CN107074944A - 藉由针对cd4之单克隆抗体介导竞争型hiv进入抑制之hiv感染的治疗和功能性治愈 - Google Patents

Abstract

本发明有关于用以预防、治疗，及/或功能性治愈HIV感染的组合物和方法。本发明之方面是关于针对CD4之单克隆抗体、其组合物，以及使用此组合物以预防、治疗，和功能性治愈HIV感染的方法。

Description

藉由针对CD4之单克隆抗体介导竞争型HIV进入抑制之HIV感 染的治疗和功能性治愈

【技术领域】

本发明是关于针对CD4之单克隆抗体介导竞争型HIV进入抑制、其组合物，以及使用此组合物治疗和功能性治愈HIV感染的方法。

【背景技术】

获得性免疫缺陷综合征(Acquired Immune Deficiency Syndrome，AIDS)是一种由人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)所引起之人类免疫系统的疾病(http://en.wikipedia.org/wiki/HIV/AIDS)。基因研究指出HIV于十九世纪晚期或二十世纪早期起源于非洲中西部。AIDS最早是于1981年由美国疾病控制与预防中心所辨识，且其原因，HIV，在1980年代初被鉴别。由于疫情的开始，已有超过70万人感染HIV，且已有35万人死于AIDS。在全球，截至2011年底已有34.0万人感染HIV(http://www.who.int/gho/hiv/en/)。

HIV感染逐渐地降低免疫系统的效力，且使个体容易受到机会性感染和产生肿瘤。HIV可透过粘膜或是具有含有HIV之体液(例如血液、精液、阴道液、射精前液体和母乳)的血液直接接触而传播。这种传播可涉及肛门、阴道或口交、输血、受污染的注射针头、母亲与婴儿于怀孕、分娩或母乳喂养期间之交流，或是于上述之体液中其它方式的暴露。

30年来，科学家们认为AIDS是由“制造病毒”的CD4T细胞所引起，而非静默T细胞。但是这些“制造病毒”的受感染的细胞并不足以去解释于发展AIDS之患者体中T细胞的大量耗竭。Greene和其同僚指出95％的静默淋巴CD4T细胞是死于细胞焦亡(pyroptosis)，而其是由失败的病毒感染所引发(Doitsh，G.et al.2014)。此些细胞具有细胞质病毒DNA，但不像变成病毒-复制单位的T细胞，这些“HIV感染的”静默T细胞被涉及前发炎性细胞激素释放之程序性细胞死亡(细胞焦亡)的高度炎症形式所自毁。此细胞蛋白，γ干扰素诱导蛋白16(interferon-gamma-inducible protein 16，IFI16)，可辨认病毒DNA并于T细胞引发一连串反应(包含介导细胞焦亡之caspase-1酶活化，且造成细胞肿胀、细胞膜通透性和细胞质内容物泄漏)。静默T细胞的自毁无益于杀死病毒。此过程最终导致HIV致病机理转以推进病程至AIDS。

现行用以延迟AIDS发生之HIV感染的治疗是由高效抗反转录病毒疗法或HAART(highly active antiretroviral therapy)组成，以防止病毒复制。现行优选的HAART包含联合疗法(或“鸡尾酒”)，其由属于至少两种类抗反转录病毒药物中的至少三个药物所组成(联合抗反转录病毒治疗(Combination antiretroviral therapy，cART))。典型治疗方案包含两个核苷类似物反转录酶抑制剂(NARTIs或NRTIs)加上一个蛋白酶抑制剂或非核苷类反转录酶抑制剂(NNRTI)。

在发达国家，当决定要何时推荐开始HAART治疗时，医生会评估病毒量、CD4T细胞数量、CD4阳性细胞减少速度和患者准备就绪。一般来说，会建议对CD4T细胞数量下降至每毫升血液200-250细胞之无症状的患者进行治疗。然而，越早开始治疗(于CD4水平为350个细胞/微升下)可显著地减少AIDS的风险和死亡。

在没有治疗的状况下，评估感染HIV后之净存活期中位数为9至11年，此取决于HIV亚型；且AIDS诊断后之平均存活率范围介于6至19个月。在广泛使用HAART治疗的地区，此疾病的死亡率减少了80％，其转而增加新确诊HIV感染患者的预期寿命至约20年。

HAART的标准目标包括患者生活品质的改善、并发症的减少，以及将HIV病毒血症减少至低于检测极限。

然而，HAART治疗存在多种问题。首先，其无法治愈HIV感染的患者，一旦停止治疗也无法避免大多数“HAART抗药性”的HIV回复至高血液水平。第二，HAART具有包含倦怠、无力、腹泻、头痛、恶心和呕吐之讨人厌的副作用。从长期来看，HIV感染的患者可能经历神经认知障碍症、骨质疏松症、神经病变、癌症、肾病和心血管疾病。尽管较新的抗反转录病毒药物比较旧的药物具有较少的副作用，终生使用仍然会造成不良的结果。无法规则服药意谓HIV反弹、抗药性和疾病进程。第三，就达到超过50％以上患者而言，HAART之表现远较理想结果差，此乃因为药物不耐症、过去无效的抗病毒治疗，以及HIV之抗药性病毒株的感染。

越来越多研究人员研究如何治愈HIV感染，或至少达成无抗反转录病毒药物治疗下之长期或永久缓解。

两种治疗策略，消除性(即根除)和功能性治愈为针对HIV感染之现行研究(如表1所示)。消除性治愈方法目的是消除所有HIV感染的细胞，由体内完全地清除HIV，且定义为其可减少病毒量至每毫升血液低于1个拷贝。功能性治愈目的是HIV的缓解状态与长期控制，包含于无抗反转录病毒疗法下的低病毒量，其于永久或延长的期间内可减少病毒量至每毫升血液低于50个拷贝。

“消除性治愈”现行唯一的例子是来自一名感染HIV男子的案例研究，此人被昵称为“柏林患者”，其罹患急性骨髓性白血病，且接受来自具有CCR5基因之突变或不同形式的捐赠者的骨髓移植。于停止治疗45个月后，医生已无法于其体内侦测到HIV。然而，采用具有CCR5突变之捐赠者的骨髓移植策略并非可行的HIV治愈方法，此策略带来毒性和治疗的复杂性。可于精英的控制者发现“功能性治愈”之自然案例。精英的控制者是指感染HIV的个体，其免疫系统可自然地控制病毒而无须使用抗反转录病毒药物。此个体成功地维持稳定的CD4(白血球)细胞数量、低或低于检测极限的病毒量，以及于其细胞中显著较低量之“潜伏的HIV”。

事实上，治愈的主要障碍是“潜伏HIV病毒库”之存在，其潜伏在免疫系统的细胞(例如记忆细胞)内，于抗反转录病毒药物治疗期间具有长的寿命，而此种治疗可藉由阻断复制作用而作用于活跃的病毒感染而非潜伏的HIV。然而，若停用此种抗反转录病毒药物治疗，潜伏的HIV可能会被活化，以更新HIV感染的过程。

针对此些“有问题的”潜伏HIV病毒库的现行策略包含致力于HAART治疗下透过病毒表达之活化以耗竭潜伏病毒库，以灭绝感染的细胞，只留下未受感染的细胞。有一群活化剂为组蛋白脱乙酰酶(Histone deacetylase，HDAC)抑制剂(请参见表2)。目前，以HDAC抑制剂作为情绪稳定剂、抗癫痫药物和抗癌治疗之使用。HDAC抑制剂之长期影响在于提高恶性肿瘤及/或致癌基因再活化的风险，此仍为主要问题。如果以联合抗反转录病毒治疗(cART)可完全地抑制活跃的病毒复制，则此策略可行。到目前为止，这些努力尚未能达成长期的病毒抑制或功能性治愈。

于HIV感染之人体用以限制或减少潜伏HIV病毒库大小的两个计划涉及(1)加强治疗(藉由对患者治疗方案加入新的ART药物)，以及(2)早期治疗(藉由感染后立即地开始ART)。多个试验结果显示，当于HIV感染的早期急性期而非慢性晚期开始cART，HIV感染细胞的数量可显著地下降。

总之，对用于HIV治疗之有效和安全的药物具有高度需求(不论是提供作为单独使用或是作为对cART的辅助使用)，此些药物(1)于无细胞(cell-free)和细胞间(cell-to-cell)传播模式中均可阻断HIV进入，显著地减少活化或静默CD4T细胞(包含那些长寿的记忆T细胞)之HIV感染；(2)特异性地再活化HIV感染的静默CD4T细胞以释出HIV，导致潜伏感染细胞的细胞凋亡；及/或(3)当抗原/细胞激素刺激时抑制HIV感染的静默CD4T细胞活化/发炎，此种活化发生之时可引起细胞焦亡和正常CD4阳性T细胞的大量耗竭，因而导致AIDS。对HIV感染之功能性或消除性治愈之一致努力以导致后续无cART下之长期或永久缓解，此为全球公共卫生的重要议题，并正于世界各地积极地探究中，且如果可行，此将在HIV感染治疗方面实现突破性重大变革。

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【发明内容】

本发明是针对用以预防、治疗，及/或功能性治愈HIV感染的组合物和方法。本发明之一方面是关于针对CD4之单克隆抗体、其组合物，以及使用此组合物以预防、治疗，和功能性治愈HIV感染的方法。

本发明之一方面是关于针对CD4之抗体、其组合物，以及使用此组合物以预防、治疗，及/或功能性治愈HIV感染的方法。在某些实施方案中，此抗体可特异性地结合位于CD4结构域1的CDR2区域。于无细胞和细胞间的系统中，本发明抗体透过其结合至CD4的结构域1而展现有效的竞争型HIV进入抑制。本发明之抗体也可抑制抗原引起的T细胞增生和CD4阳性T细胞的细胞激素制造(IL2和IFN-gamma)，其涉及细胞焦亡的致病循环。本发明抗体也具有再活化静默CD4阳性T细胞的能力。此特性对静默T细胞中潜伏HIV病毒库的再活化特别有用，可使这些细胞对抗反转录病毒药物治疗敏感。为了释放HIV，此种对CD4高亲和力之抗体可活化静默的HIV感染细胞。HIV感染静默CD4+ T细胞的再活化允许于HIV感染患者使用合并本发明抗体与HAART的合并治疗，以达成功能性治愈。

本发明是针对用以治疗、预防，和功能性治愈HIV感染的方法。在某些实施方案中，此剂型包含针对CD4之抗体。本发明也包含可用于治疗、预防，和功能性治愈HIV感染之方法的抗病毒药物。

在某些实施方案中，本发明是关于包含具有上述结合特征之单克隆人类、人源化或嵌合，抗-CD4抗体的医药组合物，当以每周或每两周之时程表以约10mg/kg或更高之剂量投予作为单一药物治疗时，此种治疗可使接受治疗之受试者的病毒量减少至低于检测极限，且只要血清抗体水平高于10μg/mL即无病毒量反弹。

在其它实施方案中，本发明是关于包含具有上述结合特征之单克隆人源化抗-CD4抗体的医药组合物，其可作为偕同HAART之辅助治疗的关键成份，当以每周或每两周之时程表以约10mg/kg或更高之剂量投予未使用治疗药物之HIV患者，将达成患者的功能性治愈。

【附图说明】

图1系竞争型与非竞争型HIV进入抑制机制。图1A系显示于竞争型HIV进入抑制模型中所提供理论结果的曲线图，在此，HIV包膜蛋白gp120和抑制剂(例如抗体药物)竞争结合于一个共同目标表面分子上的相同位置(即CD4结构域1的CDR2)。在此模型中，当此抑制剂浓度达到某个阀值时可达成HIV结合/进入的100％抑制。相较之下，图1B系显示于非竞争型HIV进入抑制模型中所提供理论结果的曲线图，在此，HIV和抑制剂结合至位于相同目标分子上的不同位置(例如CD4的结构域2对于TMB-355)。在此非竞争型抑制模型中，抑制剂可减少HIV结合/进入，但不论抑制剂之浓度为何都无法达成完全抑制。不论药物浓度为何，作为于％抑制之“高原”反映了HIV对抗体药物的抗药性。

图2系来自利用TMB-355对一组涵盖11个进化支的118种不同HIV-1Env假型病毒株的HIV进入抑制的结果(Pace，G，et al.，2011)。对每一种病毒而言，黑线是指当以浓度达到10μg/mL之TMB-355处理时的最大抑制百分比(MPI)(请参见左边的Y轴)；且灰线是指相对应的IC₅₀(请参见右边的Y轴)。TMB-355以≥50％抑制中和了92％的病毒株，且以≥95％抑制只中和了31％的病毒株。

图3系来自利用mAb B4对在10年间所收集的一组超过850种Env假型HIV病毒株的HIV进入抑制的结果。MAb B4于HIV进入抑制提供了广泛性与效力，其于所有850种Env假型病毒株具有接近100％最大抑制百分比(MPI)，且具有两个IC₅₀浓度(一个是介于0.01至1μg/mL，且第二个是约10μg/mL)。

图4系mAb dB4C7抗体Fv区域之重链的完整氨基酸序列(SEQ ID NO：7)，其于UB-421中使用。代表衍生自其亲本鼠源B4抗体之相对应CDR1、2和3区域的序列在下方划有底线(表4，SEQ ID NOs：1至3)。可变区和恒定区分别以浅灰色和深灰色阴影表示(分别为SEQ IDNOs：11和12)。以重链上位于第101个氨基酸残基Asn(N)作为N-糖化点，此对于其Fv区域位置具有独特性，对B4抗体结合具有重要性。为了取代的人类IgG₁之Fc区域序列，位于第298个氨基酸残基Asn(N)的N-糖化点乃利用氨基酸His(H)取代而加以移除(即N298H)。发现此突变可于抗体B4存在下消除IgG介导的补体依赖型细胞毒性作用(complement dependentcytotoxicity，CdC)和CD4阳性T细胞的耗竭。

图5系dB4C7抗体Fv区域之轻链的完整氨基酸序列(SEQ ID NO：8)，其于UB-421中使用。代表衍生自其亲本鼠源B4抗体之相对应CDR1、2和3区域的序列在下方划有底线(表4，SEQ ID NOs：4至6)。可变区和恒定区分别以浅灰色和深灰色阴影表示(分别为SEQ ID NOs：13和14)。

图6系经进一步改进之人源化抗体之重链的完整氨基酸序列(SEQ ID NO：9)，因为对位于重链位置第253、255和257个氨基酸的Fc区域分别地将Met(M)取代为Tyr(Y)(即M253Y)、将Ser(S)取代为Thr(T)(即S255T)、以及将Thr(T)取代为Glu(E)(即T257E)，以使此抗体具有更长的半衰期。

图7系人源化抗体mAb dB4之重链的完整氨基酸序列(SEQ ID NO：10)，其包含于图4和6中所讨论的变异氨基酸。

图8系显示在对细胞经过三次抗体继代后mAb B4对位于HPB-ALL细胞之表面CD4的结合亲和力(抗体浓度)和结合容量(游离和结合的抗体)的曲线图。

图9系mAb B4(---)和mAb dB4(-)对涂覆于ELISA微量盘上之可溶性CD4(sCD4)和p2704a肽捕获混合物之结合亲和力的曲线图比较。分别地利用mAb B4和mAb dB4去竞争地抑制B4-生物素和dB4C7-Alexa结合至捕获混合物而加以测定结合亲和力。

图10系mAb B4(---)和mAb dB4(-)对位于HPB-ALL细胞上CD4之结合亲和力的曲线图比较。结合亲和力是以FACS加以测定，分别地利用mAb B4和mAb dB4去竞争地抑制B4-生物素和dB4C7-Alexa结合至位于HPB-ALL细胞上的表面CD4。

图11系mAb dB4(---)和gp120MN(-)对位于HPB-ALL细胞上CD4之结合亲和力的曲线图比较。结合亲和力是以FACS加以测定，利用mAb dB4和gp120MN去竞争地抑制dB4C7-Alexa结合至位于HPB-ALL细胞上的表面CD4。

图12系显示mAb dB4C7对PBMC CD4+ T细胞之温度依赖性结合(MFI)的曲线图。

图13系显示来自6位未受感染个体血液样品之未被占据的CD4受体(-)和以mAbdB4占据/结合之CD4受体(---)的平均百分比(±标准差)，并作为mAb dB4浓度之函数的曲线图。利用dB4C7-Alexa结合至位于血液CD4+ T细胞表面之未被占据的结合位点以侦测未被占据的受体。然而mAb dB4占据之受体是利用山羊抗-huIgG-FITC加以侦测。

图14系显示现行抗反转录病毒治疗(cART)药物Tenofovir于HIV无细胞和细胞间传播上之效果的长条图(Sigal，A.，et al.，2011)。Y轴代表来自于存在或缺乏tenofovir状况下由不同感染源所分离之外周血单核细胞(PBMCs)的传播指数(Sigal，A.et al.，2011)。

图15系显示藉由以下刺激所引发于静默PBMCs之病毒再活化的长条图(其乃利用HIV-1 p24gag制造加以测量)，刺激种类包含未受刺激(第1长条)、植物凝集素(PHA)(第2长条)、不活化的HIV(iHIV)溶胞产物(第3长条)、针对CD4结构域1之CDR2区域的单克隆抗体(第4长条)、针对CD4结构域1之CDR3区域的单克隆抗体(第5长条)、针对CD4结构域1/2的单克隆抗体(第6长条)、可溶性CD4存在下之iHIV(第7长条)、可溶性CD4存在下针对CD4结构域1之CDR2区域的单克隆抗体(第8长条)、可溶性CD4存在下针对CD4结构域1之CDR3区域的单克隆抗体(第9长条)，以及可溶性CD4存在下针对CD4结构域1/2的单克隆抗体(第10长条)，如附图说明所示(改编自Briant L.，et al.，1999)。

图16系显示利用抗-HIV RC多克隆抗体对生物素化-B4结合至rsCD4之竞争型抑制的图式，其藉由ELISA加以测量。

图17系显示mAb dB4和抗-HIV RC多克隆抗体对位在PBMCs上之表面CD4的抗体效价测定图式。抗体效价测定为％CD4结合对抗体浓度(μg/mL)。

图18A至图18G系显示于未使用治疗药物之HIV阳性和HIV阴性受试者以mAb dB4和抗-HIV RC多克隆抗体对由超抗原SEB所引起增生CD4+和CD8+ T细胞之细胞激素IL2和IFN-γ制造抑制的分析。对HIV阴性(图18A)和HIV阳性(图18B)受试者，mAb dB4和抗-HIV RC多克隆抗体对由超抗原所引起增生CD4+ T细胞之IL2制造的抑制如图所示。对HIV阴性受试者和年龄一致的HIV阳性受试者(图18C)，mAb dB4和抗-HIV RC多克隆抗体对由超抗原所引起增生CD8+ T细胞之IL2制造的抑制也如图所示。对HIV阴性(图18D)和HIV阳性(图18E)受试者，mAb dB4和抗-HIV RC多克隆抗体对由超抗原所引起增生CD4+ T细胞之IFN-γ制造的抑制如图所示。对HIV阴性(图18F)和HIV阳性(图18G)受试者，mAb dB4和抗-HIV RC多克隆抗体对由超抗原所引起增生CD8+ T细胞之IFN-γ制造的抑制如图所示。

图19A至图19C系显示藉由对于HIV-1原代分离株DH12(HIV-1_DH12)暴露前(图19A)和暴露后(图19B)投予mAb B4以保护黑猩猩免于HIV感染的图式，其藉由于感染后一段时间测定在PBMCs中的HIV-1RNA拷贝/mL而加以评估。暴露于HIV-1_DH12而未投予抗体之对照组动物的结果图式(图19C)如图所示。向下箭头标记试验开始，此时mAb B4是于HIV-1_DH12攻毒前或后一小时投予。

图20A和图20B系显示未接受治疗和以mAb B4治疗之HIV-1感染黑猩猩的HIV病毒量的图式，其藉由随时间测定的HIV-1RNA拷贝/mL而加以评估。图20A系比较于黑猩猩X356(接受三次mAb B4输注(实心圆))与未接受治疗的对照组黑猩猩X084(在之前试验中先前接受mAb B4的单一剂量(空心圆))之血浆病毒血症的持续时间。

图20B系比较于黑猩猩X356(接受三次mAb B4输注(实心圆))与未接受治疗的对照组黑猩猩X259(未接受mAb B4之先前用药剂量(空心圆))之血浆病毒血症的持续时间。

图21系mAb dB4对人类(---)和狒狒(-)CD4阳性T细胞之结合亲和力的曲线图比较。

图22A和图22B系显示对在药物增量(1、5、10和25mg/kg)之第I期临床试验中接受抗体药物UB-421(mAb dB4C7)单次投予的患者于HIV-1RNA的平均Log₁₀变化对试验天数的图式。图22A系显示在本试验期间每一剂量所展现之病毒减少的图式。图22B系显示对每一剂量之平均和最大个别最低点的图式。

图23A至图23C系显示UB-421(mAb dB4C7)之疗效和先前报导之TMB-355(TMB-355先前称为TNX-355；Kuritzkes，D.R.，et al.，2004，图1)疗效数据的理论比较图式。图23A系显示以5mg/kg之UB-421和3mg/kg之TMB-355单次投予后所观察之病毒量下降的图式比较。图23B系显示以10mg/kg之UB-421或TMB-355单次投予后所观察之病毒量下降的图式比较。图23C系显示以25mg/kg之UB-421或TMB-355单次投予后所观察之病毒量下降的图式比较。

图24A和图24B系显示于为期8周治疗期期间在接受每周10mg/kg(图24A)或每两周25mg/kg(图24B)UB-421(mAb dB4C7)投予之受试者的平均PBMC CD4T细胞数量/mm³的图式。可藉由针对CD4结构域2之生物素化抗体测得于UB-421治疗的患者中稳定的CD4T细胞数量。

图25A至图25D系显示在第IIa期临床试验期间UB-421治疗之临床疗效的图式，如利用病毒量减少(上图)和UB-421的药物动力学(如以μg/mL血清浓度加以测定(下图))所测定。提供了用于以下代表性患者的相关数据：接受每周10mg/kg UB-421投予的患者1-1-01(图25A)；接受每周10mg/kg UB-421投予的患者1-1-02(图25B)；接受每两周25mg/kg UB-421投予的患者1-2-03(图25C)；以及接受每两周25mg/kg UB-421投予的患者1-2-06(图25D)。以整个涂满灰色阴影之区间代表UB-421结合于PBMC CD4+细胞上的持续期间。

图26A和图26B系显示于使用UB-421之第IIa期临床试验所观察之病毒量减少对照于由他人所作之TMB-355(ibalizumab，先前称为TNX-355)类似试验(Jacobson，J.L.，etal.，2009；Toma，J.，et al.，2011；and Pace，C.S.，et al.，2013)所观察之病毒量减少的理论比较图式。图26A概述于以10mg/kg和25mg/kgUB-421治疗之受试者所观察的病毒量变化，而图26B概述于以相同剂量水平TMB-355治疗之受试者所观察的病毒量变化。

图27系显示于HIV患者群体的治疗形式示意图，此HIV患者群体是于未使用治疗药物之HIV患者和HAART治疗稳定之HIV患者使用UB-421单一药物治疗以替代HAART治疗。

图28系显示于HIV患者群体的治疗形式示意图，其利用UB-421合并使用HAART治疗以于未使用治疗药物之HIV患者、HAART治疗稳定之HIV患者，和HAART治疗失败之HIV患者达成HIV感染的功能性治愈。

【具体实施方式】

本发明有关于用以预防、治疗，及/或功能性治愈HIV感染的组合物和方法。本发明之一方面是关于针对CD4之抗体、其配制剂，以及使用此配制剂以预防、治疗，及/或功能性治愈HIV感染的方法。

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CD4

CD4(cluster of differentiation 4)是一种糖蛋白(UniProtKB/Swiss-Prot：P01730.1)，其位于免疫细胞(例如辅助T细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突细胞)(http://en.wikipedia.org/wiki/CD4)。CD4是免疫球蛋白超家族的成员，且具有暴露于细胞外表面的四个免疫球蛋白结构域(D1至D4)。CD4结构域D1和D3类似免疫球蛋白可变(IgV)区；而D2和D4类似免疫球蛋白恒定(IgC)区。CD4使用其D1结构域与第二型主要组织相容性复合体(MHC II)分子的β2-结构域相互作用。因此，于其表面表达CD4分子的T细胞对MHC II所呈现之抗原具有特异性。包含特殊氨基酸序列的CD4短细胞质/细胞内尾端使其可与lck分子相互作用。

CD4的第一个细胞外结构域与免疫球蛋白共有同源性，其三个互补决定区(CDRs)与免疫球蛋白链相似。发现CD4分子细胞外区域的结构域1和结构域2均对MHC II分子之结合位点具有贡献；然而，发现单独结构域1涉及HIV结合与合胞形成(syncytia formation)。特别地，发现HIV包膜糖蛋白gp120之结合位点位于结构域1的类CDR-2环(CDR2-likeloop)。

HIV-1藉由CD4进入宿主T细胞，此乃透过其病毒包膜蛋白(称为gp120)达成。结合CD4引起gp120构型变化以允许HIV-1结合至表达于宿主细胞上的化学激素受体CCR5或CXCR4。接着另一个病毒蛋白(gp41)结构改变，HIV将融合肽插入宿主细胞，以允许病毒的外膜与细胞膜融合。HIV感染造成表达CD4之T细胞数量逐渐减少。

抗体

本发明之一方面是关于针对CD4之抗体、其组合物，以及使用此组合物以预防、治疗，及/或功能性治愈HIV感染的方法。

本发明抗体广泛地包含完整的抗体分子，其包含完整的多克隆、单克隆、单特异性、多特异性、嵌合、去免疫化、人源化、人类、灵长类、单链、单结构域(single-domain)、合成和重组抗体，以及具有所欲活性或功能之抗体片段。

本发明抗体可辨认CD4的结构域1。在某些实施方案中，抗体可特异性地结合位于CD4结构域1的CDR2区域。

本发明抗体可以任何标准方法制造。在一些实施方案中，本发明抗体可藉由以重组CD4蛋白、重组CD4蛋白的片段、或是表面表达CD4的细胞免疫动物(例如：小鼠、狗、天竺鼠、猪、山羊、马等)加以制造。或者，可化学合成抗体。

在某些实施方案中，可藉由以含有CD4结构域1之氨基酸序列的肽免疫动物以制造抗体。例如，可藉由以含有CD4结构域1之CDR2区域氨基酸序列的肽或其组合免疫动物以制造多克隆抗体。在某些实施方案中，含有CD4之第39-66个氨基酸的肽(称为HIV受体复合体(“HIV RC”))，如同HIV结合至CD4之此部分。在某些实施方案中，HIV RC肽可藉由二硫键以创造环状结构。

在某些实施方案中，可利用环状HIV RC肽免疫动物以制造多克隆抗体。本发明所述“抗-HIV RC多克隆抗体”是指抗含有CD4结构域1之CDR2区域第39-66个氨基酸的环状肽的免疫血清。

在其它实施方案中，利用CD4阳性细胞免疫动物以制造抗体。例如，在某些实施方案中，以完整、未感染的CD4+人类HPB-ALL细胞、T细胞急性淋巴细胞性白血病细胞株(T-acute lymphoblastic leukemia cell line)免疫BALB/c小鼠制造抗体。于Wang的专利(美国5,912,176号和6,090,388号专利)以及Wang等人于1999年发表的期刊论文对此抗体有更详细的讨论，其均透过引用以并入本文整体。

在其它实施方案中，抗体包含如序列表所列之重链和轻链的氨基酸序列。本发明包含含有序列表所列氨基酸序列之抗体的同源物和功能类似物。

本发明抗体的功能类似物包含序列变异和同源物，其保持如原抗体实质上相同之功能特征(结合辨认、结合亲和力等)。例如，作为功能类似物或同源物之抗体变异于氨基酸位置具有保留性取代；静电荷改变；共价结合至其它官能基；或小的加入、插入、删除或保留性取代及/或其任意组合。因此，此抗体的变异抗体功能类似物和同源物将可辨识并结合CD4，且用于受试者以治疗HIV。

在一实施方案中，抗体功能类似物或同源物通常与含有揭露于序列表之氨基酸序列的抗体具有至少约50％序列相似度。在其它实施方案中，抗体功能类似物或同源物与含有揭露于序列表之氨基酸序列的抗体具有至少约50％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、或约99％相似度。

保留性取代是指一个氨基酸残基以另一个具有相似化学特性之氨基酸残基取代。例如，非极性(疏水性)氨基酸包含丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；极性中性氨基酸包含甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；正电(碱性)氨基酸包含精氨酸、赖氨酸和组氨酸；以及负电(酸性)氨基酸包含天冬氨酸和谷氨酸。

在其它实施方案中，抗体的功能类似物可藉由对氮基端、羧基端加入或删除氨基酸，及/或藉由插入序列中间而加以修饰。在本发明之不同实施方案中，是对肽的氮基端或羧基端加入或删除。可为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸残基的加入或删除。此种加入或删除可能构成氨基酸序列，而此氨基酸序列未呈现于序列表所列之序列中，但并不改变此抗体的一般功能特征。

在某些实施方案中，以化学物质标记或标帜本发明抗体。例如，抗体可以生物素、间隔臂、探针(例如：荧光素异硫氰酸盐(FITC)、藻红蛋白(PE)、四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)、DyLight Fluors、Alexa、绿色荧光蛋白(GFP)、R-藻红蛋白(R-Phycoerythrin)、量子点(quantum dots)等)、酶缀合物，及其组合加以标帜。在具体实施方案中，抗体是以生物素或荧光探针标帜。

在具体实施方案中，抗体透过已知的去免疫化过程加以修饰。本发明所述“去免疫化”一般是指用以修饰抗体之部分的过程，藉此使其投予动物时不引起动物体内之免疫反应。具体来说，此抗体于投予至特定动物时具有免疫原性(例如，T细胞抗原表位)，去免疫化涉及定位与移除抗体部分氨基酸序列的过程。此过程可藉由结合使用免疫学与分子生物学技术达成。此过程先前已揭露(例如Jones，T.D.，et al.2009)。在抗体去免疫化的状况下，可普遍地引入突变以移除T细胞抗原表位而未显著地减少抗体的结合亲和力。

本发明所述“人源化”是指修饰(去免疫化)非人类物种抗体的蛋白质序列，藉此移除当此抗体投予人类时的免疫原性。在某些实施方案中，本发明抗体是利用以人类恒定区取代其恒定区及/或利用表达于哺乳类细胞编码此些抗体的基因以去免疫化供人类使用。

在某些实施方案中，本发明抗体具有如表4所示之重链和轻链氨基酸序列。

本发明所述“mAb B4”或“B4”或“鼠源B4”分别地是指具有SEQ ID NOs：1-6之重链和轻链的CDR1、2、3区域氨基酸序列的鼠源单克隆抗体(如表4所示)。鼠源单克隆抗体可辨识CD4并抑制HIV进入。此抗体之结构与功能特征于实施例与下文中有更详细之讨论。

本发明所述“mAb dB4“或“dB4”是指衍生自mAb B4之人类去免疫化抗体。人类去免疫化mAb dB4分别地具有SEQ ID NOs：1-6之重链和轻链的CDR1、2、3区域之氨基酸序列(如表4所示)。在一些实施方案中，mAb dB4之轻链具有SEQ ID NO：8之氨基酸序列(如图5所示)。在一些实施方案中，mAb dB4之重链具有SEQ ID NO：7之氨基酸序列(如图4所示)。在不同实施例中，mAb dB4之重链具有SEQ ID NO：9之氨基酸序列(如图6所示)。MAb B4可藉由于本领域所知悉的任何适当方法加以去免疫化。在一实施方案中，mAb B4是利用依据美国7,501,494号和7,872,110号专利所述之方法去免疫化以供人类使用，其透过引用在此并入本文整体。在特殊实施方案中，人类去免疫化mAb dB4是藉由移除mAb B4之鼠源抗体恒定区(C_H和Cκ)，并以人类IgG1的恒定区取代，而制造。MAb dB4包含以任何适当之细胞克隆制造的dB4。在具体实施方案中，mAb dB4是由7号克隆所制造。

本发明所述“mAb dB4C7”或“dB4C7”，是指由包含重组基因B4DIVHv1/VK1CHO#7的7号克隆所表达的mAb dB4，其先前于美国7,501,494号和7,872,110号专利揭露，这些专利透过引用在此并入本文整体。显示C7克隆可制造高品质的mAb dB4抗体。特别的是，mAb B4C7为人类去免疫化抗体，其具有包含SEQ ID NO：8氨基酸序列之轻链(如图5所示)和包含SEQID NO：7氨基酸序列之重链(如图4所示)。此外，将位于mAb dB4C7位置298之Asn(N)残基以His(H)取代，以移除N-糖化点，因此于抗体B4存在下消除IgG介导的补体依赖型细胞毒性作用(CdC)以防止CD4阳性T细胞的耗竭。

本发明所述“UB-421”是指使用于投予人类受试者之合适形式的mAb dB4C7。

本发明抗体也可藉由其有趣与独特的功能特征而加以描述。

例如，本发明之抗体可透过其结合至CD4之结构域1而发挥有效的竞争型HIV进入抑制。特别是，本发明之抗体于测试的所有Env假型病毒具有接近100％的最大抑制百分比(MPI)，具有两个IC₅₀浓度；一个是介于0.01至1μg/mL，且第二个是约10μg/mL。本发明抗体的结合活性较HIV gpl20包膜蛋白所展现之CD4结合亲和力高了约两个对数(即100倍更紧密的结合)。此外，本发明抗体的平均解离常数(Kd)测得为5.6x 10^-11M(范围：3.1至8.1x 10^{- 11}M)，且最大结合容量(Bmax)测得为每细胞1.2x 10⁶Ab(范围：0.93至1.4x 10⁶)。

于无细胞和细胞间的系统中均显示本发明抗体的竞争型抑制特性。本发明抗体以较HIV包膜蛋白gp120MN高至少50倍之亲和力结合至CD4受体。并且，本发明抗体以相较于其它市售抗体(例如Leu3a)更高的亲和力与特异性结合至CD4。

本发明抗体也可抑制由抗原引起的T细胞增生和CD4阳性T细胞的细胞激素制造(IL2和IFN-gamma)，其涉及细胞焦亡的致病循环。此种对CD4具高亲和力之单克隆抗体可抑制抗原(例如超抗原SEB(金黄色葡萄球菌B型肠毒素(staphylococcal enterotoxin B，SEB))引起的CD4阳性T细胞活化和细胞激素(例如IL2和IFN-γ)制造。此种抗原引起的活化导致HIV感染失败的静默CD4+ T细胞产生细胞激素，造成这些静默CD4+ T细胞和附近正常静默CD4阳性细胞的细胞焦亡，其导致之后CD4+ T细胞的大量耗竭，因而导致AIDS。

本发明抗体也具有再活化静默CD4阳性T细胞的能力。此特性对再活化静默T细胞中的潜伏HIV病毒库特别有用，可使这些细胞对抗反转录病毒药物治疗敏感。为了释放HIV，此种对CD4高亲和力之抗体可活化静默的HIV感染细胞。HIV感染的静默CD4+ T细胞再活化允许HIV感染患者使用合并本发明抗体与HAART之合并治疗，以达成功能性治愈。

于以下实施例提供本发明抗体额外的结构与功能特征。

剂型

本发明也针对用以预防、治疗，及/或功能性治愈HIV感染的药剂剂型。在某些实施方案中，剂型包含针对CD4之抗体。在具体实施方案中，本发明关于包含对CD4高亲和力之单克隆抗体的医药组合物(此抗体可针对位于CD4结构域1之CDR2区域内或附近的位置)。此种抗体的结合活性(EC_s0)较HIV gp120包膜蛋白所展现之CD4结合亲和力(对gp120之EC₅₀＝97nM)高了约两个对数(即100倍更紧密的结合)。

抗体蛋白质的药剂剂型可藉由混合抗体蛋白质与任选的药物学上可接受的载体而加以制备。药物学上可接受的载体包含溶剂、分散介质、等渗剂等。载体可为液体、半固体(例如膏状物)或固体载体。载体的例子包含水、盐溶液或其它缓冲液(例如磷酸盐、柠檬酸盐缓冲液)、油类、醇类、蛋白质(例如血清白蛋白、明胶)、碳水化合物(例如单糖、双糖，以及其它碳水化合物(包含葡萄糖、蔗糖、海藻糖、甘露糖、甘露醇、山梨糖醇或糊精)、凝胶、脂质、微脂体、树脂、多孔基体、粘合剂、充填剂、涂层、稳定剂、防腐剂、抗氧化剂(包含抗坏血酸以及甲硫氨酸)、螯合剂(例如EDTA)；成盐的抗衡离子(salt forming counter-ions)(例如钠)；非离子表面活性剂(例如TWEEN^TM、PLURONICS^TM或聚乙二醇(PEG)，或其组合)。

此剂型可包含至少一种的活性物质。例如，剂型可含有用于预防和治疗HIV感染之一或多个抗体及/或一或多个具有额外优点的化合物。活性物质可以任何方便使用的方式(例如：混合、溶液、悬浮液、乳化作用、胶囊化、吸附等)与载体结合，且可制成适用于注射、摄取、输注等的剂型(例如：锭剂、胶囊、粉末(包含冷冻干燥粉末)、糖浆剂、悬浮液)。亦可制备成缓释制剂。

在某些实施方案中，药剂剂型包含供人类使用之mAb dB4C7。包含mAb dB4C7之药剂剂型可配制于适当缓冲液中，包含，但不限于，柠檬酸盐、磷酸盐、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、1，3-二[三(羟甲基)甲基氨基]丙烷(BIS-Tris)等，于介于6.0至7.0之pH值，且可包含赋形剂(例如糖类(50mM至500mM的蔗糖、海藻糖、甘露醇，或其混合))、表面活性剂(例如：0.025％-0.5％的Tween 20或Tween 80)，及/或其它试剂。在具体实施方案中，剂型包含mAbdB4C7于含有20mM甘氨酸，以及0.05％(v/v)Tween(polysorbate 20)之磷酸盐缓冲生理食盐水(PBS)(pH 6.5)中。在其它具体实施方案中，也可制备mAb dB4之高浓度剂型以供包含皮下注射之应用，其包含10mM组氨酸。

可制备含有不同量抗体的剂型。一般来说，用于投予受试者的剂型包含介于约0.1mg/mL至约200mg/mL。在某些实施方案中，剂型可包含介于约0.5mg/mL至约50mg/mL；介于约1.0mg/mL至约50mg/mL；介于约1mg/mL至约25mg/mL；或介于约10mg/mL至约25mg/mL的抗体。在具体实施方案中，剂型包含约1.0mg/mL，约5.0mg/mL，约10.0mg/mL，或约25.0mg/mL的抗体。

在具体实施方案中，本发明关于包含具有上述结合特征之针对CD4结构域1之CDR2区域之人类、人源化或嵌合、单克隆抗-CD4抗体的医药组合物，其展现竞争型HIV进入抑制与CD4+ T细胞活化，作为HIV患者的免疫疗法。

在其它实施方案中，本发明关于包含具有上述结合特征之单克隆人类、人源化或嵌合，抗-CD4抗体的医药组合物，其作为单一药物治疗使接受治疗之受试者血清抗体水平高于10μg/mL，可将病毒量降低至检测极限以下。

在其它实施方案中，本发明关于包含具有上述结合特征之单克隆人类、人源化或嵌合，抗-CD4抗体的医药组合物，其作为单一药物治疗可于为期12周治疗期间使接受治疗之受试者血清抗体水平高于10μg/mL，且维持稳定的CD4T细胞数量，将病毒量降低至检测极限以下。

在某些实施方案中，本发明关于包含具有上述结合特征之单克隆人类、人源化或嵌合，抗-CD4抗体的医药组合物，当以每周或每两周之时程表以约10mg/kg或更高之剂量投予作为单一药物治疗时，此种治疗可于为期12周治疗期间使接受治疗之受试者的病毒量降低至检测极限以下。

在另一较佳实施方案中，本发明关于包含具有上述结合特征之单克隆人源化抗-CD4抗体的医药组合物，其可作为偕同HAART之辅助治疗的关键成份，当以每周或每两周之时程表以约10mg/kg或更高之剂量投予未使用治疗药物之HIV患者，将达成患者的功能性治愈。

在另一较佳实施方案中，本发明关于包含具有上述结合特征之单克隆人源化抗-CD4抗体的医药组合物，其可作为偕同HAART之辅助治疗的关键成份，当以每周或每两周之时程表以约10mg/kg或更高之剂量投予于HAART下具有稳定病毒量的患者，将达成患者的功能性治愈。

抗病毒药物

本发明之治疗、预防，和功能性治愈HIV感染的方法更包括抗病毒药物。

抗病毒药物包含可于哺乳类动物有效抑制HIV之形成及/或复制的任何药物(化合物或生物的)。抗病毒药物的例子包含，但不限于，进入/融合抑制剂(例如：maraviroc、enfuvirtide)；核苷类反转录酶抑制剂(NRTI)和核苷酸类反转录酶抑制剂(NtRTI)(例如：zidovudine、abacavir、lamivudine、emtricitabine和tenofovir)；非核苷类反转录酶抑制剂(NNRTI)(例如：nevirapine、efavirenz、etravirine和rilpivirine)；整合酶抑制剂(也称为整合酶链转移抑制剂或INSTIs(例如：raltegravir、dolutegravir)；蛋白酶抑制剂(例如：saquinavir、saquinavir mesylate、fosamprenavir、tipranavir、lopinavir、indinavir、nelfinavir、amprenavir、ritonavir、darunavir、atazanavir、bevirimat、vivecon)；病毒成熟抑制剂；针对HIV基因表达的药物；针对涉及HIV复制之重要宿主细胞基因和基因产物的药物；以及其它抗-HIV药物；iRNA药物；反义RNA(antisense RNA)；表达iRNA药物或反义RNA之载体；肽核酸(PNA)以及抗病毒抗体；及其组合。

抗病毒药物可以单独或合并方式使用。以合并方式使用抗病毒药物称为抗反转录病毒治疗(ART)，联合抗反转录病毒治疗(cART)或高效抗反转录病毒疗法(HAART)。抗反转录病毒(ARV)药物藉由药物抑制反转录病毒生命周期的阶段而广泛地被分类。典型的合并使用包含以两种NRTIs作为“骨架”，以及以一种NNRTI、PI或INSTI作为“基底”。在某些实施方案中，合并使用抗病毒药物的方式，例如：Combivir、Trizivir、Kaletra、Epzicom、Truvada、Atripla、Complera、Stribild、Triumeq。

治疗、预防和功能性治愈的方法

本发明也包括用以治疗、预防，和功能性治愈HIV感染的方法。在某些实施方案中，剂型包含针对CD4之抗体。

另一方面，本发明之抗体、任选的药物学上可接受的载体可于受试者用以预防、治疗，及/或功能性治愈HIV感染，以及预防HIV传播。

本发明所述HIV感染的“治疗”是指对HIV感染的有效抑制，藉此延迟发生、延缓病程、减少病毒量，及/或改善由HIV感染所引起之症状。治疗包含对HIV暴露前和暴露后。

本发明所述HIV感染的“预防”是指延迟HIV感染之发生，及/或减少或消除HIV感染的发生率或可能性。本发明所述HIV传播的“预防”是指减少或消除HIV由一个体传染至另一个体(例如于怀孕、分娩或生产，或母乳喂养期间由HIV阳性之女性传至小孩)的发生率或可能性。

本发明所述“受试者”是指任何灵长类受试者，包含人类、恒河猴、狒狒和黑猩猩受试者。

为治疗及/或预防HIV感染，对有需求的受试者投予本发明抗体的治疗剂量。

本发明所述“治疗上有效剂量”是指抑制HIV感染效果所需剂量，藉此治疗及/或预防HIV感染。抗体的剂量取决于疾病状态和其它临床因素，例如受试者重量和状况、受试者对此疗法的反应、剂型的种类和给药途径。作为治疗上有效且非有害的精确剂量可由本领域之技术人员所决定。

一般来说，投予成年人类之抗体的适当剂量范围介于约3至50mg/kg受试者体重，具有范围介于约5至25mg/kg受试者体重的典型初步范围可供使用。适当剂量也包含约5.0mg/kg、约10.0mg/kg、或约25.0mg/kg受试者体重。

包含本发明人类单克隆抗体的治疗性组合物可便于静脉投予(例如藉由单位剂量注射)。单位剂量一般是指本发明之治疗性组合物，其进一步是指对受试者适合作为单位剂量之物理上分开的单位，每一单位包含计算用以产生所欲治疗反应之活性物质的预定量和所需稀释剂(即载体或赋形剂)。

以适当剂型之方式与治疗上有效剂量投予组合物。给药量取决于所欲治疗的受试者、受试者身体利用活性物质的能力，以及所欲治疗效果之程度。需要投予之活性成分的精确剂量取决于医生之判断与个体的差异性。然而，所揭露供系统性应用之适当剂量范围取决于给药途径。用于投予的适当治疗方案也不尽相同，而是以于初次投予后投予重复剂量作为代表(于一或多个小时之间隔藉由之后的注射或其它投予方式)。另外，考虑在生物治疗中持续静脉输注以维持血液中的浓度于指定范围。

于受试者用以治疗、预防，及/或功能性治愈HIV感染的方法包含投予受试者有效剂量之含有抗体的剂型。在某些实施方案中，以单次投予的方式提供剂型给受试者。在某些实施方案中，以多次投予的方式提供剂型给受试者。当以多次投予的方式提供剂型时，剂型可以每天一次、每周一次、每两周一次(每隔一周)，或每月一次投予。在具体实施方案中，当治疗时程表是以每周一次时，剂型是以约5.0mg/kg受试者体重之剂量投予受试者。在另一实施方案中，当治疗时程表是以每两周一次时，剂型是以约25.0mg/kg受试者体重之剂量投予受试者。

在某些实施方案中，当以总共8周，以5mg/kg或25mg/kg剂量以每周为基础重复投予受试者时，含有单克隆抗体之剂型显现高安全系数且耐受性良好。在具体实施方案中，单克隆抗体可以5mg/kg剂量在HIV感染数小时内投予受试者，以提供HIV感染的消除性治愈。在其它实施方案中，单克隆抗体可以5mg/kg剂量于HIV感染后在数天内投予受试者，以提供HIV感染的功能性治愈。

在某些实施方案中，本发明关于包含具有上述结合特征之单克隆人类、人源化或嵌合，抗-CD4抗体的医药组合物，可将其透过静脉注射或皮下注射给药途径投予HIV患者作为免疫疗法以减少病毒量。在具体实施方案中，本发明关于包含具有上述结合特征之针对CD4结构域1CDR2区域之人类、人源化或嵌合单克隆抗-CD4抗体的医药组合物，其展现竞争型HIV进入抑制与CD4+ T细胞活化，以作为HIV感染之患者的免疫疗法。

在某些实施方案中，本发明关于包含具有上述结合特征之单克隆人类、人源化或嵌合抗-CD4抗体的医药组合物，可将其以每周或每两周之时程表以约10mg/kg或更高之剂量透过静脉注射或皮下注射给药途径投予HIV患者作为免疫疗法以减少病毒量。

在其它实施方案中，本发明关于包含具有上述结合特征之单克隆人类、人源化或嵌合抗-CD4抗体的医药组合物，其作为单一药物治疗可使接受治疗之受试者血清抗体水平高于10μg/mL，将病毒量降低至检测极限以下。

在其它实施方案中，本发明关于包含具有上述结合特征之单克隆人类、人源化或嵌合抗-CD4抗体的医药组合物，其作为单一药物治疗可于为期12周治疗期间使接受治疗之受试者血清抗体水平高于10μg/mL，且维持稳定的CD4T细胞数量，将病毒量降低至检测极限以下。

在其它实施方案中，本发明关于包含具有上述结合特征之单克隆人类、人源化或嵌合抗-CD4抗体的医药组合物，当以每周或每两周之时程表以约10mg/kg或更高之剂量投予作为单一药物治疗时，此种治疗可于为期12周治疗期间使接受治疗之受试者的病毒量降低至检测极限以下。

在其它实施方案中，本发明关于包含具有上述结合特征之单克隆人类、人源化或嵌合抗-CD4抗体的医药组合物，当以每周或每两周之时程表以约10mg/kg或更高之剂量投予作为单一药物治疗时，此种治疗可使接受治疗之受试者的病毒量降低至检测极限以下，且只要血清抗体水平高于10μg/mL即无病毒量反弹。

在其它实施方案中，本发明关于包含具有上述结合特征之单克隆人源化抗-CD4抗体的医药组合物，其可作为偕同HAART之辅助治疗的关键成份，当以每周或每两周之时程表以约10mg/kg或更高之剂量投予未使用治疗药物之HIV患者，可达成患者的功能性治愈。

在其它实施方案中，本发明关于包含具有上述结合特征之单克隆人源化抗-CD4抗体的医药组合物，其可作为偕同HAART之辅助治疗的关键成份，当以每周或每两周之时程表以约10mg/kg或更高之剂量投予于HAART下具有稳定病毒量的患者，可达成患者的功能性治愈。

在其它实施方案中，本发明关于包含具有上述结合特征之单克隆人源化抗-CD4抗体的医药组合物，可将其以每周或每两周之时程表以约10mg/kg或更高之剂量透过静脉注射或皮下注射给药途径投予对HAART之辅助治疗中HAART治疗失败之患者，可使病毒进一步减少。

在其它实施方案中，本发明关于包含具有上述结合特征之单克隆人源化抗-CD4抗体的医药组合物，可将其以静脉注射或皮下注射给药途径投予作为于HAART替代疗法的关键成份，藉此进行治疗循环，每治疗循环以抗-CD4抗体治疗2至4个月作为开始，其如同对于HARRT之下经历稳定低于检测极限病毒量之患者的治疗假日(treatment holiday)，之后接续HAART治疗，进行1至4个或更多循环的期间，可达成功能性治愈。

在其它实施方案中，本发明关于包含具有上述结合特征之单克隆人源化抗-CD4抗体的医药组合物，可将其以静脉注射或皮下注射给药途径投予作为于HAART替代疗法的关键成份，藉此进行治疗循环，对于未使用治疗药物之HIV患者每治疗循环以抗-CD4抗体治疗2至4个月作为开始，之后接续2至4个月的HAART治疗，进行1至4个或更多循环的期间，可达成功能性治愈。

在其它实施方案中，本发明关于包含具有上述结合特征之单克隆人源化抗-CD4抗体的医药组合物，可将其以静脉注射或皮下注射给药途径投予作为于HAART替代疗法的关键成份，藉此进行治疗循环，每治疗循环以抗-CD4抗体治疗2至4个月作为开始，其如同对于HARRT之下经历稳定低于检测极限病毒量之患者的治疗假日，之后接续HAART治疗，进行1至4个或更多循环的期间，以每周或每两周之时程表以约5mg/kg或更高之剂量，可达成功能性治愈。

在其它实施方案中，本发明关于包含具有上述结合特征之单克隆人源化抗-CD4抗体的医药组合物，可将其以静脉注射或皮下注射给药途径投予作为于HAART替代疗法的关键成份，藉此进行治疗循环，对于未使用治疗药物之HIV患者每治疗循环以抗-CD4抗体治疗2至4个月作为开始，之后接续2至4个月的HAART治疗，进行1至4个或更多循环的期间，以每周或每两周之时程表以约5mg/kg或更高之剂量，可达成功能性治愈。

在其它实施方案中，本发明关于包含具有上述结合特征之单克隆人源化抗-CD4抗体的医药组合物，其可作为偕同HAART之辅助治疗的关键成份，当以每周或每两周之时程表以约10mg/kg或更高之剂量投予未使用治疗药物之HIV患者，将达成患者的功能性治愈。

在其它实施方案中，本发明关于包含具有上述结合特征之单克隆人源化抗-CD4抗体的医药组合物，其可作为偕同HAART之辅助治疗的关键成份，当以每周或每两周之时程表以约10mg/kg或更高之剂量投予于HAART下具有稳定病毒量的患者，将达成患者的功能性治愈。

在其它实施方案中，本发明关于包含具有上述结合特征之单克隆人源化抗-CD4抗体的医药组合物，可将其以每周或每两周之时程表以约10mg/kg或更高之剂量透过静脉注射或皮下注射给药途径投予对HAART之辅助治疗中HAART治疗失败之患者，使病毒进一步减少。

在其它实施方案中，本发明关于包含具有上述结合特征之单克隆人源化抗-CD4抗体的医药组合物，可将其以静脉注射或皮下注射给药途径投予作为偕同HAART之辅助治疗的关键成份，于间歇模式中，对于未使用治疗药物之HIV患者，每循环以2至4个月之治疗期作为开始，以及1至2个月之治疗假日，进行1至4个或更多循环的期间，如同于密集HAART治疗模式的辅助治疗，可达成患者的功能性治愈。

在其它实施方案中，本发明关于包含具有上述结合特征之单克隆人源化抗-CD4抗体的医药组合物，可将其以静脉注射或皮下注射给药途径投予作为偕同HAART之辅助治疗的关键成份，于间歇模式中，对于未使用治疗药物之HIV患者，每循环以2至4个月之治疗期作为开始，以及1至2个月之治疗假日，进行1至4个或更多循环的期间，以每周或每两周之时程表以约5mg/kg或更高之剂量，如同于密集HAART治疗模式的辅助治疗，可达成患者的功能性治愈。

在其它实施方案中，本发明关于包含具有上述结合特征之单克隆人源化抗-CD4抗体的医药组合物，可将其以静脉注射或皮下注射给药途径投予作为偕同HAART之辅助治疗的关键成份，于间歇模式中，对HARRT之下经历稳定低于检测极限病毒量之患者，每循环以2至4个月之治疗期作为开始，以及1至2个月之治疗假日，进行1至4个或更多循环的期间，以每周或每两周之时程表以约5mg/kg或更高之剂量，如同于密集HAART治疗模式的辅助治疗，可达成患者的功能性治愈。

在其它实施方案中，本发明关于包含具有上述结合特征之单克隆人类、人源化或嵌合抗-CD4抗体的医药组合物，可将其以静脉注射或皮下注射给药途径投予HIV患者作为免疫疗法以减少病毒量。

在其它实施方案中，本发明关于包含具有上述结合特征之单克隆人类、人源化或嵌合抗-CD4抗体的医药组合物，可将其以每周或每两周之时程表以约5mg/kg或更高之剂量透过静脉注射或皮下注射给药途径投予HIV患者作为免疫疗法以减少病毒量。

具体实施方案

本发明包含以下具体实施方案：

(1)一种用以治疗暴露于HIV感染之受试者的方法，包含：a)投予针对CD4之单克隆抗体的药理学上有效剂量包含：SEQ ID NO：1之鼠源抗体B4之重链的CDR1、SEQ ID NO：2之鼠源抗体B4之重链的CDR2、SEQ ID NO：3之鼠源抗体B4之重链的CDR3、SEQ ID NO：4之鼠源抗体B4之轻链的CDR1、SEQ ID NO：5之鼠源抗体B4之轻链的CDR2，以及SEQ ID NO：6之鼠源抗体B4之轻链的CDR3；b)在步骤(a)后评估受试者血液之每毫升的HIV RNA水平。

(2)依据(1)的方法，其中抗体的重链序列包含SEQ ID NO：7。

(3)依据(1)的方法，其中抗体的重链序列包含SEQ ID NO：9。

(4)依据(1)的方法，其中抗体的轻链序列包含SEQ ID NO：8。

(5)依据(1)的方法，其中抗体的重链序列包含SEQ ID NO：7，且抗体的轻链序列包含SEQ ID NO：8。

(6)依据(1)的方法，其中抗体的重链序列包含SEQ ID NO：9，且抗体的轻链序列包含SEQ ID NO：8。

(7)依据(1)的方法，其中投予步骤(a)是于暴露于HIV感染24小时内进行。

(8)依据(1)的方法，其中投予步骤(a)是于暴露于HIV感染48小时内进行。

(9)依据(1)的方法，其中单克隆抗体的药理学上有效剂量是以于12周之期间内以每周或每两周之时程表以约为10μg/ml或更高之血清水平被投予。

(10)依据(1)的方法，其中低于1个拷贝/ml之每毫升的HIV RNA水平数值被视为病毒的根除。

(11)依据(1)的方法，其中介于1至低于50个拷贝/ml之每毫升的HIV RNA水平数值被视为病毒的功能性治愈。

(12)一种用以治疗HIV患者的方法，包含：a)投予组合物之药理学上有效剂量，此组合物包含针对CD4之单克隆抗体，此针对CD4之单克隆抗体包含：SEQ ID NO：1之鼠源抗体B4之重链的CDR1、SEQ ID NO：2之鼠源抗体B4之重链的CDR2、SEQ ID NO：3之鼠源抗体B4之重链的CDR3、SEQ ID NO：4之鼠源抗体B4之轻链的CDR1、SEQ ID NO：5之鼠源抗体B4之轻链的CDR2，以及SEQ ID NO：6之鼠源抗体B4之轻链的CDR3；以及高效抗反转录病毒疗法(HAART)；以及b)在步骤(a)后评估受试者血液中每毫升的HIV RNA水平。

(13)依据(12)的方法，其中抗体的重链序列包含SEQ ID NO：7。

(14)依据(12)的方法，其中抗体的重链序列包含SEQ ID NO：9。

(15)依据(12)的方法，其中抗体的轻链序列包含SEQ ID NO：8。

(16)依据(12)的方法，其中抗体的重链序列包含SEQ ID NO：7，且抗体的轻链序列包含SEQ ID NO：8。

(17)依据(12)的方法，其中抗体的重链序列包含SEQ ID NO：9，且抗体的轻链序列包含SEQ ID NO：8。

(18)依据(12)的方法，其中抗体的药理学上有效剂量是以每周或每两周之基础以10mg/kg或更高之剂量被投予。

(19)依据(12)的方法，其中抗体是以间歇模式被投予以作为于HAART治疗模式中的辅助治疗。

(20)依据(19)的方法，其中每循环是于约2至4个月之期间投予抗体作为HAART治疗模式中的辅助治疗，之后为HAART治疗模式中1至2个月的抗体治疗假日。

(21)依据(20)的方法，其中间歇方式持续一至四循环的期间。

(22)一种用以治疗HIV患者的方法，包含：a)藉由活化患者体内之潜伏感染细胞的HIV病毒表达和细胞凋亡，以减少于HIV患者体内的潜伏HIV病毒库；以及b)对患者投予HAART的药理学上有效剂量。

(23)依据(22)的方法，其中活化患者体内潜伏感染细胞的HIV病毒表达和细胞凋亡是藉由对患者投予针对CD4之单克隆抗体的药理学上有效剂量而加以执行，包含：SEQ IDNO：1之鼠源抗体B4之重链的CDR1、SEQ ID NO：2之鼠源抗体B4之重链的CDR2、SEQ ID NO：3之鼠源抗体B4之重链的CDR3、SEQ ID NO：4之鼠源抗体B4之轻链的CDR1、SEQ ID NO：5之鼠源抗体B4之轻链的CDR2，以及SEQ ID NO：6之鼠源抗体B4之轻链的CDR3。

(24)依据(22)的方法，其中活化患者体内潜伏感染细胞的HIV病毒表达和细胞凋亡是藉由对患者投予组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂而加以执行。

(25)一种用以治疗暴露于HIV感染之受试者的方法，包含：a)投予对CD4类CDR2结构域区域(CDR2-like domain region)具有高度亲和力之单克隆抗体的药理学上有效剂量；以及b)在步骤(a)后评估受试者血液之每毫升的HIV RNA水平。

(26)依据(25)的方法，其中抗体的重链序列包含SEQ ID NO：7。

(27)依据(25)的方法，其中抗体的重链序列包含SEQ ID NO：9。

(28)依据(25)的方法，其中抗体的轻链序列包含SEQ ID NO：8。

(29)依据(25)的方法，其中抗体的重链序列包含SEQ ID NO：7，且抗体的轻链序列包含SEQ ID NO：8。

(30)依据(25)的方法，其中抗体的重链序列包含SEQ ID NO：9，且抗体的轻链序列包含SEQ ID NO：8。

(31)依据(25)的方法，其中投予步骤(a)是于暴露于HIV感染24小时内进行。

(32)依据(25)的方法，其中投予步骤(a)是于暴露于HIV感染48小时内进行。

(33)依据(25)的方法，其中单克隆抗体的药理学上有效剂量是于12周之期间内以每周或每两周之时程表以约10μg/ml或更高之血清水平被投予。

(34)依据(25)的方法，其中低于1个拷贝/ml之每毫升的HIV RNA水平数值被视为病毒的根除。

(35)依据(25)的方法，其中介于1至低于50个拷贝/ml之每毫升的HIV RNA水平数值被视为病毒的功能性治愈。

额外的具体实施方案

(1)一种用以治疗暴露于HIV之受试者的方法，包含投予受试者针对CD4结构域1之抗体的药理学上有效剂量。

(2)依据(1)的方法，其中抗体特异性地结合位于CD4结构域1的CDR2区域。

(3)依据(2)的方法，其中抗体为单克隆抗体、多克隆抗体，或其组合。

(4)依据(2)的方法，其中抗体为人源化单克隆抗体。

(5)依据(4)的方法，其中人源化单克隆抗体包含：重链氨基酸序列包含：SEQ IDNO：1的CDR1、SEQ ID NO：2的CDR2，以及SEQ ID NO：3的CDR3；以及轻链氨基酸序列包含：SEQID NO：4的CDR1、SEQ ID NO：5的CDR2，以及SEQ ID NO：6的CDR3。

(6)依据(4)的方法，其中人源化单克隆抗体包含：包含SEQ ID NO：11之氨基酸序列的重链；以及包含SEQ ID NO：13之氨基酸序列的轻链。

(7)依据(4)的方法，其中人源化单克隆抗体包含：包含SEQ ID NO：10之氨基酸序列的重链；以及包含SEQ ID NO：8之氨基酸序列的轻链。

(8)依据(7)的方法，其中重链包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列。

(9)依据(8)的方法，其中人源化抗体是于暴露于HIV前投予受试者。

(10)依据(8)的方法，其中人源化抗体是于暴露于HIV后投予受试者。

(11)依据(10)的方法，其中人源化抗体是于暴露于HIV后48小时内投予。

(12)依据(8)的方法，其中人源化抗体是以至少约5mg/kg体重之剂量投予受试者。

(13)依据(12)的方法，其中人源化抗体是以多次投予受试者。

(14)依据(13)的方法，其中人源化抗体是以每周或每两周之间隔投予受试者。

(15)依据(13)的方法，更包含投予受试者抗病毒药物之步骤。

(16)依据(15)的方法，其中抗病毒药物为高效抗反转录病毒疗法(HAART)。

(17)依据(16)的方法，其中HAART包含核苷类似物反转录酶抑制剂合并使用蛋白酶抑制剂或非核苷类反转录酶抑制剂。

(18)依据(16)的方法，其中人源化抗体是与HAART同时投予。

(19)依据(16)的方法，其中在循环的期间内投予受试者人源化抗体和HAART，其中此循环包含：(i)以每周或每两周之间隔于4个月之期间对受试者投予人源化抗体，之后为两个月的治疗假日；以及(ii)于(i)内之六个月期间持续地对此受试者投予HAART。

(20)依据(18)的方法，其中受试者是以二循环的期间治疗。

(21)一种用以治疗HIV感染之受试者的方法，包含投予此受试者治疗方案包含：(a)针对CD4结构域1之抗体的药理学上有效剂量；以及(b)高效抗反转录病毒疗法(HAART)。

(22)依据(21)的方法，其中抗体特异性地结合位于CD4结构域1的CDR2区域。

(23)依据(22)的方法，其中抗体为单克隆抗体、多克隆抗体，或其组合。

(24)依据(22)的方法，其中抗体为人源化单克隆抗体。

(25)依据(24)的方法，其中人源化单克隆抗体包含：重链氨基酸序列包含：SEQ IDNO：1的CDR1、SEQ ID NO：2的CDR2，以及SEQ ID NO：3的CDR3；以及轻链氨基酸序列包含：SEQID NO：4的CDR1、SEQ ID NO：5的CDR2，以及SEQ ID NO：6的CDR3。

(26)依据(24)的方法，其中人源化单克隆抗体包含：包含SEQ ID NO：11之氨基酸序列的重链；以及包含SEQ ID NO：13之氨基酸序列的轻链。

(27)依据(24)的方法，其中人源化单克隆抗体包含：包含SEQ ID NO：10之氨基酸序列的重链；以及包含SEQ ID NO：8之氨基酸序列的轻链。

(28)依据(27)的方法，其中人源化抗体是以至少约5mg/kg体重之剂量投予受试者。

(29)依据(21)的方法，其中在循环的期间内投予受试者治疗方案，其中此循环包含：(i)以每周或每两周之间隔于4个月之期间对受试者投予人源化抗体，之后为两个月的治疗假日；以及(ii)于(i)内之六个月期间持续地对此受试者投予HAART。

(30)依据(18)的方法，其中此受试者是以二循环治疗。

更具体实施方案

(1)一种用以治疗暴露于HIV之受试者的组合物包含：针对CD4结构域1之抗体的药理学上有效剂量。

(2)依据(1)的组合物，其中抗体特异性地结合位于CD4结构域1的CDR2区域。

(3)依据(2)的组合物，其中抗体为单克隆抗体、多克隆抗体，或其组合。

(4)依据(2)的组合物，其中抗体为人源化单克隆抗体。

(5)依据(4)的组合物，其中人源化单克隆抗体包含：重链氨基酸序列包含：SEQ IDNO：1的CDR1、SEQ ID NO：2的CDR2，以及SEQ ID NO：3的CDR3；以及轻链氨基酸序列包含：SEQID NO：4的CDR1、SEQ ID NO：5的CDR2，以及SEQ ID NO：6的CDR3。

(6)依据(4)的组合物，其中人源化单克隆抗体包含：包含SEQ ID NO：11之氨基酸序列的重链，以及包含SEQ ID NO：13之氨基酸序列的轻链。

(7)依据(4)的组合物，其中人源化单克隆抗体包含：包含SEQ ID NO：10之氨基酸序列的重链；以及包含SEQ ID NO：8之氨基酸序列的轻链。

(8)依据(7)的组合物，其中重链包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列。

(9)依据(8)的组合物，其中人源化抗体是于暴露于HIV前投予受试者。

(10)依据(8)的组合物，其中人源化抗体是于暴露于HIV后投予受试者。

(11)依据(10)的组合物，其中人源化抗体是于暴露于HIV后48小时内投予。

(12)依据(8)的组合物，其中人源化抗体是以至少约5mg/kg体重之剂量投予受试者。

(13)依据(12)的组合物，其中人源化抗体是以多次投予受试者。

(14)依据(13)的组合物，其中人源化抗体是以每周或每两周之间隔投予受试者。

(15)依据(13)的组合物，其中是以抗病毒药物治疗(或投予)受试者。

(16)依据(15)的组合物，其中抗病毒药物为高效抗反转录病毒疗法(HAART)。

(17)依据(16)的组合物，其中HAART包含核苷类似物反转录酶抑制剂合并使用蛋白酶抑制剂或非核苷类反转录酶抑制剂。

(18)依据(16)的组合物，其中人源化抗体是与HAART同时投予。

(19)依据(16)的组合物，其中在循环的期间内投予受试者人源化抗体和HAART，其中此循环包含：(i)以每周或每两周之间隔于4个月之期间对受试者投予人源化抗体，之后为两个月的治疗假日；以及(ii)于(i)内之六个月期间持续地对此受试者投予HAART。

(20)依据(18)的组合物，其中受试者是以二循环的期间治疗。

(21)一种用以治疗HIV感染之受试者的组合物包含：(a)针对CD4结构域1之抗体的药理学上有效剂量；以及(b)高效抗反转录病毒疗法(HAART)。

(22)依据(21)的组合物，其中抗体特异性地结合位于CD4结构域1的CDR2区域。

(23)依据(22)的组合物，其中抗体为单克隆抗体、多克隆抗体，或其组合。

(24)依据(22)的组合物，其中抗体为人源化单克隆抗体。

(25)依据(24)的组合物，其中人源化单克隆抗体包含：重链氨基酸序列包含：SEQID NO：1的CDR1、SEQ ID NO：2的CDR2，以及SEQ ID NO：3的CDR3；以及轻链氨基酸序列包含：SEQ ID NO：4的CDR1、SEQ ID NO：5的CDR2，以及SEQ ID NO：6的CDR3。

(26)依据(24)的组合物，其中人源化单克隆抗体包含：包含SEQ ID NO：11之氨基酸序列的重链；以及包含SEQ ID NO：13之氨基酸序列的轻链。

(27)依据(24)的组合物，其中人源化单克隆抗体包含：包含SEQ ID NO：10之氨基酸序列的重链，以及包含SEQ ID NO：8之氨基酸序列的轻链。

(28)依据(27)的组合物，其中人源化抗体是以至少约5mg/kg体重之剂量投予受试者。

(29)依据(21)的组合物，其中在循环的期间内投予受试者治疗方案，其中此循环包含：(i)以每周或每两周之间隔于4个月之期间对受试者投予人源化抗体，之后为两个月的治疗假日；以及(ii)于(i)内之六个月期间持续地对此受试者投予HAART。

(30)依据(18)的组合物，其中此受试者是以二循环治疗。

除非特别说明，在此使用的所有技术和科学用语如本发明所属技术领域中具有通常知识者的通常理解具有相同意义。除非上下文清楚地指出，否则单词“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包含复数形式。类似地，单词“或(or)”是意指包括“和(and)”，除非上下文另有明确说明。因此，“包含A或B”是指包括A，或B，或A和B。更应被理解的是，用于给定多肽之所有的氨基酸大小和所有分子量或分子质量值是近似的，并且被提供作为描述之用。然而类似或等同于在此描述者的方法和材料可被用于以下所述之揭露的方法、合适的方法和材料的实践或测试中。所有出版物、专利申请、专利和在此提及的其它参考文献透过引用在此并入本文整体。在冲突的情况下，以本说明书(包括术语的解释)为准。此外，材料、方法和实施例仅是说明性的而非意指加以限制。

所提供图式和相关实施例的以下说明性解释是用以便于理解在此频繁使用的某些术语，特别是在实施例中。解释是为便利性而被提供而非用以限制本发明。

【实施例】

实施例1.MAb B4的免疫和功能特性

单克隆抗体B4(mAb B4)为可辨识位于T细胞表面之复合HIV受体位点(CD4)的单克隆抗体。MAb B4可影响和妨碍CD4和HIV共受体的相互作用。MAb B4优先地中和原代HIV-1分离株。

以下资讯总结了鼠源mAb B4之发现与初步的特性研究，其包含引用自两篇专利(由Wang所发明的美国5,912,176号和6,090,388号专利)和Wang等人于1999年发表期刊论文的资料，其均透过引用以并入本文整体。

1.衍生自HPB-ALL免疫之鼠源单克隆抗体

以完整、未感染的CD4+人类HPB-ALL细胞、T细胞急性淋巴细胞性白血病细胞株免疫BALB/c小鼠以提供mAb B4。

所提供之新种类的抗-CD4抗体(以mAb B4表示)对位于细胞表面之CD4具有特异性，且对HIV-1的原代分离株具有广泛的中和活性。

2.MAb B4辨识位置的特征

相较于重组可溶性CD4(rsCD4)，发现mAb B4优先地辨识位于细胞表面上的膜结合CD4(membrane-bound CD4)。

于暴露于HIV前之mAb B4结合至膜结合CD4显示可阻断后续gp120和整个病毒附着至CD4。然而，于暴露于抗体前就已结合至gp120的膜结合CD4仍然可结合mAb B4。因此，mAbB4能影响gp120结合至膜结合CD4，但是gp120并不影响mAb B4结合至CD4。

MAb B4的辨识位置有别于其它已充分研究之抗-CD4单克隆抗体的辨识位置，包含可辨识CD4结构域1之单克隆抗体Leu3a和OKT4A(Chiba，Y.1992；Jameson，B.D.，et al.，1988)，以及可辨识CD4结构域2之单克隆抗体5A8(Burkly，et al.，1992)。

3.MAb B4的体外中和活性

透过一般的定义，鼠源mAb B4并非中和性抗体。反而，mAb B4是藉由覆盖宿主细胞受体，而非藉由附着至病毒，以抑制病毒进入。可藉由于此领域所使用之病毒中和试验而容易地观察到mAb B4对HIV感染的效果(例如MT-2微斑中和试验(MT-2MicroplaqueNeutralization Assay)(Sawyer et al.，1994))。鼠源mAb B4的中和活性是由我们的合作者Carl Hanson博士(加州健康服务部)所评估，也于John Mascola博士(亨利杰克逊基金会，WRAIR)、David Montefiori博士(杜克大学)和Malcolm Martin博士(NIAID)的实验室中独立地评估。以下HIV中和特性，于1995年至2010年间被广泛地描绘，其与mAb B4相关：

(1)PBMC生长的原代分离株(PBMC-grown primary isolates)较T细胞株适应的分离株HIV-1_IIIB和HIV-1_MN对藉由mAb B4的中和作用更加敏感。

(2)MAb B4可中和透过使用CCR5/CXCR4(双性)和CCR5共受体之原代分离株的感染。

(3)MAb B4对使用CXCR4共受体之T细胞株适应的HIV-1分离株具有低活性。

(4)MAb B4可中和代表HIV-1亚型A-G之不同合胞诱导型(Syncytial Inducing(SI))和非合胞诱导型(Non-Syncytial Inducing(NSI))的原代分离株，达到90％终点指标(endpoints)与高达3个对数的感染性。

(5)MAb B4可中和具有双性共受体HIV-1包膜的HIV-2、猿猴免疫不全病毒(SIV)和人猴嵌合免疫缺陷病毒(SHIV)。

(6)于扁桃体组织系统，mAb B4减少了两个对数之HIV-1原代分离株VL135(HIV-1_VL135)的感染性。在活化的人类补体存在下，在此状况下许多抗-病毒抗体展现抗体依赖性增强作用，少至12.5μg/mL的mAb B4可完全地中和＞100TID₅₀(50％扁桃体感染剂量)的单亲细胞性(monocytotropic)分离株JR-CSF。

(7)当感染后加入mAb B4达48小时，mAb B4于HIV-l_VL135展现中和活性；当加入mAbB4达72小时后，则具有显著的抗-病毒效果。

a.不论是否与细胞或病毒预培养，其均同样有效。

b.它的作用是藉由阻断感染的病灶传播至新的细胞，而非藉由进入后的机制。

c.在这些试验中，mAb B4并不有助于细胞毒性。

实施例2.HIV-1中和和抗药性试验

以下于1998年至2011年期间针对不同进化支之多个HIV分离株的病毒中和和抗药性试验是在Carl Hanson博士和Monogram生物科学公司的实验室中执行。此试验的详细说明如以下所述。

1.HIV-1中和试验

如每一试验所指明收集血液或抗体样品。使用MT-2微斑试验或有丝分裂促进剂(PHA)-刺激的PBMC试验，于一组含有多个进化支(multi-clade panel)的HIV-1分离株评估血清或抗体样品。

1.1.MT-2微斑试验

MT-2微斑试验限于HIV的合胞诱导型分离株。本试验于96孔盘上进行，于其藉由在微斑上合胞的荧光染色可计数到高达每孔洞25个微小空斑。在此试验中，受感染的MT-2细胞藉由透过熔化的琼脂糖离心形成单层，此熔化的琼脂糖于离心期间胶化。此试验被认为具有敏感性并具有遍布多个数量级数的动态范围。此试验也被视为是处理大量样品时唯一具有效率的方法。利用电脑化统计分析大量复制的孔洞，以提供使用其它方式所难以达成之品质控制与标准化的程度。

1.2.PBMC试验

PBMC试验是一种标准的抗原-减少试验，于此试验中，在受感染的细胞于96孔微量盘生长后，以抗原-捕获ELISA定量于PBMCs的p24抗原表达。此试验的优点在于其适用于所有的HIV病毒株与分离株。

1.3.病毒原液

用于体外与体内中和试验的HIV原液列于表3、表5和表6，以及图1A、1B、3、22和23。来自亚型A至G和H之原代HIV-1病毒为：(a)分离自参加病毒和立克次体疾病实验室(VRDL)加州健康服务部之旧金山男性健康研究的男性同性恋者；(b)由HIV分离和鉴定之世界卫生组织网络取得，(c)由美国军方HIV研究计划提供，以及(d)由国家过敏和传染病研究所AIDS研究和参考试剂计划所馈赠。DH-12(由患者分离，于黑猩猩外周血单核细胞(PBMC)继代)也是由国家过敏和传染病研究所AIDS研究和参考试剂计划所提供。

1.4.B4或dB4中和活性

B4或dB4中和活性定义为相对于不含抗体之对照组可提供指定百分比(50-95％)之病毒减少的抗体浓度。藉由于抗体稀释物之间的内插法推导出在50％和90％终点指标之抗体浓度。

2.PhenoSense HIV进入试验

用以测定抗药性之PhenoSense HIV进入试验是于Monogram生物科学公司执行(南旧金山，加州)。

利用从载体库产生的重组病毒于不同浓度之药物或抗体(例如B4或dB4)存在下感染细胞。依据50％(IC₅₀)或90％(IC₉₀)测定用以抑制试验载体之病毒复制所需的药物量。

2.1.使用于PhenoSense HIV试验之重组病毒的产生

PhenoSense HIV试验使用之重组病毒来自于患者的样本，此些患者是于HIV感染之纵贯性研究中所筛选出，并确定为HIV血清反应阳性者。对于发生HIV感染者，收集临床和血浆样品以供实验室评估(包括HIV病毒量和CD4细胞数量)。对于起初是血清反应阴性但于后续约一年变成血清反应阳性的个体，利用两个酶免疫分析法和western印迹法之确证加以确认HIV感染。

收集来自于血清转化期间具有亚型A、BF、C、D、E、EA、F、G或J之受试者的样品(基于先前的HIV亚型分析，其乃利用多个杂交分析而达成)，用以建构重组病毒(如表3所示)。由试验样品放大HIV env、pol区域，并克隆放大的DNAs进入试验载体。于GeneSeq HIV，定序载体库以确定HIV基因型。于PhenoSense HIV试验，于不同药物浓度存在下利用从载体库产生的重组病毒感染细胞。

实施例3.MAb B4对所有进化支之HIV分离株的中和活性(利用Monogram生物科学的PhenoSense试验)

已证实mAb B4可中和B进化支的所有HIV病毒。于本试验中共计73个具代表性的非B进化支HIV分离株，将来自进化支A(n＝8)、BF(n＝1)、C(n＝18)、D(n+18)、E(n＝4)、EA(n＝10)、F(n＝8)、G(n+4)、J(n＝2)，加上三个对照组病毒92HT594、JRCSF、JRFL，制成重组病毒，并于PhenoSense HIV试验中测试，以分析其对mAb B4的敏感性(请参见表3)。显示所有重组病毒对mAb B4具有高度敏感性，其具有无先例的低IC₅₀和IC₉₀浓度，具有平均IC₅₀＝0.018μg/mL和IC₉₀＝0.062μg/mL。值得注意的是，发现这些HIV病毒分离株中的多个衍生自具多重抗药性患者，此清楚地表明mAb B4或其人类对应物在已经对HIV药物产生抗药性之患者的治疗中具有高效率。

实施例4.单克隆抗体B4的竞争型HIV进入抑制：预防治疗后之HIV抗药性突变种的不可预期效果

竞争型抑制试验可评估抑制剂(例如，进入抑制剂抗体)与HIV包膜蛋白竞争位在CD4上相同受体结合位点从而抑制HIV进入细胞的能力和疗效。理论试验中，mAb B4和HIV包膜蛋白(gp120)竞争结合CD4。图1A显示此试验的预测结果，在此每一条线代表不同的病毒分离株。具体地，从此理论试验的预期结果证明，虽然不同的病毒分离株对mAb B4具有不同敏感性(IC₅₀)，但只要mAb B4存在足够浓度下可抑制所有病毒分离株的进入，幅度达100％。

透过比较，非竞争型抑制试验可评估抑制剂(例如，共受体拮抗剂或结合于CD4之不同部分的抗体)抑制或降低HIV包膜蛋白结合至CD4从而抑制HIV进入细胞的能力和疗效。在理论试验中，分析非竞争型抑制剂(例如，TMB-355)抑制HIV包膜蛋白(gp120)结合CD4的能力。图1B显示此试验的预测结果，在此每一条线代表不同的病毒分离株。具体地，从此理论试验的预期结果证明，不同的病毒分离株对TMB-355具有不同敏感性(IC₅₀)，且不论TMB-355呈现量为何，至少一些部份的病毒分离株可进入细胞。基于此理论试验，如同于最大抑制百分比的“高原”，可预期不论IC₅₀为何均可观察到HIV抗药性。

TMB-355(原TNX-355，也称为Ibalizumab)为人源化IgG4单克隆抗体，设计其结合恒河猴和人类CD4之细胞外结构域2以避免HIV结合后进入CD4+细胞(例如，Burkly，LC，etal.，1992；以及Kurizkes，DR，et al.，2004)。位于CD4之TMB-355抗体结合位点有别于HIV包膜蛋白gp120结合所需之位点，且有别于与主要组织相容性复合体蛋白质相互作用所需之位点。据此，TMB-355介导非竞争型HIV进入抑制。

已显示TMB-355对一些HIV-1病毒具有强烈的中和活性，但是当以一组广泛的HIV-1病毒株评估时，其抑制活性与中和活性并不一致。图2显示TMB-355的最大抑制百分比(MPI)介于100％至15％(左边的Y轴)，伴随由0.01μg/mL至10μg/mL之增加的IC₅₀(右边的Y轴)，对一组118种Env假型HIV病毒，以每一长条代表一种病毒分离株(Song，R.，et al.，2013)。于分析的所有进化支中，进化支A和E病毒较非进化支A和E病毒对TMB-355显著地具有敏感性。此外，发现来自接受TMB-355治疗以减少病毒量之患者的病毒抗药性突变种于gp120的V5区域具有突变(Toma，J.，et al.，2011；Pace，C.S.，et al.，2013)。以TMB-355(Ibalizumab)所证明之非竞争型抑制效应显示在抗体治疗期间有发展抗药性HIV突变种的高度可能性，因为具有低于100％抑制的分离株会发生病毒复制。

相反地，来自一组超过850种Env假型HIV病毒于10年期间收集的结果显示，mAb B4于HIV进入抑制提供了非预期之广泛性与效力(图3)。从这些收集的数据可见mAb B4具有接近100％最大抑制百分比(MPI)，具有两个IC₅₀浓度，一个是介于0.01至1μg/mL，且另一个是约10μg/mL。MAb B4之HIV进入抑制曲线具有竞争型抑制机制的典型特性，无论IC₅₀为何，其对每一HIV病毒具有为～100％之MPI。鉴于mAb B4之显著强烈的竞争型HIV进入抑制特性，故在mAb B4治疗期间不大可能会发展出病毒抗药性突变种。这种严密的竞争型抑制，如透过mAb B4所展现者，迄今从未以任何其它测试的HIV抑制剂观察到。

来自此实施例之MPI和IC₅₀，与显示衍生自多重抗药性患者之多个HIV分离株对mAbB4具有高度敏感性的数据(实施例3)相结合，显示mAb B4或其人类对应物于HAART治疗失败之抗药性HIV患者治疗上具有高效率。由mAb B4所介导之中和模式提供独特HIV药物，其可于接受mAb B4或其人类对应相似物(具有相似Fv区域)治疗的HIV患者中预防抗药性病毒突变种的产生。

实施例5.单克隆抗体B4的人源化

因为鼠源抗体，mAb B4于人类具有免疫原性。可透过已知的去免疫化技术(Jones，T.D.，et al.2009)之过程达到鼠源抗体的人源化。MAb B4的去免疫化于Lynn.，S.和Wang，C.Y.之美国7,501,494号专利中已详细描述(其均透过引用以并入本文整体)，如同以下内容所概述。

首先，完全地移除鼠源抗体B4的恒定区(C_H和Cκ)，并以人类IgG₁的恒定区(分别为SEQ ID NOs：12和14)取代，然而保留Fv部分，从而制造嵌合B4抗体。接下来，为供人类使用而将鼠源mAb B4之Fv片段去免疫化，此是藉由辨识与除去潜在具有免疫原性之鼠源T和B-细胞抗原表位而达成。在从mAb B4的可变区中辨别此种抗原表位之后移除T细胞抗原表位。为了呈现第二型主要组织相容性复合体结合域(MHC class II-binding motifs)而利用三维“肽链线化”方法以分析可变区的氨基酸序列。藉由表面残基的“镶饰”达成由可变区移除B细胞抗原表位而不妨碍抗体辨识。此去免疫化人源化形式的mAb B4称为mAb dB4。

Lynn.，S.和Wang，C.Y.之美国7,501,494号专利讨论到IgG₁于CH2区域中含有双触角复合N端结合碳水化合物，其对于效应器作用(effector functions)具有重要性，例如补体结合和抗原依赖细胞毒性作用(antigen-dependent-cellular-cytotoxicity，ADCC)，可造成目标抗原的消除。因为mAb B4作用于CD4受体复合体，其可透过负责结合补体之IgG₁的效应器作用造成CD4+细胞的破坏和CD4+细胞功能的免疫抑制。因此，移除位于IgG₁之Fc区域的N-糖化点可破坏IgG₁结合至人类FcR1的能力，以活化补体，或结合C1q，从而消除IgG介导的补体依赖型细胞毒性作用(CdC)。藉由以His(H)取代氨基酸残基Asn(N)(即N298H)达成移除位于IgG₁之Fc区域的N-糖化点。

在本说明书中所讨论的氨基酸编号/位置是基于包含在序列表中的序列，此序列表为本说明书的一部分。应该注意的是，以上所讨论之位在第298个氨基酸之糖化点对应于天然IgG₁分子中位于第297个氨基酸之糖化点，它是根据用于IgG₁的欧洲编号系统所编号的。因此，本申请案之第298个氨基酸对应于美国7,501,494号专利中位于第297个氨基酸之糖化点。

Fv结构域之去免疫化mAb dB4重链(图4)和轻链(图5)的CDR1、2和3区域分别包含SEQ ID NOs：1至6的氨基酸序列(表4)。MAb dB4重链和轻链的完整氨基酸序列分别地如图4和5所示，如SEQ ID NOs：7和8。

发现当突变位于抗体重链的某些氨基酸时可改进(延长)mAb dB4的半衰期。具体来说，当位于第253(Met)、255(Ser)和257(Thr)个重链Fc氨基酸分别以Tyr、Thr和Glu取代时可改进人源化抗体之半衰期。人源化mAb dB4抗体经改进之重链的全长序列如图6所示，如SEQ ID NO：9。据此，经改进之人源化抗体mAb dB4包含具有SEQ ID NO：8氨基酸序列之轻链，以及具有SEQ ID NO：9氨基酸序列之重链。

鼠源mAb B4和人源化mAb dB4之序列和结构的独特特性为存在位于第101个氨基酸位置(Asn101)的糖类结合残基Asn，于Fv的重链中。此糖类结合位点对其Fv区域位置是独特的，其意外地隐藏于Fv结构域内，且只可藉由整个抗体分子的变性而曝露出来供酶裂解。起初于Fv区域呈现此糖类使抗体特性复杂化。然而，对糖链或结合位点进行修饰会破坏抗体对CD4的结合亲和力。因此，此位于Fv区域之独特的N-糖化点对抗体结合至CD4是具关键性的。

图7说明mAb dB4之完整长度的重链氨基酸序列，其强调图4和6于上述所讨论的糖化、取代和突变位置。

实施例6.利用MT-2微斑、PBMC中和试验和PhenoSense进入试验证明mAb dB4和其亲本mab B4间的生物相等性

进行广泛的比较研究，以评估去免疫化/人源化，Fc-无糖基化的mAb dB4和亲本鼠源mAb B4的生物相等性，以确保人源化形式可在灵长类动物和人类供进一步毒性/安全性和疗效研究。来自这些比较研究的结果概述于下文。

(1)高灵敏性的HIV-1中和试验，分别以来自进化支A、B、C、D和E，以及来自进化支C和E之具代表性的HIV分离株，于MT-2微斑和有丝分裂促进剂(mitogen)刺激的PBMC试验中进行。利用去免疫化技术将鼠源mAb B4人源化形成mAb dB4抗体后并未造成HIV中和活性的丧失。比较结果如MT-2微斑(表5)和基于PBMC之试验(表6)所示。

(2)因为测得对来自所有进化支之所有HIV分离株的IC₅₀s和IC₉₀s彼此间落于两倍以内，因此证明鼠源mAb B4和mAb dB4间的生物相等性。

(3)在表达双重受体(CXCR4和CCR5或X4/R5)的细胞株U87和具有各种向性之经挑选HIV分离株(包含JRCSF(R5)、HXB2(X4)、92TH594(R5/X4)、原代分离株#5(R5)、原代分离株#6(R5)和原代分离株#7(R5))上进行，以评估藉由mAb B4、mAb dB4和其它两个已知针对HIV-env之单克隆中和性抗体(2F5和2G12HIV)的HIV进入抑制。在此试验中，HIV进入抑制是由Monogram生物科学利用假型病毒(假型病毒携带来自数百个HIV病毒株之任一者的包膜糖蛋白和荧光酶(1uciferase))而加以评估。定量于U87-CD4+/CCR5+/CXCR4+细胞产生之生物发光以测定抗体的中和作用，此细胞是利用生物工程于HIV tat控制下表达荧光酶。此试验的结果如表7所示，其证明：

a.当与两个最具效力之抗-HIV Env抗体2F5(第1列)和2G12(第2列)相比较时，鼠源mAb B4(MuB4；第4列)于HIV进入抑制上较二者更具效力。对不同HIV分离株之相对应的IC₅₀s分别为0.04vs 4和0.8；0.4vs 0.07和0.5；0.05vs 3和1.3；0.05vs 50和20；0.05vs 2和3；0.03vs≥100和2；以及

b.当以各种向性之相同具代表性的HIV分离株测试时，鼠源mAb B4(MuB4；第4列)和mAb dB4(第3列)于其IC₅₀s出人意料地相等。

因此充分证明鼠源mAb B4和去免疫化的mAb dB4(二者在重链和轻链具有相同CDRs)为生物等效性的，且两种抗体的功能特性在不同的体外和体内试验中可为代表彼此的。

实施例7.(A)对HPB-ALL细胞之dB4和mAb B4结合活性；(B)对PBMC CD4阳性细胞之dB4结合活性；(C)对重组CD4之dB4结合活性，以及(D)对HPB-ALL细胞之dB4和gp120结合活性的特性

1.背景

尽管抗原结合和功能特性的定性方面是已知的，如同藉由中和试验所证明，对mAbdB4及其亲本鼠源mAb B4而言如先前实施例所示，但先前尚未研究过于CD4+ T淋巴细胞之mAb B4和mAb dB4定量的细胞结合曲线。

测试鼠源mAb B4和其人源化，Fc-无糖基化的IgG₁单克隆抗体mAb dB4在正常人类血液CD4+ T淋巴细胞和在CD4+ T-白血病HPB-ALL细胞之细胞结合曲线。使用HPB-ALL细胞是因为如实施例1所讨论是透过以HPB-ALL细胞免疫接种小鼠而选出mAb B4。一般的细胞结合是利用流式细胞仪(FACS)分析方法评估，且结果是基于平均荧光强度(MFI)记述为EC₅₀或IC₅₀数值。除了评估抗体一般的细胞结合，也研究天然dB4 IgG₁分子对HPB-ALL细胞之绝对结合亲和力(Kd)和最大结合容量(Bmax)。

2.材料

2.1.培养液和试剂

培养HPB-ALL细胞之RPMI-1640培养液和胎牛血清是来自Gibco(货号分别为11875-093和10091-148)。牛血清白蛋白(BSA)是来自ApplicChem(货号A-0850)。细胞与测试抗体之培养是在NUNC的V型底96孔盘(货号249662)上进行。供样品制备的微量稀释管(1.2mL)是来自Bertec(货号1710-00)。以2％甲醛固定细胞；样品以含有0.05％BSA和0.05％叠氮化钠之PBS(pH 7.4)稀释；且清洗液为含有0.05％叠氮化钠之PBS(pH 7.4)。

分别利用山羊抗-鼠IgG-FITC(Sigma，货号F8264)和山羊F(ab’)₂抗-人IgG Fcγ-FITC(Jackson ImmunoResearch，货号109-096-098)追踪鼠源mAb B4和人源化mAb dB4之结合。dB4-Alexa 488缀合物(整篇文章以缩写的“dB4-Alexa”表示)为于联合生物医学公司(UBI)内部制造(UBI批号0102143)。B4-生物素缀合物来自UBI(批号051807)。绵羊抗-hIgG-HRP来自The Binding Site(货号AP004)；Extravidin-HRP来自Sigma Aldrich(货号E2886)；以及可溶性rCD4来自R&D System(货号514-CD-050)。肽p2704a HIV包膜来自UBI，重组gp120MN来自ImmunoDiagnostics(货号1021-2)。利用抗-CD4(D2)-FITC抗体(Ancell，货号148-020)选取血液CD4⁺ T细胞供结合之追踪使用。利用来自LinearFlow^TM Green FlowCytometry Intensity Calibration Kits(Molecular Probe)的荧光珠作为参考标准，以定量标帜细胞的相对荧光。使用的其它荧光侦测器为：FITC-ChromPure山羊IgG、F(ab′)₂片段(Jackson ImmunoResearch，货号005-090-006)；CD3 PE(ASR)(BD Biosciences，货号340662)；CD45 PerCP(ASR)(BD Biosciences，货号340665)。

2.2.HPB-ALL细胞和周边血液CD4⁺ T细胞

由DSMZ ACC提供HPB-ALL细胞株(人类胸腺衍生急性淋巴细胞性白血病细胞株)。PBMC CD4⁺ T细胞(由健康的供血者新鲜地采血至EDTA-真空采血管内)衍生自以含有氯化铵之低渗溶液(8.3g/L氯化铵、0.84g/L碳酸氢钠以及29.4mg/L EDTA于pH 7.4之混合液)分解红血球后的外周血白细胞(PBL)。

2.3.鼠源mAb B4和人源化dB4 mAb

透过以HPB-ALL细胞作为免疫原之杂交瘤操作提供鼠源单克隆B4 IgG₁(UBI批号120197)。藉由N298H使B4-衍生的人源化dB4 IgG₁成为Fc-无糖基化(实施例5)。

2.4.ELISA和FACS侦测

96孔盘来自Nalge NUNC International，平底(Cat.442404)的供光学测定，V型底的供细胞培养(Cat.249570)。光学密度是于VersaMax微量盘分析仪上读取(MolecularDevices)。以BD FACSCalibur scanner(DB Biosciences)侦测荧光染剂；并透过相关的Cell Quest软体获得结果的数据。将来自ELISA和FACS的结合数据导入到SigmaPlot 11软体进行定量分析。

3.方法

3.1.dB4对HPB-ALL细胞的结合

3.1.1.平衡时间试验

于V型底的微量盘上，添加每孔洞0.1mL内含2x 10⁵个细胞的溶液，离心，并丢弃液体。于长达180分钟之各种持续时间，将细胞在冰上以100μL高达100ng/mL之各种浓度的dB4溶液加以培养。于培养时间收集上清液以测定游离、未结合的抗体药物。利用添加之总药物浓度扣除游离的部份而计算出结合的部份。

利用ELISA定量于结合溶液中的游离dB4浓度。简而言之，此试验涉及涂覆于NUNCMaxisorp微量盘之绵羊抗-hIgL(0.5μg/mL)混合液的使用，并以绵羊抗-huIgG-HRP(1/1000稀释)作为检测蛋白质。基于0.14-18.5ng/mL范围内之校正标准测定于未知样品中的游离dB4浓度。

3.1.2.与dB4直接结合试验

于V型底的微量盘上，添加每孔洞0.1mL内含2x 10⁵个细胞的溶液，离心，并丢弃液体。将细胞在冰上以100μL高达2000ng/mL之各种浓度的dB4溶液培养1小时。培养之后，移除dB4，并加入与起始培养所使用相同浓度之dB4的新鲜溶液至细胞中，并在冰上再培养细胞1小时。重复此步骤一次。研究来自三次培养(继代)的细胞。在第三次培养后，洗涤细胞一次，以300g离心5分钟，以100μL之山羊F(ab)₂抗-huIgG Fc-FITC(250ng/mL)于冰上染色30分钟。洗涤细胞一次并于离心后丢弃液体。对每一孔洞加入200μL的结合溶液，并将其移至微量稀释管供流式细胞检测分析。基于每一样品5,000个细胞的进样，于FACS上测定结合强度(平均荧光强度，MFI)。

3.1.3.dB4的结合亲和力试验

在离心管内，加入浓度为3.1-2000ng/mL(0.5mL)之dB4抗体至数量为4x 10⁵个细胞的HPB-ALL细胞(0.5mL)中，并于和缓的摇动下于冰上培养1小时。测定于饱和结合时之绝对结合亲和力，在此以ELISA定量溶液中的游离dB4浓度([F])，且如以上平衡试验所述计算结合部分([B])。以基于等式[B]＝Bmax·{[F]/([F]+Kd)}的曲线拟合于SigmaPlot上分析所得之饱和的游离-vs-结合浓度曲线，在此个别的[B]和[F]代表结合和游离的浓度。

3.1.4.dB4和B4与B4-生物素的竞争

于涂覆sCD4(0.5μg/mL)和p2704a肽(2.0μg/mL)混合液之平底微量盘上，于B4-生物素(10μg/mL)存在下加入0.1mL之dB4或B4溶液(浓度为0.78-100μg/mL)，并于室温下培养1小时。以下对捕获混合物之竞争型结合，是以Extravidin-HRP侦测结合的B4-生物素并以ELISA分析仪测定。

3.1.5.dB4和B4与dB4-Alexa的竞争

于V型底微量盘上，添加每孔洞0.1mL内含2x 10⁵个细胞的溶液，离心，并丢弃液体。细胞于dB4-Alexa(250ng/mL)存在下与100μL之dB4或B4溶液(浓度高达2000ng/mL)在冰上培养1小时。洗涤细胞一次并于离心后丢弃液体。对每一孔洞加入200μL的结合溶液，并将其移至微量稀释管供流式细胞检测分析。基于每一样品5,000个细胞的进样，于FACS上测定结合强度(平均荧光强度，MFI)。

3.1.6.dB4C7和gp120MN与dB4C7-Alexa的竞争

于V型底微量盘上，添加每孔洞0.1mL内含2x 10⁵个细胞的溶液，离心，并丢弃液体。细胞于dB4-Alexa(250ng/mL)存在下与100μL之dB4C7或gp120MN溶液(浓度高达200nM，～30μg/mL)在冰上培养1小时。洗涤细胞一次并于离心后丢弃液体。对每一孔洞加入200μL的结合溶液，并将其移至微量稀释管供流式细胞检测分析。基于每一样品5,000个细胞的进样，于FACS上测定结合强度(平均荧光强度，MFI)。

3.2.dB4对血液CD4+T淋巴细胞的结合

3.2.1.dB4的温度依赖性结合试验

为了模拟生理环境，在此于静脉注射后dB4(UB-421)结合(覆盖或占据)位于CD4⁺T细胞上之CD4受体，将由实验室人员新鲜采取的EDTA-血液溶液与等量之dB4于稀释缓冲液中在37℃下进行培养(dB4浓度高达100μg/mL)。为了作比较，其它样品组同时于冰上进行培养。在培养1小时后，样品以20倍体积之红血球裂解缓冲液于室温下裂解10分钟以产生外周血白细胞(PBL)部分。

离心PBL部份，洗涤，并接着以等量之含有1.0％BSA和叠氮化钠的PBS缓冲液再制(例如，0.1mL血液和0.1mL稀释缓冲液)。以0.1mL之山羊F(ab)₂抗-hIgG Fc-FITC、抗-CD3-PE和抗-CD45perCP混合液于冰上染色PBL样品30分钟。洗涤之后，以2％甲醛固定样品，并基于10,000个细胞的进样对样品进行FACS分析。利用抗-CD3-PE选取T淋巴细胞群。

3.2.2.直接结合

于三个男性和女性受试者中分析dB4对血液CD4+ T细胞的直接结合，在此将新鲜抽取之EDTA-血液与dB4于37℃下培养1小时。MAb dB4结合至CD4+ T细胞，且发现达到浓度范围为0.2-200ng/mL之表观饱和度(apparent saturation)。利用抗-CD3-PE选取T淋巴细胞群。此实验步骤与上述之温度依赖性结合试验的步骤相同，在此利用山羊F(ab)₂抗-hIgGFcγ-FITC染细胞以追踪dB4之结合。

3.2.3.未被占据的结合位点

类似于上述之直接结合试验，在对三个男性和三个女性之每一个体于相同场合下研究dB4结合后所留下未被占据之结合位点的程度(在完全受体占据之前)。此实验步骤与上述之直接结合试验的步骤相同，除了其使用固定量之dB4-Alexa(浓度250ng/mL)以显现未被占据的、空闲结合位点的程度。

3.2.4.校正微珠

为了同时调查直接结合和未被占据的结合位点，利用两种Molecular Probes的LinearFlow^TMKits(货号L14821和L14823)之组合在六个不同场合中的每一个产生log(MFI)-vs-log(bead％)标准曲线。此试剂盒组合于流式细胞仪实验中提供高和低强度标准之宽广的校正范围。作为参考标准，利用这些荧光珠定量位于藉由山羊F(ab)₂抗-hIgGFcR-FITC或dB4-Alexa标帜之细胞上的相对荧光。

4.结果和讨论

4.1.dB4的结合曲线和其于CD4-阳性HPB-ALL细胞之绝对结合亲和力(Kd)的测定

4.1.1.对HPB-ALL细胞之结合活性的平衡

在完全描述配体-受体结合反应特征之前，定义对不同浓度配体达到平衡的时间长度，即高原状态，在此结合速率等于解离速率。通常已知的状况为较低的浓度需要越长时间达到平衡。

在于冰上培养CD4-阳性HPB-ALL细胞之dB4-CD4相互作用的例子中，对2.0ng/mL浓度要花约60分钟，且对50ng/mL浓度要花约15分钟，以达到％结合数值中的高原。对dB4浓度为100ng/mL(0.1μg/mL)和更高的水平可观察到几乎瞬间达到高原状态。

这些结果指出对宽的浓度范围(例如，浓度≥2.0ng/mL)而言，dB4结合反应可于1小时达成。结合试验可在冷的及/或在0.05％叠氮化合物存在下进行，以避免配体-受体复合体之可能的内噬作用。于室温或于37℃下培养可较快达到反应的高原状态。在上述进展的状况下，HPB-ALL细胞，以三个不同细胞继代，于冰上与dB4培养1小时。收集上清液以供游离药物浓度的ELISA测定，且藉由从总数扣除提供结合的部分。利用如图8所示之结合曲线计算绝对结合亲和力和结合容量。

4.1.2.对HPB-ALL细胞的直接结合

在三个不同场合(细胞继代)，2x 10⁵个HPB-ALL细胞于冰上与dB4(高达～2000ng/mL)培养1小时，抗体展现4-参数罗吉函数(logit function)的饱和结合曲线，在此结合的程度是利用山羊F(ab)₂抗-huIgG Fc-FITC测得并以平均荧光强度(MFI)表示。于浓度为200ng/mL(0.2μg/mL)和以上者之结合接近饱和。平均结合EC_s0测得为42.2ng/mL(表8)，具有小的继代代数间的差异(between-passage variation)(n＝3)。也标准化绝对MFI数值为％MFI以供继代代数间的比较。因此使标准差减到最小，且EC₅₀数值基本上保持不变；对两个平均曲线之总平均结合EC₅₀数值测得为42.9ng/mL(表8)。

4.1.3.于HPB-ALL细胞之结合亲和力(Kd)和结合容量(Bmax)

收集培养之后的上清液(冰上培养1小时)供利用ELISA测定游离(未结合)dB4浓度[F]，且因此透过由加入(总)浓度扣除测得结合浓度[B]。利用如表9所示之游离药物-vs-结合药物数据图表评估对dB4的绝对结合亲和力。平均解离常数(Kd)测得为5.6x 10^-11M(范围：3.1至8.1x 10^-11M)，且最大结合容量(Bmax)测得为每细胞1.2x 10⁶Ab(范围：0.93至1.4x 10⁶)。这些结果指出dB4以特别高的亲合力结合至位于HPB-ALL细胞上的CD4受体，且HPB-ALL细胞具有高密度，最高每个细胞对dB4具有超过一百万个结合位点(表9)。位于HPB-ALL细胞上之CD4受体密度较位于血液CD4+ T淋巴细胞者高至少20倍，其为每细胞约3.2-6.1x 10⁴个结合位点。

4.2.dB4和B4于结合至HPB-ALL细胞的比较

面临的难题在于利用使鼠源B4抗体成为dB4之去免疫化方法以人源化是否改变了结合亲和力，故于使用竞争设计的两个技术报告上彻底研究此难题。

首先，于以可溶性CD4(sCD4)和p2704a肽之捕获混合物涂覆的ELISA微量盘上调查mAb B4和mAb dB4的结合亲和力。p2704a肽模拟CD4-CCR5受体复合体，因为其包含位在CCR5上的抗原表位序列，而HIV-1系住CCR5以进入CD4细胞。当以ELISA分析时可见，于各种浓度之mAb B4或mAb dB4存在下，B4-生物素对涂覆之sCD4/p2704a混合物的结合受到抑制。当mAb B4或mAb dB4抗体共存且与B4-生物素竞争对捕获蛋白质混合物之结合时，B4-生物素之结合受到抑制，B4和dB4之IC₅₀数值分别为5539ng/mL和8191ng/mL(图9)。B4对dB4之IC₅₀比率为0.68，显示人源化dB4具有相当于鼠源B4抗体的结合亲和力。

再者，也利用CD4-阳性HPB-ALL细胞研究相对结合亲和力，在此B4或dB4抗体共存且与dB4-Alexa竞争对细胞CD4受体之结合。利用FACS分析，dB4-Alexa结合受到抑制，B4和dB4之IC₅₀数值分别为135和197ng/mL(图10)。B4对dB4之IC₅₀比率为0.69，如利用ELISA范例所证明为实质上相同，再次显示人源化dB4利用相当于鼠源B4抗体的亲和力结合CD4受体。

比较性的竞争型结合抑制试验，利用亲本抗体B4和其人源化抗体dB4C7(UB-421)，提供对CD4阳性T细胞(HPB-ALL)的抗体结合曲线，其如同以平均荧光强度(MFI)对一系列抗体浓度(由100至104ng/mL)所测得。此试验进一步验证表5和表6所呈现的数据，此两个抗体的个别中和活性于MT2和PBMC试验系统中具有相当的中和抗体活性。

当与其亲本鼠源抗体B4比较时，这些比较性试验所提供之结果指出利用去免疫化技术以人源化并未显著地减少dB4C7(UB-421)对CD4受体的结合亲和力。

4.3.MAb dB4对CD4的结合特征

评估mAb dB4对CD4的结合特征。

4.3.1.MAb dB4对可溶性CD4和对细胞结合之CD4的结合

如以上讨论，如利用ELISA所评估，dB4抑制B4-生物素对sCD4/p2704a之结合，其IC₅₀为8191ng/mL(图9)，且如利用FACS测试，dB4抑制dB4-Alexa对HPB-ALL细胞之结合，其IC₅₀为197ng/mL(图10)。这些数据有趣地证明，相较于可溶性CD4(sCD4)，dB4对CD4-阳性T细胞具有更高的结合亲和力。具体来说，这两项试验之IC₅₀数值的比较显示dB4对CD4阳性T细胞的结合亲和力较可溶性CD4高超过40倍。

4.3.2.dB4和gp120MN于HPB-ALL细胞结合之比较

执行竞争试验以比较dB4和HIV gp120MN对结合于CD4-阳性T细胞之CD4的结合亲和力。具体来说，比较dB4和gp120MN抑制dB4-Alexa结合至位于HPB-ALL细胞上之CD4的能力(图11)。在第一个试验中，dB4抑制dB4-Alexa结合至位于HPB-ALL细胞上之CD4，其IC₅₀为1.8nM。在比较试验中，gp120MN抑制dB4-Alexa结合至位于HPB-ALL细胞上之CD4，其IC₅₀为97.2nM。依照此结果，发现dB4较gp120MN对位于HPB-ALL T细胞上之CD4具有实质上更高的结合亲和力。具体来说，这两项试验之IC₅₀数值的比较显示dB4对CD4的结合亲和力较gp120MN高至少50倍。

4.3.3.dB4和gp120MN对CD4之结合亲和力的比较

如以上讨论，mAb dB4结合至CD4具有约5.6x 10^-11M的结合亲和力(表9)。他人先前已发现，透过结晶学研究，HIV-1gpl20结合于CD4分子结构域1附近，具有约5x 10^-9M的高结合亲和力(Kd)(Myszka，D.G.，et al.，“Energetics of the HIV gp 120-CD4bindingreaction”Proc Natl Acad Sci U S A.Aug 1，2000；97(16)：9026-9031)。因此，比较dB4和gp120之Kd数值显示，dB4对CD4之结合亲和力较gp120的结合亲和力高约100倍。此结果与上述发现(基于IC₅₀数值的比较，dB4结合HPB-ALL细胞较gp120MN强至少50倍)一致。

体外结果整体显示，上述讨论证明藉由避免或关闭HIV病毒进入，使dB4足以阻断或减少HIV-1感染。

4.4.dB4(UB-421)对血液CD4+ T细胞的温度依赖性结合

研究于正常体温(37℃)下dB4对人类血液中之CD4+ T细胞的结合，以测定是否可有效地投予dB4作为治疗药物给人类受试者。为了模拟人体的生理环境，dB4C7(UB-421)与新鲜抽取的血液于37℃下培养1小时，且利用红血球裂解步骤提供外周血白细胞(PBL)样品。同时执行于冰上(4℃)的培养。之后以山羊F(ab)₂抗-huIgG-FITC染色PBL部分，以显现dB4对位于CD4-选取T细胞上之CD4受体的直接结合。

与于4℃下培养比较(数据未示)，指出以dB4于37℃下细胞培养1小时并不会造成配体-受体的内噬作用，如同观察到于鼠抗-CD4(D2)-FITC之MFI无变化。鼠抗-CD4(D2)-FITC(供CD4+ T细胞选取，浓度为50-1000ng/mL)和dB4(目标为CD4受体之D1结构域，浓度高达200ng/mL)并不会竞争结合。

如同来自一女性个体之血液样品所示(图12)，于两种不同温度(37℃或4℃)下将外周血单核细胞(PBMC)与dB4培养1小时。染色选取的CD4+ T细胞供于FACS上观察dB4结合。图12显示dB4于37℃下较于4℃下以5倍高之亲合力结合至CD4受体，此乃基于分别为4.8ng/mL和23.0ng/mL的IC₅₀数值。如同预期，dB4于两种温度状况下均可达到相同之最大结合MFI。MFI数值反映受体占据的程度，特别是当标准化这些数值并以％MFI表示时。

4.4.1.dB4对血液CD4+ T细胞的直接结合

研究于正常体温(37℃)下dB4对人类血液中之CD4+ T细胞的结合曲线。利用从六个成人(三个男性和三个女性)新鲜抽取的血液于六个不同场合下评估dB4对血液CD4+细胞的直接结合活性(表10)。在1小时培养后，分离外周血白细胞，以山羊F(ab)₂抗-huIgG Fc-FITC染色，并以FACS分析dB4-结合之CD4-选取的T细胞。以参考珠校正样品以供荧光读取。发现结合(EC₅₀)数值介于2.6ng/mL至5.7ng/mL，其平均EC₅₀为4.1ng/mL。同样地，最大％MFI数值介于68％至93％，其平均值为77.8％(表10)。这些结果分别地反映于结合亲和力和受体密度上具微小意义的受试者间差异。

4.4.2.在以mAb dB4占据受体后之未被占据的CD4结合位点

连同于4℃下dB4对血液CD4+细胞的直接结合(如同以山羊抗-hIgG侦测)，利用dB4-Alexa评估位于CD4+细胞上之未被占据，空闲的CD4结合位点。

在没有dB4的状况下，单独dB4-Alexa缀合物于浓度为约250ng/mL时可接近其最大结合的～100％(图13)。浓度高于500ng/mL时，dB4-Alexa缀合物可逐出约10％或更多的结合的dB4(数据未示)。具体来说，当以250ng/mL之接近饱和程度的dB4占据受体时，dB4-Alexa(于250ng/mL)对CD4受体之结合被完全地阻断。

与dB4-Alexa结合上升的同时可观察到受体占据随着dB4存在之下降而下降。受体占据程度与未被占据之结合位点的程度以对称方式同步化，且二曲线于浓度约4.0ng/mL处交错(图13)，此与其结合EC₅₀数值一致(表10)。

因此整体结果指出于体外使用250ng/mL的dB4-Alexa和MFI以及％MFI可作为适当之范例，用以研究对人类受试者投予dB4C7(UB-421)后之体内的受体占据。

5.结论

(1)MAb dB4与位于HPB-ALL细胞上之CD4受体相互作用，其具有独特地高活性，在浓度高于50ng/mL时于冰上达到立即的平衡。绝对结合亲和力(Kd)测定为5.6x 10^-11M，且最高时1.2x 10⁶个dB4分子(Bmax)可结合至单一个HPB-ALL细胞，其较于正常血液CD4+ T细胞者具有至少高于20倍的受体密度。

(2)人源化鼠源B4成为dB4mAb并未显著地改变对CD4受体之dB4结合亲和力。藉由结合抑制的设计，利用基于分子的ELISA(涂覆sCD4和含有CCR5抗原表位之肽p2704a)和与HPB-ALL细胞之基于细胞的FACS，两种抗体同等地阻断示迹剂(示迹剂为B4-生物素或dB4-Alexa)的结合，于此二实验中观察到B4-vs-dB4之IC₅₀比率约为0.7。

(3)dB4抗体以高于HIV-1包膜蛋白gp120MN至少50倍之亲和力结合CD4受体。具体来说，利用HPB-ALL细胞之结合抑制试验证明dB4和gp120MN分别以1.8和97.2nM之IC₅₀数值抑制示迹剂dB4-Alexa之结合。此结果也与dB4的高结合亲和力(Kd)(其于先前报导较重组gp120高约100倍)一致。

(4)MAb dB4以与对HPB-ALL细胞相似之结合亲和力结合血液CD4+ T细胞。在低温环境(4℃)下，dB4之EC₅₀为约23.0ng/mL。且在正常体温(37℃)下，dB4以约5倍高之亲和力结合血液CD4+ T细胞，结合EC_s0为4.8ng/mL。

(5)由来自六个人类受试者之血液样品的试验证明dB4浓度和CD4受体占据间具有直接(成反比的)相关性。如图13所示之相反的曲线，交叉于约4.0ng/mL，其与对CD4之dB4的平均EC₅₀结合数值一致。这些整体结果指出于体外使用dB4-Alexa(浓度250ng/mL)和以荧光珠校正之％MFI之测定可作为适当之范例，用以研究对人类受试者投予dB4C7(UB-421)后之体内的受体占据。

实施例8.抗体B4有效地抑制HIV之无细胞和细胞间传播

HIV颗粒典型地藉由无细胞传播散布全身，在此病毒扩散于血流和局部环境中以感染细胞。病毒也藉由需要亲密细胞间接触的机制以具有直接地由受感染细胞转移至未受感染细胞的能力。此种传播发生于当受感染的细胞与未受感染的细胞形成稳定的接触点时，并直接地将HIV颗粒传播给未受感染的细胞。相较于无细胞传播，细胞间传播具有较高效率，速度较快，且不需要扩散至血流。

Sigal，A.，等人于2011年报导，于抗病毒药物tenofovir存在下，起源于无细胞病毒的感染激烈地下降，于共培养试验中涉及细胞间传播之感染却显著地对药物较不具敏感性(图14)。敏感性的降低在药物的存在下足以阻止多轮感染的终止。作者使用随机感染模型在临床药物浓度的存在下研究来自细胞间传播的复制，并发现复制是间歇性的，无突变的实质积累。如果细胞间传播在体内具有相同的特性，它可能具有对免疫系统的不良后果，具有危险因子以导致个体的治疗失败，并可能有助于病毒的持久性，因此，其为治疗HIV感染的障碍。

因此，为了评估其于治疗上的潜在影响，重要的是评估用以抑制HIV细胞间传播之mAb B4和mAb dB4相关抗体的能力及效力。

1.用以测定HIV细胞间传播之抗体介导抑制的试验

1.1.材料和方法

1.1.1.细胞和病毒

选择Jurkat-inGLuc克隆(来自美国国立卫生研究所AIDS研究和参考试剂计划)，其具有利用基因工程置入于HIV-1基因体中的报导基因(luciferase)，选择其作为供体细胞(原因在于在利用目标原代CD4+ T细胞之共培养试验中，表面CD4之低度表达可使供体-vs-供体感染减到最少)。报导基因luciferase可以在受感染的细胞中表达并作为病毒感染之标志。可测定于受感染细胞中的这些病毒表达报导者以定量HIV-1感染。以原代CD4⁺ T细胞作为目标细胞。于此试验中使用进化支D的病毒UG266和UG046。

1.1.2.病毒细胞间传播试验

在本试验，在与指明的HIV-1病毒株混合之前，将供体与连续稀释之抗体B4预培养，并于几天后使用(当～10-75％的细胞为Gag⁺时)。之后以于200μl中为1.5×10⁶细胞/ml之最终浓度在96孔盘上以1∶2比率混合供体和CD4阳性PBMC目标细胞。于48小时后，针对细胞内Gag进行细胞染色并以流式细胞仪分析。利用BioLux Gaussia Luciferase Assay套组(New England Biolabs)和Berthold Technologies冷光测定仪侦测累积于培养上清液中的GLuc。

1.1.3.IC₅₀和IC₉₀的校正

透过拟合数据至S形的剂量-反应曲线(多变的斜率)绘制剂量-反应抑制曲线。抑制的百分比定义为(未处理之目标细胞的信号百分比-抗体处理之细胞的信号百分比)/(未处理之目标细胞的信号百分比)×100。依此计算IC₅₀和IC₉₀。

2.结果和讨论

表11显示，当透过严格的90％进入抑制标准测定时，抗体B4可等效地抑制HIV(进化支C的病毒株UG266和UG046)之细胞间和无细胞传播。具体来说，分别地发现对UG266和UG046病毒株于细胞间传播试验中的融合抑制效价为1∶140和1∶245，其相当于在无细胞传播中和试验中为1∶136和1∶234之中和效价。当以50％进入抑制标准测定时，相较于相对应之无细胞传播，在对细胞间传播观察到对此两种病毒株较高的融合抑制效价。

这些结果证明，当与迄今所测定之所有其它针对HIV Env蛋白质的中和单克隆抗体或其它ART-药物相比较时，抗体B4于其在抑制HIV之细胞间和无细胞传播的能力方面均具有独特的特性。这些结果显示，只有mAb B4和mAb dB4相关抗体具有资格可在个体中预防HIV病毒的无细胞和细胞间传播。

实施例9.抗体UB-421(dB4C7或dB4)介导在HIV感染个体中用于增强病毒复制之静默PBMCs的再活化

1.背景

HIV-1感染静默的外周血单核细胞(PBMCs)却保持不活化直到后续的细胞活化。利用体外模型(此体外模型是利用细胞培养条件和允许静默T细胞非增值性感染之方法，模拟藏匿于静默PBMCs中的静默HIV-1)，以研究热灭活的HIV-1(iHIV-1)或gp120-抗-gp120免疫复合物对这些静默PBMCs的刺激效应(Briant，L.，et al.，1996)。

此证明偕同热灭活HIV-1(iHIV-1)或gpl20-抗-gpl20免疫复合物之包膜糖蛋白的CD4接合(CD4engagement)足以透过交联以刺激控制NF-κB(即核转位)和AP-1活化的信号传递路径，其依次涉及CD4的细胞外结构域1(D1)和细胞质内结构域与几种激酶(Lck、Raf-1、MEK和ERK)，以诱导细胞周期进程、促进活化标志CD25的细胞表面表达，以及刺激原病毒整合和使细胞产生病毒。

由Than等人(Than，et al.，1997)之独立的科学发现进一步证实，利用抗-CD4单克隆抗体于gp120结合位点之CD4分子的交联可诱导来自HIV感染患者之潜伏受感染的PBMCs以促进病毒复制。此试验中使用的抗-CD4mAb为Leu3a，其可结合CD4之D1的CDR2-环。具体来说，Leu3是针对线性抗原表位，而此线性抗原表位代表具有CD4结构域1内之第47-64个氨基酸的肽(Chiba，Y.1992)。

此外，发现藉由针对CD4结构域1(D1)之CDR2-环的单克隆抗体可特异性地诱导于静默PBMCs之病毒的再活化，且此并非藉由针对其它抗原表位(例如位于D1之CDR3或接近D1/D2接合点区域(Briant，L.，et a1.，1999))的抗体(参见图15，比较第4长条与第5和6长条)。可利用可溶性CD4(sCD4)事先吸附CDR2-环配体以预防此种病毒再活化(参见图15，比较第4长条和第8长条)。

因此，重要的是要评估抗体dB4C7(UB-421)(其对CD4结构域1附近区域具有高结合亲合力)是否可介导在HIV感染个体中用于增强病毒复制之静默PBMCs的再活化。

2.位于CD4之D1附近之B4/dB4构型结合位点的结构精算

2.1.藉由mAb B4对黑猩猩CD4阳性PBMCs之Leu3a结合的竞争型顺序结合抑制

于此试验中使用分离自两名受试者(X282和X301)的黑猩猩PBMC细胞、mAb B4(利用FITC标帜)和Leu3a(以PE标帜)。以个别的抗体顺序地染色PBMCs并进行细胞荧光显影(cytofluorography)的分析。由此实验所提供之数据如表12所描述，并于下文中讨论。

于单一标帜的对照组样品，只利用以Leu3a染色的细胞测试呈现Leu3a-PE结合阳性者；只利用以mAb B4染色的细胞测试呈现B4-FITC结合阳性者。具体来说，于未受感染之黑猩猩样品(X282和X301)的CD4+细胞(如利用Leu3a所侦测)分别为25.5％和44.0％，其与那些以mAb B4侦测者(26.1％和45.5％)相似。

事先结合Leu3a之后暴露于mAb B4导致双重染色的(Leu3a+/B4+)PBMC细胞数量与单独只利用Leu3a或B4染色之单一标帜的对照组细胞相似(即对X282和X301分别为24.5％和46.7％)。

相反地，事先结合mAb B4之后暴露于Leu3a导致在单一或双重染色过程中只有无Leu3a阳性染色之mAb B4染色的PBMCs。

整体来说，这些结果证明藉由针对Leu3a-PE之抗体B4-FITC的单向抑制。也就是说，藉由事先Leu3a结合未能阻断B4结合；然而，事先B4结合可阻断Leu3a结合。结论为mAbB4辨识涵盖CD4结构域1之CDR2区域的构型抗原表位(抗体Leu3a可辨识此区域)，且mAb B4以相较于抗体Leu3a之较高的亲和力结合CD4的此区域。而这些数据支持此结论。

2.2.利用针对HIV RC肽(第39-66个氨基酸)之免疫血清对B4结合至rsCD4进行竞争型抑制(ELISA方法)

透过利用针对CD4结构域1CDR2区域之免疫血清的竞争型抑制试验，评估mAb B4对完整重组可溶性CD4(rsCD4)的结合亲合力。

2.2.1.抗-HIV RC多克隆抗体

利用包含CD4第39-66个氨基酸的环状肽免疫天竺鼠以制备针对CD4结构域1之CDR2区域的多克隆抗体。此环状肽于本试验中称为HIV受体复合体肽(HIV RC肽)，且如同先前于Wang等人在2002年所描述之肽p2240c。

具体来说，第0周是配制于完全弗氏佐剂者，且第3和6周是配制于不完全弗氏佐剂者，接着在此之后以配制于不完全弗氏佐剂者每月加强，以每剂量0.5ml中内含100μg者肌肉注射免疫接种4-6周龄的Duncan Hartley天竺鼠后，于特定时间点收集针对HIV RC肽之天竺鼠血清。

提供的多克隆抗体称为“抗-HIV RC多克隆抗体”。

2.2.2.藉由抗-HIV RC多克隆抗体对B4结合rsCD4进行竞争型抑制

利用每孔洞以体积0.1mL浓度0.08μg/mL之完整rsCD4涂覆的96孔微量盘进行竞争型抑制实验。在利用生物素化B4-抗体结合前，将天竺鼠血清(在利用针对HIV RC肽(CD4的第39-66个氨基酸)之免疫原免疫接种后第0、3、6、9、12、14、16和19周收集天竺鼠血清)以1∶30的比例稀释与孔洞培养，之后利用与抗生物素蛋白(avidin)-HRP之结合作为示迹剂。也对从整个试验同期所收集来自未免疫接种之天竺鼠的阴性对照血清(RC同型)进行测试。

图16显示藉由于初次免疫后第6周所提供之抗-HIV RC多克隆抗体可显著地抑制生物素化-B4结合至rsCD4，藉由于初次免疫后第9周所提供之抗-HIV RC多克隆抗体可达到近乎完全的抑制。

此竞争型结合抑制试验进一步证明mAb B4的结合位点是位于CD4结构域1的CDR2环附近，虽然藉由mAb B4直接结合至此肽并非显著地是因为mAb B4对膜结合CD4之构型结构的偏好性结合。

2.3.于mAb dB4交联时在HIV感染个体中用于增强病毒制造之静默CD4阳性T细胞的再活化

藉由利用mAb dB4处理细胞与观测TNF-α产量、病毒量和细胞增生，以评估mAb dB4活化静默CD4+细胞的能力。

在此试验中，藉由将培养盘与200μL山羊抗-人IgG(Jackson ImmunoResearch)在37℃下培养1小时，以将人类IgG涂覆于8孔培养盘。将涂覆的培养盘保存于4℃冰箱中直到本试验进一步使用。

依照标准作法将来自HIV患者之PBMC解冻1.5小时。如下所述，利用mAb dB4(实验组)、PMA+PHA(阳性对照组)或只有培养液(阴性对照组)处理PBMC，以评估静默CD4+细胞的活化。

2.3.1.MAb dB4处理

以mAb dB4(浓度为3μg/10⁶细胞/mL)于4℃下处理细胞1小时以引发细胞上CD4的交联。细胞以mAb dB4处理，之后洗涤，并以RPMI培养液和10％胎牛血清于涂覆的48孔培养盘上培养7天。以未涂覆之孔洞作为阴性对照组。于第0天、第2天和第7天冷冻培养上清液供之后的评估。于4℃处理30分钟后由细胞移除上清液，以提供作为mAb dB4样品之时间点第0天。

2.3.2.PMA+PHA处理

以0.1μM植物凝集素(phytohaemagglutinin，PHA)加上15μg/mL豆蔻酸-佛波醇-乙酸酯(phorbol myristate acetate，PMA)(Sigma)(PMA+PHA)于涂覆的48孔培养盘上和RPMI培养液与10％胎牛血清处理细胞7天，作为再活化之静默CD4+细胞的阳性对照组。利用未涂覆之孔洞作为阴性对照组。于第0天、第2天和第7天冷冻培养上清液供之后的评估。于4℃处理30分钟后由细胞移除上清液，以提供作为PMA+PHA样品之时间点第0天。

2.3.3.只有培养液

如同阴性对照组，于涂覆的48孔培养盘上以RPMI培养液和10％胎牛血清培养细胞7天(只有培养液)。利用未涂覆之孔洞作为额外的阴性对照组。于第0天、第2天和第7天冷冻培养上清液供之后的评估。于4℃下在培养液中培养30分钟后由细胞移除上清液，以提供作为只有培养液样品之时间点第0天。

2.3.4.CD4+再活化的分析

藉由评估TNF-α产量、病毒量和细胞增生以测定CD4+细胞的再活化。于表13概述来自本试验之结果。

使用标准方法分析来自所有样品之溶液，项目包含：(1)利用定量的ELISA分析TNF-α浓度；(2)利用RT PCR分析HIV病毒量；(3)细胞数量；以及(4)利用锥虫蓝(trypanblue)分析存活率。

具体来说，数据显示，相较于只有培养液的阴性对照组(低于检测极限)和以PMA+PHA刺激的细胞(较mAb dB4覆盖之细胞高约3至5倍)，mAb dB4交联所覆盖之来自HIV患者的PBMC细胞可引起TNF-α的中度生成。

同样地，mAb dB4样品以与只有培养液之阴性对照组相似的速率增生；然而，PMA+PHA刺激的细胞具有相较于以mAb dB4交联之细胞更大程度的增生(在第7天时，于PMA+PHA培养组别之细胞数量为mAb dB4培养组的5倍高)。

然而，相较于培养液对照组和PMA+PHA刺激的细胞，于以mAb dB4交联之细胞的HIV病毒量显著地增加。具体来说，当于第2和7天与只有培养液之阴性对照组相比较时，以mAbdB4交联之细胞于病毒量分别地具有151％和220％的增加；然而，PMA+PHA培养具有次佳的病毒量产生(于第2和7天分别为55％和78％)，尽管其细胞增生有5倍量的增加。

3.结论

(1)发现鼠源mAb B4可辨识位于CD4上的构型位置，且此构型位置接近抗体Leu3a所辨识的位置(位于CDR2区域第47-64个氨基酸)。基于在实施例7所描述之比较性试验，预期mAb dB4具有如同在此所述之对于mAb B4而言相同的辨识特性。

(2)利用多克隆抗体(此多克隆抗体是针对含有CD4结构域1之CDR2区域第39-66个氨基酸的环状肽(HIV RC肽))可抑制鼠源mAb B4对完整rsCD4之结合。这些结果显示mAb B4辨识CD4第39-66个氨基酸，其对应至CD4之D1的CDR2环。基于在实施例7所描述之比较性试验，预期mAb dB4具有如同在此所述之对于mAb B4而言相同的辨识特性。

(3)发现CD4与mAb dB4交联于HIV感染的PBMC CD4+ T细胞可活化病毒制造。具体来说，mAb dB4诱导TNF-α产生，并增强HIV制造，而未诱导细胞增生(如表13所示)。

(4)基于此实施例所提供之结果，mAb dB4(包含UB-421)能介导在HIV感染个体中用于增强病毒制造之静默PBMCs的再活化。

实施例10.MAb dB4C7和抗-HIV RC多克隆抗体抑制抗原所引发的T细胞增生和CD4阳性T细胞的细胞激素(IL2和IFN-γ)制造，因此破坏细胞焦亡的HIV致病循环

1.背景

最近的报告显示，当HIV病毒感染允许(permissive)、活化的CD4+ T细胞时，细胞死亡透过caspase-3依赖性的细胞凋亡默默地发生(Doitsh，G，et al.，2014)。相反地，当R5或X4-向性HIV失败地感染来自淋巴组织之非允许(non-permissive)、静默的CD4+ T细胞时，这些细胞透过caspase-1依赖性的细胞焦亡而死亡，其为程序性细胞死亡之强烈的炎症形式。被视为宿主DNA感测器的干扰素诱导因子16(IFI16)可识别不完整的HIV反转录产物，进而引发caspase-1的活化(Monroe，K.M.，et al.，2013)。在大多数的人类淋巴组织(包含扁桃体、淋巴结和脾脏)中，活化和允许的细胞次群体代表了CD4T细胞总数中的5％或更少数量，而非允许静默细胞则代表了遭遇HIV之目标中的95％或更多数量。因此，Caspase-1介导的细胞焦亡似乎主要地负责在这些淋巴组织感染HIV后驱使CD4T细胞死亡，而非caspase-3介导的细胞凋亡。分析来自以R5-向性HIV感染之受试者的新鲜淋巴结进一步支持这些发现，其中在富含静默CD4T细胞的皮质区可侦测到caspase-1和IL-1β，而发现在解剖学上不同的生发中心(在此发现生产性感染细胞)可侦测到caspase-3活性。

细胞焦亡极可能透过前发炎性细胞激素的释放和内生性危险信号，藉由移除细胞内复制的小生境(niches)和增强宿主的防御反应，促进各种细菌性感染的快速清除。然而，在致病的慢性炎症，例如HIV感染，细胞焦亡不是保护性反应且并不会导致原发性感染的清除。事实上，细胞焦亡似乎制造了恶性的致病循环，在此濒死CD4T细胞释放炎症信号以吸引更多细胞进入受感染的淋巴组织，进而死亡并产生更多的炎症。这些事件建立了炎症的慢性状态，其刺激病程和组织损伤。慢性炎症也可能促进潜伏HIV病毒库的维持，而潜伏HIV病毒库可刺激记忆CD4T细胞的恒定性增生。

CD4T细胞的耗竭和慢性炎症的发展是推动疾病进展之HIV致病机制中的特征过程，且细胞焦亡提供了这两种疾病-促进过程之间意外的连结。

以上资料显示，透过抑制由CD4+细胞之抗原刺激所引发的CD4+细胞增生及/或发炎性细胞激素制造的机制可能可以减轻或减少发生于HIV感染期间在淋巴组织的细胞焦亡。

2.实验

进行研究以确定是否mAb dB4可藉由于HIV感染个体抑制慢性炎症发展以破坏由细胞焦亡所引起的致病循环。抑制由抗原刺激所引发之细胞激素制造有助于缓解许多静默T细胞(静默T细胞已经有失败的HIV感染)之细胞焦亡的负担，从而破坏起因于细胞激素所造成CD4阳性T细胞耗竭的HIV病理。

利用金黄色葡萄球菌B型肠毒素(SEB)之体外模型评估mAb dB4C7(UB-421)在正常和HIV感染个体中抑制PBMC T细胞增生的能力。SEB是一种超抗原，其具有刺激带有特定T细胞抗原受体(TCR)之所有T细胞的能力，并可诱导大量的细胞激素制造。

透过与Huyen Cao和Mohamed Elrefaei博士的合作，进行了正常人类供体(n＝3)和HIV感染供体(n＝6，未使用ART治疗的患者，CD4+数量＞200，病毒量＞10,000)的功能分析，以评估mAb dB4C7(UB-421)或针对CD4之D1的CDR2区域的抗-HIV RC多克隆抗体(实施例9)是否可以抑制细胞增生和细胞激素(IL2和IFN-γ)的产生。

2.1.研究对象和样品

从REACH cohort(旧金山)招募HIV-阳性未使用ART治疗的志愿者(n＝6)。也将三个年龄一致的HIV-血清反应阴性对照组的志愿者纳入此试验中。将PBMC分离并冷冻保存在液态氮中直到试验的时间。

2.2.使用mAb dB4C7或纯化的抗-HIV RC多克隆抗体的饱和浓度

首先在间接免疫荧光试验中分别以mAb dB4C7IgG或抗-HIV RC多克隆抗体IgG染色CD4+ T淋巴细胞，之后再用Alexa-山羊抗-HuIgG或Alexa-山羊抗-天竺鼠IgG进行染色。为了侦测阳性细胞百分比，透过流式细胞仪分析所得之染色的细胞。MAb dB4C7和抗-HIVRC多克隆抗体于2倍稀释所测得之效价介于50μg/mL和0.0025μg/mL。MAb dB4和抗-HIV RC抗体的抗体效价测定为％CD4结合对抗体浓度(μg/mL)。在于HIV感染和正常个体进行T细胞功能测试使用之前评估这些抗体效价。

图17显示于功能试验中所使用各试剂的饱和浓度，mAb dB4(dB4C7)为1μg/mL和抗-HIV RC多克隆抗体为25μg/mL。

2.3.CD4+或CD8+ T细胞的增生

利用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(carboxy-fluorescein succinimidyl ester，CFSE)荧光试验分析细胞增生，其在细胞分裂时产生羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯(carboxy-fluorescein diacetate，succinimidyl ester，CFDA-SE)染色的减少。利用CFSE作为³H-胸腺嘧啶(增生)测试的代用品。

以mAb dB4C7或纯化的抗-HIV RC多克隆抗体之饱和浓度与PBMCs培养，以覆盖位于细胞表面上的CD4受体。细胞也分别与抗-HIV RC同型(浓度为25μg/mL)和PHA(10μg/ml；Sigma-Aldrich)培养作为阴性和阳性对照组。

于PBS中以CFDA-SE(Molecular Probes，Eugene，OR)标帜PBMCs，之后以100％FCS(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)进行荧光淬熄。在以PBS洗涤后，将细胞再悬浮于具有10％FCS的RPMI 1640(Sigma-Aldrich)中。

之后在SEB抗原(1μg/mL)存在下，将细胞于37℃含5％CO₂之条件下培养5天，并分析表面标志的表达。

利用流式细胞仪圈选CD3+(Amcyan)细胞群中CD4+(PE，D2)及CD8+(PercpCY5.5)细胞群进行分析，并针对％CFSE阳性细胞(作为％增生细胞)进一步测定此细胞群。利用LSRII(BD Biosciences，Mountain View，CA)获得每个样品四万(40,000)个淋巴细胞，并利用FLOWJO软体(TreeStar，San Carlos，CA)分析。结果测定为分裂的CD4(或CD8)T细胞的百分比。所有试验参与者证明于PHA刺激后之显著的细胞增生。CD4T细胞在无SEB抗原刺激下之细胞增生为＜0.5％(阴性对照组)。

2.4.用以测定细胞激素(IL2和IFN-γ制造)的细胞内染色试验

PBMC(0.5x 10⁶个细胞)与SEB抗原(1μg/mL)于37℃含5％CO₂之条件下培养2小时。以含有0.1％FCS之PBs(洗涤缓冲液)洗涤细胞，将细胞再悬浮于裂解缓冲液(BDBiosciences)中于室温下反应10分钟进行固定。细胞以洗涤缓冲液洗涤一次，之后将细胞再悬浮于0.5mL的膜通透剂2(BD Biosciences)中并于室温下培养10分钟进行透化处理。接着以洗涤缓冲液洗涤细胞，并以抗-IL-2APC、抗-IFN-γ(PE CY7)以及抗-CD3(Amcyan)、抗-CD4(PE，D2)或抗-CD8(Percp CY5.5)(BD Pharmingen)染色。利用LSR II(BD Biosciences)获得每个样品四万(40,000)个淋巴细胞，并利用FLOWJO软体(TreeStar)分析。在无抗原刺激下之细胞激素-制造CD4或CD8T细胞的百分比为<0.05％(阴性对照组)。结果表示为表达IFN-γ或IL2之CD4+(或CD8+)T细胞的百分比。

2.5.统计分析

利用配对t检定进行统计分析和比较。

3.结果

此SEB抗原引发之T细胞增生试验所提供的结果显示，在未使用HIV ART治疗的患者和年龄一致的正常个体中，mAb dB4C7(1μg/mL)和抗-HIV RC多克隆抗体(25μg/mL)在饱和状态下均可减少CD4+ T细胞增生，而非CD8+ T细胞增生(数据未示)。

MAb dB4(1μg/mL)和纯化的抗-HIV RC多克隆抗体(25μg/mL)于其个别的饱和PBMC表面CD4结合浓度下，于HIV阴性(图18A)和HIV阳性(图18B)个体均可抑制由超抗原SEB所引发增生CD4+ T细胞的IL2生成。于来自相同HIV阳性和阴性个体的CD8+ T细胞中则未发现此种抑制(图18C)。

MAb dB4(1μg/mL)和纯化的抗-HIV RC抗体(25μg/mL)在其个别的饱和浓度下，于HIV阴性(图18D)和HIV阳性(图18E)个体也均可抑制由超抗原SEB所引发增生CD4+ T细胞的IFN-gamma生成。于来自相同HIV阴性(图18F)和阳性(图18G)个体的CD8+ T细胞中则未发现此种抑制。

4.结论

抗体mAb dB4C7(UB-421)和抗-HIV RC多克隆抗体，二者针对CD4结构域1的CDR2区域，发现可抑制超抗原SEB所引发藉由CD4阳性T细胞的T细胞增生和细胞激素(IL2和IFN-γ)生成，而非藉由CD8阳性T细胞的T细胞增生和细胞激素(IL2和IFN-γ)生成。发现dB4C7和抗-HIV RC多克隆抗体可抑制CD4+ T细胞增生和相关细胞激素(IL2和IFN-γ)生成，显示此抗体可能对其它CD4阳性细胞相关的细胞激素生成展现相似的抑制效果，具有破坏细胞焦亡之HIV致病循环的潜力。

在此与先前实施例所观察到，其对CD4阳性T细胞增生和相关细胞激素(IL2和IFN-γ)生成的抑制效果为高度显著，其中在此所述之针对CDR2区域的抗体对CD4细胞可能展现同时发生的相反效果，包括：(1)静默HIV感染之CD4阳性T细胞的再活化，以引发由其潜伏状态释出HIV(实施例9)；(2)藉由静默CD4+ T细胞的再活化，竞争型抑制和预防HIV从新释出的病毒进入未受感染的CD4阳性T细胞(实施例4和6)；以及(3)当(超)抗原刺激时藉由CD4阳性T细胞抑制T细胞增生和细胞激素生成(此实施例)。

针对HIV结合之特定位置(即CD4结构域1的CDR2区域)的mAb dB4和抗-HIV RC多克隆抗体的独特生物特征和免疫反应的引发可提供功能性治愈HIV感染所需的特性，即能够(1)透过进入抑制阻止HIV感染；(2)于静默T细胞再活化病毒制造；以及(3)直接地改变细胞激素生成。

实施例11.于以进化支B之HIV原代分离株HIV.-1_DH12攻毒的黑猩猩利用mAb B4对HIV感染的暴露前和暴露后预防和治疗

已证明针对CD4结构域1之CDR2区域的B4相关高亲和力抗体具有许多独特的体外特性，重要的是要在最像人类的动物模型中测试B4抗体于预防及/或治疗HIV感染的疗效。已使用黑猩猩作为人类病毒、细菌和寄生虫感染的模型超过100年了。于黑猩猩所精心制定的攻毒模型中，使用进化支B之HIV原代分离株HIV-1_DH12展开攻毒试验，以评估mAb B4于暴露前和暴露后模式中对HIV-1感染提供被动性免疫的潜力。具体来说，评估mAb B4所能提供的能力，包含(1)针对感染用以保护受暴露之受试者的消除性免疫，和(2)于证实感染后几天投予抗体时对受暴露的受试者进行治疗。

1.于黑猩猩利用mAb B4对HIV感染的暴露前和暴露后预防

评估mAb B4于攻毒前和攻毒后(暴露于HIV-1)模式对HIV-1感染提供被动性免疫的潜力。

1.1.方法

1.1.1试验使用之动物

本试验总共使用4只黑猩猩。使用一只黑猩猩作为暴露前治疗动物(X084)，使用两只黑猩猩作为暴露后治疗动物(X356和X357)，以及使用一只黑猩猩作为对照组(X259)。

1.1.2动物对以HIV-1_DH12病毒原液感染的敏感性

在治疗和感染前利用其PBMC之体外感染测定动物对以HIV-1_DH12病毒原液感染的敏感性。在暴露于病毒3天内可感染所有培养物。

1.1.3MAb B4抗体

制备供输注使用之mAb B4作为高度纯化的抗体制剂(浓度为5mg/mL)。

1.1.4攻毒前预防/治疗

于HIV-1_DH12攻毒前1小时利用5mg/kg的mAb B4对黑猩猩X084进行静脉输注。

1.1.5攻毒后预防/治疗

于HIV-1_DH12攻毒后1小时利用5mg/kg的mAb B4对黑猩猩X356和X357进行静脉输注。

1.1.6对照组动物

以HIV-1_DH12攻毒黑猩猩X259而未以mAb B4抗体进行输注。

1.1.7以HIV-1_DH12攻毒

以HIV-1_DH12的100TCID₅₀(其取自预先制备的病毒原液，并已于西南生物医学研究基金会在黑猩猩PBMC中测定效价)静脉攻毒四只黑猩猩。

1.1.8HIV-1_DH12病毒的侦测

利用gag序列的DNA PCR放大、共培养、p24捕获ELISA和免疫印迹法，藉由血浆病毒血症、细胞相关病毒量和对HIV之免疫反应的侦测，以监测于黑猩猩的感染确立。利用来自所有黑猩猩于50周研究期期间内所收集之所有血液样品的HIV-1RNA拷贝/mL，以测定HIV感染的血清病毒血症指标。利用病毒分离和DNAPCR试验(DNAPCR试验是用以侦测对应gag的原病毒DNA)于黑猩猩PBMC中侦测HIV-1_DH12病毒。利用p24抗原捕获ELISA(Coulter)评估病毒制造。制备黑猩猩PBMC和淋巴结细胞之1×10⁶至1×10²个细胞的连续稀释，于IL-2培养液中与来自3日龄之PHA刺激的母细胞(数量为2×10⁶个细胞)进行共培养。选取导致p24制造之最高稀释度的孔洞作为终点指标。

1.1.9动物饲养

经机构IACUC的批准并依照国家研究委员会的指导方针，将黑猩猩饲养在西南生物医学研究基金会。

1.2.结果

利用mAb B4对接受HIV-1_DH12攻毒之黑猩猩提供消除性免疫。在HIV-1攻毒前以mAbB4抗体输注的动物中(X084)(图19A)，或在于HIV-1攻毒后1小时以mAb B4抗体输注的两只动物中(X356和X357)(图19B)，在攻毒后后续的32周期间内未侦测到感染的标志。

相反地，在攻毒后第1周开始由对照组动物(X259)从PBMC(图19C)和在攻毒后第2周时由血浆可轻易地分离出病毒。也可于第4和20周由X259活组织切片的淋巴结细胞分离出病毒。于包含细胞数量范围介于1×10⁴至1×10⁶的稀释物中，可侦测到于PBMC和淋巴结隔间之受感染的细胞。在第4周于动物X259发生血清转化。

在利用抗体治疗的黑猩猩X084、X356和X357发现在血液循环中所呈现的游离、未结合之mAb B4迅速下降。来自接受治疗之黑猩猩的CD4+和CD8+次群体在攻毒后20周期间的监测下无CD4+耗竭的证据。到第32周期间，黑猩猩PBMC对有丝分裂促进剂(PHA、商陆果实分裂素(Pokeweed mitogen)和刀豆素(Concanavalin A))的增生反应无抑制作用。

此试验结果指出mAb B4对HIV感染可以提供预防或消除性治愈，透过从攻毒日起甚至一年之血清病毒血症和其它参数的广泛随访可证明此试验结果。

1.3.结论

在黑猩猩试验中，可藉由暴露之前或暴露之后于短暂时间间隔之内的mAb B4投予以中止藉由致病性原代分离株的HIV感染。过继免疫(transferred immunity)被消除，且无暂时、减少或延迟的病毒血症证据。透过mAb B4被捕捉在位于周边血液和淋巴组织的CD4+细胞上，尽管mAb B4抗体从血浆中快速清除，但完整的保护是明显的。

精心执行的试验进一步指出，使用5mg/kg之mAb B4或相关抗体的治疗方案可供(i)遭受HIV患者于数小时内，或(ii)由血清反应阳性母亲所生下之婴儿于生产时，以达到消除性治愈。

1.4.藉由mAb B4对暴露后预防的应用

美国公共卫生服务指南对意外地暴露于HIV后之医护人员推荐使用抗反转录病毒药物的暴露后预防。然而，美国公共卫生服务指南对暴露后预防目前可用药物的毒性持保留态度。

在此试验所获得的结果证明使用mAb B4作为暴露后预防性治疗以代替或合并使用现行暴露后治疗方法的潜力。MAb B4的低毒性和疗效证明此抗体较抗反转录病毒药物更为广泛有效的潜力。

这些结果进一步指出mAb B4可用于从母亲到孩子之HIV垂直传播的预防。HIV的母婴传播(Mother-to-child transmission(MTCT))也称为周产期或垂直传播，发生于怀孕、分娩，及/或生产或母乳喂养期间，将HIV从HIV+的妇女传播给其婴儿。对未接受针对病毒之治疗的HIV+妇女在怀孕、分娩和生产期间的MTCT机率约为25％。在以母乳喂养其婴儿之未经治疗的HIV+妇女，MTCT有额外12％的机会。在全世界，在2001年，1.8万名妇女感染HIV，且大约80万名儿童也成为HIV感染者，其中多数是经由MTCT。在全世界被新诊断为HIV之大部分的人是介于15-24岁之间。MTCT预防的一个非常重要的构成要素是必须针对年轻人进行HIV预防，尤其是女孩和年轻妇女在其变得性生活频繁之前，并对那些已感染者进行治疗。关于MTCT的额外讯息可以在http://caps.ucsf.edu/archives/factsheets/mother-to-child-transmission-mtct#sthas h.DTRyms46.dpuf找到。利用mAb B4所得到的结果指出，可藉由对HIV+妇女之新生儿提供5mg/kg或更多之mAb dB4的单次投予，以在分娩和生产阶段期间预防MTCT。

2.于黑猩猩利用mAb B4治疗HIV感染

2.1.方法

2.1.1试验中使用的动物

黑猩猩X084、X356和X357在先前预防试验中使用且接受5mg/kg之mAb B4的单次投予，以保护其免于HIV-1_DH12的感染，其以治疗模式于此攻毒试验中再次使用。

2.1.2动物对以HIV-1_DH12病毒原液感染的敏感性

在抗体治疗和HIV攻毒之前，从动物制备PBMCs以测定其对以HIV-1_DH12感染的敏感性。利用病毒于预防接种的3天内感染所有的体外培养物。

2.1.3MAb B4抗体

制备供输注使用之mAb B4作为高度纯化的抗体制剂(浓度为5mg/mL)。

2.1.4以HIV-1_DH12攻毒

以HIV-1_DH12的100TCID₅₀(其取自预先制备的病毒原液，并已于西南生物医学研究基金会在黑猩猩PBMC中测定效价)静脉攻毒所有动物(X084、X356和X357)。

2.1.5攻毒后治疗

黑猩猩X084没有任何攻毒后治疗。在攻毒后第14天以5mg/kg的mAb B4输注黑猩猩X357，此时于供HIV感染治疗之受攻毒的动物中的HIV病毒血症为最高。在攻毒后第14、18和22天以5mg/kg的mAb B4输注黑猩猩X356。

2.2.结果的概述

利用输注5mg/kg鼠源mAb B4进行被动性免疫治疗试验，以于具有急性期HIV感染之黑猩猩测定mAb B4的疗效。以HIV-1_DH12静脉注射(i.v.)预防接种三只黑猩猩(X084、X356和X357)，并基于病毒检测(未示出)和定量RT-PCR证实感染确立。

于所有黑猩猩(X084、X356和X357)在暴露后7天利用RT-PCR检测来自HIV-1_DH12的RNA(基线以上)。利用病毒分离和利用HIV-1_DH12整合侦测的DNA-PCR，于14天内在来自所有三只动物之PBMCs和淋巴结细胞中检测细胞相关病毒。

在感染后第14天，利用mAb B4(5mg/kg，静脉注射)输注受感染黑猩猩中的2只(X356和X357)。在感染后第18和22天，一只动物(X356)接受额外两剂的抗体(5mg/kg，静脉注射)。对前12周以每周间隔和之后直到感染后40周每月地利用RT-PCR试验监测病毒量。在感染后第14天时，以mAb B4输注黑猩猩X356和X357，病毒RNA已经处于一个快速上升的阶段。相较于未接受治疗的黑猩猩(X084)(图20A，空心圆)，接受抗体的两只黑猩猩之后在第20天时经历于其病毒量快速且显著的下降(下降幅度为1-2个对数)，以及于初期病毒血症期持续时间的显著降低(初期病毒血症期持续时间由4周降至1周)(图20A，实心圆)。

图20A和图20B比较于未接受治疗的对照组黑猩猩X084(来自本试验，其先前接受mAb B4的单次暴露前投药)与未接受治疗的对照组X259(来自先前试验，其未接受mAb B4的投药)和接受mAb B4三次输注之黑猩猩X356的血浆病毒血症持续时间。于病毒攻毒后，如血清HIV-1RNA拷贝所检测，在无任何干预下利用HIV-1_DH12攻毒黑猩猩X084(图20A，空心圆)和X259(图20B，空心圆)，并显示早在第3天开始病毒血症。血清HIV-1病毒血症的持续时间约42天，为HIV-1_DH12感染的特征。黑猩猩X356(图20A和20B，实心圆)接受mAb B4的三次投予，且HIV-1病毒血症急剧下降，之后在或约在第21天达到低于检测极限。比较X356和X084与X259之间的病毒量数据显示，从HIV-1_DH12感染之特有的病毒血症持续时间减少了21天。

如上所述，来自本试验之未接受治疗的对照组黑猩猩X084于先前试验中接受了mAb B4的单次暴露前投予；而来自先前试验之未接受治疗的对照组黑猩猩X259则未接受任何mAb B4投予。有趣的是，比较X084(图20A，空心圆)与X259(图20B，空心圆)所提供之数据显示，相较于X259，在试验期间X084具有整体较低的病毒量。因此，虽然在此试验中未接受治疗的动物(X084)的病毒量显著高于mAb B4治疗的动物(X356)，于X084对mAb B4之先前暴露似乎显著地减少整体病毒量，特别是在HIV感染的急性期期间(比较X084与X259)。整体来说，这些结果指出于HIV暴露前之mAb B4的任何投予可减少在感染急性期期间之病毒量程度，其可能进一步降低感染后从个体至个体的病毒传播。

另外，进行细胞表面染色发现，在第14天时于投予mAb B4单一剂量的动物(X357)中，mAb B4结合至CD4+细胞维持了至少七天。且于投予此抗体之多剂量的动物(X356)中，mAb B4结合至CD4+细胞持续了至少14天。相反地，只在输注后三天之动物中于血液循环内侦测到游离mAb B4，如利用针对HIV-1_DH12分离株之中和活性所测得。如同在黑猩猩的预防试验中，这符合藉由结合至CD4+细胞而已经将mAb B4由血液循环中移除。

利用对于CD4/B4抗原表位的体外免疫染色，FACS分析在40周期间可于所有样品中侦测到CD4+细胞而无显著的耗竭。在前21天的期间于PBMC之上完成输注mAb B4的免疫染色。PBMC样品之有丝分裂促进剂所诱导的增生反应(利用刀豆素、PWM或PHA)在抗体治疗前和后是不同的，且似乎不受mAb B4输注所影响。这些观察指出mAb B4能够破坏病毒感染，且减少病毒量及病毒血症期，而无不适当的免疫毒性。

实施例12.UB-421制剂，于狒狒之临床前药理学/毒性试验和在人体组织的交叉反应性

简介

于前述实施例所讨论之细胞培养和黑猩猩试验中所获得的数据证实，有足够的科学价值证明进一步发展供人类使用之含有mAb dB4的药物制剂是有理的。制备含mAb dB4C7(UB-421)的药物制剂，并为临床使用而于大量生产上进行一般的安全性测试。

另外，进行一组临床前安全性试验以提供针对候选药物UB-421的药效学、药物动力学、毒性和安全性资讯。

在狒狒(Papio species)进行单次与多次投予以及剂量依赖性(低和高剂量)试验，以协助第一期临床试验的设计，用以评估在无症状HIV-1感染的人类受试者中UB-421之剂量依赖性的安全性、耐受性和免疫毒性。于临床前药理/毒性试验使用狒狒作为动物模型，原因为狒狒的CD4+ T细胞具有与人类相似的对mAb dB4C7结合亲合力，如图21所示(即对人类和狒狒分别为EC₅₀＝0.33μg/mL和0.29μg/mL)。与Krishna Murthy博士(西南生物医学研究基金会，病毒学暨免疫学部门，圣安东尼奥，德州)合作以开始与执行在狒狒的非人类灵长类动物药理和毒性试验。

此外，执行交叉反应性试验，以评估UB-421是否具有任何非预期性的反应性，和对有别于预定目标之人类组织之细胞毒性的可能位置。

如以下进一步详细讨论者，从这些临床前试验所得到的数据显示具有足够的科学价值证明进一步发展UB-421作为在人体临床试验之试验性新药是有理的。

1.药剂剂型

为了供人类使用而制备含有mAb dB4C7的药剂剂型。一般来说，包含mAb dB4C7之药剂剂型可配置于适当的缓冲液中包含，但不限于，柠檬酸盐、磷酸盐、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、1，3-二[三(羟甲基)甲基氨基]丙烷(BIS-Tris)等，于介于6.0至7.0之pH值，且可包含赋形剂(例如糖类(50mM至500mM的蔗糖、海藻糖、甘露醇，或其混合))、表面活性剂(例如：0.025％-0.5％的Tween 20或Tween 80)，及/或其它试剂。

UB-421是指定为于磷酸盐缓冲生理食盐水(PBS)(pH 6.5)中包含10mg/mL mAbdB4C7、20mM甘氨酸，以及0.05％(v/v)Tween(polysorbate 20)的医药组合物。

MAb dB4之高浓度剂型也可供包含皮下注射的应用而加以制备，其包含10mM组氨酸。

制造之后，执行一般的安全性和毒性试验以确保制造的药物产品对投予人类和动物受试者是安全的。

2.一般的安全性试验

2.1.UB-421生产批次和安全标准

以两个大规模生产(P/N Z807，批号225711和225758)制备UB-421药物产品供临床试验使用，并评估一般的安全性。

若在7天的测试期间符合下列条件(1)整个测试期间所有的动物存活；(2)未观察到毒性的明显征象；以及(3)于投予医药组合物之时间直到试验期结束的期间内没有动物具有明显的体重减少，则将UB-421的大规模批次制造视作对临床使用上为安全且可接受的。

2.2.实验动物

小鼠：(白化，BALB/cByJNarl品系(家鼷鼠(Mus musculus))，无特殊病原，雄性(国研院动物中心(NLAC)，台湾)。(实验编号BIO-003.90)。

天竺鼠：(白化，Hartley品系(天竺鼠(Cavia porcellus))，无特殊病原，雄性(台大医院(NTUH)，动物中心，台湾)。(实验编号BIO-003.91)。

2.3.方法

透过腹腔投予方式对两只小鼠和两只天竺鼠注射各批次的UB-421。对照组的小鼠和天竺鼠则是透过腹腔投予方式注射等渗氯化钠溶液(“S.T.”，批号1OC0206)。每只小鼠接受0.5毫升的总体积，而每只天竺鼠接受5.0毫升的总体积。在给药前(第0天)和结束前(第7天)记录动物体重。针对一般健康情况和毒性的临床征象每天观察每只动物。

2.4.分析和结论

来自一般的安全性试验结果针对分析标准产生了以下令人满意的结果：

(1)用于一般安全性试验的所有动物在测试期间内存活。

(2)在UB-421治疗的动物中未观察到明显征象的毒性。

(3)试验期间内无动物体重减少。

鉴于上述情况，将此些批次视为无未预期，不可接受的外来杂质。

这些发现证实了UB-421的大规模制造批次(批号225711和225758)无未预期或不可接受的外来杂质。据此，视这两个批次于人类临床试验使用上为安全和可接受的。

3.试验A：于狒狒之UB-421的单次投予毒性试验

3.1.方法

试验A评估为期42天UB-421之低剂量(5mg/kg体重)或高剂量(25mg/kg体重)单次投予的药效学、药物动力学和安全性，如表14A所示。在这项试验中，于30分钟期间内以5mg/kg或25mg/kg体重透过静脉输注投予UB-421。在0、0.5、1、2、4、8、12、24小时，以及在2、3、5、7、10、14、21、28、35、42天，收集用于药物动力学(PK)分析的血液样品。

利用流式细胞仪分析法分析血液样品，利用以下标志监测CD4+ T淋巴细胞的存在，标志包含：CD4结构域1(抗-CD4+D1)和CD4结构域2(抗-CD4+D2)。利用Alexa-dB4作为标志和用于竞争型CD4结合的示迹剂(竞争型CD4结合是利用单克隆抗体UB421，且单克隆抗体UB421和Alexa-dB4均针对CD4结构域1和2)。利用Alexa-山羊抗-huIgG作为针对CD4结构域1和2之单克隆抗体的示迹剂。此外，利用针对CD3和CD14的抗体监测于PBMC制备中的总T细胞(CD3)和单核细胞(CD14)数量。

3.2.结果简述

未于药效学、药物动力学和安全性试验中发现UB-421不应该于人类进行第一期临床试验之负面看法。对于评估的所有参数而言，在对照组和实验组动物均观察到发现每一资料点显著地高于或低于平均值(“超出正常范围”)。

对来自以低剂量(5mg/kg)和高剂量(25mg/kg)UB-421单次投予治疗之狒狒所提供的血液样品评估UB-421之初始药物动力学(PK)性质。

此试验结果显示，以UB-421治疗导致来自外周血单核细胞(PBMC)或由淋巴结活检样品细胞悬浮液所分离的CD3+CD4+ T淋巴细胞和CD14+CD4+单核细胞之侦测显著减少。因此怀疑这些细胞的减少是由于以UB-421“覆盖”CD4+细胞，而不是因为动物体之CD4+细胞耗竭。发现当利用针对抗-CD4+D2标志的抗体时，所侦测之CD4+ T淋巴细胞的百分比没有变化，其证实了此项怀疑。此种在输注后于CD4+细胞上以UB-421“覆盖”的持续时间于接受低剂量之动物中为至少3天，而于接受高剂量之动物中则为至少7天。当于动物的血浆中不再侦测得到UB-421时，CD4+细胞上的“覆盖”减少，且CD4+细胞(如利用抗-CD4+D1侦测)回复到与利用抗-CD4+D2侦测者相同的百分比。

综上所述，本研究发现UB-421是安全的，且当以低剂量UB-421投予时，UB-421可完全覆盖CD4阳性细胞达至少3天，当以高剂量UB-421投予时则达至少7天。基于先前实施例所讨论的结果，当完全覆盖CD4+细胞时，预期可完全地排除HIV进入细胞，此将产生病毒量减少的结果。

4.试验B：于狒狒之多次投予毒性试验

4.1.方法

试验B评估为期56天(8周)之UB-421的低剂量(5mg/kg体重)或高剂量(25mg/kg体重)重复投予的药效学、药物动力学和毒性，如表14B所示。在此试验中，一个治疗期包含以每周的间隔(每周投予一次)投予UB-421共8次。在8周治疗期结束时，对半数之接受治疗的动物进行尸体剖检与评估(表14B，第1部分)。其余的动物随后经过一个12周的恢复期，期间维持动物供观察和收集血液与淋巴结样品(表14B，第2部分)之用。在治疗期期间的0*、1、3、7*、14、21、28、35*、42、49、56*天，以及在恢复期期间的63*、70、77、91、105*、133天，由动物收集血液样品(和淋巴结活检*)供分析之用。此试验系统使用成年雄性(M)和雌性(F)的狒狒(n＝20；年龄：7至18岁)。

4.2.结果简述

来自一组大规模临床前试验所提供对UB-421之低剂量(5mg/kg)和高剂量(25mg/kg)多次投予的药物动力学、药效学、毒性和安全性资讯。

整体来说，由试验B第1部分和第2部分所提供之数据指出UB-421候选药物具有供进一步发展的科学价值以作为试验性新药。未于药效学、药物动力学和安全性研究中发现UB-421不应该于人类进行第一期临床试验之负面看法。对于评估的所有参数而言，在对照组和实验组动物均观察发现到每一资料点显著地高于或低于平均值(“超出正常范围”)。

4.2.1血液和活检分析

从利用低剂量和高剂量UB-421多次投予治疗之动物中所得到样品进行一组大规模的试验。这些试验的结果总结在表15和17，并于以下内容进一步讨论。

利用UBI ELISA试验(实施例7)和MT-2试验(实施例2)发现，于接受低剂量(5mg/kg)UB-421之动物中可于其血浆侦测到UB-421达至少3天，而于接受高剂量(25mg/kg)UB-421之动物中则达至少7天。在最后一次输注后，于某些接受高剂量之动物的血浆中检测到过量UB-421达至少14天。

在接受UB-421的16个动物中的任一个内均未发现针对UB-421的狒狒抗体，证实本候选药物于接受治疗之动物中不具有免疫原性。

所有狒狒在第0和28天免疫接种B型肝炎病毒(HBV)疫苗(Merck)。在4只对照组(1B)动物中的4只、接受低剂量(2B)UB-421的8只狒狒中的6只，以及接受高剂量(3B)UB-421的8只狒狒中的3只，在第56天可观察到可检测水平的狒狒抗-HBsAg抗体。这些结果指出CD4+细胞之UB-421“覆盖”可能造成某些动物对抗原预防接种的低反应性。然而，发现此种低反应性的效应为可逆的，因为在UB-421治疗中断和以HBV疫苗额外免疫接种后，这些动物都能够发展出抗-HBsAg抗体。

4.2.2观察和尸体剖检的结果

将本试验中接受治疗之狒狒的肉眼和显微镜分析总结在表16和17。

在一般情况下，于此试验中评估取自所有狒狒的组织(第1和2部份)，未显示可能归因于以低或高剂量水平投予UB-421之任何独特或一致的病理变化。

对所有第3B组(高剂量)动物(n＝8)于输注前之收案时进行眼睛观察，并于最后输注后一周，于治疗期结束时再次眼睛观察。从这些动物的眼科报告指出，对在治疗期结束时执行的所有测试而言，两眼均保持在正常范围内。

取得来自所有动物(n＝20)在完成投予每一剂量之前、期间和之后的心电图观察记录。从所有试验动物的心电图报告推断所发现的心电图变化是在正常的逐日差异的范围内。

4.2.3IND-Enabling毒理试验结果

除了对HBV疫苗接种的免疫反应下降之外，UB-421处理组(2B和3B)和对照组(1B)之间于免疫毒性结果并无显著差异。临床检查结果、眼科报告、心电图记录和组织病理学结果支持结论，结论为于成年狒狒在接受剂量水平高达25mg/kg之8周输注后，UB-421是安全且耐受性良好的，治疗法可有效地覆盖目标细胞而不造成细胞耗竭。

5.于人体组织的交叉反应性

如先前实施例所讨论的，mAb dB4抗体，包含mAb dB4C7(UB-421候选药物的主要成分)，证明其对CD4具有高结合亲合力，特别是位于T细胞上之膜结合CD4。以下的临床前试验利用来自30个人体器官组织的一种阵列评估是否mAb dB4C7可结合其它细胞种类。本试验的目的是评估是否mAb dB4C7具有任何意料之外的反应性，以及其对有别于预期目标人体组织之细胞毒性的可能位置。

5.1.方法

使用含有30个器官之共90个组织核心的FDA标准的冷冻组织阵列进行免疫组织化学试验，其每一组织取自3个正常人类个体捐赠者(美国BioMax组织微阵列(TMA)切片，洛克维尔，MD)。个别人类样本之额外的冷冻切片也纳入人体组织调查对象中，如表18所述。利用生物素化mAb dB4C7和对照组试剂(生物素化山羊抗-兔IgG)筛选人体组织调查对象供免疫反应之用，用以评估特异性和非所欲之自体反应性。

5.2.结果

藉由于PhenoPath实验室(西雅图，华盛顿)经认证的临床病理学家复审在成人正常组织切片所观察到的染色模式，并针对反应性进行评分。在胸腺和位于扁桃体(和淋巴结)之T细胞依赖区观察到强阳性的表面细胞膜染色，于脾脏则注意到弱阳性反应。偶发的单核细胞与淋巴细胞或巨噬细胞一致，以一个预期模式在多种组织中染色阳性。也注意到于肝脏之局部微弱的库氏细胞(Kupffer cell)染色。除了在某些组织中内源性生物素的微弱染色，测试的所有其它人体组织均呈现阴性。扁桃体部分与未标帜的mAbdB4C7抗体预培养可阻断特定染色模式。未观察到预期外的交叉反应性。

这些结果证实mAb dB4C7(UB-421的主要成分)不具有可能会对有别于预定目标之人类组织导致细胞毒性的任何意料外的交叉反应性。

实施例13.第I期，开放性，单次投予，剂量依赖性试验，以评估UB-421于无症状HIV-1感染之成年人的安全性和药物动力学

1.目标

主要目标是要评估于无症状之人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)感染的受试者以UB-421递增剂量单次静脉输注的安全性和耐受性，次要目标为确定于无症状之HIV-1感染的受试者以UB-421递增剂量单次静脉输注的药物动力学。(临床试验识别码：NCT01140126)。

2.方法

开放性，单次投予，剂量依赖性(剂量递增)，二中心，非比较性。

3.受试者人数

总共收案20个受试者(于每个剂量组有5位受试者)。

4.诊断和纳入的主要标准

为了参与这项试验，受试者必须满足以下所有标准。

(1)HIV-1血清反应阳性；

(2)年龄20岁(含)以上；

(3)对于方案版本Mar-09-2010：无症状，如同试验主持人于筛选访视(visit 1，V1)根据疾病史、生理学检查、心电图(ECG)，以及凝血试验和临床化学和血液学试验结果所判定，此些项目结果必须一直维持在正常范围±10％内；

(4)对于方案版本Jul-01-2010：无症状，定义为患者在筛选访视(visit1，V1)前24周内无急性或有症状的病毒性肝炎，且无AIDS-界定疾病的病史，其是由试验主持人根据疾病史、生理学检查、ECG，以及实验室值所判定；

(5)对于方案版本Mar-09-2010：在筛选访视(visit 1，V1)所获得CD4+T细胞数量＞350个细胞/mm³和HIV-1病毒量＞5,000个拷贝/mL；

(6)对于方案版本Jul-01-2010：在筛选访视前4周内或于筛选访视(visit 1，V1)所获得CD4+ T细胞数量＞350个细胞/mm³和HIV-1病毒量＞5,000个拷贝/mL；

(7)未使用治疗药物者即事前和目前未接受抗反转录病毒治疗的受试者；

(8)非哺乳中妇女；

(9)受试者于对具生育能力妇女之筛选访视时必需具有阴性的血清妊娠试验结果；

(10)受试者必须同意在试验期间使用屏障避孕法(女性或男性保险套)；以及

(11)受试者在接受任何研究程序前应签署知情同意书。

5.试验用药品和干预方法

以浓度为10mg/mL(100mg于10mL药瓶)提供UB-421(dB4C7mAb)。

把受试者分成4个剂量组，每一剂量组包含5名受试者，此基于其所接受UB-421的剂量。每个纳入的受试者在第0天(Visit 2，V2)以以下的剂量水平之一接受UB-421的单次静脉输注：1mg/kg体重(第1剂量组)、5mg/kg体重(第2剂量组)、10mg/kg体重(第3剂量组)或25mg/kg体重(第4剂量组)。基于特定剂量和受试者体重计算UB-421的适当体积。使用无菌生理食盐水调整每个个别剂量的体积，藉此以药物之等量输注体积输注一个剂量组内的每个个别受试者。之后使用输注帮浦输送UB-421的剂量。

6.疗程：

从筛选、治疗和随访的时间范围：62至90天。从输注到试验结束的时间范围：60天。

7.评估标准：

7.1.主要安全性终点：

(1)生理学检查(PE)

(2)生命征象

(3)临床化学和血液学试验

(4)不良事件(AE)/严重不良事件(SAE)的发生率

(5)心电图(ECG)

7.2.次要安全性终点：

(1)在给药后第0天(输注前)、第14天、第28天和第60天所展现之抗-UB-421抗体的血清浓度(UB-421的免疫原性)。

(2)初始CD4+ T细胞数量是在筛选访视(V1)时评估，或是基于筛选访视前4周内所提供的预筛选数据。

(3)在给药后第60天评估随访的CD4+ T细胞数量。

8.疗效终点

以于HIV-1病毒量从基线之改变评定疗效终点。将基线的HIV-1病毒量定义为在筛选访视V1时所评估的病毒量。

9.药物动力学(PK)

针对UB-421评估以下药物动力学(PK)参数：

(1)C_max：给药后所观察到的最高血清药物浓度。

(2)T_max：达到C_max的时间。

(3)λ_z：排除(末端)速度常数。

(4)t_1/2：排除(末端)半衰期。

(5)AUC_(0→last)：从时间零至最终样品评估时间之血清药物浓度-时间曲线下的面积。

(6)AUC_(0→∞)：从时间零至无限大之血清药物浓度-时间曲线下的面积。

(7)CL：从身体之药物的血清清除率。

(8)V_β：于消除相之分布的体积。

(9)V_ss：于稳定状态(steady-state)之分布的体积。

(10)MRT_(0→∞)：外推到无限大的平均滞留时间(MRT_(0→t))。

10.统计方法

10.1.主要安全性终点

(1)生理学检查：利用藉由中心、天数、剂量组或整体之叙述统计概述生理学异常。也呈现从基线至最终访视的转变表。

(2)生命征象：藉由每一访视利用叙述统计概述生命征象。也藉由中心、天数、剂量组或整体呈现相对于基线值的转变。

(3)临床化学和血液学试验：利用叙述统计于适用的访视概述临床化学和血液学试验的结果。根据试验主持人的专业判断和在每个研

究地点的正常范围标准，将测试结果分为四个类别：正常、异常且无临床意义(NCS)、异常且有临床意义(CS)，以及异常且有典型的临床意义(CST)。在转变表中也呈现从基线至最终访视之实验室检测结果异常的改变。

(4)不良事件(AE)的发生率：将治疗前不良事件、治疗相关紧急不良事件(TEAE)、以及药物相关不良事件概述于频率分布。每个报导的不良事件与一个国际通用医学术语辞典(MedDRA)编码和一器官系统分类相关。可将国家过敏症与传染病研究所爱滋病分部(DAIDS)的不良事件分级表第1.0版用于严重度分级。

(5)心电图(ECG)：利用叙述统计概述于适用之访视所提供的心电图纪录数据。

10.2.次要安全性终点

(1)抗-UB-421抗体的血清浓度：利用适用的访视概述抗体浓度。

(2)CD4+ T细胞数量：利用分布统计对适用的访视概述细胞数量和细胞百分比。也概述了于CD4+ T细胞数量和百分比之相对于基线至最终访视的改变。

10.3.疗效终点

(1)HIV-1病毒量：于每一访视利用叙述统计概述HIV-1病毒量。也利用中心、天数、治疗剂量组和整体呈现相对于基线数值之改变＝(于治疗后访视的数值-于基线访视的数值)。

10.4.药物动力学评估

于每一访视利用叙述统计概述药物动力学参数。

根据方案和统计分析方案(SAP)，安全性终点是在意图治疗(intent-to-treat，ITT)群体进行分析，然而疗效分析会在ITT和疗效群体二者中进行。至于药物动力学评估，因为只有在台北荣民总医院(TVGH)的受试者有样品可收集作为PK数据分析之用，故定义这些受试者为PK群体。PK评估只在TVGH的受试者进行。

11.结论的摘要

11.1.疗效、药物动力学和安全性结果

11.1.1疗效结果

如图22A所示，利用测量在整个试验中于不同时间点之HIV-1病毒量的变化以评估UB-421的疗效。疗效分析显示在UB-421输注后于来自第2剂量组(5mg/kg)、第3剂量组(10mg/kg)和第4剂量组(25mg/kg)的受试者，而非于第1剂量组(1mg/kg)的受试者，可发现于平均HIV-1病毒量之显著的净变化。

藉由在单次投予后病毒量下降至2.25log₁₀(来自10mg/kg组别)可证明抗体药物UB-421(mAb dB4C7)的疗效(图22B)。将对每一剂量组之HIV-1病毒量的最大平均下降概述如下，并在图22B显示：

第1剂量组(1mg/kg)：于第6天(V5)为0.29log₁₀个拷贝/mL。

第2剂量组(5mg/kg)：于第6天(V5)为0.97log₁₀个拷贝/mL。

第3剂量组(10mg/kg)：于第10天(V6)为1.58log₁₀个拷贝/mL。

第4剂量组(25mg/kg)：于第14天(V7)为1.63log₁₀个拷贝/mL。

HIV-1抑制的持续时间与剂量水平相关，其中相较于较低剂量之剂量组的受试者，在较高剂量之剂量组的受试者显示HIV-1病毒量下降的持续时间较长(图22A)。对以最高剂量UB-421(第4剂量组，25mg/kg)输注受试者之HIV-1病毒量抑制的持续时间维持最长，约28天。

总之，发现UB-421抗体在5、10和25mg/kg的剂量水平以剂量-依赖关系具有强的抗病毒效应。也就是说，在可比较的投药下，相对于TMB-355，利用UB-421治疗时有更高百分比的患者于血清HIV-1RNA水平达到＞1Log₁₀的减少。

针对TMB-355(TMB-355先前称为TNX-355；Kuritzkes，D.R.，et al.，2004，图1)先前报导的疗效数据评估来自本试验使用UB-421之疗效数据的理论比较，如图23A至图23C所示。基于此比较，于评估的100％的受试者中，接受10mg/kg或25mg/kg单次投予时，UB-421可达到于病毒量的10倍减少；然而TMB-355只可于使用相同剂量之83％的受试者中达到于病毒量的10倍减少。

11.1.2药物动力学结果

针对此试验中所使用UB-421的每个剂量(1、5、10和25mg/kg)评估以上列出的药物动力学(PK)参数。表19概述了在每一剂量组来自3个受试者所评估的多个PK参数(C_max、AUC_(0→∞)、T_1/2和MRT)的结果。结果显示每个PK参数和投予UB-421剂量的数据值之间具有相关性。也就是说，UB-421的剂量由1mg/kg增加至25mg/kg可对应至所评估之PK参数的增加。具体来说，C_max由28.6μg/mL增加至462.5μg/mL；AUC_(0→∞)由201μg-小时/mL增加至51367μg-小时/mL；T_1/2由14.4小时增加至85.4小时；且MRT_(0→∞)由21.6小时增加至97.4小时。

11.1.3安全性结果

透过生理学检查、生命征象、临床化学和血液学试验、AE/SAE的发生率和心电图评估UB-421的安全性特征。也测定CD4+ T细胞数量和抗-UB-421抗体浓度以提供进一步的安全性评估。

针对总共30个事件，将TEAEs的净发生率以严重度分级为65.0％(20个受试者中的13个)。报导的三个受试者具有六件治疗相关的不良事件与严重度分级：于受试者B-001-001(投予1mg/kg剂量的UB-421)为第1级(轻度)“搔痒”和“疖疮”；于受试者A-015-009(投予10mg/kg剂量的UB-421)为第1级(轻度)“淋巴细胞数量增加”、“嗜中性球数量减少”和“血小板数量下降”；且于受试者B-015-008(投予25mg/kg剂量的UB-421)为第2级(中度)“麻疹样疹”。于受试者B-015-008之麻疹样疹的发生为未预期之严重药品不良反应(SuspectedUnexpected Serious Adverse Reaction，SUSAR)；此受试者在5天护理之后从医院出院。报导的一位受试者具有另外的SAE，其与UB-421无关，于受试者A-012-005(投予5mg/kg剂量的UB-421)为肛门廔管和痔疮；在生命征象或心电图的结果则未发现与治疗相关的异常。于治疗仅有一个剂量；因此，尚未发生治疗中断或剂量变化。

在三个受试者(分别来自第2、3和4剂量组的一位受试者)中在第14天(V7)检测到抗-UB-421抗体，其水平略高于0.4μg/mL的实验检测极限。在经过第60天(试验结束)的任何后续的访视中未检测出抗-UB-421抗体。没有相关的不良事件或其它生理学异常与抗-UB-421抗体的出现有关。

此外，CD4+ T细胞数量和细胞百分比在60天的治疗期和无治疗随访期期间为相对稳定的。

总而言之，当以介于1和25mg/kg的剂量范围透过静脉内(IV)输注投予单剂量时，UB-421对HIV-1感染的成人是安全且耐受性良好的。

12.结论

此第I期试验，以剂量范围从1至25mg/kg的UB-421单次静脉输注，证明UB-421对HIV-1感染的成人是安全且耐受性良好的。大部分的不良事件为轻度或与试验药物无关的。麻疹样疹之SUSAR的唯一发生是发生在第4剂量组(25mg/kg剂量)，但目前还不清楚这起事件是否与试验药物有关。在三个受试者中只于第14天(V7)检测到对UB-421的暂时性免疫反应，其抗体水平仅略高于0.4μg/mL的实验检测极限，证明此抗体的出现为轻微的临床意义。关于此试验药物的药物动力学概况，主要参数的趋势与剂量水平相关。此外，HIV-1病毒量抑制的程度和持续时间与5、10和25mg/kg之UB-421剂量水平显著地正相关，但在1mg/kg剂量组并非如此明显。

考虑到从此试验所获得的安全性和疗效结果，在治疗无症状HIV-1感染的成年人中许可至少为5mg/kg剂量水平UB-421的进一步发展。

实施例14.第IIa期，开放性，多次投予，剂量依赖性试验以研究UB-421于无症状HIV-1感染之成年人的安全性和疗效

1.试验目的

(1)评估于无症状HIV-1感染受试者之UB-421二剂量治疗方案之多次投予的安全性和耐受性。

(2)获得于这些受试者之UB-421二剂量治疗方案之多次投予的抗病毒活性证据。

(3)评估抗病毒活性和安全性概况以确定最佳UB-421给药和剂量治疗方案。

(临床试验识别码：NCT01668043)。

2.试验设计

这是利用UB-421之重复静脉内给药的开放性试验。为了可受试性(eligibility)而筛选对HIV-1血清反应阳性且无症状之受试者。二十九位纳入的受试者接受两个剂量水平(每周10mg/kg(第1剂量组)或每两周25mg/kg(第2剂量组))之一的试验药物(UB-421)之多次静脉输注，共为期8周的治疗期。基于收案顺序透过地点且轮流地将受试者分配到两个试验剂量组之一。在8周的治疗期之后随访受试者额外的八周。此试验在第16周结束。

3.纳入的标准

受试者必须满足以下标准才有资格参与第IIa期试验：

(1)无症状，未接受抗反转录病毒治疗的患者(antiretroviral therapyHIV-1血清反应阳性

(2)CD4+ T细胞数量＞350个细胞/mm³

(3)HIV-1病毒量＞5,000个拷贝/mL

(4)无需要立即治疗的感染症(HIV-1除外)

(5)无使用免疫调节药物或全身化疗

(6)无需高效抗反转录病毒疗法(HAART)。

当依据对HIV/AIDS诊断与治疗的现行指导方针由试验总主持人视作必需时，在这项试验完成后，受试者于门诊遵循例行的监测时程表(无抗反转录病毒药物)或接受标准治疗之抗反转录病毒疗法(例如HAART)。允许于使用UB-421之第I期试验所纳入的个体和符合第IIa期试验之进入标准的个体参与此次试验。

4.试验用药品

以浓度为10mg/mL(100mg于10mL药瓶)提供UB-421(dB4C7mAb)。

每个纳入的受试者接受利用以下剂量水平之一的UB-421的多次静脉输注：每周10mg/kg(第1剂量组)或每两周25mg/kg(第2剂量组)，为期8周。UB-421的适当体积是基于特定剂量和受试者体重。使用无菌生理食盐水调整每个个别剂量的体积，藉此利用药物之等量输注体积输注一个剂量组内的每个个别受试者。对10mg/kg剂量组的输注总体积为约100mL，而对25mg/kg剂量组的输注总体积为约200mL。每次给药的输注时间为约一到两小时。

5.评估标准：

5.1.主要安全性和疗效终点：

直到第16周(试验结束)评估UB-421的以下安全性和耐受性参数：

(1)生理学检查(PE)

(2)生命征象

(3)临床化学和血液学试验

(4)不良事件(AE)/严重不良事件(SAE)的发生率

在试验期(从V2至V12)期间对每一个剂量组评估UB-421的以下疗效参数：

(1)个别最大病毒量下降

(2)平均最大病毒量下降

5.2.次要病毒学终点

在试验期(从V2至V12)期间评估以下病毒学反应：

(1)在每一试验剂量组内和之间根据次群组的个别最大病毒量下降和平均最大病毒量下降。

(2)具有病毒量<50个拷贝/mL之受试者的比例；

(3)具有病毒量<200个拷贝/mL之受试者的比例；

(4)具有病毒量下降＞0.5log₁₀个拷贝/mL之受试者的比例；

(5)具有病毒量下降＞1log₁₀个拷贝/mL之受试者的比例；

(6)分别地对第1剂量组和第2剂量组在最终完成试验药物投予后直到7天和14天具有病毒反弹(于病毒量从最低点有超过0.5log₁₀的增加)之受试者的比例；

(7)抗-UB-421抗体的血清浓度(UB-421的免疫原性)；

(8)CD4+和CD8+ T细胞数量的变化；

(9)UB-421的药物动力学参数(C_max、AUC_(0→∞)和AUC_(0→last))。

6.分析群体

意图治疗(ITT)群体：29个受试者，其接受试验药物的至少一次给药。

第1剂量组和第2剂量组的ITT群体分别为14个受试者和15个受试者。

依方案执行临床试验的群体(Per-protocol(PP)population)：18个受试者，其接受试验药物的所有给药，具有有效的基线和至少一个有效的治疗后疗效测定(HIV-1病毒量试验)，且无重大违反方案规定。第1剂量组和第2剂量组的PP群体分别为7个受试者和11个受试者。

安全性和免疫原性群体：将29个受试者纳入意图治疗(ITT)群体。

药物动力学群体：是基于安全性和免疫原性群体中的次群体。

于安全性和免疫原性群体分析基线数据和安全性终点，然而疗效分析是在ITT和PP群体二者中进行。在药物动力学群体进行药物动力学分析。

7.试验期的持续时间

筛选期：＜4周

治疗期：8周

随访期：治疗期结束后接着的8周

Visit 0代表初始筛选，而试验期间的每一次访视代表1周期间。随访期通常以每周间隔执行。

8.结果的概述

8.1.试验群体

在台湾的两个试验地点筛选总共33个无症状之HIV感染的成年人。其中29个受试者通过了筛选标准并被选择进行试验。所有符合资格的29个受试者均为男性。

8.2.安全性和耐受性结果

所有29名受试者在试验期间经历至少1件不良事件，共计128件不良事件。其中，114例(在所有29个受试者中有89.06％)为治疗相关紧急不良事件(TEAEs)和14例(在5个受试者中有10.94％)为治疗前不良事件。于29个受试者中未观察到严重不良事件(sAEs)。所有治疗前不良事件均与UB-421无关，且这些事件中无事件被视为SAEs。报导TEAEs中的大多数(78.95％)为轻度，17.54％为中度，且3.51％(于一个受试者)是重度的。

最常见的(＞10％)TEAE是皮疹和荨麻疹。除了不良事件，在22个受试者中观察到于血液学(于22个受试者中的154个事件)和生物化学(于6个受试者中的32个事件)之实验室异常检测结果。然而，大多数的变化是轻微且不具有临床意义的。生理学检查结果和生命征象在试验期期间大多为正常或无临床意义。

如临床试验方案所说明，UB-421在试验期期间为耐受性良好的，其于8周治疗期的整体治疗耐受性为73.84％。

8.3.药效学

8.3.1CD4⁺ T和CD8⁺ T细胞数量

在8周治疗期和8周随访期之后，平均CD4⁺ T细胞数量从基线略微减少了55.10±117.97个细胞/mm³，而平均CD8⁺ T细胞数量从基线增加了193.31±459.34个细胞/mm³。第1剂量组受试者之代表的CD4⁺ T细胞数量和平均CD4T细胞数量如表22A和图24A所示。第2剂量组受试者之代表的CD4⁺ T细胞数量和平均CD4T细胞数量如表22B和图24B所示。

8.3.2以UB-421覆盖CD4受体

利用荧光结合的UB-421透过流式细胞仪侦测CD4受体覆盖的程度。从四个代表受试者所提供之结果，两个来自第1剂量组和两个来自第2剂量组，分别如图25A至25B和图25C至25D所示。此试验的灵敏度为0.15μg/mL。以每周10mg/kg或每两周25mg/kg重复给药时，UB-421的临床疗效显示，当作为单一药物治疗时，于＞10μg/mL之UB-421血清水平存在下可使病毒减少至低于检测极限。只要PBMC CD4+细胞被完全覆盖(即dB4C7-Alexa结合百分比接近0)就没有病毒反弹。

在以两个剂量水平投予UB-421二至三次后可达成以UB-421完全覆盖位于PBMC上之CD4受体。此外，于整个治疗期期间可保持以UB-421完全覆盖CD4+ T细胞(图25A-25D，上图)。在大多数受试者中，如同利用荧光dB4C7mAb(dB4C7-Alexa)之结合所测定，在最终UB-421输注的三周内，结合至CD4受体的UB-421减少并回复至基线数值。

评估试验期间于受试者血清中所呈现之UB-421的浓度，以决定足以达成完全CD4覆盖和HIV-1病毒抑制之UB-421的血清浓度。基于所获得的数据，只要UB-421血清浓度维持在高于10μg/mL，则可利用UB-421达成持续的CD4+ T细胞的完全覆盖和HIV-1病毒抑制(图25A-25D，下图)。

8.4.药物动力学

在第1剂量组中观察到平均AUC从17300±10000μg x小时/mL(Visit1-2)增加至23900±10700μg x小时/mL(Visit 8-9)，然后在Visit 11-12回复至基线。在第1剂量组中所观察到的平均AUC_(0→last)是171000±70300μg x小时/mL。

在第2剂量组中观察到平均AUC从56500±19500μg x小时/mL(Visit1-3)增加至61100±20700μg x小时/mL(Visit 7-9)，然后在Visit 11-12回复至基线。在第2剂量组中所观察到的平均AUC_(0→last)是239000±73900μg x小时/mL。

这些数据证明，如同利用AUC_(0→last)所测定，相较于接受每周10mg/kg UB-421输注者(第1剂量组，171000±70300μg x小时/mL)，平均血清药物浓度以在投予每两周25mg/kgUB-421输注的受试者中较高(第2剂量组，239000±73900μg x小时/mL)。

8.5.疗效结果

此试验招募29个HIV-1感染的受试者，其接受至少一剂的UB-421(ITT群体)。招募的29个受试者中，共计18个受试者完成了8周的治疗期，其接受试验药物的所有给药(PP群体)。于试验期间透过评定所纳入无症状HIV-1感染受试者的个别和平均最大病毒量下降，以评估UB-421多次投予的疗效，且将第1和2剂量组之ITT和PP群体的结果概述于表20。

发现平均最大病毒量下降在ITT或PP群体的两个剂量水平之间并无显著差异。具体来说，在第1剂量组于ITT群体之病毒量减少了2.27±0.60log₁₀个拷贝/mL，而在第2剂量组于ITT群体之病毒量减少了2.45±0.46log₁₀个拷贝/mL。于PP群体，在第1剂量组病毒量减少了2.73±0.34log₁₀个拷贝/mL，而在第2剂量组病毒量减少了2.47±0.45log₁₀个拷贝/mL。

在治疗期期间，于所有(n＝29，100.00％)试验受试者观察到≥0.5log₁₀个拷贝/mL的病毒量下降；且于所有(n＝29，100.00％)试验受试者观察到≥1log₁₀个拷贝/mL的病毒量下降。

于以下内容揭露在治疗期期间所获得之数据的进一步评估：

在第1剂量组，于ITT之8/14(57.14％)的受试者和于PP之5/7(71.43％)的受试者具有≤200个拷贝/mL的病毒量；此外，于ITT之3/14(21.43％)的受试者和于PP之3/7(42.86％)的受试者具有<50个拷贝/mL的病毒量。

在第2剂量组，于ITT之10/15(66.67％)的受试者和于PP之7/11(63.64％)的受试者具有≤200个拷贝/mL的病毒量；且于ITT之3/15(20.00％)的受试者和于PP之2/11(18.18％)的受试者具有<50个拷贝/mL的病毒量。

来自第1和2剂量组受试者之代表的病毒量下降数据如表21A至21C和图25A至25D(上图)所示。在每一剂量组之内、每一剂量组之间，或在每一剂量组内的次群体之间，于具有病毒量下降之受试者的比例并无统计上显著的差异。此外，在8周治疗期期间，在第1和2剂量组分别有43％和18％受试者的病毒量减少至低于目前实验检测极限(20个拷贝/mL)的水平。在所有受试者中，当以UB-421完全覆盖CD4+ T细胞时可使病毒量持续下降。在随访期结束时，于两个剂量组的病毒量回复至基线水平。此外，在治疗期期间于任何的试验受试者中未观察到病毒反弹。来自两个剂量组之患者于整个治疗期中未侦测到可计量的抗-UB421抗体(表21A至21C)。

8.6.UB-421和TMB-355的比较

针对由他人(Jacobson，J.L.，et a1.，2009；Toma，J.，et al.，2011；and Pace，C.S.，et al.，2013)所执行TMB-355(ibalizumab，先前称为TNX-355)的相似试验所提供的结果，以评估UB-421于此试验所提供之结果。图26A显示在具有CD4+细胞完全覆盖的UB-421存在下，有高达＞3Log₁₀之优异的病毒量下降而无病毒量反弹。相反地，甚至在CD4+细胞完全覆盖存在下，从治疗起只有一周之后，接受TMB-355治疗的患者便遭遇到病毒反弹，此为抗药性病毒突变种发展的象征(图26B)。

这两种治疗方案的比较，如图所示，证明了利用UB-421治疗HIV感染的受试者具有较TMB-355治疗明显的优势。具体来说，UB-421在整个治疗期中提供了于HIV病毒量的持续性下降，且甚至在进入到随访期的一或两周仍具有＞3log₁₀的最大病毒量下降。相反地，TMB-355藉由第一次投予只提供了暂时性的病毒量下降，以及接近1log₁₀之最大病毒量下降。

此外，使用TMB-355之先前试验发现，尽管血清TMB-355之呈现和CD4阳性T细胞之完全覆盖，HIV病毒反弹仍在进入治疗的一周后发生(Jacobson，J.L.，et al.，2009)。这结果与于上述实施例4之先前预测一致，非竞争型进入抑制机制，如TMB-355(ibalizumab)所介导者，在抗体治疗期期间可提供抗药性HIV突变种发展的高度可能性。实际上，发现来自接受TMB-355治疗以减少病毒量之患者的病毒抗药性突变种于gp120的V5区域上辨别出突变(Toma，J.，et al.，2011；Pace，C.S.，et al.，2013)。

9.结论

发现于无症状HIV-1感染的受试者以UB-421进行8周治疗具有良好的耐受性。此外，分别来自第1和2剂量组对个别受试者之代表的CD4+ T细胞数量(表22A和22B)和平均CD4T细胞数量(图24A和24B)在整个为期两个月的监测中保持稳定。

更重要的是，以UB-421治疗导致在所有受试者中显著的病毒量下降(100％接受治疗的受试者以≥1log₁₀个拷贝/mL之最大下降作出反应)。两种治疗方案，每周10mg/kg(第1剂量组)和每两周25mg/kg(第2剂量组)输注，显示于病毒量下降之类似疗效。在第1剂量组于ITT群体之平均最大病毒量下降达到2.27±0.60log₁₀个拷贝/mL，而在第2剂量组于ITT群体之平均最大病毒量下降达到2.45±0.46log₁₀个拷贝/mL。利用UB-421所观察到的病毒减少疗效比迄今所测试的任何其它的小分子抗HIV药物优越。

从此周密进行之UB-421的多剂量第IIa期所得到的临床试验结果证明在治疗期期间不具有病毒反弹之作为单一药物治疗的高耐受性、安全性，和于病毒量下降之空前的疗效。在这试验中所获得的结果是意想不到的，且与此领域中长期抱持之怀疑(结合CD4结构域1的抗-CD4单克隆抗体是免疫抑制的，因为其对于第二型主要组织相容性复合体所介导之免疫功能的干扰，且此种疗法对于HIV疾病之治疗并不合适(Jacobson，J.L.，et al.，2009))相矛盾。此结果进一步指出利用UB-421合并使用正交的(orthogonal)HAART及/或其它HIV病毒库激活剂(例如HDACi)之HIV疗法的额外形式可达到HIV感染的功能性治愈。

实施例15.利用UB-421单一药物治疗的治疗形式作为于HIV-1感染成年人之抗反转录病毒疗法的替代品

图27说明利用UB-421单一药物治疗对各种HIV患者群体的治疗形式以作为抗反转录病毒疗法的替代品。详细的目的和方案于以下内容所述。

1.适用的患者群体

藉由稳定的高效抗反转录病毒疗法(HAART)而具有病毒抑制之对HIV-1为血清反应阳性的受试者有资格进行此种治疗。

符合资格的患者在4个月的初期透过IV或SC途径接受UB-421投予，之后是HAART治疗的另一个循环。“HAART-UB-421”交替治疗循环可重复多次，直到停用UB-421和HAART治疗时不再观察到病毒反弹为止，从而达成对HIV感染的功能性治愈。

更具体地，这些受试者分别地于为期8周和16周的治疗期，以两个剂量水平(每周10mg/kg或每两周25mg/kg)之一，接受试验药物(UB-421)的多次静脉输注。在第一次UB-421输注的前一天停用HAART治疗。在UB-421投予之前，依照试验总主持人所判断，给予受试者预防用药(治疗前给药)，包含类固醇和抗组织胺药物，以预防输注反应。在完成最后一次排程的UB-421给药后，所有受试者在同一天重启其原先或其它适当之病毒敏感的抗反转录病毒疗法。HAART治疗方案之使用是由试验总主持人所判断。在治疗期期间和在治疗期结束后6个月监测来自所有患者的病毒量和CD4细胞数量。

2.纳入标准

若受试者满足以下所有标准则可纳入此治疗形式：

(1)HIV血清反应阳性；

(2)年龄20岁(含)以上；

(3)已接受HAART治疗，定义为至少2个核苷类/核苷酸类反转录酶抑制剂(NRTIs)加上1个非核苷类反转录酶抑制剂(NNRTI)、整合酶抑制剂，或蛋白酶抑制剂，达至少2年；此治疗在进入本试验之前一年内

是不间断的且无药物更换。

(4)在筛选访视前1年内具有CD4+ T细胞数量≥500个细胞/mm³或CD4百分比≥28％的两个测量值；

(5)在筛选访视前4周内或于筛选访视时所提供具有CD4+ T细胞数量≥500个细胞/mm³；

(6)筛选访视前至少1年之HIV-1血浆RNA保持在低于检测极限，每年具有至少2个病毒量测定。病毒量在筛选访视前4周内或于筛选访视时也是低于检测极限；在筛选访视前4周以前的可检测HIV血浆RNA的单次事件将不排除参与。

3.排除标准

为了以下任何的理由可将受试者排除在此治疗形式之外：

(1)需要立即治疗的任何感染症(HIV除外)；

(2)根据美国疾病控制与预防中心(CDC)对HIV感染分类系统按照第B类和第C类条件之任何先前确诊或现行的AIDS-界定疾病；

(3)体重＞80kg；

(4)在筛选前12周内任何纪录的CD4+ T细胞数量<250个细胞/mm³或CD4+ T细胞百分比≤14％；

(5)先前纳入于UB-421的第I期或第IIa期试验，或呈现抗-UB-421抗体的任何病史；

(6)在试验药物UB-421第一次给药前12周内对单克隆抗体的任何先前暴露；

(7)任何显著疾病(除了HIV-1感染)或临床上显著的发现，包括精神和行为问题，根据筛选、病史及/或生理学检查决定，由试验主持人判定，将受试者排除参加此项试验；

(8)在试验药物第一次给药前8周内的任何疫苗接种；

(9)在试验药物第一次给药前12周内的任何免疫调节治疗(包含干扰素)、全身化疗；

(10)少于12个月的预期余命；

(11)在试验药物第一次给药前12周内的任何非法静脉注射吸毒；

(12)由于病毒学失败和先前的非何杰金氏淋巴瘤或卡波西氏肉瘤之不只一次的HAART治疗方案改变；

(13)任何当前之酒精或非法毒品的使用，由试验主持人判定，会妨碍受试者去遵从投药和访视时程表以及方案评估的能力。

4.药品成品

以浓度为10mg/mL(100mg于10mL药瓶)提供药品成品UB-421(dB4C7mAb)。受试者利用静脉输注接受10mg/kg UB-421的8次每周剂量或25mg/kg UB-421的8次每两周剂量。

UB-421的适当体积是基于特定剂量和受试者体重。使用无菌生理食盐水调整每个个别剂量的体积，藉此利用药物之等量输注体积输注一个剂量组内的每个个别受试者。对10mg/kg剂量组的输注总体积为约100mL，而对25mg/kg剂量组的输注总体积为约200mL。每次给药的输注时间为约一到两小时。

实施例16.利用UB-421合并使用HAART的治疗形式供HIV-1感染的功能性治愈

图28说明利用抗体UB-421合并使用HAART对各种HIV患者群体的治疗形式可供HIV-1感染的功能性治愈。适用的患者群体：(1)未使用治疗药物之HIV患者；(2)HAART治疗稳定的HIV患者；以及(3)HAART治疗失败之HIV患者。

更具体地，于受感染之受试者供HIV功能性治愈的临床方案之达成是藉由在初期(为期4个月)透过IV或SC途径投予UB-421，初期(为期4个月)之后是治疗假日(为期2个月)，其作为在两个完整循环(为期一年)中的一个治疗循环(为期6个月)。这些相同的受试者也在UB-421治疗之两个完整循环的期间开始和持续HAART治疗。在两个完整循环结束时，停用HAART和UB-421(A组(ArmA))以评估发生病毒反弹所需的时间，如果有病毒反弹的话。对照组中，包含在HAART治疗停用之前透过相同的12个月期间单独以HAART治疗的受试者，其也被评估以评定发生病毒反弹的时间，如果有病毒反弹的话(B组(Arm B))。

在同时发生UB-421和HAART治疗的二个循环期间和治疗期后6个月，共计18个月，监测来自所有患者的病毒量及CD4细胞数量。

A组：以HAART治疗合并使用每周10mg/kg或每两周25mg/kg的UB-421投予。B组：单独以HAART治疗。

1.于功能性治愈之UB-421治疗的设计(表23)

UB-421胜过HAART药物的潜在优势：

(1)UB-421可阻断HIV-1病毒的细胞间传播

(2)UB-421交联CD4的类CDR-2环并活化细胞，且因此从潜伏诱导和释放HIV-1

2.目标

(1)利用UB-421合并使用HAART，藉由阻断HIV之无细胞和细胞间传播，以提供HIV感染的受试者有效的治疗和保护。

(2)于HIV感染的受试者提供对HIV的功能性治愈。

3.适用的患者群体

(1)HAART治疗稳定的HIV患者；(2)未使用HAART治疗之HIV患者；以及(3)HAART治疗失败之HIV患者。

4.药品成品UB-421

以浓度为10mg/mL(100mg于10mL药瓶)提供药品成品UB-421(dB4C7mAb)。受试者利用静脉输注接受10mg/kg UB-421的8次每周剂量或25mg/kg UB-421的8次每两周剂量。

UB-421的适当体积是基于特定剂量和受试者体重。使用无菌生理食盐水调整每个个别剂量的体积，藉此利用药物之等量输注体积输注一个剂量组内的每个个别受试者。对10mg/kg剂量组的输注总体积为约100mL，而对25mg/kg剂量组的输注总体积为约200mL。每次给药的输注时间为约一到两小时。

5.分配干预

分配以下的干预措施：

5.1.A组-UB-421和HAART治疗的合并使用

受试者以适当的HAART疗法持续地治疗，并也以持续一年之两个完整循环的UB-421治疗。UB-421治疗的每个循环包括在4个月的期间以每周10mg/kg UB-421投予或以每两周25mg/kgUB-421投予，之后接续无UB-421治疗的两个月。

在1年的治疗期结束后，停用HAART和UB-421治疗。进行额外的观察试验(藉由于缺乏HAART和UB-421状况下未见任何病毒反弹)以确保HIV感染的功能性治愈。

5.2.B组-单独以HAART治疗

作为对照组，于同样期间内利用适当的HAART疗法而未以UB-421治疗用以持续地治疗一组个别的受试者。

在1年的治疗期结束后，停用HAART治疗并针对病毒反弹对受试者进行监测。

所有说明书中所揭示之发明技术特点可以任意方式组合。说明书中揭示之每一技术特点可以提供相同、等同或相似目的之其它方式替换。因此，除非另有特别说明，文中所有揭示之特点均只是等同或相似特点之一般系列之实例。

由上述可知，熟习此技艺者能轻易地了解本发明之必要特征，在不脱离其精神与范围之下能就本发明做许多改变与调整以应用于不同用途与条件。

表1.在HIV治疗上未满足的医疗需求：功能性治愈和根除

表2.目前发展中供HIV感染静默T细胞之再活化的HDAC抑制剂的列表

表3.单克隆抗体B4的HIV进入抑制活性(Monogram生物科学PhenoSense^TM试验)

表4.来自鼠源抗体B4重链和轻链序列的相对应CDR 1、2、3序列

表5.相较于亲本B4之去免疫化B4(dB4C7)的中和活性(MT-2微斑试验)

表6.相较于亲本B4之去免疫化B4(dB4C7)的中和活性(PBMC试验)

表8.dB4C7对HPB-ALL细胞之结合亲和力(EC₅₀)

表9.dB4C7对HPB-ALL细胞之绝对结合亲和力(Kd)和最大结合容量(Bmax)

表10.利用(1)山羊抗-huIgG-FITC和(2)dB4C7-Alexa结合至血液CD4+ T细胞所测得之dB4C7的结合活性(EC₅₀)

表11.单克隆抗体B4阻断HIV的无细胞和细胞间传播

表12.利用FACS分析的顺序性染色-阳性PBMC百分比

表13.于PBMC培养物的TNF-α水平和HIV-1病毒量

ND：低于检测极限

表14A.试验A：于狒狒的单次投予临床前试验

表14B.试验B：于狒狒的多次投予临床前试验

¹为期8周每周投予

²剂量：mg(UB-421)/kg(体重)

表15.于狒狒的血液和活检结果

表16.于狒狒的观察和尸体剖检结果

表17.UB-421的临床前概述：于狒狒的IND-Enabling毒理试验

表18.利用生物素化的mAb dB4C7评估组织的交叉反应性

¹观察到强阳性表面膜染色

²与未标帜的mAb dB4C7预培养可阻断染色

³观察到弱阳性

⁴观察到偶而阳性的染色

⁵局部微弱的库氏细胞染色

表19.关于在第I期试验单一剂量UB-421的PK参数

¹结果为来自3个受试者的平均值

表20.在第IIa期试验于多次投予UB-421后的病毒量下降

ITT：意图治疗群体(Intent-to-Treat Population)

PP：依方案执行临床试验的群体(Per-Protocol Population)

VL：病毒量(Viral Load)

表21A.第IIa期临床疗效数据显示病毒量减少至低于检测极限：患者1-1-01(第1剂量组：每周10mg/kg)

NQ：无法定量

斜线：未评估

表21B.第IIa期临床疗效数据显示病毒量减少至低于检测极限：患者1-1-02(第1剂量组：每周10mg/kg)

NQ：无法定量

斜线：未评估

表21C.第IIa期临床疗效数据显示病毒量减少至低于检测极限：患者1-2-03(第2剂量组：每两周25mg/kg)

NQ：无法定量

斜线：未评估

表22A.第1剂量组UB-421治疗之患者的平均CD4 T细胞数量(每周10mg/kg)

表22B.第2剂量组UB-421治疗之患者的平均CD4 T细胞数量(每两周25mg/kg)

表23.于功能治愈之UB-421治疗的设计

【序列表】

<110>美国联合生物医学公司(United Biomedical, Inc.)

王长怡

<120>藉由针对CD4之单克隆抗体介导竞争型HIV进入抑制之HIV感染的治疗和功能性治愈

<130> 1004263.213WO (2034WO)

<150>US 62/051,200

<151> 2014-09-16

<150>PCT/US2014/065048

<151> 2014-11-11

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213>鼠源抗体

<220>

<221>结构域

<222> (1)..(5)

<223>鼠源抗体B4之重链的CDR1

<400> 1

Asp Tyr Val Ile His

1 5

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213>鼠源抗体

<220>

<221>结构域

<222> (1)..(17)

<223>鼠源抗体B4之重链的CDR2

<400> 2

Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Ala Tyr Ser Asn Ala Lys Phe Lys

1 5 10 15

Asp

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213>鼠源抗体

<220>

<221>结构域

<222> (1)..(9)

<223>鼠源抗体B4之重链的CDR3

<400> 3

Arg Gly Asn Gly Thr Gly Phe Ala Tyr

1 5

<210> 4

<211> 15

<212> PRT

<213>鼠源抗体

<220>

<221>结构域

<222> (1)..(15)

<223>鼠源抗体B4之轻链的CDR1

<400> 4

Lys Ala Gly Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn

1 5 10 15

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213>鼠源抗体

<220>

<221>结构域

<222> (1)..(7)

<223>鼠源抗体B4之轻链的CDR2

<400> 5

Val Ala Ser Asn Leu Glu Ser

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213>鼠源抗体

<220>

<221>结构域

<222> (1)..(9)

<223>鼠源抗体B4之轻链的CDR3

<400> 6

Gln Gln Ser Tyr Lys Asp Pro Leu Thr

1 5

<210> 7

<211> 448

<212> PRT

<213>鼠源抗体

<220>

<221>结构域

<222> (1)..(448)

<223>具有与衍生自来自亲本鼠源B4抗体重链序列相对应之CDRs1、2、3的相似CDRs1、2、3的去免疫化人类抗体B4[UB421]的重链

<400> 7

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Val Ile His Trp Val Lys Gln Ala Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Ala Tyr Ser Asn Ala Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Gly Asn Gly Thr Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

210 215 220

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr His Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 8

<211> 218

<212> PRT

<213>鼠源抗体

<220>

<221>结构域

<222> (1)..(218)

<223>具有与衍生自来自亲本鼠源B4抗体轻链序列相对应之CDRs1、2、3的相似CDRs1、2、3的去免疫化人类抗体B4[UB421]的轻链

<400> 8

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Lys Ala Gly Gln Ser Val Asp Tyr Asp

20 25 30

Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Val Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Asn Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr

85 90 95

Lys Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Leu Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 9

<211> 448

<212> PRT

<213>鼠源抗体

<220>

<221>结构域

<222> (1)..(448)

<223>具有M253Y/S255T/T257E取代之去免疫化人类抗体B4[UB421]的重链

<400> 9

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Val Ile His Trp Val Lys Gln Ala Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Ala Tyr Ser Asn Ala Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Gly Asn Gly Thr Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

210 215 220

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg

245 250 255

Glu Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr His Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 10

<211> 448

<212> PRT

<213>人源化抗体

<220>

<221>尚未归类的特征

<222> (253)..(253)

<223>M或Y

<220>

<221>尚未归类的特征

<222> (255)..(255)

<223>S或T

<220>

<221>尚未归类的特征

<222> (257)..(257)

<223>T或E

<220>

<221>尚未归类的特征

<222> (298)..(298)

<223>N或H

<400> 10

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Val Ile His Trp Val Lys Gln Ala Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Ala Tyr Ser Asn Ala Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Gly Asn Gly Thr Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

210 215 220

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Xaa Ile Xaa Arg

245 250 255

Xaa Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Xaa Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 11

<211> 118

<212> PRT

<213>鼠源抗体

<400> 11

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Val Ile His Trp Val Lys Gln Ala Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Ala Tyr Ser Asn Ala Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Gly Asn Gly Thr Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 12

<211> 330

<212> PRT

<213>人类抗体

<220>

<221>尚未归类的特征

<222> (135)..(135)

<223>M或Y

<220>

<221>尚未归类的特征

<222> (137)..(137)

<223>S或T

<220>

<221>尚未归类的特征

<222> (139)..(139)

<223>T或E

<220>

<221>尚未归类的特征

<222> (180)..(180)

<223>N或H

<400> 12

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Xaa Ile Xaa Arg Xaa Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Xaa Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 13

<211> 111

<212> PRT

<213>鼠源抗体

<400> 13

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Lys Ala Gly Gln Ser Val Asp Tyr Asp

20 25 30

Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Val Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Asn Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr

85 90 95

Lys Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 14

<211> 107

<212> PRT

<213>人类抗体

<400> 14

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Leu Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

Claims (30)

1.一种治疗暴露于人类免疫缺陷病毒(HIV)之受试者的方法，包含：

投予该受试者针对CD4结构域1之抗体的药理学上有效剂量。

2.如权利要求1所述之方法，其中该抗体特异性地结合位于CD4结构域1的CDR2区域。

3.如权利要求2所述之方法，其中该抗体为单克隆抗体、多克隆抗体，或其组合。

4.如权利要求2所述之方法，其中该抗体为人源化单克隆抗体。

5.如权利要求4所述之方法，其中该人源化单克隆抗体包含：

重链氨基酸序列，其包含：

SEQ ID NO:1的CDR1、

SEQ ID NO:2的CDR2，以及

SEQ ID NO:3的CDR3；以及

轻链氨基酸序列，其包含：

SEQ ID NO:4的CDR1、

SEQ ID NO:5的CDR2，以及

SEQ ID NO:6的CDR3。

6.如权利要求4所述之方法，其中该人源化单克隆抗体包含：

包含SEQ ID NO:11之氨基酸序列的重链；以及

包含SEQ ID NO:13之氨基酸序列的轻链。

7.如权利要求4所述之方法，其中该人源化单克隆抗体包含：

包含SEQ ID NO:10之氨基酸序列的重链；以及

包含SEQ ID NO:8之氨基酸序列的轻链。

8.如权利要求7所述之方法，其中该重链包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。

9.如权利要求8所述之方法，其中该人源化抗体是于暴露于HIV前投予该受试者。

10.如权利要求8所述之方法，其中该人源化抗体是于暴露于HIV后投予该受试者。

11.如权利要求10所述之方法，其中该人源化抗体是于暴露于HIV后48小时内投予。

12.如权利要求8所述之方法，其中该人源化抗体是以至少约5mg/kg体重之剂量投予该受试者。

13.如权利要求12所述之方法，其中该人源化抗体是以多次投予该受试者。

14.如权利要求13所述之方法，其中该人源化抗体是以每周或每两周之间隔投予该受试者。

15.如权利要求13所述之方法，更包含投予该受试者抗病毒药物。

16.如权利要求15所述之方法，其中该抗病毒药物为高效抗反转录病毒疗法(HAART)。

17.如权利要求16所述之方法，其中该HAART包含核苷类似物反转录酶抑制剂合并使用蛋白酶抑制剂或非核苷类反转录酶抑制剂。

18.如权利要求16所述之方法，其中该人源化抗体是与HAART同时投予。

19.如权利要求16所述之方法，其中在循环之期间内投予该受试者该人源化抗体和HAART，其中该循环包含：

i)以每周或每两周之间隔于4个月之期间对该受试者投予该人源化抗体，之后为两个月之治疗假日；以及

ii)于(i)内之该六个月期间持续地对该受试者投予HAART。

20.如权利要求18所述之方法，其中该受试者以二个循环之期间治疗。

21.一种治疗HIV感染之受试者的方法，包含投予该受试者治疗方案，包含：

a)针对CD4结构域1之抗体的药理学上有效剂量；以及

b)高效抗反转录病毒疗法(HAART)。

22.如权利要求21所述之方法，其中该抗体特异性地结合位于CD4结构域1的CDR2区域。

23.如权利要求22所述之方法，其中该抗体为单克隆抗体、多克隆抗体，或其组合。

24.如权利要求22所述之方法，其中该抗体为人源化单克隆抗体。

25.如权利要求24所述之方法，其中该人源化单克隆抗体包含︰

重链氨基酸序列，其包含︰

SEQ ID NO:1的CDR1、

SEQ ID NO:2的CDR2，以及

SEQ ID NO:3的CDR3；以及

轻链氨基酸序列，其包含︰

SEQ ID NO:4的CDR1、

SEQ ID NO:5的CDR2，以及

SEQ ID NO:6的CDR3。

26.如权利要求24所述之方法，其中该人源化单克隆抗体包含︰

包含SEQ ID NO:11之氨基酸序列的重链；以及

包含SEQ ID NO:13之氨基酸序列的轻链。

27.如权利要求24所述之方法，其中该人源化单克隆抗体包含︰

包含SEQ ID NO:10之氨基酸序列的重链；以及

包含SEQ ID NO:8之氨基酸序列的轻链。

28.如权利要求27所述之方法，其中该人源化抗体是以至少约5mg/kg体重之剂量投予该受试者。

29.如权利要求21所述之方法，其中在循环之期间内投予该受试者该治疗方案，其中该循环包含：

i)以每周或每两周之间隔于4个月之期间对该受试者投予该人源化抗体，之后为两个月之治疗假日；以及

ii)于(i)内之该六个月期间持续地对该受试者投予HAART。

30.如权利要求18所述之方法，其中该受试者以二个循环之期间治疗。