EP0430999A1 - Monoklonaler antikörper zur inhibierung der infektion von zellen durch hiv-viren - Google Patents

Monoklonaler antikörper zur inhibierung der infektion von zellen durch hiv-viren

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EP0430999A1
EP0430999A1 EP89909393A EP89909393A EP0430999A1 EP 0430999 A1 EP0430999 A1 EP 0430999A1 EP 89909393 A EP89909393 A EP 89909393A EP 89909393 A EP89909393 A EP 89909393A EP 0430999 A1 EP0430999 A1 EP 0430999A1
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EP
European Patent Office
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cells
monoclonal antibody
hiv
infection
viruses
Prior art date
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Ceased
Application number
EP89909393A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Frank Prof. Dr. Emmrich
Gerhard Prof. Dr. Hunsmann
Wolfgang Dr. Lüke
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Deutsches Primatenzentrum GmbH
Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Original Assignee
Deutsches Primatenzentrum GmbH
Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
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Filing date
Publication date
Application filed by Deutsches Primatenzentrum GmbH, Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV filed Critical Deutsches Primatenzentrum GmbH
Publication of EP0430999A1 publication Critical patent/EP0430999A1/de
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2812—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C07K16/1036—Retroviridae, e.g. leukemia viruses
    • C07K16/1045—Lentiviridae, e.g. HIV, FIV, SIV
    • C07K16/1063—Lentiviridae, e.g. HIV, FIV, SIV env, e.g. gp41, gp110/120, gp160, V3, PND, CD4 binding site
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • MonocTonal antibody to inhibit the infection of cells by HIV viruses MonocTonal antibody to inhibit the infection of cells by HIV viruses
  • the invention relates to a monoclonal antibody, a cell line producing it, and to the use of the monoclonal antibody * 'for inhibiting Infek ⁇ tion of cells by the HIV virus.
  • the HIV virus also called HTLV-III or LAV-1 virus
  • HTLV-III or LAV-1 virus is the etiological agent of acquired immune deficiency AIDS. Since the discovery of this virus, medical research worldwide has been trying to find a medicament for the treatment of AIDS, or a way to prevent infection of healthy people. In the medical treatment of already infected, so-called HIV-positive people, who in turn already show severe AIDS symptoms, with substances such as. B. AZT (azidothymidine), which block the formation of DNA complementary to the viral RNA, tries to prevent the reproduction of the viruses and thereby to prevent a further deterioration in the condition of the patients.
  • AZT azidothymidine
  • the object of the present invention to create a possibility both to protect uninfected persons from infection by the HIV virus and to prevent the virus from spreading to still healthy cells in infected persons.
  • the viral surface protein gpl20 binds to the so-called CD-4 protein which is on the surface of, for example, helper T lymphocytes, macrophages and other cells (Dalgleish et al., Nature, 312, (1984), 763; Klatzmann et al., ibid., page 767, McDougal et al., Science 231, 382 (1986)) binds, and thus the Tissue specificity of the viral infection was determined.
  • the virus entry into the cell is facilitated by an envelope-mediated fusion of the viral and target cell membranes.
  • the invention now relates to a hybridoma cell line, ECACC 88050502, which produces a monoclonal antibody 30F16H5, which in turn is a further subject of the application.
  • This monoclonal antibody binds to the CD-4 protein, which is on the - ⁇ -
  • the monoclonal antibody is obtained from the hybridoma cell lines by methods known per se, namely the cells are cultivated and the monoclonal antibodies are z.
  • B. obtained from the cell supernatant by protein A Sepharo ' s chromatography.
  • Another object of the invention is the use of the monoclonal antibody 30F16H5 to inhibit the infection of cells which have a CD-4 protein on their surface by HIV viruses.
  • an initial infection z. B. in particularly vulnerable people by blocking the CD-4 protein for the HIV virus and thus preventing the entry of the virus.
  • the spread of the virus can be prevented by infection of further cells by daughter viruses, as a result of which the virus infection comes to a halt.
  • the already infected cells die after virus multiplication, but the viris can no longer penetrate new cells. There is therefore no progressive destruction of the T cells, which leads to the form of AIDS and death after HIV infection.
  • Another object of the invention is therefore a medicament for preventing infection by HIV viruses and / or the spread of viruses in the body -
  • additives for example, interferons or interleukins are conceivable, which can contribute to an activation of the immune system and thus for faster neutralization "of circulating in the blood of HIV-viruses.
  • Another object of the invention is a process for the manufacture of a medicament for preventing infection by HIV viruses and / or the spread of the viruses in the body after infection, which is characterized in that the monoclonal antibody 30F16H5 according to the invention is optionally treated with conventional Bring carriers and additives in a pharmaceutically suitable form of use.
  • Suitable forms of use for the medicament according to the invention are preferably solutions which are suitable for intravenous injection.
  • the monoclonal antibody 30F16H5 or the hybridoma cell line ECACC 88050502 it is possible to provide a means of blocking the penetration of HIV viruses into their target cells. This can prevent a possible infection, particularly in the case of uninfected persons at risk, or it can prevent the progressive destruction of the entire immune system and thus the lethal consequences of the infection in persons who are already infected.
  • the isotype of the antibody 30F16H5 was determined by means of ELISA (Emmrich et al., Eur. J. Immunol. 13 (1983) 273) as mouse IgGl.
  • a sample of the hybridoma cells was deposited with ECACC under the entry number 88050502.
  • the specificity of the antibody 30F16H5 was demonstrated methodically by cell ELISA, APAAP staining and cytofluorometry.
  • Table 1 shows representative results of the use of 1 ⁇ g / ml 30F16H5 in binding to three different human cell populations.
  • a lymphoblastoid B cell line was generated by transformation of human B lymphocytes (Steinitz et al., Immunobiology 156 (1979) 41) and used as a homogeneous B cell population.
  • CD4 and CD8 T cells were isolated from human blood using a multistage process (Emmrich et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986) 8298).
  • a Ficoll density gradient was first used to separate the mononuclear cells. Adherent cells were depleted on plastic surfaces, then T-lymphocytes were obtained by rosetting with stabilized sheep erythrocytes.
  • the T cells were labeled with commercially available anti-CD4 and anti-CD8 antibodies and, as an antibody, negative populations were separated using a fluorescence-activated cell sorting device. Contamination with other cells was less than 1% for both populations.
  • the labeling with antibodies was carried out according to relevant methods (Gathings et al., Eur. J. Immunol. 7 (1977) 804) using an anti-mouse immunoglobulin antibody which was coupled with FITC (fluorescein isothiocyanate).
  • Table 1 shows that only CD4 T cells are recognized by the antibody 30F16H5. Since no other population-different antigens other than CD4 and CD8 are known on the cells characterized in this way, it is conclusive that 30F16H5 recognizes the CD4 antigen. This was confirmed by radioimmunoprecipitation experts. - -
  • the cells were washed with 10 cpm of radioiodinated gpl30 ml in the presence or absence of serum or 0.03 0.03 ml (corresponds to 1.5 ⁇ g protein) antibody in 0.50 ml RPMI (GIBCO), containing 10% fetal calf serum, incubated for 2 hours at room temperature, then the cells were pelleted and washed four times with 1 ml RPMI without serum.
  • GIBCO 0.50 ml RPMI
  • the cell pellet was dissolved in 0.10 ml lysis buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 140 mM NaCl, 2 mM MgCl 2 , 1 mM DTT (dithiotreitol), 1 mM PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride), 0.5% NP-40 (Nonidet P 40, nonionic detergent)) resuspended and solubilized for 15 minutes at 4 ° C. The lysates were clarified at 10,000 g for 15 minutes.
  • 0.08 ml of the supernatants were mixed with 0.08 ml reaction buffer (1 volume Lysis ⁇ buffer, 2 volumes of phosphate buffered saline and 0.20 mg / ml ovalbumin), then 0.008 ml of a serum, obtained from a naturally infected green monkey (african green onkey), was added and incubated for 2 hours at 4 ° C. Thereafter, immunoprecipitation was carried out by adding 1 mg of Protein A Sepharose per 0.001 ml of the added serum for 30 minutes.
  • the precipitates were collected by centrifugation and once with high salt wash buffer (20mM Tris-HCl, pH 7.6, 500mM NaCl, 1mM EDTA, 0.5% NP-40 ' , 1% sodium deoxycholate, 30% sucrose ) and washed twice with wash buffer with low salt content (10 mM Tris-HCl, pH 7.6, 10 mM NaCl).
  • the precipitates were in 0.05 ml sample buffer (0.050 M Tris-HCl, pH 6.8, 0.250 M dithiotreitol, 8,000 M urea, 2,300% SDS • and addition of 0.005 ⁇ l of a saturated Bro phenolbia solution per 1 ml sample Buffer) and 4 minutes boiled.
  • the Sepharose was then pelleted at 10,000 g for 5 minutes and 0.03 ml of the supernatants were electrophoresed in a 9 to 12% SDS polyacrylamide gradient gel. After electrophoresis, the gel was dried and autoradiography was carried out.
  • 1 shows the autoradiography of such an immunoprecipitation, the individual columns a to m representing the binding of gpl30 to cells carrying CD-4 in the presence of the following antisera or antibodies: a without antiseru, b gpl30 / KLH '/ CFA 'rabbit immune serum c rabbit pre-immune serum (non-immune serum) d gpl30 / GLA 3) / KLH 1) / ICFA 4) rhesus immune serum, two weeks after immunization e gpl30 / KLH 1) / ICFA4) rhesus immune serum, two weeks after immunization e gpl30 / KLH 1) / ICFA4) rhesus immune serum, two weeks after immunization e gpl30 / KLH 1) / ICFA4) rhesus immune serum, two weeks after immunization e gpl30 / KLH 1)
  • Table 2 shows the results of the measurement of the radioactive radiation of the gpl30 band of FIG. 1 as% inhibition against a control.
  • the monoclonal antibody 30F16H5 according to the invention most strongly inhibits the binding of gpl30 to the CD-4 protein of the Molt-4 cells in comparison with the other monoclonal antibodies. - U -
  • the anti gpl30 antisera in the rhesus monkey were prepared as described in European patent application 88 100 191.1.
  • the rabbit antiserum was prepared as follows:
  • gpl30 30 ⁇ g of the purified gpl30 were mixed with KLH (Hae ocyanin of the keyhole worm) and emulsified in complete Freund's adjuvant (CFA). Half of this emulsion was injected subcutaneously into a rabbit. After 4 weeks, the other half was injected intramuscularly. The antiserum used here was removed 2 weeks after the second injection.
  • KLH Hae ocyanin of the keyhole worm
  • CFA complete Freund's adjuvant
  • the neutralization test was carried out according to Harada et al., J. Immun. Meth., 92_ (1986), 77-181, Harada et al., J. Clin. Microbiol. 2, (1985), 908-911.
  • HTLV I-transformed MT4 cells were used for this. det, which are very sensitive to HIV I cytopathogenicity (Harada et al., Science 229 (1985), 563-566).
  • the reduction in viral infectivity was determined by measurement
  • infectious virus dose is defined as the amount of virus that
  • 2 AD shows the neutralizing effect of the antibody 30F16H5 according to the invention at various dilutions for the infection of cells by HIV-1-IIIB (FIG. 2A), HIV-2-ben (FIG. 2B), SIVmac (FIG. 2C) ) and SIVagm-TYO-7 (Fig. 2D).
  • the antibody according to the invention is able to suppress the infectivity of HIV I up to a dilution of 1: 1600 and of HIV II up to a dilution of 1: 800 by " 75%.
  • predilutions of the antibody from 1:10 to 1: 1280 were first prepared in Click-RPMI (Biochrom) with 20% fetal calf serum in 25 mM HEPES. 25 ul of the respective antibody dilution were incubated with 50 ul of an MT4 cell suspension (6x10 cells per ml) for one hour at 37 ° C. The final dilution of the antibody then ranges from 1:30 to 1: 3840. The treated cells were then centrifuged for 10 minutes at 1500 rp in duties.Zentrifuge (Haereus Minifuge), • and with the corresponding infectious HIV-1 IIIb dose in 100 ul RPMI click (Fa.
  • FIG. 3 shows the neutralizing effect of various commercially available antibodies in comparison with the antibody according to the invention.

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Description

MonokTonaler Antikörper zur Inhibierung der Infektion von Zellen durch HIV-Viren
B e s c h r e i b u n g
Die Erfindung betrifft einen monoklonalen Antikörper, eine ihn produzierende Zellinie, sowie die Verwendung des monoklonalen* Antikörpers' zur Inhibierung der Infek¬ tion von Zellen durch das HIV-Virus.
Das HIV-Virus, auch HTLV-III- oder LAV-1-Virus genannt, ist das etiologische Agens der erworbenen Immunschwäche AIDS. Bereits seit der Entdeckung dieses Virus wird weltweit in der medizinischen Forschung versucht, ein Medikament zur Behandlung von AIDS, bzw. eine Möglich¬ keit zur Verhinderung der Infektion von gesunden Men¬ schen zu finden. Bei der medikamentösen Behandlung von bereits infizierten, sogenannten HIV-positiven Personen, welche wiederum bereits schwere AIDS-Symptome zeigen, wird mit Substanzen, wie z. B. AZT (Azidothymidin) , welche die Bildung von zur viralen RNA komplementärer DNA blockieren, versucht, eine Fortpflanzung der Viren zu verhindern und dadurch eine weitere Verschlechterung des Zustands der Patienten zu vermeiden. Derartige Substanzen, die die Bildung von intakter DNA verhindern, haben jedoch auch auf gesunde Zellen negative Auswirkun¬ gen und die bei der notwendigen Langzeitbehandlung auftretenden Nebenwirkungen sind beträchtlich. Es kann daher noch nicht die Rede davon sein, daß ein wirksames Medikament zur Bekämpfung von AIDS bereits gefunden sei. Es muß außerdem weiterhin besonders das Augenmerk auf die Verhinderung der Infektion von noch uninfizierten Personen gerichtet werden. Hierfür gibt es bereits Ansätze einiger Laboratorien, Impfstoffe gegen das HIV-Virus herzustellen. Mit den bisher erprobten Strategien ist es jedoch noch nicht gelungen, im Menschen die Bildung von Antikörpern unter Ausbildung sogenannter Gedächtniszellen zu bewirken. Die Bildung der Gedächtnis¬ zellen ist notwendig, damit nicht nach Abklingen der Primärimmunreaktion gegen den Impfstoff der Körper wiederum ungeschützt gegen das Virus bleibt, sondern nach Infektion durch das Virus diese Zellen eine wirk¬ same Sekundärimmunreaktion einleiten können.
Es ist daher die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Möglichkeit zu schaffen, sowohl uninfizierte Personen vor einer Infektion durch das HIV-Virus zu schützen, als auch bei infizierten Personen eine Ausbrei¬ tung des Virus auf noch gesunde Zellen zu verhindern. Es ist bereits aus Kowalski et al., Science Vol. 237, Seiten 1351 bis 1355 bekannt, daß das virale Oberflächen¬ protein gpl20 an das sogenannte CD-4-Protein, das auf der Oberfläche von beispielsweise Helfer-T-Lymphozyten, Makrophagen und anderen Zellen (Dalgleish et al. , Nature, 312, (1984), 763; Klatzmann et al., ibid., Seite 767, McDougal et al. , Science 231, 382 (1986)) vorhanden ist, bindet, und somit die Gewebespezifität der viralen Infektion bestimmt. Analog zu anderen Viren mit einer Virushülle wird nach der Bindung von gpl20 an CD-4 der Viruseintritt in die Zelle durch eine hüllenver¬ mittelte Fusion der viralen und Zielzellen-Membranen erleichtert.
Ein Gegenstand der Erfindung ist nun eine Hybridom- Zellinie, ECACC 88050502, die einen monoklonalen Antikör¬ per 30F16H5 produziert, der wiederum ein weiterer Gegenstand der Anmeldung ist. Dieser monoklonale Anti¬ körper bindet an das CD-4-Protein, welches auf der - ^ -
Oberfläche der Zielzellen der HIV-Viren vorhanden ist und verhindert dadurch die Bindung des viralen Glyko- proteins gpl20 (gpl30 für SIV=simian immunodeficiency virus, einem dem HIV nah verwandten Affenvirus) an das Protein und dadurch den Viruseintritt in die Zelle.
Die Gewinnung des monoklonalen Antikörpers aus den Hybridom-Zellinien erfolgt nach an sich bekannten Methoden, nämlich werden die Zellen kultiviert und die monoklonalen Antikörper z. B. aus dem Zeilüberstand durch Protein A Sepharo'se-Chromatographie erhalten.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwen¬ dung des monoklonalen Antikörpers 30F16H5 zur Inhibierung der Infektion von Zellen, welche ein CD-4-Protein auf ihrer Oberfläche aufweisen, durch HIV-Viren. Durch die Verwendung des erfindungsgemäßen Antikörpers kann eine Erstinfektion z. B. bei besonders gefährdeten Personen durch Blockierung des CD-4-Proteins für das HIV-Virus und damit der Verhinderung des Eindringens des Virus vermieden werden. Weiter kann jedoch auch nach bereits erfolgter Infektion die Ausbreitung des Virus durch Infektion weiterer Zellen durch Tochterviren verhindert werden, wodurch die Virusinfektion zum Stillstand kommt. Die bereits infizierten Zellen sterben_ nach Virusvermehrung ab, das Viris kann jedoch nicht mehr in neue Zellen eindringen. Es unterbleibt daher die fortschreitende Zerstörung der T-Zellen, welche nach einer HIV-Infektion zur Erkrankungsform AIDS und zum Tode führt.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher ein Arzneimittel zur Verhütung einer Infektion durch HIV-Viren oder/und der Ausbreitung der Viren im Körper -
nach erfolgter Infektion, das den erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper 30F16H5 in einer pharmazeutisch geeigneten Zubereitungsform enthält. Hierbei können weitere übliche pharmazeutische Träger- und Zusatzstof¬ fe eingeschlossen sein. Als Zusatzstoffe sind hier beispielsweise Interferone oder Interleukine denkbar, die zu einer Aktivierung des Immunsystems und damit zur schnelleren Neutralisation" der im Blut zirkulierenden HIV-Viren beitragen können.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Verhütung einer Infektion durch HIV-Viren oder/und der Ausbreitung der Viren im Körper nach erfolgter Infektion, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man den erfindungsgemäßen mono¬ klonalen Antikörper 30F16H5 gegebenenfalls mit üblichen Träger- und Zusatzstoffen in eine pharmazeutisch ge¬ eignete Anwendungsform bringt.
Geeignete Anwendungsformen für das erfindungsgemäße Arzneimittel sind bevorzugt Lösungen, die zur intrave¬ nösen Injektion geeignet sind.
Erfindungsgemäß gelingt es also, durch das Bereitstel¬ len des monoklonalen Antikörpers 30F16H5, bzw. der Hybridom-Zellinie ECACC 88050502, ein Mittel zur Blockie¬ rung des Eindringens von HIV-Viren in deren Zielzellen bereitzustellen. Dies kann vor allem bei gefährdeten uninfizierten Personen eine mögliche Infektion verhin¬ dern oder aber bei bereits infizierten Personen die fortschreitende Zerstörung des gesamten Immunsystems und damit die lethalen Folgen der Infektion verhindern.
Die folgenden Beispiele erläutern in Verbindung mit den Abbildungen die Erfindung weiter. - S -
Fig. 1 zeigt die Autoradiographie einer Immunpräzi- pitation mit verschiedenen Antiseren und monoklonalen Antikörpern;
Fig. 2 zeigt die Ergebnisse eines Virusneutralisations¬ tests mit dem erfindungsgemäßen Antikörper.
Fig. 3 zeigt die Ergebnisse eines Virusneutrali¬ sationstests mit verschiedenen monoklonalen Antikörpern.
B e i s p i e l 1
Immunisierung und Produktion der Hybridome zur Herstel¬ lung des monoklonalen Antikörpers 30F16H5:
4 x 10 bis 8 x 10 Zellen des menschlichen CD4-positi- ven Helfer-T-Lymphozyten Klons 2C11 (Emmrich & Kaufmann, Infection and Immunity 51 (1986) 879) wurden dreimal jeweils im Abstand von 7 Tagen in weibliche BALB/c-Mäuse intraperitoneal injiziert. Es erfolgte eine weitere Immunisierung nach drei Wochen. Am darauffolgenden Tage wurde die gleiche Zellmenge intravenös verabfolgt. 3 Tage nach der letzten Injektion wurden die Tiere getötet und die Milzzellen nach der Methode von Köhler und Milstein (Nature 256 (1975) 495) mit X63.Ag8.653 Myelomazellen fusioniert (Kearney et al. J. Immunol. 123 (1979) 1548) .
Nach 10 bis 14 Tagen wurde von den wachsenden Hybridomen Kulturüberstand entnommen und deren Antikörperaktivität in funktionellen Tests in vitro untersucht. Der Isotyp des Antikörpers 30F16H5 wurde mittels ELISA (Emmrich et al., Eur. J. Immunol. 13 (1983) 273) als Maus-IgGl er¬ mittelt. Eine Probe der Hybridomzellen wurde bei ECACC unter der Eingangsnummer 88050502 hinterlegt. Die Spezifität des Antikörper 30F16H5 wurde methodisch durch cell-ELISA, APAAP-Färbung und Zytofluorometrie nachgewiesen. In Tabelle 1 sind repräsentative Ergeb¬ nisse des Einsatzes von 1 μg/ml 30F16H5 bei der Bindung an drei verschiedene menschliche Zellpopulationen dar¬ gestellt. Eine lymphoblastoide B-Zellinie wurde durch Transformation von menschlichen B-Lymphozyten (Steinitz et al., I munobiology 156 (1979) 41) erzeugt und als homogene B-Zellpopulation eingesetzt. CD4- und CD8-T- Zellen wurden über ein mehrstufiges Verfahren aus menschlichem Blut isoliert (Emmrich et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83 (1986) 8298) . Hierfür wurde zunächst ein Ficolldichtegradient zur Trennung der mononukleären Zellen verwendet. Adharente Zellen wurden an Plastikober¬ flächen depletiert, sodann wurden T-Lymphozyten durch Rosettierung mit stabilisierten Schafserythrozyten ge¬ wonnen. Nach Lysierung der Erythrozyten wurden die T- Zellen mit kommerziell erhältlichen anti-CD4 und anti-CD8 Antikörpern markiert und als Antikörper negative Popu¬ lation mit einem Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierge- rät getrennt. Die Kontamination mit anderen Zellen lag für beide Populationen unter 1 %. Die Markierung mit Antikörpern erfolgte nach einschlägigen Methoden (Gathings et al. , Eur. J. Immunol. 7 (1977) 804) unter Verwendung eines anti-Maus-Immunoglobulin Antikörpers, der mit FITC (Fluoresceinisothiocyanat) gekoppelt war.
Tabelle 1 zeigt, daß nur CD4 T-Zellen durch den Anti¬ körper 30F16H5 erkannt werden. Da keine weiteren popu- lationsdiffe enten Antigene außer CD4 und CD8 auf den so charakterisierten Zellen bekannt sind, ist die Folgerung schlüssig, daß 30F16H5 das CD4-Antigen er¬ kennt. Dies wurde durch Radioimmunpräzipitationsexperi- ent bestätigt. - -
T a b e l l e
1) Kontrolle bei alleinigem Einsatz eines FITC-markier- ten Zweitantikörpers (Ziege anti Maus-Ig mit Fluores- zein)
2) Antikörper 30F16H5 und Zweitantikörper 3) Lymphoblastoide B-Zellinie
B e i s p i e l
Untersuchungen der Inhibition der Bindung von 125I-mar- kiertem gpl30 an CD-4 aufweisende Zellen durch verschie¬ dene Seren oder Antikörper. • Gpl30 wurde, wie in der europäischen Patentanmeldung 88 100 191.1 beschrieben, . gereinigt. Das gereinigte gpl30 wurde wie bei Markwell and Fox (1978) , Biochemistry 17, S. 4817 beschrieben mit Iodogen als dem Oxidationsmittel jodiert. Sodann wurden hiermit BindungsStudien wie folgt durchgeführt: 10 Molt-4-Zellen (menschliche Lymphomzellen) wurden dreimal mit RPMI-Kulturmedium "(Fa. GIBCO) ohne Serum gewaschen. Die gewaschenen Zellen wurden mit 10 cpm des radiojodierten gpl30 in Anwesenheit oder Abwesenheit von 0,03 ml Serum oder 0,03 ml (entspricht 1,5 μg Protein) Antikörper in 0,50 ml RPMI (Fa. GIBCO), enthaltend 10% foetales Kälberserum, 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurden die Zellen pelletiert und viermal mit jeweils 1 ml RPMI ohne Serum gewaschen. Das Zell¬ pellet wurde in 0,10 ml Lysispuffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 140 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 1 mM DTT (Dithiotreitol) , 1 mM PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid) , 0,5 % NP-40 (Nonidet P 40, nichtionisches Detergens) ) resuspendiert und 15 Minuten bei 4°C solubilisiert. Die Lysate wurden bei 10.000 g 15 Minuten geklärt. 0,08 ml der Überstände wurden mit 0,08 ml Reaktionspuffer (1 Volumen Lysis¬ puffer, 2 Volumen phosphatgepufferte Kochsalzlösung und 0,20 mg/ml Ovalbumin) verdünnt. Dann wurden 0,008 ml eines Serums, erhalten aus einer natürlich infizierten grünen Meerkatze (african green onkey) zugegeben und damit 2 Stunden bei 4°C inkubiert. Danach wurde eine Immunpräzipitation durch Zugäbe von 1 mg Protein-A-Sepha- rose pro 0,001 ml des zugegebenen Serums für 30 Minuten durchgeführt. Die Prazipitate wurden durch Zentrifugation gesammelt und einmal mit Waschpuffer mit hohem Salzgehalt (20 mM Tris-HCl, pH 7,6, 500 *mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5 % NP-40', 1 % Natriumdeoxycholat, 30 % Sucrose) und zweimal mit Waschpuffer mit niedrigem Salzgehalt (10 mM Tris-HCl, pH 7,6, 10 mM NaCl) gewaschen. Die Prazipitate wurden in 0,05 ml Proben-Puffer (0,050 M Tris-HCl, pH 6,8, 0,250 M Dithiotreitol, 8,000 M Harnstoff, 2,300 % SDS • und Zugabe von 0,005 μl einer gesättigten Bro phenolbiau- lösung pro 1 ml Proben-Puffer) aufgenommen und 4 Minu- ten gekocht. Die Sepharose wurde dann bei 10.000 g 5 Minuten lang pelletiert und 0,03 ml der überstände wurden in einem 9 bis 12%igen SDS-Polyacrylamidgradienten- gel elektrophoretisiert. Nach der Elektrophorese wurde das Gel getrocknet und eine Autoradiographie durchge¬ führt.
Fig. 1 zeigt die Autoradiographie einer solchen Immun- präzipitation, wobei die einzelnen Spalten a bis m die Bindung von gpl30 an CD-4 tragende Zellen in Anwesenheit folgender Antiseren bzw. Anti¬ körper wiedergibt: a ohne Antiseru , b gpl30/KLH ' /CFA ' Kaninchen-Immunεerum c Kaninchen-Präimmunserum (Nichtimmunserum) d gpl30/GLA3) /KLH1) /ICFA4) Rhesus-Immunserum, zwei Wochen nach Immunisierung e gpl30/KLH 1) /ICFA4) Rhesus-Immunserum, zwei
Wochen nach Immunisierung f Serum einer natürlich infizierten grünen Meer¬ katze g Serum wie d, jedoch 10 Wochen nach Immunisie¬ rung h Serum wie e, jedoch 10 Wochen nach Immunisie¬ rung i OKT4 monoklonaler Antikörper (Firma Ortho) j monoklonaler Antikörper Medac T4 (Firma Medac, Hamburg) k monoklonaler Antikörper Dakopatts T4-MK (Firma Dakopatts)
1 erfindungsgemäßer monoklonaler Antikörper 30F16H5 normales menschliches Serum (ohne Antikörper) . Haemocyanin der Schlüssellochschnecke
2) komplettes Freund* sches Adjuvans
3) Glutaraldehyd
4) inkomplettes Freund'sches Adjuvans
In der Tabelle 2 sind die Ergebnisse der Messung der radioaktiven Strahlung der gpl30-Bande der Figur 1 als %-Inhibition gegenüber einer Kontrolle angegeben.
T a b e l l e 2
Serum % Inhibition
gpl30/KLH/CFA Kaninchen-Immunserum 90
Kaninchen-Präimmunserum 2 gpl30/GLA/KLH/ICFA Rhesus- Immunserum, zwei Wochen nach
Immunisierung 51 gpl30/KLH/ICFA Rhesus-Immunserum zwei Wochen nach Immunisierung 53 Serum einer natürlich infizierten grünen Meerkatze 95 gpl30/GLA/KLH/ICFA 10 Wochen nach
Basis-Immunisierung 96 gpl30/KLH/ICFA 10 Wochen nach Basiε-
Immunisierung 93
OK 4-MK 24
Medac T4-MK 89
Dakopatts T4-MK 91
30F16H5 - 95
Hieraus ist zu entnehmen, daß der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper 30F16H5 die Bindung von gpl30 an das CD-4-Protein der Molt-4-Zellen im Vergleich mit den anderen monoklonalen Antikörpern am stärksten inhibiert. - U -
B e i s p i e l 3
Herstellung der im Beispiel 2 verwendeten Antiseren.
Die Herstellung der anti gpl30 Antiseren im Rhesusaffen erfolgte, wie in der europäischen Patentanmeldung 88 100 191.1 beschrieben.
Das Kaninchenantiserum wurde wie folgt hergestellt:
30 μg des gereinigten gpl30 wurden mit KLH (Hae ocyanin der Schlüssellochschnecke) gemischt und in komplettem Freund's Adjuvans (CFA) emulgiert. Die Hälfte dieser Emulsion wurde einem Kaninchen subcutan injiziert. Nach 4 Wochen wurde die andere Hälfte intramuskulär injiziert, Das hier verwendete Antiserum wurde 2 Wochen nach der zweiten Injektion entnommen.
B e i s p i e l 4
Virus-Neutralisationstest des erfindungsgemäßen Anti¬ körpers .
Der Neutralisationstest wurde gemäß Harada et al., J. Immun. Meth., 92_ (1986) , 77-181, Harada et al., J. Clin. Microbiol. 2 , (1985) , 908-911 durchgeführt. Hierzu wurden HTLV I-transformierte MT4-Zellen verwen- . det, die sehr sensitiv für HIV I-Cytopathogenität sind (Harada et al., Science 229 (1985), 563-566) . Die Re¬ duktion der viralen Infektiosität wurde durch Messung
3 der ( H) -Thymidinaufnahme als Marker der Zellvermehrung bestimmt. Zunächst wurden von dem Antikörper Vorverdün¬ nungen von 1:10 bis 1:1280 in Click-RPMI (Fa. Biochrom) - 4 -
mit 20% inaktiviertem foetalem Kälberserum und 25 mM Hepes hergestellt. Die jeweiligen Vorverdünnungen des Antikörpers (100 μl) wurden dann mit einem gleichen Volumen der infektiösen Virusdosis gemischt. Die infek¬ tiöse Virusdosis ist definiert als die Virusmenge, die
3 den ( H) -Thymidineinbau von nicht-infizierten Zellen zu mehr als 90% reduzieren kann. Von dieser Mischung wurden dann 50 μl zu einem gleichen Volumen einer MT4-Zellsuspension (6x10 -Zellen pro ml) in einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen zugegeben. Die Endverdünnungen des Antikörpers erstreckten sich dann von 1:40 bis 1:5120. Die Zellen wurden in Click-RPMI (Fa. Biochrom) mit 20% foetalem Kälberserum und 25 mM HEPES bei 37°C in einer 5%igen CO_-Atmosphäre kultiviert. Nach 3 Tagen wurden die Zellen mit 100 μl frischem Medium versehen. 4 Tage nach Infektion wurden 0,1 μCi ( H) -Thymidin zu den Zellen zugegeben. 20 Stunden später wurden die Zellen auf Glasfaserfilter gesammelt und mit 10 % Trichloressigsäure gewaschen. Die Radio¬ aktivität der Filter wurde bestimmt. Alle Versuche wurden dreimal durchgeführt. Fig. 2 A-D zeigt den neu¬ tralisierenden Effekt des erfindungsgemäßen Antikörpers 30F16H5 bei verschiedener Verdünnung für die Infektion von Zellen durch HIV-1-IIIB (Fig. 2A) , HIV-2-ben (Fig. 2B) , SIVmac (Fig. 2C) und SIVagm-TYO-7 (Fig. 2D) .
Es kann daraus ersehen werden, daß der erfindungsgemäße Antikörper die Infektiösität von HIV I bis zu einer Verdünnung von 1:1600 und von HIV II bis zu einer Ver¬ dünnung von 1:800 zu "75 -% zu unterdrücken vermag.
B e i s p i e l 5
Vergleich der Virus-neutralisierenden Wirkung verschie¬ dener Antikörper - _Z -
Auch hier wurden zunächst Vorverdünnungen des Antikörpers von 1:10 bis 1:1280 in Click-RPMI (Fa. Biochrom) mit 20% foetalem Kälberserum in 25 mM HEPES hergestellt. 25 μl der jeweiligen Antikörperverdünnung wurden mit 50 μl einer MT4-Zellsuspension (6x10 Zellen pro ml) für eine Stunde bei 37°C inkubiert. Die Endverdünnung des Antikörpers erstreckt sich dann von 1:30 bis 1:3840. Die so behandelten Zellen wurden dann für 10 Minuten bei 1500 rp in einer.Zentrifuge (Haereus Minifuge) • abzentrifugiert und mit der entsprechenden HIV-1-IIIb infektiösen Dosis in 100 μl Click-RPMI (Fa. Biochrom) mit 20% foetalem Kälberserum und 25 M Hepes bei 37°C in einer 5%igen CO„-Atmosphäre kultiviert. Die weitere Vorgehensweise entsprach Beispiel 4. Fig. 3 zeigt den neutralisierenden Effekt verschiedener käuflicher Antikörper im Vergleich mit dem erfindungsgemäßen Antikörper.

Claims

P a t e n t a n s p r ü e h. e
1. Hybridoma-Zellinie ECACC 88050502.
2. Monoklonaler Antikörper" 30F16H5, erhältlich aus der Hybridom-Zellinie ECACC 88050502.
3. Verwendung"des monoklonalen Antikörpers 30F16H5 zur Inhibierung der Infektion von Zellen, welche ein CD4-Protein auf ihrer Oberfläche aufweisen, durch HIV- oder SlV-Viren.
4. Arzneimittel zur Verhütung einer Infektion durch HIV-- oder SlV-Viren oder/und der Ausbreitung von Viren im Körper nach erfolgter Infektion, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß es den monoklonalen Antikörper 30F16H5 gegebe¬ nenfalls mit üblichen pharmazeutischen Träger- und Zusatzstoffen enthält.
5. Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Verhütung einer Infektion durch HIV- oder SlV-Viren oder/und der Ausbreitung der Viren im Körper nach erfolgter Infektion, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß man den monoklonalen Antikörper 30F16H5 gegebenenfalls mit üblichen Träger- und Zusatzstoffen in eine pharma¬ zeutisch geeignete Anwendungsform bringt.
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