TWI695720B - 藉由針對ｃｄ４之單株抗體調停競爭型ｈｉｖ進入抑制之ｈｉｖ感染的治療和功能性治癒 - Google Patents

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Abstract

本發明有關於用以預防、治療，及/或功能性治癒HIV感染的組成物和方法。本發明之一範疇是關於針對CD4之單株抗體、其組成物，以及使用此組成物以預防、治療，和功能性治癒HIV感染的方法。

Description

藉由針對CD4之單株抗體調停競爭型HIV進入抑制之HIV感染的治療和功能性治癒
本發明是關於針對CD4之單株抗體調停競爭型HIV進入抑制、其組成物，以及使用此組成物治療和功能性治癒HIV感染的方法。
後天免疫缺乏症候群(Acquired Immune Deficiency Syndrome,AIDS)是一種由人類免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus,HIV)所引起之人類免疫系統的疾病(http：//en.wikipedia.org/wiki/HIV/AIDS)。基因研究指出HIV於十九世紀晚期或二十世紀早期起源於非洲中西部。AIDS最早是於1981年由美國疾病控制與預防中心所辨識，且其原因，HIV，在1980年代初被鑑別。由於疫情的開始，已有超過70萬人感染HIV，且已有35萬人死於AIDS。在全球，截至2011年底已有34.0萬人感染HIV(http：//www.who.int/gho/hiv/en/)。
HIV感染逐漸地降低免疫系統的效力，且使個體容易受到伺機性感染和產生腫瘤。HIV可透過黏膜或是 具有含有HIV之體液(例如血液、精液、陰道液、射精前液體和母乳)的血液直接接觸而傳播。這種傳播可涉及肛門、陰道或口交、輸血、受污染的注射針頭、母親與嬰兒於懷孕、分娩或母乳餵養期間之交流，或是於上述之一體液中其他方式的暴露。
30年來，科學家們認為AIDS是由“製造病 毒”的CD4 T細胞所引起，而非靜默T細胞。但是這些“製造病毒”的受感染的細胞並不足以去解釋於發展AIDS之患者體中T細胞的大量耗竭。Greene和其同僚指出95%的靜默淋巴CD4 T細胞是死於細胞焦亡(pyroptosis)，而其是由失敗的病毒感染所引發(Doitsh,G.et al.2014)。此些細胞具有細胞質病毒DNA，但不像變成病毒-複製單位的T細胞，這些“HIV感染的”靜默T細胞被涉及前發炎性細胞激素釋放之計畫性細胞死亡(細胞焦亡)的高度炎症形式所自毀。此細胞蛋白，γ干擾素誘導蛋白16(interferon-gamma-inducible protein 16,IFI16)，可辨認病毒DNA並於T細胞引發一連串反應(包含調停細胞焦亡之caspase-1酵素活化，且造成細胞腫脹、細胞膜通透性和細胞質內容物洩漏)。靜默T細胞的自毀無益於殺死病毒。此過程最終導致HIV致病機轉以推進病程至AIDS。
現行用以延遲AIDS發生之HIV感染的治療是 由高效抗反轉錄病毒療法或HAART(highly active antiretroviral therapy)組成，以防止病毒複製。現行優選的HAART包含聯合療法(或“雞尾酒”)，其由屬於至少兩種 類抗反轉錄病毒藥物中的至少三個藥物所組成(聯合抗反轉錄病毒治療(Combination antiretroviral therapy,cART))。典型治療方案包含兩個核苷類似物反轉錄酶抑制劑(NARTIs或NRTIs)加上一個蛋白酶抑制劑或非核苷類反轉錄酶抑制劑(NNRTI)。
在已開發國家，當決定要何時推薦開始 HAART治療時，醫生會評估病毒量、CD4 T細胞數量、CD4陽性細胞減少速度和患者準備就緒。一般來說，會建議對CD4 T細胞數量下降至每毫升血液200-250細胞之無症狀的患者進行治療。然而，越早開始治療(於CD4水平為350cells/microliter下)可顯著地減少AIDS的風險和死亡。
在沒有治療的狀況下，評估感染HIV後之淨存 活期中位數為9至11年，此取決於HIV亞型；且AIDS診斷後之平均存活率範圍介於6至19個月。在廣泛使用HAART治療的地區，此疾病的死亡率減少了80%，其轉而增加新確診HIV感染患者的預期壽命至約20年。
HAART的標準目標包括患者生活品質的改 善、併發症的減少，以及將HIV病毒血症減少至低於檢測極限。
然而，HAART治療存在多種問題。首先，其 無法治癒HIV感染的患者，一旦停止治療也無法避免大多數“HAART抗藥性”的HIV回復至高血液水平。第二，HAART具有包含倦怠、無力、腹瀉、頭痛、噁心和嘔吐之討人厭的副作用。從長期來看，HIV感染的患者可能經歷 神經認知障礙症、骨質疏鬆症、神經病變、癌症、腎病和心血管疾病。儘管較新的抗反轉錄病毒藥物比較舊的藥物具有較少的副作用，終生使用仍然會造成不良的結果。無法規則服藥意謂HIV反彈、抗藥性和疾病進程。第三，就達到超過50%以上患者而言，HAART之表現遠較理想結果差，此乃因為藥物不耐症、過去無效的抗病毒治療，以及HIV之抗藥性病毒株的感染。
越來越多研究人員研究如何治癒HIV感染，或 至少達成無抗反轉錄病毒藥物治療下之長期或永久緩解。
兩種治療策略，消除性(即根除)和功能性治癒 為針對HIV感染之現行研究(如表1所示)。消除性治癒方法目的是消除所有HIV感染的細胞，由體內完全地清除HIV，且定義為其可減少病毒量至每毫升血液低於1copy。 功能性治癒目的是HIV的緩解狀態與長期控制，包含於無抗反轉錄病毒療法下的低病毒量，其於永久或延長的期間內可減少病毒量至每毫升血液低於50copies。
“消除性治癒”現行唯一的例子是來自一名 感染HIV男子的案例研究，此人被暱稱為“柏林患者”，其罹患急性骨髓性白血病，且接受來自具有CCR5基因之突變或不同形式的捐贈者的骨髓移植。於停止治療45個月後，醫生已無法於其體內偵測到HIV。然而，採用具有CCR5突變之捐贈者的骨髓移植策略並非可行的HIV治癒方法，此策略帶來毒性和治療的複雜性。可於精英的控制者發現“功能性治癒”之自然案例。精英的控制者是指感染HIV 的個體，其免疫系統可自然地控制病毒而無須使用抗反轉錄病毒藥物。此個體成功地維持穩定的CD4(白血球)細胞數量、低或低於檢測極限的病毒量，以及於其細胞中顯著較低量之“潛伏的HIV”。
事實上，治癒的主要障礙是“潛伏HIV病毒 庫”之存在，其潛伏在免疫系統的細胞(例如記憶細胞)內，於抗反轉錄病毒藥物治療期間具有長的壽命，而此種治療可藉由阻斷複製作用而作用於活躍的病毒感染而非潛伏的HIV。然而，若停用此種抗反轉錄病毒藥物治療，潛伏的HIV可能會被活化，以更新HIV感染的過程。
針對此些“有問題的”潛伏HIV病毒庫的現 行策略包含致力於HAART治療下透過病毒表現之活化以耗竭潛伏病毒庫，以滅絕感染的細胞，只留下未受感染的細胞。有一群活化劑為組蛋白脫乙醯酶(Histone deacetylase,HDAC)抑制劑(請參見表2)。目前，以HDAC抑制劑作為情緒穩定劑、抗癲癇藥物和抗癌治療之使用。HDAC抑制劑之長期影響在於提高惡性腫瘤及/或致癌基因再活化的風險，此仍為主要問題。如果以聯合抗反轉錄病毒治療(cART)可完全地抑制活躍的病毒複製，則此策略可行。到目前為止，這些努力尚未能達成長期的病毒抑制或功能性治癒。
於HIV感染之人體用以限制或減少潛伏HIV 病毒庫大小的兩個計劃涉及(1)加強治療(藉由對患者治療方案加入新的ART藥物)，以及(2)早期治療(藉由感染後立即地開始ART)。多個試驗結果顯示，當於HIV感染的早期 急性期而非慢性晚期開始cART，HIV感染細胞的數量可顯著地下降。
總之，對用於HIV治療之有效和安全的藥物具 有高度需求(不論是提供作為單獨使用或是作為對cART的輔助使用)，此些藥物(1)於無細胞(cell-free)和細胞間(cell-to-cell)傳播模式中均可阻斷HIV進入，顯著地減少活化或靜默CD4 T細胞(包含那些長壽的記憶T細胞)之HIV感染；(2)特異性地再活化HIV感染的靜默CD4 T細胞以釋出HIV，導致潛伏感染細胞的細胞凋亡；及/或(3)當抗原/細胞激素刺激時抑制HIV感染的靜默CD4 T細胞活化/發炎，此種活化發生之時可引起細胞焦亡和正常CD4陽性T細胞的大量耗竭，因而導致AIDS。對HIV感染之功能性或消除性治癒之一致努力以導致後續無cART下之長期或永久緩解，此為全球公共衛生的重要議題，並正於世界各地積極地探究中，且如果可行，此將在HIV感染治療方面實現突破性重大變革。
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本發明是針對用以預防、治療，及/或功能性治癒HIV感染的組成物和方法。本發明之一範疇是關於針對CD4之單株抗體、其組成物，以及使用此組成物以預防、治療，和功能性治癒HIV感染的方法。
本發明之一範疇是關於針對CD4之抗體、其組成物，以及使用此組成物以預防、治療，及/或功能性治癒HIV感染的方法。在某些實施例中，此抗體可特異性地結合位於CD4功能區塊1的CDR2區域。於無細胞和細胞間的系統中，本發明抗體透過其結合至CD4的功能區塊1而展現有效的競爭型HIV進入抑制。本發明之抗體也可抑制抗原引起的T細胞增生和CD4陽性T細胞的細胞激素製造(IL2和IFN-gamma)，其涉及細胞焦亡的致病循環。本發明抗體也具有再活化靜默CD4陽性T細胞的能力。此特性對靜默T細胞中潛伏HIV病毒庫的再活化特別有用，可使這些細胞對抗反轉錄病毒藥物治療敏感。為了釋放HIV，此種對CD4高親和力之抗體可活化靜默的HIV感染細胞。HIV感染靜默CD4+ T細胞的再活化允許於HIV感染患者使用合併本發明抗體與HAART的合併治療，以達成功能性治癒。
本發明是針對用以治療、預防，和功能性治癒HIV感染的方法。在某些實施例中，此劑型包含針對CD4之抗體。本發明也包含可用於治療、預防，和功能性治癒HIV感染之方法的抗病毒藥物。
在某些實施例中，本發明是關於包含具有上述 結合特徵之單株人類、擬人化或嵌合，抗-CD4抗體的醫藥組成物，當以每週或每兩週之時程表以約10mg/kg或更高之劑量投予作為單一藥物治療時，此種治療可使接受治療之受試者的病毒量減少至低於檢測極限，且只要血清抗體水平高於10μg/mL即無病毒量反彈。
在其他實施例中，本發明是關於包含具有上述 結合特徵之單株擬人化抗-CD4抗體的醫藥組成物，其可作為偕同HAART之輔助治療的關鍵成份，當以每週或每兩週之時程表以約10mg/kg或更高之劑量投予未使用治療藥物之HIV患者，將達成患者的功能性治癒。
第1圖係競爭型與非競爭型HIV進入抑制機制。第1A圖係顯示於競爭型HIV進入抑制模型中所提供理論結果的曲線圖，在此，HIV外套膜蛋白gp120和抑制劑(例如抗體藥物)競爭結合於一個共同目標表面分子上的相同位置(即CD4功能區塊1的CDR2)。在此模型中，當此抑制劑濃度達到某個閥值時可達成HIV結合/進入的100%抑制。相較之下，第1B圖係顯示於非競爭型HIV進入抑制模型中所提供理論結果的曲線圖，在此，HIV和抑制劑結合至位於相同目標分子上的不同位置(例如CD4的功能區塊2對於TMB-355)。在此非競爭型抑制模型中，抑制劑可減少HIV結合/進入，但不論抑制劑之濃度為何都無法達成完全抑 制。不論藥物濃度為何，作為於%抑制之“高原”反映了HIV對抗體藥物的抗藥性。
第2圖係來自利用TMB-355對一組涵蓋11個進化支的118種不同HIV-1 Env假型病毒株的HIV進入抑制的結果(Pace,G.,et al.,2011)。對每一種病毒而言，黑線是指當以濃度達到10μg/mL之TMB-355處理時的最大抑制百分比(MPI)(請參見左邊的Y軸)；且灰線是指相對應的IC50(請參見右邊的Y軸)。TMB-355以
Figure 104130548-A0101-12-0012-61
50%抑制中和了92%的病毒株，且以
Figure 104130548-A0101-12-0012-62
95%抑制只中和了31%的病毒株。
第3圖係來自利用mAb B4對在10年間所收集的一組超過850種Env假型HIV病毒株的HIV進入抑制的結果。 MAb B4於HIV進入抑制提供了廣泛性與效力，其於所有850種Env假型病毒株具有接近100%最大抑制百分比(MPI)，且具有兩個IC50濃度(一個是介於0.01至1μg/mL，且第二個是約10μg/mL)。
第4圖係mAb dB4C7抗體Fv區域之重鏈的完整胺基酸序列(SEQ ID NO：7)，其於UB-421中使用。代表衍生自其親本鼠源B4抗體之相對應CDR1、2和3區域的序列在下方劃有底線(表4，SEQ ID NOs：1至3)。變異區和恆定區分別以淺灰色和深灰色陰影表示(分別為SEQ ID NOs：11和12)。以重鏈上位於第101個胺基酸殘基Asn(N)作為N-醣化點，此對於其Fv區域位置具有獨特性，對B4抗體結合具有重要性。為了取代的人類IgG1之Fc區域序列，位於第298個胺基酸殘基Asn(N)的N-醣化點乃利用胺基酸 His(H)取代而加以移除(即N298H)。發現此突變可於抗體B4存在下消除IgG調停的補體依賴型細胞毒殺作用(complement dependent cytotoxicity,CdC)和CD4陽性T細胞的耗竭。
第5圖係dB4C7抗體Fv區域之輕鏈的完整胺基酸序列(SEQ ID NO：8)，其於UB-421中使用。代表衍生自其親本鼠源B4抗體之相對應CDR1、2和3區域的序列在下方劃有底線(表4，SEQ ID NOs：4至6)。變異區和恆定區分別以淺灰色和深灰色陰影表示(分別為SEQ ID NOs：13和14)。
第6圖係經進一步改進之擬人化抗體之重鏈的完整胺基酸序列(SEQ ID NO：9)，因為對位於重鏈位置第253、255和257個胺基酸的Fc區域分別地將Met(M)取代為Tyr(Y)(即M253Y)、將Ser(S)取代為Thr(T)(即S255T)、以及將Thr(T)取代為Glu(E)(即T257E)，以使此抗體具有更長的半衰期。
第7圖係擬人化抗體mAb dB4之重鏈的完整胺基酸序列(SEQ ID NO：10)，其包含於第4和6圖中所討論的變異胺基酸。
第8圖係顯示在對細胞經過三次抗體繼代後mAb B4對位於HPB-ALL細胞之表面CD4的結合親和力(抗體濃度)和結合容量(游離和結合的抗體)的曲線圖。
第9圖係mAb B4(---)和mAb dB4(-)對塗覆於ELISA微量盤上之可溶性CD4(sCD4)和p2704a胜肽捕獲混合物 之結合親和力的曲線圖比較。分別地利用mAb B4和mAb dB4去競爭地抑制B4-biotin和dB4C7-Alexa結合至捕獲混合物而加以測定結合親和力。
第10圖係mAb B4(---)和mAb dB4(-)對位於HPB-ALL細胞上CD4之結合親和力的曲線圖比較。結合親和力是以FACS加以測定，分別地利用mAb B4和mAb dB4去競爭地抑制B4-biotin和dB4C7-Alexa結合至位於HPB-ALL細胞上的表面CD4。
第11圖係mAb dB4(---)和gp120MN(-)對位於HPB-ALL細胞上CD4之結合親和力的曲線圖比較。結合親和力是以FACS加以測定，利用mAb dB4和gp120MN去競爭地抑制dB4C7-Alexa結合至位於HPB-ALL細胞上的表面CD4。
第12圖係顯示mAb dB4C7對PBMC CD4+ T細胞之溫度倚賴性結合(MFI)的曲線圖。
第13圖係顯示來自6位未受感染個體血液樣品之未被佔據的CD4受體(-)和以mAb dB4佔據/結合之CD4受體(---)的平均百分比(±標準差)，並作為mAb dB4濃度之函數的曲線圖。利用dB4C7-Alexa結合至位於血液CD4+ T細胞表面之未被佔據的結合位以偵測未被佔據的受體。然而mAb dB4佔據之受體是利用山羊抗-huIgG-FITC加以偵測。
第14圖係顯示現行抗反轉錄病毒治療(cART)藥物Tenofovir於HIV無細胞和細胞間傳播上之效果的長條圖(Sigal,A.,et al.,2011)。Y軸代表來自於存在或缺乏 tenofovir狀況下由不同感染源所分離之周邊血液單核球細胞(PBMCs)的傳播指數(Sigal,A.et al.,2011)。
第15圖係顯示藉由以下刺激所引發於靜默PBMCs之病毒再活化的長條圖(其乃利用HIV-1 p24 gag製造加以測量)，刺激種類包含未受刺激(第1長條)、植物凝集素(PHA)(第2長條)、不活化的HIV(iHIV)溶胞產物(第3長條)、針對CD4功能區塊1之CDR2區域的單株抗體(第4長條)、針對CD4功能區塊1之CDR3區域的單株抗體(第5長條)、針對CD4功能區塊1/2的單株抗體(第6長條)、可溶性CD4存在下之iHIV(第7長條)、可溶性CD4存在下針對CD4功能區塊1之CDR2區域的單株抗體(第8長條)、可溶性CD4存在下針對CD4功能區塊1之CDR3區域的單株抗體(第9長條)，以及可溶性CD4存在下針對CD4功能區塊1/2的單株抗體(第10長條)，如附圖說明所示(改編自Briant L.,et al.,1999)。
第16圖係顯示利用抗-HIV RC多株抗體對生物素化-B4結合至rsCD4之競爭型抑制的圖式，其藉由ELISA加以測量。
第17圖係顯示mAb dB4和抗-HIV RC多株抗體對位在PBMCs上之表面CD4的抗體效價測定圖式。抗體效價測定為% CD4結合對抗體濃度(μg/mL)。
第18A圖至第18G圖係顯示於未使用治療藥物之HIV陽性和HIV陰性受試者以mAb dB4和抗-HIV RC多株抗體對由超抗原SEB所引起增生CD4+和CD8+ T細胞之細胞激 素IL2和IFN-γ製造抑制的分析。對HIV陰性(第18A圖)和HIV陽性(第18B圖)受試者，mAb dB4和抗-HIV RC多株抗體對由超抗原所引起增生CD4+ T細胞之IL2製造的抑制如圖所示。對HIV陰性受試者和年齡一致的HIV陽性受試者(第18C圖)，mAb dB4和抗-HIV RC多株抗體對由超抗原所引起增生CD8+ T細胞之IL2製造的抑制也如圖所示。對HIV陰性(第18D圖)和HIV陽性(第18E圖)受試者，mAb dB4和抗-HIV RC多株抗體對由超抗原所引起增生CD4+ T細胞之IFN-γ製造的抑制如圖所示。對HIV陰性(第18F圖)和HIV陽性(第18G圖)受試者，mAb dB4和抗-HIV RC多株抗體對由超抗原所引起增生CD8+ T細胞之IFN-γ製造的抑制如圖所示。
第19A圖至第19C圖係顯示藉由對於HIV-1原代分離株DH12(HIV-1DH12)暴露前(第19A圖)和暴露後(第19B圖)投予mAb B4以保護黑猩猩免於HIV感染的圖式，其藉由於感染後一段時間測定在PBMCs中的HIV-1 RNA copies/mL而加以評估。暴露於HIV-1DH12而未投予抗體之控制組動物的結果圖式(第19C圖)如圖所示。向下箭頭標記試驗開始，此時mAb B4是於HIV-1DH12攻毒前或後一小時投予。
第20A圖和第20B圖係顯示未接受治療和以mAb B4治療之HIV-1感染黑猩猩的HIV病毒量的圖式，其藉由隨時間測定的HIV-1 RNA copies/mL而加以評估。第20A圖係比較於黑猩猩X356(接受三次mAb B4輸注(實心圓))與未接受治療的控制組黑猩猩X084(在之前試驗中先前接受 mAb B4的單一劑量(空心圓))之血漿病毒血症的持續時間。
第20B圖係比較於黑猩猩X356(接受三次mAb B4輸注(實心圓))與未接受治療的控制組黑猩猩X259(未接受mAb B4之先前用藥劑量(空心圓))之血漿病毒血症的持續時間。
第21圖係mAb dB4對人類(---)和狒狒(-)CD4陽性T細胞之結合親和力的曲線圖比較。
第22A圖和第22B圖係顯示對在藥物增量(1、5、10和25mg/kg)之第I期臨床試驗中接受抗體藥物UB-421(mAb dB4C7)單次投予的患者於HIV-1 RNA的平均Log10變化對試驗天數的圖式。第22A圖係顯示在本試驗期間每一劑量所展現之病毒減少的圖式。第22B圖係顯示對每一劑量之平均和最大個別最低點的圖式。
第23A圖至第23C圖係顯示UB-421(mAb dB4C7)之療效和先前報導之TMB-355(TMB-355先前稱為TNX-355；Kuritzkes,D.R.,et al.,2004，第1圖)療效數據的理論比較圖式。第23A圖係顯示以5mg/kg之UB-421和3mg/kg之TMB-355單次投予後所觀察之病毒量下降的圖式比較。第23B圖係顯示以10mg/kg之UB-421或TMB-355單次投予後所觀察之病毒量下降的圖式比較。第23C圖係顯示以25mg/kg之UB-421或TMB-355單次投予後所觀察之病毒量下降的圖式比較。
第24A圖和第24B圖係顯示於為期8週治療期期間在接受每週10mg/kg(第24A圖)或每兩週25mg/kg(第24B圖)UB-421(mAb dB4C7)投予之受試者的平均PBMC CD4 T細 胞數量/mm3的圖式。可藉由針對CD4功能區塊2之生物素化抗體測得於UB-421治療的患者中穩定的CD4 T細胞數量。
第25A圖至第25D圖係顯示在第IIa期臨床試驗期間UB-421治療之臨床療效的圖式，如利用病毒量減少(上圖)和UB-421的藥物動力學(如以μg/mL血清濃度加以測定(下圖))所測定。提供了用於以下代表性患者的相關數據：接受每週10mg/kg UB-421投予的患者1-1-01(第25A圖)；接受每週10mg/kg UB-421投予的患者1-1-02(第25B圖)；接受每兩週25mg/kg UB-421投予的患者1-2-03(第25C圖)；以及接受每兩週25mg/kg UB-421投予的患者1-2-06(第25D圖)。以整個塗滿灰色陰影之區間代表UB-421結合於PBMC CD4+細胞上的持續期間。
第26A圖和第26B圖係顯示於使用UB-421之第IIa期臨床試驗所觀察之病毒量減少對照於由他人所作之TMB-355(ibalizumab，先前稱為TNX-355)類似試驗(Jacobson,J.L.,et al.,2009；Toma,J.,et al.,2011；and Pace,C.S.,et al.,2013)所觀察之病毒量減少的理論比較圖式。第26A圖概述於以10mg/kg和25mg/kg UB-421治療之受試者所觀察的病毒量變化，而第26B圖概述於以相同劑量水平TMB-355治療之受試者所觀察的病毒量變化。
第27圖係顯示於HIV患者群體的治療形式示意圖，此HIV患者群體是於未使用治療藥物之HIV患者和HAART治療穩定之HIV患者使用UB-421單一藥物治療以替代 HAART治療。
第28圖係顯示於HIV患者群體的治療形式示意圖，其利用UB-421合併使用HAART治療以於未使用治療藥物之HIV患者、HAART治療穩定之HIV患者，和HAART治療失敗之HIV患者達成HIV感染的功能性治癒。
本發明有關於用以預防、治療，及/或功能性治癒HIV感染的組成物和方法。本發明之一範疇是關於針對CD4之抗體、其配方，以及使用此配方以預防、治療，及/或功能性治癒HIV感染的方法。
在此使用之章節標題僅作為組織的目的，且並非被解釋作為限制所述之專利標的。為了任何目的，此申請案引用之所有參考文獻或參考文獻之部分透過引用在此明確地被併入本文整體。
CD4
CD4(cluster of differentiation 4)是一種醣蛋白(UniProtKB/Swiss-Prot：P01730.1)，其位於免疫細胞(例如助手T細胞、單核球、巨噬細胞和樹突細胞)(http：//en.wikipedia.org/wiki/CD4)。CD4是免疫球蛋白超家族的成員，且具有暴露於細胞外表面的四個免疫球蛋白功能區塊(D1至D4)。CD4功能區塊D1和D3類似免疫球蛋白變異(IgV)區；而D2和D4類似免疫球蛋白恆定(IgC)區。CD4使用其D1功能區塊與第二型主要組織相容性複 合體(MHC II)分子的β2-功能區塊交互作用。因此，於其表面表現CD4分子的T細胞對MHC II所呈現之抗原具有特異性。包含特殊胺基酸序列的CD4短細胞質/細胞內尾端使其可與lck分子交互作用。
CD4的第一個細胞外功能區塊與免疫球蛋白 共有同源性，其三個互補決定區(CDRs)與免疫球蛋白鏈相似。發現CD4分子細胞外區域的功能區塊1和功能區塊2均對MHC II分子之結合位具有貢獻；然而，發現單獨功能區塊1涉及HIV結合與合胞形成(syncytia formation)。特別地，發現HIV外套膜醣蛋白gp120之結合位位於功能區塊1的類CDR-2環(CDR2-like loop)。
HIV-1藉由CD4進入宿主T細胞，此乃透過其 病毒外套膜蛋白(稱為gp120)達成。結合CD4引起gp120構型變化以允許HIV-1結合至表現於宿主細胞上的化學激素受體CCR5或CXCR4。接著另一個病毒蛋白(gp41)結構改變，HIV將融合胜肽插入宿主細胞，以允許病毒的外膜與細胞膜融合。HIV感染造成表現CD4之T細胞數量逐漸減少。
抗體
本發明之一範疇是關於針對CD4之抗體、其組成物，以及使用此組成物以預防、治療，及/或功能性治癒HIV感染的方法。
本發明抗體廣泛地包含完整的抗體分子，其包 含完整的多株、單株、單特異性、多特異性、嵌合、去免疫化、擬人化、人類、靈長類、單鏈、單功能區塊(single-domain)、合成和重組抗體，以及具有所欲活性或功能之抗體片段。
本發明抗體可辨認CD4的功能區塊1。在某些 實施例中，抗體可特異性地結合位於CD4功能區塊1的CDR2區域。
本發明抗體可以任何標準方法製造。在一些實 施例中，本發明抗體可藉由以重組CD4蛋白、重組CD4蛋白的片段、或是表面表現CD4的細胞免疫動物(例如：小鼠、狗、天竺鼠、豬、山羊、馬等)加以製造。或者，可化學合成抗體。
在某些實施例中，可藉由以含有CD4功能區 塊1之胺基酸序列的胜肽免疫動物以製造抗體。例如，可藉由以含有CD4功能區塊1之CDR2區域胺基酸序列的胜肽或其結合免疫動物以製造多株抗體。在某些實施例中，含有CD4之第39-66個胺基酸的胜肽(稱為HIV受體複合體(“HIV RC”))，如同HIV結合至CD4之此部分。在某些實施例中，HIV RC胜肽可藉由雙硫鍵以創造環狀結構。
在某些實施例中，可利用環狀HIV RC胜肽免 疫動物以製造多株抗體。本發明所述“抗-HIV RC多株抗體”是指抗含有CD4功能區塊1之CDR2區域第39-66個胺基酸的環狀胜肽的免疫血清。
在其他實施例中，利用CD4陽性細胞免疫動 物以製造抗體。例如，在某些實施例中，以完整、未感染的CD4+人類HPB-ALL細胞、T細胞急性淋巴細胞性白血病細胞株(T-acute lymphoblastic leukemia cell line)免疫BALB/c小鼠製造抗體。於Wang的專利(美國5,912,176號和6,090,388號專利)以及Wang等人於1999年發表的期刊論文對此抗體有更詳細的討論，其均透過引用以併入本文整體。
在其他實施例中，抗體包含如序列表所列之重 鏈和輕鏈的胺基酸序列。本發明包含含有序列表所列胺基酸序列之抗體的同源物和功能類似物。
本發明抗體的功能類似物包含序列變異和同 源物，其保持如原抗體實質上相同之功能特徵(結合辨認、結合親和力等)。例如，作為功能類似物或同源物之抗體變異於胺基酸位置具有保留性取代；靜電荷改變；共價結合至其他官能基；或小的加入、插入、刪除或保留性取代及/或其任意結合。因此，此抗體的變異抗體功能類似物和同源物將可辨識並結合CD4，且用於受試者以治療HIV。
在一實施例中，抗體功能類似物或同源物通常 與含有揭露於序列表之胺基酸序列的抗體具有至少約50%序列相似度。在其他實施例中，抗體功能類似物或同源物與含有揭露於序列表之胺基酸序列的抗體具有至少約50%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、或約99%相似度。
保留性取代是指一個胺基酸殘基以另一個具 有相似化學特性之胺基酸殘基取代。例如，非極性(疏水性)胺基酸包含丙胺酸、白胺酸、異白胺酸、纈胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、色胺酸和甲硫胺酸；極性中性胺基酸包含甘胺酸、絲胺酸、酥胺酸、半胱胺酸、酪胺酸、天門冬醯胺酸和麩醯胺酸；正電(鹼性)胺基酸包含精胺酸、離胺酸和組胺酸；以及負電(酸性)胺基酸包含天門冬胺酸和麩胺酸。
在其他實施例中，抗體的功能類似物可藉由對 氮基端、羧基端加入或刪除胺基酸，及/或藉由插入序列中間而加以修飾。在本發明之不同實施例中，是對胜肽的氮基端或羧基端加入或刪除。可為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個胺基酸殘基的加入或刪除。此種加入或刪除可能構成胺基酸序列，而此胺基酸序列未呈現於序列表所列之序列中，但並不改變此抗體的一般功能特徵。
在某些實施例中，以化學物質標記或標幟本發 明抗體。例如，抗體可以生物素、延伸臂、探針(例如：螢光異硫氰酸鹽(FITC)、藻紅素(PE)、四甲基異硫氰酸羅丹明(TRITC)、DyLight Fluors、Alexa、綠色螢光蛋白(GFP)、R-藻紅素(R-Phycoerythrin)、量子點(quantum dots)等)、酶結合物，及其結合加以標幟。在具體實施例中，抗體是以生物素或螢光探針標幟。
在具體實施例中，抗體透過已知的去免疫化過 程加以修飾。本發明所述“去免疫化”一般是指用以修飾抗體之部分的過程，藉此使其投予動物時不引起動物體內 之免疫反應。具體來說，此抗體於投予至特定動物時具有免疫原性(例如，T細胞抗原表位)，去免疫化涉及定位與移除抗體部分胺基酸序列的過程。此過程可藉由結合使用免疫學與分子生物學技術達成。此過程先前已揭露(例如Jones,T.D.,et al.2009)。在抗體去免疫化的狀況下，可普遍地引入突變以移除T細胞抗原表位而未顯著地減少抗體的結合親和力。
本發明所述“擬人化”是指修飾(去免疫化)非 人類物種抗體的蛋白質序列，藉此移除當此抗體投予人類時的免疫原性。在某些實施例中，本發明抗體是利用以人類恆定區取代其恆定區及/或利用表現於哺乳類細胞編碼此些抗體的基因以去免疫化供人類使用。
在某些實施例中，本發明抗體具有如表4所示 之重鏈和輕鏈胺基酸序列。
本發明所述“mAb B4”或“B4”或“鼠源 B4”分別地是指具有SEQ ID NOs：1-6之重鏈和輕鏈的CDR1、2、3區域胺基酸序列的鼠源單株抗體(如表4所示)。 鼠源單株抗體可辨識CD4並抑制HIV進入。此抗體之結構與功能特徵於實施例與下文中有更詳細之討論。
本發明所述“mAb dB4”或“dB4”是指衍生 自mAb B4之人類去免疫化抗體。人類去免疫化mAb dB4分別地具有SEQ ID NOs：1-6之重鏈和輕鏈的CDR1、2、3區域之胺基酸序列(如表4所示)。在一些實施例中，mAb dB4之輕鏈具有SEQ ID NO：8之胺基酸序列(如第5圖所 示)。在一些實施例中，mAb dB4之重鏈具有SEQ ID NO：7之胺基酸序列(如第4圖所示)。在不同實施例中，mAb dB4之重鏈具有SEQ ID NO：9之胺基酸序列(如第6圖所示)。 MAb B4可藉由於本領域所知悉的任何適當方法加以去免疫化。在一實施例中，mAb B4是利用依據美國7,501,494號和7,872,110號專利所述之方法去免疫化以供人類使用，其透過引用在此併入本文整體。在特殊實施例中，人類去免疫化mAb dB4是藉由移除mAb B4之鼠源抗體恆定區(CH和Cκ)，並以人類IgG1的恆定區取代，而製造。MAb dB4包含以任何適當之細胞選殖株製造的dB4。在具體實施例中，mAb dB4是由7號選殖株所製造。
本發明所述“mAb dB4C7”或“dB4C7”，是 指由包含重組基因B4DIVHv1/VK1CHO#7的7號選殖株所表現的mAb dB4，其先前於美國7,501,494號和7,872,110號專利揭露，這些專利透過引用在此併入本文整體。顯示C7選殖株可製造高品質的mAb dB4抗體。特別的是，mAb B4C7為人類去免疫化抗體，其具有包含SEQ ID NO：8胺基酸序列之輕鏈(如第5圖所示)和包含SEQ ID NO：7胺基酸序列之重鏈(如第4圖所示)。此外，將位於mAb dB4C7位置298之Asn(N)殘基以His(H)取代，以移除N-醣化點，因此於抗體B4存在下消除IgG調停的補體依賴型細胞毒殺作用(CdC)以防止CD4陽性T細胞的耗竭。
本發明所述“UB-421”是指使用於投予人類 受試者之合適形式的mAb dB4C7。
本發明抗體也可藉由其有趣與獨特的功能特 徵而加以描述。
例如，本發明之抗體可透過其結合至CD4之 功能區塊1而發揮有效的競爭型HIV進入抑制。特別是，本發明之抗體於測試的所有Env假型病毒具有接近100%的最大抑制百分比(MPI)，具有兩個IC50濃度；一個是介於0.01至1μg/mL，且第二個是約10μg/mL。本發明抗體的結合活性較HIV gp120外套膜蛋白所展現之CD4結合親和力高了約兩個對數(即100倍更緊密的結合)。此外，本發明抗體的平均解離常數(Kd)測得為5.6 x 10-11M(範圍：3.1至8.1 x 10-11M)，且最大結合容量(Bmax)測得為每細胞1.2 x 106Ab(範圍：0.93至1.4 x 106)。
於無細胞和細胞間的系統中均顯示本發明抗 體的競爭型抑制特性。本發明抗體以較HIV外套膜蛋白gp120 MN高至少50倍之親和力結合至CD4受體。並且，本發明抗體以相較於其他市售抗體(例如Leu3a)更高的親和力與特異性結合至CD4。
本發明抗體也可抑制由抗原引起的T細胞增 生和CD4陽性T細胞的細胞激素製造(IL2和IFN-gamma)，其涉及細胞焦亡的致病循環。此種對CD4具高親和力之單株抗體可抑制抗原(例如超抗原SEB(金黃色葡萄球菌B型腸毒素(staphylococcal enterotoxin B,SEB))引起的CD4陽性T細胞活化和細胞激素(例如IL2和IFN-γ)製造。此種抗原引起的活化導致HIV感染失敗的靜默CD4+ T細胞產生 細胞激素，造成這些靜默CD4+ T細胞和附近正常靜默CD4陽性細胞的細胞焦亡，其導致之後CD4+ T細胞的大量耗竭，因而導致AIDS。
本發明抗體也具有再活化靜默CD4陽性T細 胞的能力。此特性對再活化靜默T細胞中的潛伏HIV病毒庫特別有用，可使這些細胞對抗反轉錄病毒藥物治療敏感。為了釋放HIV，此種對CD4高親和力之抗體可活化靜默的HIV感染細胞。HIV感染的靜默CD4+ T細胞再活化允許HIV感染患者使用合併本發明抗體與HAART之合併治療，以達成功能性治癒。
於以下實施例提供本發明抗體額外的結構與 功能特徵。
劑型
本發明也針對用以預防、治療，及/或功能性治癒HIV感染的藥劑劑型。在某些實施例中，劑型包含針對CD4之抗體。在特定實施例中，本發明關於包含對CD4高親和力之單株抗體的醫藥組成物(此抗體可針對位於CD4功能區塊1之CDR2區域內或附近的位置)。此種抗體的結合活性(EC50)較HIV gp120外套膜蛋白所展現之CD4結合親和力(對gp120之EC50=97nM)高了約兩個對數(即100倍更緊密的結合)。
抗體蛋白質的藥劑劑型可藉由混合抗體蛋白質與任選的藥物學上可接受的載體而加以製備。藥物學上 可接受的載體包含溶劑、分散介質、等滲劑等。載體可為液體、半固體(例如膏狀物)或固體載體。載體的例子包含水、鹽溶液或其他緩衝液(例如磷酸鹽、檸檬酸鹽緩衝液)、油類、醇類、蛋白質(例如血清白蛋白、明膠)、碳水化合物(例如單醣、雙醣，以及其他碳水化合物(包含葡萄糖、蔗糖、海藻醣、甘露糖、甘露醇、山梨糖醇或糊精)、凝膠、脂質、微脂體、樹脂、多孔基體、黏合劑、充填劑、塗層、安定劑、防腐劑、抗氧化劑(包含抗壞血酸以及甲硫胺酸)、螯合劑(例如EDTA)；成鹽的抗衡離子(salt forming counter-ions)(例如鈉)；非離子界面活性劑(例如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)，或其結合)。
此劑型可包含至少一種的活性物質。例如，劑 型可含有用於預防和治療HIV感染之一或多個抗體及/或一或多個具有額外優點的化合物。活性物質可以任何方便使用的方式(例如：混合、溶液、懸浮液、乳化作用、膠囊化、吸附等)與載體結合，且可製成適用於注射、攝取、輸注等的劑型(例如：錠劑、膠囊、粉末(包含冷凍乾燥粉末)、糖漿劑、懸浮液)。亦可製備成緩釋製劑。
在某些實施例中，藥劑劑型包含供人類使用之 mAb dB4C7。包含mAb dB4C7之藥劑劑型可配製於適當緩衝液中，包含，但不限於，檸檬酸鹽、磷酸鹽、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、1,3-二[三(羥甲基)甲基氨基]丙烷(BIS-Tris)等，於介於6.0至7.0之pH值，且可包含賦形劑(例如醣類(50mM至500mM的蔗糖、海藻糖、甘露醇，或其混合))、 界面活性劑(例如：0.025%-0.5%的Tween 20或Tween 80)，及/或其他試劑。在具體實施例中，劑型包含mAb dB4C7於含有20mM甘胺酸，以及0.05%(v/v)Tween(polysorbate 20)之磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS)(pH 6.5)中。在其他具體實施例中，也可製備mAb dB4之高濃度劑型以供包含皮下注射之應用，其包含10mM組胺酸。
可製備含有不同量抗體的劑型。一般來說，用於投予受試者的劑型包含介於約0.1mg/mL至約200mg/mL的抗體。在某些實施例中，劑型可包含介於約0.5mg/mL至約50mg/mL；介於約1.0mg/mL至約50mg/mL；介於約1mg/mL至約25mg/mL；或介於約10mg/mL至約25mg/mL的抗體。在具體實施例中，劑型包含約1.0mg/mL，約5.0mg/mL，約10.0mg/mL，或約25.0mg/mL的抗體。
在具體實施例中，本發明關於包含具有上述結合特徵之針對CD4功能區塊1之CDR2區域之人類、擬人化或嵌合、單株抗-CD4抗體的醫藥組成物，其展現競爭型HIV進入抑制與CD4+ T細胞活化，作為HIV患者的免疫療法。
在其他實施例中，本發明關於包含具有上述結合特徵之單株人類、擬人化或嵌合，抗-CD4抗體的醫藥組成物，其作為單一藥物治療使接受治療之受試者血清抗體水平高於10μg/mL，可將病毒量降低至檢測極限以下。
在其他實施例中，本發明關於包含具有上述結合特徵之單株人類、擬人化或嵌合，抗-CD4抗體的醫藥組 成物，其作為單一藥物治療可於為期12週治療期間使接受治療之受試者血清抗體水平高於10μg/mL，且維持穩定的CD4 T細胞數量，將病毒量降低至檢測極限以下。
在某些實施例中，本發明關於包含具有上述結合特徵之單株人類、擬人化或嵌合，抗-CD4抗體的醫藥組成物，當以每週或每兩週之時程表以約10mg/kg或更高之劑量投予作為單一藥物治療時，此種治療可於為期12週治療期間使接受治療之受試者的病毒量降低至檢測極限以下。
在另一較佳實施例中，本發明關於包含具有上述結合特徵之單株擬人化抗-CD4抗體的醫藥組成物，其可作為偕同HAART之輔助治療的關鍵成份，當以每週或每兩週之時程表以約10mg/kg或更高之劑量投予未使用治療藥物之HIV患者，將達成患者的功能性治癒。
在另一較佳實施例中，本發明關於包含具有上述結合特徵之單株擬人化抗-CD4抗體的醫藥組成物，其可作為偕同HAART之輔助治療的關鍵成份，當以每週或每兩週之時程表以約10mg/kg或更高之劑量投予於HAART下具有穩定病毒量的患者，將達成患者的功能性治癒。
抗病毒藥物
本發明之治療、預防，和功能性治癒HIV感染的方法更包括抗病毒藥物。
抗病毒藥物包含可於哺乳類動物有效抑制 HIV之形成及/或複製的任何藥物(化合物或生物的)。抗病毒藥物的例子包含，但不限於，進入/融合抑制劑(例如：maraviroc、enfuvirtide)；核苷類反轉錄酶抑制劑(NRTI)和核苷酸類反轉錄酶抑制劑(NtRTI)(例如：zidovudine、abacavir、lamivudine、emtricitabine和tenofovir)；非核苷類反轉錄酶抑制劑(NNRTI)(例如：nevirapine、efavirenz、etravirine和rilpivirine)；整合酶抑制劑(也稱為整合酶鏈轉移抑制劑或INSTIs(例如：raltegravir、dolutegravir)；蛋白酶抑制劑(例如：saquinavir、saquinavir mesylate、fosamprenavir、tipranavir、lopinavir、indinavir、nelfinavir、amprenavir、ritonavir、darunavir、atazanavir、bevirimat、vivecon)；病毒成熟抑制劑；針對HIV基因表現的藥物；針對涉及HIV複製之重要宿主細胞基因和基因產物的藥物；以及其他抗-HIV藥物；iRNA藥物；反義RNA(antisense RNA)；表現iRNA藥物或反義RNA之載體；肽核酸(PNA)以及抗病毒抗體；及其結合。
抗病毒藥物可以單獨或合併方式使用。以合併 方式使用抗病毒藥物稱為抗反轉錄病毒治療(ART)，聯合抗反轉錄病毒治療(cART)或高效抗反轉錄病毒療法(HAART)。抗反轉錄病毒(ARV)藥物藉由藥物抑制反轉錄病毒生命週期的階段而廣泛地被分類。典型的合併使用包含以兩種NRTIs作為“骨架”，以及以一種NNRTI、PI或INSTI作為“基底”。在某些實施例中，合併使用抗病毒藥物的方式，例如：Combivir、Trizivir、Kaletra、Epzicom、 Truvada、Atripla、Complera、Stribild、Triumeq。
治療、預防和功能性治癒的方法
本發明也包括用以治療、預防，和功能性治癒HIV感染的方法。在某些實施例中，劑型包含針對CD4之抗體。
另一方面，本發明之抗體、任選的藥物學上可接受的載體可於受試者用以預防、治療，及/或功能性治癒HIV感染，以及預防HIV傳播。
本發明所述HIV感染的“治療”是指對HIV感染的有效抑制，藉此延遲發生、延緩病程、減少病毒量，及/或改善由HIV感染所引起之症狀。治療包含對HIV暴露前和暴露後。
本發明所述HIV感染的“預防”是指延遲HIV感染之發生，及/或減少或消除HIV感染的發生率或可能性。本發明所述HIV傳播的“預防”是指減少或消除HIV由一個體傳染至另一個體(例如於懷孕、分娩或生產，或母乳餵養期間由HIV陽性之女性傳至小孩)的發生率或可能性。
本發明所述“受試者”是指任何靈長類受試者，包含人類、恒河猴、狒狒和黑猩猩受試者。
為治療及/或預防HIV感染，對有需求的受試者投予本發明抗體的治療劑量。
本發明所述“治療上有效劑量”是指抑制 HIV感染效果所需劑量，藉此治療及/或預防HIV感染。抗體的劑量取決於疾病狀態和其他臨床因素，例如受試者重量和狀況、受試者對此療法的反應、劑型的種類和給藥途徑。作為治療上有效且非有害的精確劑量可由本領域之技術人員所決定。
一般來說，投予成年人類之抗體的適當劑量範 圍介於約3至50mg/kg受試者體重，具有範圍介於約5至25mg/kg受試者體重的典型初步範圍可供使用。適當劑量也包含約5.0mg/kg、約10.0mg/kg、或約25.0mg/kg受試者體重。
包含本發明人類單株抗體的治療性組成物可 便於靜脈投予(例如藉由單位劑量注射)。單位劑量一般是指本發明之治療性組成物，其進一步是指對受試者適合作為單位劑量之物理上分開的單位，每一單位包含計算用以產生所欲治療反應之活性物質的預定量和所需稀釋劑(即載體或賦形劑)。
以適當劑型之方式與治療上有效劑量投予組 成物。給藥量取決於所欲治療的受試者、受試者身體利用活性物質的能力，以及所欲治療效果之程度。需要投予之活性成分的精確劑量取決於醫生之判斷與個體的差異性。 然而，所揭露供系統性應用之適當劑量範圍取決於給藥途徑。用於投予的適當治療方案也不盡相同，而是以於初次投予後投予重複劑量作為代表(於一或多個小時之間隔藉由之後的注射或其他投予方式)。另外，考慮在生物治療中 持續靜脈輸注以維持血液中的濃度於指定範圍。
於受試者用以治療、預防，及/或功能性治癒 HIV感染的方法包含投予受試者有效劑量之含有抗體的劑型。在某些實施例中，以單次投予的方式提供劑型給受試者。在某些實施例中，以多次投予的方式提供劑型給受試者。當以多次投予的方式提供劑型時，劑型可以每天一次、每週一次、每兩週一次(每隔一週)，或每月一次投予。在具體實施例中，當治療時程表是以每週一次時，劑型是以約5.0mg/kg受試者體重之劑量投予受試者。在另一實施例中，當治療時程表是以每兩週一次時，劑型是以約25.0mg/kg受試者體重之劑量投予受試者。
在某些實施例中，當以總共8週，以5mg/kg 或25mg/kg劑量以每週為基礎重複投予受試者時，含有單株抗體之劑型顯現高安全係數且耐受性良好。在特定實施例中，單株抗體可以5mg/kg劑量在HIV感染數小時內投予受試者，以提供HIV感染的消除性治癒。在其他實施例中，單株抗體可以5mg/kg劑量於HIV感染後在數天內投予受試者，以提供HIV感染的功能性治癒。
在某些實施例中，本發明關於包含具有上述結 合特徵之單株人類、擬人化或嵌合，抗-CD4抗體的醫藥組成物，可將其透過靜脈注射或皮下注射給藥途徑投予HIV患者作為免疫療法以減少病毒量。在特定實施例中，本發明關於包含具有上述結合特徵之針對CD4功能區塊1CDR2區域之人類、擬人化或嵌合單株抗-CD4抗體的醫藥 組成物，其展現競爭型HIV進入抑制與CD4+ T細胞活化，以作為HIV感染之患者的免疫療法。
在某些實施例中，本發明關於包含具有上述結 合特徵之單株人類、擬人化或嵌合抗-CD4抗體的醫藥組成物，可將其以每週或每兩週之時程表以約10mg/kg或更高之劑量透過靜脈注射或皮下注射給藥途徑投予HIV患者作為免疫療法以減少病毒量。
在其他實施例中，本發明關於包含具有上述結 合特徵之單株人類、擬人化或嵌合抗-CD4抗體的醫藥組成物，其作為單一藥物治療可使接受治療之受試者血清抗體水平高於10μg/mL，將病毒量降低至檢測極限以下。
在其他實施例中，本發明關於包含具有上述結 合特徵之單株人類、擬人化或嵌合抗-CD4抗體的醫藥組成物，其作為單一藥物治療可於為期12週治療期間使接受治療之受試者血清抗體水平高於10μg/mL，且維持穩定的CD4 T細胞數量，將病毒量降低至檢測極限以下。
在其他實施例中，本發明關於包含具有上述結 合特徵之單株人類、擬人化或嵌合抗-CD4抗體的醫藥組成物，當以每週或每兩週之時程表以約10mg/kg或更高之劑量投予作為單一藥物治療時，此種治療可於為期12週治療期間使接受治療之受試者的病毒量降低至檢測極限以下。
在其他實施例中，本發明關於包含具有上述結 合特徵之單株人類、擬人化或嵌合抗-CD4抗體的醫藥組成物，當以每週或每兩週之時程表以約10mg/kg或更高之劑 量投予作為單一藥物治療時，此種治療可使接受治療之受試者的病毒量降低至檢測極限以下，且只要血清抗體水平高於10μg/mL即無病毒量反彈。
在其他實施例中，本發明關於包含具有上述結 合特徵之單株擬人化抗-CD4抗體的醫藥組成物，其可作為偕同HAART之輔助治療的關鍵成份，當以每週或每兩週之時程表以約10mg/kg或更高之劑量投予未使用治療藥物之HIV患者，可達成患者的功能性治癒。
在其他實施例中，本發明關於包含具有上述結 合特徵之單株擬人化抗-CD4抗體的醫藥組成物，其可作為偕同HAART之輔助治療的關鍵成份，當以每週或每兩週之時程表以約10mg/kg或更高之劑量投予於HAART下具有穩定病毒量的患者，可達成患者的功能性治癒。
在其他實施例中，本發明關於包含具有上述結 合特徵之單株擬人化抗-CD4抗體的醫藥組成物，可將其以每週或每兩週之時程表以約10mg/kg或更高之劑量透過靜脈注射或皮下注射給藥途徑投予對HAART之輔助治療中HAART治療失敗之患者，可使病毒進一步減少。
在其他實施例中，本發明關於包含具有上述結 合特徵之單株擬人化抗-CD4抗體的醫藥組成物，可將其以靜脈注射或皮下注射給藥途徑投予作為於HAART替代療法的關鍵成份，藉此進行治療循環，每治療循環以抗-CD4抗體治療2至4個月作為開始，其如同對於HARRT之下經歷穩定低於檢測極限病毒量之患者的治療假日(treatment holiday)，之後接續HAART治療，進行1至4個或更多循環的期間，可達成功能性治癒。
在其他實施例中，本發明關於包含具有上述結 合特徵之單株擬人化抗-CD4抗體的醫藥組成物，可將其以靜脈注射或皮下注射給藥途徑投予作為於HAART替代療法的關鍵成份，藉此進行治療循環，對於未使用治療藥物之HIV患者每治療循環以抗-CD4抗體治療2至4個月作為開始，之後接續2至4個月的HAART治療，進行1至4個或更多循環的期間，可達成功能性治癒。
在其他實施例中，本發明關於包含具有上述結 合特徵之單株擬人化抗-CD4抗體的醫藥組成物，可將其以靜脈注射或皮下注射給藥途徑投予作為於HAART替代療法的關鍵成份，藉此進行治療循環，每治療循環以抗-CD4抗體治療2至4個月作為開始，其如同對於HARRT之下經歷穩定低於檢測極限病毒量之患者的治療假日，之後接續HAART治療，進行1至4個或更多循環的期間，以每週或每兩週之時程表以約5mg/kg或更高之劑量，可達成功能性治癒。
在其他實施例中，本發明關於包含具有上述結 合特徵之單株擬人化抗-CD4抗體的醫藥組成物，可將其以靜脈注射或皮下注射給藥途徑投予作為於HAART替代療法的關鍵成份，藉此進行治療循環，對於未使用治療藥物之HIV患者每治療循環以抗-CD4抗體治療2至4個月作為開始，之後接續2至4個月的HAART治療，進行1至4 個或更多循環的期間，以每週或每兩週之時程表以約5mg/kg或更高之劑量，可達成功能性治癒。
在其他實施例中，本發明關於包含具有上述結 合特徵之單株擬人化抗-CD4抗體的醫藥組成物，其可作為偕同HAART之輔助治療的關鍵成份，當以每週或每兩週之時程表以約10mg/kg或更高之劑量投予未使用治療藥物之HIV患者，將達成患者的功能性治癒。
在其他實施例中，本發明關於包含具有上述結 合特徵之單株擬人化抗-CD4抗體的醫藥組成物，其可作為偕同HAART之輔助治療的關鍵成份，當以每週或每兩週之時程表以約10mg/kg或更高之劑量投予於HAART下具有穩定病毒量的患者，將達成患者的功能性治癒。
在其他實施例中，本發明關於包含具有上述結 合特徵之單株擬人化抗-CD4抗體的醫藥組成物，可將其以每週或每兩週之時程表以約10mg/kg或更高之劑量透過靜脈注射或皮下注射給藥途徑投予對HAART之輔助治療中HAART治療失敗之患者，使病毒進一步減少。
在其他實施例中，本發明關於包含具有上述結 合特徵之單株擬人化抗-CD4抗體的醫藥組成物，可將其以靜脈注射或皮下注射給藥途徑投予作為偕同HAART之輔助治療的關鍵成份，於間歇模式中，對於未使用治療藥物之HIV患者，每循環以2至4個月之治療期作為開始，以及1至2個月之治療假日，進行1至4個或更多循環的期間，如同於密集HAART治療模式的輔助治療，可達成患者 的功能性治癒。
在其他實施例中，本發明關於包含具有上述結 合特徵之單株擬人化抗-CD4抗體的醫藥組成物，可將其以靜脈注射或皮下注射給藥途徑投予作為偕同HAART之輔助治療的關鍵成份，於間歇模式中，對於未使用治療藥物之HIV患者，每循環以2至4個月之治療期作為開始，以及1至2個月之治療假日，進行1至4個或更多循環的期間，以每週或每兩週之時程表以約5mg/kg或更高之劑量，如同於密集HAART治療模式的輔助治療，可達成患者的功能性治癒。
在其他實施例中，本發明關於包含具有上述結 合特徵之單株擬人化抗-CD4抗體的醫藥組成物，可將其以靜脈注射或皮下注射給藥途徑投予作為偕同HAART之輔助治療的關鍵成份，於間歇模式中，對HARRT之下經歷穩定低於檢測極限病毒量之患者，每循環以2至4個月之治療期作為開始，以及1至2個月之治療假日，進行1至4個或更多循環的期間，以每週或每兩週之時程表以約5mg/kg或更高之劑量，如同於密集HAART治療模式的輔助治療，可達成患者的功能性治癒。
在其他實施例中，本發明關於包含具有上述結 合特徵之單株人類、擬人化或嵌合抗-CD4抗體的醫藥組成物，可將其以靜脈注射或皮下注射給藥途徑投予HIV患者作為免疫療法以減少病毒量。
在其他實施例中，本發明關於包含具有上述結 合特徵之單株人類、擬人化或嵌合抗-CD4抗體的醫藥組成物，可將其以每週或每兩週之時程表以約5mg/kg或更高之劑量透過靜脈注射或皮下注射給藥途徑投予HIV患者作為免疫療法以減少病毒量。
具體實施例
本發明包含以下具體實施例：
(1)一種用以治療暴露於HIV感染之受試者的方法，包含：a)投予針對CD4之單株抗體的藥理學上有效劑量包含：SEQ ID NO：1之鼠源抗體B4之重鏈的CDR1、SEQ ID NO：2之鼠源抗體B4之重鏈的CDR2、SEQ ID NO：3之鼠源抗體B4之重鏈的CDR3、SEQ ID NO：4之鼠源抗體B4之輕鏈的CDR1、SEQ ID NO：5之鼠源抗體B4之輕鏈的CDR2，以及SEQ ID NO：6之鼠源抗體B4之輕鏈的CDR3；b)在步驟(a)後評估受試者血液之每毫升的HIV RNA水平。
(2)依據(1)的方法，其中抗體的重鏈序列包含SEQ ID NO：7。
(3)依據(1)的方法，其中抗體的重鏈序列包含SEQ ID NO：9。
(4)依據(1)的方法，其中抗體的輕鏈序列包含SEQ ID NO：8。
(5)依據(1)的方法，其中抗體的重鏈序列包含SEQ ID NO：7，且抗體的輕鏈序列包含SEQ ID NO：8。
(6)依據(1)的方法，其中抗體的重鏈序列包含SEQ ID NO：9，且抗體的輕鏈序列包含SEQ ID NO：8。
(7)依據(1)的方法，其中投予步驟(a)是於暴露於HIV感染24小時內進行。
(8)依據(1)的方法，其中投予步驟(a)是於暴露於HIV感染48小時內進行。
(9)依據(1)的方法，其中單株抗體的藥理學上有效劑量是以於12週之期間內以每週或每兩週之時程表以約為10μg/ml或更高之血清水平被投予。
(10)依據(1)的方法，其中低於1copy/ml之每毫升的HIV RNA水平數值被視為病毒的根除。
(11)依據(1)的方法，其中介於1至低於50copy/ml之每毫升的HIV RNA水平數值被視為病毒的功能性治癒。
(12)一種用以治療HIV患者的方法，包含：a)投予組成物之藥理學上有效劑量，此組成物包含針對CD4之單株抗體，此針對CD4之單株抗體包含：SEQ ID NO：1之鼠源抗體B4之重鏈的CDR1、SEQ ID NO：2之鼠源抗體B4之重鏈的CDR2、SEQ ID NO：3之鼠源抗體B4之重鏈的CDR3、SEQ ID NO：4之鼠源抗體B4之輕鏈的CDR1、SEQ ID NO：5之鼠源抗體B4之輕鏈的CDR2，以及SEQ ID NO：6之鼠源抗體B4之輕鏈的CDR3；以及高效抗反轉錄病毒療法(HAART)；以及b)在步驟(a)後評估受試者血液中每毫升的HIV RNA水平。
(13)依據(12)的方法，其中抗體的重鏈序列包含SEQ ID NO：7。
(14)依據(12)的方法，其中抗體的重鏈序列包含SEQ ID NO：9。
(15)依據(12)的方法，其中抗體的輕鏈序列包含SEQ ID NO：8。
(16)依據(12)的方法，其中抗體的重鏈序列包含SEQ ID NO：7，且抗體的輕鏈序列包含SEQ ID NO：8。
(17)依據(12)的方法，其中抗體的重鏈序列包含SEQ ID NO：9，且抗體的輕鏈序列包含SEQ ID NO：8。
(18)依據(12)的方法，其中抗體的藥理學上有效劑量是以每週或每兩週之基礎以10mg/kg或更高之劑量被投予。
(19)依據(12)的方法，其中抗體是以間歇模式被投予以作為於HAART治療模式中的輔助治療。
(20)依據(19)的方法，其中每循環是於約2至4個月之期間投予抗體作為HAART治療模式中的輔助治療，之後為HAART治療模式中1至2個月的抗體治療假日。
(21)依據(20)的方法，其中間歇方式持續一至四循環的期間。
(22)一種用以治療HIV患者的方法，包含：a)藉由活化患者體內之潛伏感染細胞的HIV病毒表現和細胞凋亡，以減少於HIV患者體內的潛伏HIV病毒庫；以及b)對患者投予HAART的藥理學上有效劑量。
(23)依據(22)的方法，其中活化患者體內潛伏感染細胞的HIV病毒表現和細胞凋亡是藉由對患者投予針對CD4 之單株抗體的藥理學上有效劑量而加以執行，包含：SEQ ID NO：1之鼠源抗體B4之重鏈的CDR1、SEQ ID NO：2之鼠源抗體B4之重鏈的CDR2、SEQ ID NO：3之鼠源抗體B4之重鏈的CDR3、SEQ ID NO：4之鼠源抗體B4之輕鏈的CDR1、SEQ ID NO：5之鼠源抗體B4之輕鏈的CDR2，以及SEQ ID NO：6之鼠源抗體B4之輕鏈的CDR3。
(24)依據(22)的方法，其中活化患者體內潛伏感染細胞的HIV病毒表現和細胞凋亡是藉由對患者投予組蛋白脫乙醯酶(HDAC)抑制劑而加以執行。
(25)一種用以治療暴露於HIV感染之受試者的方法，包含：a)投予對CD4類CDR2功能區塊區域(CDR2-like domain region)具有高度親和力之單株抗體的藥理學上有效劑量；以及b)在步驟(a)後評估受試者血液之每毫升的HIV RNA水平。
(26)依據(25)的方法，其中抗體的重鏈序列包含SEQ ID NO：7。
(27)依據(25)的方法，其中抗體的重鏈序列包含SEQ ID NO：9。
(28)依據(25)的方法，其中抗體的輕鏈序列包含SEQ ID NO：8。
(29)依據(25)的方法，其中抗體的重鏈序列包含SEQ ID NO：7，且抗體的輕鏈序列包含SEQ ID NO：8。
(30)依據(25)的方法，其中抗體的重鏈序列包含SEQ ID NO：9，且抗體的輕鏈序列包含SEQ ID NO：8。
(31)依據(25)的方法，其中投予步驟(a)是於暴露於HIV感染24小時內進行。
(32)依據(25)的方法，其中投予步驟(a)是於暴露於HIV感染48小時內進行。
(33)依據(25)的方法，其中單株抗體的藥理學上有效劑量是於12週之期間內以每週或每兩週之時程表以約10μg/ml或更高之血清水平被投予。
(34)依據(25)的方法，其中低於1copy/ml之每毫升的HIV RNA水平數值被視為病毒的根除。
(35)依據(25)的方法，其中介於1至低於50copy/ml之每毫升的HIV RNA水平數值被視為病毒的功能性治癒。
額外的具體實施例
(1)一種用以治療暴露於HIV之受試者的方法，包含投予受試者針對CD4功能區塊1之抗體的藥理學上有效劑量。
(2)依據(1)的方法，其中抗體特異性地結合位於CD4功能區塊1的CDR2區域。
(3)依據(2)的方法，其中抗體為單株抗體、多株抗體，或其結合。
(4)依據(2)的方法，其中抗體為擬人化單株抗體。
(5)依據(4)的方法，其中擬人化單株抗體包含：重鏈胺基酸序列包含：SEQ ID NO：1的CDR1、SEQ ID NO：2的CDR2，以及SEQ ID NO：3的CDR3；以及輕鏈胺基酸序列 包含：SEQ ID NO：4的CDR1、SEQ ID NO：5的CDR2，以及SEQ ID NO：6的CDR3。
(6)依據(4)的方法，其中擬人化單株抗體包含：包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列的重鏈；以及包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列的輕鏈。
(7)依據(4)的方法，其中擬人化單株抗體包含：包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列的重鏈；以及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的輕鏈。
(8)依據(7)的方法，其中重鏈包含SEQ ID NO：7的胺基酸序列。
(9)依據(8)的方法，其中擬人化抗體是於暴露於HIV前投予受試者。
(10)依據(8)的方法，其中擬人化抗體是於暴露於HIV後投予受試者。
(11)依據(10)的方法，其中擬人化抗體是於暴露於HIV後48小時內投予。
(12)依據(8)的方法，其中擬人化抗體是以至少約5mg/kg體重之劑量投予受試者。
(13)依據(12)的方法，其中擬人化抗體是以多次投予受試者。
(14)依據(13)的方法，其中擬人化抗體是以每週或每兩週之間隔投予受試者。
(15)依據(13)的方法，更包含投予受試者抗病毒藥物之步驟。
(16)依據(15)的方法，其中抗病毒藥物為高效抗反轉錄病毒療法(HAART)。
(17)依據(16)的方法，其中HAART包含核苷類似物反轉錄酶抑制劑合併使用蛋白酶抑制劑或非核苷類反轉錄酶 抑制劑。
(18)依據(16)的方法，其中擬人化抗體是與HAART同時投予。
(19)依據(16)的方法，其中在一循環的期間內投予受試者擬人化抗體和HAART，其中此循環包含：(i)以每週或每兩週之間隔於4個月之期間對受試者投予擬人化抗體，之後為兩個月的治療假日；以及(ii)於(i)內之六個月期間持續地對此受試者投予HAART。
(20)依據(19)的方法，其中受試者是以二循環的期間治療。
(21)一種用以治療HIV感染之受試者的方法，包含投予此受試者治療方案包含：(a)針對CD4功能區塊1之抗體的藥理學上有效劑量；以及(b)高效抗反轉錄病毒療法(HAART)。
(22)依據(21)的方法，其中抗體特異性地結合位於CD4功能區塊1的CDR2區域。
(23)依據(22)的方法，其中抗體為單株抗體、多株抗體，或其結合。
(24)依據(22)的方法，其中抗體為擬人化單株抗體。
(25)依據(24)的方法，其中擬人化單株抗體包含：重鏈胺基酸序列包含：SEQ ID NO：1的CDR1、SEQ ID NO：2的CDR2，以及SEQ ID NO：3的CDR3；以及輕鏈胺基酸序列包含：SEQ ID NO：4的CDR1、SEQ ID NO：5的CDR2，以及SEQ ID NO：6的CDR3。
(26)依據(24)的方法，其中擬人化單株抗體包含：包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列的重鏈；以及包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列的輕鏈。
(27)依據(24)的方法，其中擬人化單株抗體包含：包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列的重鏈；以及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的輕鏈。
(28)依據(27)的方法，其中擬人化抗體是以至少約5mg/kg體重之劑量投予受試者。
(29)依據(21)的方法，其中在一循環的期間內投予受試者治療方案，其中此循環包含：(i)以每週或每兩週之間隔於4個月之期間對受試者投予擬人化抗體，之後為兩個月的治療假日；以及(ii)於(i)內之六個月期間持續地對此受試者投予HAART。
(30)依據(29)的方法，其中此受試者是以二循環治療。
更具體實施例
(1)一種用以治療暴露於HIV之受試者的組成物包含：針對CD4功能區塊1之抗體的藥理學上有效劑量。
(2)依據(1)的組成物，其中抗體特異性地結合位於CD4功能區塊1的CDR2區域。
(3)依據(2)的組成物，其中抗體為單株抗體、多株抗體，或其結合。
(4)依據(2)的組成物，其中抗體為擬人化單株抗體。
(5)依據(4)的組成物，其中擬人化單株抗體包含：重 鏈胺基酸序列包含：SEQ ID NO：1的CDR1、SEQ ID NO：2的CDR2，以及SEQ ID NO：3的CDR3；以及輕鏈胺基酸序列包含：SEQ ID NO：4的CDR1、SEQ ID NO：5的CDR2，以及SEQ ID NO：6的CDR3。
(6)依據(4)的組成物，其中擬人化單株抗體包含：包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列的重鏈，以及包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列的輕鏈。
(7)依據(4)的組成物，其中擬人化單株抗體包含：包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列的重鏈；以及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的輕鏈。
(8)依據(7)的組成物，其中重鏈包含SEQ ID NO：7的胺基酸序列。
(9)依據(8)的組成物，其中擬人化抗體是於暴露於HIV前投予受試者。
(10)依據(8)的組成物，其中擬人化抗體是於暴露於HIV後投予受試者。
(11)依據(10)的組成物，其中擬人化抗體是於暴露於HIV後48小時內投予。
(12)依據(8)的組成物，其中擬人化抗體是以至少約5mg/kg體重之劑量投予受試者。
(13)依據(12)的組成物，其中擬人化抗體是以多次投予受試者。
(14)依據(13)的組成物，其中擬人化抗體是以每週或每兩週之間隔投予受試者。
(15)依據(13)的組成物，其中是以抗病毒藥物治療(或投予)受試者。
(16)依據(15)的組成物，其中抗病毒藥物為高效抗反轉錄病毒療法(HAART)。
(17)依據(16)的組成物，其中HAART包含核苷類似物反轉錄酶抑制劑合併使用蛋白酶抑制劑或非核苷類反轉錄酶抑制劑。
(18)依據(16)的組成物，其中擬人化抗體是與HAART同時投予。
(19)依據(16)的組成物，其中在一循環的期間內投予受試者擬人化抗體和HAART，其中此循環包含：(i)以每週或每兩週之間隔於4個月之期間對受試者投予擬人化抗體，之後為兩個月的治療假日；以及(ii)於(i)內之六個月期間持續地對此受試者投予HAART。
(20)依據(18)的組成物，其中受試者是以二循環的期間治療。
(21)一種用以治療HIV感染之受試者的組成物包含：(a)針對CD4功能區塊1之抗體的藥理學上有效劑量；以及(b)高效抗反轉錄病毒療法(HAART)。
(22)依據(21)的組成物，其中抗體特異性地結合位於CD4功能區塊1的CDR2區域。
(23)依據(22)的組成物，其中抗體為單株抗體、多株抗體，或其結合。
(24)依據(22)的組成物，其中抗體為擬人化單株抗體。
(25)依據(24)的組成物，其中擬人化單株抗體包含：重鏈胺基酸序列包含：SEQ ID NO：1的CDR1、SEQ ID NO：2的CDR2，以及SEQ ID NO：3的CDR3；以及輕鏈胺基酸序列包含：SEQ ID NO：4的CDR1、SEQ ID NO：5的CDR2，以及SEQ ID NO：6的CDR3。
(26)依據(24)的組成物，其中擬人化單株抗體包含：包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列的重鏈；以及包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列的輕鏈。
(27)依據(24)的組成物，其中擬人化單株抗體包含：包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列的重鏈，以及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的輕鏈。
(28)依據(27)的組成物，其中擬人化抗體是以至少約5mg/kg體重之劑量投予受試者。
(29)依據(21)的組成物，其中在一循環的期間內投予受試者治療方案，其中此循環包含：(i)以每週或每兩週之間隔於4個月之期間對受試者投予擬人化抗體，之後為兩個月的治療假日；以及(ii)於(i)內之六個月期間持續地對此受試者投予HAART。
(30)依據(18)的組成物，其中此受試者是以二循環治 療。
除非特別說明，在此使用的所有技術和科學用語如本發明所屬技術領域中具有通常知識者的通常理解具有相同意義。除非上下文清楚地指出，否則單詞“一(a)”、“一(an)”和“該(the)”包含複數形式。類似地，單詞“或(or)”是意指包括“和(and)”，除非上下文另有明確說明。因此，“包含A或B”是指包括A，或B，或A和B。更應被理解的是，用於給定多胜肽之所有的胺基酸大小和所有分子量或分子質量值是近似的，並且被提供作為描述之用。然而類似或等同於在此描述者的方法和材料可被用於以下所述之揭露的方法、合適的方法和材料的實踐或測試中。所有出版物、專利申請、專利和在此提及的其它參考文獻透過引用在此併入本文整體。在衝突的情況下，以本說明書(包括術語的解釋)為準。此外，材料、方法和實施例僅是說明性的而非意指加以限制。
所提供圖式和相關實施例的以下說明性解釋是用以便於理解在此頻繁使用的某些術語，特別是在實施例中。解釋是為便利性而被提供而非用以限制本發明。
【實施例】
實施例1. MAb B4的免疫和功能特性
單株抗體B4(mAb B4)為可辨識位於T細胞表面之複合HIV受體位點(CD4)的單株抗體。MAb B4可影響和妨礙CD4和HIV協同受體的交互作用。MAb B4優先地 中和原代HIV-1分離株。
以下資訊總結了鼠源mAb B4之發現與初步的特性研究，其包含引用自兩篇專利(由Wang所發明的美國5,912,176號和6,090,388號專利)和Wang等人於1999年發表期刊論文的資料，其均透過引用以併入本文整體。
1. 衍生自HPB-ALL免疫之鼠源單株抗體
以完整、未感染的CD4+人類HPB-ALL細胞、T細胞急性淋巴細胞性白血病細胞株免疫BALB/c小鼠以提供mAb B4。
所提供之新種類的抗-CD4抗體(以mAb B4表示)對位於細胞表面之CD4具有特異性，且對HIV-1的原代分離株具有廣泛的中和活性。
2. MAb B4辨識位置的特徵
相較於重組可溶性CD4(rsCD4)，發現mAb B4優先地辨識位於細胞表面上與膜結合的CD4(membrane-bound CD4)。
於暴露於HIV前之mAb B4結合至與膜結合的CD4顯示可阻斷後續gp120和整個病毒附著至CD4。然而，於暴露於抗體前就已結合至gp120的與膜結合的CD4仍然可結合mAb B4。因此，mAb B4能影響gp120結合至與膜結合的CD4，但是gp120並不影響mAb B4結合至CD4。
MAb B4的辨識位置有別於其他已充分研究之抗-CD4單株抗體的辨識位置，包含可辨識CD4功能區塊1之單株抗體Leu3a和OKT4A(Chiba,Y.1992；Jameson,B.D., et al.,1988)，以及可辨識CD4功能區塊2之單株抗體5A8(Burkly,et al.,1992)。
3. MAb B4的體外中和活性
透過一般的定義，鼠源mAb B4並非中和性抗體。反而，mAb B4是藉由覆蓋宿主細胞受體，而非藉由附著至病毒，以抑制病毒進入。可藉由於此領域所使用之病毒中和試驗而容易地觀察到mAb B4對HIV感染的效果(例如MT-2微斑中和試驗(MT-2 Microplaque Neutralization Assay)(Sawyer et al.,1994))。鼠源mAb B4的中和活性是由我們的合作者Carl Hanson博士(加州健康服務部)所評估，也於John Mascola博士(亨利傑克遜基金會，WRAIR)、David Montefiori博士(杜克大學)和Malcolm Martin博士(NIAID)的實驗室中獨立地評估。以下HIV中和特性，於1995年至2010年間被廣泛地描繪，其與mAb B4相關：
(1)PBMC生長的原代分離株(PBMC-grown primary isolates)較T細胞株適應的分離株HIV-1IIIB和HIV-1MN對藉由mAb B4的中和作用更加敏感。
(2)MAb B4可中和透過使用CCR5/CXCR4(雙性)和CCR5協同受體之原代分離株的感染。
(3)MAb B4對使用CXCR4協同受體之T細胞株適應的HIV-1分離株具有低活性。
(4)MAb B4可中和代表HIV-1亞型A-G之不同合胞誘導型(Syncytial Inducing(SI))和非合胞誘導型(Non-Syncytial Inducing(NSI))的原代分離株，達到 90%終點指標(endpoints)與高達3個對數的感染性。
(5)MAb B4可中和具有雙性協同受體HIV-1外套膜的HIV-2、猿猴免疫不全病毒(SIV)和人猴嵌合免疫缺陷病毒(SHIV)。
(6)於扁桃體組織系統，mAb B4減少了兩個對數之HIV-1原代分離株VL135(HIV-1VL135)的感染性。在活化的人類補體存在下，在此狀況下許多抗-病毒抗體展現抗體依賴性增強作用，少至12.5μg/mL的mAb B4可完全地中和>100 TID50(50%扁桃體感染劑量)的monocytotropic分離株JR-CSF。
(7)當感染後加入mAb B4達48小時，mAb B4於HIV-1VL135展現中和活性；當加入mAb B4達72小時後，則具有顯著的抗-病毒效果。
a. 不論是否與細胞或病毒預培養，其均同樣有效。
b. 它的作用是藉由阻斷感染的病灶傳播至新的細胞，而非藉由進入後的機制。
c. 在這些試驗中，mAb B4並不有助於細胞毒性。
實施例2. HIV-1中和和抗藥性試驗
以下於1998年至2011年期間針對不同進化支之多個HIV分離株的病毒中和和抗藥性試驗是在Carl Hanson博士和Monogram生物科學公司的實驗室中執行。此試驗的詳細說明如以下所述。
1. HIV-1中和試驗
如每一試驗所指明收集血液或抗體樣品。使用MT-2微斑試驗或有絲分裂促進劑(PHA)-刺激的PBMC試驗，於一組含有多個進化支(multi-clade panel)的HIV-1分離株評估血清或抗體樣品。
1.1. MT-2微斑試驗
MT-2微斑試驗限於HIV的合胞誘導型分離株。本試驗於96孔盤上進行，於其藉由在微斑上合胞的螢光染色可計數到高達每孔洞25個微小空斑。在此試驗中，受感染的MT-2細胞藉由透過熔化的瓊脂糖離心形成單層，此熔化的瓊脂糖於離心期間膠化。此試驗被認為具有敏感性並具有遍佈多個數量級數的動態範圍。此試驗也被視為是處理大量樣品時唯一具有效率的方法。利用電腦化統計分析大量複製的孔洞，以提供使用其他方式所難以達成之品質控制與標準化的程度。
1.2. PBMC試驗
PBMC試驗是一種標準的抗原-減少試驗，於此試驗中，在受感染的細胞於96孔微量盤生長後，以抗原-捕獲ELISA定量於PBMCs的p24抗原表現。此試驗的優點在於其適用於所有的HIV病毒株與分離株。
1.3. 病毒原液
用於體外與體內中和試驗的HIV原液列於表3、表5和表6，以及第1A、1B、3、22和23圖。來自亞型A至G和H之原代HIV-1病毒為：(a)分離自參加病毒和立克次體疾病實驗室(VRDL)加州健康服務部之舊金山 男性健康研究的男性同性戀者；(b)由HIV分離和鑑定之世界衛生組織網絡取得，(c)由美國軍方HIV研究計劃提供，以及(d)由國家過敏和傳染病研究所AIDS研究和參考試劑計劃所饋贈。DH-12(由患者分離，於黑猩猩周邊血液單核球細胞(PBMC)繼代)也是由國家過敏和傳染病研究所AIDS研究和參考試劑計劃所提供。
1.4. B4或dB4中和活性
B4或dB4中和活性定義為相對於不含抗體之控制組可提供指定百分比(50-95%)之病毒減少的抗體濃度。藉由於抗體稀釋物之間的內插法推導出在50%和90%終點指標之抗體濃度。
2. PhenoSense HIV進入試驗
用以測定抗藥性之PhenoSense HIV進入試驗是於Monogram生物科學公司執行(南舊金山，加州)。
利用從載體庫產生的重組病毒於不同濃度之藥物或抗體(例如B4或dB4)存在下感染細胞。依據50%(IC50)或90%(IC90)測定用以抑制試驗載體之病毒複製所需的藥物量。
2.1. 使用於PhenoSense HIV試驗之重組病毒的產生
PhenoSense HIV試驗使用之重組病毒來自於患者的樣本，此些患者是於HIV感染之縱貫性研究中所篩選出，並確定為HIV血清反應陽性者。對於發生HIV感染者，收集臨床和血漿樣品以供實驗室評估(包括HIV病毒量和CD4細胞數量)。對於起初是血清反應陰性但於後續約一 年變成血清反應陽性的個體，利用兩個酵素免疫分析法和西方墨點法之確証加以確認HIV感染。
收集來自於血清轉化期間具有亞型A、BF、C、 D、E、EA、F、G或J之受試者的樣品(基於先前的HIV亞型分析，其乃利用多個雜交分析而達成)，用以建構重組病毒(如表3所示)。由試驗樣品放大HIV env、pol區域，並選殖放大的DNAs進入試驗載體。於GeneSeq HIV，定序載體庫以確定HIV基因型。於PhenoSense HIV試驗，於不同藥物濃度存在下利用從載體庫產生的重組病毒感染細胞。
實施例3. MAb B4對所有進化支之HIV分離株的中和活性(利用Monogram生物科學的PhenoSense試驗)
已證實mAb B4可中和B進化支的所有HIV病毒。於本試驗中共計73個具代表性的非B進化支HIV分離株，將來自進化支A(n=8)、BF(n=1)、C(n=18)、D(n=18)、E(n=4)、EA(n=10)、F(n=8)、G(n=4)、J(n=2)，加上三個控制組病毒92HT594、JRCSF、JRFL，製成重組病毒，並於PhenoSense HIV試驗中測試，以分析其對mAb B4的敏感性(請參見表3)。顯示所有重組病毒對mAb B4具有高度敏感性，其具有無先例的低IC50和IC90濃度，具有平均IC50=0.018μg/mL和IC90=0.062μg/mL。值得注意的是，發現這些HIV病毒分離株中的多個衍生自具多重抗藥性患者，此清楚地表明mAb B4或其人類對應物在已經 對HIV藥物產生抗藥性之患者的治療中具有高效率。
實施例4. 單株抗體B4的競爭型HIV進入抑制：預防治療後之HIV抗藥性突變種的不可預期效果
競爭型抑制試驗可評估抑制劑(例如，進入抑制劑抗體)與HIV外套膜蛋白競爭位在CD4上相同受體結合位點從而抑制HIV進入細胞的能力和療效。理論試驗中，mAb B4和HIV外套膜蛋白(gp120)競爭結合CD4。第1A圖顯示此試驗的預測結果，在此每一條線代表不同的病毒分離株。具體地，從此理論試驗的預期結果證明，雖然不同的病毒分離株對mAb B4具有不同敏感性(IC50)，但只要mAb B4存在足夠濃度下可抑制所有病毒分離株的進入，幅度達100%。
透過比較，非競爭型抑制試驗可評估抑制劑(例如，協同受體拮抗劑或結合於CD4之不同部分的抗體)抑制或降低HIV外套膜蛋白結合至CD4從而抑制HIV進入細胞的能力和療效。在理論試驗中，分析非競爭型抑制劑(例如，TMB-355)抑制HIV外套膜蛋白(gp120)結合CD4的能力。第1B圖顯示此試驗的預測結果，在此每一條線代表不同的病毒分離株。具體地，從此理論試驗的預期結果證明，不同的病毒分離株對TMB-355具有不同敏感性(IC50)，且不論TMB-355呈現量為何，至少一些部份的病毒分離株可進入細胞。基於此理論試驗，如同於最大抑制百分比的“高原”，可預期不論IC50為何均可觀察到HIV 抗藥性。
TMB-355(原TNX-355，也稱為Ibalizumab)為 擬人化IgG4單株抗體，設計其結合恆河猴和人類CD4之細胞外功能區塊2以避免HIV結合後進入CD4+細胞(例如，Burkly,LC,et al.,1992；and Kurizkes,DR,et al.,2004)。位於CD4之TMB-355抗體結合位點有別於HIV外套膜蛋白gp120結合所需之位點，且有別於與主要組織相容性複合體蛋白質交互作用所需之位點。據此，TMB-355調停非競爭型HIV進入抑制。
已顯示TMB-355對一些HIV-1病毒具有強烈 的中和活性，但是當以一組廣泛的HIV-1病毒株評估時，其抑制活性與中和活性並不一致。第2圖顯示TMB-355的最大抑制百分比(MPI)介於100%至15%(左邊的Y軸)，伴隨由0.01μg/mL至10μg/mL之增加的IC50(右邊的Y軸)，對一組118種Env假型HIV病毒，以每一長條代表一種病毒分離株(Song,R.,et al.,2013)。於分析的所有進化支中，進化支A和E病毒較非進化支A和E病毒對TMB-355顯著地具有敏感性。此外，發現來自接受TMB-355治療以減少病毒量之患者的病毒抗藥性突變種於gp120的V5區域具有突變(Toma,J.,et al.,2011；Pace,C.S.,et al.,2013)。以TMB-355(Ibalizumab)所證明之非競爭型抑制效應顯示在抗體治療期間有發展抗藥性HIV突變種的高度可能性，因為具有低於100%抑制的分離株會發生病毒複製。
相反地，來自一組超過850種Env假型HIV 病毒於10年期間收集的結果顯示，mAb B4於HIV進入抑制提供了非預期之廣泛性與效力(第3圖)。從這些收集的數據可見mAb B4具有接近100%最大抑制百分比(MPI)，具有兩個IC50濃度，一個是介於0.01至1μg/mL，且另一個是約10μg/mL。MAb B4之HIV進入抑制曲線具有競爭型抑制機制的典型特性，無論IC50為何，其對每一HIV病毒具有為~100%之MPI。鑑於mAb B4之顯著強烈的競爭型HIV進入抑制特性，故在mAb B4治療期間不大可能會發展出病毒抗藥性突變種。這種嚴密的競爭型抑制，如透過mAb B4所展現者，迄今從未以任何其它測試的HIV抑制劑觀察到。
來自此實施例之MPI和IC50，與顯示衍生自多 重抗藥性患者之多個HIV分離株對mAb B4具有高度敏感性的數據(實施例3)相結合，顯示mAb B4或其人類對應物於HAART治療失敗之抗藥性HIV患者治療上具有高效率。由mAb B4所調停之中和模式提供獨特HIV藥物，其可於接受mAb B4或其人類對應相似物(具有相似Fv區域)治療的HIV患者中預防抗藥性病毒突變種的產生。
實施例5. 單株抗體B4的擬人化
因為鼠源抗體，mAb B4於人類具有免疫原性。可透過已知的去免疫化技術(Jones,T.D.,et al.2009)之過程達到鼠源抗體的擬人化。MAb B4的去免疫化於Lynn.,S.和Wang,C.Y.之美國7,501,494號專利中已詳細描 述(其均透過引用以併入本文整體)，如同以下內容所概述。
首先，完全地移除鼠源抗體B4的恆定區(CH和Cκ)，並以人類IgG1的恆定區(分別為SEQ ID NOs：12和14)取代，然而保留Fv部分，從而製造嵌合B4抗體。接下來，為供人類使用而將鼠源mAb B4之Fv片段去免疫化，此是藉由辨識與除去潛在具有免疫原性之鼠源T和B-細胞抗原表位而達成。在從mAb B4的變異區中辨別此種抗原表位之後移除T細胞抗原表位。為了呈現第二型主要組織相容性複合體結合域(MHC class II-binding motifs)而利用三維“肽鏈線化”方法以分析變異區的胺基酸序列。藉由表面殘基的“鑲飾”達成由變異區移除B細胞抗原表位而不妨礙抗體辨識。此去免疫化擬人化形式的mAb B4稱為mAb dB4。
Lynn.,S.和Wang,C.Y.之美國7,501,494號專利討論到IgG1於CH2區域中含有雙觸角複合N端結合碳水化合物，其對於效能作用(effector functions)具有重要性，例如補體結合和抗原依賴細胞毒殺作用(antigen-dependent-cellular-cytotoxicity,ADCC)，可造成目標抗原的消除。因為mAb B4作用於CD4受體複合體，其可透過負責結合補體之IgG1的效能作用造成CD4+細胞的破壞和CD4+細胞功能的免疫抑制。因此，移除位於IgG1之Fc區域的N-醣化點可破壞IgG1結合至人類FcR1的能力，以活化補體，或結合C1q，從而消除IgG調停的補體依賴型細胞毒殺作用(CdC)。藉由以His(H)取代胺基酸殘 基Asn(N)(即N298H)達成移除位於IgG1之Fc區域的N-醣化點。
在本說明書中所討論的胺基酸編號/位置是基 於包含在序列表中的序列，此序列表為本說明書的一部分。應該注意的是，以上所討論之位在第298個胺基酸之醣化點對應於天然IgG1分子中位於第297個胺基酸之醣化點，它是根據用於IgG1的歐洲編號系統所編號的。因此，本申請案之第298個胺基酸對應於美國7,501,494號專利中位於第297個胺基酸之醣化點。
Fv功能區塊之去免疫化mAb dB4重鏈(第4圖) 和輕鏈(第5圖)的CDR1、2和3區域分別包含SEQ ID NOs：1至6的胺基酸序列(表4)。MAb dB4重鏈和輕鏈的完整胺基酸序列分別地如第4和5圖所示，如SEQ ID NOs：7和8。
發現當突變位於抗體重鏈的某些胺基酸時可 改進(延長)mAb dB4的半衰期。具體來說，當位於第253(Met)、255(Ser)和257(Thr)個重鏈Fc胺基酸分別以Tyr、Thr和Glu取代時可改進擬人化抗體之半衰期。擬人化mAb dB4抗體經改進之重鏈的全長序列如第6圖所示，如SEQ ID NO：9。據此，經改進之擬人化抗體mAb dB4包含具有SEQ ID NO：8胺基酸序列之輕鏈，以及具有SEQ ID NO：9胺基酸序列之重鏈。
鼠源mAb B4和擬人化mAb dB4之序列和結構 的獨特特性為存在位於第101個胺基酸位置(Asn101)的醣類結合殘基Asn，於Fv的重鏈中。此醣類結合位點對其Fv 區域位置是獨特的，其意外地隱藏於Fv功能區塊內，且只可藉由整個抗體分子的變性而曝露出來供酵素裂解。起初於Fv區域呈現此醣類使抗體特性複雜化。然而，對醣鏈或結合位點進行修飾會破壞抗體對CD4的結合親和力。因此，此位於Fv區域之獨特的N-醣化點對抗體結合至CD4是具關鍵性的。
第7圖說明mAb dB4之完整長度的重鏈胺基 酸序列，其強調第4和6圖於上述所討論的醣化、取代和突變位置。
實施例6. 利用MT-2微斑、PBMC中和試驗和PhenoSense進入試驗證明mAb dB4和其親本mab B4間的生物相等性
進行廣泛的比較研究，以評估去免疫化/擬人化，Fc-無醣基化的mAb dB4和親本鼠源mAb B4的生物相等性，以確保擬人化形式可在靈長類動物和人類供進一步毒性/安全性和療效研究。來自這些比較研究的結果概述於下文。
(1)高靈敏性的HIV-1中和試驗，分別以來自進化支A、B、C、D和E，以及來自進化支C和E之具代表性的HIV分離株，於MT-2微斑和有絲分裂促進劑(mitogen)刺激的PBMC試驗中進行。利用去免疫化技術將鼠源mAb B4擬人化形成mAb dB4抗體後並未造成HIV中和活性的喪失。比較結果如MT-2微斑(表5) 和基於PBMC之試驗(表6)所示。
(2)因為測得對來自所有進化支之所有HIV分離株的IC50s和IC90s彼此間落於兩倍以內，因此證明鼠源mAb B4和mAb dB4間的生物相等性。
(3)在表現雙重受體(CXCR4和CCR5或X4/R5)的細胞株U87和具有各種向性之經挑選HIV分離株(包含JRCSF(R5)、HXB2(X4)、92TH594(R5/X4)、原代分離株#5(R5)、原代分離株#6(R5)和原代分離株#7(R5))上進行，以評估藉由mAb B4、mAb dB4和其他兩個已知針對HIV-env之單株中和性抗體(2F5和2G12HIV)的HIV進入抑制。在此試驗中，HIV進入抑制是由Monogram生物科學利用假型病毒(假型病毒攜帶來自數百個HIV病毒株之任一者的外套膜醣蛋白和螢光酵素(luciferase))而加以評估。定量於U87-CD4+/CCR5+/CXCR4+細胞產生之生物螢光以測定抗體的中和作用，此細胞是利用生物工程於HIV tat控制下表現螢光酵素。此試驗的結果如表7所示，其證明：
a. 當與兩個最具效力之抗-HIV Env抗體2F5(第1列)和2G12(第2列)相比較時，鼠源mAb B4(MuB4；第4列)於HIV進入抑制上較二者更具效力。對不同HIV分離株之相對應的IC50s分別為0.04 vs 4和0.8；0.4 vs 0.07和0.5；0.05 vs 3和1.3；0.05 vs 50和20；0.05 vs 2和3；0.03 vs >100和2；以及 b. 當以各種向性之相同具代表性的HIV分離株測試時，鼠源mAb B4(MuB4；第4列)和mAb dB4(第3列)於其IC50s出人意料地相等。
因此充分證明鼠源mAb B4和去免疫化的mAb dB4(二者在重鏈和輕鏈具有相同CDRs)為生物等效性的，且兩種抗體的功能特性在不同的體外和體內試驗中可為代表彼此的。
實施例7. (A)對HPB-ALL細胞之dB4和mAb B4結合活性；(B)對PBMC CD4陽性細胞之dB4結合活性；(C)對重組CD4之dB4結合活性，以及(D)對HPB-ALL細胞之dB4和gp120結合活性的特性
1. 背景
儘管抗原結合和功能特性的定性方面是已知的，如同藉由中和試驗所證明，對mAb dB4及其親本鼠源mAb B4而言如先前實施例所示，但先前尚未研究過於CD4+ T淋巴細胞之mAb B4和mAb dB4定量的細胞結合曲線。
測試鼠源mAb B4和其擬人化，Fc-無醣基化的IgG1單株抗體mAb dB4在正常人類血液CD4+ T淋巴細胞和在CD4+ T-白血病HPB-ALL細胞之細胞結合曲線。使用HPB-ALL細胞是因為如實施例1所討論是透過以HPB-ALL細胞免疫接種小鼠而選出mAb B4。一般的細胞結合是利用流式細胞儀(FACS)分析方法評估，且結果是基於平均螢光 強度(MFI)記述為EC50或IC50數值。除了評估抗體一般的細胞結合，也研究天然dB4 IgG1分子對HPB-ALL細胞之絕對結合親和力(Kd)和最大結合容量(Bmax)。
2. 材料
2.1. 培養液和試劑
培養HPB-ALL細胞之RPMI-1640培養液和胎牛血清是來自Gibco(貨號分別為11875-093和10091-148)。牛血清白蛋白(BSA)是來自ApplicChem(貨號A-0850)。細胞與測試抗體之培養是在NUNC的V型底96孔盤(貨號249662)上進行。供樣品製備的微量稀釋管(1.2mL)是來自Bertec(貨號1710-00)。以2%甲醛固定細胞；樣品以含有0.05% BSA和0.05%疊氮化鈉之PBS(pH 7.4)稀釋；且清洗液為含有0.05%疊氮化鈉之PBS(pH 7.4)。
分別利用山羊抗-鼠IgG-FITC(Sigma，貨號F8264)和山羊F(ab’)2抗-人IgG Fcγ-FITC(Jackson ImmunoResearch，貨號109-096-098)追蹤鼠源mAb B4和擬人化mAb dB4之結合。dB4-Alexa 488結合物(整篇文章以縮寫的“dB4-Alexa”表示)為於聯合生物醫學公司(UBI)內部製造(UBI批號0102143)。B4-biotin結合物來自UBI(批號051807)。綿羊抗-hIgG-HRP來自The Binding Site(貨號AP004)；Extravidin-HRP來自Sigma Aldrich(貨號E2886)；以及可溶性rCD4來自R & D System(貨號514-CD-050)。胜肽p2704a HIV外套膜來自UBI，重組gp120 MN來自ImmunoDiagnostics(貨號1021-2)。利用抗-CD4(D2)-FITC 抗體(Ancell，貨號148-020)選取血液CD4+ T細胞供結合之追蹤使用。利用來自LinearFlowTM Green Flow Cytometry Intensity Calibration Kits(Molecular Probe)的螢光珠作為參考標準，以定量標幟細胞的相對螢光。使用的其他螢光偵測器為：FITC-ChromPure山羊IgG、F(ab')2片段(Jackson ImmunoResearch，貨號005-090-006)；CD3 PE(ASR)(BD Biosciences，貨號340662)；CD45 PerCP(ASR)(BD Biosciences，貨號340665)。
2.2. HPB-ALL細胞和周邊血液CD4 + T細胞
由DSMZ ACC提供HPB-ALL細胞株(人類胸腺衍生急性淋巴細胞性白血病細胞株)。PBMC CD4+ T細胞(由健康的供血者新鮮地採血至EDTA-真空採血管內)衍生自以含有氯化銨之低滲溶液(8.3g/L氯化銨、0.84g/L碳酸氫鈉以及29.4mg/L EDTA於pH 7.4之混合液)分解紅血球後的周邊血液白血球(PBL)。
2.3. 鼠源mAb B4和擬人化dB4 mAb
透過以HPB-ALL細胞作為免疫原之融合瘤操作提供鼠源單株B4 IgG1(UBI批號120197)。藉由N298H使B4-衍生的擬人化dB4 IgG1成為Fc-無醣基化(實施例5)。
2.4. ELISA和FACS偵測
96孔盤來自Nalge NUNC International，平底(Cat.442404)的供光學測定，V型底的供細胞培養(Cat.249570)。光學密度是於VersaMax微量盤分析儀上讀取(Molecular Devices)。以BD FACSCalibur scanner(DB Biosciences)偵測螢光染劑；並透過相關的Cell Quest軟體獲得結果的數據。將來自ELISA和FACS的結合數據導入到SigmaPlot 11軟體進行定量分析。
3. 方法
3.1. dB4對HPB-ALL細胞的結合
3.1.1. 平衡時間試驗
於V型底的微量盤上，添加每孔洞0.1mL內含2 x 105個細胞的溶液，離心，並丟棄液體。於長達180分鐘之各種持續時間，將細胞在冰上以100μL高達100ng/mL之各種濃度的dB4溶液加以培養。於培養時間收集上清液以測定游離、未結合的抗體藥物。利用添加之總藥物濃度扣除游離的部份而計算出結合的部份。
利用ELISA定量於結合溶液中的游離dB4濃度。簡而言之，此試驗涉及塗覆於NUNC Maxisorp微量盤之綿羊抗-hIgL(0.5μg/mL)混合液的使用，並以綿羊抗-huIgG-HRP(1/1000稀釋)作為檢測蛋白質。基於0.14-18.5ng/mL範圍內之校正標準測定於未知樣品中的游離dB4濃度。
3.1.2. 與dB4直接結合試驗
於V型底的微量盤上，添加每孔洞0.1mL內含2 x 105個細胞的溶液，離心，並丟棄液體。將細胞在冰上以100μL高達2000ng/mL之各種濃度的dB4溶液培養1小時。培養之後，移除dB4，並加入與起始培養所使用相同濃度之dB4的新鮮溶液至細胞中，並在冰上再培養細胞 1小時。重複此步驟一次。研究來自三次培養(繼代)的細胞。在第三次培養後，洗滌細胞一次，以300g離心5分鐘，以100μL之山羊F(ab)2抗-huIgG Fc-FITC(250ng/mL)於冰上染色30分鐘。洗滌細胞一次並於離心後丟棄液體。 對每一孔洞加入200μL的結合溶液，並將其移至微量稀釋管供流式細胞檢測分析。基於每一樣品5,000個細胞的進樣，於FACS上測定結合強度(平均螢光強度，MFI)。
3.1.3. dB4的結合親和力試驗
在離心管內，加入濃度為3.1-2000ng/mL(0.5mL)之dB4抗體至數量為4 x 105個細胞的HPB-ALL細胞(0.5mL)中，並於和緩的搖動下於冰上培養1小時。測定於飽和結合時之絕對結合親和力，在此以ELISA定量溶液中的游離dB4濃度([F])，且如以上平衡試驗所述計算結合部分([B])。以基於等式[B]=Bmax●{[F]/([F]+Kd)}的曲線擬合於SigmaPlot上分析所得之飽和的游離-vs-結合濃度曲線，在此個別的[B]和[F]代表結合和游離的濃度。
3.1.4. dB4和B4與B4-biotin的競爭
於塗覆sCD4(0.5μg/mL)和p2704a胜肽(2.0μg/mL)混合液之平底微量盤上，於B4-biotin(10μg/mL)存在下加入0.1mL之dB4或B4溶液(濃度為0.78-100μg/mL)，並於室溫下培養1小時。以下對捕獲混合物之競爭型結合，是以Extravidin-HRP偵測結合的B4-biotin並以ELISA分析儀測定。
3.1.5. dB4和B4與dB4-Alexa的競爭
於V型底微量盤上，添加每孔洞0.1mL內含 2 x 105個細胞的溶液，離心，並丟棄液體。細胞於dB4-Alexa(250ng/mL)存在下與100μL之dB4或B4溶液(濃度高達2000ng/mL)在冰上培養1小時。洗滌細胞一次並於離心後丟棄液體。對每一孔洞加入200μL的結合溶液，並將其移至微量稀釋管供流式細胞檢測分析。基於每一樣品5,000個細胞的進樣，於FACS上測定結合強度(平均螢光強度，MFI)。
3.1.6. dB4C7和gp120 MN與dB4C7-Alexa的競爭
於V型底微量盤上，添加每孔洞0.1mL內含2 x 105個細胞的溶液，離心，並丟棄液體。細胞於dB4-Alexa(250ng/mL)存在下與100μL之dB4C7或gp120 MN溶液(濃度高達200nM，~30μg/mL)在冰上培養1小時。洗滌細胞一次並於離心後丟棄液體。對每一孔洞加入200μL的結合溶液，並將其移至微量稀釋管供流式細胞檢測分析。基於每一樣品5,000個細胞的進樣，於FACS上測定結合強度(平均螢光強度，MFI)。
3.2. dB4對血液CD4+T淋巴細胞的結合
3.2.1. dB4的溫度倚賴性結合試驗
為了模擬生理環境，在此於靜脈注射後dB4(UB-421)結合(覆蓋或佔據)位於CD4+T細胞上之CD4受體，將由實驗室人員新鮮採取的EDTA-血液溶液與等量之dB4於稀釋緩衝液中在37℃下進行培養(dB4濃度高達100μg/mL)。為了作比較，其他樣品組同時於冰上進行培養。 在培養1小時後，樣品以20倍體積之紅血球裂解緩衝液於室溫下裂解10分鐘以產生周邊血液白血球(PBL)部分。
離心PBL部份，洗滌，並接著以等量之含有 1.0% BSA和疊氮化鈉的PBS緩衝液再製(例如，0.1mL血液和0.1mL稀釋緩衝液)。以0.1mL之山羊F(ab)2抗-hIgG Fc-FITC、抗-CD3-PE和抗-CD45 perCP混合液於冰上染色PBL樣品30分鐘。洗滌之後，以2%甲醛固定樣品，並基於10,000個細胞的進樣對樣品進行FACS分析。利用抗-CD3-PE選取T淋巴細胞群。
3.2.2. 直接結合
於三個男性和女性受試者中分析dB4對血液CD4+ T細胞的直接結合，在此將新鮮抽取之EDTA-血液與dB4於37℃下培養1小時。MAb dB4結合至CD4+ T細胞，且發現達到濃度範圍為0.2-200ng/mL之表觀飽和度(apparent saturation)。利用抗-CD3-PE選取T淋巴細胞群。此實驗步驟與上述之溫度倚賴性結合試驗的步驟相同，在此利用山羊F(ab)2抗-hIgG Fcγ-FITC染細胞以追蹤dB4之結合。
3.2.3. 未被佔據的結合位
類似於上述之直接結合試驗，在對三個男性和三個女性之每一個體於相同場合下研究dB4結合後所留下未被佔據之結合位的程度(在完全受體佔據之前)。此實驗步驟與上述之直接結合試驗的步驟相同，除了其使用固定量之dB4-Alexa(濃度250ng/mL)以顯現未被佔據的、空閒 結合位的程度。
3.2.4. 校正微珠
為了同時調查直接結合和未被佔據的結合位，利用兩種Molecular Probes的LinearFlowTM Kits(貨號L14821和L14823)之組合在六個不同場合中的每一個產生log(MFI)-vs-log(bead%)標準曲線。此套件組合於流式細胞儀實驗中提供高和低強度標準之寬廣的校正範圍。作為參考標準，利用這些螢光珠定量位於藉由山羊F(ab)2抗-hIgG FcR-FITC或dB4-Alexa標幟之細胞上的相對螢光。
4. 結果和討論
4.1. dB4的結合曲線和其於CD4-陽性HPB-ALL細胞之絕對結合親和力(Kd)的測定
4.1.1. 對HPB-ALL細胞之結合活性的平衡
在完全描述配體-受體結合反應特徵之前，定義對不同濃度配體達到平衡的時間長度，即高原狀態，在此結合速率等於解離速率。通常已知的狀況為較低的濃度需要越長時間達到平衡。
在於冰上培養CD4-陽性HPB-ALL細胞之dB4-CD4交互作用的例子中，對2.0ng/mL濃度要花約60分鐘，且對50ng/mL濃度要花約15分鐘，以達到%結合數值中的高原。對dB4濃度為100ng/mL(0.1μg/mL)和更高的水平可觀察到幾乎瞬間達到高原狀態。
這些結果指出對寬的濃度範圍(例如，濃度
Figure 104130548-A0101-12-0072-63
2.0ng/mL)而言，dB4結合反應可於1小時達成。結合試驗 可在冷的及/或在0.05%疊氮化合物存在下進行，以避免配體-受體複合體之可能的內噬作用。於室溫或於37℃下培養可較快達到反應的高原狀態。在上述進展的狀況下，HPB-ALL細胞，以三個不同細胞繼代，於冰上與dB4培養1小時。收集上清液以供游離藥物濃度的ELISA測定，且藉由從總數扣除提供結合的部分。利用如第8圖所示之結合曲線計算絕對結合親和力和結合容量。
4.1.2. 對HPB-ALL細胞的直接結合
在三個不同場合(細胞繼代)，2 x 105個HPB-ALL細胞於冰上與dB4(高達~2000ng/mL)培養1小時，抗體展現4-參數羅吉函數(logit function)的飽和結合曲線，在此結合的程度是利用山羊F(ab)2抗-huIgG Fc-FITC測得並以平均螢光強度(MFI)表示。於濃度為200ng/mL(0.2μg/mL)和以上者之結合接近飽和。平均結合EC50測得為42.2ng/mL(表8)，具有小的繼代代數間的差異(between-passage variation)(n=3)。也標準化絕對MFI數值為% MFI以供繼代代數間的比較。因此使標準差減到最小，且EC50數值基本上保持不變；對兩個平均曲線之總平均結合EC50數值測得為42.9ng/mL(表8)。
4.1.3. 於HPB-ALL細胞之結合親和力(Kd)和結合容量(Bmax)
收集培養之後的上清液(冰上培養1小時)供利用ELISA測定游離(未結合)dB4濃度[F]，且因此透過由加入(總)濃度扣除測得結合濃度[B]。利用如表9所示之游離 藥物-vs-結合藥物數據圖表評估對dB4的絕對結合親和力。平均解離常數(Kd)測得為5.6 x 10-11M(範圍：3.1至8.1 x 10-11M)，且最大結合容量(Bmax)測得為每細胞1.2 x 106Ab(範圍：0.93至1.4 x 106)。這些結果指出dB4以特別高的親合力結合至位於HPB-ALL細胞上的CD4受體，且HPB-ALL細胞具有高密度，最高每個細胞對dB4具有超過一百萬個結合位(表9)。位於HPB-ALL細胞上之CD4受體密度較位於血液CD4+ T淋巴細胞者高至少20倍，其為每細胞約3.2-6.1 x 104個結合位。
4.2. dB4和B4於結合至HPB-ALL細胞的比較
面臨的難題在於利用使鼠源B4抗體成為dB4之去免疫化方法以擬人化是否改變了結合親和力，故於使用競爭設計的兩個技術報告上徹底研究此難題。
首先，於以可溶性CD4(sCD4)和p2704a胜肽之捕獲混合物塗覆的ELISA微量盤上調查mAb B4和mAb dB4的結合親和力。p2704a胜肽模擬CD4-CCR5受體複合體，因為其包含位在CCR5上的抗原表位序列，而HIV-1繫住CCR5以進入CD4細胞。當以ELISA分析時可見，於各種濃度之mAb B4或mAb dB4存在下，B4-biotin對塗覆之sCD4/p2704a混合物的結合受到抑制。當mAb B4或mAb dB4抗體共存且與B4-biotin競爭對捕獲蛋白質混合物之結合時，B4-biotin之結合受到抑制，B4和dB4之IC50數值分別為5539ng/mL和8191ng/mL(第9圖)。B4對dB4之IC50比率為0.68，顯示擬人化dB4具有相當於鼠源B4抗 體的結合親和力。
再者，也利用CD4-陽性HPB-ALL細胞研究相 對結合親和力，在此B4或dB4抗體共存且與dB4-Alexa競爭對細胞CD4受體之結合。利用FACS分析，dB4-Alexa結合受到抑制，B4和dB4之IC50數值分別為135和197ng/mL(第10圖)。B4對dB4之IC50比率為0.69，如利用ELISA範例所證明為實質上相同，再次顯示擬人化dB4利用相當於鼠源B4抗體的親和力結合CD4受體。
比較性的競爭型結合抑制試驗，利用親本抗體 B4和其擬人化抗體dB4C7(UB-421)，提供對CD4陽性T細胞(HPB-ALL)的抗體結合曲線，其如同以平均螢光強度(MFI)對一系列抗體濃度(由100至104ng/mL)所測得。此試驗進一步驗證表5和表6所呈現的數據，此兩個抗體的個別中和活性於MT2和PBMC試驗系統中具有相當的中和抗體活性。
當與其親本鼠源抗體B4比較時，這些比較性 試驗所提供之結果指出利用去免疫化技術以擬人化並未顯著地減少dB4C7(UB-421)對CD4受體的結合親和力。
4.3. MAb dB4對CD4的結合特徵
評估mAb dB4對CD4的結合特徵。
4.3.1. MAb dB4對可溶性CD4和對細胞結合之CD4的結合
如以上討論，如利用ELISA所評估，dB4抑制B4-biotin對sCD4/p2704a之結合，其IC50為8191ng/mL(第 9圖)，且如利用FACS測試，dB4抑制dB4-Alexa對HPB-ALL細胞之結合，其IC50為197ng/mL(第10圖)。這些數據有趣地證明，相較於可溶性CD4(sCD4)，dB4對CD4-陽性T細胞具有更高的結合親和力。具體來說，這兩項試驗之IC50數值的比較顯示dB4對CD4陽性T細胞的結合親和力較可溶性CD4高超過40倍。
4.3.2. dB4和gp120 MN於HPB-ALL細胞結合之比較
執行競爭試驗以比較dB4和HIV gp120 MN對結合於CD4-陽性T細胞之CD4的結合親和力。具體來說，比較dB4和gp120 MN抑制dB4-Alexa結合至位於HPB-ALL細胞上之CD4的能力(第11圖)。在第一個試驗中，dB4抑制dB4-Alexa結合至位於HPB-ALL細胞上之CD4，其IC50為1.8nM。在比較試驗中，gp120 MN抑制dB4-Alexa結合至位於HPB-ALL細胞上之CD4，其IC50為97.2nM。依照此結果，發現dB4較gp120 MN對位於HPB-ALL T細胞上之CD4具有實質上更高的結合親和力。具體來說，這兩項試驗之IC50數值的比較顯示dB4對CD4的結合親和力較gp120 MN高至少50倍。
4.3.3. dB4和gp120 MN對CD4之結合親和力的比較
如以上討論，mAb dB4結合至CD4具有約5.6 x 10-11M的結合親和力(表9)。他人先前已發現，透過結晶學研究，HIV-1 gp120結合於CD4分子功能區塊1附近，具有約5 x 10-9M的高結合親和力(Kd)(Myszka,D.G.,et al.,“Energetics of the HIV gp120-CD4 binding reaction” Proc Natl Acad Sci USA.Aug 1,2000；97(16)：9026-9031)。因此，比較dB4和gp120之Kd數值顯示，dB4對CD4之結合親和力較gp120的結合親和力高約100倍。此結果與上述發現(基於IC50數值的比較，dB4結合HPB-ALL細胞較gp120 MN強至少50倍)一致。
體外結果整體顯示，上述討論證明藉由避免或關閉HIV病毒進入，使dB4足以阻斷或減少HIV-1感染。
4.4. dB4(UB-421)對血液CD4+ T細胞的溫度倚賴性結合
研究於正常體溫(37℃)下dB4對人類血液中之CD4+ T細胞的結合，以測定是否可有效地投予dB4作為治療藥物給人類受試者。為了模擬人體的生理環境，dB4C7(UB-421)與新鮮抽取的血液於37℃下培養1小時，且利用紅血球裂解步驟提供周邊血液白血球(PBL)樣品。同時執行於冰上(4℃)的培養。之後以山羊F(ab)2抗-huIgG-FITC染色PBL部分，以顯現dB4對位於CD4-選取T細胞上之CD4受體的直接結合。
與於4℃下培養比較(數據未示)，指出以dB4於37℃下細胞培養1小時並不會造成配體-受體的內噬作用，如同觀察到於鼠抗-CD4(D2)-FITC之MFI無變化。鼠抗-CD4(D2)-FITC(供CD4+ T細胞選取，濃度為50-1000ng/mL)和dB4(目標為CD4受體之D1功能區塊，濃度高達200ng/mL)並不會競爭結合。
如同來自一女性個體之血液樣品所示(第12 圖)，於兩種不同溫度(37℃或4℃)下將周邊血液單核球細胞(PBMC)與dB4培養1小時。染色選取的CD4+ T細胞供於FACS上觀察dB4結合。第12圖顯示dB4於37℃下較於4℃下以5倍高之親合力結合至CD4受體，此乃基於分別為4.8ng/mL和23.0ng/mL的IC50數值。如同預期，dB4於兩種溫度狀況下均可達到相同之最大結合MFI。MFI數值反映受體佔據的程度，特別是當標準化這些數值並以%MFI表示時。
4.4.1. dB4對血液CD4+ T細胞的直接結合
研究於正常體溫(37℃)下dB4對人類血液中之CD4+ T細胞的結合曲線。利用從六個成人(三個男性和三個女性)新鮮抽取的血液於六個不同場合下評估dB4對血液CD4+細胞的直接結合活性(表10)。在1小時培養後，分離周邊血液白血球，以山羊F(ab)2抗-huIgG Fc-FITC染色，並以FACS分析dB4-結合之CD4-選取的T細胞。以參考珠校正樣品以供螢光讀取。發現結合(EC50)數值介於2.6ng/mL至5.7ng/mL，其平均EC50為4.1ng/mL。同樣地，最大% MFI數值介於68%至93%，其平均值為77.8%(表10)。這些結果分別地反映於結合親和力和受體密度上具微小意義的受試者間差異。
4.4.2. 在以mAb dB4佔據受體後之未被佔據的CD4結合位
連同於4℃下dB4對血液CD4+細胞的直接結合(如同以山羊抗-hIgG偵測)，利用dB4-Alexa評估位於 CD4+細胞上之未被佔據，空閒的CD4結合位。
在沒有dB4的狀況下，單獨dB4-Alexa結合物 於濃度為約250ng/mL時可接近其最大結合的~100%(第13圖)。濃度高於500ng/mL時，dB4-Alexa結合物可逐出約10%或更多的結合的dB4(數據未示)。具體來說，當以250ng/mL之接近飽和程度的dB4佔據受體時，dB4-Alexa(於250ng/mL)對CD4受體之結合被完全地阻斷。
與dB4-Alexa結合上升的同時可觀察到受體佔 據隨著dB4存在之下降而下降。受體佔據程度與未被佔據之結合位的程度以對稱方式同步化，且二曲線於濃度約4.0ng/mL處交錯(第13圖)，此與其結合EC50數值一致(表10)。
因此整體結果指出於體外使用250ng/mL的 dB4-Alexa和MFI以及%MFI可作為適當之範例，用以研究對人類受試者投予dB4C7(UB-421)後之體內的受體佔據。
5. 結論
(1)MAb dB4與位於HPB-ALL細胞上之CD4受體交互作用，其具有獨特地高活性，在濃度高於50ng/mL時於冰上達到立即的平衡。絕對結合親和力(Kd)測定為5.6 x 10-11M，且最高時1.2 x 106個dB4分子(Bmax)可結合至單一個HPB-ALL細胞，其較於正常血液CD4+ T細胞者具有至少高於20倍的受體密度。
(2)擬人化鼠源B4成為dB4 mAb並未顯著地改變對CD4受體之dB4結合親和力。藉由結合抑制的設計， 利用基於分子的ELISA(塗覆sCD4和含有CCR5抗原表位之胜肽p2704a)和與HPB-ALL細胞之基於細胞的FACS，兩種抗體同等地阻斷示跡劑(示跡劑為B4-biotin或dB4-Alexa)的結合，於此二實驗中觀察到B4-vs-dB4之IC50比率約為0.7。
(3)dB4抗體以高於HIV-1外套膜蛋白gp120 MN至少50倍之親和力結合CD4受體。具體來說，利用HPB-ALL細胞之結合抑制試驗證明dB4和gp120 MN分別以1.8和97.2nM之IC50數值抑制示跡劑dB4-Alexa之結合。此結果也與dB4的高結合親和力(Kd)(其於先前報導較重組gp120高約100倍)一致。
(4)MAb dB4以與對HPB-ALL細胞相似之結合親和力結合血液CD4+ T細胞。在低溫環境(4℃)下，dB4之EC50為約23.0ng/mL。且在正常體溫(37℃)下，dB4以約5倍高之親和力結合血液CD4+ T細胞，結合EC50為4.8ng/mL。
(5)由來自六個人類受試者之血液樣品的試驗證明dB4濃度和CD4受體佔據間具有直接(成反比的)相關性。如第13圖所示之相反的曲線，交叉於約4.0ng/mL，其與對CD4之dB4的平均EC50結合數值一致。這些整體結果指出於體外使用dB4-Alexa(濃度250ng/mL)和以螢光珠校正之%MFI之測定可作為適當之範例，用以研究對人類受試者投予dB4C7(UB-421)後之體內的受體佔據。
實施例8. 抗體B4有效地抑制HIV之無細胞和細胞間傳播
HIV顆粒典型地藉由無細胞傳播散佈全身，在此病毒擴散於血流和局部環境中以感染細胞。病毒也藉由需要親密細胞間接觸的機制以具有直接地由受感染細胞轉移至未受感染細胞的能力。此種傳播發生於當受感染的細胞與未受感染的細胞形成穩定的接觸點時，並直接地將HIV顆粒傳播給未受感染的細胞。相較於無細胞傳播，細胞間傳播具有較高效率，速度較快，且不需要擴散至血流。
Sigal,A.，等人於2011年報導，於抗病毒藥物tenofovir存在下，起源於無細胞病毒的感染激烈地下降，於共培養試驗中涉及細胞間傳播之感染卻顯著地對藥物較不具敏感性(第14圖)。敏感性的降低在藥物的存在下足以阻止多輪感染的終止。作者使用隨機感染模型在臨床藥物濃度的存在下研究來自細胞間傳播的複製，並發現複製是間歇性的，無突變的實質積累。如果細胞間傳播在體內具有相同的特性，它可能具有對免疫系統的不良後果，具有危險因子以導致個體的治療失敗，並可能有助於病毒的持久性，因此，其為治療HIV感染的障礙。
因此，為了評估其於治療上的潛在影響，重要的是評估用以抑制HIV細胞間傳播之mAb B4和mAb dB4相關抗體的能力及效力。
1. 用以測定HIV細胞間傳播之抗體調停抑制的試驗
1.1. 材料和方法
1.1.1. 細胞和病毒
選擇Jurkat-inGLuc選殖株(來自美國國立衛生研究所AIDS研究和參考試劑計劃)，其具有利用基因工程置入於HIV-1基因體中的報導基因(luciferase)，選擇其作為供體細胞(原因在於在利用目標原代CD4+ T細胞之共培養試驗中，表面CD4之低度表現可使供體-vs-供體感染減到最少)。報導基因luciferase可以在受感染的細胞中表現並作為病毒感染之標誌。可測定於受感染細胞中的這些病毒表現報導者以定量HIV-1感染。以原代CD4+ T細胞作為目標細胞。於此試驗中使用進化支D的病毒UG266和UG046。
1.1.2. 病毒細胞間傳播試驗
在本試驗，在與指明的HIV-1病毒株混合之前，將供體與連續稀釋之抗體B4預培養，並於幾天後使用(當~10-75%的細胞為Gag+時)。之後以於200μl中為1.5×106細胞/ml之最終濃度在96孔盤上以1：2比率混合供體和CD4陽性PBMC目標細胞。於48小時後，針對細胞內Gag進行細胞染色並以流式細胞儀分析。利用BioLux Gaussia Luciferase Assay套組(New England Biolabs)和Berthold Technologies冷光測定儀偵測累積於培養上清液中的GLuc。
1.1.3. IC 50 和IC 90 的校正
透過擬合數據至S形的劑量-反應曲線(多變的 斜率)繪製劑量-反應抑制曲線。抑制的百分比定義為(未處理之目標細胞的訊號百分比-抗體處理之細胞的訊號百分比)/(未處理之目標細胞的訊號百分比)×100。依此計算IC50和IC90。
2. 結果和討論
表11顯示，當透過嚴格的90%進入抑制標準測定時，抗體B4可等效地抑制HIV(進化支C的病毒株UG266和UG046)之細胞間和無細胞傳播。具體來說，分別地發現對UG266和UG046病毒株於細胞間傳播試驗中的融合抑制效價為1：140和1：245，其相當於在無細胞傳播中和試驗中為1：136和1：234之中和效價。當以50%進入抑制標準測定時，相較於相對應之無細胞傳播，在對細胞間傳播觀察到對此兩種病毒株較高的融合抑制效價。
這些結果證明，當與迄今所測定之所有其他針對HIV Env蛋白質的中和單株抗體或其他ART-藥物相比較時，抗體B4於其在抑制HIV之細胞間和無細胞傳播的能力方面均具有獨特的特性。這些結果顯示，只有mAb B4和mAb dB4相關抗體具有資格可在個體中預防HIV病毒的無細胞和細胞間傳播。
實施例9. 抗體UB-421(dB4C7或dB4)調停在HIV感染個體中用於增強病毒複製之靜默PBMCs的再活化
1. 背景
HIV-1感染靜默的周邊血液單核球細胞 (PBMCs)卻保持不活化直到後續的細胞活化。利用體外模型(此體外模型是利用細胞培養條件和允許靜默T細胞非增值性感染之方法，模擬藏匿於靜默PBMCs中的靜默HIV-1)，以研究熱滅活的HIV-1(iHIV-1)或gp120-抗-gp120免疫複合物對這些靜默PBMCs的刺激效應(Briant,L.,et al.,1996)。
此證明偕同熱滅活HIV-1(iHIV-1)或gp120-抗 -gp120免疫複合物之外套膜醣蛋白的CD4接合(CD4 engagement)足以透過交聯以刺激控制NF-κB(即核轉位)和AP-1活化的訊息傳遞路徑，其依次涉及CD4的細胞外功能區塊1(D1)和細胞質內功能區塊與幾種激酶(Lck、Raf-1、MEK和ERK)，以誘導細胞週期進程、促進活化標誌CD25的細胞表面表現，以及刺激原病毒整合和使細胞產生病毒。
由Than等人(Than,et al.,1997)之獨立的科學 發現進一步證實，利用抗-CD4單株抗體於gp120結合位之CD4分子的交聯可誘導來自HIV感染患者之潛伏受感染的PBMCs以促進病毒複製。此試驗中使用的抗-CD4 mAb為Leu3a，其可結合CD4之D1的CDR2-環。具體來說，Leu3是針對線性抗原表位，而此線性抗原表位代表具有CD4功能區塊1內之第47-64個胺基酸的胜肽(Chiba,Y.1992)。
此外，發現藉由針對CD4功能區塊1(D1)之 CDR2-環的單株抗體可特異性地誘導於靜默PBMCs之病毒的再活化，且此並非藉由針對其他抗原表位(例如位於D1之CDR3或接近D1/D2接合點區域(Briant,L.,et al.,1999)) 的抗體(參見第15圖，比較第4長條與第5和6長條)。可利用可溶性CD4(sCD4)事先吸附CDR2-環配體以預防此種病毒再活化(參見第15圖，比較第4長條和第8長條)。
因此，重要的是要評估抗體dB4C7(UB-421) (其對CD4功能區塊1附近區域具有高結合親合力)是否可調停在HIV感染個體中用於增強病毒複製之靜默PBMCs的再活化。
2. 位於CD4之D1附近之B4/dB4構型結合位的結構精算
2.1. 藉由mAb B4對黑猩猩CD4陽性PBMCs之Leu3a結合的競爭型順序結合抑制
於此試驗中使用分離自二受試者(X282和X301)的黑猩猩PBMC細胞、mAb B4(利用FITC標幟)和Leu3a(以PE標幟)。以個別的抗體順序地染色PBMCs並進行細胞螢光顯影(cytofluorography)的分析。由此實驗所提供之數據如表12所描述，並於下文中討論。
於單一標幟的控制組樣品，只利用以Leu3a染色的細胞測試呈現Leu3a-PE結合陽性者；只利用以mAb B4染色的細胞測試呈現B4-FITC結合陽性者。具體來說，於未受感染之黑猩猩樣品(X282和X301)的CD4+細胞(如利用Leu3a所偵測)分別為25.5%和44.0%，其與那些以mAb B4偵測者(26.1%和45.5%)相似。
事先結合Leu3a之後暴露於mAb B4導致雙重染色的(Leu3a+/B4+)PBMC細胞數量與單獨只利用Leu3a 或B4染色之單一標幟的控制組細胞相似(即對X282和X301分別為24.5%和46.7%)。
相反地，事先結合mAb B4之後暴露於Leu3a 導致在單一或雙重染色過程中只有無Leu3a陽性染色之mAb B4染色的PBMCs。
整體來說，這些結果證明藉由針對Leu3a-PE 之抗體B4-FITC的單向抑制。也就是說，藉由事先Leu3a結合未能阻斷B4結合；然而，事先B4結合可阻斷Leu3a結合。結論為mAb B4辨識涵蓋CD4功能區塊1之CDR2區域的構型抗原表位(抗體Leu3a可辨識此區域)，且mAb B4以相較於抗體Leu3a之較高的親和力結合CD4的此區域。而這些數據支持此結論。
2.2. 利用針對HIV RC胜肽(第39-66個胺基酸)之免疫血清對B4結合至rsCD4進行競爭型抑制(ELISA方法)
透過利用針對CD4功能區塊1 CDR2區域之免疫血清的競爭型抑制試驗，評估mAb B4對完整重組可溶性CD4(rsCD4)的結合親合力。
2.2.1. 抗-HIV RC多株抗體
利用包含CD4第39-66個胺基酸的環狀胜肽免疫天竺鼠以製備針對CD4功能區塊1之CDR2區域的多株抗體。此環狀胜肽於本試驗中稱為HIV受體複合體胜肽(HIV RC胜肽)，且如同先前於Wang等人在2002年所描述之胜肽p2240c。
具體來說，第0週是配製於完全弗氏佐劑者， 且第3和6週是配製於不完全弗氏佐劑者，接著在此之後以配製於不完全弗氏佐劑者每月加強，以每劑量0.5ml中內含100μg者肌肉注射免疫接種4-6週齡的Duncan Hartley天竺鼠後，於特定時間點收集針對HIV RC胜肽之天竺鼠血清。
提供的多株抗體稱為“抗-HIV RC多株抗體”。
2.2.2. 藉由抗-HIV RC多株抗體對B4結合rsCD4進行競爭型抑制
利用每孔洞以體積0.1mL濃度0.08μg/mL之完整rsCD4塗覆的96孔微量盤進行競爭型抑制實驗。在利用生物素化B4-抗體結合前，將天竺鼠血清(在利用針對HIV RC胜肽(CD4的第39-66個胺基酸)之免疫原免疫接種後第0、3、6、9、12、14、16和19週收集天竺鼠血清)以1：30的比例稀釋與孔洞培養，之後利用與卵白素(avidin)-HRP之結合作為示跡劑。也對從整個試驗同期所收集來自未免疫接種之天竺鼠的陰性控制血清(RC同型)進行測試。
第16圖顯示藉由於初次免疫後第6週所提供之抗-HIV RC多株抗體可顯著地抑制生物素化-B4結合至rsCD4，藉由於初次免疫後第9週所提供之抗-HIV RC多株抗體可達到近乎完全的抑制。
此競爭型結合抑制試驗進一步證明mAb B4的結合位是位於CD4功能區塊1的CDR2環附近，雖然藉由 mAb B4直接結合至此胜肽並非顯著地是因為mAb B4對與膜結合的CD4之構型結構的偏好性結合。
2.3. 於mAb dB4交聯時在HIV感染個體中用於增強病毒製造之靜默CD4陽性T細胞的再活化
藉由利用mAb dB4處理細胞與觀測TNF-α產量、病毒量和細胞增生，以評估mAb dB4活化靜默CD4+細胞的能力。
在此試驗中，藉由將培養盤與200μL山羊抗-人IgG(Jackson ImmunoResearch)在37℃下培養1小時，以將人類IgG塗覆於8孔培養盤。將塗覆的培養盤保存於4℃冰箱中直到本試驗進一步使用。
依照標準作法將來自HIV患者之PBMC解凍1.5小時。如下所述，利用mAb dB4(實驗組)、PMA+PHA(陽性控制組)或只有培養液(陰性控制組)處理PBMC，以評估靜默CD4+細胞的活化。
2.3.1. MAb dB4處理
以mAb dB4(濃度為3μg/106細胞/mL)於4℃下處理細胞1小時以引發細胞上CD4的交聯。細胞以mAb dB4處理，之後洗滌，並以RPMI培養液和10%胎牛血清於塗覆的48孔培養盤上培養7天。以未塗覆之孔洞作為陰性控制組。於第0天、第2天和第7天冷凍培養上清液供之後的評估。於4℃處理30分鐘後由細胞移除上清液，以提供作為mAb dB4樣品之時間點第0天。
2.3.2. PMA+PHA處理
以0.1μM植物凝集素(phytohaemagglutinin，PHA)加上15μg/mL豆蔻酸-佛波醇-乙酸酯(phorbol myristate acetate，PMA)(Sigma)(PMA+PHA)於塗覆的48孔培養盤上和RPMI培養液與10%胎牛血清處理細胞7天，作為再活化之靜默CD4+細胞的陽性控制組。利用未塗覆之孔洞作為陰性控制組。於第0天、第2天和第7天冷凍培養上清液供之後的評估。於4℃處理30分鐘後由細胞移除上清液，以提供作為PMA+PHA樣品之時間點第0天。
2.3.3. 只有培養液
如同陰性控制組，於塗覆的48孔培養盤上以RPMI培養液和10%胎牛血清培養細胞7天(只有培養液)。利用未塗覆之孔洞作為額外的陰性控制組。於第0天、第2天和第7天冷凍培養上清液供之後的評估。於4℃下在培養液中培養30分鐘後由細胞移除上清液，以提供作為只有培養液樣品之時間點第0天。
2.3.4. CD4+再活化的分析
藉由評估TNF-α產量、病毒量和細胞增生以測定CD4+細胞的再活化。於表13概述來自本試驗之結果。
使用標準方法分析來自所有樣品之溶液，項目包含：(1)利用定量的ELISA分析TNF-α濃度；(2)利用RT PCR分析HIV病毒量；(3)細胞數量；以及(4)利用錐蟲藍(trypan blue)分析存活率。
具體來說，數據顯示，相較於只有培養液的陰性控制組(低於檢測極限)和以PMA+PHA刺激的細胞(較 mAb dB4覆蓋之細胞高約3至5倍)，mAb dB4交聯所覆蓋之來自HIV患者的PBMC細胞可引起TNF-α的中度生成。
同樣地，mAb dB4樣品以與只有培養液之陰性 控制組相似的速率增生；然而，PMA+PHA刺激的細胞具有相較於以mAb dB4交聯之細胞更大程度的增生(在第7天時，於PMA+PHA培養組別之細胞數量為mAb dB4培養組的5倍高)。
然而，相較於培養液控制組和PMA+PHA刺激 的細胞，於以mAb dB4交聯之細胞的HIV病毒量顯著地增加。具體來說，當於第2和7天與只有培養液之陰性控制組相比較時，以mAb dB4交聯之細胞於病毒量分別地具有151%和220%的增加；然而，PMA+PHA培養具有次佳的病毒量產生(於第2和7天分別為55%和78%)，儘管其細胞增生有5倍量的增加。
3. 結論
(1)發現鼠源mAb B4可辨識位於CD4上的構型位置，且此構型位置接近抗體Leu3a所辨識的位置(位於CDR2區域第47-64個胺基酸)。基於在實施例7所描述之比較性試驗，預期mAb dB4具有如同在此所述之對於mAb B4而言相同的辨識特性。
(2)利用多株抗體(此多株抗體是針對含有CD4功能區塊1之CDR2區域第39-66個胺基酸的環狀胜肽(HIV RC胜肽))可抑制鼠源mAb B4對完整rsCD4之結合。 這些結果顯示mAb B4辨識CD4第39-66個胺基酸，其對應至CD4之D1的CDR2環。基於在實施例7所描述之比較性試驗，預期mAb dB4具有如同在此所述之對於mAb B4而言相同的辨識特性。
(3)發現CD4與mAb dB4交聯於HIV感染的PBMC CD4+ T細胞可活化病毒製造。具體來說，mAb dB4誘導TNF-α產生，並增強HIV製造，而未誘導細胞增生(如表13所示)。
(4)基於此實施例所提供之結果，mAb dB4(包含UB-421)能調停在HIV感染個體中用於增強病毒製造之靜默PBMCs的再活化。
實施例10. MAb dB4C7和抗-HIV RC多株抗體抑制抗原所引發的T細胞增生和CD4陽性T細胞的細胞激素(IL2和IFN-γ)製造，因此破壞細胞焦亡的HIV致病循環
1. 背景
最近的報告顯示，當HIV病毒感染允許(permissive)、活化的CD4+ T細胞時，細胞死亡透過caspase-3依賴性的細胞凋亡默默地發生(Doitsh,G.,et al.,2014)。相反地，當R5或X4-向性HIV失敗地感染來自淋巴組織之非允許(non-permissive)、靜默的CD4+ T細胞時，這些細胞透過caspase-1依賴性的細胞焦亡而死亡，其為程序性細胞死亡之強烈的炎症形式。被視為宿主DNA感測器的干擾素誘導因子16(IFI16)可識別不完整的HIV反轉錄 產物，進而引發caspase-1的活化(Monroe,K.M.,et al.,2013)。在大多數的人類淋巴組織(包含扁桃體、淋巴結和脾臟)中，活化和允許的細胞次群體代表了CD4 T細胞總數中的5%或更少數量，而非允許靜默細胞則代表了遭遇HIV之目標中的95%或更多數量。因此，Caspase-1調停的細胞焦亡似乎主要地負責在這些淋巴組織感染HIV後驅使CD4 T細胞死亡，而非caspase-3調停的細胞凋亡。分析來自以R5-向性HIV感染之受試者的新鮮淋巴結進一步支持這些發現，其中在富含靜默CD4 T細胞的皮質區可偵測到caspase-1和IL-1β，而發現在解剖學上不同的生發中心(在此發現生產性感染細胞)可偵測到caspase-3活性。
細胞焦亡極可能透過前發炎性細胞激素的釋 放和內生性危險訊號，藉由移除細胞內複製的小生境(niches)和增強宿主的防禦反應，促進各種細菌性感染的快速清除。然而，在致病的慢性炎症，例如HIV感染，細胞焦亡不是保護性反應且並不會導致原發性感染的清除。事實上，細胞焦亡似乎製造了惡性的致病循環，在此瀕死CD4 T細胞釋放炎症信號以吸引更多細胞進入受感染的淋巴組織，進而死亡並產生更多的炎症。這些事件建立了炎症的慢性狀態，其刺激病程和組織損傷。慢性炎症也可能促進潛伏HIV病毒庫的維持，而潛伏HIV病毒庫可刺激記憶CD4 T細胞的恒定性增生。
CD4 T細胞的耗竭和慢性炎症的發展是推動 疾病進展之HIV致病機制中的特徵過程，且細胞焦亡提供 了這兩種疾病-促進過程之間意外的連結。
以上資料顯示，透過抑制由CD4+細胞之抗原 刺激所引發的CD4+細胞增生及/或發炎性細胞激素製造的機制可能可以減輕或減少發生於HIV感染期間在淋巴組織的細胞焦亡。
2. 實驗
進行研究以確定是否mAb dB4可藉由於HIV感染個體抑制慢性炎症發展以破壞由細胞焦亡所引起的致病循環。抑制由抗原刺激所引發之細胞激素製造有助於緩解許多靜默T細胞(靜默T細胞已經有失敗的HIV感染)之細胞焦亡的負擔，從而破壞起因於細胞激素所造成CD4陽性T細胞耗竭的HIV病理。
利用金黃色葡萄球菌B型腸毒素(SEB)之體外模型評估mAb dB4C7(UB-421)在正常和HIV感染個體中抑制PBMC T細胞增生的能力。SEB是一種超抗原，其具有刺激帶有特定T細胞抗原受體(TCR)之所有T細胞的能力，並可誘導大量的細胞激素製造。
透過與Huyen Cao和Mohamed Elrefaei博士的合作，進行了正常人類供體(n=3)和HIV感染供體(n=6，未使用ART治療的患者，CD4+數量>200，病毒量>10,000)的功能分析，以評估mAb dB4C7(UB-421)或針對CD4之D1的CDR2區域的抗-HIV RC多株抗體(實施例9)是否可以抑制細胞增生和細胞激素(IL2和IFN-γ)的產生。
2.1. 研究對象和樣品
從REACH cohort(舊金山)招募HIV-陽性未使 用ART治療的志願者(n=6)。也將三個年齡一致的HIV-血清反應陰性控制組的志願者納入此試驗中。將PBMC分離並冷凍保存在液態氮中直到試驗的時間。
2.2. 使用mAb dB4C7或純化的抗-HIV RC多株抗體的飽和濃度
首先在間接免疫螢光試驗中分別以mAb dB4C7 IgG或抗-HIV RC多株抗體IgG染色CD4+ T淋巴細胞，之後再用Alexa-山羊抗-HuIgG或Alexa-山羊抗-天竺鼠IgG進行染色。為了偵測陽性細胞百分比，透過流式細胞儀分析所得之染色的細胞。MAb dB4C7和抗-HIV RC多株抗體於2倍稀釋所測得之效價介於50μg/mL和0.0025μg/mL。MAb dB4和抗-HIV RC抗體的抗體效價測定為% CD4結合對抗體濃度(μg/mL)。在於HIV感染和正常個體進行T細胞功能測試使用之前評估這些抗體效價。
第17圖顯示於功能試驗中所使用各試劑的飽和濃度，mAb dB4(dB4C7)為1μg/mL和抗-HIV RC多株抗體為25μg/mL。
2.3. CD4+或CD8+ T細胞的增生
利用羧基螢光素琥珀醯亞胺酯(carboxy-fluorescein succinimidyl ester，CFSE)螢光試驗分析細胞增生，其在細胞分裂時產生羧基螢光素二乙酸鹽琥珀醯亞胺酯(carboxy-fluorescein diacetate,succinimidyl ester，CFDA-SE)染色的減少。利用CFSE作為3H-胸腺嘧 啶(增生)測試的代用品。
以mAb dB4C7或純化的抗-HIV RC多株抗體 之飽和濃度與PBMCs培養，以覆蓋位於細胞表面上的CD4受體。細胞也分別與抗-HIV RC同型(濃度為25μg/mL)和PHA(10μg/ml；Sigma-Aldrich)培養作為陰性和陽性控制組。
於PBS中以CFDA-SE(Molecular Probes， Eugene，OR)標幟PBMCs，之後以100% FCS(Sigma-Aldrich,St.Louis，MO)進行螢光淬熄。在以PBS洗滌後，將細胞再懸浮於具有10% FCS的RPMI 1640(Sigma-Aldrich)中。
之後在SEB抗原(1μg/mL)存在下，將細胞於 37℃含5% CO2之條件下培養5天，並分析表面標誌的表現。
利用流式細胞儀圈選CD3+(Amcyan)細胞群 中CD4+(PE，D2)及CD8+(PercpCY5.5)細胞群進行分析，並針對% CFSE陽性細胞(作為%增生細胞)進一步測定此細胞群。利用LSR II(BD Biosciences，Mountain View，CA)獲得每個樣品四萬(40,000)個淋巴細胞，並利用FLOWJO軟體(TreeStar,San Carlos,CA)分析。結果測定為分裂的CD4(或CD8)T細胞的百分比。所有試驗參與者證明於PHA刺激後之顯著的細胞增生。CD4 T細胞在無SEB抗原刺激下之細胞增生為<0.5%(陰性控制組)。
2.4. 用以測定細胞激素(IL2和IFN-γ製造)的細胞內染色試驗
PBMC(0.5 x 106個細胞)與SEB抗原(1μg/mL) 於37℃含5% CO2之條件下培養2小時。以含有0.1% FCS之PBS(洗滌緩衝液)洗滌細胞，將細胞再懸浮於裂解緩衝液(BD Biosciences)中於室溫下反應10分鐘進行固定。細胞以洗滌緩衝液洗滌一次，之後將細胞再懸浮於0.5mL的膜通透劑2(BD Biosciences)中並於室溫下培養10分鐘進行透化處理。接著以洗滌緩衝液洗滌細胞，並以抗-IL-2 APC、抗-IFN-γ(PE CY7)以及抗-CD3(Amcyan)、抗-CD4(PE，D2)或抗-CD8(Percp CY5.5)(BD Pharmingen)染色。 利用LSR II(BD Biosciences)獲得每個樣品四萬(40,000)個淋巴細胞，並利用FLOWJO軟體(TreeStar)分析。在無抗原刺激下之細胞激素-製造CD4或CD8 T細胞的百分比為<0.05%(陰性控制組)。結果表示為表現IFN-γ或IL2之CD4+(或CD8+)T細胞的百分比。
2.5. 統計分析
利用配對t檢定進行統計分析和比較。
3. 結果
此SEB抗原引發之T細胞增生試驗所提供的結果顯示，在未使用HIV ART治療的患者和年齡一致的正常個體中，mAb dB4C7(1μg/mL)和抗-HIV RC多株抗體(25μg/mL)在飽和狀態下均可減少CD4+ T細胞增生，而非CD8+ T細胞增生(數據未示)。
MAb dB4(1μg/mL)和純化的抗-HIV RC多株抗體(25μg/mL)於其個別的飽和PBMC表面CD4結合濃度 下，於HIV陰性(第18A圖)和HIV陽性(第18B圖)個體均可抑制由超抗原SEB所引發增生CD4+ T細胞的IL2生成。 於來自相同HIV陽性和陰性個體的CD8+ T細胞中則未發現此種抑制(第18C圖)。
MAb dB4(1μg/mL)和純化的抗-HIV RC抗體 (25μg/mL)在其個別的飽和濃度下，於HIV陰性(第18D圖)和HIV陽性(第18E圖)個體也均可抑制由超抗原SEB所引發增生CD4+ T細胞的IFN-gamma生成。於來自相同HIV陰性(第18F圖)和陽性(第18G圖)個體的CD8+ T細胞中則未發現此種抑制。
4. 結論
抗體mAb dB4C7(UB-421)和抗-HIV RC多株抗體，二者針對CD4功能區塊1的CDR2區域，發現可抑制超抗原SEB所引發藉由CD4陽性T細胞的T細胞增生和細胞激素(IL2和IFN-γ)生成，而非藉由CD8陽性T細胞的T細胞增生和細胞激素(IL2和IFN-γ)生成。發現dB4C7和抗-HIV RC多株抗體可抑制CD4+ T細胞增生和相關細胞激素(IL2和IFN-γ)生成，顯示此抗體可能對其他CD4陽性細胞相關的細胞激素生成展現相似的抑制效果，具有破壞細胞焦亡之HIV致病循環的潛力。
在此與先前實施例所觀察到，其對CD4陽性T細胞增生和相關細胞激素(IL2和IFN-γ)生成的抑制效果為高度顯著，其中在此所述之針對CDR2區域的抗體對CD4細胞可能展現同時發生的相反效果，包括：(1)靜默HIV感 染之CD4陽性T細胞的再活化，以引發由其潛伏狀態釋出HIV(實施例9)；(2)藉由靜默CD4+ T細胞的再活化，競爭型抑制和預防HIV從新釋出的病毒進入未受感染的CD4陽性T細胞(實施例4和6)；以及(3)當(超)抗原刺激時藉由CD4陽性T細胞抑制T細胞增生和細胞激素生成(此實施例)。
針對HIV結合之特定位置(即CD4功能區塊1 的CDR2區域)的mAb dB4和抗-HIV RC多株抗體的獨特生物特徵和免疫反應的引發可提供功能性治癒HIV感染所需的特性，即能夠(1)透過進入抑制阻止HIV感染；(2)於靜默T細胞再活化病毒製造；以及(3)直接地改變細胞激素生成。
實施例11. 於以進化支B之HIV原代分離株HIV-1 DH12 攻毒的黑猩猩利用mAb B4對HIV感染的暴露前和暴露後預防和治療
已證明針對CD4功能區塊1之CDR2區域的B4相關高親和力抗體具有許多獨特的體外特性，重要的是要在最像人類的動物模型中測試B4抗體於預防及/或治療HIV感染的療效。已使用黑猩猩作為人類病毒、細菌和寄生蟲感染的模型超過100年了。於黑猩猩所精心制定的攻毒模型中，使用進化支B之HIV原代分離株HIV-1DH12展開攻毒試驗，以評估mAb B4於暴露前和暴露後模式中對HIV-1感染提供被動性免疫的潛力。具體來說，評估mAb B4 所能提供的能力，包含(1)針對感染用以保護受暴露之受試者的消除性免疫，和(2)於證實感染後幾天投予抗體時對受暴露的受試者進行治療。
1. 於黑猩猩利用mAb B4對HIV感染的暴露前和暴露後預防
評估mAb B4於攻毒前和攻毒後(暴露於HIV-1)模式對HIV-1感染提供被動性免疫的潛力。
1.1. 方法
1.1.1 試驗使用之動物
本試驗總共使用4隻黑猩猩。使用一隻黑猩猩作為暴露前治療動物(X084)，使用二隻黑猩猩作為暴露後治療動物(X356和X357)，以及使用一隻黑猩猩作為控制組(X259)。
1.1.2 動物對以HIV-1 DH12 病毒原液感染的敏感性
在治療和感染前利用其PBMC之體外感染測定動物對以HIV-1DH12病毒原液感染的敏感性。在暴露於病毒3天內可感染所有培養物。
1.1.3 MAb B4抗體
製備供輸注使用之mAb B4作為高度純化的抗體製劑(濃度為5mg/mL)。
1.1.4 攻毒前預防/治療
於HIV-1DH12攻毒前1小時利用5mg/kg的mAb B4對黑猩猩X084進行靜脈輸注。
1.1.5 攻毒後預防/治療
於HIV-1DH12攻毒後1小時利用5mg/kg的mAb B4對黑猩猩X356和X357進行靜脈輸注。
1.1.6 控制組動物
以HIV-1DH12攻毒黑猩猩X259而未以mAb B4抗體進行輸注。
1.1.7 以HIV-1 DH12 攻毒
以HIV-1DH12的100 TCID50(其取自預先製備的病毒原液，並已於西南生物醫學研究基金會在黑猩猩PBMC中測定效價)靜脈攻毒四隻黑猩猩。
1.1.8 HIV-1 DH12 病毒的偵測
利用gag序列的DNA PCR放大、共培養、p24捕獲ELISA和免疫墨點法，藉由血漿病毒血症、細胞相關病毒量和對HIV之免疫反應的偵測，以監測於黑猩猩的感染確立。利用來自所有黑猩猩於50週研究期期間內所收集之所有血液樣品的HIV-1 RNA copies/mL，以測定HIV感染的血清病毒血症指標。利用病毒分離和DNA PCR試驗(DNA PCR試驗是用以偵測對應gag的原病毒DNA)於黑猩猩PBMC中偵測HIV-1DH12病毒。利用p24抗原捕獲ELISA(Coulter)評估病毒製造。製備黑猩猩PBMC和淋巴結細胞之1×106至1×102個細胞的連續稀釋，於IL-2培養液中與來自3日齡之PHA刺激的母細胞(數量為2×106個細胞)進行共培養。選取導致p24製造之最高稀釋度的孔洞作為終點指標。
1.1.9 動物飼養
經機構IACUC的批准並依照國家研究委員會的指導方針，將黑猩猩飼養在西南生物醫學研究基金會。
1.2. 結果
利用mAb B4對接受HIV-1DH12攻毒之黑猩猩提供消除性免疫。在HIV-1攻毒前以mAb B4抗體輸注的動物中(X084)(第19A圖)，或在於HIV-1攻毒後1小時以mAb B4抗體輸注的兩隻動物中(X356和X357)(第19B圖)，在攻毒後後續的32週期間內未偵測到感染的標誌。
相反地，在攻毒後第1週開始由控制組動物(X259)從PBMC(第19C圖)和在攻毒後第2週時由血漿可輕易地分離出病毒。也可於第4和20週由X259活組織切片的淋巴結細胞分離出病毒。於包含細胞數量範圍介於1×104至1×106的稀釋物中，可偵測到於PBMC和淋巴結隔間之受感染的細胞。在第4週於動物X259發生血清轉化。
在利用抗體治療的黑猩猩X084、X356和X357發現在血液循環中所呈現的游離、未結合之mAb B4迅速下降。來自接受治療之黑猩猩的CD4+和CD8+次群體在攻毒後20週期間的監測下無CD4+耗竭的證據。到第32週期間，黑猩猩PBMC對有絲分裂促進劑(PHA、商陸果實分裂素(Pokeweed mitogen)和刀豆素(Concanavalin A))的增生反應無抑制作用。
此試驗結果指出mAb B4對HIV感染可以提供預防或消除性治癒，透過從攻毒日起甚至一年之血清病毒血症和其他參數的廣泛隨訪可證明此試驗結果。
1.3. 結論
在黑猩猩試驗中，可藉由暴露之前或暴露之後於短暫時間間隔之內的mAb B4投予以中止藉由致病性原代分離株的HIV感染。過繼免疫(transferred immunity)被消除，且無暫時、減少或延遲的病毒血症證據。透過mAb B4被捕捉在位於周邊血液和淋巴組織的CD4+細胞上，儘管mAb B4抗體從血漿中快速清除，但完整的保護是明顯的。
精心執行的試驗進一步指出，使用5mg/kg之mAb B4或相關抗體的治療計畫書可供(i)遭受HIV患者於數小時內，或(ii)由血清反應陽性母親所生下之嬰兒於生產時，以達到消除性治癒。
1.4. 藉由mAb B4對暴露後預防的應用
美國公共衛生服務指南對意外地暴露於HIV後之醫護人員推薦使用抗反轉錄病毒藥物的暴露後預防。然而，美國公共衛生服務指南對暴露後預防目前可用藥物的毒性持保留態度。
在此試驗所獲得的結果證明使用mAb B4作為暴露後預防性治療以代替或合併使用現行暴露後治療方法的潛力。MAb B4的低毒性和療效證明此抗體較抗反轉錄病毒藥物更為廣泛有效的潛力。
這些結果進一步指出mAb B4可用於從母親到孩子之HIV垂直傳播的預防。HIV的母嬰傳播(Mother-to-child transmission(MTCT))也稱為週產期或垂直傳播，發生於懷孕、分娩，及/或生產或母乳餵養期間， 將HIV從HIV+的婦女傳播給其嬰兒。對未接受針對病毒之治療的HIV+婦女在懷孕、分娩和生產期間的MTCT機率約為25%。在以母乳餵養其嬰兒之未經治療的HIV+婦女，MTCT有額外12%的機會。在全世界，在2001年，1.8萬名婦女感染HIV，且大約80萬名兒童也成為HIV感染者，其中多數是經由MTCT。在全世界被新診斷為HIV之大部分的人是介於15-24歲之間。MTCT預防的一個非常重要的構成要素是必須針對年輕人進行HIV預防，尤其是女孩和年輕婦女在其變得性生活頻繁之前，並對那些已感染者進行治療。關於MTCT的額外訊息可以在http：//caps.ucsf.edu/archives/factsheets/mother-to-child-tra nsmission-mtct#sthash.DTRyms46.dpuf找到。利用mAb B4所得到的結果指出，可藉由對HIV+婦女之新生兒提供5mg/kg或更多之mAb dB4的單次投予，以在分娩和生產階段期間預防MTCT。
2. 於黑猩猩利用mAb B4治療HIV感染
2.1. 方法
2.1.1 試驗中使用的動物
黑猩猩X084、X356和X357在先前預防試驗中使用且接受5mg/kg之mAb B4的單次投予，以保護其免於HIV-1DH12的感染，其以治療模式於此攻毒試驗中再次使用。
2.1.2 動物對以HIV-1 DH12 病毒原液感染的敏感性
在抗體治療和HIV攻毒之前，從動物製備 PBMCs以測定其對以HIV-1DH12感染的敏感性。利用病毒於預防接種的3天內感染所有的體外培養物。
2.1.3 MAb B4抗體
製備供輸注使用之mAb B4作為高度純化的抗體製劑(濃度為5mg/mL)。
2.1.4 以HIV-1 DH12 攻毒
以HIV-1DH12的100 TCID50(其取自預先製備的病毒原液，並已於西南生物醫學研究基金會在黑猩猩PBMC中測定效價)靜脈攻毒所有動物(X084、X356和X357)。
2.1.5 攻毒後治療
黑猩猩X084沒有任何攻毒後治療。在攻毒後第14天以5mg/kg的mAb B4輸注黑猩猩X357，此時於供HIV感染治療之受攻毒的動物中的HIV病毒血症為最高。在攻毒後第14、18和22天以5mg/kg的mAb B4輸注黑猩猩X356。
2.2. 結果的概述
利用輸注5mg/kg鼠源mAb B4進行被動性免疫治療試驗，以於具有急性期HIV感染之黑猩猩測定mAb B4的療效。以HIV-1DH12靜脈注射(i.v.)預防接種三隻黑猩猩(X084、X356和X357)，並基於病毒檢測(未示出)和定量RT-PCR證實感染確立。
於所有黑猩猩(X084、X356和X357)在暴露後7天利用RT-PCR檢測來自HIV-1DH12的RNA(基線以上)。 利用病毒分離和利用HIV-1DH12整合偵測的DNA-PCR，於14天內在來自所有三隻動物之PBMCs和淋巴結細胞中檢測細胞相關病毒。
在感染後第14天，利用mAb B4(5mg/kg，靜 脈注射)輸注受感染黑猩猩中的2隻(X356和X357)。在感染後第18和22天，一隻動物(X356)接受額外兩劑的抗體(5mg/kg，靜脈注射)。對前12週以每週間隔和之後直到感染後40週每月地利用RT-PCR試驗監測病毒量。在感染後第14天時，以mAb B4輸注黑猩猩X356和X357，病毒RNA已經處於一個快速上升的階段。相較於未接受治療的黑猩猩(X084)(第20A圖，空心圓)，接受抗體的兩隻黑猩猩之後在第20天時經歷於其病毒量快速且顯著的下降(下降幅度為1-2個對數)，以及於初期病毒血症期持續時間的顯著降低(初期病毒血症期持續時間由4週降至1週)(第20A圖，實心圓)。
第20A圖和第20B圖比較於未接受治療的控 制組黑猩猩X084(來自本試驗，其先前接受mAb B4的單次暴露前投藥)與未接受治療的控制組X259(來自先前試驗，其未接受mAb B4的投藥)和接受mAb B4三次輸注之黑猩猩X356的血漿病毒血症持續時間。於病毒攻毒後，如血清HIV-1 RNA copies所檢測，在無任何干預下利用HIV-1DH12攻毒黑猩猩X084(第20A圖，空心圓)和X259(第20B圖，空心圓)，並顯示早在第3天開始病毒血症。血清HIV-1病毒血症的持續時間約42天，為HIV-1DH12感染的 特徵。黑猩猩X356(第20A和20B圖，實心圓)接受mAb B4的三次投予，且HIV-1病毒血症急劇下降，之後在或約在第21天達到低於檢測極限。比較X356和X084與X259之間的病毒量數據顯示，從HIV-1DH12感染之特有的病毒血症持續時間減少了21天。
如上所述，來自本試驗之未接受治療的控制組 黑猩猩X084於先前試驗中接受了mAb B4的單次暴露前投予；而來自先前試驗之未接受治療的控制組黑猩猩X259則未接受任何mAb B4投予。有趣的是，比較X084(第20A圖，空心圓)與X259(第20B圖，空心圓)所提供之數據顯示，相較於X259，在試驗期間X084具有整體較低的病毒量。因此，雖然在此試驗中未接受治療的動物(X084)的病毒量顯著高於mAb B4治療的動物(X356)，於X084對mAb B4之先前暴露似乎顯著地減少整體病毒量，特別是在HIV感染的急性期期間(比較X084與X259)。整體來說，這些結果指出於HIV暴露前之mAb B4的任何投予可減少在感染急性期期間之病毒量程度，其可能進一步降低感染後從個體至個體的病毒傳播。
另外，進行細胞表面染色發現，在第14天時 於投予mAb B4單一劑量的動物(X357)中，mAb B4結合至CD4+細胞維持了至少七天。且於投予此抗體之多劑量的動物(X356)中，mAb B4結合至CD4+細胞持續了至少14天。 相反地，只在輸注後三天之動物中於血液循環內偵測到游離mAb B4，如利用針對HIV-1DH12分離株之中和活性所測 得。如同在黑猩猩的預防試驗中，這符合藉由結合至CD4+細胞而已經將mAb B4由血液循環中移除。
利用對於CD4/B4抗原表位的體外免疫染色， FACS分析在40週期間可於所有樣品中偵測到CD4+細胞而無顯著的耗竭。在前21天的期間於PBMC之上完成輸注mAb B4的免疫染色。PBMC樣品之有絲分裂促進劑所誘導的增生反應(利用刀豆素、PWM或PHA)在抗體治療前和後是不同的，且似乎不受mAb B4輸注所影響。這些觀察指出mAb B4能夠破壞病毒感染，且減少病毒量及病毒血症期，而無不適當的免疫毒性。
實施例12. UB-421製劑，於狒狒之臨床前藥理學/毒性試驗和在人體組織的交叉反應性
簡介
於前述實施例所討論之細胞培養和黑猩猩試驗中所獲得的數據證實，有足夠的科學價值證明進一步發展供人類使用之含有mAb dB4的藥物製劑是有理的。製備含mAb dB4C7(UB-421)的藥物製劑，並為臨床使用而於大量生產上進行一般的安全性測試。
另外，進行一組臨床前安全性試驗以提供針對候選藥物UB-421的藥效學、藥物動力學、毒性和安全性資訊。
在狒狒(Papio species)進行單次與多次投予以及劑量依賴性(低和高劑量)試驗，以協助第一期臨床試驗 的設計，用以評估在無症狀HIV-1感染的人類受試者中UB-421之劑量依賴性的安全性、耐受性和免疫毒性。於臨床前藥理/毒性試驗使用狒狒作為動物模型，原因為狒狒的CD4+ T細胞具有與人類相似的對mAb dB4C7結合親合力，如第21圖所示(即對人類和狒狒分別為EC50=0.33μg/mL和0.29μg/mL)。與Krishna Murthy博士(西南生物醫學研究基金會，病毒學暨免疫學部門，聖安東尼奧，德州)合作以開始與執行在狒狒的非人類靈長類動物藥理和毒性試驗。
此外，執行交叉反應性試驗，以評估UB-421 是否具有任何非預期性的反應性，和對有別於預定目標之人類組織之細胞毒性的可能位置。
如以下進一步詳細討論者，從這些臨床前試驗 所得到的數據顯示具有足夠的科學價值證明進一步發展UB-421作為在人體臨床試驗之試驗性新藥是有理的。
1. 藥劑劑型
為了供人類使用而製備含有mAb dB4C7的藥劑劑型。一般來說，包含mAb dB4C7之藥劑劑型可配置於適當的緩衝液中包含，但不限於，檸檬酸鹽、磷酸鹽、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、1,3-二[三(羥甲基)甲基氨基]丙烷(BIS-Tris)等，於介於6.0至7.0之pH值，且可包含賦形劑(例如醣類(50mM至500mM的蔗糖、海藻糖、甘露醇，或其混合))、界面活性劑(例如：0.025%-0.5%的Tween 20或Tween 80)，及/或其他試劑。
UB-421是指定為於磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS)(pH 6.5)中包含10mg/mL mAb dB4C7、20mM甘胺酸，以及0.05%(v/v)Tween(polysorbate 20)的醫藥組成物。
MAb dB4之高濃度劑型也可供包含皮下注射的應用而加以製備，其包含10mM組胺酸。
製造之後，執行一般的安全性和毒性試驗以確保製造的藥物產品對投予人類和動物受試者是安全的。
2. 一般的安全性試驗
2.1. UB-421生產批次和安全標準
以兩個大規模生產(P/N Z807，批號225711和225758)製備UB-421藥物產品供臨床試驗使用，並評估一般的安全性。
若在7天的測試期間符合下列條件(1)整個測試期間所有的動物存活；(2)未觀察到毒性的明顯徵象；以及(3)於投予醫藥組成物之時間直到試驗期結束的期間內沒有動物具有明顯的體重減少，則將UB-421的大規模批次製造視作對臨床使用上為安全且可接受的。
2.2. 實驗動物
小鼠：(白化，BALB/cByJNarl品系(家鼷鼠(Mus musculus))，無特殊病原，雄性(國研院動物中心(NLAC)，台灣)。(實驗編號BIO-003.90)。
天竺鼠：(白化，Hartley品系(天竺鼠(Cavia porcellus))，無特殊病原，雄性(台大醫院(NTUH)，動物中心，台灣)。(實驗編號BIO-003.91)。
2.3. 方法
透過腹腔投予方式對兩隻小鼠和兩隻天竺鼠注射各批次的UB-421。控制組的小鼠和天竺鼠則是透過腹腔投予方式注射等滲氯化鈉溶液(“S.T.”，批號1OC0206)。每隻小鼠接受0.5毫升的總體積，而每隻天竺鼠接受5.0毫升的總體積。在給藥前(第0天)和結束前(第7天)記錄動物體重。針對一般健康情況和毒性的臨床徵象每天觀察每隻動物。
2.4. 分析和結論
來自一般的安全性試驗結果針對分析標準產生了以下令人滿意的結果：
(1)用於一般安全性試驗的所有動物在測試期間內存活。
(2)在UB-421治療的動物中未觀察到明顯徵象的毒性。
(3)試驗期間內無動物體重減少。
鑑於上述情況，將此些批次視為無未預期，不可接受的外來雜質。
這些發現證實了UB-421的大規模製造批次(批號225711和225758)無未預期或不可接受的外來雜質。據此，視這兩個批次於人類臨床試驗使用上為安全和可接受的。
3. 試驗A：於狒狒之UB-421的單次投予毒性試驗
3.1. 方法
試驗A評估為期42天UB-421之低劑量(5 mg/kg體重)或高劑量(25mg/kg體重)單次投予的藥效學、藥物動力學和安全性，如表14A所示。在這項試驗中，於30分鐘期間內以5mg/kg或25mg/kg體重透過靜脈輸注投予UB-421。在0、0.5、1、2、4、8、12、24小時，以及在2、3、5、7、10、14、21、28、35、42天，收集用於藥物動力學(PK)分析的血液樣品。
利用流式細胞儀分析法分析血液樣品，利用以 下標誌監測CD4+ T淋巴細胞的存在，標誌包含：CD4功能區塊1(抗-CD4+D1)和CD4功能區塊2(抗-CD4+D2)。利用Alexa-dB4作為標誌和用於競爭型CD4結合的示跡劑(競爭型CD4結合是利用單株抗體UB421，且單株抗體UB421和Alexa-dB4均針對CD4功能區塊1和2)。利用Alexa-山羊抗-huIgG作為針對CD4功能區塊1和2之單株抗體的示跡劑。此外，利用針對CD3和CD14的抗體監測於PBMC製備中的總T細胞(CD3)和單核球(CD14)數量。
3.2. 結果簡述
未於藥效學、藥物動力學和安全性試驗中發現UB-421不應該於人類進行第一期臨床試驗之負面看法。對於評估的所有參數而言，在控制組和實驗組動物均觀察到發現每一資料點顯著地高於或低於平均值(“超出正常範圍”)。
對來自以低劑量(5mg/kg)和高劑量(25mg/kg)UB-421單次投予治療之狒狒所提供的血液樣品評估 UB-421之初始藥物動力學(PK)性質。
此試驗結果顯示，以UB-421治療導致來自周 邊血液單核球細胞(PBMC)或由淋巴結活檢樣品細胞懸浮液所分離的CD3+CD4+ T淋巴細胞和CD14+CD4+單核球之偵測顯著減少。因此懷疑這些細胞的減少是由於以UB-421“覆蓋”CD4+細胞，而不是因為動物體之CD4+細胞耗竭。發現當利用針對抗-CD4+ D2標誌的抗體時，所偵測之CD4+ T淋巴細胞的百分比沒有變化，其證實了此項懷疑。 此種在輸注後於CD4+細胞上以UB-421“覆蓋”的持續時間於接受低劑量之動物中為至少3天，而於接受高劑量之動物中則為至少7天。當於動物的血漿中不再偵測得到UB-421時，CD4+細胞上的“覆蓋”減少，且CD4+細胞(如利用抗-CD4+D1偵測)回復到與利用抗-CD4+D2偵測者相同的百分比。
綜上所述，本研究發現UB-421是安全的，且 當以低劑量UB-421投予時，UB-421可完全覆蓋CD4陽性細胞達至少3天，當以高劑量UB-421投予時則達至少7天。基於先前實施例所討論的結果，當完全覆蓋CD4+細胞時，預期可完全地排除HIV進入細胞，此將產生病毒量減少的結果。
4. 試驗B：於狒狒之多次投予毒性試驗
4.1. 方法
試驗B評估為期56天(8週)之UB-421的低劑量(5mg/kg體重)或高劑量(25mg/kg體重)重複投予的藥效 學、藥物動力學和毒性，如表14B所示。在此試驗中，一個治療期包含以每週的間隔(每週投予一次)投予UB-421共8次。在8週治療期結束時，對半數之接受治療的動物進行屍體剖檢與評估(表14B，第1部分)。其餘的動物隨後經過一個12週的恢復期，期間維持動物供觀察和收集血液與淋巴結樣品(表14B，第2部分)之用。在治療期期間的0*、1、3、7*、14、21、28、35*、42、49、56*天，以及在恢復期期間的63*、70、77、91、105*、133天，由動物收集血液樣品(和淋巴結活檢*)供分析之用。此試驗系統使用成年雄性(M)和雌性(F)的狒狒(n=20；年齡：7至18歲)。
4.2. 結果簡述
來自一組大規模臨床前試驗所提供對UB-421之低劑量(5mg/kg)和高劑量(25mg/kg)多次投予的藥物動力學、藥效學、毒性和安全性資訊。
整體來說，由試驗B第1部分和第2部分所提供之數據指出UB-421候選藥物具有供進一步發展的科學價值以作為試驗性新藥。未於藥效學、藥物動力學和安全性研究中發現UB-421不應該於人類進行第一期臨床試驗之負面看法。對於評估的所有參數而言，在控制組和實驗組動物均觀察發現到每一資料點顯著地高於或低於平均值(“超出正常範圍”)。
4.2.1 血液和活檢分析
從利用低劑量和高劑量UB-421多次投予治療之動物中所得到樣品進行一組大規模的試驗。這些試驗的 結果總結在表15和17，並於以下內容進一步討論。
利用UBI ELISA試驗(實施例7)和MT-2試驗 (實施例2)發現，於接受低劑量(5mg/kg)UB-421之動物中可於其血漿偵測到UB-421達至少3天，而於接受高劑量(25mg/kg)UB-421之動物中則達至少7天。在最後一次輸注後，於某些接受高劑量之動物的血漿中檢測到過量UB-421達至少14天。
在接受UB-421的16個動物中的任一個內均未 發現針對UB-421的狒狒抗體，證實本候選藥物於接受治療之動物中不具有免疫原性。
所有狒狒在第0和28天免疫接種B型肝炎病 毒(HBV)疫苗(Merck)。在4隻控制組(1B)動物中的4隻、接受低劑量(2B)UB-421的8隻狒狒中的6隻，以及接受高劑量(3B)UB-421的8隻狒狒中的3隻，在第56天可觀察到可檢測水平的狒狒抗-HBsAg抗體。這些結果指出CD4+細胞之UB-421“覆蓋”可能造成某些動物對抗原預防接種的低反應性。然而，發現此種低反應性的效應為可逆的，因為在UB-421治療中斷和以HBV疫苗額外免疫接種後，這些動物都能夠發展出抗-HBsAg抗體。
4.2.2 觀察和屍體剖檢的結果
將本試驗中接受治療之狒狒的肉眼和顯微鏡分析總結在表16和17。
在一般情況下，於此試驗中評估取自所有狒狒的組織(第1和2部份)，未顯示可能歸因於以低或高劑量 水平投予UB-421之任何獨特或一致的病理變化。
對所有第3B組(高劑量)動物(n=8)於輸注前之 收案時進行眼睛觀察，並於最後輸注後一週，於治療期結束時再次眼睛觀察。從這些動物的眼科報告指出，對在治療期結束時執行的所有測試而言，兩眼均保持在正常範圍內。
取得來自所有動物(n=20)在完成投予每一劑 量之前、期間和之後的心電圖觀察記錄。從所有試驗動物的心電圖報告推斷所發現的心電圖變化是在正常的逐日差異的範圍內。
4.2.3 IND-Enabling毒理試驗結果
除了對HBV疫苗接種的免疫反應下降之外，UB-421處理組(2B和3B)和控制組(1B)之間於免疫毒性結果並無顯著差異。臨床檢查結果、眼科報告、心電圖記錄和組織病理學結果支持結論，結論為於成年狒狒在接受劑量水平高達25mg/kg之8週輸注後，UB-421是安全且耐受性良好的，治療法可有效地覆蓋目標細胞而不造成細胞耗竭。
5. 於人體組織的交叉反應性
如先前實施例所討論的，mAb dB4抗體，包含mAb dB4C7(UB-421候選藥物的主要成分)，證明其對CD4具有高結合親合力，特別是位於T細胞上之與膜結合的CD4。以下的臨床前試驗利用來自30個人體器官組織的一種晶片評估是否mAb dB4C7可結合其他細胞種類。本試驗 的目的是評估是否mAb dB4C7具有任何意料之外的反應性，以及其對有別於預期目標人體組織之細胞毒性的可能位置。
5.1. 方法
使用含有30個器官之共90個組織核心的FDA標準的冷凍組織晶片進行免疫組織化學試驗，其每一組織取自3個正常人類個體捐贈者(美國BioMax組織微陣列(TMA)切片，洛克維爾，MD)。個別人類樣本之額外的冷凍切片也納入人體組織調查對象中，如表18所述。利用生物素化mAb dB4C7和控制組試劑(生物素化山羊抗-兔IgG)篩選人體組織調查對象供免疫反應之用，用以評估特異性和非所欲之自體反應性。
5.2. 結果
藉由於PhenoPath實驗室(西雅圖，華盛頓)經認證的臨床病理學家複審在成人正常組織切片所觀察到的染色模式，並針對反應性進行評分。在胸腺和位於扁桃體(和淋巴結)之T細胞依賴區觀察到強陽性的表面細胞膜染色，於脾臟則注意到弱陽性反應。偶發的單核細胞與淋巴細胞或巨噬細胞一致，以一個預期模式在多種組織中染色陽性。也注意到於肝臟之局部微弱的庫氏細胞(Kupffer cell)染色。除了在某些組織中內源性生物素的微弱染色，測試的所有其他人體組織均呈現陰性。扁桃體部分與未標幟的mAb dB4C7抗體預培養可阻斷特定染色模式。未觀察到預期外的交叉反應性。
這些結果證實mAb dB4C7(UB-421的主要成分)不具有可能會對有別於預定目標之人類組織導致細胞毒性的任何意料外的交叉反應性。
實施例13. 第I期，開放性，單次投予，劑量依賴性試驗，以評估UB-421於無症狀HIV-1感染之成年人的安全性和藥物動力學
1. 目標
主要目標是要評估於無症狀之人類免疫缺陷病毒-1(HIV-1)感染的受試者以UB-421遞增劑量單次靜脈輸注的安全性和耐受性，次要目標為確定於無症狀之HIV-1感染的受試者以UB-421遞增劑量單次靜脈輸注的藥物動力學。(臨床試驗識別碼：NCT01140126)。
2. 方法
開放性，單次投予，劑量依賴性(劑量遞增)，二中心，非比較性。
3. 受試者人數
總共收案20個受試者(於每個劑量組有5位受試者)。
4. 診斷和納入的主要標準
為了參與這項試驗，受試者必須滿足以下所有標準。
(1)HIV-1血清反應陽性；(2)年齡20歲(含)以上； (3)對於計畫書版本Mar-09-2010：無症狀，如同試驗主持人於篩選訪視(visit 1，V1)根據疾病史、生理學檢查、心電圖(ECG)，以及凝血試驗和臨床化學和血液學試驗結果所判定，此些項目結果必須一直維持在正常範圍±10%內；(4)對於計畫書版本Jul-01-2010：無症狀，定義為患者在篩選訪視(visit 1，V1)前24週內無急性或有症狀的病毒性肝炎，且無AIDS-界定疾病的病史，其是由試驗主持人根據疾病史、生理學檢查、ECG，以及實驗室值所判定；(5)對於計畫書版本Mar-09-2010：在篩選訪視(visit 1，V1)所獲得CD4+ T細胞數量>350個細胞/mm3和HIV-1病毒量>5,000copies/mL；(6)對於計畫書版本Jul-01-2010：在篩選訪視前4週內或於篩選訪視(visit 1，V1)所獲得CD4+ T細胞數量>350個細胞/mm3和HIV-1病毒量>5,000copies/mL；(7)未使用治療藥物者(treatment-naïve)，即事前和目前未接受抗反轉錄病毒治療的受試者；(8)非哺乳中婦女；(9)受試者於對具生育能力婦女之篩選訪視時必需具有陰性的血清妊娠試驗結果；(10)受試者必須同意在試驗期間使用屏障避孕法(女性或男性保險套)；以及(11)受試者在接受任何研究程序前應簽署知情同意書。
5. 試驗用藥品和干預方法
以濃度為10mg/mL(100mg於10mL藥瓶)提供UB-421(dB4C7 mAb)。
把受試者分成4個劑量組，每一劑量組包含5名受試者，此基於其所接受UB-421的劑量。每個納入的受試者在第0天(Visit 2，V2)以以下的劑量水平之一接受UB-421的單次靜脈輸注：1mg/kg體重(第1劑量組)、5mg/kg體重(第2劑量組)、10mg/kg體重(第3劑量組)或25mg/kg體重(第4劑量組)。基於特定劑量和受試者體重計算UB-421的適當體積。使用無菌生理食鹽水調整每個個別劑量的體積，藉此以藥物之等量輸注體積輸注一個劑量組內的每個個別受試者。之後使用輸注幫浦輸送UB-421的劑量。
6. 療程：從篩選、治療和隨訪的時間範圍：62至90天。從輸注到試驗結束的時間範圍：60天。
7. 評估標準：7.1. 主要安全性終點：
(1)生理學檢查(PE)
(2)生命徵象
(3)臨床化學和血液學試驗
(4)不良事件(AE)/嚴重不良事件(SAE)的發生率
(5)心電圖(ECG)
7.2. 次要安全性終點：
(1)在給藥後第0天(輸注前)、第14天、第28天和第60天所展現之抗-UB-421抗體的血清濃度(UB-421的免疫原性)。
(2)初始CD4+ T細胞數量是在篩選訪視(V1)時評估，或是基於篩選訪視前4週內所提供的預篩選數據。
(3)在給藥後第60天評估隨訪的CD4+ T細胞數量。
8. 療效終點
以於HIV-1病毒量從基線之改變評定療效終點。將基線的HIV-1病毒量定義為在篩選訪視V1時所評估的病毒量。
9. 藥物動力學(PK)
針對UB-421評估以下藥物動力學(PK)參數：
(1)Cmax：給藥後所觀察到的最高血清藥物濃度。
(2)Tmax：達到Cmax的時間。
(3)λz：排除(末端)速度常數。
(4)t1/2：排除(末端)半衰期。
(5)AUC(0→last)：從時間零至最終樣品評估時間之血清藥物濃度-時間曲線下的面積。
(6)AUC(0→∞)：從時間零至無限大之血清藥物濃度-時間曲線下的面積。
(7)CL：從身體之藥物的血清清除率。
(8)Vβ：於消除相之分佈的體積。
(9)Vss：於穩定狀態(steady-state)之分佈的體積。
(10)MRT(0→∞)：外推到無限大的平均滯留時間(MRT(0→t))。
10. 統計方法
10.1. 主要安全性終點
(1)生理學檢查：利用藉由中心、天數、劑量組或整體之敘述統計概述生理學異常。也呈現從基線至最終訪視的轉變表。
(2)生命徵象：藉由每一訪視利用敘述統計概述生命徵象。也藉由中心、天數、劑量組或整體呈現相對於基線值的轉變。
(3)臨床化學和血液學試驗：利用敘述統計於適用的訪視概述臨床化學和血液學試驗的結果。根據試驗主持人的專業判斷和在每個研究地點的正常範圍標準，將測試結果分為四個類別：正常、異常且無臨床意義(NCS)、異常且有臨床意義(CS)，以及異常且有典型的臨床意義(CST)。在轉變表中也呈現從基線至最終訪視之實驗室檢測結果異常的改變。
(4)不良事件(AE)的發生率：將治療前不良事件、治療相關緊急不良事件(TEAE)、以及藥物相關不良事件概述於頻率分佈。每個報導的不良事件與一個國際通用醫學術語辭典(MedDRA)編碼和一器官系統分類相關。可將國家過敏症與傳染病研究所愛滋病分部 (DAIDS)的不良事件分級表第1.0版用於嚴重度分級。
(5)心電圖(ECG)：利用敘述統計概述於適用之訪視所提供的心電圖紀錄數據。
10.2. 次要安全性終點
(1)抗-UB-421抗體的血清濃度：利用適用的訪視概述抗體濃度。
(2)CD4+ T細胞數量：利用分佈統計對適用的訪視概述細胞數量和細胞百分比。也概述了於CD4+ T細胞數量和百分比之相對於基線至最終訪視的改變。
10.3. 療效終點
(1)HIV-1病毒量：於每一訪視利用敘述統計概述HIV-1病毒量。也利用中心、天數、治療劑量組和整體呈現相對於基線數值之改變=(於治療後訪視的數值-於基線訪視的數值)。
10.4. 藥物動力學評估
於每一訪視利用敘述統計概述藥物動力學參數。
根據計劃書和統計分析計畫書(SAP)，安全性終點是在意圖治療(intent-to-treat，ITT)群體進行分析，然而療效分析會在ITT和療效群體二者中進行。至於藥物動力學評估，因為只有在台北榮民總醫院(TVGH)的受試者有樣品可收集作為PK數據分析之用，故定義這些受試者為 PK群體。PK評估只在TVGH的受試者進行。
11. 結論的摘要
11.1. 療效、藥物動力學和安全性結果
11.1.1 療效結果
如第22A圖所示，利用測量在整個試驗中於不同時間點之HIV-1病毒量的變化以評估UB-421的療效。療效分析顯示在UB-421輸注後於來自第2劑量組(5mg/kg)、第3劑量組(10mg/kg)和第4劑量組(25mg/kg)的受試者，而非於第1劑量組(1mg/kg)的受試者，可發現於平均HIV-1病毒量之顯著的淨變化。
藉由在單次投予後病毒量下降至2.25 log10(來自10mg/kg組別)可證明抗體藥物UB-421(mAb dB4C7)的療效(第22B圖)。將對每一劑量組之HIV-1病毒量的最大平均下降概述如下，並在第22B圖顯示：
第1劑量組(1mg/kg)：於第6天(V5)為0.29log10copies/mL。
第2劑量組(5mg/kg)：於第6天(V5)為0.97log10copies/mL。
第3劑量組(10mg/kg)：於第10天(V6)為1.58log10copies/mL。
第4劑量組(25mg/kg)：於第14天(V7)為1.63log10copies/mL。
HIV-1抑制的持續時間與劑量水平相關，其中相較於較低劑量之劑量組的受試者，在較高劑量之劑量組 的受試者顯示HIV-1病毒量下降的持續時間較長(第22A圖)。對以最高劑量UB-421(第4劑量組，25mg/kg)輸注受試者之HIV-1病毒量抑制的持續時間維持最長，約28天。
總之，發現UB-421抗體在5、10和25mg/kg 的劑量水平以劑量-依賴關係具有強的抗病毒效應。也就是說，在可比較的投藥下，相對於TMB-355，利用UB-421治療時有更高百分比的患者於血清HIV-1 RNA水平達到>1Log10的減少。
針對TMB-355(TMB-355先前稱為TNX-355； Kuritzkes,D.R.,et al.,2004，第1圖)先前報導的療效數據評估來自本試驗使用UB-421之療效數據的理論比較，如第23A圖至第23C圖所示。基於此比較，於評估的100%的受試者中，接受10mg/kg或25mg/kg單次投予時，UB-421可達到於病毒量的10倍減少；然而TMB-355只可於使用相同劑量之83%的受試者中達到於病毒量的10倍減少。
11.1.2 藥物動力學結果
針對此試驗中所使用UB-421的每個劑量(1、5、10和25mg/kg)評估以上列出的藥物動力學(PK)參數。表19概述了在每一劑量組來自3個受試者所評估的多個PK參數(Cmax、AUC(0→∞)、T1/2和MRT)的結果。結果顯示每個PK參數和投予UB-421劑量的數據值之間具有相關性。也就是說，UB-421的劑量由1mg/kg增加至25mg/kg可對應至所評估之PK參數的增加。具體來說，Cmax由28.6μg/mL增加至462.5μg/mL；AUC(0→∞)由201μg-小時/mL 增加至51367μg-小時/mL；T1/2由14.4小時增加至85.4小時；且MRT(0→∞)由21.6小時增加至97.4小時。
11.1.3 安全性結果
透過生理學檢查、生命徵象、臨床化學和血液學試驗、AE/SAE的發生率和心電圖評估UB-421的安全性特徵。也測定CD4+ T細胞數量和抗-UB-421抗體濃度以提供進一步的安全性評估。
針對總共30個事件，將TEAEs的淨發生率以嚴重度分級為65.0%(20個受試者中的13個)。報導的三個受試者具有六件治療相關的不良事件與嚴重度分級：於受試者B-001-001(投予1mg/kg劑量的UB-421)為第1級(輕度)“搔癢”和“癤瘡”；於受試者A-015-009(投予10mg/kg劑量的UB-421)為第1級(輕度)“淋巴細胞數量增加”、“嗜中性球數量減少”和“血小板數量下降”；且於受試者B-015-008(投予25mg/kg劑量的UB-421)為第2級(中度)“麻疹樣疹”。於受試者B-015-008之麻疹樣疹的發生為未預期之嚴重藥品不良反應(Suspected Unexpected Serious Adverse Reaction，SUSAR)；此受試者在5天護理之後從醫院出院。報導的一位受試者具有另外的SAE，其與UB-421無關，於受試者A-012-005(投予5mg/kg劑量的UB-421)為肛門廔管和痔瘡；在生命徵象或心電圖的結果則未發現與治療相關的異常。於治療僅有一個劑量；因此，尚未發生治療中斷或劑量變化。
在三個受試者(分別來自第2、3和4劑量組的 一位受試者)中在第14天(V7)檢測到抗-UB-421抗體，其水平略高於0.4μg/mL的實驗檢測極限。在經過第60天(試驗結束)的任何後續的訪視中未檢測出抗-UB-421抗體。沒有相關的不良事件或其他生理學異常與抗-UB-421抗體的出現有關。
此外，CD4+ T細胞數量和細胞百分比在60天的治療期和無治療隨訪期期間為相對穩定的。
總而言之，當以介於1和25mg/kg的劑量範圍透過靜脈內(IV)輸注投予單劑量時，UB-421對HIV-1感染的成人是安全且耐受性良好的。
12. 結論
此第I期試驗，以劑量範圍從1至25mg/kg的UB-421單次靜脈輸注，證明UB-421對HIV-1感染的成人是安全且耐受性良好的。大部分的不良事件為輕度或與試驗藥物無關的。麻疹樣疹之SUSAR的唯一發生是發生在第4劑量組(25mg/kg劑量)，但目前還不清楚這起事件是否與試驗藥物有關。在三個受試者中只於第14天(V7)檢測到對UB-421的暫時性免疫反應，其抗體水平僅略高於0.4μg/mL的實驗檢測極限，證明此抗體的出現為輕微的臨床意義。關於此試驗藥物的藥物動力學概況，主要參數的趨勢與劑量水平相關。此外，HIV-1病毒量抑制的程度和持續時間與5、10和25mg/kg之UB-421劑量水平顯著地正相關，但在1mg/kg劑量組並非如此明顯。
考慮到從此試驗所獲得的安全性和療效結 果，在治療無症狀HIV-1感染的成年人中許可至少為5mg/kg劑量水平UB-421的進一步發展。
實施例14. 第IIa期，開放性，多次投予，劑量依賴性試驗以研究UB-421於無症狀HIV-1感染之成年人的安全性和療效
1. 試驗目的
(1)評估於無症狀HIV-1感染受試者之UB-421二劑量治療方案之多次投予的安全性和耐受性。
(2)獲得於這些受試者之UB-421二劑量治療方案之多次投予的抗病毒活性證據。
(3)評估抗病毒活性和安全性概況以確定最佳UB-421給藥和劑量治療方案。
(臨床試驗識別碼：NCT01668043)。
2. 試驗設計
這是利用UB-421之重複靜脈內給藥的開放性試驗。為了可受試性(eligibility)而篩選對HIV-1血清反應陽性且無症狀之受試者。二十九位納入的受試者接受兩個劑量水平(每週10mg/kg(第1劑量組)或每兩週25mg/kg(第2劑量組))之一的試驗藥物(UB-421)之多次靜脈輸注，共為期8週的治療期。基於收案順序透過地點且輪流地將受試者分配到兩個試驗劑量組之一。在8週的治療期之後隨訪受試者額外的八週。此試驗在第16週結束。
3. 納入的標準
受試者必須滿足以下標準才有資格參與第IIa期試驗：
(1)無症狀，未接受抗反轉錄病毒治療的患者(antiretroviral therapy(ART)-naïve)，HIV-1血清反應陽性
(2)CD4+ T細胞數量>350cells/mm3
(3)HIV-1病毒量>5,000copies/mL
(4)無需要立即治療的感染症(HIV-1除外)
(5)無使用免疫調節藥物或全身化療
(6)無需高效抗反轉錄病毒療法(HAART)。
當依據對HIV/AIDS診斷與治療的現行指導方針由試驗總主持人視作必需時，在這項試驗完成後，受試者於門診遵循例行的監測時程表(無抗反轉錄病毒藥物)或接受標準治療之抗反轉錄病毒療法(例如HAART)。允許於使用UB-421之第I期試驗所納入的個體和符合第IIa期試驗之進入標準的個體參與此次試驗。
4. 試驗用藥品
以濃度為10mg/mL(100mg於10mL藥瓶)提供UB-421(dB4C7 mAb)。
每個納入的受試者接受利用以下劑量水平之一的UB-421的多次靜脈輸注：每週10mg/kg(第1劑量組)或每兩週25mg/kg(第2劑量組)，為期8週。UB-421的適當體積是基於特定劑量和受試者體重。使用無菌生理食鹽水調整每個個別劑量的體積，藉此利用藥物之等量輸注體 積輸注一個劑量組內的每個個別受試者。對10mg/kg劑量組的輸注總體積為約100mL，而對25mg/kg劑量組的輸注總體積為約200mL。每次給藥的輸注時間為約一到兩小時。
5. 評估標準：5.1. 主要安全性和療效終點：直到第16週(試驗結束)評估UB-421的以下安全性和耐受性參數：
(1)生理學檢查(PE)
(2)生命徵象
(3)臨床化學和血液學試驗
(4)不良事件(AE)/嚴重不良事件(SAE)的發生率
在試驗期(從V2至V12)期間對每一個劑量組評估UB-421的以下療效參數：
(1)個別最大病毒量下降
(2)平均最大病毒量下降
5.2. 次要病毒學終點
在試驗期(從V2至V12)期間評估以下病毒學反應：
(1)在每一試驗劑量組內和之間根據次群組的個別最大病毒量下降和平均最大病毒量下降。
(2)具有病毒量<50copies/mL之受試者的比例；
(3)具有病毒量<200copies/mL之受試者的比例；
(4)具有病毒量下降>0.5log10copies/mL之受試者的 比例；
(5)具有病毒量下降>1log10copies/mL之受試者的比例；
(6)分別地對第1劑量組和第2劑量組在最終完成試驗藥物投予後直到7天和14天具有病毒反彈(於病毒量從最低點有超過0.5log10的增加)之受試者的比例；
(7)抗-UB-421抗體的血清濃度(UB-421的免疫原性)；
(8)CD4+和CD8+ T細胞數量的變化；
(9)UB-421的藥物動力學參數(Cmax、AUC(0→∞)和AUC(0→last))。
6. 分析群體
意圖治療(ITT)群體：29個受試者，其接受試驗藥物的至少一次給藥。第1劑量組和第2劑量組的ITT群體分別為14個受試者和15個受試者。
依計劃書執行臨床試驗的群體(Per-protocol(PP)population)：18個受試者，其接受試驗藥物的所有給藥，具有有效的基線和至少一個有效的治療後療效測定(HIV-1病毒量試驗)，且無重大違反計畫書規定。第1劑量組和第2劑量組的PP群體分別為7個受試者和11個受試者。
安全性和免疫原性群體：將29個受試者納入意圖治療(ITT)群體。
藥物動力學群體：是基於安全性和免疫原性群體中的次群體。
於安全性和免疫原性群體分析基線數據和安全性終點，然而療效分析是在ITT和PP群體二者中進行。在藥物動力學群體進行藥物動力學分析。
7. 試驗期的持續時間
篩選期：<4週
治療期：8週
隨訪期：治療期結束後接著的8週
Visit 0代表初始篩選，而試驗期間的每一次訪視代表1週期間。隨訪期通常以每週間隔執行。
8. 結果的概述
8.1. 試驗群體
在台灣的兩個試驗地點篩選總共33個無症狀之HIV感染的成年人。其中29個受試者通過了篩選標準並被選擇進行試驗。所有符合資格的29個受試者均為男性。
8.2. 安全性和耐受性結果
所有29名受試者在試驗期間經歷至少1件不良事件，共計128件不良事件。其中，114例(在所有29個受試者中有89.06%)為治療相關緊急不良事件(TEAEs)和14例(在5個受試者中有10.94%)為治療前不良事件。於29個受試者中未觀察到嚴重不良事件(SAEs)。所有治療前不良事件均與UB-421無關，且這些事件中無事件被視為SAEs。報導TEAEs中的大多數(78.95%)為輕度，17.54%為中度，且3.51%(於一個受試者)是重度的。
最常見的(>10%)TEAE是皮疹和蕁麻疹。除了 不良事件，在22個受試者中觀察到於血液學(於22個受試者中的154個事件)和生物化學(於6個受試者中的32個事件)之實驗室異常檢測結果。然而，大多數的變化是輕微且不具有臨床意義的。生理學檢查結果和生命徵象在試驗期期間大多為正常或無臨床意義。
如臨床試驗計劃書所說明，UB-421在試驗期 期間為耐受性良好的，其於8週治療期的整體治療耐受性為73.84%。
8.3. 藥效學
8.3.1 CD4 + T和CD8 + T細胞數量
在8週治療期和8週隨訪期之後，平均CD4+ T細胞數量從基線略微減少了55.10±117.97cells/mm3，而平均CD8+ T細胞數量從基線增加了193.31±459.34cells/mm3。第1劑量組受試者之代表的CD4+ T細胞數量和平均CD4 T細胞數量如表22A和第24A圖所示。第2劑量組受試者之代表的CD4+ T細胞數量和平均CD4 T細胞數量如表22B和第24B圖所示。
8.3.2 以UB-421覆蓋CD4受體
利用螢光結合的UB-421透過流式細胞儀偵測CD4受體覆蓋的程度。從四個代表受試者所提供之結果，兩個來自第1劑量組和兩個來自第2劑量組，分別如第25A至25B圖和第25C至25D圖所示。此試驗的靈敏度為0.15μg/mL。以每週10mg/kg或每兩週25mg/kg重複給藥時， UB-421的臨床療效顯示，當作為單一藥物治療時，於>10μg/mL之UB-421血清水平存在下可使病毒減少至低於檢測極限。只要PBMC CD4+細胞被完全覆蓋(即dB4C7-Alexa結合百分比接近0)就沒有病毒反彈。
在以兩個劑量水平投予UB-421二至三次後可 達成以UB-421完全覆蓋位於PBMC上之CD4受體。此外，於整個治療期期間可保持以UB-421完全覆蓋CD4+ T細胞(第25A-25D圖，上圖)。在大多數受試者中，如同利用螢光dB4C7 mAb(dB4C7-Alexa)之結合所測定，在最終UB-421輸注的三週內，結合至CD4受體的UB-421減少並回復至基線數值。
評估試驗期間於受試者血清中所呈現之 UB-421的濃度，以決定足以達成完全CD4覆蓋和HIV-1病毒抑制之UB-421的血清濃度。基於所獲得的數據，只要UB-421血清濃度維持在高於10μg/mL，則可利用UB-421達成持續的CD4+ T細胞的完全覆蓋和HIV-1病毒抑制(第25A-25D圖，下圖)。
8.4. 藥物動力學
在第1劑量組中觀察到平均AUC從17300±10000μg x小時/mL(Visit 1-2)增加至23900±10700μg x小時/mL(Visit 8-9)，然後在Visit 11-12回復至基線。在第1劑量組中所觀察到的平均AUC(0→last)是171000±70300μg x小時/mL。
在第2劑量組中觀察到平均AUC從56500± 19500μg x小時/mL(Visit 1-3)增加至61100±20700μg x小時/mL(Visit 7-9)，然後在Visit 11-12回復至基線。在第2劑量組中所觀察到的平均AUC(0→last)是239000±73900μg x小時/mL。
這些數據證明，如同利用AUC(0→last)所測定， 相較於接受每週10mg/kg UB-421輸注者(第1劑量組，171000±70300μg x小時/mL)，平均血清藥物濃度以在投予每兩週25mg/kg UB-421輸注的受試者中較高(第2劑量組，239000±73900μg x小時/mL)。
8.5. 療效結果
此試驗招募29個HIV-1感染的受試者，其接受至少一劑的UB-421(ITT群體)。招募的29個受試者中，共計18個受試者完成了8週的治療期，其接受試驗藥物的所有給藥(PP群體)。於試驗期間透過評定所納入無症狀HIV-1感染受試者的個別和平均最大病毒量下降，以評估UB-421多次投予的療效，且將第1和2劑量組之ITT和PP群體的結果概述於表20。
發現平均最大病毒量下降在ITT或PP群體的兩個劑量水平之間並無顯著差異。具體來說，在第1劑量組於ITT群體之病毒量減少了2.27±0.60log10copies/mL，而在第2劑量組於ITT群體之病毒量減少了2.45±0.46log10copies/mL。於PP群體，在第1劑量組病毒量減少了2.73±0.34log10 copies/mL，而在第2劑量組病毒量減少了2.47±0.45log10copies/mL。
在治療期期間，於所有(n=29，100.00%)試驗 受試者觀察到
Figure 104130548-A0101-12-0135-64
0.5log10copies/mL的病毒量下降；且於所有(n=29，100.00%)試驗受試者觀察到
Figure 104130548-A0101-12-0135-65
1log10copies/mL的病毒量下降。
於以下內容揭露在治療期期間所獲得之數據的進一步評估：
在第1劑量組，於ITT之8/14(57.14%)的受試者和於PP之5/7(71.43%)的受試者具有
Figure 104130548-A0101-12-0135-66
200copies/mL的病毒量；此外，於ITT之3/14(21.43%)的受試者和於PP之3/7(42.86%)的受試者具有<50copies/mL的病毒量。
在第2劑量組，於ITT之10/15(66.67%)的受試者和於PP之7/11(63.64%)的受試者具有
Figure 104130548-A0101-12-0135-67
200copies/mL的病毒量；且於ITT之3/15(20.00%)的受試者和於PP之2/11(18.18%)的受試者具有<50copies/mL的病毒量。
來自第1和2劑量組受試者之代表的病毒量下降數據如表21A至21C和第25A至25D圖(上圖)所示。在每一劑量組之內、每一劑量組之間，或在每一劑量組內的次群體之間，於具有病毒量下降之受試者的比例並無統計上顯著的差異。此外，在8週治療期期間，在第1和2劑量組分別有43%和18%受試者的病毒量減少至低於目前實驗檢測極限(20copies/mL)的水平。在所有受試者中，當以UB-421完全覆蓋CD4+ T細胞時可使病毒量持續下降。在隨訪期結束時，於兩個劑量組的病毒量回復至基線水平。此外，在治療期期間於任何的試驗受試者中未觀察到病毒 反彈。來自兩個劑量組之患者於整個治療期中未偵測到可計量的抗-UB421抗體(表21A至21C)。
8.6. UB-421和TMB-355的比較
針對由他人(Jacobson,J.L.,et al.,2009；Toma,J.,et al.,2011；and Pace,C.S.,et al.,2013)所執行TMB-355(ibalizumab，先前稱為TNX-355)的相似試驗所提供的結果，以評估UB-421於此試驗所提供之結果。第26A圖顯示在具有CD4+細胞完全覆蓋的UB-421存在下，有高達>3Log10之優異的病毒量下降而無病毒量反彈。相反地，甚至在CD4+細胞完全覆蓋存在下，從治療起只有一週之後，接受TMB-355治療的患者便遭遇到病毒反彈，此為抗藥性病毒突變種發展的象徵(第26B圖)。
這兩種治療方案的比較，如圖所示，證明了利用UB-421治療HIV感染的受試者具有較TMB-355治療明顯的優勢。具體來說，UB-421在整個治療期中提供了於HIV病毒量的持續性下降，且甚至在進入到隨訪期的一或兩週仍具有>3log10的最大病毒量下降。相反地，TMB-355藉由第一次投予只提供了暫時性的病毒量下降，以及接近1log10之最大病毒量下降。
此外，使用TMB-355之先前試驗發現，儘管血清TMB-355之呈現和CD4陽性T細胞之完全覆蓋，HIV病毒反彈仍在進入治療的一週後發生(Jacobson,J.L.,et al.,2009)。這結果與於上述實施例4之先前預測一致，非競爭型進入抑制機制，如TMB-355(ibalizumab)所調停者，在 抗體治療期期間可提供抗藥性HIV突變種發展的高度可能性。實際上，發現來自接受TMB-355治療以減少病毒量之患者的病毒抗藥性突變種於gp120的V5區域上辨別出突變(Toma,J.,et al.,2011；Pace,C.S.,et al.,2013)。
9. 結論
發現於無症狀HIV-1感染的受試者以UB-421進行8週治療具有良好的耐受性。此外，分別來自第1和2劑量組對個別受試者之代表的CD4+ T細胞數量(表22A和22B)和平均CD4 T細胞數量(第24A和24B圖)在整個為期兩個月的監測中保持穩定。
更重要的是，以UB-421治療導致在所有受試者中顯著的病毒量下降(100%接受治療的受試者以
Figure 104130548-A0101-12-0137-68
1log10copies/mL之最大下降作出反應)。兩種治療方案，每週10mg/kg(第1劑量組)和每兩週25mg/kg(第2劑量組)輸注，顯示於病毒量下降之類似療效。在第1劑量組於ITT群體之平均最大病毒量下降達到2.27±0.60log10copies/mL，而在第2劑量組於ITT群體之平均最大病毒量下降達到2.45±0.46log10copies/mL。利用UB-421所觀察到的病毒減少療效比迄今所測試的任何其他的小分子抗HIV藥物優越。
從此周密進行之UB-421的多劑量第IIa期所得到的臨床試驗結果證明在治療期期間不具有病毒反彈之作為單一藥物治療的高耐受性、安全性，和於病毒量下降之空前的療效。在這試驗中所獲得的結果是意想不到的， 且與此領域中長期抱持之懷疑(結合CD4功能區塊1的抗-CD4單株抗體是免疫抑制的，因為其對於第二型主要組織相容性複合體所調停之免疫功能的干擾，且此種療法對於HIV疾病之治療並不合適(Jacobson,J.L.,et al.,2009))相矛盾。此結果進一步指出利用UB-421合併使用正交的(orthogonal)HAART及/或其他HIV病毒庫激活劑(例如HDACi)之HIV療法的額外形式可達到HIV感染的功能性治癒。
實施例15. 利用UB-421單一藥物治療的治療形式作為於HIV-1感染成年人之抗反轉錄病毒療法的替代品
第27圖說明利用UB-421單一藥物治療對各種HIV患者群體的治療形式以作為抗反轉錄病毒療法的替代品。詳細的目的和計畫書於以下內容所述。
1. 適用的患者群體
藉由穩定的高效抗反轉錄病毒療法(HAART)而具有病毒抑制之對HIV-1為血清反應陽性的受試者有資格進行此種治療。
符合資格的患者在4個月的初期透過IV或SC途徑接受UB-421投予，之後是HAART治療的另一個循環。“HAART-UB-421”交替治療循環可重複多次，直到停用UB-421和HAART治療時不再觀察到病毒反彈為止，從而達成對HIV感染的功能性治癒。
更具體地，這些受試者分別地於為期8週和 16週的治療期，以兩個劑量水平(每週10mg/kg或每兩週25mg/kg)之一，接受試驗藥物(UB-421)的多次靜脈輸注。 在第一次UB-421輸注的前一天停用HAART治療。在UB-421投予之前，依照試驗總主持人所判斷，給予受試者預防用藥(治療前給藥)，包含類固醇和抗組織胺藥物，以預防輸注反應。在完成最後一次排程的UB-421給藥後，所有受試者在同一天重啟其原先或其他適當之病毒敏感的抗反轉錄病毒療法。HAART治療方案之使用是由試驗總主持人所判斷。在治療期期間和在治療期結束後6個月監測來自所有患者的病毒量和CD4細胞數量。
2. 納入標準
若受試者滿足以下所有標準則可納入此治療形式：
(1)HIV血清反應陽性；
(2)年齡20歲(含)以上；
(3)已接受HAART治療，定義為至少2個核苷類/核苷酸類反轉錄酶抑制劑(NRTIs)加上1個非核苷類反轉錄酶抑制劑(NNRTI)、整合酶抑制劑，或蛋白酶抑制劑，達至少2年；此治療在進入本試驗之前一年內是不間斷的且無藥物更換。
(4)在篩選訪視前1年內具有CD4+ T細胞數量≧500cells/mm3或CD4百分比≧28%的兩個測量值；
(5)在篩選訪視前4週內或於篩選訪視時所提供具有CD4+ T細胞數量≧500cells/mm3；
(6)篩選訪視前至少1年之HIV-1血漿RNA保持在低於檢測極限，每年具有至少2個病毒量測定。病毒量在篩選訪視前4週內或於篩選訪視時也是低於檢測極限；在篩選訪視前4週以前的可檢測HIV血漿RNA的單次事件將不排除參與。
3. 排除標準
為了以下任何的理由可將受試者排除在此治療形式之外：
(1)需要立即治療的任何感染症(HIV除外)；
(2)根據美國疾病控制與預防中心(CDC)對HIV感染分類系統按照第B類和第C類條件之任何先前確診或現行的AIDS-界定疾病；
(3)體重>80kg；
(4)在篩選前12週內任何紀錄的CD4+ T細胞數量<250cells/mm3或CD4+ T細胞百分比≦14%；
(5)先前納入於UB-421的第I期或第IIa期試驗，或呈現抗-UB-421抗體的任何病史；
(6)在試驗藥物UB-421第一次給藥前12週內對單株抗體的任何先前暴露；
(7)任何顯著疾病(除了HIV-1感染)或臨床上顯著的發現，包括精神和行為問題，根據篩選、病史及/或生理學檢查決定，由試驗主持人判定，將受試者排除參加此項試驗；
(8)在試驗藥物第一次給藥前8週內的任何疫苗接種；
(9)在試驗藥物第一次給藥前12週內的任何免疫調節治療(包含干擾素)、全身化療；
(10)少於12個月的預期餘命；
(11)在試驗藥物第一次給藥前12週內的任何非法靜脈注射吸毒；
(12)由於病毒學失敗和先前的非何杰金氏淋巴瘤或卡波西氏肉瘤之不只一次的HAART治療方案改變；
(13)任何當前之酒精或非法毒品的使用，由試驗主持人判定，會妨礙受試者去遵從投藥和訪視時程表以及計畫書評估的能力。
4. 藥品成品
以濃度為10mg/mL(100mg於10mL藥瓶)提供藥品成品UB-421(dB4C7 mAb)。受試者利用靜脈輸注接受10mg/kg UB-421的8次每週劑量或25mg/kg UB-421的8次每兩週劑量。
UB-421的適當體積是基於特定劑量和受試者體重。使用無菌生理食鹽水調整每個個別劑量的體積，藉此利用藥物之等量輸注體積輸注一個劑量組內的每個個別受試者。對10mg/kg劑量組的輸注總體積為約100mL，而對25mg/kg劑量組的輸注總體積為約200mL。每次給藥的輸注時間為約一到兩小時。
實施例16. 利用UB-421合併使用HAART的治療形式供HIV-1感染的功能性治癒
第28圖說明利用抗體UB-421合併使用 HAART對各種HIV患者群體的治療形式可供HIV-1感染的功能性治癒。適用的患者群體：(1)未使用治療藥物之HIV患者；(2)HAART治療穩定的HIV患者；以及(3)HAART治療失敗之HIV患者。
更具體地，於受感染之受試者供HIV功能性治 癒的臨床計畫書之達成是藉由在初期(為期4個月)透過IV或SC途徑投予UB-421，初期(為期4個月)之後是治療假日(為期2個月)，其作為在兩個完整循環(為期一年)中的一個治療循環(為期6個月)。這些相同的受試者也在UB-421治療之兩個完整循環的期間開始和持續HAART治療。在兩個完整循環結束時，停用HAART和UB-421(A組(Arm A))以評估發生病毒反彈所需的時間，如果有病毒反彈的話。 控制組中，包含在HAART治療停用之前透過相同的12個月期間單獨以HAART治療的受試者，其也被評估以評定發生病毒反彈的時間，如果有病毒反彈的話(B組(Arm B))。
在同時發生UB-421和HAART治療的二個循 環期間和治療期後6個月，共計18個月，監測來自所有患者的病毒量及CD4細胞數量。
A組：以HAART治療合併使用每週10mg/kg 或每兩週25mg/kg的UB-421投予。B組：單獨以HAART治療。
1. 於功能性治癒之UB-421治療的設計(表23)
UB-421勝過HAART藥物的潛在優勢：
(1)UB-421可阻斷HIV-1病毒的細胞間傳播
(2)UB-421交聯CD4的類CDR-2環並活化細胞，且因此從潛伏誘導和釋放HIV-1
2. 目標
(1)利用UB-421合併使用HAART，藉由阻斷HIV之無細胞和細胞間傳播，以提供HIV感染的受試者有效的治療和保護。
(2)於HIV感染的受試者提供對HIV的功能性治癒。
3. 適用的患者群體
(1)HAART治療穩定的HIV患者；(2)未使用HAART治療之HIV患者；以及(3)HAART治療失敗之HIV患者。
4. 藥品成品UB-421
以濃度為10mg/mL(100mg於10mL藥瓶)提供藥品成品UB-421(dB4C7 mAb)。受試者利用靜脈輸注接受10mg/kg UB-421的8次每週劑量或25mg/kg UB-421的8次每兩週劑量。
UB-421的適當體積是基於特定劑量和受試者體重。使用無菌生理食鹽水調整每個個別劑量的體積，藉此利用藥物之等量輸注體積輸注一個劑量組內的每個個別受試者。對10mg/kg劑量組的輸注總體積為約100mL，而對25mg/kg劑量組的輸注總體積為約200mL。每次給藥的輸注時間為約一到兩小時。
5. 分配干預
分配以下的干預措施：
5.1. A組-UB-421和HAART治療的合併使用
受試者以適當的HAART療法持續地治療，並也以持續一年之兩個完整循環的UB-421治療。UB-421治療的每個循環包括在4個月的期間以每週10mg/kg UB-421投予或以每兩週25mg/kg UB-421投予，之後接續無UB-421治療的兩個月。
在1年的治療期結束後，停用HAART和UB-421治療。進行額外的觀察試驗(藉由於缺乏HAART和UB-421狀況下未見任何病毒反彈)以確保HIV感染的功能性治癒。
5.2. B組-單獨以HAART治療
作為控制組，於同樣期間內利用適當的HAART療法而未以UB-421治療用以持續地治療一組個別的受試者。
在1年的治療期結束後，停用HAART治療並針對病毒反彈對受試者進行監測。
所有說明書中所揭示之發明技術特點可以任意方式組合。說明書中揭示之每一技術特點可以提供相同、等同或相似目的之其他方式替換。因此，除非另有特別說明，文中所有揭示之特點均只是等同或相似特點之一般系列之實例。
由上述可知，熟習此技藝者能輕易地了解本發 明之必要特徵，在不脫離其精神與範圍之下能就本發明做許多改變與調整以應用於不同用途與條件。
Figure 104130548-A0101-12-0146-1
Figure 104130548-A0101-12-0147-2
Figure 104130548-A0101-12-0148-3
Figure 104130548-A0101-12-0149-4
Figure 104130548-A0101-12-0149-5
Figure 104130548-A0101-12-0150-6
Figure 104130548-A0101-12-0150-7
Figure 104130548-A0101-12-0151-8
Figure 104130548-A0101-12-0152-9
Figure 104130548-A0101-12-0152-10
Figure 104130548-A0101-12-0153-11
Figure 104130548-A0101-12-0153-12
Figure 104130548-A0101-12-0154-13
Figure 104130548-A0101-12-0154-14
Figure 104130548-A0101-12-0155-15
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Figure 104130548-A0101-12-0156-17
Figure 104130548-A0101-12-0157-18
Figure 104130548-A0101-12-0158-19
Figure 104130548-A0101-12-0159-20
Figure 104130548-A0101-12-0160-21
Figure 104130548-A0101-12-0161-22
Figure 104130548-A0101-12-0162-23
Figure 104130548-A0101-12-0163-24
Figure 104130548-A0101-12-0164-25
Figure 104130548-A0101-12-0165-26
Figure 104130548-A0101-12-0166-27
Figure 104130548-A0101-12-0167-28
<110> 美國聯合生物醫學公司(United Biomedical,Inc.)王長怡
<120> 藉由針對CD4之單株抗體調停競爭型HIV進入抑制之HIV感染的治療和功能性治癒
<130> 1004263.213WO(2034WO)
<150> US 62/051,200
<151> 2014-09-16
<150> PCT/US2014/065048
<151> 2014-11-11
<160> 14
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 鼠源抗體
<220>
<221> 功能區塊
<222> (1)..(5)
<223> 鼠源抗體B4之重鏈的CDR1
<400> 1
Figure 104130548-A0101-12-0169-29
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 鼠源抗體
<220>
<221> 功能區塊
<222> (1)..(17)
<223> 鼠源抗體B4之重鏈的CDR2
<400> 2
Figure 104130548-A0101-12-0169-30
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 鼠源抗體
<220>
<221> 功能區塊
<222> (1)..(9)
<223> 鼠源抗體B4之重鏈的CDR3
<400> 3
Figure 104130548-A0101-12-0170-31
<210> 4
<211> 15
<212> PRT
<213> 鼠源抗體
<220>
<221> 功能區塊
<222> (1)..(15)
<223> 鼠源抗體B4之輕鏈的CDR1
<400> 4
Figure 104130548-A0101-12-0170-32
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 鼠源抗體
<220>
<221> 功能區塊
<222> (1)..(7)
<223> 鼠源抗體B4之輕鏈的CDR2
<400> 5
Figure 104130548-A0101-12-0171-33
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 鼠源抗體
<220>
<221> 功能區塊
<222> (1)..(9)
<223> 鼠源抗體B4之輕鏈的CDR3
<400> 6
Figure 104130548-A0101-12-0172-34
<210> 7
<211> 448
<212> PRT
<213> 鼠源抗體
<220>
<221> 功能區塊
<222> (1)..(448)
<223> 具有與衍生自來自親本鼠源B4抗體重鏈序列相對應之CDRs1、2、3的相似CDRs1、2、3的去免疫化人類抗體B4[UB421]的重鏈
<400> 7
Figure 104130548-A0101-12-0172-35
Figure 104130548-A0101-12-0173-36
Figure 104130548-A0101-12-0174-37
Figure 104130548-A0101-12-0175-38
Figure 104130548-A0101-12-0176-39
<210> 8
<211> 218
<212> PRT
<213> 鼠源抗體
<220>
<221> 功能區塊
<222> (1)..(218)
<223> 具有與衍生自來自親本鼠源B4抗體輕鏈序列相對應之CDRs1、2、3的相似CDRs1、2、3的去免疫化人類抗體B4[UB421]的輕鏈
<400> 8
Figure 104130548-A0101-12-0176-40
Figure 104130548-A0101-12-0177-41
Figure 104130548-A0101-12-0178-42
<210> 9
<211> 448
<212> PRT
<213> 鼠源抗體
<220>
<221> 功能區塊
<222> (1)..(448)
<223> 具有M253Y/S255T/T257E取代之去免疫化人類抗體B4[UB421]的重鏈
<400> 9
Figure 104130548-A0101-12-0179-43
Figure 104130548-A0101-12-0180-44
Figure 104130548-A0101-12-0181-45
Figure 104130548-A0101-12-0182-46
<210> 10
<211> 448
<212> PRT
<213> 擬人化抗體
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<222> (253)..(253)
<223> M或Y
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<222> (255)..(255)
<223> S或T
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<222> (257)..(257)
<223> T或E
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<222> (298)..(298)
<223> N或H
<400> 10
Figure 104130548-A0101-12-0183-47
Figure 104130548-A0101-12-0184-48
Figure 104130548-A0101-12-0185-49
Figure 104130548-A0101-12-0186-50
Figure 104130548-A0101-12-0187-51
<210> 11
<211> 118
<212> PRT
<213> 鼠源抗體
<400> 11
Figure 104130548-A0101-12-0187-52
Figure 104130548-A0101-12-0188-53
<210> 12
<211> 330
<212> PRT
<213> 人類抗體
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<222> (135)..(135)
<223> M或Y
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<222> (137)..(137)
<223> S或T
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<222> (139)..(139)
<223> T或E
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<222> (180)..(180)
<223> N或H
<400> 12
Figure 104130548-A0101-12-0189-54
Figure 104130548-A0101-12-0190-55
Figure 104130548-A0101-12-0191-56
Figure 104130548-A0101-12-0192-57
<210> 13
<211> 111
<212> PRT
<213> 鼠源抗體
<400> 13
Figure 104130548-A0101-12-0192-58
Figure 104130548-A0101-12-0193-59
<210> 14
<211> 107
<212> PRT
<213> 人類抗體
<400> 14
Figure 104130548-A0101-12-0194-60

Claims (24)

  1. 一種擬人化單株抗體，包含：包含選自由SEQ ID NO：7、9以及10所組成之群組之一胺基酸序列的一重鏈；以及包含SEQ ID NO：8之一胺基酸序列的一輕鏈。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之擬人化單株抗體，其中該擬人化單株抗體包含：包含SEQ ID NO：9之一胺基酸序列的一重鏈；以及包含SEQ ID NO：8之一胺基酸序列的一輕鏈。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之擬人化單株抗體，其中該擬人化單株抗體包含：包含SEQ ID NO：10之一胺基酸序列的一重鏈；以及包含SEQ ID NO：8之一胺基酸序列的一輕鏈。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之擬人化單株抗體，其中該擬人化單株抗體包含：包含SEQ ID NO：7之一胺基酸序列的一重鏈，以及包含SEQ ID NO：8之一胺基酸序列的一輕鏈。
  5. 一種組成物之用途，其係用於製備功能性治癒HIV患者的藥物，包含(a)一藥理學上有效劑量之如申請專利範圍第1項所述之擬人化單株抗體；以及(b)一高效抗反轉錄病毒療法(HAART)的抗病毒藥物。
  6. 如申請專利範圍第5項所述之用途，其中該擬人化單株抗體特異性地結合至CD4。
  7. 如申請專利範圍第5項所述之用途，其中該擬人化單株抗體特異性地結合至位於CD4的功能區塊1。
  8. 如申請專利範圍第5項所述之用途，其中該擬人化單株抗體的Fv區域包含一N-醣化點。
  9. 如申請專利範圍第5項所述之用途，其中該擬人化單株抗體重鏈變異區的CDR包含一醣類結合殘基Asn。
  10. 如申請專利範圍第5項所述之用途，其中該擬人化單株抗體包含：包含SEQ ID NO：7之一胺基酸序列的一重鏈；以及包含SEQ ID NO：8之一胺基酸序列的一輕鏈。
  11. 如申請專利範圍第5項所述之用途，其中該擬人化單株抗體包含：包含SEQ ID NO：10之一胺基酸序列的一重鏈；以及包含SEQ ID NO：8之一胺基酸序列的一輕鏈。
  12. 如申請專利範圍第5項所述之用途，其中該擬人化單株抗體包含：包含SEQ ID NO：9之一胺基酸序列的一重鏈，以及包含SEQ ID NO：8之一胺基酸序列的一輕鏈。
  13. 一種醫藥組成物，包含如申請專利範圍第1項所述的擬人化單株抗體以及一藥學上可接受的載體。
  14. 一種包含如申請專利範圍第1項所述之擬人化單株抗體的醫藥組成物，其中該擬人化單株抗體溶於含有20mM甘氨酸及0.05%(v/v)聚山梨酯20的磷酸鹽緩衝液中。
  15. 如申請專利範圍第14項所述之醫藥組成物，其中該磷 酸鹽緩衝液可進一步包含10mM組氨酸。
  16. 如申請專利範圍第14項所述之醫藥組成物，其中該擬人化單株抗體濃度介於1.0mg/mL至200.0mg/mL。
  17. 一種使用如申請專利範圍第1項所述之擬人化單株抗體於製造活化靜默CD4+T細胞之藥物的用途。
  18. 如申請專利範圍第17項所述之用途，其中該擬人化單株抗體特異性地結合至CD4。
  19. 如申請專利範圍第17項所述之用途，其中該擬人化單株抗體特異性地結合至位於CD4的功能區塊1。
  20. 如申請專利範圍第17項所述之用途，其中該擬人化單株抗體的Fv區域包含一N-醣化點。
  21. 如申請專利範圍第17項所述之用途，其中該擬人化單株抗體重鏈變異區的CDR包括一醣類結合殘基Asn。
  22. 如申請專利範圍第17項所述之用途，其中該擬人化單株抗體包含：包含SEQ ID NO：10之一胺基酸序列的一重鏈，以及包含SEQ ID NO：8之一胺基酸序列的一輕鏈。
  23. 如申請專利範圍第17項所述之用途，其中該擬人化單株抗體包含：包含SEQ ID NO：7之一胺基酸序列的一重鏈，以及包含SEQ ID NO：8之一胺基酸序列的一輕鏈。
  24. 如申請專利範圍第17項所述之用途，其中該擬人化單株抗體包含：包含SEQ ID NO：9之一胺基酸序列的一重鏈，以及 包含SEQ ID NO：8之一胺基酸序列的一輕鏈。
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