ES2298273T3 - Agentes preventivos o terapeuticos contra la psoriasis que contienen un antagonista de il-6 como su ingrediente activo. - Google Patents
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Abstract
Uso de un anticuerpo anti-receptor de interleuquina-6 (IL-6) que puede bloquear la unión de IL-6 al receptor de IL-6, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la psoriasis.
Description
Agentes preventivos o terapeúticos contra la
psoriasis que contienen un antagonista de IL-6 como
su ingrediente activo.
La presente invención se refiere a un agente
preventivo o terapéutico que comprende un anticuerpo
anti-receptor de la interleuquina-6
(IL-6) como ingrediente activo.
La IL-6 es una citoquina
denominada factor 2 estimulante de células B (BSF2) ó interferón
\beta2. La IL-6 fue descubierta como un factor de
diferenciación responsable de la activación de las células
linfáticas B (Hirano, T. et al., Nature (1980) 324,
73-76). Después de esto, se descubrió que era una
citoquina multifuncional que influye en la función de diversas
células (Akira, S. et al., Adv. in Immunology (1993) 54,
1-78). Se ha indicado que la IL-6
induce la maduración de las células linfática T (Lotz, M. et
al., J. Exp. Med. (1988) 167, 1253- 1258).
La IL-6 propaga su actividad
biológica por medio de dos proteínas sobre la célula. Una de ellas
es una proteína que se une a un ligando, con un peso molecular de
aproximadamente 80 kD, a la que se une la IL-6 (Taga
T. et al., J. Exp. Med. (1987) 166, 967-981;
Yamasaki, K. et al., Science (1987) 241,
825-828). El receptor de IL-6 se
presenta no solo en una forma unida a la membrana que penetra y es
expresado sobre la membrana celular, sino también como un receptor
soluble de IL-6 que consiste principalmente en la
región extracelular.
La otra es la proteína gp130 unida a la
membrana, que no se une a un ligando, con un peso molecular de 130
kD aproximadamente, que toma parte en la transducción de la señal.
La IL-6 y el receptor de IL-6 forman
el complejo IL-6/receptor de IL-6,
al que se une la proteína gp130, y con ello la actividad biológica
de la IL-6 se propaga en la célula (Taga et
al., Cell (1989) 58, 573-581).
Los antagonistas de la IL-6 son
sustancias que inhiben la transducción de las actividades biológicas
de la IL-6, Hasta ahora, han sido conocidos
anticuerpos para la IL-6 (anticuerpos
anti-IL-6), anticuerpos para el
receptor de IL-6 (anticuerpos
anti-receptor de IL-6), anticuerpos
para la gp130 (anticuerpos anti-gp130),
IL-6 reformada, péptidos parciales de
IL-6 o del receptor de IL-6, y
semejantes.
Anticuerpos para el receptor de
IL-6 han sido descritos en diversos informes
(Novick D. et al., Hybridoma (1991) 10,
137-146; Huang, Y. W. et al., Hybridoma
(1993) 12, 621-630; Solicitud de Patente
Internacional WO 95-09873; Solicitud de Patente
Francesa FR 2694767; Patente de EE.UU. US 5216128).
Ha sido conocido el anticuerpo
PM-1 humanizado obtenido por implantación de la
región determinante de la complementariedad (CDR) de un anticuerpo
PM-1 del ratón (Hirata et al., J. Immunology
(1989), uno los anticuerpos anti-receptor de
IL-6, 143, 2900-2906) en un
anticuerpo humano (Solicitud de Patente Internacional WO
92-19759).
En líneas generales, la psoriasis es una
dermatosis crónica e intratable, y tiene un aspecto en el que se ha
formado queratina blanca o blanca plateada sobre protusiones
circulares o elípticas de color rojo (eritema). La psoriasis es una
dermatosis típica de las dermatosis eritroescamatosas, y estas
dermatosis eritroescamatosas son un síntoma cutáneo en el que se
encuentran presentes simultáneamente "inflamación" que resulta
de la invasión en la piel de leucocitos tales como linfocitos, y
"queratosis" en la que la epidermis y la capa córnea de la piel
se hacen gruesas.
Aun cuando la psoriasis está dividida por sus
síntomas en psoriasis vulgaris, psoriasis artrítica, psoriasis
pustular, pustulosis palmoplantar y psoriasis guttata, la etiología
y el mecanismo de iniciación no han sido esclarecidos. Sin embargo,
el hecho de que la ciclosporina, que posee actividad de supresión de
linfocitos, ejerce un efecto terapéutico sobre la psoriasis condujo
a la hipótesis de que están implicados los linfocitos.
Los agentes terapéuticos conocidos para el
tratamiento de la psoriasis incluyen esteroides para uso externo,
ciclosporina para uso interno, metotrexato para uso interno, terapia
con radiaciones UV, etc. para regular la inflamación de la piel;
vitamina D para uso externo, retinoides (Tigasson) para uso interno,
terapia UV, etc., para controlar el crecimiento (queratosis) de la
epidermis; fármacos antiinflamatorios no esteroidales (para la
artritis de la psoriasis artrítica), antibióticos (para las
infecciones relacionadas), etc., para tratar otros estados
individuales relacionados.
Sin embargo, no han sido realizados hasta la
fecha intentos para controlar específicamente la actividad biológica
de la IL-6 usando antagonistas de la
IL-6 tales como un anticuerpo
anti-receptor de IL-6, en la
psoriasis, y no se sabía que antagonistas de la
IL-6 tales como anticuerpos
anti-receptor de IL-6 pusieran de
manifiesto un efecto terapéutico para la psoriasis.
Es un objeto de la presente invención
proporcionar un tipo nuevo de agente preventivo o terapéutico para
la psoriasis.
Por tanto, la presente invención proporciona (1)
el uso de un anticuerpo contra el receptor de IL-6
como ingrediente activo, para la producción de un agente preventivo
o terapéutico para la psoriasis.
La presente invención proporciona también lo
anterior para la psoriasis, que comprende como ingrediente activo
un anticuerpo monoclonal contra el receptor de la
IL-6 humana. El anticuerpo monoclonal contra al
receptor de la IL-6 humana es, preferiblemente,
el anticuerpo PM-1.
La presente invención proporciona también lo
anterior para la psoriasis, que comprende como ingrediente activo
un anticuerpo monoclonal contra el receptor de la
IL-6 del ratón. El anticuerpo monoclonal contra el
receptor de la IL-6 del ratón es, preferiblemente,
el anticuerpo MR16-1.
La presente invención proporciona también lo
anterior para la psoriasis, que comprende como ingrediente activo
un anticuerpo recombinante contra el receptor de
IL-6. El anticuerpo recombinante contra el receptor
de IL-6 posee, preferiblemente, la región constante
(región C) de un anticuerpo humano.
La presente invención proporciona también lo
anterior para la psoriasis, que comprende como ingrediente activo
un anticuerpo quimérico o un anticuerpo humanizado contra el
receptor de IL-6.
La presente invención proporciona también lo
anterior para la psoriasis, que comprende como ingrediente activo
un anticuerpo PM-1 humanizado.
Los antagonistas de la IL-6 son
sustancias que bloquean la transducción de señal por
IL-6 y que inhiben la actividad biológica de la
IL-6. Los antagonistas de la IL-6
son sustancias que poseen, preferiblemente, una acción inhibidora
respecto a la unión a cualquiera de IL-6, receptor
de IL-6 o gp130. Como antagonistas de la
IL-6, la presente invención proporciona un
anticuerpo anti-receptor de
IL-6.
Los anticuerpos anti-receptor de
IL-6 para usar en la presente invención, pueden ser
obtenidos como anticuerpos policlonales o monoclonales usando un
método conocido. Como los anticuerpos anti-receptor
de IL-6 para usar en la presente invención se
prefieren, en particular, anticuerpos monoclonales de origen de
mamífero. Los anticuerpos monoclonales de origen de mamífero
incluyen los producidos por un hibridoma y los producidos por un
hospedante que ha sido transformado mediante tecnología de
ingeniería genética, con un vector de expresión que contiene el gen
del anticuerpo. Estos anticuerpos, mediante unión a la
IL-6, bloquean la unión de la IL-6
al receptor de IL-6, bloqueando con ello la
propagación de la actividad biológica de la IL-6 en
la célula.
Ejemplos de tales anticuerpos incluyen: el
anticuerpo MR16-1 (Tamura, T. et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90, 11924-11928), el
anticuerpo PM-1 (Hirata, Y. et al., J.
Immunology (1989) 143, 2900-2906), el anticuerpo
AUK12-20, el anticuerpo AUK64-7 o el
anticuerpo AUK146-15 (Solicitud de Patente
Internacional WO 92-19759), y semejantes. Entre
ellos el más preferido es el anticuerpo PM-1.
A propósito, la línea celular de hibridoma que
produce el anticuerpo PM-1, ha sido depositada
internacionalmente bajo las estipulaciones del Tratado de Budapest,
como PM-1, el 12 de Julio de 1988 en el Depósito de
Organismos de Patentes Internacionales del Instituto Nacional de
Ciencia Industrial y Tecnología (Central 6,
1-1-1 Higashi, Tsukuba City,
Ibaraki Pref., 305-5466, Japón) como FERM
BP-2998. Asimismo, la línea celular de hibridoma
que produce el anticuerpo MR-16-1 ha
sido depositada internacionalmente bajo las estipulaciones del
Tratado de Budapest, como hibridoma MR16-1 de
Rata-ratón, el 13 de Marzo de 1997, en el Depósito
de Organismos de Patentes Internacionales del Instituto Nacional de
Ciencia Industrial y Tecnología (Central 6,
1-1-1 Higashi, Tsukuba City,
Ibaraki Pref., 305-5466, Japón) como FERM
BP-5875.
Un hibridoma que produce anticuerpo monoclonal
anti-receptor de IL-6 puede ser
construido, básicamente, usando un procedimiento operatorio
conocido tal como el que se describe a continuación. Así pues, se
usa el receptor de IL-6 como antígeno de
sensibilización, que es inmunizado del modo convencional de
inmunización, y las células inmunes obtenidas de este modo son
fusionadas con células parentales conocidas, en un proceso
convencional de fusión celular, seguido de un método convencional
de selección para seleccionar células que producen el anticuerpo
mono-
clonal.
clonal.
Específicamente, los anticuerpos
anti-receptor de IL-6 pueden ser
obtenidos del modo siguiente. Por ejemplo, el receptor de
IL-6 humana que se utiliza como agente de
sensibilización para la obtención del anticuerpo, puede ser obtenido
usando la secuencia de aminoácidos/gen del receptor de
IL-6 que se describe en la Solicitud de Patente
Europea No. EP 325474, y el receptor de IL-6 del
ratón puede ser obtenido usando la secuencia de aminoácidos/gen del
receptor de IL-6 descrita en la Publicación de la
Patente Japonesa Sin examinar (Kokai) No.
3-155795.
Existen dos tipos de receptor de
IL-6: el receptor de IL-6 expresado
sobre la membrana celular, y el receptor de IL-6
separado desde la membrana celular (Receptor soluble de
IL-6: Yasukawa et al., J. Biochem. (1990)
108, 673-676). El anticuerpo del receptor soluble de
IL-6 está compuesto de la región sustancialmente
extracelular del receptor de IL-6 unida a la
membrana celular y es diferente del receptor de IL-6
unido a la membrana, puesto que el primero carece de la región
transmembranal o de la región transmembranal y la región
intracelular, ambas. La proteína del receptor de
IL-6 puede ser cualquier receptor de
IL-6, en tanto pueda usarse como antígeno de
sensibilización para preparar el anticuerpo
anti-receptor de IL-6 para usar en
la presente invención.
Una vez que un gen que codifica el receptor de
IL-6 ha sido insertado en un sistema conocido de un
vector de expresión para transformar una célula huésped apropiada,
la proteína deseada del receptor de IL-6 puede ser
purificada a partir de la célula huésped o un sobrenadante de
cultivo de la misma usando un método conocido, y la proteína del
receptor de IL-6 purificada de este modo puede ser
usada como el antígeno de sensibilización. Alternativamente, células
que expresan la proteína del receptor de IL-6 o una
proteína de fusión de la proteína del receptor de
IL-6 y otra proteína, pueden usarse como el
antígeno de sensibilización.
Escherichia coli (E. coli) que
contiene el plásmido pIBIBSF2R que comprende cDNA que codifica el
receptor de IL-6 humana, ha sido depositado
internacionalmente bajo las estipulaciones del Tratado de Budapest
como HB101-pIBIBSF2R, el 9 de Enero de 1989, en el
Depósito de Organismos de Patentes Internacionales del Instituto
Nacional de Ciencia Industrial y Tecnología (Central 6,
1-1-1 Higashi, Tsukuba City, Ibaraki
Pref., 305-5466, Japón) como FERM
BP-2232.
Preferiblemente, son seleccionados los mamíferos
que han de ser inmunizados con el antígeno de sensibilización,
tomando en consideración su compatibilidad con las células
parentales para usar en la fusión celular, e incluyen, en general,
aun cuando no se limita a ellos, roedores tales como ratones, ratas
y hamsters.
La inmunización de animales con un agente de
sensibilización se lleva a cabo usando un método conocido. Un
método general, por ejemplo, lleva consigo la administración
intraperitoneal o subcutánea al mamífero de un antígeno de
sensibilización. Específicamente, un agente de sensibilización, que
ha sido diluido y suspendido en una cantidad apropiada de solución
salina tamponada con fosfato (PBS) o solución salina fisiológica,
etc., se mezcla con una cantidad apropiada de un adyuvante común
tal como adyuvante completo de Freund. Después de ser emulsionado
se administra, preferiblemente, a un mamífero varias veces cada 4 a
21 días. Adicionalmente, puede usarse un portador adecuado en el
momento de inmunización del antígeno de sensibilización.
Después de la inmunización y de la confirmación
de un aumento de los niveles de anticuerpo deseados en el suero,
mediante un método convencional, se extraen células inmunes desde el
mamífero y se someten a la fusión celular. Como células inmunes
preferidas que se someten a la fusión celular, pueden mencionarse
específicamente células esplénicas.
Las células de mieloma de mamífero como las
otras células parentales que se someten a la fusión celular con las
células inmunes antes citadas, incluyen, preferiblemente, varias
líneas celulares conocidas tales como la P3x63Ag8.653 (Kearney,
J.F. et al., J. Immunol. (1979) 123,
1548-1550), la P3x63Ag8U.1 (Current Topics in
Microbiology
and Immunology (1978) 81, 1-7), NS-1 (Kohler, G. y Milstein, C., Eur. J. Immunol. (1976) 6, 511-519), MPC-11 (Margulies, D.H. et al., Cell (1976) 8, 405-415), SP2/0 (Shulman, M. et al., Nature (1978) 276, 269-270),
FO (de St. Groth, S.F. et al., J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21), S194 (Trowbridge, I.S., J. Exp. Med. (1978) 148, 313-323), R210 (Galfre, G. et al., Nature (1979) 217, 131-133), y semejantes, que pueden usarse según sea apro-
piado.
and Immunology (1978) 81, 1-7), NS-1 (Kohler, G. y Milstein, C., Eur. J. Immunol. (1976) 6, 511-519), MPC-11 (Margulies, D.H. et al., Cell (1976) 8, 405-415), SP2/0 (Shulman, M. et al., Nature (1978) 276, 269-270),
FO (de St. Groth, S.F. et al., J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21), S194 (Trowbridge, I.S., J. Exp. Med. (1978) 148, 313-323), R210 (Galfre, G. et al., Nature (1979) 217, 131-133), y semejantes, que pueden usarse según sea apro-
piado.
La fusión celular entre las células inmunes y
las células de mieloma anteriores, puede llevase a cabo
esencialmente de conformidad con un método conocido tal como el
descrito por Milstein et al. (Kohler, G. y Milstein, C.,
Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46) y semejantes.
Más específicamente, la fusión celular anterior
se lleva a cabo en el caldo nutriente convencional en presencia de,
por ejemplo, un acelerador de la fusión celular. Como el acelerador
de la fusión celular puede usarse, por ejemplo, polietilenglicol
(PEG), virus Sendai (HVJ) y semejantes, y puede añadirse un
adyuvante tal como sulfóxido de dimetilo, según se desee, para
intensificar la eficacia de la fusión.
La relación preferida de las células inmunes y
las células de mieloma para usar, es, por ejemplo, 1 a 10 veces más
células inmunes que células de mieloma. Los ejemplos de medios de
cultivo para usar en la fusión celular anterior incluyen, por
ejemplo, el medio RPMI 1640 y el medio de cultivo MEM, adecuados
para el crecimiento de las líneas celulares de mieloma anteriores,
y el medio de cultivo convencional usado para este tipo de cultivo
celular y, además, puede añadirse un suplemento de suero tal como
suero fetal de ternera (FCS).
En la fusión celular, cantidades previamente
determinadas de las células inmunes y las células de mieloma
anteriores, se mezclan bien en el líquido de cultivo anterior, al
que se añade una solución de PEG previamente calentada a 37ºC,
aproximadamente, por ejemplo una solución de PEG con un peso
molecular medio de 1000 a 6000, en una concentración de 30 a 60%
(p/v), y se mezcla para obtener las células de fusión deseadas
(hibridomas). Después, pueden retirarse mediante repetición de la
adición sucesiva del líquido de cultivo adecuado y centrifugación
para separar el sobrenadante, agentes de fusión celular, etc., que
son indeseables para el crecimiento del hibridoma.
Dicho hibridoma es seleccionado por cultivo en
el medio de selección convencional, por ejemplo, el medio de
cultivo HAT (un líquido de cultivo qie contiene hipoxantina,
aminopterina y timidina). El cultivo en dicho medio de cultivo HAT
se continúa, en general, durante un período de tiempo suficiente
para efectuar la destrucción de las células distintas del hibridoma
deseado (células no fusionadas), en general varios días a varias
semanas. Se lleva a cabo el método de dilución limitante
convencional en el que los hibridomas que producen el anticuerpo
deseado son seleccionados y clonados.
Además de obtener el hibridoma anterior por
inmunización con un antígeno de un animal distinto de un ser humano,
es posible también sensibilizar linfocitos humanos in vitro
con la proteína antigénica deseada o con células que expresan el
antígeno, y los linfocitos B sensibilizados que resultan son
fusionados con una célula de mieloma, por ejemplo U266, que tienen
la capacidad de dividirse permanentemente, obteniendo un hibridoma
que produce el anticuerpo humano deseado que posee la actividad de
unirse al antígeno deseado o a células que expresan el antígeno
(Publicación de Patente Japonesa examinada posteriormente (Kokoku)
1-59878). Además, un animal transgénico que posee
una colección de genes de anticuerpo humano, es inmunizado con el
antígeno o células que expresan antígeno, obteniendo el anticuerpo
humano deseado, según el método anteriormente citado (véase la
Solicitud de Patente Internacional WO 93/12227, WO 92/03918, WO
94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096 y WO 96/33735).
Los hibridomas que producen anticuerpo
monoclonal construidos de este modo, pueden ser subcultivados en el
líquido de cultivo convencional, o pueden ser almacenados durante un
período de tiempo prolongado en el seno de nitrógeno líquido.
Con objeto de obtener anticuerpos monoclonales a
partir de dicho hibridoma, puede usarse un método en el que dicho
hibridoma es cultivado por el método convencional y los anticuerpos
son obtenidos como el sobrenadante, o un método en el que el
hibridoma es implantado y crece en un mamífero compatible con dicho
hibridoma, y los anticuerpos son obtenidos como la ascitis. El
primer método es adecuado para obtener anticuerpos de alta pureza,
mientras que el último es adecuado para la producción de anticuerpos
a gran escala.
Por ejemplo, puede producirse un hibridoma que
produce anticuerpos anti-receptor de
IL-6, mediante un método tal como el que se
describe en la Publicación de Patente Japonesa Sin examinar (Kokai)
No. 3-139293. Puede usarse un método en el que el
hibridoma que produce el anticuerpo PM-1, que ha
sido depositado internacionalmente bajo las estipulaciones del
Tratado de Budapest el 12 de Julio de 1988, en el Depósito
Internacional de Organismos de Patentes del Instituto Nacional de
Ciencia Industrial y Tecnología (Central 6,
1-1-1 Higashi, Tsukuba City,
Ibaraki Pref., 305-5466 Japón) como FERM
BP-2998, es inyectado intraperitonealmente a ratones
BALB/c obteniendo la ascitis, partiendo de cuya ascitis puede
purificarse el anticuerpo PM-1, o un método en el
que el hibridoma es cultivado en el medio RPMI 1640 que contiene
suero fetal bovino al 10%, BM-Codimed H1 al 5%
(fabricado por Boehringer Mannheim), el medio SFM de hibridomas
(fabricado por GIBCO BRL), el medio PFHM-II
(fabricado por GIBCO BRL), o semejantes, desde el sobrenadante del
cultivo de los cuales puede purificarse el anticuerpo
PM-1.
De conformidad con la presente invención, como
anticuerpo monoclonal, puede usarse un anticuerpo recombinante
producido por clonación de un gen de un anticuerpo procedente de un
hibridoma y el gen es integrado luego en un vector apropiado, que
es introducido en un hospedante para producir el anticuerpo
recombinante usando tecnología recombinante génica (véase, por
ejemplo, el trabajo de Borrebaeck, C.A.K. y Larrick, J.W., en
THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, publicado en el Reino Unido por
MACMILLAN PUBLISHERS LTD., 1990).
Específicamente, mRNA que codifica la región
variable (región V) del anticuerpo, se aísla desde la célula que
produce el anticuerpo de interés, por ejemplo, un hibridoma. El
aislamiento de mRNA se lleva a cabo preparando RNA total mediante
un método conocido tal como el método de ultracentrifugación con
guanidina (Chirgwin, J.M. et al., Biochemistry (1979) 18,
5294-5299), el método AGPC (Chomczynski, P. et
al., Anal. Biochem. (1978) 162, 156-159), y
luego el mRNA es purificado partiendo del RNA total usando el kit de
Purificación de mRNA (Fabricado por Pharmacia) y semejante.
Alternativamente, puede prepararse directamente mRNA utilizando el
kit de purificación de mRNA Quick Prep (fabricado por
Pharmacia).
El cDNA de la región V del anticuerpo puede ser
sintetizado a partir del mRNA obtenido de este modo usando
transcriptasa inversa. El cDNA puede ser sintetizado usando el kit
de síntesis de cDNA, primera cadena, de transcriptasa inversa AMV y
semejante. Alternativamente, para la síntesis y amplificación de
cDNA, pueden usarse el kit FINDER RACE de amplificación de 5'
(fabricado por Clontech) y el método 5'-RACE
(Frohman, M.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988)
85, 8998-9002; Belyavsky, A. et al., Nucleic
Acids Res. (1989) 17, 2919-2932) que emplea PCR. El
fragmento de DNA deseado se purifica partiendo del producto de la
PCR obtenido y puede ser ligado a DNA vector. Además, un vector
recombinante es construido a partir de éste y después es
introducido en E. coli, etc., desde el que se seleccionan
colonias para preparar el vector recombinante deseado. La secuencia
de bases del DNA deseado puede ser confirmada mediante un método
conocido tal como el método didesoxi.
Una vez obtenido el DNA que codifica la región V
del anticuerpo deseado, puede ser ligado a DNA que codifica la
región constante (región C) del anticuerpo deseado, que luego es
integrado en un vector de expresión. Alternativamente, el DNA que
codifica la región V del anticuerpo puede ser integrado en un
vector de expresión que ya contiene DNA que codifica la región C del
anticuerpo.
Con objeto de producir un anticuerpo para usar
en la presente invención, el gen del anticuerpo es integrado en un
vector de expresión de modo que es expresado bajo el control de la
región reguladora de la expresión, por ejemplo, un intensificador
y/o un promotor. Seguidamente, el vector de expresión es
transformado en una célula huésped y el anticuerpo puede ser
expresado luego en ella.
De conformidad con la presente invención, pueden
emplearse anticuerpos recombinantes alterados artificialmente tales
como anticuerpos quiméricos y anticuerpos humanizados, con la
finalidad de disminuir la antigenicidad heteróloga contra los
seres humanos. Estos anticuerpos alterados pueden ser producidos
utilizando métodos cono-
cidos.
cidos.
Pueden obtenerse anticuerpos quiméricos ligando
el DNA que codifica la región V del anticuerpo obtenido de este
modo, con el DNA que codifica la región C de un anticuerpo humano,
que luego es integrado en un vector de expresión e introducido en
un hospedante para producir el anticuerpo en él (véase la Solicitud
de Patente Europea EP 125023 y la Solicitud de Patente
Internacional WO 92-19759). Usando este método
conocido, pueden obtenerse anticuerpos quiméricos útiles para la
presente invención.
Plásmidos que contienen la región V de la cadena
L o la región V de la cadena H del anticuerpo PM-1
quimérico han sido designados, cada uno, como
pPM-k3 y pPM-h1, respectivamente, y
E. coli que tiene el plásmido respectivo ha sido depositado
internacionalmente bajo las estipulaciones del Tratado de Budapest
como NCIMB40366 y NCIMB40362, el 11 de Febrero de 1991, en las
Colecciones Nacionales de Bacterias Industriales y Marinas
Limitadas.
Un anticuerpo humanizado que también es
denominado anticuerpo humano reformado, ha sido obtenido implantando
la región determinante de la complementariedad (CDR) de un
anticuerpo de un mamífero distinto de un ser humano, por ejemplo un
anticuerpo del ratón, en la CDR de un anticuerpo humano. También es
conocida la tecnología general de DNA recombinante para preparar
tales anticuerpos (véase la Solicitud de Patente Europea EP 125023
y la Solicitud de Patente Internacional WO
92-19759).
Específicamente, se sintetiza una secuencia de
DNA destinada a ligar la CDR de un anticuerpo del ratón con la
región del marco de lectura (FR) de un anticuerpo humano, partiendo
de diversos oligonucleótidos divididos que tienen secciones que se
solapan unas con otras en sus extremos. El DNA obtenido de este modo
es ligado a DNA que codifica la región C de un anticuerpo humano y
luego es incorporado en un vector de expresión que es introducido
en un hospedante para la producción del anticuerpo (véase la
Solicitud de Patente Europea EP 239400 y la Solicitud de Patente
Internacional WO 92-19759).
Para la región FR del anticuerpo humano ligada a
través de la CDR, es seleccionada la CDR que tiene un sitio
favorable de unión de antígeno. Cuando se desea, pueden sustituirse
aminoácidos de la FR de la región V del anticuerpo, por lo que la
CDR del anticuerpo humanizado puede formar un sitio apropiado de
unión antigénica (Sato, K. et al., Cancer Res. (1993) 53,
851-856).
Como la región C del anticuerpo humano pueden
usarse, por ejemplo, las C\gamma1, C\gamma2, C\gamma3 ó
C\gamma4. La región C del anticuerpo humano puede modificarse
también con objeto de mejorar la estabilidad del anticuerpo y la
producción del mismo.
Un anticuerpo quimérico consiste en la región V
de un anticuerpo de origen de un mamífero distinto del ser humano y
de la región C de un anticuerpo humano, y el anticuerpo humanizado
consiste en la región determinante de la complementariedad de un
anticuerpo de origen de un mamífero distinto del ser humano y la
región del marco de lectura y la región C de un anticuerpo humano,
habiendo disminuido su antigenicidad en el cuerpo humano, y por
tanto son útiles como anticuerpo para usar en la presente
invención.
Como una realización preferida de un anticuerpo
humanizado para usar en la presente invención, puede citarse el
anticuerpo humanizado PM-1 (véase la Solicitud de
Patente Internacional WO 92-19759).
Genes de anticuerpos construidos según se ha
indicado anteriormente pueden ser expresados y obtenidos de un modo
conocido. En el caso de células de mamífero, la expresión puede
conseguirse usando un DNA en el que un promotor útil usado
comúnmente, un gen de un anticuerpo que ha de ser expresado y la
señal poli A, han sido ligados operablemente en su extremo 3'
aguas abajo, o un vector que lo contiene. Como el
promotor/intensificador, por ejemplo, puede citarse el
promotor/intensificador precoz inmediato de citomegalovirus
humano.
Adicionalmente, como el promotor/intensificador
que puede usarse para la expresión de un anticuerpo para usar en la
presente invención, pueden usarse promotores/intensificadores
virales tales como retrovirus, Polyomavirus, adenovirus y virus 40
de simios (SV40), y promotores/intensificadores que derivan de
células de mamífero tales como el factor 1\alpha humano de
alargamiento (HEF1\alpha).
Por ejemplo, la expresión puede llevarse a cabo
fácilmente mediante el método de Mulligan et al. (Mulligan,
R.C. et al., Nature (1979) 277, 108-114)
cuando se usa el promotor/intensificador de SV40, y mediante el
método de Mizushima, S. et al. (Mizushima, S. y Nagata, S.,
Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322) cuando se usa el
promotor/intensificador de HEF1\alpha.
En el caso del E. coli, la expresión
puede llevarse a cabo ligando operablemente un promotor usado
comúnmente, una secuencia señal para la secreción de un anticuerpo
y un gen del anticuerpo que ha de ser expresado, seguido de su
expresión. Como el promotor pueden citarse, por ejemplo, el
promotor lacz y el promotor araB. Puede usarse el método de Ward
et al. (Ward, E.S. et al., Nature (1989) 341,
544-546; Ward, E.S. et al., FASEB J. (1992)
6, 2422-2427) cuando se utiliza el promotor lacz, y
el método de Better et al., (Better, M. et al.,
Science (1988) 240, 1041-1043) cuando se utiliza el
promotor araB.
Como secuencia señal para la secreción del
anticuerpo, cuando se produce en el periplasma de E. coli,
puede usarse la secuencia señal pelB (Lei, S.P. et al., J.
Bacteriol. (1987) 169, 4379-4383). Después de
separar el anticuerpo producido en el periplasma, la estructura del
anticuerpo es apropiadamente replegada antes de usarle (véase, por
ejemplo, el documento WO 96-30394).
Como el origen de replicación, pueden usarse
los derivados de SV40, Polyomavirus, adenovirus, virus del papiloma
bovino (BPV), y semejantes. Además, para amplificar el número de
copias del gen en el sistema de células huésped, los vectores de
expresión pueden incluir como marcadores seleccionables el gen de la
aminoglicósido transferasa (APH), el gen de la timidina quinasa
(TK), el gen de la xantina guaninofosforribosil transferasa de
E. coli (Ecogpt), el gen de la dihidrofolato reductasa
(dhfr), y semejantes.
Para la producción de un anticuerpo para usar en
la presente invención, puede usarse cualquier sistema de
producción, y los sistemas de producción de preparación de
anticuerpos comprenden el sistema de producción in vitro o
el sistema de producción in vivo. Como el sistema de
producción in vitro, puede citarse un sistema de producción
que emplea células eucarióticas y el sistema de producción que
emplea células procarióticas.
Cuando se usan células eucarióticas, están los
sistemas de producción que emplean células animales, células
vegetales y células de hongos. Las células animales conocidas
incluyen: (1) células de mamífero tales como células CHO, células
COS, células de mieloma, células de riñón de hámster joven (BHK),
células HeLa, y células Vero; (2) células de anfibio tales como
oocitos de Xenopus, o (3) células de insecto tales como sf9, sf21 y
Tn5. Las células vegetales conocidas incluyen, por ejemplo, las
derivadas de Nicotiana tabacum que es sometida al cultivo del
callo.
callo.
Las células de hongos conocidas incluyen
levaduras tales como las del género Saccharomyces, más
específicamente Saccharomyces cerevisiae, u hongos
filamentosos tales como la familia Aspergillus, más específicamente
Aspergillus niger.
Cuando se usan células procarióticas, están los
sistemas de producción que emplean células bacterianas. Las células
bacterianas conocidas incluyen Escherichia coli y
Bacillus subtilis.
Introduciendo mediante transformación, el gen
del anticuerpo deseado en esas células y cultivando las células
transformadas in vitro, puede obtenerse el anticuerpo. El
cultivo se lleva a cabo por los métodos conocidos. Por ejemplo,
como el líquido de cultivo para células de mamífero, pueden usarse
los medios DMEM, MEM, RPMI1640, iMDM y semejantes, y pueden
utilizarse en combinación, suplementos séricos tales como suero
fetal de ternera (FCS). Además, pueden producirse anticuerpos in
vivo por implantación de células en las que ha sido introducido
el gen del anticuerpo, en la cavidad abdominal de un animal, y
semejante.
En cuanto a los sistemas de producción in
vivo pueden citarse aquellos que emplean animales y aquellos que
emplean plantas. Cuando se usan animales, están los sistemas de
producción que emplean mamíferos e insectos.
Como mamíferos, pueden usarse cabras, cerdos,
ovejas, ratones y ganado vacuno (Vicki Glaser, SPECTRUM
Biotechnology Applications, 1993). Asimismo, pueden usarse como
insectos gusanos de seda, y en el caso de plantas, tabaco, por
ejemplo.
Los genes de anticuerpos son introducidos en
estos animales y plantas, en los que los genes son producidos y
luego recogidos. Por ejemplo, se insertan genes de anticuerpos en la
parte media del gen que codifica proteína que es producida
intrínsecamente en la leche, tal como la caseína \beta de cabra,
para preparar genes de fusión. Fragmentos de DNA que contienen el
gen de fusión en el que ha sido insertado el gen del anticuerpo,
son inyectados en un embrión de cabra y el embrión es introducido en
una cabra hembra. El anticuerpo deseado se obtiene desde la leche
producida por una cabra transgénica, producida por la cabra que
había recibido el embrión o la progenie del mismo. Con objeto de
aumentar la cantidad de leche que contiene el anticuerpo deseado
producido por la cabra transgénica, pueden administrarse hormonas a
la cabra transgénica, según sea apropiado (Ebert, K.M. et
al., Bio/Technology (1994) 12, 699-702).
Cuando se utilizan gusanos de seda, el gusano de
seda es infectado con un baculovirus en el que ha sido insertado el
gen del anticuerpo deseado, y el anticuerpo deseado puede ser
obtenido desde el fluido corporal del gusano de seda (Maeda, S.
et al., Nature (1985) 315, 592-594). Además,
cuando se usa planta de tabaco, el gen del anticuerpo deseado se
inserta en un vector de expresión para plantas, por ejemplo el pMON
530, y después el vector es introducido en una bacteria tal como la
Agrobacterium tumefaciens. La bacteria se utiliza después
para infectar plantas de tabaco tales como la Nicotiana
tabacum, obteniendo el anticuerpo deseado desde las hojas del
tabaco. (Julian, K.-C. Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24,
131-138).
Cuando se produce un anticuerpo en sistemas de
producción in vitro o in vivo, según se ha citado
anteriormente, DNA que codifica la cadena pesada (cadena H) o la
cadena ligera (cadena L) del anticuerpo, es incorporado por
separado en un vector de expresión y los hospedantes son
transformados simultáneamente, o DNA que codifica la cadena H y la
cadena L del anticuerpo es integrado en un único vector de expresión
y el hospedante es transformado con éste (véase la Solicitud de
Patente Internacional WO 94-11523).
Los anticuerpos para usar en la presente
invención pueden ser fragmentos de anticuerpos o versiones
modificadas de los mismos en tanto en cuanto estos sean usados
preferiblemente en la presente invención. Por ejemplo, como
fragmentos de anticuerpos pueden citarse los Fab, F(ab')2, Fv
o Fv de una sola cadena (scFv) en que el Fv's de la cadena H y la
cadena L estaban ligados por medio de un engarce adecuado.
Específicamente, se tratan anticuerpos con una
enzima, por ejemplo papaína o pepsina, para producir fragmentos
de anticuerpo, o se construyen genes que codifican estos fragmentos
de anticuerpo, y después son introducidos en un vector de
expresión, que es expresado en una célula huésped adecuada (véase,
por ejemplo, Co, M.S. et al., J. Immunol. (1994) 152,
2968-2978; Better, M. y Horwitz, A.H., Methods
Enzymol. (1989) 178, 476-496; Plucktrun, A. y
Skerra, A., Methods Enzymol, (1989) 178, 497-515;
Lamoyi, E., Methods Enzymol. (1986) 121, 652-663;
Rousseaux, J. et al., Methods Enzymol. (1986) 121,
663-669; Bird, R.E. et al., TI BTECH (1991)
9, 132-137).
El fragmento scFv puede ser obtenido ligando la
región V de la cadena H y la región V de la cadena L de un
anticuerpo. En el scFv, la región V de la cadena H y la región V
de la cadena L son ligadas, preferiblemente, por medio de un
engarce, de preferencia un engarce peptídico (Huston, J.S. et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85,
5879-5882). La región V de la cadena H y la región V
de la cadena L del scFv pueden derivarse desde cualquiera de los
anticuerpos anteriormente citados. Como el engarce peptídico para
ligar las regiones V, puede emplearse cualquier péptido
monocatenario que comprende, por ejemplo, 12 - 19 restos de
aminoácidos.
Puede obtenerse DNA que codifica scFv usando
como molde DNA que codifica la cadena H o la región V de la cadena
H del anticuerpo anterior y DNA que codifica la cadena L o la
región V de la cadena L del anticuerpo anterior, amplificando la
parte del DNA que codifica la secuencia de aminoácidos deseada entre
las secuencia anteriores, mediante la técnica PCR con el par
cebador que especifica ambos de sus extremos, y amplificando
posteriormente la combinación de DNA que codifica la parte de
engarce peptídico y el par cebador que define que ambos extremos de
dicho DNA están ligados a la cadena H y la cadena L,
respectivamente.
Una vez construidos DNAs que codifican el scFv,
puede obtenerse mediante un método convencional un vector de
expresión que los contiene y un hospedante transformado con dicho
vector de expresión, y puede obtenerse el scFv mediante un método
convencional, usando el hospedante que resulta.
Estos fragmentos de anticuerpos pueden ser
producidos por obtención del gen de los mismos de un modo similar
al anteriormente citado, y permitiéndole que sea expresado en un
hospedante. "Anticuerpo", tal como se usa en las
reivindicaciones de la presente invención, engloba estos fragmentos
de anticuerpo.
Como anticuerpos modificados, pueden ser usados
anticuerpos asociados con diversas moléculas tales como
polietilenglicol (PEG). "Anticuerpo" tal como se usa en las
reivindicaciones de la presente solicitud engloba estos anticuerpos
modificados. Estos anticuerpos modificados pueden ser obtenidos
modificando químicamente los anticuerpos así obtenidos. Estos
métodos ya han sido establecidos en la técnica.
Los anticuerpos expresados y producidos según se
ha descrito anteriormente, pueden ser separados desde el interior o
el exterior de la célula o desde el hospedante, y después pueden ser
purificados para obtener homogeneidad. La separación y purificación
de anticuerpos para usar en la presente invención, puede llevarse a
cabo mediante cromatografía de afinidad. Como la columna empleada
para la cromatografía de afinidad pueden citarse la columna de
Proteína A y la columna de Proteína B. Ejemplos de portadores para
usar en la columna de Proteína A incluyen, por ejemplo, Hyper D,
POROS, Sepharose F.F. (Pharmacia), y semejantes. Además, pueden
usarse, sin limitación, los métodos de separación y purificación de
proteínas comúnmente utilizados.
Otras técnicas cromatográficas distintas de la
cromatografía de afinidad anterior, tales como filtros, filtración
en gel, precipitación por sales, diálisis y semejantes pueden
seleccionarse y combinarse, según sea apropiado, con objeto de
separar y purificar los anticuerpos para usar en la presente
invención. Las técnicas cromatográficas incluyen, por ejemplo,
cromatografía de intercambio iónico, cromatografía hidrofóbica,
filtración en gel, y semejante. Estas cromatografías pueden ser
aplicadas a cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC). También
puede usarse HPLC de fase invertida (rpHPLC).
La concentración de anticuerpo que se obtiene
como anteriormente puede ser determinada por medida de la
absorbancia o mediante el método ELISA, y semejantes. Por tanto,
cuando se emplea la medida de la absorbancia, el anticuerpo
obtenido es apropiadamente diluido con PBS(-) y después se mide la
absorbancia a 280 nm, seguida de cálculo usando el coeficiente de
absorción de DO 1,35 1 mg/ml. Cuando se usa el método ELISA la
medida se realiza del modo siguiente. 100 \mul de anticuerpo de
cabra anti-IgG humana (fabricado por TAGO) diluido a
1 \mug/ml en el seno de solución tampón de bicarbonato 0,1 M, pH
9,6, se añade a una placa de 96 pocillos (fabricada por Nunc), y se
incuba durante la noche a 4ºC para inmovilizar el anticuerpo.
Después de bloquear, se añade 100 \mul de anticuerpo
apropiadamente diluido para usar en la presente invención o
muestras que contienen el anticuerpo, o de IgG humana (fabricada
por CAPPEL) como patrón, y se incuba a temperatura ambiente durante
1 hora.
\newpage
Después de lavar, se añade 100 \mul de
anticuerpo anti-IgG humana marcado con fosfatasa
alcalina (fabricado por BIO SOURCE), diluido 5000 veces, y se
incuba a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar, se
añade la solución de sustrato y se incuba, seguido de medida de la
absorbancia a 405 nm, usando el lector de microplacas MICROPLATE
READER Modelo 3550 (fabricado por Bio-Rad), para
calcular la concentración del anticuerpo deseado.
La IL-6 reformada para usar en
la presente invención, es una sustancia que posee actividad de
unión con el receptor de IL-6 y que no propaga la
actividad biológica de la IL-6. Por tanto, aun
cuando la IL-6 reformada compite con la
IL-6 para unirse al receptor de
IL-6, no propaga la actividad biológica de la
IL-6 y por consiguiente la IL-6
reformada bloquea la transducción de señal por
IL-6
Puede prepararse IL-6 reformada
introduciendo una mutación, reemplazando restos de aminoácidos de la
secuencia de aminoácidos de la IL-6. La
IL-6 de la que procede la IL-6
reformada, puede ser de cualquier origen, pero es, preferiblemente,
IL-6 humana considerando la antigenicidad, etc.
Específicamente, la estructura secundaria de la
secuencia de aminoácidos de la IL-6 puede ser
estimada usando un programa conocido de modelización molecular tal
como el WHATIF (Vriend et al., J. Mol. Graphics (I1990) 8,
52-56), y se evalúa su efecto sobre los restos
globales de aminoácidos que han de reemplazarse. Después de
determinar los restos de aminoácidos adecuados, puede introducirse
la mutación usando un vector que contiene como molde una secuencia
de bases que codifica el gen de la IL-6 humana, en
un método de PCR usado comúnmente para reemplazar aminoácidos,
obteniendo con ello un gen que codifica IL-6
reformada. Este gen puede integrarse, según sea apropiado, en un
vector de expresión adecuado obteniendo IL-6
reformada de conformidad con los métodos anteriormente citados para
la expresión, producción y purificación de anticuerpos
recombinantes.
Ejemplos específicos de IL-6
reformada han sido descritos por Brakenhoff et al., en J.
Bio. Chem. (1944) 269, 86-93, Saviono et
al., EMBO J. (1994) 13, 1357-1367, y en los
documentos WO 96-18648 y WO
96-17869.
Los péptidos parciales de IL-6 o
los péptidos parciales del receptor de IL-6 para
usar en la presente invención, son sustancias que poseen actividad
de unión al receptor de IL-6 o a
IL-6, respectivamente, y que no propagan la
actividad biológica de la IL-6. Por tanto, los
péptidos parciales de IL-6 o los péptidos parciales
del receptor de IL-6 se unen y capturan al receptor
de IL-6 o IL-6, respectivamente,
inhibiendo específicamente de este modo la unión de
IL-6 al receptor de IL-6. Como
resultado, estos compuestos no propagan la actividad biológica de
la IL-6, y por ello bloquean la transducción de
señal por IL-6.
Los péptidos parciales de IL-6 o
los péptidos parciales del receptor de IL-6, son
péptidos que comprenden parte o la totalidad de la secuencia de
aminoácidos implicada en la unión de IL-6 y el
receptor de IL-6 de las secuencias de aminoácidos
de IL-6 o del receptor de IL-6.
Tales péptidos comprenden, habitualmente, 10-80
restos de aminoácidos, preferiblemente 20-50 restos
de aminoácidos, y más preferiblemente, 20-40 restos
de aminoácidos.
Los péptidos parciales de IL-6 o
los péptidos parciales del receptor de IL-6
especifican las regiones implicadas en la unión de
IL-6 y el receptor de IL-6 de la
secuencia de aminoácidos de IL-6 o del receptor de
IL-6, y parte o toda la secuencia de aminoácidos
puede ser preparada mediante un método conocido comúnmente tal como
tecnología de ingeniería genética o síntesis de péptidos.
Con objeto de preparar péptidos parciales de
IL-6 o péptidos parciales del receptor de
IL-6 mediante tecnología de ingeniería genética,
una secuencia de DNA que codifica el péptido deseado puede ser
integrada en un vector de expresión de modo que ellos pueden ser
obtenidos según los métodos anteriormente citados para la expresión,
producción y purificación de anticuerpos recombinantes.
Con objeto de preparar péptidos parciales de
IL-6 o péptidos parciales del receptor de
IL-6 mediante síntesis de péptidos, puede
utilizarse un método comúnmente empleado en la síntesis de
péptidos, tal como síntesis en fase sólida o síntesis en fase
líquida.
Específicamente, pueden usarse los métodos
descritos en "Zoku Iyakuhinno Kaihatsu, Vol. 14: Peptide
Synthesis" compilado por Haruaki Yajima, Hirokawa Shoten, 1991.
En cuanto a la síntesis en fase sólida, puede usarse un método en
el que un aminoácido que corresponde al extremo C terminal del
péptido que ha de ser sintetizado, se une a un soporte insoluble en
disolventes orgánicos, y luego una reacción en la que aminoácidos de
los que el grupo amino en posición \alpha y un grupo funcional de
la cadena lateral han sido protegidos con un grupo de protección
adecuado, es condensado uno por uno en la dirección desde el extremo
C terminal hacia el extremo N terminal, y una reacción en la que
dicho grupo protector del grupo amino en posición \alpha del
aminoácido o el péptido unido a la resina, es eliminado de ésta, se
repiten alternadamente para extender la cadena peptídica, La
síntesis de péptidos en fase sólida se divide, toscamente, en el
método Boc y el método Fmoc, dependiendo del tipo de grupos de
protección que se usan.
Después de sintetizar así el péptido de interés,
puede llevarse a cabo una reacción de desprotección o una reacción
de escisión de la cadena peptídica desde el soporte. Para la
reacción de escisión de cadenas peptídicas, el método Boc emplea
fluoruro de hidrógeno o ácido trifluorometanosulfónico, o el método
Fmoc emplea, habitualmente, TFA. En el método Boc, la resina con el
péptido protegido anterior se trata en presencia de anisol en el
seno de fluoruro de hidrógeno. Seguidamente, puede llevarse a cabo
la eliminación del grupo de protección y la separación desde el
soporte para recoger el péptido. La liofilización de éste
proporciona péptido crudo. Por otra parte, en el método Fmoc, la
reacción de desprotección y la reacción de separación de la cadena
peptídica desde el soporte, puede llevarse a cabo de un modo
similar al antes citado.
El péptido crudo obtenido puede ser sometido a
HPLC para separarle y purificarle. Para su elución puede usarse en
condiciones óptimas uno de los disolventes constituidos por
agua-acetonitrilo utilizados comúnmente para la
purificación de proteínas. Las fracciones que corresponden a los
picos del perfil cromatográfico son cosechadas y liofilizadas
después. Para las fracciones de péptidos purificadas de este modo,
se lleva a cabo, para su identificación, análisis del peso
molecular mediante espectroscopía de masas, análisis de la
composición de aminoácidos o análisis de la secuencia de
aminoácidos.
Ejemplos específicos de péptidos parciales de
IL-6 y de péptidos parciales del receptor de
IL-6, han sido descritos en la Publicación de
Patente Japonesa Sin Examinar (Kokai) No. 2-188600,
la Publicación de Patente Japonesa Sin Examinar (Kokai) No.
7-324097, la Publicación de Patente Japonesa Sin
Examinar (Kokai) No. 8-311098, y en la Publicación
de la Patente de EE.UU. US 5210075.
La actividad inhibidora de la transducción de
señal de la IL-6 por los antagonistas de
IL-6 de la presente invención, puede ser evaluada
usando un método comúnmente conocido. Específicamente, se cultivan
células HN60.BSF2 dependientes de IL-6, a las que
se añade IL-6, y a la vez, en presencia de
antagonista de IL-6, se determina la incorporación
de timidina marcada con ^{3}H por las células que dependen de la
IL-6. Alternativamente, se añaden
IL-6 marcada con ^{125}I y antagonista de
IL-6, al mismo tiempo, y después se determina, para
realizar una evaluación, la IL-6 marcada con
^{125}I que se ha unido a las células que expresan
IL-6. En el sistema de ensayo anterior, además del
grupo en que está presente el antagonista de IL-6,
se establece un grupo testigo negativo que no contiene antagonista
de IL-6, y se comparan los resultados obtenidos en
ambos para evaluar la actividad de inhibición de
IL-6 por el antagonista de
IL-6.
IL-6.
Con objeto de confirmar los efectos de la
presente invención, el anticuerpo anti-receptor de
IL-6 para usar en la presente invención se
administra a un animal que hubiera desarrollado lesiones parecidas a
la psoriasis después de implantarle células T CD45RB^{alto}
CD4^{+}, y se observa el tejido de la piel para evaluar la
mejoría de las lesiones parecidas a la psoriasis. Las células T
CD45RB^{alto} CD4^{+} para inducir lesiones parecidas a la
psoriasis, pueden prepararse, por ejemplo, partiendo de bazo de
ratón (BALB/c x 129/SvJ) F2, mediante un método que se describe en
los Ejemplos que figuran más adelante en esta memoria. Asimismo,
como animales en los se inducen lesiones parecidas a la psoriasis,
pueden utilizarse, por ejemplo, ratones, preferiblemente ratones
SCID.
Como se manifiesta en los Ejemplos que figuran
más adelante, dado que se observó mejoría de las lesiones
semejantes a la psoriasis mediante la administración de anticuerpo
anti-receptor de IL-6 en animales
que habían desarrollado psoriasis, se puso de manifiesto que los
antagonistas de la IL-6 tales como los anticuerpos
anti-receptor de IL-6 poseen un
efecto terapéutico para la psoriasis.
Los sujetos a tratar en la presente invención
son mamíferos.- Los mamíferos a tratar son, preferiblemente, seres
humanos.
Los agentes preventivos o terapéuticos de la
presente invención pueden ser administrados por vía oral o por vía
parenteral y sistémica o localmente. Por ejemplo, pueden
seleccionarse administración por inyección intravenosa tal como
infusión gota a gota, inyección intramuscular, inyección
intraperitoneal, inyección subcutánea, supositorios, enema,
comprimidos para vía oral con revestimiento entérico, y semejantes,
y puede seleccionarse el régimen de dosificación según sea
apropiado, dependiendo de la edad y las condiciones del paciente.
La dosis eficaz se escoge entre el intervalo de 0,01 mg a 100 mg por
kg de peso, por administración. Alternativamente, puede
seleccionarse la dosis de 1 a 1000 mg, preferiblemente 5 a 50 mg,
por paciente.
Los agentes preventivos o terapéuticos de la
presente invención pueden contener excipientes y aditivos
farmacéuticamente aceptables, dependiendo de la vía de
administración. Ejemplos de tales excipientes y aditivos incluyen
agua, disolventes orgánicos farmacéuticamente aceptables, colágeno,
poli(alcohol vinílico), polivinilpirrolidona, polímeros
carboxivinílicos, carboximetilcelulosa sódica, sal sódica de un
poli(ácido acrílico), alginato sódico, dextrano hidrosoluble,
carboximetil-almidón sódico, pectina, metilcelulosa,
etilcelulosa, goma de xantano, goma arábiga, caseína, gelatina,
agar, diglicerina, propilenglicol, polietilenglicol, vaselina,
parafina, alcohol estearílico, ácido esteárico, albúmina de suero
humano (BSA), manitol, sorbitol, lactosa, tensioactivos
farmacéuticamente aceptables, y semejantes. Los aditivos reales
usados se escogen entre los anteriores o sus combinaciones,
dependiendo de la forma de administración, pero no se limita a
ellos.
La presente invención será explicada ahora en
esta memoria con mayor detalle, con referencia a los ejemplos de
trabajo, ejemplos de referencia y ejemplos experimentales que
siguen. Hay que hacer notar, no obstante, que la presente invención
no se limita en modo alguno, a estos ejemplos.
\newpage
Ejemplo de
trabajo
Después de someter a hemolisis células
esplénicas de ratones BALB/c, según el método de Schon MP et
al. (Nature Medicine (1997) 3, 183-188), se
prepararon células T CD45RB^{alto} CD4^{+} usando la columna
MACS y la FACS Vantage, y se implantaron por vía intraperitoneal en
ratones C.B-17, a 4,0 x 10^{5}
células/cabeza.
Quince minutos después de la implantación de las
células, se administró a 2 mg/cabeza por vía intraperitoneal el
anticuerpo anti-receptor de IL-6
(MR16-1). Los grupos testigo negativo y testigo
positivo (grupo sin implantación de células y el grupo con
implantación de células) recibieron PBS. Seguidamente, se administró
MR16-1 a 1 mg/cabeza/semana, y a aproximadamente
ocho semanas después de la implantación de las células, los ratones
fueron sacrificados, y las orejas fueron recogidas y fijadas en
formalina. Según un método estándar, se prepararon muestras
histológicas y se tiñeron con HE. Después, se observó el tejido de
la piel de la oreja y se evaluaron las lesiones parecidas a la
psoriasis mediante las calificaciones establecidas según los
criterios siguientes:
-: Normal,
+/-: Se aprecia acantosis leve,
+: Se aprecia acantosis
++: Se aprecia acantosis acusada.
El análisis estadístico fue llevado a cabo por
SAS mediante el ensayo de suma de rangos, de Wilcoxon, con un nivel
de significación de 5%.
Como puede apreciarse en la Tabla 1, se observó
un aumento importante en la calificación de lesiones parecidas a
la psoriasis mediante la implantación de las células, y se demostró
el establecimiento del sistema experimental. Mediante la
administración de un anticuerpo anti-receptor de
IL-6, el MR16-1, al grupo de
implantación de las células, se observó una mejoría importante en
la calificación de las lesiones parecidas a la psoriasis. Lo
anterior ha puesto de manifiesto la posibilidad de que un anticuerpo
anti-receptor de IL-6 podría ser un
nuevo agente terapéutico para el tratamiento de la psoriasis.
Ejemplo de referencia
1
Usando el plásmido pBSF2R.236 que contiene cDNA
que codifica el receptor de IL-6, obtenido por el
método de Yamasaki et al., (Yamasaki et al., Science
(1988) 241, 825-828), se preparó el receptor soluble
de IL-6 mediante el método de PCR. El plásmido
pBSF2R se sometió a digestión con la enzima de restricción Sph I
obteniendo cDNA del receptor de IL-6, que se
insertó en mp18 (Fabricado por Amersham). Usando un cebador
sintético destinado a introducir un codón de terminación en el cDNA
del receptor de IL-6, se introdujo una mutación en
el cDNA del receptor de IL-6 mediante el método de
PCR en un sistema de mutagénesis in vitro (fabricado por
Amersham). Mediante este procedimiento operatorio, el codón de
terminación se introdujo en la posición del aminoácido 345, y se
obtuvo cDNA que codifica el receptor soluble de
IL-6.
Con objeto de expresar el receptor soluble de
IL-6 en células CHO, fue ligado a un plásmido pSV
(fabricado por Pharmacia) obteniendo el plásmido pSVL344. cDNA del
receptor soluble de IL-6 digerido con
HindIII-SalI se insertó en un plásmido pECEdhfr que
contenía el cDNA de dhfr, obteniendo el plásmido pECEdhfr344 que se
expresa en células CHO.
Diez \mug del plásmido pECEdhfr344 fueron
transfectados a una línea DXB-11 de células
dhfr-CHO (Urlaub, G. et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA (1980) 77, 4216-4220) mediante el
método de precipitación con fosfato de calcio (Chen, C. et
al., Mol. Cell. Biol. (1987) 7, 2745-2751). Las
células CHO transfectadas fueron cultivadas durante tres semanas en
el medio de selección \alphaMEM exento de nucleósido, que contenía
glutamina 1 mM, FCS dializado, al 10%, 100 U/ml de penicilina y 100
\mu/ml de estreptomicina.
Las células CHO obtenidas fueron seleccionadas
mediante el método de dilución limitante, obteniendo un clon único
de células CHO. El clon de las células CHO se amplificó con 20 nM -
200 nM de metotrexato investigando la línea 5E27 de células CHO que
produce el receptor soluble de IL-6 humana. La línea
5E27 de células CHO se cultivó en un medio de Dulbecco modificado
por Iscov (IMDM, fabricado por Gibco) suplementado con FBS al 5%.
Se recogió el sobrenadante del cultivo y se determinó por el método
ELISA, la concentración del receptor soluble de
IL-6 en el sobrenadante del cultivo. El resultado
confirmó la presencia de receptor soluble de IL-6 en
el sobrenadante del cultivo.
Ejemplo de referencia
2
Diez \mug de IL-6 de tipo
tisular (Hirano et al., Immunol. Lett. (1988) 17, 41) se
utilizaron con adyuvante completo de Freund para inmunizar ratones
BALB/c, y esto se repitió todas las semanas hasta que pudo
detectarse anticuerpo anti-IL-6 en
el suero. Se separaron células inmunes de los nódulos linfáticos
locales y se fusionaron con la línea celular de mieloma P3U1 usando
polietilenglicol 1500. Se seleccionaron hibridomas mediante el
método de Oi et al., (Selective Methods in Cellular
Immunology, W.H. Freeman y Co., San Francisco, 351, 19080) usando
el medio de cultivo HAT para establecer un hibridoma que produjera
un anticuerpo anti-IL-6 humana.
El hibridoma que produce el anticuerpo
anti-IL-6 humana se sometió a un
ensayo de unión de IL-6 del modo siguiente: una
placa de microtitulación de 96 pocillos (fabricada por Dynatech
Laboratories, Inc., Alexandria, VA) construida con polivinilo
flexible, se revistió durante la noche con 100 \mul de Ig de cabra
anti-ratón (10 \mul/ml, fabricada por Cooper
Biomedical Inc., Malvern, PA) en el seno de solución tampón de
hidrógeno carbonato-carbonato 0,1 M (pH 9,6), a
4ºC. Después se trató la placa con 100 \mul de PBS que contenía
albúmina de suero bovino (BSA) al 1%, a temperatura ambiente,
durante 2 horas.
Después de este tiempo se lavó con PBS, se
añadió a cada pocillo 100 \mul del sobrenadante del cultivo del
hibridoma y se incubó durante la noche a 4ºC. Después de lavar la
placa se añadió a cada pocillo IL-6 de tipo
recombinante marcada con ^{125}I, a 2000 cpm/0,5 ng/pocillo, y
después de lavar se midió la radiactividad de cada pocillo mediante
un contador gamma (Beckman Gamma 9000, Beckman Instruments,
Fullerton, CA). De 216 clones del hibridoma, 32 clones del
hibridoma eran positivos en el ensayo de unión de
IL-6. De entre estos clones se seleccionó
finalmente el MH166.BSF2, un clon estable. El anticuerpo MH166,
anti-IL-6, tiene un subtipo de IgG1
de tipo \kappa.
Luego, usando un clon MH60.BSF2 de hibridoma de
ratón dependiente de IL-6, se investigó la actividad
de neutralización con respecto al crecimiento del hibridoma por el
anticuerpo MH166. Células MH60.BSF2 fueron distribuidas en partes
alícuotas a 1 x 10^{4}/200 \mul/pocillo, a las que se añadió una
muestra que contenía el anticuerpo MH166, y se cultivó durante 48
horas. Después de añadir 0,5 \muCi/pocillo de
^{3}H-timidina (New England Nuclear, Boston, MA),
se continuó cultivando durante otras seis horas. Las células fueron
colocadas sobre un papel de filtro de fibra de vidrio, y fueron
tratadas mediante un cosechador automatizado (Labo Mash Science
Co., Tokio, Japón). Como testigo se uso anticuerpo de conejo
anti-IL-6.
Como resultado, el anticuerpo MH166 inhibió la
incorporación de ^{3}H-timidina por las células
MH60-BSF2 inducida por IL-6, de un
modo dependiente de la dosis. Esto reveló que el anticuerpo MH166
neutraliza la actividad de la IL-6.
Ejemplo de referencia
3
El anticuerpo MT-18
anti-receptor de IL-6, preparado
mediante el método de Hirata et al. (Hirata, Y. et
al., J. Immunol. (1989) 143, 2900-2906), se
conjugó a Sepharose 4B (fabricada por Pharmacia Fine Chemicals,
Piscataway, NJ) activada con CNBr, para purificar el receptor de
IL-6 (Yamasaki et al., Sciene (1988) 241,
825-828). Una línea celular de mieloma humano,
U266, fue solubilizada con hidrocloruro de fluoruro de
para-aminofenilmetanosulfonilo 1 mM (compuesto
preparado por Wako Pure Chemicals) (tampón de digitonina) que
contenía digitonina al 1% (fabricado por Wako Pure Chemicals),
trietanolamina 10 mM (pH 7,8) y NaCl 0,15 M, y se mezcló con
anticuerpo MT18 conjugado a bolas de Sepharose 4B. Seguidamente,
las bolas fueron lavadas seis veces con el tampón de digitonina
para preparar un receptor de IL-6 parcialmente
purificado.
Ratones BALB/c fueron inmunizados con el
receptor de IL-6 parcialmente purificado anterior,
obtenido a partir de 3 x 10^{6} células U266, cuatro veces, cada
diez días, y luego se preparó un hibridoma según un método
estándar. El sobrenadante del cultivo del hibridoma procedente de
pocillos con crecimiento positivo, fue examinado para determinar la
actividad de unión al receptor del modo siguiente: 5 x 10^{7}
células U266 fueron marcadas con ^{35}S-metionina
(2,5 mCi), y se solubilizaron con el tampón de digitonina anterior.
Las células U266 solubilizadas fueron mezcladas con 0,04 ml del
anticuerpo MT18 conjugado a bolas de Sepharose 4B, y luego se
lavaron seis veces con el tampón de digitonina. Usando 0,25 ml del
tampón de digitonina (pH 3,4), se eluyó el receptor de
IL-6 marcado con ^{35}S-metionina,
y se neutralizó con 0,025 ml de Tris 1M, pH 7,4.
0,05 ml del sobrenadante del cultivo del
hibridoma se mezclaron con 0,01 ml de Protein G Sepharose (fabricada
por Pharmacia). Después de lavar, la Sepharose se incubó con 0,005
ml de solución de receptor de lL-6 marcado con
^{35}S. Las sustancias inmunoprecipitadas fueron analizadas
mediante SDS-PAGE para estudiar el sobrenadante del
cultivo del hibridoma que reacciona con el receptor de
lL-6. Como resultado se estableció el clon
PM-1 del hibridoma de reacción positiva. El
anticuerpo producido a partir del hibridoma PM-1
tenía el subtipo IgG1 \kappa.
La actividad del anticuerpo producido por el
hibridoma PM-1 para inhibir la unión de
IL-6 al receptor de IL-6, se evaluó
usando la línea celular de mieloma humano U266. Se preparó
IL-6 recombinante humana a partir de E. coli
(Hirano et al., Immunol. Lett. (1988) 17,
41-45), y se marcó con ^{125}I usando el reactivo
de Bolton-Hunter (New England Nuclear, Boston, MA)
(Taga et al., J. Exp. Med. (1987) 166,
967-981).
4 x 10^{5} células U266 fueron cultivadas con
un sobrenadante de cultivo de 70% (v/v) de hibridoma
PM-1 y 14000 CPM de IL-6 marcada
con ^{125}I, durante una hora. Setenta microlitros de una muestra
fueron depositados en forma de capa sobre 300 \mul de FCS en un
tubo de polietileno micrófugo, de 400 \mul, se centrifugó y
después se midió la radiactividad de las células.
El resultado reveló que el anticuerpo producido
por el hibridoma PM-1 inhibe la unión de
IL-6 al receptor de IL-6.
Ejemplo de referencia
4
Se preparó un anticuerpo monoclonal contra el
receptor de IL-6 del ratón, mediante el método de
Saito, T. et al., J. Immunol. (1991) 147,
168-173.
Células CHO que producen el receptor soluble de
IL-6 del ratón, fueron cultivadas en el medio de
cultivo IMDM suplementado con FCS al 10%. Partiendo del
sobrenadante del cultivo, el receptor soluble de
IL-6 del ratón fue purificado usando una columna de
afinidad en la que el anticuerpo RS12 anti-receptor
de IL-6 del ratón (véase la referencia anterior de
Saito, Y. et al.) estaba inmovilizado en el gel Affigel 10
(fabricado por Biorad).
Cincuenta \mug de receptor soluble de
IL-6 del ratón así obtenido, se mezclaron con
adyuvante completo de Freund, y se inyectó por vía intraperitoneal
en el abdomen de ratas Wistar. Dos semanas más tarde, las ratas
recibieron una inmunización de refuerzo con adyuvante incompleto de
Freund. El día 45, se extrajeron de las ratas células esplénicas,
y 2 x 10^{8} células de éstas fueron sometidas a fusión celular
con 1 x 10^{7} células P3U1 de mieloma del ratón, con PEG 1500
(fabricado por Boehringer Mannheim) al 50% usando un método
estándar, y los hibridomas fueron seleccionados luego con el medio
HAT.
Después de añadir el sobrenadante del cultivo a
una placa revestida con anticuerpo de conejo
anti-IgG de rata (fabricado por Cappel), se hizo
reaccionar con ella receptor soluble de IL-6 del
ratón. Luego, utilizando el método ELISA empleando anticuerpo de
conejo anti-receptor del IL-6 del
ratón e IgG de oveja anti-conejo marcada con
fosfatasa, se seleccionaron hibridomas que producen anticuerpos
contra el receptor soluble de IL-6 del ratón. Los
clones de los hibridomas para los que la producción de anticuerpos
fue confirmada, se sometieron dos veces a una subselección,
obteniendo un único clon del hibridoma. Este clon fue designado
MR16-1.
Se examinó la actividad de neutralización de la
transducción de señal de la IL-6 del ratón mediante
el anticuerpo producido por este hibridoma, usando incorporación de
^{3}H-timidina, que emplea células MH60.BSF2
(Matsuda, T. et al., J. Immunol. (1988) 18,
951-956). A una placa de 96 pocillos se añadieron
células MH60.BSF2 a 1 x 10^{4} células/200 \mul/pocillo. A
esta placa se añadieron 10 pg/ml de IL-6 del ratón y
anticuerpo MR16-1 o anticuerpo RS12 a
12,3-1000 ng/ml, y se cultivó a 37ºC en CO_{2} al
5% durante 44 horas, seguido de la adición de 1 \muCi/pocillo de
^{3}H-timidina. Cuatro horas más tarde se midió la
incorporación de ^{3}H-timidina. Como resultado,
el anticuerpo MR16-1 inhibía la incorporación de
^{3}H-timidina por las células MH60.BSF2.
Por tanto, se reveló que el anticuerpo producido
por el hibridoma MR16-1 inhibe la unión de
IL-6 al receptor de IL-6.
La presente invención ha indicado que
anticuerpos anti-receptor de IL-6
poseen un efecto terapéutico sobre la psoriasis. Así pues, se
reveló que los antagonistas de la IL-6 son eficaces
como agentes terapéuticos para la psoriasis, etc.
Referencia a microorganismos depositados bajo la
Regla 13-2
Autoridad depositaria internacional
- Nombre:
- Instituto Nacional de Ciencia Industrial y Tecnología. Depósito Internacional de Organismos de Patentes
- Dirección:
- Central 6, 1-1-1 Higashi. Tsukuba City, Ibaraki Pref., 305-5466 Japón
\vskip1.000000\baselineskip
Fecha del depósito y número de depósito:
- (1)
- Nombre del organismo depositado: HB101-pIBIBSF2R
- Fecha de depósito: 9 de Enero de 1989
- Número de registro: FERM BP-2232
- (2)
- Nombre del organismo depositado: PM1
- Fecha de depósito: 12 de Julio de 1989
- Número de registro: FERM BP-2998
- (3)
- Nombre del organismo depositado: hibridoma de rata-ratón MR16-1
- Fecha de depósito: 13 de Marzo de 1997
- Número de registro: FERM BP-5875.
Claims (9)
1. Uso de un anticuerpo
anti-receptor de interleuquina-6
(IL-6) que puede bloquear la unión de
IL-6 al receptor de IL-6, para la
fabricación de un medicamento para el tratamiento de la
psoriasis.
2. El uso según la reivindicación 1, en el que
el anticuerpo contra el receptor de IL-6 es un
anticuerpo monoclonal contra el receptor de
IL-6.
3. El uso según la reivindicación 2, en el que
el anticuerpo contra el receptor de IL-6 es un
anticuerpo monoclonal contra el receptor de IL-6
humana.
4. El uso según la reivindicación 2, en el que
el anticuerpo contra el receptor de IL-6 es un
anticuerpo monoclonal contra el receptor de IL-6 del
ratón.
5. El uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que el anticuerpo contra el receptor
de IL-6 es un anticuerpo recombinante.
6. El uso según la reivindicación 1, en el que
anticuerpo monoclonal contra el receptor de IL-6
humana es el anticuerpo PM-1.
7. El uso según la reivindicación 4, en el que
el anticuerpo monoclonal contra el receptor de IL-6
del ratón es el anticuerpo MR16-1.
8. El uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que el anticuerpo contra el receptor
de IL-6 es un anticuerpo quimérico o un anticuerpo
humanizado contra el receptor de IL-6.
9. El uso según la reivindicación 8, en el que
el anticuerpo humanizado contra el receptor de IL-6
es un anticuerpo PM-1 humanizado.
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