンドロームのＳＴＡＴ３応答
要素（Ｗｅｇｅｎｋａ Ｕ．Ｍ ｅｔ ａｌ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ，１
９９３ Ｖｏｌ １３ ｐ２７６−２８８ ｐ２７７の表１）と５’ＸｈｏＩ部
位を含有するオリゴヌクレオチド対を、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ｔ
ｋＳＰＡＰのユニークなＳａｌＩ部位にクローニングしてｐＩＩＰ３−ｔｋ−Ｓ
ＰＡＰを作った。フィブリノーゲンβプロモーター中に見出されるＳＴＡＴ３応
答要素をコードする合成オリゴヌクレオチド６コピー（Ｄａｌｍｏｎ ｅｔ ａ
ｌ． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ；１９９３；１３：１１８３−１１９３ 図
１６、ＩＬ６ＲＥコンセンサスモチーフとＧＡＴテールのないＴＴＧリーダーを
含むｈβＧＦ配列）を、さらに、ｐ１１Ｐ３−ｔｋ−ＳＰＡＰのＸｈｏ１中にク
ローニングして、ｐｌｌｘ６／ｌｌＰ３−ｔｋ−ＳＰＡＰを作成した。応答要素
ｐｌｌｘ６／ｌｌＰ３−ｔｋ−ＳＰＡＰの数を確認するために配列を決定した後
、Ｎｒｕ１とＸｂａ１で消化して、９つのＳＴＡＴ応答要素とｔｋ−ＳＰＡＰを
コードする配列とを含有するＤＮＡの断片を単離した。続いて、プラスミドのｐ
ｃＤＮＡ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＮｒｕ１とＸｂａ１部位の間にこれを移
して（ＣＭＶプロモーターと置き換えている）、９つのＳＴＡＴ３応答要素、及
びＨｅｐＧ２細胞株を確立するためのＮｅｏＲ選択可能マーカーとを含有するＳ
ＰＡＰ遺伝子レポーターを作出した。

【００７７】 ２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１％ ＮＥＡＡ、及び１０％ＨＩウシ胎児血清を補
充したＤＭＥＭ培地中にて、３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気、湿度９２％でＨｅｐＧ
２細胞（ＥＣＡＣＣ）を増殖させた。ＳＴＡＴ−ｓＰＡＰレポーターを用いたト
ランスフェクションのために、１０ｃｍの組織培養皿の中に、１％の密集度で細
胞を播種し、リン酸カルシウムトランスフェクションキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇ
ｅｎ）を用いて、ＳＴＡＴ−ｓＰＡＰレポーターベクター１０μｇをトランスフ
ェクトした。１ｍｇ／ｍＬのＧ４１８個体細胞株の存在下で、クローン選択を行
った後、ＩＬ−６がＳＴＡＴｓＰＡＰレポーター遺伝子からｓＰＡＰ発現の増加
を引き起こす能力をスクリーニングした。

【００７８】 １００μＬの培地（ＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ）、１０％ＨＩ ＦＣＳ、１％の非
必須アミノ酸、ｍＭグルタミン、５００μｇ／ｍＬのＧ４１８、（全てＬｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから））中ウェル当たり３×１０^４細胞の最終濃度
になるように、９６ウェルのプレート中にＨｅｐＧ２Ｂ６細胞を播種した。４８
時間、細胞を平衡化させた。推定抗ＯＳＭ固体化合物をＤＭＳＯ中の２０ｍＭの
ストック希釈物に調製し、ＤＭＳＯで１：３の連続希釈を行った。続いて、Ｈｅ
ｐＧ２６Ｂアッセイ培地（これは、１０％ ＨＩ ＦＣＳに置き換えた、１％の
熱で不活化されたＦＣＳ、低アルカリホスファターゼ活性（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｉｅｓ）を有することを除いて上記培地と同じである）でさらにこれ
を希釈した。化合物は、最終濃度１％のＤＭＳＯで、最高濃度２００μＭから最
終濃度０．０９μＭまで１：３で希釈した（すなわち、２００、６６．６７、２
２．２２、７．４１、２．４７、０．８２、０．２７、０．０９、及び０μＭ）
。古い培地をウェルから取り除き、２ｎｇ／ｍＬのＯＳＭ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅ
ｍｓ）も含有する希釈された化合物で置換し、さらに２０時間細胞をインキュベ
ートした。各希釈は３個ずつ行った。各ウェルから２０μＬの培地を除去し、基
質としてｐＮＰＰ（ｐ−ニトロフェニルリン酸；Ｓｉｇｍａ）を用いてｓＰＡＰ
活性をアッセイした。内在性アルカリホスファターゼはＬ−ホモアルギニンでブ
ロックする。基質の光学密度は、４０５−６５０ｎｍで読む。化合物の濃度は、
産生したｓＰＡＰの測定値としてＯＤに対してプロッティングし、ＩＣ５０値を
決定するために分析することができる。

【００７９】 例７ｃ：Ａ５４９細胞：ＴＮＦα誘導ｓＰＡＰアッセイ 本アッセイでは、アルカリホスファターゼに連結されたＥ−セレクチン遺伝子
のサイトカイン応答領域を含むレポーター遺伝子で安定的にトランスフェクトさ
れたＡ５４９細胞を用いた（Ｒａｙ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．３
２８：７０７−７１５，１９９７）。このトランスフェクトされた細胞株は、Ｔ
ＮＦαとの一晩のインキュベーションによってｓＰＡＰを産生するように誘導さ
れ得る。

【００８０】 １００μＬの培地中ウェル当たり５×１０^４細胞の最終濃度になるように、９
６ウェルのプレート中に５４９細胞を播種した。２４時間、細胞を平衡化させた
。推定抗ＯＳＭ固体化合物をＤＭＳＯ中の２０ｍＭのストック希釈物に調製し、
ＤＭＳＯで１：３の連続希釈を行った。続いて、これを培地（ＤＭＥＭ、１、１
％の熱で不活化されたＦＣＳ、低アルカリホスファターゼ活性、１％非必須アミ
ノ酸、２ｍＭグルタミン、５００μｇ／ｍＬＧ４１８（全てＬｉｆｅ Ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｉｅｓから入手）でさらにこれを希釈して１％の最終濃度のＤＭＳＯ
中０．０９−２００μＭの濃度応答を得た。ウェルから古い培地を 取り除き、３ｎｇ／ｍＬのＴＮＦα（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）も含有する希釈
された化合物で置換し、さらに２０時間細胞をインキュベートした。各希釈は３
個ずつ行った。各ウェルから２０μＬの培地を除去し、基質としてｐ−ニトロフ
ェニルリン酸（Ｓｉｇｍａ）を用いてｓＰＡＰ活性をアッセイした。内在性アル
カリホスファターゼはＬ−ホモアルギニン（Ｓｉｇｍａ）でブロックする。基質
の光学密度は、４０５−６５０ｎｍで読む。化合物の濃度は、産生したｓＰＡＰ
の測定値としてＯＤに対してプロッティングし、ＩＣ５０値を決定するために分
析することができる。

【００８１】 例７ｄ：細胞生存アッセイ 細胞の生存は、テトラゾリウム化合物（３−（４，５−ジメチルチアゾール−
２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェ
ニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、内部塩；４９０ｎｍで直接測定できる可溶性ホ
ルマザン産物へのＭＴＳ）を還元する代謝的に活性な細胞中のデヒドロゲナーゼ
酵素の能力として測定した。

【００８２】 ０．０４６μｇ／ｍＬのフェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ；Ｓｉｇｍａ）
を含有する２ｍｇ／ｍＬのＭＴＳ（Ｐｒｏｍｅｇａ）の溶液をダルベッコＰＢＳ
中で調製した。ｓＰＡＰ活性アッセイ用培地を除去した後、２０μＬ／ウェルの
ＭＴＳ／ＰＭＳを添加した。続いて、さらに４５分間、細胞をインキュベートし
た。続いて、６３０ｎｍの参照を用いて４９０ｎｍでの吸光度を測定した。

【００８３】 例７ｅ：アンタゴニスト Ｎ−（１Ｈ−ピラゾロ[３，４−ｄ]ピリミジン−４−イル）ベンズアミド（Ｄ
ａｖｏｌｌ ａｎｄ Ｋｅｒｒｉｄｇｅ、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２５８９，１
９６１）（ＧＷ ３４０４４２Ｘ）は、０．３μＭのＩＣ_５０で濃度依存的なＯ
ＳＭ誘導ｓＰＡＰ放出の阻害をもたらしたが（図１６）、ＴＮＦα誘導ｓＰＡＰ
を阻害するのにはずっと強度が低かった（約９２μＭのＩＣ_５０値）（図１７）
。それ故、該化合物は、ＴＮＦαに比べて、ＯＳＭに対する選択性が１００倍を
超える。

【００８４】 例８ａ：抗ヒトＯＳＭ抗体の作成と試験 以下のように、マウスの中でヒトＯＳＭ（Ｒ＋Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）に対して
モノクローナル抗体を生じせしめた：第０、３、５、及び２４日目に、ＲＩＢＩ
アジュバント（ＲＩＢＩ、ハミルトン、ＭＴ）中に乳化した１μｇの組換えヒト
ＯＳＭ抗原（皮下）とフロイントの完全アジュバント中１μｇの抗原（腹腔内）
（２７日目に、マウスには、生理的食塩水中１μｇの抗原の腹腔内投与を与えた
）との組合せ、又は第０、３、５、２４、及び５３日目に、腹腔内にＲＩＢＩア
ジュバントに乳化した１μｇの抗原の何れかで、組換えヒトＯＳＭを用いてＳＪ
Ｌ雌マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｎｃ． Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＡ）を免疫
した（第５４目に、マウスの腹腔内に生理的食塩水中の１．５μｇの抗原を投与
した）。

【００８５】 歳後の免疫化から２４時間後に、マウスを屠殺し、脾臓細胞を採取し、融合の
ための準備をした。融合操作は、Ｓｕ Ｊ−Ｌら：：Ｈｙｂｒｉｄａｏｍ １９
９８；１７（１）：４７−５３に記載されているとおりであった。簡潔に述べれ
ば、ポリエチレングリコール１５００（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉ
ｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、脾臓細胞とミエローマ細胞Ｐ３Ｘ６３Ｂｃｌ−
２−１３（Ｋｉｌｐａｔｒｉｃｋ ＫＥ， ｅｔ ａｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ
１９９７；１６（４）：３８７−３９５）とを５：１又は１：１の比率で融合し
た。等しい容量の１０％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）、
１×Ｏｒｉｇｅｎ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ（Ｉｇ
ｅｎ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、及びペニ
シリン／ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ１６４０（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｓｂｕｒｇ，ＭＤ）とＥＸＣＥＬＬ
−６１０（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｅｎｅｘａ、ＫＳ）から構成さ
れるハイブリドーマ増殖用培地中に、１×１０^６細胞／ｍＬで融合細胞を再懸濁
した。続いて、１ｍＬ／ウェルで、２４ウェルのマイクロタイタープレート（Ｃ
ｏｓｔａｒ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）中に細胞を播種した。２４時間後に、
ハイブリドーマ増殖用中の１ｍＬの２×ＨＡＴ選別培地；１００μＭのヒポキサ
ンチン、０．４μＭアミノプテリン、１６μＭチミン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．）を各ウェルに添加した。３７℃、５％ＣＯ_２での培養
から２週間後に、ＥＬＩＳＡによって、抗ＯＳＭ抗体の分泌について、ハイブリ
ドーマ上清をスクリーニングした。選択したハイブリドーマに対して、制限希釈
クローニング（ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｃｌｏｎｉｎｇ）を行っ
た。

【００８６】 結合したヒトＯＳＭを含有する９６ウェルのプレート中でハイブリドーマの上
清と希釈した血清をインキュベートした。アルカリホスファターゼ抗マウス抗体
によって、抗ｈＯＳＭ抗体を検出した。陽性の結果を与えた抗体についての２回
反復測定したＯＤ値が表２に示されている。

【００８７】

【表２】 ３つの上清と１つを除く全てのマウス血清がＥＬＩＳＡで陽性の結果を与えた
。ＥＬＩＳＡデータを用いて、抗体濃度のおよその測定値を決定し、続いて、例
７ｂに記載されたＨｅｐＧ２ Ｂ６ ｓＰＡＰアッセイで、２ｎｇ／ｍＬのＯＳ
Ｍに対して陽性抗体を滴定した。要約すれば、ＨｅｐＧ２Ｂ６細胞とインキュベ
ートする前に、４℃で、抗体をサイトカインと共に一晩インキュベートした。例
７ｂに記載されているようにｓＰＡＰ産生をアッセイした。ハイブリドーマ上清
及びマウスの血清によるｓＰＡＰ産生の阻害が図１８に示されている。

【００８８】 例９ａ：ＯＳＭ上に存在する受容体に対する中心的結合残基の同定 まず、サイトカインのＩＬ−６ファミリーの関連メンバーと参照することによ
って、ｈＯＳＭ上の受容体結合部位を同定した。部位１と３は、受容体のサイト
カイン特異的な鎖への結合に関与していると考えられているのに対して、部位２
は、共通の受容体成分ｇｐ１３０への結合に関与していると考えられている。Ｉ
Ｌ−６ファミリーサイトカインの白血病増殖阻止因子（ＬＩＦ）中の部位２の突
然変異研究（Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ（１９９６） Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ
２７１，１１９７１−１１９７８）、インターロイキンー６（ＩＬ−６）（Ｐ
ａｏｎｅｓｓａ ｅｔ ａｌ（１９９５）ＥＭＢＯ Ｊ．１４，１９４２−１９
５１、及びＳａｖｉｎｏ ｅｔ ａｌ（１９９４）ＥＭＢＯ Ｊ．１３ １３５
７−１３６７）は、部位２の中の残基への変化は、ｇｐ１３０への結合の変化を
もたらすことができるということを示唆している。そのｇｐ１３０との相互作用
に重要であるＯＳＭの残基を調査するために、部位２の領域中のＯＳＭの表面に
露出しているでろう残基を同定することが必要であった。ｎｍｒ実験（Ｈｏｆｆ
ｍａｎ ｅｔ ａｌ（１９９６） Ｊ． Ｂｉｏｍｏｌ．ＮＭＲ ７２７３−２
８２）及びＬＩＦの公表された構造（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ（１９９４
）Ｃｅｌｌ ７７ １１０１−１６）からの情報を用いて、ＯＳＭの相同性モデ
ルを構築した。このモデルで部位２領域中の表面位置を占める残基を突然変異誘
発のために選択した。成長ホルモン（ＯＳＭの相同体）とその受容体との間に形
成された複合体の構造を決定した（Ｄｅ Ｖｏｓら（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ
２５５ ３０６）。ＯＳＭのモデルを成長ホルモンと重ね合わせることによっ
て、ＯＳＭとｇｐ１３０との間で相互作用している可能性がある部位がさらに同
定された。これらのモデル研究に基づいて、ｇｐ１３０とのその相互作用を調べ
るために、ＯＳＭ中の２７部位を突然変異のために選択した。表３を参照された
い。これらの各部位では、アラニン残基が野生型残基と置きかえられた。

【００８９】

【表３】 例９ｂ：変異体ＯＳＭ−ＧＳＴ融合分子の合成 ２７の各突然変異について、一対の突然変異オリゴヌクレオチドがデザインさ
れた。これらは、長さが約３３塩基であり、好ましくは、何れかの末端にＧ又は
Ｃ残基を有していた。ｌａｃ（／ＩＰＴＧ誘導性）プロモーター（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ）の制御下で、「野生型」ＯＳＭ ＤＮＡ（配列番号１２参照）を含有す
るｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）由来の発現にこれらをアニーリングさせ、ネ
イティブＰｆｕポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて伸長させた。Ｄ
ｐｎ１（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて最初のテンプレー
トＤＮＡを消化し、新たに合成したプラスミド（これはＤｐｎ１の基質ではなか
った）を大腸菌株ＤＨ５α（ＧｉｂｃｏＢＢＬ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｉｅｓ）中に形質転換した。少ないコロニーのセット（典型的には４つ）を取り
出し、プラスミドＤＮＡを単離し、ＤＮＡ配列を決定した。各変異に対する代表
的な変異体クローンを、組換えタンパク質を発現させるために、同様に構築した
野生型と平行して、大腸菌株ＢＬＲ（非ＤＥ３：Ｎｏｖａｇｅｎ）中に形質転換
した。０．５Ｌの培養液を確立し、約０．５のＯＤ５５０に誘導した。３時間誘
導した後、細胞を遠心によって沈降させ、ライソザイムと音波処理を組合せた方
法を用いて溶解させた。組換え変異タンパク質は、ＧＳＴとの融合として発現さ
れたので、融合物を結合するために、グルタチオンセファロースカラムを用いた
。続いて、フリーのグルタチオンを用いて、カラムから融合タンパク質を溶出し
た後、室温で４時間１０ｍＭのＤＴＴの中でインキュベートして、グルタチオン
付加物を除去し、−８０℃で保存した。

【００９０】 例９ｃ：ＯＳＭ−ＧＳＴがＥＬＩＳＡにおいて野生型ＯＳＭのｇｐ１３０−Ｆｃ
への結合と拮抗する能力に対する点変異の影響 野生型ＯＳＭ（例７ａに従って作成）；５０μＬ／ウェル、１μｇ／ｍＬ炭酸
／重炭酸緩衝液ｐＨ９．４中）によって、一晩（４℃）Ｎｕｎｃ Ｉｍｍｕｎｏ
ｐｌａｔｅｓ（Ｆ６ Ｍａｘｉｓｏｒｐ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ
）をコートした。プレートを洗浄し（ＰＢＳ ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０で
×６、Ｓｋａｔｒｏｎ Ｐｌａｔｅ洗浄機を使用）、叩いて乾燥させ、非特異的
結合を減少させるためにブロックした（２００μＬ／ウェル、１％ＢＳＡ／ＰＢ
Ｓ）。１時間インキュベートした後に（室温、揺動する台の上）、プレートを叩
いて乾燥させ、例９ｂで得た野生型（ｗｔ）又は変異体ＯＳＭ−ＧＳＴを添加し
た（５０μＬ／ウェル、２０−０．００２μｇ／ｍＬ、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中で
滴定）。ポジティブコントロールとして、ポリクローナル抗ヒトＯＳＭ抗体（Ｒ
＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）もテストした（２０−０．０２μｇ／ｍＬ）。ｇｐ１３
０−Ｆｃ（３００ｎｇ／ｍＬ以下になるように作成）と１％のＢＳＡ／ＰＢＳ（
５０μＬ／ウェル）中の抗ヒトＩｇＧアルカリホスファターゼコンジュゲート（
１：５００、Ｓｉｇｍａ）との複合体は、テストされる物質の直後に添加した。
５時間インキュベートした後に（室温、揺動する台の上）、プレートを洗浄し（
×６）、製造者の指示どおりにＥＬＩＳＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙ
ｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて展開し、４９０ｎｍ
でＯＤを測定した。各プレート上で、１％ＢＳＡ／ＰＢＳの存在下ｇｐ１３０−
Ｆｃ／コンジュゲートとＯＳＭにより総結合を決定し、ＯＳＭの不存在下ｇｐ１
３０−Ｆｃ／コンジュゲートにより非特異的結合、又はｇｐ１３０−Ｆｃの不存
在下でのコンジュゲートのＯＳＭへの結合を決定した。

【００９１】 ヒトｇｐ１３０の細胞外ドメインをコードするＤＮＡは、ヒトｇｐ１３０のＧ
ｅｎＢａｎｋ得データベース配列（受付番号Ｍ５７２３０）からデザインした合
成オリゴヌクレオチドプライマー、 フォワードプライマー： 5'CATCGGATCCAAGCTTTACAGTTACTGAGCACAGGACCTCACC 配列番号10 BamHI HindIII 5'UTR配列 ATGTTGACGTTGCAGACTTG M L T L Q T（配列番号１５） および リバースプライマー： 5' CATCCTCGAGTTTCTCCTTGAGCAAACTTTGG 配列番号１１ XhoI を用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した。

【００９２】 前記フォワードプライマーはＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩ制限エンドヌクレア
ーゼ部位、及びその後にｇｐ１３０コード配列の開始と相補的なＤＮＡ配列が続
いているコンセンサス５’未翻訳配列を含有していた。前記リバースプライマー
は、その後に、ｇｐ１３０コード配列の細胞外ドメインの３’末端と相補的なＤ
ＮＡ配列が続いているＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を含有していた。該
ＰＣＲ断片を精製し、ｐＣＲ２．１ｇｐ１３０を与えるためにｐＣＲ２．１（Ｉ
ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にサブクローニングした。

【００９３】 プラスミドｐＣＲ２．１ｇｐ１３０を制限酵素ＢａｍＨＩとＸｈｏＩで消化し
、ｇｐ１３０断片を精製し、ヒトＩｇＧ１のＦｃ断片をコードするＤＮＡ配列を
含有するプラスミド中のＢａｍＨＩとＸｈｏＩエンドヌクレアーゼ部位の中にサ
ブクローニングした。続いて、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩでプラスミドを消化し、
得られたｇｐ１３０Ｆｃ断片を精製し、バキュロウイルス発現ベクター、ｐＦａ
ｓｔＢａｃ１（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のＨｉｎｄＩＩＩ部位中
にサブクローニングして、ｐＢＡＣｇｐＦｃと表記されるプラスミドを作成した
。

【００９４】 Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃバキュロウイルス発現システム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、昆虫細胞の中で融合タンパク質ｇｐ１３０Ｆｃを発
現した後、プロテインＡアフィニティーカラムクロマトグラフィーによって細胞
培養上清から精製し、クマシーブリリアントブルー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ及
び市販の抗ｇｐ１３０と抗ｈＩｇＧ抗体を用いたウェスタンブロット分析によっ
て確認した。ＩＣ_５０を得るために、３−６実験で変異及び野生型ＯＳＭ−ＧＳ
Ｔをテストした。ＯＳＭとｇｐ１３０−Ｆｃの存在下、拮抗するリガンドの不存
在下での平均ＯＤ（すなわち、総結合）は１．１５７（レンジ０．８２５−１．
８０７）であり、非特異的結合は、０．０８未満であった。抗ＯＳＭ抗体は、全
てのアッセイで濃度依存的な阻害をもたらした（１μｇ／ｍＬで７４±１％阻害
）。野生型ＯＳＭ−ＧＳＴは、プレートに結合したＯＳＭと競合して、６つの独
立した実験で決定された０．１３９±０．０２５８μｇ／ｍＬのＩＣ５０で、濃
度依存的な阻害を与えた（図１９）。変異ＯＳＭ−ＧＳＴがプレートに結合した
ｗｔＯＳＭと競合する効力は、表４にまとめられている。ｗｔＯＳＭとｇｐ１３
０の結合を競合する能力が実質的に減少した変異は、Ｌ１３Ａ、Ｑ１６Ａ、Ｑ２
０Ａ、Ｇ１２０Ａ、Ｎ１２３Ａ、及びＮ１２４Ａであった。これらのうち、Ｑ２
０ＡとＱ１６Ａは最も弱かった：テストした最大濃度（１０μｇ／ｍＬ）で、Ｑ
２０Ａは６６±２．３％の阻害を引き起こし、Ｑ１６Ａは１５±８％の阻害にす
ぎなかった（図１９）。

【００９５】 表４：野生型及び変異ＯＳＭ−ＧＳＴがＥＬＩＳＡにおいてプレートに結合した
ｗｔＯＳＭとｇｐ１３０−Ｆｃへの結合を競合する効力。ＩＣ_５０値は３−６の
独立した実験で決定された。

【００９６】

【表４】 例９ｄ：ＨｅｐＧ２ Ｂ６インビトロアッセイにおけるＯＳＭ駆動ｓＰＡＰ産生
に対するＯＳＭ中の点変異の影響 上記例７ｂに記載したアッセイを利用した。ＯＳＭ−ＧＳＴ変異体は、濃度が
明らかな例９ｂで作成したインタクトなＯＳＭ変異体を用いて、１００ｎｇ／ｍ
Ｌの濃度に希釈した。対照用に野生型ＯＳＭ−ＧＳＴを含有せしめた。１％の熱
で不活化されたＦＣＳ、低アルカリホスファターゼ活性のＨｅｐＧ２ Ｂ６溶媒
で希釈を行った。続いて、１：３の連続希釈を行った（１００；３３．３３；１
１．１１；３．７；１．２３；０．４ｎｇ／ｍＬ）。１００μＬの溶媒中、９６
穴のプレートの各ウェルの中に３×１０^４個のＨｅｐＧ２ Ｂ６を分配した。４
８時間、細胞を平衡化させた。続いて、溶媒を取り除き、１００μＬの希釈され
たＯＳＭ−ＧＳＴ変異体で置換した。さらに２０時間細胞をインキュベートした
。各希釈は３個ずつ行った。２０μＬの溶媒を除去し、基質としてｐＮＰＰを用
いてｓＰＡＰをアッセイした。内在性ＡＬＰはＬ−ホモアルギニンでブロックし
た。Ｏ．Ｄ．は、４０５−６５０ｎｍで読んだ。実験は、２回繰り返した。

【００９７】 多くの変異体は、野生型と同じように、ｓＰＡＰの放出を駆動することができ
た。３つの変異体は、極めて低レベルのｓＰＡＰを産生した。ＥＣ_５０は、これ
らの変異体からは得られなかった。（図２０）は、ｓＰＡＰの産生を駆動する効
率がより低い「変異体９（Ｑ１６Ａ）、１３（Ｑ２０Ａ）、及び２０（Ｇ１２０
Ａ）から得られたＯ．Ｄ．プロットを示している。野生型ＯＳＭ−ＧＳＴを比較
のために示す。これらのデータは、ＥＣ_５０値を算出するために使用した。各変
異体に対する実際のＥＣ_５０、及び野生型のパーセントとしての表記が表５に示
されている。

【００９８】

【表５】 この表を調べると、ＥＬＩＳＡにおいて野生型とは相当異なるそれらの変異体
のうち３つは、ｓＰＡＰアッセイでもより効力が低く、６−Ｌ１３Ａ；１０−Ｌ
１７Ａ；２２−Ｎ１２３Ａ、及び４番目の２３−Ｎ１２４Ａは、任意的なスコア
リングシステムにより、同等の効力グレードに区分される。このように、両タイ
プのアッセイは、良好な一致を示している。変異体の幾つかは、ｓＰＡＰ産生の
駆動において野生型より「効力」が低かったが、ｓＰＡＰを全く駆動しなかった
変異体（Ｑ１６Ａ、Ｑ２０Ａ、Ｇ１２０Ａ）での実験を除く２つの実験の間には
変動があった。該アッセイ結果は、Ｇ１２０Ａ、Ｑ１６Ａ、及びＱ２０ＡはＯＳ
Ｍのｇｐ１３０への結合に影響を与えることを示している。Ｎ１２３ＡとＮ１２
４Ａもｇｐ１３０との相互作用に幾らかの影響を有するようである。

【００９９】 例１０：胃炎におけるＯＳＭの役割 Ｈ．ピロリは、胃炎、消化性潰瘍性疾患、及び胃癌を引き起こすと推測されて
いるらせん状のグラム陰性細菌である。Ｈ．ピロリＣａｇ＋株は、Ｈ．ピロリＣ
ａｇ−株よりも潰瘍の発生率が高い。ディファレンシャル遺伝子発現分析によっ
て、宿主のＨ．ピロリ感染に対する応答を調べるために、Ｈ．ピロリ株（より病
原性の強いＣａｇ＋、及びＣａｇ−）を胃内皮細胞株ＫＡＴＯ ＩＩＩ（ＥＣＡ
ＣＣ）と共にインビトロで培養した。４５分、３時間、及び２４時間の３つの時
点でｍＲＮＡを単離し、由来する放射性プローブを（サイトカイン、サイトカイ
ン受容体、及び接着分子を含むおよそ１３６のヒト遺伝子を含有する）高密度ｃ
ＤＮＡ遺伝子アレイにハイブリダイズさせた。得られた遺伝子発現のプロフィー
ルの分析によって、Ｈ．ピロリ株に応答した多数の遺伝子の誘導／抑制が明らか
になった。オンコスタチンＭは、病原性が弱いＨ．ピロリ（Ｃａｇ−）に暴露さ
れた細胞又は未処置の対照に比べて、病原性が強いＨ．ピロリ（Ｃａｇ＋）株に
暴露された細胞中で誘導されることが見出された。

【図面の簡単な説明】

【図１】 滑膜生検培養物によるエクソビボでのオンコスタチンＭの分泌を示すＥＬＩＳ
Ａを示す図。

【図２】 炎症性であるが、非炎症性でない滑膜培養物によるエクソビボでのオンコスタチ
ンＭの自発的分泌を示す図。

【図３】 ＰＭＡで分化されたＴＨＰ−１細胞によるｒｈＯＳＭのＴＮＦα産生の効果を
示す図。

【図４】 ＯＳＭとＴＮＦαとのエクソビボでのコラーゲン放出を促進する協働作用を示
す図。

【図５】 ＯＳＭとＴＮＦαとのエクソビボでのコラーゲン放出を促進する協働作用を示
す図。

【図６】 抗Ｌ−セレクチン抗体を介したＯＳＭの分泌を示す図。

【図７】 フコイダンで誘導されたＯＳＭの分泌を示す図。

【図８】 ｇｐ１３０Ｐ及びＥ−セレクチン抗体を用いたＲＡの血管内皮細胞の染色を実
証した顕微鏡写真。

【図９】 ｇｐ１３０Ｐ及びＥ−セレクチン抗体を用いたＲＡの血管内皮細胞の染色を実
証した顕微鏡写真。

【図１０】 対照及びＣＩＩ−関節炎マウスから得た関節中のＯＳＭのｍＲＮＡを示す図。

【図１１】 ヤギ抗ＯＳＭ抗体又は対照ヤギＩｇＧで処置した関節炎ＤＢＡ−１マウスを示
す図（１１Ａは臨床スコア、１１Ｂは肢の厚さ）。

【図１２】 コラーゲン関節炎マウスにおける関節の浸潤と軟骨の損傷を比較した組織学的
データを示す図（対照マウスは、ＰＭＮ及び単核細胞による関節への著しい浸潤
を示した）。

【図１３】 コラーゲン関節炎マウスにおける関節の浸潤と軟骨の損傷を比較した組織学的
データを示す図（関節の軟骨の表面破壊は、広い好中球の浸潤を特徴とした）。

【図１４】 コラーゲン関節炎マウスにおける関節の浸潤と軟骨の損傷を比較した組織学的
データを示す図；細胞の浸潤レベルが顕著に減少しており関節の軟骨が損傷され
ていないことを実証する、正常／穏やかな関節炎の抗ＯＳＭ処理した動物の代表
的な関節。

【図１５】 コラーゲン関節炎マウスにおける関節の浸潤と軟骨の損傷を比較した組織学的
データを示す図；細胞の浸潤レベルが顕著に減少しており関節の軟骨が損傷され
ていないことを実証する、正常／穏やかな関節炎を有する抗ＯＳＭ処理した動物
の代表的な関節。

【図１６】 ＯＳＭに誘導されたｓＰＡＰ放出の濃度依存性阻害を示すＮ−（１Ｈ−ピラゾ
ロ［３，４−ｄ］ピリミジンー４イル）ベンズアミドに対するＨｅｐＧ２ Ｂ６ ｓＰＡＰ及びＭＴＳアッセイを示す図。

【図１７】 Ａ５４９細胞からのＴＮＦα誘導性ｓＰＡＰの放出の限られた阻害を示すＮ−
（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンー４イル）ベンズアミドに対するＴ
ＮＦα ｓＰＡＰ及びＭＴＳアッセイを示す図。

【図１８】 ＨｅｐＧ２ Ｂ６アッセイにおけるｓＰＡＰ産生の抗体阻害を示す図（Ｍ２―
Ｍ４は、４匹のマウス個体から採取したマウスの血清を表し、ＯＭ５−６．１、
ＯＭ５−６．１０、ＯＭ６−１０．１１１は実験的に得られたハイブリドーマの
上清を表す）。

【図１９】 野生型及びプレートに結合した野生型ＯＳＭとの変異ＯＳＭ−ＧＳＴ融合体と
のＥｌｉｓａにおけるｇｐ１３０−ｆｃへの結合の拮抗を示す図。

【図２０】 ＨｅｐＧ２細胞におけるｓＰＡＰ産生を引き起こす活性が最少である３つの変
異ＯＳＭ−ＧＳＴのＯ．Ｄ．プロットを示す図。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１２年３月３日（２０００．３．３）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 29/00 １０１ Ａ６１Ｐ 29/00 １０１ 43/00 １１１ 43/00 １１１ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ (71)出願人 Ｇｌａｘｏ Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｈｏｕｓ ｅ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ａｖｅｎｕｅ Ｇ ｒｅｅｎｆｏｒｄ，Ｍｉｄｄｌｅｓｅｘ ＵＢ６ ０ＮＮ，Ｇｒｅａｔ Ｂｒｉｔａ ｉｎ Ｆターム(参考） 4C084 AA19 AA24 MA01 MA02 NA05 NA14 ZA961 ZB081 ZB111 ZB151 ZB261 ZC191 ZC201 4C085 AA13

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 炎症性関節症又は炎症性疾患を治療するための医薬を製造す
   るためのＯＳＭ又はＯＳＭ受容体のアンタゴニストの使用。
2. 【請求項２】 前記アンタゴニストがヒトＯＳＭに対するアンタゴニストで
   ある請求項１に記載の使用。
3. 【請求項３】 前記アンタゴニストがヒトＯＳＭのＧ１２０、Ｑ１６、Ｑ２
   ０、Ｎ１２３、又はＮ１２４のうちの一以上と相互作用する請求項２に記載の使
   用。
4. 【請求項４】 前記アンタゴニストがＯＳＭ受容体ｇｐ１３０のアンタゴニ
   ストである請求項１に記載の使用。
5. 【請求項５】 前記アンタゴニストが小有機分子である先行する請求項の何
   れかに記載の使用。
6. 【請求項６】 前記アンタゴニストが抗体である請求項１〜４の何れか１項
   に記載の使用。
7. 【請求項７】 前記抗体がヒト化又はキメラ化されている請求項６の使用。
8. 【請求項８】 前記医薬が軟骨からのコラーゲンの放出を阻害又は抑制する
   ために使用される先行する請求項の何れかに記載の使用。
9. 【請求項９】 慢性関節リウマチの治療のための先行する請求項の何れかに
   記載の使用。
10. 【請求項１０】 少なくとも１ｍｇの単位用量のＯＳＭに対するアンタゴニ
    ストと薬学的に許容される担体を含んだ薬学的組成物。
11. 【請求項１１】 先行する請求項の何れかに記載の使用又は薬学的組成物で
    あって、前記アンタゴニストが免疫抑制剤、耐性誘導剤、又は抗炎症剤と併用さ
    れる使用又は薬学的組成物。
12. 【請求項１２】 前記アンタゴニストがＣＤ＋４Ｔ細胞阻害剤、抗ＣＤ２３
    抗体、又はＴＮＦアンタゴニストと併用される使用又は薬学的組成物。
13. 【請求項１３】 ＯＳＭ又はＯＳＭ結合部とＯＳＭ受容体又は試験物質との
    受容体コンジュゲートを混合することと、ＯＳＭ又はＯＳＭ結合部とＯＳＭ受容
    体又は受容体コンジュゲートとの相互作用の阻害をモニターすることとを備えた
    ＯＳＭアンタゴニストを同定するためのアッセイ。
14. 【請求項１４】 受容体コンジュゲートはｇｐ１３０−Ｆｃ融合タンパク質
    である請求項１３に記載のアッセイ。