JPH06508821A

JPH06508821A - ウイルス病治療のための細胞表面受容体を標的とする分子の使用

Info

Publication number: JPH06508821A
Application number: JP4508253A
Authority: JP
Inventors: ニコルス　ジェーン　シー
Original assignee: セラジュン　インク
Priority date: 1991-03-07
Filing date: 1992-03-05
Publication date: 1994-10-06
Also published as: US6074636A; CA2104958A1; EP0721340A1; AU1643692A; WO1992015318A1; NO933171L; FI933909A0; NO933171D0; EP0721340A4

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

ウィルス病治療のための細胞表面受容体を標的とする分子の使用発明の背景本発明は、ウィルス感染に関連した疾患の治療に関する。後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の病豚媒体であるヒト免疫不全ウィルス（ＨＩ　Ｖ）は、Ｔ４　（ＣＤ４＋）リンパ球及び単球／マクロファージ系（Ｈｎｅａｇｅ）のＣＤＪ＋細胞を含む特定の免疫系細胞に選択的に感染するレトロウィルスである。病期が進行すると、ＨＩ　Ｖ感染により免疫不全となり、患者は日和見感染及び新生物感受性となる。効果的な治療法がないため、ＡＩＤＳ患者の死亡率は１００％に達する（Ｆａｕｃｉ、　、Ｓ”ｃｊｅｘｅ２３９：Ｇｌ’１．１９１１１１）。１４９２３球は多くの免疫系機能において中心的な役割を演じており、ＨＩＶ感染の恐ろしい効果は、感染した１４９２３球における細胞変性効果によるものと考えられている。通常、ウィルスの活発な複製により宿主細胞は死に至る。しかし、確実に感染している宿主細胞においてはウィルスもすぐには複製せず、これらの細胞は慢性的または潜伏的に感染しているＣＰａｕｃｌ、　ｗｐ〜。慢性的感染細胞はウィルス蛋白質を低レベルで発現している；潜伏的感染細胞は組み込まれたプロウィルスを有しているが、ウィルス蛋白質を発現しない。慢性的または潜伏的感染細胞中では細胞が活性化されるまでウィルス複製は起こらないが、これらの細胞は、体内においてＨＩＶ貯蔵庫となりうる。ＨＩＶ感染の進行を遅らせるための従来のアプローチには、ＨＩＶコート蛋白質に対して作用する抗体及び抗体様分子、ウィルスの複製阻害剤、ＨＩＶにコートされる蛋白質を発現する細胞を標的とする細胞毒の使用などかある。ＨＴＬＶにコートされた蛋白質を発現する細胞を破壊する手段として、ＣＤ４受容体の一部に融合した細胞毒から成る細胞毒性ハイブリッド蛋白質が提唱された。このアプローチは、ＨＩＶエンベロープ蛋白質ｇｐ１２０が、１４９２３球及び単球／マクロファージ系の特定の細胞上に存在するＣＤ４受容体を認識するという事実に裏付けられている。このため、ＣＤ４の可溶性誘導体を、ｇｐ１２０を発現するＨＩＶ感染細胞に対する細胞毒を標的とするよう使用することができる。このアプローチは、生産的に感染した細胞（ＨＩ　Ｖが複製されている）に対して最も効果的であると思われる；このような状況下では、細胞表面においてｇｐ１２０が大量に発現していると思われる。　Ｃｈａｕｄｈａｒｙ　ｅｔ　ａｌ、　Ｃｉｈｔｗｅ３３５：３Ｇ９．１９８８）は、慢性的にＨＩＶに感染したリンパ球細胞系に対するＣ　Ｄ　４−　Ｐｓθ〃−ｏｍｓ外毒素ハイブリッド蛋白質を投与することにより、総蛋白質合成が減少することを発見した。　Ｔｉ１ｌ　ｅＬ　ａｌ、　Ｃ８ｃ／ｅｉｃｅ２４２：Ｈ６Ｂ、　１９８８）は、ＣＤ４ −リンンＡ融合蛋白質が、慢性的にＨＩＶに感染したＨ９細胞培養物のＤＮＡ合成を減少させることを発見した。この方法の変形として、Ｃａｐｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　Ｃ７，ｔｔｗθ３３７：５２９．１９８９）は、可溶性ＣＤ４及び抗体の共通領域から成るハイブリッド蛋白質を設計した。この分子は、ＨＩ　Ｖ及びＨＩＶコート蛋白質ｇｐ１２０に対する免疫系応答に作用するよう設計されている。この一般的な型の他の分子は、補体を活性化することが示された（Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ａｋｔｔｔｒｅ３３９：”１８．１９８９）。ヒト１９２８球性レトロウィルスＩ型（ＨＴＬＶ−１）は、成人Ｔ細胞白血病に関連し、熱帯性産学性不全対麻痺及びＨＴＬＶ−１関連ミニロバシーを含む他の疾患において何らかの役割を演じる。エプスタイン−バーウィルス（ＥＢＶ）はＢリンパ球性ヒトヘルペスウィルスである。ＥＢＶに感染した人の大部分は、伝染性単核球症を起こす。ＥＢＶはアフリカバーキットリンパ腫、退性鼻咽頭癌（ａｎａｐｌａｓｉｉｃ　ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ　ｃａｒｃｌｎｏｍａ　）にも関連し、また、免疫無防備状態の患者においては、リンパ球性（通常Ｂ細胞）リンパ腫にも関連する。発明の要旨一般的に本発明は、ウィルスに感染した患者を治療する方法に関する。この方法には、患者の細胞上で発現し患者の病状に寄与する蛋白質様細胞受容体に特異的に結合することができる分子（この分子は細胞の生存力を低下させる）の患者への投与が含まれる。“細胞受容体”とは、細胞ＤＮＡによりコードされ、リガントに結合し、分子の少なくとも一部分が細胞表面上に表出されるよう発現される分子を意味する。“特異的に結合する°とは、分子が、他の細胞受容体または細胞表面蛋白質に実質的に結合しないことを意味する。”生存ノｊが低下する゛とは、死滅すること、または増殖が阻害されることを意味する。“リガンド”とは、蛋白質に結合することのできる分子を意味する。好適な実施例において、ウィルスはヒト免疫不全ウィルスであり、ＨＴＬＶ−■ であり、ＥＢＶである。蛋白質様細胞受容体は、親和性の高いインターロイキン −２受容体である。分子は、細胞受容体を有する細胞を死滅させる。この分子は、共有結合により連結している第−及び第二の部分を含むハイブリッド分子であり、第一の部分には細胞の生存力を低下させることのできる分子が含まれ、第二の部分には細胞受容体に特異的に結合することができる分子が含まれる。更に好適な実施例においては、ハイブリッド分子の第二の部分は、細胞受容体に特異的な抗体の全体または結合部分を含む。“結合部分”とは、細胞受容体に特異的に結合することのできる部分を意味する。更に好適な実施例において、リガンドは増殖因子であり、インターロイキンである。更に好適な実施例において、インターロイキンはインターロイキン−４であり、インターロイキン−６である。好適な実施例において、ハイブリッド分子の第一の部分は、細胞毒を含む。さらに好適な実施例において、細胞毒は、酵素活性を有するが普遍的な真核生物受容体結合活性を示さないペプチド毒の断片である。さらに好適な実施例において、ペプチド毒の断片には、ジフテリア毒のフラグメントＡ及び細胞膜中に穴を形成するのに十分なジフテリア毒のフラグメントＢが含まれる。さらに好適な実施例において、分子はＤＡＢ　ＩＬ−２であり、ＤＡＢ３８９ＩＬ−４てあり、ＤＡＢ３８゜ＩＬ−６である。好適な実施例において、分子は、細胞受容体に特異的な抗体の全体または結合部分を含む。さらに好適な実施例において、抗体は補体活性化抗体である。本発明により、ウィルス病の治療方法が提供される。この方法は、患者のその後のウィルス感染を誘発する細胞表面受容体を有する細胞を、除去または中和する。これは、その受容体に分子（例えば、細胞毒または溶解性抗体）を標的させることにより達成される。標的とされた細胞は、ウィルスに感染した患者の感染細胞でも非感染細胞でもよい。感染細胞は、ウィルスにより細胞表面受容体を発現する。ある症例では、ウィルス病により非感染細胞の一部が特定の受容体を発現するようになり、この発現がウィルス病の病理生理学に寄与している。特定の細胞における、ウィルスに誘発された受容体の発現には次の工程が含まれる：正常な場合その細胞（または細胞の型）が決して発現しない細胞（感染細胞または非感染細胞）の受容体の発現：その細胞（または細胞の型）が正常に発現することができるが、正常な場合特定の環境下でのみ発現する細胞（感染細胞または非感染細胞）の受容体の発現：非感染細胞による発現と比較して顕著に高レベルの受容体のウィルスに関連した発現。例えば、ＨＴＬＶ−１に感染した１９２８球は、親和性の高いインターロイキン−２受容体を強力に発現する；正常な場合この受容体は、細胞が活性化された後にのみ１９２８球により発現される。その他の例においては、ＨＩＶ感染それ自体も含み、環境的事象が細胞活性化状態に関連して受容体の発現を誘引するか、または顕著に上昇させるまでは生産的なウィルス複製は起こらない。本発明の方法は、この状況にも応用することができる。要約すると、細胞受容体の、ウィルスに関連した発現には次の工程が含まれる：直接的または間接的にウィルスにより誘導される、細胞受容体の発現；ウィルス感染に引き続く、細胞受容体の発現；病状に寄与する細胞受容体の発現。親和性の高いインターロイキン２受容体（ＩＬ−２Ｒ）を発現するＨＩＶに感染した細胞及び有害な非感染細胞を死滅させるか、または中和することにより、本発明の方法をｔＶ感染の治療に使用することができる。ｌｌｙ／ｌｒａ験（下記参照）により、ＨＩＶにコートされた蛋白質の発現に先立ち、親和性の高いＩＬ −２受容体がＨＩＶ感染細胞の表面に発現することが実証され、このため、本発明の方法は、ウィルス複製の前後双方において、ＨＩＶ感染リンパ球及び単球／マクロファージを破壊するのに有用である。したがって、本発明の方法は、成熟ウィルスの生産及び放出に先立つ初期段階で、ＨＩＶ感染細胞を除去することができる。本発明の方法は、親和性の高いＩＬ−２Ｒを発現する慢性的及び潜伏的に感染した細胞を除去することができる。本発明の方法は、ＨＩＶにコードされた蛋白質よりもむしろ細胞ＤＮＡによりコードされた蛋白質を標的とするため、この方法は、いかなるＨＩＶ株に感染した患者の治療にも有用である。ＨＩＶは、特にコート蛋白質及び逆転写酵素をコードする配列において、迅速な突然変異を生しることが知られている。本発明の方法は、コート蛋白質または逆転写酵素の正確な構造に関連せずにＨＩＶに対して効果的なので、すべてのＨＩＶ変形物に対しても有効であると思われる。このことは、所定の患者が多種ウィルス集団に感染していることが多いために重要である。本発明の方法は、感染に引き続いて、例えばＩＬ−２Ｈのような細胞表面受容体の発現を誘導するすべての型のＨＩＶ（例えば、ＨＩＶ−１及びＨＩ　Ｖ　−２）　＋：を効テアル。ＥＢＶまたはＨＴＬＶ−１による感染も、これらウィルスに感染していなければ発現しないインターロイキン−２受容体を細胞表面上に発現する原因となると考えられる。このため、本発明の方法は、ＥＢＶまたはＨＴＬＶ−１による感染に起因する疾患の治療にも使用することができる。一般に、本発明の方法は、細胞表面受容体の発現の誘導に関連するいかなるウィルス感染の治療においても利用価値が高い。ウィルス感染した細胞の除去または中和に加えて、本発明の方法は、ウィルスに誘導された細胞表面受容体の発現が感染の経過または疾患の病理生理学に寄与する、ウィルス性疾患の治療にに対しても有用である。以下に記載する例における標的としてインターロイキン−２受容体か提議されているか、本発明の方法は、ウィルスにより誘導される他の受容体（例えば、イ〉ターロイキン−４受容体またはインターロイキン−６受容体）を有する細胞を標的とすることもてきる。ＨＩＶ及び免疫細胞活性化免疫細胞活性化及びそれに付随するサイトカイン生産は、ＨＩＶ感染の進行及びＨＩＶ感染の病理学的影響において非常に重要な役割を演じている。ＨＩＶに感染した細胞の活性化が、生産的感染の確立に重要であることが示されている。細胞活性化及びウィルス生産を誘導することのできる活性化シグナルには以下か含まれる・フォルポルエステル、ＵＶ照射、抗原、マイトジェン（例えば、植物性血球凝集素）、及び例えば、腫瘍壊死因子α、腫瘍壊死因子β、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子及びインターロイキン−６（ＭｃＣｕｎｅ、　（’ｅ／／６４・３５１．１９９１参照）のようなサイトカイン。ノ゛／７　Ｖｌ’Ｖθにおいて大部分のＴ細胞を占める休止Ｔ細胞は、ＨＩＶを結合し、取り込むことができる；これらの細胞はウィルスＤＮＡの合成を開始するが、ＨＩＶゲノムＲＮＡを完全長２本鎖へと変換することができない（Ｚａｃｋ　ｅｔ　ａｌ、、　ｒｇ／／６１：２１３．１９９０）　、このため、休止細胞の感染により、細胞活性化の後にのみ生産的ウィルス感染に変換される暗黒状態または潜伏状態になる。他の例では、感染細胞は部分的に活性化され、この時ウィルスの組み込みが起こり、細胞はＨＩＶ感染に対して完全に許容的となる。次いで、この細胞は休止状態に戻り、二番目の潜伏的感染を確立させることができる。１ ′７７ｙｉｔｒｔの研究により、感染細胞は潜伏状態（この時ウィルスゲノムは組み込みされている）のままでいることができるが、ウィルスの転写が非常に低いレベルで起きていることが実証された（Ｐｏｍｅｃａｎｔｚ　ｅｔ　ａｌ、、　ｆｆｇ／／６１：１２７１゜１９９０）。このような潜伏的に感染した細胞中でのウィルスＲＮＡの生産は、細胞活性化により劇的に増加する。細胞活性化は、ウィルスにコードされた蛋白質の高発現およびウィルス復製を引き起こす。高発現及びウィルス複製は、ピリオン放出及び宿主細胞の死につながる。マイトジェン及び抗原に誘導された細胞活性化が、１９２８球及び単球／マクロファージ中でのＨＩＶの発現を誘導するという事実から、ＨＩＶの活性化においてサイトカインが重要な役割を演じるという仮説が立てられた。蛋白質ＮＦ−にＢ（この蛋白質の発現は、正常な免疫細胞活性化の間に誘導される）は、細胞活性化を伴うＨＩＶ発現の増加の原因となりうる。この蛋白質はＨＩＶエンハンサ中に存在する蛋白質に結合し、他の転写因子と共に、ＨｒＶの発現（Ｌｅｎａｒｄｏ　ｅｔ　ａｌ、、　（”ｅ／／　５１１：２２７．１９８９；Ｂｏｈｎｌｅｉｎ　ａｔ　ａｌ、＋（’ｅ／１５３：８２７．１９８８　）　、及びＩＬ−２Ｈ発現の活性化（下記参照）に寄与している。正常な免疫細胞活性化及びそれに付随するサイトカイン生産は、以下を含む幾つかの時点においてＨＩＶ感染の進行に寄与している：ＨＩＶ感染の確立、生産的に感染した細胞中てのウィルス蛋白質発現及び複製の強化、及び潜伏性からの離脱。このため、ＨＩＶにより誘導される免疫抑制を患う患者への免疫刺激薬の投与は、逆説的に有害となる。なぜならば、このような薬剤は、休止Ｔリンパ球及び単球／マクロファージの活性化および増殖を誘導する可能性があり、このためウィルスの蔓延を増長するからである。ＨＩＶはそれ自体が、免疫細胞活性化及びインターロイキン−２受容体の発現を開始することもある。単球／マクロファージ系のＣＤ４＋リンパ球またはＣＤ４＋細胞のＨＩＶまたは精製ｇｐ１２０への表出により細胞活性化及び親和性の高いインターロイキン−２受容体のｐ５５サブユニット（正常な状態では、休止細胞の表面上に発現されない分子）の発現が起きることが、／／７　ｒｉｌｒ洟験により実証された（Ｘｏｒｎｆｅｌｄ　ｅｔ　ａｌ、、　／ｚ１ｗｅ３５：４４５．１９８８：Ａ１１ｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、）、　（”／／ｌｙ。／１ｙｅｓｌ、１１５：１９２．１９９０　）、これらの結果は、ＨＩＶに感染した患者において単球上の表面ＩＬ−２受容体の増加が観察されること（Ａｔ　ｆｅｎ　ａｔ　ａｔ　、　、５ｔｔｐ〜及びＨｒＶに感染した人の血清中において可溶性ＩＬ−２Ｒの増加が観察されること（Ｐｒｉｎｃｅ　ｅｔ　ａｔ、、〕 ’、１ｚｚｔｔｔｙｏ人　１４０：１１３９．　１９１１８；　５ｅｔｈｉ　ｅｔ　ａｔ、、／ｚｚｔｔ狽凾潤^、１ｅ１１、　Ｈ：１７９．　Ｉ！ｕ１３）と一致する。コノ、表面ｐ　５５ノＨＩ　Ｖｌ、：誘発サレル発現は、ＨＩＶにコードされた蛋白質の発現に先立って起こる（Ｋｏｒｎｆｅｌｄ　ｅｔ　ａｔ、、　５ｔｔｐｒｉ：　Ａ１１ｅｎ　ｅｔ　ａｔ、５ｔｔｐｒｉ　Ｆ［ｅｌｄｓ　ｅｔ　ａｌ、、Ｉ’、１ｌｕｒｅ３３３：２’ １８．１９８８：　Ｗａｈｌ　■煤@ａｌ、。１’ｔ−Ｏｒ、　、＋７１／、　ｌＣＭ、　、！；ｅｊ、　＆、Ｓ’／８６：ｆ３２１．１９１ｔ９）　Ｏ精製されたｇｐ１２０は非感染細胞を活性化することができるため、可溶性ｇｐ１２０は潜伏的に感染した細胞を活性化し、生産的感染を引き起こすことができる。さらに、可溶性ｇｐ１２０は非感染細胞を活性化することができるため、これにより、その後のこれらの細胞の感染と、ＡＩＤＳ進行の間に観察される総合的な免疫機能障害に寄与するサイトカイン及び炎症メゾイエイタの両方に対して好ましい環境を作り出す。ｊ７７ｙｉｐｏにおいてどの程度のＨＩＶまたは可溶性ｇｐ１２０の表出が、リンパ球及び単球／マクロファージを活性化するかは知られていない。本発明の方法は、Ｈ［Ｖ感染又はＨＩＶ若しくは可溶性ｇｐ１２０との接触の結果として親和性の高いＩＬ−２Ｒを不適切に発現するいかなる細胞をも、除去または中和することができる。休止リンパ球及び単球／マクロファージは親和性の高い［Ｌ−２Ｒを発現しないため、影響を受けない。サイトカインも、ＨｒＶ感染の病理学において、より間接的な役割を演している。上述の通り、リンパ球及び単球／マクロファージ可溶性ｇｐ１２０の表出により免疫細胞の活性化が誘導される（Ｋｏｒｎｆｅｌｄ　ｅｔ　ａｌ、、　５ｔｔｐｒｔｒ、　Ａ１１ｅｎ　ｅｔ　ａｔ、。５ｔｔ）ｙｙ）。これらの細胞は感染していないため、これら細胞の活性化は、免疫系機能に悪影響を及はす。活性化細胞は未成熟な分化を行ない、このため、二番目の免疫学的刺激による活性化が起こりにくくなる。この仮説は、ＨＩＶに感染した人の免疫細胞の多くが、表現型的には分化しているが機能は低下しているという事実の説明のために提唱された（Ａｌｌｅｎ　ｅｔ　ａｌ、＋　ｓｔψ ｌＩ）。さらに、活性化細胞により生産されたサイトカイン及び炎症メゾイエイタは、有害な代謝及び免疫学的効果を有する。ＨＩＶ感染の進行及びＨ［Ｖ感染の病理学的効果においてサイトカインが重要であることは、例えば、サイトカイン受容体をブロックするなど、サイトカイン作用を聞書することによりＨＩＶ感染を治療できることを示唆している。このようなアプローチは、ＨＩＶ感染、及びサイトカイン過剰発現の病理学的効果の両方を阻害することができる。このアプローチはそれ自体で使用でき、また、ウィルスに誘導された受容体を有する細胞の受容体を標的とした細胞毒が媒体する除去または中和を補うためにも使用することができる。以下に詳細に記載するのは、インターロイキン−２受容体を有する細胞に分子を標的することによるＨＩＶ感染治療のアプローチである。しかし、本発明の方法は、この受容体を有する細胞を標的とすることには限定されない。ＨＩＶ感染の治療においては、他の受容体（例えば、インターロイキン−６受容体またはインターロイキン−４受容体）を有する細胞を標的とすることが重要である。例えば、Ｂ細胞の過剰活性化がＨＩＶの進行に寄与している場合（Ａｓａｄｏｒｌ　ａｔ　ａｔ、。／ｚｍｔｙθ／　ｆｏｄｉｙｌｌ：３７４．１９９０）　、活性化されたＢ細胞上に存在するサイトカイン受容体を標的とする薬剤は、ＨＩＶ感染の制御を間接的に補助する。さらに、免疫細胞の過剰活性化が、ＨｒＶ感染において観察される、正常な免疫機能の破壊に寄与するという観点から、サイトカイン受容体を経由して活性化細胞を標的する分子は、標的された細胞それ自体が感染していないとしても、重要な治療的アプローチとなりうる。例えば本発明の方法は、ＡＩＤＳに関連した乾１の治療に有用である。乾１は表皮細胞の過剰増殖として特徴づけられ、ＩＬ−２Ｒは乾１性斑の真皮中に存在することが知られている（Ｇｏｔｔｌｌｅｂ　ｅＬ　ａｌ、、）’、　／ＪＦ、　ｊｃＭ。１）ｗｔ　１８＋６．１９８８）。表皮細胞が免疫系の一部であり、サイトカインの完全な補体を発現するため、これらの多く（例えば、ＩＬ−２、ＴＮＦ及びＧＭ−Ｃ３Ｆ）は乾１において役割を演じていると考えられており（Ｄｕｖｌｃ、）’、　／１ｙｙｔσ／、　１）ｅｒｒ。９５：３８Ｓ、　１９９０）　、これらサイトカインに対する受容体は、本発明の方法に従い有用な標的を提供するものと思われる。本発明の方法は、ＨＩＶ感染の後期に発生し　ＩＬ−２Ｒ細胞（例えば、カポシ肉腫、及びＡＩＤＳ関連リンパ腫）を存するある種の新生物の治療にも有用である。ＨＴＬＶ、ＥＢＶ及び免疫細胞活性化Ｔリンパ球のＨＴＬＶ−１感染は、一般的に、親和性の高いインターロイキン− ２受容体の持続的な発現に関連している。これら、正常細胞の活性化の後に観察される親和性の高いインターロイキン−２の発現が一過性であることと対照的である。親和性の高いインターロイキン−２受容体の持続的な発現は、強力な転写アクティベータであるＮＦ−にＢの発現を誘導するＨＴＬＶ〜Ｉｔ、ｔｔ−Ｅ遺伝子産物に媒介されると考えられている。次いで、ＮＦ−にＢは、インターロイキン−２受容体のｐ５５サブユニットの発現を刺激する。このサブユニットはｐ７０サブユニット（構成的に発現している）を結合して、親和性の高いインターロイキン−２受容体を形成する。ＨＴＬＶ−１に感染した患者は、高度の自発的リンパ球増殖を有し、これは抗原に依存するインターロイキン−２受容体の増加と一致している。さらに、親和性の高い受容体ＩＬ−２Ｈの持続的発現は、ＨＴＬＶ−［に媒介される細胞トランスフォーメーションに寄与する。関連したレトロウィルスであるＨＴＬＶ−１１も、抗原に依存するリンパ球の増殖を増加させ、インターロイキン−２受容体の発現の増加にも関係している。このため分子は、ＩＬ−２Ｒを標的として、ＨＴＬＶ−ＩまたはＨＴＬＶ−１１感染の治療に有用である。上記に概説した通り、ＮＦ−にＢはＨＩＶ及びＨＴＬＶ−１発現の両方の病理学において役割を演じている１例えば、ＨＴＬＶエンハンサはＮＦ−にＢ結合部位を２か所付し、ＮＦ−にＢの誘導によりウィルスの転写が誘導される。ＮＦ−にＢは、Ｔ細胞を活性化する同じシグナルの多く　（マイトジェン、フォルポルエステル、生理学的なＴ細胞の活性化を模倣する細胞表面マーカーに対する抗体、及びプロティンキナーゼＣのアクティベータを含む）により活性化されるため、ＮＦ−にＢは、ＨＩＶ感染の進行において重要な役割を演じる。サイトメガロウィルスを含む他のウィルスは、それらのエンハンサ中に、ＮＦ−にＢ結合部位を有する。さらに、ＨＴＬＶ−１と同様、サイトメガロウィルス及び肝炎ウィルスは・ＮＦ−にＢの発現を誘導するトランス−アクティベータをコードする。多くのウィルスはＮＦ−にＢの発現を誘導し、このようなウィルスはいずれも、それらが感染する細胞の表面にあるインターロイキン−２受容体の発現も誘導する。これらの受容体（または他の幾つかの受容体）の発現力唱導されるという観点から、これらのウィルスに起因する疾患は、本発明の方法により治療することができる。ＥＢＶ感染により、感染細胞上の親和性の高いインターロイキン−２受容体の発現が誘導されることが知られている。このため本発明の方法は、ＥＢＶに感染した細胞を死滅または中和するのに使用することができる。本発明の他の特徴および利点は、以下に記載する実施例の詳細な説明及び特許請求の範囲から明白である。発明を実施するための最良の形態４、

【図面の簡単な説明】数面図１は、ＨＩＶに感染したＣＤ４＋Ｔ細胞及び非感染ＣＤ４＋Ｔ細胞の両方の生存力に対するＤＡＢ４８６１Ｌ−２の影響をグラフに示したものである。生存細胞のパーセンテージを、感染後の日数の関数で示している。図２は、ＨＩＶに感染したＣＤ４＋Ｔ細胞及び非感染ＣＤ４＋Ｔ細胞中の蛋白質の５ＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果を示したものである。図３は、ｔＶに感染した単球及び非感染単球中に存在する逆転写酵素活性に対するＤＡＢ４ｇｅ　ＩＬ　２の影響をグラフに示したものである。逆転写酵素活性（ｃｐｍ）は、非感染細胞（白抜き）及びＨＩＶに感染した細胞（黒）についてＤＡＢ４８６ＩＬ−２１度（ｎＭ）の関数で示している。本発明の方法に有用な分子一般に、本発明の方法に有用な分子は以下の３通りに作用することができる＝（１）分子は細胞毒領域を有するため、分子は細胞を死滅させることができる；（２）補体を誘導することにより、分子（抗体）は細胞溶解を引き起こすことができる。（３）分子は受容体のリガンドの結合または取り込みを阻止することができる。３通りのすべての場合において、分子は、受容体を有する細胞を標的としている必要がある。これは、受容体のリガンド（またはその一部または派生体）、または分子の一部として抗受容体抗体を有することにより達成される。ＨＩＶ感染の治療に有用な、インターロイキン−２受容体を標的とする分子は、これら３つのアプローチの各々についての例を提供する。ＩＬ−２のＩＬ−２受容体結合部分と細胞毒を有する融合分子は、ＨＩＶに感染した活性化リンパ球及び単球／マクロファージを死滅させるのに有用である。この分子は、非感染ＩＬ −２受容体結合細胞を死滅させることもできる。このような非感染細胞は、病状に寄与していることがある。同様に、前述の第二の型の分子（補体が結合している抗体、この場合、ＩＬ−２受容体に対して作用する）は、ＨＩＶに感染した患者中の、感染しているか又は感染していない、ＩＬ−２受容体を有する細胞を除去することができる。この例においては、第３の型の分子は、ＬＬ−２がその受容体に結合するのを阻止する分子である。この分子は、感染細胞がＩＬ−２から増殖信号を受けとるのを防止し、このため、ＨＩＶ感染の広がりを遅くすることができる。ＨＩＶに感染した人のＩＬ−２Ｒを有する細胞を死滅または中和するのに有用な分子は、多くの形状を取ることができる。ＩＬ−２それ自体が標的剤である場合、分子は、ＩＬ−２が細胞毒分子（好ましくはポリペプチドｉ）に融合している、細胞毒性を示すハイブリッド分子であることが可能である。ＩＬ−２Ｈに結合し、ＩＬ−２活性を有さす、本当のＩＬ−２に結合及び／または取り込みを阻止するＩＬ−２派生体は、本発明の方法に有用である。なぜならば、これらはＩＬ −２Ｒを有する細胞の、ＩＬ−２に誘導された増殖を阻害するからである。抗ＩＬ−２Ｒ抗体が標的剤である場合、細胞毒性を示すハイブリッド分子は、抗体の全体または一部を細胞毒に融合させることにより形成することができる。このような抗体／毒素ハイブリッド（ＥＬ−２７毒素ハイブリツドなど）の有効性は、これらが結合する細胞により取り込まれるハイブリッド分子に依存する。ＩＬ− ２の結合及び／または取り込みを阻止する抗Ｉ　Ｌ−２Ｈ抗体も、本発明の方法に有用である。溶解性成ＩＬ−２Ｒ抗体は、ＩＬ−２Ｒを有する細胞に対する補体に作用し、これらを溶解させるために、この抗体は本発明に有用である。分子のいくつかは、２個またはそれ以上の分子の全体または一部の融合により形成されたハイブリッド分子でもよい。ハイブリッド分子は、組み換えＤＮＡ分子によりコードされたハイブリッド蛋白質でもよい。この場合、２つの領域はペプチド結合により（直接的に、または中間的な領域を介して）結合している。上述の代わりに、２つの領域を別個に作製し、別個の化学的結合過程による共有結合により結合することもできる。ある場合においては、ハイブリッド分子の細胞毒性領域それ自体が、２個の別個の分子から派生することもある。標的剤としてのインターロイキン−２１Ｌ−２またはいずれのＩＬ−２受容体結合派生体も、細胞毒に対する標的剤として使用することができる。ＩＬ−２のＤＮＡ及びアミノ酸配列は既知であり（Ｔａｄａｔｓｕｇｕ　ｅｔ　ａｌ、、　、１台／ｙｒｅ３０２：３０５．１９８３）　、その構造はＸ線構造解析により推定されている（Ｂｒａｎｄｈｕｂｅｒ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｓｃ／ｅｉｃｅ２３Ｂ：１”ＩＯ’１．１９ｇ？　）　ｏ遺伝的に組み換えられたＩＬ−２派生体により、どの残基がＩＬ−２Ｒの結合（Ｃｏｆｆｉｎｓ　ｅｔａｔ、、Ｐｒｏｃ、　、ｆ’ｚｌ／、　ｌｃ、ｇｔ／、　Ｓｔ／、　＃、５’／８５ニア７０９．１９８８　）及び生物活性（Ｃｏｌ＋ｅｎ @ｅｔａｌ、、　、９ｃｉｐｉｙｃｅ２３４：３４９．１９８９；　Ｃｏｆｆ１ｎｓ　ｅｔ　ａｌ、、　５ｔｔｐｒｉ）に重要であるかに関する情報が提供されてきた。本発明において有用なＩＬ−２の派生体には、残基７４及び残基７９　（Ｗｉｌｌｉａｍｓ　ａｔ　ａｌ、　、　Ｉ’ｖｃ／ｅ／ｃ　Ｉｃｅｓ　ｌｅｓ、　１６：１０４５．１９８８に従い番号をつけた）の間の領域内で１個またはそれ以上のアミノ酸残基が欠失している欠失突然変異株（Ｇｅｎｂａｕｆｆｅ　ｅｔ　ａｔ、、　ＵＳＳＮ　３ｇ１１．５５７．本発明の参考文献に取り入れられている）が含まれる。これらの突然変異体は、ＩＬ−２Ｈ結合細胞に対して効果的に毒素を標的する。一般に、細胞毒を標的するのに有用なＩＬ−２派生体は、ＩＬ −２Ｒに効率的に結合し、エンドサイト−シスされる必要がある。種々の派生体のＩＬ−２受容体への結合能は、以下に記載するＩＬ−２Ｈ結合アッセイを用いて試験することができる。Ｉ　Ｌ−２受容体を有する細胞を標的とする分子の設計において、ＩＬ−２受容体が他の受容体と同様、幾つかの形状を有することを認識している必要がある。そして、一つの形状の受容体を有する細胞のみを標的とし、他のものは標的としないことが望ましい。ヒトインターロイキン−２受容体は、親和性の高い形状、中間的な親和性を有する形状、及び親和性の低い形状を育する。親和性の高い受容体の見かけのＫ　は〜１１０−１Ｏであり、２個のサブユニット、ｐ５５及びｐ７５　（ｐ７０とも呼ばれている）から成っている。細胞表面に発現された場合、ｐ７５及びｐ５５サブユニットは両方ともＩ　Ｌ−２に結合する。ｐ７５サブユニ応する。親和性の高い受容体が活性化Ｔ細胞及びＢ細胞上に発現されるのに対して、ｐ７５サブユニットは、体止Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞単球／マクロファージ、およびリンフ才力イン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞前駆体の表面に発現される。本発明の方法においては、親和性の高い受容体をｑする細胞のみを標的とすることか望ましい。このような環境下では、有用な分子は、中間的な親和性を有する受容体、または親和性の低い受容体を有する細胞の多くには影響を及ぼさない濃度で、親和性の高いＩＬ−２受容体を有する細胞のみを除去または中和する。［Ｌ−２それ自体と同様、分子がＩＬ−２受容体の３つのクラスのＩＬ−２受容体すべてに親和性を存する場合、親和性の低い受容体を有する細胞にはほとんど結合しない濃度で分子を投与することにより、選択性を達成することができる。Ｉ〜イブリット分子の受容体親和性は、ＩＬ−２のものに修正を加えであることもある。このようなハイブリッド分子は、親和性の高いＩＬ−２受容体を有する細胞に対する選択性が、より高いか、またはより低い。例えば、親和性の高い受容体を有する細胞は、Ｄ　Ａ　８４ｇｅ　Ｉ　Ｌ　２　（ジフテリア毒の一部と、ＩＬ−２の一部から成る融合蛋白質）に対して、中間的な親和性を有する細胞よりも５００〜１０００倍選択性か高い（ＷａＬｅｒｓ　ａｔ　ａｌ、、　Ｉ’ ｗ、）’、　／ｚｚｗｏ／、　２０ニアＰ１５．１９９０）。細胞毒は、ＩＬ−２派生体に多くの方法で結合することができる。ＩＬ−２／毒素ハイブリツトは、融合遺伝子の発現により生産されるハイブリッド蛋白質であることが好ましい。その他の方法としては、細胞毒とＩＬ−２派生体を別個に生産し、その後非ペプチド共存結合により連結することかできる。連結方法は、以下に記載する。障的削としてのインターロイキン−４インターロイキン−４（ＩＬ−４）は、多様な型の細胞に作用する細胞毒である。その受容体は、ＣＤ４＋Ｔ細胞及び単球を含む多くの型の細胞の上で発現される。Ｉ　Ｌ−４は、Ｔ細胞増殖因子として作用し、また、ＩＬ−２に誘導されるリンパ球の増殖に影響を及はすと考えられている。ＩＬ−４受容体を有する細胞に作用する細胞毒は、ＩＬ−２Ｒを有する細胞に作用する分子の有効性を強化することができる。ＩＬ−４の蛋白質及びＤＮＡ配列は既知である（Ｌｅｅ　ｅｔ　ａｌ、、）、　１１，１０／、　ｎｅｔ、　２６３：１０８１７．１９８８）。ＩＬ−４を使用して、ＩＬ−２／毒素ハイブリツト分子と類似したＩＬ−４／毒素ハイブリツト分子を作製することができる。標的剤としてのモノクローナル抗体ＩＬ−２ＲＳ　ＩＬ−４Ｒまたは選択した他のいずれがの受容体に対して作用するモノクローナル抗体は、その受容体を有する細胞に毒素を作用させるために使用することができる。これらの抗体または抗体断片は、細胞毒に融合させることかできる。この融合は、ハイブリッド蛋白質分子をコードする融合遺伝子にコートされた毒素及び抗体によっても、また、別個に生産したリガンド及び毒素分子を非ペプチド共有結合により連結することによっても行なうことができる。数種の有用な毒素を以下に記載する。抗体／毒素ハイブリットの、受容体を有する細胞を死滅させる能力は、ｒＬ−２Ｒを有する細胞について以下に記載するのと類似の毒性試験を用いて試験する本発明の方法に有用な４素分子は、細胞中に存在する時のみ顕著な細胞心性を示す毒素（例えばペプチド毒）であることが好ましい。もちろんこのような環境下では、標的受容体を有する細胞に侵入できる必要がある。この能力は、分子の性質及び細胞受容体の性質に依存する。例えば、天然においてリガンドを１［−り込むことのできる細胞受容体は、その受容体を有する細胞の中に、毒素を含む分子を侵入させやすい。ペプチド毒は、ハイブリッド蛋白質分子をコードする組み換えＤＮＡ分子を作製することによりＩＬ−２Ｈ結合領域に結合していることが好ましい。このようなアプローチにより構成物は堅固なものとなる。多くのペプチド毒は、普遍的な真核生物受容体結合領域を有する；このような例においては、受容体を有しない細胞が中毒を起こさないよう毒素を修正する必要がある。このような修正はいずれも、分子の細胞毒性機能を保持する方法で行なう必要がある（Ｕ、Ｓ、　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｓ＋ａｎ　５ｅｒｖｉｃｅｓ、　Ｕ、Ｓ、　ＳｅｒmａＩ　Ｎｏ、　４０１，４１２参照）。潜在的に有用な毒素には以下が含まれるが、それらに限定されるものではない：コレラ毒、リジン、０−シグマ様毒（ＳＬＴ−Ｉ、５ＬＴ−１１，ＳＬＴ　ＨＩＶ）、ＬＴ毒、Ｃ３毒、シグマ毒、百日咳毒、破傷風前、Ｐｓｅｕｄｏｓｏｎａｓ外毒素、アロリン、サポリン、モデシン、及びゲラニン。ジフテリア毒を基盤とする分子ジフテリア毒は、本発明の方法に有用な分子を作製するのに使用することができる。ジフテリア毒の配列は既知であり、その詳細は、本発明の参考文献に取り入れられているＭｕｒｐｈｙ　米国特許第４，６７５，３８２号に記載されている。Ｃ。ｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｄｉｐｈｔｈｅｒｌａｅにより分泌される天然ジフテリア毒は、分子のアミノ末端から始まり酵素活性を有するフラグメントＡとして特徴づけられる領域（アミノ酸Ｇ１ｙ　−Ａｒｇ１９３）、及び転座領域と普遍的細胞結合領域（アミ）酸残基４７５〜５３５）を含むフラグメントＢ（アミノ酸Ｓ　ｅ　ｒ　１９４〜５ｅｒ５３５）など、幾つかの機能的領域から構成されている。ジフテリア毒が、感受性真核生物細胞を中毒する過程には、最低でも以下の過程が含まれる：　（Ｌ）ジフテリア毒の結合領域が、感受性細胞の表面上の特異的な受容体に結合する；（ｉｉ）その受容体に結合する間、毒性分子は、小胞体内に取り込まれる；（ｉｉｉ）取込みに先立ち、または小胞体中で、毒性分子は、フラグメントＡとＢとの間でプロテアーゼにより分解される；（ｔｖ）小胞体のｐＨが６以下に低下するのにともない、毒素はエンドソーム膜を横断し、フラグメントＡの細胞質ゾル中への輸送を容易にする；　（■）フラグメントＡの触媒活性（すなわち、“Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ　Ｆａｃｔｏｒ　２°と呼ばれる真核生物蛋白質合成因子の、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド依存性アデノシンニリン酸（ＡＤＰ）リボシル化）により中毒細胞は死滅する。１分子のフラグメントＡの細胞質ゾルへの導入が、細胞の蛋白質合成機構を遮断し、細胞を死滅させるのに十分なことは明白である。Ｐｓｅｕｄｏｓｏｎａｓ外毒素Ａ１及び恐らくある種の他の天然毒素による細胞死滅機構も非常に類似したものである。ジフテリア毒の受容体結合領域が、ヒトＩＬ−２の一部と置換された融合蛋白質であるＤＡＢ４８６１　Ｌ−２（Ｗｉｌｌ［ａｓｓ　ｅｔ　ａｔ、、　、／、　ｌｌ１０／、Ｑ’ｕｙｚ、　３５：２０６７３．１９９０；　Ｖｌｌｌｔａｍｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｉ’ｒｏｌｅ／ｌｙ　ｌ’ｔｙｚ、　１：４９３，１９８７も参照）は、本発明の方法にを用な分子の一例である。この分子は、ＩＬ−２Ｒを発現する腫瘍細胞及びリンパ球を選択的に死滅させる（Ｗａｔｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ、、　ｉｗ、　、／、　／ｚｚｔｍｏ／、　２０ニアｇ５．１９９０；　Ｋｌｙｏｋａｗａ　ｅｔ　ａｌ、＋　０ｉｃｅｒ　、／ｅｓ、　４９：４０４２．１９８９）　ｅ　ＤＡ　Ｂ４８ＧＩ　Ｌ　−２は活性化リンパ球を死滅させる能力を有するため、移植の拒絶反応の制御（Ｐａｎｋｅｖｙｃｚ　ｅｔ　ａｌ９、ｒｒｍ、ｆｐ／１ｊｌｉｌｊｏｉ　４７：３１１１．１９８９：　Ｈｃｋｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　）ｒｚｔｙｓｐ／ｉｊ１．ｙｌｌ盾■@４７：３２７、１９８９）　、及びある種の自己免疫疾患の治療（Ｆｏｒｔｅ　ｅｔ　ａｌ、、　／７／　Ｉｉｌｅｒｍｌｊｏｍ／　、９Ｊｉｐｏｓ／ｗ　ｏｊ／ｚｚｔｔｔｙｏｌｏｎｔｙｓ、　１９９０　）の使用されてきた。ＤＡＢ４８６１Ｌ−２は、Ｍｅｔから始まる成熟ジフテリア毒のアミノ酸残基１〜４８５がＩ　Ｌ−２のアミノ酸残基２〜１３３に融合したキメラ分子である。子のため、ＤＡＢ４８６１Ｌ−２は、分子の酵素活性を有する部分をコードするジフテリア毒フラグメントＡの全体と、フラグメントＢの一部を含む。ＤＡＢ４８６ＩＬ−２中に存在するフラグメンｌ−Ｂは普遍的な受容体結合領域を含まないが、酵素活性を有する部分の細胞質ゾルへの輸送を促進する転位領域を含む。実験方法ＤＡＢ４８６ＩＬ−２が、ＨＩＶ−１に感染したＴ細胞を死滅させ、感染細胞と非感染細胞の混合培養物からＨＩＶ−１に感染した細胞を選択的に除去し、感染単球の培養物中でのＨ［Ｖ−１の複製を減少させることを実証する実験を以下に記載する。Ｄ　Ａ　Ｂ　ｉ、８ｓ　Ｉ　Ｌ　２が、感染Ｔ細胞の培養物中でのウィルス蛋白質の生産を阻害し、感染Ｔ細胞の培養物中での感染性ＨＩＶ−１の生産を阻止することも示された。ｒＬ−２Ｒを標的とする他の分子は、以下に記載する方法を用いてスクリーニングすることができる。旦Δ旦。ｇａ　Ｉ　Ｌ　２の調製ＤＡＢ４８６　■Ｌ−２は、ＤＡＢ４８６　ＩＬ−２をコードするプラスミドｐ　ＤＷ２４　（Ｗｆｌｌｉａｅｓ　ａｔ　ａｔ、、　、／、　ｌ？ｉｏ！、　ｌ ”ｌｅｖ、　２６５：２０Ｂ７３．１９９０．　ａｍｐｒがｋａｎｒ■u換されている）を有する大腸菌中で生産した。蛋白質は、イムノアフィニティクロマトグラフィ及び高速液体クロマトグラフィにより精製した（Ｖｉｌｌｌａｉｓ　ｅｔ　ａｔ、。５ｔｔｐｒ、ｇ）　。響を与えずに、ＨＩＶ−１に感染したＴ細胞を破壊した。ＣＤＪ＋Ｔ細胞は、Ｂ細胞、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞、及びＣＤＳ＋Ｔ細胞を除去するために、ＨＩＶ−１陰性ドナーの末梢血液からネガティブセレクションにより調製した。Ｂ細胞及びマクロファージは、ガラスウールに通すことにより除去した。ＣＤＳ＋及びＣＤ１６＋細胞は、Ｈａｒｅｇｅｖｏｉｎ　ｅｔ　ａｔ、の方法（ Δｋ１ｗｅ　３４０：３０９゜１９８９）により磁気ビーズでコーティングした、抗ＣＤ８　（ＯＫＴ８、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　ＨＤ　）及び抗ＣＤ　１６　（Ｌｅｕ　ｌｌａ、　Ｂｅｃｔｉ氏| Ｄｊｃｋｉｎｓｏｎ、　Ｍｏｕｎｔａｉｎ　Ｖｉｅｗ、　ＣＡ）モノクローナル抗体を使用して除去した。細胞は、Ｉｙｍｐｈｏｃｕｌｔ−Ｔ　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉ蒙旧ｏｃｈｅｃｔｃａｌｓ、　１ｎｄｉａｎａｐｏｌｌｓ、　Ｉm；　− １０’ＮｌのＩＬ−２に対応）を添加した、ＲＰＭＩ　１６４０　（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ、　ＢｅＬｈｅｓｄａ、　ＨＤ）及び１０％ウシ胎児血清（Ｇ　Ｉ　ＢＣＯ／ＢＲＬ、　ＢｅＬｈｅｓｄａ、　ＨＤ）中において２Ｘ１０６／ｍ　Ｉで培養した。感染は、感染の１ｕｌｔｌｐｌ　１ｃｉｔｙが１０（Ｈ９細胞の限定希釈によりカリプレートした）において、ＨＴＬＶＩ　Ｉ　ＩＢ　（＠染したＨ９細胞の上清濾過物から調製した、Ａｉｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　ａｎｄ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　ＲｅａｇｅｎｔＰｒｏｇｒａｍ　ＮＩＡＩＤ、　Ｎａｔｆｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅｓ　ｏｒ　Ｈｅａｌｔｈ、　ＢｅｔｈｅｓｄａA　ＨＤ）とともに一時間インキュベートすることにより行なった。感染後１日目と３日目にＤＡＢ４８６■Ｌ−２（１０−７Ｍまたは１０−８Ｍ）を添加した。細胞培養物は１週間に２回分割し、ｔｒｙｐａｎ　ｂｌｕｅ　ｄｙｅ　ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ　ａｓｓａｙ　（Ｋｒｕｓｅ　ｅｔ　ａｌ、、　ｅｄｓ、　！１ｓｆｔｔｅ　（ ’ｕ／１ｗｅ、−Ａｆｅｌ／１Ｏｔｌｓ　Ｊｊｔｉ　１ｉｔ）／１ｃｔｙｌｊＯｔｙｓ、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　P９８９　）により生存率をｎｊ定した。殖は一過的にしか阻害されなかった。さらに、２週間培養した後の、ＤＡＢ４８６［Ｌ−２で処理した非感染Ｔ細胞の培養物及び未処理の感染Ｔ細胞の細胞濃度は同程度であった。これと対照的に、ＨＩＶ−１により感染した細胞は、１０− ８Ｍ（黒丸）または１０’Ｍ（黒四角）のＤＡＢ　ＩＬ−２と共にインキュベートすることにより除去された。この毒性効果は、細胞の生存性に必要であり、ＩＬ−２Ｈに対してＤＡＢ４８６１Ｌ−２と比較して１０〜１００倍高い親和性を有する（Ｗａｔｅｒｓ　ｅＬ　ａｌ、、　ｓｔｇｙｙ）　Ｉ　Ｌ　−２存在下（１０−９Ｍ）で細胞を培養した事実にかがイフらず、認められたものである。Ｄ　Ａ　８４ｇｅ　Ｉ　Ｌ　２により処理しながった感染細胞の２週間後の生存率は〉７５％であり、ＤＡＢ４８６１Ｌ−２が表出した細胞の生存率の低下は特異的な効果であり、これはウィルスの複製によるものではないことを示している。ＤＡＢ４８６ｒＬ−２は、ＨＩＶ−１感染及び非感染Ｔ細胞混合培養物中において、ＨＩＶ−１にコードされた蛋白質ｇｌ）１２０、ｐ５５、及びｐ２４の生産を阻害する。上述の通りに調製し、感染したＣＤ４＋Ｔ細胞を、１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ　１６４０培地中にて一部インキユベートし、同じドナーからの非感染細胞を添加する前に、同じ培地で３回洗浄した。感染Ｔ細胞（１０９）及び非装置きに細胞を沈殿させ、２回洗浄した後、！Ｌ−２を含む新しい培地中に再度懸濁した。１日目と３日目に、ＤＡＢ４８６　■Ｌ−２を処理した培養物に添加し、２４時間後洗浄することにより除去した。未処理の培養物についても同様の日程で洗浄を行なったが、ＤＡＢ４８６１Ｌ−２への表出は行なわなかった。感染してから２週間後、メチオニン非含有培地（Ｇ　Ｉ　Ｂ　ＣＯ／　Ｂ　ＲＬ、　Ｂｅｔｈｅｓｄａ、　ＨＤ）中で、３５Ｓを用いて細胞を標識した。蛋白質は、抗旧Ｖグロブリン（Ｎ［ＡＩＤ）または間質抗ＭＨＣクラス！抗体（Ｗ６／３２）のいずれかを用いて免疫沈降させた（Ｃｏｌ　Ｉｇａｎ　ｅｔ　ａｌ　、、　ｅｄｓ、　、　（’ｗｒｅｉｙｌ　ｈ０ｆｘＯ！、ｓ’　＃　１１１ｗ０１０ｆｙ、　Ｊｏｈｎ@ｖｔ　＋ｅＹ　＆５ｏｎｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９９１）　ｏ免疫沈降させた蛋白質は、ＳＤＳゲルを用いて分離し、オートラジオグラフィにより視覚化した。図２において、レーン２〜４の蛋白質は、抗ＨＩＶ抗体を用いて免疫沈降させた；レーン６〜９の蛋白質は、抗ＭＨＣクラス！抗体を用いて免疫沈降させた：レーン１は、分子量マーカーである：右側の矢印は、ＨＩＶ−１にコードされた蛋白質ｇｐ１２０．ｐ５５及びｐ２４の予想される位置を示している。ＨＩＶ−１にコードされた蛋白質ｇｐ１２０、ｐ５５及びｐ２４は未処理の混合培養物（レーン４）中に存在したが、ＤＡ８４ｇｅ　Ｉ　Ｌ　２により処理した培養物（レーン５）中では検出できなかった。予想通り、正常なＭＨＣクラス■蛋白質は、処理（レーン９）及び未処理（レーン８）両方の混合Ｔ細胞培養物中で検出された。非感染細胞の非混合培養物（レーン２及び６）及び感染細胞の非混合培養物（レーン３及び７）をコントロールとした。処理混合培養物及び未処理混合培養物の生存率は共に＞９５９６であり、これは、ＤＡＢ４８６１Ｌ−２の細胞毒性作用が感染細胞に限定されることを示している。感染Ｔ細胞及び非感染Ｔ細胞の混合培養物をＤＡＢ４８６■Ｌ−２で処理すると、ＨＩＶ−１ｐ２４蛋白質の生産が完全に排除された。この結果は、高感度のＥＬＩＳＡアッセイにより実証された。感染ＣＤ４＋Ｔ細胞及び非感染ＣＤ４＋Ｔ細胞の処理混合物及び未処理混合物は、上述の通り調製した。１週間に２回、細胞を沈殿させ、再度懸濁させて、２日後、培養上清についてＥＬＩＳＡアッセイ法（Ａｂｂｏｔｔ、　Ｃｈｉｃａｇｏ、　ＩＬ　）によりｐ２４の存在をアッセイした。表１において、未処理混合培養物中のＩ）２４のレベルは、感染後最低】８日間着実に増加した。これと対照的に、ＩＱ’ＭのＤＡＢ４８６１Ｌ−２により処理した混合培養物中では、ｐ２４は検出されなかった。この実験から、ＨＩＶ−１にコートされた蛋白質のすべての生産がＤＡ８４８６１Ｌ−２により阻止されることが実証された。表１Ｔ細胞混合培養物とＤＡＢ４８６ＩＬ−２を共にインキュベートすることによるｐ２４抗原生産の排除培養　感染　ＨＩＶ−Ｉ　Ｔ細胞　Ｔ細胞混合獲物日数　Ｔ細胞　感染Ｔ細胞　混合培養物　＋ＤＡＢ４８６１Ｌ−２１２　０　＞５００　８９　０ｔ５　０　＞５００　２９８　０ｉｓ　ｏ　＞５００　＞５００　０１　細胞洗浄後２日後の上清中のｐ２４（ピコグラム）２１日目及び３日目に添加した１０．ＭＤＡＢ４８６１　Ｌ−２ＤＡＢ４８６１Ｌ−２はＨＩＶ−１感染を阻害する感染及び非感染Ｔ細胞の混合培養物をＤＡＢ４８６１Ｌ−２で処理することにより、感染性ＨＩＶの生産が阻害された。これは、Ｈ９腫瘍細胞と、ＤＡＢ４８６■Ｌ−２により処理した感染及び非感染Ｔ細胞混合培養物の共培養におけるｐ２４の生産を、Ｈ９腫瘍細胞と、未処理の感染及び非感染Ｔ細胞混合培養物の共培養におけるｐ２４の生産と比較することにより実証された。Ｈ９１ｆｆｌ瘍細胞がＨＩＶにより容易に感染するという事実にもかかわらず、感染及び非感染Ｔ細胞混合培養物を、Ｈ９腫瘍細胞に添加する最低３日前にＤＡＢ４８６１Ｌ−２で処理した場合、共培養の培養上清中にＨＩＶ　ｐ２４は認められなかった。上述の通り、ＣＤ４＋Ｔ細胞を精製し、ＨＩＶ−１により感染させ、洗浄し、中で培養した。０．１．６及び９日目に、５Ｘ１０５のＴ細胞を回収し、洗浄し、５×１０５の非感染Ｈ９腫瘍細胞（ＮＩＡＩＤ）と共に共培養した。共培養物を６日間インキュベートした後、共培養上清中に存在するｐ２４を測定した。ｐ２４は、上述の通り、ＥＬＩＳＡアッセイ法により測定した。表２：Ｔ細胞培養物をＤＡＢ４８６１Ｌ−２と共にインキュベートすることによる感染性ウィルスの除去細胞培！Ｉ　ＤＡＢ４８６１Ｌ−２Ｈ［Ｖ−１感染後＋７１　＋）２４Ｔ細胞培養日数　共培芥６日目非感染Ｔ細胞　・・・　０ＨＩＶ感染Ｔ細胞　・・・　０　＞５００Ｔ細胞混合物　０　＞５００Ｔ細胞混合物　１０’Ｍ　Ｏ＞５００丁細胞混合物　・・・　１　＞５００Ｔ細胞混合物　１０’Ｍ　１　＞５００Ｔ細胞混合物　・・・　６　＞５００Ｔ細胞混合物　１０−８Ｍ　６　０Ｔ細細胞台物　・・・　９　＞５００丁細胞混合物　１０’Ｍ　９　０１　ピコグラムで測定表２において、感染及び非感染Ｔ細胞混合培養物をＤＡＢ４８６１Ｌ−２により処理しない場合、ｐ２４は共培養土清中に生産された。この結果は、感染性ＨＩＶが未処理混合細胞培養物中に生産されたことを示唆している。これと対照的に、２回目のＤＡＢ４８６１Ｌ−２添加後３日目または９日目に、ＤＡＢ４８６１Ｌ−２で処理した感染及び非感染Ｔ細胞混合培養物をＨ９腫瘍細胞に添加すると、共培養土清中に９２４は検出されなかった。この結果は、ＤＡＢ４８ｏＩＬ− ２処理により、感染性ＨＩＶによる感染及び非感染細胞混合培養物を除去することができることを示唆している。ＤＡＢ４８６１Ｌ−２により処理された培養物は、ＩＬ−２及び植物性血球凝東素に対して正常な応答を示し、これは、ＤＡＢ４８６１Ｌ−２による処理が一般的にはＴ細胞に対して毒性を有しないことを示している。１９１１４　）の方法に従って精製した単球の一部（１０７）を旧Ｖ−１／ＨＴＬＶの一部を、１０％ウシ胎児血清（Ｆｅ２．ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）を含有するＲＰＭｌ　１６４０に懸濁した。感染培養物及びコントロール培養物を３７°Ｃで１時間、断続的に緩やかに振盪しながらインキュベートした。次いで、細胞をＲＰＭｌ　１６４０プラス１０％ＦＣ３て洗浄し、１０％ＦＣ５，抗生物質、及びグルタミンを含有するＲＰＭＩ　１６４０中に再懸濁し、チャンバスライド上にまい添加し、その後は３０毎に添加した。感染及びコントロール単球の培養上清について、５ｐｉｒａ　ｅｔ　ａｔ、　（）、　（’／ｊｔｙ、　１ｌｉｃｒｏｌｚｔ’ｔｚ／、　２５：９７．１９８７　）の方法を修正した■ 法で逆転写酵素活性を直接アッセイした。簡単に記載すると、各培養物から上清１５μｌを回収し、３０％グリセロール及び０．５％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００を含有する緩衝液５μｍを添加して、存在するウィルスを可溶化した。５μＣｉの　Ｈ−チミジン三リン酸（２０Ｃｉ　／ｍｍｏ　ｌ　；Ｄｕ　Ｐｏｎｔ　ＮＥＮ、　Ｂｏｓｔｏｎ、　ＭＡ　）、０．４５μｇ　ポリｒＡオリゴ（１２〜１８塩基；　Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　Ｐ［ｓｃａｔａｗａｙ、　ＮＪ　）、及び１０　ｍ　Ｍ　Ｍ　ｇ　ＣＩ　２を含有する反応液２５μｍを、各測定試料に添加した。反応溶液を３７℃で２．５時間インキュベートし、反応性産物をエタノール沈殿した。図３において、１０’ＭのＤＡＢ４８６ＩＬ−２は、旧Ｖ−１に感染した単球（黒）中の逆転写酵素活性を実質的に排除した。より低濃度のＤＡＢ４８６１Ｌ− ２は、より小さい範囲で逆転写酵素活性を阻害した。ＤＡＢ４８６１Ｌ−２は、非感染細胞（白抜き）中の逆転写酵素活性のバックグラウンド測定には影響しながった。さらに、ＤＡＢ４８６１Ｌ−２により処理した培養物中に残存した付着性単球／マクロファージは生存しており、未処理細胞との形態学的な差異はなかった。ＩＬ−２受容体を有する細胞を標的とする分子を、ウィルス性疾患に関連するガン及び肉腫の治療に使用することができる。Ｂ−Ｄ藻紅素標識モノクローナル抗ＴＡＣ（抗ｐ５５）抗体を使用して、カボン肉腫に対してＩ　Ｌ−２受容体を試験した。進行したＡｆＤＳ及び散在性化学療法抵抗性カポシ肉腫を有する患者２名に対して、毎日９０分の静脈注入により５用量のＤＡ８４８６１Ｌ−２を１コース投与した。両方の患者とも、皮膚病変が約３０％後退した。ｏｓｅａｒｃｈ　７５００　ＤＮ＾合成機）。ｒＬ−４配列（Ｙｏｄｏｔａ　ｅｔ　ａｌ、＋　Ｉ’ｒｏｃ、　／＃／、　Ｉｃ１ｄ。Ｓｃｊ、　ｌ’！；１．８３：５ｇ９９４．１９１１６　）を大腸菌において好ましいコドンニーセージ（ｄｅＢｏｅｒ　ｅＬ　ａｌ、、　ｉｎ　１ｌｉｒｊｚ／ｚ／ｌｙｆ＾ｐｔｙｅ　ｈ７ｏｒｅｓｓ１０１．　ＲｅｚｎｉｋｌｏｌＴ　ｅｔ　ａｔ、A　ｅｄｓ、、　１９８Ｇ、　［３ｕｔｔｅｒ讐ｏｒｔｈｓ、　Ｂｏｓｔｏｎ　）に修正し、その後のクローニング過程を８昌にするために制限酵素切断部位を付加した。ＩＬ−４をコードする配列（Ｈｉｓ’〜５ｅｒ１２９）をｐＤＷ２７プラスミドに挿入した。ｐＤＷ２７は、ｐＤＷ２４　（Ｗｉｌｌｊａｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、）　Ｂｌｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６５＋１１８１１５．１９９０　）から、天然ジフテリア毒のアミノ酸３８８〜４８５に対応するＤＮＡを削除することにより作製したものである。合成の阻害アッセイを用いて測定した。このアッセイの結果を表３に示す。ＩＣ５ｏ（Ｍ）は、蛋白質合成を５０％減少させるのに必要なりＡＢ３８９１Ｌ　４ｏ度である。ラットの、ＣｏｎＡ活性化、正常ひ縁りンバ球は、他のいずれの細胞または細胞系よりもＤＡＢ３８９ＩＬ〜４に対する感受性が非常に小さい。ラットのインターロイキン−４受容体は、ヒトインターロイキン−４に結合しないため、この結果はＤＡＢ３８９１Ｌ−４の特異性を実証している。これらのラット細胞は、ジフテリア毒／ラットインターロイキン−４ハイブリッド分子に対して感受性がある。表３：正常及び新生物性細胞及び細胞系の、ＤＡＢ３８９［Ｌ−４感受性細胞または細胞系　分ｌＩ　ＩＣ５ｏ（Ｍ）Ｔ細胞由来ＲＬＩＴ　１０２／６ＴＧ　ｌ：　）、ＣＴＣＬ、ＩＩＴＬＶ−Ｉ　２．９　Ｘｌ０−１１Ｃ９１／ＰＬ　ヒｌ−１ＩＩＴＬＶ−Ｉ　、トラ：ｚスフｔ−ムロ、３　×ｔｏ−１１を鎖車核細胞Ｕ９３７　ヒト、組織球性リンパ腫　２．ＯＸＩＯ’非霊長類Ｃｏｎ　Ａ活性化正常　ラット　＞　１０’ひ臓Ｔ細胞見Δ旦、８９１Ｌ−６の調製ヒトインターロイキン−６をコードする合成遺伝子を合成した（ｌＩｌＩ　Ｉ　１１％ｇｅｎ／Ｂｌｏｓｅａｒｃｈ　７５００　ＤＮＡ合成機）。ＩＬ−４配列（Ｒｅｖｅｉ　ｅｔ　ａｌ、、ＥＰＡ　１１Ｂ１１４０４．９　’）を大腸菌において好ましいコドンニーセージ（ｄｅＢｏｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　ｒｔｔ）ｙ〜に修正し、その後のクローニング過程を容易にするために制限酵素切断部位を付加した。ＩＬ−４をコードする配列をＤＡＢ３８９ＩＬ−４について上記に記載した通りにｐＤＷ２７ブラスミドに挿入した。混合毒性本発明において有用な数種の分子の細胞毒性を示す部分は、混合毒素分子として提供することができる。混合毒素分子は、２個の異なるペプチド毒から派生する分子である。一般的に、ジフテリア毒に関して上記に記載した通り、ポリペプチド毒は、普遍的な真核生物細胞結合領域に加えて、酵素活性を有する領域と転位領域を有する。結合及び転位領域は、それぞれ細胞認識及び毒素侵入に必要である。酵素活性を有する領域は、分子が細胞中に侵入した後、細胞毒活性を示す。転位領域を有することが知られている天然蛋白質には、ジフテリア毒、Ｐｓθ故 ω１０／ｍ−外毒素Ａ、及び恐らく他のペプチド毒が含まれる。ジフテリア毒及び１５θ〃泳１θｊｌｓ外毒素Ａの転位領域は良く研究されており（例えば、）Ｉｏｃｈ　ｅｔ　ａｌ、、　／−θｃ、　ｉ＞Ｉｌ、　Ｉｃｍｆ、　Ｓｃｉ、　ｌ；５’４ｇ２：ｌ［ｉ９２．１９８５；　Ｃｏ１ｏｓｂａｔｔｉ　ｅｔ　ａｌ、、）、　１１P０／、　Ｃｈｉ。２６１：３０３０．１９１１１８；及びＤｅｌｅｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｆｆｌｌ、９１ｅｉｔ、　１６０：８２．１９１１３参照）、他■ 分子中のこのような領域の存在及び位置は、ｌｌｗａｎｇ　ＣＬ　ａｌ、　（’ ｃｌ／　４１１：１２９．１９１１１７；及びＧｒａｙ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　、イ；ｉ１１．　Ｉｃ、ｇｄ、　Ｓｃｉ、　＃、５’、／Ｉｌｌ：２Ｂ４５．１９８４などの■@で決定することができる。有用なＩＬ−２／混合毒素ハイブリッド分子の１つは、酵素活性を有する大腸菌シグマ様毒素のＡサブユニット（Ｃａｌｄｅｒｗｏｏｄ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｉ’ ｒｏｃ、　Ａｋｌ／、　Ｊｃｔｙｔｌ、　５ｃｉｌｓ１８４：４３Ｂ４．１９８７　）をジフテリア毒の転位領域（アミノ酸残基２０２−４６０）、及びＩＬ− ２に融合させることにより形成されている。この３部分ハイプリント分子、５ＴＬ−Ａ／ＤＴＢ−／ＩＬ−２、はＤＡＢ４８６ＩＬ−２について上記に記載したのと同様に本発明の方法において有用である。３部分ハイブリッド分子のＩＬ− ２部分は、分子をＩＬ−２Ｒを有する細胞に特異的に結合させ、ジフテリア毒転位部分は、酵素活性を有するシグマ様毒素のＡサブユニットを標的細胞中に挿入するよう作用する。酵素活性を有するシグマ様毒素は、ジフテリア毒と同様、細胞の蛋白質合成機構に作用して蛋白質合成を阻止することにより細胞を死滅させる。これら２つの型のハイブリッド毒素の間の違いは、そちらの酵素活性の性質の違いである：　ＤＡＢ４８６１　Ｌ−２の酵素部分はＥｌｏｎｇａｔｉｏｎ　Ｆａｃｔｏｒ　２のニコチンアミドジヌクレオチドによるＡＤＰ−リボシル化を触媒し、これにより、蛋白質合成に必要なこの因子（Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ　Ｆａｃｔｏｒ　２）を不活性化するのに対して、５ＴＬ−Ａ／ＤＴＢ’／ＩＬ−２の酵素部分がリボゾームＲＮＡを重要な部位で切断することのできるリボヌクレアーゼであり、これによりリボゾームを不活性化する。このため、５ＴＬ−Ａ／ＤＴＢ７１Ｌ−２ハイブリツドは、ＤＡＢ４８６１Ｌ−２と同様の使用方法で治療に有用であり、例えば、患者の活性化Ｔ細胞がＤＡＢ４８６　ＩＬ−２に対して抵抗性を示すようになった場合などに、ＤＡＢ４８６　■Ｌ−２の代わりに、またはこれと−緒に使用することができる。毒素の結合リガンドへの連結結合リガンドと、有用なハイブリッド分子の細胞毒は、数種類の方法で連結することができる。ハイブリッド分子が融合遺伝子の発現により生産される場合、ペプチド結合が、細胞毒と結合リガンドとの間の連結として作用する。その他の方法として、毒素と結合リガンドを別個に生産し、その後非ペプチド共有結合により連結することができる。例えば、共有結合はジスルフィド結合の形をとることができる。この場合、結合リガンドが例えばＩＬ−２のような蛋白質であれば、本発明の参考文献に取り入れられているＭｕｒｐｈｙ　ｅｔ　ａｌ、米国出願番号節３１３，５９９号に記載されている通りに、ＩＬ−２をコードするＤＮＡを、さらなるシスティンコドンを有するよう組み換えることができる。システィンは、分子のＩ　Ｌ−２Ｒ結合活性を阻害しないよう位置させる必要がある。例えば、システィンコドンは、成熟型ＩＬ−２のＰ　ｒ　Ｏ２をコードするＤＮＡの直ぐ上流に挿入することができる。毒素分子は、修正ＩＬ−２のシスティンと反応するメルカプト基に派生化（ｄｅｒ４ｖａｔｉｚｅｄ　）する必要がある。ペプチド毒の場合、毒素をコードするＤＮＡ配列中にシスティンコドンを挿入することにより、これを行なうことができる。その他の方法として、メルカプト基（それ自体、またはシスティン残基の一部として）は、固相ペプチド技術を用いて導入することができる。例えば、ペプチドへのメルカプト基の導入は、ｔｌｉｓｋｅｙ　Ｃ１’ｅｐ１Ｍｅｓ３：１３’１．１９８１）により記載されている。派生化も、米国特許第４，４６８，３８２号（本発明の参考文献に取り入れられている）、Ｂａｃｈａ　ｅｔ　ａｔ、により記載された、ペプチドホルモンの派生化についての方法に従って行なうことができる。蛋白質へのメルカプト基の導入は、Ｍａａｓｃｎ　ａｔ　ａｌ。（Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｌｏｃｈｅｉ、　１３４：３２．１９１１３　）中に記載されティる。正しイメルカプト基が存在すれば、細胞毒及びＩＬ−２Ｒ結合リガンドを精製し、両方の硫黄官能基を還元する：細胞毒とりガントを混合する（約１：５〜１：２０の割合で）、室温でジスルフィド結合は完成する（一般的には、２０〜３０分）。次いで、混合物をリン酸緩衝生理食塩水に対して透析して、未反応のリガンド及び毒素分子を除去する。次いて、セファデクスクロマトグラフィまたは同様のものを用いて、毒素−毒素複合物及びリガンド−リガンド複合体から、望ましい毒素−リガント複合体を分子量に基づき分離する。ＩＬ−２受容体結合及びＩＬ−４受容体結合のアッセイ種々の分子のＩＬ−２Ｒ結合能は、親和性の高い受容体に対するＩＬ−２Ｒアツセイ（Ｊｕ　ａｔ　ａｌ、、）、　ｌ／ｉｏ／、　ｎｅｉ、　２６２：５７２３．１９８７）または中間的な親和性を有する受容体に対するＩＬ−２Ｒアツセイ（Ｒｏｂ　ｅｔ　ａｌ、、／’ｒｏｔ、　Ｉｋｌ／、　ｌｃ、ｙｄ、　Ｓｃｉ、　ｔｓ’ｉｇ４・２００２．１９８７　）を用いて測定することができる。種々の分子の［Ｌ−４Ｒ結合能は、Ｐａｒｋ　ｅＬ　ａｔ、（〕、　ｌ；：Ｉβ、　ｌ／ｅｄ、　１６６：１７Ｂ、　１９８４）により記載されたアッセイまたはＰｏｘｗｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ、　ＣＩ’ｗ、ノ’、　／ｉｚｗｏ／、１９：１６３７．１９８９）により記載されたアッセイを用いて測定することができる。毒性のアッセイ本発明の分子（抗体及びハイブリッド分子双方とも）は、例えば以下に記載するようなアッセイ法により、標的受容体を有する細胞の生存性を減少させる能力についてスクリーニングすることができる。ＩＬ−２Ｒを有する細胞の毒性は、以下の通り試験することができる。培養したＨＵＴ　１０２／６　Ｔ　Ｇ　（Ｔｓｕｄｏ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、　ｔｈｌ／、　ｌｃｉ／、　Ｓｃｉ、　ｌ／８１８３：９６９４、１９８８　）またはＹ　Ｔ　２　Ｃ２（Ｔｅｓｈｉｇｉｖａｒｉ　ｅｔ　ａｌ、、）、　ｆｒｐ、　／／１９／、　１６５二２２３K １９１１７）細胞を、２５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　（ｐＨ７，４）、２ｍＭ　＋−グルラミン、１００Ｕ／ｍｌ　ペニシリン、１００．ｃｚｇ／ｍｌ　ストレプトマイシン、及び１　゛０％０％ラン血清（Ｈａｚｅｌｔｏｎ、　Ｌｅｎｅｘａ、　ＫＳ）を添加したＲＰＭＩ　１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ、　Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ、　ＮＹ　）中に保持する。完全培地の入った９６ウエルＶ底プレート（Ｌｌｎｂｒｏ−Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　ＭｃＬｅａｎ、　ＶＡ）に、各ウェル１×１０５の濃度で細胞を植える。推定される毒素を種々の濃度（１０−１２Ｍ〜１０−６Ｍ）で添加し、培養物を、５％　ＣＯ２の環境中で３７℃で１８時間インキュベートする。インキニヘーンヨン後、プレートを１７０Ｘｇで５分間遠心分離し、培地を除去して、８μｃ　ｔ、／ｍ　ｌ　（３Ｈ−ｏイリン；　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ、　Ｂｏｓｔｏｎ、　ＭＡ）を含有する１００μｍのロイシン非含有培地（Ｍ　Ｅ　ＭＳＧｉｂｃｏ　）で置換する。３７℃でさらに９０分間インキュベートした後、プレートを１７０Ｘｇで５分間遠心分離し、培地を除去して、セルハーベスタ（ｃｅｌｌ　ｈａｒｖｅｓｔｅｒ）　（Ｓｋａｔｒｏｎ、　Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、　ＶＡ　）を用いて細胞をガラス繊維フィルター上に回収する。標準的な方法により、フィルターを洗浄、乾燥及びＭＩＪＩする。培地のみを用いて培養した細胞をコントロールとする。ＩＬ−４Ｒを有する細胞に対する毒性は、ＩＬ−２Ｒを有する細胞について上記に記載したものと同様のアッセイにより試験することができるが、ＭＬＡ１４４細胞（Ｒａｂｉｎ　ｅｔ　ａｔ、　、）、　／ｚｚｔｔｔｙｏ／、　１２７：１１１５２．１９８１）またはＨＵＴ　１０２／６ＴＧ細胞を使用し、これらの細胞を各ウェル１×１０５ずつ植え、４０分間インキュベートする。治療法一般的に、本発明の分子は静脈注入により投与する。これらは皮下注入により投与することもできる。本発明の方法に有用な分子の投与量は、物質が細胞毒か溶解性抗体か、または細胞受容体阻止分子かなどの因子に依存して変化する。毒性分子の場合、細胞による取り込みの範囲が重要な因子となる；透過性の悪い分子は高い用量で投与する必要がある。１／ＩＩｔ［ｌ臨床プロトコールにおいて、６０名以上の患者がＤＡＢ４８６ＩＬ−２を投与されている。ＭＴＤの処置を受けた患者の約３０％において、一過性無症候性肝臓トランスアミラーゼ上昇により設定した最大耐性用量（ｉａｘｉ ■ｕｍ　ｔｏｌｅｒａｔｅｄ　ｄｏｓｅ）　（Ｍ　Ｔ　Ｄ　）の分子が受け入れられた。約４０％の患者において、抗腫瘍効果が見られた；Ｂｍ胞白血病及びリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、及びホジキン病において応答が見られた（ＬｅＭａｌｓｉｒｅ　ｅｔ　ａｔ、、　＃Ｑｏ／３８０ａ：ａｂｓｔｒａｃｔ　１４２９、１９９０　；　Ｗｏｏｄｗｏｒｔｈ　ｅｔ　ａｌ　、　、　Ｆｏｔｉｒ１７／ｉｌｅｒｍｌｊｏｍ／　ｔ’ｏｉｙｌｅｒｅｔｙｃｅ　i７／７　／／１ｔｚｚｊ、／ｅｌｒｏｙ／ｒｏ／ψ−１９９０゜ＩＬ−２受容体を発現する悪性疾患を有する患者において、１０’Ｍの、血清ＤＡＢ　ＩＬ−２ａ度が安全に達成された。非常に難治性の白血病／リンパ腫患者において、顕著な抗腫瘍効果が見られ、これらの効果は、すべての患者において可溶性ＩＬ−２Ｈのレベルが増加している中で生じたものである。この知見は、可溶性ＩＬ−２Ｒが、ＩＬ−２の親和性の高いインターロイキン−２受容体への結合を阻害しないというデータと一致する。動物実験及びヒトにおける実験により、ＤＡＢ４８６■Ｌ−２が一般的な免疫抑制効果を有しないことが実証されている（ＬｅＭａｉｓｔｒｅ　ｅｔ　ａｌ、＋　５ｔｔｐｒｚ、Ｗｏｏｄｖｏｒｔｈ　ｅｔ　ａｌ、、　５ｔｔｐｒＪ）。親和性の高いＩＬ−２受容体ををする細胞によるＤＡＢ４８６１Ｌ−２の結合及び取込みが表出後３０分以内に起こり、その結果、数時間以内に蛋白質合成の阻害が最大になることが、実験により示された。このため、血清半減期がかなり短くても分子は効果的である。Ｄ　Ａ　８４８６１　Ｌ　２による典型的な治療コースは、０．０２５〜０．３ｍｇ／ｋｇ／日を１０〜３０日間投与するものである。効果的な治療法を提供するために、この治療コースを数回繰り返すことができる。他の実施例上記に記載した分子は、標的細胞に細胞毒（または溶解性抗体）を作用させることにより細胞生存力を低下させるよう働く。本発明の方法に有用なものに、標的細胞がサイトカインを利用する能力を阻害する分子がある。内在性サイトカインの利用を阻止するＩＬ−２派生体または他のサイトカインは、標的細胞の増殖を防止するのに有用である。例えば、ＩＬ−２を除去された活性化細胞は、増殖することかできす、ＩＬ−２により提供される必須の同化促進刺激がないため、最終的には死に至る。ＨＩＶ感染に関しては、ＩＬ−２の利用が阻害されれば、感染過程が停止する。所定のＩＬ−２派生体の、ＩＬ−２機能の阻害能は、例えば、Ｊｕｅｔａｌ、（）、　１ｙｉｔｙ／、　ｒｋｔ、　２８２：５７２３．１９８７　）　ｌこより５己裁されたような、［Ｌ−２生物活性アツセイにより試験することができる。毒素が不活性化されているハイプリント分子も、サイトカイン受容体を阻止するのに使用することができる。ジフテリア毒分子の毒性を存しない突然変異体が示され、（υｃｌ＋ｉｄａ　ｅＬ　ａｌｌ、〕、　ｌ／ｊｏ／、　ｌ’ｌｅｚ、　２４１ｔ：３８３８．１９７３）　、この分子は、毒性を有しないＩＬ−２／ジフテリア毒ハイブリツドの作製に使用することができる。このようなハイブリッド分子の例については、Ｓｖｒｌｕｇａ　ｅｔ　ａｔ、米国出願番号第５９０，１１３号（本発明の参考文献に取り入れられている）を参照のこと。モノクローナル抗体は、多くの方法で、サイトカイン受容体を有する細胞を死滅または中和するために使用することができる。上述の通り、毒素分子に融合した抗すイト力イン受容体抗体は、受容体を有する細胞に毒素を輸送するのに使用することができる。溶解性抗すイト力イン受容体抗体それ自体が、補体を活性化することにより、サイトカイン受容体を存する細胞を死滅させることができる。例えば、補体を活性化するモノクローナル抗体は、ＩＬ−２Ｒを有する細胞を破壊するために使用することができる。補体を誘導する抗体は一般的に、ＩｇＧ１．１ｇＧ２、ＩｇＧＢ及び１ｇＭアイソタイプである。モノクローナル抗Ｉ　Ｌ −２Ｌ抗体は、以下に記載する補体依存性細胞毒性試験を用いて、補体活性化能を有するものについてスクリーニングすることができる。ヒトＴリンパ球及びＥＢＶにトランスフオームされたＢリンパ球を、５１ＣｒＳｏｄｉｕｍ　Ｃｈｒｏｍａｔｅにより標識し、標的細胞として用いる；これらの細胞を、ハイプリトーマ培養上清及び補体と共にインキュベートし、次いで、上清を回収してガンマカウンタにより計測した。活性化Ｔリンパ球に対して毒性を示すが、休止■リンパ球または体止Ｂリンパ球に対しては毒性を示さない上清を選択する（詳細は、Ｌｃｏｒ＋ａｒｄ　ｅｔ　ａｌ、、　ｙ”ｒｏｔ、　、イン／／、　Ｉｃ、ｙ／、　、９ｃ／、　＃、５’／８０：６９５７．１９８Rに記載）。虞法により、記載された抗ＩＬ−２受容体抗体を上清から精製する。抗体の特異性は、外来ＩＬ−２により活性が阻害されることを示すことにより実証することができる。サイトカインの結合及び／または取り込みを阻止する抗体も有用である。例えば、！Ｌ−２の結合及び／または取り込みを阻害するモノクローナル抗体も本発明の方法にｎｍである。なぜならば、Ｉ　Ｌ−２を除去された、Ｉ　Ｌ−２Ｒを有するＩＩ］胞は増殖することがてきないからである。阻害モノクローナル抗体（及び他の阻害分子）のＩＬ−２生物活性阻害能は、Ｊｕ　ｅｔ　ａｌ、Ｃ５ｔｔｐｒｉ）の方法を使用して試験することができる。一般的に、阻害分子にｎｍなアッセイは、受容体の天然リガンドの１つまたはそれ以上の結合を阻害する分子の能力を測定する拮抗的結合アッセイである。本発明の方法に有用なモノクローナル抗体は、ヒトｒＬ−２Ｒ”Ｔリンパ球を用いてマウスを免疫化し、マウスひ臓球（ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅｓ　）を適当な骨髄腫細胞に酌合し、その結果書られるハイブリドーマ系により生産される抗体を、必須のＩＬ−２Ｒ結合特性について、ＥＬ　Ｉ　ＳＡアッセイによりスクリーニングする。抗体作製およびスクリーニングは、Ｕｃｈｌｙａｍａ　ａｔ　ａｌ、（）、ノ’ｚｚｕｔｙｏ１．１２６：１３９３．１９８１）の方法に従って行なうことができる。その他の方法として、を用な抗体は、ｆｌｕｓ：ｅ　ｅｔ　ａｌ、（，５’ｃｉｅｔｙｃｅ２４６：１２１５．１９１ｔ９）の方法により作製したｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌライブラリーから単離することができる。本発明においては、完全なモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体のみならず、例えば、Ｆａｂまたは（Ｆ　ａ　ｂ　）　２断片；抗体重鎮（Ｈ鎖）、抗体軽鎖（［１）　：遺伝子組み換え単鎖Ｆｖ分子（Ｌａｄｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、米国特許第４，９４６゜７７８号）１または例えば、マウスの結合特性を有するが残りの部分はヒト由来であるようなキメラ抗体なとの、免疫学的に活性のある抗体断片でもよい。ＦＴＧＵＲＥ　Ｉ。感染後の日数ＭＷ　抗ＨＩＶ　抗ｗ６／３２　ＨＩＶ−１蛋白質ＦＩＧＬｒＲＥ　３− ＤＡＢ　（４８６）ＩＬ−２１１１度（ｎＭ）国際調査報告１ｍａｌｌ＋６１１１１１１−＾ｐｐｌ＋ｅ＊＋＋＋＋ｎ　Ｎｏ、ＰＣＴＩυｓ９２／Ｑ１７０％フロントページの続き（８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。ＤＫ、ＥＳ、ＰＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ、ＴＧ）、ＡＵ、ＢＢ、ＢＧ、ＢＲ，ＣＡ、Ｃ３，ＦＩ、ＨＵ、ＪＰ。ＫＰ、ＫＲ，ＬＫ、ＭＧ、ＭＮ、ＭＷ、Ｎｏ、ＰＬ、ＲＯ，ＲＵ、ＳＤ

Claims

【特許請求の範囲】

１．ウイルス感染の治療のための薬剤の調製方法、前記方法は、薬理学的に許容できる担体と共に、前記ウイルス感染の病理学に寄与する細胞上に発現される蛋白質様細胞受容体に特異的に結合することのできる分子の結合を特徴としており、前記分子は、前記細胞の生存力を低下させることができる。
２．前記ウイルスが、ヒト免疫不全ウイルスであることを特徴とする請求項１記載の方法。
３．前記ウイルスが、ＨＴＬＶ−Ｉであることを特徴とする請求項１記載の方法。
４．前記ウイルスが、ＥＢＶであることを特徴とする請求項１記載の方法。
５．前記蛋白質様細胞受容体が、親和性の高いインターロイキン−２受容体であることを特徴とする請求項１記載の方法。
６．前記分子が共有結合により相互に連結している第一及び第二の部分から成るハイブリッド分子であり、前記第一の部分が細胞の生存力を低下させることのできる分子から成り、前記第二の部分が前記細胞受容体の特典的に結合することのできる分子から成ることを特徴とする請求項１記載の方法。
７．前記第二の部分が、前記細胞受容体に対するリガンドの全体または一部から成ることを特徴とする請求項６記載の方法。
８．前記リガンドが、インターロイキンであることを特徴とする請求項７記載の方法。
９．前記第一の部分が細胞毒を含むことを特徴とする請求項６記載の方法。
１０．前記細胞毒が、酵素活性を有するが普遍的な真核生物受容体結合活性を示さないペプチド毒の断片であることを特徴とする請求項９記載の方法。
１１．前記ペプチド毒の断片が、ジフテリア毒のフラグメントＡ及び細胞膜中に穴を形成するのに十分なジフテリア毒のフラグメントＢを含むことを特徴とする請求項１０記載の方法。
１２．前記分子がＤＡＢ４８６ＩＬ−２であることを特徴とする請求項１１記載の方法。
１３．前記分子がＤＡＢ３８９ＩＬ−４であることを特徴とする請求項１１記載の方法。
１４．前記分子がＤＡＢ３８９ＩＬ−６であることを特徴とする請求項１１記載の方法。
１５．前記インターロイキンがインターロイキン−４であることを特徴とする請求項８記載の方法。
１６．前記インターロイキンがインターロイキン−６であることを特徴とする請求項８記載の方法。