KR960015747B1 - 양자리공의 항바이러스성 단백질(pap)을 발현하는 미생물 - Google Patents

양자리공의 항바이러스성 단백질(pap)을 발현하는 미생물 Download PDF

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Abstract

내용없음

Description

양자리공의 항바이러스성 단백질(PAP)을 발현하는 미생물
제1도는 본 발명의 PAP를 발현하는 벡터 pMJ12를 제조하기 위한 전략을 나타내는 모식도이다.
제2도는 본 발명의 pMJ12를 나타내는 전기영동 사진이다.
제3도는 pMJ12로 형질전환된 대장균 HB101의 생장곡선을 나타낸 그래프이다.
제4도는 발현벡터 pMJ12로 형질전환된 HB101로부터 분리한 단백질을 SDS-PAGE로 분리한 결과를 나타내는 사진이다.
제5도는 발현된 단백질을 항-PAP(anti-PAP) 항체를 이용하는 웨스턴 블롯(Western blot)을 수행한 결과를 나타내는 사진이다.
제6도는 순수분리한 PAP로 토끼 망상적혈구 용혈물(rabbit reticulo-cyte lysate)을 이용하여 시험관내번역(in vitro transla-tion)을 수행한 후, SDS-PAGE로 분리한 결과를 나타내는 사진이다.
본 발명은 항바이러스성 단백질의 발현벡터 및 이것으로 형질전환된 미생물에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 양자리공(Phytolacca americana L.)에서 발현되는 항바이러스성 단백질인 PAP(Phytolacca antiviral protein)를 암호화하고 있는 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터 및 이것으로 형질전환된 미생물에 관한 것이다.
자리공 및 분꽃 등의 중심자목을 중심으로 한 항바이러스성 식물 단백질에 대한 연구는 양자리공에서 PAP를 순수분리한 것을 시초로 하여 시작되었다[참조:Irvin, J.D., Arch. Biochem. Biophys., 169 : 522-528(1875)]. 그후 여러 식물에서 항바이러스성 단백질이 분리되었는데, 대표적인 것으로 리시누스 코뮤니스(Ricinus communis)에서 분리한 리신(ricin)(Halling, K.C. et al., Nucleic Acid Res., 13 : 8019-8033(1985)), 미라빌리스 잘라파(Mirabilis jalapa)에서 유래한 미라빌리스 항바이러스 단백질(MAP : Mirabilis anbtiviral protein)(Kataoka, J. et al., J. Biol. Chem., 266 : 8426-8430(1911)) 및 트리코산테스 키릴로위(Trichosanthes kirilowii)에 있는 α-트리코산틴(α-trichosanthin)(Zhang, X. et al., Nature, 321 : 477-478(1986)) 등이 그 예들이다. 이들 항바이러스성 단백질은 리보좀 비활성화 단백질(RIP : ribosome inactivating protein)의 일종으로 RNA N-글리코시다제 활성(N-glycosidase activity)이 있는 것으로 알려져 있다[참조 : Endo, Y. et al., J. Biol. Chem., 263 : 8735-8739(1988)].
양자리공에서 분리된 항바이러성 단백질인 PAP는 일반적인 PAP-I, PAP-Ⅱ 및 PAP-S의 3가지 유형으로 분류되는데, 이들은 계절적으로 또는 조직적으로 다르게 발현되는 것으로 알려져 있으며, 이들 상호간의 항혈청 반응이 서로 다르게 나타나는 것으로 보고되고 있다[참조 : Irvin, J.D. et al., Arch Biochem. Biophys., 200 : 418-425(1980)]. 아울러, MAP는 합성된 후 액포(vacuole)로 구획화(compartmentation)되는 반면, PAP는 합성된 후 세포질에 남아 있지 않고 세포벽 매트릭스(cell wall matrix)로 이동되는 것으로 밝혀졌다[참조 : Ready, M.P. et al., Proc. Nat1.Acad. Sci. USA., 83 : 5053-5056(1986)]. 양자리공의 리보좀도 PAP의 RNA N-글리코시다제 활성에 의해 탈퓨린화(depurination)되는 것으로 보고 있다.
한편, PAP와 CD4 또는 CD19에 대한 단세포군 항체(monoclonal antibody)와의 면역결합체(immunoconjugate)는 사람의 면역결핍 바이러스(immunodeficiency virus) 타잎 1의 복제(replication)를 억제하는 것으로 나타났으므로(Jansen, B. et al., Cancer Res., 52 : 406-412(1992) ; Kim, Y. W. et al., J. Immunol., 144 : 1257-1262(1990); Myers, D.E. et al., J. Immunol. Methods, 136 : 221-238(1991)), 인간 후천성 면역결핍증(AIDS) 치료에 사용되는 면역결합체 등의 제조에 응용할 수 있다는 가능성을 제시하였다.
최근에는 양자리공의 여름 잎으로부터 PAP cDNA의 염기서열이 밝혀졌으며(Lin, Q. et al., Plant Mol. Biol., 17 : 609-614(1991)), 게놈 라이브러리(genomic library)에서 분리한 PAP의 염기서열도 밝혀지는 등, PAP에 대한 분자 생물학적 연구가 활발하게 진행되고 있으며, 이에 따라 PAP에 대한 세포내에서의 정확한 분자수준에서의 작용기작과 이를 이용한 형질전환된 PAP의 제조 및 면역결합체에의 이용성에 많은 관심이 집중되고 있다.
이에 본 발명의 발명자들은 PAP의 대량 제조를 목적으로 재조합 PAP 발현벡터에 대하여 1992년 8월 19일자로 대한민국 특허출원 제92-14895호 『항바이러스성 단백질 발현벡터와 이것으로 형질전환된 식물체의 제조방법』로 출원한 바 있으며, 본 발명에서는 PAP의 발현벡터 및 형질전환 미생물을 제조하여 PAP를 실제로 형질전환된 미생물로부터 발현시켰다.
본 발명의 주된 목적은 양자리공의 cDNA 라이브러리로부터 순수분리한 PAP 유전자를 미생물 발현벡터에 삽입하여, 활성을 지닌 재조합 PAP를 미생물에서 발현시키는 벡터를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 전기 발현벡터로 형질전환된 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명을 보다 상세히 설명하면 다음과 같다.
순수분리한 PAP 유전자를 대장균(E. coli) 균주인 HB101에서 발현시키기 위하여 상업적으로 입수가능한 FLAGTM벡터를 이용한다. 순수분리한 PAP 유전자는 신호 펩타이드(signal peptide)를 지니고 있어 N-말단 프라이머(N-terminal primer)와 C-말단 프라이머(C-terminal primer)를 사용하여 열순환기(Thermal Cycler)를 이용하여 코딩 영역(coding region)을 합성한다. 증폭된 DNA를 전기용출(electroelution)하여 HindⅢ로 절단한 후, HindⅢ로 절단한 FLAGTM벡터와 함께 연결하여 발현벡터 pJMC12를 완성한다. 이 벡터는 1993년 6월 30일 국제기탁기관인 사단법인 한국종균협회 부설 미생물 보존센터(KCCM)에 기탁번호(KCCM 10037)로 기탁되었다.
이와 같이 제조된 발현벡터 pMJ12를 형질전환 능력을 지닌 대장균 HB101에 형질전환한 다음, pMJ12로 형질전환된 콜로니를 선별한다. PAP의 발현 유도는 앰피실린(ampicillin)이 함유된 LB 배지에서 세포를 배양하여 IPTG(isopropyl thiogalactoside)로 유도한다. 6시간 유도한 후 세포를 수확하여 인산완충용액으로 2회 세척하고 세포를 드라이 아이스-메탄올 욕조(dry ice-methanol bath)에서 얼리고 37℃에서 녹이는 과정을 반복하여, 세포를 파괴하고 원심분리하여 상등액을 취한다. 상등액을 10μl씩 취하여 SDS-PAGE를 수행한 후, 코마시에 브릴리언트 블루 R(Coomassie brilliant blue R)로 염색하여 발현된 PAP를 확인하고, 웨스턴 블롯을 수행한다. 재조합 PAP를 순수정제하기 위하여 상등액을 항-FLAG M1 친화성 컬럼(affinity column)에 로딩(loading)하여 재조합 PAP를 결합시키고 1.0mM CaCl2용액으로 용출하여 분리한다. 순수분리한 재조합 PAP의 활성은 시험관내 번역(in vitro translation)을 수행하여 합성된 단백질을 SDS-PAGE로 분리하여 검정한다.
이하, 실시예에 의하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.
이들 실시예는 오로지 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것이 아니라는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1
미생물 발현벡터 pMJ12 제조
순수분리한 PAP 유전자를 당업계에서 널리 알려지고 상업적으로 입수가능한 대장균(E. coli) HB101에서 발현시키기 위하여 FLAGTM벡터(International Biotechnologies Inc., U.S.A.)를 이용하였다. 이때, 사용한 프라이머(primer)는 N-말단 프라이머(N-terminal primer)로서 5'-CCAAGCTTGTGAATACAATCAAC-3'과, C-말단 프라이머(C-terminal primer)로서 5'-GGAAGCTTTGATCAGAATCCTTCAAA-3'를 DNA 합성기(Applied Biosystems Inc., U.S.A.)를 이용하여 합성하고, DNA 열순환기(Thermal Cycler)(Cetus/Perkin-Elmer, U.S.A.)를 사용하여 변성(denaturation)(95℃, 30초), 결합(annealing)(55℃,30초), 연장(extension)(72℃,30초)를 30회(cycle)순환시켜 VentTMDNA 중합효소(NEB, U.S.A.)로 PAP 유전자를 증폭시켰다. 증폭한 DNA를 전기용출하여 HindⅢ로 절단한 후, HindⅢ로 절단한 FLAGTM벡터와 함께 T4DNA 연결효소(ligase)로 연결하고, 제조된 미생물 발현벡터를 pMF12라고 명명하였다. 전술한 pMJ12의 제조과정은 제1도에 모식도로 나타내었다. 제1도에서 S는 SacⅠ; E는 EcoRI ; X는 XhoI ; 및 K는 KpnI의 제한효소를 각각 나타내며, (■)는 신호서열(signal sequence)을 나타낸다. pMJ12를 CaCl2용액으로 처리하여 형질전환 능력을 부여한 대장균 HB101에 형질전환시켰다. 그런 다음, 50㎍/ml 앰피실린이 함유된 LB 배지에서 생성된 콜로니로부터 알칼리 용혈(alkaline lysis) 방법으로 DNA를 분리하여 pMJ12로 형질전환된 콜로니를 선별하였다. 형질전환된 대장균 HB101은 1993년 6월 30일 국제기탁기관인 사단법인 한국종균협회 부설 미생물 보존센터(KCCM)에 기탁번호 KCCM 10037로 기탁하였다. 한편, 제2도는 제조된 pMJ2를 HindⅢ로 절단한 후, 0.8% 아가로즈 겔 전기영동을 수행한 사진이다. 제2도에서 M은 분자량 마커를 나타내는 레인으로 λ DNA를 HindⅢ로 절단한 것이며; pMJ12 레인은 본 발명의 완성된pMJ12벡터를 나타낸다. 제2도에서 보듯이, pMJ12 벡터는 약 0.8kb로 확인되었다.
실시예 2
pMJ12로 형질전환된 미생물의 생장 억제
리보좀 비활성화 단백질(RIP)의 일종인 리신(ricin)의 경우 미생물에서 발현시켰을때 숙주 미생물의 생장을 저해시키지 않는 반면, 미라빌리스 항바이러스 단백질(MAP)의 경우는 숙주 미생물의 생장을 억제시키는 것으로 알려져 있다. 재조합 PAP가 발현될때 전술한 리보좀 비활성화 단백질 활성의 존재여부를 숙주 미생물의 세포생장곡선을 통하여 간접적으로 학인하였다 : 50㎍/ml 앰피실린이 함유된 LB 액체배지에 HB 101, pFLAG로 형질전환된 HB101 및 pMJ12로 형질전환된 HB101을 각각 접종하여 하루밤 배양한 다음, 같은 양의 세포 농도를 0.7mM IPTG가 함유된 LB 액체배지에 다시 접종하여, 37℃에서 200rpm으로 진탕 배양하면서 매 30분마다 600nm에서 흡광도를 측정하여 각각의 세포농도를 측정하였다. 측정 결과 제3도에서 보는 바와 같이, HB101(△-△), pFLAG로 형질전환된 HB101(□-□)의 생장곡선은 정상적인 생장곡선 유형을 나타내었으나, pMJ12로 형질전환된 HB101(○-○)은 생장이 현저히 저하됨을 알 수 있었다. 따라서, 재조합 PAP가 리보좀 비활성화 단백질로서의 역할에 의해 HB101의 생장을 저해하는 것을 간접적으로 확인할 수 있었다.
실시예 3
발현벡터 pMJ12로 형질전환된 HB101로부터 재조합 PAP 단백질의 발현
50㎍/ml 앰피실린이 함유된 50ml LB 배지에서 세포를 배양하여, 세포농도가 OD600값이 1.0일 때 IPTG 농도가 0.75mM이 되도록 첨가하여 PAP의 발현을 유도하였다. 6시간 유도한 후 세포를 원심분리하여 수확한 다음; PBS 완충용액(0.01M NaH2PO4, 0.15M NaCl, pH 7.4)으로 2회 세척하고, 세포를 드라이 아이스-메탄올 욕조(dry ice-methanol bath)에서 얼리고 37℃에서 융해시켰다. 0.25mg/ml 라이소자임(lysozyme)이 함유된 PBS 완충용액(pH 8.4)에 세포를 현탁시킨 후, 다시 드라이 아이스-메탄올 욕조에서 얼리고 37℃에서 녹이는 과정을 3회 반복 수행하였다. 그런 다음, 10분 간격으로 흔들어 주면서 37℃에서 30분간 방치하고, 4℃에서 25,000×g 로 45분간 원심분리하여 상등액을 취하였다. 상등액을 10μl씩 취하여 15% SDS-PAGE를 수행한 후, 코마시에 브릴리언트 블루 R(Coomassie brilliant blue R)로 염색하였다. 이어서, 탈색 용액으로 탈색시켜 발현된 재조합 PAP를 확인하고, 실시예 5에 개시된 방법으로 웨스턴 블롯을 수행하였다.
실시예4
발현벡터pMJ12로 형질전환된 HB101로부터 재조합 PAP단밸질의 분리
본 발명의 발현벡터 pMJ12로 형질전환된 HB101로부터 재조합 PAP 단백질을 다음과 같은 방법으로 4℃의 저온상태에서 분리하였다: 실시예 3에 개시한 방법으로 전체 단백질을 분리하고 CaCl2용액의 최종 농도가 1.0mM되게 1M CaCl2용액을 첨가하였다. 항-FLAG(anti-FLAG) M1 친수성 겔 컬럼을 5ml 글리신-염산(pH 3.0) 용액으로 3번 및 5ml PBS 용액으로 3번 세척하고, 상기의 용액을 로딩하였다. 그런 다음, 12ml PBS/Ca 용액(1.0mM CaCl2용액이 함유된 PBS 완충용액)으로 다시 3번 세척하였다. 컬럼에 결합한 재조합 PAP는 1ml PBS/EDTA 용액(2.0mM EDTA가 함유된 PBS 완충용액)으로 30분간 정치한후, 용리액으로서 500μl PBS/EDTA 용액을 사용하여 10분 간격으로 분획 분리하였다. 10개의 분획용액을 SDS-PAGE 및 흡광도를 측정하여 분리한 재조합 PAP의 순도 및 양을 결정하였다. 제4도는 상기와 같은 방법으로 순수분리한 재조합 PAP의 SDS-PAGE를 수행한 결과를 나타내는 사진인데, 재조합 PAP가 순수하게 분리되었음을 알 수 있었다. 제4도에서 M은 저분자량(low-molecular size) 마커(Pharmacia, U.S.A.)를 나타내는 레인이며; 우측레인은 발현된 재조합 PAP를 나타낸다. 또한 실시예 5에 개시된 방밥으로 웨스턴 블롯을 수행한 결과, 하나의 단일 밴드를 거듭 확인할 수 있었다.
실시예 5
형질전환된 대장균 HB101로부터 재조합 PAP 단백질의 검정
HB101, pFLAG로 형질전환된 HB101 및 pMJ12로 형질전환된 HB101의 전체 단백질을 실시예 3에 개시된 방법으로 각각 분리하여 웨스턴 블롯을 수행하였다. 웨스턴 블롯은 SDS-PAGE를 수행하고 분획된 단백질을 하이본드-C 엑스트라(Hybond-C extra)(Amersham, U.K.)로 옮긴 후, 0.1% 트윈(Tween) 20과 2% BSA가 함유된 PBS 용액으로 블로킹(blocking)시켰다. 세척용 완충용액(0.1% 트윈 20을 함유한 PBS용액)로 5분간 2회 세척하고, 2㎍/ml 항-PAP 항체를 실온에서 1시간 처리하였다. 전기 세척용 완충용액으로 2회 세척한 후, 토끼 퍼옥시다제 보족 2차 항체(rabbit peroxidase-conjugated second antibody)를 실온에서 1시간 처리하고 세척한 다음, 4-클로로-1-나프톨(4-chloro-naphthol)로 발색시켰다. 발색시킨 결과 제5도에서 보는 바와 같이, pMJ12로 형질전환된 HB101(제3레인)에서만 단일 밴드가 확인되었고, HB101(제1레인) 및 pFLAG로 형질전환된 HB101(제2레인)에서는 밴드를 확인할 수 없었다.
실시예 6
재조합 PAP 단백질의 활성조사
순수 정제된 재조합 PAP 단백질이 합성을 저해하는 활성을 가지고 있는지의 여부를 알아보기 위하여, 토끼 망상적혈구 용혈 시스템(Promega, U.S.A.)을 이용하여 시험관내 번역을 수행하였다. 먼저 상기 실시예 4에 개시된 방법으로 재조합 PAP를 순수정제하고 스펙트라/포어 2막(Spectra/Por 2 Membrane)(Spectrum, U.S.A.)을 이용하여 물에 투석시킨 후 사용하였다. 35μl의 토끼 망상적혈구 용혈물, 1μl의 메티오닌이 함유되지 않은 1mM 아미노산 혼합물, 1μl의 35S-메티오닌(10mCi/ml), 40U의 RNasin(40U/μ1), 2μl의 루시퍼라아제(luciferase) RNA(0.5㎍/μl), 80pmol 재조합 PAP를 처리한 처리구 및 재조합 PAP 대신 물을 가한 대조구의 각 50μl의 반응액을 30℃에서 90분간 반응시켰다. 생성된 단백질을 15% SDS-PAGE를 사용하여 분획하고 겔 드라이어(gel dryer)로 건조시킨 후, X-레이 필름(X-ray film)으로 단백질 합성 정도를 검정하였다. 제6도에서 보는 바와 같이, 대조구(제1레인)에서는 62kDa의 루시퍼라아제 단백질 합성이 일어났으나, 재조합 PAP를 처리한 처리구(제2레인)에서는 전혀 단백질 합성이 이루어지지 않음을 알 수 있었다.
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명의 PAP 단백질 발현벡터를 이용하여 항바이러스성 단백질을 생성하고 발현되는 형질전환 미생물을 제조함으로써, 생물학적 활성을 지닌 항바이러스성 단백질을 보다 용이하게 생산할 수 있음을 물론, AIDS 등 치료에 사용되는 면역결합체 등의 제조에 사용할 수 있을 것이다.

Claims (4)

  1. 양자리공의 항바이러스성 단백질(PAP : Phytolacca antiviral protein) 유전자를 포함하는 재조합 벡터 pMJ12.
  2. 제1항의 재조합 벡터로 형질전환된 대장균(E. coli) HB101(KCCM-10037).
  3. 제1항의 재조합 벡터로 형질전환된 대장균 HB101(KCCM-10037)을 배양하여 분리, 정제함으로써, 양자리공의 재조합 항바이러스성 단백질을 제조하는 방법.
  4. 제3항의 방법에 의해 제조된 항바이러스성 단백질 재조합 PAP.
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