ES2276525T3 - Preventivos o remedios para la pancreatitis que contienen anticuerpos anti-receptor il-6 como ingrediente activo. - Google Patents
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Abstract
El uso de un anticuerpo anti-receptor de interleuquina-6 (anti-IL-6R) para fabricar un medicamento para tratar la pancreatitis
Description
Preventivos o remedios para la pancreatitis que
contienen anticuerpos anti-receptor
IL-6 como ingrediente activo.
La presente invención se refiere al uso de un
anticuerpo anti-receptor de
interleuquina-6
(anti-IL-6R) como ingrediente activo
de un agente preventivo o terapéutico para la pancreatitis.
La IL-6 es una citoquina,
denominada también factor 2 estimulante de las células B (BSF2) o
interleuquina \beta2. La IL-6 fue descubierta
como un factor de diferenciación implicado en la activación de las
células linfáticas B (Hirano, T. et al., Nature (1986) 324,
73-76). Después de esto, se ha descubierto que es
una citoquina multifuncional que ejerce influencia sobre diversas
funciones de las células (Akira, S. et al., Adv. in
Immunology (1993) 54, 1-78). Se ha indicado que la
IL-6 induce la maduración de las células linfáticas
T (Lotz, M. et al., J. Exp. Immunol. (1988) 167,
1253-1258).
La IL-6 transmite su actividad
biológica por medio de dos tipos de proteínas situadas sobre la
célula. Una es el receptor de IL-6, una proteína
unida a un ligando con un peso molecular de aproximadamente 80 kD,
al que se une la IL-6 (Taga, T. et al., J.
Exp. Med. (1987) 166, 967-981; Yamasaki, K. et
al., Science (1987) 241, 825-828). El receptor
de IL-6 se presenta no solo en la forma unida a la
membrana que penetra a su través y es expresado sobre la membrana
celular, sino también como un receptor de IL-6
soluble que consiste principalmente de la región extracelular.
La otra es una proteína gp130 unida a la
membrana que tiene un peso molecular de 130 kD aproximadamente, que
está implicada en la transducción de señal unida a moléculas no
ligando. La IL-6 y el receptor de
IL-6 forman el complejo
IL-6/receptor de IL-6 que, después
de fijación a la gp130, transmite su actividad biológica a la
célula (Taga, T. et al., Cell (1989) 58,
573-581).
Un antagonista de IL-6 es una
sustancia que inhibe la transducción de la actividad biológica de la
IL-6. Como antagonistas de la IL-6
se han conocido, hasta ahora, un antagonista dirigido contra la
IL-6 (anticuerpo
anti-IL-6) un anticuerpo dirigido
contra el receptor de IL-6 (anticuerpo
anti-receptor de IL-6), un
anticuerpo dirigido contra la gp130 (anticuerpo
anti-gp130), péptidos alterados de
IL-6 y péptidos parciales de la IL-6
o del receptor de IL-6.
El anticuerpo anti-receptor de
IL-6 ha sido descrito en diversos informes (Novick
D. et al., Hybridoma (1991) 10, 137-146,
Huang, Y. W. et al., Hybridoma (1993) 12,
621-630, Publicación de la Patente internacional WO
95-0987-3, Solicitud de Patente
francesa FR2694767, Patente de EE.UU. 521628). Se ha conocido el
anticuerpo PM-1 humanizado que fue obtenido
injertando la región determinante de la complementariedad (CDR) de
uno de ellos, un anticuerpo PM-1 del ratón (Hirata,
Y. et al., J. Immunology (1989) 143,
2900-2906), a un anticuerpo humano (la Publicación
de la Patente internacional WO 92-19759).
La pancreatitis es una enfermedad inflamatoria
en la que la activación de enzimas pancreáticos causa autolisis de
los tejidos pancreáticos. Han existido informes de que la cantidad
de IL-6 producida en las células mononucleares de
la sangre periférica es significativamente alta en pacientes con
pancreatitis, en comparación con la de los seres humanos sanos,
normales, y que la producción de IL-6 desde las
células mononucleares de la sangre periférica es alta en los casos
de las pancreatitis agudas con complicaciones sistémicas, en
comparación con las que ocurren sin complicaciones (de Beaux A.C.
et al., Brit. J. Surgery, 83, 1071-5, 1996).
Además, ya que los niveles en sangre de IL-6 son
más altos y responden antes que otros parámetros en casos graves de
pancreatitis aguda, han sido considerados como un indicador
pronóstico de la gravedad de las pancreatitis (Inagasaki, T. et
al., Pancreas, 14, 1-8, 1997).
Se ha sugerido que la IL-1 y el
TNF están estrechamente relacionados con los estados de enfermedad,
y que ratones que carecen de receptores para ambas citoquinas no
padecen estados graves de enfermedad y manifiestan un grado de
mortalidad disminuido notablemente (Denham, W. et al.,
Gastroenterology, 113, 1741-6 1997) Se han llevado
a cabo, en modelos de animales, intentos de tratar las pancreatitis
utilizando estos inhibidores (Norman, J. et al., Surgery,
117, 648-6755, 1955, Hughes, G.B. et al.,
American J. Surgery, 171, 274-280, 1996; Norman, J.
et al., Surgery, 120, 615-621, 1996).
Sin embargo, no se han llevado a cabo intentos
de suprimir específicamente la actividad biológica de la
IL-6 usando antagonistas de IL-6
tales como el anticuerpo anti-receptor de
IL-6 en las pancreatitis, y se desconocía que los
antagonistas de IL-6, tales como el anticuerpo
anti-receptor de IL-6, ponen de
manifiesto efectos terapéuticos sobre la pancreatitis.
La presente invención proporciona el uso de un
anticuerpo anti-receptor de
interleuquina-6
(anti-IL-6R) para producir un
agente preventivo o terapéutico para la pancreatitis. También
proporciona en uso de un anticuerpo
anti-IL-6R para producir un agente
para la supresión del edema pancreático en las pancreatitis.
El anticuerpo usado en la invención es,
preferiblemente, un anticuerpo monoclonal dirigido contra el
receptor de IL-6. El anticuerpo monoclonal puede
ser uno dirigido contra el receptor de IL-6 humana
(por ejemplo, el anticuerpo PM-1), o contra el
receptor de IL-6 del ratón (por ejemplo, el
anticuerpo MR 16-1); este anticuerpo puede ser un
anticuerpo recombinante dirigido contra el receptor de
IL-6, preferiblemente uno que posee la región
constante (región C) de un anticuerpo humano. El anticuerpo usado en
la invención puede ser un anticuerpo quimérico o un anticuerpo
humanizado dirigido contra el receptor de IL-6, por
ejemplo un anticuerpo PM-1 humanizado.
El agente producido mediante el uso de la
invención actúa contra la pancreatitis aguda o crónica. La
pancreatitis aguda o crónica es, por ejemplo, la pancreatitis grave
o leve.
La Figura 1 muestra que la administración de
ceruleína origina edema pancreático, dando como resultado el
aumento de peso del páncreas en ratones transgénicos con
IL-6 en comparación con ratones normales. Se ha
indicado también que el efecto anterior es suprimido por la
administración del anticuerpo
anti-IL-6R.
La Figura 2 es una micrografía del tejido
pancreático de un ratón normal que ha desarrollado pancreatitis
aguda por administración de ceruleína.
La Figura 3 es una micrografía del tejido
pancreático de un ratón transgénico con IL-6 que ha
desarrollado pancreatitis aguda por administración de
ceruleína.
La Figura 4 es una micrografía del tejido
pancreático de un ratón transgénico con IL-6 que
había desarrollado pancreatitis aguda por administración de
ceruleína y que había recibido también MR16-1. En
comparación con la pancreatitis inducida por ceruleína en el ratón
normal de la Figura 2, la pancreatitis inducida por la ceruleína
está agravada (por tanto, potenciado el edema en el tejido
intersticial e incrementada la infiltración en las células
inflamatorias) en el ratón transgénico con IL-6 de
la Figura 3. En la Figura 4, por el contrario, la agravación ha
sido suprimida mediante la administración del anticuerpo
anti-receptor de IL-6,
MR16-1.
La Figura 5 muestra que el aumento de peso del
páncreas en un ratón transgénico con IL-6, inducido
por la administración de LPS y ceruleína, puede ser suprimido
mediante la administración de un anticuerpo
anti-receptor de IL-6.
Los anticuerpos anti-receptor de
IL-6 para usar en la presente invención pueden ser
obtenidos como anticuerpos policlonales o monoclonales usando un
método conocido, Como los anticuerpos
anti-IL-6 para usar en la presente
invención son preferidos los anticuerpos monoclonales de, en
particular, origen de mamíferos. Los anticuerpos monoclonales de
origen de mamífero incluyen los producidos por un hibridoma y los
producidos por un hospedante que ha sido transformado con un vector
de expresión que contiene genes de anticuerpos obtenidos por
ingeniería genética. Los anticuerpos, mediante unión al receptor
de IL-6, inhiben la fijación de IL-6
al receptor de IL-6 y con ello bloquean la
transducción de la actividad biológica de IL-6 en la
célula.
Ejemplos de tales anticuerpos incluyen el
anticuerpo MR16-1 (Tamura, T., et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90, 11924-11928), el
anticuerpo PM-1 (Hirata et al., J. Immunology
(1989) 143, 2900-2906, o el anticuerpo
AUK12-20, el anticuerpo AUK64-7 o el
anticuerpo AUK146-15 (Publicación de la Patente
internacional WO 92-19759), y semejantes. Entre
ellos, el más preferido es el anticuerpo PM-1.
Incidentemente, la línea celular de hibridomas
que produce el anticuerpo PM-1 ha sido depositada
internacionalmente bajo las estipulaciones del Tratado de Budapest
como PM-1 el 10 de Julio de 1990, en el Instituto
Nacional de Biociencia y Tecnología Humana, Agencia de Ciencia y
Tecnología Industrial de 1-3, Higashi
1-chome, ciudad de Tsukuba, pref. de Ibaraki,
Japón, como FERM BP-2998. La línea celular de
hibridomas que produce el anticuerpo MR16-1 ha sido
depositada internacionalmente bajo las estipulaciones del Tratado
de Budapest como MR16-1 el 13 de Marzo de 1997 en
el Instituto Nacional de Biociencia y Tecnología Humana, Agencia de
Ciencia y Tecnología Industrial, de 1-3 Higashi
1-chome, ciudad de Tsukuba, pref. de Ibaraki, Japón,
como FERM BP-5875.
Los hibridomas que producen el anticuerpo
monoclonal anti-receptor de IL-6
pueden ser preparados básicamente utilizando el procedimiento
operatorio que se describe más adelante. Así, se usa el receptor de
IL-6 como agente de sensibilización y se inmuniza
según el método convencional de inmunización. Las células inmunes
obtenidas de este modo se fusionan con células parentales conocidas
en el proceso convencional de fusión celular y luego las células
que producen el anticuerpo monoclonal pueden ser seleccionadas
mediante el método convencional de selección para preparar el
hibridoma deseado.
Específicamente, puede prepararse un anticuerpo
anti-receptor de IL-6 del modo
siguiente. Por ejemplo, puede obtenerse el receptor de
IL-6 humana utilizado como el agente de
sensibilización para obtener el anticuerpo, usando la secuencia
génica del receptor de IL-6/secuencia de aminoácidos
descrita en la Solicitud de Patente europea EP 325474, y puede
obtenerse el receptor de IL-6 del ratón usando la
descrita en la Publicación de Patente sin examinar (Kokai) 3
(1991)-155795.
Existen dos tipos de proteínas del receptor de
IL-6: receptor de IL-6 expresado
sobre la membrana celular, y receptor de IL-6
separado desde la membrana celular (receptor de IL-6
soluble) (Yasukawa et al., J. Biochem. (1990) 108,
673-676). El anticuerpo del receptor de
IL-6 soluble está compuesto sustancialmente de la
región extracelular del receptor de IL-6 unido a la
membrana celular, y por ello es diferente del receptor de
IL-6 unido a la membrana ya que el último carece
de la región transmembranal o ambas, la región transmembranal y la
región intracelular. Como la proteína del receptor de
IL-6, puede usarse cualquier receptor de
IL-6, en tanto en cuanto pueda ser usado como
antígeno de sensibilización para producir el anticuerpo del receptor
de IL-6 para usar en la presente invención.
Una vez que la secuencia génica del receptor de
IL-6 ha sido insertada en un sistema de vector de
expresión conocido para transformar una célula huésped apropiada,
la proteína del receptor de IL-6 que se desea puede
purificarse a partir de la célula huésped o del sobrenadante de un
cultivo de la misma empleando un método conocido. La proteína del
receptor de IL-6 purificada de este modo, puede ser
usada como el antígeno de sensibilización. Alternativamente, las
células que expresan el receptor de IL-6 o la
proteína de fusión de la proteína del receptor de
IL-6 y otra proteína, pueden emplearse como el
antígeno de sensibilización.
El E. coli que tiene el plásmido
pIBIBSF2R que contiene cDNA que codifica el receptor de
IL-6 humana ha sido depositado internacionalmente
bajo las estipulaciones del Tratado de Budapest, como
HB101-plBlBSF2R el 9 de Enero de 1989 en el
Instituto Nacional de Biociencia y Tecnología Humana, Agencia de
Ciencia y Tecnología Industrial, de 1-3, Higashi
1-chome, ciudad de Tsukuba, pref. de Ibaraki, Japón,
como FERM BP-2232.
Un hibridoma que produce un anticuerpo
monoclonal, puede ser creado básicamente usando un procedimiento
operatorio conocido según se describe más adelante. Así, puede
usarse la proteína gp130 como antígeno de sensibilización y se
emplea para inmunizar en el método convencional de inmunización. Las
células inmunes obtenidas de este modo son fusionadas con células
parentales conocidas en un proceso convencional de fusión celular, y
luego los hibridomas que producen anticuerpo monoclonal son
seleccionados mediante un método de selección conveniente para
preparar el hibridoma deseado.
Específicamente, el anticuerpo monoclonal puede
ser obtenido del modo siguiente. Por ejemplo, la proteína gp130
utilizada como antígeno de sensibilización para la generación de
anticuerpos, puede ser obtenida usando la secuencia génica de
gp130/secuencia de aminoácidos descrita en la Solicitud de Patente
europea EP 411946.
Después de que una célula huésped adecuada es
transformada por inserción de la secuencia génica de la gp130 en
un sistema de vector de expresión conocido, la proteína gp130 de
interés es purificada partiendo de la célula huésped o desde el
sobrenadante del cultivo de la misma. La proteína del receptor de
gp130 purificada puede ser utilizada como agente de
sensibilización. Alternativamente, puede usarse una proteína de
fusión de la proteína gp130 y otra proteína, como antígeno de
sensibilización.
Aun cuando los mamíferos que han de ser
inmunizados con el antígeno de sensibilización no están limitados
específicamente, son seleccionados preferiblemente teniendo en
cuentan su compatibilidad con la célula parental que ha de usarse
en la fusión celular. Estos mamíferos incluyen, en general,
roedores tales como ratones, ratas, hámsters y semejantes.
La inmunización de animales con un antígeno de
sensibilización, se lleva a cabo usando un método conocido. Un
método general implica, por ejemplo, la administración
intraperitoneal o subcutánea al mamífero de un antígeno de
sensibilización. Específicamente, un agente de sensibilización que
ha sido diluido y suspendido en una cantidad apropiada de solución
salina tamponada con fosfato (PBS) o solución salina fisiológica,
etc., se mezcla, según se desee. con una cantidad apropiada de un
adyuvante común, por ejemplo, adyuvante de Freund completo.
Después de emulsionar se administra preferiblemente a un mamífero
varias veces cada 4 a 21 días. Alternativamente, puede usarse un
vehículo adecuado en el momento de la inmunización del antígeno de
sensibilización.
Después de inmunizar y de la confirmación del
aumento de los niveles del anticuerpo deseado en el suero, las
células inmunes son extraídas desde el mamífero y sometidas a fusión
celular. Las células inmunes preferidas sometidas a la fusión
celular incluyen, en particular, las células esplénicas.
Las células de mieloma de mamífero, utilizadas
como las otras células parentales que son sometidas a la fusión
celular con las células inmunes anteriormente citadas, incluyen
preferiblemente diversas líneas celulares conocidas tales como la
P3X63Ag8.653) (Kearney, J.F., et al., J. Immunol. (1979) 123:
1548-1550), P3X63Ag8U.1 (Current Topics in
Microbiology and Immunology (1978) 81:1-7),
NS-1 (Kohler, G. y Milstein, C., Eur. J. Immunol.
(1976) 6:511-519), MPC-11 Margulies,
D.H. et al., Cell (1976) 8:405-415), SP2/0
(Shulman, M. et al., Nature (1978)
278:269-270), FO (de St. Groth, S.F. et al.,
J. Immunol. Methods (1980) 35:1-21), S194
(Trowbridge, I.S., J. Exp. Med. (1978)
148:313-323), R210 (Galfre, G. et al., Nature
(1979) 277:131-133), y semejantes.
La fusión celular entre las células inmunes y
las células de mieloma, anteriores, puede llevarse a cabo
esencialmente de conformidad con un método conocido tal como el
descrito por Milstein et al., (Kohler, G. y Milstein, C.,
Methods Enzymol. (1981) 73: 3-46).
Más específicamente, la fusión celular anterior
se lleva a cabo en el seno de un caldo nutriente convencional, en
presencia, por ejemplo, de un acelerador de la fusión celular. Como
acelerador de la fusión celular pueden usarse, por ejemplo,
polietilenglicol (PEG), virus de Sendal (HVJ) y semejantes, y,
además, puede añadirse según se desee un adyuvante tal como
sulfóxido de dimetilo, etc., para intensificar la eficacia de la
fusión.
La relación preferida que ha de emplearse entre
las células inmunes y las células de mieloma es, por ejemplo, 1 a
10 veces más células inmunes que células de mieloma. Como ejemplos
de medios de cultivo a usar para la fusión celular anterior, se
incluyen el medio RPMI1640 y el medio de cultivo MEM adecuado para
el crecimiento de las líneas de células de mieloma anteriores, y
el medio de cultivo convencional usado para este tipo de cultivo
celular, y además puede añadirse un suplemento de un suero tal como
suero fetal de ternera (FCS).
En la fusión celular, cantidades previamente
determinadas de las células inmunes y las células de mieloma,
anteriores, se mezclan bien en el líquido de cultivo anterior, al
que se añade una solución de PEG previamente calentada a 37ºC
aproximadamente, por ejemplo una solución de PEG con un peso
molecular medio de aproximadamente 1000 a 6000, en una
concentración de 30 a 60% (p/v) y se mezcla hasta obtener las
células de fusión deseadas (hibridomas). Luego pueden retirarse,
por repetición de la adición secuencial de un líquido de cultivo
adecuado y centrifugación para separar el sobrenadante, agentes de
la fusión celular, etc., que son indeseables para el crecimiento
del hibridoma.
Dicho hibridoma es seleccionado cultivando en el
medio de selección convencional, por ejemplo, el medio de cultivo
HAT (un líquido de cultivo que contiene hipoxantina, aminopterina y
timidina). El cultivo en dicho medio de cultivo HAT se continúa
generalmente durante un período de tiempo suficiente para efectuar
la muerte de las células distintas del hibridoma deseado (células
que no son de fusión), por lo general desde varios días hasta
varias semanas. Se lleva a cabo el método de dilución limitante
convencional en el que los hibridomas que producen el anticuerpo
deseado son clasificados y clonados monoclonalmente.
Además de obtener el hibridoma anterior por
inmunización con un antígeno de un animal distinto del ser humano,
es posible también sensibilizar linfocitos humanos in vitro
con el antígeno deseado o con las células que expresan el antígeno
deseado, y los linfocitos B sensibilizados que resultan son
fusionados con células de un mieloma humano, por ejemplo el U266,
para obtener el anticuerpo humano deseado que posee la actividad de
fijación al antígeno deseado o a células que expresan el antígeno
deseado (véase la Publicación de la Patente japonesa,
posteriormente examinada (Kokoku) No.
1(1989)-59878). Además, un animal transgénico
que tiene un repertorio de todos los genes de anticuerpos humanos
es inmunizado con el antígeno o las células que expresan el
antígeno, obteniendo el anticuerpo humano deseado en el método antes
descrito (véase la Publicación de Patente internacional WO
93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096 y WO
96/33735).
Los hibridomas que producen anticuerpos
monoclonales, construidos de este modo, pueden ser
sub-cultivados en el líquido de cultivo
convencional o pueden ser almacenados en nitrógeno líquido durante
un período de tiempo prolongado.
Con objeto de obtener anticuerpos monoclonales a
partir de dicho hibridoma, puede emplearse un método en el que
dicho hibridoma es cultivado mediante el método convencional y los
anticuerpos son obtenidos como el sobrenadante, o mediante un
método en el que el hibridoma se administra y crece en un mamífero
compatible con dicho hibridoma, obteniéndose los anticuerpos como
la ascitis. El primer método es adecuado para obtener anticuerpos de
alta pureza mientras que el último es adecuado para la producción
de anticuerpos a gran escala.
Específicamente, puede construirse un hibridoma
que produce un anticuerpo anti-receptor de
IL-6, utilizando el método descrito en la
Publicación de Patente japonesa sin examinar (Kokai) 3
(1989)-139293. Esto puede ser realizado mediante un
método en el que el hibridoma que produce el anticuerpo
PM-1, que fue depositado internacionalmente bajo
las estipulaciones del Tratado de Budapest como FERM
BP-2998 el 10 de Julio de 1990, en el Instituto
Nacional de Biociencia y Tecnología Humana, Agencia de Ciencia
Industrial y Tecnología, de 1-3, Higashi
1-chome, ciudad de Tsukuba, pref. de Ibaraki, Japón,
es inyectado por vía intraperitoneal a ratones BALB/c (producidos
por CLEA, Japón) obteniendo la ascitis desde la que se purifica el
anticuerpo PM-1, o mediante un método en el que
dicho hibridoma es cultivado en un medio de cultivo adecuado tal
como el medio RPMI1640 que contiene suero fetal bovino al 10% y
MB-Condimed H1 al 5% (fabricado por Boehringer
Mannheim), el medio SFM de hibridomas (fabricado por
GIBCO-BRL), el medio PFHM-II
(fabricado por GIBCO-BRL) y semejantes, y el
anticuerpo PM-1 puede ser purificado partiendo del
sobrenadante del cultivo.
Un anticuerpo recombinante, producido mediante
la tecnología del gen recombinante en la que un gen de un anticuerpo
era clonado desde el hibridoma e integrado en un vector adecuado
que luego era introducido en un hospedante, puede ser usado en la
presente invención como anticuerpo monoclonal (véase, por ejemplo,
el trabajo de Borrebaeck C.A.K., y Larrick J.W., THERAPEUTIC
MONOCLONAL ANTIBODIES, publicado en el Reino Unido por MACMILLAN
PUBLISHERS LTD. 1990).
Específicamente, mRNA que codifica la región
variable (V) del anticuerpo deseado, es aislado desde células que
producen anticuerpos tales como un hibridoma. El aislamiento de
mRNA se efectúa preparando RNA total usando, por ejemplo, un método
conocido tal como el método de ultracentrifugación con guanidina
(Chirgwin, J.M. et al., Biochemistry (1979) 18,
5294-5299), el método AGPC (Chomczynski, P. et
al., Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159) y
luego el mRNA es purificado partiendo del RNA total usando el kit de
Purificación de mRNA (fabricado por Pharmacia) y semejantes.
Alternativamente, puede prepararse mRNA directamente usando el kit
de Purificación de mRNA Quick Prep (fabricado por Pharmacia).
Puede sintetizarse el cDNA de la región V del
anticuerpo, partiendo del mRNA obtenido de este modo, usando una
transcriptasa inversa. Puede sintetizarse el cDNA usando el kit de
Síntesis de cDNA AMV Reverse Transcriptase
First-strand y semejante. Alternativamente, para la
síntesis y amplificación del cDNA pueden usarse el kit FINDER RACE
(fabricado por Clontech) de amplificación de 5' y el método
5'-RACE (Frohman, M.A. et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA (1988) 85, 8998-9002; Belyavski, A.
et al., Nucleic Acids. Res. (1989) 17,
2919-2932) que emplea la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR). El fragmento de DNA deseado se purifica desde el
producto de la PCR obtenido y puede ser ligado a DNA vector. Además,
se construye un vector recombinante a partir de éste y luego se
introduce en E. coli, etc. desde el que se seleccionan
colonias para preparar el vector recombinante deseado. La secuencia
de bases del DNA deseado puede ser confirmada mediante un método
conocido tal como el método didesoxi.
Una vez obtenido el DNA que codifica la región V
del anticuerpo deseado, puede ser ligado a DNA que codifica la
región constante (región C) del anticuerpo deseado, que luego es
integrado en un vector de expresión. Alternativamente, el DNA que
codifica la región V del anticuerpo puede ser integrado en un vector
de expresión que ya contiene DNA que codifica la región C del
anticuerpo.
Con objeto de producir el anticuerpo para usar
en la presente invención, el gen del anticuerpo es integrado, como
se describe más adelante, en un vector de expresión para ser
expresado bajo el control de una región reguladora de la expresión,
por ejemplo un potenciador y/o un promotor. Seguidamente, el vector
de expresión puede ser transformado en una célula huésped y el
anticuerpo puede ser expresado luego en ella.
Según la presente invención, un anticuerpo
recombinante, alterado artificialmente, tal como un anticuerpo
quimérico y un anticuerpo humanizado, puede ser usado con el fin de
hacer disminuir la antigenicidad heteróloga contra los seres
humanos. Estos anticuerpos alterados pueden ser producidos
utilizando métodos conocidos.
Puede obtenerse un anticuerpo quimérico ligando
el DNA obtenido de este modo, que codifica la región V del
anticuerpo, con DNA que codifica la región C de un anticuerpo
humano, que luego se integra en un vector de expresión y se
introduce en un hospedante para producir en él el anticuerpo (véase
la Solicitud de Patente europea EP 125023, y la Publicación de
Patente Internacional WO 92-19759). Usando este
método conocido puede obtenerse un anticuerpo quimérico, útil para
la presente invención.
Por ejemplo, el plásmido que contiene DNA que
codifica la región V de la cadena L o la región V de la cadena H
del anticuerpo PM-1 quimérico, fue designado como
pPM-k3 o pPM-hl, respectivamente, y
E. coli que tiene el plásmido ha sido depositado
internacionalmente bajo las estipulaciones del Tratado de Budapest
como NCIMB 40366 y NCIMB 40362, respectivamente, el 11 de Febrero
de 1991, en las Colecciones Nacionales de Bacterias Industriales y
Marinas Limitadas.
Ha sido generado anticuerpo humanizado,
denominado también anticuerpo humano reconfigurado, transplantando
la región determinante de la complementariedad (CDR) del anticuerpo
de un mamífero distinto del ser humano, por ejemplo anticuerpo de
ratón, en la CDR de un anticuerpo humano.
También es conocida la tecnología general del
DNA recombinante para la preparación de tales anticuerpos (véase la
Solicitud de Patente europea EP 125023 y la Publicación de Patente
internacional WO 92-19759).
Específicamente, una secuencia de DNA designada
para ligar la CDR de un anticuerpo del ratón con la región del
marco de lectura (FR) de un anticuerpo humano, es sintetizada a
partir de varios oligonucleótidos divididos que tienen secciones
que se solapan unas con otras en sus extremos. El DNA obtenido de
este modo, es ligado al DNA que codifica la región C del anticuerpo
humano y después es integrado en un vector de expresión, que es
introducido en un hospedante para la producción del anticuerpo
(véase la Solicitud de Patente europea EP 239400 y la Publicación
de Patente internacional WO 92-19759).
Para el FR del anticuerpo humano ligado a través
de la CDR, se selecciona la región determinante de la
complementariedad que forma un sitio favorable de unión de
antígeno. Cuando se desea, pueden sustituirse aminoácidos de la
región del marco de lectura de la región variable del anticuerpo,
de modo que la región determinante de la complementariedad del
anticuerpo humano reconfigurado puede formar un sitio apropiado de
unión de antígeno (Sato, K. et al., Cancer Res. (1993) 53,
851-856).
Por ejemplo, para un anticuerpo quimérico o un
anticuerpo humanizado, se usa la región C de un anticuerpo humano.
Como la región C de un anticuerpo humano, puede citarse la
C\gamma, y, por ejemplo, pueden emplearse las C\gamma1,
C\gamma2, C\gamma3 y C\gamma4. La región C de un anticuerpo
humano puede modificarse para mejorar la estabilidad del anticuerpo
o la producción del mismo.
Un anticuerpo quimérico consiste en la región
variable de un anticuerpo derivado de un mamífero distinto del ser
humano, y de la región C derivada de un anticuerpo humano, mientras
que un anticuerpo humanizado consiste en la región determinante de
la complementariedad de un anticuerpo derivada de un mamífero
distinto de un ser humano, y de la región del marco de lectura y la
región C derivada de un anticuerpo humano. Por consiguiente, su
antigenicidad en el cuerpo humano ha sido reducida, por lo que son
útiles como anticuerpo para emplear en la presente
invención.
invención.
Una realización preferida del anticuerpo
humanizado para emplear en la presente invención, incluye el
anticuerpo PM-1 humanizado (véase la Publicación de
Patente internacional WO 92-19759).
Genes de anticuerpos construidos según se ha
descrito anteriormente, pueden ser expresados y obtenidos por un
método conocido. En el caso de células de mamífero, la expresión
puede ser conseguida utilizando un vector que contenga un promotor
útil, utilizado habitualmente, el gen del anticuerpo que ha de ser
expresado y DNA en el que la señal de poli A ha sido ligada de modo
operable en 3' aguas abajo del mismo o un vector que contiene dicho
DNA. Ejemplos del promotor/potenciador incluyen citomegalovirus
humano inmediato al promotor/potenciador.
Adicionalmente, en cuanto al
promotor/potenciador que puede ser usado para la expresión de un
anticuerpo para usar en la presente invención, existen
promotores/potenciadores virales tales como retrovirus,
Polyomavirus, adenovirus y virus 40 de simios (SV40), y
promotores/potenciadores que derivan de células de mamíferos, tales
como el factor de elongación humano 1\alpha (HEF1\alpha).
Por ejemplo, la expresión puede conseguirse con
facilidad mediante el método de Mulligan et al., (Mulligan,
R. C. et al., Nature (1979) 277, 108-114)
cuando se usa el promotor/potenciador SV40, o mediante el método de
Mizushima et al., (Mizushima, S. y Nagata, S. Nucleic Acids
Res. (1990) 18, 5322) cuando se usa el promotor/potenciador
HEF1\alpha.
HEF1\alpha.
En el caso del E. coli, la expresión
puede ser conducida ligando de modo operable un promotor útil usado
comúnmente, una secuencia señal para la secreción del anticuerpo y
el gen del anticuerpo que ha de ser expresado, seguido por su
expresión. Como el promotor pueden citarse, por ejemplo, el
promotor lacz y el promotor araB. Puede usarse el método de Ward
et al., (Ward, E.S. et al, Nature (1098) 341,
544-546; Ward, E.S. et al., FASEB J. (1992)
6, 2422-2427) cuando se utiliza el promotor lacz, y
puede usarse el método de Better et al., (Better, M. et
al., Science (1988) 240, 1041-1043) cuando se
emplea el promotor araB.
Como la secuencia señal para la secreción de
anticuerpo cuando es producida en el periplasma de E. coli,
puede usarse la secuencia señal pelB (Lei, S.P. et al., J.
Bacteriol. (1987) 169, 4379-4383). Después de
separar el anticuerpo producido en el periplasma, la estructura del
anticuerpo es apropiadamente replegada antes de su uso (véase, por
ejemplo, el documento WO 96/30394).
Como el origen de replicación, pueden usarse los
derivados de SV40, Polyomavirus, adenovirus, virus del papiloma
bovino (BPV) y semejantes. Además, para la amplificación del número
de copias del gen en el sistema de la célula huésped. los vectores
de expresión pueden incluir como marcadores seleccionables, el gen
de la aminoglicósido-fosfotransferasa (APH), el gen
de la timidina quinasa (TK), el gen de
xantina-guaninafosforribosil-transferasa
de E. coli (Ecogpt), el gen de la
dihidrofolato-reductasa (dhfr), y semejantes.
Para la producción de anticuerpos para usar en
la presente invención, puede emplearse cualquier sistema de
producción. El sistema de producción de la preparación de
anticuerpo, comprende el sistema de producción in vitro o el
sistema de producción in vivo. En cuanto al sistema de
producción in vitro, puede citarse un sistema de producción
que emplea células eucarióticas y el sistema de producción que
emplea células procarióticas.
Cuando se utilizan las células eucarióticas,
existen los sistemas de producción que emplean células animales,
células vegetales y células de hongos. Las células animales
conocidas incluyen (1) células de mamífero tales como las células
CHO, las células COS, las células de mielomas, las células de riñón
de hámster joven (BHK), las células HeLa y las células Vero, (2)
células de anfibio tales como oocitos de Xenopus, o (3)
células de insecto tales como las sf9, sf21 y Tn5. Las células
vegetales conocidas incluyen, por ejemplo, las derivadas de
Nocotiana tabacum, que pueden ser sometidas a cultivo de
callo. Las células de hongos conocidas incluyen levaduras tales
como el género Saccharomyces, más específicamente el
Saccharomyces cerevisiae, u hongos filamentosos tales como
los del género Aspergillus, más específicamente el
Aspergillus niger.
Cuando se emplean las células procarióticas,
existen los sistemas de producción que emplean células bacterianas.
Las células bacterianas conocidas incluyen Escherichia coli (E.
coli), y Bacillus subtilis.
Por introducción en estas células, mediante
transformación, el gen del anticuerpo deseado y cultivando in
vitro las células transformadas, puede obtenerse el anticuerpo.
El cultivo se lleva a cabo mediante un método conocido. Por
ejemplo, como el líquido del cultivo pueden usarse los medios DMEM,
MEM, RPMI1640 e IMDM, y pueden usarse, en combinación, suplementos
séricos tales como suero fetal de ternera (FCS). Además, los
anticuerpos pueden ser producidos in vivo implantando en la
cavidad abdominal de un animal, células en las que ha sido
introducido el gen del anticuerpo, y semejante.
En cuanto a los sistemas de producción in
vivo, pueden citarse aquellos que emplean animales y aquellos
que emplean plantas. Cuando se usan animales, existen los sistemas
de producción que emplean mamíferos e insectos.
Como mamíferos, pueden emplearse cabras, cerdos,
ovejas, ratones y ganado vacuno (Vicki Glaser, SPECTRUM
Biotechnology Applications, 1993). En cuanto a insectos, pueden
utilizarse gusanos de seda. Cuando se usan plantas puede usarse,
por ejemplo, el tabaco.
Los genes de los anticuerpos se introducen en
estos animales o estas plantas, y los anticuerpos son producidos en
tales animales o plantas, y recuperados. Por ejemplo, un gen de un
anticuerpo se inserta en medio del gen que codifica la proteína que
es producida intrínsecamente en la leche tal como la caseína \beta
de cabra para preparar genes de fusión. Fragmentos de DNA que
contienen el gen de fusión en el que ha sido insertado el gen del
anticuerpo, son inyectados en un embrión de cabra y el embrión es
introducido en una cabra hembra. El anticuerpo deseado se obtiene
desde la leche producida por la cabra transgénica, llevada a la
cabra que recibió el embrión o su descendencia. Con objeto de
aumentar la cantidad de leche que contiene el anticuerpo deseado,
producida por la cabra transgénica, pueden administrarse hormonas a
la cabra transgénica, según sea apropiado (Ebert, K.M. et
al., Bio/Technology (1994) 12, 699-702).
Cuando se usan gusanos de seda, el gusano de
seda es infectado con baculovirus en los que se ha insertado el gen
del anticuerpo deseado, y el anticuerpo deseado puede ser obtenido
del fluido corporal del gusano de seda (Maeda, S. et al.,
Nature (1985) 315, 592-594). Además, cuando se usa
tabaco, el gen del anticuerpo deseado se inserta en un vector de
expresión para plantas, por ejemplo el pMON 530, y después se
introduce el vector en una bacteria tal como la Agrobacterium
tumefaciens. El tabaco, tal como el Nocotiana tabacum, es
infectado luego con la bacteria obteniendo el anticuerpo deseado
desde la hojas del tabaco (Julian, K.-C. Ma et al., Eur. J.
Immunol (1994) 24, 131-138.).
Cuando se obtiene el anticuerpo en sistemas de
producción in vitro o in vivo, según se ha descrito
anteriormente, DNA que codifica la cadena pesada (cadena H) o la
cadena ligera (cadena L) del anticuerpo, puede ser integrado por
separado en un vector de expresión y los hospedantes transformados
simultáneamente, o DNA que codifica la cadena H y la cadena L puede
ser integrado en un vector de expresión único y transformado con
ello el hospedante (véase la Publicación de Patente internacional
WO 94-11523).
Los anticuerpos para usar en la presente
invención pueden ser fragmentos de anticuerpos o versiones
modificadas de los mismos, mientras ellos sean usados
preferiblemente. Por ejemplo, como fragmentos de anticuerpo pueden
citarse Fab, F(ab')_{2}, Fv o Fv de una sola cadena (scFv)
en los que los Fv's de la cadena H y de la cadena L habían sido
ligados por medio de un engarce adecuado.
Específicamente, los anticuerpos son tratados
con una enzima, por ejemplo, papaína o pepsina, produciendo
fragmentos de anticuerpos o son construidos genes que codifican
estos fragmentos de anticuerpos que son introducidos después en un
vector de expresión que es expresado en una célula huésped adecuada
(véase, por ejemplo, el trabajo de Co. M, S, et al., J.
Immunol. (1994) 152, 2968-2976; Better, M. y
Horwitz, A.H., Methods in Enzymology (1989) 178,
476-496; Plucktrun, A. y Skerra, A., Methods in
Enzymology (1989) 178, 476-496; Lamoyi, E., Methods
in Enzymology (1986) 121, 652-663; Rousseaux, J.
et al., Methods in Enzymology (1986) 121,
663-669; Bird, R.E. et al., TIBTECH (1991)
9, 132-137).
El scFv puede ser obtenido ligando la región V
de la cadena H y la región V de la cadena L del anticuerpo. En el
scFv, la región V de la cadena H y la región V de la cadena L son
ligadas, preferiblemente por medio de un engarce, preferiblemente
un engarce peptídico (Huston, J.S. et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA (1988) 85, 5879-5883). La región V de la
cadena H y la región V de la cadena L del scFv pueden ser derivadas
desde cualquiera de los anticuerpos antes citados. Como el engarce
peptídico para ligar las regiones V, puede usarse cualquier péptido
monocatenario que comprenda, por ejemplo, 12-19
restos de aminoácidos.
El DNA que codifica el scFv puede obtenerse
usando el DNA que codifica la cadena H o la región V de la cadena H
del anticuerpo anterior y el DNA que codifica la cadena L o la
región V de la cadena L del anticuerpo anterior, como el molde,
amplificando la parte del DNA que codifica la secuencia de
aminoácidos deseada entre las secuencias anteriores mediante la
técnica de PCR con el par de cebadores que especifican ambos
extremos del mismo, y amplificando posteriormente la combinación de
DNA que codifica la parte del engarce peptídico y el par de
cebadores que define que ambos extremos de dicho DNA están ligados a
la cadena H y la cadena L, respectivamente.
Una vez construidos los DNAs que codifican el
scFv, pueden obtenerse por los métodos convencionales, un vector
de expresión que les contiene y un hospedante transformado con dicho
vector de expresión, y el scFv puede ser obtenido usando el
hospedante que resulta por los métodos convencionales.
Estos fragmentos de anticuerpos pueden ser
producidos obteniendo el gen de los mismos de un modo similar al
mencionado anteriormente y permitiéndole ser expresado en un
hospedante. "Anticuerpo" tal como se usa en las
reivindicaciones de la presente invención, encierra estos fragmento
de anticuerpos.
En cuanto a anticuerpos modificados, pueden
usarse anticuerpos asociados con moléculas diversas tales como
polietilenglicol (PEG). "Anticuerpo" tal como se usa en las
reivindicaciones de la presente Solicitud de Patente incluye estos
anticuerpos modificados. Estos anticuerpos modificados pueden ser
obtenidos modificando químicamente los anticuerpos obtenidos de
este modo. Estos métodos ya han sido establecidos en la técnica.
Los anticuerpos producidos y expresados según se
ha descrito anteriormente, pueden ser separados desde el interior o
desde el exterior de la célula huésped y luego pueden ser
purificados hasta obtener homogeneidad. La separación y
purificación del anticuerpo para su uso en la presente invención
puede conseguirse mediante cromatografía de afinidad. Como la
columna usada para tal cromatografía de afinidad pueden citarse la
columna de Proteína A y la columna de Proteína G. Ejemplos de los
soportes usados en la columna de Proteína A son Hyper D, POROS,
Sepharose F.F. y semejantes. Alternativamente, pueden utilizarse sin
limitación alguna los métodos de separación y purificación que se
emplean habitualmente para las proteínas.
La separación y purificación del anticuerpo para
usar en la presente invención pueden conseguirse combinando, como
sea apropiado, otro tipo de cromatografía diferente de la
cromatografía de afinidad citada, filtración, ultrafiltración,
precipitación de proteínas por sales, diálisis y semejante. La
cromatografía incluye, por ejemplo, cromatografía de intercambio
iónico, cromatografía hidrófoba, filtración sobre gel, y semejante.
Estas cromatografías pueden aplicarse en cromatografía líquida de
alta resolución (HPLC). Alternativamente, puede usarse HPLC de fase
invertida.
La concentración de anticuerpo que se obtiene
por el método anterior puede determinarse mediante la medida de la
absorbancia o mediante el ensayo de inmunoabsorción con enzimas
ligadas (ELISA) y semejante. Así pues, cuando se emplea la medida
de la absorbancia, se diluye apropiadamente una muestra con PBS(-)
y después se mide la absorbancia en 280 nm, seguido de cálculo
usando el coeficiente de absorción de Densidad Óptica 1,35 a 1
mg/ml. Cuando se usa el método ELISA la medida se realiza del modo
siguiente. 100 \mul de IgG de cabra anti-humana
(fabricada por TAGO) diluida a 1 \mug/ml en el seno de tampón de
bicarbonato 0,1 M, pH 9,6, se añade a una placa de 96 pocillos
(fabricada por Nunc), y se incuba durante la noche a 4ºC para
inmovilizar el anticuerpo. Después de bloquear, se añade 100 \mul
de cada uno de anticuerpo de la presente invención diluido
apropiadamente, o de una muestra que contiene el anticuerpo, o 100
\mul de IgG humana (fabricada por CAPPEL) como el patrón, y se
incuba a temperatura ambiente durante 1 hora.
Después de lavar, se añade 100 \mul de
anticuerpo de IgG anti-humana, marcado con fosfatasa
alcalina (fabricado por BIO SOURCE) diluido 5000 veces, y se incuba
a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar, se añade
la solución de sustrato y se incuba, seguido de la medida de la
absorbancia en 405 nm usando el lector de microplacas MICROPLATE
READER Modelo 3550 (fabricado por Bio-Rad) para
calcular la concentración del anticuerpo deseado.
La actividad del antagonista de la
IL-6 para usar en la presente invención puede ser
evaluada usando un método conocido convencionalmente.
Específicamente, es cultivada la célula MH60.BSF2, dependiente de
IL-6, a la que se añade IL-6, y
puede evaluarse la actividad usando la incorporación de
^{3}H-timidina en la célula dependiente de
IL-6, en la coexistencia del antagonista de la
IL-6. Alternativamente, la evaluación puede
llevarse a cabo cultivando U266, una célula que expresa el receptor
de IL-6, añadiendo IL-6 marcada con
^{125}I y un antagonista de IL-6 al mismo tiempo,
y determinando después la IL-6 marcada con ^{125}I
unida a la célula que expresa el receptor de IL-6.
En el sistema de ensayo anterior se establece un grupo testigo
negativo que no contiene antagonistas de IL-6,
además del grupo en el que se encuentra presente el antagonista del
receptor de IL-6, y los resultados obtenidos son
comparados para evaluar la actividad de inhibición de
IL-6 del antagonista del receptor de
IL-6.
Con objeto de confirmar los efectos conseguidos
mediante la presente invención, un anticuerpo
anti-IL-6R se administra a animales
que habían desarrollado pancreatitis después de una sobredosis de
ceruleína, y puede evaluarse el efecto de supresión del edema
pancreático y de la mejora del peso del páncreas. Como efectos
adicionales de la presente invención están los efectos de prevención
de la pancreatitis o la recurrencia de la pancreatitis.
La administración de ceruleína para inducir
pancreatitis, por ejemplo, puede llevarse a cabo según el método
descrito en el Ejemplo que figura más adelante. Los animales en los
que se induce la pancreatitis pueden ser los empleados
habitualmente para experimentación, tales como ratones y ratas.
Según se describe en el Ejemplo que figura más
adelante, en los animales que habían desarrollado pancreatitis, la
administración de anticuerpo anti-receptor del
IL-6 dio por resultado la supresión del peso del
páncreas y la mejora del edema del páncreas, y, por tanto, se puso
de manifiesto que los anticuerpos anti-receptor de
IL-6 ejercen un efecto terapéutico sobre las
pancreatitis.
Los sujetos que han de ser tratados en la
presente invención son los mamíferos. El sujeto a ser tratado es,
preferiblemente, el ser humano.
Los agentes preventivos o terapéuticos de la
presente invención pueden ser administrados o bien por vía oral o
bien por vía parenteral, sistémicamente o localmente. Por ejemplo,
pueden seleccionarse inyección intravenosa, tal como infusión por
goteo, inyección intramuscular, inyección intraperitoneal,
inyección subcutánea, supositorios, lavado intestinal, comprimidos
con revestimiento entérico para administración por vía oral, y
semejantes, y el método de administración puede ser escogido según
sea apropiado, dependiendo de la edad y el estado del paciente. La
dosis eficaz se escoge entre el intervalo de 0,01 mg a 100 mg por kg
de peso, por administración. Alternativamente, puede escogerse una
dosis en el intervalo de 1 a 1000 mg, preferiblemente 5 a 50 mg, por
paciente.
Los agentes preventivos o terapéuticos para las
pancreatitis, de la presente invención, puede contener excipientes
o aditivos aceptables desde el punto de vista farmacéutico,
dependiendo de la vía de administración. Ejemplos de tales
excipientes o aditivos incluyen el agua, un disolvente orgánico
aceptable desde el punto de vista farmacéutico, colágeno,
poli(alcohol vinílico), polivinilpirrolidona, un polímero
carboxivinílico, carboximetilcelulosa sódica, sodio poliacrílico,
alginato sódico, dextrano hidrosoluble,
carboximetil-almidón sódico, pectina,
metilcelulosa, etilcelulosa, goma de xantano, goma arábiga,
caseína, gelatina, agar, diglicerina, propilenglicol,
polietilenglicol, vaselina, parafina, alcohol estearílico, ácido
esteárico, albúmina sérica humana (HSA), manitol, sorbitol,
lactosa, tensioactivos aceptables desde el punto de vista
farmacéutico, y semejantes. Los aditivos empleados se escogen entre
los anteriores o sus combinaciones, pero sin limitarse a ellos,
dependiendo de la forma de administración.
La presente invención será explicada ahora con
mayor detalle con referencia a los ejemplos, ejemplos de referencia,
y experimentos. Ha de hacerse notar, no obstante, que la presente
invención no se limita, en modo alguno, a ellos.
A ratones transgénicos
B6-hlL-6 o ratones B6 (camadas
procedentes de ratones transgénicos hlL-6 T)
(Clinical Immunology and Immunopathology, 82:
117-124, 1997), se administró por vía
intraperitoneal cada hora, durante 7 veces, ceruleína (producida
por Kyowa Hakko) disuelta en solución salina fisiológica a 50
\mug/kg. Se administró a los ratones el anticuerpo monoclonal
MR16-1, anti-receptor de
IL-6 de ratón, a la dosis de 1 mg/ratón por medio
de la vena caudal inmediatamente antes de la administración de la
ceruleína.
Como testigo se usó el disolvente (PBS) para el
anticuerpo. Ocho horas más tarde, los ratones fueron eutanizados
para observar el peso de los páncreas, la amilasa sérica y la
histología del páncreas. El peso de los páncreas y el peso de los
cuerpos se indica en la Figura. La histología del páncreas se indica
en las Figuras 2-4. La amilasa sérica se midió
usando el método del yodo-almidón (almidón azul).
Para la histología del páncreas, se preparó un bloque del páncreas
en parafina y se tiñó con hematoxilina eosina (HE) para realizar la
observación microscópica.
En los ratones transgénicos con
IL-6 la ganancia de peso de los páncreas inducida
por la administración de ceruleína, era más pronunciada en
comparación con la de los ratones normales.
La inspección visual reveló también que el edema
estaba más avanzado así como también la pancreatitis. Por
administración de el MR16-1 a los ratones
transgénicos con IL-6, se había suprimido la
ganancia de peso de los páncreas, inducida por la administración de
ceruleína. La comparación histológica del grupo de ratones
transgénicos con IL-6 (Figura 6) y el grupo de los
ratones normales (Figura 2) ha puesto de manifiesto que las
superficies de los edemas, etc., eran más pequeñas en los ratones
normales, y que las regiones afectadas por la infiltración de
neutrófilos, eran menores. Esto indica que la administración de
MR16-1 dio por resultado una mejora (Figura 4). Así
pues, dado que se observó el efecto del anticuerpo monoclonal
anti-receptor de IL-6 en el modelo
de ratón, de la pancreatitis aguda inducida por ceruleína, los
antagonistas de la IL-6, tales como el anticuerpo
anti-receptor de IL-6, son eficaces,
por la supresión de los efectos de la IL-6, en lo
referente al tratamiento, mejoría de la gravedad, y prevención del
inicio de la pancreatitis aguda.
A ratones transgénicos
B6-hlL-6 o ratones B6 (camada de
ratones transgénicos hlL-6 T) (Clinical Immunology
and Immunopathologu, 82: 117-124, 1997) se
administró por vía intraperitoneal siete veces con intervalos de
una hora, ceruleína (producida por Kyowa Hakko) disuelta en solución
salina fisiológica a la dosis de 50 \mug/kg. Con objeto de
inducir pancreatitis grave LPS (lipopolisacárido, fabricado por
Sigma) fue administrado por vía intraperitoneal a la dosis de 1
mg/ml al mismo tiempo que la administración inicial de ceruleína.
Se administró a los ratones anticuerpo monoclonal
MR16-1 anti-receptor de
IL-6 de ratón, a la dosis de 1 mg/ratón, a través
de la vena caudal, 10 minutos antes de la administración inicial de
ceruleína. Como testigo se usó el disolvente (PBS) para el
anticuerpo. Ocho horas después, los ratones fueron eutanizados para
medir el peso de los páncreas. El peso del páncreas y el peso del
cuerpo se indican en la Figura 5.
En la pancreatitis grave inducida en los ratones
transgénicos con IL-6, la administración del
MR16-1 originó un efecto pronunciado de mejora. Así
pues, en el modelo de ratón de pancreatitis aguda grave inducida por
ceruleína y LPS, los antagonistas de IL-6 tales
como el anticuerpo anti-receptor de
IL-6 son eficaces, por supresión de los efectos de
la IL-6, en cuanto a tratamiento, mejora de la
gravedad y prevención de la iniciación de pancreatitis aguda
grave.
grave.
Ejemplo de referenica
1
Se preparó receptor de IL-6
soluble mediante el método de la PCR usando el plásmido pBSF2R.236
que contenía cDNA que codifica el receptor de IL-6,
obtenido según el método de Yamasaki et al., (Yamasaki, K
et al., Science (1988) 241, 825-828). El
plásmido pBSF2R.236 fue sometido a digestión con la enzima de
restricción Sph 1 obteniendo el cDNA del receptor de
IL-6, que luego se insertó en mp18 (fabricado por
Amersham), Usando un oligocebador sintético diseñado para
introducir un codón de detención en el cDNA del receptor de
IL-6, se introdujo una mutación en el cDNA del
receptor de IL-6 mediante el método de la PCR,
usando el sistema de mutagénesis Mutagenesis System (fabricado por
Amersham) in vitro. El procedimiento operatorio dio por
resultado la introducción de un codón de detención para el
aminoácido en la posición 345, y proporcionó cDNA que codifica el
receptor de IL-6 soluble.
Con objeto de expresar el cDNA del receptor de
IL-6 soluble en células CHO, se ligó al plásmido pSV
(fabricado por Pharmacia) obteniendo el plásmido pSVL344. El cDNA
del receptor de IL-6 soluble que se segmentó con
Hind III-Sal I fue insertado en el plásmido
pECEdhfr que contenía el cDNA de dhfr obteniendo el plásmido
pECEdhfr344 que puede ser expresado en las células CHO.
La línea de células CHO-dhfr
DXB-11 (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA (1980) 77, 4216-4220) fue transfectada con diez
\mug del plásmido pECEdhfr344 mediante el método de precipitación
por fosfato de calcio (Chen C. et al., Mol. Cell. Biol.
(1987) 7, 2745-2751). Las células CHO transfectadas
fueron cultivadas durante 3 semanas en un medio de selección
\alpha MEM desprovisto de nucleósidos, que contenía glutamina 1
mM, FCS dializado, 10%, penicilina, 100 U/ml y estreptomicina, 100
\mug/ml.
Las células CHO seleccionadas fueron
clasificadas mediante el método de dilución limitante obteniendo un
único clon de células CHO. El clon de las células CHO fue
amplificado en metotrexaro (MTX) 20 nM – 200 nM obteniendo la línea
de células CHO 5E27 que produce el receptor de IL-6
soluble, humano. La línea de células CHO 5E27 fue cultivada en
medio de Dulbecco modificado por Iscov (IMDM, fabricado por Gibco)
que contenía FBS al 5%. Se recogió el sobrenadante del cultivo y se
determinó la concentración del receptor de IL-6
soluble en el sobrenadante del cultivo mediante el método ELISA. El
resultado confirmó que se encuentra presente en el sobrenadante del
cultivo el receptor de IL-6 soluble.
Ejemplo de referencia
1
Ratones BALB/c fueron inmunizados con diez
\mug de la IL-6 recombinante (Hirano et
al., Immunol. Lett. 17:41, 1988), junto con adyuvante de Freund
completo, y esta operación se repitió todas las semanas hasta que
pudo detectarse en el suero anticuerpo
anti-IL-6.. Células inmunes fueron
extraídas desde el nódulo linfático local y después fueron
fusionadas con la línea celular de mieloma P3U1 usando
polietilenglicol 1500. Se seleccionaron hibridomas según el método
de Oi et al., (Selective Methods in Cellular Immunology, W.
H. Freeman y Co., San Francisco, 351, 1980) que emplea el medio
HAT, y se estableció el hibridoma que produce anticuerpo de
IL-6 humano.
El hibridoma que produce el anticuerpo de
IL-6 humana fue sometido a ensayo de unión de
IL-6 del modo siguiente. Una placa de
microtitulación de 96 pocillos (fabricada por Dynatech Laboratories,
Inc., Alexandria, VA) producida con polivinilo flexible, fue
recubierta con 100 \mul de Ig de cabra anti-ratón
(10 \mul/ml, fabricada por Cooper Biomedical, Inc., Malvem, PA)
durante la noche, a 4ºC. Seguidamente, la placa fue tratada con 100
\mul de PBS que contenía albúmina de suero bovino (BSA) al 1%, a
temperatura ambiente, durante 2 horas.
Después de lavarla en PBS, se añadió a cada
pocillo 100 \mul del sobrenadante del cultivo del hibridoma y
después se incubó durante la noche a 4ºC. La placa se lavó, se
añadió a cada pocillo IL-6 recombinante marcada con
^{125}I hasta una concentración de 2000 cpm/0,5 ng/pocillo y
después de lavar se determinó la radiactividad de cada pocillo
mediante un contador gamma (Beckman Gamma 9000, Beckman Instruments,
Fullerton, CA). De 216 clones de hibridomas, 32 eran positivos en
el ensayo de unión de IL-6. Desde estos clones se
obtuvo finalmente el MH166.BSF2 estable. El anticuerpo
anti-IL-6, MH166 producido por dicho
hibridoma tiene un subtipo de IgG1 \kappa.
Después, se utilizó el clon MH60.BSF2 del
hibridoma del ratón, dependiente de IL-6, para
examinar la actividad de neutralización con respecto al crecimiento
del hibridoma por el anticuerpo MH166,. Células MH60.BSF2 fueron
distribuidas a 1 x 10^{4}/200 \mul/pocillo, y se añadieron a
esto muestras que contenían el anticuerpo MH166, se cultivó durante
48 horas, se añadió 0,5 \muCi/pocillo de
^{3}H-timidina (New England Nuclear, Boston, MA),
y se continuó el cultivo durante otras 6 horas. Las células fueron
colocadas sobre un papel filtrante con fibra de vidrio y se
trataron mediante el recolector automático (Labo Mash Science Co.,
Tokio, Japón). Como testigo se empleó anticuerpo de conejo
anti-IL-6.
Como resultado, el anticuerpo MH166 inhibió, de
un modo dependiente de la dosis, la incorporación de
^{3}H-timidina de células MH60.BSF2 inducida por
IL-6. Esto reveló que el anticuerpo MH166 neutraliza
la actividad de la IL-6.
Ejemplo de referencia
3
Se preparó el anticuerpo MT18
anti-receptor de IL-6, mediante el
método de Hirata et al., (Hirata, Y. et al, J.
Immunol., 143, 2900-2906, 1989) fue fijado a
Sepharose 4B (fabricada por Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway,
N.J.)activada con CNBr, según el régimen asignado, y se purificó el
receptor de IL-6 (Yamasaki, K. et al.,
Science (1988) 241, 825-828). La línea celular de
mieloma humano, U266, fue solubilizada con hidrocloruro de
fluoruro de p-para-aminofenil metano
sulfonilo 1 mM (fabricado por Wako Chemicals) que contenía
digitonina (fabricada por Wako Chemicals) al 1%, trietanolamina 10
mM (pH 7,8) y NaCl 0,15 M (tampón de digitonina), y se mezcló con
anticuerpo MT18 fijado a bolas de Sepharose 4B. Luego, las bolas
fueron lavadas seis veces con el tampón de digitonina para preparar
el receptor de IL-6 purificado parcialmente, para
usar en inmunización.
Ratones BALB/c fueron inmunizados cuatro veces,
con intervalos de diez días, con el receptor de
IL-6 parcialmente purificado anterior, obtenido a
partir de 3 x 10^{9} células U266, y después se preparó un
hibridoma usando un método estándar. El sobrenadante del cultivo
del hibridoma procedente del pocillo de crecimiento positivo, fue
ensayado para determinar su actividad de fijación al receptor de
IL-6 según el método descrito mas adelante. 5 x
10^{7} células U266 fueron marcadas con
^{35}S-metionina (2,5 mCi) y se solubilizaron con
el tampón de digitonina anterior. Las células U266 solubilizadas
fueron mezcladas con un volumen de 0,04 ml del anticuerpo MT18
fijado a bolas de Sepharose 4B, y luego fueron lavadas seis veces
con el tampón de digitonina. Se eluyó el receptor de
IL-6 marcado con ^{35}S-metionina,
con 0,25 ml del tampón de digitonina (pH 3,4) y se neutralizó con
0,025 ml de Tris 1M (pH 7,4).
0,05 ml del sobrenadante del cultivo del
hibridoma se mezcló con 0,01 ml de Protein G Sepharose (fabricada
por Pharmacia). Después de lavar, se incubó la Sepharose con 0,005
ml de solución del receptor de IL-6 marcado con
^{35}S, preparada como se ha descrito anteriormente. El
inmunoprecipitado se analizó mediante SDS-PAGE para
determinar el sobrenadante del cultivo del hibridoma que reacciona
con el receptor de IL-6. Como resultado del
análisis, se estableció el clon de hibridoma PM 1 positivo en la
reacción. El anticuerpo producido a partir del hibridoma
PM-1 tiene el subtipo de IgG1\kappa.
La actividad inhibitoria de fijación de
IL-6 del anticuerpo producido por el hibridoma
PM-1 al receptor de IL-6 humana fue
estudiada usando la línea celular del mieloma humano U266. Se
preparó una IL-6 recombinante humana a partir de
E. coli (Hirano et al., Immunol. Lett,
17:41-45, 1988), y se marcó con ^{125}I usando el
reactivo de Bolton-Hunter (New England Nuclear,
Boston, MA)/Taga, T. et al., J. Exp. Med. (1987) 166,
967-981). 4 x 10^{5} células U266 fueron
cultivadas con el sobrenadante del cultivo del hibridoma
PM-1 al 70% (v/v) junto con 14.000 cpm de
IL-6 marcada con ^{125}I, durante una hora.
Setenta \mul de la muestra se depositaron en forma de capa sobre
300 \mul de FCS, en un tubo de microcentrífuga, de polietileno, de
\hbox{400 \mu l. Después de centrifugar, se determinó la
radiactividad de las células.}
El resultado reveló que el anticuerpo producido
por el hibridoma PM-1 inhibe la fijación de
IL-6 al receptor de IL-6.
Ejemplo de referencia
4
Se preparó un anticuerpo monoclonal dirigido
contra el receptor de IL-6 del ratón, según el
método descrito por Saito, et al., J. Immunol. (1993) 147,
168-173.
Las células CHO que producen el receptor de
IL-6 soluble del ratón fueron cultivadas en el
líquido de cultivo IMDM que contenía FCS al 10%. Partiendo del
sobrenadante del cultivo se purificó el receptor de
IL-6 soluble del ratón usando el anticuerpo RS12 del
receptor de IL-6 soluble del ratón, (véase Saito,
et al., referencia bibliográfica anterior) y una columna de
afinidad fijada a gel Affigel 10 (fabricado por Biorad).
El receptor de IL-6 soluble del
ratón (50 \mug) obtenido de este modo, se mezcló con adyuvante
completo de Freund y luego se inyectó en el abdomen de ratas
Wistar. Al cabo de 2 semanas después de la administración, los
animales recibieron una dosis de refuerzo con adyuvante de Freund
incompleto. El día 45 las células esplénicas de las ratas fueron
recolectadas y las células en aproximadamente 2 x 10^{8} fueron
fusionadas con 1 x 10^{7} células P3U1 de mieloma del ratón
usando PEG 1500 (fabricado por Boehringer Mannheim) al 50%, según el
método convencional, y luego fueron clasificadas mediante el medio
de cultivo HAT.
Después de añadir el sobrenadante del cultivo a
la placa revestida con anticuerpo de IgG de conejo
anti-rata (fabricado por Cappel) se hizo reaccionar
el receptor de IL-6 soluble de ratón. Seguidamente,
usando el anticuerpo de conejo anti-receptor de
IL-6 del ratón e IgG de oveja
anti-conejo marcada con fosfatasa alcalina, fueron
clasificados mediante el ensayo ELISA los hibridomas que producen el
anticuerpo dirigido contra el receptor de IL-6
soluble del ratón. Una vez confirmada la producción de anticuerpos,
los clones de los hibridomas fueron sub-clasificados
dos veces para obtener un único clon de hibridoma. El clon fue
designado MR16-1.
La actividad de neutralización del anticuerpo
producido por el hibridoma, sobre la transducción de señal de la
IL-6 del ratón, fue examinada mediante la
incorporación de ^{3}H-timidina usando células
MH60.BSF2 (Matsuda, T. et al., J. Immunol. (1988) 18,
951-956). En una placa de 96 pocillos fueron
preparadas células MH60.BSF2 a 1 x 10^{4} células/200
\mul/pocillo. A la placa se añadieron 10 pg/ml de
IL-6 del ratón y el anticuerpo
MR16-1 o el anticuerpo RS12 a
12,3-1000 ng/ml, y luego se cultivó a 37ºC y
CO_{2} al 5% durante 44 horas. Después se añadió 1
\muCi/pocillo de ^{3}H-timidina. Al cabo de 4
horas se midió la incorporación de
^{3}H-timidina. Como resultado de ello, el
anticuerpo MR16-1 había suprimido la incorporación
de ^{3}H-timidina de las células MH60.BSF2.
Por tanto, se demostró que el anticuerpo
MR16-1 producido por el hibridoma
MR16-1inhibe la fijación de IL-6 al
receptor de IL-6.
Según la presente invención, se ha puesto de
manifiesto que los anticuerpos anti-receptor de
IL-6 tienen un efecto terapéutico sobre las
pancreatitis y son útiles como agente terapéutico para la
pancreatitis aguda.
Claims (9)
1. El uso de un anticuerpo
anti-receptor de interleuquina-6
(anti-IL-6R) para fabricar un
medicamento para tratar la pancreatitis.
2. Un uso, según la reivindicación 1, en el que
el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal dirigido contra el
receptor de IL-6.
3. Un uso, según la reivindicación 2, en el que
el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal dirigido contra el
receptor de IL-6 humana o del ratón.
4. Un uso, según la reivindicación 2 ó 3, en el
que el anticuerpo es un anticuerpo recombinante.
5. Un uso, según la reivindicación 3, en el que
el anticuerpo monoclonal dirigido contra el receptor de
IL-6 humana o del ratón es, respectivamente, el
anticuerpo PM-1 o el anticuerpo MR
16-1.
6. Un uso, según la reivindicación 2 ó 3, en el
que el anticuerpo es un anticuerpo quimérico o un anticuerpo
humanizado dirigido contra el receptor de IL-6.
7. Un uso, según la reivindicación 6, en el que
el anticuerpo humanizado es el anticuerpo PM-1
humanizado.
8. Un uso, según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la pancreatitis es la
pancreatitis aguda.
9. El uso de un anticuerpo
anti-IL-6R para fabricar un
medicamento para suprimir el edema pancreático en la
pancreatitis.
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|---|---|---|---|
| ES99938591T Expired - Lifetime ES2276525T3 (es) | 1998-08-24 | 1999-08-23 | Preventivos o remedios para la pancreatitis que contienen anticuerpos anti-receptor il-6 como ingrediente activo. |
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|---|---|
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| WO (1) | WO2000010607A1 (es) |
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8470316B2 (en) | 2005-10-14 | 2013-06-25 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Agents for suppressing damage to transplanted islets after islet transplantation |
| US8623355B2 (en) | 2005-11-15 | 2014-01-07 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Methods for suppressing acute rejection of a heart transplant |
| US8771686B2 (en) | 2006-01-27 | 2014-07-08 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Methods for treating a disease involving choroidal neovascularization by administering an IL-6 receptor antibody |
| US8945558B2 (en) | 2005-10-21 | 2015-02-03 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Methods for treating myocardial infarction comprising administering an IL-6 inhibitor |
| US9260516B2 (en) | 2006-04-07 | 2016-02-16 | Osaka University | Method for promoting muscle regeneration by administering an antibody to the IL-6 receptor |
| US9539322B2 (en) | 2010-05-28 | 2017-01-10 | National University Corporation Hokkaido University | Method of enhancing an antitumor T cell response by administering an anti-IL-6 receptor antibody |
| US9725514B2 (en) | 2007-01-23 | 2017-08-08 | Shinshu University | Chronic rejection inhibitor |
| US10717781B2 (en) | 2008-06-05 | 2020-07-21 | National Cancer Center | Neuroinvasion inhibitor |
| US11692037B2 (en) | 2017-10-20 | 2023-07-04 | Hyogo College Of Medicine | Anti-IL-6 receptor antibody-containing medicinal composition for preventing post-surgical adhesion |
| US11851486B2 (en) | 2017-05-02 | 2023-12-26 | National Center Of Neurology And Psychiatry | Method for predicting and evaluating therapeutic effect in diseases related to IL-6 and neutrophils |
Families Citing this family (41)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE407696T1 (de) | 1997-03-21 | 2008-09-15 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Vorbeugende- oder heilmittel zur behandlung von multipler sklerose, mit antagonistischen anti-il6-rezeptor antikörpern als wirkstoff |
| UA80091C2 (en) | 2001-04-02 | 2007-08-27 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Remedies for infant chronic arthritis-relating diseases and still's disease which contain an interleukin-6 (il-6) antagonist |
| ES2536709T3 (es) | 2002-02-14 | 2015-05-27 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Utilización de ácido acético para eliminar los problemas inducidos por el ión Fe en las formulaciones de anticuerpos anti-HM1.24 o anti-IL6R |
| GB2401040A (en) * | 2003-04-28 | 2004-11-03 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Method for treating interleukin-6 related diseases |
| EP1673396A1 (en) * | 2003-09-22 | 2006-06-28 | BioVation GmbH & Co.KG. | Use of antibodies for reducing the biological effectiveness of il-6 |
| EP1728801A4 (en) | 2004-03-24 | 2009-10-21 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | SUBTYP OF A HUMANIZED ANTIBODY AGAINST THE INTERLEUKIN-6 RECEPTOR |
| AR048335A1 (es) | 2004-03-24 | 2006-04-19 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Agentes terapeuticos para trastornos del oido interno que contienen un antagonista de il- 6 como un ingrediente activo |
| ATE537190T1 (de) | 2006-06-02 | 2011-12-15 | Regeneron Pharma | Hochaffine antikörper gegen den humanen il-6- rezeptor |
| US8080248B2 (en) | 2006-06-02 | 2011-12-20 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Method of treating rheumatoid arthritis with an IL-6R antibody |
| BRPI0715115A2 (pt) | 2006-08-03 | 2013-06-04 | Vaccinex Inc | anticorpo monoclonal isolado, molÉcula de Ácido nucleico isolada, vetor de expressço, cÉlula hospedeira, mÉtodos para tratar uma doenÇa, e para produzir um anticorpo monoclonal isolado, uso do anticorpo monoclonal isolado, e, composiÇço farmacÊutica |
| JP2010095445A (ja) * | 2006-12-27 | 2010-04-30 | Tokyo Medical & Dental Univ | Ｉｌ−６アンタゴニストを有効成分とする炎症性筋疾患治療剤 |
| US9981415B2 (en) | 2007-09-10 | 2018-05-29 | Ehc Canada, Inc. | Method and apparatus for extrusion of thermoplastic handrail |
| PE20091174A1 (es) | 2007-12-27 | 2009-08-03 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Formulacion liquida con contenido de alta concentracion de anticuerpo |
| CA2724279C (en) | 2008-05-13 | 2017-03-07 | Novimmune S.A. | Anti-il-6/il-6r antibodies and methods of use thereof |
| US8188235B2 (en) | 2008-06-18 | 2012-05-29 | Pfizer Inc. | Antibodies to IL-6 and their uses |
| KR101803259B1 (ko) | 2009-03-18 | 2017-11-30 | 리스버로직스 코퍼레이션 | 신규한 소염제 |
| BRPI1014956B8 (pt) | 2009-04-22 | 2021-05-25 | Resverlogix Corp | agentes anti-inflamatórios |
| AU2010311567B2 (en) | 2009-10-26 | 2015-03-26 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method for the production of a glycosylated immunoglobulin |
| JO3417B1 (ar) | 2010-01-08 | 2019-10-20 | Regeneron Pharma | الصيغ المستقرة التي تحتوي على الأجسام المضادة لمضاد مستقبل( interleukin-6 (il-6r |
| JP5904552B2 (ja) * | 2010-05-28 | 2016-04-13 | 国立研究開発法人国立がん研究センター | 膵癌治療剤 |
| CN104998254A (zh) | 2010-11-08 | 2015-10-28 | 基因技术公司 | 皮下施用的抗-il-6受体抗体 |
| WO2012067150A1 (ja) * | 2010-11-16 | 2012-05-24 | 三菱化学株式会社 | Interleukin-6 receptor subunit beta蛋白質による脳梗塞の検査方法 |
| TWI589299B (zh) | 2011-10-11 | 2017-07-01 | 再生元醫藥公司 | 用於治療類風濕性關節炎之組成物及其使用方法 |
| WO2013176471A1 (ko) | 2012-05-21 | 2013-11-28 | 한국생명공학연구원 | 곰보배추의 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는, stat3 매개 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 |
| MX363403B (es) | 2013-07-04 | 2019-03-22 | Hoffmann La Roche | Inmumoensayo con interferencia suprimida para la deteccion de anticuerpos anti-farmacos en muestras de suero. |
| US9017678B1 (en) | 2014-07-15 | 2015-04-28 | Kymab Limited | Method of treating rheumatoid arthritis using antibody to IL6R |
| EP3268007B1 (en) | 2015-03-13 | 2022-11-09 | Resverlogix Corp. | Compositions and therapeutic methods for the treatment of complement-associated diseases |
| RU2717807C2 (ru) | 2015-05-07 | 2020-03-25 | ИЭйчСи Канада, Инк. | Компактный поручень из композитного материала с улучшенными механическими характеристиками |
| WO2016195088A1 (ja) | 2015-06-04 | 2016-12-08 | 国立研究開発法人 国立精神・神経医療研究センター | Ｉｌ－６阻害剤を有効成分とする精神疾患治療剤 |
| JP6515209B2 (ja) | 2015-06-19 | 2019-05-15 | イー エイチ シー カナダ インコーポレーテッドＥＨＣ Ｃａｎａｄａ，Ｉｎｃ． | 熱可塑性ハンドレールの押し出し成形のための方法及び装置 |
| WO2017147169A1 (en) | 2016-02-22 | 2017-08-31 | Ohio State Innovation Foundation | Chemoprevention using controlled-release formulations of anti-interleukin 6 agents, synthetic vitamin a analogues or metabolites, and estradiol metabolites |
| WO2018112264A1 (en) | 2016-12-14 | 2018-06-21 | Progenity Inc. | Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with a chemokine/chemokine receptor inhibitor |
| CN110072551B (zh) | 2016-12-14 | 2023-05-23 | 比奥拉治疗股份有限公司 | 使用利用可摄入装置释放的il-12/il-23抑制剂治疗胃肠道疾病 |
| WO2018112237A1 (en) | 2016-12-14 | 2018-06-21 | Progenity Inc. | Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an il-6r inhibitor |
| EP3596175A4 (en) | 2017-03-17 | 2021-01-13 | The Ohio State Innovation Foundation | NANOPARTICLE FOR THE DELIVERY OF CHEMOPREVENTIVE AGENTS |
| EP3600416B1 (en) | 2017-03-30 | 2023-06-07 | Biora Therapeutics, Inc. | Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an immune modulatory agent released using an ingestible device |
| WO2019246312A1 (en) | 2018-06-20 | 2019-12-26 | Progenity, Inc. | Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an immunomodulator |
| US20230009902A1 (en) | 2018-06-20 | 2023-01-12 | Progenity, Inc. | Treatment of a disease or condition in a tissue orginating from the endoderm |
| WO2019246271A1 (en) | 2018-06-20 | 2019-12-26 | Progenity, Inc. | Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an il-12/il-23 inhibitor |
| EP3917618A1 (en) | 2019-01-31 | 2021-12-08 | Sanofi Biotechnology | Anti-il-6 receptor antibody for treating juvenile idiopathic arthritis |
| EP3947737A2 (en) | 2019-04-02 | 2022-02-09 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Methods of predicting and preventing cancer in patients having premalignant lesions |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2898040B2 (ja) | 1990-01-26 | 1999-05-31 | 忠三 岸本 | ｇｐ１３０蛋白質に対する抗体 |
| US5210075A (en) | 1990-02-16 | 1993-05-11 | Tanabe Seiyaku Co., Ltd. | Interleukin 6 antagonist peptides |
| WO1992019759A1 (en) * | 1991-04-25 | 1992-11-12 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Reconstituted human antibody against human interleukin 6 receptor |
| JPH05304986A (ja) * | 1992-04-28 | 1993-11-19 | Tosoh Corp | ｇｐ１３０蛋白質に対するモノクロ−ナル抗体 |
| JP3525221B2 (ja) | 1993-02-17 | 2004-05-10 | 味の素株式会社 | 免疫抑制剤 |
| CN101829325A (zh) * | 1994-10-21 | 2010-09-15 | 岸本忠三 | Il-6受体的抗体在制备药物组合物中的用途 |
| IT1274350B (it) | 1994-12-06 | 1997-07-17 | Angeletti P Ist Richerche Bio | Antagonisti di interleuchina-6(il-6) che consistono di forme solubili del ricettore alfa di il-6, mutate nell'interfaccia che si lega a gp 130 |
| IT1274782B (it) | 1994-12-14 | 1997-07-24 | Angeletti P Ist Richerche Bio | Metodo per selezionare superagonisti, antagonisti e superantagonisti di ormoni del cui complesso recettoriale fa parte gp 130 |
| WO1996040966A1 (en) | 1995-06-07 | 1996-12-19 | Private Biologicals Corporation | Compositions and methods of treating il-6 associated diseases |
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Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8470316B2 (en) | 2005-10-14 | 2013-06-25 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Agents for suppressing damage to transplanted islets after islet transplantation |
| US8945558B2 (en) | 2005-10-21 | 2015-02-03 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Methods for treating myocardial infarction comprising administering an IL-6 inhibitor |
| US8623355B2 (en) | 2005-11-15 | 2014-01-07 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Methods for suppressing acute rejection of a heart transplant |
| US8771686B2 (en) | 2006-01-27 | 2014-07-08 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Methods for treating a disease involving choroidal neovascularization by administering an IL-6 receptor antibody |
| US9260516B2 (en) | 2006-04-07 | 2016-02-16 | Osaka University | Method for promoting muscle regeneration by administering an antibody to the IL-6 receptor |
| US9725514B2 (en) | 2007-01-23 | 2017-08-08 | Shinshu University | Chronic rejection inhibitor |
| US10717781B2 (en) | 2008-06-05 | 2020-07-21 | National Cancer Center | Neuroinvasion inhibitor |
| US9539322B2 (en) | 2010-05-28 | 2017-01-10 | National University Corporation Hokkaido University | Method of enhancing an antitumor T cell response by administering an anti-IL-6 receptor antibody |
| US11851486B2 (en) | 2017-05-02 | 2023-12-26 | National Center Of Neurology And Psychiatry | Method for predicting and evaluating therapeutic effect in diseases related to IL-6 and neutrophils |
| US11692037B2 (en) | 2017-10-20 | 2023-07-04 | Hyogo College Of Medicine | Anti-IL-6 receptor antibody-containing medicinal composition for preventing post-surgical adhesion |
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