WO2014189138A1 - 免疫不全ウイルス感染の治療又は予防剤 - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to a therapeutic or preventive agent for infection by viruses such as human immunodeficiency virus.
- Non-patent Documents 1 and 2 Non-patent Documents 1 and 2.
- Non-Patent Documents 3 and 4 Non-Patent Documents 3 and 4).
- Non-patent Document 5 Non-patent Document 5
- ART blood cancer
- AML blood cancer
- ART multidrug prescription was interrupted, and AML was improved by concentrating on AML treatment, but since the HIV virus exploded due to the interruption of ART, ART multidrug prescription was performed again and HIV control was also possible Regained calmness.
- AML recurred again, he was treated as a bone marrow transplant from a person with CCR5 deficiency as a further measure (Non-patent Document 6). I suddenly came up with CCR5 failure. This molecule is one of the receptor molecules used to infect HIV viruses.
- the CCR5 molecule is one of the molecules that serve as a scaffold when HIV is infected.
- CD4 molecule is the main infection scaffold, and CCR5 will be the first to establish infection. So far, it has been found that some people do not develop AIDS even if they are genetically infected, but they have shown that the CCR5 molecule is genetically defective (Non-patent Document 7). So, for bone marrow transplantation, I borrowed the bone marrow of a person with CCR5 deficiency. Since then, despite the discontinuation of ART / HIV multidrug prescriptions, HIV virus cannot continue to be detected in the blood even after more than 4 years after bone marrow transplantation, resulting in clinical remission. For example, it is considered a “miracle of Berlin”.
- Non-patent Document 8 Non-patent Document 8
- This genetic manipulation method can handle both CCR5 and CXCR4 viruses, it should be considered a very special case. This is because the HIV-infected person has developed a blood cancer called AML. Performing such genetic manipulations for general infected persons is a procedure of autologous blood collection, CD34 cell separation, genetic manipulation, culture, and transfer, which is too complicated and very expensive.
- a method using CD34 cells from another person should be considered, it is not easy to step out considering the high risk of developing serious side effects such as GVHD associated with bone marrow transplantation.
- the treatments aimed at inhibiting the spread of infection include a drug called T-20 that targets the CD4 molecule and a drug called maraviroc that targets the CCR5 and has already been approved for use.
- Marabiroc cannot be prescribed unless it is confirmed that the virus is a type of virus that uses CCR5.
- the test takes a month and is not prescribed because it is expensive.
- many emergence of resistant strains against these drugs has already been reported.
- Non-patent Document 2 a regimen that recommends an ART prescription with a CD4 count of 200 / ml to 500 / ml is recommended (Non-patent Document 2) ). That is, in the conventional therapy, CD4-expressing cells are regarded as subjects to be preserved as much as possible. There are many patients who cannot afford it because they will cause AIDS if they do not continue to take drugs for the rest of their lives. Also, if you forget to take a drug, it becomes resistant to the drug immediately, so that the drugs that can be used are limited. Or many patients suffer from the side effects of the prescribed drug itself. Neither of them is a cure from HIV.
- A.R. Zolopa The evolution of HIV treatment guidelines: current state-of-the-art of ART, Antiviral Res2010; 85: 241-244.
- M.A. Thompson et al. Antiretroviral treatment of adult HIV infection: 2012 recommendations of the International Antiviral Society-USA panel, JAMA 2012; 308: 387-402.
- M. Zeng et al. Cumulative mechanisms of lymphoid tissue fibrosis and T cell depletion in HIV-1 and SIV infections, J Clin Invest 2011; 121: 998-1008.
- J. Cohen HIV / AIDS research. Tissue says blood is misleading, confusing HIV cure efforts, Science 2011; 334: 1614.
- RNA-based gene therapy for HIV with lentiviral vector-modified CD34 (+) cells in patients undergoing transplantation for AIDS-related lymphoma DiGiusto et al., RNA-based gene therapy for HIV with lentiviral vector-modified CD34 (+) cells in patients undergoing transplantation for AIDS-related lymphoma, Sci Transl Med 2010; 2: 36ra43. S.G. Deeks, HIV: Shock and kill, Nature 2012; 487: 439-440. L. Shan et al., Stimulation of HIV-1-specific cytolytic T lymphocytes facilitates elimination of latent viral reservoir after virus reactivation, Immunity 2012; 36: 491-501.
- the inventor of the present application noted that the Berlin miracle case described above utilizes the concept of destroying the molecule itself rather than inhibiting infection with the CCR5 molecule.
- CD4 positive cells are infected, so if you target cells that have CD4 molecules, you can destroy cells that have CD4 molecules not only in infected cells but also in uninfected cells.
- the virus can only die because a new infection cannot be established even if the virus is released in vivo by cell destruction. This situation can be understood as the experience of a Berlin patient.
- the present invention was completed by discovering that even in patients with type infection, it is possible to prevent the spread of HIV infection in the body and treat viral infection.
- the present invention provides a therapeutic or prophylactic agent for immunodeficiency virus infection comprising as an active ingredient a substance that destroys at least one of cells having CD4 molecules, cells having CCR5 molecules, and cells having CXCR4 molecules. provide.
- the present invention provides a method for treating or preventing infection by the virus in the subject, which comprises destroying a cell that possesses a molecule that serves as a scaffold for viral infection that exists in the body of the subject.
- the present invention not only acute and chronic infections but also latent retrovirus infection cases in which the virus is integrated into the host chromosome is expected to cure HIV, and from the burden of continuing to take antiviral drugs throughout the lifetime.
- the patient can be released.
- it has been understood as a factor that the number of CD4 cells decreases from viral infection to the onset of AIDS, so no one has attempted to actively destroy CD4 cells.
- the present invention aims to cure the virus in the direction opposite to the conventional understanding.
- the present invention by destroying the cells in the patient's body holding the molecule that the virus serves as a scaffold for infection, the cells themselves already infected with the virus are destroyed and the spread of the virus infection in the patient's body is prevented, Aim for the final cure of the virus. If the virus loses a foothold for infection, a new infection (acute infection) will not be established, and it will be impossible for the virus to enter non-infected cells even in an already infected patient. Will be suppressed and eventually the virus will be eliminated from the body. According to this method, all cells that possess the scaffold molecule are destroyed, so even in the case of latent retrovirus infections where the virus is infected and integrated into the chromosome, the latent infected cells themselves are destroyed. In addition, the infection destination of the virus released to the outside of the cell is lost and the growth of the virus is prevented, so that the virus infection can be completely cured. Therefore, the present invention is effective not only for acute and chronic infections of various viruses but also for retrovirus cases.
- Immunodeficiency viruses such as human immunodeficiency virus and simian immunodeficiency virus use CD4 molecule as the main infection scaffold, and further enter cells using CCR5 molecule or CXCR4 molecule. Therefore, by destroying at least one of CD4 molecule-carrying cells, CCR5 molecule-carrying cells and CXCR4 molecule-carrying cells in the patient's body, the virus-infected cells themselves can be destroyed by eliminating the infection scaffold of the immunodeficiency virus, It is possible to prevent infection of non-infected cells with viruses.
- the therapeutic or preventive agent for immunodeficiency virus infection contains a substance that destroys at least one of CD4 molecule-carrying cells, CCR5 molecule-carrying cells and CXCR4 molecule-carrying cells as an active ingredient. A plurality of such substances may be contained.
- the virus infection can be treated by destroying the CCR5 molecule-bearing cells, and if the patient uses the CXCR4 molecule, the CXCR4 molecule-bearing cells can be treated, but the virus is CCR5 type or CXCR4 It takes time and money to test for type (although both types of immunodeficiency virus can be administered to a patient if both a substance that destroys CCR5 molecule-bearing cells and a substance that destroys CXCR4 molecule-bearing cells are administered to the patient). Is possible).
- the CD4 molecule can be used as a scaffold for any type of immunodeficiency virus, so there is no need to examine the type of virus. Therefore, in the present invention, it is preferable to deplete CD4 molecule-bearing cells in the patient, and the therapeutic or prophylactic agent of the present invention preferably contains a substance that specifically destroys CD4 molecule-bearing cells.
- an antibody against the molecule (more specifically, an antibody that recognizes an extracellular region of the molecule) can be preferably used.
- An anti-CD4 antibody may be used for destroying cells containing CD4 molecules
- an anti-CCR5 antibody may be used for destroying cells containing CCR5 molecules
- an anti-CXCR4 antibody may be used for destroying cells containing CXCR4 molecules.
- cytotoxic activities such as ADCC (antibody-dependent cytotoxicity) activity and CDC (complement-dependent cytotoxicity) activity.
- ADCC antibody-dependent cytotoxicity
- CDC complement-dependent cytotoxicity
- ADCC activity or CDC activity There is no problem in adopting either ADCC activity or CDC activity, but the stronger the cytotoxic activity, the smaller the amount used, the patient's physical burden and the risk of side effects can be reduced. high. For this reason, it is desired to use an antibody that has enhanced ADCC activity or CDC activity.
- Such an antibody having a strong cytotoxic activity is produced by, for example, increasing its cytotoxic activity from a monoclonal antibody produced by a known technique or a known antibody already established by a known technique in this field. can do.
- an antibody that specifically recognizes a desired target molecule and has a strong cytotoxic activity is known, such an antibody may be used as an active ingredient of the agent of the present invention.
- WO 2010/074266 discloses an anti-CD4 antibody having ADCC activity higher than that of a conventional anti-CD4 antibody.
- monoclonal antibodies include chimeric antibodies, humanized antibodies (non-human-derived antibody CDR regions transplanted to regions corresponding to human antibodies), human antibodies (non-human The same antibodies produced in the human body, produced using animal or human cell lines).
- chimeric antibodies, humanized antibodies, or human antibodies with humans can be preferably used.
- Methods for producing chimeric antibodies, humanized antibodies, and human antibodies have been established as methods well known in the art.
- an anti-CD4 human antibody can be prepared by immunizing a non-human animal such as a mouse genetically modified to produce a human antibody with a CD4 protein molecule.
- CD4 protein used as an immunogen or an appropriate fragment thereof can be easily prepared by a well-known genetic engineering technique based on such sequence information.
- One of the methods for enhancing ADCC activity is the Potergent (registered trademark) technology that removes fucose (core fucose) contained in the sugar chain present in the Fc portion of an antibody (Yamane-Ohnuki N, Satoh M). , Production of therapeutic antibodies with controlled fucosylation, MAbs2009; 1: 230-236.).
- FucT-8 FucT-8
- FucT-8 a gene encoding a recombinant antibody in an animal cell knocked out of Fut-8
- Antibody molecules with enhanced ADCC activity can be obtained (Yamane-Ohnuki N, et al., Establishment of FUT8 knockout Chinese hamster ovary cells: an ideal host cell line for producing completely defbosylated antibodies withtoxic-dependently Biotechnol Bioeng 2004; 87: 614-622.).
- the antibody that recognizes the CCR4 molecule obtained by this method has already been clinically effective because of its remarkable cell destruction function, and has developed from infection with a virus called HTLV-1. In order to apply it to the treatment of T cell leukemia, its manufacturing approval has been given in Japan. (Note that mogamulizumab treats T-cell leukemia by destroying T-cell leukemia lymphoma cells that express CCR4, not the HTLV-1 infection scaffold).
- ADCC activity examples include a method of converting a sugar chain present in the Fc site of an antibody.
- this method by adding GlcNAc of the antenna-type branched sugar chain part by GnT-III gene manipulation, core fucose addition is avoided (M. Schuster et al., Iproved effector functions of a therapeutic monoclonal Lewis Y-specific antibody by glycoform engineering, Cancer Res 2005; 65: 7934-7941.).
- An antibody with enhanced ADCC activity produced by such a technique may be used.
- Complement registered trademark
- H et al. Engineered antibodies of IgG1 / IgG3 mixed isotype with enhanced cytotoxic activities, Cancer Res. 2008; 68: 3863-3872.).
- Aclitamab (registered trademark) technology that enhances the effector activity of an antibody by combining the above-mentioned Potergent (registered trademark) technology and Complement (registered trademark) technology is also known (Natsume A, et al., Improving effector functions of antibodies for cancer treatment: Enhancing ADCC and CDC, Drug Des Devel Ther. 2009; 3: 7-16). You may use the antibody which raised both ADCC activity and CDC activity by such a technique.
- ADCC activity and CDC activity of antibodies are known and commercially available kits exist.
- human peripheral blood mononuclear cells and anti-CD4 antibody are mixed and reacted at 37 ° C. for several hours, and analyzed by flow cytometry analysis.
- flow cytometry analysis By measuring the ratio of CD3 + cells to CD8 + cells in the reaction solution, and comparing the measured values with those obtained using anti-CD4 antibodies that do not have ADCC activity, the ADCC activity of anti-CD4 antibodies is increased. Can be evaluated.
- an antibody against the molecule or an antigen-binding fragment thereof, to which a cytotoxic component is bound can also be used as a means for specifically destroying a cell having a specific molecule present in the patient.
- the antibody may not have a high cytotoxic activity, and cells possessing each molecule are damaged by the cytotoxic component.
- Those obtained by binding a cytotoxic component to an antibody fragment (antigen-binding fragment) that maintains the binding property to the target molecule can also be used as the active ingredient of the agent of the present invention.
- cytotoxic component refers to a substance having an activity of destroying living cells, and includes biologically derived toxic substances, chemical substances, radioactive substances and the like.
- the antigen-binding fragment may be any antibody fragment as long as the binding property of the original antibody to the corresponding antigen (antigen-antibody reactivity) is maintained.
- Specific examples include, but are not limited to, Fab, F (ab ′) 2 , scFv, and the like.
- Fab and F (ab ′) 2 can be obtained by treating a monoclonal antibody with a proteolytic enzyme such as papain or pepsin.
- a method for producing scFv single chain fragment of variable region is also well known.
- mRNA of a hybridoma produced as described above is extracted, single-stranded cDNA is prepared, and immunoglobulin H chain and L PCR is carried out using primers specific to the chain to amplify the immunoglobulin H chain gene and L chain gene, and these are ligated with a linker, added with an appropriate restriction enzyme site, and introduced into a plasmid vector.
- ScFv can be obtained by transforming E. coli to express scFv and recovering it from E. coli.
- the dose of the agent of the present invention may be an amount that can deplete the target cells in the patient body.
- the dose may vary depending on the cytotoxic activity of the active ingredient, the patient's age, weight, etc., but is usually about 0.01 ⁇ g / kg to 200 mg / kg, for example, 10 ⁇ g / kg to 150 mg / kg at a single dose. Can be a degree.
- the administration route may be oral or parenteral, but parenteral administration such as intravenous administration, intraarterial administration, intramuscular administration and subcutaneous administration is preferred. It can be prepared and used as an injection or infusion.
- Administration of the agent of the present invention may be continued for a period of several weeks to several months or longer until no virus in the patient is detected.
- administration of the above-mentioned dosage is continued once a day to several days. can do.
- the administration interval can be appropriately determined according to the blood metabolism of the substance used as the active ingredient.
- the blood metabolism of the antibody is usually about 10 to 14 days, so that the administration can be continued twice or more at intervals of about 1 to 2 weeks.
- the treatment may be carried out appropriately while confirming that the target cells in the patient are destroyed by flow cytometry analysis or the like.
- the cell depletion treatment is performed until no virus is detected in the patient.
- the cells to be depleted are part of immune cells, so the patient should be managed in a sterile condition during the period of treatment to deplete CD4 cells etc. in the patient's body Should be addressed with attention to health.
- an active ingredient such as an anti-CD4 antibody is metabolized in the patient
- hematopoietic stem cell-derived CD4-bearing cells are naturally generated in the patient.
- the recovery time of the cells can be freely controlled. Cell recovery can also be confirmed by flow cytometry analysis as appropriate.
- anti-CD4 humanized antibody IT1208 (including HV2 and LV0 described in WO 2010/074266 as a variable region) The type was IgG1).
- the antibody binding activity measured using Biacore T100 was K D (nM) ⁇ 0.009 and had high binding activity.
- CD3-positive cells were detected using an anti-CD3 antibody labeled with FITC, and CD8-positive cells were detected using an anti-CD8 antibody labeled with phycoerythrin.
- the ratio (%) of the number of CD3 positive cells to the number of CD8 positive cells was calculated, and the number of CD4 positive cells was examined (100% of the number of CD3 positive cells / the number of CD8 positive cells means zero CD4 positive cells).
- ADCC activity of anti-CD4 humanized antibody IT1208 (2) According to the protocol of ADCC activity measurement kit commercially available from Promega, the ADCC activity of IT1208 was measured under the following conditions. Add 125,000 healthy PBMCs, anti-CD4mAb (IT1208), and 75000 ADCC Bioassay Effector cells included in the Promega kit, mix gently, and then incubate in a CO 2 incubator at 37 ° C for 6 hours. A luminescence reagent, Bio-Glo reagent, was added, incubated at room temperature for 20 minutes, and chemiluminescence was measured with a luminescence plate reader.
- FIG. IT1208 exhibits ADCC activity at 1 nM or more, and increases in a concentration-dependent manner, reaching a maximum value at 50 nM.
- Rituximab (antiCD20) used as a control antibody had ADCC activity starting at a concentration of 10 nM or higher and reaching a maximum concentration of 1 ⁇ M or higher.
- anti-HIV drugs saliva (saquinavir (Chugai Pharmaceutical), lopinavir / ritonavir (Abbott Laboratories), atazanavir (Bristol-Myers-Squibb)) that have been used in that state are administered, and HIV virus copies are detected in the blood. Raised until impossible.
- Anti-CD4 mAb IT1208 was administered to an individual whose blood viral copy number was below the detection limit by the conventional HIV virus detection method by PCR and observed.
- IT1208 was administered to monkeys at 40 mg / kg (four intravenous injections at weekly intervals), and flow cytometric analysis of the number of T4 cells bearing CD4 in venous blood, lymph nodes and rectum (fluorescent dye-labeled anti-CD4 antibody was added) The direct method used was measured.
- the venous blood sample was obtained by collecting blood from the inguinal region after anesthetizing the monkey with ketamine + xylazine. *
- Lymph node samples were prepared as follows. After anesthetizing the monkey with ketamine + xylazine, the axilla was incised about 1-2 cm with a scalpel and the lymph nodes were collected in a 50 ml tube. After lymph node tissue was washed twice with Hank's solution (HBSS), 30 minutes at 37 ° C in Hank's solution (HBSS) supplemented with collagenase (final concentration 1.0 mg / ml) and DNase I (final concentration 20 ⁇ g / ml). Incubated at 150 rpm. After passing through a 70 ⁇ m cell strainer, the tissue was ground, washed and collected to obtain a lymph node sample.
- HBSS Hank's solution
- HBSS Hank's solution
- DNase I final concentration 20 ⁇ g / ml
- Rectal samples were prepared as follows. The monkeys were anesthetized with ketamine + xylazine, laid down on a dissecting table, opened in the anus with an anoscope, and 10 pieces of rectal tissue were sampled with biopsy forceps. Place rectal tissue in a 50 mL tube, add an appropriate amount of MACSbuffer (0.5% BSA-2 mMEDTAinPBS (-)), vortex for 10 seconds, pass through a tea strainer to collect the mucosal epithelial layer (liquid layer), and Collected in a separate tube. This washing process was repeated until the buffer did not become cloudy.
- MACSbuffer 0.5% BSA-2 mMEDTAinPBS (-)
- the washed tissue was transferred to a conical tube, 25 mL of predigestion solution was added, and the mixture was shaken with MACSmix (trade name) TubeTRotator (130-090-753) at 37 ° C. for 30 minutes.
- the tube was vortexed for 10 seconds, then passed through a tea strainer to collect the mucosal epithelial layer (liquid layer), and the intestinal tract was collected in another tube.
- An appropriate amount of MACS buffer was added, vortexed for 10 seconds, passed through a tea strainer to recover the mucosal epithelial layer (liquid layer), and the intestinal tract was recovered in another tube. This washing process was repeated until the buffer did not become cloudy.
- HBSS (+) with 10 mM HEPES (or RPMI1640) was added and vortexed for 10 seconds. This was passed through a tea strainer to recover the mucosal epithelial layer (liquid layer), and the intestinal tract was recovered in another tube.
- tissue and 2.5 mL of enzyme mix were placed in gentleMACS® C tube and gently dispersed with gentleMACS TM Dissociator (m_brain — 01). The mixture was shaken at 37 ° C. for 30 minutes using MACSmixTM Tube Rotator (130-090-753) and completely dispersed with gentleMACSTM® Dissociator (m_intestine_01).
- the cell suspension (cells derived from the lamina propria) was collected, diluted with an appropriate amount of MACS buffer, and passed through Pre-Separation filter (70 ⁇ m, 130-095-823). After washing the cells with MACS® buffer (4 ° C., 300 ⁇ g, centrifugation for 10 minutes), the supernatant was discarded and resuspended in an appropriate amount of MACS® buffer to obtain a rectal sample for flow cytometry analysis.
- Fig. 3 shows the results of flow cytometry analysis.
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Abstract
ウイルスの急性感染及び慢性感染のみならず、宿主染色体への組み込みが生じている潜在型のレトロウイルス感染をも根治を可能とする新規な手段が開示されている。本発明では、ウイルスが感染の足場とする分子を保有する患者体内の細胞を破壊することにより、既にウイルスに感染している細胞そのものを破壊するとともに患者体内でのウイルス感染の拡大を阻止し、最終的な根治を目指す。免疫不全ウイルス感染の治療においては、高い細胞傷害活性を有する抗体等を患者に投与して、患者体内のCD4分子保有細胞、CCR5分子保有細胞及びCXCR4分子保有細胞の少なくともいずれか、好ましくはCD4分子保有細胞を破壊すればよい。
Description
本発明は、ヒト免疫不全ウイルス等のウイルスによる感染の治療又は予防剤に関する。
HIVウイルス感染は後天性免疫不全症候群（いわゆるAIDS）を発症し、経年後に死に至る感染症として恐れられてきた。しかし人々の努力により、ウイルスのライフサイクルの研究の成果として各ステップに対する阻害剤が開発され、特にいくつかのステップを同時に阻害する方法（cART）が導入され、根治はないが、AIDSの発症をコントロールできるまでには至っている。即ち、血中のRNAウイルス検出はできない状況を継続することはできる（非特許文献1,2）。しかし、実はリンパ節、腸内組織中にもウイルスが存在する事が判明している（非特許文献3,4）。ほとんどはウイルスがレトロウイルスであるために、宿主細胞中の染色体に組み込まれた状態で眠っている状態で存在しているがために根治はしないと考えられている。従って、一生涯の薬剤費用が莫大になる事、飲み忘れによる薬剤耐性の発生、更には薬剤の副作用が問題となっており、根治を目指す機運が高まっている（非特許文献5）。
ベルリンに居住しているHIV感染患者について紹介すると、多剤処方（ART）を受けていた患者が血液癌（AML）を併発した。最初は抗HIV処方（ART）を中断し、AML治療に集中しAMLは改善されたが、ART中断したためにHIVウイルスが爆発的に増殖したので改めてART多剤処方が行われ、HIV制御もでき落ち着きを取り戻した。しかしながら再度AMLを再発したために、窮余の策としてCCR5不全の人からの骨髄移植という治療を受けた（非特許文献6）。ここで突如CCR5不全という事が出てきたが説明しておく。この分子はHIVウイルスが感染するにあたり利用する受容体分子の一つである。即ちCCR5分子はHIVが感染する際に足場となる分子の一つである。CD4分子が主たる感染の足場で、CCR5が共同して初めて感染が成立する。これまでに遺伝的に感染してもAIDSを発症しない人がいることが判明していたが、彼らはCCR5分子が遺伝的に不全という事が示されている（非特許文献7）。そこで骨髄移植にあたり、CCR5不全の人の骨髄を拝借したのである。それ以来ART・HIV多剤処方を中止しているにも係らず、骨髄移植後4年以上経っても血中にはHIVウイルスが検出できない状況が続いていて、臨床的には寛解状態に至ったとして、「ベルリンの奇跡」とされている。
ただし、HIVウイルスによってはCCR5ではなくCXCR4という異なる受容体分子を足場にするHIVウイルスも存在するために、CCR5不全の骨髄移植だけでは問題を残してしまう。CXCR4の人での多型遺伝子状態と発症との関係については情報がほとんどない。しかも実際移植を考える際に、HLAのマッチングというハードルが存在しており、ニュースを聞いて骨髄移植を希望した患者が殺到したが、移植可能な組み合わせは世界レベルでも数例しかないことが判明した。しからばと、HIV感染者でしかもAMLを発症した患者から造血幹細胞を取り出し、遺伝子操作でCCR5分子が発現できないような操作が行われ患者に戻すという治療を受けたという報告がある。いくつかの施設で各数例ではあるが、効果があることが示された。しかしこれも非常に特殊な症例と言わざるを得ない（非特許文献8）。この遺伝子操作法ではCCR5型ウイルスでもCXCR4型ウイルスでも対策はできることになるが、あくまで非常に特殊なケースと考えるべきである。それはHIV感染者がAMLという血液癌を併発してしまった症例であるが故である。一般の感染者に対して、このような遺伝子操作を行う事は自己血採取・CD34細胞分離・遺伝子操作・培養・移入という手技になり、煩雑すぎるし非常に高価な治療法である。他人からのCD34細胞を利用する手法を考えるべきであるが、骨髄移植に伴うGVHDという重篤な副作用発症リスクが高いことを考えるとなかなか踏み切れるものではない。
ARTにより血中にはフリーのHIVウイルスは検出できない状況を維持できるのが現状なのに何が問題かを改めて考えると、一生涯の服用による莫大な医療費、飲み忘れによる薬剤耐性化の問題で、処方できる薬剤の制限出現、更には薬剤の副作用による、更なる治療をきたすという問題である。これらは全て潜在型ウイルスがある条件下で活性化することに起因する。そこで潜在型HIVウイルスを無理やり意図的にたたき起こしてRNAウイルス粒子として飛び出させ、そこを多剤処方でたたくという「パージ&ショック療法」が試みられているが、試験管ではうまく行っても体内ではなかなかコントロールができていない（非特許文献9）。またRNAウイルス粒子を産生させても感染している細胞自体を壊すことはできていないことも判明し（非特許文献10）、根治とはかけ離れている実態が明らかになりつつあるのが現状である。
感染拡大阻害を目指した治療法はCD4分子をターゲットとしたT-20という薬剤、CCR5をターゲット分子としたマラビロクという薬剤が既に承認を受けて治療に用いられている。しかしマラビロクはウイルスがCCR5を利用するタイプのウイルスであることを確認しないと処方できないが、その検査に一か月を要し、費用もかかるのであまり処方されていない。CXCR4型ウイルス阻害剤については未だ承認された薬剤はない。しかしこれらの薬剤に対する耐性株の出現も既に数多く報告されている。
以上述べた通り、これまではHIVウイルス増殖を抑制する薬剤で血中のHIVウイルス量を検出感度以下に保つ治療法が確立されてきたが、ウイルス排除・根治には至っていない。AIDS発症がCD4細胞数の減少とリンクしているとの考え方で、ART処方の目安をCD4数が200個/mlから500個/mlをメドにしたレジメが推奨されている（非特許文献2）。即ち、従来の治療法では、CD4発現細胞はできるだけ温存する対象として捉えている。一生涯薬剤を飲み続けなければAIDS発症を引き起こすという事で、経済的に負担できない患者が多くいる。また薬剤を飲み忘れると直ぐに薬剤耐性になる為に、使用できる薬剤自体が制限されてしまう。或いは処方されている薬剤自体の副作用に悩む患者も多々いる。いずれもHIVからの根治とはなりえていない。
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従って、本発明の目的は、ウイルスの急性感染及び慢性感染のみならず、宿主染色体への組み込みが生じている潜在型のレトロウイルス感染をも根治を可能とする新規な手段を提供することにある。
本願発明者は、上述のベルリンの奇跡の症例が、CCR5分子への感染阻害ではなく分子そのものを破壊するという概念を利用していることに注目した。HIV感染ではCD4陽性細胞が感染を受けるので、CD4分子を保有する細胞をターゲットとすれば、感染細胞だけではなく非感染細胞でもCD4分子を保有する細胞を破壊できる。逆の視点でみると、感染の足場となる分子が存在しなければ、生体内において細胞破壊でウイルスが放出されても新たな感染が成立しないことから、ウイルスは死に絶えるしかない。この状況がベルリン患者の経験と理解できる。こうした理解に基づいて鋭意研究した結果、HIVが感染の足場として利用するCD4分子等を保有する細胞をHIV感染患者の体内から一時的に除去することにより、ウイルスが染色体に組み込まれてしまった潜在型感染の患者においても体内でのHIV感染の拡大を阻止し、ウイルス感染を治療可能であることを見出し、本願発明を完成した。
すなわち、本発明は、CD4分子を保有する細胞、CCR5分子を保有する細胞及びCXCR4分子を保有する細胞の少なくともいずれかを破壊する物質を有効成分として含む、免疫不全ウイルス感染の治療又は予防剤を提供する。また、本発明は、対象の体内に存在する、ウイルス感染の足場となる分子を保有する細胞を破壊することを含む、前記対象における前記ウイルスによる感染の治療又は予防方法を提供する。
本発明によれば、急性感染及び慢性感染のみならず、宿主染色体にウイルスが組み込まれた潜在型レトロウイルス感染症例においても、HIVの根治が期待され、一生涯抗ウイルス薬を飲み続けるという負担から患者を解放することができる。これまでは、ウイルス感染からAIDS発症に至るにはCD4細胞数が減少することが要因として理解されてきたために、誰一人積極的にCD4細胞を破壊しようとの試みはされてこなかった。本発明は、このような従来の理解とは逆の方向性でウイルスの根治を目指すものである。
本発明では、ウイルスが感染の足場とする分子を保有する患者体内の細胞を破壊することにより、既にウイルスに感染している細胞そのものを破壊するとともに患者体内でのウイルス感染の拡大を阻止し、最終的なウイルスの根治を目指す。ウイルスが感染の足場を失えば、新たな感染（急性感染）が成立せず、また既に感染している患者体内でも非感染細胞へのウイルスの侵入が不可能になるため、体内でのウイルス増殖が抑制され、最終的にはウイルスが体内から排除されることになる。この手法によれば、足場分子を保有する細胞を全て破壊するため、ウイルスが感染し染色体に組み込まれた状態になっている潜在型レトロウイルス感染症例であっても、潜在型感染細胞そのものを破壊でき、かつ、細胞外に放出されたウイルスの感染先が失われてウイルスの増殖も防止され、その結果、ウイルス感染の根治が可能になる。従って、本発明は、各種ウイルスの急性感染及び慢性感染のみならず、レトロウイルスの症例に対しても有効である。
ヒト免疫不全ウイルス及びサル免疫不全ウイルス等の免疫不全ウイルスは、CD4分子を主たる感染の足場とし、さらにCCR5分子又はCXCR4分子を利用して細胞に侵入する。従って、患者体内のCD4分子保有細胞、CCR5分子保有細胞及びCXCR4分子保有細胞の少なくともいずれかを破壊することにより、免疫不全ウイルスの感染足場を消失させることで、ウイルス感染細胞そのものを破壊できるとともに、非感染細胞へのウイルスの感染を防止することができる。従って、本発明による免疫不全ウイルス感染の治療又は予防剤は、CD4分子保有細胞、CCR5分子保有細胞及びCXCR4分子保有細胞の少なくともいずれかを破壊する物質を有効成分として含む。そのような物質を複数含有していてもよい。患者が有するウイルスがCCR5を利用するタイプであればCCR5分子保有細胞を、CXCR4分子を利用するタイプであればCXCR4分子保有細胞を破壊することによってウイルス感染を治療できるが、ウイルスがCCR5型かCXCR4型かを確認する検査には時間と費用がかかる（もっとも、CCR5分子保有細胞を破壊する物質とCXCR4分子保有細胞を破壊する物質の両者を患者に投与すれば、いずれのタイプの免疫不全ウイルスでも対応可能ではある）。一方、CD4分子はいずれのタイプの免疫不全ウイルスでも足場として利用するため、ウイルスのタイプを調べる必要がない。従って、本発明においては患者体内のCD4分子保有細胞を枯渇させることが好ましく、本発明の治療又は予防剤としては、CD4分子保有細胞を特異的に破壊する物質を含むものが好ましい。
患者体内に存在する特定の分子を保有する細胞を特異的に破壊する手段としては、当該分子に対する抗体（より具体的には、当該分子の細胞外領域を認識する抗体）を好ましく用いることができる。CD4分子保有細胞の破壊には抗CD4抗体を、CCR5分子保有細胞の破壊には抗CCR5抗体を、CXCR4分子保有細胞の破壊には抗CXCR4抗体を用いればよい。抗体にはADCC（抗体依存性細胞傷害）活性、CDC（補体依存性細胞傷害）活性等の細胞傷害活性があることが知られており、本発明ではこうした活性を高めた抗体を細胞破壊の手段として好ましく用いることができる。ADCC活性とCDC活性のいずれを採用しても問題はないが、その細胞傷害活性が強いほど使用量が少量で済むために、患者の身体的負担と副作用リスクを軽減でき、経済的なメリットも高い。そのため、ADCC活性やCDC活性を強力に高めた抗体を利用することが望まれる。
そのような強力な細胞傷害活性を有する抗体は、例えば、公知の手法により作出したモノクローナル抗体又は既に確立されている公知の抗体から、この分野で公知の手法によりその細胞傷害活性を高めることによって作出することができる。あるいは、所望の対象分子を特異的に認識し、かつ強力な細胞傷害活性を有する抗体が公知であれば、そのような抗体を本発明の剤の有効成分として利用してもよい。例えば、WO 2010/074266には、従来の抗CD4抗体よりもADCC活性が高められた抗CD4抗体が開示されている。
モノクローナル抗体には、齧歯動物等の非ヒト由来の抗体の他、キメラ抗体、ヒト化抗体（非ヒト由来抗体のCDR領域をヒト抗体の相当する領域に移植したもの）、ヒト抗体（非ヒト動物又はヒト細胞株を用いて製造される、ヒトの体内で産生されるものと同じ抗体）が包含される。ヒトに投与する場合、ヒトとのキメラ抗体、ヒト化抗体、又はヒト抗体を好ましく用いることができる。キメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体の作製方法は、この分野で周知の方法として確立している。例えば、抗CD4ヒト抗体は、ヒト抗体を産生できるように遺伝的に改変されたマウス等の非ヒト動物にCD4タンパク質分子を免疫して調製することができる。CD4の遺伝子配列、アミノ酸配列及び立体構造等の情報は、公的データベースに登録されており、例えばNCBIのGenBankにはM12807のアクセッション番号で登録されている。免疫原として用いるCD4タンパク質ないしはその適当な断片は、このような配列情報に基づいて周知の遺伝子工学的手法により容易に調製することができる。
抗体の細胞傷害活性を高める手法は公知であり、いずれの手法を用いてもよい。公知の手法の一例を以下に記載する。
ADCC活性を増強する方法の一つとして、抗体のFc部分に存在している糖鎖に含まれるフコース（コアフコース）を除去するポテリジェント（登録商標）技術が挙げられる（Yamane-Ohnuki N, Satoh M, Production of therapeutic antibodies with controlled fucosylation, MAbs2009; 1: 230-236.）。このコアフコースを付加する酵素はFucT-8（Fut-8）と称される遺伝子にコードされているので、Fut-8をノックアウトした動物細胞内で組換え抗体をコードする遺伝子を発現させることにより、ADCC活性が増強された抗体分子を得ることができる（Yamane-Ohnuki N, et al., Establishment of FUT8 knockout Chinese hamster ovary cells: an ideal host cell line for producing completely defucosylated antibodies with enhanced antibody-dependent cellular cytotoxicity, Biotechnol Bioeng 2004; 87: 614-622.）。この手法で得られたCCR4分子を認識する抗体（一般名モガムリズマブ）は、その細胞破壊機能が顕著に優れていることから既に臨床的に有効性が認められ、HTLV-1というウイルスの感染から発症するT細胞白血病の治療に応用すべく、日本国内においてその製造承認が与えられている。（なお、モガムリズマブは、CCR4を発現するT細胞白血病リンパ腫細胞を破壊することによりT細胞白血病を治療するものであり、HTLV-1の感染足場を破壊するのではない）。フコース基質供与を遮ってしまう手法も存在するが、コアフコースに限らず全てのフコースを除去してしまうためコアフコース特異的な手法ではなく、上記したポテリジェント（登録商標）技術がより好ましい。
ADCC活性を増強する他の方法として、抗体のFc部位に存在する糖鎖を変換する方法が挙げられる。当該方法では、アンテナ型分岐糖鎖部のGlcNAcをGnT-III遺伝子操作で導入することによりコアフコース付加を回避する（M. Schuster et al., Improved effector functions of a therapeutic monoclonal Lewis Y-specific antibody by glycoform engineering, Cancer Res 2005; 65: 7934-7941.）。このような手法により作出されたADCC活性が増強された抗体を用いてもよい。
また、CDC活性が増強する方法としては、例えば、アイソタイプIgG1の一部にアイソタイプIgG3の配列を組み合わせてCDC活性を高めるコンプリジェント（登録商標）技術が知られている（Natsume A, In M, Takamura H, et al. Engineered antibodies of IgG1/IgG3 mixed isotype with enhanced cytotoxic activities, Cancer Res. 2008;68:3863-3872.）。
さらに、上記したポテリジェント（登録商標）技術とコンプリジェント（登録商標）技術を組み合わせて抗体のエフェクター活性を強力に高めるアクリタマブ（登録商標）技術も知られている（Natsume A, et al., Improving effector functions of antibodies for cancer treatment: Enhancing ADCC and CDC, Drug Des Devel Ther. 2009; 3: 7-16）。このような手法でADCC活性及びCDC活性の両者を高めた抗体を用いてもよい。
抗体のADCC活性やCDC活性を評価する手法は公知であり、市販のキット類も存在する。抗CD4抗体のADCC活性の評価であれば、例えば下記実施例に記載されるように、ヒト末梢血単核球と抗CD4抗体を混合して37℃で数時間反応させ、フローサイトメトリー解析により反応液中のCD8+細胞に対するCD3+細胞の割合を測定し、得られた測定値をADCC活性を有しない抗CD4抗体を用いた場合の測定値と比較することにより、抗CD4抗体のADCC活性の強さを評価することができる。
あるいは、本発明では、患者体内に存在する特定の分子を保有する細胞を特異的に破壊する手段として、細胞毒成分が結合された、当該分子に対する抗体又はその抗原結合性断片を用いることもできる。細胞毒成分を抗体に結合したものを用いる場合、該抗体は高い細胞傷害活性を有していなくてよく、細胞毒成分によって各分子を保有する細胞が傷害される。対象とする分子との結合性を維持した抗体断片（抗原結合性断片）に細胞毒成分を結合させたものも、本発明の剤の有効成分として使用可能である。
本発明において、細胞毒成分とは、生細胞を破壊する活性を有する物質をいい、生物由来の毒物、化学物質、放射性物質等が包含される。
抗原結合性断片は、もとの抗体の対応抗原に対する結合性（抗原抗体反応性）を維持している限り、いかなる抗体断片であってもよい。具体例としては、Fab、F(ab')2、scFv等を挙げることができるが、これらに限定されない。FabやF(ab')2は、周知の通り、モノクローナル抗体をパパインやペプシンのようなタンパク分解酵素で処理することにより得ることができる。scFv（single chain fragment of variable region、単鎖抗体）の作製方法も周知であり、例えば、上記の通りに作製したハイブリドーマのmRNAを抽出し、一本鎖cDNAを調製し、免疫グロブリンH鎖及びL鎖に特異的なプライマーを用いてPCRを行なって免疫グロブリンH鎖遺伝子及びL鎖遺伝子を増幅し、これらをリンカーで連結し、適切な制限酵素部位を付与してプラスミドベクターに導入し、該ベクターで大腸菌を形質転換してscFvを発現させ、これを大腸菌から回収することにより、scFvを得ることができる。
本発明の剤の投与量は、患者体内の対象とする細胞を枯渇できる量であればよい。有効成分の細胞障害活性の強さや患者の年齢、体重等により投与量は変動し得るが、通常、1回の投与量で0.01μg/kg～200mg/kg程度、例えば10μg/kg～150mg/kg程度であり得る。投与経路は、経口でも非経口でもよいが、静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、皮下投与等の非経口投与が好ましい。注射剤や点滴剤として調製して用いることができる。
本発明の剤の投与は、患者体内のウイルスが検出されなくなるまで数週間～数箇月ないしはそれ以上の期間継続してよく、例えば上記の投与量で１日～数日に１回の投与を継続することができる。投与間隔は、有効成分として使用する物質の血中代謝に応じて適宜決定することができる。例えば、抗体を用いる場合、抗体の血中代謝は通常10日～14日程度であるため、1～2週間程度の間隔で投与を2回ないしはそれ以上継続することができる。適宜、フローサイトメトリー解析等により患者体内の対象細胞が破壊されていることを確認しながら、処置を行なってよい。細胞枯渇処置は、患者体内にウイルスが検出されなくなるまで行なわれる。患者の血液サンプルや組織サンプルを用いたPCR法による検査（Roche Diagnostics社製HIV RNA検出キット、或いは次の文献記載方法； Palmer S, et al., New Real-time reverse transcriptase-initiated PCR assay with single-copy sensitivity for human immunodeficiency virus type 1 RNA in plasma, J. Clin. Microbiol., 2003; 41: 4531-4536.）でウイルスが検出限界以下となる状態が一定期間継続して確認されるまで、細胞を枯渇させた状態を維持してよい。
免疫不全ウイルス感染の治療の場合、枯渇させる対象となる細胞は免疫細胞の一部であるので、患者体内のCD4保有細胞等を枯渇させる処置を行なう期間は、患者を無菌状態で管理するなど患者の健康に留意し対処すべきである。剤の投与を中止し、抗CD4抗体等の有効成分が患者体内で代謝されると、患者体内では自然に造血幹細胞由来のCD4保有細胞が発生する。剤の用量を調節すれば細胞の回復時期を自由にコントロールできる。細胞の回復についても適宜フローサイトメトリー解析等により確認することができる。
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
１．ADCC活性を有する抗CD4抗体の作製
WO 2010/074266に記載された方法により、ADCC活性が増強された抗CD4ヒト化抗体IT1208（可変領域としてWO 2010/074266に記載のHV2及びLV0を含む、サブタイプはIgG1）を作製した。Biacore T100を用いて測定された抗体結合活性はKD(nM)＜0.009であり、高い結合活性を有していた。
WO 2010/074266に記載された方法により、ADCC活性が増強された抗CD4ヒト化抗体IT1208（可変領域としてWO 2010/074266に記載のHV2及びLV0を含む、サブタイプはIgG1）を作製した。Biacore T100を用いて測定された抗体結合活性はKD(nM)＜0.009であり、高い結合活性を有していた。
２．抗CD4ヒト化抗体IT1208のADCC活性の測定(1)
健常人由来PBMC 500μlとanti-CD4 mAb (IT1208、又はコントロール抗体)含有液100μlをバイアル中37℃/4時間/75 rpmという条件で反応させた後、フローサイトメトリー解析により反応液中に残存するCD4保有細胞数を検討した。コントロール抗体として、EP1951303B1に開示されているGenMab社のHuMax-CD4の配列を参考に作製したものを使用した。更なるコントロールとして、市販のanti-CD20抗体（リツキシマブ、全薬工業株式会社）を使用した。活性評価はフローサイトメーターで測定した。FITCで標識した抗CD3抗体を用いてCD3陽性細胞の検出を、またフィコエリスリンで標識した抗CD8抗体を用いてCD8陽性細胞の検出を行なった。CD8陽性細胞数に対するCD3陽性細胞数の割合（％）を算出し、CD4陽性細胞数を調べた（CD3陽性細胞数／CD8陽性細胞数の割合100％がCD4陽性細胞数ゼロを意味する）。
健常人由来PBMC 500μlとanti-CD4 mAb (IT1208、又はコントロール抗体)含有液100μlをバイアル中37℃/4時間/75 rpmという条件で反応させた後、フローサイトメトリー解析により反応液中に残存するCD4保有細胞数を検討した。コントロール抗体として、EP1951303B1に開示されているGenMab社のHuMax-CD4の配列を参考に作製したものを使用した。更なるコントロールとして、市販のanti-CD20抗体（リツキシマブ、全薬工業株式会社）を使用した。活性評価はフローサイトメーターで測定した。FITCで標識した抗CD3抗体を用いてCD3陽性細胞の検出を、またフィコエリスリンで標識した抗CD8抗体を用いてCD8陽性細胞の検出を行なった。CD8陽性細胞数に対するCD3陽性細胞数の割合（％）を算出し、CD4陽性細胞数を調べた（CD3陽性細胞数／CD8陽性細胞数の割合100％がCD4陽性細胞数ゼロを意味する）。
その結果を図１に示す。Humax-CD4及びリツキシマブでは、抗体濃度10μg/mLでもそれぞれ204%、及び181%以下にはならなかったにもかかわらず、IT1208は0.01μg/mLで既に153%になっており、1μg/mL以上で111%以下になり、ほぼすべてのCD4陽性細胞が細胞死に至らしめられた。以上の通り、ヒト末梢血由来PBMC中NK細胞とコントロール抗体によるADCC活性比較で、IT1208のADCC活性が100倍近く増強していることが確認された。
３．抗CD4ヒト化抗体IT1208のADCC活性の測定(2)
プロメガ社が市販している、ADCC活性測定キットのプロトコールに従い、次の条件でIT1208のADCC活性の測定を実施した。健常人由来PBMC12500個、anti-CD4mAb（IT1208）、およびプロメガキットに含まれているADCC Bioassay Effector cellの75000個を加え穏やかによく混ぜたのち、CO2インキュベーター中で37℃、6時間培養し、発光試薬Bio-Glo reagentを加え、室温で20分培養し、発光プレートリーダーで化学発光を測定した。
プロメガ社が市販している、ADCC活性測定キットのプロトコールに従い、次の条件でIT1208のADCC活性の測定を実施した。健常人由来PBMC12500個、anti-CD4mAb（IT1208）、およびプロメガキットに含まれているADCC Bioassay Effector cellの75000個を加え穏やかによく混ぜたのち、CO2インキュベーター中で37℃、6時間培養し、発光試薬Bio-Glo reagentを加え、室温で20分培養し、発光プレートリーダーで化学発光を測定した。
その結果を図２に示す。IT1208は1nM以上でADCC活性を示し、濃度依存的に増強し50nMで最大値に達している。コントロール抗体として使用したリツキシマブ（antiCD20）は、ADCC活性がみられ始めた濃度が10nM以降で、かつ、最大に達する濃度も1μM以降であった。
４．ADCC増強型抗CD4抗体IT1208のHIV感染に対する効果(1)
HIV感染者でART処方を受けている患者（末梢血中のHIVフリーウイルスコピー数が検出限界以下：< 50 copy/ml）の末梢血球を採取し、サンプルとして用いた。フローサイトメトリー解析（蛍光色素標識抗CD4抗体を用いた直接法、又は上記２と同様の抗CD3抗体及び抗CD8抗体を用いた間接法）によりサンプル中のCD4細胞数を測定後、フィトヘマグルチニンで刺激してHIVウイルスを増加させた。ウイルスコピー数が増加したことをPCRにより確認後、サンプルにanti-CD4 mAb（IT1208、又はコントロール抗体）を添加して60分間反応させ、細胞数及びHIV RNAコピー数を計測した。
HIV感染者でART処方を受けている患者（末梢血中のHIVフリーウイルスコピー数が検出限界以下：< 50 copy/ml）の末梢血球を採取し、サンプルとして用いた。フローサイトメトリー解析（蛍光色素標識抗CD4抗体を用いた直接法、又は上記２と同様の抗CD3抗体及び抗CD8抗体を用いた間接法）によりサンプル中のCD4細胞数を測定後、フィトヘマグルチニンで刺激してHIVウイルスを増加させた。ウイルスコピー数が増加したことをPCRにより確認後、サンプルにanti-CD4 mAb（IT1208、又はコントロール抗体）を添加して60分間反応させ、細胞数及びHIV RNAコピー数を計測した。
５．ADCC増強型抗CD4抗体IT1208のHIV感染に対する効果(2)
HIV感染に用いられるヒト化マウスモデルの中で、最適と考えられるマウスモデル（Rag2-/-γc-/- (RAG-hu)マウス、Traggiai, E. et al., Development of a human adaptive immune system in cord blood cell-transplanted mice, Science, 2004; 304: 104-107.）を作成し、HIVウイルスを感染させた。更にその状態で従来使用されている抗HIV薬剤（saquinavir(中外製薬), lopinavir/ritonavir(Abbott Laboratories社) , atazanavir(Bristol-Myers-Squibb社)）を投与し、血中からHIVウイルスコピーが検出できない状態まで飼育した。PCRによる従来のHIVウイルス検出法により血中ウイルスコピー数が検出限界以下になった個体にanti-CD4 mAb（IT1208）を投与し、観察した。
HIV感染に用いられるヒト化マウスモデルの中で、最適と考えられるマウスモデル（Rag2-/-γc-/- (RAG-hu)マウス、Traggiai, E. et al., Development of a human adaptive immune system in cord blood cell-transplanted mice, Science, 2004; 304: 104-107.）を作成し、HIVウイルスを感染させた。更にその状態で従来使用されている抗HIV薬剤（saquinavir(中外製薬), lopinavir/ritonavir(Abbott Laboratories社) , atazanavir(Bristol-Myers-Squibb社)）を投与し、血中からHIVウイルスコピーが検出できない状態まで飼育した。PCRによる従来のHIVウイルス検出法により血中ウイルスコピー数が検出限界以下になった個体にanti-CD4 mAb（IT1208）を投与し、観察した。
６．サルにおけるCD4保有細胞の枯渇処理の影響について
上記で調製したIT1208をサルに投与し（100mg/kgを1週間間隔で4回、静脈注射により投与）、サル体内のCD4保有細胞を枯渇させた。当該サルを半年間観察したが、異常は認められなかった。
上記で調製したIT1208をサルに投与し（100mg/kgを1週間間隔で4回、静脈注射により投与）、サル体内のCD4保有細胞を枯渇させた。当該サルを半年間観察したが、異常は認められなかった。
また、IT1208を40mg/kg（1週間間隔で4回静脈注射）でサルに投与し、静脈血、リンパ節及び直腸内のCD4保有T細胞数をフローサイトメトリー解析（蛍光色素標識抗CD4抗体を用いた直接法）により測定した。
静脈血サンプルは、サルをケタミン＋キシラジンで麻酔後、鼠径部から採血して得た。
リンパ節サンプルは次の通りに調製した。サルをケタミン＋キシラジンで麻酔後、腋窩をメスで1～2cm程度切開してリンパ節を50mlチューブに採材した。ハンクス液（HBSS）でリンパ節組織を２回洗浄後、コラゲナーゼ（終濃度1.0mg/ml）及びDNase I（終濃度20μg/ml）を添加したハンクス液（HBSS）中で30分、37℃、150rpmでインキュベートした。70μmのセルストレイナーに通した後、組織をすりつぶし、洗浄、回収してリンパ節サンプルとした。
直腸サンプルは次の通りに調製した。サルをケタミン＋キシラジンで麻酔後、解剖台にうつ伏せにして寝かせ、肛門鏡で肛門を開き、生検鉗子で直腸組織を10ピース採材した。直腸組織を50mLチューブに入れ、適切量のMACSbuffer（0.5%BSA－2mMEDTAinPBS(-)）を添加し、10秒間ボルテックスした後、茶漉しに通して粘膜上皮層（液層）を回収し、腸管を別のチューブに回収した。この洗浄処理をbufferが濁らなくなるまで繰り返した。洗浄後の組織をコニカルチューブに移し、25mLのpredigestion solutionを添加し、37℃で30分間、MACSmix（商品名）Tube Rotator(130-090-753)で振盪した。チューブを10秒間ボルテックス後、茶漉しに通して粘膜上皮層（液層）を回収し、腸管を別のチューブに回収した。適切量のMACS bufferを添加し、10秒間ボルテックス後、茶漉しに通して粘膜上皮層（液層）を回収し、腸管を別のチューブに回収した。この洗浄処理をbufferが濁らなくなるまで繰り返した。EDTA/DTTを除去するため、10 mL程度のHBSS(+) with 10 mM HEPES（あるいはRPMI1640）を添加し、10秒間ボルテックスした。これを茶漉しに通して粘膜上皮層（液層）を回収し、腸管を別のチューブに回収した。この処理を繰り返した後、組織と2.5 mLのenzyme mixをgentleMACS C tubeに入れ、gentleMACSTM Dissociatorで軽く分散させた(m_brain_01)。37℃で30分間、MACSmixTM Tube Rotator(130-090-753)を用いて振盪し、gentleMACSTM Dissociatorで完全に分散させた(m_intestine_01)。細胞懸濁液（粘膜固有層由来の細胞）を回収し、適切量のMACS bufferで希釈した後、Pre-Separation Filter(70μm, 130-095-823)に通した。細胞にMACS bufferを添加して洗浄（4℃、300xg、10分間遠心）後、上清を捨てて適切量のMACS bufferに再懸濁し、フローサイトメトリー解析に付す直腸サンプルとした。
フローサイトメトリー解析の結果を図３に示す。上記のレジメンでIT1208を投与することにより、静脈血内のCD4保有T細胞は100%枯渇させ、リンパ節のそれは70%以上、および直腸のそれも40%以上欠失させることができた。あと１～２回程度IT1208を追加投与すればリンパ節のCD4保有T細胞を枯渇できると考えられる。SIVをART治療後、ウイルスが再発するのは主としてリンパ節からという報告がある（Horiike et al., Virology 423 (2012) 107-118）。従って、免疫不全ウイルスの根治には、体内の特にリンパ節に存在するCD4保有細胞を枯渇させることが重要と考えられる。
７．ADCC増強型抗CD4抗体IT1208のHIV感染に対する効果(3)
上記６でIT1208を100mg/kgでの投与にてCD4保有細胞を枯渇させたサルにSIVウイルスを接種し、ウイルスの増殖を観察した。
上記６でIT1208を100mg/kgでの投与にてCD4保有細胞を枯渇させたサルにSIVウイルスを接種し、ウイルスの増殖を観察した。
Claims (15)
- CD4分子を保有する細胞、CCR5分子を保有する細胞及びCXCR4分子を保有する細胞の少なくともいずれかを破壊する物質を有効成分として含む、免疫不全ウイルス感染の治療又は予防剤。
- CD4分子を保有する細胞を破壊する物質を有効成分として含む請求項１記載の治療又は予防剤。
- 前記物質が、破壊対象の細胞が保有する前記分子に対する抗体であって、細胞傷害活性を有する抗体、又は、破壊対象の細胞が保有する前記分子に対する抗体若しくはその抗原結合性断片であって、細胞毒成分が結合された抗体若しくはその抗原結合性断片である、請求項１又は２記載の治療又は予防剤。
- 前記物質が、破壊対象の細胞が保有する前記分子に対する抗体であって、細胞傷害活性を有する抗体である、請求項３記載の治療又は予防剤。
- 前記細胞傷害活性はADCC活性である、請求項３又は４記載の治療又は予防剤。
- 前記免疫不全ウイルスがヒト免疫不全ウイルスである請求項１ないし５のいずれか１項に記載の治療又は予防剤。
- 前記感染が、急性感染、慢性感染又は潜在型感染である請求項１ないし６のいずれか１項に記載の治療又は予防剤。
- 対象の体内に存在する、ウイルス感染の足場となる分子を保有する細胞を破壊することを含む、前記対象における前記ウイルスによる感染の治療又は予防方法。
- ウイルスが免疫不全ウイルスであり、対象の体内に存在する、CD4分子を保有する細胞、CCR5分子を保有する細胞及びCXCR4分子を保有する細胞の少なくともいずれかを破壊することを含む、請求項８記載の方法。
- CD4分子を保有する細胞を破壊することを含む請求項９記載の方法。
- 前記免疫不全ウイルスがヒト免疫不全ウイルスである請求項９又は１０記載の方法。
- 前記分子に対する抗体であって、細胞傷害活性を有する抗体、又は、前記分子に対する抗体若しくはその抗原結合性断片であって、細胞毒成分が結合された抗体若しくはその抗原結合性断片を前記生体に投与することにより、当該分子を保有する細胞を破壊することを含む、請求項８ないし１１のいずれか１項に記載の方法。
- 前記分子に対する抗体であって、細胞傷害活性を有する抗体を前記生体に投与することを含む、請求項１２記載の方法。
- 前記細胞傷害活性はADCC活性である、請求項１２又は１３記載の方法。
- 前記感染が急性感染、慢性感染又は潜在型感染である請求項８ないし１４のいずれか１項に記載の方法。
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