JPH05304986A - gp130蛋白質に対するモノクロ−ナル抗体 - Google Patents
gp130蛋白質に対するモノクロ−ナル抗体Info
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- JPH05304986A JPH05304986A JP4134329A JP13432992A JPH05304986A JP H05304986 A JPH05304986 A JP H05304986A JP 4134329 A JP4134329 A JP 4134329A JP 13432992 A JP13432992 A JP 13432992A JP H05304986 A JPH05304986 A JP H05304986A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】gp130蛋白質を特異的に認識し、該蛋白質
と結合することでヒトインタ−ロイキン−6の生理作用
を阻害するモノクロ−ナル抗体、これを産生するハイブ
リド−マ、このハイブリド−マを使用する前記モノクロ
−ナル抗体の製造方法、更にこのモノクロ−ナル抗体を
使用するIL−6生理作用阻害剤の提供。 【構成】インタ−ロイキン−6のシグナル伝達蛋白質で
あるgp130蛋白質を特異的に認識し、該蛋白質と結
合することでインタ−ロイキン−6の生理作用を阻害し
得るモノクロ−ナル抗体等。
と結合することでヒトインタ−ロイキン−6の生理作用
を阻害するモノクロ−ナル抗体、これを産生するハイブ
リド−マ、このハイブリド−マを使用する前記モノクロ
−ナル抗体の製造方法、更にこのモノクロ−ナル抗体を
使用するIL−6生理作用阻害剤の提供。 【構成】インタ−ロイキン−6のシグナル伝達蛋白質で
あるgp130蛋白質を特異的に認識し、該蛋白質と結
合することでインタ−ロイキン−6の生理作用を阻害し
得るモノクロ−ナル抗体等。
Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、インタ−ロイキン−6
(以下IL−6と記載する)のシグナル伝達に関与する
gp130蛋白質、特にヒトgp130蛋白質を認識す
る抗体に関する。
(以下IL−6と記載する)のシグナル伝達に関与する
gp130蛋白質、特にヒトgp130蛋白質を認識す
る抗体に関する。
【0002】
【従来の技術】IL−6は、まず標的細胞上のIL−6
レセプタ−(特開平2−288898号)と結合して複
合体を形成する。このIL−6とIL−6レセプタ−の
複合体は、更に標的細胞上の膜蛋白質であるgp130
蛋白質(特開平4−29997号)と結合することで、
該標的細胞にIL−6の種々の生理活性(田賀ら、Cell
58 巻、p573、1989年)を伝達する(田賀ら、Cell 58
巻、p573、1989年)。
レセプタ−(特開平2−288898号)と結合して複
合体を形成する。このIL−6とIL−6レセプタ−の
複合体は、更に標的細胞上の膜蛋白質であるgp130
蛋白質(特開平4−29997号)と結合することで、
該標的細胞にIL−6の種々の生理活性(田賀ら、Cell
58 巻、p573、1989年)を伝達する(田賀ら、Cell 58
巻、p573、1989年)。
【0003】IL−6の生理作用として血小板増多作用
(石橋ら、Blood 74巻、p1241 、1989年)等の有用な作
用が報告され、新しい薬剤として注目されている一方
で、IL−6の異常産生が種々の自己免疫疾患の病因因
子であることも報告され、その生理活性を阻害する薬剤
もまた注目されている(平野ら、Immunology today、11
巻、p443、1990年)。このようなIL−6阻害剤とし
て、IL−6に対する抗体の投与が末期ミエロ−マの患
者に治療効果を与えたという報告がある(B.Kleinら、E
ur.Cytokine Net. 1 巻、p193、1990年)。
(石橋ら、Blood 74巻、p1241 、1989年)等の有用な作
用が報告され、新しい薬剤として注目されている一方
で、IL−6の異常産生が種々の自己免疫疾患の病因因
子であることも報告され、その生理活性を阻害する薬剤
もまた注目されている(平野ら、Immunology today、11
巻、p443、1990年)。このようなIL−6阻害剤とし
て、IL−6に対する抗体の投与が末期ミエロ−マの患
者に治療効果を与えたという報告がある(B.Kleinら、E
ur.Cytokine Net. 1 巻、p193、1990年)。
【0004】このようなIL−6阻害剤として前記IL
−6に対する抗体の他、前述の如くIL−6のシグナ
ル、即ち生理作用を伝達する蛋白質であるgp130蛋
白質に対する抗体が期待されている。またgp130蛋
白質はIL−6以外の生理活性物質、例えばある種のガ
ン細胞増殖因子であるオンコスタチンMや、また例えば
ある種の白血病増殖阻害因子であるLIF(リュ−ケミ
アインヒビトリ−ファクタ−)のシグナル伝達蛋白であ
るとの報告があり(Gearing ら、SCIENCE 、255巻、p14
34 、1992年)、本発明の抗gp130蛋白質抗体がそ
れら生理活性物質の阻害剤として期待できる。
−6に対する抗体の他、前述の如くIL−6のシグナ
ル、即ち生理作用を伝達する蛋白質であるgp130蛋
白質に対する抗体が期待されている。またgp130蛋
白質はIL−6以外の生理活性物質、例えばある種のガ
ン細胞増殖因子であるオンコスタチンMや、また例えば
ある種の白血病増殖阻害因子であるLIF(リュ−ケミ
アインヒビトリ−ファクタ−)のシグナル伝達蛋白であ
るとの報告があり(Gearing ら、SCIENCE 、255巻、p14
34 、1992年)、本発明の抗gp130蛋白質抗体がそ
れら生理活性物質の阻害剤として期待できる。
【0005】gp130蛋白質に対する抗体としては、
例えば特開平3−219894号に記載された、gp1
30蛋白質をマウスに免疫して得られたAM64やAM
277抗体がある。
例えば特開平3−219894号に記載された、gp1
30蛋白質をマウスに免疫して得られたAM64やAM
277抗体がある。
【0006】
【発明が解決しようとする課題】従来知られたAM64
抗体等は、IL−6の生理作用を阻害する(日比ら、Ce
ll、63巻、p1149 、1990年)ものの、その阻害活性は十
分なものではない。
抗体等は、IL−6の生理作用を阻害する(日比ら、Ce
ll、63巻、p1149 、1990年)ものの、その阻害活性は十
分なものではない。
【0007】
【課題を解決するための手段】以上のような状況に鑑み
て本発明者らは、リコンビナントgp130蛋白質をマ
ウスに免疫し、gp130蛋白質を認識する多数のハイ
ブリド−マを樹立し、gp130蛋白質を認識するモノ
クロ−ナル抗体をスクリ−ニングした結果、IL−6の
生理作用を強く阻害する3種のモノクロ−ナル抗体とこ
れらを産生するハイブリド−マを発明するに至った。
て本発明者らは、リコンビナントgp130蛋白質をマ
ウスに免疫し、gp130蛋白質を認識する多数のハイ
ブリド−マを樹立し、gp130蛋白質を認識するモノ
クロ−ナル抗体をスクリ−ニングした結果、IL−6の
生理作用を強く阻害する3種のモノクロ−ナル抗体とこ
れらを産生するハイブリド−マを発明するに至った。
【0008】即ち本発明は、IL−6のシグナル伝達蛋
白質であるgp130蛋白質を特異的に認識し、該蛋白
質と結合することでインタ−ロイキン−6の生理作用を
阻害し得るモノクロ−ナル抗体であり、特にIL−6と
ヒトgp130間のシグナル伝達を阻害し得るものであ
る。例えば本発明のモノクロ−ナル抗体は、GPZ35
抗体、GPX 7抗体又はGPX 22抗体である。
白質であるgp130蛋白質を特異的に認識し、該蛋白
質と結合することでインタ−ロイキン−6の生理作用を
阻害し得るモノクロ−ナル抗体であり、特にIL−6と
ヒトgp130間のシグナル伝達を阻害し得るものであ
る。例えば本発明のモノクロ−ナル抗体は、GPZ35
抗体、GPX 7抗体又はGPX 22抗体である。
【0009】また本発明は、これらモノクロ−ナル抗体
を産生するハイブリド−マである。例えば本発明のハイ
ブリド−マは、ハイブリド−マGPZ 35(微工研菌
寄第12940号)、ハイブリド−マGPX 7(微工
研菌寄第12938号)又はハイブリド−マGPX 2
2(微工研菌寄第12939号)である。
を産生するハイブリド−マである。例えば本発明のハイ
ブリド−マは、ハイブリド−マGPZ 35(微工研菌
寄第12940号)、ハイブリド−マGPX 7(微工
研菌寄第12938号)又はハイブリド−マGPX 2
2(微工研菌寄第12939号)である。
【0010】更に本発明は、前記ハイブリド−マを培養
することを特徴とする前記モノクロ−ナル抗体の製造方
法に関するものである。例えば本発明は、ハイブリド−
マGPZ 35(微工研菌寄第12940号)、ハイブ
リド−マGPX 7(微工研菌寄第12938号)又は
ハイブリド−マGPX 22(微工研菌寄第12939
号)から選ばれるハイブリド−マを培養することを特徴
とする、gp130蛋白質を特異的に認識し、該蛋白質
と結合することでIL−6の生理作用を阻害することを
特徴とする前記モノクロ−ナル抗体の製造である。
することを特徴とする前記モノクロ−ナル抗体の製造方
法に関するものである。例えば本発明は、ハイブリド−
マGPZ 35(微工研菌寄第12940号)、ハイブ
リド−マGPX 7(微工研菌寄第12938号)又は
ハイブリド−マGPX 22(微工研菌寄第12939
号)から選ばれるハイブリド−マを培養することを特徴
とする、gp130蛋白質を特異的に認識し、該蛋白質
と結合することでIL−6の生理作用を阻害することを
特徴とする前記モノクロ−ナル抗体の製造である。
【0011】そして本発明は、gp130蛋白質を特異
的に認識し、該蛋白質と結合することでヒトインタ−ロ
イキン−6の生理作用を阻害する、これらモノクロ−ナ
ル抗体の1種以上を有効成分として含む、IL−6の生
理作用阻害剤である。以下、本発明を詳細に説明する。
的に認識し、該蛋白質と結合することでヒトインタ−ロ
イキン−6の生理作用を阻害する、これらモノクロ−ナ
ル抗体の1種以上を有効成分として含む、IL−6の生
理作用阻害剤である。以下、本発明を詳細に説明する。
【0012】本発明のモノクロ−ナル抗体は、IL−6
のシグナルを伝達するgp130蛋白質を抗原として製
造されたものである。gp130蛋白質は、IL−6の
存在下でIL−6レセプタ−と結合するが、IL−6非
存在下ではIL−6レセプタ−と結合しない、SDS−
ポリアクリルアミド電気泳動で130kDaの見かけ上
の分子量を示す糖蛋白である、等の特徴を有する。
のシグナルを伝達するgp130蛋白質を抗原として製
造されたものである。gp130蛋白質は、IL−6の
存在下でIL−6レセプタ−と結合するが、IL−6非
存在下ではIL−6レセプタ−と結合しない、SDS−
ポリアクリルアミド電気泳動で130kDaの見かけ上
の分子量を示す糖蛋白である、等の特徴を有する。
【0013】本発明のモノクロ−ナル抗体は、1991
年度日本免疫学会総会・学術集会記録21巻、p108(斎藤
ら)に記載された方法に従い、遺伝子工学的に製造され
たリコンビナントgp130蛋白質(可溶型)をマウス
に免疫し、脾臓細胞を取得しこれを樹立されたミエロ−
マ細胞(SP2/0株等)と融合させて取得したハイブ
リド−マにより生産される。例えばハイブリド−マGP
Z 35(微工研菌寄12940号)、GPX 7(微
工研菌寄12938号)又はGPX 22(微工研菌寄
12939号)により産生される、モノクロ−ナルGP
Z 35、GPX 7又はGPX 22抗体が例示でき
る。
年度日本免疫学会総会・学術集会記録21巻、p108(斎藤
ら)に記載された方法に従い、遺伝子工学的に製造され
たリコンビナントgp130蛋白質(可溶型)をマウス
に免疫し、脾臓細胞を取得しこれを樹立されたミエロ−
マ細胞(SP2/0株等)と融合させて取得したハイブ
リド−マにより生産される。例えばハイブリド−マGP
Z 35(微工研菌寄12940号)、GPX 7(微
工研菌寄12938号)又はGPX 22(微工研菌寄
12939号)により産生される、モノクロ−ナルGP
Z 35、GPX 7又はGPX 22抗体が例示でき
る。
【0014】本発明のモノクロ−ナル抗体、例えばモノ
クロ−ナルGPZ 35、GPX7又はGPX 22抗
体がgp130蛋白質のいかなる部分を認識するのかは
定かではないが、少なくともこれらモノクロ−ナル抗体
は、gp130蛋白質と結合することにより、先に知ら
れたAM64抗体やAM277抗体に比べ、強くIL−
6の生理作用を阻害する。またこれらモノクロ−ナル抗
体は、抗原に用いたリコンビナントgp130蛋白質以
外にも、細胞膜、血清又は尿から精製した天然gp13
0蛋白質とも反応性を有する。
クロ−ナルGPZ 35、GPX7又はGPX 22抗
体がgp130蛋白質のいかなる部分を認識するのかは
定かではないが、少なくともこれらモノクロ−ナル抗体
は、gp130蛋白質と結合することにより、先に知ら
れたAM64抗体やAM277抗体に比べ、強くIL−
6の生理作用を阻害する。またこれらモノクロ−ナル抗
体は、抗原に用いたリコンビナントgp130蛋白質以
外にも、細胞膜、血清又は尿から精製した天然gp13
0蛋白質とも反応性を有する。
【0015】本発明のモノクロ−ナル抗体は、前記した
ハイブリド−マ、例えばGPZ 35(微工研菌寄12
940号)、GPX 7(微工研菌寄12938号)又
はGPX 22(微工研菌寄12939号)を培養する
こと等により製造することができる。培養は通常の方法
で行えば良い。また、これらハイブリド−マの2種以上
を同時に培養すれば、2種以上の本発明のモノクロ−ナ
ル抗体の混合液を得ることもできる。
ハイブリド−マ、例えばGPZ 35(微工研菌寄12
940号)、GPX 7(微工研菌寄12938号)又
はGPX 22(微工研菌寄12939号)を培養する
こと等により製造することができる。培養は通常の方法
で行えば良い。また、これらハイブリド−マの2種以上
を同時に培養すれば、2種以上の本発明のモノクロ−ナ
ル抗体の混合液を得ることもできる。
【0016】培養液中に産生された本発明のモノクロ−
ナルの精製は、例えば硫安塩析、gp130蛋白質固定
化ゲルを使用したアフィニティ−クロマトグラフを使用
すれば良い。なお、本発明では、例えばマウスの腹腔に
ハイブリド−マを接種し、該マウスを飼育してその腹水
中にモノクロ−ナル抗体を産生させても良い。
ナルの精製は、例えば硫安塩析、gp130蛋白質固定
化ゲルを使用したアフィニティ−クロマトグラフを使用
すれば良い。なお、本発明では、例えばマウスの腹腔に
ハイブリド−マを接種し、該マウスを飼育してその腹水
中にモノクロ−ナル抗体を産生させても良い。
【0017】本発明のモノクロ−ナル抗体は、前記した
ようにgp130蛋白質と結合することによりIL−6
の生理作用を阻害する。従って、これら抗体を有効成分
とすることで、IL−6の生理作用阻害剤が提供でき
る。gp130蛋白質はIL−6のシグナル伝達を阻害
する蛋白質として知見されたものであるが、その生理作
用の詳細は完全には解明されておらず、他の、例えばあ
る種の癌細胞増殖因子であるオンコスタチンMやある種
の白血病増殖阻害因子であるLIF等は勿論、gp13
0蛋白質がそのシグナル伝達に関与する生理活性物質に
対する阻害剤としても使用できる。
ようにgp130蛋白質と結合することによりIL−6
の生理作用を阻害する。従って、これら抗体を有効成分
とすることで、IL−6の生理作用阻害剤が提供でき
る。gp130蛋白質はIL−6のシグナル伝達を阻害
する蛋白質として知見されたものであるが、その生理作
用の詳細は完全には解明されておらず、他の、例えばあ
る種の癌細胞増殖因子であるオンコスタチンMやある種
の白血病増殖阻害因子であるLIF等は勿論、gp13
0蛋白質がそのシグナル伝達に関与する生理活性物質に
対する阻害剤としても使用できる。
【0018】
【実施例】以下に本発明を更に詳細に説明するために実
施例を記載するが、本発明はこれら実施例に限定される
ものではない。
施例を記載するが、本発明はこれら実施例に限定される
ものではない。
【0019】実施例1モノクロ−ナル抗体GPZ 3
5、GPX 7、GPX 22の製造CHO細胞由来の
リコンビナントgp130蛋白質(可溶型、斎藤ら、1
991年度日本免疫学会総会・学術集会記録、21巻、p1
08)を使用し、これを10日に1回、合計4回に渡り5
0μg ずつBALB/cマウスの腹腔に免疫した。
5、GPX 7、GPX 22の製造CHO細胞由来の
リコンビナントgp130蛋白質(可溶型、斎藤ら、1
991年度日本免疫学会総会・学術集会記録、21巻、p1
08)を使用し、これを10日に1回、合計4回に渡り5
0μg ずつBALB/cマウスの腹腔に免疫した。
【0020】マウスから脾臓細胞を取得し、ミエロ−マ
細胞(SP2/0株)とポリエチレングリコ−ルを用い
て融合させた。
細胞(SP2/0株)とポリエチレングリコ−ルを用い
て融合させた。
【0021】融合細胞をDMEM,HAT培地で培養
し、培養液中にモノクロ−ナル抗体を産生させ、スクリ
−ニングを行った。即ち、免疫原として使用したリコン
ビナントgp130蛋白質(可溶型)を96穴のプレ−
トに固相化し、ハイブリド−マの培養上清及びアルカリ
フォスファタ−ゼを結合させた抗マウスイムノグロブリ
ン抗体を加えgp130蛋白質を認識するモノクロ−ナ
ル抗体の存在を調べた。このようにして、gp130蛋
白質を認識するモノクロ−ナル抗体の存在が確認された
培養液については、細胞を限界希釈法を用いてクロ−ニ
ングした。このようにして、最終的にgp130蛋白質
を認識するモノクロ−ナル抗体を産生する66クロ−ン
のハイブリド−マを樹立した。
し、培養液中にモノクロ−ナル抗体を産生させ、スクリ
−ニングを行った。即ち、免疫原として使用したリコン
ビナントgp130蛋白質(可溶型)を96穴のプレ−
トに固相化し、ハイブリド−マの培養上清及びアルカリ
フォスファタ−ゼを結合させた抗マウスイムノグロブリ
ン抗体を加えgp130蛋白質を認識するモノクロ−ナ
ル抗体の存在を調べた。このようにして、gp130蛋
白質を認識するモノクロ−ナル抗体の存在が確認された
培養液については、細胞を限界希釈法を用いてクロ−ニ
ングした。このようにして、最終的にgp130蛋白質
を認識するモノクロ−ナル抗体を産生する66クロ−ン
のハイブリド−マを樹立した。
【0022】前記66クロ−ンのハイブリド−マについ
て、以下の操作を行った。まず96穴プレ−トにマウス
由来の抗ヒトgp130蛋白質モノクロ−ナルAM64
抗体(特開平3−219894号)を固定化した。次に
CHO細胞由来のgp130蛋白質(可溶型、前記参
照)を加えて前記抗体と反応させ、結合させた。
て、以下の操作を行った。まず96穴プレ−トにマウス
由来の抗ヒトgp130蛋白質モノクロ−ナルAM64
抗体(特開平3−219894号)を固定化した。次に
CHO細胞由来のgp130蛋白質(可溶型、前記参
照)を加えて前記抗体と反応させ、結合させた。
【0023】各穴に、大腸菌を使用して製造したリコン
ビナントIL−6(Yasukawaら、Biotech.Lett. 12巻、
p419、1990年)とCHO細胞を使用して製造したリコン
ビナントIL−6レセプタ−(Yasukawaら、J.Biochem.
108巻、p673、1990年)の混合物、及び各ハイブリド−
マの培養液上清を同時に添加した。
ビナントIL−6(Yasukawaら、Biotech.Lett. 12巻、
p419、1990年)とCHO細胞を使用して製造したリコン
ビナントIL−6レセプタ−(Yasukawaら、J.Biochem.
108巻、p673、1990年)の混合物、及び各ハイブリド−
マの培養液上清を同時に添加した。
【0024】次に、この条件下でAM64抗体及びgp
130蛋白質を介して固定化されたIL−6レセプタ−
を、モノルモットにIL−6レセプタ−を免疫して製造
した抗IL−6レセプタ−ポリクロ−ナル抗体及びアル
カリフォスファタ−ゼで標識した抗モルモットイムノグ
ロブリン抗体を添加し、穴を洗浄し、アルカリフォスフ
ァタ−ゼ基質を添加することにより、添加したgp13
0蛋白質に対するモノクロ−ナル抗体のIL−6の生理
作用阻害効果を測定した。
130蛋白質を介して固定化されたIL−6レセプタ−
を、モノルモットにIL−6レセプタ−を免疫して製造
した抗IL−6レセプタ−ポリクロ−ナル抗体及びアル
カリフォスファタ−ゼで標識した抗モルモットイムノグ
ロブリン抗体を添加し、穴を洗浄し、アルカリフォスフ
ァタ−ゼ基質を添加することにより、添加したgp13
0蛋白質に対するモノクロ−ナル抗体のIL−6の生理
作用阻害効果を測定した。
【0025】その結果、前記66クロ−ンのうち、3つ
のクロ−ン(GPZ 35:微工研菌寄第12940
号、GPX 7:微工研菌寄第12938号、GPX
22:微工研菌寄第12939号)が産生したモノクロ
−ナル抗体にIL−6の生理作用阻害効果が認められ
た。
のクロ−ン(GPZ 35:微工研菌寄第12940
号、GPX 7:微工研菌寄第12938号、GPX
22:微工研菌寄第12939号)が産生したモノクロ
−ナル抗体にIL−6の生理作用阻害効果が認められ
た。
【0026】実施例2 gp130蛋白質に対するモノ
クロ−ナル抗体を用いた、IL−6のヒトB細胞株CL
4の抗体産生誘導作用の阻害効果 実施例1で調製された2つのハイブリド−マをBALB
/cマウスの腹腔に移植し、腹水からそれぞれモノクロ
−ナルGPZ 35及びGPX 22抗体を精製した。
クロ−ナル抗体を用いた、IL−6のヒトB細胞株CL
4の抗体産生誘導作用の阻害効果 実施例1で調製された2つのハイブリド−マをBALB
/cマウスの腹腔に移植し、腹水からそれぞれモノクロ
−ナルGPZ 35及びGPX 22抗体を精製した。
【0027】CL4細胞( T.Hirano ら、Proc.Natl.Ac
ad.Sci.U.S.A. 82巻、p5490 、1985年)は、IL−6の
生理作用により抗体産生細胞に分化する。このCL4細
胞懸濁液を、細胞数が1×104 細胞/0.2ml/穴の
条件となるように96穴のプレ−トに添加し、種々濃度
となるように調製した前記2種類のモノクロ−ナル抗体
又は対照(マウスイムノグロブリン)を添加し、3日
間、RPMI1640培地で培養した。培養終了後、培
養液中のイムノグロブリン量を酵素免疫測定法(ELI
SA)により測定した。なお各穴には、10U/mlのI
L−6を添加した。
ad.Sci.U.S.A. 82巻、p5490 、1985年)は、IL−6の
生理作用により抗体産生細胞に分化する。このCL4細
胞懸濁液を、細胞数が1×104 細胞/0.2ml/穴の
条件となるように96穴のプレ−トに添加し、種々濃度
となるように調製した前記2種類のモノクロ−ナル抗体
又は対照(マウスイムノグロブリン)を添加し、3日
間、RPMI1640培地で培養した。培養終了後、培
養液中のイムノグロブリン量を酵素免疫測定法(ELI
SA)により測定した。なお各穴には、10U/mlのI
L−6を添加した。
【0028】その結果、モノクロ−ナルGPZ 35又
はGPX 22抗体を添加した場合には添加濃度に依存
したCL4細胞の抗体産生の阻害が認められたが、対照
であるマウスイムノグロブリンを添加した場合には阻害
は認められなかった。このことは、本発明のモノクロ−
ナル抗体がgp130蛋白質を認識し、かつ、IL−6
の生理作用(CL4細胞の抗体産生誘導作用)を阻害す
ることを示している。結果を図1に示す。
はGPX 22抗体を添加した場合には添加濃度に依存
したCL4細胞の抗体産生の阻害が認められたが、対照
であるマウスイムノグロブリンを添加した場合には阻害
は認められなかった。このことは、本発明のモノクロ−
ナル抗体がgp130蛋白質を認識し、かつ、IL−6
の生理作用(CL4細胞の抗体産生誘導作用)を阻害す
ることを示している。結果を図1に示す。
【0029】実施例3 gp130蛋白質に対するモノ
クロ−ナル抗体を用いた、IL−6のヒトT細胞KT3
の増殖誘導作用の阻害効果 実施例1で調製された3つのハイブリド−マをBALB
/cマウスの腹腔に移植し、腹水からそれぞれモノクロ
−ナルGPZ 35、GPX 7又はGPX22抗体を
精製した。
クロ−ナル抗体を用いた、IL−6のヒトT細胞KT3
の増殖誘導作用の阻害効果 実施例1で調製された3つのハイブリド−マをBALB
/cマウスの腹腔に移植し、腹水からそれぞれモノクロ
−ナルGPZ 35、GPX 7又はGPX22抗体を
精製した。
【0030】T細胞KT3株(Y.Hirataら、J.Immuno
l.、143 巻、p2900 、1989年)は、IL−6の生理作用
により増殖する。このT細胞KT3株懸濁液を細胞数が
2×104 細胞/0.2ml/穴の条件となるように96
穴のプレ−トに添加し、種々濃度となるように調製した
前記3種類のモノクロ−ナル抗体又は対照(マウスイム
ノグロブリン)を添加し、3日間、RPMI1640培
地で培養した。培養終了後細胞数を市販のキット(Chem
icon社製)を用いてMTT法で測定した。なおIL−6
は、0.25U/mlとなるように添加した。
l.、143 巻、p2900 、1989年)は、IL−6の生理作用
により増殖する。このT細胞KT3株懸濁液を細胞数が
2×104 細胞/0.2ml/穴の条件となるように96
穴のプレ−トに添加し、種々濃度となるように調製した
前記3種類のモノクロ−ナル抗体又は対照(マウスイム
ノグロブリン)を添加し、3日間、RPMI1640培
地で培養した。培養終了後細胞数を市販のキット(Chem
icon社製)を用いてMTT法で測定した。なおIL−6
は、0.25U/mlとなるように添加した。
【0031】その結果、モノクロ−ナルGPZ 35、
GPX 7又はGPX 22抗体を添加した場合には、
添加濃度に依存した分化細胞数の減少が認められたが、
対照であるマウスイムノグロブリンを添加した場合には
減少は認められなかった。このことは、本発明のモノク
ロ−ナル抗体がgp130蛋白質を認識し、かつ、IL
−6の生理作用(T細胞TK3株の増殖誘導作用)を阻
害することを示している。結果を図2に示す。
GPX 7又はGPX 22抗体を添加した場合には、
添加濃度に依存した分化細胞数の減少が認められたが、
対照であるマウスイムノグロブリンを添加した場合には
減少は認められなかった。このことは、本発明のモノク
ロ−ナル抗体がgp130蛋白質を認識し、かつ、IL
−6の生理作用(T細胞TK3株の増殖誘導作用)を阻
害することを示している。結果を図2に示す。
【0032】実施例4 gp130蛋白質に対するモノ
クロ−ナル抗体を用いた、IL−6及びIL−6レセプ
タ−複合体の、gp130蛋白質への結合阻害効果 実施例1で調製された3つのハイブリド−マをBALB
/cマウスの腹腔に移植し、腹水からそれぞれモノクロ
−ナルGPZ 35、GPX 7又はGPX22抗体を
精製した。
クロ−ナル抗体を用いた、IL−6及びIL−6レセプ
タ−複合体の、gp130蛋白質への結合阻害効果 実施例1で調製された3つのハイブリド−マをBALB
/cマウスの腹腔に移植し、腹水からそれぞれモノクロ
−ナルGPZ 35、GPX 7又はGPX22抗体を
精製した。
【0033】96穴のプレ−トにマウスを用いて製造し
た抗ヒトgp130蛋白質モノクロ−ナルAM64抗体
を固定化し、CHO細胞を用いて製造したリコンビナン
トgp130蛋白質を添加して結合させた。次に大腸菌
を用いて製造したリコンビナントIL−6及びCHO細
胞を用いて製造したリコンビナントIL−6レセプタ−
(可溶型)の混合物と、種々の濃度の前記3種のモノク
ロ−ナル抗体又は対照としてマウスイムノグロブリンを
同時に添加した。なお、IL−6とIL−6レセプタ−
はそれぞれ5μg /mlとなるように添加した。
た抗ヒトgp130蛋白質モノクロ−ナルAM64抗体
を固定化し、CHO細胞を用いて製造したリコンビナン
トgp130蛋白質を添加して結合させた。次に大腸菌
を用いて製造したリコンビナントIL−6及びCHO細
胞を用いて製造したリコンビナントIL−6レセプタ−
(可溶型)の混合物と、種々の濃度の前記3種のモノク
ロ−ナル抗体又は対照としてマウスイムノグロブリンを
同時に添加した。なお、IL−6とIL−6レセプタ−
はそれぞれ5μg /mlとなるように添加した。
【0034】次に、この条件下でAM64抗体及びgp
130蛋白質を介して固定化されたIL−6レセプタ−
を、モルモットにIL−6レセプタ−を免疫して製造し
た抗IL−6レセプタ−ポリクロ−ナル抗体及びアルカ
リフォスファタ−ゼで標識した抗モルモットイムノグロ
ブリン抗体を添加し、穴を洗浄し、アルカリフォスファ
タ−ゼ基質を添加することにより、添加したgp130
蛋白質に対するモノクロ−ナル抗体の効果を測定した。
130蛋白質を介して固定化されたIL−6レセプタ−
を、モルモットにIL−6レセプタ−を免疫して製造し
た抗IL−6レセプタ−ポリクロ−ナル抗体及びアルカ
リフォスファタ−ゼで標識した抗モルモットイムノグロ
ブリン抗体を添加し、穴を洗浄し、アルカリフォスファ
タ−ゼ基質を添加することにより、添加したgp130
蛋白質に対するモノクロ−ナル抗体の効果を測定した。
【0035】その結果、モノクロ−ナルGPZ 35、
GPX 7又はGPX 22抗体を添加した場合には、
添加濃度に依存して測定されたシグナル、即ちgp13
0蛋白質と結合したIL−6レセプタ−、は減少した
が、マウスイムノグロブリンを添加した場合には減少は
認められなかった。このことは、本発明のモノクロ−ナ
ル抗体がgp130蛋白質を認識し、かつ、IL−6及
びIL−6レセプタ−の複合体がgp130蛋白質と結
合するのを阻害することを示している。結果を図3に示
す。
GPX 7又はGPX 22抗体を添加した場合には、
添加濃度に依存して測定されたシグナル、即ちgp13
0蛋白質と結合したIL−6レセプタ−、は減少した
が、マウスイムノグロブリンを添加した場合には減少は
認められなかった。このことは、本発明のモノクロ−ナ
ル抗体がgp130蛋白質を認識し、かつ、IL−6及
びIL−6レセプタ−の複合体がgp130蛋白質と結
合するのを阻害することを示している。結果を図3に示
す。
【0036】実施例5 gp130蛋白質に対するモノ
クロ−ナル抗体を用いた、IL−6のヒトミエロ−マ増
殖促進作用の阻害効果 実施例1で調製された3つのハイブリド−マをBALB
/cマウスの腹腔に移植し、腹水からそれぞれモノクロ
−ナルGPZ 35、GPX 7又はGPX22抗体を
精製した。
クロ−ナル抗体を用いた、IL−6のヒトミエロ−マ増
殖促進作用の阻害効果 実施例1で調製された3つのハイブリド−マをBALB
/cマウスの腹腔に移植し、腹水からそれぞれモノクロ
−ナルGPZ 35、GPX 7又はGPX22抗体を
精製した。
【0037】IL−6が存在することでオ−トクライン
的に増殖するヒトミエロ−マS6B45細胞の懸濁液
を、24穴のプレ−トに5×104 細胞/0.5ml/穴
となるように添加し、種々の濃度の前記3種のモノクロ
−ナル抗体又は対照としてマウスイムノグロブリンを加
えてRPMI1640培地で培養し、3日後のミエロ−
マ細胞の細胞数を市販のキット(Chemicon社製)を用い
てMTT法で測定した。
的に増殖するヒトミエロ−マS6B45細胞の懸濁液
を、24穴のプレ−トに5×104 細胞/0.5ml/穴
となるように添加し、種々の濃度の前記3種のモノクロ
−ナル抗体又は対照としてマウスイムノグロブリンを加
えてRPMI1640培地で培養し、3日後のミエロ−
マ細胞の細胞数を市販のキット(Chemicon社製)を用い
てMTT法で測定した。
【0038】その結果、モノクロ−ナルGPZ 35、
GPX 7又はGPX 22抗体を添加した場合には、
添加濃度に依存してミエロ−マのオ−トクライン的増殖
の阻害が認められたが、マウスイムノグロブリンを添加
した場合には阻害は認められなかった。このことは、本
発明のモノクロ−ナル抗体がgp130蛋白質を認識
し、かつ、IL−6の生理作用(ミエロ−マのオ−トク
ライン的増殖)を阻害することを示している。結果を図
4に示す。
GPX 7又はGPX 22抗体を添加した場合には、
添加濃度に依存してミエロ−マのオ−トクライン的増殖
の阻害が認められたが、マウスイムノグロブリンを添加
した場合には阻害は認められなかった。このことは、本
発明のモノクロ−ナル抗体がgp130蛋白質を認識
し、かつ、IL−6の生理作用(ミエロ−マのオ−トク
ライン的増殖)を阻害することを示している。結果を図
4に示す。
【0039】実施例6 gp130蛋白質に対するモノ
クロ−ナル抗体を用いた、IL−6及びIL−6レセプ
タ−存在下でのマウス細胞BAF130の増殖誘導作用
の阻害効果 実施例1で調製された3つのハイブリド−マをBALB
/cマウスの腹腔に移植し、腹水からそれぞれモノクロ
−ナルGPZ 35、GPX 7又はGPX22抗体を
精製した。
クロ−ナル抗体を用いた、IL−6及びIL−6レセプ
タ−存在下でのマウス細胞BAF130の増殖誘導作用
の阻害効果 実施例1で調製された3つのハイブリド−マをBALB
/cマウスの腹腔に移植し、腹水からそれぞれモノクロ
−ナルGPZ 35、GPX 7又はGPX22抗体を
精製した。
【0040】マウスBAF130は、本来ヒトgp13
0蛋白質を発現していないマウス細胞BAF(Hatakeya
maら、Cell、63巻、p154、1989年)にヒトgp130蛋
白質をコ−ドする遺伝子を導入して形質転換させ、当該
蛋白質を発現させた細胞である。この細胞の懸濁液を、
96穴のプレ−トに8×104 細胞/0.2ml/穴とな
るように添加し、それぞれ250ng/mlのIL−6及び
IL−6レセプタ−を添加した。この条件下で種々の濃
度の前記3種のモノクロ−ナル抗体又は対照としてマウ
スイムノグロブリンを加えてRPMI1640培地で2
日間培養した。
0蛋白質を発現していないマウス細胞BAF(Hatakeya
maら、Cell、63巻、p154、1989年)にヒトgp130蛋
白質をコ−ドする遺伝子を導入して形質転換させ、当該
蛋白質を発現させた細胞である。この細胞の懸濁液を、
96穴のプレ−トに8×104 細胞/0.2ml/穴とな
るように添加し、それぞれ250ng/mlのIL−6及び
IL−6レセプタ−を添加した。この条件下で種々の濃
度の前記3種のモノクロ−ナル抗体又は対照としてマウ
スイムノグロブリンを加えてRPMI1640培地で2
日間培養した。
【0041】培養後、各穴に750nCi の 3Hチミジン
を加え、6時間後に取り込まれた3 Hチミジン量をシン
チレ−ションカウンタ−で測定した。
を加え、6時間後に取り込まれた3 Hチミジン量をシン
チレ−ションカウンタ−で測定した。
【0042】その結果、モノクロ−ナルGPZ 35、
GPX 7又はGPX 22抗体を添加した場合には、
添加濃度に依存して3 Hチミジンの取り込みの減少、即
ちマウス細胞BAF130の増殖の阻害、が認められた
が、マウスイムノグロブリンを添加した場合には阻害は
認められなかった。このことは、本発明のモノクロ−ナ
ル抗体がgp130蛋白質を認識し、かつ、IL−6の
生理作用(マウス細胞BAF130の増殖作用)を阻害
することを示している。結果を図5に示す。
GPX 7又はGPX 22抗体を添加した場合には、
添加濃度に依存して3 Hチミジンの取り込みの減少、即
ちマウス細胞BAF130の増殖の阻害、が認められた
が、マウスイムノグロブリンを添加した場合には阻害は
認められなかった。このことは、本発明のモノクロ−ナ
ル抗体がgp130蛋白質を認識し、かつ、IL−6の
生理作用(マウス細胞BAF130の増殖作用)を阻害
することを示している。結果を図5に示す。
【0043】
【発明の効果】本発明が提供する、ヒトgp130蛋白
質を認識するモノクロ−ナル抗体、例えばGPZ 3
5、GPX 7又はGPX 22抗体は、ヒトgp13
0蛋白質を認識し、かつ該蛋白質と結合することでヒト
インタ−ロイキン−6の生理作用を強く阻害する特徴を
有するものであり、IL−6の生理作用を阻害するIL
−6阻害剤の開発が可能となる。このことは、これまで
知られていたgp130蛋白質を認識するAM64抗体
やAM277抗体では困難であり、例えば自己免疫疾患
やミエロ−マ等の、IL−6が引き起こし、又は関与し
ていると思われる各種疾患の治療剤として使用可能なモ
ノクロ−ナル抗体を初めて提供するものである。また更
には、gp130がシグナル伝達に関与していると思わ
れる、例えばある種の癌細胞増殖因子であるオンコスタ
チンMやある種の白血病増殖阻害因子であるLIF等の
生理活性物質の阻害剤としても期待できる。
質を認識するモノクロ−ナル抗体、例えばGPZ 3
5、GPX 7又はGPX 22抗体は、ヒトgp13
0蛋白質を認識し、かつ該蛋白質と結合することでヒト
インタ−ロイキン−6の生理作用を強く阻害する特徴を
有するものであり、IL−6の生理作用を阻害するIL
−6阻害剤の開発が可能となる。このことは、これまで
知られていたgp130蛋白質を認識するAM64抗体
やAM277抗体では困難であり、例えば自己免疫疾患
やミエロ−マ等の、IL−6が引き起こし、又は関与し
ていると思われる各種疾患の治療剤として使用可能なモ
ノクロ−ナル抗体を初めて提供するものである。また更
には、gp130がシグナル伝達に関与していると思わ
れる、例えばある種の癌細胞増殖因子であるオンコスタ
チンMやある種の白血病増殖阻害因子であるLIF等の
生理活性物質の阻害剤としても期待できる。
【0044】本発明のモノクロ−ナル抗体は、gp13
0蛋白質と結合することでIL−6の生理作用を阻害す
るものである。IL−6と結合することによりその生理
活性を阻害する抗体ではIL−6が存在する部位にこれ
を投与か又は局所的にこの抗体が止まるような工夫なし
にはIL−6阻害剤として使用し難いのに対し、本発明
のモノクロ−ナル抗体は標的細胞が存在する部位に局所
的に投与することでIL−6阻害剤として機能し得るも
のである。
0蛋白質と結合することでIL−6の生理作用を阻害す
るものである。IL−6と結合することによりその生理
活性を阻害する抗体ではIL−6が存在する部位にこれ
を投与か又は局所的にこの抗体が止まるような工夫なし
にはIL−6阻害剤として使用し難いのに対し、本発明
のモノクロ−ナル抗体は標的細胞が存在する部位に局所
的に投与することでIL−6阻害剤として機能し得るも
のである。
【0045】また本発明によれば、ハイブリド−マGP
Z 35、GPX 7又はGPX22等を培養し又はマ
ウス等の腹腔に移植することで、前記したモノクロ−ナ
ルGPZ 35、GPX 7又はGPX 22抗体を容
易に製造することが可能である。
Z 35、GPX 7又はGPX22等を培養し又はマ
ウス等の腹腔に移植することで、前記したモノクロ−ナ
ルGPZ 35、GPX 7又はGPX 22抗体を容
易に製造することが可能である。
【図1】図1は、実施例2の結果を示すものである。横
軸は添加した抗体の量(μg /ml)を示し、縦軸は測定
結果(405nmの吸光度)を示している。なお、図中の
破線は、抗体を添加せずに10U/ml又は0U/mlとな
るようにIL−6を添加した場合の結果を示している。
図中、黒丸、黒三角又は白三角は、それぞれGPX 2
2抗体、GPZ 35抗体又はマウスイムノグロブリン
を添加した場合の結果を示している。
軸は添加した抗体の量(μg /ml)を示し、縦軸は測定
結果(405nmの吸光度)を示している。なお、図中の
破線は、抗体を添加せずに10U/ml又は0U/mlとな
るようにIL−6を添加した場合の結果を示している。
図中、黒丸、黒三角又は白三角は、それぞれGPX 2
2抗体、GPZ 35抗体又はマウスイムノグロブリン
を添加した場合の結果を示している。
【図2】図2は、実施例3の結果を示すものである。横
軸は添加した抗体の量(μg /ml)を示し、縦軸は測定
結果(570−630nmの吸光度)を示している。なお
図中の破線は、抗体を添加せずに0.25U/ml又は0
U/mlとなるようにIL−6を添加した場合の結果を示
している。図中、黒丸、黒四角、黒三角又は白三角は、
それぞれGPX 22抗体、GPX 7抗体、GPZ
35抗体又はマウスイムノグロブリンを添加した場合の
結果を示している。
軸は添加した抗体の量(μg /ml)を示し、縦軸は測定
結果(570−630nmの吸光度)を示している。なお
図中の破線は、抗体を添加せずに0.25U/ml又は0
U/mlとなるようにIL−6を添加した場合の結果を示
している。図中、黒丸、黒四角、黒三角又は白三角は、
それぞれGPX 22抗体、GPX 7抗体、GPZ
35抗体又はマウスイムノグロブリンを添加した場合の
結果を示している。
【図3】図3は、実施例4の結果を示すものである。横
軸は添加した抗体の量(μg /ml)を示し、縦軸は測定
結果(405nmの吸光度)を示している。なお、図中の
破線は、抗体を添加しなかった場合の結果及びバックグ
ラウンドを示している。図中、黒丸、黒四角、黒三角又
は白三角は、それぞれGPX 22抗体、GPX 7抗
体、GPZ 35抗体又はマウスイムノグロブリンを添
加した場合の結果を示している。
軸は添加した抗体の量(μg /ml)を示し、縦軸は測定
結果(405nmの吸光度)を示している。なお、図中の
破線は、抗体を添加しなかった場合の結果及びバックグ
ラウンドを示している。図中、黒丸、黒四角、黒三角又
は白三角は、それぞれGPX 22抗体、GPX 7抗
体、GPZ 35抗体又はマウスイムノグロブリンを添
加した場合の結果を示している。
【図4】図4は、実施例5の結果を示すものである。横
軸は添加した抗体の量(μg /ml)を示し、縦軸は測定
結果(570−630nmの吸光度)を示している。なお
図中の破線は、抗体を添加しなかった場合の結果を示し
ている。図中、黒丸、黒四角、黒三角又は白三角は、そ
れぞれGPX 22抗体、GPX 7抗体、GPZ 3
5抗体又はマウスイムノグロブリンを添加した場合の結
果を示している。
軸は添加した抗体の量(μg /ml)を示し、縦軸は測定
結果(570−630nmの吸光度)を示している。なお
図中の破線は、抗体を添加しなかった場合の結果を示し
ている。図中、黒丸、黒四角、黒三角又は白三角は、そ
れぞれGPX 22抗体、GPX 7抗体、GPZ 3
5抗体又はマウスイムノグロブリンを添加した場合の結
果を示している。
【図5】図5は、実施例6の結果を示すものである。横
軸は添加した抗体の量(μg /ml)を示し、縦軸は測定
結果(取り込まれた3 Hチミジンの量、cpm )を示して
いる。なお、図中の破線は、抗体を添加せずに、IL−
6及びIL−6レセプタ−を添加した場合の結果又はI
L−6及びIL−6レセプタ−を添加しなかった場合の
結果を示している。図中、黒丸、黒四角、黒三角又は白
三角は、それぞれGPX 22抗体、GPX 7抗体、
GPZ 35抗体又はマウスイムノグロブリンを添加し
た場合の結果を示している。
軸は添加した抗体の量(μg /ml)を示し、縦軸は測定
結果(取り込まれた3 Hチミジンの量、cpm )を示して
いる。なお、図中の破線は、抗体を添加せずに、IL−
6及びIL−6レセプタ−を添加した場合の結果又はI
L−6及びIL−6レセプタ−を添加しなかった場合の
結果を示している。図中、黒丸、黒四角、黒三角又は白
三角は、それぞれGPX 22抗体、GPX 7抗体、
GPZ 35抗体又はマウスイムノグロブリンを添加し
た場合の結果を示している。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 G01N 33/53 D 8310−2J // C12N 15/06 (C12P 21/08 C12R 1:91) (72)発明者 保川 清 神奈川県相模原市相模大野7−37−17− 401 (72)発明者 鈴木 浩 神奈川県海老名市柏ケ谷967−1−711
Claims (15)
- 【請求項1】インタ−ロイキン−6のシグナル伝達蛋白
質であるgp130蛋白質を特異的に認識し、該蛋白質
と結合することでインタ−ロイキン−6の生理作用を阻
害し得るモノクロ−ナル抗体。 - 【請求項2】gp130蛋白質がヒトのものである請求
項1に記載のモノクロ−ナル抗体。 - 【請求項3】GPZ 35抗体である請求項1のモノク
ロ−ナル抗体。 - 【請求項4】GPX 7抗体である請求項1のモノクロ
−ナル抗体。 - 【請求項5】GPX 22抗体である請求項1のモノク
ロ−ナル抗体。 - 【請求項6】請求項1又は2に記載のモノクロ−ナル抗
体を産生するハイブリド−マ。 - 【請求項7】GPZ 35抗体を産生するハイブリド−
マGPZ 35。 - 【請求項8】GPX 7抗体を産生するハイブリド−マ
GPX 7。 - 【請求項9】GPX 22抗体を産生するハイブリド−
マGPX 22。 - 【請求項10】請求項6に記載のハイブリド−マを培養
することを特徴とする請求項1又は2に記載のモノクロ
−ナル抗体の製造方法。 - 【請求項11】請求項7に記載のハイブリド−マを培養
することを特徴とするGPZ 35抗体の製造方法。 - 【請求項12】請求項8に記載のハイブリド−マを培養
することを特徴とするGPX 7抗体の製造方法。 - 【請求項13】請求項9に記載のハイブリド−マを培養
することを特徴とするGPX 22抗体の製造方法。 - 【請求項14】請求項1又は2に記載のモノクロ−ナル
抗体を有効成分として含むインタ−ロイキン−6の生理
作用阻害剤。 - 【請求項15】請求項3〜5に記載のモノクロ−ナル抗
体の1種以上を有効成分として含むインタ−ロイキン6
の生理作用阻害剤。
Priority Applications (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP4134329A JPH05304986A (ja) | 1992-04-28 | 1992-04-28 | gp130蛋白質に対するモノクロ−ナル抗体 |
EP93303276A EP0572118B1 (en) | 1992-04-28 | 1993-04-27 | Monoclonal antibodies to GP130 protein |
DE69319662T DE69319662T2 (de) | 1992-04-28 | 1993-04-27 | Monoklonale Antikörper gegen GP130-Protein |
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