CN1630514A - 通过调节交感神经紧张性控制骨形成的方法和组合物 - Google Patents

通过调节交感神经紧张性控制骨形成的方法和组合物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及治疗、诊断和预防骨病的方法，包括测定和调节交感神经紧张性和瘦素活性的方法。通过降低或增加瘦素合成、瘦素受体合成、瘦素与瘦素受体的结合以及瘦素受体活性来改变骨病中的交感神经紧张性。还可以将上述方式和传统的交感神经系统激动剂和/或拮抗剂联用来改变骨病中的交感神经紧张性，这些交感神经激动剂和/或拮抗剂包括，但不局限于用来治疗或预防骨质疏松的多巴胺β羟化酶拮抗剂或β肾上腺素能拮抗剂。

Description

通过调节交感神经紧张性控制骨形成的方法和组合物
本发明得到政府支持，国立卫生院基金资助号为DK58883和NASA NCC9-58。政府可以享有本发明的某些权利。本发明要求2001年12月5日提交的美国临时申请No.60/337,054的权益，其整体在此引入作为参考。
1. 引言
本发明涉及治疗、诊断和预防骨病情(conditions)、紊乱或疾病，包括但不局限于骨质疏松的组合物和方法。本发明涉及对多肽类激素瘦素(leptin)受体信号传导通路的调节。更具体地说，本发明涉及对瘦素合成、瘦素受体合成、瘦素与其受体的结合以及瘦素向骨细胞传导信号的调节。本发明还涉及通过交感神经系统通路调节骨质平衡。
本发明还提供了鉴定方法，以及化合物在骨病情、紊乱或疾病中的治疗、预测和诊断中的预防性用途或治疗性用途。另外，提供了诊断性监测正在接受骨病情或紊乱治疗方面临床评价的患者的方法，监测化合物在临床试验中效率的方法，以及鉴定倾向于患有骨病情、紊乱或疾病的受试者的方法。
2. 发明背景
骨重建(remodeling)的生理过程使骨能够通过两个明确的连续细胞过程得以持续性更新(Karsenty，1999，Genes and Development，13：3037-3051)。最初的事件是破骨细胞对预先存在的骨的吸收，而后是成骨细胞对骨的从头形成。骨重建的这两个过程必须在青春期末期和性腺功能停止之间的窄限度内维持骨质的平衡。负责维持恒定骨质的分子机制尚不清楚，但是有些证据表明至少部分通过复杂的内分泌调节来实现这一点。例如，性腺障碍和伴随性的性甾醇缺失刺激骨重建中的骨吸收过程，最终导致骨质稀少(骨质轻)或骨质疏松(骨质轻，并易于骨折)。同样的，最近对血清中蚀骨抑制蛋白的鉴定，及通过系统途径进行的功能分析也说明了分泌的分子影响骨折性的骨吸收(Simonet et al.，1997，Cell，89：309-309)。对骨吸收的系统控制说明待鉴定的其他循环分子能够通过成骨细胞控制骨形成。由于影响骨重建的疾病的发生率和致死率较高，如果这些激素或生长因子存在的话，它们的鉴定将是非常重要的。
一种这样的疾病是骨质疏松(Riggs et al.，1998，J.Bone Miner.Res.，13：763-773)。骨质疏松是影响骨重建的最常见疾病，也是西半球最为普遍的疾病。在生理病理水平上，疾病的标记物是骨表现出较轻的质量，也就是说较小的密度，易于骨折。另外，两种性别中骨质疏松的发生和抑制性腺功能密切相关，在肥胖个体中很少发现。在细胞水平上，骨质疏松的特征是骨重建平衡失调，骨吸收多于骨形成，导致轻骨质，增加骨折的发生。在分子水平上，骨质疏松的病理发生尚不清楚。
有人描述了复杂的合成代谢及分解代谢通过活化和抑制β肾上腺素能受体对骨的影响。曾有人报道了活化β肾上腺素能受体所导致的合成代谢和分解代谢对骨的影响。曾报道了非常矛盾的结果，但这些结果是前后事件依赖性的结果，源于甲状旁腺激素的作用(Kellenberger et al.，1998，Bone 22(5)：471-478)。另外，不但报道了β激动剂的合成代谢效应，还报道了β拮抗剂的合成代谢效应。在卵巢切除大鼠的骨中观察到了β激动剂福莫特罗(formoterol)和沙丁胺醇(salbutamol)的合成代谢效应(Pataki et al.，1996，Bone 19(3)，Supplement 129S-169S)。再则，据报道β3拮抗剂BRL 35135使腰脊中的骨髓脂肪细胞减小，但是不使胫骨中的骨髓脂肪细胞减小(Kurabayashi et al.，2001，Calcif Tissue Int 68：248-254)。说明了工作量减少的情况下，β2激动剂克仑特罗(clenbuterol)对肌肉和对骨质效应之间的直接关系，经推断这是因为克仑特罗使肌肉质量发生变化，进而导致失活所致的骨矿物化作用减弱(Zeman et al.，1991，Am J.Physiol Endocrin Metab 261：E285-E289)。在用非特异性β阻断剂普萘洛尔(propranolol)处理的大鼠中观察到股骨干骺端矿物添附速度增加，说明普萘洛尔可以通过β肾上腺素能机制或膜稳定机制刺激骨代谢，影响成骨细胞(Minkowitz et al.，1991，J.Orthop Res 9：869-875)。因此，尚不清楚β激动剂和/或拮抗剂对骨类型有何作用，不清楚β激动剂和/或拮抗剂的作用是直接的，还是间接的。
下丘脑中瘦素的信号传导能够刺激交感神经对某些组织的活性，特别是对褐色脂肪组织、肾脏、后肢、肾上腺的活性(Haynes et al.，1997，J.Clin.Investigation 100(2)：270-278)。对褐色脂肪组织的交感神经活性的增加的结果是增加生热活性，以及增加UCP1(非偶联的蛋白1)和瘦素自身的基因表达(Commins et al.，1999，Endocrinology140(10)：4772-4778)。还有一些证据表明瘦素可以通过刺激交感神经来调节胰腺分泌功能(Mizuno et al.，1998，Endocrinology 139(9)：3863-3870)。其他的文章表明瘦素表达缺失的哺乳动物交感神经活性降低，出现分泌障碍，在某些情况下，肾上腺素能激动剂能够抑制这些动物的体重增加(Commins et al.，2000，J.Biol.Chem.275(42)：33059-33067；Ozata et al.，1999，J Clin Endocrinol Metab 84(10)：3686-95)。
3. 发明概述
本发明的一个目的是通过调节交感神经系统通路来治疗、诊断和/或预防骨病。本发明的一个方面中，存在治疗或预防骨质疏松的一个或多个症状的方法，该方法包括施用β肾上腺素能(adrenergic)拮抗剂。该方面的一个具体的实施方案包括，但不局限于进一步联合施用瘦素拮抗剂和β肾上腺素能拮抗剂。在另一个实施方案中，存在有治疗或预防骨骼石化症(osteopetrosis)或骨硬化(osteoscelerosis)的一个或多个症状的方法，该方法包括施用β肾上腺素能激动剂。进一步的实施方案包括，但不局限于进一步联合施用瘦素激动剂和β肾上腺素能激动剂。
本发明的另一个目的涉及调节瘦素对骨的作用的方法，该方法包括施用治疗有效量的药物组合物，使之改变交感神经紧张性(tone)。本发明的另一个方面涉及调节骨质的方法，该方法包括施用治疗有效量的药物组合物，使之改变交感神经紧张性，从而调节骨质。药物组合物的具体实施方案包括，但不局限于瘦素拮抗剂、瘦素激动剂、交感神经系统拮抗剂、交感神经系统激动剂，及其组合。
本发明的另一个目的涉及治疗或预防骨病的一个或多个症状的方法，该方法包括施用治疗有效量的药物组合物，通过改变交感神经紧张性调节瘦素在骨中的效应。药物组合物的具体实施方案包括，但不局限于瘦素拮抗剂、瘦素激动剂、交感神经系统拮抗剂、交感神经系统激动剂，及其组合。
本发明的另一个目的是诊断或预测哺乳动物骨病，包括：
(a)测定怀疑具有骨病的哺乳动物体内的交感神经紧张性和瘦素活性；和
(b)将步骤(a)中测得的值和相应的对照值相比较。
本发明的另一个目的涉及药物组合物，该药物组合物包括瘦素拮抗剂、瘦素激动剂、交感神经系统拮抗剂、交感神经系统激动剂的任意组合。这些组合的例子包括，但不局限于瘦素拮抗剂和交感神经系统拮抗剂、瘦素激动剂和交感神经系统激动剂、瘦素拮抗剂和交感神经系统激动剂、瘦素激动剂和交感神经系统拮抗剂。在另一个实施方案中，组合物进一步包括药学上可以接受的载体。
本发明的另一个目的是通过调节瘦素信号传导通路来治疗、诊断和/或预防骨病。可以根据本发明治疗和/或预防的骨病包括和相应的非发病骨相比骨质减轻的骨病，包括但不局限于骨质疏松、骨质稀少(osteopenia)和佩吉特症。可以根据本发明治疗和/或预防的骨病还包括和相应的非发病骨相比骨质增多的骨病，包括但不局限于骨骼石化症、骨硬化、骨软骨病和pynchodisostosis。
因此，根据本发明的一个方面，存在治疗骨病的方法，该方法包括：向需要所述治疗的哺乳动物体内施用治疗有效量的、能够降低血清中瘦素水平的化合物，其中骨病是和相应的非发病骨相比骨质减轻的骨病。一些化合物和方法的具体实施方案包括，但不局限于抑制或降低瘦素合成或增加瘦素降解的那些。这些化合物包括反义序列、核酶或瘦素编码多肽的三联(triple)螺旋序列。
根据本发明的另一个方面，存在治疗骨病的方法，该方法包括：向需要所述治疗的哺乳动物体内施用治疗有效量的、能够降低脑脊液中瘦素水平的化合物，其中骨病是和相应的非发病骨相比骨质减轻的骨病。一些化合物和方法的具体实施方案包括，但不局限于抑制或降低瘦素合成或增加瘦素降解的那些，以及和血液中瘦素相结合的化合物。
本发明方法的具体实施方案包括，例如，治疗骨病的方法，该方法包括向需要所述治疗的哺乳动物体内施用治疗有效量的化合物，其中骨病是和相应的非发病骨相比骨质减轻的骨病，其中的化合物选自能够和血液中瘦素相结合的化合物，这些化合物包括但不局限于特异性结合瘦素的抗体、可溶性瘦素受体多肽、间-α-胰蛋白酶抑制剂重链相关蛋白和α2-巨球蛋白。
根据本发明的另一个方面，存在治疗骨病的方法，该方法包括向需要所述治疗的哺乳动物体内施用治疗有效量的、降低磷酸化Stat3多肽水平的化合物，其中骨病是和相应的非发病骨相比骨质减轻的骨病。一些化合物和方法的具体实施方案包括，但不局限于抑制或降低瘦素合成或增加瘦素降解的那些；和血液中瘦素相结合的化合物；瘦素受体拮抗性化合物，如乙酰苯酚化合物、特异性结合瘦素的抗体、特异性结合瘦素受体的抗体和包括可溶性瘦素受体多肽序列的化合物。
根据本发明的另一个方面，存在治疗或预防骨病的方法，该方法包括向需要所述治疗或预防的哺乳动物体内施用治疗有效量的、抑制多巴胺β羟化酶(“DBH”)活性的化合物，该酶是将多巴胺转化为去甲肾上腺素所必需的。一些化合物和方法的具体实施方案包括，但不局限于抑制DBH酶活性、DBH基因表达的那些、特异性结合DBH的抗体和参与去甲肾上腺素合成途径的化合物。在另一个实施方案中，DBH抑制剂可以和另一个拮抗剂或激动剂(如β肾上腺素能拮抗剂和/或瘦素拮抗剂)同时施用。
根据本发明的另一个方面，存在治疗骨病的方法，该方法包括：向需要所述治疗的哺乳动物体内施用治疗有效量的、能够降低下丘脑中瘦素受体水平的化合物，其中骨病是和相应的非发病骨相比骨质减轻的骨病。一些化合物和方法的具体实施方案包括，但不局限于抑制或降低瘦素受体合成或增加瘦素受体降解的那些。这些化合物包括反义序列、核酶或瘦素受体编码多肽的三联螺旋序列。
根据本发明的另一个方面，存在治疗骨病的方法，该方法包括：向需要所述治疗的哺乳动物体内施用治疗有效量的、能够增加血清和/或脑脊液中瘦素水平的化合物，其中骨病是和相应的非发病骨相比骨质增加的骨病。一些化合物和方法的具体实施方案包括，但不局限于增加或诱导瘦素合成或减少瘦素降解的那些。
根据本发明的另一个方面，存在治疗骨病的方法，该方法包括向需要所述治疗的哺乳动物体内施用治疗有效量的、增加磷酸化Stat3多肽水平的化合物，其中骨病是和相应的非发病骨相比骨质增加的骨病。一些化合物和方法的具体实施方案包括，但不局限于增加或诱导瘦素合成或减少瘦素降解的那些，以及瘦素受体激动性化合物。
根据本发明的另一个方面，存在治疗骨病的方法，该方法包括：向需要所述治疗的哺乳动物体内施用治疗有效量的、能够增加下丘脑中瘦素受体水平的化合物，其中骨病是和相应的非发病骨相比骨质增加的骨病。一些化合物和方法的具体实施方案包括，但不局限于增加或诱导瘦素受体合成或减少瘦素受体降解的那些。
根据本发明的另一个方面，存在预防骨病的方法，该方法包括：向具有发生疾病危险性的哺乳动物体内施用能够降低血清中瘦素水平、浓度足以预防骨病的化合物，其中骨病是和相应的非发病骨相比骨质减轻的骨病。一些化合物和方法的具体实施方案包括，但不局限于抑制或降低瘦素合成或增加瘦素受体的那些。这些化合物包括反义序列、核酶或瘦素编码多肽的三联螺旋序列。
根据本发明的另一个方面，存在预防骨病的方法，该方法包括：向具有发生骨病危险性的哺乳动物体内施用能够降低脑脊液中瘦素水平、浓度足以预防骨病的化合物，其中骨病是和相应的非发病骨相比骨质减轻的骨病。一些化合物和方法的具体实施方案包括，但不局限于抑制或降低瘦素合成或增加瘦素降解的那些，以及与血液中瘦素相结合的化合物。
本发明方法的具体实施方案包括，例如预防骨病的方法，该方法包括：向具有发生骨病危险性的哺乳动物体内施用浓度足以预防骨病的化合物，其中骨病是和相应的非发病骨相比骨质减轻的骨病，其中的化合物选自能够和血液中瘦素相结合的化合物，这些化合物包括但不局限于特异性结合瘦素的抗体、可溶性瘦素受体多肽、间-α-胰蛋白酶抑制剂重链相关蛋白和α2-巨球蛋白。
根据本发明的另一个方面，存在预防骨病的方法，该方法包括：向具有发生骨病危险性的哺乳动物体内施用能够降低磷酸化Stat3水平、浓度足以预防骨病的化合物，其中骨病是和相应的非发病骨相比骨质减轻的骨病。一些化合物和方法的具体实施方案包括，但不局限于抑制或降低瘦素合成或增加瘦素降解的那些；和血液中瘦素相结合的化合物；瘦素受体拮抗性化合物，如乙酰苯酚化合物、特异性结合瘦素的抗体、特异性结合瘦素受体的抗体和包括可溶性瘦素受体多肽序列的化合物。
根据本发明的另一个方面，存在预防骨病的方法，该方法包括：向具有发生骨病危险性的哺乳动物体内施用能够降低下丘脑中瘦素受体水平的化合物，其中骨病是和相应的非发病骨相比骨质减轻的骨病。一些化合物和方法的具体实施方案包括，但不局限于抑制或降低瘦素受体合成或增加瘦素受体降解的那些。这些化合物包括反义序列、核酶或瘦素编码多肽的三联螺旋序列。
根据本发明的另一个方面，存在预防骨病的方法，该方法包括：向具有发生骨病危险性的哺乳动物体内施用能够增加血清和/或脑脊液中瘦素水平、浓度足以预防骨病的化合物，其中骨病是和相应的非发病骨相比骨质增加的骨病。一些化合物和方法的具体实施方案包括，但不局限于增加或诱导瘦素合成或减少瘦素降解的那些。
根据本发明的另一个方面，存在预防骨病的方法，该方法包括：向具有发生骨病危险性的哺乳动物体内施用能够增加磷酸化Stat3水平、浓度足以预防骨病的化合物，其中骨病是和相应的非发病骨相比骨质增加的骨病。一些化合物和方法的具体实施方案包括，但不局限于增加或诱导瘦素合成或减少瘦素降解的那些，以及瘦素受体激动性化合物。
根据本发明的另一个方面，存在预防骨病的方法，该方法包括：向具有发生疾病危险性的哺乳动物体内施用能够增加下丘脑中瘦素受体水平的化合物，其中骨病是和相应的非发病骨相比骨质增加的骨病。一些化合物和方法的具体实施方案包括，但不局限于增加或诱导瘦素受体合成或减少瘦素受体降解的那些。
根据本发明的另一个方面，存在诊断或预测哺乳动物(如人类)骨病的方法，该方法包括：
(a)测定哺乳动物体内，如怀疑为骨病或具有发生骨病危险性的哺乳动物体内血清中的瘦素水平；和
(b)将(a)中测得的水平和对照血清中的瘦素水平相比较，
如果(a)中测得的水平高于对照水平，则预测或诊断哺乳动物表现为骨病或具有发生骨病的危险性，其中骨病是和相应的非发病骨相比骨质减轻的骨病。
根据本发明的另一个方面，存在诊断或预测哺乳动物(如人类)骨病的方法，该方法包括：
(a)测定哺乳动物体内，如怀疑为骨病或具有发生骨病危险性的哺乳动物脑脊液中的瘦素水平；和
(b)将(a)中测得的水平和对照脑脊液中的瘦素水平相比较，
如果(a)中测得的水平高于对照水平，则预测或诊断哺乳动物表现为骨病或具有发生骨病的危险性，其中骨病是和相应的非发病骨相比骨质减轻的骨病。
根据本发明的另一个方面，存在诊断或预测哺乳动物(如人类)骨病的方法，该方法包括：
(a)测定哺乳动物体内，如怀疑为骨病或具有发生骨病危险性的哺乳动物体内血清中的瘦素水平；和
(b)将(a)中测得的水平和对照血清中的瘦素水平相比较，
如果(a)中测得的水平低于对照水平，则预测或诊断哺乳动物表现为骨病或具有发生骨病的危险性，其中骨病是和相应的非发病骨相比骨质增加的骨病。
根据本发明的另一个方面，存在诊断或预测哺乳动物(如人类)骨病的方法，该方法包括：
(a)测定哺乳动物体内，如怀疑为骨病或具有发生骨病危险性的哺乳动物脑脊液中的瘦素水平；和
(b)将(a)中测得的水平和对照脑脊液中的瘦素水平相比较，
如果(a)中测得的水平低于对照水平，则预测或诊断哺乳动物表现为骨病或具有发生骨病的危险性，其中骨病是和相应的非发病骨相比骨质增加的骨病。
根据本发明的另一个方面，存在监测化合物对哺乳动物(如人类)骨病治疗效率的方法，该方法包括：
(a)向哺乳动物施用化合物；
(b)测定哺乳动物血清中的瘦素水平；和
(c)将(b)中测得的水平和施用化合物之前的哺乳动物血清中的瘦素水平相比较，
从而监测化合物的效率，其中骨病是和相应的非发病骨相比骨质减轻的骨病。
根据本发明的另一个方面，存在监测化合物对哺乳动物(如人类)骨病治疗效率的方法，该方法包括：
(a)向哺乳动物施用化合物；
(b)测定哺乳动物脑脊液中的瘦素水平；和
(c)将(b)中测得的水平和施用化合物之前的哺乳动物脑脊液中的瘦素水平相比较，
从而监测化合物的效率，其中骨病是和相应的非发病骨相比骨质减轻的骨病。
根据本发明的另一个方面，存在监测化合物对哺乳动物(如人类)骨病治疗效率的方法，该方法包括：
(a)向哺乳动物施用化合物；
(b)测定哺乳动物血清中的瘦素水平；和
(c)将(b)中测得的水平和施用化合物之前的哺乳动物血清中的瘦素水平相比较，
从而监测化合物的效率，其中骨病是和相应的非发病骨相比骨质增加的骨病。
根据本发明的另一个方面，存在监测化合物对哺乳动物(如人类)骨病治疗效率的方法，该方法包括：
(a)向哺乳动物施用化合物；
(b)测定哺乳动物脑脊液中的瘦素水平；和
(c)将(b)中测得的水平和施用化合物之前的哺乳动物脑脊液中的瘦素水平相比较，
从而监测化合物的效率，其中骨病是和相应的非发病骨相比骨质增加的骨病。
根据本发明的另一个方面，存在鉴定能够调节(增加或降低)哺乳动物骨质的化合物的方法，该方法包括：
(a)将受试化合物和多肽相接触；
(b)测定受试化合物是否和多肽相结合，如果受试化合物与多肽相结合，则鉴定到能够调节骨质的化合物，其中多肽选自瘦素多肽、瘦素受体多肽和肾上腺素能受体多肽。
根据本发明的另一个方面，存在鉴定能够调节(增加或降低)哺乳动物骨质的化合物的方法，该方法包括：
(a)使受试化合物和多肽相接触；
(b)鉴定能够和多肽相结合的受试化合物；和
(c)将(b)中的受试化合物施用到非人类的哺乳动物体内，测定和未处理的对照非人类哺乳动物体内的相应骨相比，受试化合物是否能够调节骨质。
其中多肽选自瘦素多肽、瘦素受体多肽和肾上腺素能受体多肽，如果化合物调节了骨质，则鉴定到能够调节哺乳动物体内骨质的化合物。
根据本发明的另一个方面，存在鉴定具有调节(增加或降低)哺乳动物骨质能力的化合物的方法，该方法包括：
(a)使受试化合物和瘦素多肽及瘦素受体多肽接触一段时间，使能够形成瘦素/瘦素受体复合物或儿茶酚胺/肾上腺素能受体复合物；和
(b)测定瘦素/瘦素受体或儿茶酚胺/肾上腺素能受体复合物水平，如果测得的水平和不存在受试化合物时测得的水平不同，则鉴定到能够调节骨质的化合物。
根据本发明的另一个方面，存在鉴定能够降低哺乳动物骨质的化合物的方法，该方法包括：
(a)使受试化合物和表达功能性瘦素受体或功能性肾上腺素能受体的细胞相接触，和
(b)测定受试化合物是否活化瘦素受体或肾上腺素能受体，
如果化合物活化了瘦素受体或肾上腺素能受体，则鉴定到能够降低哺乳动物骨质的化合物。
根据本发明的另一个方面，存在鉴定能够减低哺乳动物骨质的化合物的方法，该方法包括：
(a)使受试化合物和表达功能性瘦素受体或功能性肾上腺素能受体的细胞相接触，测定受试化合物是否活化瘦素受体或肾上腺素能受体；
(b)将(a)中测定的活化瘦素受体或肾上腺素能受体的受试化合物施用到非人类的哺乳动物体内，测定与相应的对照非人类动物相比，受试化合物是否降低动物的骨质，如果受试化合物降低了骨质，则鉴定到能够降低哺乳动物骨质的化合物。
根据本发明的另一个方面，存在鉴定能够增加哺乳动物骨质的化合物的方法，该方法包括：
(a)使瘦素多肽及受试化合物和表达功能性瘦素受体的细胞相接触；和
(b)和不存在受试化合物情况下测定的瘦素受体活化水平相比，测定受试化合物是否减弱瘦素受体的活化；其中能够减弱瘦素受体活化的受试化合物是能够增加哺乳动物骨质的化合物。
根据本发明的另一个方面，存在鉴定能够增加哺乳动物骨质的化合物的方法，该方法包括：
(a)使儿茶酚胺及受试化合物和表达功能性肾上腺素能受体的细胞相接触；和
(b)和不存在受试化合物情况下测定的肾上腺素能受体活化水平相比，测定受试化合物是否减弱肾上腺素能受体的活化；其中能够减弱肾上腺素能受体活化的受试化合物是能够增加哺乳动物骨质的化合物。
根据本发明的另一个方面，存在鉴定能够增加哺乳动物骨质的化合物的方法，该方法包括：
(a)使瘦素多肽及受试化合物和表达功能性瘦素受体的细胞相接触，测定受试化合物能否减弱瘦素受体的活化；和
(b)将(a)中测定的减弱瘦素受体活化的受试化合物施用到非人类的动物体内，和对照非人类动物体内的相应骨相比，测定受试化合物是否增加骨质；如果受试化合物增加了骨质，则鉴定到能够增加哺乳动物骨质的化合物。
根据本发明的另一个方面，存在鉴定能够增加哺乳动物骨质的化合物的方法，该方法包括：
(a)使儿茶酚胺及受试化合物和表达功能性肾上腺素能受体的细胞相接触，测定受试化合物能否减弱肾上腺素能受体的活化；和
(b)将(a)中测定的减弱瘦素受体活化的受试化合物施用到非人类的动物体内，和对照非人类动物体内的相应骨相比，评价受试化合物是否增加骨质；如果受试化合物增加了骨质，则鉴定到能够增加哺乳动物骨质的化合物。
本发明还提供了能够用于治疗和/或预防骨病的药物组合物。
通过阅读下面的说明书，参考作为说明书一部分的附图，或者本发明中优选实施方案的任意实施例，其他和进一步的目的、特征和优势将是显而易见的。
3.1 术语
这里所用的下列术语指的是：
这里所用的瘦素(“Ob”)指的是ob基因(优选人ob基因)的内源性多肽产物，其已知活性是通过下丘脑介导的。
这里所用的瘦素受体(“ObR”)指的是瘦素激素与之结合产生信号的受体；优选的是，该术语指人瘦素受体。
这里所用的儿茶酚胺指的是儿茶酚(1，2-二羟基苯)的内源性含胺衍生物，优选去甲肾上腺素和肾上腺素。
这里所用的肾上腺素能受体(“AR”)指的是儿茶酚胺与之结合产生信号的受体；优选的是，该术语指人肾上腺素能受体。
这里所用的NPY指的是神经肽Y，优选人神经肽Y。神经肽Y(NPY)是胰多肽家族的成员之一。可以理解的是，这里所用的术语NPY不仅包括神经肽Y，还包括胰多肽家族中的肽衍生物，如肽YY(PYY)和胰多肽(PP)。
这里所用的神经肽Y受体(“NPY”受体或“NPY-R”)指的是在生理条件下与内源性NPY结合的受体，优选在生理条件下与内源性NPY结合的人受体。NPY受体是G蛋白偶联的受体，包括但不局限于Y1、Y2、Y3、Y4或Y5(或PP)亚型。
这里所用的睫状神经营养因子(“CNTF”)指的是CNTF基因，优选人CNTF基因的内源性多肽产物，其已知活性通过中枢神经系统和外周(包括自主)神经系统介导。
这里所用的CNTF受体指的是CNTF与之结合产生信号的受体；优选的是，该术语指人CNTF受体。在一个具体的实施方案中，CNTF受体包括gp130、LIFR、CNTFRα和传导CNTF信号所需的其他分子所形成的多聚复合物。在一个可替换的实施方案中，CNTF受体包括gp130、LIFR、CNTFRα类似物所形成的多聚复合物。本领域的熟练技术人员都知道这种类似物能够产生CNTF受体功能。在这种实施方案中，CNTF受体具体包括gp130、LIFR、sCNTFRα所形成的多聚复合物。
这里所用的CNTF受体多肽指的是CNTF受体的多肽组分。在本发明的具体实施方案中，CNTF受体多肽包括gp130、LIFR、CNTFRα和传导CNTF信号所需的其他任意分子，及其功能类似物。这种类似物包括sCNTFRα，本领域的熟练技术人员都知道这种类似物参与CNTF信号传导。
这里所用的CNTF受体多聚核苷酸指的是编码CNTF受体多肽组分的多聚核苷酸。在具体的实施方案中，CNTF受体多聚核苷酸包括编码gp130的多聚核苷酸、编码LIFR的多聚核苷酸、编码CNTFRα的多聚核苷酸和编码CNTF受体其他组分的多聚核苷酸。
这里所用的CNTF基因指的是编码CNTF受体多肽组分的基因，例如编码gp130、LIFR、CNTFRα或CNTF受体其他组分的基因。
这里所用的可溶性CNTFRα(“sCNTFRα”)是在细胞外微环境中可溶的、包含CNTFRα多肽组分的分子。可溶性CNTFRα典型地缺少CNTFRα的GPI膜锚定区。
这里所用的骨病指的是导致或特征是丧失健康或骨完整性的骨病或状态，包括但不局限于骨质疏松、骨质稀少、异常骨形成或骨吸收、佩吉特症、骨折和断骨、骨转移、骨骼石化症、骨硬化和骨软骨病。更具体的是，可以根据本发明治疗和/或预防的骨病包括和相应的非发病骨相比骨质减少的骨病(如骨质疏松、骨质稀少和佩吉特病)以及和相应的非发病骨相比骨质增加的骨病(如骨骼石化症、骨硬化和骨软骨病)。骨病的预防包括在疾病发生之前如这里所述进行积极介入，以防止疾病。骨病的治疗包括在疾病发生之后进行积极介入，以使疾病或病情减缓、改善其症状或逆转。更具体的是，这里所用的治疗指调节骨质，使之和非发病状态下的相应非发病骨(同一类型的相应骨，如长骨、脊椎骨等)更为近似的方法。
这里所用的瘦素受体拮抗剂指中和或妨碍或减弱瘦素受体作用或效应的因子。这种拮抗剂包括与瘦素结合或与瘦素受体结合的化合物。这种拮抗剂还包括中和或妨碍或减少瘦素受体信号输出的化合物，瘦素受体信号输出是瘦素与瘦素受体结合后瘦素信号传导通路中的细胞内步骤，即影响瘦素/瘦素受体信号传导、不发生在受体/配体相互作用水平上的下游事件。瘦素受体拮抗剂包括，但不局限于蛋白质、抗体、小的有机分子或碳水化合物，例如乙酰苯酚化合物、特异性结合瘦素的抗体、特异性结合瘦素受体的抗体和包含可溶性瘦素受体多肽序列的化合物。
这里所用的瘦素受体激动剂指活化、诱导或增强瘦素受体作用或效应的因子。这种激动剂包括与瘦素结合或与瘦素受体结合的化合物。这种激动剂还包括活化、诱导或增加瘦素受体信号输出的化合物，瘦素受体信号输出是瘦素与瘦素受体结合后瘦素信号传导通路中的细胞内步骤，即影响瘦素/瘦素受体信号传导、不发生在受体/配体相互作用水平上的下游事件。瘦素受体激动剂包括，但不局限于蛋白质、抗体、小的有机分子或碳水化合物，例如瘦素、瘦素类似物、特异性结合并活化瘦素的抗体。
如果所施用的量使接受者哺乳动物发生所需的生理变化，如增加或降低疾病状态下相应骨骨质；也就是说，能够治疗，即将骨质调节至和非疾病状态下相应非发病骨(同一类型的相应骨，如长骨、脊椎骨等)较为类似的程度，则可以说施用了“治疗有效量”的试剂。
这里所用的ECD指细胞外结构域。
这里所用的TM指跨膜结构域。
这里所用的CD指胞质结构域。
4. 附图简述
图1A-1F.ob/ob和db/db小鼠体内的高骨质表型。在图1A中示出了6月龄野生型(wt)和ob/ob小鼠体内椎骨(vert.)和长骨(femurs)的X-射线分析。图1B所示为3月龄(3m.)和6月龄(6m.)wt和ob/ob小鼠骨的组织学分析。上面的两组为椎骨的分析结果，下面的两组为长骨的分析结果。Von Kossa试剂将矿物化的骨基质染成横色。图1C所示为对ob/ob小鼠骨体积增加的定量分析。BV/TV为骨体积相对于小梁体积的比值。灰色柱表示wt小鼠；黑色柱表示ob/ob小鼠。图1D所示为野生型(wt)、ob/ob和野生型卵巢切除(wt-OVX)小鼠长骨的三点弯曲分析。图1E所示为6月龄wt和db/db小鼠椎骨的组织学分析。图1F所示为对db/db小鼠骨体积增加的定量分析。星号表示两组小鼠之间有统计学上的显著差异(p＜0.05)。误差柱表示中间值的标准误(SEM)。
图2A-2D.ob/ob小鼠的高骨质表型缘于瘦素缺陷，而非缘于肥胖。图2A所示为低脂饮食的1月龄wt(wt 1 mo)和ob/ob小鼠椎骨的组织学分析。图2B所示为3月龄wt和ob/+小鼠椎骨的组织学分析。图2C所示为6月龄wt和Agouti yellow突变小鼠(Ay/a)椎骨的组织学分析。图2D所示为正常饮食或高脂(HF)饮食的6月龄wt椎骨的组织学分析。星号表示实验组和对照组小鼠之间有统计学上的显著差异(p＜0.05)。
图3A-3H.瘦素信号的缺失导致成骨细胞功能增加。在图3A中，说明了3月龄wt(wt)和ob/ob小鼠的钙黄绿素双标记。两种标记(白色箭头)之间的距离表示骨形成速度。在图3B-3F中，和同窝的wt小鼠相比，ob/ob小鼠(B)和db/db小鼠(D)中骨形成速度分别增加了45％和70％。这种增加发生在存在有正常数目的成骨细胞的情况下(图3C和3E)。中空柱，wt小鼠；黑色柱，ob/ob小鼠；灰色柱，db/db小鼠；3m.，3月龄动物；6m.，6月龄动物。在图3G中，限制脂肪的1月龄ob/ob小鼠和不表现肥胖的杂合ob/+小鼠中骨形成的速度增加。在图3H，高脂肪饮食的wt小鼠或超重、但没有瘦素缺陷的Ay/a小鼠(参见FIGS.2C和D)具有正常的骨形成速度。星号表示实验组和对照组小鼠之间有统计学上的显著差异(p＜0.05)。误差柱表示为SEM。
图4A-4E.不存在瘦素信号传导条件下的正常成骨细胞功能。示出了对野生型(wt)和性腺功能减退症得到或未得到(P，安慰剂)17β-雌二醇(E2)治疗纠正的ob/ob小鼠。图4A说明17β-雌二醇纠正了ob/ob小鼠的子宫萎缩。图4B至4D为椎骨的组织学分析，说明17β-雌二醇处理导致17β-雌二醇处理的wt，甚至17β-雌二醇处理的ob/ob小鼠中骨小梁的显著增加。灰色柱，野生型小鼠；黑色柱，ob/ob小鼠；patterned柱，处理小鼠；实心柱，安慰剂对照小鼠。星号表示实验组和未处理小鼠之间有统计学上的显著差异(p＜0.05)。误差柱表示为SEM。在图4E中，示出ob/ob和db/db离体成骨细胞的正常分化和功能。来源于wt、ob/ob和db/db小鼠的骨髓原祖同样程度地分化成TRAP阳性(TRAP+)的成骨细胞(上面一组和下面的线)。它们在牙质切片基质上形成吸收窝的能力也没有差异(下面一组)。
图5A-5F.瘦素在成骨细胞中不进行信号传导。图5A中所示为对组织和原代细胞(非矿物化(NM)的成骨细胞、矿物化(M)的成骨细胞和软骨细胞)(上面一组)中瘦素表达的Northern印迹分析。GAPDH表达用作上样的内部对照(下面一组)。图5B表明通过PCR在长骨、Calabria和原代成骨细胞中检测不到Ob-Rb(Ob-受体，b型)转录物，但在下丘脑中能够检测到其信使。扩增Hprt用作cDNA质量的内部对照。图5C是Western印迹分析。抑瘤素-M(OSM)的诱导用作阳性对照。图5D中是使用瘦素或抑瘤素-M处理原代成骨细胞培养物，对即早基因表达(Tisll和c-fos基因)的Northern印迹分析。GAPDH表达用作上样的内部对照(下面一组)。图5E中示出了来源于野生型小鼠、不存在(赋形剂)或存在瘦素的条件下培养的离体原代成骨细胞培养物。观察到对胶原合成(上面一组，van Gieson染色)或基质矿物化(下面一组，von Kossa染色)没有作用。图5F中示出了离体培养实验中db/db成骨细胞的正常功能。说明了来源于wt和db/db小鼠的原代成骨细胞培养物之间的胶原合成(上面一组，van Gieson染色)和基质矿物化(下面一组，von Kossa染色)。
图6A-6C.脂肪组织对于高骨质表型的呈现来说并非必需的。在图6A中，示出了6月龄wt和不具有脂肪组织的A-ZIP/F-1转基因小鼠椎骨的组织学分析。说明了转基因小鼠中的骨体积(B)和骨形成速度。星号表示wt和转基因小鼠之间有统计学上的显著差异(p＜0.05)。误差柱表示为SEM。
图7A-7D.瘦素对骨形成的作用是通过下丘脑中继站介导的。在图7A中，对中枢灌输(第三脑室)PBS或瘦素的4月龄ob/ob小鼠和wt小鼠进行组织学比较。说明了骨体积(B)、骨小梁体积(C)和骨形成速度(D)。星号表示PBS灌输和瘦素灌输的小鼠之间有统计学上的显著差异(p＜0.05)。误差柱表示为SEM。
图8.DBH敲除小鼠具有高的骨体积。图8所示为wt和DBH-/-小鼠椎骨的组织学分析。星号表示实验组和对照组小鼠之间有统计学上的显著差异(p＜0.05)。
图9A-9F.瘦素在下丘脑中的抑制食欲功能和抗骨形成作用。(图9A-9C)MSG损伤。(A)对下丘脑结构的作用，Cresyl紫染色(上面一组)；NPY(中间一组)和SF1(下面一组)的免疫组化。分别用黑色和红色点状线圈出了弓形核(ARC)和VMH。MSG处理显著影响ARC结构和NPY表达(箭头)，而VMH结构和表达SF1的神经元完好。(B)MSG损伤小鼠椎骨的组织学分析；骨体积(％骨体积/组织体积)未受影响。(C)瘦素ICV灌输不影响MSG损伤的ob/ob小鼠(MSG+瘦素)的体重(左侧)，但是减小其骨体积(右侧)。(图9D-9F)GTG损伤。(D)对下丘脑结构的作用，Cresyl紫染色(上面一组)；NPY(中间一组)和SF1(下面一组)的免疫组化。GTG处理显著影响VMH，产生粘稠的疤痕，显著改变表达SF1的神经元的分布，而ARC结构和NPY表达(箭头)不受影响。(E)GTG损伤小鼠椎骨的组织学分析；骨体积和骨形成速度(BFR/BS)都得以增加。(F)瘦素ICV灌输减轻GTG损伤的动物(GTG+瘦素)的体重(左侧)，但是不影响其骨体积(右侧)。星号表示实验组和对照组之间有统计学上的显著差异(p＜0.05)。
图10A-10D.抑制食欲的神经肽不控制骨形成。(A)ICV灌输PBS或瘦素的4月龄agouti yellow突变小鼠(Ay/a)椎骨的组织学分析。ICV瘦素灌输导致骨体积(骨体积％)和骨形成速度减小(BFR/BS，白色箭头)。(B)3月龄Mc4-R缺陷小鼠(MC4-R-/-)椎骨的组织学分析；骨体积是正常的。(C-D)ICV灌输PBS或MTII的ob/ob小鼠椎骨的组织学分析；骨体积未受影响(C)，而体重减轻(D)。星号表示实验组和对照组之间有统计学上的显著差异(p＜0.05)。误差柱表示SEM。
图11A-11E.对瘦素抑制食欲功能的外周调节。(A)左侧所示为灌输PBS或瘦素的联体ob/ob小鼠的组织学分析。瘦素ICV灌输减小同侧小鼠(瘦素)的骨体积(骨体积％)，但是不减小异侧小鼠(瘦素配偶物)的骨体积。PBS对之没有影响(PBS和PBS配偶物)。(B)产生成骨细胞特异的瘦素(αl(I)-瘦素)转基因小鼠。上面一组，构建体示意图。小鼠瘦素cDNA位于2.3kb成骨细胞特异的αl(I)胶原启动子片段的控制之下。下面左侧组，骨中转基因表达的Northern印迹分析。下面右侧组，αl(I)瘦素小鼠，而非wt小鼠骨中检测到了瘦素免疫反应性。(C)共转染αl瘦素转基因和Stat3依赖的启动子-luc构建体、表达ObRb的293细胞中αl瘦素转基因的生物活性分析。(E)12月龄αl(I)瘦素转基因小鼠椎骨的组织学分析。成骨细胞中瘦素的表达不影响骨体积。星号表示实验组和对照组之间有统计学上的显著差异(p＜0.05)。误差柱表示SEM。
图12A-12G.骨形成的交感神经控制。(A)12月龄Dbh缺陷小鼠(Dbh-/-)椎骨的组织学分析。Dbh-/-小鼠中骨体积(骨体积％)显著增加。(B)Dbh-/-小鼠中钙黄绿素双标记、骨形成速度(BFR/BS，白色箭头)和成骨细胞数目(N.Ob/B.Pm)增加。(C，D)Dbh-/-小鼠中正常的破骨细胞数目(N.Oc/B.Pm)和脱氧吡啶啉(deoxypyridinoline)交联消除。(E)肾上腺髓质切除小鼠(ADX)椎骨的组织学分析；骨体积未受影响。(F，G)Dbh-/-小鼠中瘦素ICV灌输。脂肪垫重量减轻，而骨体积未受处理的影响(E)。星号表示实验组和对照组之间有统计学上的显著差异(p＜0.05)。误差柱表示SEM。
图13A-13F.成骨细胞上肾上腺素能受体功能的存在。(A)α-和β-肾上腺素能受体表达的RT-PCR(上面一组)和Northern印迹分析(下面一组)。在成骨细胞中仅能检测到β2-肾上腺素能受体表达。样品来源于原代成骨细胞(ob)、心脏(C1、C2、C4和C6)、褐色脂肪组织(C3)和肝脏(C5)。Hprt扩增和Gapdh表达用作上样和RNA完整性的对照。(B)在wt小鼠和成骨细胞中超表达转基因小鼠骨中β2-肾上腺素能受体的免疫定位(插入物)。单核细胞表达β2-肾上腺素能受体，那些细胞是X-gal阳性细胞的，即成骨细胞。(C，D)成骨细胞附近神经微丝(C)和酪氨酸羟化酶(D，箭头)的免疫定位。(E)2日龄小鼠骨切片的电子显微照片。有一根神经位于成骨细胞(ob)和骨小梁(t)的附近。(F)在鼠原代成骨细胞(左侧)和人SaOS-2成骨细胞(右侧)中，β-肾上腺素能激动剂(异丙肾上腺素，iso；新肾上腺素，NE)能够诱导cAMP生成，β-肾上腺素能拮抗剂(普萘洛尔)能够抑制cAMP生成。PTH用作阳性对照。
图14A-14I.β-肾上腺素能激动剂抑制骨形成。异丙肾上腺素(iso)处理ob/ob小鼠和wt(D-H)小鼠(A，D)。椎骨和胫骨的组织学分析(A)。Iso处理增加了骨体积(骨体积％)。(B，E)Iso处理降低了钙黄绿素双标记、骨形成速度(BFR/BS，白色箭头)和成骨细胞数目(N.Ob/B.Pm)。(C，F)体重分析。这些剂量的Iso不影响体重。(G)Northern印迹分析。Iso增加褐色脂肪组织中UCP-1的表达(上面一组)。(H)成骨细胞增殖.Iso、地塞米松(Dex)或赋形剂(Cont.)处理的小鼠小梁中BrdU掺入的免疫定位。右侧所示为BrdU阳性细胞相对于对照的百分比。(I)Iso、Iso和普萘洛尔(Iso+Pro)或赋形剂(Cont.)处理的原代成骨细胞中Cbfal和αl(I)胶原表达的Northern印迹分析。Gapdh表达用作所有Northern印迹分析的内部对照。星号表示实验组和对照组之间有统计学上的显著差异(p＜0.05)。误差柱表示SEM。
图15A-15G.β-肾上腺素能激动剂增加骨形成。wt普萘洛尔(Pro)处理(A，C)、接受ICV灌输的wt小鼠(D，E)、卵巢切除(OVX)和假手术(假OVX)小鼠(F，G)。椎骨(A、B、E-G)和胫骨(A)的组织学分析。Pro处理增加了骨体积(骨体积％)。普萘洛尔处理的小鼠(B和G)体内钙黄绿素双标记、骨形成速度(BFR/BS，白色箭头)和成骨细胞数目(N.Ob/B.Pm)增加。体重(C)未受影响。瘦素ICV灌输降低Pro处理的wt小鼠(D和E)脂肪垫重量，但是不降低骨质。Pro处理通过增加OVX小鼠骨形成参数来防止骨质丧失(F和G)。星号表示实验组和对照组之间有统计学上的显著差异(p＜0.01)。菱形表示OVX和假手术之间有统计学上的显著差异(p＜0.01)。误差柱表示SEM。
图和图形没有必要刻度(scale)，提到的某些特征可以按比例加以扩大或简明扼要以示意图形式表示。
5. 发明详述
这里详细地说明了本发明的各个方面。
5.1. 瘦素、瘦素受体和肾上腺素能受体 蛋白质、多肽和核酸
瘦素(“Ob”)、瘦素受体(“ObR”)和肾上腺素能受体(“AR”)蛋白质和核酸(正义和反义)可以用作本发明中治疗、诊断、预测和筛选方法的一部分。例如，可以使用Ob、ObR和/或AR蛋白质、多肽和肽片段；突变、截短或缺失形式的Ob、ObR和AR，包括但不局限于可溶性的衍生物，如和一个或多个瘦素受体ECD相对应的肽或多肽；缺失一个或多个ECD或TM的截短的瘦素受体多肽；缺失一个或多个ECD或TM的截短的肾上腺素能受体多肽；瘦素受体和肾上腺素能受体融合蛋白产物(如瘦素受体-Ig融合蛋白，也就是瘦素受体或瘦素受体的一个结构域和IgFc结构域形成的融合蛋白)。
瘦素和瘦素受体，包括人瘦素和瘦素受体的序列是人们所熟知的。至于瘦素受体蛋白的综述，参见Friedman and Halaas，1998，Nature，395：763-770和美国专利No.5,972,621。至于瘦素序列，包括人瘦素编码序列和瘦素基因调控序列，参见Zhang et al.，1994，Nature372：425-432；de la Brousse et al.，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA93：4096-4101；He et al.，1995，J.Biol.Chem.270：28887-28891；Hwanget al.，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：873-877和Gong et al.，1996，J.Biol Chem 271：3971-3974。
肾上腺素能受体，包括人肾上腺素能受体的序列是人们所熟知的(参见美国专利No 6,274,706、5,994,506、5,817,477和5,595,880)。
例如，和Ob、或ObR或AR的一个或多个结构域(如ECD、TM或CD)、截短或缺失的Ob、ObR或AR(如缺失TM或CD结构域的ObR)相对应的肽和多肽，以及全长Ob、ObR或AR，Ob、ObR或AR肽或截短的Ob、ObR或AR(如ObR ECD、TM或CD结构域)和异源非相关蛋白质相融合的融合蛋白都在本发明的范围之内，根据本领域的技术人员已知的Ob、ObR或AR核苷酸序列和Ob、ObR或AR氨基酸序列使用和设计。优选的是，瘦素多肽能够在生理和/或细胞培养条件下与瘦素受体相结合。同样，优选的瘦素受体多肽能够在生理和/或细胞培养条件下与瘦素相结合。类似的，优选的肾上腺素能受体多肽能够在生理和/或细胞培养条件下与儿茶酚胺相结合。因此，最低限度是瘦素受体多肽包含能够和瘦素结合，也就是形成瘦素/瘦素受体复合物的瘦素受体氨基酸序列。类似的，最低限度是瘦素受体多肽包含能够和瘦素结合，的瘦素受体ECD序列。类似的，最低限度是肾上腺素能受体多肽包含能够和肾上腺素结合，也就是形成肾上腺素/肾上腺素能受体复合物的肾上腺素能受体氨基酸序列。同样，最低限度是肾上腺素能受体多肽包含能够和肾上腺素结合的肾上腺素能受体氨基酸序列。
考虑到包含全部或部分ObR或AR ECD的ObR和AR肽、多肽、融合肽和融合多肽，这种肽包括可溶性瘦素受体或肾上腺素能受体多肽。优选的是，这种可溶性瘦素受体或肾上腺素能受体多肽可以在标准生理和/或细胞培养条件下分别和瘦素或儿茶酚胺相结合。因此，最低限度是这种可溶性瘦素受体或肾上腺素能受体多肽包含能够分别和瘦素或儿茶酚胺结合的ObR或AR ECD序列。
融合多肽包括，但不局限于能够用于本发明的筛选和/或诊断方法的、能够稳定可溶性ObR或AR蛋白或肽、延长体内半衰期的IgFc融合体；或者和能够使融合蛋白锚定在细胞膜上、使ECD表现在细胞表面的任意氨基酸序列相融合的融合体；或者和能够提供标记或报道功能的酶、荧光蛋白或发光蛋白相融合的融合体。
Ob、ObR或AR多肽和肽可以化学合成(参见Creighton，1983，蛋白质：结构和分子原理，W.H.Freeman & Co.，N.Y.)，可以采用本领域人员所熟知的、表达包含Ob、ObR和AR基因序列和/或编码序列的技术，通过重组DNA技术产生来源于Ob、ObR和AR的大多肽和全长Ob、ObR和AR。Ob、ObR和AR编码多肽不仅指编码开放阅读框的序列，还指Ob、ObR和AR基因的上游序列和下游序列。这种方法还可用于构件包含Ob、ObR和AR核苷酸序列的表达载体。这些方法包括，例如体外重组DNA技术、合成技术和体内基因重组(参见Sambrook et al.，1989，分子克隆：实验指南，第二版，冷泉港出版社，N.Y.和Ausabel et al.，1989，最新分子生物学方案，GreenPublishing Associates and Wiley Interscience，N.Y.，其整体在此引入作为参考)。可替换的方案是，能够编码Ob、ObR和AR核苷酸序列的RNA可以使用合成仪进行化学合成(参见“寡聚核苷酸合成”中所述技术，1984，Gait，M.J.ed.，IRL Press，Oxford，其整体在此引如作为参考。
可以使用各种宿主表达载体系统来表达本发明的Ob、ObR和AR核苷酸序列。Ob、ObR和AR肽或多肽是可溶性衍生物(和ECD相对应的ObR和/或AR肽；删除了TM和/或CD的截短或缺失ObR)的情况下，可以从培养物中回收肽或多肽，ObR或AR肽或多肽为非分泌型的情况下从宿主细胞中回收，ObR或AR肽或多肽为分泌型时从培养物的培养基中回收。但是，表达系统还包括表达Ob、ObR和AR或表达原位，即锚定在细胞膜上的功能等同物的改造宿主细胞。使用适当的变性剂和脂质微团和本领域的熟练技术人员所熟知的方法从这些表达系统中纯化或富集Ob、ObR和AR。但是，不但要保留Ob、ObR和AR的结构和功能特征，还要在药物筛选分析中评价生物活性的情况下，可以使用这些改造宿主细胞。
用于本发明目的的表达系统包括，但不局限于微生物，如转化包含Ob、ObR和AR核苷酸序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体的细菌(E.coli、B.subtilis)；转化包含核苷酸序列的重组酵母表达载体的酵母(如酿酒胶木、毕赤酵母)；感染包含核苷酸序列的重组病毒表达载体(如杆状病毒)的昆虫细胞系统；感染包含核苷酸序列的重组病毒表达载体(如花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)或转化包含核苷酸序列的重组质粒载体(如Ti质粒)的植物细胞系统；或者带有重组表达构建体的哺乳动物细胞系统，其中的重组表达构建体包含来源于哺乳动物细胞基因组(金属硫蛋白启动子)或哺乳动物病毒(如腺病毒晚期启动子；痘病毒7.5K启动子)的启动子。
在细菌系统中，最好根据要表达的Ob、ObR或AR基因产物来选择表达载体数目。例如，但要产生大量这种蛋白质，来产生Ob、ObR或AR蛋白的组合物或者产生Ob、ObR或AR蛋白的抗体时，需要已经纯化的、指导高水平融合蛋白产物表达的载体。这些载体包括但不局限于E.coli表达载体Pur278(Ruther et al.，1983，EMBO J.2：1791)，其中Ob或ObR编码序列可以单独连接到载体中，并和lacZ编码区框架一致，从而产生融合蛋白；pIN载体(Inouye & Inouye，1985，Nucleic Acids Res.13：3101-3109；Van Heeke & Schuster，1989，J.Biol.Chem.264：5503-5509)等。pGEX载体也可用于表达和谷胱甘肽S-转移酶(GST)相融合的融合蛋白形式的异源多肽。通常来说，这种融合蛋白是可溶性的，通过将之吸附到谷胱甘肽琼脂糖磁珠上，并在谷胱甘肽存在的条件下洗脱，易于从裂解的细胞进行纯化。pGEX载体可以包括凝血酶或Xa因子蛋白酶切割位点，使克隆的靶基因产物从GST基团得以释放。
在昆虫系统中，苜银蚊夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)用作表达异源基因的载体。病毒在秋粘虫卵巢细胞中生长。Ob、ObR或AR基因编码序列可以单独克隆到病毒的非必需区(例如多角体蛋白基因)，并置于AcNPV启动子(例如多角体蛋白启动子)的控制之下。成功的Ob、ObR或AR基因编码序列的插入回导致多角体蛋白基因失活，产生非包含的重组病毒(即缺少多角体蛋白基因所编码的蛋白衣壳的病毒)。使用这些重组病毒感染秋粘虫卵巢细胞，使该细胞中表达插入的基因(参见Smith et al.，1983，J.Virol.46：584和美国专利No.4,215,051)。
在哺乳动物宿主细胞中，可以使用许多基于病毒的表达系统。在使用腺病毒作为表达载体的情况下，目的Ob、ObR或AR核苷酸序列和腺病毒转录/翻译控制复合体，如晚期启动子和三联前导序列相连接。然后，通过体外或体内重组将该嵌合基因插入到腺病毒基因组中。往病毒非必需区(如E1或E3区)的插入将导致存活的重组病毒，能够在受感染的宿主中表达Ob、ObR或AR基因产物(参见Logan& Shenk，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：3655-3659)。对于插入的Ob、ObR或AR核苷酸序列的有效翻译来说还需要特定的起始信号。这些信号包括ATG起始密码子和临近序列。在整个Ob、ObR或AR基因或cDNA，包括其自身起始密码子和临近序列插入到适当的表达载体中时，则不许要额外的翻译控制信号。但是，只插入部分编码序列的情况下，必须提供外源翻译控制信号，可能包括ATG起始密码子。另外，起始密码子必须和所需编码序列的阅读框架同相，以保证完整插入物的分仪。这些外源翻译控制信号和起始密码子可以是各种来源的，可以是天然的，也可以是合成的。通过加入适当的转录增强元件、转录终止子等可以增加表达效率(参见Bittner et al.，1987，Mothods in Enzymol.153：516-544)。
另外，可以选择能够以调节插入基因序列的表达，或者所需的特定方式修饰或加工基因产物的宿主细胞株。蛋白质的这些修饰(如糖基化)和加工(如切割)对于蛋白质的功能是重要的。不同的宿主细胞对于蛋白质和基因产物的翻译后加工和修饰具有特征性和特异性机制。可以选择适当的细胞系或宿主系统，以保证所表达外源蛋白质的正确修饰和加工。为了这一目的，可以使用真核宿主细胞，这些细胞具有正确加工初始转录物、基因产物的糖基化和磷酸化的细胞机制。这些哺乳动物宿主细胞包括，但不局限于CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3、WI38，尤其是脉络膜丛细胞系。
为了重组蛋白质的长期、高产量生成，优选稳定表达。例如，可以构建稳定表达Ob、ObR或AR序列的细胞系。不使用包含病毒复制起点的表达载体，可以将位于适当表达控制元件(如启动子、增强子序列、转录终止子、多聚腺苷酸化位点等)控制之下的DNA和选择标记转化宿主细胞。将外源DNA导入后，构建的细胞在富集培养基中生长1～2天，然后转移到选择培养基中。重组质粒中的选择标记赋予选择抗性，使细胞染色体中稳定整合有质粒，生长形成细胞灶，将之克隆并放大培养成细胞系。该方法可有利地用于构建表达Ob、ObR或AR基因产物的细胞系。构建的这种细胞系在筛选和评价能够影响Ob、ObR或AR基因产物内源活性的化合物中尤其有用。
可以使用多种选择系统，包括但不局限于在tk-、hgprt-或aprt-细胞中分别使用的疱疹病毒胸苷激酶(Wigler et al.，1977，Cell 11：223)、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Szybalska & Szybalski，1962，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48：2026)和腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy et al.，1980，Cell 22：817)基因。抗代谢抗性也可以作为选择下列基因的依据：dhfr，赋予氨甲喋呤抗性(Wigler et al.，1980，Natl.Acad.Sci.USA77：3567；O’Hare et al.，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：1527)；gpt，赋予霉酚酸抗性(Mulligan & Berg，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA78：2072)；neo，赋予氨基糖苷G418抗性(Colberre-Garapin et al.，1981，J.Mol.Biol.150：1)和hygro，赋予潮霉素抗性(Santerre et al.，1984，Gene 30：147)。
还可以在转基因动物中表达Ob、ObR和AR基因产物。可以使用任意物种的动物来产生转基因动物，这些物种包括但不局限于小鼠、大鼠、兔、豚鼠、猪、micro-pigs、山羊和非人类的灵长类动物，如狒狒、猴和猩猩。
可以使用本领域已知的任意技术将Ob、ObR或AR转基因导入动物体内，或者“敲除”或灭活内源Ob、ObR或AR，产生转基因动物的建立者系。这种动物可用作本发明筛选方法的一部分，获得来源于这种动物的细胞和/或组织来产生另外的组合物(如细胞系、组织培养系统)，这种组合物也可用作本发明筛选方法的一部分。
产生这种动物的技术是本领域的技术人员所熟知的，包括但不局限于原核注射(Hoppe & Wagner，1989，U.S.Pat.No.4,873,191)；逆转录病毒介导的向胚系的基因转移(Van der Putten et al.，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：6148-6152)；胚胎干细胞中的基因打靶(Thompson et al.，1989，Cell 56：313-321)；胚胎的电穿孔(Lo，1983，Mol Cell Biol.3：1803-1814)；精子介导的基因转移(Lavitrano et al.，1989，Cell 57：717-723)等。这些技术的评论参见Gordon，1989，Transgenic Animals，Intl.Rev.Cycol.115：171-229，其整体在此引入作为参考。
至于包含转基因Ob、ObR和/或AR的转基因动物，这些动物可以在其所有的细胞中携带Ob、ObR或AR转基因。可替换的是，这些动物可以在某些，而非全部细胞中携带转基因，如嵌合动物。转基因以单一转基因或串联体，如头-头串联或头-尾串联的形式整合。还可以通过下列，例如Lasko et al.，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：6232-6236的方法，选择性地将转基因导入特定的细胞类型中，并得以活化。这种细胞类型特异性活化所需的调控序列以来于目的特定细胞类型，对于本领域的技术人员来说是显而易见的。当需要将转基因整合到内源基因的染色体位点时，优选基因打靶。简要地说，当使用该技术时，需要设计包含和内源Ob、ObR或AR基因同源的一些核苷酸序列的载体，以通过和染色体序列的同源重组进行整合，分别破坏内源Ob、ObR或AR基因核苷酸序列的功能。还可以通过下列，例如Gu et al.，1994，Science 265：103-106的方法，将转基因选择性地导入特定的细胞类型中，仅在该细胞类型中灭活Ob、ObR或AR基因。这种细胞类型特异性灭活所需的调控序列以来于目的特定细胞类型，对于本领域的技术人员来说是显而易见的。
一旦产生了转基因动物，就可以使用标准技术对重组基因的表达进行分析。通过Southern印迹分析或PCR技术进行初筛，分析动物组织是否发生了转基因的整合。转基因动物组织中转基因的mRNA表达水平可以利用以下技术进行评价，这些技术包括但不局限于来自动物的组织样品的Northern印迹分析、原位杂交分析和RT-PCR。还可以使用对转基因产物特异的抗体，对表达Ob、ObR或AR基因的组织样品进行免疫细胞化学分析。
5.1.1. Ob、ObR或AR蛋白质的抗体
特异性识别并结合Ob、ObR或AR一个或多个表位、或保守Ob、ObR或AR变体或Ob、ObR或AR肽段的表位的抗体可以用作本发明方法的一部分。这种抗体包括，但不局限于多克隆抗体、单克隆抗体(mAbs)、人抗体、人源化或嵌合抗体、单链抗体、Fab片段、F(ab’)2片段、Fab表达文库产生的片段、抗独特型(抗-Id)抗体和上述任意一项的表位结合片段。
举例来说，这种抗体可以用作本发明诊断或预测方法的一部分，通过测定哺乳动物体内的瘦素水平，如哺乳动物血清或脑脊液中的瘦素水平来诊断骨病。举例来说，这种抗体还可和下面所述的复杂筛选方案联用，评价受试化合物对Ob、ObR或AR基因产物表达和/或活性的影响。另外，这种抗体可以用在本发明的治疗和预防方法中。例如，这种抗体可以作为瘦素或肾上腺素能受体激动剂或拮抗剂。进而，可以施用这种抗体来降低大脑中的瘦素水平，其中的瘦素水平通过对脑脊液的瘦素水平进行分析测得。再则，这种抗体可以通过增加瘦素从循环中去除的速度(加速瘦素降解)来降低瘦素水平，或通过增加瘦素受体(和表达瘦素受体的细胞)解离或降解速度来降低瘦素受体水平，包括减少表达瘦素受体的细胞。
对于生成抗体来说，通过注射Ob、ObR或AR；或ObR或AR肽(对于ObR来说，为受体的功能性结构域，如ECD、TM或CD)、截短的Ob、ObR或AR多肽(对于ObR或AR来说，其中缺失了一个或多个结构域，如TM或CD)、Ob、ObR或AR的功能等同物、或者Ob、ObR或AR的突变体。这种宿主动物可以包括，但不局限于兔、小鼠和大鼠，to name but a few。可以使用增加免疫反应性的各种佐剂，取决于宿主物种，包括但不局限于弗氏佐剂(完全和不完全)；矿物胶，如氢氧化铝；表面活性物质，如溶血卵磷脂、普流尼克多元醇、多阴离子、肽、油状乳剂、钥孔嘁血蓝蛋白、二硝基苯酚；有潜力用于人的佐剂，如BCG(卡介苗)和小型棒状杆菌。多克隆抗体是来源于免疫动物血清的杂合分子群。
单克隆抗体是针对一种特定抗原的纯合抗体群，使用通过培养连续细胞系产生抗体分子的任意技术获得。这些技术包括但不局限于Kohler & Milstein，1975，Nature 256：495-497和U.S.Pat.No.4,376,110中的杂交瘤技术；人B细胞杂交瘤技术(Kosbor et al.，1983，Immunology Today 4：72；Cole et al.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA80：2026-2030)和EBV-杂交瘤技术(Cole et al.，1985，MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)。这种抗体可以是任意免疫球蛋白类型，包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD和其任意亚类。产生本发明中mAb的杂交瘤细胞可以在体外或体内进行培养。体内高滴度mAb的生成使该方法成为优选的生成方法。
另外，可以使用常规的重组DNA技术制备的包含人抗体部分和非人抗体部分的重组抗体，如嵌合及人源化的单克隆抗体，属于本发明的范围。嵌合抗体是其不同部分来源于不同动物物种的分子，如具有来源于鼠mAb的可变区和人免疫球蛋白恒定区的分子(参见美国专利No.4,816,567和4,816,397,其整体在此引入作为参考)。人源化的抗体是来源于非人类物种、具有来源于非人类物种一个或多个互补决定区(CDR)和来源于人免疫球蛋白分子构架区的抗体分子(参见美国专利No.5,585,089，其整体在此引入作为参考)。可以通过本领域已知的重组DNA技术生成这种嵌合及人源化的单克隆抗体，例如使用PCT申请No.WO/87/02671；欧洲专利申请No.184,187；欧洲专利申请No.171,496；欧洲专利申请No.173,494；PCT专利申请No.WO86/01533；美国专利申请No.4,816,567；欧洲专利申请No.125,023；Better et al.，1988，Science 240：1041-1043；Liu et al.，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：3439-3443；Liu et al.，1987，J.Immunol.139：3521-3526；Sun et al.，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：214-218；Nishimuraet al.，1987，Canc.Res.47：999-1005；Wood et al.，1985，Nature314：446-449；Shaw et al.，1988，J.Natl.Cancer Inst.80：1553-1559；Morrison，1985，Science 229：1202-1207；Oi et al.，1986，Bio/Techniques4：214；美国专利5,225,539；Jones et al.，1986，Nature 321：552-525；Verhoeyan et al.，1988，Science 239：1534和Beidler et al.，1988，J.Immunol.141：4053-4060中的方法生成。
对于治疗人类患者来说尤其需要完全的人抗体。举例来说，可以使用不能表达内源性免疫球蛋白重链和轻链基因、但能表达人重链和轻链基因的转基因小鼠来生成这种抗体。使用选择的抗原，如本发明多肽的全部或一部分，以正常的方式免疫转基因小鼠。使用常规的杂交瘤技术获得抗这种抗原的单克隆抗体。转基因小鼠携带的人免疫球蛋白转基因在B细胞分化过程中发生重排，然后转型和体细胞突变。因此，使用该技术，有可能产生有治疗用途的IgG、IgA和IgE抗体。生成人抗体的这种技术的综述参见Lonberg and Huszar，1995，Int.Rev.Immunol.13：65-93。生成人抗体和人单克隆抗体的这种技术的详细描述和生成这种抗体的方案参见美国专利No.5,625,126；5,633,425；5,569,825；5,661,016和5,545,806。另外，一些公司，如Abgenix公司(Fremont，CA)可以使用类似上述的技术提供抗选择的抗原的人抗体。
可以使用称作“指导筛选(guided selection)”的技术产生识别选择表位的完全人抗体。在该方法中，选择的非人类单克隆抗体，如小鼠抗体用于指导识别同一表位的完全人抗体的选择(Jespers et al.，1994，Bio/technology 12：899-903)。
可替换方案是，可以将生成单链抗体的技术(美国专利No.4,946,778；Bird，1988，Science 242：423-426；Huston et al.，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883和Ward et al.，1989，Nature334：544-546)加以变通，用于生成抗Ob和ObR基因产物的单链抗体。通过将Fv区的重链和轻链片段通过氨基酸桥相连接，产生单链多肽而形成单链抗体。
可以通过已知技术来产生识别特定表位的抗体片段。例如，这种片段包括但不局限于：通过对抗体分子进行胃蛋白酶消化产生的F(ab’)2片段和通过还原F(ab’)2片段的二硫桥产生的Fab片段。可替换的方案是，可以构建Fab文库(Huse et al.，1989，Science，246：1275-1281)，从而快速、简便地坚定具有所需特异性的单克隆Fab片段。
反之，使用本领域的熟练技术人员所熟知的技术，Ob、ObR或AR的抗体可以用于产生“模拟”Ob、ObR或AR的抗独特型抗体(参见Greenspan&Bona，1993，FASEB J 7(5)：437-444和Nissinoff，1991，J.Immunol.147：2427-2438)。例如，和ObR ECD相结合，并竞争性地抑制Ob和ObR相结合的抗体可以用于产生“模拟”ECD的抗独特型抗体，结合并中和Ob。这种中和性的抗独特型抗体或这种抗独特型抗体的Fab片段可用在治疗中，中和Ob，从而治疗和相应的非发病骨相比骨质降低的骨病。
5.2 诊断或预测骨病和化合物/患者监测
可以采用多种方法对骨病或状态进行诊断和预测，鉴定具有发生这种疾病或状态倾向的受试者。这些疾病或状态包括但不局限于骨质疏松、骨质稀少、异常骨形成或吸收、佩吉特症、骨折或断骨、骨转移、骨骼石化症、骨硬化、骨软骨病。
特别的是，可以根据本发明加以诊断或预测的骨病包括和相应的非发病骨相比骨质降低的骨病，包括但不局限于骨质疏松、骨质稀少和佩吉特症。
本发明的一个目的是诊断或预测哺乳动物骨病，该方法包括：
(a)测定可能具有骨病的哺乳动物体内的交感神经紧张性和瘦素活性；和
(b)将步骤(a)中测得的值和相应的对照值相比较。
因此，根据本发明的这一方面，存在诊断或预测哺乳动物，如人类骨病的方法，该方法包括：
(a)测定哺乳动物体内，如表现为骨病或具有发生骨病危险性的哺乳动物体内血清中的瘦素水平；和
(b)将步骤(a)中测得的值和对照血清中的瘦素水平相比较。
如果(a)中测得的水平高于对照水平，则预测或诊断哺乳动物表现为骨病或具有发生骨病的危险性，其中骨病是和相应的非发病骨相比骨质减轻的骨病。
可替换的方案是，存在诊断或预测哺乳动物，如人类骨病的方法，该方法包括：
(a)测定哺乳动物体内，如表现为骨病或具有发生骨病危险性的哺乳动物体内脑脊液中的瘦素水平；和
(b)将(a)中测得的水平和对照脑脊液中的瘦素水平相比较，
如果(a)中测得的水平高于对照水平，则预测或诊断哺乳动物表现为骨病或具有发生骨病的危险性，其中骨病是和相应的非发病骨相比骨质减轻的骨病。
另外，可以根据本发明加以诊断或预测的骨病包括和相应的非发病骨相比骨质增加的骨病，包括但不局限于骨骼石化症、骨硬化、骨软骨病。
因此，根据本发明的这一方面，存在诊断或预测哺乳动物，如人类骨病的方法，该方法包括：
(a)测定哺乳动物体内，如表现为骨病或具有发生骨病危险性的哺乳动物体内血清中的瘦素水平；和
(b)将步骤(a)中测得的值和对照血清中的瘦素水平相比较。
如果(a)中测得的水平低于对照水平，则预测或诊断哺乳动物表现为骨病或具有发生骨病的危险性，其中骨病是和相应的非发病骨相比骨质增加的骨病。
可替换的方案是，存在诊断或预测哺乳动物，如人类骨病的方法，该方法包括：
(a)测定哺乳动物体内，如表现为骨病或具有发生骨病危险性的哺乳动物体内脑脊液中的瘦素水平；和
(b)将(a)中测得的水平和对照脑脊液中的瘦素水平相比较，
如果(a)中测得的水平低于对照水平，则预测或诊断哺乳动物表现为骨病或具有发生骨病的危险性，其中骨病是和相应的非发病骨相比骨质增加的骨病。
另外，还提供了诊断性监测处于骨病治疗临床评价中的患者、以及监测化合物在临床试验中效率的方法。
因此，本发明的另一个方面中存在监测化合物对哺乳动物，如人类骨病治疗效率的方法，该方法包括：
(a)向哺乳动物体内施用化合物；
(b)测定哺乳动物血清中的瘦素水平；和
(c)将(b)中测得的水平和施用化合物之前的哺乳动物血清中的瘦素水平相比较，
从而监测化合物的效率，其中骨病是和相应的非发病骨相比骨质减轻的骨病。优选的化合物是和施用前相比瘦素水平增加的化合物。
根据本发明的另一个方面，存在监测化合物对哺乳动物，如人类骨病治疗效率的方法，该方法包括：
(a)向哺乳动物体内施用化合物；
(b)测定哺乳动物脑脊液中的瘦素水平；和
(c)将(b)中测得的水平和施用化合物之前的哺乳动物脑脊液中的瘦素水平相比较，
从而监测化合物的效率，其中骨病是和相应的非发病骨相比骨质减轻的骨病。优选的化合物是和施用前相比瘦素水平增加的化合物。
根据本发明的另一个方面，存在监测化合物对哺乳动物，如人类骨病治疗效率的方法，该方法包括：
(a)向哺乳动物体内施用化合物；
(b)测定哺乳动物血清中的瘦素水平；和
(c)将(b)中测得的水平和施用化合物之前的哺乳动物血清中的瘦素水平相比较，
从而监测化合物的效率，其中骨病是和相应的非发病骨相比骨质增加的骨病。优选的化合物是和施用前相比瘦素水平降低的化合物。
根据本发明的另一个方面，存在监测化合物对哺乳动物，如人类骨病治疗效率的方法，该方法包括：
(a)向哺乳动物体内施用化合物；
(b)测定哺乳动物脑脊液中的瘦素水平；和
(c)将(b)中测得的水平和施用化合物之前的哺乳动物脑脊液中的瘦素水平相比较，
从而监测化合物的效率，其中骨病是和相应的非发病骨相比骨质增加的骨病。优选的化合物是和施用前相比瘦素水平降低的化合物。
这些方法还可用于监测处于骨病治疗临床评价中的患者。通常，这些方法进一步包括检测和相应的非发病骨相比的骨质。
举例来说，这里所述的方法可以使用一些试剂，如上述的、本领域的技术人员已知的Ob和ObR核苷酸序列(参见美国专利No.5,972,621)和5.1.1节中所述的Ob和ObR抗体。Ob典型地在脂肪细胞中表达，在胃和淋巴细胞中也发现有较低水平的Ob。ObR典型地在下丘脑部位的大脑中(Friedman & Hallaas，1998，Nature，395：763-770)。举例来说，这些试剂可以用于：(1)检测Ob和ObR基因突变的存在，或检测哺乳动物血清或脑脊液中、和非骨病状态相比Ob或ObR mRNA的超表达或低表达；(2)检测哺乳动物血清或脑脊液中、和非骨病状态相比Ob或ObR基因产物的超表达或低表达；(3)检测Ob或ObR介导的信号传导通路中的紊乱或异常。可替换的方案是，检测和相应的对照样品或哺乳动物中观测水平相比Stat3蛋白的磷酸化水平。Stat3磷酸化是瘦素和瘦素受体结合后发生的生化事件(Devos et al.，1997，J.Biol.Chem.272：18304-18310)。在另一个实施方案中，这里所述的方法还涉及检测多巴胺β羟化酶(“DBH”)的活性，该酶是将多巴胺转化为去甲肾上腺素所必需的。
这里所述的方法涉及测定哺乳动物的交感神经紧张性。交感神经紧张性和交感神经系统的活化或“张力”的相对状态相关。交感神经活性控制着多种功能，能够以多种方式检测，这些方式包括但不局限于直接测定神经电频率(参见Esler & Kay，2000，J.Cardiovasc.Pharmacol.35(7 Suppl 4)：S1-7)、血浆儿茶酚胺水平(参见Urban et al.，1995，European Journal of Pharmacology，282：29-37)、热率变化(参见Boutouyrie et al.，1994，Am.J.Physiol.267(4 Pt 2)：H1368-76)或肾交感神经活性(参见Feng et al.，1992，Journal of Pharmacology andExperimental Therapeutics，261：1129-1135)。这里所述的方法可以在测定骨质技术之前或之后联合使用。例如，鉴定到和相应对照样品相比瘦素水平(如血清或脑脊液中)升高或降低的哺乳动物(如人)时，可以测定个体的骨质，进一步确认哺乳动物是否表现出和相应非发病骨相比骨质增加或降低。如果没有观察到异常骨质，则认为哺乳动物具有发生疾病的危险性；如果观察到了异常骨质，则说明哺乳动物患有骨病。
本领域技术人员所熟知的用于测定骨质的技术包括，但不局限于骨架X射线，示出骨的透明水平(透明水平越低，骨质越高)；经典的骨组织学分析(如骨体积、小梁/小梁形成的数目和方面、相对于对照和/或相对于破骨细胞的成骨细胞数目)和用于测定骨质、通常用在测定骨质疏松中的双光子骨质密度仪(DEXA)(Levis & Altman，1998，Arthritis and Rheumatism，41：577-587)。
这里所述的方法还可进一步用于诊断具有发生骨病危险性的个体。这些个体包括，但不局限于绝经期周围的妇女(这里所用的术语包括绝经前约6个月至绝经后约18个月的时间段)和正在接受皮质激素治疗，尤其是长期皮质激素治疗的患者。
可以使用事先包装好的诊断试剂盒实施这里所述的方法，其中试剂盒包含至少一种特异的Ob、ObR或AR核苷酸序列，或Ob、ObR或AR抗体试剂，便于在临床上诊断具有骨病的患者。
对于检测Ob、ObR或AR突变来说，可以使用任意有核细胞作为基因组核酸的起始材料。对于检测Ob、ObR或AR基因表达和基因产物来说，可以使用表达Ob、ObR或AR基因的任意细胞类型或组织，如对于ObR和AR来说使用脉络膜丛细胞。
基于核酸的检测技术在下面的5.2.1节中作有介绍。下面的5.2.2节中介绍了肽检测技术。
5.2.1. 检测Ob、ObR和AR基因和转录物
可以使用多种技术来检测Ob、ObR和AR基因中的突变。来源于任意有核细胞的核酸可以用作这种分析技术的起点，这些核酸可以根据本领域的技术人员所熟知的标准核酸制备方法进行分离。
DNA可以用在生物样品的杂交或扩增分析中，检测Ob、ObR或AR基因结构的异常，包括点突变、插入、缺失和染色体重排。这些分析方法包括，但不局限于Southern分析、单链构象多肽性分析(SSCP)和PCR分析。
举例来说，检测Ob、ObR或AR基因特异性突变的这种诊断性方法涉及：在有利于这些试剂特异性地分别和Ob、ObR或AR基因中的互补序列相退火的条件下，使核酸和一个或多个标记的核酸试剂接触并孵育，其中前面的核酸包括重组DNA分子、从样品，如从患者样品或其他适当细胞来源获得的克隆基因或其兼并变体，后面的标记核酸试剂包括重组DNA分子、克隆的基因或其兼并变体。优选的是，这些核酸试剂的长度至少为15至30个核苷酸。孵育后，将所有的未退火核酸和核酸：Ob/ObR/AR分子杂合体相分离。然后检测杂交的核酸的存在，如果这种分子存在的话。使用这种检测方案，可以将来源于目的细胞类型或组织的核酸固定在固相支持物上，如膜或塑料表面，如微孔板或聚苯乙烯上的塑料表面。在这种情况下，孵育后，易于将未退火的标记核酸试剂去除。使用本领域人员所熟知的标准技术完成剩余的、退火的标记核酸试剂的检测。核酸试剂与之相退火的Ob、ObR或AR基因序列和正常Ob、ObR或AR基因序列的预期退火模式相比较，确定是否存在Ob、ObR或AR基因突变。
用于检测患者样品或其他适当细胞来源中Ob、ObR或AR基因特异核酸分子的可替换诊断方法涉及通过PCR进行扩增(U.S.Pat.No.4,683,202中提出的实验方案)，然后利用本领域的技术人员所熟知的技术检测扩增的分子。可以将产生的扩增序列和预期扩增的核酸序列相比较，看扩增的核酸是否包含正常拷贝Ob、ObR或AR基因，以确定是否存在Ob、ObR或AR基因突变。
另外，可以使用人们所熟知的表型鉴定技术来鉴定具有Ob、ObR或AR基因突变的个体。举例来说，这些技术包括使用限制性片段长度多态性分析(RFLP)，该分析实际所用特定限制性酶的一个识别位点的序列改变。
另外，已介绍了利用位于两个限制性酶位点之间的、不同数目的短串联重复DNA序列的存在来鉴定Ob、ObR或AR基因突变的、分析多态性的改进方法。例如，其整体在此引入作为参考的U.S.Pat.No.5,075,217中介绍了基于(dC-dA)n-(dG-dT)n短串联重复段中长度多态性的DNA标记物。(dC-dA)n-(dG-dT)n短串联重复段的平均分割约30,000～60,000bp。相隔如此近的标记物表现出高频率的协同遗传性，在鉴定基因突变，如Ob或ObR基因中的突变及诊断与Ob或ObR突变相关的疾病或紊乱中尤其有用。
其整体在此引入作为参考的U.S.Pat.No.5,364,759中也介绍了用于检测短的三核苷酸和四核苷酸的重复序列的DNA图谱分析。该过程包括提取目的DNA，如Ob、ObR或AR基因，扩增提取的DNA，标记重复序列，以形成单一DNA的基因组图谱。
还可以通过分别检测和测定Ob、ObR或AR转录物来分析Ob、ObR或AR基因的表达水平。例如，从已知或怀疑表达Ob、ObR或AR基因的细胞类型或组织——如大脑，具体对于Ob和ObR来说是脉络膜丛细胞——中分离RNA，并使用如上所述的杂交技术或PCR技术进行检验。分离的细胞可以来源于细胞培养物或来源于患者。在评估细胞用作以细胞为基础的基因治疗技术一部分，或可替换的是，检验化合物对Ob、ObR或AR基因表达的影响的过程中，对来自培养物的细胞进行分析是必要步骤。这种分析可以对Ob、ObR或AR基因表达模式进行定量和定性，其中基因表达模式包括Ob、ObR或AR基因表达的活化或失活。
在这种检测策略的一个实施方案中，从目的RNA合成cDNA(如通过将RNA分子逆转录成cDNA)。然后，使用cDNA中的序列作为核酸扩增反应，如PCR扩增反应等的模板。用作该方法中逆转录合成起始试剂(如引物)和核酸扩增步骤的核酸试剂选自本领域的技术人员所熟知的Ob、ObR或AR核酸试剂。这种核酸试剂的优选长度至少为9～30个核苷酸。为了便于检测扩增产物，可以使用具有放射活性或非放射活性标记的核苷酸进行核酸扩增。可替换的方案是，获得足够的扩增产物，使产物能够通过标准的溴化乙锭染色或其他适当的核酸染色方法得以观察。
另外，有可能进行“原位”Ob、ObR或AR基因表达分析，即直接在来源于活检或切除的组织切片(固定的和/或冷冻的)或患者组织进行分析，而不必对核酸进行纯化。可以使用本领域的技术人员所熟知的核酸试剂作为探针和/或引物进行这种原位分析(参见Nuovo，1992，“PCR原位杂交：方案和应用”，Raven Press，NY)。
可替换的方案是，如果可以获得足够量的适当细胞，可以进行标准的Northern分析，测定Ob、ObR或AR基因的mRNA表达水平。
5.2.2. 检测Ob、ObR和AR基因产物
如这里所述，还可以使用上面5.1.1节中所述的、直接针对野生型或突变型Ob、ObR或AR基因产物或保守变体或其肽段的抗体来诊断或预测骨病。这种诊断方法可以用于检测Ob、ObR或AR基因表达的异常，或者Ob、ObR或AR结构和/或时间、组织、细胞或亚细胞定位的异常，可以在体内或体内进行，如在活检组织上进行。
举例来说，可以在体内使用直接针对AR ECD、ObR ECD或Ob的抗体来检测体内Ob、ObR或AR的表达模式和表达水平。可以使用不透射线的化合物或其他适当化合物对这种抗体加以标记，并注射到受试者中，使用X射线、CAT扫描或MRI之类的方法来观察和表达的Ob、ObR或AR的结合。优选将标记的抗体片段，如包含最小抗原结合区部分的Fab或单链抗体用于该目的，促进穿透血脑屏障，并标记脑中表达的ObR。
另外，可以得以检测的任意Ob、ObR或AR融合蛋白或Ob、ObR或AR偶联蛋白都可以施用。例如可以如上面对于标记抗体所述的，在体内施用不透射线的化合物或其他适当化合物标记的Ob、ObR或AR融合蛋白或偶联蛋白，并进行观察。另外这种融合蛋白还可用于体外诊断。
可替换的方案是，上述的免疫分析或融合蛋白检测分析可以用在体外活检或自检样品上，评价Ob、ObR或AR的表达模式。这种分析不局限于使用限定Ob、ObR或AR特定表位的抗体。使用这些标记抗体会产生Ob、ObR或AR的翻译并向细胞表面的细胞内转运方面的有用信息，鉴定加工过程中的缺陷。
分析的组织或细胞类型通常包括已知或怀疑能表达Ob、ObR或AR的组织或细胞类型，例如对于ObR来说是下丘脑和脉络膜丛细胞；对于Ob来说是脂肪组织。举例来说，这里采用的蛋白质分离方法可以是Harlow & Lane，1988，“抗体：实验指南”，冷泉港实验室出版社，冷泉港，N.Y.中介绍的方法，其整体在此引入作为参考。分离的细胞可以来源于细胞培养物或患者。在评估细胞用作以细胞为基础的基因治疗技术一部分，或可替换的是，检验化合物对Ob、ObR或AR基因表达的影响的过程中，对来自培养物的细胞进行分析是必要步骤。
举例来说，本发明中有用的、上面5.1.1节中所述的抗体或抗体片段可以用度定量或定性地检测Ob、ObR或AR基因产物或保守变体或其肽段的存在。例如，通过使用荧光标记抗体(参见该节下文)的免疫荧光技术和光显微镜、流式细胞仪或荧光计检测联用来实现该目的。如果Ob或ObR基因产物表达在细胞表面上，则尤其优选该技术。
本发明中有用的抗体或Ob、ObR或AR融合蛋白或偶联蛋白还以组织学方式用在免疫荧光分析、免疫电镜分析或非免疫分析，原位检测Ob、ObR或AR基因产物或保守变体或其肽段，或检测Ob结合(标记Ob融合蛋白的情况下)。
可以通过从患者体内取出组织样本，将其用到本发明的标记抗体或融合蛋白上来实现原位检测。优选将标记抗体(或片段)覆盖到生物样品上来应用抗体(或片段)或融合蛋白。通过使用该方法，不仅可能检测到Ob、ObR或AR基因产物，或保守变体或其肽段，或Ob结合或儿茶酚胺结合的存在，还有可能检测到其在受检验组织中的分布。使用本发明，普通的技术人员明白：可以对许多组织学方法(如染色方法)加以改进，以进行这种原位检测。
检测Ob、ObR或AR基因产物，或保守变体或其肽段的免疫分析和非免疫分析典型地包括在能够鉴定Ob、ObR或AR产物，或保守变体或其肽段的可检测标记抗体存在的条件下孵育样品，如生物液体(如血清或脑脊液)、组织提取物、新鲜收获的细胞或在细胞培养中孵育的细胞裂解物；通过本领域人员所熟知的多种技术检测结合态抗体。
使生物样品和能够固定细胞、细胞颗粒或可溶性蛋白质的固相支持物或载体，如硝酸纤维素或其他固体支持物相接触，并固定在上面。然后用适当的缓冲液洗支持物，用可检测的标记Ob、ObR或AR抗体或Ob、ObR或AR融合蛋白处理。使用缓冲液第二次洗固相支持物，去除非结合态的抗体或融合蛋白。通过常规手段检测固相支持物上的结合态标记量。
“固相支持物或载体”指能够和抗原或抗体相结合的任意支持物。熟知的支持物或载体包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙、淀粉酶、天然和修饰的纤维素、聚丙烯酰胺、辉长岩和磁铁矿。用于本发明目的的载体性质可以是某种程度上可溶或不溶的。事实上，只要偶联的分子能够和抗原或抗体相结合，支持物可以具有任何可能的结构构型。因此，支持物构型可以是球形的，如小珠；或圆柱形，位于试管的内表面或柱的外表面。可替换的方案是，表面可以是平的，如薄片、测试带等。优选的支持物包括聚苯乙烯珠。本领域的技术人员知道可以使用许多其他结合抗体或抗原的适当载体，能够使用常规的实验来确证这一点。
可以根据熟知的方法测定给定的许多Ob、ObR或AR抗体或Ob、ObR或AR融合蛋白的结合活性。本领域的熟练技术人员能够采用常规的条件确定每次测定的有效的和最佳的分析条件。
对于抗体来说，可检测性标记Ob、ObR或AR抗体的一种方式是将Ob、ObR或AR抗体和酶相连接，用于酶免分析(EIA)(Voller，“酶联免疫吸附分析(ELISA)”，1978，Diagnostic Horizons 2：1-7，Microbiological Associates Quarterly Publication，Walkersville，Md)；Voller et al.，1978，J.Clin.Pathol.31：507-520；Butler，1981，Meth.Enzymol.73：482-523；Maggio(ed.)，1980，Enzyme Immunoassay，CRCPress，Boca Raton，Fla.，：Ishikawa et al.，(eds)，1981，EnzymeImmunoassay，Kgaku Shoin，Tokyo)。结合在抗体上的酶会和适当的底物，优选显色底物发生反应，以这种方式产生能够通过分光光度法、荧光测定法或可视手段得以检测的化学基团。可以用于检测性标记抗体的酶包括，但不局限于苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-5-类固醇异构酶、酵母乙醇脱氢酶、α-甘油磷酸脱氢酶、丙糖磷酸异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡萄糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。通过使用酶显色底物的比色法进行检测。还可以通过对底物的酶反应程度和类似方法配制的标准品加以可视比较进行检测。
还可以使用任意的其他各种免疫分析进行检测。例如，通过放射性标记抗体或抗体片段，有可能通过使用放免分析法(RIA)检测Ob、ObR或AR(参见Weintraub，放免分析法原理，放射配体分析技术的第七次培训课程，The Endocrine Society，3月，1986，在此引入作为参考)。
还有可能使用荧光化合物来标记抗体。当荧光标记的抗体暴露在适当波长的光下时，可以根据荧光检测其存在。最常用的荧光标记化合物有异硫氰酸荧光素、若丹明、藻红蛋白、藻青蛋白、异藻青蛋白、对苯二醛和荧胺。
还可以使用发射荧光的金属，如152Eu或其他镧系列对抗体进行可检测性标记。使用二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)和乙二胺四乙酸(EDTA)之类的金属螯合剂使金属吸附到抗体上。
还可以使抗体和化学发光化合物相偶联将之进行可检测性标记。通过检测化学反应过程中发出的光来确定化学发光标记抗体的存在。具体泳道的化学发光标记化合物的例子有鲁米诺、异鲁米诺、theromatic acridinium酯、咪唑、acridinium盐和草酸酯。
类似的，使用生物发光化合物标记本发明的抗体。生物发光是生物系统内存在的一类化学发光，其中催化性蛋白质增加化学发光反应的效率。通过检测发光的存在而确定生物发光蛋白的存在。用于标记的重要生物发光化合物有荧光素、荧光素酶和水母蛋白。
5.3 用于治疗、诊断和预防骨病的化合物的筛选分析
本发明还提供了鉴定能够影响骨病的筛选方法(如分析方法)。本发明进一步包含瘦素和瘦素受体的激动剂和拮抗剂、儿茶酚胺和肾上腺素能受体的激动剂和拮抗剂，包括小分子、大分子和抗体，以及能够用于抑制瘦素、瘦素受体和肾上腺素能受体基因表达的核苷酸序列(如反义序列和核酶分子)，增加瘦素、瘦素受体和肾上腺素能受体基因表达的基因或调控序列置换构建体(如将瘦素、瘦素受体或肾上腺素收集基因置于强启动子系统控制之下的表达构建体)。这些化合物可以用于治疗骨病。
尤其介绍了能够用来鉴定一些化合物的细胞和非细胞分析方法，这些化合物和瘦素、瘦素受体或肾上腺素能受体相互作用，如调节瘦素和瘦素受体或儿茶酚胺和肾上腺素能受体的活性和/或结合瘦素受体或肾上腺素能受体。基于细胞的分析方法可以用来鉴定能够影响瘦素和瘦素受体和/或儿茶酚胺和肾上腺素能受体信号传导活性的化合物或组合物，鉴定它们是与瘦素受体或儿茶酚胺受体相结合，还是作用在瘦素信号传导通路或肾上腺素信号传导通路中的细胞内因子上。本发明这种基于细胞的分析方法使用表达瘦素、瘦素受体或肾上腺素能受体的细胞、细胞系或人工改造的细胞或细胞系。可以进一步对细胞进行改造，使之包括受体分子，该受体分子和活化的瘦素受体或肾上腺素能受体传导的信号相连，有助于鉴定调节瘦素和瘦素受体信号传导活性和/或肾上腺素信号传导活性的化合物。
本发明还包含使用基于细胞的分析方法或细胞裂解物分析方法(如体外转录或翻译分析)，筛选调节瘦素、瘦素受体和肾上腺素能受体基因表达的化合物或组合物。为了这一目的，将包含受体序列的构建体用在人工改造的细胞或细胞裂解提取物中，筛选在转录水平上调节受体基因产物表达的化合物，构建体中的受体序列和瘦素或瘦素受体基因的调控元件相连接。举例来说，这种分析方法可以用于鉴定调节参与瘦素、瘦素受体和肾上腺素能受体基因表达的转录因子的表达或活性，或者检验三螺旋多聚核苷酸的活性。可替换的方案是，人工改造的细胞或翻译提取物可用于筛选调节瘦素、瘦素受体和肾上腺素能受体从mRNA转录物翻译、进而影响瘦素受体和/或肾上腺素能受体表达的化合物(包括反义序列和核酶分子)。
下列分析方法可用于鉴定和Ob、ObR或AR(包括但不局限于ObR或AR的ECD或CD)相互作用(如与之结合)的化合物；和能够与Ob、ObR或AR(包括但不局限于ObR或AR的TM和CD)相互作用的细胞内蛋白质相互作用(如与之结合)的化合物；干扰Ob、ObR或AR和参与ObR介导的信号传导或肾上腺素信号传导的跨膜蛋白或细胞内蛋白相互作用的化合物；调节Ob、ObR或AR基因表达活性或调节Ob、ObR或AR水平的化合物。还可以使用能够坚定于Ob、ObR或AR基因调控序列(如启动子序列)相结合、调节Ob、ObR或AR基因表达的化合物的分析方法(参见Plant，1994，J.Biol.Chem.269：28558-28562)。鉴定中，还可以进一步验证化合物在体外或体内调节瘦素信号传导的能力，还可以进一步验证化合物调节骨质(增加或降低骨质)并治疗和相应的非发病骨相比骨质降低或增加的骨病的能力。
因此，根据本发明的这一个方面，存在鉴定能够调节(增加或降低)哺乳动物骨质的化合物的方法，该方法包括：
(a)将受试化合物和多肽相接触；
(b)测定受试化合物是否和多肽相结合，如果受试化合物与多肽相结合，则说明鉴定到了能够调节骨质的化合物，其中多肽选自瘦素多肽、瘦素受体多肽和肾上腺素能受体多肽。
可替换的是，存在鉴定能够调节(增加或降低)哺乳动物骨质的化合物的方法，该方法包括：
(a)使受试化合物和多肽相接触；
(b)鉴定能够和多肽相结合的受试化合物；和
(c)将(b)中的受试化合物施用到非人类的哺乳动物体内，测定其骨质，和未处理的对照非人类哺乳动物体内的相应骨相比，评价受试化合物是否能够调节骨质。其中多肽选自瘦素多肽、瘦素受体多肽和肾上腺素能受体多肽，如果化合物调节了骨质，则鉴定到了能够调节哺乳动物体内骨质的化合物。
根据本发明的这一方面和其他方面，这里所用的对照非人类哺乳动物指没有施用受试化合物的相应哺乳动物。
根据本发明的另一个方面，存在鉴定能够调节(增加或降低)哺乳动物骨质的化合物的方法，该方法包括：
(a)使受试化合物和瘦素多肽及瘦素受体多肽接触一段时间，使能够形成瘦素/瘦素受体复合物；和
(b)测定瘦素/瘦素受体复合物水平，如果测得的水平和不存在受试化合物时测得的水平不同，则说明鉴定到了能够调节骨质的化合物。
根据本发明的另一个方面，存在鉴定能够调节(增加或降低)哺乳动物骨质的化合物的方法，该方法包括：
(a)使受试化合物和儿茶酚胺及肾上腺素能受体多肽接触一段时间，使能够形成瘦素/瘦素受体复合物；和
(b)测定儿茶酚胺/肾上腺素能受体复合物水平，如果测得的水平和不存在受试化合物时测得的水平不同，则说明鉴定到了能够调节骨质的化合物。
根据本发明的这一方面和其他方面，可以通过分离复合物，使用本领域的技术人员所熟知的多种分析方法，如Western印迹法测定复合物形成量，测定瘦素/瘦素受体和/或儿茶酚胺/肾上腺素能受体复合物形成。
根据本发明的另一个方面，存在鉴定能够降低哺乳动物骨质的化合物的方法，该方法包括：
(a)使受试化合物和表达功能性瘦素受体的细胞相接触，和
(b)测定受试化合物是否活化瘦素受体，
如果化合物活化了瘦素受体，则说明鉴定到了能够降低骨质的化合物。
根据本发明的这一方面和其他方面，功能性瘦素受体是配体和受体的活性位点结合后能够传导信号的瘦素受体。这里所用的瘦素受体活化是指瘦素受体活性(信号传导)增加。
根据本发明的另一个方面，存在鉴定能够降低哺乳动物骨质的化合物的方法，该方法包括：
(a)使受试化合物和表达功能性肾上腺素能受体的细胞相接触，和
(b)测定受试化合物是否活化肾上腺素能受体，
如果化合物活化了肾上腺素能受体，则说明鉴定到了能够降低骨质的化合物。
根据本发明的这一方面和其他方面，功能性肾上腺素能受体是配体和受体的活性位点结合后能够传导信号的肾上腺素能受体。这里所用的肾上腺素能受体活化是指肾上腺素能受体活性(信号传导)增加。
根据本发明的另一个方面，存在鉴定能够减低哺乳动物骨质的化合物的方法，该方法包括：
(a)使受试化合物和表达功能性瘦素受体的细胞相接触，测定受试化合物是否活化瘦素受体；
(b)将(a)中活化瘦素受体的受试化合物施用到非人类的哺乳动物体内，如果受试化合物降低了骨质，则说明鉴定到了能够降低哺乳动物骨质的化合物。
根据本发明的另一个方面，存在鉴定能够减低哺乳动物骨质的化合物的方法，该方法包括：
(a)使受试化合物和表达功能性肾上腺素能受体的细胞相接触，测定受试化合物是否活化肾上腺素能受体；
(b)将(a)中活化肾上腺素能受体的受试化合物施用到非人类的哺乳动物体内，如果受试化合物降低了骨质，则说明鉴定到了能够降低哺乳动物骨质的化合物。
根据本发明的另一个方面，存在鉴定能够增加哺乳动物骨质的化合物的方法，该方法包括：
(a)使瘦素多肽及受试化合物和表达功能性瘦素受体的细胞相接触；和
(b)测定其中瘦素受体的活化水平，和不存在受试化合物情况下测定的瘦素受体活化水平相比，评价受试化合物是否减弱瘦素受体的活化；其中能够减弱瘦素受体活化的受试化合物是能够增加哺乳动物骨质的化合物。
根据本发明的另一个方面，存在鉴定能够增加哺乳动物骨质的化合物的方法，该方法包括：
(a)使儿茶酚胺及受试化合物和表达功能性肾上腺素能受体的细胞相接触；和
(b)测定其中肾上腺素能受体的活化水平，和不存在受试化合物情况下测定的肾上腺素能受体活化水平相比，评价受试化合物是否减弱肾上腺素能受体的活化；其中能够减弱肾上腺素能受体活化的受试化合物是能够增加哺乳动物骨质的化合物。
根据本发明的另一个方面，存在鉴定能够增加哺乳动物骨质的化合物的方法，该方法包括：
(a)使瘦素多肽及受试化合物和表达功能性瘦素受体的细胞相接触，测定受试化合物能否减弱瘦素受体的活化；和
(b)将(a)中减弱瘦素受体活化的受试化合物施用到非人类的动物体内，测定其骨质，和对照非人类动物体内的相应骨相比，评价受试化合物是否增加骨质；如果受试化合物增加了骨质，则说明鉴定到了能够增加哺乳动物骨质的化合物。
根据本发明的另一个方面，存在鉴定能够增加哺乳动物骨质的化合物的方法，该方法包括：
(a)使儿茶酚胺及受试化合物和表达功能性肾上腺素能受体的细胞相接触，测定受试化合物能否减弱肾上腺素能受体的活化；和
(b)将(a)中减弱瘦素受体活化的受试化合物施用到非人类的动物体内，测定其骨质，和对照非人类动物体内的相应骨相比，评价受试化合物是否增加骨质；如果受试化合物增加了骨质，则说明鉴定到了能够增加哺乳动物骨质的化合物。
根据本发明的另一个方法，存在通过测定磷酸化Stat3多肽水平来确定瘦素受体的活化的方法。Stat3多肽是靶细胞中瘦素信号传导的下游效应因子(Tartaglia et al.，1995，Cell，83，1263-1271；Baumann etal.，1996，Proc Natl Acad Sci USA 93，8374-8378；Ghilardi et al.，1996，Proc Natl Acad Sci USA 93，6231-6235；Vaisse et al.，1996，Nat Genet14：95-97；)，它在瘦素受体被瘦素活化后得以磷酸化。
可以根据本发明进行筛选的化合物包括但不局限于肽、抗体和其片段，和其他能够结合Ob、ObR或AR并模拟天然配体引发的活性(激动剂)或抑制天然配体引发的活性(拮抗剂)的有机化合物(肽模拟物)；以及肽、抗体或其片段，和其他能够模拟ObR或AR(或其部分)的ECD，与之结合并“中和”天然配体的有机化合物。可以根据本发明进行筛选的其他化合物包括但不局限于和Ob相互作用并防止Ob透过血脑屏障、进而防止Ob活化ObR的化合物。
这些化合物包括但不局限于肽，例如可溶性肽，包括但不局限于随机肽库成员(参见Lam，K.S.et al.，1991，Nature 354：82-84；Houghten，R.et al.，1991，Nature 354：84-86)和由D-和/或L-构型氨基酸组成的组合化学分子库成员，磷酸肽(包括但不局限于随机或部分兼并的磷酸肽库，参见Songyang et al.，1993，Cell 72：767-778)、抗体(包括但不局限于多克隆抗体、单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、抗独特型抗体、嵌合抗体或单链抗体、和Fab、F(ab’)2和Fab表达库片段和其表位结合片段)和小的有机或无机分子。
可以根据本发明进行筛选的化合物包括但不局限于小的有机分子，这些小的有机分子能够透过血脑屏障，进入适当的细胞(如脉络膜丛或下丘脑中)并影响Ob、ObR或AR基因或参与ObR信号传导通路或肾上腺素信号传导通路的其他基因的表达(如通过和调控区及参与基因表达的转录因子相互作用)；或者影响ObR或AR活性(如通过抑制或增强CD的酶活性)或其他一些参与ObR信号传导通路的细胞内因子，如gp130活性的化合物。
计算机模型和检索技术能够鉴定能够调节Ob、ObR或AR表达或活性的化合物，或对已鉴定的化合物加以改进。鉴定了这种化合物或组合物后，即可鉴定活性位点或活性区。这些活性位点可以典型的是配体结合位点，例如和ObR相互作用的Ob区域。使用本领域的已知方法，包括，例如根据肽的氨基酸序列、核酸的核苷酸序列、相关性化合物或组合物和其天然配体形成的复合物研究来鉴定活性位点。在后一情况下，可以使用化学或X射线晶体衍射法，寻找复合配体所在的部位，从而寻找活性位点。然后，确定活性位点的三维几何结构。可以通过已知的方法，包括能够确定完整分子结构的X射线结晶衍射来确定三维几何结构。另一方面，可以使用固相和液相NMR确定某些分子内距离。还可以使用确定结构的其他任意实验方法获得部分或完整的几何结构。可以使用能够增加确定活性位点结构准确性的天然或人工复合配体来测定几何结构。
如果测得了不完整或不够准确的结构，可以使用基于计算机的数字化模型方法使结构完整，或改进其准确性。可以使用任何公认的模型方法，包括对特定的生物多聚物，如蛋白质或核酸特异的参数化模型、以计算机分子运动为基础的分子动力学模型、以热信号群为基础的统计学机械模型或组合的模型。对于大多数模型来说，表示组成的原子和基团之间力的标准分子力场是必要的，可以选自物理化学中已知的力场。对于通过这些模型方法计算的完整和更准确结构来说，不完整或欠准确的实验性结构可以作为限制因素。
最后，通过实验性模型或者其组合确定了活性位点的结构之后，可以通过对包含化合物及其分子结构信息的数据库进行检索，鉴定候选的调节性化合物。这种检索寻找结构和确定的活性中心结构相匹配、和限定活性中心的基团相互作用的化合物。这种检索可以是人工操作的，但优选是计算机辅助的。这种检索发现的化合物是潜在的Ob、ObR或AR调节性化合物。
可替换的方案是，这些方法可以用于鉴定从已知调节性化合物或配体改进的调节性化合物。可以对已知化合物的组成加以改动，使用上述用于新组合物的实验性和计算机模型方法来测定改动的结构效应。将改变的结构和化合物的活性位点结构相比较，确定是否有改进的配合性或相互作用。通过这种方式，可以快速地评价组合物中的系统改变，如侧链基团的改变，从而获得特异性或活性提高了的改动的调节性化合物或配体。
用于在鉴定Ob、ObR或AR活性位点、相关传导和转录因子的基础上鉴定调节性化合物的进一步实验性和计算机模型方法对于本领域的技术人员来说将是显而易见的。
举例来说，分子模型系统有CHARMm和QUANTA程序(PolygenCorporation，Waltham，Mass)。CHARMm行使能量最小化和分子动力学功能。QUANTA行使构建、图模型和分子结构分析。QUANTA能够进行相互作用性构建、修饰、可视化和分子间行为分析。
许多文章都对和特定蛋白质发生相互作用之药物的计算机模型进行了评论。如Rotivinen et al.，1988，Acta Pharmaceutical Fennica97：159-166；Pipka，New Scientist 54-57(Jun.16，1988)；Mckinaly andRossmann，1989，Annu.Rev.Pharmacol.Toxiciol.29：111-122；Perry &Davies，OSAR：药物设计中的定量构效关系pp189-193(Alan R.Liss，Inc.1989)；Lewis & Dean，1989，Proc.R.Soc.Lond.236：125-140和141-162；至于核酸组分的模型受体，Askew，et al.，1989，J.Am.Chem.Soc.111：1082-1090。其他筛选和图解化合物的程序可以从公司获得，如BioDesign公司(Pasadena，加里福尼亚)、Allelix公司(Mississuga，Ontario，加拿大)和Hypercube公司(Cambridge，Ontario)。虽然这些程序最初设计用于对特定蛋白质特异的药物，一旦鉴定到了DNA或RNA区，可以将这些程序加以变通，用于对DNA或RNA区特异的药物。
虽然上述是用来设计并产生能够改变结合的化合物，人们还可以筛选已知化合物的文库，获得作为抑制剂或活化剂的化合物。这些已知化合物包括天然产物或合成化合物和生物活性物质，包括蛋白质。
举例来说，通过这里所述的分析方法鉴定到的化合物可以用于详尽阐述Ob、ObR或AR基因产物的生物功能，改善骨病。下面5.3.4节中讨论了对通过5.3.1至5.3.3节中所述技术鉴定的化合物有效性进行分析的方法。
5.3.1. 结合Ob、ObR或AR的化合物的体外筛选方法
可以设计体外系统来鉴定能够和Ob、ObR或AR(包括但不局限于ObR和AR的ECD或CD)相互作用(与之结合)的化合物。举例来说，鉴定到的化合物可以用语调节野生型和/或突变型基因产物的活性；可以用语详尽阐述Ob、ObR或AR的生物功能；可以用在筛选中来鉴定破坏正常Ob、ObR和AR相互作用的化合物；或其自身破坏这种相互作用。
用于鉴定结合Ob、ObR或AR的化合物的分析方法原理涉及：在一定条件下配制Ob、ObR或AR和受试化合物的反应混合物，反应一段时间，使两个组分能够相互作用并结合，进而形成能够从反应混合物中取出和/或在反应混合物中得以检测的复合物。Ob、ObR或AR种的使用根据筛选分析的目标而定。例如，要寻找天然配体的激动剂时，可以使用全长ObR或可溶性截短的ObR，其分子中删除了TM和/或CD；和ECD相对应的肽或包含ObR ECD和蛋白质或多肽相融合的融合蛋白。其中相融合的蛋白质或多肽提供分析系统的优越性(如产生的复合物的标记、分离)。要鉴定和ObR胞质结构域相互作用的化合物的情况下，可以使用和ObR CD相对应的肽以及包含ObR CD的融合蛋白。另外，要寻找能够防止Ob透过血脑屏障的化合物的情况下，可以使用Ob或可溶形式的Ob。还可以采用利用全长AR或可溶性截短AR的类似方法。
可以通过多种方式进行筛选分析。例如，进行这种分析的一种方法涉及：将Ob、ObR或AR蛋白、多肽、肽或融合蛋白或受试物质锚定在固相上，在反应结束时检测锚定在固相上的Ob、ObR或AR/受试化合物。在这种方法的一个实施方案中，可以将Ob、ObR或AR反应物锚定在固体表面上，直接或间接对没有锚定的受试化合物加以标记。
实际上，方便地使用微孔板作为固相。通过非共价或共价吸附将锚定组分固定。通过简单地用蛋白质溶液包被固体表面，并加以干燥来实现非共价西服。可替换的方案是，可以使用对要固定的蛋白质特异的固定化抗体，优选单克隆抗体将蛋白质锚定在固体表面上。可以提前制备这种表面，并加以保存。
为了进行分析，将非固定的组分加到包含锚定组分的包被表面上。反应完成后，在一定条件下去除未反应组分(如通过洗涤)，使形成的复合物仍固定在固体表面上。通过多种方式检测锚定在固体表面上的复合物。之前的非固定化组分事先标记的情况下，测定到固定在表面上的标记，则说明形成了复合物。之前的非固定化组分未事先标记的情况下，使用间接标记检测锚定在表面上的复合物；如使用对之前的非固定化组分特异的标记抗体(可以使用标记的抗-Ig抗体对该抗体进行直接或间接标记)。
可替换的方案是，反应在液相中进行，反应产物和未反应的组分相分离，检测复合物；如使用对Ob、ObR或AR蛋白、多肽、肽或融合蛋白或受试化合物特异的固定化抗体锚定溶液中形成的复合物，使用对可能性复合物的其他组分特异的标记抗体来检测锚定的复合物。
可替换的方案是，可以使用基于细胞的分析方法来鉴定和Ob、ObR或AR相互作用的化合物。为了这一目的，可以使用表达Ob、ObR或AR的细胞系(如COS细胞、CHO细胞、成纤维细胞等)，或遗传改造表达Ob、ObR或AR的细胞系(如通过转染或转导Ob、ObR或AR DNA)。举例来说，通过和天然Ob相比较或竞争来检测受试化合物和宿主细胞表达的ObR ECD的相互作用。
5.3.2. 和Ob、ObR和AR相互作用的蛋白质分析
可以采用适于检测蛋白质-蛋白质相互作用的任意方法来鉴定能够和Ob、ObR或AR相互作用的跨膜蛋白或细胞内蛋白。可以采用的传统方法是通过细胞裂解物，或来源于细胞裂解物的蛋白质，和Ob、ObR或AR的梯度或层析柱进行共免疫沉淀、交联和共纯化，鉴定裂解物中和Ob、ObR或AR相互作用的蛋白质。对于这些分析来说，所用的Ob、ObR或AR组分可以是全长的、缺失膜锚定区的可溶性衍生物(如截短ObR或AR，其中删除了TM，产生包含ECD和CD相融合的截短分子)、和CD相对应的肽或包含Ob或ObR的CD或AR的融合蛋白。一旦分离，这种细胞内蛋白质就可以得以鉴定，并和标准技术联用来鉴定与之相互作用的蛋白质。例如，使用本领域的技术人员所熟知的技术，如通过Edman降解技术(参见Creighton，1983，“蛋白质：结构和分子原理”，W.H.Freeman & Co.N.Y.，pp.34-49)可以确定和Ob、ObR或AR相互作用的细胞内蛋白质中的至少一部分氨基酸序列。这样获得的氨基酸序列可以用来指导产色怀念感能够用语筛选编码这种细胞内蛋白之基因序列的核苷酸混合物。举例来说，可以通过标准的杂交或PCR技术来完成筛选。产生核苷酸混合物和筛选的技术是人们所熟知的(参见Ausubel，上文，和PCR方案：方法指南和应用，1990，Innis，M.et al.，eds.AcademicPress，Inc.，纽约)。
另外，还可以采用一些方法同时鉴定编码和Ob、ObR或AR相互作用的跨膜蛋白或细胞内的蛋白的基因。举例来说，这些方法包括使用标记的Ob、ObR或AR蛋白，或Ob、ObR或AR多肽，肽或融合蛋白，如和标记物(如酶、荧光蛋白、发光蛋白或染料)或Ig-Fc结构域相融合的Ob、ObR或AR多肽或Ob、ObR或AR结构域，和抗体探测λgt11文库的熟知技术相类似的方式探测表达文库。
曾经示例性、而非限制性地介绍了检测体内蛋白质相互作用的一种方法，即两步杂交系统。已经介绍了该系统的一个版本(Chien et al.，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：9578-9582)，它可以从Clontech购得(Palo Alto，加里福尼亚)。
简要地说，使用这种系统构建编码两个杂合蛋白的质粒：一个质粒由编码和Ob、ObR或AR核苷酸序列相融合的转录活化因子的DNA结合结构域的核苷酸组成，其中Ob、ObR或AR核苷酸序列编码Ob、ObR或AR，Ob、ObR或AR多肽，肽或融合蛋白。另一个质粒由编码和未知蛋白cDNA相融合的转录活化因子的激活结构域的核苷酸组成，其中未知蛋白cDNA重组到质粒中形成cDNA文库的一部分。将DNA结合蛋白融合质粒和cDNA文库转化到包含报道基因(如HBS或lacZ)的酿酒酵母株中，其中报道基因的调控区包含转录活化因子的结合位点。单独的杂合蛋白并不能活化报道基因的转录：DNA结合结构域杂合蛋白由于不能提供活化功能而不能活化报道基因的转录，激活结构域杂合蛋白由于不能定位到活化因子结合位点而不能活化报道基因的转录。两个杂合蛋白的相互作用重构成功能性活化蛋白，引起报道基因的表达，通过对报道基因产物进行分析加以检测。
两步杂交系统或相关方法可以用于筛选激活结构域文库，寻找和“饵(bait)”基因产物相互作用的蛋白质。通过举例，而非加以限制，Ob、ObR或AR可以用作饵基因化合物。总基因组和cDNA序列和编码激活结构域的DNA相融合。将该文库和编码DNA结合结构域和饵Ob、ObR或AR基因产物相融合的杂合蛋白的质粒共转化到酵母报道株中，对产生的转化子进行筛选，寻找表达报道基因的转化子。通过举例，而非加以限制，饵Ob、ObR或AR基因序列，如Ob、ObR或AR的开放阅读框(或ObR或AR的结构域)可以克隆到载体上，使之在翻译水平上和编码GAL4蛋白DNA结合结构域的DNA相融合。纯化这些菌落，分离负责报道基因表达的文库质粒。进行DNA测序，鉴定文库质粒所编码的蛋白质。
使用本领域中的常规方法制备细胞系cDNA文库，从中检测和饵Ob、ObR或AR基因产物相互作用的蛋白质。根据这里所述的具体系统，例如，cDNA片段可以插入到载体中，使之在翻译水平上和GAL4的转录激活结构域相融合。该文库可以和饵Ob、ObR或AR基因-GAL4融合质粒共转化到包含lacZ基因的酵母株中，其中lacZ基因受包含GAL4激活序列的启动子的驱动。和GAL4转录激活结构域相融合的cDNA编码的蛋白质，和饵Ob、ObR或AR基因产物相互作用，重构成活化的GAL4蛋白，从而驱动HIS3基因的表达。检测在包含缺少组氨酸之半固体琼脂培养基的培养皿中能够生长的、表达HIS3的菌落。从这些菌株中纯化cDNA，使用本领域的常规技术生成和分离和饵Ob、ObR或AR相互作用的蛋白质。
5.3.3. 干扰和Ob和ObR或儿茶酚胺和AR大分子相互作用的化 合物分析
为了便于讨论，和Ob或ObR或儿茶酚胺和AR相互作用的大分子称为“结合配偶物”。在骨病的调节中，这些结合配偶物可能参与ObR信号传导通路或肾上腺素信号传导通路，从而参与Ob或ObR或儿茶酚胺或AR的作用。因此，需要鉴定干扰或破坏这种结合配偶物和Ob或儿茶酚胺相互作用、分别用于调节ObR或AR活性、控制和ObR或肾上腺素活性相关的骨病的化合物。
用于鉴定干扰Ob或ObR、儿茶酚胺和AR和其结合配偶物或配偶物之间相互作用的化合物的分析系统的基本原理是：制备包含上述Ob、ObR、儿茶酚胺或AR蛋白、多肽、肽或融合蛋白和结合配偶物的反应混合物，在一定条件下反应一段时间，使二者相互作用并结合，从而形成复合物。为了验证化合物的抑制活性，在存在或不存在受试化合物的条件下制备反应混合物。可以最初将受试化合物加到反应混合物中，或加入Ob或ObR基团、儿茶酚胺或AR基团和其相应的结合配偶物之后加入受试化合物。在没有受试化合物或加有安慰剂的条件下孵育对照反应混合物。然后检测Ob或ObR基团、儿茶酚胺或AR基团和其相应的结合配偶物之间任意复合物的形成。在对照反应中形成、而未在包含受试化合物的反应混合物中形成复合物，说明化合物干扰了Ob或ObR、儿茶酚胺或AR和反应相互作用性结合配偶物之间的相互作用。另外，还可以将在包含受试化合物和正常Ob或ObR蛋白(或正常儿茶酚胺或AR蛋白)的反应混合物中的复合物形成和在包含受试化合物和突变Ob或ObR蛋白(或儿茶酚胺或AR蛋白)的反应混合物中的复合物形成相比较。需要鉴定破坏突变Ob或ObR蛋白(或儿茶酚胺或AR蛋白)相互作用、而不破坏正常Ob或ObR蛋白(或儿茶酚胺或AR蛋白)的化合物的情况下，这种比较是重要的。
可以以杂合或纯合方式对干扰Ob或ObR蛋白、或儿茶酚胺或AR和结合配偶物之间相互作用的化合物进行分析。杂合分析涉及：将Ob或ObR基团、儿茶酚胺或AR基团、产物或结合配偶物锚定在固相上，反应结束时检测锚定在固相上的复合物。在纯合分析中，在液相中进行整个反应。在两种方法中，加入反应物的顺序可以改变，以获得有关受试化合物的不同信息。例如，在存在受试化合物的条件下进行反应鉴定竞争性干扰相互作用的受试化合物；即在加入Ob或ObR基团、儿茶酚胺或AR基团和反应性结合配偶物之前或同时往反应混合物中加入受试化合物。可替换的方案是，通过形成复合物之后往反应混合物中加入受试化合物，验证干扰事先形成的复合物的化合物，如具有较高结合常数置换复合物中一个组分的化合物。下文中简要地介绍了各种格式。
在杂合分析系统中，将Ob或ObR基团、儿茶酚胺或AR基团、产物或结合配偶物锚定在固相上，对非锚定的物种加以直接或间接标记。实际上，可以方便地使用微孔板。通过非共价或共价吸附将锚定物种加以固定。可以使用Ob、ObR或AR基因产物或结合配偶物的溶液包被固体表面，并加以干燥来实现非共价吸附。可替换的方案是，可以使用对待锚定物种特异的固定化抗体将物种锚定在固定表面上。可以提前制备这种表面，并加以保存。
为了进行分析，在存在或不存在受试化合物的条件下，使固定化物种的配偶物和包被表面相接触。反应结束后，去除未反应的组分(如通过洗涤)，所形成的复合物仍将固定在固体表面上。通过多种方式检测锚定在固体表面上的复合物。之前的非固定化组分事先标记的情况下，测定到固定在表面上的标记，则说明形成了复合物。之前的非固定化组分未事先标记的情况下，使用间接标记检测锚定在表面上的复合物；如使用对之前的非固定化组分特异的标记抗体(可以使用标记的抗-Ig抗体对该抗体进行直接或间接标记)。根据加入反应组分的顺序，检测抑制复合物形成或破坏事先形成之复合物的受试化合物。
可替换的方案是，在存在或不存在受试化合物的条件下，在液相中进行反应，反应产物和未反应的组分相分离，检测复合物；如使用对一种结合组分特异的固定化抗体锚定溶液中形成的复合物，使用对其他配偶物特异的标记抗体来检测锚定的复合物。根据往液相中加入反应组分的顺序，检测抑制复合物形成或破坏事先形成之复合物的受试化合物。
在本发明的可替换实施方案中，使用纯合分析方法。在该方法中，制备Ob或ObR基团、儿茶酚胺或AR基团和相互作用的结合配偶物事先形成的复合物，其中Ob或ObR或其结合配偶物作有标记，但复合物的形成猝灭该标记所产生的信号(参见使用该方法进行免疫分析的U.S.Pat.No.4,109,496)。和事先形成的复合物中一个物种竞争并置换该物种的受试物质的加入在上述背景的基础上产生一个信号。通过这种方式，可以鉴定到破坏Ob或ObR/细胞内结合配偶物相互作用和/或儿茶酚胺或AR/细胞内结合配偶物相互作用的受试物质。
在一个具体的实施方案中，制备Ob、ObR或AR融合体用于固定化。例如，可以使用融合载体Pgex-5X-1使Ob、ObR或AR或肽段，如对应于ObR CD的肽段和谷胱苷肽-S-转移酶(GST)基因相融合，并使产生的融合蛋白中保留有其活性。使用本领域的常规方法来纯化相互作用的结合配偶物，并用于产生单克隆抗体。使用本领域的常规方法，用放射性同位素125I对该抗体进行标记。在杂合分析中，GST-ObR融合蛋白(或GST-AR融合蛋白)可以锚定在谷胱苷肽-琼脂糖凝胶珠上。在存在或不存在受试化合物的条件下加入相互作用的结合配偶物，使发生相互作用并结合。在反应期结束时，洗掉未结合的物质，往系统中加入标记的单克隆抗体，使之和复合组分相结合。通过测定和谷胱苷肽-琼脂糖珠相结合的放射性，检测Ob或ObR基因产物(或儿茶酚胺或AR基因产物)和反应性结合配偶物之间的相互作用。受试化合物对相互作用的成功抑制会降低测得的放射性。
可替换的方案是，可以在不存在固体谷胱苷肽-琼脂糖珠的溶液中，将GST-Ob/ObR融合蛋白和相互作用的结合配偶物混合在一起。可以在使物种相互作用的过程中或之后加入受试化合物。然后将该混合物加到谷胱苷肽-琼脂糖珠上，并洗去未结合的物质。进而加入标记的抗体，测定和谷胱苷肽-琼脂糖珠相结合的放射性，从而检测对Ob或ObR/结合配偶物相互作用的抑制程度。
在本发明的另一个实施方案中，采用同样的技术，使用相对应于Ob、ObR或AR结合结构域和/或相互作用或结合配偶物的肽段(结合配偶物是蛋白质的情况下)代替一个或两个全长蛋白。使用本领域中的多种常规方法来鉴定和分离结合位点。这些方法包括但不局限于诱变编码一种蛋白质的基因，在共免疫沉淀分析中筛选对结合的破坏。然后选择编码复合物中第二个物种之基因中的补偿性突变。对分别编码两个蛋白质的基因进行测序分析，表明对应于蛋白质区的突变参与了相互作用性结合。可替换的方案是，使用上述方法将一种蛋白质锚定在固体表面上，使之和标记的结合配偶物相互作用并与之结合，其中结合配偶物预先用蛋白水解酶，如胰蛋白酶处理。洗涤后，包含结合结构域的短的标记肽仍和固体物质相结合，可以加以分离，并通过氨基酸测序进行鉴定。另外，一旦获得了编码细胞内结合配偶物的基因，就可以构建短的基因片段，使之表达蛋白质肽段，进而检验其结合活性，纯化或合成。
例如，但并非加以限制，制备GST-Ob、-ObR或-AR融合蛋白，使之和谷胱苷肽琼脂糖珠相结合，如上所述将Ob、ObR或AR基因产物锚定在固体物质上，使用放射性同位素，如35S对相互作用的结合配偶物加以标记，使用蛋白水解酶，如胰蛋白酶进行切割。切割产物加入到锚定的GST-Ob、-ObR或-AR融合蛋白中，使它们相结合。洗去未结合的肽后，通过已知方法对代表细胞内结合蛋白结合结构域的标记结合物质加以洗脱，纯化和氨基酸序列分析。这样鉴定的肽可以合成，或使用重组DNA技术和适当的便利蛋白相融合。
5.3.4. 鉴定能够改善骨病之化合物的分析
检验化合物治疗骨病和改善骨病症状的能力，其中化合物包括但不局限于通过上面5.3.1至5.3.3中所述的分析技术鉴定到的化合物。上述的分析方法可以鉴定影响Ob、ObR或AR活性的化合物(如瘦素受体或肾上腺素能激动剂或拮抗剂)；和结合ObR或AR天然配体并中和配体活性的化合物；影响Ob、ObR或AR基因活性的化合物(通过影响Ob、ObR或AR基因表达，包括影响剪接、从而调节全长或截短形式Ob、ObR或AR表达的分子，如蛋白质或小的有机分子)。可替换的是，所述的分析还可以鉴定调节Ob通过血脑屏障的化合物。影响有Ob或ObR基因和/或基因产物参与的Ob或ObR信号传导通路中另一个步骤、并通过影响该途径调节Ob或ObR对骨病发生的作用的化合物的鉴定和使用属于本发明的范围。类似的，影响有AR基因和/或基因产物参与的肾上腺素信号传导通路中另一个步骤、并通过影响该途径调节儿茶酚胺对骨病发生的作用的化合物的鉴定和使用属于本发明的范围。这种化合物可以用作治疗骨病的治疗方法的一部分。
可以使用基于细胞的系统鉴定能够改善骨病的化合物。举例来说，这种细胞系统包括重组或非重组细胞，如表达Ob、ObR或AR基因的细胞系，如NIH3T3L1细胞系。另外，举例来说，对于ObR可以使用脉络膜丛细胞、下丘脑细胞、或来源于脉络膜丛或下丘脑的细胞系。另外，基因改造使表达功能性Ob或ObR并对天然Ob配体的活化产生应答的表达宿主细胞(如COS细胞、CHO、成纤维细胞)可以用作分析终点，其中的应答包括如测定到化学或表型改变、诱导另一个宿主细胞基因、离子流(如Ca++)改变、宿主细胞蛋白质的酪氨酸磷酸化等。
使用这种细胞系统时，可以使细胞和足够浓度的怀疑具有改善骨病的化合物接触一段时间，使接触的细胞中骨病得以改善。接触后，对细胞进行分析，如通过分析细胞裂解物中的Ob、ObR或AR mRNA转录物(如通过Northern分析)或细胞中表达的Ob、ObR或AR蛋白来测定Ob或ObR基因表达的改变；调控或调节Ob、ObR或AR基因表达的化合物是治疗的良好候选物。可替换的方案是，对细胞进行检验，确定是否将一个或多个骨病样细胞表型改变成了类似较正常或较野生的非骨病表型，或更有可能产生较低疾病症状发生率或严重性的表型。更进一步的是，可以分析ObR或AR是其中一部分的信号传导通路组分的表达和/或活性，ObR信号传导通路和/或肾上腺素信号传导通路自身的活性。
举例来说，接触后，可以和来源于未接触的对照细胞的裂解物相比，分析细胞裂解物中宿主细胞蛋白酪氨酸磷酸化的存在。这些分析系统中受试化合物抑制宿主细胞蛋白质酪氨酸磷酸化的能力说明受试化合物能够抑制ObR活化引发的信号传导。可以使用Western印迹分析方便地对细胞裂解物进行分析，即通过凝胶电泳分离宿主细胞蛋白，转移并使用抗磷酸化酪氨酸检测抗体(如用产生信号的化合物，如放射标记、荧光、酶等标记的抗磷酸化酪氨酸抗体)进行探测(参见Glenney et al.，1988，J.Immunol.Methods 109：277-285；Frackelton etal.，1983，Mol.Cell.Biol.3：1343-1352)。可替换的方案是，使用ELISA方法，其中使用对靶宿主细胞特异的锚定抗体将参与ObR信号传导通路的特定宿主细胞蛋白质固定，使用标记的抗磷酸酪氨酸抗体检测固定化宿主细胞蛋白的磷酸化与否(参见King et al.，King et al.，1993，Life Sciences 53：1465-1472)。在另一种方法中，测定位于ObR刺激的信号传导终点的离子流，如钙离子流。
另外，可以使用包括Ob、db和ob/db小鼠的动物骨病系统来鉴定能够改善骨病样症状的化合物。这种动物模型可以用作有效治疗骨病的药物、药剂、治疗和介入的受试对象。举例来说，动物模型和足够浓度的、怀疑具有改善骨病症状能力的化合物接触一段时间，使之能够改善接触动物中的骨病症状。通过评价和骨病，如骨质疏松相关的疾病的逆转检测动物对化合物的应答。至于介入，能够逆转骨病样症状方面的任意处理都可以看作是人类骨病治疗性介入的候选物。通过下面讨论的剂量效应曲线确定受试试剂的剂量。
5.4 调节Ob或ObR表达或活性的化合物
和Ob或ObR(包括但不局限于ObR的ECD或CD)相互作用(如与之结合)的化合物、和与Ob或ObR(包括但不局限于ObR的ECD或CD)相互作用的细胞内蛋白质发生相互作用(如与之结合)的化合物、干扰Ob或ObR和参与ObR介导之信号传导的跨膜蛋白或细胞内蛋白发生相互作用的化合物、调节Ob或ObR基因表达或调节Ob或ObR水平的化合物能够调节骨质水平。更具体地说，降低Ob或ObR水平、抑制Ob透过血脑屏障或抑制Ob和ObR结合的化合物将引起骨质增加。
这种化合物的例子包括瘦素和瘦素受体激动剂和拮抗剂。这里所用的瘦素受体拮抗剂指能够中和或妨碍或减弱瘦素受体作用或效应的因子。这种拮抗剂包括能够结合瘦素或结合瘦素受体的化合物。这种拮抗剂还包括中和、妨碍或减少瘦素受体输出，瘦素受体信号输出是瘦素与瘦素受体结合后瘦素信号传导通路中的细胞内步骤，即影响瘦素/瘦素受体信号传导、不发生在受体/配体相互作用水平上的下游事件。瘦素受体拮抗剂包括，但不局限于蛋白质、抗体、小的有机分子或碳水化合物，例如乙酰苯酚类化合物、特异性结合瘦素的抗体、特异性结合瘦素受体的抗体和包含可溶性瘦素受体多肽序列的化合物。
举例来说，瘦素拮抗剂还包括增加、抑制、阻断、取消或干扰瘦素与其受体或其细胞外结构域结合的试剂或药物；作为驱动瘦素生成或合成的拮抗剂的试剂和抑制瘦素和其受体相接触，如抑制瘦素透过血脑屏障的试剂。这种试剂可以是抑制或防止瘦素和其受体相互作用或瘦素生成的有机分子(参见美国专利No.5,866,547)。瘦素受体拮抗剂包括但不局限于能够特异性和瘦素相结合并防止瘦素和关联性受体相结合的抗瘦素抗体、受体分子和衍生物。
这里所用的瘦素受体激动剂指活化、诱导或增强瘦素受体作用或效应的因子。这种激动剂包括与瘦素结合或与瘦素受体结合的化合物。这种激动剂还包括活化、诱导或增加瘦素受体信号输出的化合物，瘦素受体信号输出是瘦素与瘦素受体结合后瘦素信号传导通路中的细胞内步骤，即影响瘦素/瘦素受体信号传导、不发生在受体/配体相互作用水平上的下游事件。瘦素受体激动剂包括，但不局限于蛋白质、抗体、小的有机分子或碳水化合物，例如瘦素、瘦素类似物、特异性结合并活化瘦素的抗体。
其他的Ob结合蛋白包括但不局限于内-α-胰蛋白酶抑制剂重链相关蛋白(IHRP)；α-2巨球蛋白；及特异性结合Ob并能够防止Ob和ObR结合的OB-BP1。特异性Ob结合蛋白进一步使Ob水平得以调节、固定并对结合型/游离型瘦素进行分析(参见美国专利No.5,919,902；Birkenmeier et al.，1998，Eur.J.Endocrin.，139：224-230；和Patel et al.，1999，J.Biol.Chem.，32：22729-22738)。美国专利No.5,830,450中还介绍了其他的Ob结合蛋白，如载脂蛋白。
ObR拮抗剂的例子有乙酰苯酚，已知它现在用作减肥药和抗糖尿病化合物。既然乙酰苯酚是ObR的拮抗剂，他们能够防止Ob和ObR的结合。因此，从本发明的角度考虑，化合物会有效地导致骨质增加。可以用作ObR拮抗剂的乙酰苯酚特异结构参见美国专利No.5,859,051。
能够用于骨病的诊断、药物筛选、临床试验监测和/或治疗的其他的ObR拮抗剂和激动剂和调节ObR基因表达或ObR活性的其他化合物参见Nos.5,972,621；5,874,535和5,912,123。
5.5. 调节儿茶酚胺或肾上腺素能受体表达或活性的化合物
和儿茶酚胺或肾上腺素能受体(包括但不局限于肾上腺素能受体的ECD或CD)相互作用(如与之结合)的化合物、和与儿茶酚胺或肾上腺素能受体(包括但不局限于肾上腺素能受体的ECD或CD)相互作用的细胞内蛋白质发生相互作用(如与之结合)的化合物、干扰儿茶酚胺或肾上腺素能受体和参与肾上腺素能受体介导之信号传导的跨膜蛋白或细胞内蛋白发生相互作用的化合物、调节儿茶酚胺或肾上腺素能受体基因表达或调节儿茶酚胺或肾上腺素能受体水平的化合物能够调节骨质水平。更具体地说，降低儿茶酚胺或肾上腺素能受体水平、抑制儿茶酚胺透过血脑屏障或抑制儿茶酚胺和肾上腺素能受体结合的化合物将引起骨质增加。
这种化合物的例子包括儿茶酚胺或肾上腺素能受体激动剂和拮抗剂。这里所用的肾上腺素能受体拮抗剂指能够中和或妨碍或减弱肾上腺素能受体作用或效应的因子。这种拮抗剂包括能够结合儿茶酚胺或肾上腺素能受体的化合物。这种拮抗剂还包括中和、妨碍或减少肾上腺素能受体输出，肾上腺素能受体信号输出是儿茶酚胺与肾上腺素能受体结合后儿茶酚胺信号传导通路中的细胞内步骤，即影响儿茶酚胺/肾上腺素能受体信号传导、不发生在受体/配体相互作用水平上的下游事件。肾上腺素能受体拮抗剂包括，但不局限于蛋白质、抗体、小的有机分子或碳水化合物，例如特异性结合肾上腺素能受体的抗体和包含可溶性肾上腺素能受体多肽序列的化合物。
儿茶酚胺是儿茶酚(1，2-二羟基苯)的含胺衍生物，包括但不局限于去甲肾上腺素和其甲基化衍生物肾上腺素。去甲肾上腺素由肾上腺素能神经末端产生，而肾上腺素由肾上腺髓质产生。
如整体在此引入作为参考的美国专利No.6,313,172的背景部分中所述，人肾上腺素能受体是完整细胞膜蛋白质，分为两大类，即α肾上腺素能受体和β肾上腺素能受体。这两类都能介导周围交感神经系统对儿茶酚胺结合的作用。肾上腺素能受体对于这些化合物的结合亲和力是分类的依据：α受体和去甲肾上腺素的结合比和肾上腺素的结合强，更比和合成的化合物异丙肾上腺素的结合强。β-受体能够逆转这些激素的优选结合亲和力。在许多组织中，功能性应答，如受体活化诱导的胃肌收缩就是由β-受体结合所诱导的应答。
因而，对来源于不同动物和组织的受体的药理学分析进一步突出并限定了α受体和β受体之间的功能性差异。结果，将α受体和β受体进一步分为α1、α2、β1、β2、β3亚型。
例如，β-肾上腺素能受体拮抗剂包括但不局限于艾丝洛尔、美托洛尔、阿替洛尔或醋丁洛尔(参见美国专利No.6,303,573，其整体在此引入作为参考)。可以用作肾上腺素能拮抗剂的试剂包括但不局限于(i)和α-肾上腺素能受体结合的交感神经阻断剂和(ii)耗尽递质的试剂。作为α受体拮抗剂的阻断试剂包括酚妥拉明、妥拉唑啉、哌唑嗪、特拉唑嗪、多沙唑嗪、曲马唑嗪、吲哚胺或不可逆的α受体拮抗剂，如苯氧苄胺或二苯扎明(dibenzamine)。作为递质耗竭剂的试剂包括胍乙啶、胍那决尔、利血平或甲基酪氨酸(metyrosine)(参见美国专利No.6,009,875，其整体在此引入作为参考)。
这里所用的肾上腺素能受体激动剂指活化、诱导或增强肾上腺素能受体作用或效应的因子。这种激动剂包括与儿茶酚胺结合或与肾上腺素能受体结合的化合物。这种激动剂还包括活化、诱导或增加肾上腺素能受体信号输出的化合物，肾上腺素能受体信号输出是儿茶酚胺与肾上腺素能受体结合后肾上腺素信号传导通路中的细胞内步骤，即影响儿茶酚胺/肾上腺素能受体信号传导、不发生在受体/配体相互作用水平上的下游事件。肾上腺素能受体激动剂包括，但不局限于蛋白质、抗体、小的有机分子或碳水化合物，例如儿茶酚胺和儿茶酚胺类似物。β肾上腺素能激动剂的例子包括但不局限于异丙肾上腺素、多巴胺和多巴酚丁胺(参见美国专利No.5,713,367，其整体在此引入作为参考)。
5.6. 调节NPY或NPY-R表达或活性的化合物
本发明还提供了单独NPY和NPY受体激动剂和拮抗剂或和其他上述调节剂联合来调节在骨上的瘦素效应和/或交感神经紧张性的用途。
和NPY或NPY-R(包括但不局限于NPY-R的ECD或CD)相互作用(如与之结合)的化合物、和与NPY或NPY-R(包括但不局限于NPY-R的ECD或CD)相互作用的细胞内蛋白质发生相互作用(如与之结合)的化合物、干扰NPY或NPY-R和参与NPY-R介导之信号传导的跨膜蛋白或细胞内蛋白发生相互作用的化合物、调节NPY或NPY-R基因表达或调节NPY或NPY-R水平的化合物能够调节骨质水平。更具体地说，降低NPY或NPY-R水平、抑制NPY胺透过血脑屏障或抑制NPY或NPY-R结合的化合物将引起骨质增加。
这种化合物的例子包括NPY或NPY-R激动剂和拮抗剂。这里所用的NPY受体拮抗剂指能够中和或妨碍或减弱NPY受体作用或效应的因子。这种拮抗剂包括能够结合NPY或NPY受体的化合物。这种拮抗剂还包括中和、妨碍或减少NPY输出的化合物，NPY受体信号输出是NPY和NPY受体结合后NPY信号传导通路中的细胞内步骤，即影响NPY/NPY受体信号传导、不发生在受体/配体相互作用水平上的下游事件。NPY受体拮抗剂包括，但不局限于蛋白质、抗体、小的有机分子或碳水化合物，例如乙酰苯酚类化合物、特异性结合NPY的抗体、特异性结合NPY受体的抗体和包含可溶性NPY受体多肽序列的化合物。
举例来说，NPY拮抗剂还包括降低、抑制、阻断、取消或干扰NPY与其受体或其细胞外结构域结合的试剂或药物；作为驱动NPY生成或合成的拮抗剂的试剂和抑制NPY和其受体相接触，如抑制NPY透过血脑屏障的试剂。这种试剂可以是抑制或防止NPY和其受体相互作用或NPY生成的任意有机分子。
这里所用的NPY受体激动剂指活化、诱导或增强NPY受体作用或效应的因子。这种激动剂包括与NPY结合或与NPY受体结合的化合物。其他的NPY激动剂和类似物包括美国专利No.5,328,899中所述化合物。这种激动剂还包括活化、诱导或增加NPY受体信号输出的化合物，NPY受体信号输出是NPY与NPY受体结合后NPY信号传导通路中的细胞内步骤，即影响NPY/NPY受体信号传导、不发生在受体/配体相互作用水平上的下游事件。NPY受体激动剂包括，但不局限于蛋白质、抗体、小的有机分子或碳水化合物，例如NPY、NPY类似物、特异性结合并活化NPY的抗体。
已经介绍了多种NPY拮抗剂。例如，美国专利No.5,972,888中介绍了作为NPY拮抗剂的多种化合物，这些化合物包括但并不局限于萘、苯并呋喃、苯并噻吩和吲哚；雷洛昔芬(raloxifene)；3-(4-甲氧苯基)-4-[4-(2-吡咯烷-1-基乙氧基)苯甲酰基]-1，2-二氢萘，柠檬酸盐；3-苯基-4-[4-(2-吡咯烷-1-基乙氧基)苯甲酰基]-7-甲氧基-1，2-二氢萘；3-苯基-4-[4-(2-吡咯烷-1-基乙氧基)苯甲酰基]-1，2-二氢萘；1-[4-(2-吡咯烷-1-基乙氧基)苯甲酰基]-2-苯基萘，柠檬酸盐；3-(4-甲氧苯基)-4-[4-(2-哌啶-1-基)乙氧基]苯甲酰基]-1，2-二氢萘，柠檬酸盐；3-(4-甲氧苯基)-4-[4-(2-二甲基氨基乙氧基)苯甲酰基]-1，2-二氢萘，柠檬酸盐；3-(4-羟基苯基)-4-[4-(2-吡咯烷-1-基)乙氧基]苯甲酰基]-1，2-二氢萘，甲磺酸盐；3-(4-甲氧苯基)-4-[4-(2-六亚甲基亚氨-1-基)苯甲酰基]-1，2-二氢萘，甲磺酸盐；3-(4-甲氧苯基)-4-[4-(2-哌啶-1-)乙氧基]苯甲酰基]-1，2-二氢萘，甲磺酸盐；3-(4-甲氧苯基)-4-(4-二乙氨基乙氧苯甲酰基)-1，2-二氢萘，甲磺酸盐；3-(4-甲氧苯基)-4-(4-二异丙氨基乙氧苯甲酰基)-1，2-二氢萘，甲磺酸盐；3-羟基-4-[4-(2-吡咯烷-1-基)乙氧基]苯甲酰基]-1，2-二氢萘，钠盐；2-(4-甲氧苯基)-1-[4-(2-吡咯烷-1-基)乙氧基]苯甲酰基]萘，甲磺酸盐；3-(4-甲氧苯基)-4-[4-(2-哌啶-1-基)乙氧基]苯甲酰基]-7-甲氧基-1，2-二氢萘，甲磺酸盐；3-(4-甲氧苯基)-4-[4-(2-二甲基氨基乙氧基)苯甲酰基]-1，2-二氢萘，2-羟-1，2，3-丙烷三羧酸盐；3-(4-甲氧苯基)-4-[4-[2-(N-甲基-1-吡咯烷鎓)乙氧基]苯甲酰基]-1，2-二氢萘，碘盐；和3-(4-甲氧苯基)-4-[4-(2-吡咯烷-1-基)乙氧基]-苯甲酰基]-1，2-二氢萘，甲磺酸盐。
类似地，已经鉴定到了许多NPY-R拮抗剂。这些拮抗剂的例子包括但不局限于α-烷氧和α-硫烷氧酰胺组合物(参见美国专利No.5,939,462)；二氢吡啶化合物(参见美国专利Nos.5,554,621、6,001,836、5,668,151和5,635,503)；取代的苄胺衍生物(参见美国专利5,985,873、5,962,455和5,900,415)；二氢嘧啶酮衍生物(参见美国专利No.5,889,016)；naphthimidazolyl衍生物(参见美国专利No.5,776,931)；二甲磺酸盐(参见美国专利No.5,914,329)；和取代的苯并呋喃、苯并噻吩或吲哚(参见美国专利No.5,663,192)。美国专利Nos.5,567,714、5,504,094、5,670,482、5,989,920和5,827,853、5,985,616中还公开了其他的NPY-R拮抗剂。
5.7. 调节CNTF或CNTF受体表达或活性的化合物
本发明还提供了单独CNTF和CNTF受体激动剂和拮抗剂或和其他上述调节剂联合来调节在骨上的瘦素效应和/或交感神经紧张性的用途。
和CNTF或CNTF受体(包括但不局限于CNTF受体的ECD或CD)相互作用(如与之结合)的化合物、和与CNTF或CNTF受体(包括但不局限于CNTF受体的TM和CD)相互作用的细胞内蛋白质发生相互作用(如与之结合)的化合物、干扰CNTF或CNTF受体和参与CNTF介导之信号传导的跨膜蛋白或细胞内蛋白发生相互作用的化合物、调节CNTF或CNTF受体基因表达或调节CNTF或CNTF受体水平的化合物能够调节骨质水平。更具体地说，降低CNTF或CNTF受体水平、抑制CNTF或CNTF受体结合的化合物将引起骨质增加。
这种化合物的例子包括CNTF或CNTF受体激动剂和拮抗剂。这里所用的NPY受体拮抗剂指能够中和或妨碍或减弱CNTF受体作用或效应的因子。这种拮抗剂包括能够结合CNTF或CNTF受体的化合物。这种拮抗剂还包括中和、妨碍或减少CNTF输出的化合物，CNTF受体信号输出是CNTF和CNTF受体结合后CNTF信号传导通路中的细胞内步骤，即影响CNTF/CNTF受体信号传导、不发生在受体/配体相互作用水平上的下游事件。CNTF受体拮抗剂包括，但不局限于蛋白质、抗体、小的有机分子或碳水化合物，例如包括F152S突变型CNTF或K155A突变型CNTF的突变型CNTF分子、特异性结合CNTF的抗体、特异性结合CNTF受体的抗体和包含可溶性CNTF受体多肽序列的化合物。
举例来说，CNTF拮抗剂还包括降低、抑制、阻断、取消或干扰NPY与其受体或其细胞外结构域结合的试剂或药物；作为驱动CNTF生成或合成的拮抗剂的试剂和抑制CNTF和其受体相接触的试剂。这种试剂可以是抑制或防止CNTF和其受体相互作用或CNTF生成的任意有机分子。
CNTF受体拮抗剂还包括干扰CNTF受体功能的突变型CNTF分子(参见美国专利No.5,846,935)。例如CNTF原始序列的155位赖氨酸残基的突变产生一种CNTF拮抗剂(参见Inoue et al.，1997，J.Neurochem.69：95-101；DiMarco et al.，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA93：9247-52)。美国专利No.5,723,120要求保护了在氨基酸154-163区域发生突变的CNTF分子。CNTF受体拮抗剂还包括特异性结合CNTF并抑制CNTF和其关联性受体相结合的抗CNTF抗体、受体分子和衍生物。
CNTF受体拮抗剂包括同样抑制CNTF受体功能的IL-6受体功能拮抗剂，如基于GM-CSF结构的gp130抑制剂和/或基于IL-6结构的gp130抑制剂(参见美国专利Nos.5,914,106、5,891,998、5,849,283、5,789,552、5,591,827和5,723,120)。CNTF受体拮抗剂包括和编码CNTF受体多肽的多聚核苷酸互补的反义寡核苷酸(参见美国专利Nos.5,747,470、5,674,995和5,747,470)。其他的拮抗剂还包括来源于CNTF受体多肽的可溶性结构域或细胞外结构域的拮抗剂(参见美国专利No.5,884,099和美国专利No.5,470,952)。最后，拮抗剂包括CNTF受体多肽的抗体(参见美国专利Nos.5,892,003、5,866,689和5,717,073)。
CNTF受体拮抗剂还包括抑制CNTF活化的下游信号传导级联反应、影响CNTF活性的化合物。例如，丝氨酸激酶mTOR抑制剂雷帕霉素还抑制CNTF诱导的STAT3的磷酸化(参见Yokogami et al.，2000，Current Biology 10：47-50)。SOCS-3是CNTF信号传导的负调节因子。丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂H7抑制由CNTF诱导的、经CyRE介导的转录(参见Symes et al.，1997，J.Biol.Chem.272：9648-9654)。蛋白酶体抑制剂MG132和佛波酯调节磷酸化的STAT3水平(参见Malek et al.，1999，Cytokine 11：192-199)。
CNTF受体拮抗剂还包括干扰和/或防止CNTF/CNTF受体复合物形成的分子。例如，结合CNTF的分子或结合CNTF受体的一个组分的分子也能够防止CNTF/CNTF受体复合物形成。这种分子的例子包括但不局限于识别一个或多个CNTF受体亚基的抗体、美国专利Nos.5,717,073和5,886,689中所述的分子和该领域的技术人员已知的、防止CNTF/CNTF受体复合物形成的其他分子。
这里所用的CNTF受体激动剂指活化、诱导或增强CNTF受体作用或效应的因子。这种激动剂包括与CNTF结合或与CNTF受体结合的化合物。这种激动剂还包括活化、诱导或增加CNTF受体信号输出的化合物，CNTF受体信号输出是CNTF与CNTF受体结合后CNTF信号传导通路中的细胞内步骤，即影响CNTF/CNTF受体信号传导、不发生在受体/配体相互作用水平上的下游事件。CNTF受体激动剂包括，但不局限于蛋白质、抗体、小的有机分子或碳水化合物，例如CNTF、CNTF类似物、特异性结合并活化CNTF的抗体。另外，CNTF激动剂包括增加CNTF活性的突变型CNTF分子，如DH-CNTF，它是CNTF的超激动性变体，其中Ser166突变成了Asp，Gln167突变成了His(参见Saggio et al.，1995，EMBO J.14：3045-3054)。CNTF受体激动剂还包括影响CNTF功能下游信号传导事件的化合物。例如SOCS-3的抑制剂可以增强CNTF信号传导(参见Bjorbaek，1999，Endocrinology 140：2035-2043)。
其他的CNTF结合蛋白包括但不局限于特异性结合CNTF的抗体、可溶性CNTFRα(CNTFRα缺失CNTF的糖基化-磷酸肌醇锚定位点)、结合CNTF的其他分子，如美国专利No.5,470,952中介绍的分子和本领域的技术人员所已知的、特异性结合CNTF、从而防止CNTF和CNTF受体相结合的分子。特异性CNTF结合蛋白进一步使得游离CNTF水平调节、固定和结合态/游离态CNTF的分析成为可能。
能够用于骨病的诊断、药物筛选、临床试验监测和/或治疗的其他CNTF受体的拮抗剂和激动剂，以及能够调节CNTF受体基因表达或CNTF受体活性的其他化合物参见美国专利No.5,846,935；Inoueet al.，1997，J.Neurochem.69：95-101；DiMarco et al.，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：9247-52；美国专利No.5,723,120和Saggio，1995，EMBO J 14：3045-3054。
5.8. 治疗或预防骨病的方法
可以根据本发明治疗和/或预防的骨病包括和相应的非发病骨相比骨质减轻的骨病，包括但不局限于骨质疏松、骨质稀少、佩吉特症、骨软化症和肾性骨营养不良。可以根据本发明治疗和/或预防的骨病还包括和相应的非发病骨相比骨质增多的骨病，包括但不局限于骨骼石化症、骨硬化和骨软骨病。
低骨质疾病的一个关键参数是骨的易折性。由于不能够直接测定骨的易折性，骨质或骨矿物密度的测定可以作为骨易折程度的指标。虽然低骨质和骨易折性增加之间有联系，但骨的几何学和小梁构造的改变有时也会导致二者之间的不一致性。通常来说，使用骨质(或骨密度或骨体积)和骨几何学来获得骨表观的静态图，本领域的技术人员可以从该图获得骨的机制特征(如强度、刚度和硬度)，并预测发生骨折的危险性。在动物模型中，组织学分析可以分析骨质、几何学特征和骨形成速度。难以对骨吸收速度进行分析，这是因为对破骨细胞数目或表面面积进行计数并不能代表破骨细胞活性。可以直接测定骨的机械特征，包括但不局限于承受压力和弯曲的强度、硬度和最大承重。使用包括但不局限于单光子和双光子吸收测定法(SPA和DPA)、单X-射线和双X-射线吸收测定法(SXA和DXA)、超声(US)和磁共振成像(MRI)(参见Guglielmi et al.，1995，Eur Radiol.5(2)：129-39)。
本发明和涉及不和骨质相关的骨病。例如，本发明包括但不局限于改变矿物质含量的疾病、异常基质化合物(如胶原)的疾病或异常局部增生的疾病。
本发明的一个目的是通过调节交感神经系统通路来治疗、诊断和/或预防骨病。根据本发明的一个方面，存在治疗和预防骨质疏松的一个或多个症状的方法，该方法包括施用β-肾上腺素能受体拮抗剂。该方面的一个具体实施方案包括但不局限于进一步将瘦素受体拮抗剂和β-肾上腺素能受体拮抗剂联用。在另一个实施方案中，存在治疗和预防骨骼石化症和骨硬化的一个或多个症状的方法，该方法包括施用β-肾上腺素能受体激动剂。该方面的一个具体实施方案包括但不局限于进一步将瘦素受体激动剂和β-肾上腺素能受体激动剂联用。
本发明的另一个目的涉及调节瘦素对骨的作用的方法，该方法包括施用治疗有效量的药物组合物，使之改变交感神经紧张性。本发明的另一个方面涉及调节骨质的方法，该方法包括施用治疗有效量的药物组合物，使之改变交感神经紧张性，从而调节骨质。药物组合物的具体实施方案包括，但不局限于瘦素拮抗剂、瘦素激动剂、交感神经系统拮抗剂、交感神经系统激动剂及其组合。
本发明的另一个目的涉及治疗或预防骨质疏松的一个或多个症状的方法，该方法包括施用治疗有效量的药物组合物，通过改变交感神经紧张性调节瘦素效应。药物组合物的具体实施方案包括，但不局限于瘦素拮抗剂、瘦素激动剂、交感神经系统拮抗剂、交感神经系统激动剂及其组合。
本发明的一个方面是治疗骨病的方法，该方法包括：向需要所述治疗的哺乳动物体内施用治疗有效量的、能够降低血清中瘦素水平的化合物，其中骨病是和相应的非发病骨相比骨质减轻的骨病。一些化合物和方法的具体实施方案包括，但不局限于抑制或降低瘦素合成或增加瘦素降解的实施方案。这些化合物包括反义序列、核酶或瘦素编码多肽的三联螺旋序列。
根据本发明的另一个方面，存在治疗骨病的方法，该方法包括：向需要所述治疗的哺乳动物体内施用治疗有效量的、能够降低脑脊液中瘦素水平的化合物，其中骨病是和相应的非发病骨相比骨质减轻的骨病。一些化合物和方法的具体实施方案包括，但不局限于抑制或降低瘦素合成或增加瘦素降解以及和血液中瘦素相结合之化合物的实施方案。
本发明方法的具体实施方案包括，例如，治疗骨病的方法，该方法包括向需要所述治疗的哺乳动物体内施用治疗有效量的化合物，其中骨病是和相应的非发病骨相比骨质减轻的骨病，其中的化合物选自能够和血液中瘦素相结合的化合物，这些化合物包括但不局限于特异性结合瘦素的抗体、可溶性瘦素受体多肽、间-α-胰蛋白酶抑制剂重链相关蛋白和α2-巨球蛋白。
根据本发明的另一个方面，存在治疗骨病的方法，该方法包括向所需所述治疗的哺乳动物体内施用治疗有效量的、降低磷酸化Stat3多肽水平的化合物，其中骨病是和相应的非发病骨相比骨质减轻的骨病。一些化合物和方法的具体实施方案包括，但不局限于抑制或降低瘦素合成或增加瘦素降解；和血液中瘦素相结合的化合物；瘦素受体拮抗性化合物，如乙酰苯酚化合物、特异性结合瘦素的抗体、特异性结合瘦素受体的抗体和包括可溶性瘦素受体多肽序列的化合物。
根据本发明的另一个方面，存在治疗或预防骨病的方法，该方法包括向所需所述治疗或预防的哺乳动物体内施用治疗有效量的、抑制多巴胺β羟化酶(“DBH”)的化合物，该酶是将多巴胺转化为去甲肾上腺素所必需的。一些化合物和方法的具体实施方案包括，但不局限于抑制DBH酶活性、DBH基因表达、特异性结合DBH的抗体和参与去甲肾上腺素合成途径的化合物。
根据本发明的另一个方面，存在治疗骨病的方法，该方法包括：向需要所述治疗的哺乳动物体内施用治疗有效量的、能够降低下丘脑中瘦素受体水平的化合物，其中骨病是和相应的非发病骨相比骨质减轻的骨病。一些化合物和方法的具体实施方案包括，但不局限于抑制或降低瘦素受体合成或增加瘦素受体降解的实施方案。这些化合物包括反义序列、核酶或瘦素编码多肽的三联螺旋序列。
降低血清或脑脊液中瘦素水平的化合物是下列分析中能够降低瘦素水平的化合物：使化合物和来源于瘦素表达细胞系，优选NIH3T3L1细胞系的细胞相接触，测定瘦素表达和/或合成和不存在化合物的条件下细胞系所表现的水平是否有所降低。使用标准分析方法，如Northern印迹分析来测定瘦素表达水平，使用Western印迹分析来测定瘦素合成水平。可替换的一种分析方法包括将施用化合物之前或之后、接受骨病治疗的哺乳动物体内的瘦素水平相比较，如果瘦素水平降低，则化合物是能够降低瘦素水平的化合物。类似的，增加血清或脑脊液中瘦素水平的化合物是在这种分析中增加瘦素水平的化合物。
降低靶细胞中瘦素信号传导下游效应因子磷酸化Stat3多肽水平(Tartaglia et al.，1995，Cell 83，1263-1271；Baumann et al.，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：8374-8378；Ghilardi et al.，1996，Proc Natl AcadSci USA 93：6231-6235；Vaisse et al.，1996，Nat Genet 14，95-97)的化合物是能够在下列分析中降低磷酸化Stat3的化合物：使瘦素多肽及化合物和表达功能性瘦素受体的细胞相接触，测定细胞中磷酸化Stat3多肽的水平。为了测定磷酸化Stat3多肽的水平，可以将细胞裂解，并进行适当的分析(如Western印迹分析)。如果磷酸化Stat3多肽水平和不存在化合物的条件下细胞系所表现的水平相比降低，则化合物是能够降低磷酸化Stat3多肽水平的化合物。类似的，增加血清或脑脊液中瘦素水平的化合物是在这种分析中增加磷酸化Stat3多肽水平的化合物。
本发明中还提供了抑制多巴胺β羟化酶(“DBH”)活性的化合物，该酶是将多巴胺转化为去甲肾上腺素所必需的。使用本领域已知的体外分析方法，通过测定DBH将酪胺催化形成酚乙醇胺的活性及受试化合物的抑制作用，确定受试化合物的多巴胺β羟化酶抑制剂特性。还可以使用本领域已知的体外分析方法，通过测定多巴胺和去甲肾上腺素的组织浓度和受试化合物的效应，确定受试化合物的多巴胺-羟化酶抑制剂特性(参见B.A.Berkowitz et al.，1988 J.Pharm.ExpEher.245：850-857)。这些化合物和方法的特定实施方案包括但不局限于抑制DBH酶活性、DBH基因表达、特异性结合DBH的抗体和参与去甲肾上腺素合成途径的化合物。已知的DBH抑制剂包括但不局限于镰刀菌酸；双硫仑(disulfiram)；3-苯丙精胺和5-(4’-氯丁基)-吡啶甲酸；氨基甲酸二乙基二硫酯；β-氯苯乙胺；4-羟苯氰；2-卤-3-(对羟苯基)-1-丙烯；1-苯基-1-丙烯；2-苯基烯丙胺；2-(2-噻吩基)烯丙胺和其衍生物，如2-硫苯-2-(2-噻吩基)烯丙胺；3-苯丙精胺、1-苯基-1(氨乙基)乙烯和其衍生物，如N-(三氟乙酰基)苯基-1(氨乙基)乙烯；和5-吡啶甲酸衍生物，如5-(4’-氯丁基)-吡啶甲酸和其他烷基或卤烷基取代的吡啶甲酸，比如C1～C6烷基可选性被一个或多个卤原子取代。这些化合物在美国专利No.5,741,503中作有介绍，其整体在此引入作为参考。
如果所施用的量使接受者哺乳动物发生所需的生理变化，如增加或降低疾病状态下相应骨骨质；也就是说，能够治疗，即将骨质调节至和非疾病状态下相应非发病骨(同一类型的相应骨，如长骨、脊椎骨等)较为类似的程度，则可以说施用了“治疗有效量”的试剂。这些方法中，相应的非发病骨指和接受治疗的骨类型相同的骨(如相应的脊椎骨和长骨)，使用本领域的技术人员已知的和上文所述的标准技术来测定骨质，这些技术包括X射线、DEXA和经典的组织学分析和骨质测定方法。
可用作本发明方法一部分的化合物是上述的化合物，例如各节和这里所给出的化合物，以及通过各节和这里所给出的技术鉴定到的化合物。
下文中详述了能够用作本发明治疗和诊断方法一部分的特定技术和方法。
5.8.1. 通过增加骨质抑制Ob或ObR表达、水平或活性以治疗骨 病
可以使用中和、减缓或抑制Ob或ObR表达(转录或翻译)、水平或活性的任意方法使骨质增加，来治疗或预防骨病，其中骨病特征是和相应的非发病骨相比骨质增加。这些方法可用于治疗或预防骨病，如骨质疏松、骨质稀少、错误骨形成或吸收、佩吉特病、骨转移、软骨病和肾性骨营养不良。这些方法可用于治疗涉及骨折和断骨的疾病状态。
例如，可以通过施用化合物，如可溶性肽、蛋白质、融合蛋白或结合并“中和”循环Ob的抗体(包括抗独特型抗体)、ObR的天然配体来增加骨质。类似的，可溶性肽、蛋白质、融合蛋白或抗体(包括抗独特型抗体)之类的化合物可用于增加骨质。为了这一目的，可以使用对应于ObR的ECD的肽、ObR的可溶性缺失突变体或这些ObR结构域之一或和其他多肽(如IgFc多肽)相融合的突变体。可替换的方案是，使用模拟ObR ECD并中和Ob的抗独特型抗体或抗独特型抗体的Fab片段。可替换的方案是，还可以使用能够抑制ObR同源二聚化、从而降低对瘦素受体亲和力的化合物(参见Devos et al.，1997，J.Biol.Chem.，272：18304-18310)。对于治疗来说，这种ObR肽、蛋白质、融合蛋白、抗独特型抗体或Fab以治疗有效水平施用到需要治疗的受试者体内。对于预防来说，这种ObR肽、蛋白质、融合蛋白、抗独特型抗体或Fab以一定的浓度施用到具有发生骨病危险性的受试者体内一段时间，使之能够预防骨病。
在中和循环Ob的一个可替换实施方案中，将经过遗传改造、能够表达这种可溶性的或分泌形式的ObR的细胞施用到患者体内，它们作为体内的“生物反应器”，持续性地供应Ob中和性蛋白。这种细胞从患者体内或MHC相容性的供体获得，包括但不局限于成纤维细胞、血细胞(如淋巴细胞)、脂肪细胞、肌细胞、内皮细胞等。使用重组DNA技术，通过转导(使用病毒载体，优选将转基因整合到细胞基因组中的载体)或转染方法将ObR ECD或ObR-Ig融合蛋白的编码序列导入细胞，对细胞进行体外遗传改造，其中转导或转染方法包括但不局限于使用质粒、粘粒、YAC、电穿孔、脂质体等。ObR编码序列可以置于强组成型启动子或诱导型启动子或启动子/增强子的控制之下，以便获得ObR肽或融合蛋白的表达和分泌。以系统施用方式施用，如使之进入循环中、腹腔施用、脉络膜丛或下丘脑部位施用将表达并分泌所需ObR产物的改造细胞导入患者体内。可替换的方案是，细胞掺入基质中并包埋在体内，如遗传改造的成纤维细胞可以作为皮肤移植物的一部分进行包埋；遗传改造的内皮细胞可以作为血管移植物的一部分进行包埋(参见美国专利Nos.5,399,349和5,460,959，其整体在此引入作为参考)。
当要施用的细胞是非自身细胞时，使用防止发生抗导入细胞的宿主免疫应答的熟知技术施用这些细胞。例如，以胶囊形式导入细胞，使组分和直接细胞外环境发生交换的同时，导入的细胞不能够被宿主免疫系统所识别。
在一个可替换的实施方案中，设计骨病疗法来降低内源性ObR或ObR基因表达水平，如使用反义或核酶方法抑制并防止Ob或ObRmRNA转录物的翻译；使用三联螺旋方法抑制Ob或ObR基因的转录；或使用靶向同源重组方法灭活或“敲除”Ob或ObR基因或其内源性启动子。因为ObR基因在大脑，包括脉络膜丛和下丘脑中表达，优选能够透过血脑屏障的传送技术(参见PCT申请WO89/10134，其整体在此引入作为参考)。可替换的方案是，这里所述的反义、核酶或DNA构建体可以直接施用到包含靶细胞的部位，如脉络膜丛、下丘脑、脂肪组织等。
反义方法包括设计和Ob或ObR mRNA相互补的寡核苷酸(DNA或RNA)。反义寡核苷酸和互补性Ob或ObR mRNA转录物相结合，阻止翻译。虽然优选绝对互补性，但并不是必须的。这里所述的、和RNA的一部分“互补”的序列指具有足够互补性、能够和RNA相杂交、形成稳定二联体的序列；在使用双链反义核酸的情况下，检验二联体DNA中的一条链，或分析三联体的形成。杂交能力依赖于互补程度和反义核酸的长度。通常，杂交的核酸越长，和RNA错配的碱基越多，但仍形成稳定的二联体(有时会形成三联体)。本领域的技术人员可以通过用来测定杂交复合物融解点的标准方法来确定错配的耐受程度。
熟练的技术人员认识到：可以通过设计瘦素或瘦素受体基因控制区，如启动子、增强子和内含子的反义分子，以及这些基因编码区的反义分子。这种序列在这里分别指编码瘦素的多聚核苷酸或瘦编码素受体的多聚核苷酸。
优选来源于转录起始位点，如先导序列-10和+10之间的区域。和信使的5’端互补的寡核苷酸通常能够最有效地阻止翻译，其中信使的5’端可以是到AUG起始密码子位置并包括AUG起始密码子的5’非翻译序列。但是，最近研究表明，和mRNA的3’非翻译序列互补的序列也能够有效地抑制mRNA的翻译(参见Wagner，1994，Nature372：333-335)。和mRNA的5’非翻译区互补的寡核苷酸包括AUG起始密码子的互补物。和mRNA编码区互补的反义寡核苷酸是翻译的较弱抑制剂，但也可用于本发明。无论是和Ob或ObR mRNA的5’、3’还是编码区杂交，反义核酸都应至少长为6个核苷酸，优选长6至约50个核苷酸。在特定的方面中，寡核苷酸是至少核苷酸，至少17个核苷酸，至少25个核苷酸或至少50个核苷酸。
不管靶序列如何，优选首先进行体外研究对反义寡核苷酸抑制基因表达的能力进行定量。优选的是，这些研究使用能够区分反义基因抑制和寡核苷酸非特异性生物效应的对照。还优选的是，这些研究将靶RNA或蛋白质的水平和内部对照RNA或蛋白质相比较。另外，还预想将使用反义寡核苷酸获得的结果和使用对照寡核苷酸获得的结果相比较。优选的是，对照寡核苷酸长度和受试寡核苷酸大致相同，寡核苷酸的核苷酸序列和反义序列不同，其中反义序列仅仅是阻止和靶序列的特异性杂交所必需的。
寡核苷酸可以是DNA或RNA或嵌合混合物或衍生物或其修饰版本，可以是单链的或双链的。举例来说，可以在碱基、糖基或磷酸骨架上对寡核苷酸进行修饰，以提高分子、杂交作用等的稳定性。寡核苷酸可以包括其他附基，如肽(对于体内靶向宿主细胞受体来说)或促进跨过细胞膜(参见Letsinger et al.，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86：6553-6656和Lemaitre et al.，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84：648-652；PCT申请No..WO88/09810)或血脑屏障(参见PCT申请WO89/10134)的试剂、引发杂交的切割试剂(参见Krol et al.，1988，BioTechniques 6：958-976)或嵌入试剂(参见Zon，1988，Pharm.Res.5：539-549)。为了这一目的，寡核苷酸可以和其他分子相偶联，这些分子包括肽、杂交引发的交联试剂、转运试剂、杂交引发的切割试剂等。
反义寡核苷酸可以包括至少一个修饰碱基，修饰碱基选自：5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5(羧羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基-2-胸腺嘧啶、5-羧甲基氨甲基-2-尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基queosine、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨甲尿嘧啶、5-甲氧基氨甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基queosine、5’-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸(oxyacetic acid)(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、queosine、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp)w和2，6-二氨基嘌呤。
反义寡核苷酸可以包括至少一种修饰的糖基，选自但不局限于阿拉伯糖、2-氟阿拉伯糖、木酮糖和己糖。
在另一个实施方案中，反义寡核苷酸包括至少一种修饰的磷酸骨架，选自硫代磷酸酯(phosphorothioate)、二硫代磷酸酯、硫代磷酰胺、磷酰胺、磷二酰胺、甲基磷酸酯、磷酸三烷基酯、formacetal或其类似物。
在另一个实施方案中，反义核苷酸是α-氨基端基寡核苷酸。α-氨基端基寡核苷酸和互补RNA形成特异性的双链杂合体，和通常的β-单位相反，两条链彼此平行(Gautier et al.，1987，Nucl.Acids.Res.15：6625-6641)。寡核苷酸是2’-对甲基核糖核苷酸(Inoue et al.，1987，Nucl.Acid.Res.15：6131-6148)或嵌合RNA-DNA类似物(Inoue et al.，1987，FEBS Lett.215：327-330)。
可以通过本领域中已知的方法来合成本发明的寡核苷酸，如使用自动化的DNA合成仪(如购自Biosearch，Applied Biosystems等)。例如，可以通过Stein et al.，1988，Nucl.Acids Res.16：3206的方法来合成硫代磷酸酯的寡核苷酸。使用受控孔玻璃聚合物支持物来制备甲基化磷酸寡核苷酸(Sarin et al.，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：7448-7451)。
当可以使用和Ob或ObR编码区序列互补的反义核苷酸时，最优选使用和转录的非翻译区相互补的反义核苷酸。例如，可以根据本发明使用具有以下序列的ObR编码区反义寡核苷酸。
(a)5′-CATCTTACTTCAGAGAA-3′(SEQ ID NO：1)
(b)5′-CATCTTACTTCAGAGAAGTACAC-3′(SEQ ID NO：2)
(c)5′-CATCTTACTTCAGAGAAGTACACCCATAA-3′(SEQ ID NO：3)
(d)5′-CATCTTACTTCAGAGAAGTACACCCATAATCCTCT-3′(SEQ ID NO：4)
(e)5′-AATCATCTTACTTCAGAGAAGTACACCCATAATCC-3′(SEQ ID NO：5)
(f)5′-CTTACTTCAGAGAAGTACACCCATAATCC-3′(SEQ ID NO：6)
(g)5′-TCAGAGAAGTACACCCATAATCC-3′(SEQ ID NO：7)
(h)5′-AAGTACACCCATAATCC-3′(SEQ ID NO：8)
可以在体内将反义分子传送到表达Ob或ObR的细胞中。已经建立了许多方法将反义DNA或RNA传送到细胞中；比如，可以直接将反义分子注射到组织部位，或系统施用靶向所需细胞的修饰反义分子(连接在特异性和靶细胞表面表达的受体或抗原相结合的肽或抗体上的反义分子)。
使细胞内反义分子浓度足够能抑制内源性mRNA翻译的优选方法使用重组DNA构建体，其中反义寡核苷酸位于强pol III或pol II启动子的控制之下。使用这种构建体转染患者体内的靶细胞会导致足量的单链RNA转录，并和内源性的Ob或ObR转录物形成互补碱基对，进而抑制Ob或ObR mRNA的翻译。例如，可以体内导入载体，使之被细胞吸收，并指导反义RNA的转录。这种载体可以是游离的或染色体整合的，前提是它可以转录产生所需的反义RNA。可以通过本领域中标准的重组DNA技术来构建这种载体。载体可以是质粒、病毒或本领域中已知的、能够在哺乳动物中复制并表达的其他载体。本领域中已知的、在哺乳动物，优选人细胞中起作用的任意启动子驱动编码反义RNA的序列的表达。这种启动子可以是诱导型或组成型的。这种启动子包括但不局限于：SV40早期启动子区域(Bernoist &Chambon，1981，Nature 290：304-310)、Rous肉瘤病毒3’长末端重复中包含的启动子(Yamamoto et al.，1980，Cell 22：787-797)、疱疹胸苷激酶启动子(Wagner et al.，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78：1441-1445)、金属硫蛋白基因的调控序列(Brinster et al.，1982，Nature 296：39-42)等。可以使用任意类型的质粒、粘粒、YAC或病毒载体来制备能够直接导入组织部位，如脉络膜丛或下丘脑的重组DNA构建体。可替换的方案是，使用选择性感染所需组织的病毒载体，(如对于大脑来说，使用疱疹病毒载体)，在这种情况下通过另一种途径施用(如系统性施用)。
还可使用催化切割Ob或ObR mRNA转录物的核酶分子来抑制Ob或ObR mRNA的翻译和Ob或ObR的表达(参见PCT国际申请WO90/11364和Sarver et al.，1990，Science 247：1222-1225)。当使用能够在特定识别序列部位切割mRNA的核酶来破坏Ob或ObR mRNA时，优选使用锤头状核酶。锤头状核酶在和靶mRNA形成互补碱基对的旁侧区部位切割mRNA。唯一的需要是靶mRNA具有下列两个碱基的序列：5’-UG-3’。锤头状核酶的构建和生成是本领域中所熟知的，Haseloff & Gerlach，1988，Nature，334：585-591对其进行了更全面的描述。在人Ob和ObR cDNA的核苷酸序列中存在有上百个潜在的锤头状核酶切割位点(参见美国专利No.5,972,621)。优选的是，对核酶进行改造，使切割识别位点位于Ob或ObR mRNA 5’端附近；即增加效率，使非功能性mRNA转录物的细胞内积累最小。
例如，本发明中针对ObR mRNA的锤头状核酶具有以下序列：
(a)5′-ACAGAAUUUUUGACAAAUCAAAGCAGANNNNUCUGAGNAGUCCUUAC
   UUCAGAGAA-3′(SEQ ID NO：9)；
(b)5′-GGCCCGGGCAGCCUGCCCAAAGCCGGNNNNCCGGAGNAGUCGCCAGA
   CCGGCUCGUG-3′(SEQ ID NO：10)；
(c)5′-UGGCAUGCAAGACAAAGCAGGNNNNCCUGAGNAGUCCUUAAAUCUCC
   AAGGAGUAA-3′(SEQ ID NO：11)；
(d)5′-UAUAUGACAAAGCUGUNNNNACAGAGNAGUCCUUGUGUGGUAAAGAC
   ACG-3′(SEQ ID NO：12)；
(e)5′-AGCACCAAUUGAAUUGAUGGCCAAAGCGGGNNNNCCCGAGNAGUCAA
   CCGUAACAGUAUGU-3′(SEQ ID NO：13)；
(f)5′-UGAAAUUGUUUCAGGCUCCAAAGCCGGNNNNCCGGAGNAGUCAAGAA
   GAGGACCACAUGUCACUGAUGC-3′(SEQ ID NO：14)；
(g)5′-GGUUUCUUCAGUGAAAUUACACAAAGCAGCNNNNGCUGAGNAGUCAG
   UUAGGUCACACAUC-3′(SEQ ID NO：15)；
(h)5′-ACCCAUUAUAACACAAAGCUGANNNNUCAGAGNAGUCAUCUGAAGGU
   UUCUUC-3′(SEQ ID NO：16).
本发明的核酶还包括RNA内核糖核酸酶(以后称为“Cech型核酶”)，如Tetrahymena thermophila中天然存在的核酶(已知称为IVS或L-19 IVS RNA)，该核酶已经作有深入的介绍(Zaug et al.，1984，Science，224：574-578；Zaug & Cech，1986，Science，231：470-475；Zaug etal.，1986，Nature，324：429-433；PCT申请No.WO/88/04300；Been &Cech，1986，1986，Cell，47：207-216)。Cech型核酶具有八碱基对作用位点，该位点和靶RNA序列杂交，进而切割靶RNA。本发明包括靶向Ob和ObR中存在的八碱基对活性位点序列的Cech型核酶。
反义方法中，核酶可以由修饰寡核苷酸(如提高稳定性、靶向等)组成，并体内传送到表达Ob和ObR的细胞中。优选的传送方法涉及使用“编码”核酶、位于强组成型pol III或pol II启动子控制之下的DNA构建体，使转染细胞能够生成组量的核酶以破坏内源性的Ob或ObR信使，并抑制翻译。由于核酶和反义分子不同，它具有催化性，因此较低的细胞内浓度就可以起效。
类似的，使用“三联(triple)螺旋”碱基配对方法也可以实现对瘦素或瘦素受体的抑制。三联螺旋配对包括双螺旋足够地开放、供聚合酶、转录因子或调控分子结合的能力。使用三联螺旋的技术是本领域的技术人员所熟知的(参见Helene，1991，Anticancer Drug Des.6(6)：569-84；Helene，1992，Ann.N.Y.Acad.Sci.660：27-36和Maher，1992，Bioassays 14(12)：807-15)。
还可以使用靶向同源重组灭活或“敲除”Ob或ObR基因或其启动子来减少内源性Ob或ObR基因表达(通常参见Smithies et al.，1985，Nature 317：230-234；Thomas & Capecchi，1987，Cell 51：503-512和Thompson et al.，1989 Cell 5：313-321，其整体在此引入作为参考)。例如，可以使用旁侧带有内源性Ob或ObR基因同源DNA的突变型、无功能的Ob或ObR(或完全非相关的DNA序列)和或不和选择标记和/或隐性选择标记一起体内转染表达Ob或ObR的细胞。通过靶向同源重组发生的DNA构建体插入使Ob或ObR基因灭活。这种方法尤其使用于农业领域，在该领域，修饰ES(胚胎干)细胞以产生带有失活ObR的动物后代(参见Thomas & Capecchi 1987和Thompsonet al.1989，上文)。但是，可以将该方法加以变通，用于人类，前提是直接施用重组DNA构建体，或使用适当的病毒载体将重组DNA构建体靶向到体内所需部位，如使用疱疹病毒载体传送到大脑组织，如下丘脑、脉络膜丛或脂肪组织。
可替换的方案是，将和Ob或ObR基因调控序列(启动子和/或增强子)互补的脱氧核糖核苷酸序列，使形成能够阻止体内靶细胞中Ob或ObR基因转录的三联螺旋结构(通常参见Helene，C.1991，Anticancer Drug Des.，6(6)：569-84；Helene C.，er al，1992，Ann，N.Y.Accad.Sci.，660：27-36和Maher，L.J.，1992，Bioassays 14(12)：807-15)。
在本发明的另一个实施方案中，可以使用“显性失活(dominantnegative)”方法降低Ob或ObR的活性，增加骨质。为了这一目的，使用编码缺陷型Ob或ObR的构建体进行基因治疗，降低适当靶细胞中Ob或ObR的活性。例如，将指导宿主细胞中缺失或突变了CD或CD一部分的ObR表达的核苷酸序列导入脉络膜丛或下丘脑的细胞中(通过上述的体内或离体基因治疗方法)。可替换的方案是，使用靶向同源重组将这种缺失体或突变体导入到受试者下丘脑或脉络膜丛的内源ObR基因中。改造的细胞将表达无功能的受体(能够和其天然配体相结合，但是不能进行信号传导的锚定受体)。存在于脉络膜丛或下丘脑中的这种改造细胞对内源性Ob配体的反应性降低，从而增加骨质。
本发明的另一个实施方案是通过增加瘦素蛋白的降解来降低瘦素水平的方法，即通过抗体的结合来去除瘦素蛋白的方法。本发明的一个可替换实施方案是通过增加瘦素瘦素蛋白的降解来降低瘦素受体水平的方法，即通过抗体的结合来去除瘦素受体蛋白的方法。另一个实施方案是通过增加能够与游离瘦素相结合的可溶性瘦素受体的合成来降低瘦素水平。
本发明的另一个实施方案是施用能够影响瘦素受体结构、功能或二聚化特征的化合物的方法。这种化合物包括但不局限于蛋白质、核酸、碳水化合物或其他分子，这些化合物在结合时改变瘦素受体结构、功能或二聚化特征，从而使受体活性丧失。
5.8.2. 恢复或增加Ob或ObR表达或活性，以减少骨质
关于增加正常Ob或ObR基因表达水平和/或基因产物，可以使用Ob或ObR核酸序列来治疗骨病。但缺陷型Ob或ObR是疾病的诱因时，以基因置换疗法进行治疗。具体地说，将指导具有正常功能之Ob或ObR基因产物生成的一个或多个拷贝的正常Ob或ObR基因或Ob或ObR基因的一部分导入到患者或动物受试者的适当细胞中，所使用的载体包括但不局限于腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒和疱疹病毒载体，以及将DNA导入细胞的其他颗粒，如脂质体。
由于ObR基因在大脑中表达，包括在脉络膜丛和下丘脑中表达，因此ObR基因置换治疗技术将能够ObR基因序列传送到患者的这些细胞类型中。因而，传送ObR基因序列的技术应该易于透过血脑屏障，这些技术是本领域的技术人员所熟知的(参见PCT申请No.WO89/10134，其整体在此引入作为参考)。或者可替换的是，将ObR基因序列直接施用到要表达ObR基因序列的细胞部位。可替换的是，使用靶向同源重组来纠正适当组织中的缺陷型内源Ob或ObR基因。在动物中，可以使用靶向同源重组纠正ES细胞中的缺陷，产生具有正确特性的后代。
用来增加Ob或ObR基因表达的总体水平和/或活性的其他方法包括将适当的Ob或ObR表达细胞，优选自身细胞以一定数目导入患者的一些部位，使能够改善和骨质增加相关的骨病症状。这种细胞可以是重组细胞，也可以是非重组细胞。在能够施用来增加患者体内Ob或ObR基因表达总体水平的细胞是正常的细胞，优选表达ObR基因的脉络膜丛细胞或下丘脑细胞，或表达Ob基因的脂肪细胞。细胞可以施用到大脑或脂肪组织的解剖部位，或作为组织移植物的一部分定位于身体的不同部位。这种基于细胞的基因治疗技术对于本领域的技术人员来说是熟知的(参见美国专利Nos.5,399,349和5,460,959)。
最后，可以使用上述分析中鉴定到的、通过活化ObR刺激或增强信号传导的化合物来减少骨质，这些化合物通过活化ObR级联反应中下游信号传导蛋白、进而绕过缺陷型ObR。制剂和施用模式取决于化合物的物理化学特性。施用方法包括能够使化合物透过血脑屏障的已知技术。
5.8.3. 控制Ob和ObR活性，治疗或预防骨病的基因治疗方法
可以使用基因治疗方法对Ob和ObR的表达进行体内控制(如在转录水平或翻译水平)，调节Ob和ObR活性，治疗骨病。下面介绍了某些方法。
关于增加正常Ob或ObR基因表达水平和/或基因产物，可以使用Ob或ObR核酸序列来治疗骨病。但缺陷型Ob或ObR是疾病的诱因时，以基因置换疗法进行治疗。具体地说，将指导具有正常功能之Ob或ObR基因产物生成的一个或多个拷贝的正常Ob或ObR基因或Ob或ObR基因的一部分导入到患者或动物受试者的适当细胞中，所使用的载体包括但不局限于腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒和疱疹病毒载体，以及将DNA导入细胞的其他颗粒，如脂质体。
由于ObR基因在大脑中表达，包括在脉络膜丛和下丘脑中表达，因此ObR基因置换治疗技术能够ObR基因序列传送到患者的这些细胞类型中。因而，传送ObR基因序列的技术应该易于透过血脑屏障，这些技术是本领域的技术人员所熟知的(参见PCT申请No.WO89/10134，其整体在此引入作为参考)。或者可替换的是，将ObR基因序列直接施用到要表达ObR基因序列的细胞部位。
可替换的是，使用靶向同源重组来纠正适当组织，例如分别为脂肪组织和大脑组织中的缺陷型内源Ob或ObR基因。在动物中，可以使用靶向同源重组纠正ES细胞中的缺陷，产生具有正确特性的后代。
用来增加Ob或ObR基因表达的总体水平和/或活性的其他方法包括将适当的Ob或ObR表达细胞，优选自身细胞以一定数目导入患者的一些部位，使能够改善和骨质增加相关的骨病症状，包括但不局限于骨质疏松、骨硬化和骨软骨病。这种细胞可以是重组细胞，也可以是非重组细胞。能够施用来增加患者体内Ob或ObR基因表达总体水平的细胞是正常的细胞，或分别表达Ob或ObR基因的脂肪细胞或下丘脑细胞。细胞可以施用到大脑或脂肪组织的解剖部位，或作为组织移植物的一部分定位于身体的不同部位。这种基于细胞的基因治疗技术对于本领域的技术人员来说是熟知的，参见美国专利Nos.5,399,349和5,460,959。
5.8.4. 调节骨的联合疗法
本发明的一个方面是治疗和预防骨质疏松的方法，该方法包括施用β肾上腺素能拮抗剂，包括但不局限于β1、β2和β3拮抗剂。该方面的一个具体实施方案包括但不局限于进一步将瘦素拮抗剂和β肾上腺素能拮抗剂联合施用。
在另一个实施方案中，存在治疗和预防骨质疏松或骨硬化的方法，该方法包括施用β肾上腺素能拮抗剂，包括但不局限于β1、β2和β3拮抗剂。一个进一步的实施方案包括但不局限于进一步将瘦素拮抗剂和β肾上腺素能拮抗剂联合施用。
本发明的另一个方面涉及调节瘦素对骨的效应的方法，该方法包括施用能够改变交感神经紧张性的、治疗有效量的药物组合物。药物组合物的具体实施方案包括但不局限于瘦素拮抗剂、瘦素激动剂、交感神经系统拮抗剂、交感神经系统激动剂和其组合。
本发明的另一个方面涉及治疗或预防骨病的方法，该方法包括施用能够通过改变交感神经紧张性来调节瘦素效应的、治疗有效量的药物组合物。药物组合物的具体实施方案包括但不局限于瘦素拮抗剂、瘦素激动剂、交感神经系统拮抗剂、交感神经系统激动剂和其组合。本发明包括联合使用5.4、5.5、5.6和5.7节中所述的化合物。在一个优选的实施方案中，联合使用化合物产生协同效应。这里所用的术语“协同”指联合使用比使用两种或多种单一试剂的叠加效应更为有效。根据如上文6.2节中所述进行的X射线和组织形态分析结果，确定调节交感神经紧张性的化合物，包括但不局限于β拮抗剂和另一种治疗试剂之间的协同相互作用。可以通过本领域已知的任意方法对这些分析结果进行分析，这些方法包括Chou和Talalay的联合方法，使用微机软件进行剂量-效应分析，以获得结合指数(Chou and Talalay，1984，Adv.Enzyme Regul.22：27-55和Chou and Chou，1987，softwareand manual，Elsevier Biosoft，Cambridge，UK，pp.19-44)。结合指数值＜1说明协同，值＞1说明拮抗，值等于1说明叠加效应。
在另一个实施方案中，依次施用5.4、5.5、5.6和5.7节中所述的任意化合物组合。举例来说，但不具有限制性，瘦素拮抗剂和肾上腺素能拮抗剂联合施用，其中先施用瘦素拮抗剂，随后施用肾上腺素能拮抗剂，或相反。类似的，举例来说，但不具有限制性，瘦素激动剂和肾上腺素能激动剂联合施用，其中先施用瘦素激动剂，随后施用肾上腺素能激动剂，或相反。在另一个不具有限制性的例子中，DBH拮抗剂可以和瘦素拮抗剂和/或肾上腺素能拮抗剂联合施用。化合物的依次加入可以涉及两个或多个化合物。本领域的技术人员能够确定获得所需效应的必要化合物顺序。
5.9治疗骨病的药用制剂和方法
配制本发明的化合物，通过使活性成分和哺乳动物体内的试剂作用部位相接触的任意手段施用，从而抑制各种骨病状态。通过任意传统的用药手段施用这些化合物，这些化合物作为单独的治疗性活性成分施用，或治疗性活性成分联用。它们可以单独施用，但是通常和药用载体一起施用，根据用药途径和标准的药学经验选择药用载体。
用药剂量应是治疗有效量的化合物，使能够改善骨病的症状，该剂量取决于多种因素，如特定活性成分的药代动力学特征以及用药模式和途径；年龄、性别、健康状况和接受者体重；症状的性质和程度；目前治疗种类、治疗频率和所需效果。
5.9.1. 确定剂量
可以通过标准的药学方法来测定这些化合物在细胞培养物或实验动物中的毒性和疗效，如测定LD50(50％致死剂量)和ED50(50％有效计量)。毒性效应和治疗效应之间的剂量比值为治疗指数，表示为LD50/ED50的比值。优选具有较大治疗指数的化合物。当使用具有毒副作用的化合物时，应慎重设计将化合物靶向受影响组织部位的传送系统，使对未感染细胞的潜在损伤降至最低，从而减轻副作用。
可以使用从细胞培养物和动物研究中获得的数据来配制用于人类的剂量范围。这些化合物的剂量优选位于几乎没有或没有毒性的、包括ED50的循环浓度范围内。剂量可以在该范围内变动，这种变动依赖于所用的剂量形式和用药途径。对于本发明方法中所用到的任意化合物来说，可以从细胞培养物分析初步估算治疗有效剂量。在动物模型中配制一个剂量，获得包括细胞培养物中测得的IC50(对症状实现半数最大抑制的受试化合物浓度)在内的循环血浆浓度范围。该信息可用于更准确地测定用于人类的剂量。可以通过高效液相层析测定血浆中的化合物水平。
对于抗体来说也可以使用特定剂量。典型地说，优选的剂量为0.1mg/kg体重至100mg/kg体重(通常为10mg/kg至20mg/kg)，如果抗体在大脑中起作用，则50mg/kg至100mg/kg的剂量通常是适当的。如果抗体是部分人类抗体或全部人类抗体，则它在人体中的半衰期比其他抗体长。相应地，较低剂量的部分人类抗体或全部人类抗体经常是有可能的。可以通过其他的修饰来进一步稳定抗体。举例来说，通过脂化来稳定抗体，增加吸收和组织通透性(如进入大脑)。Cruikshanket al.，1997，J.获得性免疫综合征和人类病毒学14：193中介绍了脂化抗体的一种方法。
蛋白质或多肽的治疗有效量(有效剂量)在约0.001至30mg/kg体重的范围内，优选约0.01至25mg/kg体重，较优选约0.1至20mg/kg体重，更优选约1至10mg/kg、2至9mg/kg、3至8mg/kg、4至7mg/kg或5至6mg/kg体重。
此外，使用治疗有效量的蛋白质、多肽或抗体的治疗包括一次治疗，优选包括一些列治疗。在优选的实施例中，受试者接受约0.1至20mg/kg体重之间剂量范围的抗体、蛋白质或多肽，每周一次，持续1至10周，优选2至8周，较优选约3至7周，更优选约4、5或6周。
本发明进一步包括调节表达或活性的试剂。该试剂可以是一种小分子。例如，这种小分子包括但不局限于肽、肽类似物、氨基酸、氨基酸类似物、多聚核苷酸、多聚核苷酸类似物、核苷酸、核苷酸类似物、分子量小于约10,000克/摩尔的有机或无机分子(包括立体有机化合物和有机金属化合物)、分子量小于约5,000克/摩尔的有机或无机分子、分子量小于约1,000克/摩尔的有机或无机分子、分子量小于约500克/摩尔的有机或无机分子和这些化合物的盐、酯及其他药学上可接受的形式。
人们认为小分子试剂的适当剂量取决于因子的数目，这些因子是本领域的普通技术人员，如医生所已知的。举例来说，小分子的剂量可以变动，这种变动依赖于受试者或受处理样品的相同性、大小和情况，进一步依赖于组合物的施用途径、医生期望小分子对本发明中核酸或多肽应具有的作用。剂量包括每千克受试者或样品重量施用毫克或微克量的小分子(如约1μg/kg至约500mg/kg，约100μg/kg至约5mg/kg，或约1μg/kg至约50μg/kg)。
5.9.2. 制剂和用途
使用一种或多种生理学上可接受的载体或赋形剂，以传统方式配制根据本发明使用的药物组合物。
因此，可以化合物和其生理学上可接受的盐及溶合物配制成一定的制剂，使之适于吸入或吹入(通过嘴或鼻)给药或口服给药、经颊给药、非肠道给药或直肠给药。
对于口服来说，药物组合物可以采用片剂或胶囊形式，使用药学上可接受的赋形剂通过传统的手段制备，这些赋形剂包括结合试剂(如预先凝胶化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯酮或羟丙基甲基纤维素)；填充物(如乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(如硬脂酸镁、滑石或硅石)；崩解剂(如土豆淀粉或羟乙酸钠淀粉)；或潮湿剂(如十二烷基肌酸钠)。通过本领域中所熟知的方法给片剂包膜。对于口服的液体制剂可以采用溶液、糖浆或悬浮剂，或以干燥产品形式提供，使用前用水或其他的适当赋形剂重构。使用药学上可接受的添加剂通过传统方法制备这种液体制剂，这些添加剂包括悬浮试剂(如山梨糖醇糖浆、纤维素衍生素或氢化的食用脂肪)；乳化剂(如卵磷脂或阿拉伯胶)；非水赋形剂(如杏仁油、油状酯、乙烯醇或分级分离的植物油)；和防腐剂(如对-羟苯甲酸甲酯或对-羟苯甲酸丙酯或山梨酸)；制剂还可以适当到包含缓冲的盐、加味剂、色剂或甜味剂。
口服制剂可以适当地配制成受控制地释放活性化合物的制剂。
对于经颊给药来说，组合物可以是通过传统方式配制成的片剂或锭剂。
对于吸入给药来说，方便地将根据本发明使用的化合物通过加压包装或喷雾器以气雾方式施用。使用加压气体的情况下，可以通过提供一个阀门来确定剂量单位，以便按规定量施用。吸入器或吸入器具中胶囊和明胶软片的制剂中包含化合物的粉末混合物和适当的粉末主剂，如乳糖或淀粉。
可以将化合物配制成通过注射，如通过弹丸式注射或连续输注进行非肠道给药的制剂。注射用制剂制剂以单剂量形式和添加的防腐剂一起存在于安瓶或多剂量容器中。组合物可以采用油或水赋形剂中的悬浮液、溶液或乳化液，可以包含诸如悬浮、稳定和/或分散试剂之类的制剂试剂。可替换的方案是，活性成分以粉末形式提供，使用前用适当的赋形剂，如无菌、无致热源的水进行重构。通常来说，水、适当的油、盐、葡糖糖(葡萄糖)水溶液和相关糖溶液和二元醇，如丙二醇或聚乙二醇是非肠道溶液的适当载体。非肠道给药的溶液优选包含活性成分的水溶性盐、适当的稳定剂，如果需要的话还包括缓冲物质。抗氧化剂，如硫酸氢钠、亚硫酸钠或山梨酸。还可以使用柠檬酸和其盐以及乙二胺四乙酸钠(EDTA)。另外，非肠道溶液还包括防腐剂，如氯卡铵、对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯和氯丁醇。适当的药学载体在《Remington制药学》中作了介绍，该书是本领域的一本标准参考书。
化合物还可以配制成直肠组合物，如包含可可脂或其他甘油脂之类传统栓剂主剂的栓剂或滞留灌肠剂。
除了前面所述的制剂制剂外，化合物还可以配制成贮存库制剂。通过包埋(例如皮下或肌肉包埋)或肌肉注射使用这种长效的制剂制剂。因此，举例来说，可以使用适当的多聚物或疏水物质(例如存在于可接受油中的乳剂)或离子交换树脂，或者以少量可溶性衍生物的形式，例如少量可溶性盐的形式来配制化合物。
另外，可以采用标准的药学方法控制作用持续时间。这些方法是本领域已知的，包括控释制剂，可以包括适当的大分子，例如多聚物、聚酯、多聚氨基酸、聚乙烯、吡咯烷酮、乙酸乙烯酯、甲基纤维素、羧甲基纤维素或硫酸鱼精蛋白。可以调整大分子的浓度和掺入方法，从而达到控制释放的目的。另外，试剂还可以掺入到多聚物质颗粒中，这些多聚物质包括聚酯、多聚氨基酸、水化凝胶、聚(乳酸)或乙酸乙烯酯共聚物。除了掺入外，这些试剂还可用于诱捕微胶囊中的化合物。
如果需要，组合物可以装在包含一个或多个单位剂量的包装袋或分药器中，剂量制剂包括活性成分。举例来说，包装可以是金属或塑料箔，如发泡(blister)药袋。包装袋或分药器可以附带有使用说明。
下面说明了如何使用药剂形式来施用本发明的化合物：
胶囊：往标准的两半硬明胶胶囊中装入所需量的粉末状活性成分、175mg乳糖、24mg滑石粉和6mg硬脂酸镁，制备胶囊。
软明胶胶囊：制备活性成分和大豆油的混合物，通过正置换泵注射到明胶中形成包含所需量的活性成分的软明胶胶囊。洗涤胶囊，并加以干燥。
片剂：通过传统方法制备片剂，使剂量单位是所需量的活性成分。0.2mg二氧化硅胶体、5mg硬脂酸镁、275mg微晶纤维素、11mg玉米淀粉和98.8mg乳糖。适当的包衣可以增加可口性或延迟吸收。
针剂：将1.5％重量的活性成分和10％体积的聚乙二醇混合在水中，制备适于注射给药的非肠道组合物。用氯化钠使溶液等渗，并除菌。
悬浮剂：制备口服的悬浮水溶液，使每mL包含100mg细小活性成分、200mg羧甲基纤维素钠、5mg苯甲酸钠、1.0g山梨糖醇U.S.P.和0.025mL香草醛。
基因治疗给药：适当情况下，通过常用方式将基因治疗载体配制成固态、半固态、液态或气态制剂，包括片剂、胶囊、粉末、颗粒、药膏、溶液、栓剂、针剂、吸入剂、气雾剂中，使适用于相应的给药途径。可以使用本领域中已知的手段使组合物到达靶器官才释放并得以吸收，或组合物能够定时释放。应使用不导致本发明组合物失效的药学上可接受形式。在药剂中，组合物可以单独使用，或适当地结合，以及联合其他的药用活性化合物使用。
相应地，本发明的药用组分可以通过多种途径传送到动物体的多个部位，以产生特定的效应(参见Rosenfeld et al.，1991，上文；Rosenfeld et al.，1991，Clin.Res.，39(2)，311A；Jaffe et al.，上文和Berkner，supra)。本领域的熟练技术人员能够认识到：虽然可以采用多种形式给药，但一种特定的给药途径将比其他的途径产生更直接、更有效的反应。通过将制剂制剂应用或滴注到体腔中、吸入或吹入气雾剂或非肠道导入，包括肌肉给药、静脉给药、腹腔给药、皮下给药、真皮内给药以及局部给药，实现局部或系统传送。
本发明的组合物可以以单位剂量形式提供，其中每个剂量单位，如一茶匙、一个药片、一份溶液或一个栓剂包含包含定量的组合物，该组合物单独使用或适当地和其他活性试剂联用。这里所用的术语“单位剂量形式”指适于用作人和动物受试者单位剂量的物质上相独立的单位，每个单位包含定量的组合物，该组合物单独使用或和其他活性试剂联用，其含量足以产生所需的效应，适当情况下，结合药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂使用。本发明中单位剂量形式的规格取决于要达到的特定效应，以及特定宿主中与药物组合物相关的特定药代动力学。
本发明的组合物还配制成持续或定时释放的制剂制剂。可以通过本领域中普通技术人员所熟知的持续释放手段或传送装置来制备这种持续或定时释放的制剂制剂，这些手段和传送装置在美国专利Nos：3,845,770、3,916,899、3,536,809、3,598,123、4,008,719、4,710,384、5,674,533、5,059,595、5,591,767、5,120,548、5,073,543、5,639,476、5,354,556和5,733,566中作有介绍，其内容在此引入作为参考。本发明的药物组合物还可用于提供一个或多个成分的缓慢或持续释放，例如使用水合丙甲基纤维素、其他聚合物基质、凝胶、通透膜、渗透系统、多层包衣、微粒、脂质体、微球等或其组合提供所需的各种比例的释放。可以选择本领域的普通技术人员所已知的适当持续释放制剂制剂，包括这里所述的制剂制剂配合本发明的药物组合物使用。因此，适于口服的单一的单位剂量形式包括但不局限于片剂、胶囊、柔软胶囊、薄膜衣片、粉末等，改进为持续释放的片剂、胶囊、柔软胶囊、薄膜衣片、粉末等也属于本发明的范围。
相应地，本发明还提供了将基因转移到宿主体内的方法，该方法包括使用任意的上述给药途径和本领域的熟练技术人员已知的、适于特定应用的其他给药途径，施用本发明的载体，优选将本发明的载体作为组合物的一部分。组合物的“有效量”是在宿主体内能够产生所需效应的量，该效应可以使用本领域的熟练技术人员已知的几个端点加以监测。可以根据治疗效应(如改善和待治疗的特定疾病相关的一些症状)或进一步通过宿主体内基因转移或基因表达的证据(如使用聚合酶链式反应结合测序、Northern杂交或Southern杂交或转录分析来检测宿主中的核酸，或使用免疫印迹分析、抗体介导的检测、mRNA或蛋白质半衰期研究或特化的分析来检测转移的核酸所编码的蛋白质或多肽，或由于转移所导致的对水平和功能的影响)来监测本发明中载体向宿主细胞中的有效基因转移。
这里所述的这些方法并没有全部列出，普通的技术人员还能够使用适于特定应用的其他方法。另外，通过和已知具有所需效应的化合物相类比，推测组合物的有效量。
另外，确切剂量和方案的变动依赖于组合物是否和其他药物组合物联合施用，或依赖于个体之间药代动力学、药物储存和代谢的差异。类似的，体外应用中量的变动依赖于所用的特定细胞系(如根据细胞表面存在的腺病毒受体的数目，或用于基因转移的特定载体在细胞系中复制的能力)。另外，每个细胞中加入的载体量随插入载体中的治疗性基因的长度和稳定性，以及序列的性质而变动，它尤其是需要通过实验来确定的一个参数，由于这些因素不是本发明方法所固有的，可以加以改变(例如，和合成相关的费用)。本领域的熟练技术人员可以根据特定情况的迫切需要来简单地进行必要的调整。
下面的实施例是例举性的，并不对本发明的范围作任何限制。
6.实施例： 瘦素和骨质之间的关系
6.1. 动物的产生、表征以及治疗
繁殖的小鼠和突变的小鼠(C57BL/6J Lepob、C57BL/6J Leprdb、C57BL/6J Ay/a)购自Jackson实验室。以前曾经报道了A-ZIP/F-I转基因小鼠的产生(Moitra et al.，1998，Genes Dev 12，3168-3181)。根据已经建立的方案进行基因型分析(Chua et al.，1997，Genomics 45，264-270；Moitra et al.，1998，Genes Dev 12，3168-3181；和Namae et al.，1998，Lab Animal Sci 48，103-104)。动物喂以常规的饮食(Purina#5001)或指明情况下的高脂/高糖饮食(Bio-serv #3282)。骨样本根据报道进行加工(Ducy et al.，1999，Genes Dev 13，1025-1036)。
6.2. ob/ob和db/db小鼠中骨质表型的表现
性腺功能减退诱导破骨细胞数目增加和导致低骨质表型的骨吸收增加(Riggs&Melton，1986，N Engl J Med 314，1676-1678)。因此，下丘脑源性性腺功能减退的ob/ob小鼠比野生型同窝小鼠具有较低的骨质(Ahima et al.，1996.，Nature 382，250-252；Cheheb et al.，1996，NatGenet 12，318-320；Ahima et al.，1997，J Clin Invest 99，391-395)。为了确定ob/ob小鼠的肥胖是否影响其预期的低骨质表型，使用Faxitron(Phillips)进行6月龄野生型和ob/ob小鼠脊椎骨和长骨的X射线分析。令人奇怪的是，ob/ob小鼠的骨比野生型同窝小鼠更为致密(图1A)，说明其具有更高量的矿物化骨基质。考虑到用X射线定量骨质异常的低灵敏性，骨密度的增加表示为骨构造的主要变化(即影响大于30％骨基质)。
对未脱钙的切片用von Kossa试剂染色进行组织学分析。3月龄和6月龄小鼠中，ob/ob小鼠骨和野生型骨相比存在有更致密的骨小梁(图1B)。皮质骨未受影响。使用骨测定分析系统(骨测定仪，Atlanta)，根据标准技术对组织形态测定进行定量(Parfitt et al.，1987，J Bone Min Res 2，595-610)。使用学生检验评价组间的统计学差异(n＝4至6)。实验表明ob/ob小鼠和野生型同窝小鼠相比，长骨和脊椎骨中骨小梁体积增加了近2倍(图1C)。在两种性别中均观察到了该表型。通过将6月龄ob/ob小鼠、野生型小鼠和卵巢切除了4个月、模拟ob/ob小鼠性腺功能减退状态的野生型小鼠(wild-type-ovx)长骨的生物机械特性进行比较，分析了这种骨质增加所导致的功能性结果。通过在servo-hydrolic测试仪(Zwich GmbH & Co.)上、使用10mm/min的恒定置换速度进行三点弯曲来检验股骨的分析方法测定作为骨强度的检测指标之一的最大负荷。野生型小鼠和ob/ob小鼠骨的最大负荷没有区别，但是显著比wild-type-ovx小鼠骨的最大负荷高(图1D)。该结果说明瘦素缺陷对于骨的生物机械特征是有益的。还分析了瘦素受体发生了灭活突变的db/db小鼠骨(Tartagliaet al.，1995，Cell 83，1263-1271)。和ob/ob小鼠类似，db/db小鼠肥胖且性腺功能减退。和ob/ob小鼠的观察结果类似，长骨和脊椎骨中的骨小梁数目增加(图1E)，使骨体积和野生型小鼠骨体积相比增加3倍(图1F)。后一结果从遗传上说明了瘦素信号通过其已知的受体影响骨质。
6.3. ob/ob小鼠和db/db小鼠的高骨质表型是缺失瘦素信号传导 的次级效应，而非肥胖的次级效应
ob/ob小鼠和db/db小鼠的高骨质表型可以是这些小鼠缺失瘦素信号传导或肥胖的次级效应。为了区分这两种可能性，如实施例6.2所述分析了额外的几组突变型小鼠的高骨质表型。首先，给ob/ob小鼠食用能够推迟肥胖发生的低脂饮食，它们在1月龄时具有正常的体重。但是，该阶段小鼠已经具有高骨质表型(图2A)。其次，分析了不肥胖的杂合型瘦素缺陷小鼠(ob/+)。这些动物也具有高骨质表型(图2B)。其三，观察了最初和瘦素信号传导不相关的其他肥胖小鼠模型。另一个遗传性肥胖模型，Agouti yellow(Ay/a)小鼠(Herbergand Coleman，1977，metabolism 26，59-99)和食用高脂饮食的野生型小鼠一样具有正常的骨质(图2C和2D)。
因此，发生肥胖之前的ob/ob小鼠和不发生的ob/+小鼠中高骨质表型的存在，以及瘦素非相关肥胖模型中高骨质表型的不存在说明是瘦素信号传导的缺失，而非肥胖导致了高骨质表型。
6.4. ob/ob和db/db小鼠中成骨细胞功能增加
骨质的增加可能缘于成骨细胞骨形成增加、破骨细胞骨吸收降低或二者兼而有之。为了研究成骨细胞的体内功能，如前所述用新骨形成标记物钙黄绿素双标记(图3A)后对骨形成速度进行定量(Ducy etal.，1999，Genes Dev 13：1025-1036)。以8天的间隔给动物注射钙黄绿素两次，两天后将动物处死。和野生型同窝小鼠的骨形成速度相比，3月龄和6月龄ob/ob小鼠骨形成速度分别增加了70％和60％(图3B)。该结果表明ob/ob小鼠的高骨质表型至少部分缘于骨形成活性的增加。明显的，考虑到ob/ob小鼠中骨形成速度大幅度增加，成骨细胞的表面和成骨细胞数目没有增加，说明瘦素缺陷影响成骨细胞的功能，而不影响出生后的分化(图3C)。类似的，对db/db小鼠进行钙黄绿素标记表明即使成骨细胞数目正常，长骨和脊椎骨中骨形成速度也是增加的(图3D和3E)。性腺功能减退条件下，两个突变型小鼠株系中的破骨细胞都增加，说明虽然骨吸收增加，但也可以ob/ob小鼠和db/db小鼠的高骨质表型(图3F)。
使用同样的对照组动物如上所述测定了瘦素信号传导的缺失对于破骨细胞功能的特异效应。食用低脂饮食的1月龄ob/ob动物和杂合瘦素缺陷型小鼠都是瘦的，其骨形成速度也显著增加(图3G)。相比之下，两个瘦素非相关的肥胖模型：Ay/a突变型小鼠和食用高脂饮食的野生型小鼠具有正常的骨形成参数(图3H)。
6.5. ob/ob小鼠中破骨细胞功能的分析
高骨质表型和性腺功能减退的共存如此例外，因此提出假设：这些小鼠中的骨吸收可能是有缺陷的。ob/ob小鼠中，作为骨吸收的生化标记物之一的脱氧吡咯烷酮交联物(Dpd)(Eyre et al.，1988，Biochem252，494-500)的尿排除增加对质疑了该假设(野生型：10.5±2.5nMDpd/mM肌酸；ob/ob：24.0b±4.0nM Dpd/mM肌酸)。使用Pyrilinks-D免疫分析试剂盒(Metra Biosystem)测定晨尿中的脱氧吡咯烷酮交联物。使用肌酸的值对各样片进行标准化(肌酸试剂盒，MetraBiosystem)。分别使用第三代雌二醇试剂盒(Diagnostic kit，MetraBiosystem)和小鼠瘦素RIA试剂盒(Linco)，通过放免法对17β-雌二醇和瘦素的循环浓度进行定量。雌二醇是雌激素类似物，还是选择性雌激素受体调节剂(SERM)。将雌激素类似物和Ob或ObR抑制剂同时施用会进一步增加骨质表型。
进而，为了更彻底地说明这一点，研究了ob/ob小鼠的性腺功能减退。正常情况下，性腺功能减退使破骨细胞数目增加，骨吸收活性增加。因此，如果ob/ob小鼠的破骨细胞是有功能的，纠正这些小鼠的性腺功能减退应该能通过减少破骨细胞数目来降低其骨吸收速度，从而进一步增加骨质。另一方面，如果ob/ob小鼠的破骨细胞不能正确发挥功能，则纠正它们的性腺功能减退不会影响其高骨质表型的严重程度。为了确定这两个可能性哪个是正确的，将17β-雌二醇或安慰剂小丸(Innovative Research of America)皮下植入2月龄雌性ob/ob小鼠中，使血清浓度为250pg/mL。3个月的处理期后对这些动物进行分析。
与预期结果相同，通过其子宫特征和血液中雌二醇(图4A)水平判断：雌二醇处理纠正了它们的性腺功能减退(图4C)。和安慰剂处理的ob/ob小鼠相比，雌二醇还进一步增加了这些小鼠的高骨质表型，因此消除了ob/ob小鼠中作为高骨质表型原由的骨吸收缺陷(图4B)。处理结束时，雌二醇处理的ob/ob小鼠和雌二醇处理的野生型小鼠相比骨体积增加了50％，和未处理的野生型小鼠相比骨体积增加了3倍。用睾酮植入物处理的雄性ob/ob小鼠也获得了类似的结果。最后，在使用来源于野生型小鼠、ob/ob小鼠或db/db小鼠的造血远祖细胞和已知能诱导这些细胞分化成功能性破骨细胞的生长因子进行的分析中，体外研究了ob/ob小鼠和db/db小鼠的破骨细胞功能。根据以前报道的方案体外产生小鼠破骨细胞(Simonet et al.，1997，Cell 89，309-319；Quinn et al.，1998，Endocrinology 139，4424-4427)。将wt、ob/ob和db/db小鼠的骨髓细胞以106细胞/孔的起始密度培养在24孔培养板或牙质片上，培养基为包含10％FBS(Hiclone)、小鼠M-CSF40ng/mL(Sigma)、RANKL/ODF 25ng/mL(Peprotech)、10-8M地塞米松(Sigma)和10-8 1，25-二羟维生素D3的α-MEM(Sigma)。隔天更换培养基。培养6天后，用3.7％的甲醛固定细胞。对塑料板上所形成的破骨细胞进行酒石酸抗酸性磷酸酶染色。使用次氯酸钠溶液处理以去除牙质片上的细胞。用甲苯胺蓝对牙质片进行染色，观察吸收率。
如图4E所示，野生型、ob/ob和db/db造血远祖细胞具有分化成能够吸收基质的破骨细胞的同等能力。
因此，这些实验表明ob/ob和db/db小鼠的破骨细胞没有可检测的功能缺陷，这些突变株系高骨质表型的形成只能是由于瘦素信号传导缺失所导致的骨形成增加。
5.5. 成骨细胞中瘦素信号传导的缺失
本发明说明瘦素是成骨性骨形成的抑制因子。另外，db/db小鼠中高骨质表型的存在说明瘦素必须和其已知受体相结合以行使其功能。理论上，瘦素可以直接作用于成骨细胞，或和控制体重一样，使用下丘脑途径间接通过脂肪中存在的第二个因子的释放作用于成骨细胞。
在未长满的原代成骨细胞培养物中研究成骨细胞中瘦素的表达。细胞在10％FBS矿物化培养基中培养4天，并转到0.5％FBS的矿物化培养基中培养2天，每天换液。更换培养基2小时后，用80ng/mL瘦素(Sigma)或40ng/mL抑瘤素M(R&D Doagnostic)或赋形剂处理20分钟。使用Triazol(Gibco)提取RNA。根据本领域所熟知的方法，使用15μg总RNA进行Northern杂交。
即使在长时间的胶片曝光后也检测不到成骨细胞中瘦素的表达，说明自分泌调控是没有可能的(图5A)。在整个骨样品中都检测不到瘦素的表达，对瘦素通过旁分泌调控成骨细胞的功能提出了间接的非议(图5A)。在任何情况下，瘦素对成骨细胞功能的旁分泌和/或自分泌调控都需要功能性瘦素受体存在于成骨细胞上。存在有数种瘦素受体的转录物，但人们认为只有一种，即Ob-Rb具有信号传导能力(Tartaglia et al.，1995，Cell 83，1263-1271；Chen et al.，1996，Cell 84，491-495；Lee et al.，1996，Nature 379，632-635)。瘦素受体转录物的表达虽然不是严格的下丘脑特异性的，但也是高度下丘脑特异性的。进行RT-PCR实验，搜索原代成骨细胞和完整骨样品中的Ob-Rb转录物。在随机引物引导的cDNA上进行Ob-Rb表达的RT-PCR分析(27个循环)，使用引物如下：5’-TGGATAAACCCTTGCTCTTCA-3’(SEQ ID NO：17)和5’-ACACTGTTAATTTCACACCAGAG-3’(SEQID NO：18)(Friedman & Halaas，1998，Nature 395，763-770)。Hprt的扩增作为cDNA质量的内部参照，使用引物如下：5’-GTTGAGAGATCATCTCCACC-3’(SEQ ID NO：19)和5’-AGCGATGATGAACCAGGTTA-3’(SEQ ID NO：20)。
在使用检测下丘脑中Ob-Rb转录物所必需的许多个扩增循环进行的多次实验中，在颅盖骨、长骨和原代成骨细胞培养物中都没有检测到Ob-Rb的表达(图5B)。
为了确定瘦素是否能在成骨细胞中传导信号，用瘦素处理来源于野生型小鼠的、血清饥饿的原代成骨细胞。如以前方法所述建立来源于新生野生型或db/db小鼠的原代成骨细胞培养物(Ducy et al.，1999，Genes Dev 13，1025-1036)，并在添加有10％PBS的矿物化培养基(αMEMI 0.1mg/mL抗坏血酸；5mMα-甘油磷酸)中培养。突变细胞的培养物在该培养基中培养15天后进行分析。来源于野生型小鼠的培养物在该培养基中培养10天，然后血清降至0.5％，培养基添加有1.2μg/mL瘦素(Sigma)或赋形剂，继续培养5天。
除了发现瘦素处理靶细胞后转录水平增加的两个即早基因表达之外(Elmquist et al.，1997，Endocrinology 138，839-842)，还监测瘦素靶细胞中瘦素信号传导下游效应因子Stat3的磷酸化(Tartaglia et al.，1995，Cell 83，1263-1271；Baumann et al.，1996，Proc Natl Acad Sci USA93，8374-8378；Ghilardi et al.，1996，Proc Natl Acad Sci USA 93，6231-6235；Vaisse et al.，1996，Nat Genet 14，95-97)。使用了能够诱导Stat3磷酸化、活化成骨细胞中同样两个即早基因表达的阳性对照抑瘤素M(Lery et al.，1996，Endocrinology 137，1159-1165)。如下所述进行Western印迹分析来确定Stat3的磷酸化。使用本领域中所熟知的方法裂解细胞，蛋白质提取物在7.5％SDS-PAGE上进行分离，印到硝酸纤维素膜(Biorad)上进行免疫印迹分析。使用PhosphoPlus Stat3(Tyr7O5)抗体试剂盒(New England Biolabs)，根据生产商说明分析Stat3磷酸化。
如图5C所示，抑瘤素M处理成骨细胞诱导Stat3磷酸化，而瘦素处理则不能。该实验中使用了多个剂量的、生理性或超生理性的瘦素，但所有这些都不能诱导Stat3磷酸化。类似的，通过标准Northern分析方法发现抑瘤素M可以迅速、瞬间活化Tisll和c-fos的表达，而瘦素则不能(图5D)。最后，测定了长期瘦素处理来源于野生型小鼠的原代成骨细胞培养物对细胞外基质合成以及骨基质矿物化的影响。分别通过van Gieson和von Kossa试剂对培养物进行全量染色，评价富含胶原的细胞外基质和矿物化结节的存在。在对照培养物和瘦素处理的培养物之间，胶原合成和矿物化结节形成没有差异(图5E)。
最后，如果成骨细胞上没有功能性瘦素受体，则在离体培养物中野生型成骨细胞和db/db成骨细胞没有区别。分析来源于db/db小鼠和野生型小鼠的原代成骨细胞培养物产生真正的骨细胞外基质并使之矿物化的能力。对于分析的所有参数，即碱性磷酸酶染色、I型胶原生成和矿物化结节来说，野生型和db/db原代成骨细胞培养物之间没有差别(图5F)。总的说来，这些结果说明瘦素在整个动物中作用于骨形成不需要瘦素和成骨细胞上的受体相结合。
6.7. 不存在脂肪组织条件下的高骨质
为了说明瘦素的这种作用需要脂肪的存在，使用了仅在脂肪细胞中表达显性失活蛋白A-ZIP的转基因小鼠模型(Moitra et al.，1998，Genes Dev 12，3168-3181)。该显性失活蛋白不具有多数B-ZIP转录因子的DNA结合能力，其中B-ZIP转录因子是对于脂肪细胞分化关键的一类转录因子。结果是，A-ZIP/F-1转基因小鼠没有白色脂肪组织，而白色脂肪组织是受瘦素信号传导调控的脂肪类型，无活性褐色脂肪组织的量急剧减少。其瘦素合成也减少了20倍(Moitra et al.，1998，Genes Dev 12，3168-3181)。在A-ZIP/F-1转基因小鼠中，观察到了缘于成骨细胞功能增加的高骨质表型，该表型和ob/ob和db/db小鼠相同。
该实验具有两种意思。其一，该实验证实了瘦素缺陷，而非高脂肪指数负责ob/ob和db/db小鼠高骨质表型。其二，该实验说明脂肪组织不是瘦素作用于骨形成的必需中继站。
6.8. 脑室灌注瘦素纠正ob/ob小鼠的高骨质表型
最后，说明了瘦素和其下丘脑受体的结合是否能在逆转ob/ob小鼠肥胖表型的同时纠正其高骨质表型。为了该目的，如下所述插入在ob/ob小鼠第三脑室中运送PBS或瘦素(8ng/hr)的泵。用阿佛丁将动物麻醉，置于立体定位仪(Stoelting)上。使Calabria暴露，在前颅上钻一个0.7mm的孔。根据坐标：中线、AP-0.3、腹侧3mm(前颅0点)将一个28号套管(大脑灌注试剂盒U，Alza)包埋到第三脑室。用氰基丙烯酸脂将套管固定在颅骨上，通过Tygon和置于动物背部皮下的渗透泵(Alza)。运送速度为0.25μL/小时(8ng/hr瘦素(Sigma)或PBS，持续28天)。以前的研究已经表明该剂量在系统施用时没有作用(Hallas et al.，1997，Proc Natl Acad Sci USA 94：8878-8883)。为了尽可能接近ob/ob小鼠的生物情况，对插入了泵的动物进行卵巢切除术，以避免纠正其性腺功能减退时所导致的人为性骨质增加。泵置于体内28天，用钙黄绿素进行双标记来测定骨形成参数。
经典的组织学分析表明瘦素处理小鼠骨重新获得正常的表型，而PBS处理小鼠骨则没有(图7A)。瘦素处理小鼠中具有较少的骨小梁，这些骨小梁比PBS处理的ob/ob小鼠骨小梁看起来更为规则。瘦素处理小鼠中骨体积、小梁密度和骨形成速度都显著减小(图7A)。使用特异的放免分析法测得这些动物的血清中没有瘦素。瘦素脑室灌注对骨表型的挽救(rescue)，以及循环瘦素的不存在说明对骨形成的控制是神经内分泌瘦素依赖性的功能。
7.实施例：瘦素、骨质和交感神经紧张性之间的关系
瘦素抑制了骨形成，以及瘦素缺陷型(ob/ob)小鼠脑室(ICV)灌注瘦素纠正了其高骨质(HBM)表型，说明了这种调控的中心性质。对一对动物的其中一只ICV灌注瘦素后ob/ob小鼠的交互循环分析说明该调控环中的输出信号不具有体液特征。对瘦素作用于体重的中介因子黑素皮质素缺失的突变型小鼠进行分析，并没有鉴定到骨异常，说明其他的途径可以介导瘦素对骨形成的调控作用。瘦素缺失降低交感神经系统的活性，缺失儿茶酚胺合成所需酶的小鼠表现出HBM表型。另外，用类交感神经作用剂处理ob/ob小鼠能够纠正其HBM表型。该实施例描述将交感神经系统鉴定为瘦素调控骨形成的效应因子的过程，并说明交感神经系统调节剂可用于治疗骨病。
免疫细胞化学.解剖3日龄C57BL6小鼠的胫骨，直接冻在OCT化合物中。使用Micron恒冷切片机切割成12个微米切片。将切片固定，在5％血清中封闭，并和针对β1、β2和β3肾上腺素能受体的一抗(Santa Cruz Biotechnology)一起孵育。洗后，和偶联有便于观察的过氧化物酶的二抗相孵育，检测抗原-抗体复合物。
交互循环(联体)方法.通过常规方法麻醉后，充分麻醉条件性，使用无菌操作技术进行手术。沿着各小鼠的一侧进行竖切，将皮肤和结缔组织分开。用缝线将切割的腹侧边缘缝合。打开各小鼠腹腔，连接使腹部吻合。最后，将皮肤切口的背部边缘缝合。然后将联体小鼠饲养在单独的笼子中。用于该方法的小鼠是同系小鼠，不至于发生免疫反应。在处理期结束时进行骨组织学和组织形态学分析，以测定骨质。
给4周龄ob/ob小鼠腹腔注射β激动剂异丙肾上腺素，剂量为30mg/kg/天。处理6周后，解剖小鼠，如6.2节中所述对骨进行X射线和组织形态学分析。
在体内，瘦素抑制成骨细胞的骨形成，因此，缺少或缺失瘦素信号传导的ob/ob、db/db和脂肪代谢障碍的小鼠和人无论其体重如何，都具有高骨质(HBM)表型。ob/ob小鼠和db/db小鼠的HBM表型和性腺功能减退共存，且瘦素缺失是至今已知能导致高骨质和性腺功能减退共存的唯一条件。后一特征强调了这种调控在骨生物学中的重要性。中枢灌注瘦素降低瘦素缺陷型和野生型小鼠的骨质以及骨形成参数，从而显示了骨形成调控中中枢物质的存在。
为了确定发源于大脑并控制骨形成的信号是否具有体液特征，在ob/ob小鼠之间进行交互循环(联体)实验。建立并证实交互循环4周后，在每个联体对的一只小鼠中装入ICV运送瘦素(8ng/h)的泵。如果这些动物的血浆中检测不到瘦素，则证明没有漏过血脑屏障。4周后分析每对联体的同侧和对侧小鼠的体重和骨组织学，如果瘦素使用体液手段来控制体重和骨质，则每对联体中的两只小鼠对瘦素灌注的应答是等同的。如以前所示，在接受ICV瘦素的ob/ob小鼠体重和骨体积明显减小。相反，所有联体对中对侧小鼠体重和骨体积均没有减小。这些结果说明瘦素依赖环中的输出信号不具有体液特征。
瘦素对前阿黑皮素(POMC)神经元的活化和其调控食欲和体重的功能相关。为了确定POMC神经元是否也涉及涉及对骨形成的调控作用，我们研究了致死性瘦素agouti(Ay)小鼠，该小鼠的大脑中缺失POMC信号传导，导致迟发性肥胖，抵抗瘦素的致厌食作用。Ay小鼠具有异常的骨质，往这些小鼠中ICV灌注瘦素导致骨质显著下降，而不影响其体重。该结果说明瘦素可以在不存在阿黑皮素信号传导的条件下影响骨质。接着研究了阿黑皮素的大脑特异受体，即阿黑皮素4受体(MC4-R)缺陷型小鼠。肥胖以及性腺功能减退的MC4-R缺陷型小鼠在1月龄和3月龄时具有正常的骨质和正常的骨形成参数。总的来说，两种突变型小鼠株系的分析说明瘦素对骨形成的调控中POMC神经元不是主要的中继站，说明有其他介质参与控制骨质。这些突变型小鼠的分析还说明的骨形成中枢调控的另一个方面。事实上，缺失瘦素信号传导的条件下HBM表型的存在提出了一个合理的观点，即通过这些动物中观察到的高胰岛素血症来解释HBM表型的存在。而Ay和MC-4R缺陷型小鼠的研究表明这种解释是不可能的，这是因为这两种突变型小鼠模型的特征是存在严重的高胰岛素血症，但具有正常骨质。
为了确定交感神经元是否参与调控骨形成，研究了缺失将多巴胺转化为去甲肾上腺素所必需的酶，即多巴胺羟化酶(DBH)的小鼠。如图8所示，DBH缺陷型小鼠具有HBM表型。在缺失瘦素信号传导的条件下观察到的类似，随着时间的推移给表型逐渐加重，且发生在骨形成参数增加之后。骨吸收的生物标记物脱氧吡咯烷酮的尿排泄在DBH缺陷型小鼠中是正常的，说明骨吸收的缺陷正引发其HBM表型。
8.实施例：交感神经系统对骨形成的神经元调控
该实施例中，瘦素依赖的抗骨生成的下丘脑网络显示介导瘦素致厌食作用的神经肽不影响骨形成，瘦素抗骨生成作用的外周介质可能是神经元性的。瘦素缺失导致低的交感神经紧张性，通过遗传学方法或药理学方法去除小鼠中的肾上腺素信号传导导致瘦素抵抗性的高骨质，成骨细胞上调节其增殖和功能的β-肾上腺素能受体。相应地，β-肾上腺素能受体激动剂降低瘦素缺陷型和野生型小鼠的骨质，而β-肾上腺素能受体拮抗剂增加野生型和卵巢切除小鼠的骨质。这些操作都不影响体重。该项研究说明了对骨形成的瘦素依赖的神经元调控，这种调控对骨质疏松具有治疗意义。
8.1.引言
脊椎动物中，通过2个作用的相互制约来维持骨质恒定。这两个作用是破骨细胞介导的骨吸收和成骨细胞介导的骨形成。这两种细胞类型的协调作用限制了骨的重塑。最常见的骨重塑疾病——骨质疏松也是发达国家中最常发生的退行性病变(参见Cooper & Melton，1996，骨质疏松，R.Marcus，D.Feldman，and J.Kelsey，eds.，San Diego，Academic Press，pp.419-434)，说明了鉴定骨重塑过程中的调控分子是骨生物学中的一个重要问题。
成年小鼠中诱导去除成骨细胞后治愈的精确性使人们推测存在对骨形成的系统控制(参见Corral et al.，1998，Proc Natl Acad Sci USA95：13835-13840)。根据性腺衰竭后骨质疏松的高发性(参见Riggs etal.，1998，J Bone Miner Res 13：763-773)以及肥胖人群中骨质疏松的低发性(参见Felson et al.，1993，J Bone Miner Res 8：567-573和Tremollieres et al.，1993，J Clin Endocrinol Metab 77：683-686)提出了一个假设：骨质、体重和生育受同一种激素的控制。检验该假设，表明调节体重和性腺功能的激素——瘦素还是骨形成的强抑制剂，即是一个抗骨生成的因子(参见Ducy et al.，2000，Cell 100：197-207)。瘦素信号传导水平都降低的瘦素缺陷型(ob/ob)小鼠、瘦素受体缺陷型小鼠和脂肪代谢障碍的小鼠具有相同的高骨质(HBM)表型。具有相同骨表型的这三种突变型小鼠株系的体重相差很大，说明是瘦素信号传导控制骨质，而非体重控制骨质。往ob/ob小鼠或野生型(wt)小鼠的第三脑室灌注(ICV)瘦素降低了骨质和骨形成参数，说明在骨形成的控制过程中存在有中枢神经组分(参见Ducy et al.，2000，Cell：197-207)。这些结果和最初的假设是一致的，因为不易发生骨质疏松的肥胖人群对瘦素的中枢作用有抵抗性(参见Ahima & Flier，2000，Annu Rev Physiol 62：413-437)。瘦素缺失是仅有的已知能使HBM和性腺功能减退共存的条件，瘦素存在会导致骨流失，这一点说明了瘦素抗骨生成作用的重要性。
在瘦素行使致厌食作用的机制探讨上已经取得了很大的进展。小鼠突变株系的化学损伤、分子阐明以及神经肽缺陷型小鼠的产生使人们鉴定到了合成开胃分子和厌食分子的神经元，该神经元是瘦素致厌食作用的靶点(参见Elias et al.，1999，Neuron 23：775-786；Cowley et al.，2001，Nature 411：480-484和DeFalco et al.，2001，Science 291：2608-2613)。相比之下，瘦素致厌食作用的细胞和分子基础尚不清楚。
为了阐明瘦素抗骨生成作用的理论基础，进行了化学损伤分析、遗传学分析、胜利学分析和分子分析。该实施例中的研究表明瘦素的致厌食作用模式和抗骨生成作用模式是不同的，鉴定到了调节骨生成的神经元，找到了通过调节该通路进行治疗的切入点。
8.2.实验方法
8.2.1.动物、处理和手术方法
野生型(C57BL/6J)和突变型(C57BL/6J Ay/a，C57BL/6J ob/ob)小鼠来自Jackson实验室，肾上腺髓质切除的小鼠来自Harlan Tecklad实验室。如前所述挽救Dbh-/-小鼠。每天腹腔注射(ip)异丙肾上腺素30mg/kg(wt)或3mg/kg(ob/ob)，持续6周。普萘洛尔(Sigma)以0.5g/L的浓度加入到饮用水中。对于ICV灌注来说，如前所述将28号套管(大脑灌注试剂盒II，Alza)包埋在第三脑室，以8ng/hr的速度灌注人瘦素，或以125ng/hr的速度灌注MT-II(PhoenixPharmaceuticals)，持续28天(参见Ducy et al.，2000，Cell 100：197-207)。套管和置于动物背部皮下的渗透泵(Alza)相连接。对于联体来说，沿着每只小鼠的一侧纵向切开皮肤和腹腔。用缝线将切割边缘缝合，诱导腹部吻合。往联体对的一只小鼠尾静脉中注射1mg/kg0.25％伊文思蓝对交互循环进行定量。30min后，通过眶后采血，从两只小鼠收集血液，根据标准技术计算血液交换速度(参见Harris &Martinm，1984，Am J Physiol 247：R380-386)。所有联体对每小时的交换速度都在2％以上。联体2周后，包埋一个在联体对的一只动物中ICV运送瘦素的泵。对于GTG损伤来说，4周龄的C57BL/6J小鼠ip注射一次PBS或GTG(0.5mg/g)。对于MSG损伤来说，2日龄C57BL/6J幼鼠每天皮下注射PBS或MSG(2mg/g)，持续10天。
8.2.2.转基因小鼠的产生和分子研究
克隆2.3kb的成骨细胞特异性片段αI(I)胶原启动子下游的小鼠瘦素cDNA，产生αI(I)瘦素转基因。通过标准技术产生转基因建立者(参见Ausubel，1995，分子生物学当前方案，纽约)。通过PCR确定基因型。对表达转基因的两个株系的子代进行分析。根据标准方案使用RNA或polyA+RNA进行Northern印迹分析。在随机引物引导的cDNA上进行RT-PCR 27个循环，分析肾上腺素能受体的表达。
8.2.3. 组织学方法、免疫细胞化学和增殖
样本包埋在石蜡中，制成6μm的切片。用0.1％cresyl紫对大脑染色。根据标准方案进行免疫组织化学分析(参见Ausubel，1995，分子生物学当前方案，纽约)。对用40μg异丙肾上腺素、4μg地塞米松或赋形剂处理5天的新生小鼠进行体内成骨细胞增殖分析。第5天ip注射BrdU(0.4mg)，2小时后将小鼠处死。使用Zymed BrdU染色试剂盒(Zymed实验室)进行免疫组化分析，检测BrdU掺入。对每种处理的4只幼鼠进行分析，每只动物对10个颅骨切片进行计数。NovaRED用作显色性的过氧化物酶底物。用苏木精对切片进行复染。
对未脱钙的切片用von Kossa染色，用von Gieson复染来进行组织学分析(参见Ducy et al.，2000，Cell 100：197-207)。使用骨测定分析系统(骨测定仪，Atlanta)，根据标准方法进行静态和动态组织形态学分析(参见Parfitt et al.，1987，J Bone Miner Res 6：595-610)。每组分析6至12只动物。通过学生检验评价统计学差异)。
8.2.4. 细胞培养和生物分析
如前所述获得原代成骨细胞培养物(参见Ducy et al.，2000，Cell100：197-207)，在添加10％FBS的αMEM/0.1mg/mL抗坏血酸的培养基中培养。OaOS-2在MEM/10％FBS中培养。对于cAMP分析来说，长满的细胞培养物和含有0.1μM IBMX(3-异丁基-1-甲基黄嘌呤，Sigma)的无血清孵育8min，然后加入PBS、PTH(1～34)(Bachem)、异丙肾上腺素、去甲肾上腺素、去氧肾上腺素(Sigma)或普萘洛尔处理5min。通过免疫分析(R&D System)测定细胞内cAMP浓度。对于基因表达分析来说，于0.1％FBS中用适当的药物处理原代成骨细胞72小时。Peninsula实验室(胰岛素)或Alpco Diagnostics(瘦素)的免疫分析试剂盒对激素血清水平进行定量。使用Quidel试剂盒测定晨尿中的脱氧吡咯烷酮交联物和计算。用STAT3反应性luc报道构建体、pSVβ-gal质粒和αI(I)瘦素表达质粒或模拟质粒共转染表达ObRb的293细胞，证实αI(I)瘦素的生物活性。24小时后测定荧光素酶和β-半乳糖苷酶的活性。数据表示为荧光素酶/β-半乳糖苷酶活性比，所得的值是6个独立转染实验的中间值。
8.3. 结果
8.3.1. 鉴定下丘脑抗骨生成区域
两个下丘脑核——腹外侧下丘脑核(VMH)和弓形核(ARC)具有最高密度的、表达能够进行信号传导的瘦素ObRb的神经元；两个核都在介导瘦素的致厌食作用中发挥关键的作用(参见Tartaglia etal.，1995，Cell 83：1263-1271和Fei et al.，1997，Proc Natl Acad Sci USA94：7001-7005)。首先通过化学损伤，随后进行或不进行瘦素ICV灌注评价了这些核的神经元参与瘦素抗骨生成作用的可能性。
新生的幼鼠首先用损伤表达谷氨酸受体之脑室周围神经元的谷氨酸钠(MSG)处理(参见Olney，1969，Science 164：719-721)。MSG处理显著影响ARC结构，几乎不存在合成神经肽Y(NPY)的神经元(图9A)。相比之下，VMH神经元的标记物——产类固醇因子1(SF1)(参见Ikeda et al.，1995，Mol Endocrinol 9：478-486和Dellovadeet al.，2000，J Comp Neurol 423：579-589)的表达不变，说明这些神经元多数都不受MSG处理的影响。在下丘脑外部没有观察到损伤。通过测定固体积进行组织学分析，发现12周龄的MSG处理小鼠具有正常的骨质(图9B)。为了进一步说明MSG敏感的神经元在瘦素抗骨生成中的作用，对MSG处理的ob/ob小鼠进行瘦素ICV灌注。MSG处理阻断了瘦素ICV灌注减轻体重的活性，但是没有阻断其减少骨质的活性(图9C)。尽管ob/ob小鼠中存在有MSG诱导的损伤，但MSG处理小鼠骨质正常且瘦素ICV灌注有效，这些结果说明MSG敏感性神经元对于瘦素的抗骨生成作用不是必需的。
继而，4周龄wt小鼠用硫代葡萄糖金(GTG)处理，GTG是破坏VMH神经元和更靠近背侧的ARC神经元的化合物，也影响其他神经元(参见Debons et al.，1962，Am J Physiol 4：743-750)。在进行分析的各个小鼠中，密集的疤痕使腹侧下丘脑的解剖形态变形，说明GTG处理VMH的有害效应。GTG处理小鼠的免疫组化研究表明表达SF1的VMH神经元明显紊乱，而位于ARC中的、表达NPY的神经元未受影响(图9D)。这些发现说明GTG和MSG分别影响ARC和VMH神经元。骨组织学分析表明12周龄的GTG处理小鼠表现出HBM，其严重程度和ob/ob小鼠近似相同(图9E)。和ob/ob小鼠一样，这种HBM缘于骨形成增加，表现为骨形成速度增加(图9E)。指示破骨细胞活性的胶原降解产物——脱氧吡咯烷酮(dpd)的尿清除，以及破骨细胞数目正常说明骨吸收不受GTG的影响(数据未列出)。这些发现说明对GTG敏感的神经元参与控制骨质。
为了确定GTG敏感性神经元是否参与瘦素的抗骨生成作用，在GTG处理的ob/ob小鼠中进行瘦素ICV灌注。瘦素ICV灌注减轻了这些动物的体重，说明瘦素ICV灌注是有效的(图9F)。虽然ob/ob小鼠对瘦素极为敏感，但是这种灌注没有减少骨质(图9F)。总之，这些数据表明GTG敏感性神经元网络对于瘦素的抗骨生成作用是必需的。另外，GTG或MSG分别影响瘦素的抗骨生成作用和致厌食作用，说明这两种作用至少部分由不同的神经元通路所介导。
8.3.2. 瘦素的抗骨生成作用不需要已知的致厌食性神经肽
为了超越化学损伤法，使用了遗传学方法。研究表明ARC产生的α-黑素细胞刺激激素(αMSH)和表达黑素皮质素4受体(MC4-R)及黑素皮质素受体(MC3-R)的神经元相结合是瘦素的致厌食作用所必需的(参见Huszar et al.，1997；Vaisse et al.，1998；Yeo et al.，1998；Cowley et al.，2001，Nature 411：480-484)。为了研究黑素皮质素信号传导在瘦素抗骨生成作用中的功能，通过破坏黑素皮质素信号传导和黑素皮质素受体激动剂处理的ob/ob小鼠对突变型小鼠株系进行分析。
Ay/a小鼠中，由于agouti蛋白和黑素皮质素受体结合，黑素皮质素信号传导水平下降。其中agouti蛋白是黑素皮质素受体信号传导的竞争性拮抗剂，对MC4-R有高亲和力(参见Miller et al.，1993；Lu etal.，1994；Fan et al.，1997)。结果Ay/a小鼠发生迟发性肥胖，并伴随有对瘦素致厌食作用的中枢抵抗(参见Halaas et al.，1997，Proc NatlAcad Sci USA 94：8878-8883)，和Mc4-r缺陷型小鼠中观察到的表型相类似(参见Huszar et al.，1997，Cell 88：131-141)。相比之下，多个证据表明黑素皮质素信号传导受到破坏时不发生瘦素的抗骨生成作用。首先，Ay/a小鼠具有正常骨质(参见Ducy et al.，2000，Cell100：197-207)。其次，Ay/a小鼠不抵抗瘦素的抗骨生成作用，表现为长期ICV瘦素灌注降低骨形成速度，减小Ay/a小鼠和wt小鼠的骨体积(图10A)。其三，Mc4-r缺陷型小鼠具有正常的骨质(图10B)。其四，往ob/ob小鼠中ICV灌注MC4-R/MC3-R激动剂MTII不影响其骨质，但显著减轻其体重(图10C和10D)。
表达受瘦素调控的另一个致厌食多肽是可卡因安非他明相关转录物(CART)(参见Kristensen et al.，1998，Nature 393：72-76)。虽然CART调节小鼠的体重(参见Asnicar et al.，2001，Endocrinology142：4394-4400)，但cart缺陷型小鼠不表现出HBM(数据未列出)。总之，这些实验表明对于瘦素致厌食作用关键的黑素皮质素和CART信号传导通路不是其抗骨生成作用所必需的。这些结果和MSG敏感性神经元的观察结果相一致，MSG敏感性神经元是αMSH的主要下丘脑性发源地，负责瘦素的抗骨生成作用。
Mc4-r缺陷型小鼠的分析说明了在缺失瘦素信号传导的小鼠中不能研究的另一个问题。不存在瘦素信号传导的条件下观察到HBM，说明HBM可能该条件下产生的高胰岛素血症的次级效应。而Mc4-r缺陷型小鼠血浆胰岛素水平升高，但骨质正常，证明了高胰岛素血症并不导致HBM(表1)。下面提供的其他三个证据进一步说明了血浆胰岛素水平和骨质调控的不相关性。
8.3.3. 瘦素抗骨生成作用的外周介导
下一个问题是下丘脑抗骨生成网络所产生的信号是体液性的还是神经元性的。需要借助ob/ob动物(没有循环瘦素)之间的交互循环(联体)实验来解决该问题。如实验方法所述进行联体实验，染料注射证实2小时后联体动物之间的有效交互循环＞95％。联体2周后，每个联体对中包埋ICV灌注瘦素的泵。在进行分析的所有动物血清中都检测不到瘦素，排除了瘦素向血液循环中渗露的可能性(数据未列出)。4周后，将动物处死，进行分析。和预期相同，接受瘦素ICV的ob/ob小鼠骨质显著减少；相比之下，对侧小鼠的骨质为发生变化(图11A)。虽然不能排除短寿命体液介质的存在，该实验说明了在瘦素的抗骨生成作用中存在神经元性介质的可能性。
上述的实验都不能排除瘦素通过局部作用影响成骨细胞功能的可能性。为了验证该假设，使用成骨细胞特异性的αI(I)胶原启动子片段(参见Rossert et al.，1995，J Cell Biol 129：1421-1432)驱动瘦素在成骨细胞[αI(I)瘦素]的表达，产生了两个转基因小鼠株系。Northern印迹分析和免疫细胞化学分析表明成骨细胞合成了高水平的瘦素(图11B、11C)，使血浆瘦素水平轻微增加，但还维持在正常范围内(wt：3.2ng/mL±0.4，αI(I)瘦素：5.6±0.8，每个基因型n＝7)。DNA转染后瘦素增加Stat3依赖的荧光素酶报道构建体在表达ObRb的293细胞中的活性，从而确认了该转基因转录的瘦素生物活性(图11D)。虽然具有生物活性的瘦素存在高的局部水平，在1年内的任何阶段中转基因小鼠的骨质和野生型小鼠的骨质没有区别(图11E)。该结果说明瘦素抗骨形成作用的理论依据不是直接作用于成骨细胞。
8.3.4. 骨形成的交感神经调节
已经分析透彻的瘦素缺失后果是交感神经系统(SNS)的活性降低(参见Bray & York，1998，Recent Prog Horm Res 53，95-117)。另外，人们设想VMH介导瘦素诱导的儿茶酚胺分泌增加(参见Ruffin &Nicolaidis，1999，Brain Res 846：23-29和Satoh et al.，1999，Diabetes48：1787-1793)。这些观察结果以及这里所给出的研究发现探讨了SNS在控制骨形成中的作用。
由于SNS功能是通过肾上腺素能受体介导的，因此研究了缺失产生肾上腺素能受体的儿茶酚胺配体——去甲肾上腺素和肾上腺素所需酶多巴胺β羟化酶(DBH)的突变型小鼠。组织学分析表明Dbh缺陷型小鼠中存在HBM，尽管其程度没有ob/ob小鼠中的严重(图12A)。由于Dbh缺陷型小鼠中，有利于低骨质的两个条件——血清皮质酮和多巴胺水平增加(参见Adachi et al.，1993，Semin ArthritisRheum 22：375--384；Alaniz et al.，1999，Proc Natl Acad Sci USA96：2274-2278和et al.，2000，Bone，26：15-19)，因此该发现具有重大意义(参见Alaniz et al.，1999，Proc Natl Acad Sci USA 96：2274-2278)。这种HBM是骨形成速度和成骨细胞数增加、而骨吸收标记物正常的次级效应(图12A-12D，数据未列出)。除了高皮质酮水平外，Dbh缺陷型小鼠中观察到的HBM和高胰岛素血症或其他激素紊乱不相关(表1，未列出)。儿茶酚胺的释放主要有两个来源：交感神经和肾上腺。为了确定肾上腺产生的儿茶酚胺是否参与骨质的调节，分析了提前4周手术切除了作为循环肾上腺素主要来源的肾上腺髓质(参见Young & Landsberg，1998，The Adrenal.Williams内分泌教材，J.D.Wilson，D.W.Foster，H.Kronenberg，and P.R.Larsen，eds.(Philadelphia，W.B.Saunders Co.)，pp.665-682)的野生型小鼠。组织学分析表明切除肾上腺髓质不影响骨质(图12E)。该结果确认了存在对骨形成的神经元调节。
另一个问题是瘦素中枢抗骨生成作用和骨形成的SNS调节之间是否存在直接的联系。为了解决该问题，往Dbh缺陷型小鼠中ICV灌注了瘦素ICV。这种灌注使所有处理了的Dbh缺陷型小鼠中性腺脂肪几乎消失，说明在不存在去甲肾上腺素和肾上腺素的条件下中枢运送瘦素影响体重调节(图12F)。但是，瘦素不能减少Dbh缺陷型小鼠的骨质(图12G)，说明瘦素的抗骨生成作用依赖于SNS功能。
表1.血清胰岛素水平和骨质
                           胰岛素             骨体积
                          (ng/mL)
    野生型               0.8±0.3              正常
    MC4-R-/-            23.0±6.0*           正常
    Dbh-/-              1.0±0.4              高
    ob/ob                19.6±0.8             高
ob/ob+异丙肾上腺素       4.4±0.4              低
野生型+普萘洛尔          0.8±0.1              高
*(Huszar et al.，1997，Cell 88：131-141)
8.3.5. 成骨细胞上的功能性肾上腺素能受体
交感神经调节骨形成应该具备几个条件。其一是成骨细胞上存在有功能性肾上腺素能受体。通过RT-PCR进行的基因表达分析和Northen印迹分析表明原代小鼠成骨细胞培养物中存在β2肾上腺素能受体转录物，但是不存在其他的肾上腺素能受体转录物(图13A)。对来源于表达LacZ的转基因小鼠长骨进行免疫组化分析证实了成骨细胞上β2肾上腺素能受体的存在(图13B)，其中LacZ位于成骨细胞特异性αI(I)胶原启动子片段控制之下。不能够检测到其他的肾上腺素能受体亚型。此外，用抗神经纤维抗体和抗酪氨酸羟化酶抗体在成骨细胞周围观察到轴突免疫反应性(图13C和13D)。电子显微镜证实：无髓鞘的周围神经轴突经过骨小梁和成骨细胞附近的骨髓(图13E)。β肾上腺素能受体是G蛋白偶联的受体，通过cAMP通路传导信号(参见Benovic et al.，1998，Annu Rev Cell Biol 4：405-428)。因此，为了评价成骨细胞上存在β2肾上腺素能受体的生物相关性，单独使用β肾上腺素能激动剂异丙肾上腺素，或在β肾上腺素能受体拮抗剂普萘洛尔存在的条件下使用β肾上腺素能激动剂异丙肾上腺素；使用β肾上腺素能受体的天然配体去甲肾上腺素；α肾上腺素能激动剂去氧肾上腺素或使用赋形剂来处理这些细胞，测定cAMP的生成。使用和成骨细胞中另一个G蛋白偶联受体相结合的甲状旁腺激素(PTH)作为阳性对照(Gardella & Juppner，2001，Trends EndocrinolMetab 12：210-217)。异丙肾上腺素或去甲肾上腺素处理使cAMP生成增加至PTH的类似程度，而去氧肾上腺素则没有这种作用。普萘洛尔处理能够抵消这些作用。是小鼠和人成骨细胞也获得了同样的结果(图13F)。
8.3.6. 类交感神经刺激剂处理的ob/ob小鼠骨质减少，但仍保持 肥胖
第二个条件是用类交感神经刺激剂处理应减少其骨质。为了说明这一点，用β肾上腺素能受体激动剂异丙肾上腺素或赋形剂处理1月龄ob/ob小鼠6周。如图14A所示，长期异丙肾上腺素处理(3mg/kg/天)导致ob/ob小鼠脊椎骨和长骨中大量骨流失。这是由于骨形成速度下降，单位骨面积上的成骨细胞数减少(图14B)，而骨吸收参数未受影响(数据未列出)。利用10mg/kg/天的异丙肾上腺素获得了相同的结果(数据未列出)。该实验有两个方面是特别重要的。其一，形成低骨质、而ob/ob小鼠仍具有高胰岛素血症进一步说明了高胰岛素血症和骨质调节的不相关性(表1)。其二，在这两个剂量下，异丙肾上腺素减少骨质，而不影响体重，说明存在异丙肾上腺素选择性影响骨质的剂量范围(图14A和14C)。为了确定没有缺失瘦素所导致的代谢和神经异常的动物体内SNS的作用，在野生型小鼠中重复了该实验。异丙肾上腺素还是显著减少骨质、骨形成速度和成骨细胞数目，而不影响其体重(图14D-14F)。褐色脂肪组织中非偶联蛋白1(Ucpl)表达的增加说明异丙肾上腺素能够模拟ob/ob及野生型小鼠中交感神经活性的增加(Scarpace & Matheny，1998，Am J Physiol275：E259-264)(图14G)。总之，这些数据鉴定了不依赖于其对体重的作用，通过作用于β2肾上腺素能受体作为骨形成调节剂的SNS。
为了阐明异丙肾上腺素体内抗骨生成作用的机制，研究了成骨细胞增殖、基因表达和凋亡。体内溴化脱氧尿嘧啶(BrdU)标记后，经异丙肾上腺素处理的野生型小鼠颅骨中阳性细胞的数目和对照小鼠颅骨中阳性细胞的数目相比减少2倍，说明异丙肾上腺素抑制成骨细胞增殖(图14H)。使用严重抑制成骨细胞增殖的地塞米松作为对照。成骨细胞基因表达研究表明异丙肾上腺素处理降低控制成骨细胞功能的转录因子Dbfal(参见Ducy et al.，1999，Genes Dev 13：1025-1036)和编码骨细胞外基质主要成分的基因αI(I)胶原的表达(图14I)。用β肾上腺素能拮抗剂普萘洛尔处理逆转异丙肾上腺素对基因表达的抑制作用(图14I)。为了研究凋亡，分析了Caspase 3表达和Annexin-V染色水平，没有观察到异丙肾上腺素处理和对照成骨细胞相比的改变(数据未列出)。这些结果SNS的抗骨生成作用是出于对成骨细胞增殖和功能的抑制。
8.3.7. β肾上腺素能拮抗剂增加wt和卵巢切除小鼠的骨质
SNSA调节骨形成的最重要生物医学条件是β肾上腺素能拮抗剂(β阻断剂)应该通过增加骨形成来增加骨质。为了说明这一点，wt小鼠用普萘洛尔(0.4mg/天)处理5周。这种处理导致脊椎骨和长骨的骨质显著增加(图15A)。在一些普萘洛尔处理的小鼠中，骨体积可以和ob/ob小鼠中的观察结果相匹配。这种骨质的增加缘于骨形成速度的增加和成骨细胞数目的增加(图15B)。普萘洛尔诱导的骨质变化同时，动物的体重和脂肪垫重量保持正常(图15C，数据未列出)。普萘洛尔不导致高胰岛素血症或其他的激素变化(表1，数据未列出)。随后，研究了瘦素抗骨生成作用和β阻断剂对骨质效应之间的可能联系。为了该目的，对普萘洛尔处理的小鼠进行了瘦素ICV灌注。中枢运送瘦素导致普萘洛尔处理的小鼠脂肪垫消失，但是不影响其骨质(图15D、15E)。该实验是支持瘦素的抗骨生成作用需要交感神经活性的第二个有力证据。
普萘洛尔对wt小鼠骨形成的作用表明普萘洛尔可能会缓和雌激素耗竭后观察到的骨质疏松。为了验证这一点，将6周龄的wt小鼠卵巢切除，小鼠用普萘洛尔或赋形剂处理7周。卵巢切除耗竭雌激素减少赋形剂处理小鼠中的骨质。相比之下，普萘洛尔处理的卵巢切除小鼠具有正常的骨质(图15F)。普萘洛尔处理的这种预防效应是由于骨形成速度和成骨细胞数目的明显增加，二者水平均比对照的卵巢切除小鼠高(图15G)。后一结果强调了骨形成过程中交感神经调节的生理和治疗重要性。
8.4. 讨论
已经鉴定到了瘦素抗骨生成作用所需的神经元通路，表明SNS是骨形成的负调控因子。可以调节SNS对骨形成的这种抑制作用，而不影响体重。除了为瘦素的抗骨生成作用提供了分子基础外，这些发现还确认了对骨重塑的神经元调节。β肾上腺素能拮抗剂能够克服卵巢切除对骨的有害作用，而不影响体重，这一点对骨质疏松的治疗具有重要意义。
8.4.1. 瘦素抗骨生成作用的特异性
这些结果说明了下丘脑在瘦素抗骨生成作用中的重要性，带有损伤研究所固有的局限性，说明VMH是该通路中的瘦素作用位点。但是，这些化学损伤研究没有鉴定到下丘脑中瘦素抗骨生成作用所需的确切神经元亚型，也没有排除大脑中其他部位存在的其他神经元群体参与该作用。为了有力地说明这些问题，需要区域特异性灭活大脑中的瘦素受体，进行进一步研究(参见Cohen et al.，2001，J.Clin.Invest108：1113-1121)。
使用遗传修饰的小鼠株系说明瘦素抗骨生成作用的特异性。参与瘦素抗骨生成作用的一个神经肽是αMSH，该神经肽由ARC神经元产生，与黑素皮质素受体相结合。在不表现出骨质异常的Ay/a小鼠和Mc4-r缺陷型小鼠中该信号传导通路遭到破坏。另外，Ay/a小鼠对瘦素的抗骨生成作用没有抗性，而用黑素皮质素受体激动剂处理ob/ob小鼠减轻其体重，但不影响其骨质。这些结果说明黑素皮质素不是骨形成的主要调控因子，和MSG诱导的损伤对瘦素抗骨生成功能不具有明显的作用相一致。CART是另一个致厌食的神经肽，其在下丘脑中的表达受瘦素的调控(参见Kristersen et al.，1998，Nature 393：72-76)。高脂饮食的Cart缺陷型小鼠发生轻度肥胖(参见Asnicar et al.，2001，Endocrinology，142：4394-4400)，但不具有HBM。MSG或GTG处理的小鼠和突变型小鼠株系的下丘脑中能够差异性调节瘦素致厌食作用和抗骨生成作用，说明这两种功能至少部分由不同的神经元群体所介导。
8.4.2. 交感神经活性和对骨形成的调节
多个证据，包括联体实验、Dbh缺陷型小鼠的分析、用交感神经激动剂或拮抗剂处理ob/ob、野生型或卵巢切除小鼠的结果都确认了SNS是骨形成的主要调节因子。β阻断剂对骨形成的这种合成代谢作用解释了其对大鼠骨折的有益作用(参见Minkowitz et al.，1991，JOrthop Res 9：869-875)。在这些实验中，SNS对骨质的作用不依赖于体重或脂肪重的变化。而且，瘦素ICV灌注不能减轻Dbh缺陷型小鼠和经普萘洛尔处理的小鼠中的骨质，揭示了瘦素抗骨生成作用和交感神经活性之间的功能联系。
其他的小鼠遗传学观察也支持存在有对骨形成的交感神经调节。多巴胺转运蛋白缺陷的小鼠中不发生突触前末端对多巴胺的快速吸收，因此骨质减少(参见Bliziotes et al.，2000，Bone 26：15-19)。后一发现说明Dbh缺陷型小鼠中循环多巴胺水平的增加(参见Alaniz etal.，1999，Proc Natl Acad Sci USA 96：2274-2278)限制其骨表型，而非产生或放大其骨表型。在联体小鼠中的交互循环实验没有排除瘦素抗骨形成作用中存在短寿命体液介质的可能性。但是，肾上腺切除实验的结果推翻了这种机制。类似的，全垂体功能减退患者的低骨质也不支持这一说法(参见Kaufman et al.，1992，J Clin Endocrinol Metab74：118-123)。
8.4.3. 瘦素作为控制激素(master hormone)
包括控制体重、生育和骨形成的瘦素多效性功能使人联想到氢化可的松、雌激素、甲状腺素和胰岛素等激素的许多功能。根据发育过程中控制基因协调细胞分化程序的说法进行类推，提出：瘦素和其他激素定义为参与协调控制重要体内平衡功能的一组控制激素。控制激素的这些功能可以采用不同的作用模式。事实上，对糖皮质激素受体突变体的分析表明和其受体结合的氢化考的松使用不同的方式产生不同的功能(参见Reichardt et al.，1998，Cell 93：531-541和Karst et al.，2000，Nat Neurosci 3：977-978)。这里的证据区分了瘦素致厌食作用模式和抗骨生成作用模式，说明对于瘦素来说情况也是如此。脊椎动物中控制激素通过不同的通路发挥多种功能的能力可能是进化过程中大型动物将逐渐增加的体内平衡复杂性进行整合的方式。
8.4.3. 生物医学应用
有一个证据说明对骨质的交感神经调节存在于人类中并发挥重要作用。反射性交感神经营养不良是以高肾上腺素活性为特征的人类疾病，其表现包括骨质疏松。用β阻断剂治疗受这些疾病影响的患者能够纠正大多数表现，包括骨质疏松(参见Schwartzman，2000，N Engl JMed 343：654-656)。以过量交感神经活性为特征的人类疾病中骨质疏松的存在，以及用β阻断剂治疗后骨质疏松的消失和该实施例中的发现是一致的。虽然许多药物能够有效地阻断该疾病中的骨损坏，还需要能够促进骨形成的药物。这里所观察到的广泛使用的、没有主要有害效应的普萘洛尔能够显著促进骨形成和骨质，而不影响体重，说明β肾上腺素能拮抗剂或其衍生物可以用语治疗骨质疏松。
发明书中所提到的所有专利和其他出版物代表本发明所属领域的熟练技术人员水平。所有专利和其他出版物在此引入作为参考，如同每个单独的出版物具体、单独引入作为参考一样。
本领域的熟练技术人员可以认识到本发明适于实现目标，获得所提到的终产品和优势，以及其中固有的优势。这里所述的瘦素、瘦素受体、瘦素抗体、瘦素类似物、瘦素激动剂和拮抗剂、激动剂和拮抗剂、药物组合物、治疗、方法、程序和技术代表优选的实施方案，是示例性的，并不对范围作任何限制。其中的变化以及其他用途对于本领域的熟练技术人员来说是存在的，属于下面权利要求书所定义的范围。
                              序列表
<110>KARSENTY，Gerard
     SHU，Takeda
     ELEFTERIOU，Florent
<120>通过调节交感神经紧张性控制骨形成的方法和组合物
<130>AUXT-PCN-006
<140>
<141>
<150>PCT/US02/34920
<151>2002-10-31
<150>60/337,054
<151>2001-12-05
<160>20
<170>PatentIn version 3.0
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uauaugacaa agcugunnnn acagagnagu ccuugugugg uaaagacacg                50
<210>13
<211>61
<212>RNA
<213>人
<220>
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<223>n＝a，u，g，或c
<400>13
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u                                                                     61
<210>14
<211>69
<212>RNA
<213>人
<220>
<221>misc_特性
<223>n＝a，u，g，或c
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<210>15
<211>61
<212>RNA
<213>人
<220>
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<223>n＝a，u，g，或c
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gguuucuuca gugaaauuac acaaagcagc nnnngcugag nagucaguua ggucacacau     60
c                                                                      61
<210>16
<211>53
<212>RNA
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<220>
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<223>n＝a，u，g或c
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acccauuaua acacaaagcu  gannnnucag agnagucauc ugaagguuuc uuc            53
<210>17
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<210>18
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<210>20
<211>20
<212>DNA
<213>人
<400>20
agcgatgatg aaccaggtta                                                 20

Claims (40)

1.治疗骨质疏松症状的方法，该方法包括向需要所述治疗的哺乳动物施用治疗有效量的β肾上腺素能拮抗剂。
2.权利要求1的方法，进一步包括施用治疗有效量的瘦素拮抗剂。
3.权利要求1或2的方法，其中β肾上腺素能拮抗剂选自β1、β2和β3拮抗剂。
4.权利要求2的方法，其中瘦素拮抗剂选自乙酰苯酚、结合瘦素的抗体和结合瘦素受体的抗体。
5.预防骨质疏松症状的方法，该方法包括施用能够有效预防所述症状的一定量的β肾上腺素能拮抗剂。
6.权利要求5的方法，进一步包括施用瘦素拮抗剂。
7.权利要求5或6的方法，其中β肾上腺素能拮抗剂选自β1、β2和β3拮抗剂。
8.权利要求6的方法，其中瘦素拮抗剂选自乙酰苯酚、结合瘦素的抗体和结合瘦素受体的抗体。
9.治疗骨硬化或骨骼石化症症状的方法，该方法包括向需要所述治疗的哺乳动物施用治疗有效量的β肾上腺素能激动剂。
10.权利要求9的方法，进一步包括施用治疗有效量的瘦素激动剂。
11.权利要求9或10的方法，其中β肾上腺素能激动剂选自β1、β2和β3激动剂。
12.预防骨硬化或骨骼石化症的方法，该方法包括施用β肾上腺素能激动剂。
13.权利要求12的方法，进一步包括施用瘦素激动剂。
14.权利要求12或13的方法，其中β肾上腺素能激动剂选自β1、β2和β3激动剂。
15.调节瘦素对骨的作用的方法，该方法包括：向需要所述调节的哺乳动物施用能够改变所述哺乳动物交感神经紧张性的、治疗有效量的药物组合物。
16.调节骨质的方法，该方法包括：向需要所述调节的哺乳动物施用能够改变所述哺乳动物交感神经紧张性的、治疗有效量的药物组合物，使所述哺乳动物的骨质得以调节。
17.治疗骨病症状的方法，该方法包括：向需要所述治疗的哺乳动物施用能够改变所述哺乳动物交感神经紧张性的、治疗有效量的药物组合物。
18.预防骨病症状的方法，该方法包括：向需要所述预防的哺乳动物施用能够改变所述哺乳动物交感神经紧张性的、有效量的药物组合物。
19.权利要求15、16、17或18的方法，其中的药物组合物包含瘦素激动剂。
20.权利要求15、16、17或18的方法，其中的药物组合物包含瘦素拮抗剂。
21.权利要求20的方法，其中的瘦素拮抗剂选自乙酰苯酚、结合瘦素的抗体和结合瘦素受体的抗体。
22.权利要求15、16、17或18的方法，其中的药物组合物包含交感神经系统激动剂。
23.权利要求22的方法，其中交感神经系统激动剂是β肾上腺素能激动剂。
24.权利要求22的方法，其中交感神经系统激动剂选自肾上腺素、异丙肾上腺素、多巴胺和杜丁胺。
25.权利要求15、16、17或18的方法，其中的药物组合物包含交感神经系统拮抗剂。
26.权利要求25的方法，其中交感神经系统拮抗剂是β肾上腺素能拮抗剂。
27.权利要求25的方法，其中交感神经系统拮抗剂选自普萘洛尔、艾司洛尔、美托洛尔、阿替洛尔、醋丁洛尔、酚妥拉明、妥拉唑啉、哌唑嗪、特拉唑嗪、多沙唑嗪、曲马唑嗪、吲哚胺、苯氧苄胺、二苯扎明、胍乙啶、胍那决尔、利血平和甲基酪氨酸。
28.权利要求15、16、17或18的方法，其中的药物组合物包含瘦素激动剂和交感神经系统激动剂。
29.权利要求15、16、17或18的方法，其中的药物组合物包含瘦素拮抗剂和交感神经系统拮抗剂的组合。
30.权利要求16的方法，其中骨质增加。
31.权利要求16的方法，其中骨质减少。
32.权利要求17或18的方法，其中骨病特征是和非发病骨相比骨质减少。
33.权利要求32的方法，其中的骨病选自骨质疏松、骨质稀少和佩吉特病。
34.权利要求17或18的方法，其中骨病特征是和非发病骨相比骨质增加。
35.权利要求34的方法，其中的骨病选自骨骼石化症、骨硬化、骨软骨病和pynchodisostosis。
36.诊断或预测哺乳动物中骨病的方法，该方法包括：
(a)测定怀疑具有骨病的哺乳动物的交感神经紧张性和瘦素活性；
和
(b)将步骤(a)中测得的值和相应的对照值相比较。
37.用于哺乳动物的药物组合物，该组合物包含治疗有效量的β肾上腺素能拮抗剂和瘦素拮抗剂。
38.用于哺乳动物的药物组合物，该组合物包含治疗有效量的β肾上腺素能激动剂和瘦素激动剂。
39.用于哺乳动物的药物组合物，该组合物包括治疗有效量的多巴胺β羟化酶和瘦素拮抗剂。
40.权利要求37、38或39的方法，进一步包括药学上可接受的载体。
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