JP3015383B2 - 形質導入した線維芽およびそれらの使用 - Google Patents

形質導入した線維芽およびそれらの使用

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ホワイトヘツド・インスチチユート・フオー・バイオメデイカル・リサーチ
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Description

【発明の詳細な説明】 背景 胚において、中胚葉は３つの一次胚芽層の中央のもの
であり、そして外胚葉および内胚葉の間に横たわる。そ
れは、発育の間に、結合組織、すべての体の筋糸、血
液、心臓血管およびリンパ系、尿生殖器の系の大部分お
よび心膜腔、胸膜腔および腹膜腔の内層を生ずる。結合
組織、血管および血液、リンパ系および心臓を生産する
中胚葉の部分は、間葉と呼ばれる。間葉細胞により産生
される細胞の１つの型は線維芽細胞であり、これは細胞
質プロセスをもつ星細胞または紡錘形細胞である。それ
らは結合系中に存在し、そしてコラーゲン線維を形成す
ることができる。
線維芽は、体中の他の細胞のように、すべての遺伝物
質の全体の相補体を合有する。しかしながら、それらが
含有する遺伝子の小さい百分率のみが生物学的に機能的
レベルが発現されるのみである。すなわち、線維芽中の
遺伝子の大部分はまったく発現されないか、あるいはそ
れらがエンコードするポリペプチドが生物学的に非機能
的であるか、あるいは意味がない、許容されない量また
は濃度で産生されるようなレベルで発現される。
最近開発された方法を使用して、種間の遺伝子の組み
換えを達成することが可能である。異なる生物学的クラ
スから誘導された遺伝子は複製することができ、そして
選択した微生物中で発現される。したがって、他のクラ
スの有機体の特性である代謝または合成の機能（例え
ば、ホルモンの合成、タンパク質の合成、窒素の固定）
を特定する微生物の遺伝子中に、遺伝子を特定のウイル
スまたはプラスミドのレプリコン結合することによっ
て、導入することができる。
1970年代の後半まで、クローニングしたDNA配列を哺
乳動物の細胞中に導入する一般的方法の開発に向かって
進歩がなされてきた。しかしながら、現在の時点におい
て、遺伝物質を線維芽中に安定に導入し、そして線維芽
が通常発現しないか、あるいは生物学的に意味のないレ
ベルで発現する、遺伝物質を発現される有効な方法が要
求されている。
発明の要約 ここに記載する本発明は、遺伝子操作した間葉または
結合組織の細胞に関し、とくにこのような細胞中で有意
の濃度で通常発現されない遺伝物質を、生物学的に有意
にレベルで発現する、遺伝子操作された線維芽に関す
る。本発明は、また、このような遺伝物質を線維芽中に
安定に導入する方法および遺伝子操作された線維芽を使
用する方法に関する。
本発明の線維芽は、それらの中に問題を遺伝物質を安
定し導入し、そして組み込まれた遺伝物質を発現する。
この問題の遺伝物質は、ここで組み込まれた遺伝物質と
呼ぶ。組み込まれた遺伝物質は、線維芽中に通常存在し
ないDNAまたはRNA;線維芽中に通常存在するが、生物学
的に有意なレベル（すなわち、それがエンコードするポ
リペプチドの通常の生理学的作用を産生するために十分
なレベル）でそれらの中に発現されないDNAまたはRNA;
線維芽中に通常存材しかつそれが線維芽中で発現される
ように修飾されているDNAまたはRNA;および単独である
いはそれらの任意の組み合わせで、線維芽により発現さ
れるように修飾することができるDNAまたはRNAであるこ
とができる。本発明の線維芽により発現される組み込ま
れた遺伝物質は、選択可能なマーカーをエンコードし、
こうして組み込まれた遺伝物質を発現する細胞を同定し
かつ選択する手段を提供する、遺伝物質を包含すること
ができる。組み込まれた遺伝物質を含有する線維芽は、
形質導入された線維芽と呼ぶ。
とくに、線維芽中で生物学的に有意のレベルで通常発
現されない、問題のポリペプチドまたはタンパク質をエ
ンコードする遺伝物質を包含する遺伝物質で線維芽を安
定に形質導入するために、レトロウイルスを使用した。
このようにして導入された遺伝物質は、また、優生な選
択可能なマーカーをエンコードする遺伝物質を包含す
る。問題のポリペプチドをエンコードするDNAおよび優
生な選択可能なマーカーをエンコードするDNAを包含す
る遺伝物質を、培養した線維芽中に導入した。遺伝子が
導入された線維芽（すなわち、レトロウイルスのベクタ
ーの使用により形質導入された線維芽）によるこれらの
遺伝子の発現は、また、実証された。
それらが含有する組み込まれた遺伝物質を発現する形
質導入された線維芽を移植する方法は、また、本発明の
主題である。本発明の形質導入された線維芽は、現在非
経口的に投与される、予防および治療または処置におい
て有用である、ポリペプチドまたはタンパク質の構成的
供給のために使用される。それらは皮膚の移植片および
グリア細胞または線維芽移植片中で使用することがで
き、これらは問題のポリペプチドまたはタンク質をエン
コードするDNAを中枢神経系中に導入する。
本発明の線維芽および問題点のポリペプチドまたはタ
ンパク質のために供給系、それらを非常に有用とする、
多くの利点が存在する。例えば、問題のポリペプチドま
たはタンパク質（例えば、ホルモン、酵素、薬物）をエ
ンコードする組み込まれた遺伝物質を包含する線維芽を
使用する皮膚移植片は、エンコードされたポリペプチド
を合成し、こうしてそのポリペプチドのための連続的供
給系として働く。このようにして、ホルモンまたは他の
ポリペプチドを皮膚移植片を受ける個体の血液流中の拡
散される。
重要な利点は、本発明の遺伝子操作された線維芽を使
用して、現在静脈内、筋肉内または皮下に投与されてい
る治療タンパク質（例えば、ホルモン、酵素、凝固因
子）を投与することができる。さらに、一般に分離した
ポリペプチド（例えば、インスリン）で必要であるよう
に、個体への投与の前に、ポリペプチドの広範な（かつ
しばしば経費のかかる）精製を必要としない、本発明に
より修飾された線維芽は、通常産生されるように、ポリ
ペプチドのホルモンを産生する。例えば、インスリンの
場合において、遺伝子操作された線維芽は膵臓中につく
られるものと同一の形態でインスインを産生する。
本発明の線維芽を有する移植片の使用に対する他の利
点は、移植片の大きさ調節することによって、体に供給
されるポリペプチドの量を調節することができる。さら
に、皮膚移植片の場合において、ポリペプチドの産生を
必要としなくなった場合、それを切除することができ
る。例えば、ポリペプチド（ホルモン、酵素、または薬
物）の供給は特定の期間のためにのみ必要である場合、
処置がもはや必要でないとき、操作した移植片を除去す
ることができる。
本発明の供給系の他の重要な利点は、それが連続的供
給系であるので、ポリペプチドのホルモンが非常に短い
半減期を有するという事実は限定ではないということで
ある。例えば、ヒト成長ホルモンの半減期はほぼ18分、
副甲上腺ホルモンのそれはほぼ2.5〜５分、そして自然
インスリン（純粋なインスリン）のそれはほぼ３〜４分
である。
遺伝子はレトロウイルスのベクターを使用して線維芽
中に導入することができるので、それらはレトロウイル
スのベクターの制御を「オン」とする（それに付す）こ
とができる；このような場合において、問題の遺伝子を
レトロウイルスのプロモーターから転写される。プロモ
ーターは、RNAの合成を開始するRNAポリメラーゼ分子に
より認識される、特定のヌクレオチド配列である。ある
いは、問題の遺伝物質の転写の原因となる追加のプロモ
ーター要素（組み換えレトロウイルス中に組み込まれた
プロモーターに加えて）を有するレトロウイルスのベク
ターを使用することができる。例えば、外部の因子また
はキューにより変調される追加のプロモーターが存在す
る構成体を使用することができ、その外部の因子または
キューを活性化することによって線維芽により産生され
るポリペプチドのレベルを制御することができる。例え
ば、熱衝撃タンパク質が、プロモーターが温度により調
節される遺伝子によりエンコードされるタンパク質であ
る。金属を含有するタンパク質のメタロチオニンをエン
コードする遺伝子のプロモーターは、カドミウム（C
d++）イオンに対する応答性である。外部のキューによ
り影響を受けるこのプロモーターまたは他のプロモータ
ーの組み込みは、また、操作した線維芽によりポリペプ
チドの産生を調節することができる。
図面の簡単な説明 第１図は、野生型ネズミ白血病ウイルス（レトロウイ
ルス）のゲノムの概略的表示である。
第２図は、各々が組み換えゲノムを有する、本発明に
おいて有用なレトロウイルスのベクターの概略的表示で
ある。第2a図はpZIPNeoである；第2b図はpLJである；第
2c図はpWeである；第2d図はpEmである；そして、第2e図
はpIpである。
第３図は、第2b図に表されるpLJベクターおよびヒト
副甲状腺ホルモン遺伝子を使用する、組み換えレトロウ
イルスのベクターの構成の概略的表示である。
第４図は、表示する期間における、形質導入された線
維芽により産生されたヒト副甲状腺ホルモンの量を表す
グラフである。ダッシュ線は、組織培養平板上で形質導
入されたNIH3T3により産生を表す。実線は、ラットから
誘導されそして組織培養平板上で形質導入された線維芽
を表す。
第５図は、形質導入された線維芽単独（黒くした円）
あるいはサイト（cyto）３ビーズ上に被覆しそして全面
生長させた形質導入された線維芽を注射したラットにお
いて、表示した期間で、産生されたヒト副甲状腺ホルモ
ンの量を表すグラフである。
発明の詳細な説明 問題の遺伝物質を、線維芽中に組み込みそして生ずる
遺伝子操作された線維芽中で発現した。記載する方法に
より線維芽中に組み込まれる遺伝物質は、線維芽中に通
常存在しないDNA;線維芽中に通常存在するが、生物学的
に有意なレベル（すなわち、それがエンコードするポリ
ペプチドの通常の生理学的作用を産生するために十分な
レベル）でそれらの中に発現されないDNAまたはRNA;線
維芽中に通常存在しかつそれが線維芽中で発現されるよ
うに修飾されているDNAまたはRNA;および単独であるい
はそれらの任意の組み合わせで、線維芽により発現され
るように修飾することができるDNAまたはRNAであること
ができる。この問題の遺伝物質はここにおいて組み込ま
れた遺伝物質と呼ぶ。本発明の線維芽は組み込まれる遺
伝物質を発現する。本発明の線維芽により発現された組
み込まれた遺伝物質（すなわち、DNAまたはRNA）は、単
独であるいは選択可能なマーカーをエンコードする遺伝
子と組み合わせて、問題のポリペプチドまたはタンパク
質（問題の遺伝物質）をエンコードする遺伝物質であ
る。
例えば、ホルモンをエンコードする遺伝物質は、組み
換えゲノムを有するウイルスを含有する培地にそれらを
暴露することによって（すなわち、それらを感染するこ
とによって）線維芽中に導入した。使用する培地は、産
生体の細胞（例えば、Psiまたは両栄養性の産生体）を
増殖した培地を収穫することによって得る。すなわち、
産生体の細胞は、組織培養において、10％の仔ウシ選択
可能なマーカー（CS）およびペニシリンおよびストレプ
トマイシンを有するダルベッコ変性イーグル培地（DM
E）中で全面生長密度に増殖した。新鮮な培地を添加
し、そして引き続いて（例えば、ほぼ12時間後）、培地
を収穫する。ほぼ10mlの培地を全面産生体の細胞の10cm
の平板から収穫する。使用済みの培地（またはウイルス
のストック）は0.45ミクロンのミリポアフィルターで濾
過して分離した産生体の細胞を除去し、そして直ちに使
用して細胞を感染させるか、あるいは−70℃において貯
蔵する。培地を線維芽（受容体の線維芽）を全面以下
（subconfluent）平板から除去し、そして8mcg/mlのポ
リブレン（Aldrich）を含有するウイルスのストック
（例えば、5ml/10cmの平板）と急速に置換する。引き続
いて（例えば、ほぼ12時間後）、これを除去し、そして
新鮮な培地と置換する。こうして、使用する培地はウイ
ルスの上澄み液である。感染性ウイルスの組み換えゲノ
ムは、問題の遺伝物質を包含する。組み換えゲノムは、
また、優先な選択可能なマーカーをエンコードする遺伝
物質を有することができる。
こうして、生物学的に有意のレベルで通常発限されな
いポリペプチドおよび、必要に応じて、優生な選択可能
なマーカーを発現する線維芽をつくる。
とくに、pai am細胞中で産生された感染生ウイルス
を含有する培地に線維芽を暴露する；感染生ウイルスは
問題の遺伝物質を有する組み換えゲノムを含有する。１
つの場合における組み換えゲノムは、副甲状腺ホルモン
（hPTH）をエンコードする遺伝物質を包含する。必要に
応じて、それは、また、優先な選択関なマーカーをエン
コードする（例えば、ネオマイシン抵抗性をエンコード
するneo遺伝子）を包含することができる。結局、線維
芽は形質導入される−−すなわち、問題の遺伝物質（こ
の場合において、hPTHをエンコードするDNAおよび、必
要に応じて、neo遺伝子）は線維芽中に安定に導入す
る。形質導入された線維芽はエンコードされたhPTHを発
現しそして、neo遺伝子が存在する場合、それを発現
し、選択可能な特性を有する細胞を生ずる。
あるいは、線維芽は感染性ウイルスを含有する培地へ
の暴露の結果形質導入され、ここで組み換えゲノムは次
の１または２以上のエンコードするDNA: 低い密度のリポタンパク質のための受容体； ヒト成長ホルモン； ヒスチジドナールに対する抵抗性を付与する遺伝子； ヒトアデノシンデアミナーゼ； インターリューキン２の受容体； ヒトベータ−グロブリン； ヒトアルファ−グロブリン； ジヒドロフォレートリダクターゼの突然変異体の形
態； マルチドラグ（multidrug）抵抗性； ヒトからのグルコースセレブロシダーゼ； アデノウイルスからのE1A遺伝子； ヒトにおけるHLAのための多くの異なる遺伝子； ヒトアルブミン； ヒトオルニチントランスカルバマリアーゼ； E.coliからのベーターガラクトシダーゼ； E.coliにおけるネオマイシンに対する抵抗性； ヒトインスリン；および モロネー（Moloney）ネズミの白血病ウイルスからの
エンベロープタンパク質。
組み込まれた遺伝物質を発現する線維芽を、組織培養
容器中に全面生長させ；それらが増殖した培養容器から
除去し；そして体中に導入するか、あるいはそれに適用
する。それらは腹膜腔中に、単独でおよびコラーゲン被
覆表面を有するマイクロキャリヤービーズ上に被覆して
（ほぼ100細胞／ビーズ）導入された。あるいは、それ
らは皮膚移植片の１成分として、例えば、米国特許第4,
485,096号、その教示をここに引用によって加える、に
記載されているような方法を使用して適用することがで
きる。
組み込まれた遺伝物質を発現する線維芽は、また、中
枢神経系中に導入することができる。これは、例えば、
本発明の遺伝子操作された線維芽（すなわち、問題の遺
伝子を導入した線維芽）を定位的投与により脳の特定の
領域に直接導入することによって実施することができ
る。それは、また、腰椎穿刺によるか、あるいは直接室
中に脳脊髄液中に導入し、これは髄膜に沿って線維芽を
接種するであろう。
いったん体中に導入するか、あるいはそれに適用する
と、形質導入された線維芽は問題の遺伝物質によりエン
コードされたホルモン、酵素または薬物を連続的に供給
する。記載する実施例において、エンコードされた産生
物はhPTHである。
このようにして供給されたホルモン、酵素または薬物
の量は、必要に応じて変更または調節することができ
る。これは、例えば、それらの産生に影響を及ぼす外部
のキューまたは因子を使用することによって；適用され
た移植片の大きさまたは体中に導入された線維芽の量を
制御することによって；あるいは移植片を除去すること
によって実施される。
培養した線維芽 線維芽は被検体から皮膚のバイオプシー（例えば、体
の任意の区域からの小さいパンチバイオプシー）により
得る。生ずる組織を組織培養培地中に入れ、そして小さ
い片に分離する（例えば、メスを使用して組織を掻き裂
くことによって）。組織の小さい塊を組織培養フラスコ
の湿潤表面上に配置する；ほぼ10片を各フラスコ中に配
置する。フラスコを逆さにし、密閉し、そして室温にお
いて一夜放置する。室温において24時間後、フラスコを
倒立させる；組織の塊はフラスコの底に固定して止ま
り、そして新鮮な培地［例えば、10％のFBSおよびペニ
シリンおよびストレプトマイシンを有するハム（Ham）
のF12培地］を添加する。次いで、これを37℃において
ほぼ１週間インキュベーションする。この時点で、新鮮
な培地を添加し、そして引き続いて数日毎に交換する。
培養においてさらに２週後、１層の線維芽が出現する。
１層をトリプシン処理し、そして引っ掻いてより大きい
全長の中に入れる。線維芽をほぼ50世代の間培養するこ
とができる；ほぼその時に、それらは発症（crisis）と
呼ぶものを行い、そして引き続いて非常によく増殖しな
い。線維芽を引っ掻いてより大きいフラスコにいれる
（その上に再配置する）とすぐに、それらは後述するプ
ロトコルに従い感染する。
レトロウイルスのベクター レトロウイルスはRNAウイルスである；すなわち、ウ
イルスのゲノムはRNAである。しかしながら、このゲノ
ムはDNA中間体に転写され、この中間体に感染された細
胞の染色体のDNA中に非常に効率よく組み込まれる。こ
の組み込まれたDNA中間体をプロウイルスと呼ぶ。
第１図に示すように、レトロウイルスのゲノムおよびプ
ロウイルスのDNAは３つの遺伝子を有する:gag、polおよ
びenv、これらは２つの長い末端の反復（LTR）配列によ
りフランキングされている。gag遺伝子の内部の構造
（ヌクレオカプシド）タンパク質をエンコードする;pol
遺伝子はRNA指令DNAポリメラーゼ（逆トランスクリプタ
ーゼ）をエンコードする；そしてenv遺伝子はウイルス
のエンヴェロープ糖タンパク質をエンコードする。５′
および３′のLTRはヴィリオンRNAの転写およびポリアデ
ニル化を促進する。
５′LTRに隣接して、ゲノムの逆トランスクリプター
ゼため（tRNAプロモーター結合部位）およびウイルスの
RNAの粒子中への効率よい包膜のため（Psi部位）に必要
な配列が存在する。Mulligan、R.C.、Expreimental Ma
nipulation of Gene Expression、M.Inouye（編）、
155−173（1983）;Mann、R.et al.、Call、33:153−15
9（1983）;Cone、R.D.およびR.C.Mulligan、Proceeding
s of the National Academy of Sciences,U.S.
A.、81:6349−6353（1984）。
包膜（または感染性ヴィリオン中へのレトロウイルス
のRNAのパッケージング）に必要な配列がウイルスのゲ
ノムから失われる場合、ゲノムのRNAの包膜を防止するc
is欠損が生ずる。しかしながら、生ずる突然変異体はす
べてのヴィリオンのアンパク質の合成をなお指令するこ
とができる。ムリガン（Mulligan）および共同研究者ら
は、これらのPsi配列が欠失されているレトロウイルス
のゲノム、ならびに染色体中に安定に組み込まれた突然
変異体を含有する細胞系を記載した。Mulligan、R.C.、
Expreimental Manipulation of Gene Expression、
M.Inouye（編）、155−173（1983）;Cone、R.D.および
R.C.Mulligan、Proceedings of the National Acad
emy of Sciences,U.S.A.、81:6349−6353（1984）。
これらの刊行物の教示をここに引用によって加える。
ムリガン（Mulligan）および共同研究者らが記載する
Psi2細胞系は、捕食のモロニー（Moloney）ネズミ白血
病ウイルス（Mo−MuLV）である、pMOV−Psi-でNIH3T3線
維芽でトランスフェクションすることによってつくっ
た。pMOV−Psi-はウイルスの遺伝子産生物を発現する
が、ウイルスのゲノムの包膜に必要であるPsi配列を欠
く。pMOV−Psi-は、マウス（および関連する齧歯類）の
細胞のみ上に存在する受容体を認識する捕食のウイルス
のエンヴェロープ糖タンパク失を発現する。
他の細胞系は、Psi−２−様パッケージング細胞系で
ある、Psi am系である、これらのPsi−am細胞系は修飾
したPsi−ゲノムを含有し、ここで捕食のエンヴェロー
プ糖タンパク質は両栄養性ウイルス4070Aから誘導され
たエンヴェロープ配列で置換されている。Hartley、J.
W.およびW.P.Rowe、Journal of Virology、19:19−25
（1976）。結局、それらは両栄養性宿主範囲をもつ組み
換えウイルスの産生に有用である。Psi am細胞系をつ
くために使用したレトロウイルスは非常に広い哺乳動物
の宿主範囲（両栄養性宿主の範囲）を有し、そしてヒト
細胞の感染に使用することができる。細胞の向性は、
「ウイルスが完全な複製サイクルを行う、ウイルスおよ
び細胞の性質」を呼ぶ。Weiss、R.et al.、RNA Tumor
Viruses、Vol.1（第２版）、Cold Spring Harbor、
p.73、1984。両栄養性ウイルスは、広い宿主範囲を有し
かつ相同および異種の両者の細胞中で複製するものであ
る。組み換えゲノムがPsiパッケージング配列を有する
場合、Psi am細胞系に組み換えレトロウイルスのゲノ
ムを感染性レトロウイルスの粒子中にパッケージングす
ることができる。Cone、R.D.およびR.C.Mulligan、Proc
eedings of the National Academy of Sciences,
U.S.A.、81:6349−6353（1984）。
レトロウイルスのゲノムは、新しい遺伝子を細胞中に
導入することができるベクターとして使用するため、コ
ーン（Cone）およびムリガン（Mulligan）により修飾さ
れた。第２図に示すように、gag、polおよびenv遺伝子
はすべて除去し、そしてneo遺伝子をエンコードするDNA
セグメントをそれらの場所に挿入した。neo遺伝子は優
生な選択可能なマーカーとして働く。組み換えゲノムの
部分を残すレトロウイルスの配列は、LTR、tRNA部位お
よびPsiパッケージング部位を包含する。Cepko、C.et
al.、Cell、37:1053−1062（1984）。
本発明の形質導入された線維芽の産生に使用した追加
のベクターの構成は第２図に表されており、そして下に
詳述する。
pZip。このベクターの構成は、Cepko、C.et al.、Ca
ll、37:1053−1062（1984）中に記載された。簡潔的に
は、このベクターは２つの遺伝子を発現することができ
る：問題の遺伝子および選択可能なマーカーとしてneo
遺伝子。
問題の遺伝子をBamH I中に５′LTRに対してちょうど
末梢にクローニングし、切り継ぎ供与体部位および切り
継ぎ受容体部位によりフランキングされている。２つの
転写体はプロウイルスの転写から生ずる：未処理転写体
は問題の遺伝子を発現するが、「処理した」転写体はne
o遺伝子の発現を生ずるのであろう。
pLJ。このベクターの特性は、Korman、A.J.et al.、
Proceedings of the National Academy of Scien
ces,U.S.A.、84:2150（1987）に記載されている。この
ベクターは２つの遺伝子を発現することができる：問題
の遺伝子および優生な選択可能なマーカー、例えば、ne
o遺伝子。問題の遺伝子は直接な向きにBamH I/Sma I/Sa
l Iクローニング部位中に５′LTRに対してちょうど末梢
にウローニングするが、neo遺伝子を内部のプロモータ
ー（SV40から）（これはクローニング部位より遠い３′
である）（クローニング部位の３′に位置する）に対し
て末梢に配置する。pLJからの転写は２つの部位におい
て開始する:1）５′LTR、これは問題の遺伝子の発現す
る原因となる、および２）内部のSV40プロモーター、こ
れはneo遺伝子の発現の原因である。
pWe。このベクターの構成および最初の特性は記載さ
れた。Choudory、P.V.et al.、CSH Symposia Quanti
tative Biology、L.I.1047（1986）。簡潔的には、こ
のベクターは２つの遺伝子の発現を誘導する：優生な選
択可能なマーカー、例えば、Neo、これは５′LTRからち
ょうど下流に存在する、および問題を遺伝子、これは高
いレベルの構成的発現を行うことができる内部のプロモ
ーターからちょうど下流中にクローニングすることがで
きる。いくつかの異なる内部のプロモーター、例えば、
ニワトリからのベータ−アクチプロモーター（Choudor
y、P.V.et al.、CSH Symposia Quantitative Biolo
gy、L.I.1047（1986））、およびヒトからのヒストンH4
プロモーター（Hanly、S.M.et al.、Molecular and
Cellular Biology、５:380（1985））を使用した。neo
遺伝子の発現は、５′LTRにおいて開始する転写からで
ある；問題の遺伝子の発現は、内部のプロモーターにお
いて開始した転写からである。
pEm。この簡単なベクターにおいて、野生型ウイルス
のgag、polおよびenvの全体の解読配列を、発現された
唯一の遺伝子である、問題の遺伝子で置換する。pEmベ
クターの成分は後述する。５′フランキング配列、５′
LTRおよび400bpの連続的配列（BAMHI部位まで）はpZIP
からである。３′フランキング配列およびLTRは、ま
た、pZIPからである；しかしながら、３′LTRから150bp
上流のcla部位はBAMHIでリンカーされており、そしてベ
クター中に存在するBamH Iクローニング部位の他の半分
を形成する。pBR322のHind III/EcoR I断片はプラスミ
ドの主鎖を形成する。このベクターはモロニー（Molone
y）ネズミ白血病ウイルスの菌株からクローニングした
配列から誘導する。類似のベクターは、骨髄増殖性肉腫
ウイルスから誘導された配列から構成した。
pIp。このベクターは内部のプロモーターから誘導さ
れた単一の遺伝子を発現することができる。これらの構
成を下に要約する。５′フランキング配列、５′LTRお
よび1400pbの連続的配列を包含するベクターの５′の区
画（gag領域中のxho部位まで）は、野生型モロニー（Mo
loney）白血病ウイルスの配列から誘導する。Shinnick
et al.,Nature、293:543（1981）。２つの間の差はS
ac IIリンカーがgag遺伝子のATGに直ぐに隣接するHae I
II制限部位中にクローニングする。３′フランキング配
列、３′LTRおよび３′連続的配列を包含するベクター
の３′区画（env解読領域中のcla I部位まで）はpZIPか
らである。しかしながら、２つの修飾が存在する:1）cl
a I部位はBamH Iに結合されている、および２）エンハ
ンサーを含む３′LTR中の小さい配列（Pvu II〜Xba I）
が欠失されている。ベクターの５′および３′の架橋
は、いくつかのプロモーターの１つである；各１つはXh
o I/BamH I断片上に含有され、そして各々はほとんどの
組織中の高いレベルの構成的発現を行うことができる。
これらのプロモーターは、ニワトリからのベータ−アク
チンプロモーター（Choldory、P.V.et al.、CSH Symp
osia Quantitative Biology、L.I.1047（1986））、
およびヒトからのヒストンH4プロモーター（Hanly、S.
M.et al.、Molecular and Cellular Biology、５:3
80（1985））を包含する。ベクターの主鎖はpBR322から
のHind III/EcoR I断片である。問題の遺伝子は、BamH
I部位中に、直接に向きに、内部のプロモーターからち
ょうど下流にクローニングした。
ROベクター。このベクターはベクターの異種群を表
し、ここで問題の遺伝子は転写に必要なすべての配列
（すなわち、プロモーター／エンハンサー、イントロン
をもつおよびもたない解読配列、およびポリアデニル化
シグナル）を含有し、そしてその転写が正常のレトロウ
イルスの転写のそれに反対の方向である向きにレトロウ
イルス中に導入する。これは導入された遺伝子の調節に
おいて含まれる。cis−作用要素のより多くの含むこと
を可能とする。事実上、前述の遺伝子のいずれをもROベ
クターであるように適合することができる。１つの例は
コーン（Cone）らにより記載され、ここで全体のベータ
グロブリン遺伝子を逆向きでpZipのBamH I部位中にクロ
ーニングする。Cone、R.D.およびR.C.Mulligan、Procee
dings of the National Academy of Sciences,U.
S.A.、81:6349−6353（1984）。ROベクターを構成し、
ここで問題の遺伝子はpIpのXho I/BamH I部位中にクロ
ーニングした（本質的に内部のプロモーターを置換す
る）。問題の遺伝子が挿入さたベクター、ならびに構成
対を発現について試験したとき得られた結果を表１に示
す。
選択可能なマーカーを包含するベクターは、第2a図、
第2b図および第2c図に表されている。第2a図において、
pZIP neo SVX、セプコ（Cepko）により記載されてい
る、を表す。Cepko、C.et al.、Cell、37:1058−1062
（1984）。ここで、既知の技術を使用して、それらの間
の問題の遺伝子が挿入された、切り継ぎ供与体（splice
donor）および切り継ぎアクセプト（accept）、また
はSDおよびSAと記載する、が存在する。挿入した遺伝子
の発現は未処理のメッセージにおけるLTRに基づく；処
理したメッセージはネオマイシンの発現の原因である。
第2b図には、ベクターpLJが表されている。pLJにおい
て、問題の遺伝物質は５′LTR直後に挿入されている。
この遺伝物質の発現はLTRから転写され、そしてneo遺伝
子の発現は内部のSV40プロモーターから転写される。
第2c図において、pWeが表されている。LTRプロモータ
ーおよび転写体はネオマイシンの発現の原因となり、そ
して内部のプロモーターは問題の遺伝子の発現の原因と
なる。この型のベクターにおいて有用なプロモーター
は、ニワトリのベータ−アクチン、ヒトヒストン、単純
ヘルペスチミジンキナーゼ、thy1（Ｔ細胞において使用
する組織特異的プロモーター）およびラットアルブミン
から誘導されたプロモーターを包含する。
選択可能なマーカーをまたないベクターは、また、線
維芽を問題の遺伝物質で形質導入するために使用するこ
とができる。ベクターは、このようなマーカーが存在す
る、前述のベクターの基本的な簡素化されたものであ
る。ベクターpEmはは第2d図に表されている；表されて
いるように、ベクターの主要な成分は５′および３′LT
R、および２つのLTRの間に挿入された問題の遺伝物質で
ある。pIpは、内部のプロモーターが存在する、１系列
の有用なベクターを表す。第2e図に表されるように、内
部のプロモーターをフランキングする各末端においてLT
Rが存在する；これらのベクターにおいて有用なプロモ
ーターは、ニワトリのベータ−アクチン、ヒトヒスト
ン、単純ヘルプスチミジンキナーゼおよびthy1を包含す
る。
線維芽中の遺伝物質の導入および遺伝物質の発現の評価 組み換えゲノムを有する組み換え両栄養性レトロウイ
ルスを産生する細胞継を使用して、線維芽を感染させ
る。前述したように、組み換えゲノムは種々の成分を包
含することができるが、一般に２つのLTRおよび、gagの
代わりに、polおよびenv配列、第２プロモーター配列お
よび、ある場合において、選択可能なマーカーをエンコ
ードする遺伝子（例えば、neo）から構成される。
問題の遺伝物質を線維芽中に導入するために使用する
ウイルスのストックを、前述したように、収穫し、８μ
g/ml（mcg/ml）のポリブレン（Aldrich）を補充し、そ
して線維芽の培養物を添加する。ウイルスの力価が高い
（例えば、ほぼ106cfu/ml）である場合、事実上すべて
の線維芽は感染され、そして選択（例えば、組み換えゲ
ノムを包含するベクターが導入された線維芽の選択）は
必要ではない。力価が非常ひ低い場合、選択可能なマー
カー、例えば、neoまたはhisを有するレトロウイルスの
ベクターを使用することが必要である。選択可能なマー
カーを使用する場合、ウイルスの発現後、細胞を全面生
長させ、そして選択的培地に分割する（例えば、選択可
能なマーカーがneoである場合、培地はG418を含有し、
選択可能なマーカーがhisである場合、培地はヒシツジ
ノールを含有しそしてヒスチジンを含有しない）。
neo遺伝子がトランスポゾンTncから誘導されたバクテ
リアの遺伝子であり、これはバクテリア細胞中でネオマ
イシン抵抗性をエンコードし、そして哺乳動物細胞中で
抗生物質G418に対する抵抗性をエンコードする。このne
o遺伝子は優性な選択可能なマーカーとして作用する；
哺乳動物細胞中のその存在はその細胞をG418の存在下に
増殖するものに変換する。（それが存在しない場合、細
胞はG418の存在下に死亡する。）結局、哺乳動物細胞中
のこの遺伝子の存在はG418を含有する培地中で細胞を培
養することによって決定することができる。この組み換
えゲノムを有する組み換えレトロウイルスは、neoウイ
ルスと呼ぶ。
neo遺伝子を有する組み換えレトロウイルスのベクタ
ーは、また、クローニング部位を有する、結局、問題を
遺伝物質はベクター中に導入し、線維芽中に組み込み、
そして組み換えレトロウイルスで形質導入された線維芽
により発現することができる（組み込まれた遺伝物質を
有する線維芽と呼ぶ）。
BamH Iクローニング部位において、問題の遺伝物質を
挿入することができる。問題の遺伝物質は、線維芽中に
通常存在したいDNA;線維芽中に通常存在するが、生物学
的に有意なレベル（すなわち、それをエンコードするポ
リペプチドの通常の生理学的作用を生成するために十分
なレベル）でそれらの中に発現されないDNAまたはRNA;
線維芽中に通常存在しんかつそれが線維芽中で発現され
るように修飾されているDNAまたはRNA;および単独であ
るいはそれらの任意の組み合わせで、線維芽により発現
されるように修飾することができるDNAまたはRNAである
ことができる。
副甲状腺ホルモン（hPTH）をエンコードする遺伝子の
コピーを、次の方法で、この部位（例えば、pLJ）中に
クローニングした:pLJプラスミドをBamH Iで消化し、引
き続いて酵素の仔ウシ腸ホスファターゼで処理する。こ
の後、直線のベクターをアガロースゲルで分画し、そし
て、ガラスビーズを使用して、精製した。さらに、ヒト
PTH遺伝子を含有するBamH I断片を、pBR322中にクロー
ニングしたヒトPTHの完全なcDNAを含有するする、ヘン
ディイ（Hendy）らが記載するプラスミドから調製し
た、Hendy et al.、Proceedings of the National
Academy of Soienoes,U.S.A.、78:7365−7369（198
1）。
17bpの５′非翻訳配列、すべての解読配列および31bp
の３′非翻訳配列を含有する、PTH cDNAの下位（sub）
断片を、最初のプラスミドをDde IおよびHinf Iで消化
し、そして600bpの断片を分離することによって分離し
た。この断片の末端をDNAポリメラーゼで処理、リセス
ド（recessed）末端中に充填した。BamH Iリンカーを平
滑末端にT4 DNAリガーゼで結合した。上からの結合混
合物をBamH Iで消化して、真性のBamH I制限断片を発生
させた。次いで、これはpBR322のBamH I部位中にサブク
ローニングし、これをベクターの構成においてhPTH源と
して使用する。
等しい量のpLJ直線の主鎖およびBamH I PTH断片を、
T4 DNAリガーゼの存在下に、一緒に添加した。生ずる
混合物を２つの断片の結合のために適当な条件下に維持
した。結合混合物を使用して、バクテリアのHB101を形
質転換し、次いでこれをカナマイシンを含有する寒天上
に配置した。Maniatis,T. et al.、Molecular Cloni
ng:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor La
boratory、pp250−251、504;Bolivar、F.およびK.Backm
an、Methods in Enzymology、R.Wu.（編）、Vol.68、
Academic Press、ニューヨーク（1979）。生ずるコロ
ニーを組み換えプラスミドについて分析した。
副甲状腺ホルモンは、体におけるカルシウムの調節に
おいて１つの役割を有するポリペプチドである。pPTH遺
伝子はヒト線維芽中に存在するが、それは生物学的に有
意のレベルでそれらの細胞中で発現されない。副甲状腺
ホルモン、例えば、hPTH、またはこのような細胞により
通常生物学的に有意のレベルでつくられない他の物質を
つくることができる線維芽は、個体に移植し、そしてホ
ルモン、または他の物質のための連続的供給系として働
く。
この物質はhPTHを参照して記載するが、記載する方法
を使用して、任意の遺伝子を線維芽中に導入することが
でき、そして細胞によるその発現は同様な方法で評価す
ることができる。説明するように、表１に列挙したタン
パク質または機能をエンコードするDNAはレトロウイル
スのベクター中にクローニングし、そして多くの場合に
おいて、同様な方法で線維芽中に導入し、そして形質導
入した細胞により発現することができる理解すべきであ
る。
hPTHをエンコードするDNAおよび選択可能なマーカー
をエンコードするDNA（例えば、neo遺伝子）を含有す
る、組み換えウイルス構成体を産生するPsi am細胞系
を使用して、前述したように、ウイルスのストックを産
生した。ウイルスのストックを収穫した;hPTH遺伝子を
含有するウイルスで形質導入しべき線維芽を、このスト
ックとともにインキューベーションした。この場合にお
いて、選択可能なマーカーを使用して、G418を含有する
培地上で培養することによって、形質導入した線維芽を
同定および選択する。ウイルスの力価が十分に高い場
合、本質的にすべての線維芽が、選択可能なマーカーお
よび適当な培地を使用して、感染および選択されること
は必要ではない。
本発明により方法でhPTHをエンコードするDNAで形質
導入した、ウイスター（Wistar）ラットからの倍数（di
ploid）線維芽は、アメリカン・タイプ・カルチャー・
コレクション（マリイランド州ロックビレ）に受け入れ
番号CRT9514で受託された。hPTH遺伝子を有する組み換
えレトロウイルスで形質導入された線維芽がhPTH遺伝子
を発現する能力は、生体外および生体内の両者で、評価
した。
生体外の評価は次のようにして実施した:hPTH遺伝子
を含有するウイルスで感染させ、そしてネオマイシン中
でウイスター（Wistar）ラットから確立した線維芽（FW
R）の二次培養により選択した、NIH3T3細胞によりhPTH
の生体外産生を評価した。NIH3T3細胞は、ニワトリ胚か
ら誘導し、そして生体外の選択的培養によ永久分裂のを
与える。FWR細胞をラット（Wistar）のシンジェネイッ
ク菌株から体外移植組織から誘導した。細胞は制限した
半減期を有し、そして二次培養物と呼ぶ。
両者の型の細胞は、前述したように、ウイルスで前に
感染させそして選択されたものであった。選択後、細胞
の各型を10cmの皿に接種し、そして全面生長させた。次
いで、新鮮な培地（10％のCS尾ペニシリンおよびストレ
プトマイシンを有するDME）を添加した；この時点を引
き続いて時間ゼロと呼ぶ。引き続く時間において、培地
のアリコートを収穫し、そして凍結した。24時間の終わ
りにおいて、すべての培地を細胞から除去し、そしてイ
ンキューベーター中に戻した;12時間後、追加のアリコ
ートを組織培養物中のヒトPTHの不安定性の分析のため
に取った。
アリコートをpPTHの存在について、完全なhPTHを測定
するラジオイムノアッセイ（Nichols）を使用して分析
した。技術は次の文献に記載されている：血清中のヒト
の完全な副甲状腺ホルモンの定量的決定のためのAllegr
o 完全なPTH/イムノアッセイ系（Allegro Intact pP
TH/Immunoassay System for the Quantitative De
termination of Human Intact Pararth yroid ho
rmon in Serum）、（Nichols Institute Diagnosti
cs、カリフォルニア州サンジュアンカプストラノ）（36
B−2170、有効7/86改訂）、その教示をここに引用によ
って加える。アッセイはほぼlng/ml血清の感度を有し、
そしてそれはラットhPTHと交差反応しないことにおいて
ヒトPTHに対して特異的であることが示された。実験の
結果を、RIAにより測定したhPTHの経時的産生としてプ
ロットする。結果を第４図に示す。
感染させそして選択したウイスター（Wistar）ラット
の線維芽をサイトデックス（Cytodex）ビーズ上に接種
した後、同一の分析を、また、実施した。細胞をビーズ
上で全面以下であるとき、新鮮な培地を添加した；アリ
コートを取り、そしてPTHの産生速度を測定した。これ
らの条件下に、産生速度は組織培養プラスチック上に組
織培養物中で測定したものの２培であった。両者の場合
において、評価期間の終わりにおいて、細胞をトリプシ
ン処理により収穫し、そして計数した。生体内評価に次
のようにして実施した： ほぼ２×107の操作した線維芽を、シンジェネイック
ラットの腹膜腔中に、単独であるいはサイトデックス３
マイクロキャリヤのビーズ上で全面生長後、注射した。
リン酸塩か緩衝液（PBS）またはビーズ単独のみを、類
似する量で、腹膜空中に注射したラットを対照として使
用した。対照ラットにPBS単独を腹空内（IP）に注射し
た。第２の対照には、ヒトPTHを発現する２×107FWR細
胞をIP注射した；それらをPBS中の懸濁液で投与した。
他の細胞ラットに、300mgのサイトデックス（Cytodex）
３ビーズ単独（すなわち、細胞をもたない）を与えた。
第４のラットには、２×107細胞に相当する、FWR PTH
細胞で被覆したサイトデックス（Cytodex）のほぼ150mg
を与えた。第５のラットには、FWR線維芽（ほぼ２〜３
×107細胞）で被覆したビーズのほぼ200mgを投与した。
注射時間はＴ＝０と呼ぶ。
形質導入された線維芽の移植は、hPTHについて特異的
なイムノアッセイを使用して、受容体の血液中のhPTHの
存在を決定することによって評価した。
すべての動物において、第１測定はＴ＝３時間（注射
後３時間）において得た。これはほぼ1/2mlの血液を動
物の各々の尾の静脈を通して得ることによって実施し
た。次いで、血液を凝固させ、そして血清を前述のニコ
ルスのラジオイムノアッセイによりhPTHについて分析し
た。これを反復した；種々の時間において、ほぼ1/2ml
の血液を、ラットの尾の静脈切開により採取し、そして
pPTHについて分析した。これらの決定の結果を表中に示
す。また、これらの動物における血清カルシウムレベル
の結果を表に示す。
この評価の結果を第５図に表す。形質導入された線維
芽の単独の注射後３時間以内に、６ピコグラム（pg）の
hPTHが受容体の血清の1mlにつき検出された。（正常の
ヒト血清PTHレベルは10〜50pg/mlの範囲である。）ビー
ズ上の形質導入された線維芽の単独の注射後３時間以内
に、120pg/mlまたは175pg/ml血清のhPTHレベルが検出さ
れた。表にまた示すように、hPTH遺伝子を含有する形質
導入された線維芽を注射したラットは高カルシウム血症
とならなかった。生体外の実験はhPTHがラット組織中で
活性であることを示唆するので、これは期待されない。
１つの可能な説明は、反調節機構が活性化された（すな
わち、カルシトニン）ことである。
結局、形質導入された線維芽は、線維芽により通常生
物学的に有意のレベルが分泌されない副甲状腺ホルモン
を分泌しそして、さらに、それらはこのホルモンを生理
学的（またはそれより大きい）濃度で分泌することがで
きることが実証された。ヒト副甲状腺ホルモンを分泌す
る線維芽の移植（ここで、腹膜腔中への）は、レトロウ
イルスにより線維芽へ与えられた表現型の変化（すなわ
ち、hPTHの分泌）は受容体において系統的に検出される
ことを実証した。同様な方法における、形質導入された
線維芽を上皮小体切除へ投与することは、さらに、産生
されたhPTHの有効性をさらに実証する。
こうして、本発明の１つの実施態様において、線維芽
はレトロウイルスのベクターを使用して形質導入し、こ
こで組み換えゲノムは問題のDNAおよび、必要に応じ
て、優性な選択可能なマーカーをエンコードするDNAを
包含する。形質導入された線維芽を分離し、そして十分
な数に増殖する。それらを受容体中に移植すること（例
えば、腹膜腔中に、中枢神経系中に）により導入する。
あるいは、線維芽を同様に形質導入し、分離し、増殖さ
せ、次いでマトリックスに接合または結合する。このア
プローチは、長期（数週以上）の移植を望むとき、とく
に有用である。使用するマトリックスは、記載するよう
に、支持体、例えば、マイクロキャリヤーのビーズ、と
くにコラーゲン被覆したマイクロキャリアーのビーズで
あることができる。マトリックスは事実上任意の適当な
大きさの固体のマトリックスであることができる。形質
導入された線維芽を含有する皮膚移植片を適用すること
ができる。
hPTH以外のポリペプチドをエンコードする遺伝物質の導
入 pPTH以外のポリペプチドをエンコードする遺伝子は、
また、レトロウイルスのベクターにより線維芽に導入す
ることができる。例えば、ヒト成長ホルモン（HGH）を
エンコードする遺伝子またはインスリンをエンコードす
る遺伝子は、線維芽中に導入することができる。このよ
うな遺伝子は、単独であるいは選択可能なマーカー、例
えば、neo遺伝子、すなわち抗生物質耐性決定基と組み
合わせて、線維芽中に導入することができる。HGHは通
常視床下部によってのみ分泌される。インスリンは血液
流中のグルコースレベルを調節するポリペプチドであ
る。
これらの遺伝子、ならびに他の遺伝子（例えば、上に
列挙したもののあるもの）を、hPTH遺伝子について前述
したのと同一の方法で線維芽中に導入し、そして生ずる
形質導入された線維芽を体の適当な部位上に移植するこ
とができる。
ポリペプチドエンコードする遺伝物質の導入における他
の優生の選択可能なマーカーの使用 neo遺伝子以外の優生な選択可能なマーカーを使用し
て、遺伝物質を線維芽中に導入することができる。例え
ば、His Ｄ遺伝子をこの目的で使用することができ
る。His Ｄ遺伝子サルモネラ属（Salmonella）からバ
クテリアの遺伝子である、そしてヒスチジノールデヒド
ロゲナーゼ、すなわち、ヒスチジノールをヒスチジンに
転化するポリペプチドをエンコードする。ヒスチジンは
必須アミノ酸である；ヒスチジノールはヒスチジンのア
ルコール類似体であり、そして適切な代謝条件下にヒス
チジンに転化することができる。細胞をヒスチジノール
を含有するが、ヒスチジンを欠く培地で増殖される場
合、His Ｄ遺伝子はヒスチジノールをヒスチジンに転
化することができる。ヒスチジンはそれらの機能にとっ
て必須であるので、His Ｄ遺伝子を有する（そしてこ
うしてヒスチジンをつくることができる）は生き残り、
そしてその遺伝子を欠くものは生き残らないであろう。
His Ｄ遺伝子を有するレトロウイルスのベクターを
使用して、ケラチノサイトを感染させた。His Ｄ遺伝
子を含有するケラチノサイトは、ヒスチジンを欠くが、
ヒスチジノールを含有する培地中でこれらの細胞を増殖
することによって選択した。期待するように、His Ｄ
遺伝子を有するケラチノサイトはコロニーを形成し、そ
して全面生長した。場合、このような細胞は、neo遺伝
子が含まれるものより非常に高い頻度で発生した。これ
らの同一技術は、問題のDNAを含有する線維芽の選択に
おいて有用である。
この仕事の結果として、また、独立の優生の選択可能
なマーカー（例えば、neo遺伝子およびHis Ｄ遺伝子）
を新しい遺伝物質中に導入することができる。２つの異
なるサブユニットを有するポリペプチドの場合におい
て、例えば、別の優生な選択可能なマーカーを使用し
て、２つのサブユニットをエンコードする遺伝情報を導
入することができる。さらに、２またはそれ以上の優生
な選択可能なマーカーは、特異的に切断または処理した
活性とさせることが必要なポリペプチド（例えば、イン
スリンおよび副甲状腺ホルモン）の場合において、使用
することができる。必要な処理する酵素をエンコードす
る遺伝子は、このような処理を必要とする副甲状腺ホル
モンをエンコードする遺伝子と一緒に導入することがで
きる。これは線維芽がその副甲状腺ホルモンを処理する
ことができるようにするであろう。
問題を遺伝物質の線維芽中に導入するための他のベヒク
ル また、レトロウイルス以外のベヒクルを使用して、線
維芽を遺伝子操作また修飾することができる。問題の遺
伝物質を、このような細胞中で新しい遺伝物質を発現す
ることができる、任意のウイルスにより線維芽中に導入
することができる。例えば、SV40、ヘルペスウイルス、
アデノウイルスおよびヒト乳頭腫ウイルスはこの目的に
使用することができる。
問題の遺伝物質の他の型の細胞中への導入 本発明の方法を使用して、また、問題の遺伝物質を他
の型の細胞中に導入することができる。この方法を使用
して、問題の遺伝物質を系中に導入し、ここで細胞を組
織から収穫することができ、組織培養物を固体マトリッ
クス上で増殖させ、そしてレトロウイルスを感染させる
ことができる。問題の遺伝物質は、また、中枢神経系中
に組み込むことができる。例えば、それは線維芽中に導
入するか、あるいはグリア細胞または神経膠細胞、これ
らは中枢神経系および末梢神経系の非ニューロンであ
る、中に導入することができる。形質導入された細胞は
受容体の動物中に導入することができる。これは直接脳
の特定の領域中への定位的投与により、あるいは脳脊髄
液中に導入することによって実施することができる。中
枢神経系において、グリア細胞は、乏突起膠細胞、星状
細胞、脳室上衣細胞および小グリア細胞を包含する。末
梢神経系において、それらは神経節細胞の衛星細胞およ
び末梢神経線維の神経線維鞘（またはシュヴァン）細胞
を包含する。
問題の遺伝物質、例えば、プリンサルベージ（salvag
e）酵素のハイポキサンチングアニンホスホリボシルト
ランスフェラーゼ（HPRT）は、HPRTの遺伝欠損を補正す
る目的でグリア細胞中に導入することができ、この欠損
はレッシューナイハン症候群、すなわち、多数のCNS異
常性をもつ破壊的な遺伝病を生ずる。それは、また、中
枢神経系中に導入して、例えば、変性病（例えば、神経
増殖因子をエンコードする遺伝物質を導入することによ
り）、パーキンソン病（例えば、DOPA合成酵素をエンコ
ードする遺伝物質を導入することにより）および「異常
の」遺伝子により引き起こされる遺伝疾患（例えば、躁
うつ病）を処置または防止することができ、ここで異常
な遺伝子は置換し、その機能を補正するか、あるいは反
対作用するか、あるいはエンコードされた産生物の産生
を変更することができる。
問題の遺伝物質は、また、内皮細胞中に導入すること
ができ、ここで内皮細胞は漿液の膜を覆い、そして心
臓、血管、リンパ節および前眼房をライニングする。問
題の遺伝物質、例えば、hPTHはこのような細胞中に導入
して、血流中へのその供給を促進することができる。
組み込まれた遺伝物質を有する線維芽および他の細胞の
使用 本発明により、線維芽が通常線維芽中で生物学的に有
意のレベルで産生されないポリペプチドおよびタンパク
室を産生し、そしてそれらを血流または体の他の区域、
例えば、中枢神経系中に分泌するような方法で、線維芽
を遺伝子操作することができる。このようにして形成し
た線維芽は、連続的な薬物の供給系として働いて、必要
な物質の周期的投与（摂取、注射などにより）を必要と
する現在の養生法を置換することができる。
例えば、現在の時点で、膵臓から分離し、高度に精製
し、次いでインスリンの産生または利用が障害されるも
のにより体中に注射しなくてはならないインスリンを、
本発明により、連続的に供給することができる。このよ
うにして、インスリンは連続的薬物供給系を経て体中に
導入するすることができ、そして、結局、インスリンの
毎日地の注射の必要性はないであろう。
遺伝子操作された線維芽は、また、凝固因子の産生に
使用することができる。血友病は凝固に参加する因子II
Iと呼ばれるタンパク質を欠く。因子IIIは、現在、注射
により投与される。因子IIIをエンコードする遺伝子を
有する線維芽を使用して皮膚移植片を作り、ここで遺伝
子は因子IIIを産生する；皮膚移植片として、組織は因
子を血流中に分泌するであろう。
問題の遺伝物質を線維芽および他の型の細胞中に組み
込むことは、遺伝病処置および後天性の病気の処置にお
いてとくに価値がることがある。遺伝病の場合におい
て、このアプローチを使用して、代謝シンク（sink）と
して使用することができる、遺伝的に修飾された線維芽
および他の細胞を提供する。すなわち、このような線維
芽は潜在的な毒性の物質を分解する働きをするであろ
う。例えば、これは尿サイクルの疾患の処置において使
用することができるであろう。体により通常産生される
産生物（例えば、酵素またはホルモン）は産生されない
か、あるいは不十分の量でつくられる遺伝病の処置にお
いて、本発明の線維芽することができる。ここで、失わ
れるか、あるいは不適切な産生される物質をエンコード
する遺伝子で形質導入された線維芽を使用して、それを
十分な量で産生することができる。例えば、これはアル
ファー１抗トリプシンを産生において使用することがで
きる。それは、また、因子VIIIおよび因子IXの産生物に
おいて使用することができ、こうして血友病の処置にお
いて有用であろう。
遺伝子操作された線維芽（すなわち、問題の遺伝物質
で形質導入された線維芽）を使用して処置を与えること
ができる、多くの後天性病気が存在する。例えば、慢性
病において普通に存在し、そしてしばしば慢性病腎臓疾
患（例えば、血液透析患者において）に関連する、貧血
の処置において、このような細胞を使用することができ
る。この場合において、エリスロポイエチンをエンコー
ドする遺伝子を中に組み込んで有する線維芽は、骨髄腫
を刺激して赤血球生成（すなわち、赤血球の産生）によ
り貧血を補正するであろう。
本発明の線維芽を使用して、また、活性化として低い
投与量の組織プラスミノゲン活性化剤を投与することが
できる。この場合において、TPAをエンコードする組み
込まれた遺伝物質を有する線維芽を、血栓の防止を望む
個体投換に移植する。これは、例えば、普通の疾患、例
えば、冠状動脈の病気、脳血管の病気、末梢血管の閉
塞、静脈（例えば、表面）の血栓症、例えば、肺動脈の
塞栓、または深い静脈の血栓に対する予防として有用で
あろう。カルシトニンをエンコードするDNAを含有する
線維芽は、現在カルシトニンを皮下投与する、バジェッ
ト病、骨の代謝の進行性の、慢性疾患の処置において使
用することができる。
遺伝子操作された線維芽を有する皮膚移植片のための
他の用途は、産児調節である。試験は、現在、受胎能の
調節において黄体化ホルモン遊離促進ホルモン（LHRH）
と呼ぶポリペプチドホルモンを使用するアンダーウェイ
（underway）である。LHRHの連続的投与は無菌の個体を
生ずる；投与を停止するとき、個体は再び出産可能であ
る。LHRHは注射または経口的薬物処置を取るよりむし
ろ、LHRHを連続的に分泌する小さい移植片を有して同一
の効果を与える。受胎能を再び獲得しようとする場合に
おいて、この移植は切除することができるであろう；ポ
リペプチドのホルモンの供給は停止するであろう。
インターリューキン（例えば、IL−１、IL−２、IL−
３）を産生および分泌するように遺伝子操作された線維
芽は、いくつかの場合において使用することができる。
例えば、現在使用されている治療のあるもの（例えば、
化学的治療）の結果は、しばしば骨髄の直接の抑制によ
り引き起こされる、好中球減少の誘発（血液中の異常な
低い数の好中球の存在）である。例えば、（AIDS）後天
性免疫欠損症候群の処置において使用される、事実上す
べての化学的治療剤、ならびにAZTは好投換減少を生ず
る。この条件は多数の生命に危険を及ぼす感染を生ず
る。これらの場合において、例えば、IL−３をエンコー
ドする遺伝物質を含有する線維芽の移植によりIL−３の
投与を使用して、好中球の計数を増加することができ
る。さらに血小板の産生を刺激するトロンボポイエチン
は、血小板の計数が低い多数の状態の処置において使用
することができる。この場合において、トロンボポイエ
チンの遺伝子で形質導入された線維芽は個体に適用する
ことができる；エンコードされた産生物の産生および分
泌は、血小板の産生を刺激する。
組み込まれた遺伝物質を有する線維芽の他の関係する
適用は、エイズ（AIDS）の処置においてである。インタ
ーリューキン２およびインターリューキン３は、免疫系
を刺激し、エイズの処置において潜在的に価値がある。
それらは、これらの２つのポリペプチド（これらは現在
周期的注射により投与される）を産生するように遺伝子
操作した線維芽を有する皮膚移植片により供給すること
ができる。
本発明の他の使用は、酵素欠損病の処置においてであ
る。この場合において、線維芽中に導入された遺伝子に
よりエンコードされた産生物（ポリペプチド）は分泌さ
れない；むしろ、それは細胞の内側に残留する酵素であ
る。個体が特定の酵素を欠き、そして種々のアミノ酸ま
たは他の代謝物を代謝することができない、遺伝病の多
数を場合が存在する。これらの酵素のための正しい遺伝
子は、皮膚移植片中に導入することができる；次いて、
転写はその代謝の機能を実施するであろう。例えば、作
用されたものが酵素のアデノシンデアミナーゼ欠く遺伝
病が存在する。この酵素はプリンの尿酸への分解におい
て含まれる。皮膚移植片を適用いた区域を血液が通過す
るとき、失う酵素を血液を解読するために十分に高いレ
ベルで産生することができる皮膚移植片を、本発明を使
用して、産生することができるであろう。
本発明は、また、獣医学の適用を有する。例えば、そ
うでなければ、動物の飼料中に組み込まれ、動物の水に
添加するか、あるいは周期的に（例えば、毎日またはそ
れより低い頻度で）注射することによって供給される、
物質、例えば、薬物（例えば、抗生物質）およびホルモ
ンの供給において、本発明を使用することができる。本
発明の修飾された線維芽の使用は、修飾された細胞から
形成された組織を動物に適用することができ、そして進
行する基準でエンコードされたタンパク質の量を提供
し、こうして物質の毎日／周期的投与の必要性を排除す
ることができるという利点を有する。
工業的実用性 本発明は、ホルモン、酵素および薬物が必要な、ヒト
を包含する哺乳動物にこのような工業的適用性を有す
る。例えば、本発明は、そうでなければ静脈内、中間体
または皮下に投与されるホルモンを連続的に供給するた
めに使用することができる。本発明は、延長した期間の
間必要である、このような物質、例えば、ホルモン（例
えば、副甲状腺ホルモン、インスリン）の提供において
とくに価値がある。
同等の実施態様 当業者は日常の実験を使用して、ここに詳しく記載し
た本発明の特定の実施態様に対する多くの同等の実施態
様を認識するか、あるいは確認することができるであろ
う。このように同等の実施態様は、以下の請求の範囲の
範囲に包含されることを意図する。
フロントページの続き (72)発明者 マリガン，リチヤード・シー アメリカ合衆国マサチユセツツ州02138 ケンブリツジ・フランクリンストリー ト441 (72)発明者 ウイルソン，ジエイムズ・エム アメリカ合衆国マサチユセツツ州02154 ウオルサム・ウイツトマンロード24 (56)参考文献 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，84（1987−２），Ｐ．1055 −1059 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，84（1987−２），Ｐ．906 −909 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，79（1982−８），Ｐ．2268 −2272 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏ ｇｙ，61［８］（1987−８），Ｐ．2567 −2572 Ｓｃｉｅｎｃｅ，211（1981−３− ６），Ｐ．1052−1054 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (22)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】天然の線維芽細胞には存在しないDNAまた
    はRNA、天然の線維芽細胞には存在するが生物学上有意
    なレベルでは発現されないDNAまたはRNA、線維芽細胞に
    て通常に生ずるが形質導入された線維芽細胞中で発現す
    るように修飾されたDNAまたはRNA、および形質導入され
    た線維芽細胞中で発現できるように修飾されたDNAまた
    はRNAからなる群から選択された少なくとも一つのDNAま
    たはRNAを含む目的遺伝物質を有し、且つ、選択可能な
    マーカーをコードしていない、ヘルパーを含まない高ウ
    イルス力価の組換えレトロウイルスにより形質導入され
    ている、支持マトリックスに結合した線維芽細胞。
  2. 【請求項２】ヒト線維芽細胞である、請求項１記載の線
    維芽細胞。
  3. 【請求項３】支持マトリックスがマイクロキャリアービ
    ーズからなる、請求項１記載の線維芽細胞。
  4. 【請求項４】マイクロキャリアービーズがコラーゲンで
    被覆されている、請求項３記載の線維芽細胞。
  5. 【請求項５】遺伝物質が治療用蛋白質をコードする、請
    求項１ないし４のいずれか１項記載の線維芽細胞。
  6. 【請求項６】治療用蛋白質が、（ａ）ホルモン、（ｂ）
    酵素または（ｃ）薬物であって、通常は線維芽細胞にお
    いて生物学上有意なレベルでは作られない、請求項５記
    載の線維芽細胞。
  7. 【請求項７】ホルモンがヒト唾液腺ホルモンまたは受精
    調節ホルモンである、請求項６記載の線維芽細胞。
  8. 【請求項８】レトロウイルスが、両栄養性モロニーネズ
    ミ白血病ウイスルから誘導された、長い末端反復配列、
    tRNA結合部位およびPaiパッキング部位からなるゲノ
    ム、および目的遺伝物質を有する組換え両栄養性レトロ
    ウイルスである、請求項１ないし７のいずれか１項記載
    の線維芽細胞。
  9. 【請求項９】レトロウイルスゲノムが、外部因子による
    モジュレートされうる真核性プロモーターをさらに含
    む、請求項８記載の線維芽細胞。
  10. 【請求項１０】レトロウイルスがpRO,pEMまたはpIPのい
    ずれかであって、 pROは、目的遺伝子が転写に必要な全ての配列、即ちプ
    ロモーター／エンハンアー、イントロンを有するかまた
    は有さない解読配列およびポリアデニル化シグナルを該
    遺伝子の転写がレトロウイルスの正常な転写とは反対の
    方向である向きに含むベクターであり、 pEMは、野生型ウイルスのgag,polおよびenvをコードす
    る全配列が目的遺伝子で置換されているベクターであっ
    て、５′フランキング配列、５′LTR、およびBAMHI部位
    までの400bpの連続配列および３′フランキング配列とL
    TRはpZIP由来であり、３′LTRから150bp上流のcla部位
    はBAMHIと結合して該ベクターに存在するBamH Iクロー
    ニング部位の他の半分を形成し、pBR322のHind III/Eco
    R I断片はプラスミドの主鎖を形成するベクターであ
    り、そして pIPは内部プロモーターから誘導される単一の遺伝子を
    発現できるベクターであって、該ベクターの５′区画
    は、５′フランキング配列、５′LTRおよびgag領域中の
    xho部位までの1400bpの連続配列を含み、該gag遺伝子の
    ATGにすぐ隣接のHae III制限部位中にクローニングされ
    たSac IIリンカーを有する野生型モロニーネズミ白血病
    ウイルスであり、該ベクターの３′区画は、３′フラン
    キング配列、３′LTRおよびenv解読領域中のcla I部位
    までの３′蓮続配列を含み、修飾されて１）cla I部位
    がBamH Iに結合され、２）エンハンサーを含む３′LTR
    中のPvu IIからXba Iまでの小さな配列が欠失しているp
    ZIP由来のベクターである、請求項１ないし４のいずれ
    か１項記載の線維芽細胞。
  11. 【請求項１１】（ａ）培養された線維芽細胞を、目的遺
    伝子物質からなる組換えゲノムを有するが選択可能なマ
    ーカーをコードしていない、ヘルパーを含まない高ウイ
    ルス力価の両栄養性組換えレトロウイルスを含む培地と
    接触させ、そして （ｂ）培養された線維芽細胞および感染性組換えレトロ
    ウイルスを含む培地を、該組換えレトロウイルスによる
    線維芽細胞の感染に適当な条件下で維持するが、あとで
    選択は行わない 工程からなる、請求項１ないし４のいずれか１項記載の
    線維芽細胞を製造する方法。
  12. 【請求項１２】工程（ｂ）の線維芽細胞をそれらの生育
    に適当な条件下で培養する工程をさらに含む、請求項11
    記載の方法。
  13. 【請求項１３】治療用である、請求項１ないし10のいず
    れか１項記載の線維芽細胞。
  14. 【請求項１４】連続的栄養放出系である、請求項13記載
    の線維芽細胞。
  15. 【請求項１５】選択可能なマーカーをコードしていな
    い、ヘルパーを含まない高ウイルス力価の両栄養性組換
    えレトロウイルスにより形質導入された線維芽細胞であ
    って、該線維芽細胞は目的DNAを組み込んで有し、該目
    的DNAは、天然線維芽細胞には存在しないDNA、天然の線
    維芽細胞には存在するが生物学上有意なレベルでは発現
    されないDNA、天然の線維芽細胞に存在し且つ形質導入
    された細胞中で発現するように修飾されたDNA、および
    形質導入された線維芽細胞中で発現するように修飾でき
    るDNAからなる群から選択される少なくとも一つであ
    る、線維芽細胞。
  16. 【請求項１６】ヒト線維芽細胞である、請求項15記載の
    線維芽細胞。
  17. 【請求項１７】ヘルパーを含まない両栄養性レトロウイ
    ルスベクターにより形質導入されたヒト線維芽細胞のゲ
    ノム中に安定に組み込まれている蛋白質またはポリペプ
    チドをコードする目的DNAを発現できる、請求項16記載
    の形質導入されたヒト線維芽細胞。
  18. 【請求項１８】形質導入された線維芽細胞が、両栄養性
    モロニーネズミ白血病ウイルスから誘導された、長い末
    端反復配列、tRNA結合部位およびPaiパッキング部位か
    らなる組換えゲノム、および目的遺伝物質を有する組換
    え両栄養性レトロウイルスをその中に組み込んで有す
    る、請求項15ないし17のいずれか１項記載の線維芽細
    胞。
  19. 【請求項１９】組換えレトロウイルスが、外部因子によ
    りモジュレートされうる真核性プロモーターをさらに含
    む、請求項18記載の線維芽細胞。
  20. 【請求項２０】組み込んだ遺伝物質が治療用蛋白質をコ
    ードする、請求項15または17記載の線維芽細胞。
  21. 【請求項２１】（ａ）培養された線維芽細胞を、目的遺
    伝物質からなる組換えゲノムを有するが、選択可能なマ
    ーカーをコードしない、ヘルパーを含まない高ウイルス
    力価の両栄養性組換えレトロウイルスを含む培地と接触
    させ、そして （ｂ）培養された線維芽細胞および感染性組換えレトロ
    ウイルスを含む培地を、該組換えレトロウイルスによる
    線維芽細胞の感染に適当な条件下で維持するが、あとで
    選択は行わない 工程からなる、請求項15ないし20のいずれか１項記載の
    線維芽細胞を製造する方法。
  22. 【請求項２２】工程（ｂ）の線維芽細胞をそれらの生育
    に適当な条件下で培養する工程をさらに含む、請求項21
    記載の方法。
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