PT1071449E - Utilização de um anticorpo antagonista para o mediador inflamatório oncostatina m ( osm ) - Google Patents

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DESCRIÇÃO "UTILIZAÇÃO DE UM ANTICORPO ANTAGONISTA PARA O MEDIADOR INFLAMATÓRIO ONCOSTATINA M (OSM)" A presente invenção refere-se à utilização de um antagonista de OSM na preparação de um medicamento para o tratamento ou profilaxia de uma artropatia inflamatória ou distúrbio inflamatório e métodos de selecção para esses antagonistas. A artrite reumatóide (AR) é uma doença inflamatória crónica que afecta articulações, caracterizada por hiperplasia sinovial e infiltração celular extensa por células mononucleares e leucócitos polimorfonucleares (PMN). Uma interacção complexa e pouco compreendida entre tipos de células residentes e infiltrantes conduz à secreção crónica de metaloproteinases (MMPs), resultando na destruição da cartilagem articular, ligamentos e osso subcondral (Firestein GS Current Opinion in Rheumatology. 4:348-54, 1992). Entre as numerosas citocinas pró-inflamatórias implicadas em accionar a patologia articular da AR, foi demonstrado que o TNFa desempenha um papel essencial, com as terapias anti-TNFa a apresentarem claros benefícios (Eliott MJ. et ai. Lancet. 344(8930):1105-10, 1994). O TNFa medeia vários efeitos patológicos incluindo a indução de MMPs (Dayer JM. et ai. Journal of Experimental Medicine. 162(6):2163-8, 1985), regulação positiva de outras citocinas pró-inflamatórias (Haworth C. et ai. European Journal of Immunology. 21(10):2575-9, 1991 e Dinarello CA et ai. Journal of Experimental Medicine, 163(6):1433-50, 1986) e adesão de PMN e migração celular transendotelial aumentadas (Smart SJ. Casale TB American Journal of Physiology. 266:L238-45, 1994). Embora o 1 TNFoí seja visto actualmente como o iniciador da cascata de citocinas pró-inflamatórias, é conhecido relativamente pouco da sua regulação positiva (M. de Feldmann et al. Annual Review of Immunology. 14:397-440, 1996). Ά oncostatina M (OSM) (Rose TM. Bruce AG. PNAS USA 88(19):8641-5 de, 1991) é uma glicoproteina de 28 kDa que pertence a uma familia de citocinas que compreende IL-6, IL-11, factor inibitório da leucemia (LIF), factor neurotrófico ciliar (CNTF) e cardiotrofina 1 (CT-1) (Taga T. Kishimoto T. Annual

Review of Immunology. 15:797-819, 1997). Todos os membros

partilham de uma cadeia de sinalização comum, gpl30, como parte de uma familia complexa de receptores hetero- e homodiméricos (Grotzinger J. et al. [Artigo] Proteins. 27(1):96-109, 1997). A OSM partilha de um receptor heterodimérico comum com LIF, (LIFr: gpl30, tipo I) e tem também o seu próprio receptor único que compreende a cadeia OSMrp e gpl30 (tipo II) (Mosley B. et al. [Artigo] Journal of Biological Chemistry. 271(51):32635-32643, 1996). A OSM é à muito tempo conhecida pelos efeitos no crescimento e diferenciação celular (Horn D. et al. [Artigo de Revista] Growth Factors. 2(2-3):157-65, 1990). Recentemente, foi também demonstrado em murganhos in vivo que a OSM tem potentes propriedades pró-inflamatórias (Modur V. et al. J. Clin Invest. 100:158-168, 1997) e demonstra potente sinergia com IL-1 para promover degradação da cartilagem articular em sistemas de modelo, ex-vivo (Cawston T. Biochemical & Biophysical Research Communications. 215(1):377-85, 1995). A OSM induz um aumento prolongado em P-selectina (e E-selectina) em células endoteliais (Yao L. et al. Journal of Experimental Medicine. 184(1):81-92, 1996), estimula a actividade do activador de plasminogénio de tipo urocinase em fibroblastos sinoviais humanos (Hamilton J. et al. Biochemical & 2

Biophysical Research Communications. 180(2):652-9, 1991) e é um poderoso indutor de IL-6 a partir de células endoteliais (Brown Tj . et al. Journal Of Immunology. 147(7):2175-80, 1991, 1 Out) . A OSM foi recentemente medida em AR mas não em liquido sinovial de OA (Hui W. et al. Annals Of The Rheumatic Diseases. 56(3):184-187, 1997) e sinóvia, cuja produção foi localizada em macrófagos (1997, Okamoto H et al. Arthritis and Rheumatism 40(6): 1096-1105) e Cawston et al. (1998, Arthritis and

Rheumatism, 41(10) 1760-1771). Até à data, mais experiências neste campo foram especulativas com base na semelhança dos membros da subfamilia IL-6 (Carrol G. et al. Inflamm. Res. 47 (1998) 1-7).

Os presentes requerentes descobriram que a OSM tem a capacidade para induzir a secreção de TNFa em macrófagos. Ao contrário de dados recentes, sugerindo que a OSM regula positivamente a produção de inibidor tecidual de metaloproteinase - 1 (TIMP-1) (Nemoto et al. 1996, A&R 39(4), 560-566), que complexa com e inactiva MMP-1 e seria, deste modo, esperado diminuir a libertação de colagénio, os requerentes verificaram que a OSM induz a secreção de TNFa, sugerindo-lhes que a OSM pode, de facto, desempenhar um papel na mediação da destruição da cartilagem. Com base nesta verificação, os presentes requerentes demonstraram que a administração terapêutica de um anticorpo neutralizante anti-OSM sem a inibição de outros membros da familia IL-6 pode isoladamente melhorar a artrite induzida por colagénio num modelo de murganho. A sinergia de OSM com TNFa para promover a libertação de colagénio a partir da cartilagem foi subsequentemente demonstrada por T. Cawston et al. (1998, Arthritis and Rheumatism, 41 (10) 1760-1771). O documento EP 451612 ensina a utilização de um anticorpo para OSM, para o tratamento de distúrbios de crescimento celular. 3

De acordo com a presente invenção, é deste modo proporcionada a utilização de um antagonista de OSM na preparação de um medicamento para o tratamento ou profilaxia de uma artropatia inflamatória ou distúrbio inflamatório. Uma utilização particular de um antagonista de OSM é na preparação de um medicamento para prevenir ou reduzir a libertação de colagénio a partir da cartilagem. A invenção proporciona ainda um método para o tratamento ou profilaxia de uma artropatia inflamatória ou distúrbio inflamatório que compreende a administração de uma quantidade eficaz de um antagonista de OSM a um doente que sofre desse distúrbio. 0 antagonista pode funcionar por bloqueamento da interacção de OSM com o receptor de OSM, gp 130, ou de outros receptores de OSM, cadeia OSMr|3 ou LIFr, ou por bloqueamento da formação de heterodimeros destas proteínas, e como tal prevenir a ligação de OSM e sinalizando, desse modo, a redução da síntese de citocinas pró-inflamatórias e/ou MMPs. De acordo com a invenção, o antagonista pode, deste modo, ser um ligando quer para OSM ou um ou mais dos receptores de OSM (gpl30, OSM^ ou LIFr) ou um agente capaz de interferir com estas interacções de um modo que afecte a actividade biológica de OSM. A referência, aqui apresentada adiante, a um antagonista para OSM pode ser aceite como significando quer um antagonista para a própria OSM ou a um dos seus receptores.

No documento US 5571513, são divulgados anticorpos monoclonais anti-gpl30 obtidos a partir de hibridomas 4B11 e 2H4. A divulgação contempla a utilização destes anticorpos no tratamento da componente de fase aguda da inflamação. Contudo, Yoshida et al; Contemporary Immunology, Humana Press, demonstram que uma destruição homozigógita de gpl30 é letal e conduz a distúrbios miocárdicos e hematológicos. 4

Vandenabeele et al.; Trends in Cell Biology, pp392-399 (1995) explicam que o TNF não sinaliza através da subunidade gpl30 mas através do seu próprio conjunto de receptores. Richards, C.D. et al. explicam que tanto a OSM humana (J. Immunol. (1993) 150, pp5596-5603) como a OSM murina (J. Immunol. 1997) pp2431-2437) regulam positivamente. A produção de inibidor tecidular de metaloproteinase (TIMP). Os complexos TIMP e inactivam metaloproteinases de matriz. Estes artigos explicam que essa indução selectiva de TIMP-1 por OSM pode ser influente na alteração da destruição da matriz em inflamação crónica. Trepicchio, W.L. et al., J. Immunol., 1996, 157:3627-3634 explicam que IL-11 é anti-inflamatória. Xing, et al; J. Cellular Immunol., 101 (2) pp311-320, Jan 1998, explicam que IL-6 é anti-inflamatória. Ichihara M, et al., 1997, Blood, 90 ppl65-173, demonstram que, em murganhos, a OSM e o LIF não utilizam o mesmo receptor, sugerindo que estudos que utilizam OSM humana em murganhos resultam em efeitos mediados através do receptor de LIF e não o receptor de OSM.

Os presentes requerentes demonstraram também que no endotélio vascular sinovial da artrite reumatóide, a P e E-selectina se co-localizam com gpl30, o elemento de sinalização dos receptores de OSM de tipo I e II. Sem desejar estar ligado à teoria, isto indica que a OSM, produzida por macrófagos sinoviais pode iniciar o endotélio vascular da AR para facilitar o recrutamento de leucócitos, através de regulação positiva da P e E-selectina. A constatação que a ligação de L-selectina quer por anticorpo especifico ou fucoidano (agonista de L-selectina) conduz as células mononucleares humanas a segregar OSM, pode ser altamente significativa em termos de amplificação da resposta inflamatória, por proporcionar uma fonte local adicional de OSM para dirigir TNFa e P e E-selectina. 5

Foram identificados os resíduos de aminoácidos que são importantes para a interacção de OSM com gpl30. A partir da sequência de aminoácidos publicada de OSM (Malik et al., 1989,

Mol. Cell Biol., 9(7), 2847-53, sequência de ADN com a entrada M27288 na base de dados do EMBL, sequência de proteína com a entrada P13725 em Swissprot) estes são G120, Q16 e Q20; N123 e N124 podem também desempenhar um papel (ver abaixo). Os primeiros 25 resíduos são um péptido de sinal, e a proteína madura começa na sequência AAIGS. A sequência é numerada a partir do primeiro aminoácido da proteína madura, como mostrado. 1 5 15 25 35 MGVLLTQRTL LSLVIALLFP SMASMAAIGS CSKEYRVXLG QLQKQTDLMQ DTSRLLDPYI 45 55 65 75 85 95 RIQGLDVPKL REHCRERPGA FPSEETLRGL GRRGFLQTLN ATLGCVLRRL ADLEQRLPKA 105 115 125 135 145 155 EDLEKLQMftR PHILGLRNNI YCMAQLLDNS OTAEPTKAGR GASQPPTPTP 165 175 185 195 205 215 ASDAFORKLE gcrflhgyhr fmhsvgrvfs krgesphrsr rhsphqalrk gvrrtrpsrk 225 227

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Deste modo, a invenção proporciona ainda um antagonista ou agente capaz de interacção com um ou mais destes resíduos específicos e/ou os sítios de ligação que ajudam a definir na OSM, para alterar a actividade biológica da OSM.

As artropatias inflamatórias que podem ser tratadas de acordo com esta invenção incluem a artrite reumatóide, artrite psoriática, artrite juvenil, osteoartrite inflamatória e/ou artrite reactiva. Os distúrbios inflamatórios que podem ser tratados incluem, entre outros, a doença de Crohn, colite ulcerosa, gastrite, por exemplo, gastrite resultante da infecção 6 com H. pylori, asma, doença pulmonar obstrutiva crónica, doença de alzheimer, esclerose múltipla e psoriase.

Os antagonistas potenciais de OSM incluem moléculas orgânicas pequenas, iões que interactuam especificamente com OSM, por exemplo, um substrato, possivelmente um componente da membrana celular natural, um receptor ou um ligando natural, um seu fragmento ou um péptido ou a outra molécula proteica, sendo particularmente preferida uma forma mutante não sinalizadora de OSM que vai bloquear a ligação de OSM ao receptor de OSM, mas também moléculas modificadas de OSM. Esses antagonistas podem ser na forma de ADN que codifica a proteina ou péptido e podem ser transferidos para expressão in vivo do referido antagonista. Os antagonistas podem ser vacinas que compreendem essas moléculas de proteina ou de péptido ou ADN, concebidas para produzir um efeito antagonistico para OSM, através da indução de respostas de anticorpo in vivo dirigidas para OSM nativo. Esses antagonistas podem também incluir anticorpos, reagentes derivados de anticorpos ou moléculas quiméricas. Está incluido na definição de antagonista um mimético estrutural ou funcional de qualquer uma molécula descrita acima. Estão também contempladas moléculas de ácidos nucleicos, tais como, aptâmeros de ADN ou ARN.

Os antagonistas preferidos incluem pequenas moléculas orgânicas. Esses compostos podem ser de qualquer classe de compostos mas serão seleccionados na base da sua capacidade para afectar a actividade biológica de OSM, através de um dos mecanismos descritos acima, e será fisiologicamente aceitável, i. e., não tóxico ou demonstrando um nivel aceitável de toxicidade ou outros efeitos colaterais. Uma classe de compostos que pode proporcionar antagonistas úteis são os ribonucleósidos, tais como, N-(lH-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4il)benzamida); Davoll e Kerridge, J. Chem Soc., 2589, 1961) 7

Outros antagonistas preferidos incluem anticorpos, seus fragmentos ou construções artificiais que compreendem anticorpos ou seus fragmentos ou construções artificiais concebidas para mimetizar a ligação de anticorpos ou seus fragmentos. Essas construções são discutidas por Dougall et al. em Tibtech 12, 372-379) (1994).

Estão também incluídos na definição de anticorpo, anticorpos recombinantes, tais como, anticorpos humanos recombinantes, que podem ser utilizados. Os anticorpos podem ser alterados, i. e., podem ser anticorpos "quiméricos" que compreendem os domínios variáveis de um anticorpo dador e os domínios constantes de um anticorpo humano (como descrito no documento WO86/01533) ou podem ser anticorpos "humanizados" em que apenas os CDRs são derivados a partir de uma espécie diferente do que a estrutura dos domínios variáveis do anticorpo (como divulgado no documento EP-A-0239400). As regiões determinantes de complementaridade (CDRs) podem ser derivadas a partir de um anticorpo monoclonal de roedor ou primata. A estrutura dos domínios variáveis, e os domínios constantes, do anticorpo alterado é geralmente derivada a partir de um anticorpo humano. Esse anticorpo humanizado não deve provocar uma tão grande resposta imune quando administrada a um ser humano comparativamente à resposta imune produzida por um ser humano contra um anticorpo totalmente estranho, tal como um derivado a partir de um roedor.

Os antagonistas preferidos incluem anticorpos completos, fragmentos F(ab')2, fragmentos Fab, fragmentos Fv, fragmentos ScFv, outros fragmentos, péptidos de CDR e miméticos. Estes podem ser obtidos/preparados por especialistas na técnica. Por exemplo, pode ser utilizada digestão enzimática para obter fragmentos F(ab')2 e Fab (ao submeter uma molécula de IgG a clivagem por pepsina ou papaína, respectivamente). Na seguinte descrição as referências a "anticorpos" devem consideradas como incluindo todas as possibilidades mencionadas acima.

Como será entendido pelos especialistas na técnica, onde são aqui descritos antagonistas proteicos ou peptidicos específicos, também podem ser utilizados derivados desses antagonistas. O termo "derivado" inclui variantes dos antagonistas descritos, tendo uma ou mais substituições, delecções ou inserções de aminoácidos relativamente aos referidos antagonistas, embora tendo ainda a actividade de ligação descrita. De um modo preferido, estes derivados têm identidade substancial da sequência de aminoácidos com os antagonistas especificados. 0 grau de identidade da sequência de aminoácidos pode ser calculado utilizando um programa, tal como "bestfit" (Smith e Waterman, Advances in Applied Mathematics, 482-489 (1981)), para encontrar o melhor segmento de semelhança entre quaisquer duas sequências. 0 alinhamento é baseado na maximização da pontuação conseguida utilizando uma matriz de semelhanças de aminoácidos, tal como aquela descrita por Schwarz e Dayhof (1979) Atlas of Protein Sequence and Structure, Dayhof, M.O., Ed pp 353-358.

De um modo preferido, o grau de identidade de sequência é, pelo menos, 50% e, de um modo mais preferido é, pelo menos, 75%. Identidades de sequência de, pelo menos, 90% ou de, pelo menos, 95% são muito preferidas. Não obstante, será entendido pelo especialista que graus elevados de identidade de sequência não são necessariamente requeridos uma vez que vários aminoácidos pode ser frequentemente substituídos por outros aminoácidos que têm propriedades semelhantes sem alterar substancialmente ou afectar adversamente determinadas propriedades de uma proteína. Estas são por vezes referidas como alterações "conservadoras" de aminoácidos. Assim, os aminoácidos glicina, valina, leucina ou isoleucina podem frequentemente ser substituídos por outro que 9 inclui:- fenilalanina, tirosina e triptofano (aminoácidos que têm cadeia laterais aromáticas); lisina, arginina e histidina (aminoácidos que têm cadeias laterais básicas); aspartato e glutamato (aminoácidos que têm cadeias laterais acidicas); asparagina e glutamina (aminoácidos que têm cadeias laterais de amida) e cisteina e metionina (aminoácidos que têm cadeias laterais contendo enxofre). Assim, o termo "derivado" pode também incluir uma variante de uma sequência de aminoácidos que compreende uma ou mais dessas alterações "conservadoras" relativamente à referida sequência. A presente invenção inclui também fragmentos dos antagonistas da presente invenção ou dos seus derivados que têm ainda a actividade de ligação descrita. Os fragmentos preferidos têm, pelo menos, dez aminoácidos de comprimento, mas podem ser mais longos (e. g., até 50 ou até 100 aminoácidos de comprimento).

Os antagonistas preferidos adicionais de OSM para utilização na invenção são ligandos oligonucleotídicos. A evolução sistemática de ligandos através de enriquecimento exponencial (SELEX) é um protocolo em que vastas bibliotecas de oligonucleótidos de cadeia simples são seleccionadas para uma actividade desejada contra uma proteína alvo ou outra molécula (Tuerk & Gold 1990 Science 249, 505-510, Green et al., 1991 Meths. Enzymol. 2 75-86/ Gold et al., 1995 Annu. Rev Biochem 64, 763-797/ Uphof et al., 1996 Curr. Opin. Struct. Biol. 6, 281-288). O produto desta selecção é uma única sequência de oligonucleótidos denominada um aptâmero com a actividade desejada, geralmente com ligação de elevada afinidade para a proteína alvo. O processo SELEX é geralmente iniciado com uma biblioteca de ADN ou ARN que consiste em cerca de 1014-1015 sequências aleatórias de oligonucleótidos. Numa biblioteca de 10 oligonucleótidos totalmente aleatória, cada molécula apresentará uma estrutura terciária única que será inteiramente dependente da sequência de nucleótidos dessa molécula. Assim, quando seleccionada contra uma proteína alvo, a afinidade de ligação do oligonucleótido para essa proteína será determinada através do ajuste entre a forma do oligonucleótido e os epitopos na proteína alvo. Como uma consequência de começar a partir de uma biblioteca de vasta diversidade é habitual ser-se capaz de identificar aptâmeros de afinidade sub-nM para a proteína alvo com selectividade para essa proteína alvo relativamente a outras proteínas com homologia estrutural global (Tuerk & Gold 1990 supra, Green et al., 1991 supra; Gold et al., 1995 supra; Uphof et al., 1996 supra). Utilizando metodologia SELEX, foram gerados aptâmeros de ARN ou ADN para mais de 100 proteínas e pequenas moléculas, incluindo dopamina (Mannironi et al., 1997 Biochemistry 36, 9726-9734), substância P (Nieuwlandt et al., 1995 biochemistry 34, 5651-5659), elastase de neutrófilo humano (Bless et al., 1997 Current biol. 7, 877-880), Factor de

Crescimento Derivado de Plaqueta (PDGF) (Green et al., 1996 Biochemistry 35, 14413-14424), Factor de Crescimento Endotelial

Vascular (VEGF) (Green et al., 1995 Chem Biol. 2, 683-695), trombina (Bock et al., 1992 Nature 355, 564-66) e L-selectina (O' Connell et al., 1996 PNAS USA 93, 5883-5887).

Foi demonstrado que um número de aptâmeros têm actividade biológica, geralmente antagonismo de receptor ou inibição enzimática, tanto in vltro como In vivo. Por exemplo, foram gerados aptâmeros de ARN com afinidade elevada e actividade inibitória para a elastase de neutrofilo humano (hNE) através de SELEX misturada (Bless et al., 1997 supra). No seguimento de modificação pós-SELEX para aumentar a estabilidade in vivo, o aptâmero foi testado num modelo de rato da inflamação pulmonar (Bless et al., 1997 supra). Num segundo exemplo foi gerado um 11 aptâmero de ADN de 4 9 nucleótidos de comprimento para a L-selectina humana com afinidade nM para a proteína (0'Connell et ai., 1996 supra). 0 aptâmero apresenta selectividade de 600 vezes para L-selectina relativamente a E-selectina e

selectividade de 10 000 vezes relativamente a P-selectina. A injecção intravenosa de uma formulação de PEG do aptâmero inibiu o movimento de PBMC humano marcado radioactivamente para os nódulos linfáticos, mas não para outros órgãos, de um modo dependente da dose (Hicke et ai., 1996 J. Clin. Invest. 98, 2688-2692). Num terceiro exemplo foram produzidos aptâmeros de ARN de afinidade elevada contra o VEGF humano para investigar o papel do VEGF na angiogénese (Jellinek et ai., 1994 Biochemistry 33, 10450-10456; Green et ai., 1995; Ruckman et ai., 1998. J.

Biol. Chem 273, 20556-20567; Willis et ai., 1998 Bioconjug.

Chem. 9, 573-582). Uma formulação lipossomal do aptâmero de VEGF inibe a proliferação celular endotelial induzida pelo VEGF in vitro e o aumento da permeabilidade vescular e a angiogénese in vivo (Willis et ai., 1998 supra). Deste modo, é proporcionado um ligando oligonucleotídico de OSM para utilização na invenção.

Para produzir um aptâmero para utilização na invenção, como descrito acima, a OSM ou um receptor deve ser primeiro ligado a placas para selecção. Podem ser depois realizados ciclos iterativos de selecção e amplificação (i. e., o processo SELEX) de acordo com Fitzwater e Polisky (Meths in Enzymol. 267, 275- 301) para gerar aptâmeros de ADN ou ARN para a OSM humana. Tipicamente, estes aptâmeros são aptâmeros de ARN modificados, uma vez que o ARN proporciona a maior diversidade estrutural e, deste modo, a possibilidade de gerar moléculas de elevada afinidade. No seguimento da geração de um aptâmero de elevada afinidade, pode ser realizado um número de protocolos de optimização pós-SELEX para aumentar a estabilidade do aptâmero, para truncar o aptâmero numa sequência nuclear (os aptâmeros 12 têm, tipicamente, 100 ou menos oligómeros) que é mais acessível para síntese em fase sólida reduzindo, deste modo, o custo da síntese, e para desenvolver formulações para utilização in vivo.

No primeiro destes processos, o aptâmero pode ser truncado para reduzir o comprimento da molécula a uma sequência nuclear requerida para a actividade. A sequência nuclear curta, frequentemente entre 20 e 40 nucleótidos de comprimento, irá ser mais barata e mais rapidamente sintetizada e pode ter uma biodisponibilidade aumentada. A informação relativamente à composição da sequência nuclear pode ser obtida a partir de comparações de homoloqia de sequência. Contudo, as experiências de truncamento envolvem geralmente a síntese de aptâmeros sequencialmente mais curtos até ser gerada uma sequência mínima requerida para a actividade. Isto envolve geralmente a remoção de sequências fixas, mas existem numerosos exemplos em que nucleótidos dentro da sequência fixa têm contribuído para a afinidade do aptâmero (Fitzwater e Polisky, 1996 supra; Ruckman J, et al. (1998) J. Biol. Chem. 273. 20556-20567. Green et al., 1995 supra). Deste modo, a invenção pode proporcionar aptâmeros que são versões truncadas ou prolongadas do aptâmero seleccionado ou um que demonstra uma homologia maior que 7 0% em sequência para um aptâmero seleccionado.

No seguimento do truncamento, pode ser realizado um número de experiências de modificação de base para melhorar a estabilidade do aptâmero, através de protecção contra clivagem por ribonuclease. Durante o SELEX, não é possível incluir bases de purina modificadas em 2' uma vez que a polimerase T7 utilizada para transcrição in vitro não vai tolerar esta modificação. Assim, para aumentar a estabilidade do aptâmero pós-SELEX, é habitual substituir as bases de purina dentro do aptâmero com purinas modificadas em 2'. Esta modificação é 13 geralmente através da utilização de purinas 2'-0-metilo embora possam ser utilizadas outras purinas modificadas, incluindo purinas 2'-amino ou purinas 2'-fluoro (Ruckman et al., 1998 supra; Green et al., 1995 supra). Isto tem que ser realizado de um modo sequencial uma vez que esta modificação, pós-SELEX, também pode resultar numa perda de afinidade (Green et al., 1995 supra) .

No seguimento do truncamento e estabilização, é possível gerar quantidades muito grandes de um aptâmero curto totalmente modificado que pode ser sintetizado através de sintese química à escala sólida. Podem ser adicionadas muitas moléculas à extremidade 5' do aptâmero para facilitar a utilização do aptâmero ou para formular um aptâmero para distribuição in vivo. Isto inclui uma unidade em gaiola para auxiliar na imagiologia (Hnatowich D. J. (1996) Q. J. Nucl. Med. 40. 202-8.), fluoresceína para auxiliar na detecção molecular (German et al., 1998 anal. Chem. 70. 4540-5.), um grupo lipídico para auxiliar na inserção num lipossoma (Willis et al., 1998 supra), ou conjugação a uma molécula pequena de fármaco ou péptido (Charlton J, et al. (1997b) Biochemistry 36, 3018-3026). De um modo geral, a adição de uma molécula à extremidade 5' de um aptâmero não resulta numa perda de afinidade ou especificidade.

Para melhorar a semi-vida in vivo, os aptâmeros têm sido modificados através da adição de moléculas de polietilenoglicol (PEG) ou através da incorporação em lipossomas. Em ambos os casos, essa modificação pode causar um aumento significativo na semi-vida in vivo (Willis et al., 1998 supra).

Para além das formulações lipossomais, os aptâmeros têm sido formulados tanto com PEG 20K como 40K, para aumentar a estabilidade sérica in vivo. Foi gerado um aptâmero de ADN 14 contra a L-selectina humana. Para aumentar a estabilidade in vivo, foi acoplado um éster de PEG 20K ao aptâmero através da unidade da amina do terminal N. Foi demonstrado que o aptâmero conjugado com PEG bloqueia o movimento de linfócitos dependente de L-selectina in vivo em murganhos SCID (Hicke et al., 1996 supra). Deste modo, é proporcionado para utilização na invenção um conjugado de um aptâmero e uma molécula veiculo, por exemplo, PEG. Nesta forma de realização, o aptâmero e o veiculo serão ligados, por exemplo, através da unidade de amina do terminal N. Além disso é proporcionada uma formulação ou composição para utilização na invenção que compreende um aptâmero e uma molécula de distribuição, por exemplo, um lipossoma. Nesta forma de realização pode não existir nenhuma ligação entre o aptâmero e o veiculo, o aptâmero poder ser simplesmente encapsulado, dispersado ou distribuído através do veículo.

Os aptâmeros isolados neste estudo podem também ser modificados para utilização como moléculas diagnósticas para detectar a presença de OSM humana no soro, tecido ou noutras amostras ex vivo, ou para a detecção de OSM humana no corpo inteiro em estudos de imagiologia in vivo (Charlton J, et al. (1997) Chemistry and Biology 4, 809-816.; Hnatowich, 1996 supra). Pode ser adicionada fluoresceína ou outros grupos fluorescentes de detecção à extremidade 5' da molécula do aptâmero para auxiliar na detecção de fluorescência para aplicações, tais como ensaios de FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting) (Davis KA. et al. (1996) Nuc. Acids Res. 24,

702-6.; Charlton et al., 1997 supra), ELONA (Enzyme Linked Oligonucleotide Assays) (Drolet DW, et al. (1996) Nature Biotech. 14, 1021-1025) e outras aplicações diagnósticas. O advento de gaiolas de péptido quelante de tecnécio-99m (Tc99m), tais como, MAG3 (Fritzberg A. R, et al., J Nucl Med 1986: 27. 111-6) facilitou extremamente a utilização de uma vasta gama de 15 moléculas (Kubo A. et al., (1998) Kaku Igaku 35, 909-28) e de macromoléculas (Taillefer R. et al., (1995) Eur. J. Nucl. Med. 22. 453-64.), para imagiologia da presença da proteína alvo in vivo (macromoléculas (Pallela V. R., et al. (1999) Nucl. Med. 40. 352-60.). As imagens são visualizadas com auxilio de uma câmara γ e têm sido realizadas num variedade de espécies, desde murganho até ao homem. Uma modificação recente dos quelantes de Tc99m permitiu uma marcação mais eficiente e estável de moléculas sob condições suaves (Hnatowich D. J. 1998 Nucl Med 39, 56-64.). Já foram desenvolvidos métodos para marcar radioactivamente oligonucleótidos de cadeia simples, foi preliminarmente investigado o destino desses oligonucleótidoss marcados não modificados in vivo (Hnatowich, 1996 supra).

Será naturalmente entendido que quaisquer antagonistas baseados em péptido, proteína ou ácido nucleico para utilização nesta invenção estarão, de um modo preferido, numa forma purificada, i. e., livres de matéria associada com essa molécula quer no seu estado natural ou como resultado da sua preparação, particularmente a pureza é superior a 70% mas, de um modo mais preferido, superior a 80% ou 90%.

Os antagonistas da presente invenção podem ser utilizados isoladamente ou em combinação com agentes imunossupressores, tais como esteróides (prednisona, etc.), ciclofosfamida, ciclosporina A ou um análogo de purina (e. g., metotrexato, 6-mercaptopurina, ou semelhantes), ou anticorpos, tais como, um anticorpo antilinfócito ou, de um modo mais preferido, com um agente anti-inflamatório ou antiautoimune, indutor de tolerância, tal como um inibidor da célula T+CD4, e. g., um anticorpo anti-CD4 (de um modo preferido um anticorpo de bloqueamento ou não esgotante), um anticorpo anti-CD8, um anticorpo anti-CD23, um antagonista de TNF, e. g., um anticorpo 16 anti-TNF ou inibidor de TNF, e. g., receptor de TNF solúvel, ou agentes, tais como, NSAIDs ou outros inibidores de citocina.

As dosagens adequadas de um antagonista da presente invenção irão variar dependendo de factores, tais como, a doença ou distúrbio a ser tratado, a via de administração e a idade e o peso do indivíduo a ser tratado e a natureza do antagonista. Sem se estar ligado a quaisquer dosagens particulares, crê-se que, por exemplo, para administração parentérica, uma dosagem diária a partir de 0,01 a 20 mg/kg de um anticorpo (ou outra molécula grande) da presente invenção (geralmente presente como parte de uma composição farmacêutica, como indicado acima) pode ser adequada para tratar um adulto típico. Mais apropriadamente, a dose pode ser de 0,1 a 5 mg/kg, tal como 0,1 a 2 mg/kg. Uma dose unitária será apropriadamente 1-400 mg. Dosagens adequadas de pequenas moléculas orgânicas seriam semelhantes e as dosagens adequadas de ligandos oligonucleotídicos seriam, por exemplo, 0,1-10 mg/kg. A invenção proporciona ainda uma composição farmacêutica que compreende um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável e, como ingrediente activo, um antagonista de acordo com a invenção e, opcionalmente, um outro agente terapêutico, como descrito acima. O antagonista, e as suas composições farmacêuticas desta invenção são particularmente úteis para administração parentérica, i. e., subcutaneamente, intramuscularmente ou intravenosamente, mas dependendo da natureza do antagonista podem ser mais apropriadas outras vias, tais como, oral, por inalação, intra-nasal, tópica ou intra-articular.

As composições para administração parentérica irão geralmente compreender uma solução do antagonista ou um seu cocktail dissolvido num veículo aceitável, de um modo preferido, um veículo aquoso. Pode ser utilizada uma variedade de veículos 17 aquosos, e. g., água, água tamponada, 0,4% de soro fisiológico, 0,3% de glicina e semelhantes. Estas soluções são estéreis e geralmente livres de matéria particulada. Estas composições podem ser esterilizadas através de técnicas de esterilização convencionais bem conhecidas. As composições podem conter substâncias auxiliares farmaceuticamente aceitáveis, como necessário para aproximar condições fisiológicas, tais como, agentes de ajuste de pH e de tamponamento, agentes de ajuste de toxicidade e semelhantes, por exemplo acetato de sódio, cloreto de sódio, cloreto de potássio, cloreto de cálcio, lactato de sódio, etc. A concentração do anticorpo ou de outro antagonista nestas formulações pode variar extensamente, por exemplo, desde menos de cerca de 0,5%, geralmente a ou, pelo menos, cerca de 1% até tanto quanto 15 ou 20% em peso, e será seleccionada com base principalmente nos volumes fluidos, viscosidades, etc., de acordo com o modo particular de administração seleccionado.

Assim, uma composição farmacêutica típica para injecção intramuscular poderia ser preparada para conter 1 mL de água tamponada esterilizada, e 50 mg de antagonista. Uma composição tipica para infusão intravenosa poderia ser preparada para conter 250 mL de solução de Ringer estéril, e 150 mg de anticorpo ou de outro antagonista de acordo com a invenção. Os próprios métodos para preparação de composições administráveis parentericamente serão do conhecimento ou evidentes aos especialistas na técnica e estão descritos mais detalhadamente em, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Science, 15a ed., Mack Publishing Company, Easton, Pensilvânia (1980). As formulações adequadas para antagonistas de ácidos nucleicos são discutidas acima.

Os antagonistas proteicos desta invenção, tais como, anticorpos, podem ser liofilizados para armazenamento e reconstituídos num veículo adequado antes da utilização. Esta 18 técnica tem demonstrado ser eficaz com imunoglobulinas convencionais. Podem ser utilizadas quaisquer técnicas adequadas de liofilizaçao e reconstituição. Será entendido pelos especialistas na técnica que a liofilizaçao e reconstituição podem conduzir a vários graus de perda da actividade do anticorpo (e. g., com imunoglobulinas convencionais, os anticorpos IgM tendem a ter uma maior perda de actividade do que anticorpos IgG) e que os níveis de utilização podem ter que ser ajustados para compensar.

Podem ser realizadas administrações simples ou múltiplas das composições, com perfis e níveis de dose a serem seleccionados pelo médico assistente. Em qualquer situação, as formulações farmacêuticas devem proporcionar uma quantidade suficiente de anticorpo ou de outro antagonista desta invenção para tratar eficazmente o doente. A presente invenção inclui no seu âmbito um ensaio para determinar se um agente particular que se liga a OSM pode ou não ser útil no tratamento de uma doença inflamatória. Deste modo, a invenção compreende um ensaio para a identificação de antagonistas de OSM que compreende a combinação de OSM com o agente de teste e a determinação se o agente é capaz ou não de bloquear a interacção entre OSM e o receptor de OSM ou de afectar a actividade biológica de OSM, através de expressão diferencial de uma molécula marcadora.

Para seleccionar um antagonista para utilização na invenção, como descrito acima, deve ser primeiro obtida a OSM, os resíduos de ligação chave de OSM, como descrito acima, presentes num veículo ou de um modo em que os sítios de ligação sejam definidos ("unidade de ligação a OSM"), ou um receptor de OSM. 0 ADNc que codifica a OSM humana pode ser gerado sinteticamente, com base na sequência no EMBL (número de acesso M27288), clonado 19 num veículo de expressão apropriado e utilizado para transformar um hospedeiro apropriado, tal como, E. Coli. A proteína OSM humana é depois purificada a partir do meio de cultura e ligada a placas para selecção. A OSM, uma unidade de ligação de OSM e/ou um receptor de OSM podem ser utilizados para avaliar a ligação de substratos moleculares pequenos e ligandos em, por exemplo, células, preparações livres de células, bibliotecas químicas, e misturas de produtos naturais. Deste modo, a invenção proporciona um ensaio para a identificação de um antagonista de OSM que compreende a colocação em contacto de OSM com um agente de teste e medição da ligação. Estes substratos e ligandos podem ser substratos naturais e os ligandos podem ser miméticos estruturais ou funcionais. Essas moléculas estão incluídas na definição de antagonistas de OSM. 0 método de selecção pode ter elevada capacidade. Por exemplo, para seleccionar antagonistas, pode ser preparada uma mistura de reacção sintética, um compartimento celular, tal como, uma membrana, envelope celular ou parede celular, ou uma preparação dos mesmos, a partir de uma célula que expresse o receptor de OSM. A preparação é depois incubada com OSM marcada na ausência ou presença de uma molécula candidata. A capacidade da molécula candidata para ligar ao receptor de OSM é reflectida na diminuição da ligação a OSM. As moléculas que ligam gratuitamente, i. e., sem induzirem os efeitos funcionais de OSM são muito provavelmente bons antagonistas. Este ensaio pode ser invertido e o receptor de OSM marcada pode ser utilizado com OSM não marcada. Uma selecção adicional com um formato de ELISA pode ser utilizado para identificar antagonistas de OSM, em que é medida a capacidade de uma molécula candidata para prevenir a ligação de um conjugado do receptor de OSM, tal como, a proteína de fusão gpl30-Fc, a OSM imobilizada em placa, neste ensaio o gpl30-Fc ligado é 20 detectado através de anticorpo anti-Fc marcado enzimaticamente e ensaio colorimétrico.

Os efeitos funcionais de antagonistas potenciais podem ser medidos, por exemplo, através da determinação da actividade de um sistema repórter no seguimento de interacção da molécula candidata com uma célula ou uma preparação celular apropriada, e comparação do efeito com o de OSM ou de moléculas que provocam os mesmos efeitos em OSM. Os sistemas repórter que podem ser úteis a este respeito incluem, mas não estão limitados a, substrato marcado colorimetricamente convertido em produto, um gene repórter que responde a alterações na actividade funcional do receptor de OSM, e ensaios de ligação conhecidos na técnica.

Figuras:

Figura la: ELISA mostrando a secreção ex vivo de Oncostatina M por culturas de biopsia sinovial.

Figura lb: Secreção ex vivo espontânea de Oncostatina M por culturas sinoviais inflamadas, mas não por não inflamadas.

Figura 2: Efeito de rhOSM na produção de TNF alfa por células THP-1 diferenciadas por PMA.

Figura 3 a&b Efeito sinergistico de OSM com TNFa para promover a libertação de colagénio ex vivo.

Figura 4a

Secreção mediada por anticorpo anti-L-selecção de OSM. 21

Figura Figura

Figura

Figura

Figura

Figura

Figura 4b Secreção de OSM induzida por fucoidano. 5a-d Fotomicrografia demonstrando a coloração de endotélio vascular de AR utilizando anticorpos de P e E-selecção de gpl30. 6 ARN mensageiro de OSM em articulações de murganhos de controlo & artríticos - CII. 7 Murganhos artríticos DBA-1 tratados com anticorpo anti-OSM da cabra ou IgG de controlo de cabra. 7a = Pontuações clínicas. 7b = Espessura da pata. 8 Dados histológicos comparando a infiltração de articulação e a lesão de cartilagem em murganhos colagénio-artríticos. 8a & b: Os murganhos de controlo apresentaram infiltração articular extensa por células mononucleadas e PMNs (8a) e destruição superficial da cartilagem articular, caracterizada por infiltração de neutrófilos generalizada (8b). 8c & 8d: Articulações representativas de um animal tratado com anti-OSM com artrite normal/suave, demonstrando um nível de redução acentuado de infiltrado celular com cartilagem articular intacta. 9 Ensaio de MTS e sPAP de HePG2 B6 para N-(1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-il)benzamida mostrando uma inibição dependente de concentração da libertação de sPAP induzida por OSM. 10 Ensaio de MTS e sPAP de TNFa para N-(1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-il)benzamida mostrando 22 inibição limitada da libertação de sPAP induzida por TNFa a partir de células A549.

Figura 11 Inibição por anticorpo da produção de sPAP no ensaio de HepG2 B6. M2-M4 denotam soros de quatro murganhos individuais; OM5-6.1, OM5-6.10, OM6-10.111 denotam sobrenadantes de hibridoma derivados experimentalmente. Figura 12 Competição da fusão de OSM-GST de tipo selvagem e mutante com OSM de tipo selvagem ligada a placa, para ligação a gpl30-Fc num Elisa. Figura 13 Representações gráficas de O.D. de três OSM-GSTs mutantes mostrando menos actividade na condução da produção de sPAP nas células HepG2. A presente invenção será agora descrita apenas a titulo exemplificativo com referência às figuras acompanhantes; em que:

Exemplo 1: Detecção de OSM em culturas de tecido sinovial ex vivo.

Experiência 1:

Tecido sinovial removido recentemente de doentes diagnosticados como tendo artrite reumatóide, osteoartrite ou 23

inflamação de joanetes foi dissecado mecanicamente utilizando agulhas hipodérmicas estéreis para produzir fragmentos de aproximadamente 1 mm3. Estes foram colocados em poços de 200 pL de fundo plano numa placa de cultura de tecidos de 96 poços (Costar) aos quais foi adicionado RPMI 1640 (Sigma) suplementado com 10% de soro masculino AB+ inactivado pelo calor (North London Blood Transfusion Centre), 10 mM de hepes, 1% de piruvato de sódio, 1% de aminoácidos não essenciais (todos da Sigma) , 4 mM de L-glutamina (Hyclone) , 100 U/mL de penicilina + 100 pg/mL de estreptomicina (Hyclone) (meio humano completo, CHM) e incubados a 37 °C.

Foram recolhidas amostras de 100 uL/poço de sobrenadante de cultura nos dias 0, 2, 5 e 9, congelaas a 20 °C e depois testadas para OSM através de ELISA. Os dados (Quantikine R&D Systems) são mostrados na Fig la. A OSM segregada foi detectada em amostras de sinóvia derivada de AR, mas não de sinóvia derivada de doentes de OA ou não artríticos de controlo. Os niveis de OSM nas culturas de tecido de AR foram máximos em torno do dia 5 de incubação, alcançando uma concentração de aproximadamente 1400 pg/mL e permaneceram maiores que 800 pg/mL no dia 9.

Experiência 2: O tecido sinovial foi lavado em PBS e o tecido gordo removido. Foram utilizadas tesouras estéreis para cortar o tecido em fragmentos pequenos (1-4 mm) . Este tecido foi lavado em PBS antes da utilização. O tecido foi pesado e plaqueado directamente numa placa de 24 ou 48 poços (Costar), 100 mg/poço. 24 0 tecido foi cultivado a 37 °C e 5% de C02 em 1,5 mL de meio de Eagle modificado por Dulbecco (Sigma) suplementado com 10% de soro humano AB+ inactivado pelo calor (Sigma) , 2 mM de L-glutamina (Life Technologies), 200 U/mL de penicilina e 200 pg/mL de estreptomicina (Life Technologies), 480 U/mL de nistatina (Sigma), 50 pg/mL de gentamicina (Life Technologies) e 10 mM de Hepes (Sigma), esterilizado por filtração. No dia 3, os sobrenadantes foram removidos e testados para OSM num ELISA utilizando anticorpos emparelhados (R&D Systems).

As culturas de tecido sinovial de biopsia de joelho de doentes com AR ou OA inflamada segregaram espontaneamente OSM. Após o periodo de incubação de 3 dias, o nivel médio de OSM no sobrenadante de cultura a partir de culturas de AR foi de 246 pg/mL (gama de 30 a 982, n = 12) e a partir de culturas de OA foi de 473 pg/mL (gama de 44 a 2001, n = 14) . A OSM é segregada por tecido sinovial inflamado mas não quiescente (Figure lb).

Exemplo 2a: Diferenciação de células THP-1

As células THP-1 da linha pró-monocítica humana (ECACC) foram repicadas duas vezes semanalmente em RPMI suplementado com 10% de FCS inactivado pelo calor, 10 mM de hepes, 1% de aminoácidos não essenciais (todos da Sigma), 4 mM de L-glutamina (Hyclone), 100 U/mL de penicilina + 100 pg/mL de estreptomicina (Hyclone) (meio completo, CM) e depois foi adicionado PMA (Sigma) a células lavadas a 1 ug/mL e incubadas a 37 °C durante 30 minutos. As células foram lavadas 3x em PBS pré-aquecido, ressuspensas em CM e plaqueadas a 1,5 x 105 células/mL em placas de fundo plano de 96 poços (Costar). As placas foram incubadas durante 48 horas a 37 °C, 5% de C02, depois lavadas com PBS, os meios substituídos, e incubadas durante mais 24 horas. As células foram lavadas lx em PBS antes da utilização. 25

Exemplo 2b: Preparação de monócitos sanguíneos estimulados por IFN gama

Crostas inflamatórias humanas (North London Blood Transfusion Centre) foram diluídas 1:3 com PBS, colocadas sobre Lymphoprep (Nycomed UK) e centrifugadas a 600 xg durante 30 minutos à temperatura ambiente. As PBMC recolhidas foram lavadas 3 vezes em PBS, contadas e ressuspensas em 80 mL de RPMI 1640/10% de FCS a 5 x 106 células/mL. Foram colocados 20 mL em cada um de quatro balões de 175 cm2 e incubados de um dia para o outro a 37 °C para permitir aos monócitos aderirem. As células não aderentes foram rejeitadas e as células aderentes raspadas após incubação com verseno gelado a 4 °C durante 15 minutos. As células foram lavadas duas vezes em PBS, ressuspensas em RPMI 1640 + 10% de soro humano inactivado pelo calor (Sigma) a 6,9 x em 105/mL e colocados 250 uL de suspensão de células em cada poço de uma placa de fundo plano de 96 poços (Costar) . Foi adicionado a metade da placa 100 IU/mL de IFN γ (Genzyme) , a outra metade deixada como controlo. As placas foram incubadas de um dia para o outro a 37 °C, 5% de C02 antes do ensaio.

Exemplo 2c: Estimulação da libertação de TNFa: A oncostatina M recombinante humana (rhOSM) liofilizada foi adquirida à R&D Systems, diluída a 10 pg/mL em PBS estéril + 0,1% de BSA (Sigma) e as fracções armazenadas a -20 °C até à utilização. Foram adicionados rhOSM, LPS derivado de E. coli ou CM a poços triplicados de macrófagos, monócitos ou células THP-1, preparadas como acima e incubadas durante 7 horas a 26 37 °C, 5% de C02. Os sobrenadantes foram recolhidos e congelados a -20 °C até ao teste para a proteína TNFa por ELISA. Nos ensaios concebidos para co-ensaiar ARNm de TNFa, as células foram incubadas, como acima, durante 4 horas, lavadas uma vez em PBS e lisadas em tampão de extracção de ARN (RNAzole). O ARN foi detectado como se segue. O ARN total foi preparado de acordo com as instruções do fabricante e armazenado a -80 °C em água tratada com DEPC. Para RT-PCR, aproximadamente 1 ug de ARN foi inversamente transcrito utilizando iniciação com oligo dT (kit de síntese da primeira cadeia de ADNc, Pharmacia Biotech) e o ADNc resultante submetido a 30 ciclos de PCR utilizando os seguintes iniciadores para TNFa (amplímeros da Clontech): para diante - GAGTGACAAGCCTGTAGCCCATGTTGTAGCA, reverso - GCAATGATCCCAAAGTAGACCTGCCCAGAC. O produto amplificado (444 pb) foi separado através de electroforese em gel de agarose (2%) e visualizado através de coloração com brometo de etídio.

Exemplo 2d: A OSM induz a produção de TNFa em células humanas da linha monocitica A linha pró-monocitca humana Thp-1 foi induzida a diferenciar utilizando PMA, lavada exaustivamente, e incubada com OSM recombinante humana, como descrito acima. Os sobrenadantes de cultura foram removidos a 8 horas e ensaiados para a produção de TNFa através de ELISA específico (TNF Quantikine, R&D Systems) de acordo com instruções dos fabricantes. A OSM induziu uma libertação relacionada com a dose de TNFa, mensurável acima de 1 ng/mL de OSM e máxima a 200-500 ng/mL, alcançando rotineiramente níveis segregados superiores a 2500 pg/mL de TNFa. Uma experiência representativa é mostrada na Fig 2. A expressão da mensagem de TNFa, medida 27 através de RT-PCR, como descrito acima, foi aumentada fortemente em células THP-1 incubadas durante 4 horas com 100 ng/mL de OSM, relativamente a células de controlo não estimuladas (Fig 2).

Importante, a indução de TNFa não foi devida a endotoxina contaminante uma vez que a pré-fervura de OSM removeu completamente a secreção de TNFa (dados não mostrados). Igualmente, a remoção de OSM por imunoprecipitação utilizando anticorpo especifico removeu a actividade (dados não mostrados). Estas observações foram alargadas para incluir monócitos sanguíneos humanos, pré-activados com interferão-γ e macrófagos sanguíneos humanos, diferenciados em cultura durante 7 dias. Ambos os tipos de células, quando co-incubadas durante 8 horas com OSM, segregaram TNFa, como medido por ELISA. A secreção média de TNFa por monócitos foi de 1447 pg/mL (gama de 137-4709 pg/mL; n = 4 dadores) e de 542 pg/mL por macrófagos (gama de 62-1428 pg/mL; n = 3 dadores).

Exemplo 3a: Ensaio de degradação de cartilagem A cartilagem do septo nasal de bovino foi mantida a 4 °C de um dia para o outro após o sacrifício. Foram cortados discos de 2 mm de diâmetro a partir de fatias de 2 mm e lavados duas vezes em HBSS. Foram incubados três discos por poço de uma placa de 24 poços (Costar) a 37 °C, 5% de C02 durante 24 horas num volume de 600 pL de DMEM (Sigma) contendo 25 mM de HEPES suplementado com 2 mM de glutamina, 100 pg/mL de estreptomicina, 100 U/mL de penicilina e 2,5 pg/mL de anfotericina B (meio de degradação de cartilagem, CDM) . A cartilagem foi cultivada em poços quadruplicados quer em: 600 pL de CDM isoladamente, 2, 10 ou 50 ng/mL de TNFa recombinante humano isoladamente, 10 ng/mL de rhOSM isoladamente (R&D Systems) ou TNFa + OSM e incubados durante 7 dias a 37 °C, 5% de C02. Os sobrenadantes foram 28 recolhidos e substituídos com meio fresco contendo reagentes de teste idênticos ao dia 1. A experiência foi continuada durante mais 7 dias e no dia 14 todo o meio foi removido e a cartilagem restante digerida com 4,5 mg de papaína (sigma) em 0,1 M de fosfato tampão pH 6,5, contendo 5 mM de EDTA e 5 mM de cloridrato de cisteína, incubando a 65 °C durante 16 horas, para determinar o conteúdo de hidroxiprolina restante dos fragmentos de cartilagem. O nível cumulativo da libertação de OH-prolina no meio no dia 14 foi medido e expresso como a percentagem de libertação total, como apresentado abaixo.

Exemplo 3b: Ensaio de hidroxiprolina A libertação de hidroxiprolina foi ensaiada (como uma medida da degradação de colagénio) utilizando uma modificação de placa de microtitulação do método em (Bergmann I e Loxley R. (1963) Anal. Biochem. 35 1961-1965). Foi diluída cloramina T (7%) (p/v) a 1:4 em tampão de citrato acetato (57 g de acetato de sódio, 37,5 g de citrato de tri-sódio, 5,5 g de ácido cítrico, 385 mL de propan-2-ol por litro de água). Foi diluído P-dimetilaminobenzaldeído (DAB; 20 g em 30 mL de 60% de ácido perclórico) a 1:3 em propan-2-ol. Os espécimes foram hidrolisados em 6 M de HCL durante 20 h a 105 °C e o hidrolisado neutralizado por secagem sobre NaOH in vacuo utilizando um

Savant Speed VAC. O resíduo foi dissolvido em água e foram adicionados 40 uL de amostra ou padrão (hidroxiprolina; 5-30 ug/mL) a placas de microtitulação conjuntamente com reagente cloramina-T e depois reagente DAB (150 uL) após 4 minutos. A placa foi aquecida a 65 °C durante 35 minutos, arrefecida e a absorvência determinada a 560 nm. 29

Exemplo 3c: Sinergia de OSM com TNFa para aumentar a libertação de MMPl e colagénio a partir de explantes de cartilagem, ex vivo. A cartilagem nasal de bovino foi cultivada em poços quadruplicados durante 14 dias na presença ou ausência de OSM ou TNFa isoladamente (ambos de R&D Systems) , ou em combinação, como descrito acima. Os sobrenadantes de cultura foram ensaiados para a actividade total de colagenase no dia 7 e para a libertação de colagénio no dia 14. Os dados na Fig 3b demonstram que nem a OSM nem o TNFa isoladamente, utilizados a 10 ng/mL ou 50 ng/mL, respectivamente, induzem a secreção significativa de MMPl. Contudo, a combinação de OSM e TNFa utilizados nestas concentrações induziu a libertação mensurável de MMPl. Estas observações foram acompanhadas por uma impressionante sinergia entre OSM e TNFa para aumentar a libertação de colagénio a partir de cartilagem. A fig 3a mostra que OSM isoladamente a 10 ng/mL não induziu a libertação de colagénio, enquanto que apenas a concentração mais elevada de TNFa utilizada (50 ng/mL) teve um pequeno, mas demonstrável efeito (menos de 10%). Contudo, a combinação de 10 ng/mL de OSM, quer com 50 ou 10 ng/mL de TNFa resultou em libertação de colagénio superior a 80% e 30%, respectivamente.

Exemplo 4a: Estimulação de PBMC através de L-selectina

As células mononucleadas foram isoladas a partir de crostas inflamatórias, como descrito acima. Foram plaqueadas 5 x 105 células em volumes de 0,5 mL e incubadas durante 24 horas a 37 °C, 5% de C02, com anticorpos monoclonais anti-L-selectina de fucoidano com p. mol. 60 - 80 kD (Sigma), LAMI-3 e TQ1 ou um anticorpo IgG de isotipo condizente (todos da Coulter) . Os 30 sobrenadantes foram ensaiados para OSM utilizando um ensaio de ELISA especifico (Quantikine, R&D Systems), de acordo com as instruções do fabricante.

Exemplo 4b: A ligação de L-selectina induz a secreção de OSM

As células mononucleadas de dadores saudáveis foram incubadas durante 24 horas com anticorpos anti-L-selectina humana, (quer TQ1 ou LAM-1), ou um anticorpo de controlo de isotipo condizente, e os sobrenadantes de cultura ensaiados por ELISA para OSM. Os dados na fig 4a mostram uma indução dependente da dose de OSM utilizando ambos os anticorpos de anti-L-selectina. 0 anticorpo de controlo teve um efeito minimo. Foi depois investigada a capacidade do agonista de L-selectina fucoidano para induzir OSM a partir de culturas de células mononucleadas. A Fig. 4b mostra que o fucoidano era um forte estimulante da secreção de OSM, induzindo niveis semelhantes àqueles observados em culturas de biopsia sinovial de AR e OA (Exemplo 1, Experiência 2 Fig lb,).

Exemplo 5a: Imuno-histoquímica

As amostras de tecido humano fresco foram congeladas em hexano liquido arrefecido por C02 e armazenadas na fase de vapor de N2 liquido até à utilização. Foram cortadas secções de 7 mm em criostato para lâminas de vidro revestidas com 3-aminopropiltrietoxisilano (APES) (Maddox P. et ai. J. Clin Path. 40/ 1256-1260, 1987) e fixadas durante 10 minutos a 4 °C em 2% de paraformaldeido. A actividade de peroxidase endógena 31 foi bloqueada durante 20 minutos em 0,05% de H202. Foram obtidos anticorpos monoclonais primários, não conjugados, a partir das seguintes fontes: CD62P, CLB, Holanda; CD62E e gpl30 R&D Systems UK. Os anticorpos primários foram aplicados na diluição óptima durante 45 minutos à temperatura ambiente. As secções de controlo negativo foram incubadas com um anticorpo monoclonal anti-BrdU (SIGMA) utilizado a concentrações de proteína equivalentes aos anticorpos de teste. Foi utilizado um anticorpo secundário biotinilado, seguido por ABC marcado por peroxidase (Vector Elite) para marcar o anticorpo primário. A peroxidase foi revelada com um substrato de DAB (3,3'-diaminobenzidina) (SIGMA).

Exemplo 5b: Co-dlstrlbuição de selectlnas e receptores de OSM na sinóvia de AR

As secções congeladas de tecido sinovial de AR inflamado foram coradas utilizando anticorpos específicos para gpl30, e Selectina P e E, como descrito acima. A fotomicrografia (a) na Fig 5 demonstra que endotélio vascular de AR corou fortemente positivo para gpl30. A coloração da sinóvia de AR para a expressão de selectina P e E revelou um perfil de coloração idêntico a gpl30, restrito a células endoteliais vasculares, (fig 5 b e c, respectivamente). Deve ser notado na Figura 5c o infiltrado de células mononucleadas perivasculares associado com a coloração de selectina E. A coloração de secções em série utilizando anticorpos primários de controlo foi negativa em células endoteliais vasculares (Fig 5 painéis c e d) . 32

Exemplo 6a: Tratamento de anticorpo Anti-OSM da artrite induzida por colagénio. A artrite induzida por colagénio foi induzida em murganhos DBA/1 machos (8-12 semanas de idade) através de imunização com colagénio bovino nativo de tipo II (CII) como descrito previamente (plater-zyberk C. Clin. Exp. Immunol 98:442-7 1994 e plater-zyberk C. Nature Medicine 1: 781-5, 1995). A partir do dia 16 após a imunização de CII, os murganhos foram monitorizados diariamente para sinais de vermelhidão e inchaço da articulação. A partir do primeiro aparecimento de sintomas clinicos, os murganhos foram examinados três vezes por semana e cada membro foi classificado em relação à gravidade da doença, utilizando as seguintes pontuações visuais: 0 = normal, 0,5 = artrite em 2 ou mais dedos, 1 = ligeiro inchaço e eritema da pata sem envolvimento de dedos, 1,5 = o mesmo gue 1 com envolvimento de dedos, 2 = inchaço mais acentuado com eritema da pata sem envolvimento de dedos, 2,5 = o mesmo gue 2 com envolvimento de dedos, 3 = inchaço grave com perda de movimento, 3,5 = o mesmo que 3 com envolvimento de dedos. A espessura da pata foi medida utilizando paquímetros (Proctest 2T, Kroeplin Langenmesstechnik).

Os murganhos DBA/1 imunizados com CII foram tratados após início clínico da doença através de injecções i.p. de 100 mg de anticorpo anti-OSM de murganho, de cabra (R e D Systems, N° de cat. AF-495-NA). A progressão da doença foi avaliada como descrito acima. No dia 14 pós-início, os murganhos foram sacrificados por deslocamento cervical e as patas recolhidas para examinação histopatológica. 33

Exemplo 6b: Avaliação histológica de articulações de murganho artrítico

As pernas foram esfoladas e os joelhos e as patas dissecados. As articulações foram fixas em 10% de formalina tamponada durante 4 dias (joelhos) ou 1 dia (patas) e descalcifiçadas durante 3 dias em 25% de ácido fórmico, desidratadas e impregnadas em cera de parafina. Secções sagitais (5-7 mm) das articulações foram desenceradas e coradas com Safranina O, contra-corante rápido de hematoxilina verde/ferro (como descrito em plater-zyberk Nature Medicine, acima). A sinovite foi classificada de forma cega de 0 (nenhuma infiltração) até 3 (extensa infiltração e hiperplasia sinovial). O grau de perda da intensidade da coloração de Safranina O, indicativo da depleção de proteoglicano da cartilagem, foi pontuado numa gama de 0 (cartilagem totalmente corada) até 3 (depleção e perda completa de cartilagem).

Exemplo 6c: Detecção de ARNm de OSM em tecidos da articulação de murganhos artríticos por colagénio.

Os murganhos artríticos, mais os animais não tratados de controlo, foram sacrificados e ambas as patas e pés removidos e congelados rapidamente em azoto líquido seguido por armazenamento a -80 °C. O ARN foi preparado através da moagem de cada membro em RNAzole utilizando um homogeneizador mecânico ultraturrax. O material particulado foi deixado a sedimentar, e o sobrenadante depois misturado com 1/10 do volume de clorofórmio e centrifugado para separar a fase aquosa contendo o ARN. O ARN foi precipitado utilizando RNAmate (BioChain Institute Inc, San Leandro, Califórnia) para remover proteoglicanos contaminantes. Após lavagem em 75% de etanol, o 34 ARN total foi dissolvido em água-DEPC e transcrito inversamente utilizando o kit de síntese da primeira cadeia de ADNc da Pharmacia e iniciação com oligo dt. As reacções de PCR foram realizadas utilizando os seguintes iniciadores (iniciadores feitos por encomenda à Life Technologies) derivados da sequência de OSM de murganho (Yoshimura A. et al. EMBO Journal 15 1055-1063, 1996): GGGTGTCCTACCAAGGAACA, CTGAGACCTTTCAAGAGGAC.

Após 30 ciclos de PCR, os produtos de reacção (379 pb) foram detectados utilizando electroforese em gel de agarose, RT-PCR foi utilizado para detectar ARNm de OSM em patas de murganho artrítico, como descrito acima. A Fig 6 mostra que os níveis de produto de PCR específico de OSM foram aumentados em articulações retiradas de animais com pontuações clínicas da doença aumentando progressivamente. Em contraste, foi detectada pouca ou nenhuma mensagem de OSM em animais de controlo.

Exemplo 6d: A neutralização de OSM melhora a artrite induzida por colagénio

Para testar directamente a hipótese que a neutralização pode melhorar sintomas clínicos da artrite, foram administradas i.p duas injecções de 100 pg de anticorpo policlonal neutralizante para OSM nos dias 1 e 3 após o primeiro aparecimento de artrite clínica num grupo de 6 murganhos. Em paralelo, um segundo grupo de 6 murganhos artríticos foi tratado de forma idêntica, utilizando IgG de cabra não imune em vez de anti-OSM. Os murganhos foram pontuados para a gravidade clínica da artrite, e o inchaço das patas individuais medido durante um período de acompanhamento de 11 dias após a segunda injecção de anticorpo. Os murganhos tratados com IgG de cabra de controlo desenvolveram uma artrite progressiva, acompanhada por um aumento no inchaço da pata. 35

Em acentuado contraste, os murganhos tratados com anticorpo anti-OSM desenvolveram uma artrite significativamente menos grave em termos de pontuação clinica e inchaço da pata (Fig 7 a e b) . Igualmente, o número de patas artríticas foi reduzido significativamente em tratados com anti-OSM comparativamente aos animais tratados com IgG de controlo, demonstrando que este protocolo terapêutico foi eficaz na protecção de animais com doença já estabelecida contra progressão adicional da doença. (Dados não mostrados). Esta experiência foi repetida de forma idêntica, utilizando 7 murganhos por grupo e produziu dados muito condizentes (dados não mostrados). A redução na gravidade clínica que resulta do tratamento com anticorpo anti-OSM foi confirmada por examinação histológica post-mortem das patas artríticas no dia 14 após inicio da doença. Os dados histológicos que comparam a infiltração articular e a lesão da cartilagem no dia 14 em murganhos artríticos por colagénio tratados com IgG de controlo ou anticorpo anti-OSM são mostrados na Figura 8. Os murganhos tratados com IgG de controlo apresentaram infiltração articular extensa por células mononucleadas e PMNs (Fig 8a) . Isto foi acompanhado por destruição superficial da cartilagem articular, caracterizada por infiltração generalizada de neutrófilos (Fig 8b) . Em contraste, a Fig 8c e d mostra articulações representativas de um animal tratado com anti-OSM com artrite mínima, demonstrando um nível reduzido acentuado de infiltrado celular, com cartilagem articular intacta. Além disso, as articulações foram pontuadas de forma cega para o aspecto histopatológico da cartilagem e sinóvia e descritas como normais, moderadas ou graves. Foi avaliado um total de 73 articulações individuais por grupo de tratamento; os dados são sumariados na Tabela 1. Nos animais tratados com anti-OSM, 47% das articulações examinadas eram normais ou apresentavam uma 36 sinovite suave, comparativamente a apenas 6% no grupo tratado com IgG de controlo. Do mesmo modo, em murganhos tratados com anti-OSM, 58% das articulações examinadas mostraram pouca ou nenhuma lesão da cartilagem comparativamente a 21% no grupo tratado com IgG de controlo. As articulações dos dois ratos tratados com anti-OSM com sinais claros de vermelhidão e inchaço articular no dia 1 do tratamento, subsequentemente mostraram melhoria completa da artrite e não apresentaram qualquer infiltração celular nem anomalias visiveis quer na cartilagem ou sinóvia (dados não mostrados).

Tabela 1: Pontuação histológica de articulações de murganhos tratados quer com anti-OSM ou IgG de controlo

Tratamento Normal/suave cartilagem sinóvia Moderado cartilagem Grave sinóvia cartilagem sinóvia IgG anti-OSM 58% 21% 47% 6% 21% 26% 23% 37% 22% 53% 31% 57

Articulações totais examinadas: 73 articulações/tratamento

Exemplo 7: Identificação de antagonistas moleculares orgânicos pequenos.

Os antagonistas moleculares orgânicos pequenos de OSM foram identificados por inibição de uma resposta biológica induzida por OSM da linha celular repórter sem causar manifesta toxicidade celular. Como um controlo, foi também testado o efeito de compostos numa linha celular responsiva a TNFa. 37

Exemplo 7a: Expressão e purificação de OSM humana.

Um fragmento de ADN que codifica a OSM humana (hOSM) com a sequência lider de 25 aminoácidos removida, foi amplificado utilizando a Reacção em Cadeia da Polimerase (PCR) a partir de uma biblioteca de ADNc de leucócito activado utilizando os iniciadores oligonucleotidicos sintéticos 5'-GCATAGGATCCGCGGCTATAGGCAGCTGCTCG-3' e 5'-ATCGCGAATTCCTACCGGGGCAGCTGTCCCCT-3' , concebidos a partir da sequência EMBL para a hOSM (número de acesso M27288) . Este produto de PCR foi sub-clonado em pCR2.1 (Invitrogen) para produzir pCR2.1hOSM.

Foi criado um sitio de clivagem de endonuclease de restrição Sall dentro do sitio do Factor Xa, no vector de expressão bacteriana pGEX-3X (Pharmacia) através da inserção de AC para TG utilizando o kit de mutagénese dirigida 'Quickchange' (Stratagene) para criar a sequência representada abaixo (SEQ ID 7) ;

BamHI EcoRl

AAA TCG GAT CTG ATC GAA GGT CGA CGG ATC CCC GGG AAT TCA TCG KSDLIEG R R I P G N S S

Factor Xa

Após verificação da sequência da inserção de OSM em pCR2.lhOSM, o ADN que codifica a forma madura da OSM humana foi amplificado por PCR a partir deste vector utilizando o iniciador para diante 5'-GATACGATCGTCTCATCGAGCGGCTATAGGCAGCTGC-3' contendo um sitio de endonuclease de restrição BsmBI (sublinhado), e o iniciador reverso 5'-ATTACATGGAATTCCTATCTCCGGCTCCGGTTCGG-3' contendo um sitio EcoRl (sublinhado). Este produto de PCR contém a forma madura da OSM humana sem a sequência lider e sem os 31 aminoácidos do terminal C que são removidos após maturação da 38 proteina. Após a PCR, o fragmento de ADN amplificado foi purificado, digerido com as enzimas de restrição BsmBI e EcoRI e sub-clonado no vector pGE7C-3X modificado (Pharmacia: contendo ADN que codifica GST) que foi digerido com Sall e EcoRI para produzir um plasmideo designado pGEX 196. Após verificação da sequência, o plasmideo pGEX196 foi transformado em E. coli BLR-DE3 (Novagen) . As células transformadas foram cultivadas em meio 2xYT+G (triptona 16 g/L; extracto de levedura 10 g/L; NaCl 5 g/L; pH 7,0 com NaOH; 2% de glucose) suplementado com 100 ug/mL de ampicilina.

Para preparar a proteina purificada, uma cultura de um dia para o outro de pGEX 196 em E. coli BLR-DE3 foi diluída 1:100 e esta cultura foi cultivada a 37 °C até uma A60onm de 0,8. A expressão da proteína de fusão GST-hOSM foi induzida por adição de 0,1 mM de IPTG (Isopropil-l-tio-b-D-galactopiranósido) e a cultura mantida durante mais duas horas. A GST-hOSM foi isolada a partir da cultura de E. coli por purificação em lote. Foi recolhida uma cultura bacteriana de 3 litros através de centrifugação a 3000 rpm e o precipitado resultante ressuspenso em 50 mL de PBS gelado (soro fisiológico tamponado com fosfato) contendo comprimidos de inibidores de Proteinases (Boerhinger). Foram adicionados 5 mL de lisozima e a suspensão celular incubada sobre gelo durante 5 minutos. As células foram sonicadas a 4 °C e foram adicionados 1% de Triton X100 e 10 mM de ditiotreitol. O lisado foi depois misturado por inversão a 4 °C durante 10 minutos, e depois centrifugado a 14000g. O sobrenadante foi adicionado a agarose de glutationa (n° de cat. G4510 Sigma) e misturado por inversão a 4 °C durante 30 minutos. A suspensão foi centrifugada levemente, o sobrenadante removido por aspiração e a agarose sedimentada foi lavada duas vezes com PBS frio. Foi adicionado tampão de eluição (20 mM de glutationa, 100 mM de Tris pH 8,0, 100 mM de NaCl; 39 novamente pH 8,0) e a suspensão foi incubada sobre gelo durante 5 minutos. O sobrenadante foi recolhido e as fracções foram analisadas através de electroforese em gel de poliacrilamida/dodecilsulfato de Sódio (SDS-PAGE) , seguida por coloração em corante azul brilhante de Coomassie, para confirmar a integridade da proteína purificada.

As experiências de optimização da clivagem proteolítica foram estabelecidas utilizando Factor Xa e trombina, com a trombina a produzir a quantidade óptima de hOSM, como demonstrado por análise de SDS-PAGE corada com azul brilhante de coomassie. A separação dos produtos GST e OSM foi realizada por cromatografia de permuta iónica e o produto OSM purificado foi verificado por sequenciação do terminal N e espectrometria de massa.

Exemplo 7b: HepG2 B6: Ensaio de sPAP Induzido por OSM

Uma célula linha celular HepG2 (ECACC) foi transfectada de forma estável com seis elementos funcionais de resposta STAT3 (REs) a montante do ADNc de sPAP (fosfatase alcalina placentar segregada), como descrito abaixo, para formar HepG2B6. O STAT3 (transdutor de sinal e activador da transcrição) é um intermediário na cascata de sinalização intercelular da família da citocina IL-6. Após dimerização de receptores de superfície celular, o STAT3 é fosforilado e irá depois ligar a ADN de REs no núcleo e activar o ADN a jusante, nesta construção esse ADN é sPAP. Assim, esta linha pode ser conduzida a produzir sPAP através de incubação de um dia para o outro em Oncostatina M.

Um gene repórter da fosfatatse alcalina placentar segregada (sPAP) responsiva a STAT foi construído como se segue. 40

Inicialmente um par de oligonucleótidos contendo três cópias de um elemento de resposta STAT3 palindrómico (Wegenka U.M et al. Mol Cell. Biol, 1993 Vol 13 p276-288 Tabela 1 na p277) e um

sitio Xhol a 5' foram clonados no sitio único Sall do plasmideo pBluescript tkSPAP para criar pllP3-tk-SPAP. Mais seis cópias de um oligonucleótido sintético que codifica o elemento de resposta STAT3 encontrado no promotor β do Fibrinogénio (Dalmon et ai., Mol Cell Biol; 1993/ 13: 1183-1193 Figura 9, a sequência l^FG

incluindo o motivo de consenso IL6RE e a lider TTG sem a cauda GAT) foram depois clonados no Sitio Xhol de pllP3-tk-SPAP para produzir pllx6/llP3-tk-SPAP. Após sequenciação para confirmar o número de elementos de resposta, o pllx6/llP3-tk-SPAP foi digerido com NruI e Xbal para isolar um fragmento de ADN contendo os elementos de resposta 9STAT e a sequência codificante de tk-SPAP. Isto foi subsequentemente transferido entre os sitios NruI e Xbal do plasmideo pcDNA4 (Invitrogen) (substituindo o promotor CMV) para produzir um gene repórter de SPAP contendo elementos responsivos 9 STAT3, e o marcador de selecção NeoR para estabelecimento da linha celular HepG2.

As células HepG2 (ECACC) foram cultivadas em meio DMEM suplementado com 2 mM de L-glutamina, 1% de NEAA e 10% de soro fetal de vitela Hl a 37 °C numa atmosfera de 5% de CO2, 92% de humidade. Para a transfecção com o repórter STAT-sPAP, as células foram plaqueadas a 1% de confluência numa placa de cultura de tecidos de 10 cm e transfectadas com 10 ug do vector repórter STAT-sPAP utilizando um kit de transfecção de fosfato de cálcio (Invitrogen). Após selecção clonal na presença de 1 mg/mL de G418, as linhas celulares individuais foram seleccionadas para a capacidade de IL-6 para causar um aumento na expressão de sPAP a partir do gene repórter STATsPAP.

As células HepG2B6 foram plaqueadas em placas de 96 poços para uma concentração final de 3 x 104 células por poço em 100 pL 41 de meio (DMEM (Sigma), 10% de FCS Hl, 1% de aminoácidos não essenciais, 2 mM de Glutamina, 500 μg mL'1 de G418, (todos da Life Technologies)). As células foram deixadas a equilibrar durante 48 horas. Os putativos compostos sólidos anti-OSM foram preparados para uma diluição de stock de 20 mM em DMSO e diluidos em série a 1:3 em DMSO. Isto foi depois mais diluido em meio de ensaio de HepG26B, este é como o meio acima mas com 1% de FCS inactivado pelo calor, a baixa actividade de fosfatase alcalina (Life Technologies) substituída para 10% de FCS Hl. Os compostos foram diluidos a 1:3 a partir de uma concentração superior de 200 μΜ para uma concentração final de 0,0 9 μΜ numa concentração final de 1% de DMSO. (isto é, 200, 66,67, 22,22, 7,41, 2,47, 0,82, 0,27, 0,09 e 0 μΜ). O meio velho foi removido dos poços e substituído com composto diluido contendo também 2 ng.mL-1 de OSM (R&D Systems), as células foram incubadas durante mais 20 horas. Cada diluição foi realizada em triplicado. Foram removidos 20 pL de meio a partir de cada poço e ensaiados para actividade de sPAP utilizando pNPP (Fosfato de p-nitrofenilo; Sigma), como um substrato. A fosfatase alcalina endógena é bloqueada com L-homoarginina. A densidade óptica do substrato é medida a 405-650 nm. A concentração do composto é representada graficamente contra OD como uma medida do sPAP produzido e pode ser analisada para determinar os valores de IC50 .

Exemplo 7c: Células A549: Ensaio de sPAP induzido por TNFa

Este ensaio utilizou células A549 que tinham sido transfectadas de forma estável com um gene repórter, compreendendo a região responsiva de citocina do gene de E-selectina acoplado à fosfatase alcalina (Ray et al., Biochem J. 328:707-715, 1997). Esta linha celular transfectada pode ser 42 conduzida à produção de sPAP através de incubação de um dia para o outro com TNFa.

As células A549 foram plaqueadas em placas de 96 poços a uma concentração final de 5 x 104 células por poço em 100 pL de meio. As células foram deixadas a equilibrar durante 24 horas. Os putativos compostos sólidos anti-OSM foram preparados para uma diluição de stock de 20 mM em DMSO e diluídos em série a 1:3 em DMSO. Isto foi depois mais diluído em meio (DMEM, 1% de FCS inactivado pelo calor, actividade baixa de fosfatase alcalina, 1% de aminoácidos não essenciais, 2 mM de Glutamina, 500 pg mlf1 de G418, (todos da Life Technologies), para produzir uma resposta de concentração de 0,09-200 pM numa concentração final de 1% de DMSO. Os meios velhos foram removidos dos poços e substituídos com composto diluído contendo também 3 ng mL-1 de TNFa (R&D Systems), as células foram incubadas durante mais 20 horas. Cada diluição foi realizada em triplicado, 20 pL de meio foi removido de cada poço e ensaiado para actividade de sPAP utilizando Fosfato de p-nitrofenilo (Sigma), como um substrato. A fosfatase alcalina endógena foi bloqueada com L-homoarginina (Sigma) . A densidade óptica do substrato é lida a 405-650 nm. A concentração do composto é representada graficamente contra OD como uma medida de sPAP produzido e pode ser analisada para determinar os valores de IC50.

Exemplo 7d: Ensaio de viabilidade celular A viabilidade celular foi medida como a capacidade de enzimas desidrogenases em células metabolicamente activas para reduzir um composto de tetrazólio (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazólio, sal interno; MTS num produto de formazano solúvel que pode ser directamente medido a 490 nm. 43

Uma solução de 2 mg/mL de MTS (Promega) contendo 0,046 pg/mL de metossulfato de fenazina (PMS; sigma) foi preparada em PBS de Dulbecco. Após remoção do meio para o ensaio de actividade de sPAP, foram adicionados 20 pL/poço de MTS/PMS. As células foram depois incubadas durante mais 45 minutos. A absorvência a 490 nm foi depois medida utilizando uma referência de 630 nm.

Exemplo 7e: Antagonistas A N-(lH-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-il)benzamida (Davoll e Kerridge, J. Chem. Soc. 2589. 1961) (GW 340442X) produziu uma inibição dependente da concentração da libertação de sPAP induzida por OSM com um IC50 de 0,3 μΜ (Figura 9), mas foi muito menos potente a inibir o sPAP induzido por TNFa (valor aprox. de IC50 de 92 μΜ) (Figura 10) . Deste modo, este composto tem uma selectividade 100 vezes superior para OSM relativamente a TNFa.

Exemplo 8a: Produção e teste de anticorpos anti-OSM humana.

Os anticorpos monoclonais foram produzidos contra a OSM humana (R+D Systems! ) em murganhos como se segue; murganhos SJL fêmea (Jackson Inc. Bar Harbor, MA) foram imunizados com OSM humana recombinante (R&D Systems) quer com uma combinação de 1 pg de antigénio de OSM humana recombinante emulsionado em adjuvante RIBI (RIBI, Hamilton, MT) subcutaneamente e 1 pg de antigénio em adjuvante completo de Freund intraperitonealmente nos dias 0, 3, 5 e 24 (no dia 27, foi administrada ao murganho

um injecção intraperitoneal de 1 pg de antigénio em soro fisiológico); ou 1 pg de antigénio emulsionado em adjuvante RIBI 44 nos dias 0, 3, 5, 24 e 53 intraperitonealmente (no dia 54, o murganho foi injectado com 1,5 pg de antigénio em soro fisiológico intraperitonealmente).

Vinte quatro horas após a última imunização, os murganhos foram sacrificados, e os esplenócitos foram recolhidos e preparados para fusão. O processo de fusão foi como descrito em Su J-L et al: Hybridoma 1998; 17(1): 47-53.). Resumidamente, os esplenócitos e as célula de mieloma P3X63Bcl-2-13 (Kilpatrick KE, et al. Hybridoma 1997; 16(4): 387-395) numa proporção de 5:1 ou 1:1 foram fundidos, utilizando polietilenoglicol 1500 (Boehringer Mannheim, Alemanha). As células fundidas foram ressuspensas a 1 x 106 células/mL em meio de crescimento de hibridoma que é composto de igual volume de RPMI 1640 (Life Technologies, Inc., Gaithesburg, MD) e EXCELL-610 (JRH Biosciences, Lenexa, KS) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (Hyclone, Logan, UT) , 1 X Origen Hybridoma Cloning Factor (Igen, Gaithersburg, MD), 2 mM de L-glutamina, e penicilina/estreptomicina. As células foram depois plaqueadas em placas de microtitulação de 24 poços (Costar, Cambridge, MA) a 1 mL/poço. Vinte quatro horas mais tarde, foram adicionados a cada poço 1 mL de meio de selecção HAT 2x; 100 μΜ de hipoxantina, 0,4 μΜ de aminopterina, 16 μΜ de timina (Life

Technologies, Inc.) em meio de crescimento de hibridoma. Após 2 semanas de cultura a 37 °C, 5% de C02, os sobrenadantes de hibridoma foram seleccionados por ELISA para a secreção de anticorpos anti-OSM. Foi realizada clonagem de diluição limitante em hibridomas seleccionados.

Os sobrenadantes de hibridoma e os soros diluidos foram incubados em placas de 96 poços contendo OSM humana ligada. Os anticorpos anti-hOSM foram detectados através de anticorpos anti-murganho com fosfatase alcalina. Os valores duplicados de 45 0.D. para anticorpos produzindo um resultado positivo são apresentados na Tabela 2.

Tabela 2 Hibridoma OD 1:10 OD 1:100 OD 1:1000 OM5-6.1 1,346 0, 901 0,302 1,329 0, 929 0,249 OM5-6-10 1,347 1,017 0,296 1,434 1,122 0,352 OM6-10.111 1,77 1,073 0,36 1, 615 1,557 , 0524 SOROS DE MURGANHO OD 1:500 OD 1:2500 OD 1:5000 0,006 0 0,005 Ml 0,006 0 0,001 0,003 M2 1,843 1,086 0,73 1,86 1,052 0,794 M3 1,405 0,445 0,198 1,338 0,324 0,217 M4 1,48 0,537 0,18 1, 631 0,484 0,18

Três dos sobrenadantes e todos os soros de murganho, à excepção de um, produziram resultados positivos no ELISA. Utilizando os dados de ELISA, foi determinada uma medida bruta da concentração de anticorpo e os anticorpos positivos foram depois titulados contra 2 ng mL-1 de OSM no ensaio de sPAP de HepG2 B6 descrito no Exemplo 7b. Em resumo, um anticorpo foi incubado de um dia para o outro com a citocina a 4 °C antes de ser incubado com as células HepG2 B6. A produção de sPAP foi ensaiada como descrito no Exemplo 7b. A inibição da produção de sPAP pelos sobrenadantes de hibridoma e os soros de murganho é mostrada na Figura 11. 46

Exemplo 9a: Identificação de residuos de ligação chave para o receptor em OSM.

Os sítios de ligação ao receptor na hOSM foram identificados inicialmente através de referência a membros relacionados da família IL6 das citocinas. Pensa-se que os sítios 1 e 3 estejam envolvidos na ligação à(s) cadeia (s) específica (s) de citocina do receptor, enquanto se pensa que o sítio 2 esteja envolvido na ligação ao componente de receptor comum gpl30. Estudos de mutação no sítio 2 do factor inibitório de leucemia da família das citocinas IL-6 (LIF) (Hudson et al. (1996) J. Biol Chem 271, 11971-11978), interleucina-6 (IL-6) (Paonessa et al. (1995) EMBO J. 14, 1942-1951 e Savino et al. (1994) EMBO J. 13 1357-1367) sugerem que alterações para resíduos no sítio 2 podem resultar em ligação alterada a gpl30. A fim de investigar os resíduos de OSM que são importantes para a sua interacção com gpl30 foi necessário identificar aqueles resíduos que estariam expostos à superfície de OSM na região do sítio 2. Utilizando a informação de experiências de RMN (Hoffman et al. (1996) J. Biomol. NMR 7 273-282) e a estrutura publicada de LIF (Robinson et al. 1994 Cell 77 1101-16) foi construído um modelo de homologia de OSM. Os resíduos que ocupam posições de superfície neste modelo na região do sítio 2 foram seleccionados para mutagénese. Foi determinada a estrutura do complexo formado entre a hormona do crescimento (um homólogo de OSM) e o seu receptor (De Vos et al. (1992) Science 255 306). Através de sobreposição do modelo de OSM com a hormona do crescimento, foram identificados mais sítios de potencial interacção entre OSM e gpl30.

Com base nestes estudos de modelação foram seleccionados 27 sítios para mutação em OSM para investigar a sua interacção com gpl30. Ver a Tabela 3. Em cada um destes sítios, um resíduo de alanina substitui o resíduo de tipo selvagem. 47

Tabela 3

Local Localização Comentários Ser 7 região do terminal N Lys 8 região do terminal N Glu 9 região do terminal N Tyr 10 Hélice A Arg 11 Hélice A Leu 13 Hélice A No modelo actual, a exposição destas leucinas é incerta. Se existe uma distorção na hélice abaixo do residuo 17, a parte superior da hélice 1 pode ser rodada e estes residuos enterrados Leu 14 Hélice A Leu 17 Hélice A Gly 15 Hélice A (continuação)

Gin 16 Hélice A Os residuos 16-22 são praticamente um continuo de residuos hidrófilos, se a estrutura aqui subjacente for helicoidal então alguns destes pode estar enterrados no núcleo da proteína e terem presumivelmente resíduos associados com os quais estabelecem ligações de hidrogénio. Alternativamente, a hélice está distorcida nesta região e a maioria destes resíduos estão expostos. Gin 18 Hélice Ά 48

Lys 19 Hélice A Gin 20 Hélice A Thr 21 Hélice A Asp 22 Hélice A Gin 25 Hélice A Asp 2 6 Hélice A Met 113 Hélice C Pro 116 Hélice C Asn 117 Hélice C Leu 119 Hélice C Gly 120 Hélice C Sem funcionalidade na cadeia lateral mas um de um mutante quádruplo de LIF humano afecta a ligação a gpl30 Arg 122 Hélice C Asn 123 Hélice C Asn 124 Hélice C Tyr 126 Hélice C Gin 130 Hélice C

Exemplo 9b: Sintese de moléculas de fusão GST-OSM mutante

Para cada uma das 27 mutações foi concebido um par de oligonucleótidos mutagénicos. Estes tinham aproximadamente 33 bases de comprimento e, de um modo preferido, um residuo G ou C numa das extremidades. Estes foram emparelhados à expressão derivada de pGEX (Pharmacia) contendo o ADN de OSM de "tipo selvagem" (Ver página página 6) sob o controlo de um promotor lac (/indutivel por IPTG) (Pharmacia) e estendidos utilizando polimerase Pfu nativa (Stratagene). 0 ADN original molde foi digerido com Dpnl (New England Biolabs) e o plasmideo recentemente sintetizado (que não era um substrato para Dpnl) foi transformado na estirpe DH5alfa de E. coli (GibcoBBL/Life 49

Technologies). Foi escolhido um pequeno conjunto (tipicamente 4) de colónias, foi isolado o ADN plasmidico e foi determinada a sequência de ADN. Um clone mutante representativo para cada mutação, conjuntamente com um tipo selvagem construído de forma semelhante, foi transformado na estirpe BLR de E. coli (non DE3: Novagen) para expressão das proteínas recombinantes. Foram estabelecidas e induzidas culturas de 0,51 a um OD550 de aproximadamente 0,5. Após 3 horas de indução, as células foram sedimentadas por centrifugação e lisadas utilizando um método combinado de lisozima e sonicação. Uma vez que as proteínas recombinantes mutantes foram expressas como fusões com GST, foram utilizadas colunas de sefarose de glutationa para ligar as fusões. As proteínas de fusão foram depois eluídas das colunas utilizando glutationa livre e foram depois incubadas em 10 mm de DTT durante 4 horas à temperatura ambiente para remover o aducto de glutationa e armazenadas a -80 °C.

Exemplo 9c: Efeito de mutações pontuais na capacidade de OSM-GST para competir com OSM de tipo selvagem para ligação a gpl30-Fc num ELISA

Foram revestidas Imunoplacas Nunc (F6 Maxisorp, Life

Technologies) de um dia para o outro (4 °C) com OSM de tipo selvagem (produzido de acordo com Exemplo 7a) ; 50 pL/poço, 1 pg/mL em tampão carbonato/bicarbonato pH 9,4). As placas foram lavadas (6x em 0,05% de tween 20 em PBS, utilizando o lavador de placas Skatron) , secas por inversão e batimento e bloqueadas para reduzir a ligação não específica (200 pL/poço, 1% de BSA/PBS) . Após incubação de 1 h (à temperatura ambiente numa plataforma de agitação) as placas foram secas por inversão e batimento e foi adicionado OSM-GST de tipo selvagem (wt) ou 50 mutante do Exemplo 9b (50 pL/poço, 20-0,002 pg/mL, titulado em 1% de BSA/PBS). Como um controlo positivo, foi também testado o anticorpo policlonal anti-OSM humana (R&D Systems) (20-0,02 pg/mL). Foi adicionado um complexo de gpl30-Fc (produzido como abaixo de 300 ng/mL) e conjugado anti-IgG humana com fosfatase alcalina (1:500, Sigma) em 1% de BSA/PBS (50 pL/poço) imediatamente depois dos agentes sob teste. Após uma incubação de 5 h (à temperatura ambiente numa plataforma de agitação) as placas foram lavadas (6x) e reveladas utilizando o Sistema de Amplificação de ELISA (Life Technologies) de acordo com as instruções do fabricante e o OD medido a 4 90 nm. Em cada placa, foi determinada a ligação total através de gpl30-Fc/conjugado e OSM na presença de 1% de BSA/PBS, e ligação não específica através de gpl30-Fc/conjugado na ausência de OSM, ou ligação de conjugado a OSM na ausência de gpl30-Fc. O ADN que codifica o domínio extracelular de gpl30 humano foi amplificado por Reacção em Cadeia da Polimerase (PCR) utilizando iniciadores oligonucleotídicos sintéticos, iniciador para diante, ^OATronATrCAAGCTTTACAGTTACTGAGCACAGGACCTCACC BamHI HindIII sequência UTR 5’

ATGTTGACGTTGCAGACTTG ML TL Q T

e iniciador reverso S*CATCCTCGAGTTTCTCCTTGAGCAAACTTTGG

Xhol concebidos a partir da sequência da base de dados GenBank (número de acesso M57230) para gpl30 humano. O iniciador para diante continha sítios de endonuclease restrição BamHI e 51

HindIII, e uma sequência do consenso 5' não traduzida seguida pela sequência de ADN complementar ao inicio da sequência codificante de gpl30. O iniciador reverso continha um sitio de endonuclease de restrição Xhol seguido pela sequência de ADN complementar para a extremidade 3' do dominio extracelular da sequência codificante de gpl30. Este fragmento de PCR foi purificado e sub-clonado em pCR2.1 (Invitrogen) para produzir pCR2.1 gpl30. 0 plasmideo pCR2.1gpl30 foi digerido com enzimas de restrição RamHI e Xhol e o fragmento gpl30 foi purificado e sub-clonado nos sitios de endonuclease BamHI e Xhol num plasmideo contendo uma sequência de ADN codificando um fragmento Fc de IgGl humano. 0 plasmideo foi depois digerido com a enzima de restrição HindIII, e o fragmento gpl30Fc resultante foi purificado e subclonado no sitio HindIII de um vector de expressão de baculovirus, pFastBacl (Life Technologies), para produzir um plasmideo designado pBACgpFc. A proteina de fusão gpl30Fc foi expressa em células de insecto utilizando o sistema de expressão de baculovirus

Bac-to-Bac (Life Technologies) e foi depois purificada a partir do sobrenadante da cultura de células através de cromatografia de coluna de afinidade de proteina A e verificada por SDS-PAGE corada com azul brilhante de coomassie e por análise de transferência de western utilizando anticorpos anti-gpl30 e anti-hlgG disponíveis comercialmente. A OSM-GST mutante e wt foram testadas para obter IC5o em 3-6 experiências. 0 OD médio na presença de OSM e gpl30-Fc na ausência do ligando competidor (i. e., ligação total) foi 1,157 (gama de 0,825-1, 807) e a ligação não especifica foi menos de 0,08. O anticorpo anti-OSM produziu uma inibição dependente da concentração em todos os ensaios (74±1% de inibição a 1 pg/mL). 52 A OSM-GST wt competiu com OSM ligada à placa para produzir uma inibição dependente da concentração (Fig. 12), com um IC50 de 0,13910,0258 pg/mL determinado em 6 experiências independentes. A potência da OSMGST mutante na competição com OSM wt ligada à placa está sumariada na Tabela 4. As mutações que resultaram num diminuição substancial na capacidade para competir com a OSM wt para a ligação a gpl30 foram L13A, Q16A, Q20A, G120A, N123A e N124A. Destes, Q20A e Q16A foram as mais fracas: à concentração máxima testada (10 pg/mL) Q20A produziu 66±2,3% e Q16A apenas 15±8% de inibição (Figura 12)

Tabela 4: Potência da OSM-GST wt e mutante na competição com OSM wt ligada à placa para ligação a gpl30-Fc no ELISA. Os valores de IC50 foram determinados em 3-6 experiências independentes.

Mutante IC50 [pg/mL] Média Erro Padrão tipo selvagem 0,110 0,120 0,257 0,139 0,026 0,136 0,070 0,142 (D S7A 0,199 0,078 0,121 0,133 0,035 (2) K8A 0,252 0,055 0,106 0,138 0,059 (3) E9A 0,208 0,163 0,097 0,156 0,032 (4) Y10A 0,320 0,180 0,168 0,223 0,049 (5) RI IA 0,181 0,255 0,280 0,239 0,030 (6) L13A 2, 960 1, 990 2, 640 2,530 0,285 (7) L14A 0, 660 0,470 0,412 0,514 0,075 (8) G15A 0,090 0,203 0,171 0,155 0,034 (9) Q16A >10 >10 >10 >10 (10) L17A 2,210 1, 900 1,350 1,820 0,251 (11) Q18A 0,320 0,310 0,555 0,395 0,080 53 (12) K19A 0,047 0,075 0,300 0,040 0,116 0,062 (13) Q20A 4,130 5,570 4,100 6,200 5, 000 0,527 (14) T21A 0,108 0,044 0,101 0,084 0,020 (15) D22 0,040 0,080 0,092 0,071 0,016 (16) M113A 0,511 0,199 0,252 0,321 0,096 (17) P116A 0,232 0,169 0,197 0,199 0,018 (18) N117A 0,983 0,756 0,617 0,785 0,107 (19) L119A 0,272 0,266 0,227 0,255 0,014 (20) G120A 3, 650 2, 680 2, 950 3,090 0,289 (21) R122A 0,140 0,220 0,167 0,176 0,024 (22) N123A 4,750 1,570 2,560 2, 960 0, 940 (23) N124A 1,630 1,950 2,380 1, 990 0,217 (continuação) (24) Y126A 0,386 0,359 0,400 0,382 0,012 (25) Y130A 0,145 0,180 0,094 0,140 0,025 (26) Q26A 0,042 0,036 0,055 0,044 0,006 (27) D26A 0,170 0,280 0,481 0,310 0,091

Exemplo 9d: Efeito de mutações pontuais em OSM na produção de sPAP conduzida por OSM num ensaio in vitro HepG2 B6

Foi utilizado o ensaio descrito no Exemplo 7b acima. As OSM-GST mutantes foram diluidas a uma concentração de 100 ng mL"1 utilizando a concentração conhecida de mutantes de OSM intactos produzidos no Exemplo 9b. Uma OSM-GST de tipo selvagem foi incluída para fins de controlo. As diluições foram realizadas em meio HepG2 B6 com 1% de FCS inactivado pelo calor, baixa actividade de fosfatase alcalina. Foram depois realizadas diluições em série de 1:3. (100; 33,33; 11,11; 3,7; 1,23; 0,4 ng mL"1) . Foram dispensadas 3 x 104 HepG2 B6 em poços individuais de uma placa de 96 poços em 100 pL de meio. As células foram 54 deixadas a equilibrar durante 48 horas. 0 meio foi depois removido e substituído com 100 pL de OSM-GST mutante diluída. As células foram incubadas durante mais 20 horas. Cada diluição foi realizada em triplicado, foram removidos 20 pL de meio e ensaiados para sPAP utilizando pNPP como um substrato. A ALP endógena foi bloqueada com L-homoarginina. A 0. D. foi lida a 405-650 nm. A experiência foi repetida duas vezes. A maioria dos mutantes podia conduzir à libertação de sPAP de um modo semelhante ao de tipo selvagem. Três mutantes produziram níveis muito baixos de sPAP. Os EC50s não foram obtidos a partir destes mutantes. A (Figura 13) mostra as representações gráficas de O.D. obtidas a partir dos mutantes 9 (Q16A), 13 (Q20A) e 20 (G120A), que foram menos eficazes na condução da produção de sPAP. A OSM-GST wt é mostrada para comparação. Estes dados foram utilizados para calcular os valores de EC5o· Os valores reais de EC50s para cada mutante e expressos como uma percentagem do tipo selvagem são mostrados na Tabela 5.

Tabela 5

Mutante Exp 1 Q, O Exp 1 ECso ng ml-1 Exp 2 Q, O Exp 2 ECso ng ml’1 Exp 3 o O Exp 3 EC50 ng ml’1 Média 0 0 ' Potência' WT 100 24 100 32 100 1 S7A 50 12 69 22,2 59, 5 MAIS 2 K8A 66 16 38 12,5 52 MAIS 3 E9A 98 23, 6 27 8, 9 62,5 MAIS 4 Y10A 134 32,4 256 82 195 MENOS 5 RI IA 118 28, 6 86 27,7 102 IGUAL 6 L13A 269 65,7 171 54, 9 220 MENOS 7 L14A 81 19, 4 77 24, 9 79 MAIS 8 G15A 87 21 55 17,8 71 MAIS 55

9 Q16A NC NC NENHUMA 10 L17A 301 72,7 174 56 237,5 MENOS 11 Q18A 84 20,2 68 21,7 76 MAIS 12 K19A 98 23, 6 37 11,9 67,5 MAIS 13 Q20A NC NC NENHUMA 14 T21A 71 17 33 10,5 52 MAIS 15 D22 152 36, 7 50 16 101 IGUAL 16 M113A 106 25, 6 7825 92 IGUAL 17 P116A 104 25 47 15 75,5 MAIS 18 N117A 241 58 132 42,5 186, 5 MENOS 19 L119A 115 27,8 72 23 93,5 IGUAL 20 G120A NC NC NENHUMA (continuação)

21 R122A 135 32,4 43 13, 8 124 47,3 101 IGUAL 22 N123A 157 37, 9 154 49,7 155, 5 MENOS 23 N124A 125 30,2 113 36,2 119 IGUAL 24 Y126A 386 93 32 10,3 106, 5 40, 8 175 MENOS 25 Q130A 52 12,5 26 8,2 39 MAIS 26 Q25A 55 13,3 41 13 48 MAIS 27 D2 6A 81 19, 5 79 25, 5 80 IGUAL São mostrados os valores de EC50 expressos como uma percentagem do EC50 de Tipo Selvagem e os valores reais de EC50 reais. < 80% Mais potente; 80-120% Igual potência; > 120% Menos potente do que o tipo selvagem. NC - não calculado A examinação desta tabela mostra que três desses mutantes que são substancialmente diferentes do wt no ELISA são também menos potentes no ensaio de sPAP, 6 - L13A; 10 - L17A; 22 - N123A e o quarto, 23 - N124A enquadra-se apenas na classe 56 igualmente potente através do sistema de pontuação arbitrário. Assim, ambos os tipos de ensaio mostram boa concordância. Vários dos mutantes foram menos 'potentes' do que o tipo selvagem na condução da produção de sPAP mas verificou-se variação entre as duas experiências, excepto naqueles mutantes (Q16A, Q20A, G120A) que não conduziram de todo sPAP. Os resultados do ensaio indicam que G120A, Q16A e Q20A afectam a ligação de OSM a gpl30. N123A e N124A também parecem ter algum efeito nas interacções com gp 130.

Exemplo 10: Papel da OSM na gastrite. A H. pylori é uma bactéria Gram negativa de forma espiral que foi implicada na causa da gastrite, doença de úlcera péptica e cancro gástrico. As estripes Cag+ de H. pylori têm uma incidência mais elevada com úlceras do que as estripes Cag-de H. pylori. As estripes de H. pylori (Cag+ mais patogénica, e Cag-) foram co-cultivadas in vitro com a linha celular epitelial gástrica ΚΑΤΟ III (ECACC) para investigar a resposta do hospedeiro à infecção por H. pylori através de análise da expressão génica diferencial. O ARNm foi isolado a pontos de tempo: 45 min, 3 horas e 24 horas, foram hibridadas sondas radioactivas derivadas com arrays génicas de ADNc de elevada densidade (contendo aproximadamente 136 genes humanos incluindo citocinas, receptores de citocina e moléculas de adesão). A análise dos perfis de expressão génica obtidos revelou indução/repressão de numerosos genes em resposta às estirpes de H. pylori. Verificou-se que a Oncostatina M foi induzida em células expostas a estirpes de H. pylori altamente patogénicas (Cag+) comparativamente a células expostas a H. pylori 57 fracamente patogénicas (Cag-) ou a células não tratadas de controlo.

Lisboa, 20 de Outubro de 2006 58

Claims (8)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de um anticorpo antagonista para a Oncostatina M (OSM) para a preparação de um medicamento para o tratamento ou profilaxia de uma artropatia inflamatória.
2. 2. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que a artropatia inflamatória é seleccionada a partir do grupo que consiste em; Artrite reumatóide, artrite psoriática, artrite reactiva.
3. 3. Utilização de acordo com as reivindicações 1 a 2, em que o anticorpo é um anticorpo para a OSM humana.
4. 4. Utilização de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3, em que o anticorpo é um fragmento de anticorpo seleccionado a partir de F(ab')2/ Fab, Fv, ScFv.
5. 5. Utilização de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o anticorpo é humanizado ou quimerizado.
6. 6. Utilização de acordo com a reivindicação 2 para o tratamento da artrite reumatóide.
7. 7. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o anticorpo está em combinação com um agente imunossupressor, indutor de tolerância ou anti-inflamatório.
8. 8. Utilização de acordo com a reivindicação 7, em que o anticorpo está em combinação com um agente inibidor da 1 célula CD4+T, um anticorpo anti-CD23 ou um antagonista de TNF. em que o reduzir a Utilização de acordo com a reivindicação 1, medicamento é utilizado para prevenir ou libertação de colagénio da cartilagem. Lisboa, 20 de Outubro de 2006