ES2847891T3 - Anticuerpos anti-IL-6 para el tratamiento de la mucositis oral - Google Patents

Anticuerpos anti-IL-6 para el tratamiento de la mucositis oral

Info

Publication number
ES2847891T3
ES2847891T3 ES11843309T ES11843309T ES2847891T3 ES 2847891 T3 ES2847891 T3 ES 2847891T3 ES 11843309 T ES11843309 T ES 11843309T ES 11843309 T ES11843309 T ES 11843309T ES 2847891 T3 ES2847891 T3 ES 2847891T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
antibody
seq
sequence
polypeptide
mucositis
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES11843309T
Other languages
English (en)
Inventor
Jeffrey T L Smith
Leon R Garcia-Martinez
Andrew L Feldhaus
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Vitaeris Inc
Original Assignee
Vitaeris Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Vitaeris Inc filed Critical Vitaeris Inc
Application granted granted Critical
Publication of ES2847891T3 publication Critical patent/ES2847891T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • C07K16/248—IL-6
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/445—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine
    • A61K31/4523—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine containing further heterocyclic ring systems
    • A61K31/454—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine containing further heterocyclic ring systems containing a five-membered ring with nitrogen as a ring hetero atom, e.g. pimozide, domperidone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/204—IL-6
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/08—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for nausea, cinetosis or vertigo; Antiemetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/12—Antidiarrhoeals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)

Abstract

Una composición para uso en el tratamiento o prevención de la mucositis asociada con la radioterapia, que comprende una cantidad eficaz de un anticuerpo antagonista de IL-6, en el que dicho anticuerpo anti-IL-6 comprende la secuencia ligera variable humanizada de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID. NO: 709 y la secuencia pesada variable humanizada de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 657.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos anti-IL-6 para el tratamiento de la mucositis oral
Campo de la invención
Los antagonistas de IL-6, incluidos los anticuerpos anti-IL-6 y los fragmentos de anticuerpo de los mismos, se pueden usar para reducir la proteína C reactiva ("niveles de CRP") y la inflamación y en procedimientos y composiciones para el tratamiento y prevención de la mucositis, incluyendo la mucositis oral, alimentaria y del tracto gastrointestinal.
Antecedentes de la invención
Interleucina-6 (IL-6)
La interleucina-6 ("IL-6") es una citocina multifuncional involucrada en numerosos procesos biológicos tales como la regulación de la respuesta inflamatoria aguda, la modulación de respuestas inmunes específicas que incluyen la diferenciación de células B y T, el metabolismo óseo, la trombopoyesis, la proliferación epidérmica, la menstruación, la diferenciación de células neuronales, la neuroprotección, el envejecimiento, el cáncer y la reacción inflamatoria que ocurre en la enfermedad de Alzheimer. Véase Papassotiropoulos, et al., (2001) Neurobiology of Aging 22: 863-871.
IL-6 es un miembro de una familia de citocinas que promueven las respuestas celulares a través de un complejo receptor que consta de al menos una subunidad de la glicoproteína transductora de señales gp130 y el receptor de IL-6 ("IL-6R") (también conocido como gp80). El IL-6R también puede estar presente en forma soluble ("sIL-6R"). IL-6 se une a IL-6R, que luego dimeriza al receptor transductor de señales gp130. Véase Jones (2005) Immunology 175: 3463-3468.
La IL-6 es una citocina proinflamatoria pleiotrópica, que regula la respuesta de fase aguda y la transición de la respuesta inmune innata a la adaptativa. IL-6 aumenta la síntesis hepática de proteínas que participan en la "respuesta de fase aguda" que conduce a síntomas tales como fiebre, escalofríos y fatiga. Estimula la diferenciación de las células B y la secreción de anticuerpos y previene la apoptosis de las células B activadas. IL-6 activa e induce la proliferación de células T y, en presencia de IL-2, induce la diferenciación de células T CD8 maduras e inmaduras en células T citotóxicas. iL-6 también participa en la diferenciación de las células Th17 y la producción de IL-17 e inhibe la diferenciación de las células T reguladoras (Treg). IL-6 también activa osteoclastos, sinoviocitos, neutrófilos y otras células hematopoyéticas. Park, et al., (2007) Bulletin of the NYU Hospital for Joint Diseases 65 (Supl. 1): S4-10; Guerne, et al. (1989) J Clin Invest. 83(2): 585-92; Houssiau, et al., (1988) Arthritis Rheum. 31(6): 784-8; Nishimotor, et al. (2006) Nat Clin Pract Rheumatol. 2(11): 619-26; Kishimoto (1989) Blood 74(1): 1-10; y Van Snick (1990) Annu Rev Immunol. 8: 253-78.
En los seres humanos, el gen que codifica IL-6 está organizado en cinco exones y cuatro intrones, y se asigna al brazo corto del cromosoma 7 en 7p21. La traducción del ARN de IL-6 y el procesamiento postraduccional dan como resultado la formación de una proteína de 21 a 28 kDa con 184 aminoácidos en su forma madura. Véase Papassotiropoulos, et al. (2001) Neurobiology of Aging 22: 863-871.
La función de IL-6 no está restringida a la respuesta inmune ya que actúa en la hematopoyesis, trombopoyesis, formación de osteoclastos, provocación de la respuesta de fase aguda hepática que da como resultado la elevación de la proteína C reactiva (CRP) y la proteína amiloide A en suero (SAA). Se sabe que es un factor de crecimiento para queratinocitos epidérmicos, células mesangiales renales, células de mieloma y plasmacitoma. Grossman et al., (1989) Prot Natl Acad Sci. 86 (16): 6367-6371; Horii et al., (1989) J. Immunol. 143 (12): 3949-3955; y Kawano, et al. (1988) Nature 332: 83-85. IL-6 es producida por una amplia gama de tipos de células que incluyen monocitos/macrófagos, fibroblastos, queratinocitos epidérmicos, células endoteliales vasculares, células mesangiales renales, células gliales, condrocitos, células T y B y algunas células tumorales. Akira et al., (1990) FASEB J. 4 (11): 2860-2867. A excepción de las células tumorales que producen IL-6 de manera constitutiva, las células normales no expresan IL-6 a menos que se estimulen de manera apropiada.
Se han observado niveles elevados de IL-6 en muchos tipos de cáncer, incluyendo cáncer de mama, leucemia, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de páncreas, linfoma, cáncer de pulmón, carcinoma de células renales, cáncer colorrectal y mieloma múltiple. Véase, por ejemplo, Chopra, et al. (2004) MJAFI 60:45-49; Songur, et al. (2004) Tumori 90:196-200; Blay, et al. (1992) Cancer Research 52: 3317-3322; Nikiteas, et al. (2005) World J. Gasterenterol. 11:1639-1643; revisado en Heikkila, et al., (2008) Eur J Cancer 44:937-945. Los estudios clínicos (revisados en Trikha, et al. (2003) Clinical Cancer Research 9: 4653-4665) han mostrado alguna mejora en los resultados de los pacientes debido a la administración de varios anticuerpos anti-IL-6, particularmente en aquellos cánceres en los que IL-6 juega un papel directo en la promoción de la proliferación o supervivencia de las células cancerosas.
Como se indicó anteriormente, IL-6 estimula la respuesta de fase aguda hepática, lo que da como resultado un aumento de la producción de CRP y niveles elevados de CRP en suero. Por esta razón, se ha informado que la proteína C reactiva (CRP) comprende un marcador sustituto de la actividad de IL-6. Por lo tanto, se puede detectar una actividad elevada de IL-6 mediante la medición de la CRP en suero. Por el contrario, la supresión eficaz de la actividad de IL-6, por ejemplo, mediante la administración de un anticuerpo anti-IL-6 neutralizante, puede detectarse mediante la disminución resultante de los niveles de CRP en suero.
Se cree que la IL-6 juega un papel en el desarrollo de una multitud de enfermedades y trastornos, que incluyen, pero sin limitarse a fatiga, caquexia, enfermedades autoinmunes, enfermedades del sistema esquelético, cáncer, enfermedades cardíacas, obesidad, diabetes, asma, enfermedad de Alzheimer y esclerosis múltiple. Véase, por ejemplo, los documentos WO 2011/066374, WO 2011/066371, WO 2011/066378 y WO 2011/066369.
Un ensayo clínico reciente demostró que la administración de rosuvastatina a individuos aparentemente sanos que tenían CRP elevada (mayor a 2,0 mg/l) redujo sus niveles de CRP en un 37% y disminuyó en gran medida la incidencia de infarto de miocardio, accidente cerebrovascular, revascularización arterial, hospitalización por angina inestable o muerte por causas cardiovasculares. Ridker et al., N Engl J Med. 9 de noviembre de 2008 [Publicación electrónica ya disponible].
Además de su papel directo en la patogénesis de algunos cánceres y otras enfermedades, los niveles de IL-6 crónicamente elevados parecen afectar adversamente el bienestar y la calidad de vida del paciente. Por ejemplo, se ha informado que los niveles elevados de IL-6 están asociados con caquexia y fiebre, y una albúmina en suero reducida. Gauldie, et al. (1987) PNAS 84: 7251-7253; Heinric, et al. (1990) Biochem J. 265(3): 621-636; Zamir, et al. (1993) Metabolism 42: 204-208; Zamir, et al. (1992) Arch Surg 127: 170-174. Se ha informado que la inhibición de IL-6 por un anticuerpo neutralizante mejora la fiebre y la caquexia en pacientes con cáncer, aunque no se ha informado de una mejora en el nivel de albúmina en suero de estos pacientes. Emille, et al. (1994) Blood 84: 2472-2479; Blay, et al. (1992) Cancer Research 52: 3317-3322; Bataille, et al. (1995) Blood 86: 685-691.
Mucositis
La mucositis es la inflamación y ulceración dolorosas de las membranas mucosas que recubren el tracto digestivo, normalmente como efecto adverso del tratamiento de quimioterapia y radioterapia para el cáncer. Ridge et al., "Head and Neck Tumors" en Pazdur R, Wagman LD, Camphausen KA, Hoskins WJ (Eds) Cancer Management: A Multidisciplinary Approach. [11 Ed.] (2008). La mucositis puede ocurrir en cualquier parte del tracto gastrointestinal (GI). La mucositis oral se caracteriza por inflamación y ulceración en la boca y es una complicación común y a menudo debilitante del tratamiento del cáncer. Sonis (2004) J Supportive Oncology 2(Supl. 3): 3-8.
La mucositis oral y gastrointestinal es una toxicidad de muchas formas de radioterapia y quimioterapia. Tiene un impacto significativo en la salud, la calidad de vida y los resultados económicos asociados con el tratamiento. También afecta indirectamente el éxito de la terapia antineoplásica al limitar la capacidad de los pacientes para tolerar un tratamiento tumoricida óptimo. La compleja patogenia de la mucositis solo se ha apreciado recientemente y refleja las interacciones dinámicas de todas las células y tipos de tejidos que componen el epitelio y la submucosa. La identificación de los eventos moleculares que conducen a la lesión de la mucosa inducida por el tratamiento ha proporcionado objetivos para intervenciones de base mecánica para prevenir y tratar la mucositis.
Históricamente, se pensaba que la mucositis surgía únicamente como consecuencia de una lesión epitelial. Se planteó la hipótesis de que la radiación o la quimioterapia se dirigían de forma no específica a las células del epitelio basal que proliferaban rápidamente, lo que provocaba la pérdida de la capacidad del tejido para renovarse. Se pensó que la atrofia, adelgazamiento y ulceración del epitelio de la mucosa que se asocia con la mucositis era una consecuencia de estos eventos. Además, se creía que el proceso se veía facilitado por el trauma y los microorganismos orales.
La mucositis inducida por radiación se reconoció típicamente como un proceso 'de afuera hacia adentro', en el que se producen rompimientos de la cadena de ADN en las células epiteliales basales orales. La mucositis inducida por quimioterapia se ha atribuido principalmente al daño de las células basales que se produce cuando los fármacos penetran en estas células desde el suministro de sangre submucosa. También se ha propuesto, pero no probado, un papel de los agentes quimioterapéuticos transmitidos por la saliva en la inducción de mucositis. La mucositis inducida por quimioterapia puede agravarse aún más por mielosupresión concomitante.
La mucositis inducida por radiación o quimioterapia se inicia por lesión directa de las células epiteliales basales y las células del tejido subyacente. Los rompimientos de la cadena de ADN pueden provocar la muerte o lesiones celulares. La lesión no relacionada con el ADN se inicia a través de una variedad de mecanismos, algunos de los cuales están mediados por la generación de especies reactivas de oxígeno. La radiación y la quimioterapia son activadores eficaces de varias vías productoras de lesiones en endotelios, fibroblastos y epitelios. En estas células, la activación de factores de transcripción como el factor nuclear KB (NF-kB) y NRF2 conduce a la sobrerregulación de genes que modulan la respuesta al daño. Las células inmunes (macrófagos) producen citocinas proinflamatorias, tales como el factor a de necrosis tumoral (TNF-a) y la interleucina 6, que provocan una mayor lesión tisular. Estas moléculas de señalización también participan en un circuito de retroalimentación positiva que amplifica los efectos originales de la radiación y la quimioterapia. Por ejemplo, TNF-a activa la actividad de NF-kB y la esfingomielinasa en la mucosa, lo que conduce a una mayor muerte celular. Además, el daño directo e indirecto a las células madre epiteliales resulta en una pérdida de la capacidad de renovación. Como resultado, el epitelio comienza a adelgazarse y los pacientes comienzan a experimentar los primeros síntomas de la mucositis.
La mucositis se observa durante el tratamiento quimioterapéutico o de radiación de muchos cánceres diferentes, incluyendo cáncer de cabeza y cuello, mieloma múltiple, cánceres colorrectales, debido a los problemas causados por la mucositis que pueden evitar más radiación o quimioterapia y también impedir la nutrición debido a las molestias causadas por mucositis durante la deglución y la digestión.
Los síntomas más comunes de mucositis incluyen enrojecimiento, sequedad o hinchazón de la boca, ardor o malestar al comer o beber, llagas abiertas en la boca y garganta, calambres abdominales y dolor a la palpación o enrojecimiento o úlceras rectales. Esencialmente, la mucositis involucra la inflamación del revestimiento de la boca y el tracto digestivo, y ocurre con frecuencia en pacientes con cáncer después de la quimioterapia y la radioterapia. Las mejillas, las encías, la placa blanda, la orofaringe, la parte superior y los lados de la lengua y el piso de la boca pueden verse afectados, así como el esófago y las áreas rectales. Junto con el enrojecimiento y la hinchazón, los pacientes suelen experimentar un dolor intenso y ardiente.
La mucositis oral y gastrointestinal (GI) puede afectar hasta al 100% de los pacientes sometidos a quimioterapia de dosis alta y trasplante de células madre hematopoyéticas (HSCT), al 80% de los pacientes con neoplasias malignas de la cabeza y el cuello que reciben radioterapia y a una amplia gama de pacientes que reciben quimioterapia. La mucositis del tracto digestivo aumenta la mortalidad y la morbilidad y contribuye al aumento de los costes sanitarios. Rubenstein, et al. (2004) Cancer 100 (Supl. 9): 2026-46.
Para la mayoría de los tratamientos contra el cáncer, alrededor del 5-15% de los pacientes padecen mucositis. Sin embargo, con 5-fluorouracilo (5-FU), hasta un 40% padece mucositis y un 10-15% padece mucositis oral de grado 3­ 4. El irinotecano se asocia con mucositis gastrointestinal grave en más del 20% de los pacientes. El 75-85% de los receptores de trasplante de médula ósea experimentan mucositis, de las cuales la mucositis oral es la más común y más debilitante, especialmente cuando se usa melfalán. En la mucositis oral de grado 3, el paciente no puede comer alimentos sólidos y en el grado 4, el paciente tampoco puede consumir líquidos. Rubenstein, et al. (2004) Cancer 100 (Supl. 9): 2026-46.
La radioterapia en la cabeza y el cuello o en la pelvis o el abdomen se asocia con mucositis oral o GI de Grado 3 y Grado 4, respectivamente, superando a menudo el 50% de los pacientes. Entre los pacientes que se someten a radioterapia de cabeza y cuello, el dolor y la disminución de la función oral pueden persistir mucho después de concluida la terapia. La dosis de radiación fraccionada aumenta el riesgo de mucositis a > 70% de los pacientes en la mayoría de los ensayos. La mucositis oral es particularmente profunda y prolongada entre los receptores de HSCT que reciben irradiación corporal total. Rubenstein, et al. (2004) Cancer 100 (Supl. 9): 2026-46.
Aunque existen factores que aumentan la probabilidad y la gravedad de la mucositis, no existe una manera fiable de predecir quién se verá afectado. La mucositis no solo es más común en pacientes de edad avanzada, sino que el grado de degradación suele ser más debilitante. La gravedad de la mucositis tiende a aumentar si un paciente ejerce una mala higiene bucal o tiene un estado nutricional comprometido. Una infección o irritación preexistente de la membrana mucosa también puede resultar en un caso más grave de mucositis.
Los tipos de fármacos utilizados para tratar el cáncer y el programa mediante el cual se administran pueden influir en el riesgo de desarrollar mucositis. La doxorrubicina y el metotrexato, por ejemplo, suelen causar mucositis. El agente de quimioterapia fluorouracilo no suele afectar gravemente a las membranas mucosas cuando se administra en pequeñas dosis en infusión intravenosa (IV) continua. Cuando se ajusta el programa de modo que se administre una dosis más alta durante un período de tiempo más corto (generalmente más de cinco días), el fluorouracilo puede causar casos de mucositis muy graves, dolorosos y que limitan la dosis. Los pacientes que se someten a tratamiento con quimioterapia en dosis altas y rescate de médula ósea a menudo desarrollan mucositis.
Además, la mucositis también tiende a desarrollarse en la radioterapia administrada en la cavidad oral, o en dosis que exceden los 180 cGy por día durante un período de cinco días. La terapia combinada, ya sea con múltiples agentes de quimioterapia o quimioterapia y radioterapia en la cavidad oral, puede aumentar la incidencia de mucositis.
Actualmente no existe una cura real para la mucositis, el tratamiento está dirigido a la prevención y el manejo de los síntomas. La mucositis generalmente se resuelve unas semanas después del tratamiento a medida que las células se regeneran y solo ocasionalmente se requiere suspender el tratamiento. En algunos casos, la terapia con medicamentos se modificará para administrar un agente menos tóxico.
Los pacientes con riesgo de mucositis deben ser meticulosos en su higiene bucal, cepillarse frecuentemente con un cepillo de dientes suave y usar hilo dental cuidadosamente con hilo dental sin cera. Si se desarrolla sangrado de las encías, los pacientes deben reemplazar sus cepillos de dientes con gasas o un hisopo suave Toothette. Las dentaduras postizas también deben limpiarse con regularidad. Los pacientes deben estar bien hidratados, beber líquidos con frecuencia y enjuagarse la boca varias veces al día. Deben evitarse los enjuagues bucales que contienen alcohol o peróxido de hidrógeno, ya que pueden resecar la boca y aumentar el dolor. Los labios también deben mantenerse húmedos. Debe evitarse la irritación física de la boca. Si el tiempo lo permite, los problemas dentales, como caries o dentaduras postizas mal ajustadas, deben resolverse con un dentista antes de comenzar el tratamiento del cáncer. Los pacientes generalmente se sienten más cómodos comiendo alimentos suaves a temperatura media. Los alimentos picantes, ácidos, muy calientes o muy fríos pueden irritar la mucosa. También deben evitarse el tabaco y el alcohol.
El personal del hospital y los propios pacientes deben inspeccionar la boca con frecuencia para buscar signos y síntomas de mucositis. Puede haber evidencia de mucositis (inflamación, membranas mucosas blancas o amarillas brillantes que se convierten en membranas rojas, en carne viva y dolorosas) tan pronto como cuatro días después de la administración de la quimioterapia. Los enjuagues bucales de bicarbonato de sodio a veces se utilizan para disminuir la cantidad de flora bucal y promover la comodidad, aunque no hay evidencia científica de que esto sea beneficioso. Por lo general, los pacientes se enjuagan cada pocas horas con una solución que contiene 1/2 cucharadita de sal y 1/2 cucharadita de bicarbonato de sodio en una taza de agua.
A menudo se requiere alivio del dolor en pacientes con mucositis. En algunos casos, el enjuague con una mezcla de Maalox, xilocaína y clorhidrato de difenhidramina alivia el dolor. Sin embargo, debido a los efectos adormecedores de la xilocaína, la sensación del gusto puede verse alterada. Peor aún, puede reducir el reflejo nauseoso natural del cuerpo, lo que posiblemente cause problemas para tragar. Los agentes de recubrimiento como el kaopectato y el gel de hidróxido de aluminio también pueden ayudar a aliviar los síntomas. El enjuague con bencidamina también se ha mostrado prometedor, no solo para controlar el dolor, sino también para prevenir el desarrollo de mucositis. El dolor más severo puede requerir Tylenol líquido con codeína o incluso medicamentos opioides intravenosos. Es posible que los pacientes con dolor intenso no puedan comer y también requieran suplementos nutricionales a través de una IV (vía intravenosa).
Un tratamiento llamado crioterapia se ha mostrado prometedor en pacientes que están siendo tratados con fluorouracilo administrado en el programa de dosis altas de cinco días antes mencionado. Los pacientes agitan continuamente trozos de hielo en la boca durante la infusión de treinta minutos del fármaco, lo que hace que los vasos sanguíneos se contraigan, reduciendo así la capacidad del fárma
Los enjuagues bucales de manzanilla y alopurinol se han probado en el pasado para tratar la mucositis, pero los estudios han encontrado que son ineficaces. Se están evaluando modificadores de la respuesta biológica para determinar su posible papel en el manejo de la mucositis. Los estudios recientes que utilizan pastillas antimicrobianas tópicas también han demostrado ser prometedores, pero se necesita más investigación.
Los pacientes con mieloma múltiple que reciben quimioterapia (dexametasona y melfalán) y trasplante autólogo de células madre (ASCT) a quienes se les administró además un anticuerpo anti-IL-6 (BE8) tuvieron niveles reducidos de CRP y una reducción significativa de la fiebre, así como aparición y gravedad reducidas de la mucositis. Rossi et al., (2005) Bone Marrow Transplantation 36: 771-779. Particularmente, la mucositis en los pacientes tratados fue de un grado de toxicidad menor que no requirió infusión de morfina en comparación con los pacientes que no recibieron el anticuerpo anti-IL-6. Además, los síntomas de la mucositis gastrointestinal, tales como la diarrea, se redujeron y la calidad de vida mejoró, como se evidencia por una mejor ingesta oral de nutrición y actividad diaria.
Por lo tanto, existe una gran necesidad en la técnica de procedimientos mejorados para tratar y prevenir la mucositis, tanto la mucositis oral como la gastrointestinal, ya que esta condición compromete la eficacia de los tratamientos de quimioterapia o radiación contra el cáncer y afecta negativamente la calidad de vida de pacientes con cáncer debido al dolor extremo y la incomodidad causada por esta condición. La invención descrita en el presente documento proporciona composiciones que comprenden anticuerpos anti-IL-6 y fragmentos de anticuerpos de los mismos, y procedimientos de uso que pueden usarse para tratar afecciones relacionadas con IL-6.
Rajesh V Lalla et al., (2006) Supportive Care in Cancer 14(6): 558-565 es un artículo de revisión que analiza el uso de agentes antiinflamatorios en el tratamiento de la mucositis. Describe que las citocinas proinflamatorias, incluida la IL-6, están elevadas en pacientes que padecen mucositis después de la radiación y/o la quimioterapia.
Sumario de la invención
La invención es como se define en las reivindicaciones.
La presente invención proporciona una composición para su uso en el tratamiento o prevención de la mucositis asociada con la radioterapia, que comprende una cantidad eficaz de un anticuerpo antagonista de IL-6, en el que dicho anticuerpo anti-IL-6 comprende la secuencia ligera variable humanizada de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 709 y la secuencia pesada variable humanizada de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 657.
En una realización, la mucositis puede ser mucositis oral, gastrointestinal o alimentaria asociada con radioterapia.
La presente invención proporciona composiciones para su uso de acuerdo con las reivindicaciones que comprenden anticuerpos monoclonales humanizados que se unen selectivamente a IL-6 y que son como se definen en las reivindicaciones.
Los anticuerpos anti-IL-6 (por ejemplo, anticuerpos ALD518, también conocidos como Ab1) de acuerdo con las reivindicaciones se usan en procedimientos para el tratamiento o prevención de la mucositis asociada con radioterapia. El anticuerpo anti-IL-6 o el fragmento de anticuerpo puede administrarse de forma profiláctica a pacientes con riesgo significativo de desarrollar mucositis.
Las composiciones para su uso en el tratamiento o la prevención de la mucositis asociada con la radioterapia comprenden una cantidad eficaz de un anticuerpo antagonista de IL-6 de acuerdo con las reivindicaciones. En otra realización, las composiciones para su uso en el tratamiento o la prevención de la mucositis oral asociada con la radioterapia pueden comprender una cantidad eficaz de un anticuerpo antagonista de IL-6 de acuerdo con las reivindicaciones. En otra realización, las composiciones para su uso en el tratamiento o la prevención de la mucositis del tracto digestivo asociada con la radioterapia pueden comprender una cantidad eficaz de un anticuerpo antagonista de IL-6 de acuerdo con las reivindicaciones. En otra realización, las composiciones para su uso en el tratamiento o la prevención de la mucositis del tracto gastrointestinal asociada con la radioterapia pueden comprender una cantidad eficaz de un anticuerpo antagonista de IL-6 de acuerdo con las reivindicaciones.
La invención proporciona una composición para su uso en el tratamiento o la prevención de la mucositis asociada con la radioterapia, que comprende una cantidad eficaz de un anticuerpo Ab1, o un fragmento de anticuerpo del mismo, de acuerdo con las reivindicaciones en las que el anticuerpo o fragmento de anticuerpo del mismo, se une específicamente a IL-6.
La invención proporciona una composición para su uso en el tratamiento o prevención de la mucositis oral asociada con radioterapia, que comprende una cantidad eficaz de un anticuerpo Ab1, o un fragmento de anticuerpo del mismo, de acuerdo con las reivindicaciones, en el que el anticuerpo o fragmento de anticuerpo del mismo, se une específicamente a IL-6.
La invención proporciona una composición para su uso en el tratamiento o prevención de la mucositis del tracto gastrointestinal asociada con la radioterapia, que comprende una cantidad eficaz de un anticuerpo Ab1, o un fragmento de anticuerpo del mismo, de acuerdo con las reivindicaciones, en el que el anticuerpo o fragmento de anticuerpo del mismo, se une específicamente a IL-6.
La invención proporciona una composición para su uso en el tratamiento o prevención de la mucositis del tracto digestivo asociada con radioterapia, que comprende una cantidad eficaz de un anticuerpo Ab1, o un fragmento de anticuerpo del mismo, de acuerdo con las reivindicaciones, en el que el anticuerpo o fragmento de anticuerpo del mismo, se une específicamente a IL-6.
El anticuerpo anti-IL6 para su uso de acuerdo con la invención comprende una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 709 y una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 657.
En una realización, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo del mismo se puede aislar. En una realización, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo del mismo puede humanizarse. En una realización, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo del mismo puede tener una semivida de al menos aproximadamente 30 días. De acuerdo con las reivindicaciones, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo del mismo comprende la secuencia ligera variable humanizada de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 709. De acuerdo con las reivindicaciones, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo del mismo comprende la secuencia pesada variable humanizada de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 657. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo del mismo comprende las CDR de cadena ligera como se expone en la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 4, 5 y 6. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo del mismo comprende las CDR de cadena pesada como se expone en la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 7, 120 y 9. En una realización adicional, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo del mismo puede ser un anticuerpo monoclonal anti-IL-6 humanizado, asialado con una semivida de -30 días que comprenden las secuencias ligeras y pesadas variables humanizadas como se expone en las SEQ ID NOs: 709 y 657.
Preferiblemente, estos anticuerpos estarán aglicosilados. En realizaciones más específicas de la invención, estos anticuerpos bloquearán la activación de gp130 y/o poseerán afinidades de unión (Kd) menores de 50 picomolar y/o valores de Asociación menores o iguales a 10'4 S-1.
En una realización, los fragmentos de unión incluyen, pero sin limitarse a, fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, Fv y scFv.
En una realización, los anticuerpos anti-IL-6 bloquean los efectos de IL-6. En otra realización, el anticuerpo anti-IL-6 es un anticuerpo monoclonal humanizado que se une a IL-6 humana libre y al complejo IL-6R/IL-6 soluble con una afinidad de al menos aproximadamente 4 pM. En otra realización, el anticuerpo anti-IL-6 tiene una semivida en suero de al menos 30 días. En otra realización, el anticuerpo anti-IL-6 se basa en una estructura kappa de IgG1 humana de consenso que tenía asparaginas modificadas con alanina para eliminar los sitios de N-glicosilación.
En otra realización, los anticuerpos y las versiones humanizadas pueden derivarse de células inmunes de conejo (linfocitos B) y pueden seleccionarse basándose en su homología (identidad de secuencia) con las secuencias de la línea germinal humana. Estos anticuerpos pueden requerir modificaciones de secuencia mínimas o nulas, lo que facilita la retención de propiedades funcionales después de la humanización. En ejemplos de realizaciones, los anticuerpos humanizados pueden comprender estructuras humanas que son altamente homólogas (poseen un alto nivel de identidad de secuencia) a las de un anticuerpo parental (por ejemplo, conejo).
Un anticuerpo anti-IL6 o fragmento de anticuerpo o variante del mismo puede unirse específicamente a los mismos epítopos lineales o conformacionales en un polipéptido IL-6 intacto o fragmento del mismo que puede incluir al menos fragmentos seleccionados entre los que abarcan los residuos de aminoácidos 37-51, residuos de aminoácidos 70-84, residuos de aminoácidos 169-183, residuos de aminoácidos 31-45 y/o residuos de aminoácidos 58-72.
De acuerdo con la presente invención, el anticuerpo anti-IL-6 para su uso de acuerdo con la invención comprende las secuencias variables de cadena pesada y ligera en la SEQ ID NO: 657 y la SEQ ID NO: 709.
En una realización preferida, el anticuerpo anti-IL-6 humanizado comprenderá las secuencias de cadena ligera variable y pesada variable expuestas respectivamente en la SEQ ID NO: 657 y la SEQ ID NO: 709, y preferiblemente que comprenda además regiones constantes de cadena pesada y ligera respectivamente expuestas en la SEQ ID NO: 588 y la SEQ ID NO: 586, y variantes de las mismas que comprenden al menos sustituciones o eliminaciones de aminoácidos que no afectan sustancialmente la unión de IL-6 y/o la función efectora deseada. Esta realización también contempla polinucleótidos que comprenden, o alternativamente consisten en, al menos uno de los ácidos nucleicos que codifican las secuencias de cadena pesada variable (SEQ ID NO: 700) y de cadena ligera variable (SEQ ID NO: 723) y las secuencias cadena pesada de región constante (SEQ ID NO: 589) y la cadena ligera de región constante (SEQ ID NO: 587).
En una realización de la invención, el anticuerpo anti-IL-6 o fragmento de anticuerpo o variante del mismo puede estar aglicosilado o sustancialmente aglicosilado, por ejemplo, como resultado de una o más modificaciones en la región Fc del anticuerpo.
En una realización de la invención, el anticuerpo anti-IL-6 o fragmento de anticuerpo o variante del mismo puede contener una región Fc que se ha modificado para alterar la función efectora, la semivida, la proteólisis y/o la glicosilación. Preferiblemente, la región Fc se modifica para eliminar la glicosilación.
En una realización de la invención, el anticuerpo anti-IL-6 o fragmento de anticuerpo o variante del mismo puede ser un anticuerpo humano, humanizado, monocatenario o quimérico.
En una realización de la invención, el anticuerpo anti-IL-6 o fragmento de anticuerpo o variante del mismo puede ser un anticuerpo humanizado derivado de un anticuerpo anti-IL-6 de conejo (parental).
En una realización de la invención, las regiones marco (FR) en la región ligera variable y las regiones pesadas variables de dicho anticuerpo anti-IL-6 o fragmento de anticuerpo o variante del mismo, respectivamente, pueden ser FR humanas que no están modificadas o que se han modificado mediante la sustitución de como máximo 2 o 3 residuos de FR humana en la región de cadena ligera o pesada variable con los correspondientes residuos de FR del anticuerpo de conejo parental, y las FR humanas pueden haberse derivado de secuencias de anticuerpos de cadena ligera y pesada variable humana que se han seleccionado de una biblioteca de secuencias de anticuerpos de la línea germinal humana con base en su alto nivel de homología con las correspondientes regiones de cadena ligera o pesada variable de conejo en relación con otras secuencias de anticuerpos de la línea germinal humana contenidas en la biblioteca. Como se divulga en detalle más adelante en una realización preferida, el anticuerpo comprenderá FR humanas que se seleccionan con base en su alto nivel de homología (grado de identidad de secuencia) con el del anticuerpo parental que está humanizado.
Las secuencias variables pesada y ligera comprenden aquellas en las SEQ ID NOs: 657 y 709.
En una realización de la invención, al menos uno de dichos residuos FR puede sustituirse con un aminoácido presente en el sitio correspondiente en un anticuerpo anti-IL-6 parental de conejo a partir del cual se han derivado las regiones determinantes de complementariedad (CDR) contenidas en dichos polipéptidos VH o VL o mediante una sustitución conservadora de aminoácidos.
En una realización de la invención, dicho anticuerpo anti-IL-6, o fragmento de anticuerpo o variante del mismo, puede ser humanizado. En una realización de la invención, dicho anticuerpo anti-IL-6, o fragmento de anticuerpo o variante del mismo, puede ser quimérico.
En una realización de la invención, dicho anticuerpo anti-IL-6, o fragmento de anticuerpo o variante del mismo, puede comprender además una región Fc humana, por ejemplo, una región Fc que comprende las regiones constantes de cadena pesada y ligera variables expuestas en las SEQ ID NOs: 704 y 702.
En una realización de la invención, dicha Fc humana puede derivarse de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgG5, IgG6, IgG7, IgG8, IgG9, IgG10, IgG11, IgG12, IgG13, IgG14, IgG15, IgG16, IgG17, IgG18 o IgG19.
En una realización de la invención, el anticuerpo anti-IL-6 o fragmento de anticuerpo o variante del mismo puede tener una semivida de eliminación de al menos aproximadamente 30 días.
En una realización, el anticuerpo, o fragmento de anticuerpo del mismo, puede inhibir al menos una actividad asociada con IL-6. En otra realización, al menos una actividad asociada con IL-6 puede ser una actividad in vitro que comprende la estimulación de la proliferación de células T1165; la unión de IL-6 a IL-6R; la activación (dimerización) de la glicoproteína transductora de señales gp130; la formación de multímeros IL-6/IL-6R/gp130; la estimulación de la producción de haptoglobina por células HepG2 modificadas para expresar al receptor de IL-6 humano; o cualquier combinación de los mismos. En una realización, antes de la administración del anticuerpo, o fragmento de anticuerpo del mismo, el sujeto puede haber exhibido o puede estar en riesgo de desarrollar al menos uno de los siguientes síntomas: proteína C reactiva ("CRP") elevada en suero; velocidad elevada de sedimentación de eritrocitos; o una combinación de los mismos.
En una realización, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo del mismo puede comprender un Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv, IgNAR o SMIP. En una realización, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo del mismo puede tener una semivida in vivo de al menos aproximadamente 30 días en un sujeto humano sano. En una realización, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo del mismo puede tener una afinidad de unión (Kd) para IL-6 de menos de aproximadamente 50 picomolar, o una tasa de disociación (Kdisociación) de IL-6 menor o igual a 10'4 S-1. En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo del mismo puede unirse específicamente al mismo (s) epítopo o epítopos lineales o conformacional y/o compite por unirse al mismo epítopo o epítopos lineales o conformacionales en un polipéptido IL-6 humano intacto o fragmento del mismo como un anticuerpo anti-IL-6 que comprende los polipéptidos de la SEQ ID NO: 702 y la SEQ ID NO: 704 o los polipéptidos de la s Eq ID NO: 2 y la SEQ ID NO: 3. En un aspecto de la divulgación, la unión al mismo epítopo o epítopos lineales o conformacionales y/o competición por la unión al mismo epítopo o epítopos lineales o conformacionales en un polipéptido IL-6 humano intacto o fragmento del mismo se comprueba mediante mapeo epitópico usando fragmentos de péptidos lineales superpuestos que abarcan la longitud completa del polipéptido IL-6 humano nativo e incluye al menos un residuo comprendido en los fragmentos de IL-6 seleccionados entre aquellos que abarcan respectivamente los residuos de aminoácidos 37-51, los residuos de aminoácidos 70-84, los residuos de aminoácidos 169-183, los residuos de aminoácidos 31-45 y/o los residuos de aminoácidos 58-72 de la SEQ ID NO: 1.
En una realización, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo del mismo puede estar aglicosilado. En una realización, el anticuerpo, o fragmento de anticuerpo del mismo, puede contener una región Fc que se ha modificado para alterar la función efectora, la semivida, la proteólisis y/o la glicosilación. En una realización, el anticuerpo, o fragmento de anticuerpo del mismo, puede ser un anticuerpo humano, humanizado, monocatenario o quimérico. En una realización, el anticuerpo, o fragmento de anticuerpo del mismo, puede comprender un Fab, Fab', F(ab')2, Fv o scFv. En una realización, el anticuerpo, o fragmento de anticuerpo del mismo, puede comprender además un Fc humano. En otra realización, el Fc puede derivarse de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgG5, IgG6, IgG7, IgG8, IgG9, IgG10, IgG11, IgG12, IgG13, IgG14, IgG15, IgG16, IgG17, IgG18 o IgG19.
En una realización, la composición para su uso de acuerdo con las reivindicaciones puede comprender al menos aproximadamente 25, 80, 100, 160, 200 o 320 mg. En una realización, la cantidad eficaz puede estar entre aproximadamente 0,1 y 100 mg/kg de peso corporal del sujeto. En una realización, al sujeto se le puede administrar al menos 1, 2, 3, 4 o 5 dosis. En una realización, la composición se puede administrar cada 4 semanas. En una realización, al sujeto se le pueden administrar 25 mg cada 4 semanas. En una realización, al sujeto se le pueden administrar 80 mg cada 4 semanas. En una realización, al sujeto se le pueden administrar 100 mg cada 4 semanas. En una realización, al sujeto se le pueden administrar 160 mg cada 4 semanas. En una realización, al sujeto se le pueden administrar 200 mg cada 4 semanas. En una realización, al sujeto se le pueden administrar 320 mg cada 4 semanas. En otra realización, la composición se puede administrar cada 4 semanas durante al menos 16 semanas. En otra realización, la composición puede administrarse cada 4 semanas durante al menos 24 semanas.
En esta realización, los anticuerpos anti-IL-6, o fragmentos de anticuerpos de los mismos, pueden administrarse en dosis efectivas para disminuir la inflamación, el dolor y la pérdida de movilidad experimentada por la mucositis, por ejemplo, dosis que oscilan entre aproximadamente 25-500 mg, más preferiblemente al menos aproximadamente dosis de 25, 80, 100, 120, 160, 200, 240 o 320 mg.
El anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una secuencia ligera variable humanizada de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 709.
El anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una secuencia pesada variable humanizada de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 657.
El anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende las CDR de cadena ligera como se expone en la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 4, 5 y 6.
El anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende las CDR de cadena pesada como se expone en la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 7, 120 y 9.
En una realización, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal anti-IL-6 humanizado, asialado con una semivida de -30 días que comprende las secuencias ligera y pesada variables humanizadas como se expone en las SEQ ID NOs: 709 y 657.
En una realización, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede expresarse a partir de una célula recombinante. En otra realización, la célula puede ser una célula de mamífero, levadura, bacteriana y de insecto. En otra realización, la célula puede ser una célula de levadura. En otra realización, la célula puede ser una célula de levadura diploidal. En otra realización, la célula de levadura puede ser una levadura de Pichia. En una realización, el anticuerpo se puede asialar. En una realización, el anticuerpo puede humanizarse.
En una realización, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo del mismo puede comprender un Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv, IgNAR o SMIP.
En una realización, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo del mismo puede tener una semivida in vivo de al menos aproximadamente 30 días.
En una realización, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo del mismo puede tener una afinidad de unión (Kd) por IL-6 de menos de aproximadamente 50 picomolar, o una tasa de disociación (Kd¡soc¡ac¡ón) de IL-6 menor o igual a 10'4 S-1.
En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo del mismo puede unirse específicamente al mismo epítopo o epítopos lineales o conformacionales y/o compite por unirse al mismo epítopo o epítopos lineales o conformacionales en un polipéptido IL-6 humano intacto o fragmento del mismo como un anticuerpo anti-IL-6 que comprende los polipéptidos de la SEQ ID NO: 702 y la SEQ ID NO: 704 o los polipéptidos de la SEQ ID NO: 2 y la SEQ ID NO: 3.
En un aspecto, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo del mismo que se une al mismo epítopo o epítopos lineales o conformacionales y/o compite por unirse al mismo epítopo o epítopos lineales o conformacionales en un polipéptido IL-6 humano intacto o fragmento del mismo se comprueba mediante mapeo epitópico utilizando fragmentos de péptidos lineales superpuestos que abarcan la longitud completa del polipéptido IL-6 humano nativo e incluye al menos residuos comprendidos en fragmentos de IL-6 seleccionados entre los que abarcan respectivamente los residuos de aminoácidos 37-51, los residuos de aminoácidos 70-84, residuos de aminoácidos 169-183, residuos de aminoácidos 31-45 y/o residuos de aminoácidos 58-72 de la SEQ ID NO: 1.
En una realización, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo del mismo puede estar aglicosilado. En una realización, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo del mismo puede comprender una región Fc que se ha modificado para alterar la función efectora, la semivida, la proteólisis y/o la glicosilación. En una realización, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo del mismo puede ser un anticuerpo humano, humanizado, monocatenario o quimérico. En una realización, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo del mismo puede comprender además una Fc humana, preferiblemente en la que dicho Fc humana se deriva de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgG5, IgG6, IgG7, IgG8, IgG9, IgG10, IgG11, IgG12, IgG13, IgG14, IgG15, IgG16, IgG17, IgG18 o IgG19.
En una realización, el paciente puede tener una proteína C reactiva ("CRP") elevada. En una realización, el paciente puede tener un nivel elevado en suero de IL-6. En una realización, el paciente puede tener un nivel elevado de IL-6 en las articulaciones.
En una realización, el anticuerpo antagonista de IL-6 puede inhibir al menos una actividad asociada con IL-6. En otra realización, al menos una actividad asociada con IL-6 es una actividad in vitro que comprende la estimulación de la proliferación de células T1165; la unión de IL-6 a IL-6R; la activación (dimerización) de la glicoproteína transductora de señales gp130; la formación de multímeros IL-6/IL-6R/gp130; la estimulación de la producción de haptoglobina por células HepG2 modificadas para expresar al receptor de IL-6 humano; o cualquier combinación de los mismos.
En otra realización, antes de la administración del anticuerpo antagonista de IL-6, el sujeto a tratar ha presentado o tiene riesgo de desarrollar al menos uno de los siguientes síntomas: disminución de la albúmina en suero; proteína C reactiva ("CRP") elevada en suero; velocidad elevada de sedimentación de eritrocitos; fatiga; fiebre; anorexia (pérdida del apetito); pérdida de peso; caquexia; debilidad; disminución de la puntuación pronóstica de Glasgow ("GPS"); dímero D elevado en suero; perfil de coagulación anormal; y cualquier combinación de los mismos.
De acuerdo con la invención, la mucositis es un efecto secundario de radioterapia administrada al sujeto antes, concurrente o después de la administración del anticuerpo o fragmento de anticuerpo. En otra realización, el procedimiento puede comprender además monitorizar al sujeto para evaluar dicho síntoma después de la administración del anticuerpo. En otra realización, el síntoma puede presentarse antes de la administración de dicho anticuerpo antagonista de IL-6. En otra realización, el síntoma se puede mejorar o restaurar a una condición normal dentro de aproximadamente 1-5 semanas de la administración de dicho anticuerpo antagonista de IL-6. En otra realización, el síntoma puede permanecer mejorado posteriormente durante un período completo entre dos administraciones consecutivas de dicho anticuerpo antagonista de IL-6. En otra realización, el paciente tratado puede tener al menos un síntoma de mucositis oral, digestiva o del tracto gastrointestinal.
En otra realización, el paciente tratado puede tener cáncer o está siendo tratado por cáncer. En una realización, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en acantoma, carcinoma de células acínicas, neuroma acústico, melanoma lentiginoso acral, acrospiroma, leucemia eosinofílica aguda, leucemia linfoblástica aguda, leucemia megacarioblástica aguda, leucemia monocítica aguda, leucemia mieloblástica aguda con maduración, leucemia mieloide aguda de células dendríticas, leucemia mieloide aguda, leucemia promielocítica aguda, adamantinoma, adenocarcinoma, carcinoma adenoide quístico, adenoma, tumor odontogénico adenomatoide, carcinoma adrenocortical, leucemia de células T adultas, leucemia agresiva de células NK, cánceres relacionados con SIDA, linfoma relacionado con SIDA, sarcoma alveolar de partes blandas, fibroma ameloblástico, cáncer anal, linfoma anaplásico de células grandes, cáncer anaplásico de tiroides, linfoma angioimmunblástico de células T, angiomiolipoma, angiosarcoma, cáncer de apéndice, astrocitoma, tumor rabdoide teratoide atípico, carcinoma de células basales, carcinoma de tipo basal, leucemia de células B, linfoma de células B, carcinoma del conducto de Bellini, cáncer del tracto biliar, cáncer de vejiga, blastoma, cáncer de hueso, tumor óseo, glioma del tronco encefálico, tumor cerebral, cáncer de mama, tumor de Brenner, tumor bronquial, carcinoma bronquioloalveolar, tumor marrón, linfoma de Burkitt, cáncer de sitio primario desconocido, tumor carcinoide, carcinoma, carcinoma in situ, carcinoma de pene, carcinoma de sitio primario desconocido, carcinosarcoma, enfermedad de Castleman, tumor embrionario del sistema nervioso central, astrocitoma cerebeloso, astrocitoma cerebral, cáncer de cuello uterino, colangiocarcinoma, condroma, condrosarcoma, cordoma, coriocarcinoma, papiloma del plexo coroideo, leucemia linfocítica crónica, leucemia monocítica crónica, leucemia mielógena crónica, trastorno mieloproliferativo crónico, leucemia neutrofílica crónica, tumor de células claras, cáncer de colon, cáncer colorrectal, craneofaringioma, linfoma cutáneo de células T, enfermedad de Degos, dermatofibrosarcoma protuberante, quiste dermoide, tumor desmoplásico de células redondas pequeñas, linfoma difuso de células B grandes, tumor neuroepitelial disembrioplásico, carcinoma embrionario, tumor del seno endodérmico, cáncer de endometrio, cáncer de endometrio uterino, tumor endometrioide, linfoma de células T asociado a enteropatía, ependimoblastoma, ependimoma, sarcoma epitelioide, eritroleucemia, cáncer de esófago, estesioneuroblastoma, familia de tumores de Ewing, sarcoma familiar de Ewing, sarcoma de Ewing, tumor extracraneal de células germinales, tumor extragonadal de células germinales, cáncer de vías biliares extrahepáticas, enfermedad de Paget extramamaria, cáncer de trompas de Falopio, fetus in fetu, fibroma, fibrosarcoma, linfoma folicular, cáncer folicular de tiroides, cáncer de vesícula biliar, cáncer de vesícula biliar, ganglioglioma, ganglioneuroma, cáncer gástrico, linfoma gástrico, cáncer gastrointestinal, tumor carcinoide gastrointestinal, tumor estromal gastrointestinal, tumor de células germinales, germinoma, coriocarcinoma gestacional, tumor trofoblástico gestacional, tumor óseo de células gigantes, glioblastoma multiforme, glioma, gliomatosis cerebri, tumor glómico, glucagonoma, gonadoblastoma, tumor de células de la granulosa, leucemia de células pilosas, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de corazón, hemangioblastoma, hemangiopericitoma, hemangiosarcoma, neoplasia maligna hematológica, carcinoma hepatocelular, linfoma hepatoesplénico de células T, síndrome hereditario de cáncer de mama-ovario, linfoma de Hodgkin, cáncer hipofaríngeo, glioma hipotalámico, cáncer inflamatorio de mama, melanoma intraocular, carcinoma de células de los islotes, tumor de células de los islotes, leucemia mielomonocítica juvenil, sarcoma de Kaposi, cáncer de riñón, tumor de Klatskin, tumor de Krukenberg, Cáncer de laringe, melanoma lentigo maligno, leucemia, cáncer de labio y cavidad oral, liposarcoma, cáncer de pulmón, luteoma, linfangioma, linfangiosarcoma, linfoepitelioma, leucemia linfoide, linfoma, macroglobulinemia, histiocitoma fibroso maligno, histiocitoma fibroso maligno de hueso, glioma maligno, mesotelioma maligno, tumor maligno de la vaina del nervio periférico, tumor rabdoide maligno, tumor tritón maligno, linfoma MALT, linfoma de células del manto, leucemia de mastocitos, tumor de células germinales mediastínico, tumor mediastínico, cáncer de tiroides medular, meduloblastoma, meduloepitelioma, melanoma, meningioma carcinoma de células de Merkel, mesotelioma, cáncer metastásico escamoso de cuello con primario oculto, carcinoma urotelial metastásico, tumor mulleriano mixto, leucemia monocítica, cáncer de boca, tumor mucinoso, síndrome de neoplasia endocrina múltiple, mieloma múltiple, micosis fungoide, enfermedad mielodisplásica, síndromes mielodisplásicos, leucemia mieloide, sarcoma mieloide, enfermedad mieloproliferativa, mixoma, cáncer de cavidad nasal, cáncer nasofaríngeo, carcinoma nasofaríngeo, neoplasma, neurinoma, neuroblastoma, neurofibroma, neuroma, melanoma nodular, linfoma no Hodgkin, cáncer de piel no melanoma, cáncer de pulmón de células no pequeñas, oncología ocular, oligoastrocitoma, oligodendroglioma, oncocitoma, meningioma de la vaina del nervio óptico, cáncer oral, cáncer orofaríngeo, osteosarcoma, cáncer de ovario, cáncer epitelial de ovario, tumor de células germinales de ovario, tumor de bajo potencial maligno de ovario, enfermedad de Paget de la mama, tumor de Pancoast, cáncer de páncreas, cáncer papilar de tiroides, papilomatosis, paraganglioma, cáncer de seno paranasal, cáncer de paratiroides, cáncer de pene, tumor de células epitelióides perivasculares, cáncer de faringe, feocromocitoma, tumor parenquimatoso pineal de diferenciación intermedia, pineoblastoma, pituicitoma, adenoma pituitario, tumor pituitario, neoplasia de células plasmáticas, blastoma pleuropulmonar, poliembrioma, linfoma linfoblástico T precursor, linfoma primario del sistema nervioso central, linfoma de derrame primario, cáncer hepatocelular primario, cáncer hepático primario, cáncer peritoneal primario, tumor neuroectodérmico primitivo, cáncer de próstata, pseudomixoma peritoneo, cáncer de recto, carcinoma de células renales, carcinoma del tracto respiratorio que involucra el gen NUT en el cromosoma 15, retinoblastoma, rabdomioma, rabdomiosarcoma, transformación de Richter, teratoma sacrococígeo cáncer de glándulas salivales, Sarcoma, Schwannomatosis, carcinoma de glándulas sebáceas, neoplasia secundaria, seminoma, tumor seroso, tumor de células de Sertoli-Leydig, tumor del estroma de los cordones sexuales, síndrome de Sézary, carcinoma de células en anillo de sello, cáncer de piel, tumor de células redondas azules pequeñas, carcinoma de células pequeñas, cáncer de pulmón de células pequeñas, linfoma de células pequeñas, cáncer de intestino delgado, sarcoma de tejidos blandos, somatostatinoma, verruga del hollín, tumor de la médula espinal, tumor espinal, linfoma esplénico de la zona marginal, carcinoma de células escamosas, cáncer de estómago, melanoma de extensión superficial, tumor neuroectodérmico primitivo supratentorial, tumor epitelialestromal superficial, sarcoma sinovial, leucemia linfoblástica aguda de células T, leucemia de linfocitos granulares grandes de células T, leucemia de células T, linterna de células T, leucemia prolinfocítica de células T, teratoma, cáncer linfático terminal, cáncer testicular, tecoma, cáncer de garganta, carcinoma tímico, timoma, cáncer de tiroides, cáncer de células de transición de pelvis renal y uréter, carcinoma de células de transición, cáncer de uraco, cáncer de uretra, neoplasia urogenital, sarcoma uterino, melanoma uveal, cáncer de vagina, síndrome de Verner Morrison, carcinoma verrugoso, glioma de la vía visual, cáncer de vulva, macroglobulinemia de Waldenstrom, tumor de Warthin, tumor de Wilms y combinación de los mismos. En una realización, el cáncer es cáncer colorrectal, cáncer de pulmón de células no pequeñas, colangiocarcinoma, mesotelioma, enfermedad de Castleman, carcinoma de células renales o cualquier combinación de los mismos. En una realización, el paciente puede tener un cáncer seleccionado de cáncer de cabeza y cuello, cáncer de esófago, cáncer de garganta, cáncer de pulmón, cánceres gastrointestinales tales como cáncer de estómago, cáncer colorrectal, cáncer de páncreas, así como cánceres hematológicos tales como mieloma múltiple, leucemia y linfoma.
En un aspecto de la divulgación, el paciente padece una enfermedad o trastorno seleccionado del grupo que consiste en fatiga general, fatiga inducida por el ejercicio, fatiga relacionada con el cáncer, fatiga relacionada con la enfermedad inflamatoria, síndrome de fatiga crónica, caquexia relacionado con el cáncer, caquexia relacionada con el corazón, caquexia relacionada con las vías respiratorias, caquexia relacionada con el riñón, caquexia relacionada con la edad, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico (SLE), artritis idiopática juvenil sistémica, psoriasis, artropatía psoriásica, espondilitis anquilosante, enfermedad inflamatoria intestinal (IBD), polimialgia reumática, arteritis de células gigantes, vasculitis autoinmune, enfermedad de injerto contra huésped (GVHD), síndrome de Sjogren, enfermedad de Still del adulto, artritis reumatoide, artritis idiopática juvenil sistémica, osteoartritis, osteoporosis, enfermedad ósea de Paget, osteoartritis, mieloma múltiple, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, cáncer de próstata, leucemia, cáncer de células renales, enfermedad multicéntrica de Castleman, cáncer de ovario, resistencia a fármacos en la quimioterapia del cáncer, toxicidad de la quimioterapia del cáncer, cardiopatía isquémica, aterosclerosis, obesidad, diabetes, asma, esclerosis múltiple, enfermedad de Alzheimer, enfermedad cerebrovascular, fiebre, respuesta de fase aguda, alergias, anemia, anemia de inflamación (anemia de enfermedad crónica), hipertensión, depresión, depresión asociada con una enfermedad crónica, trombosis, trombocitosis, insuficiencia cardíaca aguda, síndrome metabólico, aborto espontáneo, obesidad, prostatitis crónica, glomerulonefritis, enfermedad inflamatoria pélvica, lesión por reperfusión, rechazo de trasplante, enfermedad de injerto contra huésped (GVHD), influenza aviar, viruela, influenza pandémica, síndrome de dificultad respiratoria del adulto (ARDS), síndrome respiratorio agudo severo (SARS), sepsis y síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS).
En una realización, el paciente tiene o va a recibir un trasplante autólogo de células madre o de médula ósea.
En una realización, el anticuerpo antagonista de IL-6 se puede administrar antes, al mismo tiempo o después de la quimioterapia o radioterapia. En una realización, el agente quimioterapéutico es un inhibidor de EGFR. En una realización, el inhibidor de EGFR se selecciona del grupo que consiste en Cetuximab (Erbitux), Erlotinib (Tarceva), Gefitinib (Iressa), Lapatinib (Tykerb), Panitimumab (Vectibox), Sunitinib o Sutent (N-(2-dietilaminoetil)-5-[(Z)-(5-fluoro-2-oxo-1H-indol-3-iliden)metil]-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxamida), Gefitinib o N-(3-cloro-4-fluorofenil)-7-metoxi-6-(3-morfolin-4-ilpropoxi)quinazolin-4-amina y Zalutumumab. En una realización, el paciente puede tener un cáncer que ha mostrado resistencia a dicho agente quimioterapéutico o radiación después de al menos una ronda de quimioterapia o radiación. En una realización, el agente quimioterapéutico o la radiación reduce o evita que el cáncer tratado invada o haga metástasis a otros sitios del cuerpo. En una realización, el agente quimioterapéutico o la radiación da como resultado un aumento de la apoptosis de las células cancerosas tratadas.
En una realización, el cáncer tratado se selecciona de cánceres avanzados y no avanzados que incluyen cánceres con metástasis tales como cáncer de pulmón metastásico y no metastásico, cáncer de mama, cáncer de cabeza y cuello, (HNSCC), cáncer de faringe, cáncer de páncreas, cáncer colorrectal, cáncer anal, glioblastoma multiforme, cánceres epiteliales, carcinomas de células renales, leucemia mielógena aguda o crónica y otras leucemias.
En una realización, los resultados se utilizan para facilitar el diseño de un régimen terapéutico apropiado para la mucositis o una enfermedad asociada con la mucositis.
En una realización, el anticuerpo antagonista de IL-6, se coadministra con otro agente terapéutico seleccionado del grupo que consiste en analgésicos, antibióticos, agentes anticaquexia, anticoagulantes, agentes anticitocinas, agentes antieméticos, agente contra la fatiga, agentes contra la fiebre, agentes antiinflamatorios, agentes antináuseas, antipiréticos, agentes antivirales, agente contra la debilidad, agentes quimioterapéuticos, antagonista de citocina, citocinas, agentes citotóxicos, agentes de terapia génica, factores de crecimiento, antagonistas de IL-6, agentes inmunosupresores, anestésicos locales, estatinas, otros agentes terapéuticos o cualquier combinación de los mismos.
En otra realización, el analgésico es acetaminofén, amitriptilina, benzocaína, carbamazepina, codeína, hidrocloruro (HCl) de diclonina, dihidromorfina, parche de fentanilo, flupirtina, fluriprofeno, gabapentina, hidrocodona APAP, hidromorfona, ibuprofeno, cetoprofeno, lidocaína, morfina un opiáceo y sus derivados, oxicodona, pentazocina, petidina, fenacetina, pregabalina, propoeilfeno, propoil APA, salicilamida, tramadol, tramadol APAP, Ulcerease® (fenol al 0,6%) o voltarén.
En otra realización, el anestésico local es ametocaína, articaína, benzocaína, bupivacaína, mepivacaína, cocaína, cinchocaína, cloroprocaína, ciclometicaína, dibucaína, dimetocaína, EMLA® (mezcla eutéctica de lidocaína y prilocaína), etidocaína, larocaína levobupicaína, lidocaína, lignocaína, procaína, piperocaína, prilocaína, proparacaína, propoxicaína, ropivacaína, saxitoxina, tetracaína, tetrodotoxina o trimecaína.
En otra realización, el agente anticaquexia es canabis, dronabinol (Marinol®), nabilona (Cesamet), canabidiol, canabicromeno, tetrahidrocanabinol, Sativex, acetato de megestrol o cualquier combinación de los mismos.
En otra realización, el anticoagulante es abciximab (ReoPro®), acenocumarol, antitrombina III, argatrobán, aspirina, bivalirudina (Angiomax®), clopidogrel, dabigatrán, etexilato de dabigatrán (Pradaxa®/Pradax®), desidurina, (Rebasc®/Iprivask®), dipiridamol, eptifibatida (Integrilin®), fondaparinux, heparina, hirudina, idraparinux, lepirudina (Refludan®), heparina de bajo peso molecular, melagatrán, fenindiona, fenprocumón, ticlopidina, tirofibán(Aggrastat®), warfarina, ximelagatrán (Exanta®/Exarta®), o cualquier combinación de los mismos.
En otra realización, el agente antiinflamatorio es acetaminofén, azapropazona, diclofenaco, diflunisal, etodolac, fenbufeno, fenoprofeno, flurbiprofeno, ibuprofeno, indometacina, ketoprofeno, ketorolaco, mefenamic, meloxicam, nabumetona, naproxeno, fenilbutazona, piroxicam, un salicilato, sulindac, tenoxicam, ácido tiaprofénico o ácido tolfenámico. En otra realización más, el salicilato es ácido acetilsalicílico, amoxiprina, benorilato, salicilato de colina y magnesio, etenzamida, faislamina, salicilato de metilo, salicilato de magnesio, salicilato de salicilo o salicilamida.
En otra realización, el agente contra las náuseas o agente antiemético comprende antagonistas del receptor 5-HT3, ajwaina, alizaprida, anticolinérgicos, antihistamínicos, aprepitant, benzodiazepinas, canabicromeno, canabidiol, canabinoides, canabis, casopitant, clorpromazina, ciclizina, dexametasona, dimenhidrinato (Gravo®), difenhidramina, dolasetrón, domperidona, antagonistas de la dopamina, doxilamina, dronabinol (Marinol®), droperidol, emetrol, jengibre, granisetrón, haloperidol, hidroxicina, hioscina, lorazepam, meclizina, metoclopramida, midazolam, muscimol, nabilona (Cesamet), antagonistas del receptor nk1, ondansetrón, palonosetrón, menta, fenergán, proclorperazina, Promacot, prometazina, pentazina, propofol, sativex, tetrahidrocanabinol, trimetobenzamida, tropisetrón, nandrolona, estilbestrol, talidomida, lenalidomida, agonistas de grelina, antagonistas de miostatina, anticuerpos antimiostatina, moduladores selectivos del receptor de andrógenos, moduladores selectivos del receptor de estrógenos, antagonistas de angiotensina All, agonistas del receptor adrenérgico beta dos, agonistas del receptor adrenérgico beta tres o cualquier combinación de los mismos.
En otra realización, el agente antiviral se selecciona del grupo que consiste en abacavir, aciclovir, adefovir, amantadina, amprenavir, una combinación de dosis fija antirretroviral, un potenciador sinérgico antirretroviral, arbidol, atazanavir, atripla, brivudina, cidofovir, combivir, darunavir, delavirdina, didanosina, docosanol, edoxudina, efavirenz, emtricitabina, enfuvirtida, entecavir, inhibidores de entrada, famciclovir, fomivirsen, fosamprenavir, foscarnet, fosfonet, inhibidor de fusión, ganciclovir, gardasil, ibacitabina, idoxurudina, imiquimod, imunovir, indinavir, inosina, inhibidor de integrasa, interferón, interferón tipo I, interferón tipo II, interferón tipo III, lamivudina, lopinavir, lovirida, maraviroc, MK-0518, moroxidina, nelfinavir, nevirapina, nexavir, análogos de nucleósido, oseltamivir, penciclovir, peramivir, pleconaril, podofilotoxina, inhibidor de proteasa, inhibidor de transcriptasa inversa, ribavirina, rimantadina, ritonavir, saquinavir, estavudina, tenofovir, tenofovir disoproxil, tipranavir, trifluridina, trizivir, tromantadina, truvada, valaciclovir, valganciclovir, vicriviroc, vidarabina, viramidina, zalcitabina, zanamivir, zidovudina o cualquier combinación de los mismos.
En otra realización, el agente citotóxico, agente quimioterapéutico o agente inmunosupresor comprende 1-deshidrotestosterona, 1-metilnitrosourea, 5-fluorouracilo, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, Abatacept, abraxano, acitretina, aclarrubicina, Actinio-225 (225Ac), actinomicina, Adalimumab, inhibidores de adenosina desaminasa, Afelimomab, Aflibercept, Afutuzumab, Alefacept, alitretinoína, sulfonatos de alquilo, agentes alquilantes, altretamina, alvocidib, ácido aminolevulínico/aminolevulinato de metilo, aminopterina, amrubicina, amsacrina, anagrelida, Anakinra, antracenodionas, antraciclinas, antramicina (AMC); agentes antimitóticos, antibióticos, anticuerpos anti-CD20, antifolatos, globulina anti-linfocitos, antimetabolitos, globulina anti-timocitos, trióxido de arsénico, Aselizumab, asparaginasa, agotadores de asparagina, Astatina 211 (211At), Atlizumab, Atorolimumab, atrasentano, Avastin®, azacitidina, Azatioprina, azelastina, aziridinas, basiliximab, anticuerpos BAYX, Belatacept, Belimumab, belotecano, bendamustina, Bertilimumab, bexaroteno, bisantreno, Bismuto 213 (213Bi), Bismuto 212 (212Bi), bleomicina, anticuerpos BLyS, bortezomib, busulfán, inhibidores de calcineurina, caliqueamicina, camptotecina, camptotecinas, capecitabina, carboplatino (paraplatino), carbocuona, carminomicina, carmofur, carmustina, carmustina (BSNU) anticuerpos CAT, anticuerpos (CDN11), anticuerpos CD147/Basigin, anticuerpos CD154, anticuerpos CD18, anticuerpos CD20, anticuerpos CD23, anticuerpos CD3, anticuerpos CD4, anticuerpos CD40, anticuerpos CD62L/l-selectina, anticuerpos CD80, inhibidores de CDK, Cedelizumab, celecoxib, Certolizumab pegol, clorambucilo, clorambucilos, Ciclosporina, cis-diclorodiamina platino (II) (DDP) cisplatino, cladribina, Clenoliximab, clofarabina, colchicina, anticuerpos del componente 5 del complemento, Cobre 67 (67Cu), corticosteroides, anticuerpos CTLA-4, proteínas de fusión CTLA-4, inhibidores de ciclofilina, ciclofosfamidas, ciclotosfamida, citarabina, citocalasina B, ribonucleasas citotóxicas, dacarbazina, Daclizumab, dactinomicina, dactinomicina (actinomicina D), daunorrubicina, (anteriormente daunomicina), decitabina, Deforolimus, demecolcina, detorrubicina, dibromomanitol, dietilcarbamazina, inhibidores de la dihidrofolato reductasa, dihidroxi antracina diona, toxina diftérica, inhibidores de la ADN polimerasa, docetaxel, Dorlimomab aritox, Dorlixizumab, doxorrubicina (adriamicina), DXL625, Eculizumab, Efalizumab, efaproxiral, antagonistas del EGFR, elesclomol, elsamitrucina, Elsilimomab, emetina, antagonistas del receptor de endotelina, epipodofilotoxinas, epirrubicina, epotilonas, Erbitux®, Erlizumab, estramustina, Etanercept, bromuro de etidio, etoglúcido, etopósido, fosfato de etopósido, Everolimus, Faralimomab, inhibidores de farnesil transferasa, inhibidores de FKBP, floxuridina, fludarabina, fluorouracilo, Fontolizumab, fotemustina, Galiximab, Galio 67 (67Ga), Gantenerumab, Gavilimomab, gemcitabina, glucocorticoides, Golimumab, Gomiliximab, gramicidina D, Gusperimus, Herceptin®, hidracinas, hidroxiurea, agentes hipometilantes, idarrubicina, ifosfamida, antagonistas de IL-1, antagonistas del receptor de IL-1, IL-12 anticuerpos de IL-12, antagonistas de IL-12R, anticuerpos de IL-13, IL-2, inhibidores de IL-2, receptor de IL-2/anticuerpos de CD25, anticuerpos de IL-6, mesilato de imatinib, anticuerpos de inmunoglobulina E, inhibidores de IMP deshidrogenasa, Infliximab, Inolimomab, anticuerpos de integrina, anticuerpos de interferón, interferones, anticuerpos de interleucina 5, anticuerpos del receptor de interleucina-6, interleucinas, Yodo 125 (125I), Yodo 131 (131I), Ipilimumab, irinotecano, ixabepilona, Keliximab, larotaxel, Plomo 212 (212Pb), Lebrilizumab, Leflunomida, Lenalidomida, Lerdelimumab, leucovorina, anticuerpos LFA-1, lidocaína, inhibidores de lipoxigenasa, lomustina (CCNU), lonidamina, lucantona, Lumiliximab, Lutecio 177 (177Lu), Macrólidos, manosulfano, Maslimomab, masoprocol, mecloretamina, melfalán, Mepolizumab, mercaptopurina, Metelimumab, Metotrexato, inhibidores del ensamblaje de microtúbulos, mejoradores de la estabilidad de los microtúbulos, mitramicina, mitobronitol, mitoguazona, mitomicina, mitomicina C, mitotano, mitoxantrona, Morolimumab, inhibidores de mTOR, Muromonab-CD3, mustinas, Ácido micofenólico, mitotano (O,P'-(DDD)), Natalizumab, nedaplatino, Nerelimomab, nimustina, mostazas nitrogenadas, nitrosoureas, ácido nordihidroguaiarético, oblimersen, Ocrelizumab, Odulimomab, ofatumumab, olaparib, Omalizumab, ortataxel, Otelixizumab, oxaliplatino, paclitaxel (taxol), pascolizumab, antagonistas de PDGF, pegaspargasa, pemetrexed, Pentostatina, Pertuzumab, Pexelizumab, inhibidores de la fosfodiesterasa, Fósforo 32 (32P), Pimecrolimus Abetimus, pirarrubicina, pixantrona, platinos, plicamicina, inhibidores de poliADP ribosa polimerasa, porfímero sódico, derivados de porfirina, prednimustina, procaína, procarbazina, propranolol, inhibidores del proteasoma, exotoxina de Pseudomonas, toxina de Pseudomonas, inhibidores de la síntesis de purinas, puromicina, inhibidores de la síntesis de pirimidinas, radionúclidos, radioterapia, raltitrexed, Ranimustina, reslizumab, agonistas del receptor de retinoides X, retinoides, Renio 186 (186Re) Renio 188 (188Re), inhibidores de la ribonucleótido reductasa, ricina, Rilonacept, Rituxan®, Rovelizumab, rubitecano, Ruplizumab, Samario 153 (153SM), satraplatino, Escandio 47 (47Sc), moduladores selectivos del receptor de andrógenos, moduladores selectivos del receptor de estrógenos, seliciclib, semustina, antagonistas de las hormonas sexuales, siplizumab, sirolimus, inhibidores de la aromatasa esteroidea, esteroides, estreptozocina, estreptozotocina, Tacrolimus, talaporfina, talizumab, taxanos, taxoles, tegafur, Telimomab aritox, , temoporfina, temozolomida, Temsirolimus, Teneliximab, tenipósido, Teplizumab, Teriflunomida, tesetaxel, testolactona, tetracaína, Talidomida, tioepa clorambucilo, tiopurinas tioguanina, TioTEPA, i inhibidores de timidilato sintasa, tiazofurina, tipifarnib, anticuerpos contra linfocitos T, antagonistas del TNF, anticuerpos del TNF, proteínas de fusión del TNF, proteínas de fusión del receptor del TNF, inhibidores del TNF-alfa, Tocilizumab, inhibidores de topoisomerasa, topotecano, toralizumab, trabectedina, Tremelimumab, treosulfano, tretinoina, triazenos, triaziquona, trietilenmelamina, tetranitrato de triplatino, trofosfamida, anticuerpos monoclonales específicos del antígeno tumoral, inhibidores de tirosina quinasa, uramustina, Ustekinumab, Valrubicina, vapaliximab, antagonistas del VEGF, Vepalimomab, verteporfina, vinblastina, alcaloides de la vinca, vincristina, vindesina, vinflunina, vinorelbina, Visilizumab, vorinostat, itrio 88 (88Y), itrio 90 (90Y), zanolimumab, Zileuton, Ziralimumab, zolimomab aritox, zorrubicina, Zotarolimus o cualquier combinación de los mismos.
En otra realización, el agente de quimioterapia se selecciona del grupo que consiste en antagonistas de VEGF, antagonistas de EGFR, platinos que incluyen cisplatino y carboplatino, taxoles, irinotecano, 5-fluorouracilo, gemcitabina, leucovorina, esteroides, ciclofosfamida, melfalán, alcaloides de la vinca, vinblastina, vincristina, vindesina, vinorelbina, mustinas, inhibidores de tirosina quinasa, radioterapia, antagonistas de hormonas sexuales, moduladores selectivos del receptor de andrógenos, moduladores selectivos del receptor de estrógenos, antagonistas de PDGF, antagonistas de TNF, antagonistas de IL-1, interleucinas, IL-12, IL-2, Antagonistas de IL-12R, anticuerpos monoclonales conjugados con toxina, anticuerpos monoclonales específicos de antígeno tumoral, Erbitux®, Avastin®, Pertuzumab, anticuerpos anti-CD20, Rituxan®, ocrelizumab, ofatumumab, DXL625, Herceptin® o cualquier combinación de los mismos.
En otra realización, el antagonista de citocinas es un antagonista del factor de necrosis tumoral alfa, interferón gamma, interleucina 1 alfa, interleucina 1 beta, interleucina 6, TNF-a, IL-1a, IL-1p, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, IL-13, IL-18, IFN-a, IFN-y, BAFF, CXCL13, IP-10, factor inhibidor de la leucemia o una combinación de los mismos.
En otra realización, el factor de crecimiento es VEGF, EPO, EGF, HRG, factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), hepcidina o cualquier combinación de los mismos.
En otra realización, la estatina comprende atorvastatina, cerivastatina, fluvastatina, lovastatina, mevastatina, pitavastatina, pravastatina, rosuvastatina, simvastatina o cualquier combinación de las mismas.
En otra realización, el otro agente terapéutico es un antagonista de un factor que comprende el factor alfa de necrosis tumoral, interferón gamma, interleucina 1 alfa, interleucina 1 beta, interleucina 6, factor inductor de proteólisis, factor inhibidor de leucemia, tamoxifeno, antagonistas de BCL-2, estrógeno, bifosfonatos, teriparatida, ranelato de estroncio, alendronato de sodio (Fosamax), risedronato (Actonel), raloxifeno, ibandronato (Boniva), Obatoclax, ABT-263, gosipol, gefitinib, inhibidores de la tirosina quinasa del receptor del factor de crecimiento epidérmico, erlotinib, inhibidores del receptor del factor de crecimiento epidérmico, psoralenos, trioxsaleno, metoxsaleno, bergapteno, retinoides, etretinato, acitretina, infliximab (Remicade®), adalimumab, infliximab, etanercept, Zenapax®, Ciclosporina, Metotrexato, factor estimulante de colonias de granulocitos, filgrastim, lenograstim, Neupogen, Neulasta, Ácidos 2-arilpropiónicos, Aceclofenaco, Acemetacina, ácido Acetilsalicílico (Aspirina), Alclofenaco, Alminoprofeno, Amoxiprina, Ampirona, Ácidos Arilalcanoicos, Azapropazona, Benorilato, Benoxaprofeno, Bromfenac, Carprofeno, Celecoxib, Salicilato de Colina y magnesio, Clofezona, Inhibidores de COX-2, Dexibuprofeno, Dexketoprofeno, Diclofenaco, Diflunisal, Droxicam, Etenzamida, Etodolac Etoricoxib, Faislamina, ácidos fenámicos, Fenbufeno, Fenoprofeno, Ácido flufenámico, Flunoxaprofeno, Flurbiprofeno, Ibuprofeno, Ibuproxam, Indometacina, Indoprofeno, Kebuzona, Ketoprofeno, Ketorolaco, Lornoxicam, Loxoprofeno, Lumiracoxib, Salicilato de magnesio, Ácido meclofenámico, Ácido mefenámico, Meloxicam, Metamizol, Salicilato de metilo Mofebutazona, Nabumetona, Naproxeno, Ácidos N-arilantranílicos, Oxametacina, Oxaprozina, Oxicams, Oxifenbutazona, Parecoxib, Fenazona, Fenilbutazona, Piroxicam, Pirprofeno, profenos, Proglumetacina, Derivados de pirazolidina, Rofecoxib, Salicilato de salicilo, Salicilamida, Salicilatos, Sulfinpirazona, Sulindac, Suprofeno, Tenoxicam, Ácido tiaprofénico, Ácido tolfenámico, Tolmetina y Valdecoxib. Los antibióticos incluyen Amikacina, Aminoglucósidos, Amoxicilina, Ampicilina, Ansamicinas, Arsfenamina, Azitromicina, Azlocilina, Aztreonam, Bacitracina, Carbacefem, Carbapenémicos, Carbenicilina, Cefaclor, Cefadroxilo, Cefalexina, Cefalotina, Cefamandol, Cefazolina, Cefdinir, Cefditoreno, Cefepime, Cefixime, Cefoperazona, Cefotaxima, Cefoxitina, Cefpodoxima, Cefprozil, Ceftazidima, Ceftibuteno, Ceftizoxima, Ceftobiprol, Ceftriaxona, Cefuroxima, Cefalosporinas, Cloranfenicol, Cilastatina, Ciprofloxacina, Claritromicina, Clindamicina, Cloxacilina, Colistina, Co-trimoxazol, Dalfopristina, Demeclociclina, Dicloxacilina, Diritromicina, Doripenem, Doxiciclina, Enoxacina, Ertapenem, Eritromicina, Etambutol, Flucloxacilina, Fosfomicina, Furazolidona, Ácido fusídico, Gatifloxacina, Geldanamicina, Gentamicina, Glicopéptidos, Herbimicina, Imipenem, Isoniazida, Kanamicina, Levofloxacina, Lincomicina, Linezolida, Lomefloxacina, Loracarbef, Macrólidos, Mafenida, Meropenem, Meticilina, Metronidazol, Mezlocilina, Minociclina, Monobactamas, Moxifloxacina, Mupirocina, Nafcilina, Neomicina, Netilmicina, Nitrofurantoína, Norfloxacina, Ofloxacina, Oxacilina, Oxitetraciclina, Paromomicina, Penicilina, Penicilinas, Piperacilina, Platensimicina, Polimixina B, Polipéptidos, Prontocil, Pirazinamida, Quinolonas, Quinupristina, Rifampicina, Rifampina, Roxitromicina, Espectinomicina, Estreptomicina, Sulfacetamida, Sulfametizol, Sulfanilimida, Sulfasalazina, Sulfisoxazol, Sulfonamidas, Teicoplanina, Telitromicina, Tetraciclina, Tetraciclinas, Ticarcilina, Tindazol, Tobramicina, Trimetoprim, Trimetoprim-Sulfametoxazol, Troleandomicina, Trovafloxacina y Vancomicina. Los agentes activos también incluyen Aldosterona, Beclometasona, Betametasona, Corticosteroides, Cortisol, Acetato De Cortisona, Acetato De Desoxicorticosterona, Dexametasona, Acetato De Fludrocortisona, Glucocorticoides, Hidrocortisona, Metilprednisolona, Prednisolona, Prednisona, Esteroides, Triamcinolona, un agonista, antagonista o modulador de un factor que comprende TNF-alfa, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, IL-13, IL-18, IFN-alfa, IFN-gamma, BAFF, CXCL13, IP-10, VEGF, EPO, EGF, HRG, factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), hepcidina o cualquier combinación de los mismos.
En una realización, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede estar directa o indirectamente acoplado a un marcador detectable, una fracción que aumenta la semivida, un agente citotóxico, un agente terapéutico o un agente inmunosupresor. En otra realización, el marcador detectable comprende colorantes fluorescentes, materiales bioluminiscentes, materiales radiactivos, fracciones quimioluminiscentes, estreptavidina, avidina, biotina, materiales radiactivos, enzimas, sustratos, peroxidasa de rábano picante, acetilcolinesterasa, fosfatasa alcalina, p-galactosidasa, luciferasa, rodamina, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, umbeliferona, diclorotriazinilamina, ficoeritrina, cloruro de dansilo, luminol, luciferina, aequorina, yodo 125 (125I), carbono 14 (14C), azufre 35 (35S), tritio (3H), fósforo 32 (32P) o cualquier combinación de los mismos.
En una realización, el sujeto puede recibir quimioterapia en forma concomitante. En otra realización, el sujeto puede recibir radioterapia en forma concomitante.
En otra realización, el anticuerpo puede ser el anticuerpo Ab1.
En otra realización, la composición se puede administrar por vía intravenosa durante al menos aproximadamente 1 hora. En otra realización, la cantidad eficaz es o el medicamento comprende entre aproximadamente 0,1 y 20 mg/kg de peso corporal del sujeto receptor de dicho antagonista de IL-6. En otra realización, la cantidad eficaz es o el medicamento comprende al menos aproximadamente 25, 80, 100, 160, 200 o 320 mg. En otra realización, la cantidad eficaz es o el medicamento comprende entre aproximadamente 0,1 y 100 mg/kg de peso corporal del sujeto.
En otra realización, al sujeto se le puede administrar al menos 1, 2, 3, 4 o 5 dosis. En otra realización, la composición se puede administrar cada 4 semanas. En otra realización, la composición se puede administrar suministrando 160 mg cada 4 semanas hasta un total de 2 dosis. En otra realización, la composición se puede administrar suministrando 160 mg cada 4 semanas hasta un total de 2 dosis. En otra realización, la composición se puede administrar suministrando 320 mg cada 4 semanas hasta un total de 2 dosis.
En otra realización, la mucositis oral y orofaríngea puede inducirse mediante regímenes de quimiorradiación (CRT) usados para el tratamiento de cánceres de cabeza y cuello.
En otra realización, el procedimiento puede comprender además la evaluación del estado de la mucositis oral o cáncer de cabeza y cuello.
En otra realización, la evaluación puede comprender una modalidad de formación de imágenes seleccionada del grupo que consta de exámenes CAT, PET y MRI.
En otra realización, al sujeto se le puede administrar 5-fluoracilo (5-FU) o irinotecano.
En una realización, la composición se puede administrar por vía subcutánea. En otra realización, la composición puede ser una composición farmacéutica. En una realización adicional, la composición puede formularse para una administración subcutánea.
En una realización, el paciente puede tener una proteína C reactiva elevada ("CRP"). En una realización, el paciente puede tener un nivel elevado de IL-6 en suero. En una realización, el paciente puede tener un nivel elevado de IL-6 en las articulaciones. En una realización, el paciente puede haber tenido una respuesta inadecuada a los fármacos antiinflamatorios no esteroideos (NSAID). En una realización, el paciente puede haber tenido una respuesta inadecuada a los fármacos antirreumáticos no biológicos modificadores de la enfermedad (DMARD).
En una realización, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede estar directa o indirectamente acoplado a un marcador detectable, agente citotóxico, agente terapéutico o a un agente inmunosupresor. En una realización, el marcador detectable puede comprender un colorante fluorescente, material bioluminiscente, material radiactivo, fracción quimioluminiscente, estreptavidina, avidina, biotina, material radiactivo, enzima, sustrato, peroxidasa de rábano picante, acetilcolinesterasa, fosfatasa alcalina, p-galactosidasa, luciferasa, rodamina, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, umbeliferona, diclorotriazinilamina, ficoeritrina, cloruro de dansilo, luminol, luciferina, aequorina, Yodo 125 (125I), Carbono 14 (14C), Azufre 35 (35S), Tritio (3H), Fósforo 32 (32P), o cualquier combinación de los mismos. En otra realización, el antagonista de IL-6 se puede acoplar a una fracción que aumenta la semivida.
En una realización, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede coadministrarse con otro agente terapéutico seleccionado del grupo que consiste en analgésicos, antibióticos, agentes anticaquexia, anticoagulantes, agentes anticitocinas, agentes antieméticos, agente contra la fatiga, agente contra la fiebre, agentes antiinflamatorios, agentes contra las náuseas, antipiréticos, agentes antivirales, agente contra la debilidad, agentes de quimioterapia, antagonista de citocinas, citocinas, agentes citotóxicos, agentes de terapia génica, factor de crecimiento, antagonistas de IL-6, agentes inmunosupresores, estatinas o cualquier combinación de los mismos. En una realización, el antagonista de citocinas puede ser un antagonista de un factor que comprende el factor alfa de necrosis tumoral, interferón gamma, interleucina 1 alfa, interleucina 1 beta, interleucina 6 o cualquier combinación de los mismos. En una realización, el antagonista de citocinas puede ser un antagonista de TNF-a, IL-1a, IL-1p, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, IL-13, IL-18, IFN-a, IFN-y, BAFF, CXCL13, IP-10, factor inhibidor de la leucemia o una combinación de los mismos. En una realización, el factor de crecimiento puede ser VEGF, EPO, EGF, HRG, factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), hepcidina o cualquier combinación de los mismos. Una realización abarca anticuerpos humanizados específicos y fragmentos y variantes de los mismos para el tratamiento o la prevención de la mucositis capaces de unirse a IL-6 y/o al complejo IL-6/IL-6R. Estos anticuerpos pueden unirse a IL-6 soluble o IL-6 expresada en la superficie celular. Además, estos anticuerpos pueden inhibir la formación o los efectos biológicos de al menos uno de IL-6, complejos de IL-6/IL-6R, complejos de IL-6/IL-6R/gp130 y/o multímeros de IL-6/IL-6R/gp130. La presente invención se refiere a nuevas terapias y protocolos terapéuticos que utilizan anticuerpos anti-IL-6, preferiblemente los descritos en el presente documento.
La invención también contempla la administración de conjugados de anticuerpos anti-IL-6 y versiones humanizadas, quiméricas o monocatenarias de los mismos y otros fragmentos de unión y variantes de los mismos conjugados con al menos una fracción funcional o detectable.
En una realización de la invención, el anticuerpo anti-IL-6 o fragmento de anticuerpo o variante del mismo puede unirse directa o indirectamente a un marcador o agente terapéutico detectable.
En una realización de la invención, el anticuerpo anti-IL-6 o fragmento de anticuerpo o variante del mismo puede administrarse al paciente con una frecuencia como máximo una vez por período de aproximadamente 4, 8, 12, 16, 20 o 24 semanas.
En una realización de la invención, se puede mejorar la calidad de vida del paciente.
Esta invención se refiere a nuevos anticuerpos anti-IL-6, nuevas terapias y protocolos terapéuticos que utilizan anticuerpos anti-IL-6 y formulaciones farmacéuticas que contienen anticuerpos anti-IL-6, en la que dichos anticuerpos son como se definen en las reivindicaciones y dichos anticuerpos o dichas formulaciones se utilizan en el tratamiento o la prevención de la mucositis asociada con radioterapia. En realizaciones preferidas, el anticuerpo anti-IL-6 tiene una semivida in vivo de al menos aproximadamente 30 días, tiene un efecto in vivo de disminuir la proteína C reactiva, posee una afinidad de unión (Kd) por IL-6 menor de aproximadamente 50 picomolar, y/o tiene una tasa de disociación (Kdisociación) de IL-6 menor o igual a 10'4 S-1.
En una realización de la invención, el nivel de CRP en suero del paciente puede permanecer reducido durante todo un período entre dos administraciones consecutivas de anticuerpos anti-IL-6.
En una realización, el paciente puede haber sido diagnosticado con mucositis.
En una realización, el anticuerpo, o fragmento de anticuerpo del mismo, puede expresarse a partir de una célula recombinante. En otra realización, la célula puede seleccionarse de una célula de mamífero, levadura, bacteria e insecto. En otra realización, la célula puede ser una célula de levadura. En otra realización, la célula puede ser una célula de levadura diploidal. En otra realización, la célula de levadura puede ser una levadura Pichia En otra realización, el anticuerpo anti-IL-6 puede producirse en un sistema de expresión basado en levadura (Pichia pastoris) usando procesos de fermentación convencionales y purificación posterior. En una realización, los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento pueden expresarse en células de levadura. En una realización, la levadura competente para el apareamiento puede ser miembro de la familia Saccharomycetaceae, que incluye los géneros Arxiozyma; Ascobotryozyma; Citeromyces; Debaryomyces; Dekkera; Eremothecium; Issatchenkia; Kazachstania; Kluyveromyces; Kodamaea; Lodderomyces; Pachysolen; Pichia; Saccharomyces; Saturnispora; Tetrapisispora; Torulaspora; Williopsis; y Zygosaccharomyces. Otros tipos de levadura potencialmente útiles en la invención incluyen Yarrowia, Rhodosporidium, Candida, Hansenula, Filobasium, Filobasidellla, Sporidiobolus, Bullera, Leucosporidium, y Filobasidella. En una realización preferida, la levadura competente para el apareamiento puede ser miembro del género Pichia. En una realización preferida adicional, la levadura competente para el apareamiento del género Pichia es una de las siguientes especies: Pichia pastoris, Pichia methanolica, Y Hansenula polymorpha (Pichia angusta). En una realización particularmente preferida, la levadura competente para el apareamiento del género Pichia puede ser la especie Pichia pastoris.
En una realización, una composición para su uso en el tratamiento de la mucositis oral asociada con radioterapia en un sujeto con cáncer de cabeza y cuello que recibe quimioterapia concomitante puede comprender una cantidad eficaz de un anticuerpo monoclonal humanizado de acuerdo con las reivindicaciones que se une selectivamente a IL-6.
En una realización, una composición para usar en el tratamiento o prevención de la mucositis oral asociada con radioterapia puede comprender un anticuerpo monoclonal humanizado de acuerdo con las reivindicaciones que se une selectivamente a IL-6 y solución salina.
En una realización, la composición para uso de acuerdo con las reivindicaciones puede comprender un anticuerpo anti-IL-6 o un fragmento de anticuerpo de acuerdo con las reivindicaciones contenidas en una composición que comprende, o alternativamente consiste en, dicho anticuerpo anti-IL-6 o fragmento de anticuerpo, histidina base aproximadamente 5 mM, histidina HCl aproximadamente 5 mM para obtener un pH final de 6, sorbitol 250 mM y polisorbato 80 al 0,015% (p/p).
En una realización, la composición para uso de acuerdo con las reivindicaciones puede comprender un anticuerpo anti-IL-6 o fragmento de anticuerpo de acuerdo con las reivindicaciones contenidas en una composición que comprende, o alternativamente consiste en, dicho anticuerpo anti-IL-6 o fragmento de anticuerpo, histidina base aproximadamente 5 mM, histidina HCl aproximadamente 5 mM para obtener un pH final de 6, sorbitol 250 a 280 mM o sorbitol en combinación con sacarosa, y polisorbato 80 al 0,015% (p/p), teniendo dicha formulación un espacio de cabeza de nitrógeno en los viales de transporte.
En una realización, la composición para uso de acuerdo con las reivindicaciones puede comprender un anticuerpo anti-IL-6 o un fragmento de anticuerpo de acuerdo con las reivindicaciones contenidas en una composición que comprende, o alternativamente consiste en, un anticuerpo anti-IL-6 o fragmento de anticuerpo, histidina base 25 mM, ácido fosfórico en cantidad suficiente hasta pH 6 y sorbitol 250 mM.
En una realización, la composición para uso de acuerdo con las reivindicaciones puede comprender un anticuerpo anti-IL-6 o fragmento de anticuerpo de acuerdo con las reivindicaciones contenido en una composición que comprende, o alternativamente consiste en, dicho anticuerpo anti-IL-6 o fragmento de anticuerpo, histidina base 12,5 mM, histidina HCl 12,5 mM (o histidina base 25 mM y ácido clorhídrico en cantidad suficiente hasta pH 6), sorbitol 250 mM y polisorbato 80 al 0,015% (p/p).
En una realización, la composición para usar de acuerdo con las reivindicaciones puede comprender un anticuerpo anti-IL-6 o un fragmento de anticuerpo de acuerdo con las reivindicaciones contenidas en una composición que comprende, o alternativamente consiste en, dicho anticuerpo anti-IL-6 o fragmento de anticuerpo, histidina base aproximadamente 5 mM, histidina HCl aproximadamente 5 mM para obtener un pH final de 6, sorbitol 250 mM y polisorbato 80 al 0,015% (p/p).
En una realización, la composición puede comprender una concentración de un anticuerpo anti-IL-6 o un fragmento de anticuerpo que es al menos aproximadamente de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 mg/ml o al menos aproximadamente 10-100 mg/ml.
En una realización, la composición puede comprender al menos aproximadamente 50 o 100 mg de un anticuerpo anti-IL-6 o fragmento de anticuerpo.
En una realización, la composición puede comprender al menos aproximadamente 80 mg, aproximadamente 160 mg o aproximadamente 320 mg de un anticuerpo anti-IL-6 o fragmento de anticuerpo.
En una realización, la cantidad eficaz está entre aproximadamente 0,1 y 20 mg/kg de peso corporal del sujeto receptor.
En una realización, la cantidad eficaz está entre aproximadamente 0,1 y 100 mg/kg de peso corporal del sujeto.
En una realización, la composición puede comprender al menos aproximadamente 25, 80, 100, 160, 200 o 320 mg.
En una realización, la composición se puede formular para administración intravenosa.
En una realización, la composición puede comprender un excipiente seleccionado del grupo que consiste en histidina, sorbitol y polisorbato 80.
En una realización, la composición se puede administrar cada 4 semanas. En una realización, la composición puede administrarse a razón de 80 mg cada 4 semanas para un total de 2 dosis. En una realización, la composición se puede administrar a razón de 160 mg cada 4 semanas para un total de 2 dosis. En una realización, la composición puede administrarse a razón de 320 mg cada 4 semanas para un total de 2 dosis.
El anticuerpo anti-IL-6 comprende un polipéptido de cadena ligera que comprende un polipéptido que tiene un 100% de identidad con la SEQ ID NO: 709.
En una realización, el anticuerpo anti-IL-6 puede comprender un polipéptido de cadena ligera que comprende un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene al menos 75% de identidad, al menos 80% de identidad, al menos 85% de identidad, al menos 90 % de identidad, al menos 95% de identidad, al menos 96%, al menos 97% de identidad, al menos 98%, al menos 99% de identidad, o 100% de identidad con la SEQ ID NO: 723.
El anticuerpo anti-IL-6 comprende un polipéptido de cadena pesada que comprende un polipéptido que tiene una identidad del 100% con la SEQ ID NO: 657.
En una realización, el anticuerpo anti-IL-6 puede comprender un polipéptido de cadena pesada que comprende un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene al menos 75% de identidad, al menos 80% de identidad, al menos 85% de identidad, al menos 90% identidad, al menos 95% de identidad, al menos 96%, al menos 97% de identidad, al menos 98%, al menos 99% de identidad o 100% de identidad con la SEQ ID NO: 700.
En una realización, el anticuerpo anti-IL-6 puede comprender un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene al menos un 75% de identidad con el polinucleótido de la SEQ ID NO: 723, un polipéptido codificado por un polinucleótido que se hibrida en condiciones de rigurosidad media con un polinucleótido que tiene la secuencia del complemento inverso de la SEQ ID NO: 723, o un polipéptido codificado por un polinucleótido que hibrida bajo condiciones de alta rigurosidad con un polinucleótido que tiene la secuencia del complemento inverso de la SEQ ID NO: 723; y un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene al menos un 75% de identidad con el polinucleótido de la SEQ ID NO: 700, un polipéptido codificado por un polinucleótido que se hibrida bajo condiciones de rigurosidad media con un polinucleótido que tiene la secuencia del complemento inverso de la SEQ ID NO: 700, o un polipéptido codificado por un polinucleótido que hibrida bajo condiciones de alta rigurosidad con un polinucleótido que tiene la secuencia del complemento inverso de la SEQ ID NO: 700; en el que el anticuerpo Ab1 o el fragmento de anticuerpo se une específicamente a IL-6 y antagoniza una o más actividades asociadas con IL-6.
En una realización, el anticuerpo anti-IL-6 puede comprender el anticuerpo anti-IL-6 que además comprende la secuencia de cadena ligera constante contenida en la s Eq ID NO: 586.
En una realización, el anticuerpo anti-IL-6 puede comprender la secuencia de cadena pesada constante contenida en SEQ ID NO: 588.
En una realización, la composición puede comprender además metotrexato.
En una realización, la composición puede comprender además al menos un agente antiinflamatorio, un agente analgésico o un fármaco antirreumático modificador de la enfermedad (DMARD).
En una realización, el agente antiinflamatorio se selecciona del grupo que consiste en esteroides, Cortisona, Glucocorticoides, prednisona, prednisolona, Hidrocortisona (Cortisol), acetato de cortisona, metilprednisolona, Dexametasona, Betametasona, Triamcinolona, Beclometasona y Acetato de fludrocortisona, fármaco antiinflamatorio no esteroideo (NSAID), ibuprofeno, naproxeno, meloxicam, etodolac, nabumetona, sulindac, tolementina, salicilato de colina y magnesio, diclofenaco, diflusinal, indometicina, Ketoprofeno, Oxaprozina, piroxicam, y pimesulida, Salicilatos, Aspirina (ácido acetilsalicílico), Diflunisal, Salsalato, derivados de p-aminofenol, Paracetamol, Fenacetina, derivados del Ácido propiónico, Ibuprofeno, Naproxeno, Fenoprofeno, Ketoprofeno, Flurbiprofeno, Oxaprozina, Loxoprofeno, derivados del Ácido Acético, Indometacina, Sulindac, Etodolac, Ketorolac, Diclofenaco, Nabumetona, Derivados del Ácido Enólico (Oxicam), Piroxicam, Meloxicam, Tenoxicam, Droxicam, Lornoxicam, Isoxicam, derivados del Ácido Fenámico (125I), Fenamatos, Ácido Mefenámico, Ácido Meclofenámico, Ácido Flufenámico, Ácido Tolfenámico, Inhibidores Selectivos de COX-2 (Coxib), Celecoxib, Rofecoxib, Valdecoxib, Parecoxib, Lumiracoxib, Etoricoxib, Firocoxib, Sulfoanilidas, Nimesulida, y Licofelona.
En una realización, el agente analgésico se selecciona del grupo que consiste en NSAID, inhibidores de COX-2, Celecoxib, Rofecoxib, Valdecoxib, Parecoxib, Lumiracoxib, Etoricoxib, Firocoxib, acetaminofén, opiáceos, Dextropropoxifeno, Codeína, Tramadol Anileridina, Petidina, Hidrocodona, Morfina, Oxicodona, Metadona, Diacetilmorfina, Hidromorfona, Oximorfona, Levorfanol, Buprenorfina, Fentanilo, Sufentanilo, Etorfina, Carfentanilo, dihidromorfina, dihidrocodeína, Tebaína, Papaverina, diprocualona, Flupirtina, Antidepresivos tricíclicos, y lidocaína.
En una realización, el DMARD puede seleccionarse del grupo que consiste en micofenolato de mofetilo (CellCept), inhibidores de calcineurina, ciclosporina, sirolimus, everolimus, retinoides orales, azatioprina, ésteres de ácido fumérico, D-penicilamina, ciclofosfamida, columna de inmunoadsorción, columna de Prosorba(r), una sal de oro, auranofina, aurotiomalato de sodio (Myocrisina), hidroxicloroquina, cloroquina, leflunomida, metotrexato (MTX), minociclina, sulfasalazina (SSZ), bloqueadores del factor alfa de necrosis tumoral (TNFa), etanercept (Enbrel), infliximab (Remicade), adalimumab (Humira), certolizumab pegol (Cimzia), golimumab (Simponi), bloqueadores de interleucina 1 (IL-1), por ejemplo, anakinra (Kineret), anticuerpos monoclonales contra las células B, rituximab (Rituxan), bloqueadores de coestimulación de células T, abatacept (Orencia), bloqueadores de interleucina 6 (IL-6), tocilizumab, RoActemra y Actemra.
En una realización, el DMARD no es un anticuerpo.
En una realización, la administración de una composición descrita en el presente documento a un paciente que la necesita da como resultado una mejora en al menos uno de los siguientes: (i) puntuaciones mejoradas de DAS-28, (ii) puntuaciones mejoradas de EULAR, (iii ) puntuaciones mejoradas de LDAS, (iv) puntuaciones mejoradas de ACR, (v) un aumento en albúmina en suero, (vi) una disminución en CRP, (vii) mejora en una o más puntuaciones del dominio SF-36, (viii) una mejora en la puntuación de SF-6D, en la que dicha eficacia se mide con relación a la línea de base de dicho paciente antes de la administración de dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo, con respecto a los pacientes no tratados, con respecto a los pacientes que reciben una formulación de control o placebo, o con respecto a las normas de edad/género.
En una realización, la administración de una composición descrita en el presente documento a un paciente que la necesita da como resultado una mejora prolongada de la enfermedad (observada al menos 4, 6, 8, 10, 12, 14 o 16 semanas después de la administración de anticuerpos) como se manifiesta por al menos uno de los siguientes: (i) puntuaciones mejoradas de DAS-28, (ii) puntuaciones mejoradas de EULAR, (iii) puntuaciones mejoradas de LDAS (iv) puntuaciones mejoradas de ACR, (v) un aumento en la albúmina en suero, (vi) una disminución en CRP, (vii) una mejora en una o más puntuaciones del dominio SF-36, (viii) una mejora en la puntuación de SF-6D, en la que dicha eficacia se mide con respecto al valor inicial de dicho paciente antes de la administración de dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo, con respecto a pacientes no tratados, con respecto a pacientes que recibieron una formulación de control o placebo, o con respecto a las normas de edad/género.
En una realización adicional, la mejora en la puntuación de SF-6D es al menos igual a la diferencia mínima importante (MID) con respecto al SF-6D del paciente antes de dicha administración.
En una realización adicional, la mejora en la puntuación de SF-6D es al menos dos veces la MID con respecto al SF-6D del paciente antes de dicha administración.
En una realización adicional, la mejora en la puntuación de SF-6D es al menos tres veces la MID con respecto al SF-6D del paciente antes de dicha administración.
En otra realización, la mejora en SF-36 puede comprender una mejora en la puntuación del dominio de desempeño físico, siendo dicha mejora al menos igual a la diferencia mínima clínicamente importante (MCID), al menos 2 veces la MCID, al menos 3 veces la MCID, al menos 4 veces la MCID, al menos 5 veces la MCID, o al menos 6 veces la MCID para esa puntuación de dominio.
En otra realización, la mejora en SF-36 puede comprender una mejora en la puntuación del dominio físico del rol, siendo dicha mejora al menos igual a la MCID, al menos 2 veces la MCID, al menos 3 veces la MCID, al menos 4 veces la MCID, al menos 5 veces la MCID o al menos 6 veces la MCID para esa puntuación de dominio.
En otra realización, la mejora en SF-36 puede comprender una mejora en la puntuación del dominio del dolor corporal, siendo dicha mejora al menos igual a la MCID, al menos 2 veces la MCID, al menos 3 veces la MCID, al menos 4 veces la MCID, al menos 5 veces la MCID o al menos 6 veces la MCID para esa puntuación de dominio.
En otra realización, la mejora en SF-36 puede comprender una mejora en la puntuación del dominio de salud general, siendo dicha mejora al menos igual a la MCID, al menos 2 veces la MCID, al menos 3 veces la MCID, al menos 4 veces la MCID, al menos 5 veces la MCID o al menos 6 veces la MCID para esa puntuación de dominio.
En otra realización, la mejora en SF-36 puede comprender una mejora en la puntuación del dominio emocional del rol, siendo dicha mejora al menos igual a la MCID, al menos 2 veces la MCID, al menos 3 veces la MCID, al menos 4 veces la MCID, al menos 5 veces la MCID o al menos 6 veces la MCID para esa puntuación de dominio.
En otra realización, la mejora en SF-36 puede comprender una mejora en la puntuación del dominio de vitalidad, siendo dicha mejora al menos igual a la MCID, al menos 2 veces la MCID, al menos 3 veces la MCID, al menos 4 veces la MCID, al menos 5 veces la MCID, o al menos 6 veces la MCID para esa puntuación de dominio.
En otra realización, la mejora en SF-36 puede comprender una mejora en la puntuación del dominio de desempeño social, siendo dicha mejora al menos igual a la MCID, al menos 2 veces la MCID, al menos 3 veces la MCID, al menos 4 veces la MCID, al menos 5 veces la MCID o al menos 6 veces la MCID para esa puntuación de dominio.
En otra realización, la mejora en SF-36 puede comprender una mejora en la puntuación del dominio de salud mental, siendo dicha mejora al menos igual a la MCID, al menos 2 veces la MCID, al menos 3 veces la MCID, al menos 4 veces la MCID, al menos 5 veces la MCID o al menos 6 veces la MCID para esa puntuación de dominio.
En una realización, existe una composición para usar en un procedimiento de tratamiento o prevención de la mucositis oral asociada con radioterapia, comprendiendo el procedimiento administrar una composición que comprende 160 mg de un anticuerpo Ab1 o un fragmento de anticuerpo del mismo de acuerdo con las reivindicaciones, en el que dicho paciente no desarrolla una mucositis oral más grave que un grado 3 de acuerdo con la escala de mucositis oral de la OMS. En otra realización, el paciente puede estar sometido a quimioterapia. En otra realización, el paciente puede estar sometido a radioterapia. En otra realización, el paciente tiene cáncer de cabeza y cuello. En otra realización, es posible que el paciente no desarrolle mucositis oral más graves que las de Grado 2, 1 o 0.
Breve descripción de las diversas vistas de los dibujos
La Figura 1 representa alineaciones de secuencias ligeras variables y pesadas variables entre secuencias ligeras variables y pesadas variables de un anticuerpo de conejo y secuencias humanas homólogas y secuencias humanizadas. Las regiones del marco se identifican como FR1-FR4. Las regiones determinantes de complementariedad se identifican como CDR1-CDR3. Los residuos de aminoácidos se numeran como se muestra. Las secuencias iniciales de conejo se denominan RbtVL y RbtVH para las secuencias ligeras variables y pesadas variables, respectivamente. Tres de las secuencias de anticuerpos de la línea germinal humana más similares, que abarcan desde el Marco 1 hasta el final del Marco 3, están alineadas debajo de las secuencias de conejo. Primero se muestra la secuencia humana que se considera más similar a la secuencia del conejo. En este ejemplo, las secuencias más similares son L12A para la cadena ligera y 3-64-04 para la cadena pesada. No se muestran las secuencias de CDR3 humanas. La secuencia del Marco 4 humano más cercana está alineada debajo de la secuencia del Marco 4 del conejo. Los guiones verticales indican un residuo en el que el residuo de conejo es idéntico con al menos uno de los residuos humanos en la misma posición. Los residuos en negrita indican que el residuo humano en esa posición es idéntico al residuo de conejo en la misma posición. Las secuencias humanizadas finales se denominan VLh y VHh para las secuencias ligeras variables y pesadas variables, respectivamente. Los residuos subrayados indican que el residuo es el mismo que el residuo de conejo en esa posición pero diferente de los residuos humanos en esa posición en las tres secuencias humanas alineadas. Las Figuras 2 y 3 representan alineaciones entre secuencias ligeras y pesadas variables de un anticuerpo de conejo y secuencias humanas homólogas y las secuencias humanizadas. Las regiones marco se identifican como FR1-FR4. Las regiones determinantes de complementariedad se identifican como CDR1-CDR3.
Las Figuras 4A-B y 5A-B representan alineaciones entre secuencias ligeras y pesadas variables, respectivamente, de diferentes formas de Ab1. Las regiones marco se identifican como FR1-FR4. Las regiones determinantes de complementariedad se identifican como CDR1-CDR3. Se destacaron las diferencias de secuencia dentro de las regiones CDR.
La Figura 6 proporciona la curva de respuesta a la dosis de a-2-macroglobulina (A2M) para el anticuerpo Ab1 administrado por vía intravenosa a diferentes dosis una hora después de una dosis de 100 pg/kg sc de IL-6 humana. Véase también el documento WO 2011/066371.
La Figura 7 proporciona datos de supervivencia para los grupos de progresión del anticuerpo Ab1 frente a los grupos de control. Véase también el documento WO 2011/066371.
La Figura 8 proporciona datos de supervivencia adicionales para los grupos de regresión del anticuerpo Ab1 frente a los grupos de control. Véase también el documento WO 2011/066371.
La Figura 9 proporciona datos de supervivencia para IgG humana policlonal a razón de 10 mg/kg iv cada tres días (tamaño del tumor 270-320 mg) frente al anticuerpo Ab1 a razón de 10 mg/kg iv cada tres días (tamaño del tumor 270-320 mg). Véase también el documento WO 2011/066371.
La Figura 10 proporciona datos de supervivencia para IgG humana policlonal a razón de 10 mg/kg iv cada tres días (tamaño del tumor 400-527 mg) frente al anticuerpo Ab1 a razón de 10 mg/kg iv cada tres días (tamaño del tumor 400-527 mg). Véase también el documento WO 2011/066371.
La Figura 11 muestra un aumento de la concentración de hemoglobina después de la administración de Ab1 a pacientes con cáncer avanzado. Véase también el documento WO 2011/066371.
La Figura 12 representa las concentraciones medias de lípidos en plasma tras la administración de Ab1 a pacientes con cáncer avanzado. Véase también el documento WO 2011/066371.
La Figura 13 representa los recuentos medios de neutrófilos tras la administración de Ab1 a pacientes con cáncer avanzado. Véase también el documento WO 2011/066371.
La Figura 14A demuestra la supresión de los niveles de CRP en suero en individuos sanos.
La Figura 14B demuestra la supresión de los niveles de CRP en suero en pacientes con cáncer avanzado.
La Figura 15A representa los valores medios de CRP para cada concentración de dosificación (placebo, 80 mg, 160 mg y 320 mg) del anticuerpo monoclonal Ab1 en pacientes con NSCLC.
La Figura 15B representa el cambio en los valores medios de CRP de cada grupo de concentración de dosis correspondiente a la Figura 15A en pacientes con NSCLC.
La Figura 16 representa la concentración media en plasma de CRP en pacientes con cáncer avanzado después de una sola administración infusión intravenosa de 80, 160 o 320 mg de Ab1 (ALD518) (n = 8).
La Figura 17 representa los niveles medios de CRP en suero en pacientes con artritis reumatoide con una respuesta inadecuada al metotrexato después de una dosificación de 80, 160 o 320 mg de Ab1 (ALD518).
La Figura 18A representa que Ab1 aumenta la concentración media de hemoglobina (g/dl) a 80, 160 y 320 mg después de 12 semanas de dosificación en pacientes con NSCLC frente a placebo. Véase también el documento WO 2011/066371.
La Figura 18B representa el cambio medio desde el valor inicial en la concentración de hemoglobina (g/dl) para pacientes con NSCLC frente a placebo. Véase también el documento WO 2011/066371.
La Figura 18C representa la concentración media de hemoglobina (g/dl) en pacientes con NSCLC con un valor inicial de hemoglobina por debajo de 11 g/l del valor inicial frente al tiempo con Ab1 en comparación con placebo. La Figura 19 representa el cambio medio desde el valor inicial de concentración de hemoglobina (g/dl) para pacientes con artritis reumatoide con una respuesta inadecuada al metotrexato frente a placebo. El intervalo normal de concentración de hemoglobina es de aproximadamente 11,5-15,5 g/dl. Véase también el documento WO 2011/066371.
La Figura 20A representa que Ab1 aumenta la concentración media de albúmina a 80, 160 y 320 mg en pacientes con NSCLC. Véase también el documento WO 2011/066371.
La Figura 20B representa el cambio desde el valor inicial de la concentración media de albúmina de cada grupo de concentración de dosis correspondiente a la Figura 20A en pacientes con NSCLC. Véase también el documento WO 2011/066371.
La Figura 20C representa la concentración media de albúmina en pacientes con NSCLC con un valor inicial de albúmina de < 35 g/l del valor inicial frente al tiempo para Ab1 frente a placebo. Véase también el documento WO 2011/066371.
La Figura 21A representa la concentración de niveles medios de CRP en plasma después de la dosificación subcutánea o intravenosa de Ab1 humanizado.
La Figura 21B representa la concentración de niveles medios de CRP en plasma después de la dosificación subcutánea o intravenosa de Ab1 humanizado a una dosificación de 50 mg o 100 mg durante 12 semanas. La Figura 22 representa el porcentaje de ratones ulcerados en cualquier momento después de una dosis única de radiación.
La Figura 23 representa la mediana del volumen tumoral a lo largo del tiempo.
La Figura 24 representa el porcentaje de ratones sin ulceraciones frente a ulceraciones el día 10.
La Figura 25 muestra la mediana del número de días ulcerados después de una dosis única de radiación.
La Figura 26 representa la disposición del paciente en un ensayo clínico de Fase II para la administración de ALD518 a pacientes con artritis reumatoide activa (RA). Un asterisco indica que un paciente no recibió tratamiento en forma aleatoria (el paciente se seleccionó para recibir en forma aleatoria para recibir 160 mg de ALD518, pero recibió 320 mg el día 1 y 160 mg de ALD518 en la semana 8; EA = evento adverso.
La Figura 27 ilustra gráficamente los cambios medios en las puntuaciones compuestas del SF-36 en la semana 12 en un ensayo clínico de fase II para la administración de ALD518 a pacientes con RA activa. Los datos son la media y las barras de error representan intervalos de confianza del 95% (para cada grupo, la barra izquierda muestra la puntuación PCS y la barra derecha muestra la puntuación MCS). Los cambios medios en las puntuaciones PCS y MCS en la semana 12 excedieron la MCID en todos los grupos de tratamiento con ALD-518. En la semana 12 se demostraron mayores mejoras en la puntuación MCS a favor de todos los grupos de tratamiento con ALD-518 (p <0,05). Los cambios en las puntuaciones MCS también excedieron las puntuaciones PCS en todos los grupos de tratamiento con ALD518. SF-36 = Encuesta de salud de formato corto-36; PCS = puntuación del componente físico; MCS = puntuación del componente mental; MCID = diferencia mínima clínicamente importante.
La Figura 28A-D presenta diagramas de araña que resumen los cambios desde el valor inicial hasta la semana 12 en las puntuaciones del dominio SF-36 en comparación con las normas emparejadas por edad/sexo para un ensayo clínico de fase II para la administración de ALD518 a pacientes con rA activa. Los diagramas de araña resumen las normas de edad/género, las puntuaciones promedio del valor inicial antes del tratamiento y las puntuaciones promedio después del tratamiento en cada uno de los ocho dominios evaluados para los pacientes que recibieron 80 mg (panel A), 160 mg (panel B) o 320 mg (panel C) de ALD-518 o placebo (panel D). PF = función física; RP = rol físico; BP = dolor corporal; GH = salud general; VT = vitalidad; SF = desempeño social; RE = rol emocional; MH = salud mental; SF-36 = Formato corto-36.
La Figura 29A-B presenta diagramas de araña que resumen los cambios desde el inicio hasta las semanas 12 (A) y 16 (B) en las puntuaciones del dominio SF-36 en comparación con las normas emparejadas por edad/sexo para un ensayo clínico de fase II para la administración de ALD518 a pacientes con RA activa. Los diagramas de araña resumen las puntuaciones en ocho dominios probados para las normas de edad/género, puntuaciones promedio de inicio combinadas antes del tratamiento y puntuaciones promedio después del tratamiento para cada grupo de tratamiento (dosis de ALD518 de 80 mg, 160 mg o 320 mg) y grupo placebo. Las abreviaturas son como en la Figura 28.
La Figura 30 muestra el grado de mucositis oral de la OMS frente a IMRT acumulativa (Gy): ALD518 160 mg intravenoso en la semana 0 y la semana 4 para tres pacientes.
Descripción detallada de realizaciones preferidas
La invención es como se define en las reivindicaciones.
Definiciones
Debe entenderse que esta invención no se limita a la metodología, protocolos, líneas celulares, especies o géneros animales y reactivos particulares descritos, ya que estos pueden variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en este documento tiene el propósito de describir únicamente realizaciones particulares y no pretende limitar el alcance de la presente invención, que estará limitada únicamente por las reivindicaciones adjuntas.
Como se usa en el presente documento, las formas singulares "un", "uno, una" y "el, la" incluyen referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a "una célula" incluye una pluralidad de tales células y la referencia a "la proteína" incluye la referencia a una o más proteínas y equivalentes de las mismas conocidas por los expertos en la técnica, etc. Todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por un experto en la técnica a la que pertenece esta invención, a menos que se indique claramente lo contrario.
Amplificación, como se usa en el presente documento, se refiere en términos generales a la amplificación de secuencias de polinucleótidos y es la producción in vitro de múltiples copias de una secuencia de ácido nucleico particular. La secuencia amplificada suele estar en forma de ADN. Se conocen en la técnica una variedad de tecnologías para llevar a cabo tal amplificación. Véase, por ejemplo, Van Brunt (1990) Bio/Technol. 8 (4): 291-294. La reacción en cadena de la polimerasa o PCR es un prototipo de amplificación de ácido nucleico, y el uso de la PCR en el presente documento debe considerarse un ejemplo de otras técnicas de amplificación adecuadas.
Anticuerpo, como se usa en el presente documento, se refiere en términos generales a cualquier estructura molecular que contiene una cadena polipeptídica con una forma específica que se ajusta y reconoce un epítopo, en la que al menos una interacción de unión no covalente estabiliza el complejo entre la estructura molecular y el epítopo. La molécula de anticuerpo arquetípica es la inmunoglobulina, y todos los tipos de inmunoglobulinas, IgG, IgM, IgA, IgE, IgD, de todas las fuentes, por ejemplo, humana, de roedor, conejo, vaca, oveja, cerdo, perro, pollo, se consideran "anticuerpos". Los anticuerpos incluyen, pero sin limitarse a anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanos y otros anticuerpos de mamíferos no humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos monocatenarios scFv, cuerpos de camello, nanocuerpos, IgNAR (anticuerpos monocatenarios derivados de tiburones), inmunofarmacéuticos modulares pequeños (SMIP) y fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, Fab, Fab', F(ab')2). Se han descrito numerosas secuencias codificantes de anticuerpos; y otros pueden plantearse mediante procedimientos bien conocidos en la técnica. Véase Streltsov, et al., (2005) Protein Sci. 14(11): 2901-9; Greenberg, et al. (1995) Nature 374(6518): 168­ 173; Nuttall, et al. (2001) Mol Immunol. 38(4): 313-26; Hamers-Casterman, et al. (1993) Nature 363(6428): 446-8; Gill, et al. (2006) Curr Opin Biotechnol. 17(6): 653-8.
Fragmento de anticuerpo, como se usa en este documento, se refiere en términos generales a un fragmento de un anticuerpo que reconoce un antígeno (por ejemplo, parátopos, fragmento de unión a antígeno). El fragmento de anticuerpo puede comprender un parátopo que puede ser una región pequeña (por ejemplo, 15-22 aminoácidos) de la región Fv del anticuerpo y puede contener partes de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo. Véase Goldsby, et al. Antigens (Capítulo 3) Immunology (5a Ed.) Nueva York: W.H. Freeman and Company, páginas 57-75.
Proteína C reactiva (CRP), como se usa en este documento, se refiere en términos generales a una proteína de 224 aminoácidos que se encuentra en la sangre y que aumenta en respuesta a la inflamación [(por ejemplo, GenBank acceso a la proteína No. NP_000558 (SEQ ID NO: 726)]. La CRP también abarca cualquier forma pre-pro, pro y madura de esta secuencia de aminoácidos de CRP, así como mutantes y variantes, incluidas las variantes alélicas de esta secuencia. Los niveles de CRP, por ejemplo, en el suero, el hígado o en cualquier otra parte del cuerpo, se pueden medir fácilmente usando procedimientos de rutina y reactivos disponibles comercialmente, por ejemplo, ELISA, tira reactiva de anticuerpos, inmunoturbidimetría, inmunodifusión rápida, aglutinación visual, transferencia Western, transferencia Northern. Como se mencionó anteriormente, los niveles de CRP pueden además medirse en pacientes que tienen o están en riesgo de desarrollar trombosis de acuerdo con la invención.
Secuencia de codificación, como se usa en el presente documento, se refiere en términos generales a una secuencia en marco de codones que (en vista del código genético) corresponde o codifica una secuencia de proteína o péptido. Dos secuencias codificantes se corresponden entre sí si las secuencias o sus secuencias complementarias codifican las mismas secuencias de aminoácidos. Una secuencia de codificación en asociación con secuencias reguladoras apropiadas puede transcribirse y traducirse en un polipéptido. Una señal de poliadenilación y una secuencia de terminación de la transcripción normalmente se ubicarán en 3' con respecto a la secuencia de codificación. Una "secuencia promotora" es una región reguladora de ADN capaz de unirse a la ARN polimerasa en una célula e iniciar la transcripción de una secuencia de codificación secuencia abajo (dirección 3'). Las secuencias promotoras contienen típicamente sitios adicionales para la unión de moléculas reguladoras (por ejemplo, factores de transcripción) que afectan la transcripción de la secuencia de codificación. Una secuencia de codificación está "bajo el control" de la secuencia promotora u "operativamente enlazada" al promotor cuando la ARN polimerasa se une a la secuencia promotora en una célula y transcribe la secuencia de codificación en ARNm, que luego se traduce a la proteína codificada por la secuencia de codificación. Una secuencia de polinucleótidos "corresponde" a una secuencia polipeptídicas si la traducción de la secuencia de polinucleótidos de acuerdo con el código genético produce la secuencia polipeptídicas (es decir, la secuencia de polinucleótidos "codifica" la secuencia polipeptídicas), una secuencia de polinucleótidos "corresponde" a otra secuencia de polinucleótidos si las dos secuencias codifican la misma secuencia polipeptídica.
Región determinante de complementariedad, región hipervariable o CDR, como se usa en este documento se refiere en términos generales a al menos una de las regiones determinantes de complementariedad o hipervariable (CDR) que se encuentran en las regiones variables de cadenas ligeras o pesadas de un anticuerpo (Véase Kabat, EA et al. (1987) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, Md.). Estas expresiones incluyen las regiones hipervariables definidas por Kabat et al. ("Sequences of Proteins of Immunological Interest", Kabat E., et al. (1983) Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos) o los bucles hipervariables en estructuras tridimensionales de anticuerpos. Chothia y Lesk (1987) J Mol. Biol. 196: 901-917. Las CDR de cada cadena se mantienen en estrecha proximidad mediante regiones marco y, con las CDR de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión al antígeno. Dentro de las CDR hay aminoácidos seleccionados que se han descrito como las regiones determinantes de selectividad (SDR) que representan los residuos de contacto críticos utilizados por las CDR en la interacción anticuerpo-antígeno (Kashmiri (2005) Methods 36: 25-34). En el presente documento se proporcionan ejemplos de las CDR para anticuerpos anti-IL-6.
Enfermedad o afección, como se usa en el presente documento, se refiere en términos generales a una enfermedad o afección que se le ha diagnosticado a un paciente o se sospecha que tiene, particularmente una enfermedad o afección asociada con IL-6 elevada. Una enfermedad o afección abarca, sin limitación a la misma, mucositis, así como afecciones idiopáticas caracterizadas por síntomas que incluyen IL-6 elevada.
Cantidad eficaz, como se usa en el presente documento, se refiere en general a una cantidad de un ingrediente activo que es eficaz para aliviar o reducir hasta cierto punto al menos uno de los síntomas de la enfermedad que necesita tratamiento, o para retrasar el inicio de marcadores clínicos o síntomas de una enfermedad que necesita prevención, cuando se administra el compuesto. Por lo tanto, una cantidad eficaz se refiere a una cantidad del ingrediente activo que exhibe efectos tales como (i) revertir la velocidad del progreso de una enfermedad; (ii) inhibir hasta cierto punto el avance de la enfermedad; y/o (iii) aliviar en cierta medida (o, preferiblemente, eliminar) al menos uno de los síntomas asociados con la enfermedad. La cantidad eficaz puede determinarse empíricamente experimentando con los compuestos en cuestión en sistemas de modelos in vivo e in vitro conocidos para una enfermedad que necesita tratamiento. El contexto en el que se usa la frase "cantidad eficaz" puede indicar un efecto deseado particular. Por ejemplo, "una cantidad de un anticuerpo anti-IL-6 eficaz para prevenir o tratar un estado de hipercoagulabilidad" y frases similares se refieren a una cantidad de anticuerpo anti-IL-6 que, cuando se administra a un sujeto, provocará una mejora medible en el perfil de coagulación del sujeto, o prevenir, ralentizar, retrasar o detener un empeoramiento del perfil de coagulación por el que el sujeto está en riesgo. De manera similar, "una cantidad de un anticuerpo anti-IL-6 eficaz para reducir los niveles de CRP en suero" y frases similares se refieren a una cantidad de anticuerpo anti-IL-6 que, cuando se administra a un sujeto, provocará una disminución medible en los niveles de CRP en suero, o prevenir, ralentizar, retrasar o detener, un aumento en los niveles de CRP en suero para los que el sujeto está en riesgo. De manera similar, "una cantidad de un anticuerpo anti-IL-6 eficaz para aumentar los niveles de albúmina en suero" y frases similares se refieren a una cantidad de anticuerpo anti-IL-6 que, cuando se administra a un sujeto, provocará un aumento medible en los niveles de albúmina en suero, o prevenir, ralentizar, retrasar o detener, una disminución en los niveles de albúmina en suero para los que el sujeto está en riesgo. De manera similar, "una cantidad de un anticuerpo anti-IL-6 eficaz para reducir la debilidad" y frases similares se refieren a una cantidad de anticuerpo anti-IL-6 que, cuando se administra a un sujeto, provocará una disminución medible de la debilidad de acuerdo con lo determinado por la prueba de fuerza de agarre manual. De manera similar, "una cantidad de un anticuerpo anti-IL-6 eficaz para aumentar el peso" y frases similares se refieren a una cantidad de anticuerpo anti-IL-6 que, cuando se administra a un sujeto, provocará un aumento medible en el peso del paciente. Una cantidad eficaz variará de acuerdo con el peso, el sexo, la edad y el historial médico del individuo, así como la gravedad de la afección o afecciones del paciente, el tipo de enfermedad o enfermedades, modo de administración y similares. Una cantidad eficaz se puede determinar fácilmente usando experimentación de rutina, por ejemplo, mediante titulación (administración de dosis crecientes hasta que se encuentre una dosis eficaz) y/o por referencia a cantidades que fueron eficaces para pacientes anteriores. Generalmente, los anticuerpos anti-IL-6 de la presente invención se administrarán en dosis que oscilan entre aproximadamente 0,1 mg/kg y aproximadamente 20 mg/kg del peso corporal del paciente.
Vector de expresión, como se usa en este documento, se refiere en términos generales a un vector de ADN que contiene elementos que facilitan la manipulación para la expresión de una proteína extraña dentro de la célula huésped diana. Convenientemente, la manipulación de secuencias y la producción de ADN para la transformación se realiza primero en un huésped bacteriano (por ejemplo, E. coli) y normalmente los vectores incluirán secuencias para facilitar tales manipulaciones, incluido un origen bacteriano de replicación y un marcador de selección bacteriano apropiado. Los marcadores de selección codifican proteínas necesarias para la supervivencia o el crecimiento de células huésped transformadas cultivadas en un medio de cultivo selectivo. Las células huésped no transformadas con el vector que contiene el gen de selección no sobrevivirán en el medio de cultivo. Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, (b) complementan las deficiencias auxotróficas o (c) suministran nutrientes críticos que no están disponibles en medios complejos. Los ejemplos de vectores y procedimientos para la transformación de levadura se describen, por ejemplo, en Burke, Dawson y Stearns (2000) Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Plegamiento, como se usa en este documento, se refiere en términos generales a la estructura tridimensional de polipéptidos y proteínas, en la que las interacciones entre los residuos de aminoácidos actúan para estabilizar la estructura. Aunque las interacciones no covalentes son importantes para determinar la estructura, normalmente las proteínas de interés tendrán enlaces disulfuro covalentes intra y/o intermoleculares formados por dos residuos de cisteína. Para proteínas y polipéptidos de origen natural o derivados y variantes de los mismos, el plegamiento apropiado es típicamente la disposición que da como resultado una actividad biológica óptima, y puede controlarse convenientemente mediante ensayos de actividad, por ejemplo, unión a ligando, actividad enzimática.
Región marco o FR, como se usa en este documento, se refiere en términos generales a al menos una de las regiones marco dentro de las regiones variables de las cadenas ligera y pesada de un anticuerpo. Véase Kabat, et al. (1987) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD., Estas expresiones incluyen aquellas regiones de secuencia de aminoácidos interpuestas entre las CDR dentro de las regiones variables de las cadenas ligera y pesada de un anticuerpo. Como se menciona en las realizaciones preferidas, las FR pueden comprender FR humanas altamente homólogas al anticuerpo parental (por ejemplo, anticuerpo de conejo).
Puntuación de pronóstico de Glasgow (GPS), como se usa en este documento, se refiere en términos generales a una puntuación de pronóstico basada en la inflamación que otorga un punto por un nivel de albúmina en suero menor de 35 mg/l y un punto para un nivel de CRP superior a 10 mg/l. Por lo tanto, una GPS de 0 indica albúmina y CRP normales, una GPS de 1 indica albúmina reducida o CRP elevada, y una GPS de 2 indica albúmina reducida y CRP elevada.
gp130 (también llamada subunidad beta del receptor de interleucina-6), como se usa en este documento, se refiere en términos generales a una proteína transmembrana que forma una subunidad de receptores de citocina tipo I en la familia de receptores de IL-6 [(por ejemplo, secuencia precursora de 918 aminoácidos disponible en el Swiss-Prot Acceso de Proteína No. P40189 (SEQ ID NO: 728)]. gp130 también abarca cualquier forma pre-pro, pro y madura de esta secuencia de aminoácidos, como la forma madura codificada por los aminoácidos 23 a 918 de la secuencia mostrada, así como mutantes y variantes que incluyen variantes alélicas de esta secuencia.
Región heteróloga o dominio de un constructo de ADN, como se usa en este documento, se refiere en términos generales a un segmento identificable de ADN dentro de una molécula de ADN más grande que no se encuentra en asociación con la molécula más grande en la naturaleza. Por lo tanto, cuando la región heteróloga codifica un gen de mamífero, el gen estará normalmente flanqueado por ADN que no flanquea el ADN genómico de mamífero en el genoma del organismo fuente. Otro ejemplo de una región heteróloga es un constructo en el que la secuencia de codificación en sí no se encuentra en la naturaleza (por ejemplo, un ADNc en el que la secuencia de codificación genómica contiene intrones o secuencias sintéticas que tienen codones diferentes al gen nativo). Las variaciones alélicas o los eventos mutacionales que ocurren naturalmente no dan lugar a una región heteróloga de ADN como se define en el presente documento.
Homología, como se usa en el presente documento, se refiere en términos generales a un grado de similitud entre una secuencia de ácido nucleico y una secuencia de ácido nucleico de referencia o entre una secuencia polipeptídica y una secuencia polipeptídica de referencia. La homología puede ser parcial o completa. La homología completa indica que el ácido nucleico o las secuencias de aminoácidos son idénticas. Una secuencia de aminoácidos o ácidos nucleicos parcialmente homóloga es una que no es idéntica a la secuencia de aminoácidos o ácidos nucleicos de referencia. El grado de homología se puede determinar mediante comparación de secuencias. El término "identidad de secuencia" puede usarse indistintamente con "homología".
Célula huésped, como se usa en el presente documento, se refiere en términos generales a una célula que contiene un vector de expresión y apoya la replicación o expresión del vector de expresión. Las células huésped pueden ser células procariotas tales como E. coli, o células eucariotas tales como células de levadura, insectos (por ejemplo, SF9), anfibios o mamíferos tales como CHO, HeLa, HEK-293 (por ejemplo, células cultivadas, explantes y células in vivo.)
Aislado, como se usa en el presente documento, se refiere en términos generales al material removido de su entorno original en el que se encuentra de forma natural y, por lo tanto, es alterado por la mano del hombre de su entorno natural. El material aislado puede ser, por ejemplo, ácido nucleico exógeno incluido en un sistema de vector, ácido nucleico exógeno contenido dentro de una célula huésped o cualquier material que haya sido removido de su entorno original y, por lo tanto, alterado por la mano del hombre (por ejemplo, "anticuerpo aislado").
Mejorado, como se usa en el presente documento, se refiere en general a cualquier cambio beneficioso resultante de un tratamiento. Un cambio beneficioso es cualquier forma en la que la condición de un paciente es mejor de lo que hubiera sido sin el tratamiento. "Mejorado" incluye la prevención de una afección no deseada, ralentizar la velocidad a la que empeora una afección, retrasar el desarrollo de una afección no deseada y restablecer una condición esencialmente normal. Por ejemplo, la mejora de la mucositis abarca cualquier disminución del dolor, hinchazón, rigidez o inflamación de las articulaciones y/o aumento de la movilidad de las articulaciones.
Antagonista de IL-6, como se usa en este documento, se refiere en términos generales a cualquier composición que previene, inhibe o disminuye el efecto o efectos de la señalización de IL-6. Generalmente, tales antagonistas pueden reducir los niveles o actividad de IL-6, receptor alfa de IL-6, gp130 o una molécula involucrada en la transducción de señales de IL-6, o pueden reducir los niveles o complejos de actividad entre los anteriores (por ejemplo, reduciendo la actividad de un complejo IL-6/ receptor de IL-6). Los antagonistas incluyen ácidos nucleicos antisentido, que incluyen ADN, ARN o un análogo de ácido nucleico tal como un ácido nucleico peptídico, ácido nucleico bloqueado, morfolino (fosforodiamidato morfolino oligo), ácido nucleico de glicerol o ácido nucleico de treosa. Véase Heasman (2002) Dev Biol. 243 (2): 209-14; Hannon y Rossi (2004) Nature 431 (7006): 371-8; Paul et al., (2002) Nat Biotechnol. 20 (5): 505­ 8; Zhang et al., (2005) J Am Chem Soc. 127 (12): 4174-5; Wahlestedt et al., (2000) Proc Natl Acad Sci USA. 97 (10): 5633-8; Hanvey et al., (1992) Science 258 (5087): 1481-5; Braasch et al., (2002) Biochemistry 41 (14): 4503-10; Schoning, et al. (2000) Science 290 (5495): 1347-51. Además, los antagonistas de IL-6 incluyen específicamente péptidos que bloquean la señalización de IL-6 tales como los descritos en cualquiera de las patentes de los Estados Unidos Nos. 5.210.075; 6.172.042; 6.599.875; 6.841.533; y 6.838.433. Además, los antagonistas de IL-6 de acuerdo con la invención pueden incluir inhibidores de p38 MAP quinasa tales como los descritos en la solicitud de patente de los Estados Unidos No. 2007/0010529 dado el papel de esta quinasa en la producción de citocinas y más particularmente en la producción de IL-6. Además, los antagonistas de IL-6 de acuerdo con la invención incluyen los compuestos glicoalcaloides descritos en la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos No.
2005/0090453, así como otros compuestos antagonistas de IL-6 aislables usando los ensayos de cribado de antagonistas de IL-6 reportados allí. Otros antagonistas de IL-6 incluyen anticuerpos, tales como anticuerpos anti-IL-6, anticuerpos anti-receptor alfa de IL-6, anticuerpos anti-gp130 y anticuerpos anti-p38 MAP quinasa que incluyen (pero sin limitarse a) a los anticuerpos anti-IL-6 descritos en el presente documento, Actemra® (Tocilizumab), Remicade®, Zenapax® (daclizumab) o cualquier combinación de los mismos. Otros antagonistas de IL-6 incluyen porciones o fragmentos de moléculas implicadas en la señalización de IL-6, tales como IL-6, receptor alfa de IL-6 y gp130, que pueden ser de secuencia nativa, mutante o variante, y opcionalmente pueden acoplarse a otras fracciones (tales como fracciones que aumentan la semivida, por ejemplo, un dominio Fc). Por ejemplo, un antagonista de IL-6 puede ser un receptor o fragmento de IL-6 soluble, un receptor de IL-6 soluble:proteína de fusión Fc, un inhibidor de molécula pequeña de IL-6, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo del receptor anti-IL-6 o variante del mismo, ácido nucleico antisentido. Otros antagonistas de IL-6 incluyen avemirs, tal como C326 (Silverman, et al. (2005) Nat Biotechnol. 23 (12): 1556-61) y moléculas pequeñas, tales como el retinoide sintético AM80 (tamibaroteno) (Takeda, et al. (2006) Arterioscler Thromb Vasc Biol. 26 (5): 1177- 83). Dichos antagonistas de IL-6 pueden administrarse por cualquier medio conocido en la técnica, incluido el contacto de un sujeto con ácidos nucleicos que codifican o hacen que se exprese cualquiera de los polipéptidos o secuencias antisentido anteriores.
Interleucina-6 (IL-6), como se usa en este documento, se refiere en términos generales a la interleucina-6 (IL-6) que abarca no solo la siguiente secuencia de 212 aminoácidos disponible como GenBank Acceso de Proteína No. NP_000591 (por ejemplo, la SEQ ID NO : 1), sino también cualquier forma pre-pro, pro y madura de esta secuencia de aminoácidos de IL-6, así como mutantes y variantes que incluyen variantes alélicas de esta secuencia.
Receptor de interleucina-6 (IL-6R) (receptor alfa de IL-6 (IL-6RA) [CD126], como se usa en este documento, se refiere en términos generales a la proteína de 468 aminoácidos que se une a IL-6, una potente citocina pleiotrópica que regula el crecimiento y la diferenciación celular y también juega un papel importante en la respuesta inmune (por ejemplo, Swiss-Prot Acceso Proteína de No. P08887 y SEQ ID NO: 727). IL-6R también incluye cualquier forma pre-pro, pro y madura de esta secuencia de aminoácidos, así como mutantes y variantes que incluyen variantes alélicas de esta secuencia.
Mamífero, como se usa en este documento, se refiere en términos generales a todos y cada uno de los animales vertebrados de sangre caliente de la clase Mammalia, incluidos los humanos, caracterizados por una cubierta de pelo en la piel y, en las hembras, glándulas mamarias productoras de leche para nutrir a las crías. Los ejemplos de mamíferos incluyen, pero sin limitarse a alpacas, armadillos, capibaras, gatos, camellos, chimpancés, chinchillas, ganado, perros, cabras, gorilas, hámsteres, caballos, humanos, lémures, llamas, ratones, primates no humanos, cerdos, ratas, ovejas, musarañas, ardillas y tapires. Los mamíferos incluyen, pero sin limitarse a, especies bovinas, caninas, equinas, felinas, murinas, ovinas, porcinas, primates y roedores. Mamífero también incluye todos y cada uno de los enumerados en las especies de mamíferos del mundo mantenidos por el Museo Nacional de Historia Natural, Instituto Smithsoniano en Washington DC.
Meiosis, como se usa en el presente documento, se refiere en términos generales a un proceso mediante el cual una célula de levadura diploide experimenta una división reductora para formar cuatro productos de esporas haploides. Cada espora puede luego germinar y formar una línea celular haploide que crece vegetativamente.
Ácido nucleico o secuencia de ácido nucleico, como se usa en este documento, se refiere en términos generales a un oligonucleótido desoxirribonucleótido o ribonucleótido en forma monocatenaria o bicatenaria. El término abarca ácidos nucleicos, es decir, oligonucleótidos, que contienen análogos conocidos de nucleótidos naturales. El término también abarca estructuras de tipo ácido nucleico con estructuras sintéticas. A menos que se indique lo contrario, una secuencia de ácido nucleico particular también incluye implícitamente variantes modificadas de manera conservadora de la misma (por ejemplo, sustituciones de codones degenerados) y secuencias complementarias, así como la secuencia indicada explícitamente. El término ácido nucleico se usa indistintamente con gen, ADNc, ARNm, oligonucleótido y polinucleótido.
Operativamente enlazado, como se usa en el presente documento, se refiere en términos generales a cuando dos fragmentos de ADN se unen de manera que las secuencias de aminoácidos codificadas por los dos fragmentos de ADN permanecen en el marco.
Parátopo, como se usa en este documento, se refiere en términos generales a la parte de un anticuerpo que reconoce un antígeno (por ejemplo, el sitio de unión al antígeno de un anticuerpo). Los parátopos pueden ser una región pequeña (por ejemplo, 15-22 aminoácidos) de la región Fv del anticuerpo y puede contener partes de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo. Véase Goldsby, et al. Antigens (Capítulo 3) Immunology (5a Ed.) Nueva York: W.H. Freeman and Company, páginas 57-75.
Paciente, como se usa en el presente documento, se refiere en términos generales a cualquier animal que necesite tratamiento para aliviar un estado de enfermedad o para prevenir la aparición o reaparición de un estado de enfermedad. Además, "Paciente", como se usa en el presente documento, se refiere en términos generales a cualquier animal que tenga factores de riesgo, antecedentes de enfermedad, susceptibilidad, síntomas, signos, que haya sido diagnosticado previamente, esté en riesgo o sea miembro de una población de pacientes para una enfermedad. El paciente puede ser un paciente clínico tal como un ser humano o un paciente veterinario tal como un animal de compañía, domesticado, ganado, exótico o de zoológico. El término "sujeto" se puede usar de manera intercambiable con el término "paciente".
Levadura poliploide que expresa de manera estable o expresa un polipéptido heterólogo secretado deseado durante un tiempo prolongado, como se usa en el presente documento, se refiere en términos generales a un cultivo de levadura que secreta dicho polipéptido durante al menos varios días hasta una semana, más preferiblemente al menos un mes, aún más preferiblemente al menos aproximadamente 1-6 meses, e incluso más preferiblemente durante más de un año a niveles de umbral de expresión, típicamente al menos aproximadamente 10-25 mg/litro y preferiblemente sustancialmente mayor.
El cultivo de levadura poliploide que secreta cantidades deseadas de polipéptido recombinante, como se usa en este documento, se refiere en términos generales a cultivos que de manera estable o durante períodos prolongados secretan al menos aproximadamente 10-25 mg/litro de polipéptido heterólogo, más preferiblemente al menos aproximadamente 50-500 mg/litro, y lo más preferiblemente al menos aproximadamente 500-1000 mg/litro o más.
La reducción prolongada de la CRP en suero, y frases similares, como se usan en este documento, se refieren en términos generales a una disminución medible en el nivel de CRP en suero en relación con el nivel de CRP en suero inicial (es decir, el nivel de CRP en suero en un momento antes de que comience el tratamiento) que es detectable dentro de aproximadamente una semana desde que comienza un tratamiento (por ejemplo, la administración de un anticuerpo anti-IL-6) y permanece por debajo del nivel inicial de CRP en suero durante un período prolongado, por ejemplo, al menos aproximadamente 14 días, al menos aproximadamente 21 días, al menos aproximadamente 28 días, al menos aproximadamente 35 días, al menos aproximadamente 40 días, al menos aproximadamente 50 días, al menos aproximadamente 60 días, al menos aproximadamente 70 días, al menos aproximadamente 11 semanas, o al menos aproximadamente 12 semanas desde el inicio del tratamiento.
Promotor, como se usa en este documento, se refiere en términos generales a una matriz de secuencias de ácido nucleico que dirige la transcripción de un ácido nucleico. Como se usa en el presente documento, un promotor incluye las secuencias de ácido nucleico necesarias cerca del sitio de inicio de la transcripción, tal como, en el caso de un promotor de tipo polimerasa II, un elemento TATA. Un promotor también incluye opcionalmente elementos potenciadores o represores distales, que pueden ubicarse hasta varios miles de pares de bases desde el sitio de inicio de la transcripción. Un promotor "constitutivo" es un promotor que está activo en la mayoría de las condiciones ambientales y de desarrollo. Un promotor "inducible" es un promotor que está activo bajo la regulación ambiental o del desarrollo.
Cantidad profilácticamente eficaz, como se usa en este documento, se refiere en términos generales a la cantidad de un compuesto que, cuando se administra a un paciente para la profilaxis de una enfermedad o para la prevención de la reaparición de una enfermedad, es suficiente para efectuar dicha profilaxis para la enfermedad o reincidencia. La cantidad profilácticamente eficaz puede ser una cantidad eficaz para prevenir la incidencia de signos y/o síntomas. La "cantidad profilácticamente eficaz" puede variar dependiendo de la enfermedad y su gravedad y la edad, peso, historial médico, predisposición a condiciones, condiciones preexistentes, del paciente a ser tratado.
Profilaxis, como se usa en este documento, se refiere en términos generales a un curso de terapia en el que los signos y/o síntomas no están presentes en el paciente, están en remisión o estaban presentes previamente en un paciente. La profilaxis incluye prevenir la aparición de enfermedades posteriores al tratamiento de una enfermedad en un paciente. Además, la prevención incluye el tratamiento de pacientes que potencialmente pueden desarrollar la enfermedad, especialmente pacientes que son susceptibles a la enfermedad (por ejemplo, miembros de una población de pacientes, aquellos con factores de riesgo o en riesgo de desarrollar la enfermedad).
Recombinante como se usa en este documento, se refiere en términos generales con referencia a un producto, por ejemplo, a una célula, o ácido nucleico, proteína o vector, indica que la célula, ácido nucleico, proteína o vector, ha sido modificado por la introducción de un ácido nucleico o proteína heterólogo o la alteración de un ácido nucleico o proteína nativa, o que la célula se deriva de una célula así modificada. Por lo tanto, por ejemplo, las células recombinantes expresan genes que no se encuentran dentro de la forma nativa (no recombinante) de la célula o expresan genes nativos que de otra manera se expresan anormalmente, subexpresan o no expresan en absoluto.
Marcador seleccionable, como se usa en el presente documento, se refiere en términos generales a un marcador seleccionable que es un gen o fragmento de gen que confiere un fenotipo de crecimiento (característica de crecimiento físico) a una célula que recibe ese gen como, por ejemplo, a través de un evento de transformación. El marcador seleccionable permite que esa célula sobreviva y crezca en un medio de crecimiento selectivo en condiciones en las que las células que no reciben ese gen marcador seleccionable no pueden crecer. Los genes marcadores seleccionables generalmente se dividen en varios tipos, incluidos los genes marcadores seleccionables positivos tales como un gen que confiere a una célula resistencia a un antibiótico u otro fármaco, temperatura cuando se cruzan dos mutantes ts o se transforma un mutante ts; genes marcadores seleccionables negativos, tales como un gen biosintético que confiere a una célula la capacidad de crecer en un medio sin un nutriente específico que necesitan todas las células que no tienen ese gen biosintético, o un gen biosintético mutagenizado que confiere a una célula la incapacidad de crecer por células que no tienen el gen de tipo silvestre; y similares. Los marcadores adecuados incluyen pero sin limitarse a ZEOMYCIN® (zeocina), neomicina, G418, LYS3, MET1, MET3a, ADE1, ADE3 y URA3.
Específicamente (o selectivamente) se une a un anticuerpo o "específicamente (o selectivamente) inmunorreactivo con" o "específicamente interactúa o se une", como se usa en este documento, se refiere en términos generales a una proteína o péptido (u otro epítopo), se refiere, en algunas realizaciones, a una reacción de unión que es determinante de la presencia de la proteína en una población heterogénea de proteínas y otros productos biológicos. Por ejemplo, en condiciones de inmunoensayo designadas, los anticuerpos especificados se unen a una proteína particular al menos dos veces más que el fondo (señal no específica) y no se unen sustancialmente en una cantidad significativa a otras proteínas presentes en la muestra. Normalmente, una reacción específica o selectiva será al menos dos veces la señal o ruido de fondo y más típicamente más de aproximadamente 10 a 100 veces el fondo.
Signos de enfermedad, como se usa en este documento, se refiere en términos generales a cualquier anormalidad indicativa de enfermedad, detectable en el examen del paciente; una indicación objetiva de enfermedad, en contraste con un síntoma, que es una indicación subjetiva de enfermedad.
Soporte sólido, soporte y sustrato, como se usa en este documento, se refiere en términos generales a cualquier material que proporcione una estructura sólida o semisólida con la que se pueda unir otro material, incluidos, pero sin limitarse a soportes lisos (por ejemplo, metal, vidrio, superficies de plástico, silicona y cerámica), así como materiales texturizados y porosos.
Sujetos, como se usa en el presente documento, se refiere en términos generales a cualquier persona adecuada para ser tratada de acuerdo con la presente invención incluyen, pero sin limitarse a, sujetos aviares y mamíferos, y son preferiblemente mamíferos. Los mamíferos de la presente invención incluyen, pero sin limitarse a, caninos, felinos, bovinos, caprinos, equinos, ovinos, porcinos, roedores (por ejemplo, ratas y ratones), lagomorfos, primates, humanos. Es adecuado cualquier sujeto mamífero que necesite ser tratado de acuerdo con la presente invención. Se pueden tratar sujetos humanos de ambos sexos y en cualquier etapa de desarrollo (es decir, recién nacido, infante, juvenil, adolescente, adulto) de acuerdo con la presente invención. La presente invención también se puede llevar a cabo en sujetos animales, particularmente sujetos mamíferos tales como ratones, ratas, perros, gatos, ganado, cabras, ovejas y caballos con fines veterinarios y con fines de cribado y desarrollo de fármacos. "Sujetos" se usa indistintamente con "pacientes".
Apareamiento de especies de levadura competentes, como se usa en el presente documento, abarca ampliamente cualquier levadura diploide o tetraploide que se pueda hacer crecer en cultivo. Dichas especies de levadura pueden existir en forma haploide, diploide o tetraploide. Las células de una ploidía determinada pueden, en condiciones apropiadas, proliferar durante un número indefinido de generaciones en esa forma. Las células diploides también pueden esporular para formar células haploides. El apareamiento secuencial puede resultar en cepas tetraploides a través de un mayor apareamiento o fusión de cepas diploides. En la presente invención, las células de levadura diploides o poliploides se producen preferiblemente mediante apareamiento o fusión de esferoplasto.
Célula de levadura haploide, como se usa en el presente documento, se refiere en términos generales a una célula que tiene una única copia de cada gen de su complemento genómico (cromosómico) normal.
Célula de levadura poliploide, como se usa en este documento, se refiere en términos generales a una célula que tiene más de una copia de su complemento genómico (cromosómico) normal.
Célula de levadura diploide, como se usa en este documento, se refiere en términos generales a una célula que tiene dos copias (alelos) de esencialmente cada gen de su complemento genómico normal, típicamente formada por el proceso de fusión (apareamiento) de dos células haploides.
Célula de levadura tetraploide, como se usa en el presente documento, se refiere en términos generales a una célula que tiene cuatro copias (alelos) de esencialmente cada gen de su complemento genómico normal, típicamente formada por el proceso de fusión (apareamiento) de dos células haploides. Los tetraploides pueden portar dos, tres, cuatro o más casetes de expresión diferentes. Tales tetraploides podrían obtenerse en S. cerevisiae por apareamiento selectivo homocigótico heterotálico a/a y diploides alfa/alfa y en Pichia por apareamiento secuencial de haploides para obtener diploides auxotróficos. Por ejemplo, un haploide [met his] puede emparejarse con un haploide [ade his] para obtener diploide [his]; y un haploide [met arg] se puede aparear con un haploide [ade arg] para obtener un diploide [arg]; luego el diploide [his] x diploide [arg] para obtener un protótrofo tetraploide. Los expertos en la técnica entenderán que la referencia a los beneficios y usos de las células diploides también puede aplicarse a las células tetraploides.
Apareamiento de levadura, como se usa en este documento, se refiere en términos generales a un proceso mediante el cual dos células de levadura haploides se fusionan naturalmente para formar una célula de levadura diploide.
Región variable o VR, como se usa en este documento, se refiere en términos generales a los dominios dentro de cada par de cadenas ligeras y pesadas en un anticuerpo que están involucrados directamente en la unión del anticuerpo al antígeno. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (Vh) seguido de varios dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable (Vl) en un extremo y un dominio constante en el otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera está alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de la cadena ligera está alineado con el dominio variable de la cadena pesada.
Variantes, como se usa en este documento, se refiere en términos generales a anticuerpos monocatenarios, dímeros, multímeros, variantes de secuencia y variantes de sustitución de dominio. Anticuerpos monocatenarios tales como SMIP, anticuerpos de tiburón, nanocuerpos (por ejemplo, anticuerpos de camélidos). Las variantes de secuencia se pueden especificar por porcentaje de identidad (similitud, homología de secuencia), por ejemplo, 99%, 95%, 90%, 85%, 80%, 70%, 60% o por número de sustituciones conservadoras o no conservadoras permitidas. Las variantes de sustitución de dominios incluyen el reemplazo de un dominio de una proteína por un dominio similar de una proteína relacionada. Un dominio similar puede identificarse por la similitud de secuencia, estructura (real o predicha) o función. Por ejemplo, las variantes de sustitución de dominio incluyen la sustitución de al menos una CDR y/o regiones marco.
Las técnicas y procedimientos se realizan generalmente de acuerdo con procedimientos convencionales bien conocidos en la técnica y como se describen en varias referencias generales y más específicas que se citan y analizan a lo largo de la presente memoria descriptiva. Véase, por ejemplo, Sambrook, et al. (2001) Molec. Clonación: Lab. Manual [3a. Ed.] Cold Spring Harbor Laboratory Press. Pueden usarse técnicas estándar para ADN recombinante, síntesis de oligonucleótidos y cultivo y transformación de tejidos (por ejemplo, electroporación, lipofección). Las reacciones enzimáticas y las técnicas de purificación se pueden realizar de acuerdo con las especificaciones del fabricante o como se logra comúnmente en la técnica o como se describe en el presente documento. Las nomenclaturas utilizadas en relación con los procedimientos y técnicas de laboratorio de química analítica, química orgánica de síntesis y química médica y farmacéutica descritas en el presente documento son las bien conocidas y comúnmente utilizadas en la técnica. Pueden usarse técnicas estándar para síntesis química, análisis químicos, preparación, formulación y administración farmacéutica y tratamiento de pacientes.
Mucositis
La mucositis es un término médico que se usa para referirse a llagas en la boca, mucositis oral o esofagitis. Puede variar en severidad desde enrojecimiento, dolor en la boca y/o encías hasta llagas abiertas que pueden causar que un paciente no pueda comer. El revestimiento de todo el tracto gastrointestinal (por ejemplo, boca, garganta, estómago e intestino) está formado por células epiteliales, que se dividen y replican rápidamente y mueren con quimioterapia y radioterapia. Por lo tanto, todo el revestimiento de todo el tracto gastrointestinal desde la boca hasta el ano es susceptible a la mucositis (por ejemplo, mucositis del tracto digestivo). La mucositis puede ocurrir en áreas del tracto digestivo; por ejemplo, mucositis gastrointestinal (GI). La emesis (vómitos) y la diarrea también son comunes en la mucositis, especialmente en la mucositis gastrointestinal. Véase Lalla, et al., (2008) Dent Clin North Am. 52 (1): 61-viii.
Los pacientes tratados con radioterapia para el cáncer de cabeza y cuello normalmente reciben una dosis diaria de radiación de aproximadamente 200 cGy, cinco días a la semana, durante 5-7 semanas continuas. Casi todos estos pacientes desarrollarán algún grado de mucositis oral. En estudios recientes, se produjo mucositis oral grave en el 29-66% de todos los pacientes que recibieron radioterapia para el cáncer de cabeza y cuello. La incidencia de mucositis oral fue especialmente alta en (A) pacientes con tumores primarios en la cavidad oral, orofaringe o nasofaringe, (B) aquellos que también recibieron quimioterapia concomitante, (C) aquellos que recibieron una dosis total superior a 5000 cGy y (D) aquellos que fueron tratados con esquemas de radiación de fraccionamiento alterados (por ejemplo, más de un tratamiento de radiación por día). Véase Lalla, et al. (2008) Dent Clin North Am. 52 (1): 61-viii.
Estudios recientes han indicado que los mecanismos fundamentales implicados en la patogénesis de la mucositis son mucho más complejos que el daño directo al epitelio solo. Se cree que los mecanismos de la mucositis inducida por radiación y por quimioterapia son similares. El siguiente modelo de cinco etapas para la patogenia de la mucositis:
1. Inicio de la lesión tisular: la radiación y/o la quimioterapia inducen daño celular que resulta en la muerte de las células epiteliales basales. También se cree que la generación de especies reactivas de oxígeno (radicales libres) por radiación o quimioterapia desempeña un papel en el inicio de la lesión de la mucosa. Estas pequeñas moléculas altamente reactivas son subproductos del metabolismo del oxígeno y pueden causar un daño celular significativo.
2. Sobrerregulación de la inflamación mediante la generación de señales mensajeras: además de causar la muerte celular directa, los radicales libres activan segundos mensajeros que transmiten señales desde los receptores de la superficie celular al interior de la célula. Esto conduce a una sobrerregulación de las citocinas proinflamatorias, daño tisular y muerte celular.
3. Señalización y amplificación: La sobrerregulación de citocinas proinflamatorias tal como el factor alfa de necrosis tumoral (TNF-a), producido principalmente por macrófagos, causa daño a las células mucosas y también activa vías moleculares que amplifican el daño mucoso.
4. Ulceración e inflamación: hay un infiltrado de células inflamatorias significativo asociado con las ulceraciones de la mucosa, con base en parte en subproductos metabólicos de la microflora oral colonizadora. La producción de citocinas proinflamatorias también se sobrerregula debido a esta infección secundaria.
5. Curación: Esta fase se caracteriza por la proliferación epitelial así como la diferenciación celular y tisular, restaurando la integridad del epitelio.
El grado y extensión de la mucositis oral que se desarrolla en cualquier paciente y sitio en particular parece depender de factores como la edad, el sexo, la enfermedad sistémica subyacente y la raza, así como factores específicos de tejido (por ejemplo, tipos de epitelio, ambiente microbiano local y función). Véase Lalla, et al. (2008) Dent Clin North Am. 52(1): 61-viii.
Los antagonistas de IL-6 descritos en este documento, incluyen pero sin limitarse a anticuerpos anti-IL-6 y fragmentos de anticuerpos, y pueden usarse en procedimientos y composiciones para el tratamiento de la mucositis (por ejemplo, oral, esofágica, alimentaria, gastrointestinal mucositis del tracto).
Mucositis oral
La mucositis oral es un problema significativo en pacientes que se someten a tratamiento quimioterapéutico para tumores sólidos. En un estudio, se informó que 303 de 599 pacientes (51%) que recibieron quimioterapia para tumores sólidos o linfoma desarrollaron mucositis oral y/o gastrointestinal. La mucositis oral se desarrolló en el 22% de los 1236 ciclos de quimioterapia, la mucositis GI en el 7% de los ciclos y la mucositis tanto oral como GI en el 8% de los ciclos. Un porcentaje aún mayor (aproximadamente 75-80%) de pacientes que reciben quimioterapia de dosis alta antes del trasplante de células hematopoyéticas desarrollan mucositis oral clínicamente significativa. Véase Lalla, et al. (2008) Dent Clin North Am. 52 (1): 61-viii.
La mucositis oral conduce a varios problemas, que incluyen dolor, problemas nutricionales como resultado de la incapacidad para comer y un mayor riesgo de infección debido a llagas abiertas en la mucosa. La mucositis oral tiene un efecto significativo sobre la calidad de vida del paciente y puede limitar la dosis (requiriendo una reducción de las dosis posteriores de quimioterapia).
Los signos y síntomas de la mucositis incluyen: boca y encías enrojecidas, brillantes o hinchadas; sangre en la boca; llagas en la boca o en las encías o la lengua; dolor o molestia en la boca o garganta; dificultad para tragar o hablar; sensación de sequedad, ardor leve o dolor al comer; manchas blandas y blanquecinas o pus en la boca o en la lengua; y aumento de moco o saliva más espesa en la boca.
Más del cuarenta por ciento de los pacientes que reciben quimioterapia desarrollarán algún grado de mucositis durante el curso de su tratamiento. Los pacientes que reciben radiación en las áreas de la cabeza, el cuello o el pecho, y los pacientes que se someten a un trasplante de médula ósea o de células madre, tienen incluso más probabilidades de desarrollar mucositis. Es más probable que ciertos agentes de quimioterapia causen este efecto secundario (Tabla 1), al igual que la irradiación corporal total, que a menudo se usa para los trasplantes de médula ósea.
Tabla 1. Selección los a entes uimiotera éuticos ue se sabe ue causan mucositis.
Figure imgf000028_0001
continuación
Figure imgf000029_0001
La mala salud bucal o dental, fumar, masticar tabaco, beber alcohol, deshidratación y enfermedades tales como enfermedad renal, diabetes o VIH/SIDA pueden aumentar la probabilidad de desarrollar mucositis o empeorarla.
El seguimiento del desarrollo y la resolución de la mucositis puede ser difícil, dado que la experiencia es diferente para cada paciente. La escala de toxicidad oral de la Organización Mundial de la Salud (OMS) es un sistema de clasificación de uso común desarrollado para ayudar a evaluar la gravedad de la mucositis:
Tabla 2: Escala de gravedad de la mucositis oral (adaptada de la ESCALA DE TOXICIDAD ORAL DE LA OMS)
Figure imgf000029_0002
Se han intentado numerosos estudios que utilizan muchos medicamentos e intervenciones diferentes para reducir la incidencia y la gravedad de la mucositis oral. Desafortunadamente, solo algunas de estas intervenciones han tenido mucho éxito. Actualmente, un buen régimen de cuidado bucal (Tabla 3) es el más eficaz para prevenir o disminuir la gravedad de la mucositis y ayudar a prevenir el desarrollo de infecciones a través de llagas en la boca abierta. El éxito de un régimen de cuidado oral son los enjuagues bucales, y numerosos estudios han determinado que el agua salada antigua es un enjuague bucal eficaz. El enjuague bucal ayuda a eliminar los desechos y a mantener el tejido bucal húmedo y limpio. Otros componentes importantes incluyen el uso de humectantes para la boca y los labios, el uso de un cepillo de dientes de cerdas suaves, el mantenimiento de una ingesta adecuada de líquidos y proteínas y evitar alimentos irritantes, alcohol y tabaco.
___________________________Tabla 3: Ejemplo de protocolo de cuidado oral___________________________ _________________________ Recomendaciones de protocolos de cuidado oral_________________________ Solución salina normal (1 cucharadita de sal de mesa por 946 ml de agua) [por ejemplo, sal y soda (media cucharadita de sal y 2 cucharadas de bicarbonato de sodio en 946 ml de agua tibia)]________________________ Usar un cepillo de dientes de cerdas suaves después de las comidas y antes de acostarse. Si el cepillo causa dolor, se pueden usar hisopos suaves Toothette_______________________________________________________ Usar una pasta de dientes no abrasiva (o mezclar 1 cucharadita de bicarbonato de sodio en 2 tazas de agua). Evitar las pastas dentales con blanqueadores._________________________________________________________ Mantener los labios húmedos con humectantes. Evitar el uso de vaselina (la base de aceite puede promover la infección).
Evitar los productos que irritan la boca y las encías: evitar los enjuagues bucales comerciales y los que contienen alcohol__________________________________________________________________________________________ Limitar el uso de hilo dental, NO usar con plaquetas por debajo de 40.000 No usar hisopos de limón o glicerina o cepillos de dientes sin cerdas suaves
Aumentar su ingesta de líquidos.____________________________________________________________________ Tratar de incluir alimentos ricos en proteínas en su dieta.
Evitar los alimentos calientes, picantes o ácidos, el alcohol, los alimentos duros o gruesos (pan crujiente, patatas fritas, galletas saladas).____________________________________________________________________________ Si usa dentadura postiza: quítela siempre que sea posible para exponer las encías al aire. Las dentaduras postizas sueltas pueden irritar la boca y las encías y no deben usarse. No usar dentaduras postizas si las llagas en la boca son graves___________________________________________________________________ No fumar cigarrillo, puros o pipas. No usar tabaco sin humo (tabaco de mascar, rapé)_______________________
La crioterapia, que implica chupar trozos de hielo durante la administración de la quimioterapia, ha mostrado cierto efecto en el alivio de la mucositis causada por 5-FU (fluorouracilo). Dos agentes, Gelclair® y Zilactin®, son protectores de la mucosa que actúan recubriendo la mucosa, formando una barrera protectora para las terminaciones nerviosas expuestas. Estos agentes dieron como resultado un mejor control del dolor y la capacidad de comer y hablar. Amifostina (Ethyol®), un medicamento que protege contra el daño a la mucosa causado por la radiación (aprobado por la FDA para pacientes que reciben radioterapia para cánceres de cabeza y cuello).
El factor de crecimiento de queratinocitos (KGF) estimula el crecimiento, la reparación y la supervivencia de las células que protegen el revestimiento de la boca y el tracto gastrointestinal. El KGF humano recombinante se ha desarrollado como el fármaco KEPIVANCE® (palifermina) y actualmente se utiliza para tratar la mucositis oral en pacientes con neoplasias hematológicas que reciben terapia mielotóxica que requieren soporte de células madre hematopoyéticas (HSCT). Se encontró que la palifermina disminuye la duración y la gravedad de la mucositis oral en estos pacientes. "Coping with Cancer" por Vachani del Centro de Cáncer Abramson de la Universidad de Pennsylvania (2009). Los antagonistas de IL-6, incluidos los anticuerpos anti-IL-6 y sus fragmentos de anticuerpo, pueden usarse en procedimientos y composiciones para el tratamiento de la mucositis, incluida la mucositis oral asociada con quimioterapia y radioterapia. También se pueden observar emesis y diarrea en pacientes que padecen mucositis oral. Los antagonistas de IL-6, incluidos los anticuerpos anti-IL-6, pueden usarse en procedimientos y composiciones para el tratamiento de la emesis y la diarrea asociadas con quimioterapia, radioterapia y mucositis oral.
Mucositis del tracto digestivo
La mucositis es un problema clínico agudo importante en oncología, causado por los efectos citotóxicos de la quimioterapia y la radioterapia. La afección puede afectar la mucosa de todo el tracto digestivo (AT), provocando dolor de boca y garganta, ulceración, dolor abdominal, distensión abdominal, vómito (emesis) y diarrea. La mucositis es extremadamente común y ocurre en aproximadamente el 40% de los pacientes después de dosis estándar de quimioterapia y en casi todos los pacientes sometidos a quimioterapia de dosis alta con trasplante de células madre o radiación de cabeza y cuello. Bowen et al., (2011) Journal of Supportive Oncology 9 (5): 161-168.
La mucositis del tracto digestivo se refiere a la expresión de una lesión de la mucosa a través del continuo de la mucosa oral y gastrointestinal, desde la boca hasta el ano. La incidencia de mucositis oral de grado 3 o 4 de la OMS puede ser tan alta como -75% en pacientes sometidos a trasplante de células madre hematopoyéticas (HSCT), de acuerdo con la intensidad del régimen de acondicionamiento utilizado y el uso de metotrexato. Para todos los sitios del tumor, la quimioterapia con 5-fluorouracilo (5-FU), capecitabina o tegafur conduce a una alta tasa (por ejemplo, 20-50%) de mucositis del tracto digestivo. La quimioterapia con metotrexato y otros antimetabolitos conduce a una tasa de mucositis del tracto digestivo del 20 al 60% de acuerdo con la dosis administrada por ciclo del fármaco. Véase Peterson, et al. (2009) Annals of Oncology 20 (Suplemento 4): iv174-iv177 y Logan, et al. (2008) Cancer Chemotherapy and Pharmacology 62 (1): 33-41. Los antagonistas de IL-6, incluidos los anticuerpos anti-IL-6 y sus fragmentos de anticuerpos, pueden usarse en procedimientos y composiciones para el tratamiento de la mucositis del tracto digestivo, incluida la mucositis del tracto digestivo asociada con quimioterapia y radioterapia. La emesis y la diarrea también se observan comúnmente en pacientes que padecen mucositis, especialmente mucositis del tracto digestivo. Los antagonistas de IL-6, incluidos los anticuerpos anti-IL-6, se pueden usar en procedimientos y composiciones para el tratamiento de la emesis y la diarrea asociadas con quimioterapia, radioterapia y mucosas del tracto digestivo.
Mucositis del tracto gastrointestinal
La mucositis gastrointestinal puede resultar de la quimioterapia y/o radioterapia y se refiere a lesiones inflamatorias en el tracto gastrointestinal. Los vómitos (emesis) y la diarrea son elementos comunes de la mucositis gastrointestinal.
Se recomienda el cuidado intestinal básico que incluye el mantenimiento de una hidratación adecuada para los pacientes que se someten a quimioterapia y radioterapia para limitar los efectos de la mucositis gastrointestinal. Las recomendaciones actuales también incluyen la administración de 500 mg de sulfasalazina por vía oral dos veces al día para reducir la incidencia y la gravedad de la enteropatía inducida por radiación en pacientes que reciben radioterapia de haz externo en la pelvis. La amifostina también se sugiere en una dosis de al menos 340 mg/m2 para prevenir la proctitis por radiación en aquellos que reciben radioterapia de dosis estándar para el cáncer rectal. Además, octreotida a una dosis de al menos 100 |jg sc dos veces al día cuando la loperamida no logra controlar la diarrea inducida por la quimioterapia de dosis alta o estándar asociada con el HSCT, así como la amifostina se sugiere para reducir la esofagitis inducida por la quimioterapia y la radioterapia concomitantes en pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas. Véase Peterson, et al. (2009) Annals of Oncology 20 (Suplemento 4): iv174-iv177. Los antagonistas de IL-6, incluidos los anticuerpos anti-IL-6 y sus fragmentos de anticuerpos, pueden usarse en procedimientos y composiciones para el tratamiento de la mucositis gastrointestinal, incluida la mucositis gastrointestinal asociada con quimioterapia y radioterapia.
La emesis y la diarrea también se observan comúnmente en pacientes que padecen mucositis, especialmente mucositis del tracto gastrointestinal. Véase Lalla, et al. (2008) Dent Clin North Am. 51 (1): 61-viii. Los antagonistas de IL-6, incluidos los anticuerpos anti-IL-6, pueden usarse en procedimientos y composiciones para el tratamiento de la emesis y la diarrea asociadas con quimioterapia, radioterapia y mucositis del tracto gastrointestinal.
Tratamiento de la artritis reumatoide
También se describe en el presente documento el uso de antagonistas de IL-6, incluidos los anticuerpos anti-IL-6 descritos en el presente documento, tales como Ab1 o formas humanizadas del mismo para tratar o prevenir la artritis reumatoide. Esta solicitud proporciona resultados de estudios clínicos que muestran seguridad, farmacocinética y farmacodinámica para la administración subcutánea e intravenosa de un ejemplo de anticuerpo anti-IL-6, Ab1 (también conocido como ALD518, los ejemplos de secuencias se proporcionan en la Tabla 4). Los datos clínicos demuestran que un anticuerpo anti-IL-6 disminuye la gravedad de la enfermedad en pacientes con artritis reumatoide a los que se les ha administrado ALD-518 por vía subcutánea (SC) o intravenosa (IV), incluida la mejora de los componentes mentales y físicos de la enfermedad.
El anticuerpo anti-IL-6 (por ejemplo, ALD518) fue bien tolerado cuando se administró en una sola dosis subcutánea (SC); las reacciones en el lugar de la inyección fueron generalmente leves. La biodisponibilidad de ALD518 SC fue de -60% de ALD518 IV, y la semivida fue de -30 días. Se observaron reducciones rápidas y significativas en la CRP (proteína C reactiva), que se mantuvieron durante 24 semanas de evaluación. La semivida de ALD518 cuando se administra por vía subcutánea (aproximadamente 30 días) es similar a la semivida observada previamente con la administración intravenosa. Además, la ALD518 subcutánea produjo reducciones grandes y rápidas de CRP en suero y las reducciones de CRP observadas durante las primeras 12 semanas del estudio se mantuvieron durante 24 semanas de evaluación. Estos resultados también son similares a los observados con la administración intravenosa. Juntos, estos resultados sugieren que los anticuerpos anti-IL-6, tales como Ab1 (ALD518), pueden usarse para el tratamiento de RA, así como para la prevención o el tratamiento de otras afecciones asociadas a IL-6. Estos regímenes terapéuticos pueden combinarse con otros agentes terapéuticos para la RA, que incluyen metotrexato u otros fármacos para la RA identificados en el presente documento y generalmente conocidos en la técnica, incluidos analgésicos, fármacos antirreumáticos modificadores de la enfermedad (DMARD), antiinflamatorios y otros.
Se describen además regímenes de dosificación específicos y formulaciones de dosificación para tratar la artritis reumatoide mediante la administración subcutánea o intravenosa de anticuerpos anti-IL-6 o fragmentos de anticuerpos de acuerdo con la invención, tales como anticuerpos Ab1 humanizados. Por ejemplo, a un sujeto se le pueden administrar 80, 160 o 320 mg de un anticuerpo anti-IL-6 (por ejemplo, Ab1).
Los anticuerpos anti-IL-6 pueden usarse para administrar por vía subcutánea anticuerpos de la divulgación, incluido Ab1, para indicaciones de artritis reumatoide, la formulación de administración comprende, o alternativamente consiste en, aproximadamente 50 o 100 mg/ml de anticuerpo, aproximadamente histidina base 5 mM, histidina HCl aproximadamente 5 mM para obtener un pH final de 6, sorbitol 250 mM y polisorbato 80 al 0,015% (p/p). La formulación de administración puede comprender, o alternativamente consistir en, aproximadamente 20 o 100 mg/ml de anticuerpo, histidina base aproximadamente 5 mM, histidina HCl aproximadamente 5 mM para obtener un pH final de 6, sorbitol (o sorbitol en combinación con sacarosa) de 250 a 280 mM y polisorbato 80 al 0,015% (p/p), teniendo dicha formulación un espacio de cabeza de nitrógeno en los viales de transporte.
Los regímenes terapéuticos para la prevención o el tratamiento de la RA pueden combinarse con otros agentes terapéuticos para la RA, que incluyen analgésicos, DMARD, antiinflamatorios y otros. Por ejemplo, los analgésicos y los medicamentos antiinflamatorios, incluidos los esteroides, pueden aliviar los síntomas de la enfermedad, mientras que los medicamentos antirreumáticos modificadores de la enfermedad (DMARD) pueden inhibir o detener el proceso inmunológico subyacente y prevenir un mayor daño a largo plazo. En ejemplos de realizaciones, ALD518 (u otro anticuerpo de la presente divulgación) puede administrarse a un paciente aproximadamente al mismo tiempo que otro terapéutico para RA (que puede o no formularse conjuntamente) o puede administrarse a un paciente que también está siendo sometido a otro régimen terapéutico pero no necesariamente al mismo tiempo. Se puede considerar que un régimen proporciona una combinación de terapias siempre que el paciente experimente simultáneamente los efectos de las terapias combinadas. Debido a las posibles diferencias en el horario de dosificación, una combinación puede incluir la administración de diferentes tratamientos en diferentes momentos, por ejemplo, un paciente puede recibir un medicamento tal como metotrexato en un horario semanal (por ejemplo, al menos 10 mg por semana) y puede recibir ALD518 (u otro anticuerpo anti-IL-6 de la presente divulgación) con menos frecuencia (como aproximadamente cada ocho semanas, cada doce semanas, cada tres meses). Los ejemplos de DMARD que pueden administrarse en combinación con ALD518 (u otro anticuerpo de la presente divulgación) incluyen, pero sin limitarse a Micofenolato de mofetilo (CellCept®), inhibidores de calcineurina (por ejemplo, ciclosporina, sirolimus, everolimus), retinoides orales, azatioprina, ésteres de ácido fumérico, D-penicilamina, ciclofosfamida, columnas de inmunoadsorción (por ejemplo, columnas Prosorba®), sales de oro (por ejemplo, auranofina, aurotiomalato de sodio (miocrisina)), hidroxicloroquina, cloroquina, leflunomida, metotrexato (MTX), minociclina, sulfasalazina (SSZ), bloqueadores del factor alfa de necrosis tumoral (TNFa) (por ejemplo, etanercept (Enbrel), infliximab (Remicade), adalimumab (Humira), certolizumab pegol (Cimzia), golimumab (Simponi)), bloqueadores de la interleucina 1 (IL-1) (por ejemplo, anakinra (Kineret)), anticuerpos monoclonales contra las células B (por ejemplo, rituximab (Rituxan)), bloqueadores de la coestimulación de células T (por ejemplo, abatacept (Orencia)), bloqueadores de interleucina 6 (IL-6) (por ejemplo, tocilizumab (un anticuerpo receptor anti-IL-6), RoActemra, Actemra). Los ejemplos de agentes antiinflamatorios que pueden administrarse en combinación con ALD518 (u otro anticuerpo de la presente divulgación) incluyen, pero sin limitarse a, esteroides antiinflamatorios tales como cortisona, glucocorticoides, prednisona, prednisolona, hidrocortisona (cortisol), acetato de cortisona, metilprednisolona, dexametasona, betametasona, triamcinolona, beclometasona y acetato de fludrocortisona, y fármacos antiinflamatorios no esteroideos (NSAID) (que también pueden actuar como analgésicos), tales como ibuprofeno, naproxeno, meloxicam, etodolac, nabumetona, sulindac, tolementina, salicilato de colina y magnesio, diclofenaco, diflusinal, indometicina, ketoprofeno, oxaprozina, piroxicam y nimesulida, salicilatos, aspirina (ácido acetilsalicílico), diflunisal, salsalato, derivados de p-amino fenol, paracetamol, fenacetina, derivados de ácido propiónico, Ibuprofeno, Naproxeno, Fenoprofeno, Ketoprofeno, Flurbiprofeno, Oxaprozina, Loxoprofeno, Derivados del ácido acético, Indometacina, Sulindac, Etodolac, Ketorolac, Diclofenaco, Nabumetona, Derivados del ácido Enólico (Oxicam), Piroxicam, Meloxicam, Tenoxicam, Droxicam, Lornoxicam, Isoxicam, Derivados del ácido Fenámico (Fenamatos), Ácido mefenámico, Ácido meclofenámico, Ácido flufenámico, Ácido tolfenámico, Inhibidores selectivos de COX-2 (Coxibs), Celecoxib, Rofecoxib, Valdecoxib, Parecoxib, Lumiracoxib, Etoricoxib, Firocoxib, Sulfoanilidas, Nimesulida y Licofelona. Los ejemplos de analgésicos incluyen aquellos que pueden administrarse en combinación con ALD518 (u otro anticuerpo de la presente divulgación), pero sin limitarse a, NSAID, inhibidores de COX-2 (que incluyen Celecoxib, Rofecoxib, Valdecoxib, Parecoxib, Lumiracoxib, Etoricoxib y Firocoxib), acetaminofén, opiáceos (por ejemplo, Dextropropoxifeno, Codeína, Tramadol, Anileridina, Petidina, Hidrocodona, Morfina [por ejemplo, oral, intravenosa (IV) o intramuscular (IM)], Oxicodona, Metadona, Diacetilmorfina, Hidromorfona, Oximorfona, Levorfanol, Buprenorfina, Fentanilo, Sufentanilo, Etorfina, Carfentanilo, dihidromorfina, dihidrocodeína, Tebaína y Papaverina), diprocualona, Flupirtina, antidepresivos tricíclicos y lidocaína (tópica).
Antagonistas anti-IL-6
El antagonista de IL-6 puede comprender un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo. El antagonista de IL-6 puede ser un agente que bloquea la transmisión de señales por IL-6, bloquea la unión de IL-6 a su receptor, suprime/interfiere con la expresión de iL-6 y/o inhibe la actividad biológica de IL-6. Los antagonistas de IL-6 pueden unirse directa o indirectamente a polipéptidos de inmunoglobulina o fracciones efectoras tales como entidades terapéuticas o detectables.
Los ejemplos de antagonistas de IL-6 incluyen, pero sin limitarse a anticuerpo anti-IL-6, anticuerpo anti-IL-6R, anticuerpo anti-gp130, mutante de IL-6, oligonucleótido antisentido de IL-6R y péptidos parciales de IL-6 o IL-6R. Un ejemplo del mutante de IL-6 usado en la presente invención se describe en Brakenhoff, et al. (1994) J. Biol. Chem.
269: 86-93 o Savino, et al. (1994) EMBO J. 13: 1357-1367. El polipéptido mutante de IL-6 o fragmento del mismo no posee los efectos de transmisión de señales de IL-6 pero retiene la actividad de unión con IL-6R y se produce al introducir una mutación en forma de sustitución, eliminación o inserción en la secuencia aminoácidos de IL6. Si bien no existen limitaciones sobre las especies animales utilizadas, es preferible utilizar una IL6 de origen humano. De manera similar, cualquier péptido parcial de IL-6 o péptido parcial de IL-6R usado en la presente invención siempre que evite que IL6 o IL6R (gp80) o gp130 afecten la transducción de señales y por lo tanto eviten la actividad biológica asociada a IL-6. Para obtener detalles sobre los péptidos parciales de IL-6 y los péptidos parciales de IL-6R, véase, por ejemplo la Patente de Estados unidos No. 5.210.075 y la Patente EP No. 617126. Además, se puede utilizar un receptor de IL-6 soluble mutado como antagonista de IL-6. Véase Salvati, et al. (1995) The Journal of Biological Chemistry 270: 12242-12249.
La señalización de IL-6 está mediada por la familia Jak-Tyk de tirosina quinasas citoplasmáticas, que incluyen JAK1, JAK2 y JAK3 (revisado en Murray (2007) J Immunol. 178 (5): 2623-9). Los inhibidores de JAK1, JAK2 o JAK3 se pueden usar como antagonistas de IL-6 de IL-6. Sivash et al., (2004) British Journal of Cancer 91: 1074-1080. Puede usarse un inhibidor de Syk como antagonista de IL-6. Ulanova et al., (2005) Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 288 (3): L497-507. La talidomida y sus derivados, tal como la lenalidomida, pueden ser antagonistas útiles de IL-6. Kedar et al., (2004) Int J Cancer. 110 (2): 260-5.
Además, los oligonucleótidos capaces de silenciar el ARN de IL6 o IL6R o mecanismos antisentido pueden usarse en el procedimiento de la presente invención (JP5-300338 para detalles sobre el oligonucleótido antisentido de IL-6R).
Además, el antagonista de IL-6 puede dirigirse a IL-6, receptor a de IL-6, gp130, p38 MAP quinasa, JAK1, JAK2, JAK3, SYK o cualquier combinación de los mismos. Por ejemplo, SANT-7 es un antagonista del receptor de IL-6 que interfiere con la formación de los heterómeros IL-6/IL-6R/gp130. Véase Honemann, et al. (2001) Int. J. Cancer 93: 674-680.
El antagonista de IL-6 puede comprender un anticuerpo del receptor anti-IL-6 (por ejemplo, TOCILIZUMAB®, ACTEMRA®), anti-IL6 (por ejemplo, SILTUXIMAB®), anti-gp130, anti-p38 MAP quinasa, anti-JAK1, anti-JAK2, anti-JAK3 o anti-SYK o fragmento de anticuerpo. Véase Nishimoto, et al., (2005) Blood 106 (8): 2627-32; van Rhee et al., (2010) Journal of Clinical Oncology 28 (23): 3701-3708; documento WO 2010/056948; publicación de la solicitud de Patente de Estados Unidos No. 2010/0138945.
El antagonista de IL-6 puede comprender una molécula pequeña que incluye, pero no se limita a, agonistas del receptor de talidomida, lenalidomida, hidrocarburo arilo (por ejemplo, 7,12-dimetilbenz[a]antraceno (DMBA) y 2,3,7,8-tetraclorodibenzo-p-dioxina (TCDD)) o cualquier combinación de los mismos. Véase Jensen, et al. (2003) Environmental Health: A Global Access Science Source 2:16.
El antagonista de IL-6 puede ser un péptido antagonista de IL-6. Véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos No. 6.838.433. Por ejemplo, una molécula de IL-6 truncada puede actuar como antagonista de IL-6. Véase Alberti, et al. (2005) J. Cancer Res 65: 2-5.
El antagonista de IL-6 puede ser un anticuerpo anti-IL-6. Véase también la publicación de la solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 2007/0292420. El antagonista de IL-6 puede comprender un anticuerpo anti-IL-6 o un fragmento de anticuerpo como se describe con más detalle en el presente documento. La divulgación incluye anticuerpos que tienen especificidad de unión a IL-6 y que poseen una secuencia de cadena ligera variable que comprende la secuencia expuesta en la secuencia polipeptídica de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 709 y versiones humanizadas y variantes de las mismas, incluidas las expuestas en las FIGS. 1-5, y aquellas identificadas en la Tabla 4.
Anticuerpos anti-IL-6 y fragmentos de anticuerpos de los mismos
Los anticuerpos consisten en dos cadenas polipeptídicas ligeras idénticas de peso molecular aproximadamente 23.000 daltons (la "cadena ligera") y dos cadenas pesadas idénticas de peso molecular 53.000-70.000 (la "cadena pesada"). Las cuatro cadenas están unidas por enlaces disulfuro en una configuración "Y" en la que las cadenas ligeras rodean las cadenas pesadas comenzando en la boca de la configuración "Y". La porción de "ramificación" de la configuración "Y" se denomina región Fab; la parte del vástago de la configuración "Y" se denomina región Fc. La orientación de la secuencia de aminoácidos va desde el extremo terminal N en la parte superior de la configuración "Y" hasta el extremo terminal C en la parte inferior de cada cadena. El extremo terminal N posee la región variable que tiene especificidad por el antígeno que lo provocó, y tiene aproximadamente 100 aminoácidos de longitud, existiendo ligeras variaciones entre la cadena ligera y pesada y de anticuerpo a anticuerpo.
La región variable está unida en cada cadena a una región constante que extiende la longitud restante de la cadena y que dentro de una clase particular de anticuerpo no varía con la especificidad del anticuerpo (es decir, el antígeno que lo provoca). Hay cinco clases principales conocidas de regiones constantes que determinan la clase de la molécula de inmunoglobulina (IgG, IgM, IgA, IgD e IgE correspondientes a las regiones constantes de cadena pesada y, M, a, 8 y £ (gamma, mu, alfa, delta o épsilon)). La región o clase constante determina la función efectora subsiguiente del anticuerpo, incluida la activación del complemento (Kabat, E.A. (1976) Structural Concepts in Immunology and Immunochemistry [2nd Ed.] Páginas 413-436, Holt, Rinehart, Winston) y otras respuestas celulares (Andrews et al., (1980) Clinical Immunobiology páginas 1 a 18, WB Sanders; Kohl et al., (1983) Immunology 48: 187); mientras que la región variable determina el antígeno con el que reaccionará. Las cadenas ligeras se clasifican como k (kappa) o A (lambda). Cada clase de cadena pesada se puede emparejar con cadena ligera kappa o lambda. Las cadenas ligeras y pesadas están unidas covalentemente entre sí, y las porciones de "cola" de las dos cadenas pesadas están unidas entre sí mediante enlaces disulfuro covalentes cuando las inmunoglobulinas se generan por hibridomas o por células B.
Por ejemplo, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno o variantes de los mismos pueden producirse mediante ingeniería genética. En esta técnica, como con otros procedimientos, las células productoras de anticuerpos se sensibilizan al antígeno o inmunógeno deseado. El ARN mensajero aislado de células productoras de anticuerpos se utiliza como molde para producir ADNc mediante amplificación por PCR. Se produce una biblioteca de vectores, cada uno de las cuales contiene un gen de cadena pesada y un gen de cadena ligera que retiene la especificidad antigénica inicial, mediante la inserción de secciones apropiadas del ADNc de inmunoglobulina amplificado en los vectores de expresión. Se construye una biblioteca combinatoria combinando la biblioteca de genes de cadena pesada con la biblioteca de genes de cadena ligera. Esto da como resultado una biblioteca de clones que coexpresan una cadena ligera y pesada (que se asemeja al fragmento Fab o al fragmento de unión al antígeno de una molécula de anticuerpo). Los vectores que portan estos genes se cotransfectan en una célula huésped. Cuando se induce la síntesis de genes de anticuerpos en el huésped transfectado, las proteínas de cadena pesada y ligera se autoensamblan para producir anticuerpos activos que pueden detectarse mediante el cribado con el antígeno o inmunógeno.
Las secuencias codificantes de anticuerpos de interés incluyen aquellas codificadas por secuencias nativas, así como ácidos nucleicos que, en virtud de la degeneración del código genético, no son idénticas en secuencia a los ácidos nucleicos descritos y variantes de los mismos. Los polipéptidos variantes pueden incluir sustituciones, adiciones o eliminaciones de aminoácidos (aa). Las sustituciones de aminoácidos pueden ser sustituciones de aminoácidos conservadoras o sustituciones para eliminar aminoácidos no esenciales, tal como para alterar un sitio de glicosilación, o para minimizar el plegamiento incorrecto mediante sustitución o eliminación de al menos un residuo de cisteína que no es necesario para la función. Se pueden diseñar variantes para retener o tener una actividad biológica mejorada de una región particular de la proteína (por ejemplo, un dominio funcional, residuos de aminoácidos catalíticos). Las variantes también incluyen fragmentos de los polipéptidos descritos en este documento, particularmente fragmentos biológicamente activos y/o fragmentos correspondientes a dominios funcionales. Se conocen técnicas para la mutagénesis in vitro de genes clonados. También se incluyen en la presente invención los polipéptidos que han sido modificados usando técnicas de biología molecular ordinarias para mejorar su resistencia a la degradación proteolítica o para optimizar las propiedades de solubilidad o para hacerlos más adecuados como agentes terapéuticos.
Los anticuerpos quiméricos se pueden preparar por medios recombinantes combinando las regiones variables de cadena ligera y pesada (Vl y Vh), obtenidas a partir de células productoras de anticuerpos de una especie con las regiones constantes de cadena ligera y pesada de otra. Normalmente, los anticuerpos quiméricos utilizan regiones variables de roedores o conejos y regiones constantes humanas, para producir un anticuerpo con dominios predominantemente humanos. La producción de tales anticuerpos quiméricos es bien conocida en la técnica y puede lograrse por medios estándar (como se describe, por ejemplo, en la patente de los Estados Unidos No. 5.624.659, incorporada en el presente documento como referencia en su totalidad). Se contempla además que las regiones constantes humanas de los anticuerpos quiméricos de la invención se pueden seleccionar de las regiones constantes de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgG5, IgG6 , IgG7, IgG8 , IgG9, IgG10, IgG11, IgG12, IgG13, IgG14, IgG15, IgG16, IgG17, IgG18 o IgG19.
Los anticuerpos humanizados se diseñan para contener aún más dominios de inmunoglobulina de tipo humano e incorporan solo las regiones determinantes de complementariedad del anticuerpo derivado de animal. Esto se logra examinando cuidadosamente la secuencia de los bucles hipervariables de las regiones variables del anticuerpo monoclonal y ajustándolos a la estructura de las cadenas de anticuerpos humanos. Aunque facialmente complejo, el proceso es sencillo en la práctica. Véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos No. 6.187.287. En una realización preferida, la humanización se puede efectuar como se describe en detalle más adelante. Este esquema injerta CDR en FR humanas altamente homólogas al anticuerpo parental que se está humanizando.
Las inmunoglobulinas y sus fragmentos se pueden modificar postraduccionalmente, por ejemplo para añadir fracciones efectoras tales como enlazadores químicos, fracciones detectables, tales como colorantes fluorescentes, enzimas, toxinas, sustratos, materiales bioluminiscentes, materiales radiactivos, fracciones quimioluminiscentes y similares, o fracciones de unión específicos, tales como estreptavidina, avidina o biotina, y se pueden utilizar similares en los procedimientos y composiciones de la presente invención.
Ejemplos de anticuerpos anti-IL-6
El anticuerpo antagonista de IL- 6 para uso de acuerdo con la presente invención comprende la secuencia ligera variable humanizada de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 709 y la secuencia pesada variable humanizada de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 657.
También se describen en el presente documento anticuerpos que tienen especificidad de unión a IL- 6 y que poseen una secuencia de cadena pesada variable que comprende la secuencia expuesta en las secuencias polipeptídicas de la SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 657 y versiones humanizadas y variantes de las mismas que incluyen aquellas expuestas en las Figuras 1-5, y las identificadas en la Tabla 4.
Se describen además anticuerpos que tienen especificidad de unión a IL- 6 y que poseen una secuencia de cadena pesada variable que es una versión modificada de la SEQ ID NO: 3 en la que el residuo de triptófano en CDR2 se cambia por una serina como se expone en la secuencia polipeptídicas de la SEQ ID NO: 658 y versiones humanizadas y variantes de la misma, incluidas las expuestas en las Figuras 1-5, y las identificados en la Tabla 4.
La invención contempla además anticuerpos que comprenden las secuencias polipeptídicas de la SEQ ID NO: 4; la SEQ ID NO: 5; y la SEQ ID NO: 6 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 2, y las secuencias polipeptídicas de la SEQ ID NO: 7; la SEQ ID NO: 8 o 120; y la SEQ ID NO: 9 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 3 o 19. Otros anticuerpos descritos en este documento incluyen combinaciones de las CDR y las secuencias de cadenas ligera y pesada variables expuestas en este documento.
En otra realización, la invención contempla otros anticuerpos, como por ejemplo anticuerpos quiméricos, que comprenden las secuencias polipeptídicas de la SEQ ID NO: 4; la SEQ ID NO: 5; y la SEQ ID NO: 6 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 2, y las secuencias polipeptídicas de la s Eq ID NO: 7; SEQ ID NO: 8 o 120; y SEQ ID NO: 9 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencias de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 3 o 19. Otros anticuerpos descritos en este documento incluyen combinaciones de las CDR y versiones humanizadas de la secuencias de cadena pesada y ligera variables expuestas anteriormente.
La invención también contempla fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a IL-6. Los fragmentos de anticuerpos descritos en este documento pueden comprender, o alternativamente consistir en, versiones humanizadas de la secuencia polipeptídica de la SEQ ID NO: 2, 20, 647, 651, 660, 666 , 699, 702, 706 o 709. Los fragmentos de anticuerpos descritos en este documento pueden comprender, o, alternativamente, consisten en versiones humanizadas de la secuencia polipeptídica de la Se Q ID NO: 3, 18, 19, 652, 656, 657, 658, 661, 664, 665, 704 o 708.
En una realización adicional de la divulgación, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a IL- 6 comprenden las secuencias polipeptídicas de la SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5; y SEQ ID NO: 6 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 709.
En una realización adicional de la divulgación, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a IL- 6 comprenden las secuencias polipeptídicas de la SEQ ID NO: 7; la SEQ iD n O: 8 o la Se Q ID NO: 120; y la SEQ ID NO: 9 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 3 y 657 o 19.
También se describen fragmentos de anticuerpos que incluyen al menos uno de los fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento. Los fragmentos de los anticuerpos que tienen especificidad de unión a IL-6 pueden comprender, o alternativamente consistir en, uno, dos, tres o más, incluyendo todos los siguientes fragmentos de anticuerpo: la región de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 2; la región de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 3; las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5; y SEQ ID NO: 6 ) de la región de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 2; y las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 120; y SEQ ID NO: 9) de la región de cadena pesada variable de la Se Q ID NO: 3 y 657 o 19.
También se describen variantes en las que cualquiera de las secuencias polipeptídicas de cadena pesada de la SEQ ID NO: 18 o SEQ ID NO: 19 se sustituye por la secuencia polipeptídica de cadena pesada de la SEQ ID NO: 3 o 657; la secuencia polipeptídica de cadena ligera de la SEQ ID NO: 20 se sustituye por la secuencia polipeptídica de cadena ligera de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 709; y la secuencia de CDR de cadena pesada de la s Eq ID NO: 120 se sustituye por la secuencia de CDR de cadena pesada de la SEQ ID NO: 8.
El anticuerpo anti-IL-6 descrito en el presente documento puede ser Ab1, que comprende la SEQ ID NO: 2 y la SEQ ID NO: 3, o más particularmente un anticuerpo que comprende la SEQ ID NO: 657 y la SEQ ID NO: 709 (que son respectivamente codificada por las secuencias de ácido nucleico en la SEQ ID NO: 700 y la SEQ ID NO: 723) o una compuesta por las SEQ ID NOs alternativas expuestas en el párrafo anterior, y que tienen al menos una de las actividades biológicas expuestas en este documento. El anticuerpo anti-IL- 6 puede comprender una secuencia humanizada como se muestra en las Figuras 1-5.
Las secuencias de anticuerpos anti-IL- 6 se muestran en la Tabla 4. Se muestran ejemplos de variantes de secuencia de otras formas alternativas de las cadenas pesada y ligera de Ab1 a Ab36. Los anticuerpos descritos abarcan variantes de secuencia adicionales, que incluyen sustituciones conservadoras, sustitución de al menos una secuencia de CDR y/o secuencias de FR.
Los ejemplos de variantes de Ab1 incluyen un anticuerpo que comprende una variante de la cadena ligera y/o la cadena pesada. Los ejemplos de variantes de la cadena ligera de Ab1 incluyen la secuencia de cualquiera de las cadenas ligeras de Ab1 mostradas (es decir, cualquiera de las SEQ ID NOs: 2, 20, 647, 651, 660, 6 66 , 699, 702, 706 o 709) en la que la secuencia completa de CDR1 está reemplazada o en la que al menos un residuo en la secuencia de CDR1 está sustituida por el residuo en la posición correspondiente de cualquiera de las otras secuencias de CDR1 de cadena ligera expuestas (es decir, cualquiera de la SEQ ID NO: 23, 39, 55, 71, 87, 103, 124, 140, 156, 172, 188, 204, 220, 236, 252, 268, 284, 300, 316, 332, 348, 364, 380, 396, 412, 428, 444, 460, 476, 492, 508, 524, 540, 556 o 572); y/o en el que se reemplaza la secuencia de CDR2 completa o en el que al menos un residuo en la secuencia de CDR2 está sustituido por el residuo en la posición correspondiente de cualquiera de las otras secuencias de CDR2 de cadena ligera expuestas (es decir, cualquiera de las SEQ ID NO: 24, 40, 56, 72, 88 , 104, 125, 141, 157, 173, 189, 205, 221, 237, 253, 269, 285, 301, 317, 333, 349, 365, 381, 397, 413, 429, 445, 461,477, 493, 509, 525, 541, 557 o 573); y/o en el que se reemplaza toda la secuencia de CDR3 o en la que al menos un residuo en la secuencia de CDR3 está sustituido por el residuo en la posición correspondiente de cualquiera de las otras secuencias de CDR3 de cadena ligera expuestas (es decir, cualquiera de las Se Q ID NO: 25, 41, 57, 73, 89, 105, 126, 142, 158, 174, 190, 206, 2 2 2 , 238, 254, 270, 286, 302, 318, 334, 350, 366, 382, 398, 414, 430, 446, 462, 478, 494, 510, 526, 542, 558 o 574).
Los ejemplos de variantes de la cadena pesada de Ab1 incluyen la secuencia de cualquiera de las cadenas pesadas de Ab1 mostradas (es decir, cualquiera de las SEQ ID NOs: 3, 18, 19, 652, 656, 657, 658, 661, 664, 665, 704 o 708) en la que la secuencia de CDR1 completa está reemplazada o en la que al menos un residuo en la secuencia de CDR1 está sustituido por el residuo en la posición correspondiente de cualquiera de las otras secuencias de CDR1 de cadena pesada expuestas (es decir, cualquiera de las SEQ ID NOs: 26, 42, 58, 74, 90, 106, 127, 143, 159, 175, 191, 207, 223, 239, 255, 271, 287, 303, 319, 335, 351, 367, 383, 399, 415, 431, 447, 463, 479, 495, 511, 527, 543, 559 o 575); y/o en la que la secuencia de CDR2 completa está reemplazada o en la que al menos un residuo en la secuencia de c DR2 está sustituido por el residuo en la posición correspondiente de una CDR2 de cadena pesada de Ab1, tal como los que se indican en la Tabla 4 (es decir, cualquiera de las SEQ ID NO: 8 , o 120) o cualquiera de las otras secuencias CDR2 de cadena pesada expuestas (es decir, cualquiera de las SEQ ID NOs: 27, 43, 59, 75, 91, 107, 121, 128, 144, 160, 176, 192, 208, 224, 240, 256, 272, 288, 304, 320, 336, 352, 368, 384, 400, 416, 432, 448, 464, 480, 496, 512, 528, 544, 560 o 576 ); y/o en la que se reemplaza toda la secuencia de CDR3 o en la que al menos un residuo en la secuencia de CDR3 está sustituido por el residuo en la posición correspondiente de cualquiera de las otras secuencias de CDR3 de cadena pesada expuestas (es decir, cualquiera de las SEQ ID NOs: 28, 44, 60, 76, 92, 108, 129, 145, 161, 177, 193, 209, 225, 241, 257, 273, 289, 305, 321, 337, 353, 369, 385, 401, 417, 433, 449, 465, 481,497, 513, 529, 545, 561 o 577).
En otra realización, la invención contempla otros anticuerpos, como por ejemplo anticuerpos quiméricos o humanizados, que comprenden las secuencias polipeptídicas de la SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5; y SEQ ID NO: 6 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 2, y las secuencias polipeptídicas de la SEQ ID NO: 7 (CDR1); SEQ ID NO: 8 (CDR2); SEQ ID NO: 120 (CDR2); y SEQ ID NO: 9 (CDR3) que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 19. Otros anticuerpos descritos en este documento incluyen combinaciones de las CDR y las secuencias de cadena ligera y pesada variables expuestas anteriormente, incluidas las expuestas en las Figuras 1-5, y las identificadas en la Tabla 4.
En otro aspecto, el anticuerpo anti-IL- 6 de la divulgación es uno que comprende al menos uno de los siguientes: una cadena ligera CDR1 codificada por la secuencia en la SEQ ID NO: 12 o la SEQ ID NO: 694; una CDR2 de cadena ligera codificada por la secuencia en la SEQ ID NO: 13; una CDR3 de cadena ligera codificada por la secuencia en la SEQ ID NO: 14 o la SEQ ID NO: 695; una CDR1 de cadena pesada codificada por la secuencia en la SEQ ID NO: 15, una CDR2 de cadena pesada codificada por la SEQ ID NO: 16 o la SEQ ID n O: 696 y una CDR3 de cadena pesada codificada por la SEQ ID NO: 17 o la SEQ ID NO: 697 Además, la divulgación abarca tales secuencias de ácido nucleico y variantes de las mismas.
En otro aspecto, la divulgación se dirige a secuencias de aminoácidos correspondientes a las CDR de dicho anticuerpo anti-IL- 6 que se seleccionan de la SEQ ID NO: 4 (CDR1), la SEQ ID NO: 5 (CDR2), la SEQ ID NO: 6 (CDR3), la SEQ ID NO: 7, la SEQ ID NO: 120 y la SEQ ID NO: 9.
También se describe un anticuerpo anti-IL- 6 que comprende una secuencia de ácido nucleico de cadena ligera de la SEQ ID NO: 10, 662, 698, 701, 705, 720, 721, 722 o 723; y/o una secuencia de ácido nucleico de cadena pesada de la SEQ ID NO: 11,663, 700, 703, 707, 724 o 725. También se describen los polipéptidos correspondientes codificados por cualquiera de las secuencias de ácido nucleico anteriores y combinaciones de las mismas.
También se describen anticuerpos anti-IL- 6 o una porción de los mismos codificados por una secuencia de ácido nucleico seleccionada de las comprendidas en las Se Q ID NOs: 10 , 12 , 13, 14, 662, 694, 695, 698, 701, 705., 720, 721, 722, 723, 11, 15, 16, 17, 663, 696, 697, 700, 703, 707, 724 y 725. Por ejemplo, la CDR1 en la cadena ligera puede estar codificada por la SEQ ID NO: 12 o 694, la CDR2 en la cadena ligera puede estar codificada por la SEQ ID NO: 13, la CDR3 en la cadena ligera puede estar codificada por la SEQ ID n O: 14 o 695; la CDR1 en la cadena pesada puede estar codificada por la SEQ ID NO: 15, la CDR2 en la cadena pesada puede estar codificada por la SEQ ID NO: 16 o 696, la CDR3 en la cadena pesada puede estar codificada por la SEQ ID NO: 17 o 697. Como se discutió anteriormente, los anticuerpos que contienen estas CDR pueden construirse usando marcos humanos apropiados basados en los procedimientos de humanización descritos en este documento.
También se describe una cadena ligera variable codificada por las SEQ ID NOs: 10, 662, 698, 701, 705, 720, 721, 722 o 723 y una cadena pesada variable de los anticuerpos anti-IL- 6 codificados por las SEQ ID NOs: 11, 663, 700, 703, 707, 724 o 725.
Las cadenas ligeras y pesadas variables del anticuerpo anti-IL-6 , respectivamente, pueden estar codificadas por las SEQ ID NOs: 10 y 11, o la SEQ ID NO: 698 y la SEQ ID NO: 700, o la SEQ ID NO: 701 y la SEQ ID NO: 703 o la SEQ ID NO: 705 y la SEQ ID NO: 707.
En el presente documento se describen constructos de ácido nucleico que contienen cualquiera de las secuencias de ácido nucleico anteriores y combinaciones de las mismas, así como células recombinantes que contienen estas secuencias de ácido nucleico y constructos que las contienen en las que estas secuencias o constructos de ácido nucleico pueden ser extracromosómicas o integradas en el genoma de la célula huésped.
En el presente documento se describen polipéptidos que contienen cualquiera de las CDR o combinaciones de las mismas enumeradas en las SEQ ID NO: 4, la SEQ ID NO: 5, la SEQ ID NO: 6 , la SEQ ID NO: 7, la SEQ ID NO: 8 , la SEQ ID NO: 120, la SEQ ID NO: 9 o polipéptidos que comprenden cualquiera de los polipéptidos ligeros variables comprendidos en las SEQ ID NOs: 2, 20, 647, 651, 660, 666 , 699, 702, 706 o 709 y/o los polipéptidos pesados variables comprendidos en las SEQ ID NO: 3, 18, 19, 652, 656, 657, 658, 661, 664, 665, 704 o 708.
En el presente documento se describe un anticuerpo anti-IL- 6 que comprende al menos uno de los siguientes: una cadena ligera variable codificada por la secuencia en la SEQ ID NO: 10 o la SEQ ID NO: 698 o la SEQ ID NO: 701 o la SEQ ID NO: 705 y una cadena variable codificada por la secuencia en la SEQ ID NO: 11 o la SEQ ID NO: 700 o la SEQ ID NO: 703 o la SEQ ID NO: 707.
En otro aspecto, el anticuerpo anti-IL- 6 es una variante de las secuencias anteriores que incluye al menos una sustitución en el marco y/o secuencias de CDR y que tiene al menos una de las propiedades de Ab1 in vitro y/o tras administración in vivo.
Estas propiedades in vitro e in vivo se describen con más detalle en los ejemplos siguientes e incluyen: competir con Ab1 por la unión a IL- 6 y/o péptidos de la misma; que tiene una afinidad de unión (Kd) para iL- 6 de menos de aproximadamente 50 picomolar, y/o una velocidad de disociación (Kdisociación) de IL- 6 menor o igual a 10' 4 S-1; que tiene una semivida in vivo de al menos aproximadamente 22 días en un sujeto humano sano; capacidad para prevenir o tratar la hipoalbunemia; capacidad para prevenir o tratar la CRP elevada; capacidad para prevenir o tratar la coagulación anormal; y/o capacidad para disminuir el riesgo de trombosis en un individuo que tiene una enfermedad o afección asociada con un mayor riesgo de trombosis. En este documento se exponen ejemplos no limitantes adicionales de actividad anti-IL-6 , por ejemplo, bajo el título "Actividad anti-IL-6 ".
En el presente documento se describe un anticuerpo anti-IL-6 que incluye al menos una de las secuencias de CDR de cadena ligera y/o cadena pesada de Ab1 (véase Tabla 4) o una variante o variantes de la misma que tiene al menos una de las propiedades de Ab1 in vitro y/o tras la administración in vivo (los ejemplos de tales propiedades se analizan en el párrafo anterior). Un experto en la técnica entendería cómo combinar estas secuencias de CDR para formar una superficie de unión a antígeno, por ejemplo por enlace a al menos una estructura que puede comprender secuencias de estructura humana o de otro mamífero, o sus ortólogos funcionales derivados de un SMIP (inmunofármaco de molécula pequeña), cuerpo de camello, nanocuerpo, IgNAR, otra inmunoglobulina u otro anticuerpo modificado. Véase, por ejemplo, Robak y Robak (2011) BioDrugs 25 (1): 13-25 y Wesolowski, et al. (2009) Med Microbiol Immunol 198: 157-174. Por ejemplo, un anticuerpo de acuerdo con la divulgación puede unirse específicamente a la IL-6 humana e incluir una, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más de las siguientes secuencias de CDR o variantes de las mismas: un polipéptido que tiene al menos 72,7% de identidad de secuencia (es decir, 8 de 11 aminoácidos) con la CDR1 de cadena ligera de la SEQ ID NO: 4; un polipéptido que tiene al menos una identidad de 81,8% (es decir, 9 de 11 aminoácidos) con la CDR1 de cadena ligera de la SEQ ID NO: 4; un polipéptido que tiene al menos una identidad de 90,9% (es decir, 10 de 11 aminoácidos) con la CDR1 de cadena ligera de la SEQ ID NO: 4; un polipéptido que tiene una identidad del 100% (es decir, 11 de 11 aminoácidos) con la CDR1 de cadena ligera de la s Eq ID NO: 4; un polipéptido que tiene al menos 85,7% de identidad de secuencia (es decir, 6 de 7 aminoácidos) con la CDR2 de cadena ligera de la SEQ ID NO: 5; un polipéptido que tiene un 100% de identidad (es decir, 7 de 7 aminoácidos) de identidad con la CDR2 de cadena ligera de la SEQ ID NO: 5; un polipéptido que tiene al menos un 50% de identidad de secuencia (es decir, 6 de 12 aminoácidos) con la CDR3 de cadena ligera de la SEQ ID NO: 6 ; un polipéptido que tiene al menos un 58,3% de identidad de secuencia (es decir, 7 de 12 aminoácidos) con la CDR3 de cadena ligera de la SEQ ID NO: 6 ;
un polipéptido que tiene al menos 6 6 ,6 % de identidad (es decir, 8 de 12 aminoácidos) con la CDR3 de cadena ligera de la SEQ ID NO: 6 ; un polipéptido que tiene al menos 75% de identidad (es decir, 9 de 12 aminoácidos) con la CDR3 de cadena ligera de la SEQ ID NO: 6 ; un polipéptido que tiene al menos un 83,3% de identidad de secuencia (es decir, 10 de 12 aminoácidos) con la CDR3 de cadena ligera de la SEQ ID NO: 6 ; un polipéptido que tiene al menos 91,6% de identidad de secuencia (es decir, 11 de 12 aminoácidos) con la CDR3 de cadena ligera de la SEQ ID NO: 6 ; un polipéptido que tiene 100% (es decir, 12 de 12 aminoácidos) de identidad con la CDR3 de cadena ligera de la SEQ ID NO: 6 ; un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia (es decir, 4 de 5 aminoácidos) con la CDR1 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 7; un polipéptido que tiene 100% de identidad (es decir, 5 de 5 aminoácidos) con la CDR1 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 7; un polipéptido que tiene al menos 50% de identidad de secuencia (es decir, 8 de 16 aminoácidos) con la CDR2 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 120; un polipéptido que tiene al menos 56,2% de identidad de secuencia (es decir, 9 de 16 aminoácidos) con la CDR2 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 120; un polipéptido que tiene al menos 62,5% de identidad de secuencia (es decir, 10 de 16 aminoácidos) con la CDR2 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 120; un polipéptido que tiene al menos 68,7% de identidad de secuencia (es decir, 11 de 16 aminoácidos) con la CDR2 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 120; un polipéptido que tiene al menos 75% de identidad de secuencia (es decir, 12 de 16 aminoácidos) con la CDR2 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 120;
un polipéptido que tiene al menos un 81,2% de identidad de secuencia (es decir, 13 de 16 aminoácidos) con la CDR2 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 120; un polipéptido que tiene al menos 87,5% de identidad de secuencia (es decir, 14 de 16 aminoácidos) con la CDR2 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 120; un polipéptido que tiene al menos un 93,7% de identidad de secuencia (es decir, 15 de 16 aminoácidos) con la CDR2 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 120; un polipéptido que tiene 100% de identidad (es decir, 16 de 16 aminoácidos) con la CDR2 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 120; un polipéptido que tiene al menos un 33,3% de identidad de secuencia (es decir, 4 de 12 aminoácidos) con la CDR3 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 9; un polipéptido que tiene al menos 41,6% de identidad (es decir, 5 de 12 aminoácidos) con la CDR3 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 9; un polipéptido que tiene al menos 50% de identidad de secuencia (es decir, 6 de 12 aminoácidos) con la CDR3 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 9; un polipéptido que tiene al menos un 58,3% de identidad de secuencia (es decir, 7 de 12 aminoácidos) con la CDR3 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 9; un polipéptido que tiene al menos 6 6 ,6 % de identidad de secuencia (es decir, 8 de 12 aminoácidos) con la CDR3 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 9; un polipéptido que tiene al menos 75% de identidad de secuencia (es decir, 9 de 12 aminoácidos) con la CDR3 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 9; un polipéptido que tiene al menos un 83,3% de identidad de secuencia (es decir, 10 de 12 aminoácidos) con la CDR3 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 9; un polipéptido que tiene al menos 91,6% de identidad de secuencia (es decir, 11 de 12 aminoácidos) con la CDR3 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 9; un polipéptido que tiene 100% de identidad (es decir, 12 de 12 aminoácidos) con la CDR3 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 9; un polipéptido que tiene al menos un 90,9% de identidad de secuencia (es decir, 10 de 11 aminoácidos) con la CDR1 de cadena ligera de la SEQ ID NO: 4; un polipéptido que tiene un 100% de identidad (es decir, 11 de 11 aminoácidos) con la CDR1 de cadena ligera de la SEQ ID NO: 4; un polipéptido que tiene al menos 85,7% de identidad de secuencia (es decir, 6 de 7 aminoácidos) con la CDR2 de cadena ligera de la SEQ ID NO: 5; un polipéptido que tiene un 100% de identidad (es decir, 7 de 7 aminoácidos) con la CDR2 de cadena ligera de la SEQ ID NO: 5; un polipéptido que tiene al menos un 6 6 ,6 % de identidad de secuencia (es decir, 8 de 12 aminoácidos) con la CDR3 de cadena ligera de la SEQ ID NO: 6 ; un polipéptido que tiene al menos 75% de identidad de secuencia (es decir, 9 de 12 aminoácidos) con la CDR3 de cadena ligera de la SEQ ID NO: 6 ; un polipéptido que tiene al menos un 83,3% de identidad de secuencia (es decir, 10 de 12 aminoácidos) con la CDR3 de cadena ligera de la SEQ ID NO: 6 ; un polipéptido que tiene al menos 91,6% de identidad de secuencia (es decir, 11 de 12 aminoácidos) con la CDR3 de cadena ligera de la SEQ ID NO: 6 ; un polipéptido que tiene un 100% de similitud (es decir, 12 de 12 aminoácidos) con la CDR3 de cadena ligera de la SEQ ID NO: 6 ; un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia (es decir, 4 de 5 aminoácidos) con la CDR1 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 7; un polipéptido que tiene un 100% de similitud (es decir, 5 de 5 aminoácidos) con la CDR1 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 7; un polipéptido que tiene al menos 56,2% de identidad de secuencia (es decir, 9 de 16 aminoácidos) con la CDR2 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 120; un polipéptido que tiene al menos 62,5% de identidad de secuencia (es decir, 10 de 16 aminoácidos) con la CDR2 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 120; un polipéptido que tiene al menos 68,7% de identidad de secuencia (es decir, 11 de 16 aminoácidos) con la CDR2 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 120; un polipéptido que tiene al menos 75% de identidad de secuencia (es decir, 12 de 16 aminoácidos) con la CDR2 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 120; un polipéptido que tiene al menos un 81,2% de identidad de secuencia (es decir, 13 de 16 aminoácidos) con la CDR2 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 120; un polipéptido que tiene al menos 87,5% de identidad de secuencia (es decir, 14 de 16 aminoácidos) con la CDR2 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 120; un polipéptido que tiene al menos un 93,7% de identidad de secuencia (es decir, 15 de 16 aminoácidos) con la CDR2 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 120; un polipéptido que tiene un 100% de similitud (es decir, 16 de 16 aminoácidos) con la CDR2 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 120; un polipéptido que tiene al menos 50% de similitud de secuencia (es decir, 6 de 12 aminoácidos) con la CDR3 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 9; un polipéptido que tiene al menos un 58,3% de identidad de secuencia (es decir, 7 de 12 aminoácidos) con la CDR3 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 9; un polipéptido que tiene al menos 66 ,6 % de identidad de secuencia (es decir, 8 de 12 aminoácidos) con la CDR3 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 9; un polipéptido que tiene al menos 75% de identidad de secuencia (es decir, 9 de 12 aminoácidos) con la CDR3 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 9; un polipéptido que tiene al menos un 83,3% de identidad de secuencia (es decir, 10 de 12 aminoácidos) con la CDR3 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 9; un polipéptido que tiene al menos 91,6% de identidad de secuencia (es decir, 11 de 12 aminoácidos) con la CDR3 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 9; o un polipéptido que tiene un 100% de similitud (es decir, 12 de 12 aminoácidos) con la CDR3 de cadena pesada de la Se Q ID NO: 9.
Otros aspectos de la divulgación incluyen al menos un polinucleótido que codifica cualquiera de los anteriores, por ejemplo, un polinucleótido que codifica un polipéptido que se une específicamente a una IL- 6 humana e incluye una, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más de las siguientes c Dr o variantes de las mismas:
un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos 72,7% de identidad de secuencia (es decir, 8 de 11 aminoácidos) con la CDR1 de cadena ligera de la SEQ ID NO: 4; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos un 81,8% de identidad de secuencia (es decir, 9 de 11 aminoácidos) con la CDR1 de cadena ligera de la SEQ ID NO: 4; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos un 90,9% de identidad de secuencia (es decir, 10 de 11 aminoácidos) con la CDR1 de cadena ligera de la SEQ ID NO: 4; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene 100% de identidad de secuencia con la CDR1 de cadena ligera de la SEQ ID NO: 4; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos 85,7% de identidad de secuencia (es decir, 6 de 7 aminoácidos) con la CDR2 de cadena ligera de la SEQ ID NO: 5; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una identidad de secuencia del 100% con la CDR2 de cadena ligera de la SEQ ID NO: 5; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos 50% de identidad de secuencia (es decir, 6 de 12 aminoácidos) con la CDR3 de cadena ligera de la SEQ ID NO: 6 ; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos 58,3% de identidad de secuencia (es decir, 7 de 12 aminoácidos) con la CDR3 de cadena ligera de la SEQ ID NO: 6 ; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos 6 6 ,6 % de identidad de secuencia (es decir, 8 de 12 aminoácidos) con la CDR3 de cadena ligera de la SEQ ID NO: 6 ; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos 75% de identidad de secuencia (es decir, 9 de 12 aminoácidos) con la CDR3 de cadena ligera de la SEQ ID NO: 6 ; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos un 83,3% de identidad de secuencia (es decir, 10 de 12 aminoácidos) con la CDR3 de cadena ligera de la SEQ ID NO: 6 ; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos 91,6% de identidad de secuencia (es decir, 11 de 12 aminoácidos) con la CDR3 de cadena ligera de la SEQ ID NO: 6 ; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene 100% de identidad de secuencia con la CDR3 de cadena ligera de la SEQ ID NO: 6 ; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia (es decir, 4 de 5 aminoácidos) con la CDR1 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 7; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene 100% de identidad con la CDR1 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 7; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos 50% de identidad de secuencia (es decir, 8 de 16 aminoácidos) con la CDR2 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 120; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos un 56,2% de identidad de secuencia (es decir, 9 de 16 aminoácidos) con la CDR2 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 120; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos un 62,5% de identidad de secuencia (es decir, 10 de 16 aminoácidos) con la CDR2 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 120; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos 68,7% de identidad de secuencia (es decir, 11 de 16 aminoácidos) con la CDR2 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 120; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos 75% de identidad de secuencia (es decir, 12 de 16 aminoácidos) con la CDR2 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 120; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos un 81,2% de identidad de secuencia (es decir, 13 de 16 aminoácidos) con la CDR2 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 120; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos 87,5% de identidad de secuencia (es decir, 14 de 16 aminoácidos) con la CDR2 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 120; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos un 93,7% de identidad de secuencia (es decir, 15 de 16 aminoácidos) con la CDR2 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 120; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene 100% de identidad con la CDR2 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 120; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos un 33,3% de identidad de secuencia (es decir, 4 de 12 aminoácidos) con la CDR3 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 9; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos 41,6% de identidad (es decir, 5 de 12 aminoácidos) con la CDR3 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 9; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos 50% de identidad de secuencia (es decir, 6 de 12 aminoácidos) con la CDR3 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 9; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos 58,3% de identidad de secuencia (es decir, 7 de 12 aminoácidos) con la CDR3 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 9; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos 6 6 ,6 % de identidad de secuencia (es decir, 8 de 12 aminoácidos) con la CDR3 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 9; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos 75% de identidad de secuencia (es decir, 9 de 12 aminoácidos) con la CDR3 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 9; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos un 83,3% de identidad de secuencia (es decir, 10 de 12 aminoácidos) con la CDR3 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 9; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos 91,6% de identidad de secuencia (es decir, 11 de 12 aminoácidos) con la CDR3 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 9; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene 100% de identidad (es decir, 12 de 12 aminoácidos) con la CDR3 de cadena pesada de la SEQ iD NO: 9; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos un 90,9% de identidad de secuencia (es decir, 10 de 11 aminoácidos) con la CDR1 de cadena ligera de la SEQ ID NO: 4; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene 100% de similitud de secuencia con la CDR1 de cadena ligera de la SEQ ID NO: 4; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos 85,7% de identidad de secuencia (es decir, 6 de 7 aminoácidos) con la CDR2 de cadena ligera de la SEQ ID NO: 5; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene 100% de similitud de secuencia con la CDR2 de cadena ligera de la SEQ ID NO: 5; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos 6 6 ,6 % de identidad de secuencia (es decir, 8 de 12 aminoácidos) con la CDR3 de cadena ligera de la SEQ ID NO: 6 ; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos 75% de identidad de secuencia (es decir, 9 de 12 aminoácidos) con la CDR3 de cadena ligera de la SEQ ID NO: 6 ; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos un 83,3% de identidad de secuencia (es decir, 10 de 12 aminoácidos) con la CDR3 de cadena ligera de la SEQ ID NO: 6 ; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos 91,6% de identidad de secuencia (es decir, 11 de 12 aminoácidos) con la CDR3 de cadena ligera de la SEQ ID NO: 6 ; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene 100% de similitud de secuencia con la CDR3 de cadena ligera de la SEQ ID NO: 6 ; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia (es decir, 4 de 5 aminoácidos) con la CDR1 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 7; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene un 100% de similitud de secuencia con la CDR1 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 7; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos un 56,2% de identidad de secuencia (es decir, 9 de 16 aminoácidos) con la CDR2 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 120; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos un 62,5% de identidad de secuencia (es decir, 10 de 16 aminoácidos) con la CDR2 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 120; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos 68,7% de identidad de secuencia (es decir, 11 de 16 aminoácidos) con la CDR2 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 120; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos 75% de identidad de secuencia (es decir, 12 de 16 aminoácidos) con la CDR2 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 120; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos un 81,2% de identidad de secuencia (es decir, 13 de 16 aminoácidos) con la CDR2 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 120; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos 87,5% de identidad de secuencia (es decir, 14 de 16 aminoácidos) con la CDR2 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 120; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos un 93,7% de identidad de secuencia (es decir, 15 de 16 aminoácidos) con la CDR2 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 120;
un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene 100 % de similitud de secuencia (es decir, 16 de 16 aminoácidos) con la CDR2 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 120; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos un 50% de similitud de secuencia (es decir, 6 de 12 aminoácidos) con la CDR3 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 9; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos un 58,3% de identidad de secuencia (es decir, 7 de 12 aminoácidos) con la CDR3 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 9; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos 66 ,6 % de identidad de secuencia (es decir, 8 de 12 aminoácidos) con la CDR3 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 9; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos 75% de identidad de secuencia (es decir, 9 de 12 aminoácidos) con la CDR3 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 9; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos un 83,3% de identidad de secuencia (es decir, 10 de 12 aminoácidos) con la CDR3 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 9; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos 91,6% de identidad de secuencia (es decir, 11 de 12 aminoácidos) con la CDR3 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 9; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene un 100% de similitud de secuencia (es decir, 12 de 12 aminoácidos) con la CDR3 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 9.
T l 4: n i m l n i r n i-IL-
Figure imgf000039_0001
continuación
Figure imgf000040_0001
continuación
Figure imgf000041_0001
continuación
Figure imgf000042_0001
Como referencia, los identificadores de secuencia distintos de los incluidos en la Tabla 4 se resumen en la Tabla 5.
Tabla 5: Resumen de identificadores de secuencia en esta a licación.
Figure imgf000042_0002
Tales fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos pueden estar presentes en al menos una de las siguientes formas no limitantes: formas de anticuerpo Fab, Fab', F(ab')2, Fv y Fv de cadena sencilla. En una realización preferida, los anticuerpos anti-IL- 6 descritos en el presente documento comprenden además la secuencia de cadena ligera constante kappa que comprende la secuencia expuesta en la secuencia polipeptídica de la SEQ ID NO: 586.
En otra realización preferida, los anticuerpos anti-IL- 6 descritos en el presente documento comprenden además la secuencia polipeptídica de cadena pesada constante gamma-1 que comprende una de las secuencias expuestas en la secuencia polipeptídica de la SeQ ID NO: 588 y la SEQ ID NO: 719.
Las realizaciones de los anticuerpos descritos en el presente documento pueden incluir una secuencia líder, tal como un líder de Ig de conejo, un prepéptido de albúmina, una secuencia líder de secreción pre-pro del factor de apareamiento de levadura (tal como P. pastoris o Saccharomyces cerevisiae o el factor alfa), o líder de HAS humana. Los ejemplos de secuencias líder se muestran desplazadas de FR1 en el extremo terminal N de los polipéptidos mostrados en las Figuras 4A-B y 5A-B como sigue: secuencias líder de Ig de conejo en las SEQ ID NOs: 2 y 660 y las SEQ ID NO: 3 y 661; y un prepéptido de albúmina en las SEQ ID NO: 706 y 708, que facilita la secreción. También pueden usarse otras secuencias líder conocidas en la técnica por conferir propiedades deseadas, tales como secreción, estabilidad mejorada o semivida, ya sea solas o combinadas entre sí, en las cadenas pesadas y/o ligeras, que opcionalmente pueden ser escindidas antes de la administración a un sujeto. Por ejemplo, un polipéptido puede expresarse en una célula o un sistema de expresión libre de células que también expresa o incluye (o se modifica para expresar o incluir) una proteasa, por ejemplo, una peptidasa señal unida a la membrana, que escinde una secuencia líder.
En el presente documento se describe un anticuerpo anti-IL-6 aislado que comprende una secuencia polipeptídica Vh que comprende: las SEQ ID NOs: 3, 18, 19, 22, 38, 54, 70, 86 , 102, 117, 118, 123, 139, 155, 171, 187, 203, 219, 235, 251, 267, 283, 299, 315, 331, 347, 363, 379, 395, 411, 427, 443, 459, 475, 491, 507, 523, 539, 555, 571, 652, 656, 657, 658, 661, 664, 665, 668 , 672, 676, 680, 684, 6 88 , 691,692, 704 o 708; y que comprende además una secuencia polipeptídica VL que comprende: las SEQ ID NOs: 2, 20, 21, 37, 53, 69, 85, 101, 119, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346, 362, 378, 394, 410, 426, 442, 458, 474, 490, 506, 522, 538, 554, 570, 647, 651, 660, 6 66 , 667, 671, 675, 679, 683, 687, 693, 699, 702, 706 o 709 o una variante de las mismos en las que al menos uno de los residuos marco (residuos FR) o residuos de CDR en dicho polipéptido Vh o Vl ha sido sustituido con otro residuo de aminoácido que da como resultado un anticuerpo anti-IL- 6 que se une específicamente a IL-6. La invención contempla formas humanizadas y quiméricas de estos anticuerpos en las que preferiblemente las FR comprenderán FR humanas altamente homólogas al anticuerpo original. Los anticuerpos quiméricos pueden incluir un Fc derivado de las regiones constantes de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgG5, IgG6 , IgG7, IgG8 , IgG9, IgG10, IgG11, IgG12, IgG13, IgG14, IgG15, IgG16, IgG17, IgG18 o IgG19 y en particular, una región constante de cadena ligera y pesada variable como se expone en la SEQ ID NO: 588 y la SEQ ID NO: 586.
En una realización de la invención, los anticuerpos o polipéptidos Vh o Vl se originan o se seleccionan de al menos una población de células B de conejo antes del inicio del proceso de humanización al que se hace referencia en este documento.
En otra realización de la invención, los anticuerpos anti-IL- 6 y sus fragmentos y variantes tienen especificidad de unión por homólogos de primates de la proteína IL- 6 humana. Ejemplos no limitantes de homólogos de primates de la proteína IL- 6 humana son IL- 6 obtenida de Macaca fascicularis (mono cynomolgus) y el mono Rhesus. En otra realización de la invención, los anticuerpos anti-IL- 6 y sus fragmentos y variantes inhiben la asociación de IL- 6 con IL-6 R, y/o la producción de complejos IL-6/IL-6R/gp130 y/o la producción de multímeros de IL-6/IL-6R/gp130 y/o antagoniza los efectos biológicos de al menos uno de los anteriores.
Anticuerpo policlonal
Los anticuerpos policlonales son poblaciones heterogéneas de moléculas de anticuerpos derivadas de los sueros de animales inmunizados con un antígeno. Los anticuerpos policlonales que se unen selectivamente a la IL- 6 pueden prepararse mediante procedimientos bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Howard y Kaser (2007) Making and Using Antibodies: A Practical Handbook CRC Press.
Anticuerpo monoclonal
Un anticuerpo monoclonal contiene una población sustancialmente homogénea de anticuerpos específicos para antígenos, población que contiene sitios de unión de epítopos sustancialmente similares. Los anticuerpos monoclonales pueden obtenerse mediante procedimientos conocidos por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Kohler y Milstein (1975) Nature 256: 495-497; patente de los Estados Unidos No. 4.376.110; Ausubel et al., [Eds.] (2011) CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Assoc. y Wiley Interscience, NY; y Harlow & Lane (1998) USING ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory; Colligan et al., (2005) [Eds.] Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. y Wiley Interscience, n Y. Dichos anticuerpos pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulina, incluidas IgG, IgM, IgE, IgA, GILD y cualquier subclase de las mismas. Un hibridoma que produce un anticuerpo de la presente invención puede cultivarse in vitro, in situ o in vivo.
Anticuerpo quimérico
Los anticuerpos quiméricos son moléculas cuyas porciones diferentes se derivan de diferentes especies animales, tales como aquellas que tienen una región variable derivada de un anticuerpo murino y una región constante de inmunoglobulina humana, que se utilizan principalmente para reducir la inmunogenicidad en la aplicación y para aumentar los rendimientos en producción, por ejemplo, cuando los anticuerpos monoclonales murinos tienen mayores rendimientos de hibridomas pero mayor inmunogenicidad en seres humanos, de modo que se utilizan anticuerpos monoclonales quiméricos murinos humanos. Los anticuerpos quiméricos y los procedimientos para su producción son conocidos en la técnica. Vease Cabilly, et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3273-3277; Morrison et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855, Boulianne, et al. (1984) Nature 312: 643-646; Neuberger et al., (1985) Nature 314: 268-270; Solicitud de patente europea 173494 (1986); documento WO 86/01533 (1986); Patente europea 184187 (1992); Sahagan et al., (1986) J. Immunol. 137: 1066-1074; Liu et al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3439 -344 3 ; Sun et al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 214-218; Better, et al., (1988) Science 240: 1041-1043; y Harlow & Lane (1998) USING ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory; y patente de Estados Unidos No. 5.624.659.
Anticuerpo humanizado
Los anticuerpos humanizados se diseñan para contener aún más dominios de inmunoglobulina de tipo humano e incorporan solo las regiones determinantes de complementariedad del anticuerpo derivado de animal. Esto se puede lograr examinando la secuencia de los bucles hipervariables de las regiones variables del anticuerpo monoclonal y ajustándolos a la estructura de las cadenas de anticuerpos humanos. Véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos No. 6.187.287. Asimismo, otros procedimientos para producir anticuerpos humanizados son ahora bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos Nos. 5.225.539; 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762; 6.054.297; 6.180.370; 6.407.213; 6.548.640; 6.632.927; y 6.639.055; Jones et al., (1986) Nature 321: 522-525; Reichmann et al., (1988) Nature 332: 323-327; Verhoeyen et al., (1988) Science 239: 1534-36; y Zhiqiang An (2009) [Ed.] Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic, John Wiley & Sons, Inc.
Fragmentos de anticuerpos (fragmentos de unión a antígenos)
Además de las inmunoglobulinas completas (o sus contrapartes recombinantes), se pueden sintetizar fragmentos de inmunoglobulina que comprenden el sitio de unión al epítopo (por ejemplo, Fab', F(ab')2 u otros fragmentos). Pueden diseñarse un "fragmento" o inmunoglobulinas mínimas utilizando técnicas de inmunoglobulinas recombinantes. Por ejemplo, las inmunoglobulinas "Fv" para su uso en la presente invención pueden producirse sintetizando una región de cadena ligera variable fusionada y una región de cadena pesada variable. También son de interés las combinaciones de anticuerpos, por ejemplo diacuerpos, que comprenden dos especificidades distintas de Fv. Los fragmentos de anticuerpos de inmunoglobulinas incluyen, pero sin limitarse a, SMIP (inmunofármacos de molécula pequeña), cuerpos de camello, nanocuerpos e IgNAR. Además, los fragmentos de unión al antígeno pueden comprender el sitio de unión al epítopo y tener la misma selectividad de unión al antígeno que el anticuerpo.
Un fragmento de unión a antígeno (por ejemplo, un fragmento Fab) puede comprender al menos un dominio constante y uno variable de cada una de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo del que se deriva. Estos dominios dan forma al parátopo, el sitio de unión al antígeno, en el extremo terminal amino del monómero. Los dos dominios variables se unen al epítopo en sus antígenos específicos. Los fragmentos Fc y Fab se pueden generar usando papaína que escinde el monómero de inmunoglobulina en dos fragmentos Fab y un fragmento Fc. La pepsina se escinde por debajo de la región de bisagra, por lo que se pueden formar un fragmento F(ab')2 y un fragmento pFc'. Otra enzima, IdeS (enzima degradante de inmunoglobulina de Streptococcus pyogenes, nombre comercial FabRICATOR®) escinde la IgG de una manera específica de secuencia a pH neutro. El fragmento F(ab')2 se puede dividir en dos fragmentos Fab' mediante reducción suave. Además, las regiones variables de las cadenas pesada y ligera pueden fusionarse para formar un fragmento variable de cadena sencilla (scFv), que tiene solo la mitad del tamaño del fragmento Fab, pero conserva la especificidad original del anticuerpo original.
Anticuerpo antiidiotípico
Un anticuerpo antiidiotípico (anti-Id) es un anticuerpo que reconoce determinantes únicos generalmente asociados con el sitio de unión al antígeno de un anticuerpo. Se puede preparar un anticuerpo de Id inmunizando un animal de la misma especie y tipo genético (por ejemplo, cepa de ratón) como fuente del anticuerpo con el anticuerpo para el que se está preparando un anti-Id. El animal inmunizado reconocerá y responderá a los determinantes idiotípicos del anticuerpo inmunizante produciendo un anticuerpo contra estos determinantes idiotípicos (el anticuerpo anti-Id). Véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos No. 4.699.880. El anticuerpo anti-Id también puede usarse como un "inmunógeno" para inducir una respuesta inmune en otro animal más, produciendo un denominado anticuerpo antianti-Id. El anti-anti-Id puede ser epitópicamente idéntico al anticuerpo original que indujo el anti-Id. Por lo tanto, mediante el uso de anticuerpos para los determinantes idiotípicos de un anticuerpo, es posible identificar otros clones que expresan anticuerpos de idéntica especificidad.
Anticuerpos diseñados y modificados
Además, se puede preparar un anticuerpo de la divulgación utilizando un anticuerpo que tenga al menos una de las secuencias de VH y/o VL derivadas de un material de partida de anticuerpo para diseñar un anticuerpo modificado, cuyo anticuerpo modificado puede tener propiedades alteradas del anticuerpo de partida. Se puede diseñar un anticuerpo modificando al menos un residuo dentro de una o ambas regiones variables (es decir, VH y/o VL), por ejemplo, dentro de al menos una región CDR y/o dentro de al menos una región marco. Adicional o alternativamente, un anticuerpo puede diseñarse modificando residuos dentro de la región o regiones constantes, por ejemplo, para alterar la función o funciones efectoras del anticuerpo.
Un tipo de diseño de región variable que se puede realizar es el injerto de CDR. Los anticuerpos interactúan con los antígenos diana predominantemente a través de residuos de aminoácidos que se encuentran en las seis regiones determinantes de complementariedad (CDR) de las cadenas ligeras y pesadas. Por esta razón, las secuencias de aminoácidos dentro de las CDR son más diversas entre los anticuerpos individuales que las secuencias fuera de las CDR. Debido a que las secuencias de CDR son responsables de la mayoría de las interacciones anticuerpo-antígeno, es posible expresar anticuerpos recombinantes que imitan las propiedades de anticuerpos específicos de origen natural mediante la construcción de vectores de expresión que incluyen secuencias de CDR del anticuerpo específico de origen natural injertado en secuencias marco de un anticuerpo diferente, con diferentes propiedades. Véase, por ejemplo, Riechmann, et al. (1998) Nature 332: 323-327; Jones et al., (1986) Nature 321: 522-525; Queen et al., (1989) Proc. Natl. Acad. U.S.A. 86 : 10029-10033; patentes de los Estados Unidos Nos. 5.225.539; 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762; y 6.180.370.
Las secuencias marco adecuadas pueden obtenerse a partir de bases de datos públicas de ADN o referencias publicadas que incluyen secuencias de genes de anticuerpos de línea germinal. Por ejemplo, las secuencias de ADN de línea germinal para los genes de la región variable de la cadena ligera y pesada humana pueden encontrarse en la base de datos de secuencias de línea germinal humana "VBase" (disponible en Internet), así como en Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos, Publicación de los NIH No. 91-3242; Tomlinson et al., (1992) "The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops", J. Mol. Biol. 227: 776-798; y Cox, et al. (1994) Eur. J Immunol. 24: 827-836.
Otro tipo de modificación de la región variable es mutar residuos de aminoácidos dentro de las regiones VH y/o VL de CDR1, CDR2 y/o CDR3 para mejorar de ese modo al menos una propiedad de unión (por ejemplo, afinidad) del anticuerpo de interés. Puede realizarse mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis mediada por PCR para introducir la mutación o mutaciones y el efecto sobre la unión del anticuerpo, u otra propiedad funcional de interés, puede evaluarse en ensayos apropiados in vitro o in vivo. Preferiblemente, se pueden introducir modificaciones conservadoras (como se discute en este documento). Las mutaciones pueden ser sustituciones, adiciones o eliminaciones de aminoácidos, pero preferiblemente son sustituciones. Además, típicamente no se alteran más de uno, dos, tres, cuatro o cinco residuos dentro de una región CDR.
Los anticuerpos modificados genéticamente de la divulgación incluyen aquellos en los que se han realizado modificaciones en los residuos marco dentro de VH y/o VL, por ejemplo para mejorar las propiedades del anticuerpo. Normalmente, tales modificaciones del marco se realizan para disminuir la inmunogenicidad del anticuerpo. Por ejemplo, un enfoque consiste en "retromutar" al menos un residuo del marco a la correspondiente secuencia de la línea germinal. Más específicamente, un anticuerpo que ha sufrido una mutación somática puede contener residuos del marco que difieren de la secuencia de la línea germinal de la que se deriva el anticuerpo. Dichos residuos pueden identificarse comparando las secuencias marco del anticuerpo con las secuencias de línea germinal de las que se deriva el anticuerpo.
Además o como alternativa a las modificaciones realizadas dentro del marco o regiones CDR, los anticuerpos de la divulgación pueden diseñarse para incluir modificaciones dentro de la región Fc, típicamente para alterar al menos una de las propiedades funcionales del anticuerpo, tal como la semivida en suero, fijación del complemento, unión al receptor Fc y/o citotoxicidad celular dependiente de antígeno. Además, un anticuerpo de la divulgación puede modificarse químicamente (por ejemplo, al menos una de las fracciones químicas puede unirse al anticuerpo) o modificarse para alterar su glicosilación, nuevamente para alterar al menos una de las propiedades funcionales del anticuerpo. Tales realizaciones se describen más adelante. La numeración de residuos en la región Fc es el índice EU de Kabat.
La región bisagra de CH1 puede modificarse de modo que se altere el número de residuos de cisteína en la región bisagra, por ejemplo, aumente o disminuya. Véase la patente de los Estados Unidos No. 5.677.425. El número de residuos de cisteína en la región bisagra de CH1 puede alterarse para, por ejemplo, facilitar el ensamblaje de las cadenas ligera y pesada o para aumentar o disminuir la estabilidad del anticuerpo. La región bisagra de Fc de un anticuerpo se puede mutar para disminuir la semivida biológica del anticuerpo. Más específicamente, se pueden introducir mutaciones de al menos un aminoácido en la región de interfaz del dominio CH2-CH3 del fragmento de bisagra Fc de manera que el anticuerpo tenga una unión de proteína A de Staphylococcyl (SpA) alterada con respecto a la unión de SpA del dominio de bisagra Fc nativo. Vease, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos No.
6.165.745.
El anticuerpo puede modificarse para aumentar su semivida biológica. Son posibles varios enfoques. Por ejemplo, se puede introducir al menos una de las siguientes mutaciones: T252L, T254S, T256F. Véase la patente de los Estados Unidos No. 6.277.375. Alternativamente, para aumentar la semivida biológica, el anticuerpo se puede alterar dentro de la región CH1 o CL para que contenga un epítopo de unión al receptor de rescate tomado de dos bucles de un dominio CH2 de una región Fc de una IgG. Véanse las patentes de los Estados Unidos Nos. 5.869.046 y 6.121.022.
La región Fc se puede alterar reemplazando al menos un residuo de aminoácido con un residuo de aminoácido diferente para alterar la función o funciones efectoras del anticuerpo. Por ejemplo, al menos un aminoácido seleccionado de los residuos de aminoácidos 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 y 322 se puede reemplazar con un residuo de aminoácido diferente de modo que el anticuerpo tenga una afinidad alterada por un ligando efector pero conserva la capacidad de unión al antígeno del anticuerpo original. El ligando efector por el que se puede alterar la afinidad puede ser, por ejemplo, un receptor Fc o el componente C1 del complemento. Véanse las patentes de los Estados Unidos Nos. 5.624.821 y 5.648.260.
La región Fc se puede modificar para aumentar la afinidad del anticuerpo por un receptor Fcy modificando al menos un aminoácido en las siguientes posiciones: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265 , 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 o 439. Véase el documento WO 00/42072. Además, los sitios de unión en IgG1 humana para FcyRI, FcyRII, FcyRIII y FcRn han sido mapeados y variantes con unión mejorada. Véase Shields, et al. (2001) J. Biol. Chem. 276: 6591-6604. Se muestra que las mutaciones específicas en las posiciones 256, 290, 298, 333, 334 y 339 mejoran la unión a FcyRIII. Además, se ha demostrado que las siguientes combinaciones de mutantes mejoran la unión de FcyRIII: T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K224A y S298A/E333A/K334A.
La glicosilación de un anticuerpo puede modificarse. Por ejemplo, se puede preparar un anticuerpo aglicosilado (es decir, el anticuerpo carece de glicosilación). La glicosilación se puede alterar para, por ejemplo, aumentar la afinidad del anticuerpo por el antígeno. Tales modificaciones de carbohidratos pueden lograrse, por ejemplo, alterando al menos un sitio de glicosilación dentro de la secuencia del anticuerpo. Por ejemplo, se pueden realizar sustituciones de al menos un aminoácido que den como resultado la eliminación de al menos un sitio de glicosilación del marco de la región variable para eliminar de ese modo la glicosilación en ese sitio. Tal aglicosilación puede aumentar la afinidad del anticuerpo por el antígeno. Vease, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos Nos. 5.714.350 y 6.350.861.
Adicional o alternativamente, se puede preparar un anticuerpo que tenga un tipo alterado de glicosilación, tal como un anticuerpo hipofucosilado que tenga cantidades reducidas de residuos de fucosilo o un anticuerpo que tenga estructuras de GlcNac bisectantes aumentadas. Tales modificaciones de carbohidratos pueden lograrse, por ejemplo, expresando el anticuerpo en una célula huésped con maquinaria de glicosilación alterada. Se han descrito en la técnica células con maquinaria de glicosilación alterada y se pueden utilizar como células huésped en las que expresar anticuerpos recombinantes de la invención para producir de ese modo un anticuerpo con glicosilación alterada. Véase la publicación de la solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 2004/0110704 y Yamane-Ohnuki, et al. (2004) Biotechnol Bioeng. 87: 614-22; el documento EP 1.176.195; el documento WO 2003/035835; Shields et al., (2002) J. Biol. Chem. 277: 26733-26740; el documento WO 99/54342; Umana et al., (1999) Nat. Biotecnología. 17: 176-180; y Tarentino, et al. (1975) Biochem. 14: 5516-23.
Se puede pegilar un anticuerpo para, por ejemplo, aumentar la semivida biológica (por ejemplo, en suero) del anticuerpo. Para pegilar un anticuerpo, el anticuerpo, o fragmento del mismo, típicamente se hace reaccionar con polietilenglicol (p Eg ), como un éster reactivo o derivado de aldehído de PEG, bajo condiciones en las que al menos un grupo PEG se une al anticuerpo o fragmento de anticuerpo. Preferiblemente, la pegilación se lleva a cabo mediante una reacción de acilación o una reacción de alquilación con una molécula de PEG reactiva (o un polímero soluble en agua reactivo análogo).
En el presente documento se describen variantes y equivalentes que son sustancialmente homólogos a los anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, diacuerpos, SMIP, cuerpos de camello, nanocuerpos, IgNAR, polipéptidos, regiones variables y CDR expuestos en el presente documento. Estos pueden contener, por ejemplo, mutaciones de sustitución conservadoras (es decir, la sustitución de al menos un aminoácido por aminoácidos similares). Por ejemplo, la sustitución conservadora se refiere a la sustitución de un aminoácido por otro dentro de la misma clase general, por ejemplo, un aminoácido ácido con otro aminoácido ácido, un aminoácido básico con otro aminoácido básico o un aminoácido neutro por otro aminoácido neutro. También se describen los homólogos polipeptídicos mencionados anteriormente de los fragmentos de anticuerpo, las regiones variables y las CDR expuestas en el presente documento que además tienen actividad anti-IL-6. Los ejemplos no limitantes de actividad anti-IL- 6 se exponen en este documento, por ejemplo, bajo el título "Actividad anti-IL-6 ", más adelante.
Los anticuerpos anti-IL- 6 también se han descrito en las siguientes solicitudes de patente publicadas y no publicadas, que son copropiedad del cesionario de la presente solicitud: documento WO 2008/144763; publicaciones de las solicitudes de patente de los Estados Unidos Nos. 2009/0028784, 2009/0297513 y 2009/0297436. Se han descrito otros anticuerpos anti-IL- 6 en las siguientes patentes de los Estados Unidos Nos: 7.482.436; 7.291.721; 6.121.423; publicaciones de solicitud de patente de los Estados Unidos Nos. 2008/0075726; 2007/0178098; 2007/0154481; 2006/0257407; y 2006/0188502.
Variantes de secuencia polipeptídicas
Para cualquier secuencia de anticuerpos anti-IL- 6 descrita en el presente documento, se puede lograr una caracterización u optimización adicional agregando o eliminando sistemáticamente residuos de aminoácidos para generar péptidos más largos o más cortos, y probando esos y las secuencias generadas desplazando una ventana de tamaño más largo o más corto hacia arriba o hacia abajo del antígeno desde ese punto. El acoplamiento de este enfoque para generar nuevas dianas candidatas con pruebas de eficacia de moléculas antigénicas basadas en esas secuencias en un ensayo de inmunogenicidad, como se conoce en la técnica o como se describe en el presente documento, puede conducir a una manipulación adicional del antígeno. Además, dichas secuencias optimizadas se pueden ajustar mediante, por ejemplo, la adición, eliminaciones u otras mutaciones como se conoce en la técnica y/o se discute en este documento para optimizar aún más los anticuerpos anti-IL- 6 (por ejemplo, aumentando la estabilidad en suero o la semivida en circulación, aumento de la estabilidad térmica, mejora del suministro, mejora de la inmunogenicidad, aumento de la solubilidad, direccionamiento a una ubicación particular in vivo o tipo de célula).
En otro aspecto, la divulgación proporciona secuencias polipeptídicas que tienen al menos aproximadamente un 90% de homología de secuencia con al menos una de las secuencias polipeptídicas de fragmentos de anticuerpos, regiones variables y CDR expuestas en el presente documento. Más preferiblemente, la divulgación proporciona secuencias de polipéptidos que tienen al menos aproximadamente un 95% de homología de secuencia, incluso más preferiblemente al menos aproximadamente un 98% de homología de secuencia, y aún más preferiblemente al menos aproximadamente un 99% de homología de secuencia con al menos una de las secuencias polipeptídicas de los fragmentos de anticuerpo, regiones variables y CDR expuestas en este documento. Los procedimientos para determinar la homología entre secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos son bien conocidos por los expertos en la técnica.
Los polipéptidos de anticuerpos anti-IL- 6 descritos en este documento pueden comprender mutaciones de sustitución conservadoras (es decir, la sustitución de al menos un aminoácido por aminoácidos similares). Por ejemplo, la sustitución conservadora se refiere a la sustitución de un aminoácido por otro dentro de la misma clase general, por ejemplo, un aminoácido ácido con otro aminoácido ácido, un aminoácido básico con otro aminoácido básico o un aminoácido neutro por otro aminoácido neutro.
Las secuencias de polipéptidos de anticuerpos anti-IL- 6 pueden tener al menos aproximadamente 60, 65, 70, 75, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 8 6 , 87, 88 , 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 98,5, 99, 99,5, 99,8, 99,9 o 100% de homología de secuencia con cualquiera de al menos una de las secuencias polipeptídicas expuestas en este documento. Más preferiblemente, la divulgación proporciona secuencias polipeptídicas que tienen al menos aproximadamente un 95% de homología de secuencia, incluso más preferiblemente al menos aproximadamente un 98% de homología de secuencia, y aún más preferiblemente al menos aproximadamente un 99% de homología de secuencia con cualquiera de al menos una de las secuencias polipeptídicas de secuencias polipeptídicas de anticuerpos anti-IL- 6 expuestas en este documento. Los procedimientos para determinar la homología entre secuencias de aminoácidos, así como secuencias de ácidos nucleicos, son bien conocidos por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Nedelkov y Nelson (2006) New and Emerging Proteomic Techniques, Humana Press. Por lo tanto, un polipéptido de anticuerpos anti-IL- 6 puede tener al menos aproximadamente 60, 65, 70, 75, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 8 6 , 87, 8 8 , 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 98,5, 99, 99,5, 99,8, 99,9 o 100% de homología de secuencia con una secuencia polipeptídica.
El término homología, o identidad, se entiende que significa el número de aminoácidos concordantes (identidad) con otras proteínas, expresado en porcentaje. La identidad se determina preferiblemente comparando una secuencia dada con otras proteínas con la ayuda de programas informáticos. Si las secuencias que se comparan entre sí son de diferente longitud, la identidad debe determinarse de tal manera que el número de aminoácidos que comparte la secuencia corta con la secuencia más larga determina el porcentaje de identidad. La identidad se puede determinar de forma rutinaria por medio de programas informáticos conocidos que están disponibles públicamente como, por ejemplo, Clustal W. Thompson, et al. (1994) Nucleic Acids Research 22: 4673-4680. ClustalW está disponible públicamente en el Laboratorio Europeo de Biología Molecular y puede descargarse de varias páginas de Internet, entre otras, el IGBMC (Instituto de Genética y Biología Molecular y Celular) y el EBI y todas las páginas de Internet de EBI reflejadas (Instituto Europeo de Bioinformática). Si se utiliza el programa informático ClustalW versión 1.8 para determinar la identidad entre, por ejemplo, la proteína de referencia de la presente solicitud y otras proteínas, se deben establecer los siguientes parámetros: KTUPLE = 1, TOPDIAG = 5, WINDOW = 5, PAIRGAP = 3, GAPOPEN = 10, GAPEXTEND = 0,05, GAPDIST = 8 , MAXDIV = 40, MATRIX = GONNET, ENDGAPS (OFF), NOPGAP, NOHGAP. Véase también la herramienta del Instituto Europeo de Bioinformática (EBI) disponible en línea y Smith (2002) Protein Sequencing Protocols [2nd Ed.] Humana Press.
Una posibilidad de encontrar secuencias similares es realizar investigaciones en bases de datos de secuencias. En el presente documento, al menos una secuencia puede ingresarse como lo que se conoce como consulta. Esta secuencia de consulta se compara luego con secuencias presentes en las bases de datos seleccionadas utilizando programas informáticos estadísticos. Estas consultas de bases de datos (búsquedas rápidas) son conocidas por el trabajador especializado y pueden realizarse en diferentes proveedores. Si, por ejemplo, una consulta de base de datos de este tipo se lleva a cabo en el NCBI (Centro Nacional de Información Biotecnológica), se debe utilizar la configuración estándar para la consulta de comparación respectiva. Para las comparaciones de secuencias de proteínas (blastp), estas configuraciones son: Entrada de límites = no activada; Filtro = baja complejidad activado; Valor esperado = 10; tamaño de palabra = 3; Matriz = BLOSUM62; Costes por hueco: Existencia = 11, Extensión = 1. El resultado de dicha consulta es, entre otros parámetros, el grado de identidad entre la secuencia de la consulta y las secuencias similares que se encuentran en las bases de datos. Los procedimientos y materiales para preparar fragmentos de polipéptidos de anticuerpos anti-IL- 6 son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Maniatis, et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual [3a edición] Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Los polipéptidos variantes de anticuerpos anti-IL- 6 pueden retener su especificidad antigénica para unirse a IL-6. Las variantes completamente específicas pueden contener solo variaciones conservadoras o variaciones en residuos no críticos o en regiones no críticas. Las variantes también pueden contener la sustitución de aminoácidos similares que no dan como resultado ningún cambio o un cambio insignificante en su especificidad. Alternativamente, tales sustituciones pueden afectar positiva o negativamente la especificidad hasta cierto punto. Las variantes no específicas contienen típicamente al menos sustituciones, eliminaciones, inserciones, inversiones o truncamiento de aminoácidos no conservadoras o una sustitución, inserción, inversión o eliminación en un residuo crítico o región crítica de un epítopo. Las técnicas de biología molecular y bioquímica para modificar polipéptidos de anticuerpos anti-IL- 6 mientras se conserva la especificidad son bien conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Ho, et al. (1989) Gene 77 (1): 51 -59; Landt et al., (1990) Gene 96 (1): 125-128; Hopp y Woods (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (6 ): 3824-3828; Kolaskar y Tongaonkar (1990) FEBS Letters 276 (1-2): 172-174; y Welling, et al. (1985) FEBS Letters 188 (2): 215­ 218.
Los aminoácidos que son esenciales para la función pueden identificarse mediante procedimientos conocidos en la técnica, tales como mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis de exploración de alanina. Cunningham et al., (1989) Sci. 244: 1081-85. El último procedimiento introduce mutaciones únicas de alanina en cada residuo de la molécula. Las moléculas mutantes resultantes se prueban luego para determinar la actividad biológica, tal como la unión al epítopo. Los sitios que son críticos para la unión ligando-receptor también pueden determinarse mediante análisis estructural tal como cristalografía, resonancia magnética nuclear o marcaje de fotoafinidad. Smith et al., (1992) J. Mol. Biol. 224: 899-904; de Vos, et al. (1992) Sci. 255: 306-12.
Por ejemplo, una clase de sustituciones son las sustituciones de aminoácidos conservadas. Tales sustituciones son aquellas que sustituyen un aminoácido dado en un polipéptido de anticuerpos anti-IL- 6 con otro aminoácido de características similares. Normalmente se observan como sustituciones conservadoras los reemplazos, uno por otro, entre los aminoácidos alifáticos Ala, Val, Leu e Ile; intercambio de los residuos hidroxilo Ser y Thr, intercambio de los residuos ácidos Asp y Glu, sustitución entre los residuos amida Asn y Gln, intercambio de los residuos básicos Lys y Arg, reemplazos entre los residuos aromáticos Phe, Tyr. La orientación sobre qué cambios de aminoácidos es probable que sean fenotípicamente silenciosos se encuentra, por ejemplo, en Bowie, et al. (1990) Sci. 247: 1306-10. Por lo tanto, un experto en la técnica apreciará que los inventores poseen variantes de péptidos sin delineación de todas las variantes específicas. En cuanto a las secuencias de aminoácidos, un experto reconocerá que las sustituciones, eliminaciones o adiciones individuales a una secuencia de ácido nucleico, péptido, polipéptido o proteína que altera, agrega o elimina un solo aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos en la secuencia codificada es una "variante modificada de forma conservadora" en la que la alteración da como resultado la sustitución de un aminoácido por un aminoácido químicamente similar. Las tablas de sustitución conservadoras que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son bien conocidas en la técnica. Dichas variantes modificadas de manera conservadora se suman y no excluyen variantes polimórficas, homólogos interespecies y alelos de la invención. Véase, por ejemplo, Creighton (1992) Proteins: Structures and Molecular Properties [2a Ed.] W.H. Freeman.
Además, los polipéptidos contienen a menudo aminoácidos distintos de los veinte aminoácidos "naturales". Además, muchos aminoácidos, incluidos los aminoácidos terminales, pueden modificarse mediante procesos naturales, tales como procesamiento y otras modificaciones postraduccionales, o mediante técnicas de modificación química bien conocidas en la técnica. Las modificaciones conocidas incluyen, pero sin limitarse a, acetilación, acilación, ribosilación de ADP, amidación, unión covalente de flavina, unión covalente de un fracción hemo, unión covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, unión covalente de un lípido o derivado de lípido, unión covalente de fosfotidilinositol, entrecruzamiento, ciclación, formación de enlaces disulfuro, desmetilación, formación de entrecruzamientos covalentes, formación de cistina, formación de piroglutamato, formilación, g-carboxilación, glicosilación, formación de anclaje GPI, hidroxilación, yodación, metilación, miristoilación, oxidación, procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación, sulfatación, adición de aminoácidos mediada por transferencia de ARN a proteínas tales como arginilación y ubiquitinación. Véase Creighton (1992) Proteins: Structure and Molecular Properties [2nd Ed.] Y Lundblad (1995) Techniques in Protein Modification [1st Ed.] Hay muchas revisiones detalladas disponibles sobre este tema. Véase, por ejemplo, Wold (1983) Posttranslational Covalent Modification of Proteins Acad. Prensa, NY; Seifter et al., (1990) Meth. Enzymol. 182: 626-46; y Rattan, et al. (1992) Ann. NY Acad. Sci. 663: 48-62.
En otro aspecto, la divulgación contempla además la generación y el uso de anticuerpos antiidiotípicos que se unen a cualquiera de las secuencias anteriores. En un ejemplo de un aspecto, tal anticuerpo antiidiotípico podría administrarse a un sujeto que ha recibido un anticuerpo anti-lL- 6 para modular, reducir o neutralizar el efecto del anticuerpo anti-IL-6. Un ejemplo adicional de uso de tales anticuerpos antiidiotípicos es para la detección de los anticuerpos anti-IL- 6 de la presente divulgación, por ejemplo, para controlar los niveles de los anticuerpos anti-IL-6 presentes en la sangre de un sujeto u otros fluidos corporales.
Los anticuerpos anti-IL- 6 o fragmentos o variantes de los mismos de acuerdo con las reivindicaciones contienen una secuencia variable pesada y ligera de la SEQ ID NO: 657 y 709.
Polinucleótidos que codifican polipéptidos de anticuerpo anti-il-6
En el presente documento se describen polinucleótidos que codifican polipéptidos de los anticuerpos que tienen especificidad de unión a IL-6. Los polinucleótidos pueden comprender, o alternativamente consistir en, la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 2 que está codificada por la secuencia polinucleotídica de la s Eq ID NO: 10 o la secuencia polinucleotídica de las SEQ ID NOs: 662, 698, 701 o 705.
Los polinucleótidos pueden comprender, o alternativamente consistir en, la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 3 que está codificada por la secuencia polinucleotídica de la SEQ Id NO: 11 o la secuencia polinucleotídica de las SEQ iD NOs: 663, 700, 703 o 707.
Los polinucleótidos que codifican fragmentos o variantes del anticuerpo que tienen especificidad de unión a IL-6 pueden comprender, o alternativamente consistir en, al menos una de las secuencias polinucleotídicas de las SEQ ID NOs: 12 o 694; la SEQ ID NO: 13; y las SEQ ID NOs: 14 o 695 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 2.
Los polinucleótidos que codifican fragmentos o variantes del anticuerpo que tienen especificidad de unión a IL-6 pueden comprender, o alternativamente consistir en, al menos una de las secuencias polinucleotídicas de la SEQ ID NO: 15; las SEQ ID NOs: 16 o 696; y las SEQ ID NOs: 17 o 697 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 3 o la SEQ ID NO: 661 o la SEQ ID NO: 657 u otros representadas en las Figuras 4 o 5.
También se describen secuencias de polinucleótidos que incluyen al menos una de las secuencias de polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos o variantes descritas en el presente documento. Los polinucleótidos que codifican fragmentos o variantes del anticuerpo que tienen especificidad de unión a IL- 6 pueden comprender, o alternativamente consistir en, uno, dos, tres o más, incluyendo todos los siguientes polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos: el polinucleótido de la SEQ ID NO: 10 que codifica la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 2; el polinucleótido de la SEQ ID NO: 11 que codifica la región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 3; el polinucleótido de la SEQ ID NO: 720 que codifica el polipéptido de cadena ligera de la Se Q ID NO: 20; el polinucleótido de la SEQ ID NO: 721 que codifica el polipéptido de cadena ligera de la SEQ ID NO: 647; el polinucleótido de la SEQ ID NO: 662 que codifica el polipéptido de cadena ligera de la SEQ ID NO: 660; el polinucleótido de la SEQ ID NO: 722 que codifica el polipéptido de cadena ligera de la SEQ ID NO: 66 6 ; el polinucleótido de la SEQ ID NO: 698 que codifica el polipéptido de cadena ligera de la SEQ ID NO: 699; el polinucleótido de la SEQ ID NO: 701 que codifica el polipéptido de cadena ligera de la SEQ ID NO: 702; el polinucleótido de la SEQ ID NO: 705 que codifica el polipéptido de cadena ligera de la SEQ ID NO: 706; el polinucleótido de la SEQ ID NO: 723 que codifica el polipéptido de cadena ligera de la SEQ ID NO: 709; el polinucleótido de la SEQ ID NO: 724 que codifica el polipéptido de cadena pesada de la SEQ ID NO: 19; el polinucleótido de la SEQ ID NO: 725 que codifica el polipéptido de cadena pesada de la SEQ ID NO: 652; el polinucleótido de la SEQ ID NO: 700 que codifica el polipéptido de cadena pesada de la SEQ ID NO: 657; el polinucleótido de la SEQ ID NO: 663 que codifica el polipéptido de cadena pesada de la SEQ ID NO: 661; el polinucleótido de la SEQ ID NO: 703 que codifica el polipéptido de cadena pesada de la SEQ ID NO: 704; el polinucleótido de la SEQ ID NO: 707 que codifica el polipéptido de cadena pesada de la SEQ ID NO: 708; los polinucleótidos de las SEQ ID NOs: 12, 13, 14, 694 y 695 que codifican las regiones determinantes de complementariedad de los polipéptidos de cadena ligera antes mencionados; y los polinucleótidos de las SEQ ID NOs: 15, 16, 17, 696 y 697 que codifican las regiones determinantes de complementariedad de los polipéptidos de cadena pesada mencionados anteriormente, y polinucleótidos que codifican las secuencias variables de cadena pesada y ligera en la SEQ ID NO: 657 y la SEQ ID NO: 709 respectivamente, por ejemplo, las secuencias de ácido nucleico en la SEQ ID NO: 700 y la SEQ ID NO: 723 y fragmentos o variantes de las mismas, por ejemplo, basadas en la degeneración de codones. Estas secuencias de ácido nucleico que codifican secuencias variables de cadena pesada y ligera pueden expresarse solas o en combinación y estas secuencias se fusionan preferiblemente a secuencias constantes variables adecuadas, por ejemplo, aquellas de la SEQ ID NO: 589 y la SEQ ID NO: 587.
Los ejemplos de secuencias de nucleótidos que codifican anticuerpos anti-IL- 6 se identifican en la Tabla 4. Las secuencias de polinucleótidos mostradas deben entenderse como ilustrativas, en vez de limitantes. Un experto en la técnica puede determinar fácilmente las secuencias de polinucleótidos que codificarían un polipéptido dado y puede generar fácilmente secuencias de codificación adecuadas para la expresión en un sistema de expresión dado, por ejemplo, adaptando las secuencias de polinucleótidos proporcionadas y/o generándolas de nuevo y puede producir fácilmente secuencias de expresión con codones optimizados, por ejemplo, como se describe en la solicitud de patente publicada de los Estados Unidos No. 2008/0120732 o usando otros procedimientos conocidos en la técnica.
Los polinucleótidos pueden comprender además la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de cadena ligera constante kappa de la SEQ ID NO: 586 que está codificada por la secuencia polinucleotídica de la SEQ ID NO: 587.
Los polinucleótidos pueden comprender además, la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena pesada constante gamma-1 de la SEQ ID NO: 588 que está codificada por la secuencia polinucleotídica de la SEQ ID NO: 589.
También se describe en el presente documento un polinucleótido aislado que comprende un polinucleótido que codifica una secuencia de aminoácidos del anticuerpo anti-IL- 6 Vh seleccionada de las s Eq ID NOs: 3, 18, 19, 652, 656, 657, 658, 661, 664, 665, 704 y 708 o que codifica una variante de la misma en la que al menos un residuo del marco (residuo de FR) se ha sustituido con un aminoácido presente en la posición correspondiente en un polipéptido VH de anticuerpo anti-IL- 6 de conejo o una sustitución de aminoácido conservadora. Además, la invención abarca específicamente anticuerpos anti-IL- 6 humanizados o fragmentos de unión de anticuerpos humanizados o variantes de los mismos y secuencias de ácido nucleico que codifican los anteriores que comprenden los polipéptidos de cadena pesada y/o cadena ligera humanizados representados en las secuencias contenidas en la FIG. 1-5, o las identificadas en la Tabla 4, o variantes de las mismas en las que se puede modificar al menos un marco o residuos de CDR. Preferiblemente, si se introducen modificaciones, no afectarán negativamente la afinidad de unión del anticuerpo anti-IL- 6 resultante o fragmento o variante del mismo.
También se describe un polinucleótido aislado que comprende la secuencia de polinucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos del anticuerpo anti-IL- 6 Vl seleccionada de las SEQ ID NOs: 2, 20, 647, 651, 660, 6 66 , 699, 702, 706 y 709 o que codifica una variante de las mismas en la que al menos un residuo del marco (residuo de FR) se ha sustituido con un aminoácido presente en la posición correspondiente en un polipéptido Vl de anticuerpo anti-IL- 6 de conejo o una sustitución conservadora de aminoácido.
También se describe al menos un polinucleótido heterólogo que comprende una secuencia que codifica los polipéptidos expuestos en la SEQ ID NO: 2 y la SEQ ID NO: 3; la SEQ ID NO: 2 y la SEQ ID NO: 18; la SEQ ID NO: 2 y la SEQ ID NO: 19; la SEQ ID NO: 20 y la SEQ ID NO: 3; la SEQ ID NO: 20 y la SEQ ID NO: 18; o la SEQ ID NO: 20 y la SEQ ID NO: 19.
También se describe un polinucleótido aislado que expresa un polipéptido que contiene al menos un polipéptido de CDR derivado de un anticuerpo anti-IL- 6 en el que dicho polipéptido expresado solo se une específicamente a IL- 6 o se une específicamente a IL- 6 cuando se expresa en asociación con otra secuencia polinucleotídica que expresa un polipéptido que contiene al menos un polipéptido de CDR derivado de un anticuerpo anti-IL- 6 en el que dicha al menos una CDR se selecciona de las contenidos en los polipéptidos Vl o Vh expuestos en las SEQ ID NOs: 3, 18, 19, 652, 656, 657, 658, 661, 664, 665, 704, 708, 2, 20, 647, 651,660, 6 66 , 699, 702, 706 o 709.
También se describen células huésped y vectores que comprenden dichos polinucleótidos.
En el presente documento se describen constructos de ácido nucleico que contienen cualquiera de las secuencias de ácido nucleico anteriores y combinaciones de las mismas, así como células recombinantes que contienen estas secuencias de ácido nucleico y constructos que contienen estas secuencias de ácido nucleico o constructos que pueden ser extracromosómicos o integrados en el genoma de la célula huésped.
En el presente documento se describen vectores que comprenden las secuencias polinucleotídicas que codifican las secuencias polipeptídicas de cadena pesada y ligera variables, así como las regiones determinantes de complementariedad individuales (CDR, o regiones hipervariables) expuestas en el presente documento, así como células huésped que comprenden dichas secuencias. La célula huésped puede ser una célula de levadura. La célula huésped de levadura puede pertenecer al género Pichia.
En algunos casos, se proporciona más de un ejemplo de polinucleótido que codifica una secuencia polipeptídica dada, como se resume en la Tabla 5.
Tabla 5. Múlti les eem los de olinucleótidos ue codifican oli é tidos articulares.
Figure imgf000050_0001
continuación
Figure imgf000051_0002
En algunos casos, múltiples identificadores de secuencia se refieren a la misma secuencia polipeptídica o de polinucleótido, como se resume en la Tabla 3. Se entiende que las referencias a estos identificadores de secuencia son intercambiables, excepto cuando el contexto indique lo contrario.
Tabla 6. Secuencias repetidas. Cada celda enumera un grupo de secuencias repetidas incluidas en la lista de secuencias.
Figure imgf000051_0001
continuación
Figure imgf000052_0001
Ciertos ejemplos incluyen polinucleótidos que hibridan en condiciones de hibridación moderadas o muy rigurosas con un polinucleótido que tiene uno de los ejemplos de secuencias de codificación enumeradas en la Tabla 4, y también incluyen polinucleótidos que hibridan en condiciones de hibridación moderadas o muy rigurosas con un polinucleótido que codifica el mismo polipéptido como un polinucleótido que tiene uno de los ejemplos de las secuencias de codificación enumeradas en la Tabla 4, o polipéptido codificado por cualquiera de los polinucleótidos anteriores.
La frase "condiciones de hibridación de alta rigurosidad" se refiere a las condiciones en las que una sonda se hibridará con su subsecuencia diana, típicamente en una mezcla compleja de ácido nucleico, pero no con otras secuencias. Las condiciones de alta rigurosidad dependen de la secuencia y serán diferentes en diferentes circunstancias. Las secuencias más largas se hibridan específicamente a temperaturas más altas. Una guía extensa para la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993). Generalmente, las condiciones de alta rigurosidad se seleccionan para que sean aproximadamente 5-10 °C más bajas que el punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica a un pH de fuerza iónica definido. La Tm es la temperatura (bajo una fuerza iónica definida, pH y concentración nucleica) a la cual el 50% de las sondas complementarias a la diana hibridan con la secuencia diana en equilibrio (ya que las secuencias diana están presentes en exceso, a Tm, 50% de las sondas están ocupadas en equilibrio). Las condiciones de alta rigurosidad serán aquellas en las que la concentración de sal sea inferior a aproximadamente 1,0 M de iones de sodio, normalmente una concentración de aproximadamente 0,01 a 1,0 M de iones de sodio (u otras sales) a un pH de 7,0 a 8,3 y la temperatura sea de al menos aproximadamente 30 °C para sondas cortas (por ejemplo, de 10 a 50 nucleótidos) y al menos aproximadamente 60 °C para sondas largas (por ejemplo, más de 50 nucleótidos). También se pueden lograr condiciones de alta rigurosidad con la adición de agentes desestabilizadores tales como formamida. Para la hibridación selectiva o específica, una señal positiva es al menos dos veces el fondo, opcionalmente 10 veces la hibridación del fondo. Los ejemplos de condiciones de hibridación de alta rigurosidad pueden ser los siguientes: formamida al 50%, SSC5x y SDS al 1%, incubando a 42 °C, o SSC5x, SDS al 1%, incubando a 65 °C, con lavado en SSC 0,2x y SDS al 0,1% a 65 °C. Tales hibridaciones y etapas de lavado se pueden llevar a cabo, por ejemplo, durante 1,2, 5, 10, 15, 30, 60; o más minutos.
Los ácidos nucleicos que no se hibridan entre sí en condiciones de alta rigurosidad todavía están sustancialmente relacionados si los polipéptidos que codifican están sustancialmente relacionados. Esto ocurre, por ejemplo, cuando se crea una copia de un ácido nucleico utilizando la máxima degeneración de codones permitida por el código genético. En tales casos, los ácidos nucleicos se hibridan típicamente en condiciones de hibridación de rigurosidad moderada. Los ejemplos, de "condiciones de hibridación de rigurosidad moderada" incluyen una hibridación en un tampón de formamida al 40%, NaCl 1 M, SDS al 1% a 37 °C y un lavado en SSC 1x a 45 °C. Tales hibridaciones y etapas de lavado se pueden llevar a cabo durante, por ejemplo, 1, 2, 5, 10, 15, 30, 60 o más minutos. Una hibridación positiva es al menos dos veces la del fondo. Los expertos en la técnica reconocerán fácilmente que se pueden utilizar condiciones alternativas de hibridación y lavado para proporcionar condiciones de rigurosidad similar.
Los vectores de expresión para usar en los procedimientos de la invención incluirán además secuencias específicas de levadura, que incluyen un marcador auxotrófico o de fármaco seleccionable para identificar cepas de levadura transformadas. Puede usarse además un marcador de fármaco para amplificar el número de copias del vector en una célula huésped de levadura.
La secuencia de codificación del polipéptido de interés está operativamente unida a secuencias reguladoras de la transcripción y la traducción que proporcionan la expresión del polipéptido en células de levadura. Estos componentes del vector pueden incluir, pero sin limitarse a, al menos uno de los siguientes: un elemento potenciador, un promotor y una secuencia de terminación de la transcripción. También se pueden incluir secuencias para la secreción del polipéptido, por ejemplo una secuencia señal. El origen de replicación de la levadura es opcional, ya que los vectores de expresión a menudo se integran en el genoma de la levadura.
En una realización de la invención, el polipéptido de interés está operativamente enlazado, o fusionado, a secuencias que proporcionan una secreción optimizada del polipéptido a partir de células diploides de levadura.
Los ácidos nucleicos están "operativamente unidos" cuando se colocan en una relación funcional con otra secuencia de ácidos nucleicos. Por ejemplo, el ADN de una secuencia señal está operativamente unido al ADN de un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está operativamente ligado a una secuencia de codificación si afecta la transcripción de la secuencia. Generalmente, "operativamente enlazado" significa que las secuencias de ADN que se enlazan son contiguas y, en el caso de un líder secretor, contiguas y en marco de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen por qué ser contiguos. El enlace se logra mediante ligación en sitios de restricción convenientes o alternativamente mediante un procedimiento de PCR/recombinación familiar para los expertos en la técnica (Gateway® Technology; Invitrogen, Carlsbad, California). Si tales sitios no existen, los adaptadores o enlazadores de oligonucleótidos sintéticos se utilizan de acuerdo con la práctica convencional.
Los promotores son secuencias sin traducir ubicadas secuencia arriba (5') del codón de inicio de un gen estructural (generalmente dentro de aproximadamente 100 a 1000 pb) que controlan la transcripción y traducción de secuencias de ácido nucleico particulares a las que están operativamente enlazadas. Dichos promotores se clasifican en varias clases: promotores inducibles, constitutivos y reprimibles (que aumentan los niveles de transcripción en respuesta a la ausencia de un represor). Los promotores inducibles pueden iniciar niveles aumentados de transcripción del ADN bajo su control en respuesta a algún cambio en las condiciones de cultivo, por ejemplo, la presencia o ausencia de un nutriente o un cambio de temperatura.
El fragmento de promotor de levadura también puede servir como sitio para la recombinación e integración homóloga del vector de expresión en el mismo sitio en el genoma de la levadura; alternativamente, se usa un marcador seleccionable como sitio para la recombinación homóloga. La transformación de Pichia se describe en Cregg, et al. (1985) Mol. Celda. Biol. 5: 3376-3385.
Los ejemplos de promotores adecuados de Pichia incluyen el AOX1 y el promotor (Cregg, et al. (1989) Mol. Cell. Biol.
9: 1316-1323); promotor ICL1 (Menendez, et al., (2003) Yeast 20 (13): 1097-108); promotor de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAP) (Waterham, et al., (1997) Gene 186 (1): 37-44); y promotor FLD1 (Shen et al., (1998) Gene 216 (1): 93-102). El promotor GAP es un promotor constitutivo fuerte y los promotores AOX y FLD1 son inducibles.
Otros promotores de levadura incluyen ADH1, alcohol deshidrogenasa II, GAL4, PHO3, PHO5, Pyk y promotores quiméricos derivados de los mismos. Además, en la invención pueden usarse promotores que no sean de levadura, tales como promotores de mamíferos, insectos, plantas, reptiles, anfibios, virales y aviares. Más típicamente, el promotor comprenderá un promotor de mamífero (potencialmente endógeno a los genes expresados) o comprenderá un promotor de levadura o viral que proporciona una transcripción eficaz en sistemas de levadura.
Los polipéptidos de interés pueden producirse de forma recombinante no solo directamente, sino también como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, por ejemplo, una secuencia señal u otro polipéptido que tenga un sitio de escisión específico en el terminal N de la proteína o polipéptido maduro. En general, la secuencia señal puede ser un componente del vector o puede ser parte de la secuencia de codificación del polipéptido que se inserta en el vector. La secuencia señal heteróloga seleccionada preferiblemente es una que se reconoce y procesa a través de una de las rutas estándar disponibles dentro de la célula huésped. La señal pre-pro del factor alfa de S. cerevisiae ha demostrado ser eficaz en la secreción de una variedad de proteínas recombinantes de P. pastoris. Otras secuencias señal de levadura incluyen la secuencia señal del factor de apareamiento alfa, la secuencia señal de invertasa y las secuencias señal derivadas de otros polipéptidos de levadura secretados. Además, estas secuencias de péptidos señal pueden diseñarse para proporcionar una secreción mejorada en sistemas de expresión de levaduras diploides. Otras señales de secreción de interés también incluyen secuencias señal de mamíferos, que pueden ser heterólogas a la proteína que se secreta, o pueden ser una secuencia nativa de la proteína que se secreta. Las secuencias señal incluyen secuencias pre-peptídicas y, en algunos casos, pueden incluir secuencias pro-péptidas. Muchas de estas secuencias señal son conocidas en la técnica, incluidas las secuencias señal que se encuentran en las cadenas de inmunoglobulina, por ejemplo, secuencia de preprotoxina K28, PHA-E, FACE, MCP-1 humana, secuencias señal de albúmina de suero humano, cadena pesada de Ig humana, cadena ligera de Ig humana y similares. Véase Hashimoto, et al. (1998) Protein Eng 11 (2): 75; y Kobayashi, et al. (1998) Therapeutic Apheresis 2 (4): 257.
La transcripción se puede incrementar insertando una secuencia activadora de la transcripción en el vector. Estos activadores son elementos de ADN que actúan en cis, normalmente entre 10 y 300 pb, que actúan sobre un promotor para aumentar su transcripción. Los potenciadores de la transcripción son relativamente independientes de la orientación y la posición, habiéndose encontrado en 5' y 3' de la unidad de transcripción, dentro de un intrón, así como dentro de la propia secuencia de codificación. El potenciador puede empalmarse en el vector de expresión en una posición 5' o 3' de la secuencia de codificación, pero preferiblemente está ubicado en un sitio 5' del promotor.
Los vectores de expresión usados en células huésped eucariotas también pueden contener secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para estabilizar el ARNm. Dichas secuencias están comúnmente disponibles desde 3' hasta el codón de terminación de la traducción, en regiones no traducidas de ADN o ADNc eucariotas o virales. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la parte no traducida del ARNm.
La construcción de vectores adecuados que contienen al menos uno de los componentes enumerados anteriormente emplea técnicas de ligación estándar o procedimientos de PCR/recombinación. Los plásmidos aislados o fragmentos de ADN se escinden, adaptan y vuelven a ligar en la forma deseada para generar los plásmidos requeridos o mediante procedimientos de recombinación. Para el análisis para confirmar las secuencias correctas en los plásmidos construidos, las mezclas de ligación se utilizan para transformar células huésped y los transformantes exitosos seleccionados por resistencia a antibióticos (por ejemplo, ampicilina o Zeocin® (fleomicina)) cuando sea apropiado. Los plásmidos de los transformantes se preparan, analizan mediante digestión con endonucleasas de restricción y/o se secuencian.
Como alternativa a la restricción y ligación de fragmentos, se pueden usar procedimientos de recombinación basados en sitios att y enzimas de recombinación para insertar secuencias de a Dn en un vector. Tales procedimientos se describen, por ejemplo, por Landy (1989) Ann. Rev. Biochem. 58: 913-949; y son conocidos por los expertos en la técnica. Dichos procedimientos utilizan la recombinación de ADN intermolecular que está mediada por una mezcla de proteínas de recombinación lambda codificadas por E. coli. La recombinación ocurre entre sitios de unión específicos (att) en las moléculas de ADN que interactúan. Para una descripción de los sitios att, véase Weisberg y Landy (1983) Site-Specific Recombination in Phage Lambda, Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Press), páginas 211-250. Los segmentos de ADN que flanquean los sitios de recombinación se cambian, de modo que después de la recombinación, los sitios att son secuencias híbridas compuestas por secuencias donadas por cada vector parental. La recombinación puede ocurrir entre ADN de cualquier topología.
Se pueden introducir sitios att en una secuencia de interés ligando la secuencia de interés en un vector apropiado; generar un producto de PCR que contiene sitios B att mediante el uso de cebadores específicos; generar una biblioteca de ADNc clonada en un vector apropiado que contiene sitios att.
El huésped de expresión puede modificarse adicionalmente mediante la introducción de secuencias que codifican al menos una enzima que potencia el plegamiento y la formación de enlaces disulfuro, es decir, foldasas, chaperoninas. Dichas secuencias que pueden expresarse de forma constitutiva o inducible en la célula huésped de levadura, utilizando vectores, marcadores, son conocidas en la técnica. Preferiblemente, las secuencias, incluidos los elementos reguladores de la transcripción suficientes para el patrón de expresión deseado, se integran de forma estable en el genoma de levadura mediante una metodología dirigida.
Por ejemplo, la PDI eucariota no solo es un catalizador eficaz de la oxidación de la proteína cisteína y la isomerización del enlace disulfuro, sino que también exhibe actividad chaperona. La coexpresión de PDI puede facilitar la producción de proteínas activas que tienen múltiples enlaces disulfuro. También es de interés la expresión de BIP (proteína de unión a cadena pesada de inmunoglobulina); ciclofilina; y similares. En una realización de la invención, cada una de las cepas parentales haploides expresa una enzima de plegamiento distinta, por ejemplo una cepa puede expresar BIP y la otra cepa puede expresar PDI o combinaciones de las mismas.
Los vectores se utilizan para introducir una sustancia extraña, como ADN, ARN o proteína, en un organismo o célula huésped. Los vectores típicos incluyen virus recombinantes (para polinucleótidos) y liposomas u otros agregados lipídicos (para polipéptidos y/o polinucleótidos). Un "vector de ADN" es un replicón, tal como un plásmido, fago o cósmido, al que se puede unir otro segmento polinucleotídico para provocar la replicación del segmento unido. Un "vector de expresión" es un vector de ADN que contiene secuencias reguladoras que dirigirán la síntesis de polipéptidos por una célula huésped apropiada. Por lo general, esto significa un promotor para unirse a la ARN polimerasa e iniciar la transcripción del ARNm, así como los sitios de unión del ribosoma y las señales de inicio para dirigir la traducción del ARNm en un polipéptido o polipéptidos. La incorporación de una secuencia de polinucleótidos en un vector de expresión en el sitio apropiado y en el marco de lectura correcto, seguida de la transformación de una célula huésped apropiada por el vector, permite la producción de un polipéptido codificado por dicha secuencia de polinucleótidos. Los ejemplos de vectores de expresión y las técnicas para su uso se describen en las siguientes publicaciones: Old, et al. (1989) Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering, Blackwell Scientific Publications [4a Ed.]; Sambrook, et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sambrook, et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual [3ra Ed.] Cold Spring Harbor Laboratory Press; Gorman, "High Efficiency Gene Transfer into Mammalian Cells," en DNA Cloning, Volumen II, Glover, D. M., Ed., IRL Press, Washington, D.C., páginas 143-190.
Por ejemplo, un liposoma u otro agregado lipídico puede comprender un lípido tal como fosfatidilcolinas (lecitinas) (PC), fosfatidiletanolaminas (PE), lisolecitinas, lisofosfatidiletanolaminas, fosfatidilserinas (PS), fosfatolidilgliceroles (PG), fosfatidilinositol (PI), esfingomielinas, cardiolipina, ácidos fosfatídicos (PA), ácidos grasos, gangliósidos, glucolípidos, glicolípidos, mono, di o triglicéridos, ceramidas, cerebrósidos y combinaciones de los mismos; un lípido catiónico (u otro anfífilo catiónico) tal como 1,2-dioleiloxi-3-(trimetilamino)propano (DOTAP); N-colestiloxicarbaril-3,7,12-triazapentadecano-1,15-diamina (CTAP); bromuro de N-[1-(2,3,-ditetradeciloxi)propil]-N,N-dimetil-N-hidroxietilamonio (DMRIE); bromuro de N-[1-(2,3,-dioleiloxi)propil]-N,N-dimetil-N-hidroxietilamonio (DORIE); cloruro de N-[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio (DOTMA); 3 beta [N-(N',N'-dimetilaminoetano)carbamoil] colesterol (DC-Choi); y dimetildioctadecilamonio (DDAB); dioleoilfosfatidil etanolamina (DOPE), DOPC que contiene colesterol; y combinaciones de los mismos; y/o un polímero hidrófilo tal como polivinilpirrolidona, polivinilmetiléter, polimetiloxazolina, polietiloxazolina, polihidroxipropiloxazolina, polihidroxipropilmetacrilamida, polimetacrilamida, polidimetilacrilamida, polihidroxipropilmetacrilato, polihidroxietilacrilato, hidroximetilcelulosa, hidroxietilcelulosa, polietilenglicol, poliaspartamida y combinaciones de los mismos. Otros lípidos catiónicos adecuados se describen en Miller (1998) Angewandte Chemie International Edition 37 (13-14): 1768-1785 y Cooper, et al. (1998) Chem. EUR. J.
4 (1): 137-151. Los liposomas pueden estar entrecruzados, parcialmente entrecruzados o libres de reticulación. Los liposomas entrecruzados pueden incluir componentes entrecruzados así como componentes no entrecruzados. Los liposomas catiónicos o citofectinas adecuados están disponibles comercialmente y también se pueden preparar como se describe en Sipkins, et al. (1998) Nature Medicine 4 (5): 623-626 o como se describe en Miller, citado anteriormente. Los ejemplos de liposomas incluyen un lípido zwitteriónico o neutro polimerizable, un lípido dirigido a integrina polimerizable y un lípido catiónico polimerizable adecuado para unión a un ácido nucleico. Los liposomas pueden incluir opcionalmente péptidos que proporcionen una mayor eficacia, por ejemplo, como se describe en la patente de los Estados Unidos No. 7.297.759. Se describen liposomas y otros ejemplos de agregados de lípidos adicionales en la patente de los Estados Unidos No. 7.166.298.
Procedimientos de producción de anticuerpos y fragmentos de los mismos
También se describe en este documento la producción de los anticuerpos descritos en este documento o fragmentos de los mismos. Los polipéptidos recombinantes correspondientes a los anticuerpos descritos en el presente documento o fragmentos de los mismos se secretan a partir de cepas poliploides, preferiblemente diploides o tetraploides de levadura competente de apareamiento. Se describen procedimientos para producir estos polipéptidos recombinantes en forma secretada durante periodos prolongados utilizando cultivos que comprenden levadura poliploide, es decir, al menos varios días a una semana, más preferiblemente al menos un mes o varios meses, e incluso más preferiblemente al menos 6 meses a un año o más. Estos cultivos de levadura poliploides expresarán al menos 10-25 mg/litro del polipéptido, más preferiblemente al menos 50-250 mg/litro, aún más preferiblemente al menos 500-1000 mg/litro, y lo más preferiblemente un gramo por litro o más del polipéptido o polipéptidos recombinantes.
Un par de células haploides de levadura marcadas genéticamente se transforman con vectores de expresión que comprenden subunidades de una proteína heteromultimérica deseada. Una célula haploide comprende un primer vector de expresión y una segunda célula haploide comprende un segundo vector de expresión. Las células de levadura diploides se transformarán con al menos un vector de expresión que proporcione la expresión y secreción de al menos uno de los polipéptidos recombinantes. Una sola célula haploide puede transformarse con al menos un vector y usarse para producir una levadura poliploide mediante estrategias de fusión o apareamiento. Un cultivo de levadura diploide puede transformarse con al menos un vector que proporcione la expresión y secreción de un polipéptido o polipéptidos deseados. Estos vectores pueden comprender vectores, por ejemplo, plásmidos linealizados u otros productos de ADN lineal que se integran en el genoma de la célula de levadura de forma aleatoria, mediante recombinación homóloga o utilizando una recombinasa tal como Cre/lox o Flp/Frt. Opcionalmente, se pueden introducir vectores de expresión adicionales en las células haploides o diploides; o el primer o segundo vector de expresión pueden comprender secuencias codificantes adicionales; para la síntesis de heterotrímeros; heterotetrámeros. Los niveles de expresión de los polipéptidos no idénticos pueden calibrarse individualmente y ajustarse mediante una selección apropiada, número de copias del vector, fuerza del promotor y/o inducción y similares. Las células haploides transformadas se cruzan o fusionan genéticamente. Las cepas diploides o tetraploides resultantes se utilizan para producir y secretar proteínas completamente ensambladas y biológicamente funcionales, anticuerpos humanizados descritos en el presente documento o fragmentos de los mismos.
El uso de células diploides o tetraploides para la producción de proteínas proporciona beneficios inesperados. Las células pueden cultivarse con fines de producción, es decir, escalarse y durante períodos de tiempo prolongados, en condiciones que pueden ser perjudiciales para el crecimiento de células haploides, condiciones que pueden incluir una alta densidad celular; crecimiento en medios mínimos; crecimiento a bajas temperaturas; crecimiento estable en ausencia de presión selectiva; y que puede proporcionar el mantenimiento de la integridad de la secuencia genética heteróloga y el mantenimiento de un alto nivel de expresión a lo largo del tiempo. Sin desear limitarse a ello, los inventores teorizan que estos beneficios pueden surgir, al menos en parte, de la creación de cepas diploides a partir de dos cepas haploides parentales distintas. Estas cepas haploides pueden comprender numerosas mutaciones autótrofas menores, cuyas mutaciones se complementan en el diploide o tetraploide, lo que permite el crecimiento y mejora la producción en condiciones altamente selectivas.
Las células de levadura haploides competentes de apareamiento transformadas proporcionan un procedimiento genético que permite el apareamiento de subunidades de una proteína deseada. Las cepas de levadura haploide se transforman con cada uno de dos vectores de expresión, un primer vector para dirigir la síntesis de una cadena polipeptídica y un segundo vector para dirigir la síntesis de una segunda cadena polipeptídica no idéntica. Las dos cepas haploides se aparean para proporcionar un huésped diploide en el que se puede obtener una producción de proteína diana optimizada.
Opcionalmente, se proporcionan secuencias codificantes no idénticas adicionales. Estas secuencias pueden estar presentes en vectores de expresión adicionales o en el primer o segundo vector de expresión. Como se conoce en la técnica, se pueden expresar de forma independiente múltiples secuencias codificantes a partir de promotores individuales; o puede expresarse de manera coordinada mediante la inclusión de un "sitio de entrada de ribosoma interno" o "IRES", que es un elemento que promueve la entrada de ribosoma interno directo al codón de iniciación, tal como ATG, de un cistrón (una región que codifica una proteína), lo que conduce por lo tanto a la traducción del gen independiente de la protección del gen. Los elementos IRES funcionales en la levadura están descritos por Thompson, et al. (2001) PNAS 98: 12866-12868.
Las secuencias de anticuerpos se producen en combinación con una cadena J secretora, que proporciona una estabilidad mejorada de IgA. Véase las patentes de los Estados Unidos Nos. 5.959.177 y 5.202.422.
Las dos cepas de levadura haploides son cada una auxotróficas y requieren la suplementación de medio para el crecimiento de las células haploides. El par de auxótrofos son complementarios, de modo que el producto diploide crecerá en ausencia de los suplementos necesarios para las células haploides. Muchos de estos marcadores genéticos se conocen en levadura, incluidos los requisitos de aminoácidos (por ejemplo, met, lys, his, arg), nucleósidos (por ejemplo, ura3, ade1); y similares. Pueden preferirse marcadores de aminoácidos para los procedimientos de la invención. Alternativamente, las células diploides que contienen los vectores deseados se pueden seleccionar por otros medios, por ejemplo, mediante el uso de otros marcadores, tales como proteína fluorescente verde, genes de resistencia a antibióticos, varios marcadores seleccionables dominantes y similares.
Dos células haploides transformadas pueden cruzarse genéticamente y las cepas diploides que surgen de este evento de apareamiento se pueden seleccionar por sus requerimientos nutricionales híbridos y/o espectros de resistencia a antibióticos. Alternativamente, las poblaciones de las dos cepas haploides transformadas se someten a esferoplastia y se fusionan, y la progenie diploide se regenera y selecciona. Por cualquier procedimiento, las cepas diploides pueden identificarse y cultivarse selectivamente en función de su capacidad para crecer en medios diferentes a los de sus progenitores. Por ejemplo, las células diploides se pueden cultivar en un medio mínimo que puede incluir antibióticos. La estrategia de síntesis diploide tiene ciertas ventajas. Las cepas diploides tienen el potencial de producir niveles mejorados de proteína heteróloga a través de una complementación más amplia de mutaciones subyacentes, lo que puede afectar la producción y/o secreción de proteína recombinante. Además, una vez que se han obtenido cepas estables, los antibióticos utilizados para seleccionar esas cepas no necesitan necesariamente estar continuamente presentes en el medio de cultivo.
Como se indicó anteriormente, una levadura haploide puede transformarse con uno o varios vectores y acoplarse o fusionarse con una célula no transformada para producir una célula diploide que contiene el vector o los vectores. En otras realizaciones, una célula de levadura diploide puede transformarse con al menos un vector que proporcione la expresión y secreción de un polipéptido heterólogo deseado por la célula de levadura diploide.
Se transforman dos cepas haploides con una biblioteca de polipéptidos, por ejemplo una biblioteca de cadenas ligeras o pesadas de anticuerpos. Las células haploides transformadas que sintetizan los polipéptidos se aparean con las células haploides complementarias. Las células diploides resultantes se criban en busca de proteína funcional. Las células diploides proporcionan un medio para reunir rápida, conveniente y económicamente un gran número de combinaciones de polipéptidos para pruebas funcionales. Esta tecnología es especialmente aplicable para la generación de productos proteicos heterodiméricos, en los que los niveles optimizados de síntesis de subunidades son críticos para la expresión y secreción de proteínas funcionales.
La relación del nivel de expresión de las dos subunidades está regulada para maximizar la generación de producto. Se ha demostrado previamente que los niveles de proteína de la subunidad de heterodímero afectan la generación del producto final. Simmons (2002) J. Immunol Methods. 263 (1-2): 133-47. La regulación se puede lograr antes de la etapa de apareamiento mediante la selección de un marcador presente en el vector de expresión. Al aumentar de manera estable el número de copias del vector, se puede aumentar el nivel de expresión. En algunos casos, puede ser deseable aumentar el nivel de una cadena en relación con la otra, para alcanzar una proporción equilibrada entre las subunidades del polipéptido. Los marcadores de resistencia a antibióticos son útiles para este propósito, por ejemplo el marcador de resistencia Zeocin® (fleomicina), resistencia G418 y proporciona un medio de enriquecimiento para cepas que contienen múltiples copias integradas de un vector de expresión en una cepa mediante la selección de transformantes que son resistentes a niveles más altos de Zeocin® (fleomicina) o G418. La proporción adecuada (por ejemplo, 1 :1 ; 1 :2 ) de los genes de la subunidad puede ser importante para la producción eficaz de proteínas. Incluso cuando se usa el mismo promotor para transcribir ambas subunidades, muchos otros factores contribuyen al nivel final de proteína expresada y, por lo tanto, puede ser útil aumentar el número de copias de un gen codificado en relación con el otro. Alternativamente, las cepas diploides que producen niveles más altos de un polipéptido, en relación con las cepas de vector de copia única, se crean mediante el apareamiento de dos cepas haploides, las cuales tienen múltiples copias de los vectores de expresión.
Las células huésped se transforman con los vectores de expresión descritos anteriormente, se aparean para formar cepas diploides y se cultivan en medio nutritivo convencional modificado según sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas. Se conocen en la técnica varios medios mínimos adecuados para el crecimiento de levaduras. Cualquiera de estos medios puede complementarse según sea necesario con sales (tales como cloruro de sodio, calcio, magnesio y fosfato), tampones (tal como fosfato, HEPES), nucleósidos (tales como adenosina y timidina), antibióticos, oligoelementos y glucosa o una fuente de energía equivalente. También se puede incluir cualquier otro suplemento necesario en concentraciones apropiadas que serían conocidas por los expertos en la técnica. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH y similares, son las utilizadas previamente con la célula huésped seleccionada para la expresión, y serán evidentes para el experto en la materia.
Las proteínas secretadas se recuperan del medio de cultivo. Un inhibidor de proteasa, como el fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), puede ser útil para inhibir la degradación proteolítica durante la purificación, y se pueden incluir antibióticos para prevenir el crecimiento de contaminantes accidentales. La composición puede concentrarse, filtrarse, dializarse usando procedimientos conocidos en la técnica.
Las células diploides de la invención se cultivan con fines de producción. Tales propósitos de producción incluyen deseablemente el crecimiento en medios mínimos, medios que carecen de aminoácidos preformados y otras biomoléculas complejas, por ejemplo, medios que comprenden amoniaco como fuente de nitrógeno y glucosa como fuente de energía y carbono, y sales como fuente de fosfato, calcio y similares. Preferiblemente, dichos medios de producción carecen de agentes selectivos tales como antibióticos, aminoácidos, purinas, pirimidinas. Las células diploides pueden cultivarse hasta una densidad celular alta, por ejemplo, al menos aproximadamente 50 g/l; más usualmente al menos aproximadamente 100 g/l; y puede ser de al menos aproximadamente 300, aproximadamente 400, aproximadamente 500 g/l o más.
El crecimiento de las células objetivo con fines de producción se realiza a bajas temperaturas, temperaturas que pueden reducirse durante la fase logarítmica, durante la fase estacionaria o ambas. El término "baja temperatura" se refiere a temperaturas de al menos aproximadamente 15 °C, más usualmente al menos aproximadamente 17 °C, y puede ser aproximadamente 20 °C, y usualmente no es más de aproximadamente 25 °C, más usualmente no más de aproximadamente 22 °C. En otra realización de la invención, la temperatura baja no es normalmente superior a aproximadamente 28 °C. La temperatura de crecimiento puede afectar la producción de proteínas secretadas de longitud completa en cultivos de producción, y la disminución de la temperatura de crecimiento del cultivo puede mejorar considerablemente el rendimiento del producto intacto. La disminución de la temperatura parece ayudar al tráfico intracelular a través de las vías de procesamiento de plegado y postraduccional utilizadas por el huésped para generar el producto diana, junto con la reducción de la degradación de la proteasa celular.
Los procedimientos proporcionan la expresión de proteína activa secretada, preferiblemente una proteína de mamífero. "Anticuerpos activos" secretados, como se usa en este documento, se refiere a un multímero correctamente plegado de al menos dos cadenas emparejadas adecuadamente, que se une con precisión a su antígeno afín. Los niveles de expresión de proteína activa son habitualmente al menos aproximadamente 10-50 mg/litro de cultivo, más habitualmente al menos aproximadamente 100 mg/litro, preferiblemente al menos aproximadamente 500 mg/litro, y pueden ser 1000 mg/litro o más.
Los procedimientos pueden proporcionar una mayor estabilidad del huésped y secuencias codificantes heterólogas durante la producción. La estabilidad se evidencia, por ejemplo, por el mantenimiento de altos niveles de expresión de tiempo, en los que el nivel de expresión inicial disminuye en no más de aproximadamente un 20 %, generalmente no más de un 10%, y puede disminuir en no más de aproximadamente 5% sobre aproximadamente 20 duplicaciones, 50 duplicaciones, 100 duplicaciones o más.
La estabilidad de la cepa también proporciona el mantenimiento de la integridad de la secuencia del gen heterólogo a lo largo del tiempo, en la que la secuencia de la secuencia de codificación activa y los elementos reguladores transcripcionales necesarios se mantienen en al menos aproximadamente el 99% de las células diploides, normalmente en al menos aproximadamente el 99,9% de las células diploides, y preferiblemente en al menos aproximadamente el 99,99% de las células diploides en aproximadamente 20 duplicaciones, 50 duplicaciones, 100 duplicaciones o más. Preferiblemente, sustancialmente todas las células diploides mantienen la secuencia de la secuencia codificadora activa y los elementos reguladores transcripcionales requeridos.
Los expertos en la técnica conocen bien otros procedimientos de producción de anticuerpos. Por ejemplo, los procedimientos para producir anticuerpos quiméricos son ahora bien conocidos en la técnica. Vease, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos No. 4.816.567; Morrison et al., (1984) PNAS USA 81: 8651-55; Neuberger et al., (1985) Nature 314: 268-270; Boulianne et al., (1984) Nature 312: 643-46.
Asimismo, otros procedimientos para producir anticuerpos humanizados son ahora bien conocidos en la técnica. Vease, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos Nos. 5.225.539; 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762; 6.054.297; 6.180.370; 6.407.213; 6.548.640; 6.632.927; y 6.639.055; Jones et al., (1986) Nature 321: 522-525; Reichmann et al., (1988) Nature 332: 323-327; Verhoeyen et al., (1988) Science 239: 1534-36.
Los polipéptidos de anticuerpos de la divulgación que tienen especificidad de unión a IL- 6 también pueden producirse mediante la construcción, usando técnicas convencionales bien conocidas por los expertos en la técnica, un vector de expresión que contiene un operón y una secuencia de ADN que codifica una cadena pesada de anticuerpo. en el que la secuencia de ADN que codifica las CDR requeridas para la especificidad del anticuerpo se deriva de una fuente de células no humanas, preferiblemente una fuente de células B de conejo, mientras que la secuencia de ADN que codifica las partes restantes de la cadena de anticuerpos se deriva de una fuente de células humanas.
Se produce un segundo vector de expresión utilizando los mismos medios convencionales bien conocidos por los expertos en la técnica, conteniendo dicho vector de expresión un operón y una secuencia de ADN que codifica una cadena ligera de anticuerpo en la que la secuencia de ADN que codifica las CDR requeridas para la especificidad del anticuerpo se deriva de una fuente de células no humanas, preferiblemente una fuente de células B de conejo, mientras que la secuencia de ADN que codifica las partes restantes de la cadena de anticuerpos se deriva de una fuente de células humanas.
Los vectores de expresión se transfectan en una célula huésped mediante técnicas convencionales bien conocidas por los expertos en la técnica para producir una célula huésped transfectada, cultivando dicha célula huésped transfectada mediante técnicas convencionales bien conocidas por los expertos en la técnica para producir dichos polipéptidos de anticuerpos.
La célula huésped puede cotransfectarse con los dos vectores de expresión descritos anteriormente, conteniendo el primer vector de expresión ADN que codifica un operón y un polipéptido derivado de cadena ligera y el segundo vector que contiene ADN que codifica un operón y un polipéptido derivado de cadena pesada. Los dos vectores contienen diferentes marcadores seleccionables, pero preferiblemente logran una expresión sustancialmente igual de los polipéptidos de cadena pesada y ligera. Alternativamente, puede usarse un solo vector, incluyendo el vector ADN que codifica los polipéptidos de cadena pesada y ligera. Las secuencias codificantes de las cadenas pesada y ligera pueden comprender ADNc.
Las células huésped utilizadas para expresar los polipéptidos de anticuerpos pueden ser una célula bacteriana tal como E. coli o una célula eucariota. En una realización particularmente preferida de la invención, puede usarse una célula de mamífero de un tipo bien definido para este propósito, tal como una célula de mieloma o una línea celular de ovario de hámster chino (CHO).
Los procedimientos generales mediante los cuales se pueden construir los vectores, los procedimientos de transfección necesarios para producir la célula huésped y los procedimientos de cultivo necesarios para producir los polipéptidos de anticuerpos a partir de dichas células huésped incluyen todos técnicas convencionales. Aunque preferiblemente la línea celular usada para producir el anticuerpo es una línea celular de mamífero, se puede usar alternativamente cualquier otra línea celular adecuada, tal como una línea celular bacteriana tal como una cepa bacteriana derivada de E. coli, o una línea celular de levadura.
De manera similar, una vez producidos, los polipéptidos del anticuerpo pueden purificarse de acuerdo con procedimientos estándar en la técnica, tales como, por ejemplo, filtración de flujo cruzado, precipitación con sulfato de amonio, cromatografía en columna de afinidad y similares.
Los polipéptidos de anticuerpos descritos en este documento también se pueden usar para el diseño y síntesis de miméticos peptídicos o no peptídicos que serían útiles para las mismas aplicaciones terapéuticas que los polipéptidos de anticuerpos de la invención. Véase, por ejemplo, Saragobi et al. (1991) Science 253: 792-795.
Cribado y aislamiento de células B
También se describen en el presente documento procedimientos para aislar una población clonal de células B específicas de antígeno que se pueden usar para aislar al menos una célula específica de antígeno. Como se describe y ejemplifica más adelante, estos procedimientos contienen una serie de etapas de cultivo y selección que pueden usarse por separado, en combinación, secuencial, repetitiva o periódicamente. Preferiblemente, estos procedimientos se usan para aislar al menos una célula específica de antígeno, que puede usarse para producir un anticuerpo monoclonal, que es específico para un antígeno deseado, o una secuencia de ácido nucleico correspondiente a tal anticuerpo.
Se describe un procedimiento que comprende las etapas de:
(a) preparar una población de células que comprende al menos una célula B específica de antígeno;
(b) enriquecer la población de células, por ejemplo, mediante cromatografía, para formar una población de células enriquecida que comprende al menos una célula B específica de antígeno;
(c) aislar una única célula B de la población de células B enriquecida; y
(d) determinar si la única célula B produce un anticuerpo específico para el antígeno.
En el presente documento se describe una mejora de un procedimiento para aislar una única célula B productora de anticuerpos, comprendiendo la mejora enriquecer una población de células B obtenida de un huésped que ha sido inmunizado o expuesto naturalmente a un antígeno, en el que la etapa de enriquecimiento precede cualquier etapa de selección, comprende al menos una etapa de cultivo y da como resultado una población clonal de células B que produce un único anticuerpo monoclonal específico para dicho antígeno.
A lo largo de esta solicitud, una "población clonal de células B" se refiere a una población de células B que solo secreta un único anticuerpo específico para un antígeno deseado. Es decir, estas células producen solo un tipo de anticuerpo monoclonal específico para el antígeno deseado.
En la presente solicitud, "enriquecer" células de una población de células significa aumentar la frecuencia de las células deseadas, típicamente células específicas de antígeno, contenidas en una población de células mixta, por ejemplo, un aislado que contiene células B derivado de un huésped que se inmuniza contra un antígeno deseado. Por lo tanto, una población enriquecida de células abarca una población de células que tiene una mayor frecuencia de células específicas de antígeno como resultado de una etapa de enriquecimiento, pero esta población de células puede contener y producir diferentes anticuerpos.
El término general "población de células" abarca poblaciones de células antes y después del enriquecimiento, teniendo en cuenta que cuando se realizan múltiples etapas de enriquecimiento, una población de células puede ser enriquecida tanto antes como después. Por ejemplo, en el presente documento se describe un procedimiento que comprende:
(a) recolectar una población de células de un huésped inmunizado para obtener una población de células recolectada;
(b) crear al menos una suspensión de células individuales a partir de la población de células recolectadas;
(c) enriquecer al menos una suspensión de células individuales para formar una primera población de células enriquecidas;
(d) enriquecer la primera población de células enriquecida para formar una segunda población de células enriquecida;
(e) enriquecer la segunda población de células enriquecida para formar una tercera población de células enriquecida; y
(f) seleccionar un anticuerpo producido por una célula específica de antígeno de la tercera población de células enriquecida.
Cada población de células puede usarse directamente en la siguiente u etapa, o puede congelarse parcial o totalmente para almacenamiento a largo o corto plazo o para etapas posteriores. Además, las células de una población de células se pueden suspender individualmente para producir suspensiones de células individuales. La suspensión de células individuales se puede enriquecer, de modo que una suspensión de células individuales sirva como la población de células antes del enriquecimiento. Entonces, al menos una suspensión de células individuales específicas de antígeno juntas forman la población de células enriquecidas; las suspensiones de células individuales específicas de antígeno se pueden agrupar juntas, por ejemplo, volver a sembrar en placa para análisis y/o producción de anticuerpos adicionales.
En el presente documento se describe un procedimiento de enriquecimiento de una población de células para producir una población de células enriquecida que tiene una frecuencia celular específica de antígeno que es de aproximadamente 50% a aproximadamente 100%, o incrementos en la misma. Preferiblemente, la población de células enriquecidas tiene una frecuencia celular específica de antígeno de al menos aproximadamente 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 99% o 100%.
En el presente documento se describe un procedimiento para enriquecer una población de células mediante el cual la frecuencia de células específicas de antígeno aumenta al menos aproximadamente 2 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 50 veces, 100 veces o incrementos en el mismo.
A lo largo de esta solicitud, el término "incremento" se usa para definir un valor numérico en grados variables de precisión, por ejemplo, al 10, 1, 0,1, 0,01 más cercano. El incremento puede redondearse a cualquier grado de precisión medible, y no es necesario redondear el incremento al mismo grado de precisión en ambos lados de un intervalo. Por ejemplo, el intervalo de 1 a 100 o incrementos en el mismo incluye intervalos tales como 20 a 80, 5 a 50 y 0,4 a 98. Cuando un intervalo es de extremo abierto, por ejemplo, un intervalo de menos de 100, incrementos en el mismo significa incrementos entre 100 y el límite medible. Por ejemplo, menos de 100 o incrementos en el mismo significa 0 a 100 o incrementos en el mismo a menos que la característica, por ejemplo, la temperatura, no esté limitada por 0.
Se puede medir la especificidad del antígeno con respecto a cualquier antígeno. El antígeno puede ser cualquier sustancia a la que se pueda unir un anticuerpo, incluidos, pero sin limitarse a péptidos, proteínas o fragmentos de los mismos; carbohidratos; moléculas orgánicas e inorgánicas; receptores producidos por células animales, células bacterianas y virus; enzimas; agonistas y antagonistas de rutas biológicas; hormonas; y citocinas. Los ejemplos de antígenos incluyen, pero sin limitarse a, IL-2, IL-4, IL-6 , IL-10, IL-12, IL-13, IL-18, IFN-a, IFN-y, BAFF, CXCL13, IP-10, VEGF, EPO, EGF, HRG, factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) y hepcidina. Los antígenos preferidos incluyen IL-6 , IL-13, TNF-a, VEGF-a, factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) y hepcidina. En un procedimiento que utiliza más de una etapa de enriquecimiento, el antígeno utilizado en cada etapa de enriquecimiento puede ser igual o diferente del otro. Múltiples etapas de enriquecimiento con el mismo antígeno pueden producir una población grande y/o diversa de células específicas de antígeno; múltiples etapas de enriquecimiento con diferentes antígenos pueden producir una población de células enriquecida con especificidad cruzada para los diferentes antígenos.
El enriquecimiento de una población de células se puede realizar mediante cualquier medio de selección celular conocido en la técnica para aislar células específicas de antígeno. Por ejemplo, una población de células puede enriquecerse mediante técnicas cromatográficas, por ejemplo, tecnología de perlas de Miltenyi o de perlas magnéticas. Las perlas pueden unirse directa o indirectamente al antígeno de interés. En una realización preferida, el procedimiento de enriquecimiento de una población de células incluye al menos una etapa de enriquecimiento cromatográfico.
Una población de células también puede enriquecerse mediante la realización de cualquier técnica de ensayo de especificidad de antígeno conocida en la técnica, por ejemplo, un ensayo ELISA o un ensayo halo. Los ensayos ELISA incluyen, pero sin limitarse a, inmovilización selectiva de antígenos (por ejemplo, captura de antígeno biotinilado mediante una placa recubierta de estreptavidina, avidina o neutravidina), recubrimiento de placa de antígeno no específico y mediante una estrategia de acumulación de antígeno (por ejemplo, captura de antígeno selectiva seguida de la adición de un compañero de unión para generar un complejo heteromérico antígeno-proteína). El antígeno puede unirse directa o indirectamente a una matriz sólida o soporte, por ejemplo, una columna. Un ensayo halo comprende poner en contacto las células con perlas cargadas con antígeno y anticuerpo anti-huésped marcado específico para el huésped utilizado para recolectar las células B. El marcador puede ser, por ejemplo, un fluoróforo. En una realización, se realiza al menos una etapa de enriquecimiento del ensayo en al menos una suspensión de células individuales. En otra realización, el procedimiento de enriquecimiento de una población de células incluye al menos una etapa de enriquecimiento cromatográfico y al menos una etapa de enriquecimiento de ensayo.
Se conocen en la técnica procedimientos para "enriquecer" una población de células por tamaño o densidad. Véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos No. 5.627.052. Estas etapas pueden usarse en el presente procedimiento además de enriquecer la población de células por especificidad de antígeno.
Las poblaciones de células contienen al menos una célula capaz de reconocer un antígeno. Las células que reconocen antígenos incluyen, pero sin limitarse a, células B, células plasmáticas y su progenie. En una realización, la presente invención proporciona una población de células clonales que contiene un solo tipo de célula B específica de antígeno, es decir, la población de células produce un único anticuerpo monoclonal específico para un antígeno deseado.
Se cree que la población clonal específica de antígeno de células B consiste predominantemente en células secretoras de anticuerpos específicas de antígeno, que se obtienen mediante el nuevo protocolo de cultivo y selección proporcionado en este documento. Por consiguiente, en el presente documento se describen procedimientos para obtener una población de células enriquecida que contiene al menos una célula secretora de anticuerpos específica de antígeno. En el presente documento se describe una población de células enriquecidas que contiene aproximadamente 50% a aproximadamente 100%, o incrementos en la misma, al menos aproximadamente 60%, 70%, 80%, 90% o 100% de células secretoras de anticuerpos específicas de antígeno.
En el presente documento se describe un procedimiento para aislar una sola célula B enriqueciendo una población de células obtenida de un huésped antes de cualquier etapa de selección, por ejemplo, seleccionar una célula B particular de una población de células y/o seleccionar un anticuerpo producido por una célula particular. La etapa de enriquecimiento se puede realizar como una, dos, tres o más etapas. Se aísla una única célula B de una población de células enriquecida antes de confirmar si la única célula B secreta un anticuerpo con especificidad de antígeno y/o una propiedad deseada.
Se usa un procedimiento para enriquecer una población de células en un procedimiento para la producción y/o selección de anticuerpos. Por tanto, en el presente documento se describe un procedimiento que comprende enriquecer una población de células antes de seleccionar un anticuerpo. El procedimiento puede incluir las etapas de: preparar una población de células que comprende al menos una célula específica de antígeno, enriquecer la población de células aislando al menos una célula específica de antígeno para formar una población de células enriquecida e inducir la producción de anticuerpos a partir de al menos una célula específica de antígeno. La población de células enriquecidas contiene más de una célula específica de antígeno. Cada célula específica de antígeno de la población enriquecida se cultiva en condiciones que producen una población de células B específica de antígeno clonal antes de aislar una célula productora de anticuerpos de la misma y/o producir un anticuerpo utilizando dicha célula B, o una secuencia de ácido nucleico correspondiente a dicho anticuerpo. A diferencia de las técnicas anteriores en las que los anticuerpos se producen a partir de una población de células con una baja frecuencia de células específicas de antígeno, la presente invención permite la selección de anticuerpos entre una alta frecuencia de células específicas de antígeno. Debido a que se usa una etapa de enriquecimiento antes de la selección de anticuerpos, la mayoría de las células, preferiblemente virtualmente todas las células, usadas para la producción de anticuerpos son específicas de antígeno. Al producir anticuerpos a partir de una población de células con una frecuencia aumentada de especificidad antigénica, aumenta la cantidad y variedad de anticuerpos.
En los procedimientos de selección de anticuerpos descritos en el presente documento, un anticuerpo se selecciona preferiblemente después de una etapa de enriquecimiento y una etapa de cultivo que da como resultado una población clonal de células B específicas de antígeno. Los procedimientos pueden comprender además una etapa de secuenciar un anticuerpo seleccionado o porciones del mismo de al menos una célula aislada específica de antígeno. Puede emplearse cualquier procedimiento conocido en la técnica para secuenciación y puede incluir secuenciar la cadena pesada, la cadena ligera, la región o regiones variables y/o la región o regiones determinantes de complementariedad (CDR).
Además de la etapa de enriquecimiento, el procedimiento para la selección de anticuerpos también puede incluir al menos una etapa de cribado de una población de células para el reconocimiento de antígenos y/o la funcionalidad del anticuerpo. Por ejemplo, los anticuerpos deseados pueden tener características estructurales específicas, tales como unirse a un epítopo particular o imitar una estructura particular; actividad antagonista o agonista; o actividad neutralizante, por ejemplo, inhibiendo la unión entre el antígeno y un ligando. El cribado de la funcionalidad del anticuerpo puede depender del ligando. El cribado de la funcionalidad del anticuerpo incluye, pero no se limita a, un ensayo de interacción proteína-proteína in vitro que recrea la interacción natural del ligando del antígeno con la proteína receptora recombinante; y una respuesta basada en células que depende del ligando y se controla fácilmente (por ejemplo, respuesta de proliferación). El procedimiento para la selección de anticuerpos puede incluir una etapa de cribado de la población de células para determinar la funcionalidad del anticuerpo midiendo la concentración inhibidora (IC50). Al menos una de las células específicas de antígeno aisladas produce un anticuerpo que tiene una IC50 de menos de aproximadamente 100, 50, 30, 25, 10 pg/ml o incrementos en la misma.
Además de la etapa de enriquecimiento, el procedimiento para la selección de anticuerpos también puede incluir al menos una etapa de cribado de una población de células para determinar la fuerza de unión del anticuerpo. La fuerza de unión del anticuerpo se puede medir mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica (por ejemplo, Biacore®). Al menos una de las células específicas de antígeno aisladas produce un anticuerpo que tiene una alta afinidad por el antígeno, por ejemplo, una constante de disociación (Kd) de menos de aproximadamente 5x1010 M-1, preferiblemente de aproximadamente 1x1013 a 5x10-10, 1x10-12 a 1x10-10, 1x10-12 a 7,5 x10-11, 1x10-11 a 2x10-11, aproximadamente 1,5 x10-11 o menos, o incrementos en la misma. Se dice que los anticuerpos son maduros por afinidad. La afinidad de los anticuerpos es comparable o superior a la afinidad de cualquiera de Panorex® (edrecolomab), Rituxan® (rituximab), Herceptin® (trastuzumab), Mylotarg® (gemtuzumab), Campath® (alemtuzumab), Zevalin® (ibritumomab), Erbitux® (cetuximab), Avastin® (bevacizumab), Raptiva® (efalizumab), Remicade® (infliximab), Humira® (adalimumab) o Xolair® (omalizumab). Preferiblemente, la afinidad de los anticuerpos es comparable o superior a la afinidad de Humira®. La afinidad de un anticuerpo también se puede incrementar mediante técnicas conocidas de maduración por afinidad. Se criba al menos una población de células para al menos una de, preferiblemente ambas, la funcionalidad del anticuerpo y la fuerza de unión del anticuerpo.
Además de la etapa de enriquecimiento, el procedimiento para la selección de anticuerpos también puede incluir al menos una etapa de cribado de una población de células en busca de homología de secuencia de anticuerpos, especialmente homología humana. Al menos una de las células específicas de antígeno aisladas produce un anticuerpo que tiene una homología con un anticuerpo humano de al menos aproximadamente 50% a aproximadamente 100%, o incrementos en el mismo, o al menos aproximadamente 60%, 70%, 80%, 85%, 90% o 95% homólogo. Los anticuerpos se pueden humanizar para aumentar la homología con una secuencia humana mediante técnicas conocidas en la técnica tales como injerto de CDR o injerto de residuo determinante de selectividad (SDR).
También se describen en este documento los propios anticuerpos de acuerdo con cualquiera de las realizaciones descritas anteriormente en términos de IC50, Kd y/u homología.
Procedimientos de humanización de anticuerpos
En el presente documento se describe un procedimiento para humanizar cadenas ligeras y pesadas de anticuerpos. Se puede seguir el siguiente procedimiento para la humanización de las cadenas pesada y ligera:
Cadena ligera
1. Identificar el aminoácido que es el primero que sigue a la secuencia del péptido señal. Este es el comienzo del Marco 1. El péptido señal comienza en la primera metionina de inicio y tiene típicamente, pero no necesariamente, 22 aminoácidos de longitud para las secuencias de proteínas de cadena ligera de conejo. El inicio del polipéptido maduro también puede determinarse experimentalmente mediante secuenciación de la proteína del terminal N, o puede predecirse usando un algoritmo de predicción. Este es también el comienzo del Marco 1, de acuerdo con la definición clásica de los que trabajan en este campo.
Ejemplo: residuo de aminoácido 1 de RbtVL en la Fig. 1, comenzando con 'AYDM ...' (SEQ ID NO: 733) 2. Identificar el final del Marco
3. Esto es típicamente 86-90 aminoácidos después del comienzo del Marco 1 y típicamente es un residuo de cisteína precedido por dos residuos de tirosina. Este es el final del Marco 3, de acuerdo con la definición clásica de quienes trabajan en este campo.
Ejemplo: residuo de aminoácido 88 de RbtVL en la Fig. 1, que termina como 'TYYC' (SEQ ID NO: 733)
3. Usar la secuencia de cadena ligera de conejo del polipéptido comenzando desde el principio del Marco 1 hasta el final del Marco 3 como se definió anteriormente y realizar una búsqueda de homología de secuencia para las secuencias de proteína de anticuerpos humanos más similares. Normalmente, esta será una búsqueda contra secuencias de la línea germinal humana antes de la maduración del anticuerpo para reducir la posibilidad de inmunogenicidad, sin embargo, se puede usar cualquier secuencia humana. Normalmente, un programa como BLAST se puede utilizar para buscar en una base de datos de secuencias las más homólogas. Se pueden encontrar bases de datos de secuencias de anticuerpos humanos de diversas fuentes, como NCBI (Centro Nacional de Información Biotecnológica).
Ejemplo: la secuencia de aminoácidos de RbtVL de los residuos numerados del 1 al 88 en la Fig. 1 se busca en BLAST contra una base de datos de línea germinal de anticuerpos humanos. Las tres primeras secuencias devueltas únicas se muestran en la Fig. 1 como L12A (SEQ ID NO: 734), V1 (SEQ ID NO: 735) y Vx02 (SEQ ID NO: 736).
4. Generalmente, la secuencia de cadena ligera variable de la línea germinal humana más homóloga se usa luego como base para la humanización. Sin embargo, los expertos en la técnica pueden decidir utilizar otra secuencia que no tenga la homología más alta de acuerdo con lo determinado por el algoritmo de homología, basándose en otros factores, incluidos los huecos de la secuencia y las similitudes del marco.
Ejemplo: En la Fig. 1, L12A (SEQ ID NO: 734) era la secuencia de cadena ligera variable de la línea germinal humana más homóloga y se usa como base para la humanización de RbtVL.
5. Determinar el marco y la disposición de CDR (FR1, FR2, FR3, CDR1 y CDR2) para el homólogo humano que se usa para la humanización de la cadena ligera. Esto es, utilizando el diseño tradicional como se describe en este campo. Se alinea la secuencia de cadena ligera variable de conejo con el homólogo humano, mientras se mantiene la disposición de las regiones marco y CDR.
Ejemplo: En la Fig. 1, la secuencia de RbtVL se alinea con la secuencia homóloga humana L12A, y se indican los dominios marco y CDR.
6. Se reemplazan las regiones CDR1 y CDR2 de la secuencia de la cadena ligera homóloga humana con las secuencias CDR1 y CDR2 de la secuencia de conejo. Si existen diferencias de longitud entre las secuencias de CDR de conejo y humana, se utilizan las secuencias de CDR de conejo completas y sus longitudes. Es posible que la especificidad, afinidad y/o inmunogenicidad del anticuerpo humanizado resultante no se altere si se realizan intercambios de secuencia más pequeños o más grandes, o si se alteran un residuo o residuos específicos; sin embargo, los intercambios descritos se han utilizado con éxito, pero no se excluye la posibilidad de permitir otros cambios.
Ejemplo: En la Fig. 1, los residuos de aminoácidos de CDR1 y CDR2 de la cadena ligera variable homóloga humana L12A se reemplazan con las secuencias de aminoácidos de CDR1 y CDR2 de la secuencia de la cadena ligera del anticuerpo de conejo RbtVL. Los marcos 1,2 y 3 de L12A humano no están alterados. La secuencia humanizada resultante se muestra a continuación como VLh de los residuos numerados del 1 al 88. Nótese que los únicos residuos que son diferentes de la secuencia humana L12A están subrayados y, por tanto, son residuos de aminoácidos derivados de conejo. En este ejemplo, solo 8 de los 88 residuos son diferentes de la secuencia humana.
7. Después del marco 3 de la nueva secuencia híbrida creada en la Etapa 6, se adjunta la CDR3 completa de la secuencia del anticuerpo de la cadena ligera de conejo. La secuencia de CDR3 puede tener varias longitudes, pero típicamente tiene una longitud de 9 a 15 residuos de aminoácidos. La región CDR3 y el comienzo de la siguiente región del marco 4 se definen clásicamente y pueden ser identificadas por los expertos en la técnica. Normalmente, el comienzo del Marco 4 y, por tanto, después, el final de CDR3 consiste en la secuencia "FGGG ..." (SEQ ID NO: 743), sin embargo, puede existir alguna variación en estos residuos.
Ejemplo: En la Fig. 1, se agrega la CDR3 de RbtVL (residuos de aminoácidos numerados 89-100) después del final del marco 3 en la secuencia humanizada indicada como VLh.
8. El marco 4 de la cadena ligera de conejo, que normalmente son los 11 residuos de aminoácidos finales de la cadena ligera variable y comienza como se indica en la Etapa 7 anterior y normalmente termina con la secuencia de aminoácidos '... VVKR' (SEQ ID NO: 744) se reemplaza con el homólogo del marco 4 de la cadena ligera humana más cercana, normalmente de la secuencia de la línea germinal. Con frecuencia, este marco 4 de cadena ligera humana es de la secuencia 'FGGGTKVEIKR' (SEQ ID NO: 745). Es posible que se puedan usar otras secuencias del marco 4 de la cadena ligera humana que no son las más homólogas o bien diferentes sin afectar la especificidad, afinidad y/o inmunogenicidad del anticuerpo humanizado resultante. Esta secuencia del marco 4 de la cadena ligera humana se añade al final de la secuencia humanizada de la cadena ligera variable que sigue inmediatamente a la secuencia de CDR3 de la Etapa 7 anterior. Este es ahora el final de la secuencia de aminoácidos humanizados de cadena ligera variable.
Ejemplo: En la Fig. 1, el Marco 4 (FR4) de la secuencia de cadena ligera de conejo RbtVL se muestra encima de una secuencia de FR4 humana homóloga. La secuencia de FR4 humana se agrega a la secuencia de cadena ligera variable humanizada (VLh) justo después del final de la región CD3 agregada en la Etapa 7 anterior.
Además, las Figuras 4 y 5 representan secuencias de cadena ligera variable y pesada variable anti-IL- 6 humanizadas preferidas humanizadas a partir de las regiones pesada y ligera variables en Ab1 de acuerdo con la invención. Estas regiones de cadena ligera y pesada humanizadas están contenidas respectivamente en los polipéptidos expuestos en las SEQ ID NOs: 647 o 651 y en las SEQ ID NO: 652, 656, 657 o 658. La CDR2 de la región pesada variable humanizada en la SEQ ID NO: 657 (que contiene una sustitución de serina en CDR2) se expone en la SEQ ID NO: 658. Las alineaciones que ilustran las variantes de las cadenas ligera y pesada se muestran en las Figuras 2 y 3, respectivamente, destacando las diferencias de secuencia dentro de las regiones CDR. Los identificadores de secuencia de las secuencias de CDR y de ejemplos de secuencias de codificación se resumen en la Tabla 4 anterior.
Cadena pesada
1. Identificar el aminoácido que es el primero que sigue a la secuencia del péptido señal. Este es el comienzo del Marco 1. El péptido señal comienza en la primera metionina de inicio y normalmente tiene 19 aminoácidos de longitud para las secuencias de proteínas de cadena pesada de conejo. Típicamente, pero no necesariamente siempre, los 3 residuos de aminoácidos finales de un péptido señal de cadena pesada de conejo son '... VQC', seguidos del inicio del Marco 1. El inicio del polipéptido maduro también se puede determinar experimentalmente mediante la secuenciación de la proteína del terminal N, o se puede predecir usando un algoritmo de predicción. Este es también el comienzo del Marco 1, de acuerdo con la definición clásica de los que trabajan en este campo. Ejemplo: residuo 1 de aminoácido de RbtVH 1 en la Fig.1, comenzando con 'QEQI__ ' (SEQ ID NO: 738) 2. Identificar el final del Marco 3. Esto es típicamente de 95-100 aminoácidos después del comienzo del Marco 1 y típicamente tiene la secuencia final de '...CAR' (aunque la alanina también puede ser una valina). Este es el final del Marco 3, de acuerdo con la definición clásica de quienes trabajan en este campo.
Ejemplo: residuo 98 de aminoácidos de RbtVH en la Fig. 1, que termina como '...FCVR' (SEQ ID NO: 738). 3. Usar la secuencia de cadena pesada de conejo del polipéptido comenzando desde el principio del Marco 1 hasta el final del Marco 3 como se definió anteriormente y realizar una búsqueda de homología de secuencia para las secuencias de proteína de anticuerpos humanos más similares. Esto será típicamente contra una base de datos de secuencias de la línea germinal humana antes de la maduración del anticuerpo para reducir la posibilidad de inmunogenicidad, sin embargo, se puede usar cualquier secuencia humana. Normalmente, se puede utilizar un programa como BLAST para buscar en una base de datos de secuencias las más homólogas. Se pueden encontrar bases de datos de secuencias de anticuerpos humanos de diversas fuentes, como NCBI (Centro Nacional de Información Biotecnológica).
Ejemplo: la secuencia de aminoácidos de RbtVH de los residuos numerados del 1 al 98 en la Fig. 1 se somete a BLAST con una base de datos de la línea germinal de anticuerpos humanos. Las tres primeras secuencias devueltas únicas se muestran en la Fig.1 como 3-64-04 (SEQ ID NO: 739), 3-66-04 (SEQ iD NO: 740) y 3-53-02 (SEQ ID NO: 741).
4. Generalmente, la secuencia de cadena pesada variable de la línea germinal humana más homóloga se usa luego como base para la humanización. Sin embargo, los expertos en la técnica pueden decidir utilizar otra secuencia que no sea la más homóloga de acuerdo con lo determinado por el algoritmo de homología, basándose en otros factores, incluidos los huecos de la secuencia y las similitudes del marco.
Ejemplo: 3-64-04 en la Fig. 1 era la secuencia de cadena pesada variable de la línea germinal humana más homóloga y se usa como base para la humanización de RbtVH.
5. Determinar el marco y la disposición de CDR (FR1, FR2, FR3, CDR1 y CDR2) para el homólogo humano que se usa para la humanización de la cadena pesada. Esto se hace utilizando el diseño tradicional como se describe en este campo. Se alinea la secuencia de cadena pesada variable de conejo con el homólogo humano, mientras se mantiene la disposición de las regiones marco y CDR.
Ejemplo: En la Fig. 1, la secuencia de RbtVH está alineada con la secuencia homóloga humana 3-64-04, y se indican los dominios marco y de CDR.
6. Reemplazar las regiones CDR1 y CDR2 de la secuencia de cadena pesada homóloga humana con las secuencias de CDR1 y CDR2 de la secuencia de conejo. Si existen diferencias de longitud entre las secuencias de CDR de conejo y humana, utilizar las secuencias de CDR de conejo completas y sus longitudes. Además, puede ser necesario reemplazar los tres aminoácidos finales de la región del Marco 1 de la cadena pesada humana con los tres aminoácidos finales del Marco 1 de la cadena pesada de conejo. Por lo general, pero no siempre, en el Marco 1 de la cadena pesada del conejo, estos tres residuos siguen a un residuo de glicina precedido por un residuo de serina. Además, puede ser necesario reemplazar el aminoácido final de la región del Marco 2 de la cadena pesada humana con el aminoácido final del Marco 2 de la cadena pesada del conejo. Normalmente, pero no necesariamente siempre, este es un residuo de glicina precedido por un residuo de isoleucina en el Marco 2 de cadena pesada de conejo. Es posible que la especificidad, afinidad y/o inmunogenicidad del anticuerpo humanizado resultante no se altere si se realizan intercambios de secuencia más pequeños o más grandes, o si se altera un residuo o residuos específicos, sin embargo, los intercambios como se describe se han utilizado con éxito, pero no excluye la posibilidad de que se permitan otros cambios. Por ejemplo, un residuo del aminoácido triptófano aparece típicamente cuatro residuos antes del final de la región c DR2 de cadena pesada de conejo, mientras que en c DR2 de cadena pesada humana este residuo es típicamente un residuo de serina. Se ha demostrado que cambiar este residuo de triptófano de conejo por un residuo de serina humana en esta posición tiene un efecto mínimo o nulo sobre la especificidad o afinidad del anticuerpo humanizado y, por tanto, minimiza aún más el contenido de residuos de aminoácidos derivados de la secuencia de conejo en la secuencia humanizada.
Ejemplo: En la Fig. 1, los residuos de aminoácidos de CDR1 y CDR2 de la cadena pesada variable homóloga humana se reemplazan con las secuencias de aminoácidos de CDR1 y CDR2 de la secuencia de la cadena ligera del anticuerpo de conejo RbtVH, excepto por el residuo en el cajón, que es triptófano en la secuencia de conejo (posición número 63) y serina en la misma posición en la secuencia humana, y se mantiene como el residuo de serina humana. Además de los cambios de CDR1 y CDR2, los tres aminoácidos finales del Marco 1 (posiciones 28-30) así como el residuo final del Marco 2 (posición 49) se retienen como residuos de aminoácidos de conejo en lugar de humanos. La secuencia humanizada resultante se muestra a continuación como VHh de los residuos numerados del 1 al 98. Nótese que los únicos residuos que son diferentes de la secuencia humana 3-64-04 están subrayados y, por tanto, son residuos de aminoácidos derivados de conejo. En este ejemplo, solo 15 de los 98 residuos son diferentes de la secuencia humana.
7. Después del marco 3 de la nueva secuencia híbrida creada en la Etapa 6 , adjuntar la CDR3 completa de la secuencia del anticuerpo de cadena pesada de conejo. La secuencia de c DR3 puede tener varias longitudes, pero típicamente tiene una longitud de 5 a 19 residuos de aminoácidos. La región CDR3 y el comienzo de la siguiente región marco 4 se definen clásicamente y son identificables por los expertos en la técnica. Normalmente, el comienzo del marco 4 y, por tanto, después del final de CDR3 consta de la secuencia WGXG ... (en la que X es normalmente Q o P) (SEQ ID NO: 746), sin embargo, puede existir alguna variación en estos residuos.
Ejemplo: La CDR3 de RbtVH (residuos de aminoácidos numerados 99-110) se agrega después del final del marco 3 en la secuencia humanizada indicada como VHh.
8. El marco 4 de la cadena pesada de conejo, que normalmente son los 11 residuos de aminoácidos finales de la cadena pesada variable y comienza como se indica en la Etapa 7 anterior y normalmente termina con la secuencia de aminoácidos '...TVSS' (SEQ ID NO: 747) se reemplaza con el homólogo del marco 4 de la cadena pesada humana más cercana, normalmente de la secuencia de la línea germinal. Con frecuencia, este marco 4 de cadena pesada humana es de la secuencia 'WGQGTLVTVSS' (SEQ ID NO: 748). Es posible que se puedan usar otras secuencias del marco 4 de la cadena pesada humana que no sean las más homólogas o diferentes sin afectar la especificidad, afinidad y/o inmunogenicidad del anticuerpo humanizado resultante. Esta secuencia del marco 4 de la cadena pesada humana se añade al final de la secuencia humanizada de la cadena pesada variable que sigue inmediatamente a la secuencia de CDR3 de la Etapa 7 anterior. Este es ahora el final de la secuencia de aminoácidos humanizados de cadena pesada variable.
Ejemplo: En la Fig. 1, el marco 4 (FR4) de la secuencia de cadena pesada de conejo RbtVH se muestra encima de una secuencia de FR4 pesada humana homóloga. La secuencia de FR4 humana se agrega a la secuencia de cadena pesada variable humanizada (VHh) justo después del final de la región CD3 agregada en la Etapa 7 anterior.
Realizaciones ejemplares adicionales de la invención
También se describen en el presente documento anticuerpos anti-IL- 6 o fragmentos de anticuerpos o variantes de los mismos que pueden unirse específicamente al mismo epítopo o epítopos lineales o conformacionales y/o competir por unirse al mismo epítopo o epítopos lineales o conformacionales en un polipéptido IL- 6 humano intacto o fragmento del mismo como un anticuerpo anti-IL- 6 que comprende Ab1 y anticuerpos quiméricos, humanizados, de cadena sencilla y fragmentos de los mismos (que contienen al menos una CDR de los anticuerpos identificados anteriormente) que se unen específicamente a IL-6 , que preferiblemente están aglicosilados. El anticuerpo anti-IL- 6 o fragmento o variante del mismo puede unirse específicamente al mismo epítopo o epítopos lineales o conformacionales y/o competir por unirse al mismo epítopo o epítopos lineales o conformacionales en un polipéptido IL- 6 humano intacto o un fragmento del mismo como Ab1 y anticuerpos monocatenarios, humanizados, quiméricos y fragmentos de los mismos (que contienen al menos una CDR del anticuerpo mencionado anteriormente) que se unen específicamente a IL-6 , que preferiblemente están aglicosilados.
El anticuerpo anti-IL- 6 que puede unirse específicamente a los mismos epítopos lineales o conformacionales en un polipéptido IL- 6 intacto o un fragmento del mismo que está (están) específicamente unidos por Ab1 puede unirse a un epítopo o epítopos de IL- 6 determinado por mapeo epitópico usando fragmentos de péptidos lineales superpuestos que abarcan la longitud completa del polipéptido IL- 6 humano nativo. El epítopo de IL- 6 comprende, o alternativamente consiste en, al menos un residuo comprendido en fragmentos de IL- 6 seleccionados entre aquellos que abarcan respectivamente los residuos de aminoácidos 37-51, los residuos de aminoácidos 70-84, los residuos de aminoácidos 169-183, los residuos de aminoácidos residuos 31-45 y/o residuos de aminoácidos 58-72.
Se describe en el presente documento un anticuerpo anti-IL- 6 que se une al mismo epítopo de IL- 6 y/o compite con un anticuerpo anti-IL-6 por unirse a IL- 6 como un anticuerpo o fragmento de anticuerpo descrito en el presente documento, incluyendo, pero sin limitarse a, un anticuerpo anti-IL- 6 seleccionado de Ab1 y anticuerpos monocatenarios, humanizados, quiméricos y fragmentos de los mismos (que contienen al menos una CDR del anticuerpo mencionado anteriormente) que se unen específicamente a IL-6 , que preferiblemente están aglicosilados.
También se describe un anticuerpo anti-IL- 6 aislado o fragmento de anticuerpo o variante del mismo que comprende al menos una de las CDR contenidas en las secuencias de polipéptidos Vh que comprenden: las SEQ ID NOs: 3, 18, 19, 22, 38, 54, 70, 86 , 102, 117, 118, 123, 139, 155, 171, 187, 203, 219, 235, 251, 267, 283, 299, 315, 331, 347, 363, 379, 395, 411, 427, 443, 459, 475, 491, 507, 523, 539, 555, 571, 652, 656, 657, 658, 661, 664, 665, 6 68 , 672, 676, 680, 684, 68 8 , 691, 692, 704, o 708 y/o al menos una de las CDR contenidas en la secuencia polipeptídica Vl que consta de: 2, 20, 21, 37, 53, 69, 85, 101, 119, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346, 362, 378, 394, 410, 426, 442, 458, 474, 490, 506, 522, 538, 554, 570, 647, 651, 660, 6 66 , 667, 671, 675, 679, 683, 687, 693, 699, 702, 706 o 709 y las secuencias Vh y Vl representadas en las alineaciones de anticuerpos comprendidas en las Figuras 1-5 de esta solicitud.
El anticuerpo anti-IL- 6 descrito en el presente documento puede comprender al menos 2 regiones determinantes de complementariedad (CDR) en cada una de las regiones ligera variable y pesada variable que son idénticas a las contenidas en un anticuerpo anti-IL- 6 que comprende Ab1 y anticuerpos quiméricos, humanizados, de cadena sencilla y fragmentos de los mismos (que contienen al menos una CDR del anticuerpo mencionado anteriormente) que se unen específicamente a IL-6 , que preferiblemente están aglicosilados.
El anticuerpo anti-IL- 6 descrito aquí puede comprender al menos 2 regiones determinantes de complementariedad (CDR) en cada una de las regiones ligera variable y pesada variable que son idénticas a las contenidas en Ab1. En otra realización, todas las CDR del anticuerpo anti-IL- 6 discutidas anteriormente son idénticas a las CDR contenidas en un anticuerpo anti-IL- 6 que comprende Ab1 y anticuerpos quiméricos, humanizados, de cadena sencilla y fragmentos de los mismos (que contienen al menos una CDR del anticuerpo mencionado anteriormente) que se unen específicamente a IL-6 , que preferiblemente están aglicosilados. En una realización preferida de la invención, todas las CDR del anticuerpo anti-IL- 6 discutidas anteriormente son idénticas a las CDR contenidas en Ab1, por ejemplo, un anticuerpo compuesto por las secuencias VH y VL comprendidas en la SEQ ID NO: 657 y la SEQ ID NO: 709 respectivamente.
La invención contempla además que uno o más anticuerpos anti-IL- 6 discutidos anteriormente están aglicosilados o sustancialmente no glicosilados (por ejemplo, pueden contener uno o más, por ejemplo, 1-5 residuos de manosa); que contienen una región Fc que se ha modificado para alterar la función efectora, la semivida, la proteólisis y/o la glicosilación; son humanos, humanizados, monocatenarios o quiméricos; y son un anticuerpo humanizado derivado de un anticuerpo anti-IL- 6 de conejo (parental). Los ejemplos de regiones constantes que proporcionan la producción de anticuerpos aglicosilados en Pichia están comprendidas en la SEQ ID NO: 588 y la SEQ ID NO: 586 que están codificadas respectivamente por las secuencias de ácido nucleico en la SEQ ID NO: 589 y la SEQ ID NO: 587.
La invención contempla además al menos un anticuerpo anti-IL- 6 en el que las regiones marco (FR) en la región ligera variable y las regiones pesadas variables de dicho anticuerpo, respectivamente, son FR humanas que no están modificadas o que han sido modificadas por el sustitución de como máximo 2 o 3 residuos de FR humanas en la región de cadena ligera o pesada variable con los residuos de FR correspondientes del anticuerpo de conejo parental, y en el que dichas FR humanas se han derivado de secuencias de anticuerpos de cadena ligera y pesada variable humana que se han seleccionado de una biblioteca de secuencias de anticuerpos de la línea germinal humana con base en su alto nivel de homología con las regiones de cadena ligera o pesada variable de conejo correspondientes en relación con otras secuencias de anticuerpos de la línea germinal humana contenidas en la biblioteca.
En una realización de la invención, el anticuerpo anti-IL- 6 o fragmento o variante del mismo puede unirse específicamente a células humanas que expresan IL- 6 y/o a moléculas de IL-6 solubles circulantes in vivo, incluyendo IL- 6 expresada sobre o por células humanas en un paciente con una enfermedad asociada con células que expresan IL-6.
La invención contempla además anticuerpos anti-IL- 6 o fragmentos o variantes de los mismos unidos directa o indirectamente a un marcador detectable o agente terapéutico.
También se describen secuencias de ácido nucleico que dan como resultado la expresión de un anticuerpo anti-IL-6 o un fragmento de anticuerpo o una variante del mismo como se estableció anteriormente, incluyendo aquellas que comprenden, o alternativamente consisten en, codones preferidos de levadura o humanos. Se describen además vectores (incluidos plásmidos o vectores virales recombinantes) que comprenden dicha secuencia o secuencias de ácido nucleico. También se describen células huésped o células huésped recombinantes que expresan al menos uno de los anticuerpos expuestos anteriormente, que incluyen células de mamífero, levadura, bacterias e insectos. La célula huésped puede ser una célula de levadura. La célula de levadura puede ser una célula de levadura diploide. La célula de levadura puede ser una levadura Pichia.
En el presente documento se describe un procedimiento de tratamiento que comprende administrar a un paciente con una enfermedad o afección asociada con mucositis una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un anticuerpo anti-IL- 6 o fragmento de anticuerpo o variante del mismo. Las enfermedades que pueden tratarse se presentan en la lista no limitativa expuesta anteriormente. El tratamiento incluye además la administración de otro agente terapéutico o régimen seleccionado entre quimioterapia, radioterapia, administración de citocinas o agente de terapia génica. Por ejemplo, los inhibidores de TNF-a que incluyen pero sin limitarse a glucocorticoides, triamcinolona, dexametasona, prednisona, también pueden administrarse secuencialmente o posteriormente con al menos un anticuerpo anti-IL- 6 o fragmento de anticuerpo o variante del mismo descrito en el presente documento. Otros ejemplos de medicamentos que pueden incluirse con los antagonistas de IL- 6 incluyen, pero sin limitarse a ARISTOCORT® (triamcinolona), Ba y Ca DROM® (dexametasona), DECADRON® (dexametasona), DELTASONE® (prednisona), DEXAMETHASONE INTENSOL® (dexametasona), ENBREL® (etanercept), Hu M iRA® (adalimumab), REMICADE® (infliximab), RIDUARA® (auranofina) y SIMPONI® (golimumab).
Ejemplos de realizaciones de polipéptidos de cadena pesada y ligera y polinucleótidos
Esta sección enumera ejemplos de realizaciones de polipéptidos de cadena pesada y ligera, así como ejemplos de polinucleótidos que codifican dichos polipéptidos. Estos ejemplos de polinucleótidos son adecuados para el sistema de expresión divulgado de Pichia.
Se describen en este documento polinucleótidos que tienen al menos aproximadamente 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia (homología de secuencia) con los polinucleótidos enumerados en esta solicitud o que codifican polipéptidos enumerados en esta solicitud, o que se hibridan con dichos polinucleótidos en condiciones de baja rigurosidad, moderada rigurosidad o alta rigurosidad, preferiblemente aquellos que codifican polipéptidos (por ejemplo, una cadena ligera y pesada de inmunoglobulina, un anticuerpo monocatenario, un fragmento de anticuerpo) que tienen al menos una de las actividades biológicas expuestas en este documento, incluida, sin limitación, la unión específica a un polipéptido IL-6. En el presente documento se describe una composición que comprende dicho polinucleótido y/o un polipéptido codificado por dicho polinucleótido. También se describe en el presente documento un procedimiento de tratamiento de una enfermedad o afección asociada con IL- 6 o que puede prevenirse, tratarse o mejorarse con un antagonista de IL- 6 tal como Ab1 (por ejemplo, mucositis) que comprende la administración de una composición que comprende dicho polinucleótido y/o polipéptido.
En el presente documento se describe un polipéptido de cadena pesada que comprende al menos una de las secuencias de CDR de los polipéptidos de cadena pesada y/o ligera enumerados en este documento (incluidos los contenidos en los polipéptidos de cadena pesada y ligera enumerados en este documento) y al menos uno de los polipéptidos de la región marco enumerados en este documento, incluidos los representados en las Figuras 1-5 o Tabla 4, y están contenidos en las secuencias polipeptídicas de cadena pesada y ligera enumeradas en este documento. Un polipéptido de cadena pesada puede comprender al menos una secuencia de la región Marco 4 como se muestra en las Figuras 1-5 o Tabla 4, o como está contenido en un polipéptido de cadena pesada o ligera mencionado en este documento.
Un polipéptido de cadena ligera puede comprender al menos una de las secuencias de CDR de los polipéptidos de cadena pesada y/o ligera enumerados en este documento (incluidos los contenidos en los polipéptidos de cadena pesada y ligera enumerados en este documento) y al menos uno de los polipéptidos de la región marco enumerados en este documento, incluidos los representados en las Figuras 1-5 o Tabla 4, y contenidos en las secuencias polipeptídicas de cadena pesada y ligera enumeradas en este documento. Un polipéptido de cadena ligera puede comprender al menos una secuencia de la región Marco 4 como se muestra en las Figuras 1-5 o Tabla 4, o como está contenido en un polipéptido de cadena pesada o ligera mencionado en este documento.
Ciertas secuencias enumeradas pueden sustituirse entre sí, a menos que el contexto indique lo contrario. Se entiende que la mención de que las secuencias particulares pueden sustituirse entre sí, cuando se realizan dichas menciones, es ilustrativa en lugar de limitante, y también se entiende que tales sustituciones están incluidas incluso cuando no se mencionan ejemplos ilustrativos de sustituciones, por ejemplo, siempre que se mencione al menos uno de los polipéptidos de cadena ligera Ab1, por ejemplo cualquiera de las SEQ ID NOs: 2, 20, 647, 651, 660, 6 66 , 699, 702, 706 o 709, se puede sustituir con otro polipéptido de cadena ligera Ab1 a menos que el contexto indique lo contrario. De manera similar, siempre que se mencione uno de los polipéptidos de cadena pesada Ab1, por ejemplo, cualquiera de las SEQ ID NOs: 3, 18, 19, 652, 656, 657, 658, 661,6 64 , 665, 704 o 708, se puede sustituir con otro polipéptido de cadena pesada Ab1 a menos que el contexto indique lo contrario. Asimismo, siempre que se mencione uno de los polinucleótidos de cadena ligera Ab1, por ejemplo, cualquiera de las SEQ ID NOs: 10, 662, 698, 701 o 705, se puede sustituir con otro polinucleótido de cadena ligera Ab1 a menos que el contexto indique lo contrario. De manera similar, siempre que se mencione uno de los polinucleótidos de cadena pesada Ab1, por ejemplo, cualquiera de las SEQ ID NOs: 11 , 663, 700, 703 o 707, se puede sustituir con otro polinucleótido de cadena pesada Ab1 a menos que el contexto indique lo contrario.
Además, se entiende que la mencion de cualquier miembro de cualquiera de los siguientes grupos comprende la sustitución por cualquier otro miembro del grupo, como sigue: polipéptidos de cadena ligera Ab2 (SEQ ID NOs: 21 y 667); polinucleótidos de cadena ligera Ab2 (SEQ ID NOs: 29 y 669); polipéptidos de cadena pesada Ab2 (SEQ iD NOs: 22 y 668 ); polinucleótidos de cadena pesada Ab2 (SEQ ID NOs: 30 y 670); polipéptidos de cadena ligera Ab3 (SEQ ID No s : 37 y 671); polinucleótidos de cadena ligera Ab3 (SEQ ID NOs: 45 y 673); polipéptidos de cadena pesada Ab3 (SEQ ID NOs: 38 y 672); polinucleótidos de cadena pesada Ab3 (SEQ ID NOs: 46 y 674); polipéptidos de cadena ligera Ab4 (SEQ ID n Os: 53 y 675); polinucleótidos de cadena ligera Ab4 (SEQ ID n Os: 61 y 677); polipéptidos de cadena pesada Ab4 (SEQ iD NOs: 54 y 676); polinucleótidos de cadena pesada Ab4 (SEQ ID NOs: 62 y 678); polipéptidos de cadena ligera Ab5 (SEQ ID NO: 69 y 679); polinucleótidos de cadena ligera Ab5 (SEQ ID NOs: 77 y 681); polipéptidos de cadena pesada Ab5 (SEQ ID NOs: 70 y 680); polinucleótidos de cadena pesada Ab5 (SEQ ID NOs: 78 y 682); polipéptidos de cadena ligera Ab6 (SEQ ID NOs: 85 y 683); polinucleótidos de cadena ligera Ab6 (SEQ ID NOs: 93 y 685); polipéptidos de cadena pesada Ab6 (SEQ iD NOs: 86 y 684); polinucleótidos de cadena pesada Ab6 (SEQ ID No s : 94 y 68 6 ); polipéptidos de cadena ligera Ab7 (SEQ ID NOs: 101, 119, 687, 693); polinucleótidos de cadena ligera Ab7 (Se Q iD Nos: 109 y 689); polipéptidos de cadena pesada Ab7 (SEQ ID NOs: 102, 117, 118, 6 88 , 691 y 692); polinucleótidos de cadena pesada Ab7 (SEQ ID NOs: 110 y 690); polinucleótidos de CDR1 de cadena ligera de Ab1 (SEQ ID NOs: 12 y 694); polinucleótidos de CDR3 de cadena ligera de Ab1 (SEQ ID NOs: 14 y 695); polinucleótidos de CDR2 de cadena pesada de Ab1 (SEQ ID NOs: 16 y 696) y polinucleótidos de CDR3 de cadena pesada de Ab1 (SEQ ID NOs: 17 y 697). Los ejemplos de secuencias de polinucleótidos que codifican Ab1 incluyen, pero sin limitarse a, las SEQ ID NOs: 662, 663, 698, 700, 701, 703, 705, 707, 720, 721, 722, 723, 724 y 725.
Actividad anti-il-6
Como se indicó anteriormente, IL- 6 es un miembro de una familia de citocinas que promueven respuestas celulares a través de un complejo receptor que consta de al menos una subunidad de la glicoproteína transductora de señales gp130 y el receptor de IL- 6 (IL-6 R). La IL-6 R también puede estar presente en forma soluble (sIL-6 R). IL- 6 se une a IL-6 R, que luego dimeriza el receptor transductor de señales gp130.
Se cree que los anticuerpos anti-IL- 6 para uso de acuerdo con la invención, o los fragmentos de unión a IL- 6 o variantes de los mismos, son útiles al exhibir actividad anti-IL-6. En una realización no limitante de la invención, los anticuerpos anti-IL- 6 para su uso de acuerdo con la invención, o los fragmentos de unión a IL- 6 o variantes de los mismos, exhiben actividad anti-IL- 6 al unirse a IL- 6 que puede ser IL- 6 soluble o IL- 6 expresada en la superficie celular y/o puede prevenir o inhibir la unión de IL- 6 a IL-6 R y/o la activación (dimerización) de la glicoproteína transductora de señal gp130 y la formación de los multímeros IL-6/IL-6R/gp130 y los efectos biológicos de cualquiera de los anteriores. Los anticuerpos anti-IL- 6 objetivo pueden poseer diferentes actividades antagónicas basadas en que (es decir, epítopo) el anticuerpo particular se une a IL- 6 y/o cómo afecta a la formación de los complejos y/o multímeros de IL- 6 anteriores y los efectos biológicos de los mismos. En consecuencia, diferentes anticuerpos anti-IL- 6 para su uso de acuerdo con la invención, por ejemplo, pueden ser más adecuados para prevenir o tratar afecciones que implican la formación y acumulación de IL- 6 sustancialmente soluble, como la artritis reumatoide, mientras que otros anticuerpos pueden verse favorecidos en tratamientos en los que la prevención de IL-6/IL-6R/gp130 o multímeros IL-6/IL-6R/gp130 es un resultado terapéutico deseado. Esto se puede determinar en ensayos de unión y otros.
La actividad anti-IL- 6 del anticuerpo anti-IL- 6 para su uso de acuerdo con la presente invención, y los fragmentos y variantes del mismo que tienen especificidad de unión a IL-6 , también se pueden describir por su fuerza de unión o su afinidad por IL-6. Esto también puede afectar sus propiedades terapéuticas. En una realización de la invención, los anticuerpos anti-IL- 6 y sus fragmentos que tienen especificidad de unión a IL-6 , se unen a IL- 6 con una constante de disociación (Kd) menor o igual a 5 x 10'7, 10'7, 5 x 10'8, 10'8, 5 x 10'9, 10'9, 5 x 10'1°, 10'1°, 5 x 10'11, 10'11, 5 x 10'12, 10­ 12, 5 x 10-13, 10-13, 5 x 10-14, 10-14, 5 x 10-15 o 10-15. Preferiblemente, los anticuerpos anti-IL- 6 y los fragmentos y variantes de los mismos se unen a IL- 6 con una constante de disociación menor o igual a 5 x 10-10.
En otra realización de la invención, la actividad anti-IL- 6 de los anticuerpos anti-IL- 6 y los fragmentos y variantes de los mismos que tienen especificidad de unión a IL-6 , se unen a IL- 6 con una velocidad de disociación menor que o igual a 10-4 S-1, 5 x 10-5 S-1, 10-5 S-1, 5 x 10-6 S-1, 10-6 S-1, 5 x 10-7 S-1 o 10-7 S-1. En una realización de la invención, los anticuerpos anti-IL- 6 y los fragmentos y variantes de los mismos que tienen especificidad de unión a IL-6 , se unen a un epítopo de IL- 6 lineal o conformacional.
En una realización adicional de la invención, la actividad anti-IL- 6 de los anticuerpos anti-IL- 6 y fragmentos y variantes de los mismos que tienen especificidad de unión a IL-6 , exhiben actividad anti-IL- 6 mejorando o reduciendo los síntomas de, o alternativamente tratando o previniendo enfermedades y trastornos asociados con IL-6. Más adelante se exponen ejemplos no limitantes de enfermedades y trastornos asociados con IL-6. En otra realización de la invención, los anticuerpos anti-IL- 6 descritos en este documento, o los fragmentos de unión a IL- 6 y variantes de los mismos, no tienen especificidad de unión para IL-6 R o la glicoproteína transductora de señales gp-130.
Ensayos de cribado
También se describen en el presente documento ensayos de cribado diseñados para ayudar en la identificación de enfermedades y trastornos asociados con IL- 6 en pacientes que presentan síntomas de una enfermedad o trastorno asociado con iL-6 , especialmente mucositis.
Los anticuerpos anti-IL- 6 o los fragmentos de unión a IL- 6 o variantes de los mismos se utilizan para detectar la presencia de IL- 6 en una muestra biológica obtenida de un paciente que presenta síntomas de una enfermedad o trastorno asociado con IL-6. La presencia de IL-6 , o niveles elevados de la misma en comparación con los niveles de IL- 6 previos a la enfermedad en una muestra biológica comparable, puede ser beneficiosa para diagnosticar una enfermedad o trastorno asociado con IL-6.
También se describe un ensayo de diagnóstico o cribado para ayudar en el diagnóstico de enfermedades o trastornos asociados con IL- 6 en pacientes que presentan síntomas de una enfermedad o trastorno asociado con IL- 6 identificado en el presente documento, que comprende analizar el nivel de expresión de IL- 6 en una muestra biológica de dicho paciente usando un anticuerpo anti-IL- 6 modificado postraduccionalmente o un fragmento de unión o variante del mismo. El anticuerpo anti-IL- 6 o el fragmento de unión o variante del mismo puede modificarse post-traduccionalmente para incluir una fracción detectable tal como se establece previamente en la divulgación.
El nivel de IL- 6 en la muestra biológica se determina usando un anticuerpo anti-IL- 6 modificado o un fragmento de unión o una variante del mismo como se expone en este documento, y comparando el nivel de IL- 6 en la muestra biológica con un nivel estándar de IL- 6 (por ejemplo, el nivel en muestras biológicas normales). El médico experto entendería que puede existir cierta variabilidad entre las muestras biológicas normales y lo tomaría en cuenta al evaluar los resultados.
El ensayo mencionado anteriormente también puede ser útil para controlar una enfermedad o trastorno, en el que el nivel de IL- 6 obtenido en una muestra biológica de un paciente que se cree que tiene una enfermedad o trastorno asociado a IL- 6 se compara con el nivel de IL-6 en muestras biológicas previas del mismo paciente, con el fin de comprobar si el nivel de IL- 6 en dicho paciente ha cambiado con, por ejemplo, un régimen de tratamiento. Un médico experto entendería que una muestra biológica incluye, pero no se limita a, suero, plasma, orina, saliva, mucosidad, líquido pleural, líquido sinovial y líquido cefalorraquídeo.
Los antagonistas de IL- 6 descritos en el presente documento, incluidos los anticuerpos anti-IL- 6 (por ejemplo, anticuerpo Ab1) pueden usarse en procedimientos para estudiar la mucositis. Por ejemplo, los antagonistas de IL-6 descritos en el presente documento, incluidos los anticuerpos anti-IL- 6 (por ejemplo, anticuerpo Ab1), se pueden comparar con otros agentes terapéuticos, tanto conocidos como experimentales, para probar la eficacia en el tratamiento de la mucositis. Véase Bowen, et al. (2011) J Support Oncol. 9 (5): 161-8.
Proteínas de fusión
También se describen aquí proteínas de fusión que comprenden antagonistas de IL-6. Las fusiones que comprenden los polipéptidos de anticuerpos anti-IL- 6 también están dentro del alcance de la presente divulgación. Por ejemplo, la proteína de fusión se puede unir a una proteína de fusión GST en la que las secuencias polipeptídicas de anticuerpos anti-IL- 6 se fusionan con el extremo terminal C de las secuencias g St . Tales proteínas de fusión pueden facilitar la purificación de los polipéptidos de anticuerpos anti-IL-6 recombinantes. Alternativamente, los polipéptidos de anticuerpos anti-IL- 6 pueden fusionarse con una proteína que se une a los folículos de células B, iniciando así tanto una respuesta inmune humoral como la activación de las células T. Berney et al., (1999) J. Exp. Med. 190: 851-60. Alternativamente, por ejemplo, los polipéptidos de anticuerpos anti-IL- 6 pueden acoplarse genéticamente con un anticuerpo anti-células dendríticas para administrar el antígeno al sistema inmunológico y estimular una respuesta inmunitaria celular. He, et al. (2004) Clin. Cancer Res. 10: 1920-27. Se puede producir una proteína quimérica o de fusión de la invención mediante técnicas estándar de ADN recombinante. Por ejemplo, los fragmentos de ADN que codifican las diferentes secuencias de polipéptidos se ligan juntos en marco de acuerdo con técnicas convencionales, por ejemplo, empleando extremos romos o terminales escalonados para la ligadura, digestión con enzimas de restricción para proporcionar los terminales apropiados, relleno de extremos cohesivos según corresponda, tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar uniones indeseables y ligadura enzimática. El gen de fusión puede sintetizarse mediante técnicas convencionales que incluyen sintetizadores de ADN automatizados.
Las proteínas de fusión pueden incluir secuencias de translocación del terminal C o del terminal N. Además, las proteínas de fusión pueden comprender elementos adicionales, por ejemplo, para la detección, purificación u otras aplicaciones de proteínas. Dominios que facilitan la detección y purificación incluyen, pero sin limitarse a péptidos quelantes de metales tales como tractos de polihistidina, módulos de histidina-triptófano u otros dominios que permiten la purificación en metales inmovilizados; proteína de unión a maltosa; dominios de proteína A que permiten la purificación sobre inmunoglobulina inmovilizada; o el dominio utilizado en el sistema de purificación por afinidad/extensión FLAG (Immunex Corp, Seattle WA).
Se puede preparar una proteína de fusión a partir de una proteína de la divulgación mediante fusión con una porción de una inmunoglobulina que comprende una región constante de una inmunoglobulina. Más preferiblemente, la porción de la inmunoglobulina comprende una región constante de cadena pesada que es opcional y más preferiblemente una región constante de cadena pesada humana. La región constante de la cadena pesada es lo más preferiblemente una región constante de la cadena pesada de IgG, y opcionalmente y lo más preferiblemente es una cadena Fc, lo más preferiblemente un fragmento Fc de IgG que comprende los dominios CH2 y CH3. Aunque se puede utilizar opcionalmente cualquier subtipo de IgG, se prefiere el subtipo IgG1. La cadena Fc puede ser opcionalmente una cadena Fc conocida o de "tipo silvestre", o alternativamente puede estar mutada. Véase, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos No. 2006/0034852. El término "cadena Fc" también comprende opcionalmente cualquier tipo de fragmento Fc. Se han identificado varios de los residuos de aminoácidos específicos que están implicados en la actividad mediada por la región constante del anticuerpo en la subclase de IgG. Por lo tanto, la inclusión, sustitución o exclusión de estos aminoácidos específicos permite la inclusión o exclusión de la actividad mediada por la región constante de inmunoglobulina específica. Además, los cambios específicos pueden resultar en aglicosilación, por ejemplo, y/u otros cambios deseados en la cadena Fc. Opcionalmente, se pueden realizar al menos algunos cambios para bloquear una función de Fc que se considera indeseable, tal como un efecto indeseable del sistema inmunológico. Véase McCafferty, et al. (2002) Antibody Enginering: A Practical Approach (Eds.) Oxford University Press.
La inclusión de secuencias enlazadoras escindibles tales como el Factor Xa (véase, por ejemplo, Ottavi, (1998) Biochimie 80: 289-93), motivo de reconocimiento de proteasa de subtilisina (véase, por ejemplo, Polyak (1997) Protein Eng. 10: 615-19); enteroquinasa (Invitrogen, San Diego, CA.), entre el dominio de translocación (para una expresión eficaz de la membrana plasmática) y el resto del polipéptido recién traducido puede ser útil para facilitar la purificación. Por ejemplo, un constructo puede incluir un polipéptido que codifica una secuencia de ácido nucleico unida a seis residuos de histidina seguido de una tiorredoxina, un sitio de escisión de enteroquinasa (véase, por ejemplo, Williams (1995) Biochemistry 34: 1787-97), y un dominio de translocación del terminal C. Los residuos de histidina facilitan la detección y purificación, mientras que el sitio de escisión de la enteroquinasa proporciona un medio para purificar la proteína o las proteínas deseadas del resto de la proteína de fusión. La tecnología perteneciente a vectores que codifican proteínas de fusión y la aplicación de proteínas de fusión están bien descritas en la técnica. Véase, por ejemplo, Kroll (1993) DNA Cell. Biol. 12: 441-53.
Conjugados
Los antagonistas de IL- 6 pueden conjugarse con otras fracciones (por ejemplo, conjugados). Además, los anticuerpos anti-IL-6 , los anticuerpos que se unen a los anticuerpos anti-IL- 6 y sus fragmentos, pueden conjugarse con otras fracciones. Estos conjugados se utilizan a menudo en la preparación de vacunas. El polipéptido de anticuerpos anti-IL- 6 puede conjugarse con un carbohidrato (por ejemplo, manosa, fucosa, glucosa, GlcNA, maltosa), que es reconocido por el receptor de manosa presente en las células dendríticas y macrófagos. Las funciones de endocitosis y fagocitosis mediadas por receptor, de unión y agregación resultantes proporcionan una inmunidad innata y adaptativa mejorada. Véase Mahnke, et al. (2000) J. Cell Biol. 151: 673-84; Dong et al., (1999) J. Immonol. 163: 5427-34. Otras fracciones adecuadas para la conjugación para provocar una respuesta inmune incluyen, pero sin limitarse a, hemocianina de lapa californiana (KLH), toxoide diftérico, toxoide del cólera, exoproteína A de Pseudomonas y proteínas de la membrana externa microbiana (OMPS).
Etiquetas
Como se indicó anteriormente, los anticuerpos y fragmentos y variantes de los mismos pueden modificarse posttraduccionalmente para agregar fracciones efectoras tales como enlazadores químicos, fracciones detectables tales como, por ejemplo, colorantes fluorescentes, enzimas, sustratos, materiales bioluminiscentes, materiales radiactivos y fracciones quimioluminiscentes o fracciones funcionales tales como, por ejemplo, estreptavidina, avidina, biotina, una citotoxina, un agente citotóxico y materiales radiactivos.
Los anticuerpos anti-IL- 6 y sus fragmentos de anticuerpo descritos en el presente documento pueden modificarse postraduccionalmente para añadir fracciones efectores tales como enlazadores químicos, fracciones detectables tales como, por ejemplo, colorantes fluorescentes, enzimas, sustratos, materiales bioluminiscentes, materiales radiactivos, fracciones quimioluminiscentes, un agente citotóxico, materiales radiactivos o fracciones funcionales.
Se puede acoplar una amplia variedad de entidades, por ejemplo, ligandos, a los oligonucleótidos como se conoce en la técnica. Los ligandos pueden incluir moléculas de origen natural o moléculas recombinantes o sintéticas. Los ejemplos de ligandos incluyen, pero sin limitarse a, avidina, biotina, péptidos, peptidomiméticos, polilisina (PLL), polietilenglicol (PEG), mPEG, grupos catiónicos, espermina, espermidina, poliamina, tirotropina, melanotropina, lectina, glicoproteína, proteína A tensioactiva, mucina, poliaminoácidos glicosilados, transferrina, aptámero, inmunoglobulinas (por ejemplo, anticuerpos), insulina, transferrina, albúmina, azúcar, moléculas lipofílicas (por ejemplo, esteroides, ácidos biliares, colesterol, ácido cólico y ácidos grasos), vitamina A, vitamina E, vitamina K, vitamina B, ácido fólico, B12, riboflavina, biotina, piridoxal, cofactores de vitamina, lipopolisacárido, hormonas y receptores de hormonas, lectinas, carbohidratos, carbohidratos multivalentes, marcadores radiomarcados, colorantes fluorescentes y derivados de los mismos. Véase, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos Nos. 6.153.737; 6.172.208; 6.300.319; 6.335.434; 6.335.437; 6.395.437; 6.444.806; 6.486.308; 6.525.031; 6.528.631 y 6.559.279.
Además, se pueden añadir fracciones al antígeno o epítopo para aumentar la semivida in vivo (por ejemplo, alargando el tiempo de eliminación del torrente sanguíneo. Tales técnicas incluyen, por ejemplo, la adición de fracciones de PEG (también denominada pegilación), y son bien conocidos en la técnica. Véase la publicación de solicitud de Patente de Estados Unidos No. 2003/0031671.
Un anticuerpo anti-IL-6 o un fragmento de unión a antígeno del mismo, descrito en el presente documento, puede "unirse" a un sustrato cuando está asociado con el marcador sólido a través de una interacción química o física no aleatoria. La unión puede ser a través de un enlace covalente. Sin embargo, las uniones no necesitan ser covalentes o permanentes. Los materiales se pueden unir a una etiqueta a través de una "molécula espadadora" o "grupo enlazador". Tales moléculas espaciadoras son moléculas que tienen una primera porción que se adhiere al material biológico y una segunda porción que se adhiere a la etiqueta. Así, cuando se une a la etiqueta, la molécula espaciadora separa la etiqueta y los materiales biológicos, pero se une a ambos. Los procedimientos para unir material biológico (por ejemplo, una etiqueta) a una etiqueta son bien conocidos en la técnica e incluyen, pero sin limitarse a, el acoplamiento químico.
Etiquetas detectables
El anticuerpo anti-IL- 6 o los fragmentos de anticuerpo descritos en el presente documento se pueden modificar postraduccionalmente para agregar etiquetas efectoras tales como enlazadores químicos, etiquetas detectables tales como, por ejemplo, colorantes fluorescentes, enzimas, sustratos, materiales bioluminiscentes, materiales radiactivos y marcadores quimioluminiscentes o marcadores funcionales tales como, por ejemplo, estreptavidina, avidina, biotina, una citotoxina, un agente citotóxico y materiales radiactivos. Otros ejemplos de enzimas incluyen, pero sin limitarse a, peroxidasa de rábano picante, acetilcolinesterasa, fosfatasa alcalina, p-galactosidasa y luciferasa. Otros ejemplos de materiales fluorescentes incluyen, pero sin limitarse a, rodamina, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, umbeliferona, diclorotriazinilamina, ficoeritrina y cloruro de dansilo. Otros ejemplos de marcadores quimioluminiscentes incluyen, pero sin limitarse a, luminol. Otros ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen, pero sin limitarse a, luciferina y aequorina. Otros ejemplos materiales radiactivos incluyen, pero sin limitarse a, bismuto213 (213Bs), carbono 14 (14C), carbono 11 (11C), cloro 18 (18Cl ), cromo 51 (51Cr), cobalto 57 (57Co), cobalto60 (60Co), cobre 64 (64Cu), cobre 67 (67Cu ), disprosio 165 (165Dy), erbio 169 (169Er), flúor 18 (18F), galio 67 (67Ga), galio 68 (68Ga ), germanio 68 (68Ge), holmio 166 (166Ho), indio 111 (111In), yodo 125 (125I), yodo 123 (123I ), yodo 124 (124I), yodo 131 (131I), iridio 192 (192Ir), hierro 59 (59Fe), criptón 81 (81Kr ), plomo 212 (212Pb), lutecio 177 (177Lu), molibdeno 99 (99Mo), nitrógeno 13 (13N), oxígeno 15 (15O), paladio 103 (103Pd), fósforo 32 (32P), potasio 42 (42K), renio186 (186Re), renio 188 (188Re), rubidio 81 (81Rb), rubidio 82 (82Rb), samario 153 (153Sm), selenio 75 (75Se), sodio 24 (24Na), estroncio 82 (82Sr), estroncio 89 (89Sr), azufre 35 (35S), tecnecio 99m (99Tc), talio 2 O1 (201Tl), tritio (3H), xenón 133 (133Xe), iterbio 169 (169Yb), iterbio 177 (177Yb) e itrio 90 (90Y).
Agentes citotóxicos
Los anticuerpos anti-IL- 6 y los fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento se pueden conjugar con agentes citotóxicos que incluyen, pero sin limitarse a, metotrexato, aminopterina, 6 -mercaptopurina, 6 -tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil dacarbazina; agentes alquilantes como mecloretamina, tioepa clorambucilo, melfalán, carmustina (BSNU), mitomicina C, lomustina (CCNU), 1-metilnitrosourea, ciclofosfamida, mecloretamina, busulfano, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C, cis-diciclodiamina platino (II) (DDP) cisplatino y carboplatino (paraplatino); las antraciclinas incluyen daunorrubicina (anteriormente daunomicina), doxorrubicina (adriamicina), detorrubicina, carminomicina, idarrubicina, epirrubicina, mitoxantrona y bisantreno; los antibióticos incluyen dactinomicina (actinomicina D), bleomicina, caliqueamicina, mitramicina y antramicina (AMC); y agentes antimitóticos tales como los alcaloides de la vinca, vincristina y vinblastina. Otros agentes citotóxicos incluyen paclitaxel (TAXOL®), ricina, exotoxina de pseudomonas, gemcitabina, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, etopósido, tenopósido, colchicina, dihidroxi antracindiona, 1 -deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, puromicina, procarbazina, hidroxiurea, asparaginasa, corticosteroides, mitotano (O,P'-(DDD)), interferones y mezclas de estos agentes citotóxicos.
Otros agentes citotóxicos incluyen, pero sin limitarse a, agentes quimioterapéuticos tales como carboplatino, cisplatino, paclitaxel, gemcitabina, caliqueamicina, doxorrubicina, 5-fluorouracilo, mitomicina C, actinomicina D, ciclofosfamida, vincristina, bleomicina, antagonistas de VEGF, antagonistas de EGFR, platinos, taxoles, irinotecano, 5-fluorouracilo, gemcitabina, leucovorina, esteroides, ciclofosfamida, melfalán, alcaloides de la vinca (por ejemplo, vinblastina, vincristina, vindesina y vinorelbina), mustinas, inhibidores de tirosina quinasa, radioterapia, antagonistas de las hormonas sexuales, moduladores selectivos del receptor de andrógenos, moduladores selectivos del receptor de estrógeno, antagonistas de PDGF, antagonistas de TNF, antagonistas de IL-1, interleucinas (por ejemplo, IL-12 o IL-2), antagonistas de IL-12R, Erbitux®, Avastin®, Pertuzumab, anticuerpos anti-CD20, Rituxan®, ocrelizumab, ofatumumab, DXL625, Herceptin® o cualquier combinación de los mismos. Las enzimas tóxicas de plantas y bacterias tales como ricina, toxina de la diftérica y toxina de Pseudomonas se pueden conjugar con los anticuerpos humanizados, o fragmentos de unión de los mismos, para generar reactivos de destrucción específicos de tipo celular. Youle et al., (1980) Proc. Nat'l Acad. Sci. EE. UU., 77: 5483; Gilliland et al., (1980) Proc. Nat'l Acad. Sci. EE. UU., 77: 4539; Krolick et al., (1980) Proc. Nat'l Acad. Sci. EE. UU., 77: 5419. Otros agentes citotóxicos incluyen ribonucleasas citotóxicas. Véase la Patente de los Estados Unidos No. 6.653.104.
Los anticuerpos anti-IL- 6 y los fragmentos de anticuerpo descritos en el presente documento pueden conjugarse con un radionúclido que emite partículas alfa o beta (por ejemplo, radioinmunoconjugados). Dichos isótopos radiactivos incluyen, pero sin limitarse a, emisores beta tales como fósforo 32 (32P), escandio 47 (47Sc), cobre 67 (67Cu), galio 67 (67Ga), itrio 88 (88Y), itrio 90 (90Y), yodo 125 (125I), yodo 131 (131I), samario 153 (153Sm), lutecio 177 (177Lu), renio 186 (186Re), renio 188 (188Re) y emisores alfa tales como astato 211 (211At), plomo 212 (212Pb), bismuto 212 (212Bi), bismuto 213 (213Bi) o actinio 225 (225Ac).
Se conocen en la técnica procedimientos para conjugar un anticuerpo anti-IL- 6 descrito en el presente documento con un marcador, tales como los procedimientos descritos por Hunter, et al. (1962) Nature 144: 945; David et al. (1974) Biochemistry 13: 1014; Pain, et al. (1981) J. Immunol. Meth. 40: 219; y Nygren (1982) Histochem and Cytochem 30: 407.
Sustratos
Los anticuerpos anti-IL- 6 y los fragmentos de anticuerpo de los mismos descritos en este documento pueden unirse a un sustrato. Varios sustratos (por ejemplo, soportes sólidos) conocidos en la técnica son adecuados para su uso con el anticuerpo anti-IL- 6 descrito en el presente documento. El sustrato puede modificarse para contener canales u otras configuraciones. Véase Fung (2004) [Ed.] Protein Arrays: Methods and Protocols Humana Press and Kambhampati (2004) [Ed.] Protein Microarray Technology John Wiley & Sons.
Los materiales de sustrato incluyen, pero sin limitarse a, acrílicos, agarosa, vidrio de borosilicato, carbono (por ejemplo, láminas o gránulos de nanofibras de carbono), acetato de celulosa, celulosa, cerámicas, geles, vidrio (por ejemplo, cal sodada inorgánica modificada, de poro controlado, modificado, o vidrio funcionalizado), látex, perlas magnéticas, membranas, metal, metaloides, nitrocelulosa, NYLON®, haces de fibra óptica, polímeros orgánicos, papel, plásticos, poliacriloilmorfolida, poli(4-metilbuteno), poli(tereftalato de etileno), poli(butirato de vinilo), poliacrilamida, polibutileno, policarbonato, polietileno, tereftalato de polietilenglicol, poliformaldehído, polimetacrilato, polimetilmetacrilato, polipropileno, polisacáridos, poliestireno, poliuretanos, acetato de polivinilo, cloruro de polivinilo, difluoruro de polivinilideno (PVDF), polivinilpirrolidinona, rayón, resinas, cauchos, materiales semiconductores, Sepharose®, sílice, silicio, copolímeros de estireno, TEFLON® y una variedad de otros polímeros.
Los sustratos no necesitan ser planos y pueden incluir cualquier tipo de forma, incluidas formas esféricas (por ejemplo, perlas) o formas cilíndricas (por ejemplo, fibras). Los materiales unidos a soportes sólidos se pueden unir a cualquier parte del soporte sólido (por ejemplo, se pueden unir a una parte interior de un material de soporte sólido poroso).
El cuerpo del sustrato puede tener la forma de un perla, caja, columna, cilindro, disco, placa (por ejemplo, placa de vidrio, placa PETRI), fibra, película, filtro, placa de microtitulación (por ejemplo, placa de microtitulación de 96 pocillos), varilla de varias hojas, red, granulo, placa, anillo, varilla, rollo, lámina, portaobjetos, laminilla, bandeja, tubo o vial. El sustrato puede ser un cuerpo discreto singular (por ejemplo, un solo tubo, una sola perla), cualquier número de una pluralidad de cuerpos de sustrato (por ejemplo, una rejilla de 10 tubos, varias perlas) o combinaciones de los mismos (por ejemplo, una bandeja comprende una pluralidad de placas de microtitulación, una columna llena de perlas, una placa de microtitulación llena de perlas).
Un anticuerpo anti-IL- 6 o un fragmento de anticuerpo del mismo se puede "unir" a un sustrato cuando se asocia con el sustrato sólido mediante una interacción química o física no aleatoria. La unión puede ser a través de un enlace covalente. Sin embargo, las uniones no necesitan ser covalentes o permanentes. Los materiales se pueden unir a un sustrato a través de una "molécula espadadora" o "grupo enlazador". Tales moléculas espaciadoras son moléculas que tienen una primera porción que se adhiere al material biológico y una segunda porción que se adhiere al sustrato. Por lo tanto, cuando se une al sustrato, la molécula espaciadora separa el sustrato y los materiales biológicos, pero se une a ambos. Los procedimientos para unir material biológico (por ejemplo, una etiqueta) a un sustrato son bien conocidos en la técnica e incluyen, pero sin limitarse a, el acoplamiento químico.
Se pueden usar placas, tales como placas de microtitulación, que soportan y contienen la fase sólida para reacciones de síntesis en fase sólida. Las placas de microtitulación pueden albergar perlas que se utilizan como fase sólida. Por "partícula" o "micropartícula" o "nanopartícula" o "perla" o "microperla" o "microesfera" se entiende en el presente documento materia microparticulada que tiene cualquiera de una variedad de formas o tamaños. La forma puede ser generalmente esférica pero no necesita ser esférica, siendo, por ejemplo, cilíndrica o poliédrica. Como apreciarán los expertos en la técnica, las partículas pueden comprender una amplia variedad de materiales dependiendo de su uso, que incluyen, pero no se limitan a, almidón entrecruzado, dextranos, celulosa, proteínas, polímeros orgánicos que incluyen polímeros de estireno como poliestireno y metilestireno, así como otros copolímeros de estireno, plásticos, vidrio, cerámica, polímeros acrílicos, materiales magnéticamente sensibles, coloides, toriasol, grafito de carbono, dióxido de titanio, nailon, látex y TEFLON®. Véase, por ejemplo, la "Microsphere Detection Guide" de Bangs Laboratories, Fishers, IN.
El anticuerpo anti-IL- 6 o el fragmento de anticuerpo se puede unir a cualquiera de las formas de sustratos descritos en este documento (por ejemplo, perla, caja, columna, cilindro, disco, placa (por ejemplo, placa de vidrio, placa de PETRI), fibra, película, filtro, placa de microtitulación (por ejemplo, placa de microtitulación de 96 pocillos), varilla de múltiples hojas, red, gránulo, placa, anillo, varilla, rollo, lámina, portaobjetos, varilla, bandeja, tubo o vial). En particular, las partículas o perlas pueden ser un componente de un material gelificante o pueden ser componentes separados tales como perlas de látex hechas de una variedad de plásticos sintéticos (por ejemplo, poliestireno). La etiqueta (por ejemplo, estreptavidina) se puede unir a un sustrato (por ejemplo, una perla).
Evaluación de los marcadores inflamatorios
Pueden medirse marcadores inflamatorios conocidos (por ejemplo, IL-6 ) para evaluar el riesgo de mucositis o la gravedad de la mucositis. Estos marcadores pueden medirse a partir de suero, líquido sinovial o biopsias de piel usando procedimientos conocidos en la técnica (por ejemplo, inmunoensayos).
Niveles de IL- 6 en suero
Los niveles de IL- 6 en suero pueden medirse como un marcador farmacodinámico que evalúa el efecto de neutralización de los niveles de IL-6. Los niveles de IL- 6 en suero pueden medirse usando un inmunoensayo (por ejemplo, ensayo ELISA). Una disminución de los niveles de IL- 6 en suero puede ser indicativa de una disminución de la inflamación.
Biomarcadores de inflamación en suero
Pueden medirse biomarcadores en suero para determinar la expresión de citocinas proinflamatorias y otros biomarcadores solubles que pueden correlacionarse con actividad de enfermedad (por ejemplo, mucositis oral, digestiva o del tracto gastrointestinal), actividad de la enfermedad que incluye pero no se limita a reactantes de fase aguda, citocinas proinflamatorias en suero (por ejemplo, IL-1, TNF-a, IFN-y, IL-l2p40, IL-17), quimiocinas (por ejemplo, RANTES, MIP-1a, MCP-1), metaloproteinasas de matriz (por ejemplo, MMP-2, MMP-3, MMP-9) y otros biomarcadores asociados con la inflamación y las vías autoinmunes que se conocen en la técnica. Los biomarcadores solubles del metabolismo de los huesos y cartílagos (por ejemplo, Osteocalcina y otros productos de degradación del colágeno) también pueden evaluarse mediante un inmunoensayo (por ejemplo, ELISA). Una disminución de un biomarcador de inflamación en suero puede ser indicativo de una disminución de la inflamación.
Inmunohistoquímica de biopsias de piel
Se pueden recolectar biopsias de piel para análisis de biomarcadores, incluido el análisis de matriz de genoma completo e inmunohistoquímica (IHC). El análisis inmunohistoquímico puede incluir la medición del grosor epidérmico, la frecuencia de poblaciones de células inflamatorias y residentes (por ejemplo, células T, macrófagos, queratinocitos) y otros marcadores inflamatorios relacionados con la ruta de la IL- 6 conocida en la técnica. Específicamente, los siguientes antígenos específicos pueden evaluarse por procedimiento IHC estándar usando las muestras fijadas con formalina: CD3, CD6 8 , queratina 16, FoxP3, IL-6 R y MMP-3. Una disminución de un biomarcador inflamatorio en una biopsia de piel puede ser indicativa de una disminución de la inflamación.
Administración
Los anticuerpos anti-IL- 6 descritos en el presente documento, o los fragmentos de unión a IL- 6 o variantes de los mismos, así como las combinaciones de dichos fragmentos o variantes de anticuerpos, pueden administrarse a un sujeto en una concentración de entre aproximadamente 0,1 y 20 mg/kg, tal como aproximadamente 0,4 mg/kg, aproximadamente 0,8 mg/kg, aproximadamente 1,6 mg/kg o aproximadamente 4 mg/kg, de peso corporal del sujeto receptor. Por ejemplo, las composiciones que comprenden los antagonistas de IL-6 descritos en este documento pueden comprender al menos aproximadamente 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160., 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490 o 500 mg. Por ejemplo, las composiciones que comprenden los anticuerpos anti-IL- 6 descritos en este documento pueden comprender al menos aproximadamente 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150., 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490 o 500 mg.
Por ejemplo, una composición para tratar la mucositis puede comprender 80, 160 o 320 mg de un anticuerpo anti-IL-6 (por ejemplo, Ab1). Una composición para tratar la mucositis oral puede comprender 80, 160 o 320 mg de un anticuerpo anti-IL- 6 (por ejemplo, Ab1). Una composición para tratar la mucositis asociada con la quimioterapia puede comprender 80, 160 o 320 mg de un anticuerpo anti-IL- 6 (por ejemplo, Ab1). Una composición para tratar la mucositis oral asociada con la quimioterapia puede comprender 80, 160 o 320 mg de un anticuerpo anti-IL- 6 (por ejemplo, Ab1). Una composición para tratar la mucositis asociada con la radioterapia puede comprender 80, 160 o 320 mg de un anticuerpo anti-IL- 6 (por ejemplo, Ab1). Una composición para el tratamiento de la mucositis oral asociada con radioterapia puede comprender 80, 160 o 320 mg de un anticuerpo anti-IL- 6 (por ejemplo, Ab1). Una composición para tratar la mucositis asociada con el cáncer puede comprender 80, 160 o 320 mg de un anticuerpo anti-IL- 6 (por ejemplo, Ab1). Una composición para tratar la mucositis oral asociada con el cáncer puede comprender 80, 160 o 320 mg de un anticuerpo anti-IL- 6 (por ejemplo, Ab1). Por ejemplo, las composiciones que comprenden los anticuerpos anti-IL-6 descritos en este documento pueden comprender al menos aproximadamente 0,5-10 mg/kg del anticuerpo anti-IL-6. Los anticuerpos anti-IL- 6 descritos en el presente documento, o los fragmentos de unión a IL- 6 o variantes de los mismos, así como las combinaciones de dichos fragmentos o variantes de anticuerpos, pueden administrarse a un sujeto a una concentración de aproximadamente 0,4 mg/kg de peso corporal del sujeto receptor. Los anticuerpos anti-IL- 6 descritos en este documento, o los fragmentos de unión a IL- 6 o variantes de los mismos, así como las combinaciones de dichos fragmentos o variantes de anticuerpos, pueden administrarse a un sujeto receptor con una frecuencia de una vez cada veintiséis semanas o menos, tal como una vez cada dieciséis semanas o menos, una vez cada ocho semanas o menos, o una vez cada cuatro semanas o menos. Los anticuerpos anti-IL- 6 descritos en este documento, o los fragmentos de unión a IL- 6 o variantes de los mismos, así como combinaciones de los mismos, pueden administrarse a un sujeto receptor con una frecuencia como máximo una vez por período de aproximadamente una semana, tal como como máximo una vez por período de aproximadamente dos semanas, tal como como máximo una vez por período de aproximadamente cuatro semanas, tal como como máximo una vez por período de aproximadamente ocho semanas, tal como máximo una vez por período de aproximadamente doce semanas, tal como como máximo una vez por período de aproximadamente dieciséis semanas, tal como máximo una vez por período de aproximadamente veinticuatro semanas.
Las composiciones descritas en este documento se pueden administrar en cualquiera de las siguientes vías: bucal, epicutánea, epidural, infusión, inhalación, intraarterial, intracardiaca, intracerebroventricular, intradérmica, intramuscular, intranasal, intraocular, intraperitoneal, intraespinal, intratecal, intravenosa, oral, parenteral, pulmonar, rectal a través de un enema o supositorio, subcutánea, subdérmica, sublingual, transdérmica y transmucosal. Las vías de administración preferidas son la inyección o infusión intravenosa. La administración puede ser local, cuando la composición se administra directamente, cerca de, en el sitio, cerca, en, alrededor o en las proximidades del sitio o sitios de la enfermedad, por ejemplo, local (articulación) o sistémica, en la que la composición se administra al paciente y atraviesa el cuerpo ampliamente, alcanzando así el sitio o sitios de la enfermedad. La administración local (por ejemplo, inyección subcutánea) se puede lograr mediante la administración a la célula, tejido, órgano y/o sistema de órganos, que abarca y/o está afectado por la enfermedad, y/o en la que los signos y/o síntomas de la enfermedad son activos o es probable que ocurran (por ejemplo, articulación inflamada). La administración puede ser tópica con efecto local, la composición se aplica directamente donde se desea su acción (por ejemplo, articulación). Además, la administración de una composición que comprende una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-IL- 6 seleccionado del grupo que consiste en Ab1-Ab36 o un fragmento de anticuerpo del mismo, puede ser subcutáneo.
Los compuestos se pueden administrar mediante una variedad de formas de dosificación conocidas en la técnica. Se contempla cualquier forma de dosificación biológicamente aceptable conocida por los expertos en la técnica y combinaciones de las mismas. Ejemplos de tales formas de dosificación incluyen, sin limitación, comprimidos masticables, comprimidos de disolución rápida, comprimidos efervescentes, polvos reconstituibles, elixires, líquidos, soluciones, suspensiones, emulsiones, comprimidos, comprimidos multicapa, comprimidos bicapa, cápsulas, cápsulas de gelatina blanda, cápsulas de gelatina dura, pastillas, grageas, grageas masticables, perlas, polvos, chicles, gránulos, partículas, micropartículas, gránulos dispersables, cápsulas lisas, duchas vaginales, supositorios, cremas, tópicos, inhaladores, inhaladores en aerosol, parches, inhaladores de partículas, implantes, implantes con depósito, ingeribles, inyectables (incluidos subcutáneos, intramusculares, intravenosos e intradérmicos), infusiones y combinaciones de los mismos.
Otros compuestos que se pueden incluir mediante mezcla son, por ejemplo, ingredientes médicamente inertes (por ejemplo, diluyente sólido y líquido), tales como lactosa, dextrosa-sacarosa, celulosa, almidón o fosfato de calcio para comprimidos o cápsulas, aceite de oliva o oleato de etilo para cápsulas blandas y agua o aceite vegetal para suspensiones o emulsiones; agentes lubricantes tales como sílice, talco, ácido esteárico, estearato de magnesio o calcio y/o polietilenglicoles; agentes gelificantes tales como arcillas coloidales; agentes espesantes tales como goma tragacanto o alginato de sodio, agentes aglutinantes tales como almidones, gomas arábigas, gelatina, metilcelulosa, carboximetilcelulosa o polivinilpirrolidona; agentes disgregantes tales como almidón, ácido algínico, alginatos o glicolato de almidón de sodio; mezclas efervescentes; colorante; edulcorantes; agentes humectantes tal como lecitina, polisorbatos o laurilsulfatos; y otros ingredientes accesorios terapéuticamente aceptables, tales como humectantes, conservantes, tampones y antioxidantes, que son aditivos conocidos para tales formulaciones.
Las dispersiones líquidas para administración oral pueden ser jarabes, emulsiones, soluciones o suspensiones. Los jarabes pueden contener como vehículo, por ejemplo, sacarosa o sacarosa con glicerol y/o manitol y/o sorbitol. Las suspensiones y las emulsiones pueden contener un vehículo, por ejemplo, una goma natural, agar, alginato de sodio, pectina, metilcelulosa, carboximetilcelulosa o alcohol polivinílico.
También se describen kits que incluyen al menos un recipiente que comprende unidades de dosificación farmacéuticas que comprenden una cantidad eficaz de al menos un anticuerpo y sus fragmentos de la presente invención. Los kits pueden incluir instrucciones, directrices, etiquetas, información de marketing, advertencias o folletos informativos.
Dosis
La cantidad de anticuerpos anti-IL- 6 en una composición terapéutica de acuerdo con cualquier realización de esta invención puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de la enfermedad, la edad, el sexo, el peso, los antecedentes del paciente, los factores de riesgo, la predisposición a la enfermedad, vía de administración, régimen de tratamiento preexistente (por ejemplo, posibles interacciones con otros medicamentos) y peso del individuo. Los regímenes de dosificación pueden ajustarse para proporcionar la respuesta terapéutica óptima. Por ejemplo, se puede administrar un solo bolo, se pueden administrar varias dosis divididas a lo largo del tiempo, o la dosis se puede reducir o aumentar proporcionalmente de acuerdo con lo indicado por las exigencias de la situación terapéutica.
Por ejemplo, para el tratamiento de la mucositis (por ejemplo, mucositis oral, alimentaria o del tracto gastrointestinal) una composición puede comprender al menos aproximadamente 80, 160 o 320 mg de antagonistas de IL- 6 que se pueden administrar a un paciente que requiera de la misma. En otra realización, para el tratamiento de la mucositis oral, una composición puede comprender al menos aproximadamente 80, 160 o 320 mg de antagonistas de IL- 6 que se pueden administrar a un paciente que lo necesite. Además, para el tratamiento de la mucositis, una composición puede comprender al menos aproximadamente 80, 160 o 320 mg de anticuerpo anti-IL- 6 (por ejemplo, Ab1) que se pueden administrar a un paciente que lo necesite. En otra realización, para el tratamiento de la mucositis oral, una composición puede comprender al menos aproximadamente 80, 160 o 320 mg de anticuerpo anti-IL- 6 (por ejemplo, Ab1) que puede administrarse a un paciente que lo necesite. La dosificación del antagonista de IL- 6 puede depender del modo de administración. Por ejemplo, para la administración subcutánea de una composición puede comprender un antagonista de IL-6 , la composición puede comprender al menos aproximadamente 1-500 mg/ml, 10-250 mg/ml, 10-100 mg/ml o 40-100 mg/ml de un antagonista de IL. Por ejemplo, una composición para administración subcutánea puede comprender al menos aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 mg/ml de un antagonista de IL-6. Por lo tanto, una composición para administración subcutánea puede comprender al menos aproximadamente al menos aproximadamente 1-500 mg/ml, 10-250 mg/ml, 10-100 mg/ml o 40-100 mg/ml de un anti-IL- 6 anticuerpo (por ejemplo, Ab1). o al menos aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 mg/ml de un anticuerpo anti-IL-6 (por ejemplo, Ab1). Para la administración intravenosa, una composición puede comprender un antagonista de IL-6 , la composición puede comprender al menos aproximadamente 1-500 mg/ml, 10-250 mg/ml, 10-100 mg/ml o 40-100 mg/ml de un antagonista de IL. Por ejemplo, una composición para administración intravenosa puede comprender al menos aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 mg/ml de un antagonista de IL-6. Por lo tanto, una composición para administración intravenosa puede comprender al menos aproximadamente al menos aproximadamente 1-500 mg/ml, 10-250 mg/ml, 10-100 mg/ml o 40-100 mg/ml de un anti-IL- 6 anticuerpo (por ejemplo, Ab1) o al menos aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 mg/ml de un anticuerpo anti-IL- 6 (por ejemplo, Ab1). La mucositis puede estar asociada con quimioterapia, radioterapia, cáncer o trasplantes de células madre hematopoyéticas. Por ejemplo, la mucositis oral puede estar asociada con quimioterapia, radioterapia, cáncer o trasplantes de células madre hematopoyéticas.
Por ejemplo, una composición para el tratamiento de la mucositis del tracto digestivo puede comprender al menos aproximadamente 80, 160 o 320 mg de antagonistas de IL- 6 que se pueden administrar a un paciente que lo necesite. Además, una composición para el tratamiento de la mucositis del tracto digestivo puede comprender al menos aproximadamente 80, 160 o 320 mg de anticuerpo anti-IL- 6 (por ejemplo, Ab1) que puede administrarse a un paciente que lo necesite. Por ejemplo, una composición para el tratamiento de la mucositis del tracto digestivo formulada para administración subcutánea puede comprender al menos aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 mg/ml de un antagonista de IL-6. Por lo tanto, una composición para el tratamiento de la mucositis del tracto digestivo formulada para administración subcutánea puede comprender al menos aproximadamente al menos aproximadamente 1-500 mg/ml, 10-250 mg/ml, 10-100 mg/ml o 40-100 mg/ml. de un anticuerpo anti-IL- 6 (por ejemplo, Ab1) o al menos alrededor de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 mg/ml de un anticuerpo anti-IL- 6 ( por ejemplo, Ab1). Una composición para el tratamiento de la mucositis del tracto digestivo formulada para administración intravenosa puede comprender al menos aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 mg/ml de un antagonista de IL-6. Por lo tanto, una composición para el tratamiento de la mucositis del tracto digestivo formulada para administración intravenosa puede comprender al menos aproximadamente al menos aproximadamente 1-500 mg/ml, 10-250 mg/ml, 10-100 mg/ml o 40-100 mg/ml de un anticuerpo anti-IL- 6 (por ejemplo, Ab1) o al menos alrededor de 10 , 20 , 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 mg/ml de un anticuerpo anti-IL- 6 ( por ejemplo, Ab1 ). La mucositis del tracto digestivo puede estar asociada con quimioterapia, radioterapia, cáncer o trasplantes de células madre hematopoyéticas.
Por ejemplo, una composición para el tratamiento de la mucositis del tracto gastrointestinal puede comprender al menos aproximadamente 80, 160 o 320 mg de antagonistas de IL- 6 que se pueden administrar a un paciente que lo necesite. Además, una composición para el tratamiento de la mucositis del tracto gastrointestinal puede comprender al menos aproximadamente 80, 160 o 320 mg de anticuerpo anti-IL- 6 (por ejemplo, Ab1) que se puede administrar a un paciente que lo necesite. Por ejemplo, una composición para el tratamiento de la mucositis del tracto gastrointestinal formulada para administración subcutánea puede comprender al menos aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 mg/ml de un antagonista de IL-6. Por tanto, una composición para el tratamiento de la mucositis del tracto gastrointestinal formulada para administración subcutánea puede comprender al menos aproximadamente al menos aproximadamente 1-500 mg/ml, 10-250 mg/ml, 10-100 mg/ml o 40-100 mg/ml de un anticuerpo anti-IL- 6 (por ejemplo Ab1). Una composición para el tratamiento de la mucositis del tracto gastrointestinal formulada para administración intravenosa puede comprender al menos aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 mg/ml de un antagonista de IL-6. Por tanto, una composición para el tratamiento de la mucositis del tracto gastrointestinal formulada para administración intravenosa puede comprender al menos aproximadamente al menos aproximadamente 1-500 mg/ml, 10-250 mg/ml, 10-100 mg/ml o 40-100 mg/ml de un anticuerpo anti-IL- 6 (por ejemplo, Ab1) o al menos aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 mg/ml de un anticuerpo anti-IL- 6 (por ejemplo, Ab1). La mucositis del tracto gastrointestinal puede estar asociada con quimioterapia, radioterapia, cáncer o trasplantes de células madre hematopoyéticas.
Además, una formulación intravenosa de un anticuerpo anti-IL- 6 Ab1 puede comprender al menos aproximadamente 10 mg/ml o 40 mg/l para el tratamiento de la artritis reumatoide y una formulación subcutánea de un anticuerpo anti-IL- 6 Ab1. puede comprender al menos aproximadamente 100 mg/ml para el tratamiento de la artritis reumatoide. Por ejemplo, una composición para el tratamiento de la artritis reumatoide formulada para administración subcutánea puede comprender al menos aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 mg/ml de un antagonista de IL-6. Por lo tanto, una composición para el tratamiento de la artritis reumatoide formulada para administración subcutánea puede comprender al menos aproximadamente al menos aproximadamente 1-500 mg/ml, 10-250 mg/ml, 10 - 100 mg/ml o 40-100 mg/ml de un anticuerpo anti-IL- 6 (por ejemplo, Ab1 ) o al menos aproximadamente 10 , 20 , 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 mg/ml de un anticuerpo anti-IL- 6 (por ejemplo, Ab1). Una composición para el tratamiento de la artritis reumatoide formulada para administración intravenosa puede comprender al menos aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 mg/ml de un antagonista de IL-6. Por lo tanto, una composición para el tratamiento de la artritis reumatoide formulada para administración intravenosa puede comprender al menos aproximadamente al menos aproximadamente 1-500 mg/ml, 10-250 mg/ml, 10-100 mg/ml o 40-100 mg/ml de un anticuerpo anti-IL- 6 (por ejemplo, Ab1) o al menos aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 mg/ml de un anticuerpo anti-IL- 6 (por ejemplo, Ab1). La artritis reumatoide puede estar asociada con quimioterapia, radioterapia, cáncer o trasplantes de células madre hematopoyéticas.
Por ejemplo, una composición para el tratamiento de la emesis puede comprender al menos aproximadamente 80, 160 o 320 mg de antagonistas de IL- 6 que se pueden administrar a un paciente que lo necesite. Además, una composición para el tratamiento de la emesis puede comprender al menos aproximadamente 80, 160 o 320 mg de anticuerpo anti-IL- 6 (por ejemplo, Ab1) que se pueden administrar a un paciente que lo necesite. Por ejemplo, una composición para el tratamiento de la emesis formulada para administración subcutánea puede comprender al menos aproximadamente 10 , 2 0 , 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 mg/ml de un antagonista de IL-6. Por lo tanto, una composición para el tratamiento de la emesis formulada para administración subcutánea puede comprender al menos aproximadamente al menos aproximadamente 1-500 mg/ml, 10-250 mg/ml, 10-100 mg/ml o 40-100 mg/ml de un anticuerpo anti-IL- 6 (por ejemplo, Ab1) o al menos aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 mg/ml de un anticuerpo anti-IL- 6 (por ejemplo, Ab1). Una composición para el tratamiento de la emesis formulada para administración intravenosa puede comprender al menos aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 mg/ml de un antagonista de IL-6. Por lo tanto, una composición para el tratamiento de la emesis formulada para administración intravenosa puede comprender al menos aproximadamente al menos aproximadamente 1-500 mg/ml, 10-250 mg/ml, 10-100 mg/ml o 40-100 mg/ml de un anticuerpo anti-IL- 6 (por ejemplo, Ab1) o al menos aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 mg/ml de un anticuerpo anti-IL- 6 (por ejemplo, Ab1). La emesis puede estar asociada con quimioterapia, radioterapia, cáncer o trasplantes de células madre hematopoyéticas.
Por ejemplo, una composición para el tratamiento de la diarrea puede comprender al menos aproximadamente 80, 160 o 320 mg de antagonistas de IL- 6 que se pueden administrar a un paciente que lo necesite. Además, una composición para el tratamiento de la emesis puede comprender al menos aproximadamente 80, 160 o 320 mg de anticuerpo anti-IL- 6 (por ejemplo, Ab1) que se pueden administrar a un paciente que lo necesite. Por ejemplo, una composición para el tratamiento de la diarrea formulada para administración subcutánea puede comprender al menos aproximadamente 10 , 2 0 , 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 mg/ml de un antagonista de IL-6. Por lo tanto, una composición para el tratamiento de la diarrea formulada para administración subcutánea puede comprender al menos aproximadamente al menos aproximadamente 1-500 mg/ml, 10-250 mg/ml, 10-100 mg/ml o 40-100 mg/ml de un anticuerpo anti-IL- 6 (por ejemplo, Ab1) o al menos aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 mg/ml de un anticuerpo anti-IL- 6 (por ejemplo, Ab1). Una composición para el tratamiento de la diarrea formulada para administración intravenosa puede comprender al menos aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 mg/ml de un antagonista de IL-6. Por lo tanto, una composición para el tratamiento de la diarrea formulada para administración intravenosa puede comprender al menos aproximadamente al menos aproximadamente 1-500 mg/ml, 10-250 mg/ml, 10-100 mg/ml o 40-100 mg/ml de un anticuerpo anti-IL- 6 (por ejemplo, Ab1) o al menos aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 mg/ml de un anticuerpo anti-IL- 6 (por ejemplo, Ab1). La diarrea puede estar asociada con quimioterapia, radioterapia, cáncer o trasplantes de células madre hematopoyéticas.
Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en forma de unidad de dosificación para facilitar la administración y uniformidad de la dosificación. La forma de unidad de dosificación, como se usa en este documento, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para los sujetos mamíferos a tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de anticuerpos, o fragmentos de anticuerpos de los mismos, calculados para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. La especificación de las formas unitarias de dosificación de la invención está dictada por y depende directamente de las características únicas de los anticuerpos y sus fragmentos, y el efecto terapéutico particular que se va a lograr, y las limitaciones inherentes en la técnica de la composición de dichos anticuerpos y fragmentos de los mismos, para el tratamiento de la sensibilidad en individuos. En uso terapéutico para el tratamiento de afecciones en mamíferos (por ejemplo, seres humanos) para las que los anticuerpos y fragmentos de los mismos de la presente invención o una composición farmacéutica apropiada de los mismos son efectivos, los anticuerpos y fragmentos de los mismos de la presente invención pueden administrarse en una cantidad efectiva. Las dosis adecuadas para esta invención pueden ser una composición, una composición farmacéutica o cualquier otra composición descrita en este documento.
La dosis se puede administrar como una dosis única, una dosis doble, una dosis triple, una dosis cuádruple y/o una dosis quíntuple. Las dosis se pueden administrar de forma única, simultánea y secuencial. Por ejemplo, se pueden administrar dos dosis el mismo día seguidas de dos dosis posteriores cuatro semanas después.
La forma de dosificación puede ser cualquier forma de liberación conocida por los expertos en la técnica. Las composiciones de la presente invención pueden formularse para proporcionar una liberación inmediata del ingrediente activo o una liberación sostenida o controlada del ingrediente activo. En una preparación de liberación sostenida o de liberación controlada, la liberación del ingrediente activo puede ocurrir a una velocidad tal que los niveles en sangre se mantengan dentro de un intervalo terapéutico pero por debajo de los niveles tóxicos durante un período de tiempo prolongado (por ejemplo, de 4 a 24 horas). Las formas de dosificación preferidas incluyen liberación inmediata, liberación prolongada, liberación por pulsos, liberación variable, liberación controlada, liberación programada, liberación sostenida, liberación retardada, acción prolongada y combinaciones de las mismas, y son conocidas en la técnica.
Se apreciará que la actividad farmacológica de las composiciones puede controlarse usando modelos farmacológicos estándar que se conocen en la técnica. Además, se apreciará que las composiciones que comprenden anticuerpos anti-IL- 6 o fragmentos de anticuerpos de los mismos pueden incorporarse o encapsularse en una matriz o membrana polimérica adecuada para la administración en un sitio específico, o pueden funcionalizarse con agentes dirigidos específicos capaces de efectuar un suministro específico del sitio. Estas técnicas, así como otras técnicas de administración de fármacos, son bien conocidas en la técnica. La determinación de las dosis óptimas para una situación particular está dentro de las capacidades de los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Grennaro (2005) [Ed.] Remington: The Science and Practice of Pharmacy [21a Ed.]
Los anticuerpos anti-IL- 6 descritos en este documento, o los fragmentos de unión a IL- 6 o variantes de los mismos, así como las combinaciones de dichos fragmentos o variantes de anticuerpos, pueden administrarse a un sujeto en una formulación farmacéutica.
Una "composición farmacéutica" se refiere a una composición química o biológica adecuada para la administración a un mamífero. Dichas composiciones pueden formularse específicamente para la administración a través de al menos una de varias vías, que incluyen pero sin limitarse a bucal, epicutánea, epidural, inhalación, intraarterial, intracardíaca, intracerebroventricular, intradérmica, intramuscular, intranasal, intraocular, intraperitoneal, intraespinal, intratecal, intravenosa, oral, parenteral, rectal a través de un enema o supositorio, subcutánea, subdérmica, sublingual, transdérmica y transmucosa. Además, la administración puede realizarse mediante inyección, polvo, líquido, gel, gotas u otros medios de administración. Además, una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-IL-6 descrito en este documento (por ejemplo, ALD518) se puede administrar por vía subcutánea.
Los anticuerpos anti-IL- 6 descritos en este documento, o los fragmentos de unión a IL- 6 o variantes de los mismos, así como las combinaciones de dichos fragmentos o variantes de anticuerpos, pueden administrarse opcionalmente en combinación con al menos un agente activo. Dichos agentes activos incluyen agentes analgésicos, antipiréticos, antiinflamatorios, antibióticos, antivirales y anticitocinas. Los agentes activos incluyen agonistas, antagonistas y moduladores de TNF-alfa, IL-2, IL-4, IL-6 , IL-10, IL-12, IL-13, IL-18, IFN-alfa, IFN-gamma, BAFF, CXCL13, IP-10, VEGF, EPO, EGF, HRG, factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), hepcidina, incluidos anticuerpos reactivos contra cualquiera de los anteriores y anticuerpos reactivos contra cualquiera de sus receptores. Los agentes activos también incluyen; Ácidos 2-arilpropiónicos, Aceclofenaco, Acemetacina, Ácido acetilsalicílico (aspirina), Alclofenaco, Alminoprofeno, Amoxiprina, Ampirona, Ácidos arilalcanoicos, Azapropazona, Benorilato, Benoxaprofeno, Bromfenaco, Carprofeno, Celecoxib, Salicilato de colina y magnesio, Clofezona, Inhibidores de COX-2, Dexibuprofeno, Dexketoprofeno, Diclofenaco, Diflunisal, Droxicam, Etenzamida, Etodolac, Etoricoxib, Faislamina, ácidos fenámicos, Fenbufeno, Fenoprofeno, Ácido flufenámico, Flunoxaprofeno, Flurbiprofeno, Ibuprofeno, Ibuproxam, Indometacina, Indoprofeno, Kebuzona, Ketoprofeno, Ketorolac, Lornoxicam, Loxoprofeno, Lumiracoxib, Salicilato de magnesio, Ácido meclofenámico, Ácido mefenámico, Meloxicam, Metamizol, Salicilato de metilo, Mofebutazona, Nabumetona, Naproxeno, Ácidos N-arilantranílicos, Oxametacina, Oxaprozina, Oxicams, Oxifenbutazona, Parecoxib, Fenazona, Fenilbutazona, Piroxicam, Pirprofeno, profenos, Proglumetacina, Derivados de pirazolidina, Rofecoxib, Salicilato de salicilo, Salicilamida, Salicilatos, Sulfinpirazona, Sulindac, Suprofeno, Tenoxicam, Ácido tiaprofénico, Ácido tolfenámico, Tolmetina y Valdecoxib. Los antibióticos incluyen Amikacina, Aminoglucósidos, Amoxicilina, Ampicilina, Ansamicinas, Arsfenamina, Azitromicina, Azlocilina, Aztreonam, Bacitracina, Carbacefem, Carbapenémicos, Carbenicilina, Cefaclor, Cefadrofaxil, Cefalexina, Cefalotina, Cefamandol Cefazolina, Cefdinir, Cefditoreno, Cefepime, Cefixime, Cefoperazona, Cefotaxima, Cefoxitina, Cefpodoxima, Cefprozil, Ceftazidima, Ceftibuteno, Ceftizoxima, Ceftobiprol, Ceftriaxona, Cefuroxima, Cefalosporinas, Cloranfenicol, Cilastatina, Ciprofloxacina, Claritromicina, Clindamicina, Cloxacilina, Colistina, Co-trimoxazol, Dalfopristina, Demeclociclina, Dicloxacilina, Diritromicina, Doripenem, Doxiciclina, Enoxacina, Ertapenem, Eritromicina, Etambutol, Flucloxacilina, Fosfomicina, Furazolidona, Ácido Fusídico, Gatifloxacina, Geldanamicina, Gentamicina, Glicopéptidos, Herbimicina, Imipenem, Isoniazida, Kanamicina, Levofloxacina, Lincomicina, Linezolida, Lomefloxacina, Loracarbef, Macrólidos, Mafenida, Meropenem, Meticilina, Metronidazol, Mezlocilina, Minociclina, Monobactamas, Moxifloxacina, Mupirocina, Nafcilina, Neomicina, Netilmicina, Nitrofurantoína, Norfloxacina, Ofloxacina, Oxacilina, Oxitetraciclina, Paromomicina, Penicilina, Penicilinas, Piperacilina, Platensimicina, Polimixina B, Polipéptidos, Prontosilo, Pirazinamida, Quinolonas, Quinupristina, Rifampicina, Rifampina, Roxitromicina, Espectinomicina, Estreptomicina, Sulfacetamida, Sulfametizol, Sulfanilimida, Sulfasalazina, Sulfisoxazol, Sulfonamidas, Teicoplanina, Telitromicina, Tetraciclina, Tetraciclinas, Ticarcilina, Tindazol, Tobramicina, Trimetoprim, Trimetoprim-Sulfametoxazol, Troleandomicina, Trovafloxacina, y Vancomicina. Los agentes activos también incluyen Aldosterona, Beclometasona, Betametasona, Corticosteroides, Cortisol, Acetato de cortisona, Acetato de Desoxicorticosterona, Dexametasona, Acetato de Fludrocortisona, Glucocorticoides, Hidrocortisona, Metilprednisolona, Prednisolona, Prednisona, Esteroides, y Triamcinolona. Los agentes antivirales incluyen, pero sin limitarse a, abacavir, aciclovir, adefovir, amantadina, amprenavir, una combinación de dosis fija de antirretrovirales, un potenciador sinérgico antirretroviral, arbidol, atazanavir, atripla, brivudina, cidofovir, combivir, darunavir, delavirdina, didanosina, docosanol, edoxudina, efavirenz, emtricitabina, enfuvirtida, entecavir, inhibidores de entrada, famciclovir, fomivirsen, fosamprenavir, foscarnet, fosfonet, inhibidor de fusión, ganciclovir, gardasil, ibacitabina, idoxurudina, imiquimod, imunovir, indinavir, inosina, inhibidor de integrasa, interferón, interferón tipo I, interferón tipo II, interferón tipo III, lamivudina, lopinavir, lovirida, maraviroc, MK-0518, moroxidina, nelfinavir, nevirapina, nexavir, análogos de nucleósidos, oseltamivir, penciclovir, peramivir, pleconaril, podofilotoxina, inhibidor de la transcriptasa, inhibidor de la transcriptasa inversa, ribavirina, rimantadina, ritonavir, saquinavir, estavudina, tenofovir, tenofovir disoproxil, tipranavir, trifluridina, trizivir, tromantadina, truvada, valaciclovir, valganciclovir, vicriviroc, vidarabina, viramidina, zalcitabina, zanamivir y zidovudina. También se contempla cualquier combinación adecuada de estos agentes activos.
Un "excipiente farmacéutico" o un "excipiente farmacéuticamente aceptable" es un vehículo, normalmente un líquido, en el que se formula un agente terapéutico activo. En una realización de la invención, el agente terapéutico activo es un anticuerpo humanizado descrito en este documento, o al menos uno de sus fragmentos o variantes. El excipiente generalmente no proporciona ninguna actividad farmacológica a la formulación, aunque puede proporcionar estabilidad química y/o biológica y características de liberación. Se pueden encontrar ejemplos de formulaciones, por ejemplo, en Grennaro (2005) [Ed.] Remington: The Science and Practice of Pharmacy [21a Ed.]
Como se usa en este documento, "vehículo farmacéuticamente aceptable" o "excipiente" incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción que son fisiológicamente compatibles. En una realización, el portador es adecuado para la administración parenteral. Alternativamente, el vehículo puede ser adecuado para administración intravenosa, intraperitoneal, intramuscular o sublingual. Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla su uso en las composiciones farmacéuticas de la invención. También se pueden incorporar compuestos activos complementarios a las composiciones.
Las composiciones farmacéuticas normalmente deben ser estériles y estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento. La invención contempla que la composición farmacéutica esté presente en forma liofilizada. La composición se puede formular como una solución, microemulsión, liposoma u otra estructura ordenada adecuada para una alta concentración de fármaco. El vehículo puede ser un medio disolvente o de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido) y mezclas adecuadas de los mismos. La invención contempla además la inclusión de un estabilizador en la composición farmacéutica.
Los anticuerpos y sus fragmentos, para su uso de acuerdo con la presente invención, pueden formularse en composiciones farmacéuticas de diversas formas de dosificación. Por ejemplo, el anticuerpo puede ser ALD518, un anticuerpo de inmunoglobulina 1 monoclonal (IgG1) anti-interleucina- 6 (anti-IL-6 ) humanizado fabricado en la levadura Pichia pastoris. ALD518 puede suministrarse como una inyección congelada de pH 6,0 en viales de un solo uso (80 mg o 160 mg) para administración intravenosa. Los ejemplos de excipientes no activos incluyen, pero sin limitarse a, histidina (por ejemplo, 25 mM) y sorbitol (por ejemplo, 250 mM). Por ejemplo, una formulación de 160 mg puede comprender como excipientes no activos, histidina 25 mM, sorbitol 250 mM y polisorbato 80 al 0,015%. Para preparar las composiciones farmacéuticas para su uso de acuerdo con la invención, al menos un anticuerpo anti-IL- 6 o fragmentos de unión del mismo, ya que el ingrediente activo puede mezclarse íntimamente con vehículos y aditivos apropiados de acuerdo con técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica de las formulaciones farmacéuticas. Véase Grennaro (2005) [Ed.] Remington: The Science and Practice of Pharmacy [21a Ed.] Por ejemplo, los anticuerpos descritos en el presente documento pueden formularse en solución salina tamponada con fosfato pH 7,2 y suministrarse como una solución líquida transparente incolora de 5,0 mg/ml.
De manera similar, las composiciones para preparaciones líquidas incluyen soluciones, emulsiones, dispersiones, suspensiones, jarabes y elixires, con vehículos y aditivos adecuados que incluyen pero sin limitarse a agua, alcoholes, aceites, glicoles, conservantes, agentes saborizantes, agentes colorantes y agentes de suspensión. Las preparaciones típicas para administración parenteral comprenden el ingrediente activo con un vehículo tal como agua estéril o aceite parenteralmente aceptable que incluye, pero sin limitarse a polietilenglicol, polivinilpirrolidona, lecitina, aceite de cacahuete o aceite de sésamo, con otros aditivos para ayudar a la solubilidad o conservación, también se pueden incluir. En el caso de una solución, se puede liofilizar hasta obtener un polvo y luego reconstituir inmediatamente antes de su uso. Para las dispersiones y suspensiones, los vehículos y aditivos apropiados incluyen gomas acuosas, celulosas, silicatos o aceites.
Los anticuerpos anti-IL- 6 o sus fragmentos de unión pueden administrarse mediante una variedad de formas de dosificación. Se contempla cualquier forma de dosificación biológicamente aceptable conocida por los expertos en la técnica y combinaciones de las mismas. Ejemplos de tales formas de dosificación incluyen, sin limitación, polvos reconstituibles, elixires, líquidos, soluciones, suspensiones, emulsiones, polvos, gránulos, partículas, micropartículas, gránulos dispersables, cápsulas lisas, inhaladores, inhaladores de aerosol, parches, inhaladores de partículas, implantes, implantes con depósito, inyectables (incluidos subcutáneos, intramusculares, intravenosos e intradérmicos), infusiones y combinaciones de los mismos.
En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro de sodio en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede conseguirse incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina. Además, los compuestos descritos en este documento se pueden formular en una formulación de liberación prolongada, por ejemplo, en una composición que incluye un polímero de liberación lenta. Los anticuerpos anti-IL-6 pueden prepararse con vehículos que protegerán al compuesto contra una liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, que incluye implantes y sistemas de administración microencapsulados. Se pueden usar polímeros biodegradables y biocompatibles, tales como acetato de vinil etileno, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, ácido poliláctico y copolímeros polilácticos poliglicólicos (PLG). Los expertos en la técnica conocen muchos procedimientos para la preparación de tales formulaciones.
En una realización de la invención que puede usarse para administrar por vía intravenosa anticuerpos de acuerdo con la invención, incluido ALD518, para indicaciones de mucositis, la formulación de administración comprende, o alternativamente consiste en, aproximadamente 10,5 mg/ml de anticuerpo, histidina base 25 mM, cantidad suficiente de ácido fosfórico hasta pH 6 y sorbitol 250 mM.
En otra realización de la invención que puede usarse para administrar por vía intravenosa anticuerpos de acuerdo con la invención, incluido ALD581, para indicaciones de mucositis, la formulación de administración comprende, o alternativamente consiste en, aproximadamente 10,5 mg/ml de anticuerpo, histidina base 12,5 mM, histidina HCl 12,5 mM (o histidina base 25 mM y cantidad suficiente de ácido clorhídrico hasta pH 6 ), sorbitol 250 mM y polisorbato 80 al 0,015% (p/p).
En una realización de la invención que se puede usar para administrar por vía subcutánea anticuerpos de acuerdo con la invención, incluido ALD518, para indicaciones de mucositis, la formulación de administración comprende, o alternativamente consiste en, aproximadamente 50 o 100 mg/ml de histidina base 5 mM, histidina HCl aproximadamente 5 mM hasta un pH final de 6 , sorbitol 250 mM y polisorbato 80 al 0,015% (p/p). En otra realización de la invención que se puede usar para administrar anticuerpos por vía subcutánea de acuerdo con la invención, incluyendo Ab1, para indicaciones de mucositis, la formulación de administración comprende, o alternativamente consiste en, aproximadamente 20 o 100 mg/ml de anticuerpo, histidina base aproximadamente 5 mM, histidina HCl aproximadamente 5 mM para obtener un pH final de 6 , sorbitol 250 a 280 mM (o sorbitol en combinación con sacarosa) y Polisorbato 80 al 0,015% (p/p), teniendo dicha formulación un espacio de cabeza de nitrógeno en los viales de transporte.
Las composiciones farmacéuticas normalmente deben ser estériles y estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento. La invención contempla que la composición farmacéutica esté presente en forma liofilizada. La composición se puede formular como una solución, microemulsión, liposoma u otra estructura ordenada adecuada para una alta concentración de fármaco. El vehículo puede ser un medio de dispersión o disolvente que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido) y mezclas adecuadas de los mismos. La invención contempla además la inclusión de un estabilizador en la composición farmacéutica.
En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro de sodio en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede conseguirse incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina. Además, el polipéptido alcalino se puede formular en una formulación de liberación prolongada, por ejemplo, en una composición que incluye un polímero de liberación lenta. Los compuestos activos se pueden preparar con vehículos que protegerán al compuesto contra una liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, que incluye implantes y sistemas de administración microencapsulados. Se pueden utilizar polímeros biodegradables y biocompatibles, tales como acetato de vinil etileno, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, ácido poliláctico y copolímeros polilácticos poliglicólicos (PLG). Los expertos en la técnica conocen muchos procedimientos para la preparación de tales formulaciones.
Para cada una de las realizaciones enumeradas, los compuestos se pueden administrar mediante una variedad de formas de dosificación. Se contempla cualquier forma de dosificación biológicamente aceptable conocida por los expertos en la técnica y combinaciones de las mismas. Ejemplos de tales formas de dosificación incluyen, sin limitación, polvos reconstituibles, elixires, líquidos, soluciones, suspensiones, emulsiones, polvos, gránulos, partículas, micropartículas, gránulos dispersables, cápsulas lisas, inhaladores, inhaladores de aerosol, parches, inhaladores de partículas, implantes, implantes con depósito, inyectables (incluidos subcutáneos, intramusculares, intravenosos e intradérmicos), infusiones y combinaciones de los mismos.
Una persona experta en la técnica sería capaz de determinar una dosis eficaz y la frecuencia de administración a través de la experimentación de rutina, por ejemplo, guiada por la divulgación en este documento y las enseñanzas de Goodman, et al. (2011) Goodman & Gilman, The Pharmacological Basis of Therapeutics [12a Ed.]; Howland et al., (2005) Lippincott's Illustrated Reviews: Pharmacology [2a Ed.]; y Golan, (2008) Principles of Pharmacology: The Pathophysiologic Basis of Drug Therapy [2aEd.] Véase también, Grennaro (2005) [Ed.] Remington: The Science and Practice of Pharmacy [21a Ed.]
La invención se puede poner en práctica de formas distintas a las descritas particularmente en la descripción y los ejemplos anteriores. Ciertas enseñanzas relacionadas con procedimientos para obtener una población clonal de células B específicas de antígeno se describen en la publicación de la solicitud de patente de EE. UU. No.
2007/0269868.
Ciertas enseñanzas relacionadas con la humanización de anticuerpos monoclonales derivados de conejo y modificaciones de secuencia preferidas para mantener la afinidad de unión al antígeno se describieron en la publicación de la solicitud de patente de los EE. UU. No. 2009/0104187.
Ciertas enseñanzas relacionadas con la producción de anticuerpos o fragmentos de los mismos usando levadura competente de apareamiento y los procedimientos correspondientes se describieron en la publicación de la solicitud de patente de los EE.UU. No. 2006/0270045.
Ciertas enseñanzas relacionadas con anticuerpos anti-IL-6 , procedimientos de producción de anticuerpos o fragmentos de los mismos usando levadura competente de apareamiento y los procedimientos correspondientes se describieron en la publicación de la solicitud de patente de los EE.UU. No. 2009/0104187.
Ciertas enseñanzas relacionadas con anticuerpos anti-IL- 6 y procedimientos de uso de esos anticuerpos o fragmentos de los mismos para abordar ciertas enfermedades y/o trastornos se describieron en la publicación de la solicitud de patente de los EE.UU. No. 2010/0150829.
Ciertos polinucleótidos y polipéptidos de anticuerpos anti-IL- 6 se describen en la lista de secuencias que acompaña a esta solicitud de patente, y la descripción de dicha lista de secuencias se incorpora en este documento como referencia en su totalidad.
Los siguientes ejemplos se presentan para proporcionar a los expertos en la técnica una divulgación y descripción completas de cómo hacer y utilizar la presente invención, y no pretenden limitar el alcance de lo que se considera como el invención. Se han realizado esfuerzos para garantizar la precisión con respecto a los números utilizados (por ejemplo, cantidades, temperatura, concentraciones), pero se deben permitir algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique lo contrario, las partes son partes en peso, el peso molecular es el peso molecular promedio, la temperatura está en grados centígrados; y la presión es atmosférica o cerca a la misma. Ejemplos
Los siguientes ejemplos que describen un anticuerpo anti-IL6 que comprende una secuencia ligera variable de la SEQ ID No. 709 y una secuencia pesada variable de la SEQ ID No. 657 para uso en el tratamiento o prevención de la mucositis asociada con radioterapia son ilustrativos de la invención. Los otros ejemplos son ejemplos preparatorios o ejemplos no ilustrativos de la invención.
En los siguientes ejemplos, el término "Ab1" se refiere a un anticuerpo que comprende la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 702 y la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 704, excepto cuando el contexto indique lo contrario. La designación de laboratorio "Ab1" también abarca un anticuerpo anti-IL- 6 también conocido como "ALD518" y "BMS-945429" que comprende la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 19 y la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 20.
Ejemplo 1
Producción de cultivo enriquecido de anticuerpos de células B específicas de antígeno
Los paneles de anticuerpos se obtienen inmunizando animales huésped de anticuerpos tradicionales para aprovechar la respuesta inmune nativa a un antígeno diana de interés. Normalmente, el huésped utilizado para la inmunización es un conejo u otro huésped que produce anticuerpos utilizando un proceso de maduración similar y proporciona una población de células B específicas de antígeno que producen anticuerpos de diversidad comparable, por ejemplo, diversidad epitópica. La inmunización inicial del antígeno se puede realizar utilizando adyuvante completo de Freund (CFA) y los refuerzos posteriores se pueden efectuar con adyuvante incompleto. Aproximadamente 50-60 días después de la inmunización, preferiblemente el día 55, se prueban los títulos de anticuerpos y se inicia el proceso de selección de anticuerpos (ABS) si se establecen los títulos apropiados. Los dos criterios clave para la iniciación de ABS son el potente reconocimiento de antígenos y la actividad modificadora de la función en los sueros policlonales. En el momento en que se establecen los títulos de anticuerpos positivos, los animales se sacrifican y las fuentes de células B se aíslan. Estas fuentes incluyen: el bazo, los ganglios linfáticos, la médula ósea y las células mononucleares de sangre periférica (PBMC). Se generan suspensiones de células individuales y las suspensiones de células se lavan para hacerlas compatibles para el almacenamiento a largo plazo a baja temperatura. Luego, las células se congelan típicamente.
Para iniciar el proceso de identificación de anticuerpos, una pequeña fracción de las suspensiones de células congeladas se descongela, se lavan y se colocan en un medio de cultivo de tejidos. A continuación, estas suspensiones se mezclan con una forma biotinilada del antígeno que se usó para generar la respuesta inmune animal, y las células específicas de antígeno se recuperan usando la metodología de selección de células de perlas magnéticas de Miltenyi. El enriquecimiento específico se realiza utilizando perlas de estreptavidina. La población enriquecida se recupera y progresa en la siguiente fase de aislamiento de células B específicas.
Ejemplo 2
Producción de cultivos clonales que contienen células B específicas de antígeno
Las células B enriquecidas producidas de acuerdo con el Ejemplo 1 se cultivan luego en placas con densidades celulares variables por pocillo en una placa de microtitulación de 96 pocillos. Generalmente, se trata de 50, 100, 250 o 500 células por pocillo con 10 placas por grupo. El medio se complementa con medio acondicionado de células T de conejo activadas al 4% junto con 50K células alimentadoras EL4B irradiadas congeladas. Estos cultivos se dejan en reposo durante 5-7 días, momento en el que se recolecta el anticuerpo secretado que contiene el sobrenadante y se evalúan las propiedades diana en un entorno de ensayo separado. El sobrenadante restante se deja intacto y la placa se congela a -70 °C. En estas condiciones, el proceso de cultivo normalmente da como resultado pocillos que contienen una población de células mixtas que comprende una población clonal de células B específicas de antígeno, es decir, un solo pozo contendrá solo un único anticuerpo monoclonal específico para el antígeno deseado.
Ejemplo 3
Cribado de sobrenadantes de anticuerpos en busca de anticuerpos monoclonales de especificidad y/o propiedades funcionales deseadas
Los sobrenadantes que contienen anticuerpos derivados del pocillo que contiene una población de células B específicas de antígeno clonal producida de acuerdo con el Ejemplo 2 se criban inicialmente para el reconocimiento de antígenos usando procedimientos de ELISA. Esto incluye la inmovilización selectiva de antígenos (por ejemplo, captura de antígeno biotinilado por placa recubierta de estreptavidina), recubrimiento de placa de antígeno no específico o, alternativamente, mediante una estrategia de acumulación de antígeno (por ejemplo, captura selectiva de antígeno seguida de la adición de un compañero de unión para generar un complejo de proteína heteromérica -antígeno). Los sobrenadantes de pocillos positivos para antígeno se prueban luego opcionalmente en un ensayo de modificación de la función que depende estrictamente del ligando. Un ejemplo de este tipo es un ensayo de interacción proteína-proteína in vitro que recrea la interacción natural del ligando del antígeno con la proteína receptora recombinante. Alternativamente, se utiliza una respuesta basada en células que depende del ligando y se controla fácilmente (por ejemplo, respuesta de proliferación). El sobrenadante que muestra un reconocimiento y una potencia de antígenos significativos se considera un pocillo positivo. A continuación, las células derivadas del pocillo positivo original pasan a la fase de recuperación de anticuerpos.
Ejemplo 4
Recuperación de una sola célula B productora de anticuerpos de especificidad antigénica deseada
Las células se aíslan de un pocillo que contiene una población clonal de células B específicas de antígeno (producidas de acuerdo con el Ejemplo 2 o 3), que secretan una única secuencia de anticuerpo. Las células aisladas se ensayan luego para aislar una única célula secretora de anticuerpos. Las perlas de estreptavidina Dynal® (perlas magnéticas) se recubren con antígeno diana biotinilado en medio tamponado para preparar microperlas que contienen antígenos compatibles con la viabilidad celular. A continuación, perlas cargadas de antígeno, células productoras de anticuerpos del pocillo positivo y un anticuerpo anti-IgG huésped H&L marcado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) (como se indicó, el huésped puede ser cualquier huésped mamífero, por ejemplo, conejo, ratón, rata) se incuban juntos a 37 °C. A continuación, esta mezcla se vuelve a pipetear en alícuotas sobre un portaobjetos de vidrio de modo que cada alícuota tenga en promedio una única célula B productora de anticuerpos. A continuación, las células secretoras de anticuerpos específicas de antígeno se detectan mediante microscopía de fluorescencia. El anticuerpo secretado se concentra localmente en las perlas adyacentes debido al antígeno unido y proporciona información de localización basada en la fuerte señal fluorescente. Las células secretoras de anticuerpos se identifican mediante la detección con FITC de complejos anticuerpo-antígeno formados adyacentes a la célula secretora. La única célula que se encuentra en el centro de este complejo se recupera luego usando un micromanipulador. La célula se congela rápidamente en un tubo Eppendorf de p Cr para su almacenamiento a -80 °C hasta que se inicia la recuperación de la secuencia de anticuerpos.
Ejemplo 5
Aislamiento de secuencias de anticuerpos de células B específicas de antígeno
Las secuencias de anticuerpos se recuperan usando un procedimiento combinado basado en RT-PCR a partir de una única célula B aislada producida de acuerdo con el Ejemplo 4 o una célula B específica antigénica aislada de la población de células B clonales obtenida de acuerdo con el Ejemplo 2. Los cebadores están diseñados para hibridación en regiones conservadas y constantes de los genes de inmunoglobulina diana (pesados y ligeros), tales como secuencias de inmunoglobulinas de conejo, y se usa una etapa de recuperación de PCR anidada de dos etapas para obtener la secuencia de anticuerpos. Los amplicones de cada pocilio se analizan en busca de recuperación e integridad de tamaño. A continuación, los fragmentos resultantes se digieren con AluI para determinar la clonalidad de la secuencia. Las secuencias idénticas muestran un patrón de fragmentación común en su análisis electroforético. De manera significativa, este patrón de fragmentación común que prueba la clonalidad celular se observa generalmente incluso en los pocillos originalmente sembrados hasta 1000 células/pocillo. A continuación, los fragmentos de amplicón de cadena ligera y pesada originales se digieren con enzima de restricción con HindlII y Xhol o HindlII y BsiWl para preparar las respectivas piezas de ADN para la clonación. Las digestiones resultantes se ligan luego en un vector de expresión y se transforman en bacterias para la propagación y producción de plásmidos. Las colonias se seleccionan para la caracterización de la secuencia.
Ejemplo 6
Producción recombinante de anticuerpo monoclonal de especificidad antigénica deseada y/o propiedades funcionales
Se establecen las secuencias de anticuerpos de longitud completa correctas para cada pocillo que contiene un único anticuerpo monoclonal y se prepara ADN miniprep utilizando la metodología de fase sólida de Qiagen. Este ADN se usa luego para transfectar células de mamíferos para producir anticuerpos recombinantes de longitud completa. El producto de anticuerpo crudo se prueba en busca de reconocimiento de antígeno y propiedades funcionales para confirmar que las características originales se encuentran en la proteína de anticuerpo recombinante. Cuando sea apropiado, se completan las transfecciones transitorias de mamíferos a gran escala y el anticuerpo se purifica mediante cromatografía de afinidad de proteína A. Se evalúa Kd utilizando procedimientos estándar (por ejemplo, Biacore®) así como IC50 en un ensayo de potencia.
Ejemplo 7
Preparación de anticuerpos que se unen a IL- 6 humana
Utilizando el protocolo de selección de anticuerpos descrito en este documento, se puede generar un panel extenso de anticuerpos. Los anticuerpos tienen alta afinidad hacia IL- 6 (Kd pM de uno a dos dígitos) y demuestran un potente antagonismo de IL- 6 en múltiples sistemas de cribado basados en células (T1165 y HepG2). Además, la colección de anticuerpos muestra distintos modos de antagonismo hacia los procesos impulsados por IL-6.
Estrategia de inmunización
Se inmunizaron conejos con huIL- 6 (R&R). La inmunización consistió en una primera inyección subcutánea (sc) de 100 |jg en adyuvante completo de Freund (CFA) (Sigma) seguida de dos refuerzos, con dos semanas de diferencia, de 50 jg cada uno en adyuvante incompleto de Freund (IFA) (Sigma). Se extrajo sangre de los animales el día 55 y se determinaron los títulos en suero mediante ELISA (reconocimiento de antígeno) y mediante ensayo de proliferación no radiactiva (Promega) utilizando la línea celular T1165.
Evaluación del título de selección de anticuerpos
El reconocimiento de antígeno se determinó revistiendo placas Immulon 4 (Thermo) con 1 jg/m l de huIL- 6 (50 jl/pocillo) en solución salina tamponada con fosfato (PBS, Hyclone) durante la noche a 4 °C. El día del ensayo, las placas se lavaron 3 veces con PBS/Tween 20 (comprimidos de PBST, Calbiochem). A continuación, las placas se bloquearon con 200 jl/pocillo de gelatina de piel de pescado al 0,5% (FSG, Sigma) en PBS durante 30 minutos a 37 °C. Se eliminó la solución de bloqueo y se transfirieron las placas. Se prepararon muestras de suero (sangrados y pre­ sangrados) a una dilución inicial de 1:100 (todas las diluciones se realizaron en jl/pocillo de FSG 50) seguido de diluciones 1 :10 en la placa (la columna 12 se dejó en blanco para el control de fondo). Las placas se incubaron durante 30 minutos a 37 °C. Las placas se lavaron 3 veces con PBS/Tween 20. Se añadió Fc-HRP anti-conejo de cabra (Pierce) diluido 1:5000 a todos los pocillos (50 jl/pocillo) y las placas se incubaron durante 30 minutos a 37 °C. Las placas se lavaron como se describió anteriormente. Se añadieron a las placas 50 jl/pocillo de TMB de parada estable (Fitzgerald Industries) y se dejó que se desarrollara color, generalmente durante 3 a 5 minutos. La reacción de desarrollo se detuvo con 50 jL/pocillo de HCl 0,5 M. Las placas se leyeron a 450 nm. Se representó la densidad óptica (DO) frente a la dilución utilizando el software Graph Pad Prizm y se determinaron los títulos.
Evaluación funcional de títulos
La actividad funcional de las muestras se determinó mediante un ensayo de proliferación con T1165. Las células T1165 se mantuvieron de forma rutinaria en medio RPMI modificado (Hyclone) suplementado con HEPES, piruvato de sodio, bicarbonato de sodio, L-glutamina, glucosa alta, penicilina/estreptomicina, suero fetal bovino (FBS) al 10% inactivado por calor (todos los suplementos de Hyclone), 2-mercaptoetanol (Sigma) y 10 ng/ml de huIL- 6 (R&D). El día del ensayo, se determinó la viabilidad celular mediante azul de tripano (Invitrogen) y se sembraron las células a una densidad fija de 20.000 células/pocillo. Antes de la siembra, las células se lavaron dos veces en el medio descrito anteriormente sin IL- 6 humana (centrifugando a 13000 rpm durante 5 minutos y desechando el sobrenadante).
Después del último lavado, las células se resuspendieron en el mismo medio utilizado para el lavado en un volumen equivalente a 50 pl/pocillo. Las células se dejaron a un lado a temperatura ambiente.
En una placa de 96 pocillos de fondo redondo (Costar), se agregaron muestras de suero partiendo de diluciones 1:100, seguido por una dilución 1:10 a través de la placa (columnas 2 a 10) a razón de 30 pl/pocillo en repeticiones de 5 (filas B a F: dilución realizada en el medio descrito anteriormente sin huIL-6 ). La columna 11 era solo medio para el control de IL-6. Se añadieron 30 pl/pocillo de huIL- 6 a una concentración 4x de la EC50 final (concentración determinada previamente) a todos los pocillos (se diluyó huIL- 6 en el medio descrito anteriormente). Los pocillos se incubaron durante 1 hora a 37 °C para permitir que se produjera la unión del anticuerpo. Después de 1 hora, se transfirieron 50 pl/pocillo de complejo anticuerpo-antígeno (Ab-Ag) a una placa de 96 pocillos de fondo plano (Costar) siguiendo el formato de mapa de placa dispuesto en la placa de fondo redondo. En la Fila G, se añadieron 50 pl/pocillo de medio a todos los pocillos (columnas 2 a 11) para el control de fondo. Se añadieron 50 pl/pocillo de la suspensión celular reservada a todos los pocillos (columnas 2 a 11, filas B a G). En las columnas 1 y 12 y en las filas A y H, se agregaron 200 pl/pocillo de medio para evitar la evaporación de los pocillos de prueba y minimizar el efecto de borde. Las placas se incubaron durante 72 horas a 37 °C en 4% de CO2. A las 72 horas, se añadieron 20 pl/pocillo de reactivos CellTiter96 (Promega) a todos los pocillos de prueba de acuerdo con el protocolo del fabricante, y las placas se incubaron durante 2 horas a 37 °C. A las 2 horas, las placas se mezclaron suavemente en un agitador orbital para dispersar las células y permitir la homogeneidad en los pocillos de prueba. Las placas se leyeron a una longitud de onda de 490 nm. La densidad óptica (DO) frente a la dilución se representó utilizando el software Graph Pad Prizm y se determinó el título funcional. Se realizó una placa de control de ensayo positivo como se describió anteriormente usando MAB2061 (R&D Systems) a una concentración inicial de 1 pg/ml (concentración final) seguido de diluciones 1:3 a través de la placa.
Recolección de tejidos
Una vez que se establecieron los títulos aceptables, se sacrificó el o los conejos). El bazo, los ganglios linfáticos y la sangre total se recolectaron y procesaron de la siguiente manera:
Se procesaron el bazo y los nódulos linfáticos en una suspensión de células individuales disociando el tejido y empujando a través de una malla de alambre estéril a 70 pm (Fisher) con un émbolo de una jeringa de 20 cc. Las células se recogieron en el medio RPMI modificado descrito anteriormente sin huIL-6 , pero con glucosa baja. Las células se lavaron dos veces mediante centrifugación. Después del último lavado, se determinó la densidad celular mediante azul de tripano. Las células se centrifugaron a 1500 rpm durante 10 minutos; se descartó el sobrenadante. Las células se resuspendieron en el volumen apropiado de dimetilsulfóxido al 10% (DMSO, Sigma) en FBS (Hyclone) y se dispensaron a razón de 1 ml/vial. Luego, los viales se almacenaron a -70 °C durante 24 h antes de colocarlos en un tanque de nitrógeno líquido (LN2) para su almacenamiento a largo plazo.
Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) mezclando sangre completa con partes iguales del medio bajo en glucosa descrito anteriormente sin FBS. Se colocaron cuidadosamente en capas 35 ml de la mezcla de sangre completa sobre 8 ml de Lympholyte Rabbit (Cedarlane) en un tubo cónico de 45 ml (Corning) y se centrifugaron durante 30 minutos a 2500 rpm a temperatura ambiente sin frenos. Después de la centrifugación, las capas de PBMC se retiraron cuidadosamente usando una pipeta Pasteur de vidrio (VWR), se combinaron y se colocaron en un vial limpio de 50 ml. Las células se lavaron dos veces con el medio modificado descrito anteriormente mediante centrifugación a 1500 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente y se determinó la densidad celular mediante tinción con azul de tripano. Después del último lavado, las células se resuspendieron en un volumen apropiado de medio DMSO/FBS al 10% y se congelaron como se describe en el presente documento.
Cultivo de células B
El día de la preparación del cultivo de células B, los viales de PBMC, esplenocitos o ganglios linfáticos se descongelaron para su uso. Los viales se sacaron del tanque de LN2 y se colocaron en un baño de agua a 37 °C hasta que se descongelaron. El contenido de los viales se transfirió a un tubo de centrífuga cónico de 15 ml (Corning) y se añadieron lentamente al tubo 10 ml de RPMI modificado descrito anteriormente. Las células se centrifugaron durante 5 minutos a 1,5 K RPM y se descartó el sobrenadante. Las células se resuspendieron en 10 ml de medio fresco. La densidad celular y la viabilidad se determinaron mediante azul de tripano. Las células se lavaron de nuevo y se resuspendieron a 10E7 células/80 pl de medio. Se añadió huIL- 6 biotinilada (B huIL-6 ) a la suspensión celular a la concentración final de 3 pg/ml y se incubó durante 30 minutos a 4 °C. B huIL- 6 no unida se eliminó con dos lavados de 10 ml de tampón de fosfato (PBF):PBS libre de Ca/Mg (Hyclone), ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 2 mM, albúmina de suero bovino (BSA) al 0,5% (Sigma sin biotina). Después del segundo lavado, las células se resuspendieron a 10E7 células/80 pl de PBF. Se añadieron 20 pl de microesferas de estreptavidina MACS® (Miltenyi)/células 10E7 a la suspensión celular. Las células se incubaron a 4 °C durante 15 minutos. Las células se lavaron una vez con 2 ml de células PBF/10E7. Después del lavado, las células se resuspendieron a razón de 10E8 células/500 pl de PBF y se reservaron. Se enjuagó previamente una columna MACS® MS (Miltenyi) con 500 ml de PBF en un soporte magnético (Miltenyi). Se aplicó suspensión celular a la columna a través de un prefiltro y se recogió la fracción no unida. La columna se lavó con 1,5 ml de tampón PBF. La columna se retiró del soporte magnético y se colocó en un tubo Falcon limpio de polipropileno y estéril de 5 ml. Se añadió 1 ml de tampón PBF a la parte superior de la columna y se recogieron las células seleccionadas positivas. El rendimiento y la viabilidad de la fracción celular positiva y negativa se determinó mediante tinción con azul de tripano. La selección positiva produjo un promedio del 1 % de la concentración celular inicial.
Se estableció un cribado de células piloto para proporcionar información sobre los niveles de siembra para el cultivo. Se sembraron tres grupos de 10 placas (un total de 30 placas) a razón de 50, 100 y 200 células B enriquecidas/pocillo. Además, cada pocillo contenía 50K células/pocillo de células EL-4.B5 irradiadas (5000 Rads) y un nivel apropiado de sobrenadante de células T (que varía del 1 al 5% de acuerdo con la preparación) en medio RPMI modificado con alto contenido de glucosa hasta un volumen final de 250 pL/pocillo. Los cultivos se incubaron durante 5 a 7 días a 37 °C en CO2 al 4%.
Identificación de células B secretoras selectivas de anticuerpos
Se ensayaron los cultivos para el reconocimiento de antígenos y la actividad funcional entre los días 5 y 7.
Cribado para reconocimiento de antígenos
El formato de ELISA usado es como se describió anteriormente excepto que se usaron 50 pl de sobrenadante de los pocillos de cultivos de células B (BCC) (las 30 placas) como fuente del anticuerpo. El medio acondicionado se transfirió a placas recubiertas con antígeno. Una vez que se identificaron los pocillos positivos, se eliminó el sobrenadante y se transfirió a una placa o placas maestras de 96 pocillos. A continuación, las placas de cultivo originales se congelaron eliminando todo el sobrenadante excepto 40 pl/pocillo y añadiendo 60 pl/pocillo de DMSO al 16% en FBS. Las placas se envolvieron en toallas de papel para reducir la congelación y se colocaron a -70 °C.
Cribado de actividad funcional
A continuación, las placas maestras se cribaron para determinar la actividad funcional en el ensayo de proliferación de T1165 como se describió anteriormente, excepto que la fila B era solo medio para el control de fondo, la fila C era medio IL- 6 para el control de proliferación positivo, y las filas D-G y columnas 2-11 fueron los pocillos del BCC (50 pl/pocillo, puntos únicos). Se añadieron 40 pl de IL- 6 a todos los pocillos excepto a la fila de medios a razón de 2,5 veces la concentración de CE50 determinada para el ensayo. Después de 1 hora de incubación, el complejo Ab/Ag se transfirió a una placa de fondo plano de 96 pocillos, tratada con cultivo de tejido (TC). Se añadieron 20 pl de suspensión celular en medio RPMI modificado sin hulL- 6 (T1165 a razón de 20.000 células/pocillo) a todos los pocillos (volumen final de 100 pl por pocillo). Se restó el fondo y los valores de DO observados se transformaron en % de inhibición. Recuperación de células B
Se retiraron las placas que contenían los pocillos de interés a -70 °C y se recuperaron las células de cada pocillo con lavados de 5-200 pl de medio/pocillo. Los lavados se agruparon en un tubo de centrífuga estéril de 1,5 ml y las células se sedimentaron durante 2 minutos a 1500 rpm.
Se invirtió el tubo, se repitió el centrifugado y se eliminó cuidadosamente el sobrenadante. Las células se resuspendieron en 100 pl/tubo de medio. Se añadieron a la suspensión celular 100 pl de dynabeads de estreptavidina M280 recubiertas con IL- 6 biotinilada (Invitrogen) y 16 pl de IgG-FITC de cabra anti-conejo H&L diluido 1:100 en medio. Se retiraron 20 pl de suspensión de células/perlas/FITC, y se prepararon gotas de 5 pl en un portaobjetos de vidrio (Corning) previamente tratado con Sigmacote (Sigma), a razón de 35 a 40 gotas/portaobjetos. Se añadió una barrera impermeable de aceite de parafina (JT Baker) para sumergir las gotas y el portaobjetos se incubó durante 90 minutos a 37 °C, 4% de CO2 en la oscuridad.
Las células B específicas que producen anticuerpos pueden identificarse por el anillo fluorescente que las rodea debido a la secreción de anticuerpos, el reconocimiento del antígeno biotinilado asociado a la perla y la posterior detección mediante el reactivo de detección de IgG fluorescente. Una vez que se identificó una célula de interés, se recuperó la célula en el centro del anillo fluorescente mediante un micromanipulador (Eppendorf). La célula única que sintetizaba y exportaba el anticuerpo se transfirió a un tubo de microcentrífuga de 250 pl y se colocó en hielo seco. Después de recuperar todas las células de interés, se transfirieron a -70 °C para su almacenamiento a largo plazo.
Ejemplo 8
Expresión de células de levadura
Genes de anticuerpos: se clonaron y construyeron genes que dirigieron la síntesis de un anticuerpo monoclonal de conejo humanizado quimérico.
Vector de expresión: El vector contiene los siguientes componentes funcionales: 1) un origen de replicación ColE1 mutante, que facilita la replicación del vector plásmido en células de la bacteria Escherichia coli; 2) un gen Sh ble bacteriano, que confiere resistencia al antibiótico Zeocin® (fleomicina) y sirve como marcador seleccionable para las transformaciones de E. coli y P. pastoris; 3) un casete de expresión compuesto por el promotor del gen de gliceraldehído deshidrogenasa (gen GAP), fusionado con secuencias que codifican la secuencia líder de secreción pre-pro del factor de apareamiento alfa de Saccharomyces cerevisiae, seguida de secuencias que codifican una señal de terminación transcripcional de P. pastoris del gen de alcohol oxidasa I (AOX1) de P. pastoris. El gen marcador de resistencia a Zeocin® (fleomicina) proporciona un medio de enriquecimiento para las cepas que contienen múltiples copias integradas de un vector de expresión en una cepa mediante la selección de transformantes que son resistentes a niveles más altos de Zeocin® (fleomicina).
Cepas de Pichia pastoris: se pueden usar las cepas met1, lys3, ura3 y ade1 de Pichia pastoris. Aunque se podrían usar dos conjuntos complementarios de cepas auxotróficas para la construcción y mantenimiento de cepas diploides, estas dos cepas son especialmente adecuadas para este procedimiento por dos razones. Primero, crecen más lentamente que las cepas diploides que son el resultado de su apareamiento o fusión. Por lo tanto, si una pequeña cantidad de células haploides adel o ura3 permanecen presentes en un cultivo o surgen por meiosis u otro mecanismo, la cepa diploide debería superarlas en cultivo.
La segunda es que es fácil controlar el estado sexual de estas cepas, ya que las colonias diploides Ade+ que surgen de su apareamiento son de un color blanco o crema normal, mientras que las células de cualquier cepa que sean mutantes adel haploides formarán una colonia con un distintivo color rosa. Además, todas las cepas que sean mutantes haploides ura3 son resistentes al fármaco ácido 5-fluoroorótico (FOA) y pueden identificarse de forma sensible colocando muestras de un cultivo en placas de medio mínimo uracilo con FOA. En estas placas, solo las cepas mutantes ura3 (presumiblemente haploides) que requieren uracilo pueden crecer y formar colonias. Por lo tanto, con las cepas parentales haploides marcadas con ade1 y ura3, se puede controlar fácilmente el estado sexual de las cepas diploides productoras de anticuerpos resultantes (haploide frente a diploide).
Procedimientos
Construcción de vectores de expresión de pGAPZ-alfa para la transcripción de genes de anticuerpos de cadena ligera y pesada. Los fragmentos de cadena ligera y pesada humanizados se clonaron en los vectores de expresión pGAPZ mediante un proceso dirigido por PCR. Los constructos humanizados recuperados se sometieron a amplificación en condiciones estándar del kit de KOD polimerasa (Novagen) ((1) 94 °C, 2 minutos; (2) 94 °C, 30 segundos; (3) 55 °C, 30 segundos; (4) 72 °C, 30 segundos: ciclo a través de las etapas 2-4 durante 35 veces; (5) 72 °C, 2 minutos) empleando los siguientes cebadores (1) AGCGCTTATTCCGCTATCCAGATGACCCAGTC directo de cadena ligera: el sitio Afel está subrayado de forma sencilla (SEQ ID NO: 729). El final de la secuencia señal de HSA está doblemente subrayado, seguido de la secuencia de la cadena ligera variable madura (no subrayada); la CGTACGTTTGATTTCCACCTTG inversa (SEQ ID NO: 730).
Cebador inverso de cadena ligera variable. El sitio BsiWI está subrayado, seguido del complemento inverso para el extremo 3' de la cadena ligera variable. Tras la digestión con la enzima de restricción con AfeI y BsiWI, esto permite la inserción en marco con el vector pGAPZ utilizando la secuencia líder HAS humana en marco con la región constante de cadena ligera kappa humana para la exportación. (2) Se lleva a cabo una estrategia similar para la cadena pesada. El cebador directo empleado es AGCGCTTATTCC GAGGTGCAGCTGGTGGAGTC (SEQ ID NO: 731). El sitio de AfeI está subrayado de forma sencilla. El final de la secuencia señal de HSA está subrayado dos veces, seguido de la secuencia de la cadena pesada variable madura (no subrayada). El cebador de cadena pesada inversa es CTCGAG ACGGTGACGAGGGT (SEQ ID NO: 732). El sitio XhoI está subrayado, seguido del complemento inverso para el extremo 3' de la cadena pesada variable. Esto permite la clonación de la cadena pesada en marco con la región CH1-CH2-CH3 de IgG-Yl previamente insertada dentro de pGAPZ usando una estrategia de clonación direccional comparable.
Transformación de vectores de expresión en cepas huésped haploides adel ura3, metí y lys3 de P. pastoris. Todos los procedimientos usados para la transformación de cepas haploides de P. pastoris y la manipulación genética del ciclo sexual de P. pastoris son como se describen en Higgins, D. R. y Cregg, J. M., Eds. 1998. Pichia Protocols. Methods in Molecular Biology. Humana Press, Totowa, Nueva Jersey.
Antes de la transformación, cada vector de expresión se linealiza dentro de las secuencias promotoras de GAP con AvrII para dirigir la integración de los vectores en el locus del promotor GAP del genoma de P. pastoris. Las muestras de cada vector se transforman luego individualmente en cultivos electrocompetentes de las cepas adel, ura3, metí y lys3 por electroporación y los transformantes exitosos se seleccionan en placas de YPD Zeocin® (fleomicina) por su resistencia a este antibiótico. Las colonias resultantes se seleccionan, se rayan para colonias individuales en placas de YPD Zeocin® (fleomicina) y luego se examinan para detectar la presencia del inserto del gen del anticuerpo mediante un ensayo de PCR en el ADN genómico extraído de cada cepa para el inserto del gen del anticuerpo adecuado y/o por la capacidad de cada cepa para sintetizar una cadena de anticuerpos mediante un procedimiento de elevación de colonias/inmunotransferencia. Wung et al. (1996) Biotechniques 21: 808-812. Las cepas haploides adel, metí y lys3 que expresan una de los tres constructos de cadena pesada se recogen para constructos diploides junto con la cepa haploide ura3 que expresa el gen de la cadena ligera. Los genes de cadena pesada que expresan haploides se aparean con el haploide de cadena ligera apropiado ura3 para generar una proteína secretora diploide.
Apareamiento de cepas haploides que sintetizan una única cadena de anticuerpos y selección de derivados diploides que sintetizan anticuerpos funcionales tetraméricos. Para aparear cepas haploides de P. pastoris, cada cepa productora de cadena pesada de adel (o metí o lys3) que se va a cruzar se raya a través de una placa rica en y Pd y la cepa productora de cadena ligera ura3 se raya en una segunda placa de YPD (~10 rayas por placa). Después de uno o dos días de incubación a 30 °C, las células de una placa que contiene cepas de cadenas pesadas y una placa que contiene cepas de cadenas ligeras ura3 se transfieren a una tela de terciopelo estéril sobre un bloque de placas de réplica en un patrón de trama cruzada para que cada cepa de cadena pesada contenga un parche de células mezcladas con cada cepa de cadena ligera. Las células en placa de réplica con estrías cruzadas se transfieren luego a una placa de apareamiento y se incuban a 25 °C para estimular el inicio del apareamiento entre cepas. Después de dos días, las células de las placas de acoplamiento se transfieren de nuevo a un terciopelo estéril en un bloque de placas de réplica y luego se transfieren a placas de medio mínimo. Estas placas se incuban a 30 °C durante tres días para permitir el crecimiento selectivo de colonias de cepas diploides prototrópicos. Las colonias que surgieron se recogen y se rayan en una segunda placa de medio mínimo para aislar una sola colonia y purificar cada cepa diploide. Las líneas celulares diploides resultantes se examinan luego para determinar la producción de anticuerpos.
Se ensayan cepas diploides putativas para demostrar que son diploides y contienen ambos vectores de expresión para la producción de anticuerpos. Para la diploidía, las muestras de una cepa se esparcen en placas de apareamiento para estimularlas a pasar por la meiosis y formar esporas. Los productos de esporas haploides se recolectan y analizan para determinar su fenotipo. Si un porcentaje significativo de los productos de esporas resultantes son auxótrofos simples o dobles, se puede concluir que la cepa original debe haber sido diploide. Las cepas diploides se examinan para detectar la presencia de ambos genes de anticuerpos extrayendo ADN genómico de cada una y utilizando este ADN en reacciones PCR específicas para cada gen.
Fusión de cepas haploides que sintetizan una única cadena de anticuerpos y selección de derivados diploides que sintetizan anticuerpos tetraméricos funcionales. Como alternativa al procedimiento de apareamiento descrito anteriormente, cultivos individuales de cepas haploides adeí y ura3 que producen anticuerpos monocatenarios se someten a esferoplastia y sus esferoplastos resultantes se fusionan usando polietilenglicol/CaCh. Las cepas haploides fusionadas se incrustan luego en agar que contiene sorbitol 1 M y medio mínimo para permitir que las cepas diploides regeneren su pared celular y crezcan en colonias visibles. Las colonias resultantes se recogen del agar, se extienden sobre una placa de medio mínimo y las placas se incuban durante dos días a 30 °C para generar colonias a partir de células individuales de líneas celulares diploides. Las supuestas líneas celulares diploides resultantes se examinan luego en busca de diploidía y producción de anticuerpos como se describió anteriormente.
Purificación y análisis de anticuerpos. Una cepa diploide para la producción de anticuerpos de longitud completa se obtiene mediante el apareamiento de la cadena ligera metí y la cadena pesada lys3 utilizando los procedimientos descritos anteriormente. Los medios de cultivo de cultivos en matraces agitadores o fermentadores de cepas de expresión diploide de P. pastoris se recolectan y examinan para detectar la presencia de proteína de anticuerpo mediante SDS-PAGE e inmunotransferencia utilizando anticuerpos dirigidos contra las cadenas pesadas y ligeras de IgG humana, o específicamente contra la cadena pesada de IgG.
Para purificar los anticuerpos secretados por levadura, los medios clarificados de cultivos productores de anticuerpos se pasan a través de una columna de proteína A y después de lavar con fosfato de sodio 20 mM, pH 7,0, tampón de unión, la proteína unida a la proteína A se eluye usando tampón de glicina HCl 0,1 M, pH 3,0. Las fracciones que contienen la mayor cantidad de proteína total se examinan mediante SDS-PAGE teñida con azul de Coomassie e inmunotransferencia para la proteína del anticuerpo. El anticuerpo se caracteriza usando el ELISA descrito anteriormente para el reconocimiento de IL-6.
Ensayo de actividad de anticuerpos. Se evalúa la actividad funcional del anticuerpo humanizado derivado de levadura recombinante mediante el ensayo de proliferación de células T1165 dirigido por IL- 6 y el ensayo de haptoglobina HepG2 estimulado por IL- 6 descrito anteriormente.
Ejemplo 9
Neutralización de la respuesta de fase aguda mediante la administración intravenosa de anticuerpo anti-IL- 6 Ab1
La IL- 6 humana puede provocar una respuesta de fase aguda en ratas, y una de las principales proteínas de fase aguda que se estimula en la rata es la macroglobulina alfa-2 (A2M). Se diseñó un estudio para evaluar la dosis de anticuerpo Abl necesaria para eliminar la respuesta de A2M a una única inyección subcutánea de 100 |jg de IL-6 humana administrada una hora después de diferentes dosis (0,03, 0,1, 0,3, 1 y 3 mg/kg) de anticuerpo Ab1 administrado por vía intravenosa (n = 10 ratas/nivel de dosis) o IgG1 humana policlonal como control (n = 10 ratas). Se recuperó el plasma y se cuantificó la A2M mediante un kit ELISA tipo sándwich comercial (ICL Inc., Newberg OR; Cat. No. E-25A2M). El criterio de valoración fue la diferencia en la concentración plasmática de A2M en el momento de 24 horas (post-Abl).
La ID50 para el anticuerpo Ab1 fue de 0,1 mg/kg con supresión completa de la respuesta de A2M a razón de 0,3 mg/kg. Véase la Figura 6. Esto demuestra que la IL- 6 puede neutralizarse in vivo por los anticuerpos anti-IL- 6 descritos en el presente documento.
Ejemplo 10
Estudio 1 del modelo de caquexia RXF393
Introducción
La línea celular de cáncer de células renales humanas, RXF393, produce una profunda pérdida de peso cuando se trasplanta a ratones desnudos atímicos. La pérdida de peso comienza alrededor del día 15 después del trasplante y el 80% de todos los animales pierden al menos el 30% de su peso corporal total entre los días 18 y 20 después del trasplante. RXF393 secreta IL- 6 humana y la concentración plasmática de IL- 6 humana en estos animales es muy alta, alrededor de 10 ng/ml. La IL- 6 humana puede unirse al receptor de IL- 6 soluble murino y activar las respuestas de IL- 6 en el ratón. La IL- 6 humana es aproximadamente 10 veces menos potente que la IL- 6 murina para activar las respuestas de IL- 6 en el ratón. Los objetivos de este estudio fueron determinar el efecto del anticuerpo Ab1 sobre la supervivencia, el peso corporal, la proteína amiloide A en suero, los parámetros hematológicos y el crecimiento tumoral en ratones desnudos atímicos trasplantados con la línea celular de cáncer de células renales humanas, RXF393.
Procedimientos
Se implantaron fragmentos de tumor RXF393 (30-40 mg) subcutáneamente en el flanco derecho en 80 ratones desnudos atímicos machos de seis semanas de edad. A continuación, los animales se dividieron en ocho grupos de diez ratones. A tres grupos se les administró anticuerpo Ab1 a razón de3 mg/kg, 10 mg/kg o 30 mg/kg por vía intravenosa semanalmente el día 1, día 8 , día 15 y día 22 después del trasplante (grupos de progresión). A otros tres grupos se les administró anticuerpo Ab1 a razón de 3 mg/kg, o 10 mg/kg, o 30 mg/kg por vía intravenosa semanalmente el día 8 , el día 15 y el día 22 después del trasplante (grupos de regresión). Finalmente, un grupo de control recibió IgG humana policlonal a razón de 30 mg/kg y un segundo grupo de control recibió solución salina tamponada con fosfato por vía intravenosa semanalmente el día 1, día 8 , día 15 y día 22 después del trasplante.
Los animales se sacrificaron el día 28, cuando el tumor alcanzó 4.000 mm3 o si se debilitaron (> 30% de pérdida de peso corporal). Los animales se pesaron los días 1, 6 y luego diariamente desde los días 9 a 28 después del trasplante. Se utilizó el porcentaje de peso corporal medio (MPBW) como parámetro principal para controlar la pérdida de peso durante el estudio. Se calculó como sigue: (Peso corporal - Peso del tumor)/Peso corporal inicial x 100. El peso del tumor se midió los días 1, 6 , 9, 12, 15, 18, 22, 25 y 28 después del trasplante. Se extrajo sangre bajo anestesia de cinco ratones de cada grupo los días 5 y 13 y de los diez ratones de cada grupo cuando se sacrificaron (día 28 en la mayoría de los casos). Se analizó la sangre para determinar la hematología y la concentración de proteína amiloide A en suero (SAA). A un grupo adicional de 10 ratones machos desnudos atímicos de 6 semanas de edad no portadores de tumores se les tomaron muestras de sangre para hematología y estimación de la concentración de SAA para actuar como un conjunto de valores de referencia.
Resultados - Supervivencia
Ningún animal fue sacrificado o murió en ninguno de los grupos de anticuerpos Ab1 antes de la fecha de finalización del estudio del día 28. En los dos grupos de control, 15 animales (7/9 en el grupo de IgG humana policlonal y 8/10 en el grupo de solución salina tamponada con fosfato) se encontraron muertos o fueron sacrificados porque estaban muy debilitados (> 30% de pérdida de peso corporal). La mediana del tiempo de supervivencia en ambos grupos de control fue de 20 días.
Las curvas de supervivencia para los dos grupos de control y los grupos de progresión del anticuerpo Ab1 (dosificado desde el día 1 del estudio) se presentan en la Figura 7.
Las curvas de supervivencia para los dos grupos de control y los grupos de regresión del anticuerpo Ab1 (dosificado desde el día 8 del estudio) se presentan en la Figura 8.
Hubo una diferencia estadísticamente significativa entre las curvas de supervivencia para los grupos de control de IgG humana policlonal (p = 0,0038) y solución salina tamponada con fosfato (p = 0,0003) y la curva de supervivencia para los seis grupos de anticuerpos Ab1. No hubo diferencias estadísticamente significativas entre los dos grupos de control (p = 0,97).
Resultados: tamaño del tumor
El tamaño del tumor en los ratones supervivientes se estimó mediante palpación. Durante los primeros 15 días del estudio, ninguno de los ratones de ningún grupo fue encontrado muerto o fue sacrificado, por lo que la comparación del tamaño de los tumores entre los grupos en estos días estuvo libre de sesgos de muestreo. No se observaron diferencias en el tamaño del tumor entre los grupos de progresión o regresión del anticuerpo Ab1 y los grupos de control hasta el día 15. La comparación del tamaño del tumor entre los ratones supervivientes en los grupos de control y de tratamiento después del inicio de la mortalidad en los controles (el día 15) no se llevó a cabo porque se presumió que el tamaño del tumor de los ratones de control supervivientes estaba sesgado y, en consecuencia, los resultados de dicha comparación no serían significativos.
Como la administración del anticuerpo Ab1 promovió la supervivencia sin ninguna reducción evidente en el tamaño del tumor, la IL- 6 en suero elevada puede contribuir a la mortalidad a través de mecanismos independientes del crecimiento del tumor. Estas observaciones apoyan la hipótesis de que el anticuerpo Ab1 puede promover la supervivencia del paciente con cáncer sin afectar directamente el crecimiento del tumor, posiblemente mejorando el bienestar general del paciente.
Resultados: Pérdida de peso
En comparación con los controles, los ratones a los que se les administró Ab1 se protegieron de la pérdida de peso. El día 18, el MPBW en los ratones de control fue del 75%, lo que corresponde a una pérdida de peso promedio del 25%. Por el contrario, el mismo día, el MPBW en los grupos de tratamiento con Ab-1 se cambió mínimamente (entre 97% y 103%). Hubo una diferencia estadísticamente significativa entre las curvas de MPBW para los controles (que recibieron IgG humana policlonal o PBS) y el grupo de dosis de 10 mg/kg (p <0,0001) o los grupos de dosis de 3 mg/kg y 30 mg/kg (p <0,0005). No hubo diferencias estadísticamente significativas entre los dos grupos de control.
Los ratones de control están demacrados en comparación con el aspecto normal del ratón tratado con Ab1. Estos resultados sugieren que Ab1 puede ser útil para prevenir o tratar la caquexia causada por IL- 6 elevada en humanos. Resultados: amiloide A en suero plasmático
La concentración media (± SEM) de amiloide A en suero plasmático frente al tiempo para los dos grupos de control y los grupos de progresión del anticuerpo Ab1 (dosificado desde el día 1 del estudio) y regresión (dosificado desde el día 8 del estudio) se presentan en la Tabla 7.
-
Figure imgf000087_0001
SAA se sobrerregula mediante la estimulación de hIL- 6 y esta respuesta se correlaciona directamente con los niveles circulantes de hIL- 6 derivados del tumor implantado. El marcador sustituto proporciona una lectura indirecta del hIL-6 activo. Por lo tanto, en los dos grupos de tratamiento descritos anteriormente hay niveles significativamente reducidos de SAA debido a la neutralización de hIL- 6 derivada de tumor. Esto respalda además el argumento de que el anticuerpo Ab1 muestra eficacia in vivo.
Ejemplo 11
Estudio 2 del modelo de caquexia RXF393
Introducción
Se realizó un segundo estudio en el modelo de caquexia RXF-393 en el que el tratamiento con anticuerpo Ab1 se inició en una etapa posterior (días 10 y 13 después del trasplante) y con una fase de tratamiento más prolongada (hasta 49 días después del trasplante). El intervalo de dosificación con el anticuerpo Ab1 se redujo de 7 a 3 días y también se midió el consumo diario de alimentos. También se intentó estandarizar los tamaños de los tumores en el momento de iniciar la dosificación con el anticuerpo Ab1.
Procedimientos
Se implantaron fragmentos de tumor RXF393 (30-40 mg) subcutáneamente en el flanco derecho de 80 ratones desnudos atímicos macho de seis semanas de edad. Se seleccionaron 20 ratones cuyos tumores habían alcanzado entre 270-320 mg de tamaño y se dividieron en dos grupos. Un grupo recibió anticuerpo Ab1 a razón de 10 mg/kg iv cada tres días y el otro grupo recibió IgG humana policlonal a razón de 10 mg/kg cada 3 días a partir de ese momento (día 10 después del trasplante). Se seleccionaron otros 20 ratones cuando el tamaño de su tumor había alcanzado un tamaño de 400-527 mg y se dividieron en dos grupos. Un grupo recibió anticuerpo Ab1 a razón de 10 mg/kg iv cada tres días y el otro grupo recibió IgG humana policlonal a razón de 10 mg/kg cada 3 días a partir de ese momento (día 13 después del trasplante). Los 40 ratones restantes no participaron más en el estudio y fueron sacrificados el día 49, cuando el tumor alcanzó 4.000 mm3 o si se debilitaron mucho (> 30% de pérdida de peso corporal).
Los animales se pesaron cada 3-4 días desde el día 1 hasta el día 49 después del trasplante. Se utilizó el porcentaje de peso corporal medio (MPBW) como parámetro principal para controlar la pérdida de peso durante el estudio. Se calculó como sigue: ((Peso corporal - Peso del tumor)/Peso corporal de referencia) x 100. El peso del tumor se midió cada 3-4 días desde el día 5 hasta el día 49 después del trasplante. Se midió el consumo de alimentos (cantidad consumida en 24 horas por peso (g) por cada grupo de tratamiento) todos los días desde el día 10 para los grupos de tumores de 270-320 mg y el día 13 para los grupos de tumores de 400-527 mg.
Resultados: Supervivencia
Las curvas de supervivencia para el anticuerpo Ab1 a razón de 10 mg/kg iv cada tres días (270-320 mg de tamaño del tumor) y para la IgG policlonal humana a razón de 10 mg/kg iv cada tres días (270-320 mg de tamaño del tumor) se presentan en la Figura 9.
La mediana de supervivencia para el anticuerpo Ab1 a razón de 10 mg/kg iv cada tres días (270-320 mg de tamaño del tumor) fue de 46 días y para la IgG humana policlonal a razón de 10 mg/kg iv cada tres días (270-320 mg de tamaño del tumor) fue de 32,5 días (p = 0,0071).
Las curvas de supervivencia para el anticuerpo Ab1 a razón de 10 mg/kg i.v. cada tres días (400-527 mg de tamaño del tumor) y para la IgG policlonal humana a razón de 10 mg/kg i.v. cada tres días (400-527 mg de tamaño del tumor) se presentan en la Figura 10. La mediana de supervivencia para el anticuerpo Ab1 a razón de 10 mg/kg i.v. cada tres días (400-527 mg de tamaño del tumor) fue de 46,5 días y para la IgG humana policlonal a razón de 10 mg/kg i.v. cada tres días (400-527 mg de tamaño del tumor) fue de 27 días (p = 0,0481).
Ejemplo 12
Evaluación farmacocinética multidosis del anticuerpo Ab1 en primates no humanos
Se dosificó el anticuerpo Ab1 en una infusión de bolo único a un solo mono cynomologous macho y hembra en solución salina tamponada con fosfato. Se extrajeron muestras de plasma a intervalos de tiempo fijos y se cuantificó el nivel de anticuerpo Ab1 mediante el uso de un ensayo ELISA de captura de antígeno. Se capturó IL- 6 biotinilada (50 j l de 3 |jg/ml) en placas de microtitulación de 96 pocillos recubiertas con estreptavidina. Las placas se lavaron y bloquearon con gelatina de piel de pescado al 0,5%. Se añadieron muestras de plasma adecuadamente diluidas y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Se retiraron los sobrenadantes y se aplicó un anticuerpo secundario conjugado anti-hFc-HRP y se dejó a temperatura ambiente.
A continuación, se aspiraron las placas y se añadió TMB para visualizar la cantidad de anticuerpo. A continuación, se determinaron los niveles específicos mediante el uso de una curva estándar. Se administró una segunda dosis de anticuerpo Ab1 el día 35 a los mismos dos monos cynomologous y el experimento se replicó usando un plan de muestreo idéntico.
Este anticuerpo aglicosilado de longitud completa humanizado expresado y purificado de Pichia pastoris muestra características comparables a la proteína expresada en mamíferos. Además, múltiples dosis de este producto muestran semividas reproducibles, lo que infiere que esta plataforma de producción no genera productos que muestren una inmunogenicidad mejorada.
Ejemplo 13
Caracterización mecanicista de octetos de proteínas de anticuerpos
La señalización de IL- 6 depende de las interacciones entre IL- 6 y dos receptores, IL-6R1 (CD126) y gp130 (transductor de señal de IL-6 ). Para determinar el mecanismo de acción del anticuerpo, se realizaron estudios mecanicistas utilizando interferometría de biocapa con un instrumento Octet QK (ForteBio; Menlo Park, CA). Los estudios se realizaron en dos configuraciones diferentes. En la primera orientación, la IL- 6 biotinilada (R&D Systems No de parte 206-IL-001MG/CF, biotinilada con el producto Pierce EZ-link sulfo-NHS-LC-LC-biotina número 21338 de acuerdo con los protocolos del fabricante) se unió inicialmente a un biosensor recubierto de estreptavidina (ForteBio número de parte 18-5006). La unión se controla como un aumento de la señal.
La IL- 6 unida al sensor se incubó luego con el anticuerpo en cuestión o con la solución diluyente sola. A continuación, el sensor se incubó con molécula de IL-6R1 soluble (R&D Systems número de producto 227-SR-025/CF). Si la molécula de IL-6R1 no se unía, se consideró que el anticuerpo bloqueaba las interacciones IL-6/IL-6R1. Estos complejos se incubaron con gp130 (R&D Systems 228-GP-010/CF) en presencia de IL-6R1 con fines de estabilidad. Si gp130 no se unía, se concluyó que el anticuerpo bloqueaba las interacciones de gp130 con IL-6.
En la segunda orientación, el anticuerpo se unió a un biosensor recubierto con un reactivo específico de Fc anti-IgG1 humana (ForteBio número de parte 18-5001). La IL- 6 se unió al anticuerpo inmovilizado y el sensor se incubó con IL-6R1. Si IL-6R1 no interaccionaba con IL-6 , entonces se concluyó que el anticuerpo de unión a IL- 6 bloqueaba las interacciones IL-6/IL-6R1. En aquellas situaciones en las que se observó anticuerpo/IL-6/IL-6R1, el complejo se incubó con gp130 en presencia de IL-6 R1. Si gp130 no interaccionaba, se concluyó que el anticuerpo bloqueaba las interacciones IL-6/gp130. Todos los estudios se realizaron en un volumen final de 200 pl, a 30 °C y 1000 rpm. Para estos estudios, todas las proteínas se diluyeron usando el tampón diluyente de muestras de ForteBio (número de parte 18-5028). Los resultados se presentan en la Tabla 8.
Tabla 8 Anticuer os anti-IL6 ue se^ unen a R1 o GP130
Figure imgf000089_0001
El anticuerpo bloquea la unión de IL6 a R1 bloquea la unión de IL6 a GP130
Ejemplo 14
Mapeo de péptidos
Con el fin de determinar el epítopo reconocido por Ab1 en IL- 6 humana, se empleó el anticuerpo en un ensayo basado en transferencia Western. La forma de IL- 6 humana utilizada en este ejemplo tenía una secuencia de 183 aminoácidos de longitud. Una biblioteca de 57 miembros de péptidos de 15 aminoácidos superpuestos que abarcan esta secuencia se sintetizó comercialmente y se unió covalentemente a una membrana de nitrocelulosa PepSpots (JPT Peptide Technologies, Berlín, Alemania). Las secuencias de los péptidos de 15 aminoácidos superpuestos se encuentran en las SEQ ID NOs: 590-646. Las transferencias se prepararon y probaron de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
Brevemente, las transferencias se humedecieron previamente en metanol, se enjuagaron en PBS y se bloquearon durante más de 2 horas en leche desnatada al 10% en PBS/Tween al 0,05% (solución de bloqueo). El anticuerpo Ab1 se usó a una dilución final de 1 mg/ml, y el anticuerpo secundario anti-humano-Kappa de ratón conjugado con HRP (Southern BioTech # 9220-05) se usó a una dilución 1:5000. Se realizaron diluciones/incubaciones de anticuerpos en solución de bloqueo. Las transferencias se desarrollaron usando reactivos avanzados Amersham ECL (GE # RPN2135) y la señal quimioluminiscente se documentó usando una cámara CCD (AlphaInnotec). La secuencia de la forma de IL- 6 humana utilizada para generar la biblioteca de péptidos se expone en la SEQ ID NO: 1.
Ejemplo 15
Ab1 tiene alta afinidad por IL- 6
Se usó resonancia de plasmón superficial para medir la velocidad de asociación (Ka), la velocidad de disociación (Kd) y la constante de disociación (KD) para Ab1 a IL- 6 de rata, ratón, perro, humano y mono cynomolgus a 25 °C (Tabla 5). La constante de disociación de la IL- 6 humana fue 4 pM, lo que indica una afinidad muy alta. Como era de esperar, la afinidad generalmente disminuyó con la distancia filogenética del ser humano. Las constantes de disociación de Ab1 para IL- 6 de mono cynomolgus, rata y ratón fueron 31 pM, 1,4 nM y 0,4 nM, respectivamente. La afinidad de Ab1 para IL- 6 de perro por debajo del límite de cuantificación del experimento.
La alta afinidad de Ab1 por IL- 6 de ratón, rata y mono cynomolgus sugiere que Ab1 puede usarse para inhibir IL- 6 de estas especies. Esta hipótesis se probó utilizando un ensayo de proliferación celular. En resumen, se utilizó la IL- 6 de cada especie para estimular la proliferación de células T1165, y se midió la concentración a la que Ab1 podía inhibir el 50% de la proliferación (IC50). La inhibición fue consistente con las constantes de disociación medidas (Tabla 6 ). Estos resultados demuestran que Ab1 puede inhibir la IL- 6 nativa de estas especies y sugieren el uso de estos organismos para el modelado in vitro o in vivo de la inhibición de IL- 6 por Ab1. Además, otros anticuerpos de IL-6 descritos en este documento pueden tener propiedades similares.
Tabla 9. Resonancia de plasmón superficial: constantes de unión promediadas determinadas a 25 °C para Ab1 ara IL- .
Figure imgf000090_0001
Tabla 10. Valores de IC50 para Ab1 contra IL- 6 humana, de mono cynomolgus, ratón, rata y perro en el n n T11 .
Figure imgf000090_0003
Ejemplo 16
Evaluación farmacocinética multidosis del anticuerpo Ab1 en voluntarios humanos sanos
Se dosificó el anticuerpo Ab1 en una única infusión de bolo en histidina y sorbitol a voluntarios humanos sanos. Se administraron dosis de 1 mg, 3 mg, 10 mg, 30 mg o 100 mg a cada individuo en grupos de dosificación que contenían de cinco a seis individuos. Se extrajeron muestras de plasma a intervalos de tiempo fijos durante hasta doce semanas. El plasma humano se recogió mediante venopunción en un tubo de recolección de vacío que contenía EDTA. El plasma se separó y se usó para evaluar los niveles circulantes de Ab1 usando un anticuerpo monoclonal específico para Ab1, como sigue. Una recubrió una placa de microtitulación de 96 pocillos durante la noche con el anticuerpo monoclonal específico para Ab1 en PBS 1X durante la noche a 4 °C. Las etapas restantes se llevaron a cabo a temperatura ambiente. Los pocillos se aspiraron y posteriormente se bloquearon usando gelatina de piel de pescado (FSG) al 0,5% (Sigma) en PBS 1X durante 60 minutos. Luego se agregaron muestras de plasma humano y se incubaron durante 60 minutos, luego se aspiraron, luego se agregaron 50 pl de IL- 6 biotinilada de 1 pg/ml a cada pocillo y se incubaron durante 60 minutos. Se aspiraron los pocillos y se añadieron 50 pl de estreptavidina-HRP (Pharmingen), diluidos 1:5.000 FSG al 0,5%/PBS, y se incubaron durante 45 minutos. El desarrollo se realizó utilizando procedimientos estándar que emplean TMB para la detección. A continuación, se determinaron los niveles mediante comparación con una curva estándar preparada en un formato comparable.
Se examinó la concentración promedio en plasma de Ab1 para cada grupo de dosificación. Las medias de AUC y Cmáx aumentaron linealmente con la dosis. Para dosis de 30 mg y superiores, la semivida de Ab1 promedio en cada grupo de dosis fue de aproximadamente 25 a 30 días. La farmacocinética se muestra en la Tabla 11.
Tabla 11. Sumario de la farmacocinética de Ab1 en voluntarios humanos sanos
Figure imgf000090_0002
Ejemplo 17
Farmacocinética de Ab1 en pacientes con cáncer avanzado
Se dosificó el anticuerpo Ab1 en una única infusión de bolo en solución salina tamponada con fosfato a cinco individuos con cáncer avanzado. Cada individuo recibió una dosis de 80 mg (n = 2) o 160 mg (n = 3) de Ab1. Se extrajeron muestras de plasma semanalmente y se cuantificó el nivel de anticuerpo Ab1 como en el Ejemplo 16. Se examinó la concentración promedio en plasma de Ab1 en estos individuos en función del tiempo. La semivida promedio de Ab1 fue de aproximadamente 31 días. Los anticuerpos anti-IL- 6 descritos en el presente documento pueden tener semividas igualmente largas.
Ejemplo 18
Ab1 tiene una semivida inesperadamente larga
En general, la semivida promedio de Ab1 fue de aproximadamente 31 días en humanos (para dosis de 10 mg y superiores) y aproximadamente 15-21 días en mono cynomolgus. La semivida de Ab1 en humanos y monos cynomolgus no tiene precedentes en comparación con las semividas de otros anticuerpos anti-IL- 6 (Tabla 11). Como se describió anteriormente, Ab1 se derivó de la humanización de un anticuerpo de conejo y se produce a partir de Pichia pastoris en forma aglicosilada. Estas características dan como resultado un anticuerpo con muy baja inmunogenicidad en humanos. Además, la falta de glicosilación evita que Ab1 interactúe con el receptor Fc o el complemento. Sin pretender limitarse a la teoría, se cree que la semivida inesperadamente larga de Ab1 es al menos parcialmente atribuible a la humanización y/o la falta de glicosilación. La secuencia y/o estructura particular de las superficies de unión al antígeno también pueden contribuir a la semivida de Ab1. Véase también el documento WO 2011/066369.
Tabla 12. Semivida de eliminación de Ab1
Figure imgf000091_0001
Ejemplo 19
Efecto de Ab1 sobre la concentración de hemoglobina, la concentración de lípidos en plasma y el recuento de neutrófilos en pacientes con cáncer avanzado
Se dosificó el anticuerpo Ab1 en una única infusión de bolo en solución salina tamponada con fosfato a ocho individuos con cáncer avanzado (NSCLC, cáncer colorrectal, colangiocarcinoma o mesotelioma). Cada individuo recibió una dosis de 80 mg, 160 mg o 320 mg de Ab1. Se extrajeron muestras de sangre justo antes de la infusión y a intervalos de tiempo fijos durante seis semanas, y se determinaron la concentración de hemoglobina, la concentración de lípidos en plasma y los recuentos de neutrófilos. La concentración promedio de hemoglobina aumentó ligeramente (Figura 11), al igual que el colesterol total y los triglicéridos (Figura 12), mientras que los recuentos medios de neutrófilos disminuyeron levemente (Figura 13).
Estos resultados demuestran además algunos de los efectos beneficiosos de la administración de Ab1 a individuos con enfermedades crónicas. Dado que la IL- 6 es la principal citocina responsable de la anemia de las enfermedades crónicas (incluida la anemia relacionada con el cáncer), la neutralización de IL- 6 por Ab1 aumenta la concentración de hemoglobina en estos individuos. De manera similar, como la IL- 6 es de importancia central en el aumento de los recuentos de neutrófilos en la inflamación, la ligera reducción observada en los recuentos de neutrófilos confirma además que Ab1 inhibe la IL-6. Finalmente, la IL- 6 causa anorexia y caquexia en estos pacientes; la neutralización de IL- 6 por Ab1 da como resultado el retorno del apetito y la reversión de la caquexia. El aumento de las concentraciones de lípidos en plasma refleja la mejora del estado nutricional de los pacientes. Tomados en conjunto, estos resultados demuestran además que Ab1 revierte eficazmente estas consecuencias adversas de IL- 6 en estos pacientes.
Ejemplo 20
Ab1 suprime la CRP en suero en voluntarios sanos y en pacientes con cáncer avanzado
Introducción
Se han identificado concentraciones de CRP en suero como un fuerte indicador de pronóstico en pacientes con ciertas formas de cáncer. Por ejemplo, Hashimoto et al., realizaron un análisis univariado y multivariado de las concentraciones de CRP en suero previas a la operación en pacientes con carcinoma hepatocelular con el fin de identificar los factores que afectan la supervivencia y la recurrencia de la enfermedad. Hashimoto et al., (2005) Cáncer 103 (9): 1856-1864. Los pacientes se clasificaron en dos grupos, aquellos con niveles de CRP en suero > 1,0 mg/dl ("el grupo positivo para CRP") y aquellos con niveles de CRP en suero <1,0 mg/dl ("el grupo negativo para CRP"). Los autores identificaron "una correlación significativa entre el nivel de CRP en suero previo a la operación y el tamaño del tumor" Id. Además, los autores encontraron que "las tasas de supervivencia general y de supervivencia libre de recurrencia en el grupo positivo para CRP fueron significativamente más bajas en comparación con las tasas en el grupo negativa para Cr P" Id. Los autores concluyeron que el nivel de CRP previo a la operación de los pacientes es un indicador predictivo independiente y significativo de mal pronóstico y recurrencia temprana en pacientes con carcinoma hepatocelular.
Otros investigadores han identificado correlaciones similares. Por ejemplo, Karakiewicz et al., determinaron que CRP en suero era un predictor independiente e informativo de la mortalidad específica por carcinoma de células renales. Karakiewicz et al., (2007) Cáncer. 110 (6 ): 1241-1247. Por consiguiente, sigue existiendo una necesidad en la técnica de procedimientos y/o tratamientos que reduzcan las concentraciones de proteína C reactiva (CRP) en suero en pacientes con cáncer, y particularmente en aquellos con cánceres avanzados.
Procedimientos
Los voluntarios sanos recibieron una infusión intravenosa (IV) única de 1 hora de 100 mg (5 pacientes), 30 mg (5 pacientes), 10 mg (6 pacientes), 3 mg (6 pacientes) o 1 mg (6 pacientes) del anticuerpo monoclonal Ab1, mientras que otros 14 voluntarios sanos recibieron placebo por vía intravenosa. Comparativamente, 2 pacientes con formas avanzadas de cáncer colorrectal recibieron una sola infusión intravenosa (IV) durante 1 hora de 80 mg del anticuerpo monoclonal Ab1. No se administraron más dosis del anticuerpo monoclonal Ab1 a la población de prueba.
Los pacientes se evaluaron antes de la administración de la dosis y, posteriormente, semanalmente durante al menos 5 semanas después de la dosis. En el momento de cada evaluación, se examinó a los pacientes para determinar la concentración en suero de CRP.
Resultados: Voluntarios sanos
Como se indicó anteriormente, los niveles de CRP en suero son un marcador de inflamación; en consecuencia, los niveles de CRP basales suelen ser bajos en individuos sanos. Los niveles bajos de CRP de base pueden dificultar la detección de una reducción adicional de los niveles de CRP. No obstante, se detectó una reducción sustancial en las concentraciones de CRP en suero en voluntarios sanos que recibieron todas las concentraciones del anticuerpo monoclonal Ab1, en comparación con los controles (Figura 14A). La reducción en los niveles de CRP en suero fue rápida, ocurriendo dentro de una semana de la administración de anticuerpos, y se prolongó, continuando al menos hasta la medición final ( 8 o 12 semanas después de la administración de anticuerpos).
Resultados: pacientes con cáncer
A cinco pacientes con cáncer avanzado (cáncer colorrectal, colangiocarcinoma o NSCLC) que tenían niveles elevados de CRP en suero se les administró 80 mg o 160 mg de Ab1. Los niveles de CRP en suero se redujeron en gran medida en estos pacientes (Figura 14B). La reducción de los niveles de CRP en suero fue rápida, con el 90% de la disminución ocurriendo dentro de una semana de la administración de Ab1, y se prolongó, continuando al menos hasta que se tomó la medición final (hasta doce semanas). En dos individuos representativos, los niveles de CRP se redujeron por debajo del intervalo de referencia normal (menos de 5-6 mg/l) en una semana. Por lo tanto, la administración de Ab1 a pacientes puede provocar una supresión rápida y sostenida de los niveles de CRP en suero.
Ejemplo 21
Ab1 mejoró la fuerza muscular, mejoró el peso y redujo la fatiga en pacientes con cáncer avanzado
Introducción
La pérdida de peso y la fatiga (y la debilidad muscular que la acompaña) son síntomas muy comunes de los pacientes con formas avanzadas de cáncer, y estos síntomas pueden empeorar a medida que el cáncer continúa progresando. La fatiga, la pérdida de peso y la debilidad muscular pueden tener efectos negativos importantes en la recuperación de los pacientes con formas avanzadas de cáncer, por ejemplo, al alterar los estilos de vida y las relaciones y afectar la voluntad o la capacidad de los pacientes para continuar con los tratamientos contra el cáncer. Los procedimientos conocidos para abordar la fatiga, la pérdida de peso y la debilidad muscular incluyen rutinas regulares de acondicionamiento físico y ejercicio, procedimientos para conservar la energía del paciente y tratamientos que abordan la fatiga y la debilidad muscular inducidas por la anemia. No obstante, sigue existiendo una necesidad en la técnica de procedimientos y/o tratamientos que mejoren la fatiga, la pérdida de peso y la debilidad muscular en pacientes con cáncer.
Procedimientos
Cuatro pacientes con formas avanzadas de cáncer [(cáncer colorrectal (2), NSCLC (1), colangiocarcinoma (1)] recibieron una única infusión intravenosa (IV) de una hora de 80 mg o 160 mg del anticuerpo monoclonal Ab1. No se administraron más dosis del anticuerpo monoclonal Ab1 a la población de prueba.
Los pacientes se evaluaron antes de la administración de la dosis y, posteriormente, durante al menos 6 semanas después de la dosis. En el momento de cada evaluación, se examinó a los pacientes para detectar lo siguiente: a) cualquier cambio de peso; b) fatiga medida mediante el cuestionario de subescala de fatiga Facit-F, una prueba médicamente reconocida para evaluar la fatiga. Véase, por ejemplo, Cella, et al., (2002) Cancer 94 (2): 528-538; Cella et al., (2002) Journal of Pain & Symptom Management 24 (6 ): 547-561); y fuerza de agarre manual (una prueba médicamente reconocida para evaluar la fuerza muscular, que generalmente emplea un dinamómetro de agarre manual).
Resultados: Cambio de peso
Los datos promediados para ambas concentraciones de dosificación (80 mg y 160 mg) del anticuerpo monoclonal Ab1 demostraron un aumento de aproximadamente 2 kilogramos de peso por paciente durante el período de 6 semanas.
Fatiga
Los datos promediados para ambas concentraciones de dosificación (80 mg y 160 mg) del anticuerpo monoclonal Ab1 demostraron un aumento en la puntuación media de la subescala FS, Facit-F de al menos aproximadamente 10 puntos en la población de pacientes durante un período de 6 semanas.
Fuerza de agarre de la mano
Los datos promediados para ambas concentraciones de dosificación (80 mg y 160 mg) del anticuerpo monoclonal Ab1 demostraron un aumento en la fuerza media de agarre de la mano de al menos aproximadamente un 10 por ciento en la población de pacientes durante un período de 6 semanas. Véase, por ejemplo, el documento WO 2011/066371.
Ejemplo 22
Ab1 para la prevención de trombosis
Estudios previos han demostrado que la administración de un anticuerpo anti-IL- 6 puede provocar una disminución del recuento de plaquetas. Emilie et al., (1994) Blood 84 (8 ): 2472-9; Blay et al., (1997) Int J Cancer 72 (3): 424-30. Estos resultados aparentemente se han visto como un indicador de peligro potencial, porque una mayor disminución en el recuento de plaquetas podría causar complicaciones tales como hemorragias. Sin embargo, los solicitantes han discernido ahora que la inhibición de IL- 6 restaura un perfil de coagulación normal, que los solicitantes predicen que evitará la trombosis. La disminución del recuento de plaquetas como resultado de la inhibición de IL- 6 no es un signo de peligro potencial, sino que refleja la restauración beneficiosa de la coagulación normal.
Se cree que el mecanismo por el cual se restaura la coagulación normal es el resultado de la interacción entre IL- 6 y la reacción de fase aguda. En respuesta a niveles elevados de IL-6 , como por ejemplo en un paciente con cáncer, el hígado produce proteínas de fase aguda. Estas proteínas de fase aguda incluyen factores de coagulación, tales como el factor II, factor V, factor VIII, factor IX, factor XI, factor XII, productos de degradación de F/fibrina, complejo trombinaantitrombina III, fibrinógeno, plasminógeno, protrombina y factor de von Willebrand. Este aumento de los factores de coagulación puede medirse directamente o puede inferirse de las mediciones funcionales de la capacidad de coagulación. Los antagonistas de IL-6 , tales como Ab1, suprimen las proteínas de fase aguda, por ejemplo, amiloide en suero (Ejemplo 10). Los solicitantes predicen ahora que esta supresión de las proteínas de fase aguda restablecerá el perfil de coagulación normal y, por lo tanto, evitará la trombosis. La restauración de la coagulación normal puede causar una ligera caída en el recuento de plaquetas, pero el paciente, no obstante, conservará la capacidad de coagulación normal y, por lo tanto, no tendrá un mayor riesgo de hemorragia. Dicho tratamiento representará una gran mejora con respecto a las terapias de anticoagulación disponibles cuya utilidad está limitada por el riesgo de efectos secundarios adversos, tales como hemorragias graves. Véase, por ejemplo, el documento WO 2011/066371.
Los solicitantes contemplan que se obtendrán los mismos efectos beneficiosos de inhibir la IL- 6 independientemente del procedimiento de inhibición. Los procedimientos adecuados para inhibir IL- 6 incluyen la administración de anticuerpos anti-IL-6 , terapia antisentido, receptor de IL- 6 soluble, ya sea individualmente o en combinaciones.
Ejemplo 23
Ab1 aumenta la concentración de albúmina en plasma en pacientes con cáncer avanzado
Introducción
Las concentraciones de albúmina en suero se reconocen como indicadores predictivos de supervivencia y/o éxito de recuperación de pacientes con cáncer. La hipoalbunemia se correlaciona fuertemente con el bajo rendimiento del paciente en numerosas formas de cáncer. Por ejemplo, en un estudio, ningún paciente que se sometiera a quimioterapia sistémica por adenocarcinoma de páncreas metastásico y que tuviera niveles de albúmina en suero inferiores a 3,5 g/dl respondió con éxito a la quimioterapia sistémica. Fujishiro et al., (2000) Hepatogastroenterology 47 (36): 1744-46 y Senior y Maroni (1999) Am. Soc. Nutr. Sci. 129: 313S-314S. En al menos un estudio, los intentos de rectificar la hipoalbuminemia en 27 pacientes con cáncer metastásico mediante la infusión intravenosa diaria de albúmina de 20 g hasta alcanzar niveles normales de albúmina en suero (> 3,5 g/dl) tuvieron poco éxito. Demirkazik et al., (2002) Proc. A.m. Soc. Clin. Oncol. 21: Abstr 2892. Por consiguiente, sigue existiendo una necesidad en la técnica de procedimientos y/o tratamientos que mejoren las concentraciones de albúmina en suero en pacientes con cáncer y aborden estados hipoalbuminémicos en pacientes con cáncer, particularmente aquellos con cánceres avanzados.
Procedimientos
Cuatro pacientes con formas avanzadas de cáncer [(cáncer colorrectal (2), NSCLC (1), colangiocarcinoma (1)] recibieron una única infusión intravenosa (IV) de una hora de 80 mg o 160 mg del anticuerpo monoclonal Ab1. No se administraron más dosis del anticuerpo monoclonal Ab1 a la población de prueba.
Se evaluó a los pacientes antes de la administración de la dosis y posteriormente durante al menos 6 semanas después de la dosis. En el momento de cada evaluación, se examinó a los pacientes para determinar la concentración de albúmina en plasma.
Resultados
Los datos promediados para ambas concentraciones de dosificación (80 mg y 160 mg) del anticuerpo monoclonal Ab1 demostraron un aumento de aproximadamente 5 g/l de concentración de albúmina en plasma por paciente durante un período de 6 semanas. Véase, por ejemplo, el documento WO 2011/066371.
Ejemplo 24
Ab1 suprime la CRP en suero en pacientes con cáncer avanzado
Introducción
Se han identificado concentraciones de CRP en suero como un fuerte indicador de pronóstico en pacientes con ciertas formas de cáncer. Por ejemplo, Hashimoto et al., realizaron un análisis univariado y multivariado de las concentraciones en sueros de CRP previas a la operación en pacientes con carcinoma hepatocelular con el fin de identificar los factores que afectan la supervivencia y la recurrencia de la enfermedad. Hashimoto et al., (2005) Cancer 103 (9): 1856-1864. Los pacientes se clasificaron en dos grupos, aquellos con niveles de CRP en suero > 1,0 mg/dl ("el grupo positivo para CRP") y aquellos con niveles de CRP en suero <1,0 mg/dl ("el grupo negativo para CRP"). Los autores identificaron "una correlación significativa entre el nivel de CRP en suero previo a la operación y el tamaño del tumor" Id. Además, los autores encontraron que "las tasas de supervivencia general y de supervivencia libre de recurrencia en el grupo positivo para CRP fueron significativamente más bajas en comparación con las tasas en el grupo negativo para Cr P" Id. Los autores concluyeron que el nivel de CRP previo a la operación de los pacientes es un indicador predictivo independiente y significativo de mal pronóstico y recurrencia temprana en pacientes con carcinoma hepatocelular.
Otros investigadores han identificado correlaciones similares. Por ejemplo, Karakiewicz et al., determinaron que la CRP en suero era un predictor independiente e informativo de la mortalidad específica por carcinoma de células renales. Karakiewicz et al., (2007) Cancer 110 (6 ): 1241-1247. Por consiguiente, sigue existiendo una necesidad en la técnica de procedimientos y/o tratamientos que reduzcan las concentraciones de proteína C reactiva (CRP) en suero en pacientes con cáncer, y particularmente en aquellos con cánceres avanzados.
Procedimientos
Se dividieron ciento veinticuatro pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) en 4 grupos de tratamiento. Los pacientes de un grupo recibieron una infusión intravenosa (IV) durante 1 hora de placebo (n = 31), 80 mg (n = 29), 160 mg (n = 32) o 320 mg (n = 32) del anticuerpo monoclonal Ab1 cada 8 semanas durante un período de 24 semanas para un total de 3 dosis. La concentración de CRP se cuantificó mediante un ensayo inmunoturbidimétrico mejorado con partículas de proteína C reactiva utilizando anticuerpos anti-CRP unidos al látex (es decir, Roche CRP Tinaquant®). En resumen, se recogió aproximadamente 1,0 ml de suero de muestra del paciente y se almacenó en un tubo de recolección plástico. La muestra se colocó en un tampón apropiado y se añadió a la muestra anticuerpo anti-CRP acoplado a micropartículas de látex para iniciar la reacción. Estos anticuerpos anti-CRP con micropartículas de látex conjugadas reaccionan con el antígeno en la muestra para formar un complejo antígeno/anticuerpo. Después de la aglutinación, esta se midió turbidimétricamente usando un analizador Roche/Hitachi Modular P.
Los pacientes se evaluaron antes de la administración de la dosis y, posteriormente, en las semanas 2, 4, 8 y 12. En el momento de cada evaluación, se examinó a los pacientes para determinar la concentración de CRP en suero.
Resultados
Los datos promediados para cada concentración de dosificación (placebo, 80 mg, 160 mg y 320 mg) del anticuerpo monoclonal Ab1 se representan en la Figura 15A. Todos los niveles de dosificación del anticuerpo Ab1 demostraron una caída inmediata en las concentraciones de CRP en relación con el placebo durante un período de 12 semanas. Los niveles de CRP mostraron un gran avance a las 8 semanas después de la dosificación. Los niveles de CRP cayeron por debajo de 5 mg/l en la semana 12. Los valores medianos de CRP demostraron disminuciones rápidas y sostenidas para todas las concentraciones de dosificación en relación con el placebo (Figura 15B). Por lo tanto, la administración de Ab1 a pacientes con cáncer avanzado puede provocar una supresión rápida y sostenida de los niveles de CRP en suero.
Ejemplo 25
Ab1 suprime la CRP en suero en pacientes con cánceres avanzados
Introducción
Se han identificado concentraciones de CRP en suero como un fuerte indicador de pronóstico en pacientes con ciertas formas de cáncer. Por ejemplo, Hashimoto et al., realizaron un análisis univariado y multivariado de las concentraciones en sueros de CRP previas a la operación en pacientes con carcinoma hepatocelular con el fin de identificar los factores que afectan la supervivencia y la recurrencia de la enfermedad. Hashimoto et al., (2005) Cancer 103 (9): 1856-1864. Los pacientes se clasificaron en dos grupos, aquellos con niveles de CRP en suero > 1,0 mg/dl ("el grupo positivo para CRP") y aquellos con niveles de CRP en suero <1,0 mg/dL ("el grupo negativo para CRP"). Los autores identificaron "una correlación significativa entre el nivel de CRP en suero previo a la operación y el tamaño del tumor" Id. Además, los autores encontraron que "las tasas de supervivencia general y de supervivencia libre de recurrencia en el grupo positivo para CRP fueron significativamente más bajas en comparación con las tasas en el grupo negativo para Cr P ". Id. Los autores concluyeron que el nivel de CRP previo a la operación de los pacientes es un indicador predictivo independiente y significativo de mal pronóstico y recurrencia temprana en pacientes con carcinoma hepatocelular.
Otros investigadores han identificado correlaciones similares. Por ejemplo, Karakiewicz et al., determinaron que la CRP en suero era un predictor independiente e informativo de la mortalidad específica por carcinoma de células renales. Karakiewicz et al., (2007) Cancer 110 (6 ): 1241-1247. Por consiguiente, sigue existiendo una necesidad en la técnica de procedimientos y/o tratamientos que reduzcan las concentraciones de proteína C reactiva (CRP) en suero en pacientes con cáncer, y particularmente en aquellos con cánceres avanzados.
Procedimientos
Ocho pacientes con diversas formas de cáncer avanzado [(colorrectal (3), NSCLC (1), colangio (1) y mesotelioma (2)] recibieron una única infusión intravenosa de 1 hora de 80 mg (2 pacientes), 160 mg (3 pacientes) o 320 mg (3 pacientes) del anticuerpo monoclonal Ab1. No se administraron más dosis del anticuerpo monoclonal Ab1 a la población de prueba.
Se evaluó a los pacientes antes de la administración de la dosis y posteriormente de forma semanal durante al menos 8 semanas después de la dosis. En el momento de cada evaluación, se examinó a los pacientes para determinar la concentración en suero de CRP. La concentración de CRP se cuantificó mediante un ensayo inmunoturbidimétrico mejorado con partículas de proteína C reactiva utilizando anticuerpos anti-CRP unidos al látex (es decir, Roche CRP Tinaquant®). En resumen, se recogió aproximadamente 1 ,0 ml de suero de muestra del paciente y se almacenó en un tubo de recolección de plástico. La muestra se colocó en un tampón apropiado y se añadió a la muestra anticuerpo anti-CRP acoplado a micropartículas de látex para iniciar la reacción. Estos anticuerpos anti-CRP con micropartículas de látex conjugadas reaccionan con el antígeno en la muestra para formar un complejo antígeno/anticuerpo. Después de la aglutinación, esta se midió turbidimétricamente usando un analizador Roche/Hitachi Modular P.
Resultados
Los niveles de CRP en suero se redujeron en gran medida en todos los pacientes estudiados (Figura 16). La reducción de los niveles de CRP en suero fue rápida, con aproximadamente el 90% de la disminución ocurriendo dentro de una semana de la administración de Ab1, y los niveles disminuidos prolongados continuaron al menos hasta que se tomó la medición final (hasta doce semanas). En todos los casos, excepto en un paciente con cáncer colorrectal, los niveles de CRP cayeron al intervalo de referencia normal o por debajo de él (menos de 5-6 mg/l) en una semana. El paciente con cáncer colorrectal alcanzó niveles normales similares en la semana 4 del estudio. Por lo tanto, la administración de Ab1 a pacientes con cáncer avanzado puede provocar una supresión rápida y sostenida de los niveles de CRP en suero.
Ejemplo 26
Ab1 suprime la CRP en suero en pacientes con artritis reumatoide
Introducción
Se han identificado concentraciones en sueros de CRP como un fuerte indicador de pronóstico en pacientes con artritis reumatoide. Los pacientes que padecían artritis reumatoide con altos niveles de CRP demostraron un deterioro casi universal. Amos et al., (1977) Hno. Medicina. J. 1: 195-97. Por el contrario, los pacientes con niveles bajos de CRP no mostraron progresión de la enfermedad, lo que sugiere que es necesario mantener niveles bajos de CRP para tratar eficazmente la artritis reumatoide. Id. El seguimiento de la CRP durante los regímenes de tratamiento de la artritis reumatoide con oro, D-penicilamina, cloroquina o dapsona indicó que el deterioro radiológico se impidió después de los primeros 6 meses de tratamiento cuando los niveles de CRP se controlaron de manera constante. Dawes et al., (1986) Rheumatology 25: 44-49. Se identificó una correlación muy significativa entre la producción de CRP y la progresión radiológica. van Leeuwen et al., (1997) Rheumatology 32 (Suplemento 3): 9-13. Otro estudio reveló que para los pacientes con artritis reumatoide activa, la supresión de la CRP anormalmente elevada condujo a una mejora en las métricas de las pruebas funcionales, mientras que la elevación sostenida de la CRP se asoció con un deterioro en las mismas métricas. Devlin et al., (1997) J. Rheumatol. 24: 9-13. No se observó ningún deterioro adicional sin una nueva elevación de la CRP, lo que indica que la supresión de la CRP es un candidato viable para el tratamiento de la artritis reumatoide. Id. Por consiguiente, sigue existiendo una necesidad en la técnica de procedimientos y/o tratamientos que reduzcan las concentraciones de proteína C reactiva (CRP) en suero en pacientes con artritis reumatoide.
Procedimientos
Ciento veintisiete pacientes con artritis reumatoide activa y CRP >10 mg/l se dividieron en 4 grupos de tratamiento. Los pacientes de un grupo recibieron una infusión intravenosa (IV) durante 1 hora de placebo (n = 33), 80 mg (n = 32), 160 mg (n = 34) o 320 mg (n = 28) de anticuerpo monoclonal Ab1, una vez al comienzo del ensayo de 16 semanas y nuevamente en la semana 8. La concentración de CRP se cuantificó mediante un ensayo inmunoturbidimétrico mejorado con partículas de proteína C reactiva usando anticuerpos anti-CRP unidos al látex (es decir, Roche CRP Tinaquant®). En resumen, se recogió aproximadamente 1 ,0 ml de suero de muestra del paciente y se almacenó en un tubo de recolección plástico. La muestra se colocó en un tampón apropiado y se añadió a la muestra anticuerpo anti-CRP acoplado a micropartículas de látex para iniciar la reacción. Estos anticuerpos anti-CRP con micropartículas de látex conjugadas reaccionan con el antígeno en la muestra para formar un complejo antígeno/anticuerpo. Después de la aglutinación, esta se midió turbidimétricamente usando un analizador Roche/Hitachi Modular P. Los datos sobre la concentración de CRP se recopilaron cada semana durante las primeras 4 semanas, cada dos semanas entre las semanas 4 y 12, y al final de la prueba en la semana 16.
Resultados
Los niveles de CRP en suero se redujeron en gran medida en todos los pacientes estudiados (Figura 17). La reducción de los niveles de CRP en suero fue rápida, con una reducción inmediata de los niveles de CRP en relación con el placebo dentro de una semana de la administración de Ab1, y los niveles disminuidos prolongados continuaron al menos hasta que se tomó la medición final (hasta dieciséis semanas). En todos los casos, los niveles de CRP cayeron al nivel o por debajo del intervalo de referencia normal (menos de 5-6 mg/l) en una semana. Por lo tanto, la administración de Ab1 a pacientes con artritis reumatoide puede provocar una supresión rápida y sostenida de los niveles de CRP en suero y presenta un régimen de tratamiento eficaz.
Ejemplo 27
Ab1 aumenta la hemoglobina en pacientes con cáncer avanzado
Se dosificó el anticuerpo Ab1 en 80 mg, 160 mg o 320 mg de Ab1 en solución salina tamponada con fosfato a 93 individuos con carcinoma de pulmón de células no pequeñas. Al grupo de placebo de 31 individuos con carcinoma de pulmón de células no pequeñas se le administró solo solución salina tamponada con fosfato. Se extrajeron muestras de sangre justo antes de la dosificación (semana cero) y a las dos, cuatro, ocho y doce semanas, y se determinó la concentración de hemoglobina. La concentración media de hemoglobina aumentó para los que recibieron el anticuerpo Ab1, mientras que la concentración media de hemoglobina de los que recibieron placebo no aumentó después de doce semanas en comparación con la concentración justo antes de la dosificación (semana cero) (Figuras 18A y 18B).
Un subconjunto de la población de estudio comenzó el estudio con niveles bajos de hemoglobina, definidos como una concentración de hemoglobina inicial por debajo de 11 g/l. La concentración media de hemoglobina aumentó por encima de 11 g/l después de ocho semanas para los que recibieron el anticuerpo Ab1 en dosis de 160 mg y 320 mg, mientras que la concentración media de hemoglobina de los que recibieron el anticuerpo Ab1 en dosis de 80 mg o placebo no aumentó por encima de 11 g/l después de ocho semanas (Figura 18C).
Estos resultados demuestran además algunos de los efectos beneficiosos de la administración de Ab1 a individuos con enfermedades crónicas. Dado que la IL- 6 es la principal citocina responsable de la anemia de las enfermedades crónicas (incluida la anemia relacionada con el cáncer), la neutralización de IL- 6 por Ab1 aumenta la concentración de hemoglobina en estos individuos.
Ejemplo 28
Ab1 aumenta la hemoglobina en pacientes con artritis reumatoide
Se analizaron los niveles de hemoglobina en pacientes con artritis reumatoide durante el tratamiento con anticuerpo Ab1. El anticuerpo Ab1 se dosificó a 80 mg, 160 mg o 320 mg en solución salina tamponada con fosfato a 94 individuos con artritis reumatoide. Al grupo de placebo de 33 individuos con artritis reumatoide se le administró solo solución salina tamponada con fosfato. Se extrajeron muestras de sangre justo antes de la dosificación (semana cero), y a la una, dos, tres, cuatro, seis, ocho, diez, doce y dieciséis semanas, y se determinó la concentración de hemoglobina. La concentración media de hemoglobina aumentó para los que recibieron el anticuerpo Ab1, mientras que la concentración media de hemoglobina de los que recibieron placebo no aumentó apreciablemente después de dieciséis semanas en comparación con la concentración justo antes de la dosificación (semana cero) (Figura 19).
Estos resultados demuestran además algunos de los efectos beneficiosos de la administración de Ab1 a individuos con enfermedades crónicas. Dado que la IL- 6 es la principal citocina responsable de la anemia de las enfermedades crónicas (incluida la anemia relacionada con el cáncer), la neutralización de IL- 6 por Ab1 aumenta la concentración de hemoglobina.
Ejemplo 29
Ab1 aumenta la albúmina en pacientes con cáncer avanzado
Introducción
Las concentraciones de albúmina en suero se reconocen como indicadores predictivos de supervivencia y/o éxito de recuperación de pacientes con cáncer. La hipoalbuminemia se correlaciona fuertemente con el bajo desempeño del paciente en numerosas formas de cáncer. Por ejemplo, en un estudio, ningún paciente que se sometiera a quimioterapia sistémica para adenocarcinoma de páncreas metastásico y que tuviera niveles de albúmina en suero inferiores a 3,5 g/dl respondió con éxito a la quimioterapia sistémica. Fujishiro et al., (2000) Hepatogastroenterology 47 (36): 1744-46. Los autores concluyen que "los pacientes con ... hipoalbuminemia ... podrían ser candidatos inapropiados para la quimioterapia sistémica y podrían ser tratados con otros enfoques experimentales o cuidados de apoyo". Id.
De manera similar, Senior y Maroni afirman que "La reciente apreciación de que la hipoalbuminemia es el predictor más poderoso de mortalidad en la enfermedad renal en etapa terminal resalta la importancia crítica de asegurar una ingesta adecuada de proteínas en esta población de pacientes". Senior y Maroni (1999) Am. Soc. Nutr. Sci. 129: 313S-314S.
En al menos un estudio, los intentos de rectificar la hipoalbuminemia en 27 pacientes con cáncer metastásico mediante una infusión intravenosa diaria de albúmina de 20 g hasta alcanzar niveles normales de albúmina en suero (> 3,5 g/dl) tuvieron poco éxito. Los autores señalan que "la infusión de albumina para los pacientes con cáncer en etapa avanzada tiene un valor limitado en la práctica clínica. Los pacientes con PS 4 e hipoalbuminemia tienen un peor pronóstico". Demirkazik et al., (2002) Proc. A.m. Soc. Clin. Oncol. 21: Abstr 2892.
Por consiguiente, sigue existiendo una necesidad en la técnica de procedimientos y/o tratamientos que mejoren las concentraciones de albúmina en suero en pacientes con cáncer y aborden estados hipoalbuminémicos en pacientes con cáncer, particularmente aquellos con cánceres avanzados.
Procedimientos
Se dosificó el anticuerpo Ab1 a 80 mg, 160 mg o 320 mg de Ab1 en solución salina tamponada con fosfato a 93 individuos con carcinoma de pulmón de células no pequeñas. Cada individuo recibió una dosis. El grupo de placebo de 31 individuos con carcinoma de pulmón de células no pequeñas se le administró solo solución salina tamponada con fosfato. Se extrajeron muestras de sangre justo antes de la dosificación (semana cero) y a las dos, cuatro, ocho y doce semanas, y se determinó la concentración de albúmina.
Resultados
La concentración media de albúmina aumentó para los que recibieron el anticuerpo Ab1, mientras que la concentración media de albúmina de los que recibieron placebo no aumentó después de doce semanas en comparación con la concentración justo antes de la dosificación (semana cero) (Figura 20A). El cambio de los valores de albúmina basales para todos los grupos de concentración de dosis se representa en la Figura 20B.
Un subconjunto de la población de estudio comenzó el estudio con niveles bajos de albúmina, definidos como una concentración de albúmina inicial menor o igual a 35 g/l. La concentración media de albúmina inicialmente aumentó con todas las dosis de anticuerpo Ab1 sobre el placebo, pero solo los pacientes que recibieron 160 mg o 320 mg demostraron niveles sostenidos de albúmina por encima de 35 g/l durante 8 semanas del estudio (Figura 20C). El grupo de dosis de 80 mg demostró un aumento inicial, pero disminuyó gradualmente después de la semana 2 y nunca se elevó por encima de 35 g/l durante las 8 semanas en las que hubo datos disponibles. Id.
Ejemplo 30
Ab1 mejoró el peso y redujo la fatiga en pacientes con cáncer avanzado
Introducción
La pérdida de peso y la fatiga son síntomas muy comunes de los pacientes con formas avanzadas de cáncer y estos síntomas pueden empeorar a medida que el cáncer continúa progresando. La fatiga y la pérdida de peso pueden tener efectos negativos importantes en la recuperación de los pacientes con formas avanzadas de cáncer, por ejemplo, al alterar los estilos de vida y las relaciones y afectar la voluntad o la capacidad de los pacientes para continuar con los tratamientos contra el cáncer. Los procedimientos conocidos para abordar la fatiga y la pérdida de peso incluyen rutinas regulares de gimnasio y ejercicio, procedimientos para conservar la energía del paciente y tratamientos que abordan la fatiga inducida por la anemia. No obstante, sigue existiendo una necesidad en la técnica de procedimientos y/o tratamientos que mejoren la fatiga y la pérdida de peso en pacientes con cáncer.
Procedimientos
Se dividieron ciento veinticuatro pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) en 4 grupos de tratamiento. Los pacientes de un grupo recibieron una infusión intravenosa (IV) durante 1 hora de placebo (n = 31), 80 mg (n = 29), 160 mg (n = 32) o 320 mg (n = 32) de anticuerpo monoclonal Ab1 cada 8 semanas durante un período de 24 semanas para un total de 3 dosis.
Se evaluó a los pacientes antes de la administración de la dosis y, posteriormente, durante al menos 12 semanas después de la dosis. En el momento de cada evaluación, se examinó a los pacientes para detectar lo siguiente: cualquier cambio de peso; y la fatiga medida mediante el cuestionario de la subescala de fatiga Facit-F, una prueba médicamente reconocida para evaluar la fatiga. Véase, por ejemplo, Cella, et al., (2002) Cancer 94 (2): 528-538; Cella et al., (2002) Revista de manejo del dolor y los síntomas 24 (6 ): 547-561.
Resultados
Cambio de peso
Los datos de cambio de peso promedio de cada grupo de concentración de dosis (placebo, 80 mg, 160 mg y 320 mg) del anticuerpo monoclonal Ab1 durante 12 semanas. El cambio porcentual promedio en el peso corporal de cada concentración de dosis. Los datos de masa corporal magra promediados para los grupos de concentración de dosis.
Fatiga
La fatiga promedio de cada grupo de concentración de dosis (placebo, 80 mg, 160 mg y 320 mg) del anticuerpo monoclonal Ab1 demostró aumentos en la puntuación media de la subescala FS Facit-F para algunos de los grupos de concentración de dosis en la población de pacientes durante el período de 8 semanas.
Ejemplo 31
Ab1 disminuye los niveles de dímero D en pacientes con cáncer avanzado
Introducción
Las concentraciones de dímero D se reconocen como herramientas de diagnóstico útiles para predecir los riesgos de eventos trombóticos en pacientes. Adam et al., (2009) Blood 113: 2878-87. Los pacientes que son negativos para el dímero D tienen una probabilidad baja de trombosis. Por ejemplo, el análisis del dímero D puede descartar la sospecha de trombosis venosa profunda de las extremidades inferiores en los pacientes. Wells et al., (2003) N. Engl. J. Med.
349: 1227-35. La evaluación clínica en combinación con la prueba del dímero D negativo puede reducir eficazmente la incidencia de embolia pulmonar al 0,5%. Van Belle et al., (2006) JAMA 295: 172-79; Kruip et al., (2002) Arch. Inter. Med. 162: 1631-35; Wells et al., (2001) Ann. Intern. Med. 135: 98-107.
El análisis del dímero D puede tener utilidad para seguir el progreso del tratamiento de los trastornos de la coagulación. Un estudio indicó que el tratamiento de anticoagulación para la tromboembolia venosa aguda resultó en una disminución gradual de las concentraciones de dímero D. Adam et al., (2009) Blood 113: 2878-87; Schutgens et al., (2004) J. Lab. Clin. Med. 144: 100-107. Este descubrimiento llevó a la conclusión de que la monitorización de los niveles de dímero D podría utilizarse para evaluar la respuesta al tratamiento. Adam, en 2883.
Para pacientes con cáncer, el análisis del dímero D puede tener un significado adicional, ya que el cáncer aumenta la prevalencia de trombosis. Adam et al., (2009) Blood 113: 2878-87. Un estudio con pacientes oncológicos indicó que las concentraciones de dímero D tienen un alto valor predictivo negativo y una alta sensibilidad en el diagnóstico de embolia pulmonar. King et al., (2008) Radiology 247: 854-61. La trombosis venosa profunda se puede excluir de manera similar para pacientes con cáncer con baja probabilidad de desarrollar trombosis venosa profunda y una prueba negativa para dímero D, aunque esta combinación es menos probable para pacientes oncológicos. Lee et al., (2008) Tromb. Res. 123: 177-83. Puede ser necesario un umbral más alto para un resultado negativo de dímero D en pacientes con cáncer. Righini et al., (2006) Haemost. 95: 715-19.
En consecuencia, sigue existiendo una necesidad en la técnica de procedimientos y/o tratamientos de trombosis que mejoren las concentraciones de dímero D en pacientes con cáncer y aborden estados elevados de dímero D en pacientes con cáncer, particularmente aquellos con cánceres avanzados.
Procedimientos
Ciento veinticuatro pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) se dividieron en 4 grupos de tratamiento. Los pacientes de un grupo recibieron una infusión intravenosa (IV) durante 1 hora de placebo (n = 31), 80 mg (n = 29), 160 mg (n = 32) o 320 mg (n = 32) del anticuerpo monoclonal Ab1 cada 8 semanas durante un período de 24 semanas para un total de 3 dosis. Se recogieron datos sobre la concentración de dímero D durante las primeras 8 semanas de tratamiento. La concentración de datos de dímero D se cuantificó mediante un ensayo inmunoturbidimétrico de dímero D. Brevemente, el ensayo se basa en el cambio de turbidez de una suspensión de micropartículas que se mide por fotometría. Se recogieron aproximadamente 1,5 ml de plasma de citrato de sodio de muestra del paciente y se almacenaron en un tubo de recolección plástico. Se mezcló una suspensión de micropartículas de látex, recubiertas por enlace covalente con anticuerpos monoclonales específicos para el dímero D, con el plasma de prueba cuyo nivel de dímero D se iba a analizar. Las reacciones antígeno-anticuerpo que conducen a una aglutinación de las micropartículas de látex indujeron un aumento de la turbidez del medio de reacción. Este aumento de la turbidez se reflejó en un aumento de la absorbancia, esta última medida fotométricamente con un analizador STAGO STA. El aumento de la absorbancia fue función del nivel de dímero D presente en la muestra de prueba.
Resultados
Los datos promediados para cada concentración de dosificación (placebo, 80 mg, 160 mg y 320 mg) del anticuerpo monoclonal Ab1. Todos los niveles de dosificación del anticuerpo Ab1 demostraron una caída en los niveles de dímero D sobre el placebo durante un período de 8 semanas. Véase el documento WO 2011/066371.
Ejemplo 32
Eficacia y seguridad de Ab1 en pacientes con NSCLC avanzado
El objetivo principal de este estudio fue determinar la eficacia y seguridad de ALD518 o Ab1 humanizado en pacientes con NSCLC avanzado.
Procedimientos
Se dosificaron 124 pacientes (pts) con NSCLC, ECOG 0-3, pérdida de peso en los 3 meses anteriores de > 5% del peso corporal, hemoglobina (Hb) > 7 g/dl y proteína C reactiva (CRP) > 10 mg/l. Los pacientes se asignaron al azar a 1 de 4 grupos (n~30/grupo). Se administraron 80 mg, 160 mg o 320 mg de placebo o ALD518 por vía intravenosa cada 8 semanas. Los pacientes fueron seguidos durante 24 semanas. Los datos incluyeron hematología, química clínica, CRP y eventos adversos (EA).
Resultados
29 pacientes completaron los tratamientos y evaluaciones del estudio, 38 no completaron cada visita, 52 murieron de enfermedad progresiva y 5 se retiraron debido a eventos adversos. No hubo toxicidades limitantes de la dosis (DLT) o reacciones a la infusión. 84 pacientes tenían EA graves, de los cuales 1 se consideró posiblemente relacionado con la administración de ALD518 (hemorragia rectal). Los valores medios (± DE) para Hb, hematocrito (Hct), Hb corpuscular media (MCH) y albúmina son los siguientes:
T l 1 : P r m r líni m i r ALD 1 A l fr n l
Figure imgf000100_0001
38/93 pts tratados con ALD518 y 10/31 que recibieron placebo tienen una Hb previa a la dosis < 11 g/dl. 24 de estos pts con ALD518 y 7 de estos pts con placebo permanecieron en el estudio en la semana 4. 14/24 pts con ALD518 y 0/7 con placebo habían elevado su Hb de < 11g/dl a > 12g/dl.
Conclusión
El ALD518 aumentó la Hb, Hct, MCH y la albúmina en los pacientes con NSCLC y elevó la Hb a > 12 g/dl en el 58% de los pacientes con una Hb < 11 g/dl al inicio. Esto indica además que ALD518 se puede administrar como un agente estimulante no eritropoyéti
Ejemplo 33
Ab1 logró ACR 20/50/70 en pacientes con artritis reumatoide
Introducción
La artritis reumatoide es un trastorno inflamatorio sistémico crónico que ataca principalmente la membrana sinovial de las articulaciones. La enfermedad causa una inflamación dolorosa y potencialmente incapacitante, y el inicio suele ocurrir entre los 40 y 50 años de edad. La interpretación de la eficacia del tratamiento farmacológico en la artritis reumatoide se ve dificultada por la gran cantidad de herramientas de evaluación subjetiva y objetiva que se han puesto a disposición a lo largo de los años. El Colegio Americano de Reumatología ("ACR") publicó un conjunto estandarizado de medidas para la artritis reumatoide para facilitar la evaluación de la mejoría de la enfermedad en ensayos clínicos. Felson et al., (1993) Arthritis & Rheumatism 36: 729-40.
Procedimientos
Ciento veintisiete pacientes con artritis reumatoide activa y CRP >10 mg/l se dividieron en 4 grupos de tratamiento. Los pacientes de un grupo recibieron una infusión intravenosa (IV) durante 1 hora de placebo (n = 33), 80 mg (n = 32), 160 mg (n = 34) o 320 mg (n = 28) de anticuerpo monoclonal Ab1, una vez al comienzo de la prueba de 16 semanas y nuevamente en la semana 8. Los datos sobre la concentración de CRP se recopilaron cada semana durante las primeras 4 semanas, cada dos semanas entre las semanas 4 y 12, y al final de la prueba en la semana 16.
Se emplearon evaluaciones de acuerdo con los protocolos estandarizados del Colegio Americano de Reumatología para determinar el porcentaje de mejora de los pacientes durante el ensayo clínico y fueron realizadas por una persona entrenada en la técnica ordinaria para evaluar la artritis reumatoide. La evaluación se basó en medidas de actividad, incluido el recuento de articulaciones sensibles, el recuento de articulaciones inflamadas, la evaluación del dolor del paciente, las evaluaciones globales del paciente y del médico de la actividad de la enfermedad y la evaluación de laboratorio de la velocidad de sedimentación de eritrocitos o el nivel de CRP. Id. La evaluación del dolor del paciente se basó en el Índice de Discapacidad del Cuestionario de Evaluación de Salud de Stanford (HAQ DI). Los pacientes que logran un aumento del 20 % en las medidas de actividad para la artritis reumatoide durante un ensayo clínico se clasifican como los que logran una ACR 20. De manera similar, los pacientes que logran mejoras del 50% y 70% se clasifican como ACR 50 y ACR 70, respectivamente.
Resultados
Una porción significativa de pacientes que padecían artritis reumatoide alcanzaron ACR 20 o más durante el curso del estudio. Véase la Tabla 13. Los pacientes observaron una mejora rápida en los sistemas durante las primeras 4 semanas del estudio, así como una mejora continua y constante durante el transcurso de la evaluación de 16 semanas. Los mejores resultados fueron exhibidos por pacientes que recibieron el nivel de dosis de 320 mg, con un 43% que alcanzó el estado ACR 70 durante el estudio.
Tabla 14: Porcentaje de pacientes que lograron ACR 20/50/70 en la semana 16: imputación de no r n r MITT
Figure imgf000101_0001
El análisis de los componentes individuales de la evaluación del ACR demostró ganancias en cada componente. Las puntuaciones HAQ DI demostraron un cambio clínicamente significativo sobre el placebo durante el curso de la evaluación. Los niveles en sueros de CRP se redujeron considerablemente en todos los pacientes estudiados. La reducción de los niveles de CRP en suero fue rápida, con una reducción inmediata de los niveles de CRP en relación con el placebo dentro de una semana de la administración de Ab1, y los niveles disminuidos prolongados continuaron al menos hasta que se tomó la medición final (hasta dieciséis semanas). En todos los casos, los niveles de CRP cayeron al nivel o por debajo del intervalo de referencia normal (menos de 5-6 mg/l) en una semana. Por lo tanto, la administración de Ab1 puede producir una mejora rápida y sostenida en los pacientes con artritis reumatoide, como lo demuestra la mejora significativa en las puntuaciones de ACR durante la evaluación clínica, y presenta un régimen de tratamiento eficaz. Véase también el documento WO 2011/066371.
Ejemplo 34
Ab1 logró mejores puntuaciones de DAS28 y EULAR en pacientes con artritis reumatoide
Introducción
La artritis reumatoide es un trastorno inflamatorio sistémico crónico que ataca principalmente la membrana sinovial de las articulaciones. La enfermedad causa una inflamación dolorosa y potencialmente incapacitante, y el inicio suele ocurrir entre los 40 y 50 años de edad. La interpretación de la eficacia del tratamiento farmacológico en la artritis reumatoide se ve dificultada por la gran cantidad de herramientas de evaluación subjetiva y objetiva que se han puesto a disposición a lo largo de los años. El Colegio Americano de Reumatología ("ACR") publicó un conjunto estandarizado de medidas para la artritis reumatoide para facilitar la evaluación de la mejoría de la enfermedad en ensayos clínicos. Felson et al., (1993) Arthritis & Rheumatism 36: 729-40.
La actividad inflamatoria asociada con la artritis reumatoide se mide usando numerosas variables a través de criterios de respuesta validados tales como la puntuación de actividad de la enfermedad (DAS), DAS28 y EULAR. La DAS es un índice clínico de la actividad de la enfermedad artritis reumatoide que combina información de articulaciones inflamadas, articulaciones sensibles, respuesta de fase aguda y salud general. Fransen et al., (2005) Clin. Expor ejemplo Rheumatol. 23 (Suplemento 39): S93-S99. La DAS 28 es un índice similar a la DAS original, pero utiliza un recuento de 28 articulaciones sensibles (intervalo 0-28), un recuento de 28 articulaciones inflamadas (intervalo 0-28), ESR (velocidad de sedimentación de eritrocitos) y una evaluación opcional del estado general de salud en una escala analógica visual (intervalo 0-100). Id. Los criterios de respuesta de la Liga Europea contra el Reumatismo (EULAR) clasifican a los pacientes usando la cantidad individual de cambio en la DAS y el valor DAS (bajo, moderado, alto) alcanzado en una de las siguientes clasificaciones: Bueno; Moderado; o no responde. Id.
Procedimientos
Ciento veintisiete pacientes con artritis reumatoide activa se dividieron en 4 grupos de tratamiento. Los pacientes de un grupo recibieron una infusión intravenosa (IV) durante 1 hora de placebo (n = 33), 80 mg (n = 32), 160 mg (n = 34) o 320 mg (n = 28) de anticuerpo monoclonal Ab1, una vez al comienzo de la prueba de 16 semanas y nuevamente en la semana 8. Los datos sobre las puntuaciones DAS28 y EULAR se recopilaron cada semana durante las primeras 4 semanas, cada dos semanas entre las semanas 4 y 12, y al final de la prueba en la semana 16. Se empleó la evaluación de acuerdo con los protocolos estandarizados DAS28 y EULAR para determinar las puntuaciones respectivas de los pacientes durante el ensayo clínico y fue realizada por una persona entrenada en la técnica ordinaria de evaluar la artritis reumatoide.
Resultados
Los pacientes que recibieron 80 mg, 160 mg o 320 mg de Ab1 demostraron puntuaciones DAS28 mejoradas en relación con los pacientes que recibieron placebo en el transcurso de 16 semanas, como se presenta en la Figura 62 como un cambio medio desde la puntuación DAS28 inicial. Además, un porcentaje significativo de pacientes que recibieron 80 mg, 160 mg o 320 mg de Ab1 lograron clasificaciones "Buena" o "Moderada" en relación con los pacientes que recibieron placebo en el transcurso de 16 semanas. Por lo tanto, la administración de Ab1 puede dar como resultado una mejora en las puntuaciones DAS28 y EULAR en la artritis reumatoide en comparación con los pacientes que reciben placebo. Véase el documento WO 2011/066371.
Ejemplo 35
Seguridad, farmacocinética (PK) y farmacodinámica (PD) de Ab1 en sujetos humanos
Antecedentes
Se administró un anticuerpo humanizado derivado de Ab1 (Ab1 humanizado o ALD518) que contenía las secuencias pesadas y ligeras variables en las SEQ ID NOs: 19 y 20 a pacientes con artritis reumatoide. Este anticuerpo es un anticuerpo monoclonal IgG1 humanizado, asialado, contra IL- 6 que se ha demostrado que tiene una semivida (t12) de aproximadamente 30 días en humanos. En estudios en pacientes con RA, la vía intravenosa (IV) con este anticuerpo (Ab1 humanizado) ha demostrado: eficacia durante 16 semanas con respuestas rápidas del Colegio Americano de Reumatología (ACR); supresión completa y duradera de la proteína C reactiva (CRP); buena tolerabilidad y un perfil de seguridad acorde con la biología del bloqueo de IL-6. Este anticuerpo humanizado se une a IL- 6 con alta afinidad, evitando la interacción y la señalización mediada por IL-6 R. Se han demostrado respuestas rápidas y significativas al tratamiento con la administración intravenosa (IV) de Ab1 humanizado en pacientes con RA. En este ejemplo, se estudia la seguridad, farmacocinética y farmacodinámica de la administración subcutánea (SC) de Ab1 humanizado en sujetos sanos.
El objetivo de este estudio fue evaluar la seguridad, farmacocinética (PK) y farmacodinámica (PD) de una única inyección SC de este anticuerpo humanizado en sujetos masculinos sanos.
Procedimientos
En este estudio de fase I, doble ciego, controlado con placebo, 27 sujetos fueron asignados al azar 2:1 para recibir una dosis única de Ab1 humanizado o placebo en los siguientes grupos: Ab1 humanizado 50 mg SC, Ab1 humanizado 100 mg SC o Ab1 humanizado 100 mg IV (n = 6 activos y n = 3 placebo por grupo). El objetivo principal fue evaluar la seguridad de Ab1 humanizado SC frente al placebo durante 12 semanas. Las concentraciones en plasma de Ab1 humanizado y las concentraciones en sueros de proteína C reactiva (CRP) se evaluaron como objetivos secundarios. Las evaluaciones se realizaron diariamente en la semana 1 y luego en el día 10, las semanas 2, 4, 6 y 8 , y luego mensualmente hasta la semana 12. El estudio no fue ciego en la semana 12 y los sujetos con Ab1 humanizados se controlaron hasta la semana 24.
Diseño del estudio y población
El estudio incluyó a 27 sujetos varones sanos (de 18 a 65 años). Los sujetos fueron dosificados en tres grupos de tratamiento de nueve sujetos cada uno, asignados al azar 2:1 para recibir una dosis única de Ab1 humanizado o placebo el Día 1. Los tratamientos de Ab1 humanizado por grupo fueron: infusión de 100 mg IV de Ab1 humanizado durante 60 minutos; Inyección de 50 mg SC de Ab1 humanizado (1 ml); o inyección 100 mg de Ab1 humanizada (1 ml). El estudio no fue ciego en la semana 12, después de lo cual los sujetos con placebo interrumpieron el ensayo y los sujetos con ALD518 fueron monitoreados hasta la semana 24.
Evaluaciones de seguridad e inmunogenicidad
El objetivo principal del estudio fue evaluar la seguridad de Ab1 humanizado SC en comparación con placebo durante 12 semanas. La seguridad se controló durante 12 semanas para todos los sujetos. El estudio no fue ciego en la semana 12, y los sujetos Ab1 humanizados fueron monitoreados hasta la semana 24. Se realizaron pruebas de seguridad de laboratorio antes de la dosis en la selección y el día -1, y después de la dosis en los días 2 y 7, semanas 2, 4, 6 , 8 y 12 para todos los sujetos, y semanas 16, 20 y 24 posteriores a la dosis para aquellos asignados al azar a Ab1 humanizado. Los anticuerpos Ab1 anti-humanizados se midieron mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). Se recolectaron muestras de sangre en el día 1 (antes de la dosis) y en la semana 12 después de la dosis para todos los sujetos, y en la semana 24 después de la dosis para aquellos asignados al azar a Ab1 humanizado.
Evaluaciones farmacocinética y farmacodinámica
Las concentraciones de CRP en suero y Ab1 humanizado en plasma se evaluaron mediante ELISA. Para todos los sujetos, las muestras se recolectaron en la selección, antes de la dosis el día 1 y después de la dosis los días 2 y 7 y las semanas 2, 4, 6 , 8 y 12. Para los sujetos asignados al azar a Ab1 humanizado, se recolectaron más muestras en las semanas 16, 20 y 24 después de la dosis.
Análisis estadístico
Todos los sujetos que recibieron una dosis de Ab1 humanizado o placebo se incluyeron en el análisis de seguridad. Todos los sujetos que recibieron una dosis de Ab1 humanizado o placebo se incluyeron en los análisis de inmunogenicidad y de PD. Todos los sujetos que recibieron una dosis de Ab1 humanizado se incluyeron en los análisis de PK (n = 18). Todas las muestras de PK de los sujetos que recibieron placebo se confirmaron con la siguiente cuantificación. Se generaron estadísticas descriptivas para los datos demográficos iniciales, los datos de seguridad, los parámetros de Ab1 humanizado en plasma y las concentraciones de CRP en suero. Se utilizó la prueba de Suma de Rango de Wilcoxon para comparar las concentraciones de CRP para los tratamientos con Ab1 humanizado frente a placebo.
Resultados: Sumario
Durante 24 semanas, no hubo muertes o EA graves, ni retiros debido a EA. Casi todos los sujetos (89%) experimentaron EA, que fueron leves o moderados, excepto un evento de gastroenteritis grave en el grupo de 50 mg SC de Ab1 humanizado. Las reacciones en el lugar de la inyección ocurrieron en 5/12 sujetos con Ab1 humanizado SC, 1/6 sujetos con placebo SC y 1/3 sujetos con placebo IV (no hubo reportes en sujetos con Ab1 humanizado IV). Estos fueron leves excepto un caso de eritema moderado y prurito en el grupo de 100 mg SC con Ab1 humanizado. Los aumentos en los recuentos directos de bilirrubina y neutrófilos por debajo del límite de lo normal fueron más comunes en los sujetos que recibieron Ab1 humanizado que con placebo; todos fueron CTC de grado 1 o 2. La semivida del Ab1 humanizado fue similar en todos los grupos (intervalo medio: 30,7-33,6 días). La mediana de Tmáx. de Ab1 humanizado fue mayor después de administración SC (~ 1 semana) que después de administración IV (final de la infusión). La PK de Ab1 humanizado SC fue proporcional a la dosis en términos de AUC y Cmáx. con dosis de 50 mg y 100 mg. De acuerdo con AUCü-~ (día * |jg/ml) de 237, 452 y 764 para los grupos de 50 mg SC, 100 mg SC y 100 mg IV de Ab1 humanizado, respectivamente, la biodisponibilidad de Ab1 humanizado fue ~60% para los grupos SC frente a IV. Los sujetos que recibieron Ab1 humanizado experimentaron reducciones rápidas y sostenidas en la CRP en suero (Figura 21A), se observaron resultados similares cuando se administró el anticuerpo por vía intravenosa o subcutánea (Figura 21B).
Disposición de los sujetos y demografía del valor inicial
Se inscribió un total de 27 sujetos y completaron el estudio (n = 18 Ab1 humanizado y n = 9 placebo). Ningún sujeto fue retirado por ningún motivo. Todos los sujetos eran varones; 23/27 sujetos eran caucásicos y 4/27 asiáticos. La edad media fue 29 (intervalo 20-59) y fue similar en todos los grupos. La altura y el peso medios también fueron generalmente comparables entre los grupos, aunque el grupo con placebo IV fue ligeramente menos pesado.
Seguridad e inmunogenicidad hasta la semana 12 para Ab1 humanizado y placebo
En la Tabla 9 se presenta un resumen de seguridad. Para los grupos Ab1 humanizados SC, un total de 11/12 (91%) pacientes experimentaron un evento adverso (EA) en comparación con: 6 /6 (100%) para el grupo de Ab1 humanizado IV; 4/6 (66 ,6 %) para el grupo de placebo SC; y 3/3 (100%) para el grupo de placebo IV.
Tabla 15. Eventos adversos
Figure imgf000103_0001
continuación
Figure imgf000104_0001
Entre los grupos: No se informaron muertes ni EA graves y no hubo retiros debido a EA. La mayoría de los EA fueron de intensidad leve o moderada. Un caso de gastroenteritis en un sujeto con 50 mg de Ab1 humanizado SC se consideró severo, pero no serio y no relacionado con la medicación del estudio. No se detectaron anticuerpos anti-Ab1 humanizados en ningún sujeto durante este período.
Reacciones en el lugar de la inyección
Se informaron reacciones en el lugar de la inyección en el 26% (7/27) de los sujetos y todas ocurrieron antes de la semana 12 (Tabla 40). Las reacciones en el lugar de la inyección ocurrieron en 5/12 sujetos con Ab1 humanizado SC y 1/6 sujetos con placebo SC. En los grupos IV, 0/6 sujetos con Ab1 humanizado y 1/3 sujetos con placebo experimentaron reacciones en el lugar de la inyección. Todas las reacciones en el lugar de la inyección fueron leves excepto en un sujeto con 100 mg de Ab1 humanizado SC con eritema y prurito moderados en el lugar de la inyección. No se produjeron reacciones en el lugar de la inyección después de la semana 12 en ninguno de los grupos con Ab1 humanizados. Se notificaron reacciones en el lugar de la infusión en 0/6 sujetos que recibieron Ab1 humanizado IV y 1/3 en sujetos con placebo IV (prurito en el lugar de la infusión)
T l 1 . R i n n l l r l in i n n A 1 h l m n 12*
Figure imgf000104_0002
Evaluaciones de laboratorio clínico
La Tabla 43 muestra incidencias de niveles aumentados de alanina aminotransferasa (ALT) y aspartato aminotransferasa (AST) y bilirrubina en los grupos de Ab1 humanizado y placebo. Todos los niveles de ALT y AST fueron de Grado 1 de acuerdo con los Criterios de Terminología Común para Eventos Adversos (CTCAE), y ningún nivel fue > 3 veces el límite superior de lo normal (ULN). Todos los aumentos en la bilirrubina total y directa fueron CTCAE Grado 1 o 2 y ningún sujeto cumplió con los criterios de daño hepático inducido por fármacos. Solo un sujeto (grupo de 100 mg de Ab1 humanizado SC) tenía bilirrubina total fuera del intervalo (26 pmol/l, intervalo 0-24 pmol/l), en la semana 24.
Tabla 16. Evaluaciones de laboratorio clínico durante 24 semanas Abl
Figure imgf000104_0003
También se observaron disminuciones esporádicas en los recuentos de neutrófilos y plaquetas en los grupos de Ab1 humanizado y placebo. Los recuentos de neutrófilos por debajo del límite inferior de lo normal fueron más comunes en los sujetos que recibieron Ab1 humanizado que en el placebo, pero todas las disminuciones fueron CTCAE de grado 1 o 2. Solo un sujeto (grupo de 50 mg de Ab1 humanizado SC) tuvo neutropenia leve constante hasta la semana 24 (1,6 x 109/l en la semana 24). Las reducciones en los recuentos de plaquetas fueron todas de CTCAE Grado 1 (nivel más bajo 134 x 109/l) y ningún sujeto tuvo un recuento bajo de plaquetas después de la semana 8.
Farmacocinética
La biodisponibilidad de Ab1 humanizado fue del 60% para los grupos de 50 y 100 mg de Ab1 humanizado SC frente a los grupos de 100 mg de Ab1 humanizado IV con base en el AUC0.~ media (Tabla 44). La semivida de Ab1 humanizado fue similar en todos los grupos (intervalo medio: 30,7-33,6 días) (Tabla 17). La concentración máxima en plasma (Cmáx) de Ab1 humanizado SC se redujo en comparación con IV (Figura 15). La mediana del tiempo para la concentración plasmática máxima (Tmáx) de Ab1 humanizado fue mayor después de Ab1 humanizado subcutáneo (aproximadamente una semana) que después de la administración de Ab1 humanizado IV (aproximadamente al final de la infusión).
Tabla 17. Parámetros farmacocinéticos en lasma de Ab1 hasta la semana 24
Figure imgf000105_0001
Farmacodinámica
Los niveles de CRP se redujeron en todos los sujetos que recibieron Ab1 humanizado independientemente de la dosis o vía de administración. De las semanas 4 a la 12, los niveles de CRP fueron significativamente más bajos en los sujetos que recibieron Ab1 humanizado en comparación con el placebo (valor p no ajustado <0,05). Se observó una alta correlación entre la IgG producida y la especificidad del antígeno para un ejemplo de protocolo de IL- 6 con 9 de 11 pocillos que mostraron una correlación de IgG específica con el reconocimiento del antígeno. En sujetos con Ab1 humanizado, los niveles de CRP se redujeron a < 20% de los niveles previos a la dosis en: 72% (13/18) de los sujetos en la semana 1; 73% (11/15) de los sujetos en la semana 12; y 56% (10/18) de los sujetos en la semana 24.
Conclusiones
En este estudio de fase I, el anticuerpo anti-IL- 6 Ab1 humanizado fue generalmente bien tolerado cuando se administró en una sola dosis SC en sujetos varones sanos. Las reacciones en el lugar de la inyección fueron generalmente leves. No se detectaron anticuerpos anti-Ab1 humanizados. Los cambios en las enzimas hepáticas, neutrófilos y plaquetas fueron reversibles. La biodisponibilidad de Ab1 humanizado SC fue aproximadamente el 60% de la observada con Ab1 humanizado IV. La semivida de Ab1 humanizado fue de aproximadamente 30 días, independientemente de la vía de administración. Estos datos coinciden con los datos anteriores utilizando Ab1 humanizado IV. Ab1 humanizado subcutáneo condujo a reducciones grandes y rápidas de la CRP en suero. Las reducciones en la CRP observadas durante las primeras 12 semanas del estudio se mantuvieron durante 24 semanas de evaluación. Estos datos preliminares respaldan el desarrollo y la evaluación continuos de Ab1 humanizado subcutáneo para el tratamiento de pacientes con mucositis.
En resumen, en este estudio de fase I, el anticuerpo anti-IL- 6 Ab1 humanizado fue bien tolerado cuando se administró en una sola dosis SC; las reacciones en el lugar de la inyección fueron generalmente leves. La biodisponibilidad de Ab1 humanizado SC fue ~ 60% de Ab1 humanizado IV, y la semivida fue de -30 días. Se observaron reducciones rápidas y significativas en la CRP, que se mantuvieron durante 24 semanas de evaluación.
Ejemplo 36
Efecto de Ab1 sobre la actividad de la enfermedad evaluada por DAS28
ALD518 * es un anticuerpo monoclonal anti-IL- 6 humanizado, asialado con una semivida de -30 días que contiene las secuencias pesadas y ligeras variables humanizadas contenidas en las SEQ ID NOs: 19 y 20. Estas secuencias pesadas y ligeras humanizadas derivan de un anticuerpo de conejo parental que se une específicamente a IL-6 humana, cuyo anticuerpo se denomina en dicha solicitud incorporada como Ab1. ALD518 se une a IL- 6 con alta afinidad, evitando la interacción y la señalización mediada por IL-6 R soluble y unido a la membrana. Se han demostrado respuestas ACR rápidas y significativas con ALD518* en pacientes con RA. En este ejemplo, se informa el impacto de ALD518 en la actividad de la enfermedad evaluada por DAS28 durante 16 semanas.
Procedimientos
Los pacientes con RA activa y una respuesta inadecuada al metotrexato (MTX) fueron asignados al azar 1:1:1:1 a ALD518* 80, 160 o 320 mg intravenoso o placebo durante este estudio de fase II de 16 semanas, doble ciego, controlado con placebo. Los pacientes recibieron dos infusiones intravenosas de ALD518 (día 1 y semana 8 ), mientras continuaban con dosis estables de metotrexato (MTX). El criterio de valoración primario fue la proporción de pacientes que alcanzaron el ACR20 en la semana 12; la actividad de la enfermedad se evaluó mediante la puntuación de actividad de la enfermedad (DAS28) con base en la proteína C reactiva (CRP) como criterio de valoración secundario. Se evaluó la proporción de pacientes que alcanzaron la remisión definida por DAS28 (puntuación <2,6), estado de baja actividad de la enfermedad (LDAS; puntuación <3,2) y buenas respuestas EULAR (DAS28 actual <3,2 y mejora desde el inicio> 1 ,2 ) para la población modificada que se intenta tratar, y se presentan para pacientes con datos disponibles (como se observa). Los valores p se basan en pruebas de Chi-cuadrado.
Resultados
De 127 pacientes asignados al azar y tratados, 116 completaron el ensayo. Al inicio del estudio, la edad media fue de 52,3 años y la duración de la RA fue de 6 ,8 años. En las semanas 4, 12 y 16, la proporción de pacientes que lograron LDAS y remisión fue mayor que el placebo para todas las dosis de ALD518*; las diferencias fueron significativas frente a placebo (p <0,05) para todas las evaluaciones excepto ALD518* 80 mg en la semana 4 (p = 0,056). De manera similar, las respuestas EULAR fueron significativamente mejores para todas las dosis de ALD518* frente al placebo (p <0,01) en las semanas 4, 12 y 16. Hubo una tendencia hacia mayores respuestas con dosis más altas de ALD518*.
Tabla 18. Proporción de pacientes que lograron remisión definida por DAS28, LDAS y respuestas EULAR buenas
Figure imgf000106_0001
Se notificaron EAG en dos pacientes con ALD518 (ambos tuvieron aumentos significativos en las enzimas hepáticas y se interrumpió el tratamiento). En general, se produjeron elevaciones de las enzimas hepáticas > 2xULN en el 17% de los pacientes tratados con ALD518* frente a el 0% de los pacientes tratados con placebo; la frecuencia fue mayor en el grupo de dosis de 320 mg. Se observaron aumentos modestos en el colesterol total (aumento medio en la semana 16 = 1,1 mmol/l para ALD518* frente a 0,2 mmol/l para placebo). Nueve pacientes con ALD518 tenían neutropenias transitorias de Grado II y dos tenían neutropenias transitorias de Grado III. No hubo infecciones graves o reacciones a la infusión en ningún grupo de tratamiento, ni inmunogenicidad evidente.
Conclusiones
En este estudio de fase II, el nuevo inhibidor de IL- 6 ALD518 dio como resultado mejoras rápidas y significativas en la actividad de la enfermedad sostenidas durante 16 semanas de evaluación en pacientes con Ra y una respuesta inadecuada al metotrexato (MTX). ALD518 fue bien tolerado, con un perfil de seguridad compatible con la biología del bloqueo de IL-6.
Ejemplo 37
Administración de Ab1
Procedimientos
Los pacientes con RA activa se asignaron al azar a un ensayo doble ciego controlado con placebo de 16 semanas que comparaba múltiples infusiones iv de ALD518 (80, 160 o 320 mg). Los pacientes recibieron una infusión cada 8 semanas y se mantuvieron con una dosis estable de MTX durante todo el ensayo. Las evaluaciones incluyeron respuestas ACR 20/50/70 y DAS28. Se evaluó la seguridad de todos los pacientes. Para los retiros tempranos, se utilizó el análisis LOCF para las variables continuas y la imputación de no respondedores para las variables categóricas.
Resultados
Se asignaron al azar 132 pacientes; 127 fueron dosificados. La duración media de la enfermedad fue de 6 ,6 años; la puntuación media de DAS28 fue de 6,2 y la media de HAQ-DI fue de 1,72. Once pacientes no completaron el ensayo de 16 semanas: 320 mg-3, 160 mg-1, 80 mg-3, placebo-4: Cuatro interrumpieron debido a eventos adversos (80 mg-2, 320 mg-2), con 2 EAG (80 mg-1, 320 mg-1). Se observaron elevaciones de las enzimas hepáticas (LFT)> 2xULN en el 17% de ALD518 frente al 0% de placebo. Hubo aumentos modestos en el colesterol total (aumento medio en la semana 16 = 1,1 mmol/l de ALD518 frente a 0,2 mmol/l de placebo). Nueve pacientes con ALD518 tenían neutropenias transitorias de grado 2; Dos pacientes neutropenias transitorias de grado 3. No se informaron infecciones graves en ningún grupo de tratamiento. Las infusiones de ALD518 fueron bien toleradas sin reacciones a la infusión o inmunogenicidad evidente. En las semanas 4 y 16, las respuestas ACR (análisis de imputación de no respondedores) y las mejoras en las puntuaciones DAS28 fueron:
T l 1 : P n i n DA 2 n l m n 4 r l i A 1 1 2
Figure imgf000107_0001
^
Figure imgf000107_0002
Conclusión
El ALD518 es el primer mAb para IL-6 , en oposición a un mAb anti-receptor de IL-6 , que muestra una mejora significativa, rápida y sostenida en la actividad de la enfermedad en RA. ALD518 en dosis que varían de 80 a 320 mg administrados como 2 infusiones IV a pacientes con RA activa fue bien tolerado con aumentos en las LFT y colesterol total y neutropenia transitoria observados en algunos pacientes. No hubo reacciones a la infusión asociadas con la administración de ALD518 ni inmunogenicidad detectable.
Ejemplo 38
Tratamiento de la mucositis oral con cáncer de cabeza y cuello con quimioterapia y radioterapia simultáneas
Los sujetos que padecen mucositis oral con cáncer de cabeza y cuello que reciben quimioterapia y radioterapia simultáneas pueden recibir un régimen de dosis de 160 mg o 320 mg de una composición que comprende un anticuerpo monoclonal humanizado que se une selectivamente a IL-6.
Los sujetos serán evaluados utilizando la estadificación del tumor (sistema TNM estándar) durante el período de cribado, que puede ocurrir dentro de los 30 días anteriores al inicio de la radioterapia (RT). El período de tratamiento de RT será de aproximadamente 7 semanas, de acuerdo con el plan de radiación prescrito para el sujeto. Las visitas del período de tratamiento posterior a la RT serán en las Semanas 1,2, 3 y 4 después del período de tratamiento. Las visitas de seguimiento a largo plazo se realizarán a los 3, 6 , 9 y 12 meses después del final de la RT para determinar si hay un efecto de ALD518 en la respuesta del tumor a la CRT.
Los sujetos pueden haber sido diagnosticados recientemente, confirmado patológicamente, SCC no metastásico de la cavidad oral, orofaringe, hipofaringe o laringe. Se puede programar que los sujetos reciban un ciclo continuo de radioterapia de intensidad modulada (IMRT), con una dosis acumulada mínima de 55 Gy y una dosis máxima de 72 Gy. Los campos de tratamiento de radiación planificados pueden incluir al menos 2 sitios orales (por ejemplo, mucosa bucal, piso de la cavidad oral, lengua o paladar blando) y cada sitio recibe una dosis total de > 55 Gy. El plan de tratamiento puede incluir monoterapia con cisplatino administrado en regímenes estándar semanales (30 a 40 mg/m2) o cada tres semanas (80 a 100 mg/m2, administrados los días 0, 21 y 42) o monoterapia con carboplatino administrado semanalmente ( 100 mg/m2).
Se puede administrar una composición que comprende un anticuerpo monoclonal humanizado que se une selectivamente a IL- 6 dentro de las 2 horas antes de la radiación de los sujetos cada 4 semanas para un total de 2 dosis. Se realizará una visita inicial el primer día de ALD518 y RT. La seguridad, PK, PD y marcadores de la biología de IL- 6 (por ejemplo, IL- 6 total, sIL-6 r, gp130 soluble, complejo sIL-6 ) se controlarán durante el tratamiento de RT y el período de tratamiento posterior a RT. El período de seguimiento a largo plazo del tratamiento puede incluir visitas de seguimiento a largo plazo, principalmente para la evaluación de la respuesta y la supervivencia del tumor. Estas evaluaciones se llevarán a cabo en los meses 3, 6 , 9 y 12 después de la última dosis de RT. En los meses 3, 6 , 9 y 12, los tumores se evaluarán clínicamente. En las visitas de seguimiento del mes 6 y del mes 12, el estado del tumor se evaluará utilizando los criterios RECIST y se puede utilizar la misma modalidad de obtención de imágenes (TAC, PET o RM) que se utilizó para evaluar el estado del tumor antes del inicio de la RT (en el momento de la estadificación).
Después de un régimen de tratamiento que comprende la administración de un anticuerpo monoclonal humanizado que se une selectivamente a IL-6 , los pacientes pueden mostrar una mejoría en su mucositis oral (por ejemplo, una reducción de los síntomas).
Ejemplo 39
Estudio 1 de mucositis oral: estudio de dosis única de radiación aguda (40 Gy)
Introducción: Se estudió la eficacia del tratamiento con un anticuerpo anti-IL- 6 de roedor (clon MP5-20F3 monoclonal de IgG1 de rata, R&D Systems) en un modelo de ratón establecido de mucositis oral inducida por radiación. Dorr y Kummermehr (1991) Virchows Arch B Cell Pathol Incl Mol Pathol 60 (5): 287-94. Los criterios de valoración del estudio incluyeron la duración y gravedad de la mucositis oral, el peso corporal y la supervivencia en ratones C3H normales.
Procedimientos: 36 ratones C3H machos se expusieron a una dosis única de radiación de 40 Gy dirigida a la parte inferior de la lengua el día 0. Se administró a los animales un anticuerpo anti-IL- 6 de roedor (clon MP5-20F3 monoclonal de IgG1 de rata, R&D Systems), anticuerpo de control (clon monoclonal 43414monoclonal de IgG1 de rata, R&D Systems), o vehículo los días -1, 2, 6 , 9 y 13, mediante inyección intravenosa a razón de 10 mg/kg en la vena de la cola. Los animales se pesaron diariamente y se controló el consumo de alimento y agua en cada grupo de tratamiento.
Se capturaron imágenes de la lengua diariamente desde los días 4 a 16. Se asignó una puntuación de mucositis oral a cada animal en base a una escala de puntuación definida por diseño de protocolo. La escala de puntuación se presenta en la Tabla 21. Una vez finalizado el estudio, observadores ciegos puntuaron las imágenes de la lengua para establecer los valores utilizados para determinar el grado y la duración de la mucositis oral y cualquier efecto del tratamiento. Se considera que una puntuación de 1 a 2 representa una etapa leve de la enfermedad, mientras que una puntuación de 3 a 5 indica una mucositis de moderada a grave.
Tabla 21: Escala de untuación de mucositis oral de modelo de roedor
Figure imgf000108_0001
Resultados: el inicio de la mucositis fue el mismo para los 3 grupos con puntuaciones máximas de mucositis que se produjeron en el día 10. Un análisis del número de días que los ratones presentaron puntuaciones de 3+ durante el estudio no demostró diferencias estadísticas entre los 3 grupos (media de los días de 3,3, 4 y 3,6 para vehículo, control de isotipo y anti-IL-6 , respectivamente).
El día 10, el 100% de los ratones en los grupos con vehículo y anticuerpos de control desarrollaron úlceras mientras que el 67% del grupo anti-IL- 6 desarrolló úlceras (Figura 22). No hubo diferencia estadística en las puntuaciones de ulceración en el día 10 entre el anticuerpo anti-IL- 6 y el anticuerpo de control o los grupos de vehículo. Los días 12 y 13, una cantidad numéricamente mayor (no estadísticamente diferente) de ratones en el grupo anti-IL- 6 tuvo ulceración en comparación con los ratones en los grupos de vehículo o de control.
Se observó pérdida de peso en los 3 grupos y la pérdida máxima de peso se produjo entre los días 11 y 12. No hubo diferencias estadísticamente significativas en el cambio de peso entre los tres grupos. No se observaron toxicidades generales en este estudio que pudieran atribuirse al tratamiento con el control o los anticuerpos anti-IL- 6 o el vehículo. No se produjeron muertes relacionadas con el tratamiento durante el estudio.
Ejemplo 40
Estudio con niveles ascendentes de dosis de radiación en un modelo de ratón de mucositis oral inducida por radiación
Introducción
Se estudió la eficacia del tratamiento con un anticuerpo anti-IL- 6 de roedor (clon MP5-20F3 monoclonal de IgG1 de rata, R&D Systems) en un modelo de ratón establecido de mucositis oral inducida por radiación. Dorr & Kummermehr J. Proliferation kinetics of mouse tongue epithelium under normal conditions and following single dose irradiation. Virchows (1991) Arch B Cell Pathol Incl Mol Pathol. 60(5): 287-294. Los criterios de valoración del estudio incluyeron la duración y gravedad de la mucositis oral, el peso corporal y la supervivencia en ratones C3H normales.
Procedimientos
Se expusieron 120 ratones C3H machos (12 por grupo de tratamiento por dosis de radiación) a una sola dosis de radiación, totalizando 25, 30, 35, 40 o 45 Gy dirigidos a la parte inferior de la lengua el día 0. Los animales recibieron dosis con un anticuerpo anti-IL- 6 de roedor (clon MP5-20F3 monoclonal de IgG1 de rata, R&D Systems) o un anticuerpo de control (clon 42414 monoclonal de IgG1 de rata, R&D Systems) los días -1, 2, 6 , 9 y 13, a través de inyección intravenosa a razón de 10 mg/kg en la vena de la cola. Los animales se pesaron diariamente; y se controló el consumo de alimentos y agua en cada grupo de tratamiento.
Se capturaron imágenes de la lengua diariamente desde los días 4 a 16. Se asignó una puntuación de mucositis oral a cada animal con base en una escala de puntuación definida por diseño de protocolo. La escala de puntuación se presenta en la Tabla 21. Una vez finalizado el estudio, observadores ciegos puntuaron las imágenes de la lengua para establecer los valores utilizados para determinar el grado y la duración de la mucositis oral y cualquier efecto del tratamiento. Se considera que una puntuación de 1 a 2 representa una etapa leve de la enfermedad, mientras que una puntuación de 3 a 5 indica una mucositis de moderada a grave.
Conclusiones
Los ratones tratados con el anticuerpo anti-IL- 6 a 25 Gy mostraron una disminución estadísticamente significativa en la mediana del número de días con ulceración en comparación con los ratones tratados con el anticuerpo de control (p = 0,0134). No hubo diferencias entre los grupos de tratamiento a 30 y 35 Gy. Los ratones tratados con el anticuerpo anti-IL- 6 a 40 y 45 Gy mostraron un aumento estadísticamente significativo en el número medio de días con ulceración en comparación con los ratones tratados con el anticuerpo de control (p = 0,0237 y 0,0037, respectivamente). Estos datos se muestran en la Figura 23.
El grupo tratado con anti-IL- 6 tuvo un porcentaje numéricamente menor de ratones que se ulceraron en cualquier momento durante el transcurso del estudio en comparación con el grupo tratado con anticuerpos de control a los niveles de radiación de 25 y 30 Gy (45% frente a 82%; 67% frente a 92%). Véase la Figura 24. A niveles de dosis de radiación más altos, el porcentaje de ratones que se ulceraron durante el transcurso del estudio en los dos grupos de tratamiento fue similar.
Durante el transcurso del estudio, el grupo de tratamiento con anti-IL- 6 que recibió 25 Gy tuvo cambios porcentuales medios positivos estadísticamente significativos desde el peso corporal inicial en comparación con el grupo de anticuerpos de control en todos los puntos de tiempo. Además, en el día 4, el grupo anti-IL- 6 a niveles de dosis de radiación de 30 y 35 Gy tuvo cambios porcentuales medios positivos estadísticamente significativos con respecto al peso corporal inicial en comparación con el grupo de anticuerpos de control. A los niveles de dosis de radiación de 40 y 45 Gy, no hubo diferencias en la mediana del cambio porcentual desde el inicio entre los grupos de anticuerpos anti-IL- 6 y de control.
En este estudio no se observaron toxicidades generales que pudieran atribuirse al tratamiento con el anticuerpo anti-IL- 6 o el anticuerpo de control. No se observaron muertes relacionadas con el tratamiento durante el estudio.
Conclusiones
En conclusión, a la dosis más baja (25 Gy) de radiación hubo una menor incidencia y duración de mucositis oral ulcerada (puntuaciones 3-5) en el grupo tratado con anti-IL- 6 en comparación con los controles. Además, los ratones tratados con el anticuerpo anti-IL- 6 no perdieron peso corporal en comparación con los controles. Al nivel de dosis de radiación de 30 Gy, hubo una menor incidencia de mucositis oral ulcerada en el grupo tratado con anti-IL- 6 en comparación con los controles. Los ratones que recibieron dosis únicas más altas de radiación (40 Gy y 45 Gy) tuvieron una mayor duración de la mucositis oral ulcerada en el grupo tratado con anticuerpos anti-IL- 6 en comparación con los controles. Los niveles de dosis de radiación administrados como dosis únicas en este estudio son mucho más altos que las dosis diarias (aproximadamente 2 Gy) administradas en IMRT para el tratamiento del cáncer de cabeza y cuello. Estos datos respaldan el uso de un anticuerpo monoclonal humanizado (por ejemplo, ALD518) en la prevención de la mucositis oral inducida por CRT en pacientes con cáncer de cabeza y cuello.
Ejemplo 41
Efecto del tratamiento anti-IL- 6 sobre el crecimiento tumoral en un modelo de xenoinjerto
Introducción
La línea celular de carcinoma de células escamosas de faringe humana (FaDu) se ha utilizado como modelo para cánceres de cabeza y cuello en estudios de xenoinjerto de ratón. Alderson, et al. (2002) Cancer Chemother. Pharmacol. 50: 202-212. FaDu expresa tanto IL-6 como el receptor de IL- 6 y los niveles de IL- 6 se inducen en respuesta al tratamiento con radiación. Chen et al. (2010) Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys. 76: 1214-1224. Se estudió el efecto del tratamiento anti-IL- 6 sobre el crecimiento de tumores FaDu en presencia o ausencia de tratamiento con radiación en un modelo de xenoinjerto de ratón establecido. Los criterios de valoración del estudio incluyeron el volumen del tumor y el peso corporal.
Procedimientos
A 120 ratones desnudos atímicos hembras de seis semanas de edad se les implantaron diez millones de células tumorales FaDu por vía subcutánea. Cuando los tumores alcanzaron el intervalo de peso de 125-250 mg (día 10), los animales se dividieron en 3 grupos de 40 ratones. A un grupo se le administró vehículo dos veces por semana mediante una inyección intravenosa en la vena de la cola. El segundo grupo recibió 10 mg/kg de cada uno de ALD518 y un anticuerpo anti-IL- 6 de ratón (IgG1 monoclonal de rata, R&D Systems). El tercer grupo de tratamiento recibió 10 mg/kg de cada uno de los anticuerpos de control de isotipo (IgG1 monoclonal humana, R&D Systems). En cada uno de los grupos de tratamiento, la mitad de los animales (N = 20) fueron irradiados con 2 Gy/día durante 5 días y los otros 20 animales no fueron irradiados. Los animales se sacrificaron cuando el volumen del tumor alcanzó 4.000 mm3 o se produjo una ulceración del tumor. Se pesaron todos los animales y se midieron los volúmenes tumorales tres veces por semana durante la duración del estudio.
Resultados
Los volúmenes tumorales de cada animal se midieron tres veces por semana comenzando el primer día de tratamiento (día 10). El estudio se completó el día 29. Los tumores FaDu tienen una alta tasa de ulceración; en este estudio, se sacrificaron entre 9 y 13 animales en cada grupo el día 29 debido a la ulceración del tumor. No se sacrificó a ningún animal debido a la carga tumoral. La mediana del volumen tumoral para cada grupo se presenta en la Figura 25. Todos los grupos tenían volúmenes tumorales medianos entre 162-167 mm3al comienzo del tratamiento (día 10). Los grupos tratados con vehículo, anticuerpos de control de isotipo o anticuerpos anti-IL- 6 pero no irradiados mostraron volúmenes tumorales medios muy similares a lo largo del estudio. Estos grupos no fueron estadísticamente diferentes. Los grupos tratados con vehículo, anticuerpos de control de isotipo o anticuerpos anti-IL- 6 más radiación tuvieron volúmenes tumorales medios reducidos de aproximadamente un 50% en comparación con los grupos no irradiados después del día 22. Los volúmenes tumorales medios de los grupos irradiados fueron similares y no estadísticamente diferentes. Por lo tanto, el tratamiento con anticuerpos anti-IL- 6 no tuvo ningún efecto sobre el crecimiento tumoral ni en los grupos irradiados ni en los no irradiados.
Las conclusiones adicionales del estudio incluyen: no se observaron diferencias de peso entre los seis grupos; no se observaron toxicidades generales que pudieran atribuirse al tratamiento con el vehículo, anticuerpos de control o anticuerpos anti-IL-6 ; y no hubo muertes relacionadas con el tratamiento.
Ejemplo 43
Diseño del ensayo clínico
Un ensayo de fase 2, doble ciego, controlado con placebo que evalúa la seguridad, eficacia, farmacocinética y farmacodinámica de ALD518, y los resultados económicos y de salud en sujetos que reciben CRT para el tratamiento de carcinomas de células escamosas (SCC) se pueden realizar en la cavidad oral, orofaringe, hipofaringe o laringe. Se pueden inscribir hasta 96 sujetos en este ensayo. Inicialmente, se inscribirán 3 sujetos de etiqueta abierta en un ensayo de seguridad de la dosis de 160 mg. Aproximadamente 90 sujetos serán asignados al azar (1:1:1) en 1 de 2 niveles de dosis de ALD518 (160 mg y 320 mg) o placebo durante la parte de doble ciego del ensayo. La seguridad, PK, PD y marcadores de la biología de IL- 6 (por ejemplo, IL-6 total, sIL-6 r, gp130 soluble, complejo sIL-6 ) se controlarán durante el tratamiento de RT y el período de tratamiento posterior a la RT. Además, los análisis exploratorios de la biología de IL-6 , incluidos los biomarcadores de citocinas, pueden realizarse en un subconjunto de sujetos y requerirán un consentimiento por separado.
La elegibilidad de los sujetos, incluida la estadificación del tumor (sistema TNM estándar), se evaluará durante el período de cribado, que puede ocurrir dentro de los 30 días anteriores al inicio de la radioterapia (RT). El período de tratamiento de RT será de aproximadamente 7 semanas, de acuerdo con el plan de radiación prescrito para el sujeto. Las visitas de seguimiento posteriores a la RT serán en las Semanas 1, 2, 3 y 4. Las visitas de seguimiento a largo plazo se realizarán a los 3, 6 , 9 y 12 meses después del final de la RT para determinar si hay un efecto de ALD518 sobre la respuesta tumoral a CRT.
Los sujetos elegibles tendrán SCC no metastásico recientemente diagnosticado, confirmado patológicamente, de la cavidad oral, orofaringe, hipofaringe o laringe. Los sujetos deben estar programados para recibir un curso continuo de radioterapia de intensidad modulada (IMRT), con una dosis acumulada mínima de 55 Gy y una dosis máxima de 72 Gy. Los campos de tratamiento con radiación planificados deben incluir al menos 2 sitios orales (por ejemplo, mucosa bucal, piso de la cavidad oral, lengua o paladar blando) recibiendo cada sitio una dosis total > 55 Gy. El plan de tratamiento debe incluir monoterapia con cisplatino administrado en regímenes estándar semanales (30 a 40 mg/m2 o cada tres semanas (80 a 100 mg/m2, administrados los días 0, 21 y 42) o en monoterapia con carboplatino administrado semanalmente ( 100 mg/m2).
Se administrará ALD518 o placebo cada 4 semanas dentro de las 2 horas previas a la radiación de los sujetos para un total de 2 dosis. Se realizará una visita de referencia el primer día de RT. Durante el período de tratamiento de RT, los sujetos serán evaluados dos veces por semana para determinar la presencia y la gravedad de la MO por evaluadores entrenados y tratamientos ciegos que utilizan la escala de clasificación de la Organización Mundial de la Salud (OMS) para la MO. Los sujetos también completarán un diario, que contiene el cuestionario diario de mucositis oral (CDMO) y una lista de uso de analgésicos, y semanalmente los instrumentos PRO de la subescala FACT-HN y FACIT-F.
Todos los sujetos regresarán a la clínica para 4 visitas semanales después de completar la RT para la evaluación de la MO. Durante este tiempo, los sujetos también continuarán completando el CDMO y los instrumentos PRO de subescala FACT-HN y FACIT-F. El período de seguimiento a largo plazo del ensayo clínico incluirá visitas trimestrales, principalmente para la evaluación de la respuesta tumoral. Estas evaluaciones se llevarán a cabo en los meses 3, 6 , 9 y 12 después de la última dosis de RT. En los meses 3, 6 , 9 y 12 , los tumores se evaluarán clínicamente. En las visitas de seguimiento del mes 6 y del mes 12, el estado del tumor se evaluará utilizando los criterios RECIST y la misma modalidad de imágenes (c At , PET o MRI) que se utilizó para evaluar el estado del tumor antes del inicio de la RT (en el momento de la estadificación).
Ejemplo 44
Evaluación adicional de ALD518 en ensayos clínicos de RA
Este ejemplo describe más resultados de ensayos clínicos de Fase II para la administración de ALD518 a pacientes con rA activa. A los efectos de la inclusión en este estudio, se consideró que un paciente tenía RA activa si el paciente presentaba al menos 6 articulaciones inflamadas/ 6 sensibles, CRP >10 mg/dl y había sido tratado con una dosis estable de metotrexato (MTX) (> 10 mg/semana) durante al menos 3 meses y uso estable de NSAID o esteroides (si los hubiera).
ALD518 se administró en un estudio doble ciego controlado con placebo en el que los pacientes con RA activa fueron asignados al azar 1:1:1:1 para recibir 80 mg (n = 32), 160 mg (n = 34), o 320 mg (n = 28) de ALD518, o placebo (n = 33). Se administraron ALD518 o placebo como una infusión intravenosa durante 60 minutos el día 1 y luego nuevamente 8 semanas después. Los pacientes se mantuvieron con dosis estables de metotrexato (MTX) (al menos 10 mg/semana). Los fármacos antirreumáticos modificadores de la enfermedad (DMARD) distintos del MTX se interrumpieron al menos 4 meses antes de la entrada al estudio. Los criterios de valoración de eficacia se evaluaron en las semanas 12 (criterio de valoración principal) y en la semana 16. La HRQoL se evaluó mediante formulario corto 36 (SF-36) de la encuesta de resultados médicos. Se realizaron análisis en la población modificada que se intenta tratar para pacientes con datos disponibles en la visita de interés (como se observa).
Se asignaron al azar y trataron 127 pacientes con RA activa, y 116 completaron el ensayo (80 mg, 29/32; 160 mg, 33/34; 320 mg, 25/28; placebo, 29/33). La disposición del paciente se resume en la Figura 26.
Al inicio del estudio, la edad media fue 52,3 años; la duración media de la RA fue de 6 ,8 años; los recuentos medios de articulaciones sensibles e inflamadas fueron 26,1 y 16,7, y las puntuaciones medias del resumen del componente físico (PCS) y el componente mental (MCS) fueron 31,0 y 35,0, respectivamente. Los cambios medios desde el inicio hasta la semana 12 en MCS fueron significativamente mayores en cada grupo de dosis de ALD518 en comparación con el placebo, y los cambios medios en las puntuaciones de PCS y MCS superaron la MCID en cada grupo de ALD518. En la semana 12, los cambios medios desde el valor inicial en uno o más dominios de SF-36 fueron significativamente mayores en los grupos de dosis de ALD518 frente a placebo. Se observaron cambios > MCID en todos los dominios y en SF-6 D en pacientes que recibieron ALD518. Las mejoras en la semana 12 se mantuvieron en la semana 16.
Resultados
Puntuaciones del resumen de componentes del formulario corto 36: Se evaluó HRQoL mediante el cuestionario de la forma corta 36 (SF-36) informado por el paciente. El SF-36 incluye 36 preguntas divididas en ocho dominios y resumidas en las puntuaciones de resumen de los componentes físico y mental (PCS y MCS, respectivamente). Las puntuaciones van de 0 a 100, y las puntuaciones más altas indican una mejor salud. Las diferencias mínimas clínicamente Importantes (MCID) observadas son 2,5-5,0 para PCS y MCS, y 5,0-10,0 para puntuaciones de dominio.
Formulario corto-6D: El SF-6 D es una medida validada basada en preferencias de servicios de salud. El SF-6 D se calculó utilizando los cambios medios dentro de los grupos de tratamiento en los ocho dominios del SF-36 para producir una única medida de utilidad. La diferencia mínima importante (MID) es 0,041.
Análisis
Se realizó un análisis en la población modificada que se intenta tratar para pacientes con datos disponibles en la visita de interés (como se observó). Los cambios iniciales en el PCS, MCS de SF-36 y las puntuaciones de dominio se resumieron como estadísticas descriptivas por grupo de tratamiento y visita. Los grupos de tratamiento con ALD518 también se compararon con placebo en la semana 12 utilizando una prueba t de dos muestras.
Para las Semanas 12 y 16, se usaron diagramas de araña para presentar resultados en todos los dominios del SF-36 en una sola figura y para comparar con datos normativos emparejados por edad y género de una población de los estados Unidos. Las demarcaciones a lo largo de los ejes de dominio de los diagramas de araña representan cambios de 10 en la puntuación del dominio, y la disposición del paciente y las características y demografías de referencia.
[Como se muestra en la Figura 26, un total de 127 pacientes fueron asignados al azar y recibieron >1 dosis de ALD518; El 91,3% de los pacientes completaron el estudio y once (8,7%) pacientes interrumpieron el estudio.
Las puntuaciones del dominio SF-36 individuales de inicio y la semana 12 se muestran en la Tabla 22 y se ilustran gráficamente en la Figura 27. Las puntuaciones de los dominios iniciales estaban generalmente bien equilibradas entre los grupos de tratamiento. Al inicio, los pacientes tenían una HRQoL alterada. Las puntuaciones medias de PCS y MCS iniciales combinadas fueron 31,0 y 35,0, respectivamente, y las desviaciones estándar de 1,5-2,0 menores que los valores normativos de 50. Las puntuaciones para cada una de las subescalas individuales del SF-36 también fueron considerablemente más bajas que las normas estadounidenses correspondientes por edad y género.
Para todos los grupos de tratamiento con ALD518, las mejoras medias desde el inicio hasta la semana 12 fueron grandes en los ocho dominios del SF-36 y excedieron las observadas con placebo (véase la Tabla 22 y la Figura 27). Las mejoras medias fueron significativamente mayores que las observadas con placebo (p <0,05; Tabla 22) en la semana 12 en los siguientes dominios: rol físico (grupo de 320 mg de ALD518); dolor corporal, salud general, desempeño social y salud mental (grupos de tratamiento con 80 y 320 mg de ALD518); vitalidad (todos los grupos con ALD518); rol emocional (grupo 80 mg con ALD518). Línea
En todas las dosis de ALD518, las mejoras medias en los ocho dominios de SF-36 excedieron la MCID en la semana 12. Véase la Tabla 22. Después del ajuste para el cambio desde el valor inicial en el grupo placebo, las mejoras desde el valor inicial observadas con ALD518 fueron mayores que, y en algunos casos al menos dos veces, el observado en el grupo placebo. Se observaron cambios (mejoras) dependientes de la dosis en los dominios del rol físico, dolor corporal y salud mental. El tratamiento con ALD518 dio como resultado mejoras en las puntuaciones de SF-36 con respecto a las observadas en la población comparativa "normal". Véase la Figura 29.
Tabla 22: Dominios PCS MCS de SF-36 al nido en la semana 12
Figure imgf000112_0001
continuación
Figure imgf000113_0002
Resumen de resultados: 127 pacientes con RA activa fueron asignados al azar y tratados, y 116 completaron el ensayo (80 mg, 29/32; 160 mg, 33/34; 320 mg, 25/28; placebo, 29/33). Al inicio del estudio, la edad media era de 52,3 años; la duración media de la RAfue de 6 ,8 años; los recuentos medios de articulaciones sensibles e inflamadas fueron 26,1 y 16,7, y las puntuaciones medias del resumen del componente físico (PCS) y el componente mental (MCS) fueron 31,0 y 35,0, respectivamente. Los cambios medios desde el inicio hasta la semana 12 en MCS fueron significativamente mayores en cada grupo de dosis de ALD518 en comparación con el placebo, y los cambios medios en las puntuaciones de PCS y MCS superaron la MCID en cada grupo de ALD518. En la semana 12, los cambios medios desde el valor inicial en uno o más dominios de SF-36 fueron significativamente mayores en los grupos de dosis de ALD518 que en el grupo de placebo (Tabla 23). Las mejoras en SF-6 D fueron de 3 a 4 veces la MID en los grupos de ALD-518 en comparación con menos de 2 veces la MID en el grupo de placebo (como se indicó anteriormente, la MID es 0,041). Se observaron cambios que excedieron la MCID en todos los dominios y en SF-6 D en pacientes que recibieron ALD518. Las mejoras en la semana 12 se mantuvieron en la semana 16.
Tabla 23. Puntuaciones de SF-6D al inicio y en las semanas 12 y 16. El sombreado resalta los cambios que excedieron la MID diferencia mínima im ortante .
Figure imgf000113_0001
Conclusiones: El tratamiento con el inhibidor de IL- 6 ALD518 dio como resultado mejoras estadísticamente significativas y clínicamente significativas en los aspectos físicos y mentales de la HRQoL. Estos datos respaldan aún más la eficacia clínica de ALD518 para el tratamiento de pacientes con RA activa y respuestas inadecuadas al metotrexato (MTX).
Ejemplo 45
Ensayo clínico de mucositis oral en curso
Los sujetos que padecen mucositis oral con cáncer de cabeza y cuello que reciben quimioterapia y radioterapia concurrentes están siendo tratados con un régimen de dosis de 160 mg de una composición que comprende un anticuerpo monoclonal humanizado que se une selectivamente a IL- 6 (ALD518, también conocido como Ab1 que contiene las secuencias variables en la SEQ ID NO: 19 y la SEQ ID NO: 20).
Los sujetos están siendo evaluados usando estadificación del tumor (sistema TNM estándar) durante el período de selección, que ocurre dentro de los 30 días previos al inicio de la radioterapia (RT). El período de tratamiento de RT es de aproximadamente 7 semanas, de acuerdo con el plan de radiación prescrito para el sujeto. Las visitas posteriores al período de tratamiento de RT se programan para las semanas 1, 2, 3 y 4 después del período de tratamiento. Las visitas de seguimiento a largo plazo se programan a los 3, 6 , 9 y 12 meses después del final de la RT para determinar si existe un efecto de ALD518 en la respuesta tumoral a CRT.
Los sujetos fueron diagnosticados recientemente y confirmados patológicamente con SCC no metastásico de la cavidad oral, orofaringe, hipofaringe o laringe. Los sujetos están programados para recibir un curso continuo de radioterapia de intensidad modulada (IMRT) con una dosis acumulada mínima de 55 Gy y una dosis máxima de 72 Gy. Los campos de tratamiento de radiación planificados incluyen al menos 2 sitios orales (por ejemplo, mucosa bucal, piso de la cavidad oral, lengua o paladar blando) y cada sitio recibe una dosis total de > 55 Gy. El plan de tratamiento incluye monoterapia con cisplatino administrado en regímenes estándar semanales (30 a 40 mg/m2) o cada tres semanas (80 a 100 mg/m2, administrados los días 0, 21 y 42) o monoterapia con carboplatino administrado semanalmente ( 100 mg/m2).
Se administra una composición que comprende un anticuerpo monoclonal humanizado que se une selectivamente a IL- 6 (ALD518 también conocido como Ab1) en las 2 horas previas a la radiación de los sujetos cada 4 semanas para un total de 2 dosis. Se realizó una visita inicial el primer día de ALD518 y RT. La seguridad, PK, PD y marcadores de la biología de IL- 6 (por ejemplo, IL- 6 total, sIL-6 r, gp130 soluble, complejo sIL-6 ) se controlan durante el tratamiento con RT y el período de tratamiento posterior a RT. El período de seguimiento a largo plazo del tratamiento incluye visitas de seguimiento a largo plazo programadas, principalmente para la evaluación de la respuesta y supervivencia del tumor. Estas evaluaciones están programadas para los meses 3, 6 , 9 y 12 después de la última dosis de RT. En los meses 3, 6 , 9 y 12, los tumores se evaluarán clínicamente. En las visitas de seguimiento del mes 6 y del mes 12, el estado del tumor se evaluará utilizando los criterios RECIST y se puede usar la misma modalidad de obtención de imágenes (TAC, PET o RMI) que se utilizó para evaluar el estado del tumor antes del inicio de la RT (en el momento de la estadificación).
Después de un régimen de tratamiento que comprende la administración de un anticuerpo monoclonal humanizado que se une selectivamente a IL-6 , ALD518 (Ab1), los pacientes muestran una mejora en su mucositis oral (por ejemplo, una reducción de los síntomas) después de solo 4 semanas de tratamiento.
De acuerdo con la evaluación utilizando la escala de mucositis oral de la OMS (Organización Mundial de la Salud) (Tabla 2), se evaluaron 3 pacientes que recibieron 160 mg de administración intravenosa de ALD518 (Ab1). El primer sujeto (círculos) no ha mostrado ningún signo de desarrollar mucositis oral, manteniendo un Grado 0 durante las 4 semanas completas. Esto es indicativo de que ALD518 actúa para prevenir el desarrollo de mucositis oral. El segundo paciente (cuadrados) desarrolló mucositis oral de grado 2, pero parece haber disminuido su gravedad. Esto es indicativo de que ALD518 actúa para prevenir el desarrollo de mucositis oral grave (por ejemplo, Grado 4) e incluso reducir la gravedad de la mucositis oral. El tercer paciente (triángulos) desarrolló mucositis oral grado 2/3. Esto es indicativo de que ALD518 actúa para prevenir el desarrollo de mucositis oral grave (por ejemplo, Grado 4). En esta población de pacientes, se espera que alrededor del 60% de los pacientes desarrollen al menos mucositis oral de grado 3 o 4 con este tipo de IMRT quimioterapia y que más del 80% de los pacientes desarrollen al menos mucositis oral de grado 2 o superior. Por lo tanto, estos datos sugieren que un anticuerpo monoclonal humanizado que se une selectivamente a IL- 6 (por ejemplo, ALD518 también conocido como Ab1) es eficaz para tratar y prevenir la mucositis oral resultante de la combinación de quimioterapia y radioterapia.
Además, con base en estos resultados, se concluye que otros antagonistas de IL-6 , incluidos los identificados en esta solicitud, por ejemplo, los anticuerpos anti-IL- 6 ejemplificados y fragmentos de anticuerpos, así como los antagonistas de IL- 6 no anticuerpos identificados, tendrán aplicación clínica en el tratamiento y prevención de la mucositis, por ejemplo, mucositis oral y gastrointestinal o alimentaria.
Ejemplo 46
Ensayo clínico de anemia en curso
Tres pacientes con cáncer que iban a ser tratados con cisplatino fueron tratados con ALD518 antes de la quimioterapia con cisplatino para prevenir o disminuir la anemia, y en particular para prevenir la aparición de anemia severa, que es un efecto secundario muy común de la terapia con cisplatino, es decir, cuando se administra solo o junto con radioterapia.

Claims (7)

REIVINDICACIONES
1. Una composición para uso en el tratamiento o prevención de la mucositis asociada con la radioterapia, que comprende una cantidad eficaz de un anticuerpo antagonista de IL-6, en el que dicho anticuerpo anti-IL-6 comprende la secuencia ligera variable humanizada de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID. NO: 709 y la secuencia pesada variable humanizada de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 657.
2. La composición para uso de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicha mucositis se selecciona del grupo que consiste en: mucositis oral asociada con radioterapia; mucositis del tracto digestivo asociada con radioterapia; y mucositis del tracto gastrointestinal asociada con radioterapia.
3. La composición para uso de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que dicho anticuerpo anti-IL-6 comprende los polipéptidos de la SEQ ID NO: 702 y la SEQ ID NO: 704.
4. La composición para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que dicho anticuerpo es un anticuerpo de cadena sencilla o quimérico.
5. La composición para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que dicho anticuerpo comprende un Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv, IgNAR o un compuesto inmunofarmacéutico modular pequeño (SMIP).
6. La composición para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que dicho anticuerpo contiene una región Fc, en la que dicha región Fc se ha modificado opcionalmente para alterar la función efectora, la semivida, la proteólisis y/o la glicosilación.
7. La composición para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, que comprende además un vehículo, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable.
ES11843309T 2010-11-23 2011-11-23 Anticuerpos anti-IL-6 para el tratamiento de la mucositis oral Active ES2847891T3 (es)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US41634310P 2010-11-23 2010-11-23
US41635110P 2010-11-23 2010-11-23
US41636310P 2010-11-23 2010-11-23
US41633210P 2010-11-23 2010-11-23
US201161489857P 2011-05-25 2011-05-25
US201161511797P 2011-07-26 2011-07-26
PCT/US2011/062121 WO2012071554A2 (en) 2010-11-23 2011-11-23 Anti-il-6 antibodies for the treatment of oral mucositis

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2847891T3 true ES2847891T3 (es) 2021-08-04

Family

ID=46064554

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES11843309T Active ES2847891T3 (es) 2010-11-23 2011-11-23 Anticuerpos anti-IL-6 para el tratamiento de la mucositis oral

Country Status (7)

Country Link
US (7) US9304134B2 (es)
EP (2) EP2643018B1 (es)
AU (4) AU2011332810A1 (es)
CA (2) CA2818813C (es)
DK (1) DK2643018T3 (es)
ES (1) ES2847891T3 (es)
WO (2) WO2012071561A2 (es)

Families Citing this family (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8062864B2 (en) 2007-05-21 2011-11-22 Alderbio Holdings Llc Nucleic acids encoding antibodies to IL-6, and recombinant production of anti-IL-6 antibodies
US8404235B2 (en) 2007-05-21 2013-03-26 Alderbio Holdings Llc Antagonists of IL-6 to raise albumin and/or lower CRP
US8252286B2 (en) 2007-05-21 2012-08-28 Alderbio Holdings Llc Antagonists of IL-6 to prevent or treat thrombosis
US9701747B2 (en) 2007-05-21 2017-07-11 Alderbio Holdings Llc Method of improving patient survivability and quality of life by anti-IL-6 antibody administration
US8178101B2 (en) 2007-05-21 2012-05-15 Alderbio Holdings Inc. Use of anti-IL-6 antibodies having specific binding properties to treat cachexia
TWI561530B (en) 2007-05-21 2016-12-11 Alderbio Holdings Llc Antibodies to il-6 and use thereof
US7906117B2 (en) 2007-05-21 2011-03-15 Alderbio Holdings Llc Antagonists of IL-6 to prevent or treat cachexia, weakness, fatigue, and/or fever
US9452227B2 (en) 2008-11-25 2016-09-27 Alderbio Holdings Llc Methods of treating or diagnosing conditions associated with elevated IL-6 using anti-IL-6 antibodies or fragments
US8323649B2 (en) * 2008-11-25 2012-12-04 Alderbio Holdings Llc Antibodies to IL-6 and use thereof
US8420089B2 (en) 2008-11-25 2013-04-16 Alderbio Holdings Llc Antagonists of IL-6 to raise albumin and/or lower CRP
US8337847B2 (en) 2008-11-25 2012-12-25 Alderbio Holdings Llc Methods of treating anemia using anti-IL-6 antibodies
US8992920B2 (en) 2008-11-25 2015-03-31 Alderbio Holdings Llc Anti-IL-6 antibodies for the treatment of arthritis
US9212223B2 (en) 2008-11-25 2015-12-15 Alderbio Holdings Llc Antagonists of IL-6 to prevent or treat thrombosis
AU2016250478A1 (en) * 2009-11-24 2016-11-17 Alder Biopharmaceuticals, Inc. Antibodies to IL-6 and use thereof
US9775921B2 (en) 2009-11-24 2017-10-03 Alderbio Holdings Llc Subcutaneously administrable composition containing anti-IL-6 antibody
CN102740888B (zh) 2009-11-24 2016-10-12 奥尔德生物制药公司 Il-6抗体及其用途
EP2643018B1 (en) 2010-11-23 2020-10-14 AlderBio Holdings LLC Anti-il-6 antibodies for the treatment of oral mucositis
BR112013021863A2 (pt) 2011-03-03 2016-11-22 Apexigen Inc anticorpos anti-receptor il-6 e métodos de uso
CA2894160C (en) * 2012-12-07 2024-01-02 Anthrogenesis Corporation Treating oral lesions using placental extracellular matrix
US9550828B2 (en) 2013-09-05 2017-01-24 Boise State University Oncostatin M (OSM) antagonists for preventing cancer metastasis and IL-6 related disorders
WO2015191969A1 (en) * 2014-06-13 2015-12-17 Mayo Foundation For Medical Education And Research Treating lymphomas
US9840553B2 (en) 2014-06-28 2017-12-12 Kodiak Sciences Inc. Dual PDGF/VEGF antagonists
WO2016061562A2 (en) 2014-10-17 2016-04-21 Kodiak Sciences Inc. Butyrylcholinesterase zwitterionic polymer conjugates
DE102015101041A1 (de) * 2015-01-26 2016-07-28 Dr. Ing. H.C. F. Porsche Aktiengesellschaft Elektrische Ladevorrichtung, elektrische Ladestation und Verfahren zur Steuerung einer elektrischen Ladevorrichtung
US9808438B2 (en) * 2015-11-09 2017-11-07 Enzychem Lifesciences Corporation Method for treating mucositis
JP7088454B2 (ja) 2015-12-30 2022-06-21 コディアック サイエンシーズ インコーポレイテッド 抗体および抗体複合体
WO2017192933A1 (en) * 2016-05-05 2017-11-09 Weiner, David Dna monoclonal antibodies targeting il-6 and cd126
WO2018013509A1 (en) * 2016-07-11 2018-01-18 Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona Compositions and methods for diagnosing and treating arrhythmias
WO2019059943A1 (en) * 2017-09-25 2019-03-28 Obi Justice E COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE TREATMENT OF BOWEN'S DISEASE AND ASSOCIATED DISEASES
AU2019205488A1 (en) * 2018-01-04 2020-07-23 Cedars-Sinai Medical Center Use of anti-iL-6 antibody, e.g., Clazakizumab for desensitization of solid organ transplant recipients and/or for preventing, stabilizing or reducing antibody mediated rejection (ABMR)
CA3092588A1 (en) * 2018-03-02 2019-09-06 Kodiak Sciences Inc. Il-6 antibodies and fusion constructs and conjugates thereof
US20210228695A1 (en) * 2018-06-06 2021-07-29 Realta Holdings, Llc Pic1 peptide compositions and methods of use thereof for treatment of drug-induced immune hemolytic anemia
WO2020036975A1 (en) * 2018-08-14 2020-02-20 Tosk, Inc. Methods and compositions for reducing fluorouracil induced toxicity
US11633399B2 (en) 2018-12-25 2023-04-25 Sol-Gel Technologies Ltd. Treatment of skin disorders with compositions comprising an EGFR inhibitor
US11633457B2 (en) 2019-04-11 2023-04-25 Boise State University Pharmaceutical compositions comprising oncostatin m (OSM) antagonist derivatives and methods of use
US11446303B2 (en) 2019-06-21 2022-09-20 Tosk, Inc. Uridine phosphorylase (UPase) inhibitors for treatment of liver conditions
CA3157509A1 (en) 2019-10-10 2021-04-15 Kodiak Sciences Inc. Methods of treating an eye disorder
CN111588850A (zh) * 2020-02-19 2020-08-28 中国科学技术大学 Il-6受体抗体的新用途
WO2022159852A1 (en) * 2021-01-25 2022-07-28 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Methods and compositions for treating adenoid cystic carcinoma

Family Cites Families (201)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL58765A (en) 1979-11-21 1986-09-30 Yeda Res & Dev Process for the production of essentially pure messenger rna of human fibroblast interferon and process for the production of interferon beta
US5554513A (en) 1979-11-21 1996-09-10 Yeda Research & Development Co. Ltd. Production of recombinant human interferon-beta2
US4376110A (en) 1980-08-04 1983-03-08 Hybritech, Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
EP0173494A3 (en) 1984-08-27 1987-11-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Chimeric receptors by dna splicing and expression
GB8422238D0 (en) 1984-09-03 1984-10-10 Neuberger M S Chimeric proteins
US4699880A (en) 1984-09-25 1987-10-13 Immunomedics, Inc. Method of producing monoclonal anti-idiotype antibody
JPS61134325A (ja) 1984-12-04 1986-06-21 Teijin Ltd ハイブリツド抗体遺伝子の発現方法
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
JP3101690B2 (ja) 1987-03-18 2000-10-23 エス・ビィ・２・インコーポレイテッド 変性抗体の、または変性抗体に関する改良
US5677425A (en) 1987-09-04 1997-10-14 Celltech Therapeutics Limited Recombinant antibody
US5670373A (en) 1988-01-22 1997-09-23 Kishimoto; Tadamitsu Antibody to human interleukin-6 receptor
IL88375A (en) 1988-11-14 1995-07-31 Yeda Res & Dev Monoclonal antibodies that specifically bind interferon-bia 2 natural and recombinant and a natural and recombinant interferon-beta 2 purification method and method
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5216128A (en) 1989-06-01 1993-06-01 Yeda Research And Development Co., Ltd. IFN-β2/IL-6 receptor its preparation and pharmaceutical compositions containing it
DE10399036I1 (de) 1989-08-07 2004-04-01 Peptide Technology Ltd Bindeligande für Tumornekrosisfaktor.
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
US5202422A (en) 1989-10-27 1993-04-13 The Scripps Research Institute Compositions containing plant-produced glycopolypeptide multimers, multimeric proteins and method of their use
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
US6153737A (en) 1990-01-11 2000-11-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Derivatized oligonucleotides having improved uptake and other properties
US6657103B1 (en) 1990-01-12 2003-12-02 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5210075A (en) 1990-02-16 1993-05-11 Tanabe Seiyaku Co., Ltd. Interleukin 6 antagonist peptides
WO1992002551A1 (en) 1990-08-02 1992-02-20 B.R. Centre Limited Methods for the production of proteins with a desired function
ES2103770T3 (es) 1990-11-26 1997-10-01 Akzo Nobel Nv Procedimiento de produccion de anticuerpos monoclonales.
JPH06508821A (ja) 1991-03-07 1994-10-06 セラジュン　インク ウイルス病治療のための細胞表面受容体を標的とする分子の使用
US6277969B1 (en) 1991-03-18 2001-08-21 New York University Anti-TNF antibodies and peptides of human tumor necrosis factor
US5795965A (en) 1991-04-25 1998-08-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Reshaped human to human interleukin-6 receptor
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
WO1992022653A1 (en) 1991-06-14 1992-12-23 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
US6335434B1 (en) 1998-06-16 2002-01-01 Isis Pharmaceuticals, Inc., Nucleosidic and non-nucleosidic folate conjugates
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
JPH05300338A (ja) 1992-04-17 1993-11-12 Ricoh Co Ltd 複合機
CA2118508A1 (en) 1992-04-24 1993-11-11 Elizabeth S. Ward Recombinant production of immunoglobulin-like domains in prokaryotic cells
JPH05304986A (ja) 1992-04-28 1993-11-19 Tosoh Corp ｇｐ１３０蛋白質に対するモノクロ−ナル抗体
US6172208B1 (en) 1992-07-06 2001-01-09 Genzyme Corporation Oligonucleotides modified with conjugate groups
WO1994004659A1 (en) 1992-08-21 1994-03-03 United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services A novel b-lymphoma cell line and antigen
JP3525221B2 (ja) 1993-02-17 2004-05-10 味の素株式会社 免疫抑制剤
US5888511A (en) 1993-02-26 1999-03-30 Advanced Biotherapy Concepts, Inc. Treatment of autoimmune diseases, including AIDS
AU6445894A (en) 1993-03-19 1994-10-11 Duke University Method of treatment of tumors with an antibody binding to tenascin
US5856135A (en) 1993-05-31 1999-01-05 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Reshaped human antibody to human interleukin-6
EP0702516A4 (en) 1993-06-01 1998-04-22 Life Technologies Inc GENETIC IMMUNIZATION WITH CATIONIC LIPIDS
US5888510A (en) 1993-07-21 1999-03-30 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Chronic rheumatoid arthritis therapy containing IL-6 antagonist as effective component
FR2707882B1 (fr) 1993-07-23 1997-08-01 Immunotech Sa Nouveaux kits thérapeutiques anti-médiateurs protéiques, procédé de préparation et compositions pharmaceutiques les renfermant.
EP0728139B1 (en) 1993-09-03 2003-08-13 Isis Pharmaceuticals, Inc. Amine-derivatized nucleosides and oligonucleosides
NZ278607A (en) 1994-02-07 1999-05-28 Knoll Ag Use of tnf antagonists for treating disorders involving elevated serum levels of il-6 wherein the serum levels are 500pg/ml or above
US5882872A (en) 1994-04-28 1999-03-16 Kudsk; Kenneth A. Use of an IL-6 assay for predicting the development of post-trauma complications
US5646005A (en) 1994-04-28 1997-07-08 Kudsk; Kenneth A. Use of an IL-6 assay for predicting the development of post-trauma complications
US5707624A (en) 1994-06-03 1998-01-13 The Regents Of The University Of Michigan Treatment of Kaposi's sarcoma by inhibition of scatter factor
CA2168963C (en) 1994-06-07 2007-01-16 Masayuki Miyata Drug for prevention and therapy of diseases caused by fibrinoid formation or thrombus formation in the lung and model animals of the diseases
US5545623A (en) 1994-06-10 1996-08-13 Akira Matsumori Method of inhibiting secretion of inflammatory cytokines
US8017121B2 (en) 1994-06-30 2011-09-13 Chugai Seiyaku Kabushika Kaisha Chronic rheumatoid arthritis therapy containing IL-6 antagonist as effective component
DE69534530T2 (de) 1994-08-12 2006-07-06 Immunomedics, Inc. Für b-zell-lymphom und leukämiezellen spezifische immunkonjugate und humane antikörper
CN1306963C (zh) 1994-10-21 2007-03-28 岸本忠三 用于治疗il－6产生所致疾病的药物组合物
JP4079461B2 (ja) 1994-12-29 2008-04-23 中外製薬株式会社 Ｉｌ−６アンタゴニストを含んでなる抗腫瘍剤の作用増強剤
ATE330629T1 (de) 1995-02-13 2006-07-15 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Inhibitor des muskelproteinabbaus enthaltend einen il-6 rezeptor antikörper
US5801155A (en) 1995-04-03 1998-09-01 Epoch Pharmaceuticals, Inc. Covalently linked oligonucleotide minor grove binder conjugates
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
CA2230949C (en) 1995-09-28 2009-11-17 Judith Chebath Synthetic peptides that inhibit il-6 activity
US6482927B1 (en) 1995-11-27 2002-11-19 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Chimeric proteins comprising the extracellular domain of murine Ob receptor
US6841533B1 (en) 1995-12-07 2005-01-11 Peptor Limited Conformationally constrained backbone cyclized interleukin-6 antagonists
CA2250394A1 (en) 1996-03-30 1997-10-09 Boehringer Mannheim Gmbh Method for the production of activated marked tumor-specific t cells and use thereof in treatment of tumors
US6444806B1 (en) 1996-04-30 2002-09-03 Hisamitsu Pharmaceutical Co., Inc. Conjugates and methods of forming conjugates of oligonucleotides and carbohydrates
US5854398A (en) 1996-07-25 1998-12-29 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) interleukin 6 (IL-6) and uses thereof
EP0826696B1 (de) 1996-09-03 2002-05-29 GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit GmbH Verwendung bi-und trispezifischer Antikörper zur Induktion einer Tumorimmunität
US6653104B2 (en) 1996-10-17 2003-11-25 Immunomedics, Inc. Immunotoxins, comprising an internalizing antibody, directed against malignant and normal cells
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
CA2284271C (en) 1997-03-21 2012-05-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha A preventive or therapeutic agent for sensitized t cell-mediated diseases comprising il-6 antagonist as an active ingredient
US6306393B1 (en) 1997-03-24 2001-10-23 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of B-cell malignancies using anti-CD22 antibodies
TR199902800T2 (xx) 1997-05-15 2000-04-21 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Ka�eksiyi tedavi edici madde.
DE19725586C2 (de) 1997-06-17 1999-06-24 Gsf Forschungszentrum Umwelt Verfahren zur Herstellung von Zellpräparaten zur Immunisierung mittels heterologer intakter bispezifischer und/oder trispezifischer Antikörper
US20020187150A1 (en) 1997-08-15 2002-12-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Preventive and/or therapeutic agent for systemic lupus erythematosus comprising anti-IL-6 receptor antibody as an active ingredient
US6407218B1 (en) 1997-11-10 2002-06-18 Cytimmune Sciences, Inc. Method and compositions for enhancing immune response and for the production of in vitro mabs
ES2333071T5 (es) 1998-01-14 2015-08-17 Novartis Vaccines And Diagnostics S.R.L. Antígenos de Neisseria meningitidis
JP4124573B2 (ja) 1998-03-17 2008-07-23 中外製薬株式会社 Ｉｌ−６アンタゴニストを有効成分として含有する炎症性腸疾患の予防又は治療剤
EP2261229A3 (en) 1998-04-20 2011-03-23 GlycArt Biotechnology AG Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
CA2327505A1 (en) 1998-04-28 1999-11-04 Smithkline Beecham Corporation Monoclonal antibodies with reduced immunogenicity
EP0972780A1 (en) 1998-05-18 2000-01-19 Applied Research Systems ARS Holding N.V. Il-6 antagonist peptides
US6620382B1 (en) 1998-05-22 2003-09-16 Biopheresis Technologies, Llc. Method and compositions for treatment of cancers
US6300319B1 (en) 1998-06-16 2001-10-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Targeted oligonucleotide conjugates
GB9815909D0 (en) 1998-07-21 1998-09-16 Btg Int Ltd Antibody preparation
US6838290B2 (en) 1998-08-21 2005-01-04 Immunex Corporation Methods for screening compounds that affect IL-1 epsilon activity
US6335437B1 (en) 1998-09-07 2002-01-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for the preparation of conjugated oligomers
US7345217B2 (en) 1998-09-22 2008-03-18 Mendel Biotechnology, Inc. Polynucleotides and polypeptides in plants
ATE255420T1 (de) 1998-09-25 2003-12-15 Horst Lindhofer Verwendung von tumorzellen zeitversetzt in kombination mit intakten antikörpern zur immunisierung
US6989244B1 (en) 1998-10-21 2006-01-24 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for screening compounds inhibiting signal transduction through inflammatory cytokines
CA2359067C (en) 1999-01-15 2017-03-14 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
US6972125B2 (en) 1999-02-12 2005-12-06 Genetics Institute, Llc Humanized immunoglobulin reactive with B7-2 and methods of treatment therewith
US6419944B2 (en) 1999-02-24 2002-07-16 Edward L. Tobinick Cytokine antagonists for the treatment of localized disorders
EP2264166B1 (en) 1999-04-09 2016-03-23 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
CA2388245C (en) 1999-10-19 2012-01-10 Tatsuya Ogawa The use of serum-free adapted rat cells for producing heterologous polypeptides
US6342587B1 (en) 1999-10-22 2002-01-29 Ludwig Institute For Cancer Research A33 antigen specific immunoglobulin products and uses thereof
US6395437B1 (en) 1999-10-29 2002-05-28 Advanced Micro Devices, Inc. Junction profiling using a scanning voltage micrograph
US7094566B2 (en) 2000-03-16 2006-08-22 Amgen Inc., IL-17 receptor like molecules and uses thereof
US6939547B2 (en) 2000-07-31 2005-09-06 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Specific binding agents for KSHV vIL-6 that neutralize a biological activity
US6559279B1 (en) 2000-09-08 2003-05-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Process for preparing peptide derivatized oligomeric compounds
JP4261907B2 (ja) 2000-10-20 2009-05-13 中外製薬株式会社 低分子化アゴニスト抗体
WO2002034292A1 (fr) 2000-10-25 2002-05-02 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Agents preventifs ou therapeutiques contre le psoriasis renfermant l'antagoniste de l'il-6 comme substance active
JP4889187B2 (ja) 2000-10-27 2012-03-07 中外製薬株式会社 Ｉｌ−６アンタゴニストを有効成分として含有する血中ｍｍｐ−３濃度低下剤
AU2000279624A1 (en) 2000-10-27 2002-05-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Blooe vegf level-lowering agent containing il-6 antagonist as the active ingredient
IL139380A0 (en) 2000-10-31 2001-11-25 Prochon Biotech Ltd Active variants of fibroblast growth factor
US20040198661A1 (en) 2000-12-08 2004-10-07 Bowdish Katherine S. Polypeptides and antibodies derived from chronic lymphocytic leukemia cells and uses thereof
US7169573B2 (en) 2001-02-20 2007-01-30 Oklahoma Medical Research Foundation Method for monitoring coagulability and hypercoagulable states
UA80091C2 (en) 2001-04-02 2007-08-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Remedies for infant chronic arthritis-relating diseases and still's disease which contain an interleukin-6 (il-6) antagonist
EA007275B1 (ru) 2001-05-24 2006-08-25 Займодженетикс, Инк. Слитые белки taci-иммуноглобулина
JP2003066047A (ja) 2001-06-14 2003-03-05 Matsushita Electric Ind Co Ltd 免疫反応測定方法及びそれに用いる免疫反応測定用試薬
KR20040026680A (ko) 2001-07-09 2004-03-31 콤비네이토릭스, 인코포레이티드 염증 질환 치료용 조합
US20030031671A1 (en) 2001-08-01 2003-02-13 Sydney Welt Methods of treating colon cancer utilizing tumor-specific antibodies
US20030219839A1 (en) 2001-09-20 2003-11-27 Katherine Bowdish Anti-PDGF antibodies and methods for producing engineered antibodies
ATE430580T1 (de) 2001-10-25 2009-05-15 Genentech Inc Glycoprotein-zusammensetzungen
DK1562968T3 (da) 2001-11-14 2013-10-28 Janssen Biotech Inc Anti-il-6-antistoffer, sammensætninger, fremgangsmåder og anvendelser
US20040185040A1 (en) 2001-11-21 2004-09-23 Celltech R & D Limited Modulating immune responses
CA2466845A1 (en) 2001-11-21 2003-06-05 Fred Ramsdell Manipulation of cytokine levels using cd83 gene products
US7393648B2 (en) 2001-12-03 2008-07-01 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Hybrid antibodies
KR100468316B1 (ko) 2002-01-29 2005-01-27 주식회사 웰진 Ｄｎａ의 세포 또는 조직 내 전달 효율을 높이는 펩타이드
US8188231B2 (en) 2002-09-27 2012-05-29 Xencor, Inc. Optimized FC variants
MXPA04009924A (es) 2002-04-09 2005-07-01 Kyowa Hakko Kogyo Kk Celulas de genoma modificado.
GB0209884D0 (en) 2002-04-30 2002-06-05 Ares Trading Sa Proteins
US20030229030A1 (en) 2002-06-11 2003-12-11 Theoharides Theoharis C. Method of treating interleukin-6-mediated inflammatory diseases
KR101143035B1 (ko) 2002-06-14 2012-05-08 이뮤노메딕스, 인코오포레이티드 단클론 항체 ｈＰＡＭ4
WO2004003544A1 (en) 2002-06-26 2004-01-08 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the diagnosis and treatment of demyelinating inflammatory disorders
US20040086979A1 (en) 2002-08-15 2004-05-06 Dongxiao Zhang Humanized rabbit antibodies
US20060078532A1 (en) 2004-10-12 2006-04-13 Omoigui Osemwota S Method of prevention and treatment of Atherosclerosis, Peripheral vascular disease, Coronary artery disease, aging and age-related disorders including osteoporosis, arthritis, type 2 diabetes, dementia and Alzheimer's disease
US20060275294A1 (en) 2002-08-22 2006-12-07 Omoigui Osemwota S Method of prevention and treatment of aging, age-related disorders and/or age-related manifestations including atherosclerosis, peripheral vascular disease, coronary artery disease, osteoporosis, arthritis, type 2 diabetes, dementia, alzheimers disease and cancer
US20060078533A1 (en) 2004-10-12 2006-04-13 Omoigui Osemwota S Method of prevention and treatment of aging and age-related disorders including atherosclerosis, peripheral vascular disease, coronary artery disease, osteoporosis, arthritis, type 2 diabetes, dementia, alzheimer's disease and cancer
AU2003261787B2 (en) 2002-08-30 2008-11-06 Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute Human antihuman interleukin-6 antibody and fragment of the antibody
CN101972478B (zh) 2002-10-08 2012-10-31 免疫医疗公司 抗体治疗
DE60334246D1 (de) 2002-11-21 2010-10-28 Celltech R & D Inc Modulieren von immunantworten
AU2003298816C1 (en) 2002-12-02 2010-12-16 Amgen Fremont, Inc. Antibodies directed to Tumor Necrosis Factor and uses thereof
CA2510715A1 (en) 2002-12-20 2004-07-08 Enkam Pharmaceuticals A/S Method of modulation of interaction between receptor and ligand
US7534427B2 (en) 2002-12-31 2009-05-19 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of B cell malignancies and autoimmune diseases using unconjugated antibodies and conjugated antibodies and antibody combinations and fusion proteins
US20050090453A1 (en) 2003-01-15 2005-04-28 Solbec Pharmaceuticals Co., Ltd. Methods of modulating IL-6
KR101142624B1 (ko) 2003-02-24 2012-06-15 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 인터루킨-6 길항제를 함유하는 척수손상 치료제
GB2401040A (en) 2003-04-28 2004-11-03 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Method for treating interleukin-6 related diseases
US20070010529A1 (en) 2003-05-19 2007-01-11 Kanji Takahashi Nitrogenous heterocyclic compounds and medical use thereof
GB0312481D0 (en) 2003-05-30 2003-07-09 Celltech R&D Ltd Antibodies
CA2530980A1 (en) 2003-06-19 2005-01-20 Tanox, Inc. Tissue factor-specific antibodies for preventing or treating acute lung injury or acute respiratory distress syndrome
US20050048578A1 (en) 2003-06-26 2005-03-03 Epitomics, Inc. Methods of screening for monoclonal antibodies with desirable activity
WO2005009464A1 (en) 2003-07-25 2005-02-03 Lopez De Silanes Juan Administration of anti-cytokine f(ab')2 antibody fragments
JP2007520991A (ja) 2003-08-07 2007-08-02 エピトミクス インコーポレーティッド ウサギ単クローン抗体をヒト型化する方法
US20050043517A1 (en) 2003-08-20 2005-02-24 Jill Giles-Komar Method for generating antibodies
AU2004266159A1 (en) 2003-08-22 2005-03-03 Biogen Idec Ma Inc. Improved antibodies having altered effector function and methods for making the same
EP1664774A4 (en) 2003-08-29 2007-06-27 Centocor Inc RAPID MEANS FOR OBTAINING HIGH-EXPRESSION CLONES OF MAMMALIAN CELLS, ACCORDING TO A METHYLCELLULOSE SCREENING METHOD AND IMMUNOPRECIPITATION
US7392140B2 (en) 2003-09-23 2008-06-24 Prediction Sciences, Llc Cellular fibronectin as a diagnostic marker in stroke and methods of use thereof
US7634360B2 (en) 2003-09-23 2009-12-15 Prediction Sciences, LL Cellular fibronectin as a diagnostic marker in stroke and methods of use thereof
EP1690550B1 (en) 2003-10-17 2012-08-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Therapeutic agent for mesothelioma
ES2630224T3 (es) 2003-10-22 2017-08-18 Keck Graduate Institute Métodos para sintetizar polipéptidos heteromultiméricos en levadura con el uso de una estrategia de apareamiento haploide
US8617550B2 (en) 2003-12-19 2013-12-31 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Treatment of vasculitis with IL-6 antagonist
CA2572119A1 (en) 2004-06-29 2006-01-12 Warner-Lambert Company Llc Combination therapies utilizing benzamide inhibitors of the p2x7 receptor
JP2008507529A (ja) 2004-07-22 2008-03-13 アーリー ディテクション， エルエルシー 抗サイトカインレセプター抗体を用いる診断のための方法
US20060051348A1 (en) 2004-09-09 2006-03-09 Jorn Gorlach Method of producing a plurality of isolated antibodies to a plurality of cognate antigens
US20070036788A1 (en) 2004-09-22 2007-02-15 Ahmed Sheriff Use of a compound for reducing the biological effectiveness of il-6
EP1809326A4 (en) 2004-10-27 2009-11-04 Medimmune Inc MODULATION OF ANTIBODY SPECIFICITY BY MEASURING ADAPTATION OF ITS AFFINITY TO AN APPARENT ANTIGEN
US7462697B2 (en) 2004-11-08 2008-12-09 Epitomics, Inc. Methods for antibody engineering
US20060171943A1 (en) 2005-02-01 2006-08-03 Amgen Inc. Compositions and methods of treating fibrotic disorders
ITRM20050103A1 (it) 2005-03-10 2006-09-11 Rocco Savino Associazione di antagonisti della interleuchina 6 e farmaci antiproliferativi.
US20080033027A1 (en) 2005-03-21 2008-02-07 Vicus Therapeutics Spe 1, Llc Drug combination pharmaceutical compositions and methods for using them
US7431927B2 (en) 2005-03-24 2008-10-07 Epitomics, Inc. TNFα-neutralizing antibodies
PA8672101A1 (es) 2005-04-29 2006-12-07 Centocor Inc Anticuerpos anti-il-6, composiciones, métodos y usos
US20070048306A1 (en) 2005-08-30 2007-03-01 Giles-Komar Jill M Method for generating anti-variable region monoclonal antibodies
UA96141C2 (ru) 2005-12-09 2011-10-10 Юсиби Фарма, С.А. Нейтрализующее антитело, которое имеет специфичность к человеческому il-6
JP2009526087A (ja) 2005-12-22 2009-07-16 アナボレックス， インコーポレイテッド 悪液質の予防および処置のための組成物および方法
EA200870130A1 (ru) 2005-12-30 2009-02-27 Мерк Патент Гмбх Антитела против ил-6, предотвращающие связывание с gp130 комплекса ил-6 и альфа-рецептора ил-6
US7790463B2 (en) 2006-02-02 2010-09-07 Yale University Methods of determining whether a pregnant woman is at risk of developing preeclampsia
US20110059101A9 (en) 2006-03-13 2011-03-10 Ablynx N.V. Amino Acid Sequences Directed Against Il-6 And Polypetides Comprising The Same For The Treatment Of Diseases And Disorders Associated With Il-6 Mediated Signalling
US7504106B2 (en) 2006-03-14 2009-03-17 Boris Skurkovich Method and composition for treatment of renal failure with antibodies and their equivalents as partial or complete replacement for dialysis
WO2007120656A2 (en) 2006-04-10 2007-10-25 Abbott Biotechnology Ltd. Uses and compositions for treatment of rheumatoid arthritis
DK2021463T3 (en) 2006-05-19 2017-01-16 Alder Biopharmaceuticals Inc Culture method to obtain a cloned population of antigen-specific B cells
EP2021373A4 (en) 2006-05-31 2010-06-02 Hanwa Chemical Corp MONOCLONAL ANTIBODY VCAM-1 SPECIFIC
US7582298B2 (en) 2006-06-02 2009-09-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. High affinity antibodies to human IL-6 receptor
BRPI0715115A2 (pt) 2006-08-03 2013-06-04 Vaccinex Inc anticorpo monoclonal isolado, molÉcula de Ácido nucleico isolada, vetor de expressço, cÉlula hospedeira, mÉtodos para tratar uma doenÇa, e para produzir um anticorpo monoclonal isolado, uso do anticorpo monoclonal isolado, e, composiÇço farmacÊutica
NZ599144A (en) 2006-09-08 2013-10-25 Abbott Lab Interleukin -13 binding proteins
WO2008042611A2 (en) 2006-09-29 2008-04-10 Centocor, Inc. Method of using il6 antagonists with mitoxantrone for prostate cancer
AU2007317333A1 (en) 2006-11-02 2008-05-15 Seattle Genetics, Inc. Methods of treating neoplastic, autoimmune and inflammatory diseases
TW200831528A (en) 2006-11-30 2008-08-01 Astrazeneca Ab Compounds
MX343879B (es) 2007-05-21 2016-11-25 Alderbio Holdings Llc Metodo de humanizacion de anticuerpo de conejo novedoso y anticuerpos de conejo humanizados.
US9701747B2 (en) 2007-05-21 2017-07-11 Alderbio Holdings Llc Method of improving patient survivability and quality of life by anti-IL-6 antibody administration
US8062864B2 (en) 2007-05-21 2011-11-22 Alderbio Holdings Llc Nucleic acids encoding antibodies to IL-6, and recombinant production of anti-IL-6 antibodies
US8252286B2 (en) 2007-05-21 2012-08-28 Alderbio Holdings Llc Antagonists of IL-6 to prevent or treat thrombosis
US8404235B2 (en) 2007-05-21 2013-03-26 Alderbio Holdings Llc Antagonists of IL-6 to raise albumin and/or lower CRP
US7906117B2 (en) 2007-05-21 2011-03-15 Alderbio Holdings Llc Antagonists of IL-6 to prevent or treat cachexia, weakness, fatigue, and/or fever
US8178101B2 (en) 2007-05-21 2012-05-15 Alderbio Holdings Inc. Use of anti-IL-6 antibodies having specific binding properties to treat cachexia
TWI561530B (en) 2007-05-21 2016-12-11 Alderbio Holdings Llc Antibodies to il-6 and use thereof
US20090238825A1 (en) 2007-05-21 2009-09-24 Kovacevich Brian R Novel rabbit antibody humanization methods and humanized rabbit antibodies
EP2170393A4 (en) 2007-06-19 2013-01-23 Univ Johns Hopkins ANTITROMOMBOTIC AGENTS AND METHOD OF USE THEREOF
US7473171B1 (en) * 2007-07-26 2009-01-06 Cnh America Llc Molded spreader disk
US8277804B2 (en) 2008-05-21 2012-10-02 Alderbio Holdings Llc Antagonists of IL-6 to prevent or treat thrombosis
KR20110094307A (ko) 2008-11-13 2011-08-23 펨타 파마슈티컬스, 인크. 인간화된 항-ｉｌ-6 항체
US8420089B2 (en) 2008-11-25 2013-04-16 Alderbio Holdings Llc Antagonists of IL-6 to raise albumin and/or lower CRP
US8323649B2 (en) 2008-11-25 2012-12-04 Alderbio Holdings Llc Antibodies to IL-6 and use thereof
US9212223B2 (en) 2008-11-25 2015-12-15 Alderbio Holdings Llc Antagonists of IL-6 to prevent or treat thrombosis
US9452227B2 (en) 2008-11-25 2016-09-27 Alderbio Holdings Llc Methods of treating or diagnosing conditions associated with elevated IL-6 using anti-IL-6 antibodies or fragments
US8992920B2 (en) * 2008-11-25 2015-03-31 Alderbio Holdings Llc Anti-IL-6 antibodies for the treatment of arthritis
US8337847B2 (en) 2008-11-25 2012-12-25 Alderbio Holdings Llc Methods of treating anemia using anti-IL-6 antibodies
CN102438653B (zh) 2008-11-25 2019-04-23 奥尔德生物制药公司 预防或治疗恶病质、虚弱、疲劳和/或发烧il-6拮抗剂
US20120183531A1 (en) 2009-07-14 2012-07-19 Biogen Idee Ma Inc Methods for Inhibiting Yellow Color Formation in a Composition
CN102740888B (zh) 2009-11-24 2016-10-12 奥尔德生物制药公司 Il-6抗体及其用途
US9775921B2 (en) 2009-11-24 2017-10-03 Alderbio Holdings Llc Subcutaneously administrable composition containing anti-IL-6 antibody
EP2643018B1 (en) 2010-11-23 2020-10-14 AlderBio Holdings LLC Anti-il-6 antibodies for the treatment of oral mucositis
WO2015054293A1 (en) 2013-10-07 2015-04-16 Alder Biopharmaceuticals, Inc. Anti-il-6 antibodies for the treatment of psoriatic arthritis

Also Published As

Publication number Publication date
AU2017203536A1 (en) 2017-06-15
CA2818813A1 (en) 2012-05-31
EP2643018A4 (en) 2016-06-29
US20120128626A1 (en) 2012-05-24
CA2818814A1 (en) 2012-05-31
US9957321B2 (en) 2018-05-01
US8992908B2 (en) 2015-03-31
US20190023780A1 (en) 2019-01-24
WO2012071561A3 (en) 2012-08-16
US20200140539A1 (en) 2020-05-07
EP2643018B1 (en) 2020-10-14
US20120189629A1 (en) 2012-07-26
WO2012071554A3 (en) 2012-08-16
US20210332126A1 (en) 2021-10-28
WO2012071561A2 (en) 2012-05-31
US20150368337A1 (en) 2015-12-24
AU2011332810A1 (en) 2013-06-13
EP2643016A2 (en) 2013-10-02
US9304134B2 (en) 2016-04-05
AU2019250228A1 (en) 2019-11-07
AU2017203536B2 (en) 2019-07-18
US20160340423A1 (en) 2016-11-24
DK2643018T3 (da) 2021-01-18
WO2012071554A2 (en) 2012-05-31
CA2818813C (en) 2020-10-06
EP2643018A2 (en) 2013-10-02
AU2011332810A8 (en) 2013-08-01
AU2011332817A1 (en) 2013-06-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20210332126A1 (en) Anti-il-6 antibodies for the treatment of oral mucositis
US10858424B2 (en) Anti-IL-6 antibodies for the treatment of arthritis
US20180092999A1 (en) Antibodies to il-6 and use thereof
AU2009323009B2 (en) Antibodies to IL-6 and use thereof
US9775921B2 (en) Subcutaneously administrable composition containing anti-IL-6 antibody
US20100129357A1 (en) Antibodies to il-6 and use thereof
US20100150829A1 (en) Antibodies to IL-6 and use thereof
WO2015054293A1 (en) Anti-il-6 antibodies for the treatment of psoriatic arthritis
US20160130340A1 (en) Dosing regimens using anti-il-6 antibodies for the treatment of rheumatoid and psoriatic arthritis
AU2016250478A1 (en) Antibodies to IL-6 and use thereof
AU2013203976A1 (en) Antibodies to IL-6 and use thereof