DE69131253T2

DE69131253T2 - Zur behandlung von tumoren und hiv-infektionen nützliches pflanzliches protein

Info

Publication number: DE69131253T2
Application number: DE69131253T
Authority: DE
Inventors: Hao-Chia Chen; Henry Huang; Paul Huang; Peter Huang; Philip Huang; Hsiang-Fu Kung; Sylvia Lee-Huang; Peter Nara
Original assignee: US Department of Health and Human Services; American Bioscience Inc; New York University NYU
Current assignee: US Department of Health and Human Services; New York University NYU; Abraxis Bioscience LLC
Priority date: 1990-10-09
Filing date: 1991-10-09
Publication date: 2000-02-24
Anticipated expiration: 2011-10-10
Also published as: WO1992006106A1; EP0552257A4; EP0552257A1; AU8842291A; DE69131253D1; US5484889A; CA2093800A1; EP0552257B1; ATE180277T1; JPH06501689A

Description

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung auf dem Gebiet der Virologie und Onkologie betrifft MAP 30, ein Protein, das aus Pflanzenextrakten von Momordica charantia gewonnen wird, und seine Anwendung bei der Behandlung von Tumoren und HIV- Infektionen.

Hintergrund der Erfindung

Krebs und Ansätze zu seiner Therapie

Krebs entsteht, wenn normale Zellen eine neoplastische Umwandlung durchmachen und sich zu bösartigen Tumoren entwickeln. Diese Umwandlung ist auf tieferliegende genetische Veränderungen zurückzuführen. Man nimmt an, daß onkogene Zellen veränderte Formen normaler Gene, sogenannter "protoonkogener" Zellen sind, die das Wachstum in normalen Zellen zentral steuern. Wenn ein karzinogenes Mittel wie Strahlung oder eine chemische karzinogene Substanz die DNA des Zielgens einer Zelle schädigt, kann sich Krebs entwickeln. Wenn eine onkogene Zelle einmal durch eine Mutation aktiviert wurde, kann ein Onkogen übermäßiges oder regelloses Zellwachstum fördern. Eine Klasse von Onkogenen unterdrückt in normalen Zellen das Wachstum, anstatt die Proliferation zu fördern. Wenn dieser Typ eines das Wachstum unterdrückenden Gens aus einer Zelle verloren geht, wird ein normaler Hemmmechanismus des Zellwachstums unterdrückt, was zu einem unkontrollierten Wachstum und damit möglicherweise zu Krebs führen kann.
Derzeit bemüht man sich intensiv, Therapien zu entwickeln, die die Entwicklung von Krebs verhindern oder blockieren. In der Vergangenheit hat man sich auf die Behandlung der Krankheit durch chirurgische Eingriffe, Strahlentherapie und verschiedene Formen der Chemotherapie bemüht, um das Tumorgewebe zu entfernen oder zu zerstören. Diese zytotoxischen Verfahren sind durch ihren Mangel an Spezifität erheblich eingeschränkt.

Immunotoxine und ihre Grenzen

Immunotoxine sind dadurch entwickelt worden, daß man ein Proteintoxin über einen Linker an einen tumorspezifischen monoklonalen Antikörper konjugierte, um eine zielgerichtete Tumortherapie durchzuführen (E. S. Vitetta et al., Ann. Rev. Immunol. 3: 197-212 (1985)). Im Prinzip wird ein injiziertes Immunotoxin durch den Blutstom zum Tumorzielgewebe transportiert, dringt in das Gewebe ein und bindet an die einzelnen Tumorzellen. Dann wirkt das Toxin auf hoch lokalisierte Weise, um nur die gebundenen Tumorzellen zu zerstören. Alle drei Komponenten der Konjugate sind wichtig für die spezifische Abgabe der Zytotoxizität: Der Antikörper macht es möglich, daß das Konjugat im Zielgewebe zurückgehalten wird, indem er an ein spezfisches Antigen an der Zelloberfläche bindet. Dadurch wird die zelluläre Aufnahme durch die Zielzellen erleichtert. Der Linker hält das Toxin an den Antikörper gebunden und inaktiv, während es zirkuliert, ermöglicht aber die rasche Freisetzung des aktiven Toxins innerhalb der Zielzellen. Das Toxin zerstört die Zelle durch Hemmung der Proteinsynthese oder durch einen anderen verwandten Mechanismus.
Einige der stärksten bekannten zytotoxischen Substanzen sind Proteintoxine bakteriellen und pflanzlichen Ursprungs (A. E. Frankel et al., Ann. Rev. Med. 37: 125- 142 (1986)). Die zytotoxische Wirkung dieser Moleküle beinhaltet zwei Ereignisse - das Binden der Zelloberfläche und die Hemmung der Proteinsynthese der Zelle. Die am häufigsten verwendeten pflanzlichen Toxine sind Ricin und Abrin, die am häufigsten verwendeten bakteriellen Toxine sind das Diphtherietoxin und Pseudomonas exotoxin A.
In Ricin und Abrin sind die bindende und die toxische Funktion in zwei getrennten Proteinuntereinheiten, den Ketten A und B, enthalten. Die Ricin-B-Kette bindet an die Kohlehydrate der Zelloberfläche und fördert die Aufnahme der A-Kette in die Zelle. Wenn die Ricin-A- Kette einmal innerhalb der Zelle ist, hemmt sie die Proteinsynthese dadurch, daß sie die 60S-Untereinheit des eukaryontischen Ribosoms desaktiviert (Y. Endo et al., J. Biol. Chem. 262: 5908-5912 (1987)).
Das Diphtherietoxin und Pseudomonas exotoxin A sind einkettige Proteine, und ihre Bindungs- und Toxizitätsfunktionen liegen in verschiedenen Domänen der gleichen Proteinkette. Im Diphtherietoxin hemmt die Domäne mit endständiger. C-Gruppen die Proteinsynthese durch ADP- Ribosylierung des Elongationsfaktors EF2, Die beiden Aktivitäten sind getrennt, und das Toxin entwickelt seine volle Aktivität erst nach der proteolytischen Spaltung zwischen den beiden Domänen. Pseudomonas exotoxin A hat die gleiche katalytische Aktivität wie das Diphtherietoxin.
Die Verwendung von Immunotoxinen auf der Basis des Diphtherietoxins ist durch die Tatsache eingeschränkt, daß die meisten Menschen gegen das Diphtherietoxin immunisiert sind. Die Verwendung von Immunotoxinen auf Ricinbasis ist ebenfalls eingeschränt, weil diese Immunotoxine nur in Gegenwart von Lactose eine spezifische Toxizität aufweisen. Diese tritt bei hohen Konzentrationen in Wettbewerb mit den Kohlehydraten der Zell oberfläche um die Bindungsstellen der B-Kette. Ein alternativer Ansatz wurde entwickelt, die Ricin-A-Kette oder das "einkettige, Ribosomen desaktivierende Protein" (single chain ribosome inactivating protein = SCRTP) zur Herstellung von Immunotoxinen zu verwenden.

SCRIPs und ihre mögliche Anwendung in der Tumortherapie

SCRIPs sind stark aktiv bei der Desaktivierung von Ribosomen in zellfreien Systemen, sind gegenüber intakten Zellen jedoch relativ ungiftig. Viele verschiedene solcher Moleküle sind in Pflanzen zu finden. Dazu gehören das antivirale Protein der Kermesbeere, das Weizenkeimprotein, Gelonin, Dianthine, MomorCharine, Trichosantin und viele andere (F. Strip et al., FEBS Lett. 195: 1-8 (1986)). Einige dieser SCRIPs wurden zur Herstellung von Immunotoxinen verwendet. Wenn sie sich erst einmal innerhalb der Zelle befinden, ist ihre Zytotoxizität. Überraschenderweise höher als die ihrer nativen "Holo"-Gegenstücke. Viele dieser SCRIPs sind antivirale Mittel, und einige weisen auch eine spezifische Antitumoraktivität auf.

HIV-Infektion und AIDS

Das HIV-Virus (Humanes Immundefizienzvirus), das ätiologische Mittel für AIDS (Erworbenes Immundefektsyndrom) gehört zu den Lentiviren, einer Untergruppe der Retroviren. Viele Retroviren sind bekannte Karzinogene. Von HIV an sich ist nicht bekannt, daß es Krebs bei Menschen oder Tieren verursacht, aber es stellt eine gewaltige Herausforderung für den Wirt dar. HIV baut seine genetische Information in das Genom des Wirts ein. Das virale Genom enthält viele Steuerungselemente, die es dem Virus ermöglichen, seine Replikationsgeschwindigkeit in sowohl ruhenden als auch sich teilenden Zellen Zu kontrollieren. Wichtiger noch, HIV infi ziert und befällt Zellen des Immunsystems es zerstört das Immunsystem des Körpers und macht den Patienten anfällig für opportunistische Infektionen und Neoplasmen. Der Immundefekt scheint progressiv und irreversibel zu sein mit einer Mortalitätsrate, die im Laufe der Jahre beinahe 100% erreicht.
HIV wird über parenterale Inokulation und/oder intimen sexuellen Kontakt übertragen. Nach Schätzungen sind etwa 2 Millionen Menschen in den Vereinigten Staaten und 5 bis 10 Millionen Menschen auf der ganzen Welt derzeit mit HIV infiziert. Kürzlich veröffentlichte Hochrechnungen deuten darauf hin, daß ein Großteil der derzeit infizierten Personen innerhalb der nächsten sieben Jahre an AIDS erkranken wird. 1989 allein wurde im Land über 130.000 AIDS-Fälle berichtet; mehr als die Hälfte dieser Patienten ist inzwischen verstorben. Nach Schätzungen werden bis Ende 1990 weitere 200.000 in den U. S. A. diagnostiziert werden, Berichte an die Weltgesundheitsorganisation geben Anlaß zu der Vermutung, daß innerhalb der nächsten fünf Jahre weltweit mindestens eine Million neuer AIDS-Fälle zu erwarten ist. Es ist offensichtlich, daß AIDS eine bisher noch nicht dagewesene Bedrohung für die allgemeine Gesundheit in den vereinigten Staaten und auf der ganzen Welt darstellt. Die Suche nach wirksamen Therapien zur Behandlung von AIDS ist von höchster Wichtigkeit.
HIV-1 wirkt trophisch und zytopatisch auf die T4-Lymphozyten, Zellen des Immunsystems, die das Zelloberflächen- Differenzierungsantigen CD4 (auch als OKT4, T4 und leu3 bekannt) exprimieren. Der virale Tropismus ist auf die Wechselwirkungen zwischen dem Glycoprotein der Virushülle, gp120, und den CD4-Molekülen an der Zelloberfläche zurückzuführen (A. G. Dalgleish et al., Nature 312: 763- 767 (1984)). Diese Tnteraktionen sind nicht nur für die Infektion anfälliger Zellen durch HTV, sondern auch für die virusinduzierte Verschmelzung infizierter und nicht infizierter T-Zellen verantwortlich. Diese Zellverschmelzung führt zur Bildung riesiger vielkerniger Synzythien, zum Zelltod und zur progressiven Abnahme von CD4-Zellen bei AIDS-Patienten. Diese Ereignisse führen zu einer durch HIV ausgelösten Unterdrückung des Immunsystems und entsprechenden Folgeereignissen, opportunistischen Infektionen und Neoplasmen.
Zusätzlich zu den CD4+T-Zellen, umfaßt der Wirtebereich für HIV auch Zellen der mononuclearen Phagozytenlinie (A. G. Dalgleish et al., siehe oben), darunter Blutmonozyten, Gewebemakrophagen, Langerhans-Zellen der Haut und dendritische Retikulumzellen innerhalb der Lymphknoten. HIV ist außerdem neurotrop, d. h. es kann Monozyten und Makrophagen im zentralen Nervensystem infizieren und erhebliche neurologische Schäden verursachen. Makrophagen/Monozyten sind ein Hauptreservoir von HIV. Sie können miteinander agieren und mit CD4-tragenden T-Zellen verschmelzen, wodurch es zu einer Abnahme der T-Zellen kommt. Dies trägt zur Pathogenese von AIDS bei.

Medikamente gegen HIV

Man bemüht sich derzeit intensiv um die Entwicklung von Therapien, die die Entwicklung klinischer Symptome bei HIV-infizierten Patienten verhindert oder beeinflußt. Größtenteils hat man sich auf den Einsatz von nucleosidanalogen Medikamenten wie AZT (Azidothymidin) und auf andere Didesoxynucleosid-Derivate wie ddA, ddT, ddI und ddC konzentriert. Diese Medikamente hemmen das virale Enzym, die reverse Transcriptase, und hemmen dadurch die erneute Infektion von Zellen. Wenn eine Zelle jedoch erst einmal mit dem Virus infiziert ist, bedient sich dieses zur Replikation der Enzyme der Wirtszelle. Somit kann man davon ausgehen, daß Medikamente, die nur die reverse Transcriptase hemmen, begrenzt wirksam sind. Es kann zwar die Verbreitung des freien Virus innerhalb des Organismus blockiert werden, aber die Mechanismen der Bildung von Syncytiumzellen und die Pathogenese durch direkte interzelluläre Verbreitung bleiben bestehen.
Eine sehr geringe Anzahl HIV-infizierter T-Zellen kann durch Mechanismen auf der Grundlage der Expression des viralen Oberflächenantigens mit einer großen Anzahl nicht infizierter T-Zellen verschmelzen und diese schließlich töten. In vitro Studien haben gezeigt, daß sich HIV selbst dann repliziert, wenn in einer über längere Zeit bestehenden Kultur nach wie vor Nucleosidanaloge vorhanden sind. Auch Medikamente, die auf andere virale Prozesse abzielen, werden entwickelt, z. B. lösliches CD4 und Dextransulfat zur Hemmung der viralen Bindung, α-Interferone und "Ampligen" zur Hemmung der viralen Knospung sowie Castanospermin zur Hemmung der Verarbeitung des viralen Glycoproteins. Diese Medikamente befinden sich noch in der frühen Testphase. Die tatsächlichen Prozesse der HIV-Replikation innerhalb der Zellen und der Proteinsynthese waren kein spezifisches Ziel, weil man davon ausging, daß diese viralen Funktionen eine reine Nachahmung normaler Wirtsprozesse durch Wirtsmechanismen sind.
Vor kurzem haben M. S. McGrath et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2844-2848 (1989)) berichtet, daß GLQ 223, ein aus einer chinesischen Heilpflanze, Trichosanthis kirilowii, isoliertes SCRIP, die HIV-Replikation selektiv hemmt. Diese Verbindung zeigte eine dosisabhängige Anti-HIV-Wirkung bei sowohl akut als auch chronisch infizierten T-Zellen sowie bei Monozyten/Makrophagen. Diese Entdeckung führte rasch zu klinischen Tests von GLQ 223 als Mittel gegen AIDS. Die Behandlung von Zellen mit GLQ 223 führte zur selektiven Hemmung der Synthese von viraler DNA, RNA und Protein, hatte aber keine oder nur eine sehr geringe Wirkung auf die zelluläre Synthese. Die Hemmung der Virusreplikation trat bei GLQ 223-Konzentrationen ein, die keine nachweisbare Wirkung auf nicht infizierte Zellen hatten.
Die Mechanismen der selektiven Anti-HIV-Aktivität von GLQ 223 sind nicht bekannt. Es wurde nicht festgestellt, ob diese Aktivität mit der die Ribosomen desaktivierenden oder abortiven Wirkung dieser Verbindung zusammenhängt. Auf der Hand liegen zwei mögliche Mechanismen. Die selektive Bindung oder Aufnahme von GLQ 223 durch infizierte Zellen könnte für seine selektive Wirkung auf infizierte Zellen verantwortlich sein. Wenn sie sich erst einmal innerhalb der infizierten Zellen befindet, könnte die Verbindung über ihre Ribosomen desaktivierende Funktion nichtspezifisch wirken. Alternativ kann die Selektivität des Mittels auch auf die unterschiedlichen Effekte auf virale gegenüber zellulären Komponenten zurückzuführen sein, was zur Hemmung der viralen, nicht aber der zellulären Nucleinsäure- und Proteinsynthese führen könnte.
Lifson et al., US-A-4,795,739 (erteilt am 3. Januar 1989), offenbaren, daß Pflanzenproteine, darunter Trichosanthin und α- und β-Momorcharin (auch als Momorcharin A und B oder MCA und MCB bekannt) die Antigenexpression des Virus in HIV-infizierten Zellen verringern und selektiv toxisch auf HIV-infizierte Zellen wirken. Wie es heißt, sind diese Proteine nützlich zur Behandlung von HIV-infizierten Zellen beim Menschen.

Zusammenfassung der Erfindung

Es ist eine Aufgabe der Erfindung, die vorstehenden Mängel des Standes der Technik zu überwinden.
Auch ist es Aufgabe der Erfindung, ein Protein, das sowohl aus der Frucht als auch dem Samen der Pflanze Momordica charantia, die sowohl gegen Tumoren als auch gegen HIV wirkt, gewonnen werden kann und im wesentlichen frei von anderen Kontaminanten pflanzlichen Ursprungs ist, oder ein funktionelles Derivat davon zur Verfügung zu stellen.
Folglich stellt die Erfindung ein gereinigtes Protein zur Verfügung, das sowohl Antitumor als auch Anti-HIV- Aktivität aufweist und die Aminosäuresequenz
Asp-Val-Asn-Phe-Asp-Leu-Ser-Thr-Ala-Thr-Ala-Lys-Thr-Tyr- Thr-Lys-Phe-Ile-Glu-ASp-Phe-Arg-Ala-Thr-Leu-Pro-Phe-Sar- His-Lys-Val-Try-Asp-Ile-Pro-Leu-Leu-Tyr-Ser-Thr-Ile-Ser- Asp-Pro.
umfaßt.
In einer Ausführungsform wird das Protein aus pflanzlichem Material aufgereinigt; alternativ wird es mittels rekombinanter DNA erzeugt.
Die Erfindung stellt auch ein funktionelles Derivat eines Proteins zur Verfügung, wobei
(i) das Derivat sowohl Anti-HIV- als auch Antitumoraktivität aufweist und
(ii) das Derivat ein Fragment des Proteins ist und mindestens die Aminosäuresequenz
Asp-Val-Asn-Phe-Asp-Leu-Ser-Thr-Ala-Thr-Ala-Lys-Thr-Tyr- Thr-Lys-Phe-Ile-Glu-Asp-Phe-Arg-Ala-Thr-Leu-Pro-Phe-Sar- His-Lys-Val-Try-Asp-Ile-Pro-Leu-Leu-Tyr-Ser-Thr-Ile-Ser- Asp-pro.
umfaßt;
(iii) das Derivat eine Variante des Proteins oder des Fragments darstellt, in der eine Aminosäure insertiert, ersetzt oder entfernt wurde, oder
(iv) das Derivat ein chemisches Derivat des Proteins oder des Fragments ist, in dem eine oder mehrere Aminosäuren eine Modifikation aufweisen, die durch Umsetzen mit einem organischen Derivatisierungsmittel eingeführt wurde, welches mit ausgewählten Seitenketten oder endständigen Resten reagieren kann.
In einer Ausführungsform wird das Protein aus dem Pflanzenmaterial aufgereinigt; alternativ wird es mittels rekombinanter DNA hergestellt.
In einer bevorzugten Ausführungsform hat das Protein, MAP 30, ein Molekulargewicht von etwa 30 kD, das durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese bestimmt wurde und folgende Aminosäuresequenz mit endständigen N-Gruppen aufweist:
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Aufreinigung eines Proteins, das über sowohl Antitumor- als auch Anti-HIV-Aktivität verfügt, aus der Frucht oder dem Samen der Pflanze Momordica charantia zur Verfügung, umfassend
(a) das Homogenisieren der Frucht oder des Samens zum Erhalt eines Homogenats;
(b) mindestens einmaliges Zentrifugieren des Homogenats und Wiedergewinnen des Überstandes und
(c) Fraktionieren des Überstandes und Gewinnung des Proteins.
Die Erfindung betrifft ferner eine DNA-Sequenz, die die Aminosäuresequenz des vorstehenden Proteins oder eines funktionellen Derivats davon, das im wesentlichen frei von einer anderen DNA-Sequenz ist, codiert. Die DNA ist vorzugsweise genomische DNA oder cDNA. Bevorzugt umfaßt die DNA-Sequenz einen exprimierbaren Träger.
Die Erfindung stellt auch prokaryontische und eukaryontische Wirtszellen zur Verfügung, die mit der vorstehenden DAN transformiert oder transfiziert wurden.
Ebenfalls zur Verfügung gestellt wird ein im wesentlichen reines Protein, das durch die in einem prokaryontischen oder eukaryontischen Wirt exprimierte DNA codiert wird.
Ferner stellt die Erfindung verbesserte Verfahren zur Behandlung eines Patienten mit einer HIV-1-Infektion oder einem Tumor zur Verfügung. Genauer geht es bei der Erfindung um ein Verfahren zur Behandlung einer Person, die mit HIV-1 infiziert ist, bei dem der Person eine wirksame Menge des erfindungsgemäßen Proteins oder eines funktionellen Derivats davon verabreicht wird.
Außerdem betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung einer Person mit einer HIV-1-Infektion oder einem Tumor durch Verabreichung des MAP-30-Proteins in Kombination mit einem oder mehreren bekannten Therapeutika gegen AIDS, unter anderem AZT, ddI, lösliches CD4, ddC, ddA und GLQ 223.
Zu den erfindungsgemäßen Behandlungsverfahren gehört auch die Verabreichung eines Konjugats von MAP 30 mit löslichem CD4 oder CD4-Derivaten oder Antikörpern, die spezifisch für CD4 oder HIV-codierte Glycoproteine wie gp120 und gp41 sind, an eine Person mit einer HIV-Infektion.
Ferner stellt die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung einer Person mit einem Tumor zur Verfügung, bei dem eine wirksame Menge des erfindungsgemäßen Proteins oder eines funktionellen Derivats davon entweder allein oder bevorzugt in Kombination mit einem tumorspezifischen Antikörper oder einem anderen tumorsteuernden Mittel verabreicht wird.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist eine Fotografie einer Momordica charantia- Pflanze mit ihren Früchten. Das Bild A zeigt eine unreife Frucht mit ihrer charakteristischen grüner Farbe. Das Bild B zeigt eine reife Frucht mit einer hellorange farbenen Außenhaut und rotem Samen.
Die Kurve in Fig. 2A zeigt die Aufreinigung von MAP 30 aus einem Samenextrakt von Momordica charantia. Die Aufreinigung von rohem MAP 30 erfolgte unter Verwendung von CM-Sepharose CL6B. Die Probe von Schritt 1 wurde bei 15.000 xg 30 Minuten zentrifugiert, um etwaige während der Dialyse gebildete Niederschläge zu entfernen. Die Probe (153 mg) wurde dann auf eine Kolonne (1,5 · 34 cm) von CM-Sepharose CL6B (Pharmacia-LKB) aufgebracht, die mit 50 mM Natriumphosphat, pH 6,3, ins Gleichgewicht gebracht worden war (Lösung B). Die Kolonne wurde mit Lösung B gewaschen, um ungebundene Verunreingungen zu entfernen, während MAP 30 an CM-S band und deshalb in der Kolonne zurückgehalten wurde. Fraktionen von 6 ml wurden mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 36 ml/h gesammelt. Die Elution wurde durch Absorption bei 280 nm (A&sub2;&sub8;&sub0;) überwacht. Wenn die Absorption der Lösung B den Ausgangswert erreicht hatte, wur de die Säule mit einem linearen Gradienten eluiert, der aus 240 ml Lösung B und 240 ml Puffer B mit 0,2 M NaCl bestand. Die Fraktionen in jedem Peak wurden zusammengenommen, konzentriert, der Puffer zu PBS gewechselt und auf Anti-HIV-Aktivität und Ribosomen desaktivierende Aktivität untersucht. Die größte Anti-HIV- Aktivität fand sich in Peak 2, der zwischen 60 und 70 mM NaCl eluiert wurde.
Die Kurve in Fig. 2 B zeigt die weitere Aufreinigung von MAP 30 durch Sephadex-Gelfiltration. Die aus Peak 2 des CM-Sepharose-CL6B-Schritts zusammengefaßte Proteinprobe (14,5 mg) wurde durch Gelfiltration auf einer Sephadex G75 superfeinen Kolonne (1,5 · 110 cm) in 20 mM Natriumphosphatpuffer, pH 6,3, zusätzlich gereinigt. Die Elution wurde durch A280 überwacht. Die Strömungsgeschwindigkeit betrug 3 ml/h, und 1,5 ml Fraktionen wurden gesammelt. Homogenes MAP 30 wurde als einzelner Peak aus den Fraktionen 54 bis 58 bei einem Kolonnenvolumen von etwa 0,45 eluiert.
Fig. 3 zeigt ein Gelmuster, das die SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese (SDS-PAGE) von rohem und reinen MAP 30 in Gegenwart und Abwesenheit des Reduktionsmittels, 2-Mercaptoethanol, zeigt. Die Elektrophorese wurde bei einer konstanten Spannung von 80 V über 6 Stunden durchgeführt, bis der Kennzeichnungsfarbstoff (Bromphenol-Blau) 2 cm vom unteren Ende des Gels zu sehen war. Die Spuren 1 bis 5 sind Proben, die mit 2-Mercaptoethanol behandelt wurden: 1. Molekulargewichtsstandards, je 2 ug, 2. rohes MAP 30, 100 ug (30 bis 60% gesättigte Ammoniumsulfatfraktion), 3. rohes MAP 30, 100 ug (2,0 Volumen Acetonniederschlag), 4. und 5. homegenes MAP 30, 8 ug in jeder Spur, aufgereinigt aus den Spuren 2 bzw. 3. Die Spuren 6 bis 10 entsprechen 1 bis 5, aber ohne die 2-Mercaptoethanolbehandlung.
Fig. 4 ist eine Graphik, die die Auswirkung von MAP 30 auf die HIV-Infektiosität zeigt. Dies wurde durch eine Untersuchung der Synzitium-bildenden Einheit (SFU) in der infizierten Zelle (infectious cell center = ICC) beurteilt. Die Ergebnisse von Synzytium pro Vertiefung werden als prozentuale Kontrolle ausgedrückt. Die experimentellen Bedingungen sind in der Legende zu Tabelle 1 beschrieben. Experimentelle Irrtümer werden durch entsprechende Fehlerbalken angezeigt.
Die Kurve in Fig. 5 zeigt die Auswirkung von MAF 30 auf die HIV-Replikation, die durch die Produktion von viralem Kernprotein p24 und virale-RT-Aktivität bestimmt wurde. Die prozentuale Hemmung ist als Funktion der MAP 30-Konzentration aufgezeigt. Unsicherheiten sind durch Fehlerbalken angegeben. Die experimentellen Bedingungen sind in der Legende zu Tabelle 2 beschrieben.
Die Kurve in Fig. 6 zeigt die Auswirkung von MAP 30 auf die eukaryontische Translation. Die Ribosomen desaktivierende Wirkung von MAP 30 wurde unter Verwendung eines Retikulozyten-Lysat-Translations-Kits (DuPont, New England Nuclear) studiert. Die Proteinbiosynthese wurde durch Inkorporierung von [³H]-Leukin in säureunlösliches Produkt gemessen. Die hemmende Wirkung von MAP 30 wurde als Inkorporierung von [³H]-Leukin (cpm · 10&sup4;/ul) als Funktion der MAP-30-Konzentration ausgedrückt.
Fig. 7 zeigt die Sequenz der N-terminalen 44 Aminosäuren von MAP 30 und einen Vergleich mit der N-terminalen Sequenz der Rückstände 7 bis 51 von Trichosanthin (Tri- 1) und der Ricin-A-Kette (Ric A), wie von Zhang et al. (Nature 321: 477-478 (1986)) berichtet. Die eingekastelten Bereiche sind identische oder konservierte Aminosäuren dieser Pflanzenproteine. Substitutionen durch Aminosäure mit ähnlichen physikalisch-chemischen Eigenschaften werden als konservativ angenommen, wie bei Ser und Thr, Val, Leu sowie Ile, Asp und Glu.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Die erfindungsgemäßen Pflanzenproteine, die sich von GLQ 223 unterscheiden, gehören zur Familie der Ribosomen desaktivierenden Proteine.
Momordica charantia, auch als Mubie oder MC bekannt, ist das Quellmaterial für die Isolierung des Proteins MAP 30. Die Früchte und die Samen dieser Pflanze sind als "Kugua" bzw. "Kuguazi" bekannt. Momordica charantia wächst Verbreitet im südlichen und östlichen China und zwar von April bis September, wobei die größte Ernte im Hochsommer erzielt wird.
Es gibt viele Varianten von Momordica charantia, von denen einige hauptsächlich zu medizinischen Zwecken angebaut werden, während andere auch als Gemüse oder Obst zum Verzehr dienen. Der Gehalt an MAP 30 ist in der Arzneivariante am höchsten, die in den Vereinigten Staaten nicht in der Natur zur Verfügung steht. Um einen konstanten und ausreichenden Nachschub des Quellmaterials für die Exprimente der Erfinder sicherzustellen, begannen sie, die Arzneivariante aus ausgewählten Samen anzubauen und zu züchten.
Die Samen werden eingepflanzt und keimen nach 14 bis 20 Tagen. Nach 60 bis 80 Tagen beginnen die Pflanzen, Früchte zu tragen, die nach etwa 90 bis 120 Tagen reif sind. Extrakte werden zu verschiedenen Stufen der Reifung aus verschiedenen Teilen der Pflanze, vor allem der Frucht und den Samen, hergestellt. Eine wirksame gegen HIV aktive Komponente ist in der Frucht und im Samen vorhanden, und ihr Gehalt nimmt mit zunehmender Reife erheblich zu. Eine wachsende Mormordica charantia Frucht ist in Fig. 1A zu sehen; die Farbe der Frucht ist grün. Wenn die Frucht reift, färbt sie sich erst hellgelb und schließlich leuchtend orange. Wenn die Früchte zu diesem Zeitpunkt nicht geerntet werden, platzen sie spontan auf, so daß die reifen roten Samen freiliegen (siehe Fig. 1B). Natürlich gereifte Früchte und Samen werden für die Herstellung von MAP 30 bevorzugt.
Mit dem Begriff "Antitumoraktivität" ist die Fähigkeit gemeint, das Wachstum von Tumorzellen in vitro oder in vivo zu hemmen oder in vivo die Entwicklung eines Tumors aus einer Tumorzelle, die im betreffenden Tier eine tumorbildende Umwandlung erfahren hat, oder aus einem dem Tier eingepflanzten Tumor zu hemmen. Der Begriff schließt sowohl die tatsächliche onkogene Umwandlung einer Zelle zur einer tumorbildenden Zelle als auch die Fähigkeit einer Tumorzelle, Metastasen zu bilden oder andere Stellen im Körper zu befallen, ein.
Die Antitumoraktivitäten der Momorcharin-Proteinfamilie sind durch unabhängige Tests bestätigt worden; dieser Aktivitätstyp ist in der Technik bekannt.
Das Protein MAP 30 wird zur Behandlung von HIV-Infektionen entweder allein oder in Kombination mit anderen in der Technik bekannten Therapieformen verwendet, darunter Chemotherapie mit Medikamenten wie AZT, ddC, ddA, ddT, ddI, GLQ 223 oder mit einer Therapie auf biologischer Grundlage, wie z. B. mit löslichem CD4.
Der Begriff "Anti-HIV-Aktivität" bedeutet die Fähigkeit, die Bindung von Viren an Zellen, das Eindringen von Viren in Zellen sowie den Zellstoffwechsel, der Replikation, Produktion und Freisetzung ermöglicht, zu hemmen. Ebenfalls beabsichtigt ist die Hemmung der interzellulären Verbreitung des Virus. Der Begriff soll die Hemmung der Synthese und der zellulären Expression viraler Antigene, die Aktivität viruscodierter Enzyme wie reverse Transcriptase und Protease sowie alle bekannten pathogenen Wirkungen von HIV, wie z. B. die Unterdrückung des Immunsystems, einschließen. Somit ist jede Aktivität, die dazu neigt, einen dieser Mechanismen zu hemmen, eine "Anti-HIV-Aktivität".
"Funktionelles Derivat" bedeutet ein "Fragment", eine "Variante", ein "Analogon" oder ein "chemisches Derivat" von MAP 30, wobei diese Begriffe nachstehend definiert sind. Ein funktionelles Derivat behält mindestens einen Teil der Funktion von MAP 30, die seinen erfindungsgemäßen Einsatz ermöglicht.
Ein "Fragment" von MAP 30 bedeutet jede Unterklasse des Moleküls, d. h. ein kürzeres Peptid.
Eine "Variante" von MAP 30 bedeutet ein Molekül, das entweder dem ganzen Peptid oder einem Fragment davon im wesentlichen ähnlich ist. Peptidvarianten können auf einfache Weise durch direkte chemische Synthese mit in der Technik bekannten Verfahren hergestellt werden.
Alternativ können Varianten der Aminosäuresequenz des Peptids durch Mutationen in der DNA hergestellt werden, die das synthetisierte Peptid codiert. Solche Varianten umfassen beispielsweise Deletionen, Insertionen oder Substitutionen von Resten innerhalb der Aminosäuresequenz. Auch eine beliebige Kombination von Deletion, Insertion und Substitution kann vorgenommen werden, um das fertige Konstrukt zu erhalten, vorausgesetzt, daß dieses über die erwünschte Aktivität verfügt. Selbstverständlich dürfen die Mutationen, die an der die Peptidvariante codierenden DNA vorgenommen werden, das Ablesmuster nicht verändern und schaffen vorzugsweise keine Komplementärbereiche, die eine sekundäre mRNA- Struktur erzeugen können (siehe EP-A-0 075 444).
Auf genetischem Niveau werden solche Varianten üblicherweise durch stellengesteuerte Mutagenese von Nucleotiden in der das Peptidmolekül codierenden DNA (wie z. B. von Adelmann et al., DNA 2: 183 (1988) beschrieben) und anschließende Expression der DNA in einer rekombinanten Zellkultur hergestellt. Die Varianten wiesen typischerweise die gleiche qualitative biologische Aktivität auf wie das Peptid, das keine Variante ist.
Ein "Analogon" von MAP 30 bedeutet ein nicht natürliches Molekül, das entweder dem gesamten Molekül oder einem Fragment davon im wesentlichen ähnlich ist.
Ein "chemisches Derivat" von MAP 30 enthält zusätzliche chemische Komponenten, die normalerweise kein Teil des Peptids sind. Kovalente Modifikationen des Peptids sind im Rahmen der Erfindung eingeschlossen. Solche Modifikationen können in das Molekül eingebracht werden, indem man die betreffenden Aminosäurerückstände des Peptids mit einem organischen Derivatisierungsmittel zur Umsetzung bringt, das mit ausgewählten Seitenketten oder endständigen Resten reagieren kann.
Cysteinylreste werden am häufigsten mit α-Halogenacetaten (und entsprechenden Aminen) wie Chloressigsäure oder Chloracetamid umgesetzt, um Carboxymethyl- oder Carboxyamidomethylderivate zu ergeben. Cysteinylreste werden auch durch die Reaktion mit Bromtrifluoraceton, α-Brom-β-(5-imidozoyl)-propionsäure, Chloracetylphosphat, N-Alkylmaleinimiden, 3-Nitro-2-pyridyldisulfid, Methyl-2-pyridyldisulfid, p-Chlorquecksilberbenzoat, 2-Chlorquecksilber-4-nitrophenol oder Chlor-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol derivatisiert.
Histidylrückstände werden durch die Reaktion mit Diethylprocarbonat bei einem pH von 5,5 bis 7,0 derivati siert, weil dieses Mittel relativ spezifisch für die Histidylseitenkette ist. Parabromphenacylbromid ist ebenfalls geeignet; die Reaktion wird vorzugsweise in 0,1 M Natriumcacodylat bei einem pH von 6,0 durchgeführt.
Lysinyl- und endständige Aminoreste werden mit Bernsteinsäure- oder anderen Carbonsäureanhydriden zur Umsetzung gebracht. Die Derivatisierung mit diesen Mitteln hat die Wirkung, die Ladung der Lysinylreste umzukehren. Andere geeignete Reagenzien für die Derivatisierung von α-Amino enthaltenden Resten umfassen Imidoester wie Methylpicolinimidat, Pyridoxalphosphat, Pyridoxal, Chlorborhydrid, Trinitrobenzolsulfonsäure, O-Methylisoharnstoff, 2,4-Pentandion und die mit Transaminase katalysierte Reaktion mit Glyoxylat.
Arginylreste werden durch die Reakion mit einem oder mehreren herkömmlichen Reagenzen modifiziert, darunter Phenylglyoxal, 2,3-Butandion, 1,2-Cyclohexandion und Ninhydrin. Die Derivatisierung von Argininrückständen erfordert, daß die Reaktion wegen des hohen pKa der funktionellen Guanidingruppe unter alkalischen Bedingungen durchgeführt wird. Darüber hinaus können diese Reagenzien mit den Lysingruppen sowie der Argininepsilon-aminogruppe reagieren.
Die spezifische Modifikation der Tyrosylreste an sich ist eingehend studiert worden. Besonderes Interesse galt der Einführung spektraler Marker in Tyrosylreste durch die Reaktion mit aromatischen Diazoniumverbindungen oder Tetranitromethan. Am häufigsten werden N-Acetylimidizol und Tetranitromethan dazu verwendet, O-Acetyltyrosylspezies bzw. 3-Nitroderivate herzustellen.
Carboxylseitengruppen (Aspartyl oder Glutamyl) werden selektiv durch die Reaktion mit Carbodiimiden (R'-N-C- N-R') wie 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinyl-(4-ethyl))carbodiimid oder 1-Ethyl-3-(4-azonia-4, 4-dimethylpentyl)- carbodiimid modifiziert. Darüber hinaus werden Aspartyl und Glutamylreste durch die Reaktion mit Ammoniumionen zu Asparaginyl und Glutaminylresten umgewandelt.
Glutaminyl- und Asparaginylreste werden häufig zu den entsprechenden Glutamyl- und Aspartylresten deamidiert. Alternativ werden diese Reste unter leicht sauren Bedingungen deamidiert. Beide Formen dieser Reste fallen in den Rahmen der Erfindung.
Die Derivatisierung mit bifunktionellen Mitteln eignet sich zur Vernetzung des Peptids zu einer wasserunlöslichen Trägermatrix oder anderen makromolekularen Trägern. Häufig verwendete Vernetzungsmittel umfassen z. B. 1,1-Bis(diazoacetyl)-2-phenylethan, Glutaraldehyd, N- Hydroxybernsteinsäureester, z. B. Ester mit 4-Azidosalicylsäure, homobifunktionelle Imidoester einschließlich Disuccinimidylester wie 3,3'-Dithiobis(succinimidylpropionat) und bifunktionelle Maleinimide wie Bis-N- maleinimid-1,8-octan. Derivatisierungsmittel wie Methyl-3-[(p-azidophenyl)-dithio]-propionimidat ergeben durch Licht aktivierbare Zwischenprodukte, die in Gegenwart von Licht Vernetzungen bilden können. Alternativ werden reaktive wasserunlösliche Matrizen wie durch Cyanogenbromid aktivierte Kohlehydrate und die in US-A- 3,969,287, 3,691,016, 4,195,128, 4,247,642, 4,229,537 und 4,330,440 beschriebenen reaktiven Substrate zur Proteinimmobilisierung verwendet.
Andere Modifikationen umfassen die Hydroxylierung von Prolin und Lysin, die Phosphorylierung von Hydroxylgruppen von Seryl oder Treonylresten, die Methylierung der α-Aminogruppen von Lysin, Arginin und Histidin seitenketten (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecule Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, S. 79-86 (1983)), die Acetylierung von Amin mit endständigen N-Gruppen und in einigen Fällen die Amidierung der Carboxylgruppen mit endständigen C-Gruppen.
Solche derivatisierten Komponenten können die Löslichkeit, Absorption, die biologische Halbwertzeit u. ä. verbessern. Die Komponenten können etwaige unerwünschte Nebenwirkungen des Proteins entweder ganz beseitigen oder abschwächen. Komponenten, die solche Wirkungen mildern können, sind z. B. in Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Auflage, Mack Publishing Co., Easton, PA (1980) offenbart.
Für die Aufreinigung des erfindungsgemäßen Proteins MAP 30 kann eine Chromatographie auf CM-Sepharose CL6B ("Schritt 2") nach dem geeigneten Extraktionsverfahren eingesetzt werden. Wie für Fachleute offensichtlich sein wird, hängt eine effektive Fraktionierung von der optimalen Wahl der experimentellen Bedingungen in bezug auf die Kapazität der Tauschervorrichtung, der Größe der Kolonne, der Menge der Probe und den Elutionsbedingungen ab.
Beispielsweise verwendet man für 100 g Ausgangsmaterial bevorzugt eine Kolonnengröße von etwa 1,5 · 40 cm (70 ml). Die Kolonne wird mit dem Ausgangspuffer ins Gleichgewicht gebracht. Die Probe im gleichen Puffer wird durch Zentifugieren gereinigt, um etwaige während der Dialyse oder Lagerung gebildete Niederschläge zu entfernen. Die Kolonne wird mit dem Ausgangspuffer gewaschen bis man die Absorptionsablesung an der Ausgangslinie erreicht. Die Elution wird durch UV-Absorption bei A&sub2;&sub8;&sub0; überwacht.
Ein linearer Gradient, der aus 240 ml Lösung B und 240 ml von 0,2 M NaCl in der Lösung B besteht, kann dann aufgebracht werden. 6 ml Fraktionen werden mit einer Fraktionssammelvorrichtung gesammelt und wie hier beschrieben auf ihre Anti-HIV-Aktivität getestet. MAP 30 wird bei Salzkonzentrationen von 60 bis 70 mM eluiert. Aktive Fraktionen werden gesammelt, der Puffer ausgetauscht und dann mit Centricon 10 (Amicon, 10.000 Mr Ausschluß) konzentriert.
Dann erfolgt eine Gelfiltration unter Verwendung von Sephadex G75 Superfine in 20 mM Natriumphosphat, pH 6,3, mit einer Kolonnengröße von 1,5 · 110 cm. Eine Probe aus Schritt 2 wird einem Pufferaustausch zu 20 mM Natriumphosphat, pH 6,3, unterzogen und durch Centricon-1 auf etwa 2 ml konzentriert, ehe man sie in die Kolonne einbringt. Die Kolonne wird mit dem gleichen Puffer eluiert. Die Anti-HIV-Aktivität wird auf diese Weise als einzelner Hauptpeak eluiert (siehe Beispiele).
Homogene Proben werden für eine strukturelle und funktionelle Charakterisierung unter Einsatz tryptischer Analyse, Aminosequenzbildung, Antikörperproduktion und Untersuchung der biologischen Aktivität wie Hemmung der Proteinsynthese in vitro (Ribosomendesaktivierung) und die Hemmung der HIV-Replikation verwendet.
Genomische und cDNA-Klone, die SCRIP aus Moordica charantia codieren, werden auf der Grundlage des Wissens über Teilaminosäuresequenzen geklont. Aus diesen Sequenzen übernommene Oligonucleotidprimer werden in der Polymerasekettenreaktion (PCR) verwendet, um die SCRIP- Gene mit zwei Verfahren spezifisch zu vervielfältigen.
Beim ersten Verfahren werden zwei Primer, die zwei Enden das SCRIP-Peptids codieren, in der PCR mit Poly- (A&spplus;)-mRNA und genomischer DNA als Matrize verwendet. Die auf diese Weise vermehrten genomischen oder cDNA- Fragmente werden in das Plasmid pUC18 geklont, wobei man Restriktions-Schnittstellen verwendet, die an das 5'-Ende der Oligonucleotidprimer angefügt wurden. Bei diesem Verfahren ist nur sehr wenig Ausgangsmaterial für die Verwendung als Matrize erforderlich.
Beim zweiten Verfahren wird ein einzelner spezifischer Primer verwendet. Lamda-Phagenbibliotheken, die man aus genomischer DNA oder cDNA erzeugt hat, werden als Matrize verwendet. Die PC-Reaktion zur Replikation spezifischer Klone ist sensibler als das direkte Screening der plattierten Zellen mit markierten Oligonucleotiden. Phagen-DNA aus den Bibliotheken wird aus einem Plattenlysat hergestellt und das Gemisch als Matrize bei der PCR verwendet. Einer der Primer ist aus einer spezifischen Aminosäuresequenz des SCRIP gestaltet, der andere Primer ist komplementär zum Lambda-Phagen-Vektor nahe einem Ende der Klonierungsstelle. Wenn die PCR-Bedingungen entsprechend streng eingestellt werden, sollten sich die wenigen spezifischen Klone vermehren. Bei diesem Verfahren ist nur ein spezifischer Primer erforderlich.
Genomische DNA mit hohem Molekulargewicht wird aus Momordica charantia isoliert. Das Verfahren ist für frische und gefrorene Momordica charantia Früchte und Samen gleich.
Es gibt verschiedene Probleme, die nur bei der Isolierung von Nucleinsäuren aus Pflanzengewebe auftreten. Zuerst läßt sich die Zellwand der Pflanze nur schwer ohne Scherung von DNA mit hohem Molekulargewicht sprengen. Zweitens enthalten rohe Pflanzenextrakte große Mengen von Polysacchariden, Tanninen und Pigmenten, die gemeinsam mit den Nucleinsäuren aufgereinigt werden und die spätere Analyse und enzymatische Manipulation stören.
Gefrorenes Gewebe kann ohne Beschädigung der DNA mit hohem Molekulargewicht homogenisiert werden, indem man es in einem Waring-Mixer in Gegenwart von flüssigem Stickstoff zu einem trockenen Pulver mischt. Um genomische DNA zu isolieren, werden beispielsweise 5 g pulverisiertes Pflanzengewebe erneut in einem 50 ml Extraktionspuffer aus 100 mM Tris HCl, pH 8,0, 0,7 M NaCl, 10 mM EDTA, 1% 2-Mercaptoethanol und 1% (Gew./Vol.) Cetyltriammoniumbromid (CTAB) suspendiert und 30 Minuten bei 55ºC inkubiert. Das Detergenz CTAB sprengt wirksam die Zellwände und bildet einen löslichen Komplex mit Nucleinsäuren in Gegenwart des starken Salzes (0,7 M NaCl). Das Gemisch wird dann auf Raumtemperatur abgekühlt und zweimal mit Chloroform/Isoamylalkohol extrahiert. Die wäßrige Schicht wurde bei 155 · g 10 Minuten zentrifugiert; etwaige Niederschläge werden verworfen. Der Überstand wird dann mit einem gleichen Volumen von Ausfällungspuffer aus 100 mM Tris HCl, pH 8,0, 10 mM EDTA und 1% CTAB verdünnt und bei Raumtemperatur eine Stunde stehengelassen. Wenn die Salzkonzentration unter 0,4 M NaCl sinkt, fällt der CTAB- Nucleinsäurekomplex aus, während die Polysaccharide und andere Verunreinigungen in der Lösung verbleiben. Dann wird das Gemisch bei 155 · g 30 Minuten zentrifugiert.
Das Pellet wird erneut in 10 mM Tris, 1 mM EDTA (TE), suspendiert und zweimal mit Phenol/Chloroform und einmal mit Chloroform/Isoamylalkohol extrahiert. Die Lösung wird mit Natriumacetat auf 0,3 M eingestellt. Dann gibt man oben 3 Volumen Ethanol zu. Genomische DNA wird durch Rühren mit einem sterilen Glasstab aus der Lösung gespult. Die DNA wird mit 70%igem Ethanol gespült kurz getrocknet und bei 1 mg/ml erneut in TE suspendiert. Durch Agarose-Gelelektrophorese wurde festgestellt, daß die Größe der auf diese Weise hergestellten DNA über 20 kb beträgt. Die Ausbeute aus 5 g Ausgangsmaterial betrug 1 mg aus der Momordica charantia Frucht und 1,5 mg aus den Samen.
Aus diesen Pflanzengeweben wird RNA durch Mischen des gefrorenen Gewebes in Gegenwart von flüssigem Stickstoff zu Pulver und Homogenisieren des Pulvers in 10 Gewichtsvolumen RNAzol, einem im Handel erhältlichen Extraktionsmittel, das Guanidinisothiocyanat, SDS und Phenol enthält (Cinna/Biotecx, Texas). Da man davon ausgeht, daß das Homogenat Polysaccharide enthält, wird es 30 Minuten bei 4ºC bei 2.000 · g zentrifugiert. Der Überstand wird sorgfältig entfernt, so daß eine gelatineartige Masse zurückbleibt. Der Überstand wird zweimal mit einem gleichen Volumen von Chloroform extrahiert; DNA und Protein bilden einen unlöslichen Komplex an der Grenzfläche. RNA wird mit Isopropanol aus der wäßrigen Schicht ausgefällt. Das Pellet wird erneut suspendiert, mit Phenol:Chloroform extrahiert und mit Ethanol ausgefällt, um gesamte zelluläre RNA zu ergeben. Bei diesem Verfahren betrug die Ausbeute aus 10 g Ausgangsmaterial etwa 1 mg aus der Momordica charantia Frucht und 0,5 mg aus den Samen. Das Verhältnis von A&sub2;&sub6;&sub0;/A&sub2;&sub8;&sub0; wurde mit 1,9 bis 2,0 bestimmt.
Poly(A&spplus;)-RNA wird durch Chromatographie auf Oligo-dT- Cellulose isoliert. Üblicherweise erhält man Ausbeuten von 2 bis 5% RNA.
cDNA und genomische Bibliotheken werden mit etablierten Verfahren in den Lamda-gt11-Vektor geklont. Die Verwendung der EcoR1-Stelle gt11 bietet spezifische Vorteile, da es möglich ist, einen Primer zu verwenden, der komplementär zum β-Galactosidasegen neben der Klonierungsstelle ist, um spezifische Klone zu vermehren. Dazu verwendet man einen anderen Primer, der dem spezifi schen Gen, in diesem Fall dem SCRIP, komplementär ist.
Die cDNA-Synthese erfolgte nach dem Verfahren von Gubler und Hoffman (Gene 25 : 263 (1983)). Zuerst wurde ein Strang cDNA unter Verwendung von Poly (A&spplus;)-RNA als Matrize und Moloney-Mäuseleukämievirus reverser Transcriptase mit Oligo-dT als Primer hergestellt. Ein zweiter Strang cDNA wurde unter Verwendung von DNA Polymerase I und E. coli Ligase in Gegenwart von RNAse H hergestellt. Doppelsträngige cDNA wurde mit T4-Polymerase an den Enden glatt gemacht und die resultierende cDNA mit EcoR1 Methylase behandelt. Dann gab man EcoR1- Linker zu und ligasierte die cDNA an Lambda gt11-Arme und packte sie in Phagen.
Genomische DNA wurde teilweise mit MBoI abgedaut und Fragmente in einer Größe von 15 bis 23 kb durch präparative Agarosegel-Elektrophorese gewählt. Die Enden dieser Fragmente wurden dann glatt gemacht, mit EcoR1 Methylase behandelt und mit EcoR1 Linke m zu Lambda gt11 geklont.
Die Oligonucleotideprimer für die PCR werden aus der Aminosäuresequenz des SCRIP gestaltet. Weil durch die Entartung des genetischen Codes die Anzahl möglicher Codonwahlen an jeder Position steigt, verwendet man ein Gemisch aus Oligonucleotidprimern, um jede Möglichkeit in Erwägung zu ziehen. Einer dieser Primer ist dem Gen in diesem Bereich genau komplementär. Alternativ werden die Primer länger gemacht, und nicht jede Möglichkeit wird in Erwägung gezogen. In letzterem Fall verleihen die Länge des Primers und die ersten beiden Basen jedes Codons die erforderliche Spezifität. Obwohl die genaue Ergänzung der Gene nicht vorliegt, ist der Primer ausreichend spezifisch, um im PCR-Verfahren verwendet zu werden.
Die bevorzugten Primer haben zu Anfang eine Länge von 17 bis 20 Nucleotiden mit einer Entartung von 1024 oder weniger. Ein Hexanucleotid, das eine Erkennungsstelle für ein Restriktionsfragment wie HindIII enthält, wird ans 5'-Ende des Primers angefügt und zum Klonen verwendet.
Die folgenden 17-Basen-Oligonucleotideprimer oder Sonden wurden auf der Grundlage der Information der Aminosäuresequenz mit endständigen N-Gruppen von MAP 30 gestaltet. Diese Oligonucleotide haben eine Entartung von 64:
Rest Asp-Val-Asn-Phe-Asp-Leu
5' GAT-GTT-AAT-TTT-GAT-CT 3'
Die folgenden 24-Basen-Oligonucleotide, die komplementär zum β-Galactosidgen nahe der EcoR1-Klonierungsstelle sind, wurden als Primer bei PCR verwendet:
Lamda 1 5' GGTGGCGACGACTCCTGGAGCCCG 3'
Lamda 2 5' TTGACACCAGACCAACTGGTAATG 3'
Zusammen mit einem für eine Einzelsequenz spezifischen Primer wurden diese Lambda-Primer dazu verwendet, spezifische Klone aus genomischen und cDNA-Bibliotheken zu vermehren und überlappende Klone zu erhalten, die Bereiche außerhalb bekannter Nucleotidsequenzen codieren. Oligonucleotide werden unter Verwendung eines Synthesisers 380B von Applied Biosystems unter Verwendung des Phosphorimidat-Verfahrens synthetisiert und mittels HPLC gereinigt. Eine 5'-Phosphatgruppe wird unter Ver wendung von T4-Kinase angefügt.
Unter Verwendung des Zwei-Primer-Ansatzes werden beide Oligonucleotide so gestaltet, daß sie getrennte Teile des SCRIP-Peptids codieren. Die Matrize ist entweder genomische DNA oder cDNA. Beim Ein-Primer-Verfahren ist der andere Primer ein Lambda-Primer und die Matrize eine Mischung aus Phagen-DNA, die aus den Bibliotheken isoliert wurde.
Beurteilungen über die Polymerasekettenreaktion liefern K. B. Mullis (Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51: 263-273 (1986)), R. K. Saiki et al. (Bio/Technology 3: 1008-1012 (1985)) und K. B. Mullis et al. (Met. Enzymol. 155: 335-350 (1987)).
Die Variablen der PC-Reaktion umfassen die Glühtemperatur, die Polymerisationszeit und das Verhältnis von Matrize zu Primern. In einer Ausführungsform werden 100 ng cDNA oder 1 ug der gesamten genomischen DNA oder gemischten Phagen-Bibliothek DNA als Matrize verwendet. Dann verwendet man 5-100 pMol Oligonucleotidprimer, je nach dessen Entartung. Die PCR-Reaktionen werden in einem programmierbaren thermischen Zyklusgerät durchgeführt.
Ein typischer Zyklus besteht aus Denaturierung bei 94ºC über eine Minute, Wärmebehandlung bei 45ºC über zwei Minuten und Polymerisation bei 72ºC über 3 Minuten in den ersten 20 Zyklen. Daran schließen sich weitere 20 Zyklen an, während denen die Polymerisationszeit nach und nach um zwei Sekunden pro Zyklus gesteigert wird. Die Reaktionsprodukte werden durch Agarosegel-Elektrophorese unter Verwendung herkömmlicher Agarose für Produkte von 500 bp bis zu mehreren kb und NuSieve Agarose für Produkte von 100 bP to 2 kb analysiert.
Das auf diese Weise vergrößerte genomische oder cDNA- Fragment wird geklont. Dazu bedient man sich der Restriktionsstellen, die an das 5'-Ende der Oligonucleotidprimer angefügt wurden. Die PCR-Reaktionsprodukte werden mit Restriktionsenzym angedaut und in einen uPC13 Vektor geklont, der an einer geeignete Stelle linear gemacht und mit Darmphosphatase vom Kalb behandelt wurde. Diese Klone werden dann mit radiomarkierter, mit Gel gereinigter DNA, die den wichtigen PCR-Produkten entspricht, gescreent.
Diese Klone werden dazu verwendet, genomische und cDNA- Lambda-Phagen Bibliotheken auf überlappende Klone zu screenen. Außerdem wird die Sequenzinformation aus diesen Klonen dazu verwendet, neue Primer für die Einzel- Primer-PCR-Amplifikation aus Phagenbibliotheken zu gestalten. Alternativ verwendet man die Primerverlängerung unter Verwendung von aus diesen Klonen abgeleiteten Sequenzen, um cDNA-Klone von voller Länge zu erzeugen.
Techniken zur Synthese solcher Oligonucleotide sind beispielsweise auch in R. Wu et al., Prog. Nucl. Acid. Res. Molec. Biol. 21: 101-141 (1978)) offenbart. Verfahren zur Konstruktion rekombinanter Moleküle nach den vorstehend beschriebenen Verfahren sind von J. T. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1984) offenbart.
Die geklonten Gene für MCI, MCA, MCB und MAP 30 können in prokaryontischen Expressionsvektoren, die in der Technik bekannt sind, exprimiert werden.
Ein "Expressionsvektor" ist ein Vektor der (aufgrund der Gegenwart geeigneter Transcriptions- und/oder Translationskontrollsequenzen) ein DNA- (oder cDNA-) Molekül exprimieren kann, das in den Vektor geklont wurde und dadurch ein Polypeptid oder Protein erzeugt: Die Expression der geklonten Sequenzen tritt ein, wenn der Expressionsvektor in eine entsprechende Wirtszelle eingeführt wird. Wenn man einen prokaryontischen Expressionsvektor verwendet, wäre die geeignete Wirtszelle jede prokaryontische Zelle, die die geklonten Sequenzen exprimieren kann. Ähnlich wäre bei Verwendung eines eukaryontischen Expressionsvektors die geeignete Wirtszelle jede eukaryontische Zelle, die die geklonten Sequenzen exprimieren kann. Da eukaryontische DNA störende Sequenzen enthalten kann und solche Sequenzen in prokaryontischen Zellen nicht richtig verarbeitet werden können, ist es wichtig, daß man cDNA aus einer Zelle verwendet, die das erfindungsgemäße Pflanzenprotein exprimieren kann, damit eine prokaryontische genomische Expressionsvektorbibliothek erzeugt wird. Verfahren zur Herstellung von cDNA und zur Erzeugung einer genomischen Bibliothek sind von Sambrook et al. (siehe oben) offenbart worden.
Wie es heißt, ist ein Nucleinsäuremolekül wie DNA imstande, ein Polypeptid "zu exprimieren", wenn es Nucleotidsequenzen aufweist, die Transcriptions- und Translations-Regulationsinformationen enthalten, und solche Sequenzen sind "operabel" mit Nucleotidsequenzen verknüpft, die das Polypeptid codieren. Eine operable Verknüpfung ist eine Verknüpfung, in der Regulations- DNA-Sequenzen und die DNA-Sequenz, die exprimiert werden soll, so miteinander verbunden sind, daß eine Genexpression möglich ist. Die genaue Beschaffenheit der für die Genexpression erforderlichen Regulationsbereiche kann von Organismus zu Organismus schwanken, umfaßt jedoch im allgemeinen einen Promoterbereich, der in Prokaryonten sowohl den Promoter (der die Initiation der RNA-Transcription steuert) als auch die DNA- Sequenzen, die bei Transcription in RNA die Initiation der Proteinsynthese signalisieren, enthält. Solche Bereiche umfassen normalerweise diese 5'-nicht codierenden Sequenzen, die an der Initiation der Transcription und Translation beteiligt sind, z. B. die TATA-Box, die mit einem Cap versehende Sequenz, CAAT-Sequenz u. ä.
Auf Wunsch kann der nicht codierende Bereich 3' für die das Protein codierende Sequenz durch die vorstehend beschriebenen Verfahren hergestellt werden. Dieser Bereich kann wegen seiner Regulationssequenzen für die Transcriptionstermination wie Termination und Polyadenylation zurückbehalten werden. Wenn man also den 3'- Bereich zurückbehält, der natürlich an die das Protein codierende DNA-Sequenz angrenzt, können Signale für die Transcriptionstermination zur Verfügung gestellt werden. Wo die Signale für die Transcriptionstermination in der Expressionswirtszelle nicht ausreichend funktionell sind, kann ein in der Wirtszelle funktioneller Bereich substituiert werden.
Zwei DNA-Sequenzen (wie eine Promoterbereichssequenz und eine das erwünschte Protein codierende Sequenz) sind dann "operabel verknüpft" wenn die Beschaffenheit der Verknüpfung zwischen den beiden DNA-Sequenzen (1) nicht zur Einleitung einer Rasterverschiebungsmutation führt, (2) die Fähigkeit der Promoterbereichssequenz nicht stört, die Transcription des zu exprimierenden Gen zu steuern, (3) die Fähigkeit der zu exprimierenden Gensequenz nicht beeinträchtigt, durch die Promotorbereichssequenz transcribiert zu werden. Ein Promoterbereich wäre dann operabel mit einer DNA-Sequenz verknüpft, wenn der Promoter imstande wäre, die Transcription dieser DNA-Sequenz zu bewirken. Um somit das Protein zu exprimieren, sind Transcriptions- und Translationssignale notwendig, die von einem entsprechenden Wirt erkannt werden.
Ein Promoter ist ein doppelsträngiges DNA- oder RNA- Molekül, das RNA-Polymerase binden und die Transcription einer "operabel verknüpften" Nucleinsäuresequenz beschleunigen kann. Der hier verwendete Begriff "Promotersequenz" ist die Sequenz des Promoters, die auf demjenigen Strang der DNA oder RNA zu finden ist, der durch die RNA-Polymerase transcribiert wird. Ein "Promotersequenz-Complement" ist ein Nucleinsäuremolekül, dessen Sequenz das Complement einer "Promotersequenz" ist. Deshalb wird bei Verlängerung einer Primer-DNA oder -RNA, die einem einsträngigen Promotersequenz-Complement benachbart ist, oder einer "Promotersequenz" ein doppelsträngiges Molekül erzeugt, das einen funktionellen Promoter enthält, wenn diese Verlängerung bis zur "Promotersequenz" oder zum "Promotersequenz-Complement" reicht. Dieser funktionelle Promoter steuert die Transcription eines Nucleinsäuremoleküls, das operabel mit dem Strang des doppelsträngigen Moleküls verknüpft ist, der die "Promotersequenz" enthält (und nicht dem Strang des Moleküls, der das "Promotersequenz-Complement enthält).
Bestimmte RNA-Polymerasen wiesen eine hohe Spezifität für solche Promoter auf. Die RNA-Polymerasen der Bakteriophagen T7, T3 und SP-5 sind besonders gut charakterisiert und weisen eine hohe Promotorspezifität auf. Die Promotersequenzen, die für jede dieser RNA-Polymerasen spezifisch sind, steuern auch die Polymerase, so daß nur ein Strang der beiden Stränge einer doppelsträngigen DNA-Matrize genutzt wird (d. h. transcribiert wird). Die Wahl, welcher Strang transcribiert wird, wird durch die Orientierung der Promotersequenz bestimmt. Diese Wahl bestimmt die Steuerung der Transcription, da RNA nur durch die Zugabe eines Nucleotid-5'-phosphats zu einem 3'-Hydroxylterminus enzymatisch polymerisiert wird.
Die erfindungsgemäßen Promotersequenzen können entweder prokaryontisch, eukaryontisch oder viral sein. Geeignete Promoter sind reprimierbar oder, stärker bevorzugt, konstitutiv. Beispiele für geeignete prokaryontische Promoter umfassen Promoter, die folgende Substanzen erkennen: T4-Polymerasen (S. Malik et al., J. Biol. Chem 263: 1174-1181 (1984), A. H. Rosenberg et al., Gene 59: 191-200 (1987), S. Shinedling et al., J. Molec. Biol. 195: 471-480 (1987), M. Hu et al., Gene 42: 21 -30 (1986)), T3-, Sp6- und T7-Polymerasen (M. Chamberlin et al., Nature 228: 227-231 (1970), J. N. Bailey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 80: 2814-2818 (1983), P. Davanloo et al. Proc. Natl. Acad Sci. (USA) 81: 2035-2039 (1984)), die PR und PL-Promoter von Bakteriophage 1 (The Bacteriophage Lambda, Herausg. A. D. Hershey, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor NY (1973), Lambda II, Herausg. R. W. Hendrix, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor NY (1980)) und die trp, recA, Wärmeschock und lacZ-Promoter von E. coli, die a-Amylase (I. Ulmanen et al., J. Bacteriol. 162: 176-1982 (1985)) und die s-28-spezifischen Promoter von B. subtilis (M. Z. Gilman et al., Gene 32: 11 -20 (1984)), die Promoter der Bacteriophagen von Bacillus (T. J. Gryczan in: The Molecular Biology of the Bacilli, Academic Press, Inc. NY (1982)), Streptomyces- Promoter (J. M. Ward et al., Mol. Gen. Genet. 203: 468- 478 (1986)), den int-Promoter von Bacteriophage 1, den bla-Promoter des b-Lactamasegens von pBR322, und den CAT-Promoter des Choramphenicolacetyl-Transferasegens von pPR325 usw. Über prokaryontische Promoter schreiben B. R. Glick (J. Ind. Microbiol. 1: 277-282 (1987)), Y. Centatiempo (Biochimie 68: 505-516 (1986)), J. D. Watson et al. (in: Molecular Biology of the Gene, 4. Auflage, Benjamin Cummins, Menlo Park, CA (1987)) und S. Gottesmann (Ann. Rev. Genet. 18: 415-442 (1984)). Bevorzugte eukaryontische Promoter umfassen den Promoter des Maus-Metallothionein I-Gens (D. Hamer et al., J. Mol. Appl. Gen. 1: 273-288 (1982)), den TK-Promoter des Herpesvirus (S. McKnight, Cell 31: 355-365 (1982)), den SV40-Frühpromoter (C. Benoist et al., Nature (London) 290: 304-310 (1981)) und den Hefegal4-Genpromoter (S. A. Johnston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79: 6971-6975 (1982)), P. A. Silver et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 81: 5951-5955 (1984)). Alle diese Veröffentlichungen werden hiermit in diese Anmeldung einbezogen.
Die Herstellung der erfindungsgemäßen Pflanzenproteine oder ihrer funktionellen Derivate in Insekten kann beispielsweise dadurch erfolgen, daß man das Insekt mit einem Baculovirus infiziert, das gentechnisch so behandelt wurde, daß es das relevante Gen exprimiert. Die Verfahren dazu sind Fachleuten bekannt. Somit können in einer Ausführungsform die MAP 30 codierenden Sequenzen operabel mit den Regulationsbereichen des viralen Polyhedrinproteins verknüpft werden (Jasney, Science 238: 1653 (1987)). Mit dem rekombinanten Baculovirus infizierte gezüchtete Insektenzellen oder die lebenden Insekten selbst können das MAP 30 Protein in Mengen von bis zu 20 bis 50% der gesamten Proteinproduktion herstellen. Wenn man lebende Insekten verwendet, sind Tausendfüßler derzeit die bevorzugen Wirte für die erfindungsgemäße Proteinproduktion im großen Maßstab.
Starke Promoter werden für die Erfindung am meisten bevorzugt. Beispiele für solche bevorzugten Promoter sind solche, die die T3-, SP6- und T7-Polymerasepromoter, den PL-Promoter des Bacteriophagen Lambda, den recA- Promoter und den Promoter des Maus-Metallothionein-I- Gens erkennen.
Die Expression der geklonten Gene, die die erfindungsgemäßen Proteine codieren, ermöglicht die Herstellung der aktiven Proteine im großen Maßstab. Dann können neue Chimärenmoleküle hergestellt werden, die über verbesserte Antitumor- und/oder Anti-HIV-Aktivität und geringere Toxizität gegenüber den Wirtszellen verfügen, weil nur die Teile des Moleküls eingesetzt werden, die aktiv gegen Viren oder Tumoren wirken. Beispielsweise können die erfindungsgemäßen Pflanzenproteine an andere Proteine mit hemmenden und zytotoxischen Eigenschaften gekoppelt werden, darunter die Ricin-A-Kette, das Pseudomonas-Toxin, das Diphtherietoxin und der Tumornekrosefaktor. An Antikörper oder andere Liganden konjugierte Toxine sind in der Technik bekannt (siehe z. B. S. Olsnes et al., Immuol. Today 10: 291-295 (1989)). Eine solche Kopplung kann auf chemische Weise oder durch rekombinante DNA-Techniken erfolgen, wobei DNA codierendes MAP 30 mit DNA verknüpft wird, die ein anderes toxisches Protein, ein CD4-Molekül oder -Fragment, eine monoklonale Antikörperkette bzw. -Fragment wie den variablen Bereich schwerer Ketten u. ä. codiert
SCRIPs hemmen die Proteinsynthese durch die hydrolytische Spaltung einer Glycosidbindung zwischen dem Adenin und der Ribose an einer spezifischen Stelle A4324 auf der 28S-rRNA, wobei die Phosphodiesterbindungen der RNA-Hauptkette intakt bleiben. Diese Reaktion führt zu einem Rückgang der Stabilität der RNA und macht sie empfänglich gegenüber einer Anilinbehandlung bei einem pH von 4,5, wobei ein Fragment von etwa 450 Nucleotiden bei der Spaltung freigesetzt wird. Die gleichen Ergebnisse waren bei einer Behandlung entweder mit nativen ribonuclearen Proteinteilchen oder nackter 285 rRNA zu beobachten. Diese direkte Wechselwirkung von SCRIPs mit nackter rRNA beeinträchtigt die Stabilität zellulärer RNA bei der SCRIP-Behandlung.
Zusätzliche Konjugate von MAP 30 oder einem funktionellen Derivat davon, die ebenfalls im Rahmen der Erfindung liegen, umfassen Konjugate mit Antikörpern, die spezifisch für Tumorantigene oder HIV-Antigene wie gp120 oder gp41 sind (S. Matsushita et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses 6: 193-203 (1990), das hiermit in diese Anmeldung einbezogen wird), Konjugate mit CD4- Molekülen oder löslichen CD4-Fragmenten u. ä. Solche Konjugate ermöglichen die zielgenaue Abgabe von MAP 30 an eine relevante Stelle, wie eine ein HIV-Antigen exprimierende Zelle, um eine noch höhere Spezifität und eine niedrigere nichtspezifische Toxizität zu erreichen.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur rekombinanten Herstellung der Zellen eines AIDS-Patienten für die in situ Expression von MAP 30 zur Verfügung. Ein hybrides Plasmid, das das MAP 30-Gen oder ein Fragment davon unter Leitung des HIV LTR enthält, kann in einen Retrovirusvektor insertiert werden. Für eine Erörterung der Verfahren, die an der Produktion und Expression eines retroviralen Vektors beteiligt sind, wird z. B. auf T. D. Palmer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 1055 -1059 (1987), J. M. Wilson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 3014-3018 (1988), J. A. Zwiebel et al., Science 24: 220-222 (1989) verwiesen, die hiermit in diese Anmeldung einbezogen werden. Transfizierte Zellen, die ein integriertes HIV-MAP 30-Plasmid enthalten, würden konstitutiv sehr geringe Mengen von MAP 30 exprimieren; bei der Transaktivierung mit einer HIV- Infektion würde die Produktion von MAP 30 effektiv induziert. Die kontinuierliche Gegenwart von MAP 30, das endogen zugeführt wird, kann einen therapeutischen Nutzen haben, der über das hinausgeht, was man durch herkömmliche Verabreichung des Proteins erreicht.
Um Tumorpatienten mit den erfindungsgemäßen Pflanzenproteinen zu behandeln, wird MAP 30 oder ein funktionelles Derivat davon einem Patienten in täglichen Dosen von etwa 1 ng bis etwa 50 mg, stärker bevorzugt im Be reich von etwa 1 ug bis etwa 10 mg verabreicht. Die optimale Dosis sollte durch den behandelnden Arzt auf der Grundlage des Zustandes und Gewichts des Patienten sowie der Ansprache auf die Behandlung festgelegt werden.
Alternativ wird das MAP 30 oder ein funktionelles Derivat davon wie vorstehend abwechselnd mit GLQ 223 in gleichen Dosen verabreicht. Diese Kombinationsbehandlung hat sich als effektiv bei throphoplastischen Tumoren erwiesen.
Um eine HIV-Infektion bei einem Patienten zu behandeln, wird MAP 30 oder ein funktionelles Derivat davon einem Patienten in täglichen Dosen von 1 ng bis etwa 50 mg, stärker bevorzugt in einem Bereich von etwa 1 ug bis etwa 10 mg verabreicht.
Selbstverständlich hängt die Dosis von MAP 30 und dessen funktionellen Derivaten vom Alter, Geschlecht, der Gesundheit und dem Gewicht des Empfängers, der Art einer eventuell gleichzeitig stattfindenden Behandlung, der Behandlungshäufigkeit und der Art der erwünschten Wirkung ab. Die Bereiche der hier zur Verfügung gestellten effektiven Dosen sind nicht dazu da, die Erfinder einzuschränken, und stellen bevorzugte Dosisbereiche dar. Jedoch wird die am meisten bevorzugte Dosis auf den jeweiligen Patienten zugeschnitten, wie ein normaler Fachmann verstehen wird und ohne übermäßiges Experimentieren festlegen kann.
Alternativ wird eine Person mit einer HIV-Infektion oder mit AIDS mit den vorstehenden Mengen an Pflanzenproteinen zusammen mit anderen bekannten Therapeutika behandelt, darunter AZT, ddI, ddA, ddC, GLQ 223 oder lösliches CD4. Vorzugweise werden die Medikamente nach Tagen abwechselnd in den empfohlenen Mengen für jedes verabreicht.
MAP 30 wird in Zusammensetzungen verabreicht, einschließlich Zusammensetzungen, in denen das Pflanzenprotein in einer effektiven Menge enthalten ist, um den beabsichtigten Zweck zu erreichen. Die Bestimmung der effektiven Mengen gehört zum Fachwissen eines Fachmanns.
Das erfindungsgemäße MAP 30 Protein bzw. die pharmazeutischen Zusammensetzungen können auf jede Weise verabreicht werden, die den beabsichtigten Zweck erreichen. Beispielsweise kann die Verabreichung parenteral erfolgen, darunter subkutan, intervenös, interdermal, intramuskulär, intraperitoneal, intrathekal, transdermal oder bukkal. Alternativ oder gleichzeitig kann oral oder rektal verabreicht werden. Die Proteine und pharmazeutischen Zusammensetzungen können parenteral durch Bolusinjektion oder durch allmähliche Perfusion im Laufe der Zeit verabreicht werden.
Zusätzlich zu MAP 30 oder einem funktionellen Derivat davon können diese pharmazeutischen Zusammensetzungen geeignete pharmazeutisch akzeptable Träger enthalten, die Hilfsstoffe umfassen, welche die Verarbeitung der aktiven Verbindungen zu pharmazeutisch einsetzbaren Zubereitungen erleichtern. Bevorzugt enthalten die Zubereitungen, vor allem diejenigen, die oral verabreicht und für den bevorzugten Verabreichungstyp verwendet werden können, wie Tabletten, Dragees und Kapseln, Zubereitungen für die rektale Verabreichung wie Zäpfchen sowie geeignete Lösungen für die Verabreichung durch Injektion oder oral etwa 0,1 bis 99%, bevorzugt etwa 25 bis 85% der aktiven Verbindung(en) zusammen mit dem Hilfsstoff.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen werden auf bekannte Weise hergestellt, z. B. durch herkömmliche Mix-, Granulier-, Dragier-, Löse- oder Lyophilisierungsverfahren. So kann man pharmazeutische Zubereitungen für die orale Verwendung dadurch herstellen, daß man die aktiven Verbindungen mit festen Hilfsstoffen kombiniert, das resultierende Gemisch ggfs. mahlt und das Granulatgemisch nach Zugabe eventuell erwünschter oder notwendiger Hilfsstoffe verarbeitet, um Tabletten oder Drageekerne herzustellen.
Geeignete Hilfsstoffe sind vor allem Füllstoffe wie Zucker, z. B. Lactose, Saccharose, Mannit oder Sorbit, Cellulosezubereitungen und/oder Calciumphosphate wie Tricalciumphosphat oder Calciumhydrogenphosphat, sowie Bindemittel wie Stärkepaste, die z. B. unter Verwendung von Maisstärke, Weizenstärke, Reisstärke, Kartoffelstärke, Gelatine, Traganthgummi, Methylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Natriumcarboxymethylcellulose und/oder Polyvinylpyrrolidon hergestellt werden.
Auf Wunsch können auch Aufschlußmittel, wie die vorstehend erwähnten Stärken sowie Carboxymethylstärke, vernetztes Polyvinylpyrrolidon, Agar oder Algininsäure oder ein Salz davon wie Natriumalginat zugesetzt werden.
Hilfsstoffe, die in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen verwendet werden können, umfassen flußregulierende Mittel und Schmiermittel wie Siliciumdioxid, Talkum, Stearinsäure oder deren Salze und/oder Polyethylenglycol.
Drageekerne werden mit geeigneten Beschichtungen versehen, die auf Wunsch beständig gegen Magensäfte sein können. Zu diesem Zweck verwendet man konzentrierte Zuckerlösungen, die ggfs. Gummi arabicum, Talkum, Polyvinylpyrrolidon u. ä. enthalten können.
Ebenfalls in den Rahmen der Erfindung fällt ein Antikörper, der für MAP 30 oder ein funktionelles Derivat davon spezifisch ist.
Der Begriff "Antikörper" bedeutet sowohl monoklonale Antikörper, bei denen es sich um eine im wesentlichen homogene Population handelt, sowie polyklonale Antikörper, die heterogene Populationen sind. Polyklonale Antikörper werden aus den Seren von Tieren gewonnen, die mit einem Antigen immunisiert wurden. Monoklonale Antikörper (mAbs) für spezifische Antigene können durch Fachleuten bekannte Techniken gewonnen werden, siehe z. B. Kohler und Milstein, Nature 256: 495-497 (1975) und US-A-4,376,110. Solche Antikörper können von der Immunglobulinklasse sein, darunter IgG, IgN, IgE, IgA, IgD und eine beliebige Unterklasse davon.
Der Begriff "Antikörper" schließt auch sowohl intakte Moleküle als auch Fragmente davon ein, wie z. B. Fab und F(ab')&sub2;, die Antigen binden können. Fab und F(ab')&sub2;- Fragmenten fehlt das Fc-Fragment des intakten Antikörpers. Sie treten rascher wieder aus dem Kreislauf aus und können weniger nicht spezifisches bindendes Gewebe aufweisen als ein intakter Antikörper (Wahl et al., J. Nucl. Med. 24: 316-325 (1983))
Selbstverständlich können Fab und F(ab')&sub2; sowie andere Fragmente der für die Erfindung nützlichen Antikörper auf die gleiche Weise wie ein intakter Antikörper auch für den Nachweis und die Quantifizierung von MAP 30 verwendet werden. Solche Fragmente werden typischerweise durch eine proteolytische Spaltung unter Verwendung von Enzymen wie Papain (zur Herstellung von Fab-Fragmenten) oder Pepsin (zur Herstellung von F(ab')&sub2;-Fragmenten) produziert.
Man sagt, ein Antikörper ist "imstande, ein Molekül zu binden," wenn er spezifisch damit reagieren kann, um es an den Antikörper zu binden. Der Begriff "Epitop" bezieht sich auf den Teil eines Moleküls, der durch einen Antikörper gebunden und auch von diesem Antikörper erkannt werden kann. Epitopische Determinanten bestehen üblicherweise aus chemisch aktiven Oberflächengruppierungen von Molekülen wie Aminosäuren oder Zuckerseitenketten und haben spezifische dreidimensionale strukturelle Eigenschaften sowie spezifische Ladungscharakteristika.
Ein "Antigen" ist ein Molekül oder ein Teil eines Moleküls, das durch einen Antikörper gebunden werden kann, der darüber hinaus in der Lage ist, ein Tier dazu zu veranlassen, Antikörper zu produzieren, der an ein Epitop dieses Antigens binden kann. Ein Antigen kann ein oder mehr als ein Epitop haben. Die vorstehend angesprochene spezifische Reaktion bedeutet, daß das Antigen stark selektiv mit seinem entsprechenden Antikörper und nicht mit einer Vielzahl anderer Antikörper reagiert, die durch ein anderes Antigen angesprochen werden können.
Die Antikörper oder Fragmente von Antikörpern, die für die Erfindung geeignet sind, können quantitativ oder qualitativ die Gegenwart von MAP 30 nachweisen. Beispielsweise wäre es von Nutzen, den MAP 30-Gehalt im Kreislauf oder im Gewebe einer Person zu überwachen, die therapeutische Dosen des Proteins erhält. Somit können die für die Erfindung geeigneten Antikörper (oder deren Fragmente) histologisch dazu eingesetzt werden, die Gegenwart von MAP 30 nachzuweisen oder zu visualisieren.
Ein Test auf MAP 30 umfaßt typischerweise das Inkubieren einer biologischen Probe der Person in Gegenwart eines nachweisbar markierten Antikörpers oder eines Antikörperfragments, der MAP 30 indentifizieren und den Antikörper nachweisen kann, der in der Probe gebunden ist.
Somit kann in diesem Aspekt der Erfindung eine biologische Probe mit Nitrocellulose oder einem anderen festen Träger, der Zellen, Zellteilchen oder lösliche Proteine immobilisieren kann, behandelt werden. Der Träger kann dann mit geeigneten Puffern gewaschen und anschließend mit dem nachweisbar markierten MAP 30-spezifischen Antikörper behandelt werden. Der Festphasenträger kann dann ein zweites Mal mit dem Puffer gewaschen werden, um ungebundenen Antikörper zu entfernen. Die Menge des gebundenen Markers auf diesem festen Träger kann dann auf herkömmliche Weise nachgewiesen werden.
Mit "Festphasenträger" ist jeder Träger gemeint, der Antigen oder Antikörper binden kann. Allgemein bekannte Träger umfassen Glas, Polystyrol, Polypropylen, Polyethylen, Dextran, Nylon, Amylasen, natürliche und modifizierte Cellulose, Polyacrylamide, Agarosen und Manetit. Die Beschaffenheit des Trägers kann für die Zwecke der Erfindung entweder bis zu einem gewissen Maß löslich oder unlöslich sein. Das Trägermaterial kann praktisch jede mögliche strukturelle Konfiguration aufweisen, solange das gekoppelte Molekül an ein Antigen oder einen Antikörper binden kann.
Die Bindungsaktivität eines Anti-MAP 30-Antikörpers kann nach bekannten Verfahren bestimmt werden, z. B. Enzymimmunoassay (EIA) oder Radioimmunoassay (RIA). Fachleute werden in der Lage sein, durch Routineexperimente die operativen und optimalen Untersuchungsbedingungen für jede Bestimmung festzulegen.
Für EIA ist der Antikörper durch Verknüpfung mit einem Enzym nachweisbar markiert. Wenn dieses Enzym wiederum später der Einwirkung seines Substrats ausgesetzt ist, reagiert es auf solche Weise mit dem Substrat, daß eine chemische Komponente erzeugt wird, die nachgewiesen werden kann, z. B. auf spektrophotometrische, fluorometirsche oder visuelle Weise. Zu den Enzymen, die dazu verwendet werden können, den Antikörper nachweisbar zu markieren, gehören unter anderem Malatdehydrogenase, Staphylokokkennuclease, δ-V-Steroidisomerase, Hefealkoholdehydrogenase, α-Glycerophosphatdehydrogenase, Triosephosphatisomerase, Meerrettichperoxidase, alkalische Phosphatase, Asparaginase, Glucoseoxidase, β-Galatcosidase, Ribonuclease, Urease, Catalase, Glucose-6- phosphatdihydrogenase, Glucoamylase und Acetylcholinesterase.
Durch radioaktive Markierung des Antikörpers oder Fragments ist es möglich, eine Bindung an MAP 30 durch Einsatz eines RIA nachzuweisen. Eine gute Beschreibung für RIA ist in Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology von T. S. Work et al., North Holland Publishing Company, NY (1978) zu finden. Besonders wird auf das Kapitel mit dem Titel "An Introduction to Radioimmune Assay and Related Techniques" von T. Chard verwiesen, das hiermit in diese Anmeldung einbezogen wird.
Das radioaktive Isotop kann z. B. durch Einsatz eines Gammazählers oder eines Szintillationszählers bzw. durch Autoradiographie nachgewiesen werden.
Es ist auch möglich, den Antikörper mit einer fluoreszierenden Verbindung zu markieren. Wenn der fluoreszierend markierte Antikörper der Einwirkung von Licht einer bestimmten Wellenlänge ausgesetzt wird, kann seine Gegenwart aufgrund von Fluoreszenz nachgewiesen werden. Zu den am häufigsten verwendeten fluoreszierenden Mar kerverbindungen gehören Fluoreszinisothiocyanat, Rhodamin, Phycoerytherin, Phycocyanin, Allophycocyanin, o-ehthaldehyd und Fluorescamin.
Der Antikörper kann auch durch Verwendung von Fluoreszenz emittierenden Metallen wie ¹&sup5;²Eu oder anderen Metallen der Lanthanoidserie nachweisbar markiert werden. Diese Metalle können unter Verwendung von Metallchelierungsgruppen wie Biethylentriaminpentaessigsäure (DTPA) oder Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) an den Antikörper angefügt werden.
Der Antikörper kann auch durch Kopplung an eine chemilumineszierende Verbindung nachweisbar markiert werden. Die Gegenwart des mit der chemilumineszierenden Substanz markierten Antikörpers wird dann dadurch nachgewiesen, daß man die Gegenwart von Lumineszenz, die im Laufe der chemischen Reaktion eintritt, nachweist. Beispiele für besonders geeignete chemilumineszierende Markerverbindungen sind Luminol, Isoluminol, theromatischer Acridinester, Imidazol, Acridinsalz und Oxalatester.
Ähnlich kann man eine biolumineszierende Verbindung dazu verwenden, den erfindungsgemäßen Antikörper zu markieren. Biolumineszenz ist ein Typ der Chemilumineszenz, den man in biologischen Systemen findet, in denen ein katalytisches Protein die Effizienz der chemilumineszierenden Reaktion erhöht. Die Gegenwart eines biolumineszierenden Proteiris wird dadurch bestimmt, daß man Lumineszeriz nachweist. Wichtige biolumineszierende Verbindungen für Markierungszwecke sind Luciferin, Luciferase und Aeguorin.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung veranschaulichen, aber nicht einschränken.

Beispiel 1

Herstellung von MAP 30

Für eine routinemäßige Herstellung von MAP 30 verwendete man 100 bis 200 g Samen der Momordica charantia. Diese Samen wurden zuerst entrindet und pulverisiert, Das Samenpulver wurden dann mit eiskaltem 0,15 M NaCl (Lösung A) durch Homogenisieren in einem Gewebemixer über 5 Minuten bei 5 bis 6 ml Lösung A pro Gramm Samen extrahiert. Der pH des Extrakts wurde mit 1 N HCl auf 3,6 eingeteilt. Das Gemisch wurde bei 4ºC 15 Minuten leicht gerührt. Zellabfall wurde durch Filtration durch zwei Schichten Mull und anschließendes Zentrifugieren bei 12.000 · g über 30 Minuten entfernt. Der resultierende Überstand enthielt oft eine Schicht Samenfett, das effektiv durch Milliporenfiltration durch einen Filter von 0,45 um entfernt wurde. Der geklärte Überstand wurde dann durch Ausfällen mit Ammoniumsulfat bei 0 bis 30%, 30 bis 60% und 60 bis 90% Sättigung fraktioniert. Eine Anti-HIV-Aktivität wurde im zu 30 bis 60% gesättigten Ammoniumsulfatniederschlag gefunden. In einer zusätzlichen Ausführungsform kann der Rohextrakt mit 0,8 und 2,0 Volumen kaltem (-20ºC) Aceton fraktioniert werden.
MAP fand sich in dem Niederschlag, der durch die Zugabe von 2,0 Volumen Aceton hergestellt wurde. Heide Verfahren ergeben die gleiche Ausbeute an MAP 30.
Der Niederschlag wurde in 50 mM Natriumphosphat, pH 6,3 (Lösung B), aufgelöst und gründlich gegen den gleichen Puffer dialysiert. Dieses Material wurde als "Probe von Schritt 1" bezeichnet und durch Chromatographie auf CM- Sepharose CL6B zusätzlich gereinigt. Dann wurde die Probe von Schritt 1 bei 15.000 · g 30 Minuten zentrifugiert, um etwaigen während der Dialyse gebildeten Niederschlag zu entfernen, in eine Säule von CM-Sepharose CLEB (1,5 · 34 cm) eingebracht, mit Lösung 8 ins Gleichgewicht gebracht und die Säule mit Lösung B gewaschen, bis man die Ausgangsabsorption erreichte. Etwa 60 bis 70% der kontaminierenden Proteine wurden entfernt, während MAP 30 an das CM-Sepharose CL6B band und damit in der Säule zurückgehalten wurde.
Dann wurde die Säule mit einem linearen Gradienten eluiert, der aus 240 ml Lösung H und 240 ml Lösung B mit 200 mM NaCl bestand. Ein typisches Lösungsprofil ist in Fig. 2A 2u sehen. Fünf größere Proteinpeaks wurden aus den Momordica charantia-Extrakten isoliert. Jedes dieser Proteine wurde zusätzlich gereinigt, bis es homogen war. Ihre Größen und die biologische Aktivität wurden ebenfalls studiert. Das durch SDA-PAGE bestimmte Molekulargewicht der Proteine in den Peaks 1, 2, 3, 4 und S betrug 32, 30, 29, 23 bzw. 22 kDa. Alle diese Proteine zeigen einen wechselnden Grad der Hemmung der eukaryontischen Translation. Der Großteil der Anti-HIV- Aktivität war in Peak 2 zu finden, was MAP 30 entspricht. Auch Peak 3, ein kleinerer Proteinpeak, der einem Molekül von 29 kD entspricht, zeigte die Hemmung der p24 Expression und RT-Produktion in HIV-infizierten Zellen. Seine 39 Amznosäuresequenz mit endständigen N- Gruppen ist identisch mit der von MAP 30. Die Proteine mit 32, 23 und 22 kD zeigten eine geringere Wirkung auf die 81 V-Infektion oder Replikation unter den vorstehend erwähnten Testbedingungen. Diese Protine haben auch verschiedene Aminosäureseguenzen, und es wurde keine Homologie zu MAP 30 gefunden. Wichtiger noch, MAP 30 ist nicht toxisch gegenüber intaken Zellen, während die anderen Pflanzenproteine toxisch sind.
Der Großteil der HIV-Aktivität wurde in Peak 2 gefunden, das mit 60 und 70 mM NaCl eluiert wurde. Dieses Material wurde als "Probe von Schritt 2" bezeichnet und enthielt Verunreinigungen verschiedener Größen. Diese Verunreinigungen wurden durch Gelfiltration auf Sephadex G75 (superfein) in 20 mM Natriumphosphatpuffer, pH 6,3 entfernt. Wie aus Fig. 2B hervorgeht, wurde MAP 30 in einem einzigen Peak bei einem Kolonnenvolumen von etwa 0,45 eluiert.
Die Größe, Homogenität und Untereinheitsstruktur von MAP 30 wurden durch SDS-PAGE in Gegenwart oder Abwesenheit von 2-Mercaptoethanol bestimmt. Diese Ergebnisse sind in Fig. 3 zu sehen. Eine einzige Bande mit einem Molekulargewicht, das 30 kD entspricht, wurde für MAP sowohl in Gegenwart (Spuren 4 und 5) als auch Abwesenheit (Spuren 9 und 10) des Reduktionsmittels erhalten, was anzeigt, daß dieses Protein aus einem einkettigen Polypeptid besteht. Die Spuren 2 und 7 enthielten rohes und die Spuren 4 und 9 reines MAP 30, das aus dem 30-60%igen Ammoniumsulfatniederschlag hergestellt worden war. Die Spuren 3 und 8 waren mit rohem und die Spuren 5 bis 10 reinem MAP gefüllt, das aus Acetonniederschlag (2 Volumen) hergestellt worden war.

Beispiel 2

Anti-HIV-Aktivität von MAP 30

A. Materialien und Verfahren

Zelllinien und Viren

Die CD4-positive T-Zelllinie GEM-ss wurde als einschichtige Indikatorzellen für den Mikrotiter-Synzytium-bildenden Test verwendet. Die H9-Zelllinie wurde in Suspensionskulturen für Tests auf. p24-Expression und mit dem Virus in Zusammenhang stehende RT-Aktivität verwendet. Die Grundlösung des HIV-1-Virus wurde von R. Gallo bezogen. Der Virus wurde präpariert und wie zuvor beschrieben gelagert (Nara et al., AIDS Res. Hum. Retrovir. 3: 283-302 (1987)). Die Zelllinien wurden in RPMI-1640 mit Penicillin-Streptomycin (100 U/ml)und 10%igem, durch Hitze inaktivierten Kalsfoetusserum (komplettes Medium) aufbewahrt.

Reinigung und Charakterisierung von MAP 30

Die Bedingungen für die Chromatographie und SDA-PAGE sind in den Legenden zu Fig. 2 und 3 beschrieben. Für die Herstellung von MAP 30 aus Früchten von Momordica charantia verwendete man routinemäßig 2 bis 5 kg reife Früchte. Der Fruchtsaft wurde durch Zugabe von festem Salz auf 0,15 M NaCl eingestellt. Die Verfahren für Extraktion, Fraktionierung und Reinigung waren die gleichen wie vorstehend beschrieben.

Mikrotiter-Syncytium-bildender Test

Die Auswirkung von MAP 30 auf die Infektiosität von HIV-1 wurde durch den quantitativen Mikrotiter-Synzytium-bildenden infektiösen Zellkerntest (SF/ICC) untersucht, der von Nara et al., (Nature 332: 469-470 (1988)) entwickelt wurde. Die spezifischen experimentellen Bedingungen sind hier kurz beschrieben. Frische Indikatorzellen, CEM-55 (Synzytium-sensible Leu-3 positive CEM-Zelllinie) in einem kompletten RPMI-Medium wurden auf mit Poly-L-Lysin beschichtete Mikrotitervertiefungen mit 50.000 in 50 ul/Vertiefung plattiert. Die Indikatorzelen wurden 15 Sekunden oder 90 Minuten mit 50 ul MAP 30 bei Konzentrationen von 1,67, 16,7, 167 und 1670 nM (0,05 bis 50 pg/ml) vorbehandelt. Am Ende dieser Zeit wurden über 60 Minuten in jede Vertiefung 50 ul einer gefrorenen vorgetiterten HIV-Mischung aus HxB3/H9-Zellen gegeben, was 100 Synzytium-bildenden Einheiten (SFU) entspricht. Der Überstand, der MAP 30 und das Virus enthielt, wurde dann aus jeder Vertiefung entnommen und die Zellen mit dem kompletten Medium gewaschen, um von MAP 30 und HIV freie Rückstände zu entfernen. Dann wurden die Vertiefungen mit 200 ul Medium gefüllt oder erneut mit Medium gespeist, das MAP 30 in der gleichen ursprünglichen Konzentration enthielt. Die Platten wurden bei 37ºC in einem angefeuchteten Inkubator mit 5% CO&sub2; inkubiert. Die fokale Synzytiumbildung, die eine einzige infektiöse Virioneinheit darstellt, wurde am 50 Tag (120 Stunden) durch Beobachtung unter einem umgekehrten Mikroskop festgestellt.

Tests auf p24-Expression und reverse Transcriptase

Die Auswirkung von MAP 30 auf die HIV-1 Replikation und Transmission in vitro wurde durch Untersuchung auf Expression des viralen Kernproteins p24 und der viralen reversen Transcriptase (RT) Aktivität (A. D. Hoffman et al., Virology 147: 326-335 (1985)) in Suspensionskulturen HIV-infizierter H9-Zellen untersucht. Die H9- Zellen wurden mit einer getiterten durch Kälte konservierten viralen Lösung von H9/HTLV-IIB mit einer Infektionsmultiplizität von 0,005 injiziert. Die Zellen wurden bei 5 · 10&sup7;/ml mit dem Inokulum bei 37ºC 60 min. inkubiert, um die Absorption des Virus zu ermöglichen. Dann wurden die Zellen gewaschen, um ungebundenes Virus zu entfernen, und erneut im kompletten RPMI-Medium suspendiert. Sie wurden während der Dauer des Experiments bei 1 · 10&sup5;/ml mit oder ohne Zugabe von MAP 30 bei verschiedenen Konzentrationen plattiert. MAP 30 wurde in Konzentrationen von 10 ug/ml (334 nM) zu 0,01 ug/ml (0,334 nM) in aufeinanderfolgenden zehnfachen Verdünnungen zugegeben. In diesem Test erreicht die virale Produktion bei der eingesetzten Infektionsmultiplizität am 4. Tag einen Peak. Somit testete man die p24-Expression und die mit HIV im Zusammenhang stehende RT-Aktivität in zellfreien Überständen am 4. Tag. Die Menge des erzeugten viralen p24 Antigens wurde durch RIA wie beschrieben (Nara et al., 1987, siehe oben) gemessen und in ng/ml ausgedrückt. Die HIV-RT-Aktivität wurde durch Inkorporierung von markiertem dTTP wie von Hoff man et al. beschrieben (siehe oben) untersucht und in cpm · 10³/ml ausgedrückt.

Zytotoxizität und Lebensfähigkeit der Zellen

Die Zytotoxizität von MAP 30 wurde durch seine Auswirkung auf die zelluläre Synthese von DNA und Protein gemessen. Die gleichen Konzentrationen von MAP 30 wie solche, die in der p24-Produktion und den HIV-RT-Untersuchungen (0,01, 0,1, 1,0 und 10 ug/l) verwendet wurden, wurden auch nicht infizierten Zellen zugesetzt, um die Auswirkungen auf zelluläre DNA oder die Proteinsynthese und Lebensfähigkeit der Zellen zu untersuchen. Die Synthese dieser Makromoleküle wurde durch Pulsmarkierung der Zellen mit 1 uCi von [³H]-Thymidin oder [³H]-Leukin acht Stunden vor dem Ernten der Zellen am 4. Tag gemessen. Die Inkorporierung des markierten Vorläufers in durch TCA ausfällbare Produkte wurde durch Szintillationszählen bestimmt. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde durch den Ausschluß des Farbstoffs Trypanblau bestimmt.

In vitro Translationstest

Die Fähigkeit von MAP 30, die in vitro Translation eukaryontischer Zellen zu hemmen, wurde durch die Inkorporierung eines mit [³H] markierten Leukins in ein TCAunlösliches Produkt in einem Kaninchen-Retikulozyten- Lysatsystem (R. B. Pelham et al., Eur. J. Biochem. 67: 247-256 (1976)) gemessen. Dieses System wurde von Du- Pont-New England Nuclear bezogen. Das Reaktionsgemisch enthielt 1 ug mRNA, 2 mM Magnesiumacetat, 80 mM Kaliumacetat-Translationscocktail (2,5 mM Spermidin, 34,5 mg/ml Creatinphosphat, 26 mg/ml GTP in 250 mM HEPES Puffer) und 1 uCl [³H]-Leukin.

B. Ergebnisse

Hemmung der Synzytiumbildung

Die Auswirkung von MAP 30 auf die Infektiosität von HIV-1 wurde durch den quantitativen Mikrotiter-Infektionsitäts-Test gemessen. Dieses Test quantifiziert die akuten Zellen, die frei von HIV-1-Infektion sind, und basiert auf der Interaktion zwischen fusigenen virusinfizierten Zellen, die das HIV-Hüllen-Gen exprimieren, und nicht infizierten benachbarten Zellen, die CD4- Moleküle aufweisen. Die fokale Synzytiumbildung, die eine einzige infektiöse Virioneinheit darstellt, wurde am 5. Tag (120 Stunden) durch Untersuchung unter einem umgekehrten Mikroskop festgestellt. Die Ergebnisse von zwei unabhängigen Experimenten sind in Tabelle 1 und Fig. 4 zusammengefaßt. Eine 90 Minuten lange Vorinkubation der Indikatorzellen mit MAP 30 führte zu einer dosisabhängigen Hemmung von HIV-Infektion und Replikation. Bei 1,67 nM und 1670 nM bewirkte MAP 30 60% bzw. 86% Hemmung der Synzytiumbildung. Aus diesen Ergebnissen erhielt man eine ID&sub5;&sub0; von 0,83 nM. Bei den gleichen Konzentrationen bewirkte eine 15 Sekunden lange Vorbehandlung 23% bzw. 25% spezifischer Hemmung. Unter keiner dieser Bedingungen war eine zytotoxische oder zytostatische Wirkung auf die Indikatorzellen zu beobachten. Die fortgesetzte Anwesenheit von MAP 30 in der HIV-infizierten Zellkultur über 120 Stunden ergab bei allen getesteten Konzentrationen einen höheren Hemmeffekt, und zwar 61% und 79% Hemmung bei 1,67 nM und 16,7 nM. Eine vollkommene Eliminierung der Synzytiumbildung war bei 167 nM zu beobachten. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, daß MAP 30 die anfängliche Virusinfektion sowie die Weitergabe viraler Genprodukte durch Zellkontakte oder Freisetzung freier Virionen beeinträchtigt. Tabelle 1 Auswirkung von MAP 30 auf die HIV-Infektion, gemessen durch Synzytiumbildung im ICC-Test an HIV-infizierten CEM-SS-Zellen
Diese Ergebnisse werden als SFU (Synzytium-bildende Einheiten) pro Vertiefung als Prozent Kontrolle ausgedrückt. Jeder Testpunkt wurde doppelt ausgeführt. Duplikatvertiefungen mit Indikatorzellen, die MAP 30 in jeder Konzentration ohne Viruseinwirkung enthielten, wurden ebenfalls eingeschlossen, um die Zytotoxizität von MAP 30 zu bestimmen. Die Prozent ICC (infektiöser Zellkern) werden als Vn/Vo (Durchschnittszahl von Synzytien in mit MAP 30 behandelten Proben/Durchschnittszahl von Synzytien in unbehandelten Kontrollen) ausgedrückt; die Werte sind der Durchschnitt von zwei unabhängigen Experimenten. In der unbehandelten Kontrollgruppe (*) ist die Anzahl von Synzytien pro Vertiefung der Durchschnitt aus 101, 92, 96 und 87.

Hemmung der p24-Expression im viralen Kernprotein

Um die antivirale Aktivität von MAP 30 auf eine andere menschliche T-Zelle in einer Suspensionskultur zu untersuchen, wurde die p24-Expression des viralen Kernproteins und die mit dem Virus zusammenhängende RT- Aktivität in HIV-infizierten H9-Zellen untersucht. Die Expression von p24 wurde unter Einsatz von RIA bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 aufgeführt. In Gegenwart von 0,334 nM MAP 30, wurde die Expression von p24 auf 29% der unbehandelten Kontrolle verringert. Wenn die Konzentration von MAP 30 in der Kultur zunahm, stieg auch die Hemmung der p24-Expression. Eine nahezu vollständige Hemmung war bei 33,4 nM (1 ug/ml) zu beobachten. Diese Ergebnisse wurden auch als prozentuale Hemmung der p24-Produktion als Funktion der MAP-30- Konzentration wie in Fig. 5 gezeigt ausgedrückt. Die ID&sub5;&sub0; für die p24-Produktion betrug etwa 0,22 nM. Die verringerte Produktion von p24 war nicht auf zytotoxische oder zytostatische Auswirkungen zurückzuführen, und es war keine Abnahme in der zellulären DNA- oder Proteinsynthese bei diesen MAP 30-Konzentrationen zu beobachten.

Hemmung der mit dem Virus zusammenhängenden RT-Aktivität

Die RT-Aktivität wurde unter Verwendung von Poly(rA) p(dT)&sub1;&sub2;&submin;&sub1;&sub8; als Matrize-Primer und mit [³H] markiertem dTTP als Substrat gemessen. Die Ergebnisse sind als Polynucleotidinkorporierung von [³H]-Marker in cpm/ml ausgedrückt. Wie Tabelle 2 zeigt, war die HIV-RT-Aktivität in Zellen, die mit 0,334, 3,34, 33,4 bzw. 334 nM MAP 30 behandelt worden waren, auf 52, 25, 13 und 6% der Kontrollaktivität verringert. Diese Daten sind auch in Fig. 5 als % Hemmung der RT-Aktivität als Funktion der MAP 30 Konzentration gezeigt. Der Wert ID&sub5;&sub0; für die Aktivität ist wahrscheinlich auf einen Rückgang der Virionproduktion zurückzuführen, was sich auch anhand der zurückgegangenen p24-Expression zeigt. Tabelle 2 Auswirkung von MAP 30 auf die HIV-Replikation: p24-Expression und RT-Aktivität
Die p24-Expression und die virale RT-Aktivität wurden in HIV-infizierten H9-Zellen untersucht. Die MAP- Konzentrationen entsprechen 0,01, 0,1, 1 und 10 ug/ml. p24 und RT wurden in Kulturüberständen gemessen, die am 4. Tag geerntet wurden. Die aufgeführten Werte sind das Mittel von Doppelexperimenten. % C (% der Kontrolle) wird bezogen auf unbehandelte infizierte Kontrollen ausgedrückt. p24 wird als ng/ml und HIV-RT-Aktivität als cpm · 10³/ml ausgedrückt. Die Lebensfähigkeit der Zelle wurde mittels Ausschluß von Trypanblau-Farbstoff untersucht. Die Isotopinkorporierung zeigt ³H-Thymidin oder ³H-Leukin an.
Die Menge an erzeugtem p24 viralem Antigen wurde durch RIA gemessen und in ng/ml ausgedrückt. Die mit dem Virus zusammenhängende RT-Aktivität wurde durch Inkorporierung von [³H]-Tymidin in säureunlösliche Produkte unter Einsatz von Poly (rA)-p(dT)&sub1;&sub2;&submin;&sub1;&sub8; (Pharmacia) als Matrizenprimer untersucht. Die RT-Aktivität wurde als cpm · 10³/ml ausgedrückt. Die Auswirkung auf die zelluläre DNA- oder Proteinsynthese wurde durch Pulsmarkierung der Zellen mit 1 uCl (1 Ci = 37 GBq) [³H]-Thymidin oder [³H]-Leukin 8 Stunden vor der Ernte gemessen. Die Inkorporierung des markierten Vorläufers in durch TCA ausfällbare Produkte wurde durch Szintillationszählen bestimmt. Die Ergebnisse werden auf Zähler bereinigt, die man für Kontrollkulturen ohne MAP 30 erhielt. Kontroll-cpm: [³H]-Thymidin - 206.217, [³H]-Leukin - 62.439. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde durch den Ausschluß blauen Trypan-Farbstoffs bestimmt. Die angegebenen Werte sind die Durchschnittswerte von Duplikaten in zwei unabhängigen Experimenten. Fehler liegen innerhalb von 6%, was durch die Fehlerbalken in Fig. 5 angezeigt wird.

Hemmung der in vitro Translation eukaryontischer Zellen

Angesichts der Sequenzhomologie zwischen MAP 30 und diesen Ribosomen desaktivierenden Proteinen wurde die Auswirkung von MAP 30 auf die eukaryontische Translation in vitro in einem Kaninchen-Retikulozyten-Lysatsystem untersucht. Die Ergebnisse sind in Fig. 6 zu sehen. Die Auswirkung von MAP 30 auf die Proteinbiosynthese wird als Inkorporierung von mit [³H] markiertem Leukin in ein in TCA unlösliches Produkt ausgedrückt. MAP 30 zeigte eine dosisabhängige Hemmung der zellfreien Translation mit einer ID&sub5;&sub0; von 3,3 nM.

Beispiel 3

MAP 30 ist gegenüber intakten Zellen nicht toxisch

Untersuchungen auf Zytotoxizität

Um festzustellen, daß die Anti-HIV-Aktivität von MAP 30 virusspezifisch ist, wurde die Auswirkung von MAP 30 auf zelluläre DNA oder Proteinsynthese in nicht infizierten H9-Zellen bestimmt. Die Inkorporierung von [³H]-Thymidin oder [³H]-Leukin in durch Trichloressigsäure (TCA) ausfällbare DNA bzw. ein Protein wurde durch Pulsmarkierungselemente gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 aufgeführt. Von 0,334 bis 33,4 nM löste MAP 30 keine nachweisebare Wirkung auf die zelluläre Inkorporierung von markiertem Thymidin oder Leukin aus, während der Großteil der p24 und HIV-RT Produktion gehemmt wurde. Selbst bei 334 nM (im Bereich des 1000- fachen der ID&sub5;&sub0;) führte MAP 30 im Vergleich zu der praktisch nicht stattfindenden Hemmung der p24- und HIV-RT-Produktion in HIV-infizierten H9-Zellen nur zu 25% Rückgang in der Synthese von zellulärer DNA bzw. Protein. Ein therapeutischer Index von mindestens 1.000 war zu beobachten.

Beispiel 4

Antitumoraktivität von MAP 30

MAP 30 wird Tumorzellen in vitro zugesetzt oder wird in vivo zur Behandlung von Tieren mit Tumoren verwendet. Das Protein hat eine präferentielle Zytotoxizität für menschliche Leukämiezellen, weil es um mindestens das Zehnfache wirksamer bei der Zerstörung von Leukämiezellen ist als die normalen periphären Blutlymphozyten des Menschen. MAP zeigt bei Mäusen auch in vivo eine Antitumoraktivität. Beispielsweise ruft die Vorbehandlung von Tumorzellen (wie P388 oder L1210) mit MAP 30 Tage vor der intraperitonealen Implantation gefolgt von einer intraperitonealen Injektion von MAP 30 (in Dosen zwischen etwa 1 bis 100 ug) alle zwei Wochen einen signifikanten Antitumoreffekt hervor und verlängert die Lebensdauer der behandelten Tiere. Die zur in vivo Behandlung verwendeten Konzentrationen sind während des Behandlungszeitraumes nicht toxisch für die Mäuse.

Beispiel 5

MAP-30 Aminosäuresequenz mit endständigen N-Gruppen

Sequenzanalysen

Die MAP-30 Aminosäuresequenz wurde durch automatisierten Edman-Abbau unter Verwendung eines Proteinsequenzers von Biosystems, Modell 470A, mit einem Online-PTH- Analyzer bestimmt.

N-Terminus-Sequenz von MAP 30

Die Sequenz der ersten 44 Aminosäuren vom N-Terminus ist in Fig. 7 gezeigt. Hier sind die ersten Proteinsequenzdaten von der Pflanze Momordica charantia dargestellt. Eine Suche in der EMBL-Protein Datenbank und eine strukturelle Analyse der MAP 30-Sequenz zeigen eine Homologie mit den Aminosäuresequenzen mit endständigen N-Gruppen der Ricin A-Kette und von Trichosanthin. Die EMBL-Datenbank zeigt 34% Homologie zur Ricin-A-Kette und 57% Homologie zu Trichosanthin, wenn man sowohl identische als auch konservierte Reste betrachtet. Betrachtet man nur identische Reste, verringert sich die Homologie auf 35 bzw. 43%. Wie Ricin und Trichosanthin hemmt auch MAP 30 die in vitro Translation euraryontischer Zellen. Anders als diese Verbindungen ist MAP 30 gegenüber intakten normalen Zellen nicht toxisch.
Ricin ist ein Pflanzentoxin, das aus zwei durch eine Disulfidbrücke verbundenen Untereinheiten von 25 kDa (Kette A und B) besteht. Die B-Kette des Toxins bindet an die Oberfläche der eukaryontischen Zellen und ermöglicht den Eintritt der A-Kette. Die A-Kette ist die katalytische Untereinheit des Moleküls, die bei Initialisierung die Proteinsynthese in der Zelle hemmt. MAP 30 ist insofern eindeutig verschieden von Ricin, daß es sich um ein einkettiges Polypeptid handelt, und ist nicht toxisch gegenüber intakten Zellen.
Trichosanthin ist ein Pflanzenprotein von 26 kDa, das aus der Wurzelknolle von Trichosanthes isoliert wird. Dieses Protein wurde zur Einleitung von Abtreibungen und zur Behandlung throphoblastischer Tumore verwendet (R. Q. Qian et al., Acta Chem. Sinica 39: 927-931 (1981), Z. Gu et al., Acta Chem. Sinica 43: 943-945 (1984), I. F. Lan et al., Contraception 21: 77-86 (1980), K. F. Cheng, Obstet. Gynecol. 59: 494-498 (1982), W. Y. Chan et al., Contraception 29: 91-100 (1984)). Es hat sich auch gezeigt, daß es in vitro die Proteinsynthese hemmt (J. M. Maraganore et al., J. Biol. Chem. 262: 11628-11633 (1987)). Vor kurzer Zeit wurde berichtet, daß Trichosanthin, das als GLQ 223 bezeichnet wird, gegen HIV wirkt (M. S. McGrath et al., siehe oben). Wichtig ist auch, daß MAP 30 unter identischen Testbedingungen wesentlich weniger zytotoxisch ist als GLQ 223. Beispielsweise bewirkte GLQ 223 bei ID&sub9;&sub0; (Hemmdosis bei 90% Hemmung) der HIV-RT-Aktivität etwa 35 bzw. 40% Hemmung der Zellsynthese der DNA bzw. des Proteins, während MAP bei der gleichen Hemmdosis die Synthese dieser Makromoleküle nicht nachweisbar hemmte (Tabelle 2). Selbst beim Zehnfachen seiner ID&sub9;&sub0; bewirkte MAP 30 nur 25 bzw. 28% Hemmung auf die zelluläre Inkorporierung von [³H]-Thymidin bzw. [³H]-Leukin. Somit ist die Zytotoxizität von MAP 30 um mindestens eine Größenordnung geringer als die von GLQ 223. Die mit GLQ 223 einhergehenden zytotoxischen Effekte sind gut dokumentiert und haben verschiedentlich Bedenken bezüglich seiner klinischen Verwendbarkeit hervorgerufen. Die niedrige Zytotoxizität von MAP 30 in vitro deutet darauf hin, daß es einen viel besseren therapeutischen Index haben könnte.
Es gibt Berichte über die Isolierung verschiedener anderer bioaktiver Proteine aus Momordica charantia, von denen einige über Ribosomen desaktivierende Aktivität verfügen und andere die Tumorentwicklung bei Tieren oder die virale Replikation in einer Kultur hemmen können. Diese Proteine sind als Momordica charantia-Inhibitoren (MCI) bezeichnet worden und haben ein Molekulargewicht von 23 bis 24 kDa. Man kennt sie auch als Momorcharin α und β (MCA und MCB) mit Molekulargewichten von 32 bzw. 28 kDa. Für diese Proteine stehen keine Aminosäuresequenzdaten zur Verfügung, die einen Vergleich mit der Sequenz MAP 30 ermöglichen würden.

Beispiel 6

Molekulares Klonen von MAP 30

Poly-A&spplus;-mRNA wurde wie vorstehend beschrieben aus Momordica charantia hergestellt. Eine cDNA-Bibliothek wurde wie vorstehend beschrieben in Lambda gt11 konstruiert. Die Bibliothek wurde durch Plaquehybridisierung gescreent. Dazu verwendet man Oligonucleotidsonden, die von der N-Terminus-Aminosäuresequenz von MAP 30 abgeleitet waren. Diese Oligonucleotide wurden bereits vorstehend beschrieben. Mehrere positive Klone wurden identifiziert.
Die Klone werden nach Standardverfahren sequenziert (siehe vorstehend), um die Nucleotidsequenz des MAP 30- Gens und daraus die Aminosäuresequenz des MAP 30- Proteins zu bestimmen.
Das geklonte Gen wird in bakteriellen und eukaryontischen Zellen nach den vorstehend beschriebenen Verfahren exprimiert.

Beispiel 7

Konjugation von MAP 30 an Anti-HIV-Antikörper

MAP 30 wird unter Verwendung des heterobifunktionellen Reagenz, SPDP (N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat mit monoklonalen Humananti-gp41- und Humananti-gp120 Antikörpern verknüpft. Gereinigter Antikörper in mit Phosphat gepufferter Salzlösung wird 30 Minuten bei Raumtemperatur mit SDPD in einem 10 bis 15- fachen Molüberschuß behandelt, um 2-Pyridyldisulfidgruppen in das IgG-Molekül einzubringen. Das freie SPDP wird durch Dialyse entfernt. Dann wird die Probe bei 4ºC 16 Stunden mit MAP 30 (dreifacher Molüberschuß) vermischt. Dann wird das Konjugat durch Gelfiltration auf einer Sephacryl S-200 Säule von ungebundenem MAP 30 getrennt.
Der zytotoxische Effekt des Konjugats wird auf CEM, H9 bzw. U1-Zellen getestet. Wie sich zeigt, hat das Konjugat eine spezifische zytotoxische Aktivität für HIV- infizierte, aber nicht für nicht infizierte Zielzellen.
Das Konjugat wird dazu verwendet, eine Person mit einer HIV-Infektion oder AIDS durch Verabreichung wie vorstehend beschrieben zu behandeln.
Nachdem wir die Erfindung umfassend beschrieben haben, wird für Fachleute offensichtlich sein, daß diese über einen weiten Bereich äquivalenter Parameter, Konzentrationen und Bedingungen angewendet werden kann, ohne daß man von ihrem Rahmen oder der zugrundeliegenden Idee abweicht und ohne daß übermäßige Experimente erforderlich sind.
Diese Erfindung wurde zwar anhand spezifischer Ausführungsformen beschrieben, doch sie kann selbstverständlich weiter modifiziert werden. Diese Anmeldung deckt auch sämtliche Variationen, Anwendungen oder Adaptionen der Erfindung ab, die im allgemeinen ihren Prinzipien folgen, einschließlich solcher Abweichungen von der vorliegenden Offenbarung, die zur bekannten oder üblichen Praxis in der Technik gehören, auf die sich diese Erfindung bezieht, und die auf die vorstehend erläuterten und im Rahmen der Ansprüche liegenden wesentlichen Merkmale angewendet werden können.

Claims

1. Gereinigtes Protein, das sowohl Antitumor als auch Anti-HIV-Aktivität aufweist und die Aminosäuresequenz umfaßt:

Asp-Val-Asn-Phe-Asp-Leu-Ser-Thr-Ala-Thr-Ala-Lys-Thr-Tyr- Thr-Lys-Phe-Ile-Glu-Asp-Phe-Arg-Ala-Thr-Leu-Pro-Phe-Ser- His-Lys-Val-Try-Asp-Ile-Pro-Leu-Leu-Tyr-Ser-Thr-Ile-Ser- Asp-Pro.

2. Ein Protein gemäß Anspruch 1 mit einem Molekulargewicht von etwa 30 kD, ermittelt über SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese.

3. Derivat eines Proteins gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß

(i) das Derivat sowohl Anti-HIV- als auch Antitumor-Aktivität aufweist und

(ii) das Derivat ein Fragment des Proteins ist und mindestens die Aminosäuresequenz gemäß Anspruch 1 umfaßt oder

(iii) das Derivat eine Variante des Proteins oder des Fragments aus (ii) darstellt, in der eine Aminosäure insertiert, ersetzt oder entfernt wurde, oder

(iv) das Derivat ein chemisches Derivat des Proteins oder des Fragments aus (ii) ist, in dem eine oder mehrere Aminosäuren eine Modifikation aufweisen, die durch Umsetzen mit einem organischen Derivatisierungsmittel eingeführt wurde, welches mit ausgewählten Seitenketten oder endständigen Resten reagieren kann.

4. Protein gemäß Anspruch 1 oder 2, worin die in Anspruch 1 angegebene Sequenz die N-terminale Sequenz darstellt.

5. Verfahren zur Aufreinigung eines Proteins gemäß Anspruch 1 mit sowohl Antitumor- als auch Anti-HIV-Aktivität, erhältlich aus Frucht und Samen der Pflanze Momordica charantia, umfassend

(a) das Homogenisieren der Frucht oder des Samens zum Erhalt eines Homogenats;

(b) mindestens einmaliges Zentrifugieren des Homogenats und Wiedergewinnung des Überstandes und

(c) Fraktionieren des Überstandes und Gewinnung des Proteins.

6. DNS, codierend ein Protein oder ein Derivat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4.

7. DNS gemäß Anspruch 6, die eine genomische DNS oder ein cDNS-Molekül darstellt.

8. DNS gemäß Anspruch 6, bei der es sich um einen exprimierbaren Träger handelt.

9. Prokaryontische Zelle, enthaltend eine DNS gemäß einem der Ansprüche 6 bis 8.

10. Bakterienzelle gemäß Anspruch 9.

11. Eukaryontische Zelle, die ausgewählt ist unter einer Hefezelle oder einer Säugerzelle und eine DNS gemäß einem der Ansprüche 6 bis 8 enthält.

12. Pharmazeutische Zubereitung, umfassend ein Protein gemäß Anspruch 1, 2 oder 4 oder ein Derivat gemäß Anspruch 3 sowie einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.

13. Zubereitung gemäß Anspruch 12, welche weiterhin einen Wirkstoff enthält, der unter AZT, ddI, ddC, ddA, GLQ 223, löslichem CD4 und einer Mischung derselben ausgewählt ist.

14. Zubereitung gemäß Anspruch 12, welche zusätzlich GLQ 223 enthält.

15. Verwendung eines Proteins gemäß Anspruch 1, 2 oder 4 oder eines Derivates gemäß Anspruch 3 in der Herstellung eines Medikaments zur Tumorbehandlung.