DE3828582A1

DE3828582A1 - Monoklonaler antikoerper zur inhibierung der infektion von zellen durch hiv-viren

Info

Publication number: DE3828582A1
Application number: DE3828582A
Authority: DE
Inventors: Frank Prof Dr Emmrich; Gerhard Prof Dr Hunsmann; Wolfgang Dr Lueke
Original assignee: Deutsches Primatenzentrum GmbH; Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Deutsches Primatenzentrum GmbH; Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 1988-08-23
Filing date: 1988-08-23
Publication date: 1990-03-01
Also published as: EP0430999A1; DK24891A; AU4070289A; JPH04501055A; WO1990002199A1; ES2018387A6; AU629847B2; DK24891D0

Description

Die Erfindung betrifft einen monoklonalen Antikörper, eine ihn produzierende Zellinie, sowie die Verwendung des monoklonalen Antikörpers zur Inhibierung der Infektion von Zellen durch das HIV-Virus.

Das HIV-Virus, auch HTLV-III- oder LAV-1-Virus genannt, ist das etiologische Agens der erworbenen Immunschwäche AIDS. Bereits seit der Entdeckung dieses Virus wird weltweit in der medizinischen Forschung versucht, ein Medikament zur Behandlung von AIDS, bzw. eine Möglichkeit zur Verhinderung der Infektion von gesunden Menschen zu finden. Bei der medikamentösen Behandlung von bereits infizierten, sogenannten HIV-positiven Personen, welche wiederum bereits schwere AIDS-Symptome zeigen, wird mit Substanzen, wie z. B. AZT (Azidothymidin), welche die Bildung von zur viralen RNA komplementärer DNA blockieren, versucht, eine Fortpflanzung der Viren zu verhindern und dadurch eine weitere Verschlechterung des Zustands der Patienten zu vermeiden. Derartige Substanzen, die die Bildung von intakter DNA verhindern, haben jedoch auch auf gesunde Zellen negative Auswirkungen und die bei der notwendigen Langzeitbehandlung auftretenden Nebenwirkungen sind beträchtlich. Es kann daher noch nicht die Rede davon sein, daß ein wirksames Medikament zur Bekämpfung von AIDS bereits gefunden sei. Es muß außerdem weiterhin besonders das Augenmerk auf die Verhinderung der Infektion von noch uninfizierten Personen gerichtet werden. Hierfür gibt es bereits Ansätze einiger Laboratorien, Impfstoffe gegen das HIV-Virus herzustellen. Mit den bisher erprobten Strategien ist es jedoch noch nicht gelungen, im Menschen die Bildung von Antikörpern unter Ausbildung sogenannter Gedächtniszellen zu bewirken. Die Bildung der Gedächtnis zellen ist notwendig, damit nicht nach Abklingen der Primärimmunreaktion gegen den Impfstoff der Körper wiederum ungeschützt gegen das Virus bleibt, sondern nach Infektion durch das Virus diese Zellen eine wirksame Sekundärimmunreaktion einleiten können.

Es ist daher die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Möglichkeit zu schaffen, sowohl uninfizierte Personen vor einer Infektion durch das HIV-Virus zu schützen, als auch bei infizierten Personen eine Aus breitung des Virus auf noch gesunde Zellen zu verhindern. Es ist bereits aus Kowalski et al., Science Vol. 237, Seiten 1351 bis 1355 bekannt, daß das virale Oberflächen protein gp120 an das sogenannte CD-4-Protein, das auf der Oberfläche von beispielsweise Helfer-T-Lymphozyten, Makrophagen und anderen Zellen (Dalgleish et al., Nature, 312, [1984], 763; Klatzmann et al., ibid., Seite 767, McDougal et al., Science 231, 382 [1986]) vorhanden ist, bindet, und somit die Gewebespezifität der viralen Infektion bestimmt. Analog zu anderen Viren mit einer Virushülle wird nach der Bindung von gp120 an CD-4 der Viruseintritt in die Zelle durch eine hüllenver mittelte Fusion der viralen und Zielzellen-Membranen erleichtert.

Ein Gegenstand der Erfindung ist nun eine Hybridom- Zellinie, ECACC 88 050 502, die einen monoklonalen Antikörper 30F16H5 produziert, der wiederum ein weiterer Gegenstand der Anmeldung ist. Dieser monoklonale Anti körper bindet an das CD-4-Protein, welches auf der Oberfläche der Zielzellen der HIV-Viren vorhanden ist und verhindert dadurch die Bindung des viralen Glyko proteins gp120 (gp130 für SIV = simian immunodeficiency virus, einem dem HIV nah verwandten Affenvirus) an das Protein und dadurch den Viruseintritt in die Zelle.

Die Gewinnung des monoklonalen Antikörpers aus den Hybridom-Zellinien erfolgt nach an sich bekannten Methoden, nämlich werden die Zellen kultiviert und die monoklonalen Antikörper z. B. aus dem Zellüberstand durch Protein A Sepharose-Chromatographie erhalten.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Ver wendung des monoklonalen Antikörpers 30F16H5 zur Inhibierung der Infektion von Zellen, welche ein CD-4-Protein auf ihrer Oberfläche aufweisen, durch HIV-Viren. Durch die Verwendung des erfindungsgemäßen Antikörpers kann eine Erstinfektion z. B. bei besonders gefährdeten Personen durch Blockierung des CD-4-Proteins für das HIV-Virus und damit der Verhinderung des Eindringens des Virus vermieden werden. Weiter kann jedoch auch nach bereits erfolgter Infektion die Ausbreitung des Virus durch Infektion weiterer Zellen durch Tochterviren verhindert werden, wodurch die Virusinfektion zum Stillstand kommt. Die bereits infizierten Zellen sterben nach Virusvermehrung ab, das Virus kann jedoch nicht mehr in neue Zellen eindringen. Es unterbleibt daher die fortschreitende Zerstörung der T-Zellen, welche nach einer HIV-Infektion zur Erkrankungsform AIDS und zum Tode führt.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher ein Arzneimittel zur Verhütung einer Infektion durch HIV-Viren oder/und der Ausbreitung der Viren im Körper nach erfolgter Infektion, das den erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper 30F16H5 in einer pharmezeutisch geeigneten Zubereitungsform enthält. Hierbei können weitere übliche pharmazeutische Träger- und Zusatzstoffe eingeschlossen sein. Aus Zusatzstoffe sind hier beispielsweise Interferone oder Interleukine denkbar, die zu einer Aktivierung des Immunsystems und damit zur schnelleren Neutralisation der im Blut zirkulierenden HIV-Viren beitragen können.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Verhütung einer Infektion durch HIV-Viren oder/und der Ausbreitung der Viren im Körper nach erfolgter Infektion, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man den erfindungsgemäßen mono klonalen Antikörper 30F16H5 gegebenenfalls mit üblichen Träger- und Zusatzstoffen in eine pharmazeutisch geeignete Anwendungsform bringt.

Geeignete Anwendungsformen für das erfindungsgemäße Arzneimittel sind bevorzugt Lösungen, die zur intravenösen Injektion geeignet sind.

Erfindungsgemäß gelingt es also, durch das Bereitsstellen des monoklonalen Antikörpers 30F16H5, bzw. der Hybridom-Zellinie ECACC 88 050 502, ein Mittel zur Blockierung des Eindringens von HIV-Viren in deren Zielzellen bereitzustellen. Dies kann vor allem bei gefährdeten uninfizierten Personen eine mögliche Infektion verhindern oder aber bei bereits infizierten Personen die fortschreitende Zerstörung des gesamten Immunsystems und damit die lethalen Folgen der Infektion verhindern.

Die folgenden Beispiele erläutern in Verbindung mit den Abbildungen die Erfindung weiter.

Fig. 1 zeigt die Autoradiographie einer Immunpräzipitation mit verschiedenen Antiseren und monoklonalen Antikörpern;

Fig. 2 zeigt die Ergebnisse eines Virusneutralisations tests mit dem erfindungsgemäßen Antikörper.

Fig. 3 zeigt die Ergebnisse eines Virusneutralisations tests mit verschiedenen monoklonalen Antikörpern.

Beispiel 1

Immunisierung und Produktion der Hybridome zur Herstellung des monoklonalen Antikörpers 30F16H5:

4 × 10⁶ bis 8 × 10⁶ Zellen des menschlichen CD4-positiven Helfer-T-Lymphozyten Klons 2C11 (Emmrich & Kaufmann, Infection and Immunity 51 [1986] 879) wurden dreimal jeweils im Abstand von 7 Tagen in weibliche BALB/c-Mäuse intraperitoneal injiziert. Es erfolgte eine weitere Immunisierung nach drei Wochen. Am darauffolgenden Tage wurde die gleiche Zellmenge intravenös verabfolgt. 3 Tage nach der letzten Injektion wurde die Tiere getötet und die Milzzellen nach der Methode von Köhler und Milstein (Nature 256 [1975] 495) mit X63.Ag8.653 Myelomazellen fusioniert (Kearney et al. J. Immunol. 123 [1979] 1548).

Nach 10 bis 14 Tagen wurde von den wachsenden Hybridomen Kulturüberstand entnommen und deren Antikörperaktivität in funktionellen Tests in vitro untersucht. Der Isotyp des Antikörpers 30F16H5 wurde mittels ELISA (Emmrich et al., Eur. J. Immunol. 13 [1983] 273) als Maus-IgG1 ermittelt. Eine Probe der Hybridomzellen wurde bei ECACC unter der Eingangsnummer 88 050 502 hinterlegt.

Die Spezifität des Antikörpers 30F16H5 wurde methodisch durch cell-ELISA- APAAP-Färbung und Zytofluorometrie nachgewiesen. In Tabelle 1 sind repräsentative Ergebnisse des Einsatzes von 1 µg/ml 30F16H5 bei der Bindung an drei verschiedene menschliche Zellpopolationen dar gestellt. Eine lymphoblastoide B-Zellinie wurde durch Transformation von menschlichen B-Lymphozyten (Steinitz et al., Immunobiology 156 [1979] 41) erzeugt und als homogene B-Zellpopulation eingesetzt. CD4- und CD8-T- Zellen wurden über ein mehrstufiges Verfahren aus menschlichem Blut isoliert (Emmrich et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 [1986] 8298). Hierfür wurde zunächst ein Ficolldichtegradient zur Trennung der mononukleären Zellen verwendet. Adhärente Zellen wurden an Plastikober flächen depletiert, sodann wurden T-Lymphozyten durch Rossettierung mit stabilisierten Schafserythrozyten gewonnen. Nach Lysierung der Erythrozyten wurden die T- Zellen mit kommerziell erhältlichen anti-CD4 und anti-CD8 Antikörpern markiert und als Antikörper negative Population mit einem Fluoreszenz-aktivierten Zellsortiergerät getrennt. Die Kontamination mit anderen Zellen lag für beide Populationen unter 1%. Die Markierung mit Antikörpern erfolgte nach einschlägigen Methoden (Gathings et al., Eur. J. Immunol. 7 [1977] 804) unter Verwendung eines anti-Maus-Immunoglubulin Antikörpers, der mit FITC (Fluoresceinisothiocyanat) gekoppelt war.

Tabelle 1 zeigt, daß nur CD4 T-Zellen durch den Anti körper 30F16H5 erkannt werden. Da keine weiteren populations differenten Antigene außer CD4 und CD8 auf den so charakterisierten Zellen bekannt sind, ist die Folgerung schlüssig, daß 30F16H5 das CD4-Antigen erkennt. Dies wurde durch Radioimmunpräzipitations experiment bestätigt.

Tabelle 1

Beispiel 2

Untersuchungen der Inhibition der Bindung von ¹²⁵I-markiertem gp130 an CD-4 aufweisende Zellen durch verschiedene Seren oder Antikörper. Gp130 wurde, wie in der europäischen Patentanmeldung 88 100 191.1 beschrieben, gereinigt. Das gereinigte gp130 wurde wie bei Markwell and Fox (1978), Biochemistry 17, S. 4817 beschrieben mit Iodogen als dem Oxidationsmittel jodiert. Sodann wurden hiermit Bindungsstudien wie folgt durchgeführt:

10⁶ Molt-4-Zellen (menschliche Lymphomzellen) wurden dreimal mit RPMI-Kulturmedium (Fa. GIBCO) ohne Serum gewaschen. Die gewaschenen Zellen wurden mit 10⁶ cpm des radiojodierten gp130 in Anwesenheit oder Abwesenheit von 0,03 ml Serum oder 0,03 ml (entspricht 1,5 µg Protein) Antikörper in 0,50 ml RPMI (Fa. GIBCO), enthaltend 10% foetales Kälberserum, 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurden die Zellen pelletiert und viermal mit jeweils 1 ml RPMI ohne Serum gewaschen. Das Zell pellet wurde in 0,10 ml Lysispuffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 140 mM NaCl, 2 mM MgCl₂, 1 mM DTT (Dithiotreitol), 1 mM PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid), 0,5% NP-40 (Nonidet P 40, nichtionisches Detergens)) resuspendiert und 15 Minuten bei 4°C solubilisiert. Die Lysate wurden bei 10 000 g 15 Minuten geklärt. 0,08 ml der Überstände wurden mit 0,08 ml Reaktionspuffer (1 Volumen Lysis puffer, 2 Volumen phosphatgepufferte Kochsalzlösung und 0,20 mg/ml Ovalbumin) verdünnt. Dann wurden 0,008 ml eines Serums, erhalten aus einer natürlich infizierten grünen Meerkatze (african green monkey) zugegeben und damit 2 Stunden bei 4°C inkubiert. Danach wurde eine Immunpräzipitation durch Zugabe von 1 mg Protein-A-Sepharose pro 0,001 ml des zugegebenen Serums für 30 Minuten durchgeführt. Die Präzipitate wurden durch Zentrifugation gesammelt und einmal mit Waschpuffer mit hohem Salzgehalt (20 mM Tris-HCl, pH 7,6, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5% NP-40, 1% Natriumdeoxycholat, 30% Sucrose) und zweimal mit Waschpuffer mit niedrigem Salzgehalt (10 mM Tris-HCl, pH 7,6, 10 mM NaCl) gewaschen. Die Präzipitate wurden in 0,05 ml Proben-Puffer (0,050 M Tris-HCl, pH 6,8, 0,250 M Dithiotreitol, 8,000 M Harnstoff, 2,300% SDS und Zugabe von 0,005 µl einer gesättigten Bromphenolblau lösung pro 1 ml Proben-Puffer) aufgenommen und 4 Minuten gekocht. Die Sepharose wurde dann bei 10 000 g 5 Minuten lang pelletiert und 0,03 ml der Überstände wurden in einem 9 bis 12%igen SDS-Polyacrylamidgradientengel elektrophoretisiert. Nach der Elektrophorese wurde das Gel getrocknet und eine Autoradiographie durchgeführt.

Fig. 1 zeigt die Autoradiographie einer solchen Immun prozipitation, wobei die einzelnen Spalten a bis m die Bindung von gp130 an CD-4 tragende Zellen in Anwesenheit folgender Antiseren bzw. Antikörper wiedergibt:

In der Tabelle 2 sind die Ergebnisse der Messung der radioaktiven Strahlung der gp130-Bande der Fig. 1 als %-Inhibition gegenüber einer Kontrolle angegeben.

Serum
%-Inhibition \|-
0
gp130/KLH/CFA Kaninchen-Immunserum	90
Kaninchen-Präimmunserum	2
gp130/GLA/-KLH/ICFA Rhesus-Immunserum, zwei Wochen nach Immunisierung	51
gp130/KLH/-ICFA Rhesus-Immunserum zwei Wochen nach Immunisierung	53
Serum einer natürlich infizierten grünen Meerkatze	95
gp130/GLA/KLH/ICFA 10 Wochen nach Basis-Immunisierung	96
gp130/KLH/ICFA 10 Wochen nach Basis-Immunisierung	93
OKT4-MK	24
Medac T4-MK	89
Dakopatts T4-MK	91
30F16H5	95

Hieraus ist zu entnehmen, daß der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper 30F16H5 die Bindung von gp130 an das CD-4-Protein der Molt-4-Zellen im Vergleich mit den anderen monoklonalen Antikörpern am stärksten inhibiert.

Beispiel 3

Herstellung der im Beispiel 2 verwendeten Antiseren.

Die Herstellung der anti gp130 Antiseren im Rhesusaffen erfolgte, wie in der europäischen Patentanmeldung 88 100 191.1 beschrieben.

Das Kaninchenantiserum wurde wie folgt hergestellt:
30 µg des gereinigten gp130 wurden mit KLH (Haemocyanin der Schlüsselschnecke) gemischt und in komplettem Freund's Adjuvans (CFA) emulgiert. Die Hälfte dieser Emulsion wurde einem Kaninchen subcutan injiziert. Nach 4 Wochen wurde die andere Hälfte intramuskulär injiziert. Das hier verwendete Antiserum wurde 2 Wochen nach der zweiten Injektion entnommen.

Beispiel 4

Virus-Neutralisationstest des erfindungsgemäßen Antikörpers.

Der Neutralisationstest wurde gemäß Harada et al., J. Immun. Meth., 92 (1986), 77-181, Harada et al., J. Clin. Microbiol. 22, (1985), 908-911 durchgeführt. Hierzu wurden HTLV I-transformierte MT4-Zellen verwendet, die sehr sensitiv für HIV I-Cytophthogenität sind (Harada et al., Science 229 [1985], 563-566). Die Reduktion der viralen Infektiosität wurde durch Messung der (³H)-Thymidinaufnahme als Marker der Zellvermehrung bestimmt. Zunächst wurden von dem Antikörper Vorverdünnungen von 1 : 10 bis 1 : 1280 in Click-RPMI (Fa. Biochrom) mit 20% inaktiviertem foetalem Kälberserum und 25 mM Hepes hergestellt. Die jeweiligen Vorverdünnungen des Antikörpers (100 µl) wurden dann mit einem gleichen Volumen der infektiösen Virusdosis gemischt. Die infektiöse Virusdosis ist definiert als die Virusmenge, die den (³H)-Thymidineinbau von nicht-infizierten Zellen zu mehr als 90% reduzieren kann. Von dieser Mischung wurden dann 50 µl zu einem gleichen Volumen einer MT4-Zellsuspension (6 × 10⁵-Zellen pro ml) in einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen zugegeben. Die Endverdünnungen des Antikörpers erstreckten sich dann von 1 : 40 bis 1 : 5120. Die Zellen wurden in Click-RPMI (Fa. Biochrom) mit 20% foetalem Kälberserum und 25 mM HEPES bei 37°C in einer 5%igen CO₂-Atmosphäre kultiviert. Nach 3 Tagen wurden die Zellen mit 100 µl frischem Medium versehen. 4 Tage nach Infektion wurden 0,1 µCi (³H)-Thymidin zu den Zellen zugegeben. 20 Stunden später wurden die Zellen auf Glasfaserfilter gesammelt und mit 10% Trichloressigsäure gewaschen. Die Radio aktivität der Filter wurde bestimmt. Alle Versuche wurden dreimal durchgeführt. Fig. 2A-D zeigt den neutralisierenden Effekt des erfindungsgemäßen Antikörpers 30F16H5 bei verschiedener Verdünnung für die Infektion von Zellen durch HIV-1-IIIB (Fig. 2A), HIV-2-ben (Fig. 2B), SIVmac (Fig. 2C) und SIVagm-TYO-7 (Fig. 2D).

Es kann daraus ersehen werden, daß der erfindungsgemäße Antikörper die Infektiösität von HIV I bis zu einer Verdünnung von 1 : 1600 und von HIV II bis zu einer Ver dünnung von 1 : 800 zu 75% zu unterdrücken vermag.

Beispiel 5

Vergleich der Virus-neutralisierenden Wirkung verschiedener Antikörper.

Auch hier wurden zunächst Vorverdünnungen des Antikörpers von 1 : 10 bis 1 : 1280 in Click-RPMI (Fa. Biochrom) mit 20% foetalem Kälberserum in 25 mM HEPES hergestellt. 25 µl der jeweiligen Antikörperverdünnung wurden mit 50 µl einer MT4-Zellsuspension (6 × 10⁶ Zellen pro ml) für eine Stunde bei 37°C inkubiert. Die Endverdünnung des Antikörpers erstreckt sich dann von 1 : 30 bis 1 : 3840. Die so behandelten Zellen wurden dann für 10 Minuten bei 1500 rpm in einer Zentrifuge (Haereus Minifuge) abzentrifugiert und mit der entsprechenden HIV-1-IIIb infektiösen Dosis in 100 µl Click-RPMI (Fa. Biochrom) mit 20% foetalem Kälberserum und 25 mM Hepes bei 37°C in einer 5%igen CO₂-Atmosphäre kultiviert. Die weitere Vorgehensweise entsprach Beispiel 4. Fig. 3 zeigt den neutralisierenden Effekt verschiedener käuflicher Antikörper im Vergleich mit dem erfindungsgemäßen Antikörper.

Claims

1. Hybridoma-Zellinie ECACC 88 050 502.

2. Monoklonaler Antikörper 30F16H5, erhältlich aus der Hybridom-Zellinie ECACC 88 050 502.

3. Verwendung des monoklonalen Antikörpers 30F16H5 zur Inhibierung der Infektion von Zellen, welche ein CD4-Protein auf ihrer Oberfläche aufweisen, durch HIV- oder SIV-Viren.

4. Arzneimittel zur Verhütung einer Infektion durch HIV- oder SIV-Viren oder/und der Ausbreitung von Viren im Körper nach erfolgter Infektion, dadurch gekennzeichnet, daß es den monoklonalen Antikörper 30F16H5 gegebenen falls mit üblichen pharmazeutischen Träger- und Zusatzstoffen enthält.

5. Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Verhütung einer Infektion durch HIV- oder SIV-Viren oder/und der Ausbreitung der Viren im Körper nach erfolgter Infektion, dadurch gekennzeichnet, daß man den monoklonalen Antikörper 30F16H5 gegebenenfalls mit üblichen Träger- und Zusatzstoffen in eine pharma zeutisch geeignete Anwendungsform bringt.