JP2001508032A - 殺虫剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ種（例えばＸ．ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ）からの細胞又は上清等の材料を単独で使用するか又はＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓもしくはこれに由来する殺虫性材料と併用して害虫に施用することを特徴とする害虫（例えば昆虫）の駆除方法。Ｘ．ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ又はその突然変異体の培養物から獲得可能であり、Ｐｉｅｒｉｓ ｂｒａｓｓｉｃａｅ、Ｐｉｅｒｉｓ ｒａｐａｅ及びＰｌｕｔｅｌｌａ ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａに対して経口殺虫活性をもち、５５℃まで実質的に熱安定性であり、タンパク性であり、経口殺虫剤としてＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ細胞と相乗作用し、トリプシン及びプロテイナーゼＫによるタンパク分解に実質的に耐性であることを特徴とする単離殺虫剤（及び該殺虫剤を含む組成物）も開示される。殺虫活性をコードするＤＮＡも開示される。

Description

【発明の詳細な説明】 殺虫剤 本発明は細菌、特にＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ種に由来する殺虫活性をもつ材料 、薬剤及び組成物に関する。本発明は更に、このような化合物及び組成物を利用 する生物及び方法にも関する。 例えば作物防御又は昆虫媒介病の防除用として殺虫活性をもつ材料、薬剤、組 成物及び生物は常に必要とされている。既存殺虫剤に対する耐性の問題を解決す るためには新規材料が必要である。このような材料は製造費用が安く、安定して おり、（単独使用又は併用時に）毒性が高く、害虫標的が経口摂取した場合に有 効であることが理想的である。従って、これらの性質の全てに優れた材料、薬剤 、組成物又は生物を提供するような発明がなされるならば、技術的前進となろう 。 Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ種は自然界で線虫宿主と共生していることが多く、こ の共生を利用して害虫活性を防除できることが知られている。例えば、Ｘｅｎｏ ｒｈａｂｄｕｓ種のうちには宿主の血液嚢に注入すると単独で昆虫宿主を死滅さ せるもの があることが知られている。 更に、Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓから１種の細胞外 殺昆虫毒素が単離されている（この種は最近Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ属から外さ れたが、この属内の種に密接に関連している）。この毒素は摂取した場合には有 効でないが、ある種の昆虫幼虫に注入すると極めて毒性である（Ｐａｒａｓｉｔ ｅｓ ａｎｄ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｏｆ Ｉｎｓｅｃｔｓ Ｖｏｌ．２，Ｂｅ ｃｋａｇｅ，Ｎ．Ｅ．ら編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９３参照）。 Ｐ．ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ及びＸ．ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓに由来し、静 脈内又は局所施用した場合に抗生物性をもつ所定の低分子量複素環化合物も知ら れている（Ｒｈｏｄｅｓ，Ｓ．Ｈ．ら，ＰＣＴ ＷＯ８４／０１７７５参照）。 しかしながら、これらの従来技術材料のうちで上記理想的殺虫特性をもつもの は皆無であり、特に、経口施用した場合に毒性活性が得られない。 本発明はＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ種に由来する殺虫剤及び組成物、このような 化合物及び組成物を産生する生物、並びにこれらの薬剤、組成物及び生物を利用 する方法を提供し、従来技 術の問題の一部を解消するものである。 本発明の１側面によると、Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ種からの細胞又は該種に由 来するかもしくは該種から獲得可能な殺虫性材料を害虫に経口施用することを特 徴とする昆虫害虫の駆除又は防除方法か開示される。 ＷＯ９５／００６４７として公開されたＣＳＩＲＯのＰＣＴ出願は、Ｘｅｎｏ ｒｈａｂｄｕｓ ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓに由来する毒性と思われるタンパク 質を開示しているが、このタンパク質の毒性の詳細は示されておらず、経口殺昆 虫剤としての使用が開示されていないことは明白である。 そこで、本発明は昆虫に経口施用するのに適しており、Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕ ｓ種から獲得可能な殺虫性材料、その殺虫性フラグメント、又はこれらのいずれ かの殺虫性変異体もしくは誘導体を含む殺昆虫組成物を提供する。 組成物は実際にＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ種の細胞を含むものでもよいし、ある いはＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ種の細胞培養物から抽出した上清を含むものでもよ い。但し、組成物は追って例示するようなＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓから単離可能 な毒素を含むものが好ましい。毒性活性は図２の塩基配列によりコード される材料に関連付けられている。従って、組成物は図２の塩基配列の全部又は 一部によりコードされる殺虫性材料を含むものが適切である。殺虫性フラグメン ト及びこのような毒素の変異体又は誘導体を使用してもよい。 図２の配列は４０ｋｂのオーダーの長さである。この配列は、各々単独又は一 緒に調節可能であるか又は殺昆虫性となり得る２種以上のタンパク質をコードす る場合もあると考えられる。どの部分が殺昆虫活性に必要又は十分であるかは慣 例通りに決定できる。 本明細書で使用する「変異体」なる用語は、活性は類似するが、アミノ酸配列 が改変された毒素を意味する。アミノ酸のうちには活性の種類をさほど変えずに 別のアミノ酸で置換できるものがある。置換は、あるアミノ酸を広義の類似性質 のアミノ酸に置換する「保存置換」でもよいし、非保存置換でもよい。但し、一 般に変異体は天然毒素と少なくとも６０％、適切には少なくとも７０％、より好 ましくは少なくとも９０％相同である。 「誘導体」なる用語は、例えば化学的又は生化学的方法により改変された毒素 を意味する。 これらの毒素は新規であり、これらの毒素と該毒素をコードする核酸は本発明 の別の側面を構成する。 好ましいＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ種は細菌Ｘ．ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓであ る。本発明の範囲で有用なＸ．ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓの特定株はＮａｔｉｏ ｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ａｎｄ Ｍａｒ ｉｎｅ Ｂａｃｔｅｒｉａ，Ａｂｅｒｄｅｅｎ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ（ＮＣＩＭＢ ）から入手可能なＡＴＴＣ１９０６１株である。また、１９９７年７月１０日付 けでＮＣＩＭＢに寄託された２種の新規Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ株（受託番号Ｎ ＣＴＭＢ４０８８６及びＮＣＩＭＢ４０８８７）も利用できる。これらの株も本 発明の別の側面を構成する。 全株は下表１に示すような共通特性をもつ。＊ＮＢＴＡ（０．００２５％ブロモチモールブルーと０．００４％塩化テトラゾ リウムを含有するＯｘｏｉｄ栄養寒天）。 害虫標的は昆虫が好ましく、より好ましくは鱗翅目、特にＰｉｅｒｉｓ ｂｒ ａｓｓｉｃａｅ、Ｐｉｅｒｉｓ ｒａｐａｅもしくはＰｌｕｔｅｌｌａ ｘｙｌ ｏｓｔｅｌｌａ又は双翅目、特にＣｕｌｅｘ ｑｕｉｎｑｕｅｆａｃｉａｔｕｓ である。 本発明の好ましい態様では、Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ種からの細胞又はこれに 由来する薬剤を経口殺虫剤としてＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓと併用する。 別の態様では、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ自体を使用せ ずに、Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓから獲得可能な殺虫性材料（例えばδ内 毒素又は他の単離物）をＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ種と併用する。 「〜から獲得可能」なる用語は、該当細菌から直接単離された材料のみならず 、その後、他の生物にクローニングされ、産生された材料も意味する。 従って、Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ属の細菌（及びこれに由来する材料）がこれ を摂取させた場合に殺虫活性をもち、このような細菌及び材料をＢ．ｔｈｕｒｉ ｎｇｉｅｎｓｉｓ（及びこれに由来する毒素又は材料）と有利に併用できるとい う予想外の発見は、本発明の別の側面の基礎となる。Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎ ｓｉｓ単離物単独の殺虫活性は十分に立証されている。しかし、このような単離 物とＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ種の細菌（又はこれに由来する材料）の相乗殺虫活 性は未だ立証されていない。 本発明の更に別の態様では、Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ種からの細胞の代わりに Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ種、特にＸ．ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓの培養物から抽 出した培養上清を上 記方法で使用する。 これらの全方法は特に害虫防除に使用することができる。 本発明によると、Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ種、好ましくはＸ．ｎｅｍａｔｏｐ ｈｉｌｕｓからの細胞とＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓを併有する殺虫組成物 も入手可能になる。上記方法と同様に、本発明の組成物ではＢ．ｔｈｕｒｉｎｇ ｉｅｎｓｉｓの代わりにＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓからの殺虫性毒素（好 ましくはδ内毒素）を使用してもよい。 同様に、Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ種からの細胞の代わりにＸｅｎｏｒｈａｂｄ ｕｓ種、好ましくはＸ．ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓの培養物から抽出した培養上 清を使用してもよい。 このような組成物は特に、例えば作物に噴霧することにより作物防御や、家畜 類防御に使用することができる。更に、本発明の組成物は媒介生物防除にも使用 することができる。 本発明は更に、Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ種から単離可能な新規殺虫剤にも関す る。このような殺虫剤の単離方法は当業者に自明である。 特に、このような方法では毒素タンパク質をタンパク質レベル又はＤＮＡレベ ルで分離及び同定する。 本願出願人は殺昆虫活性をコードするＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ ＮＣＩＭＢ４ ０８８７からのＤＮＡの領域をクローニングし、部分的に配列決定し、これを後 記図２（配列番号１）として示す。従って、好ましい態様では、本発明は配列番 号１のＤＮＡ又はその変異体もしくはフラグメントによりコードされる毒素も提 供する。 本発明はこのような毒素をコードする組換えＤＮＡも提供する。本発明の組換 えＤＮＡは図２の配列を含むものでもよいし、その変異体又はフラグメントを含 むものでもよい。遺伝暗号の縮重の結果として他のＤＮＡ配列が類似タンパク質 をコードする場合もある。本発明はこのような全配列を包含する。 本発明で提供する配列から、毒素遺伝子のＤＮＡを同定した後に抽出するため に使用可能なプローブを作製することができる。その後、当業者に自明のように このＤＮＡをベクター及び宿主細胞にクローニングすることができる。 図２の配列を含むか又はストリンジェント条件下でこの配列とハイブリダイズ するＤＮＡも本発明の別の側面を構成する。 「〜とハイブリダイズする」なる用語は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔ ｓｃｈ及びＭａｎｉａｔｉｓ著“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐ ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐ ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．に例示されているようなストリンジェントハ イブリダイゼーション条件下で塩基配列が図２の配列の全部又は一部とアニール することを意味する。 任意の特定解析法で使用される配列の長さはその方法の種類、配列の相補度、 配列の種類及び特にプローブ又はプライマーのＧＣ含量と使用する特定ハイブリ ダイゼーション条件に依存する。高ストリンジェンシー条件下では、完全に相補 的な配列しか結合しないが、低ストリンジェンシー条件下では、標的配列に６０ ％、より適切には８０％相同な配列が結合する。本明細書で使用する「ストリン ジェント条件」なる用語は高ストリンジェンシー条件と低ストリンジェンシー条 件の両者を含む。 図２のＤＮＡの適切なフラグメント、即ち殺虫剤をコードするフラグメントは 標準技術を使用して同定することができる。例えばＨ．Ｓ．Ｓｉｅｆｅｒｔら， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，（１９８６）８３，７３５− ７３９に記載されているように、例えばトランスポゾン突然変異誘発 法を使用することかできる。種々のトランスポゾンを使用してコスミドｃＨＲＩ ＭＩ等のベクターを突然変異させた後、殺昆虫活性の低下をスクリーニングすれ ばよい。こうして毒性活性に関与するタンパク質をコードするＤＮＡの領域を同 定することができる。 例えば、ｃＨＲＩＭＩ ＤＮＡを大腸菌ＲＤＰ１４６（ｐＬＢ１０１）にエレ クトロポレートしてこの株を大腸菌ＲＤＰ１４６（ｐＯＸ３８）、次いで大腸菌 ＮＳ２１１４Ｓｍと交配することにより、ミニトランスポゾンｍＴｎ３（ＨＩＳ ３）をｃＨＲＩＭ１等の毒性Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓクローン（以下、「クロー ン１」と呼ぶ）に導入すればよい。最終株はトランスボゾンｍＴｎ３（ＨＩＳ３ ）の単独挿入部位をもつｃＨＲＩＭ１ＤＮＡを含む。後記実施例８に記載するよ うに、これらのコロニーを培養し、殺昆虫活性を試験すればよい。制限マッピン グやＤＮＡシーケンシングを使用すると、ｍＴｎ３（ＨＩＳ３）の挿入点、従っ て毒性に関与するＤＮＡの領域を同定することができる。Ｔｎ５やｍＴｎ５等の 他のトランスポゾンでも同様のアプローチを使用できる。 Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＳａｍｂｒｏｏｋ著 “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ,Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕ ａｌ”，(１９８２)Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒに要約されているよ うなｃＨＲＩＭ１の部位特異的突然変異誘発を使用してもＤＮＡの特定領域の毒 性活性を試験することができる。 あるいは、サブクローニング法を使用して殺昆虫活性をコードするクローン化 ＤＮＡの領域を同定することもできる。この方法では、ＤＮＡの特定の小さいフ ラグメントをサブクローニングし、活性を測定する。このためには、コスミドＤ ＮＡを適切な制限酵素で切断し、ｐＵＣ１９等のプラスミドベクター上の適合可 能な制限部位に連結すればよい。連結混合物を大腸菌に形質転換し、抗生物質耐 性等の選択マーカーを使用してプラスミドベクター上でコードされる形質転換ク ローンを選択する。これらの技術の詳細は例えばＭａｎｉａｔｉｓら，前出（３ ９０〜３９１頁参照）や、Ｌ．Ｇ．Ｄａｖｉｅｓ，Ｍ．Ｄ．Ｄｉｂｎｅｒ及びＪ ．Ｆ．Ｂａｔｔｅｙ著Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏ ｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ（２２２〜２２４頁参照）に記載されている。 後記実施例８に記載するように、特定クローン化フラグメン トを含む個々のコロニーを培養し、活性を試験することができる。同一方法を使 用して殺昆虫活性をもつサブクローンを更に切断し、活性をコードするＤＮＡの 領域を更に同定することができる。 本発明は更に、Ｘ．ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ又はその変異体の培養物から獲 得可能であり、Ｐｉｅｒｉｓ ｂｒａｓｓｉｃａｅ、Ｐｉｅｒｉｓ ｒａｐａｅ 及びＰｌｕｔｅｌｌａ ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａに対して経口殺虫活性をもち、５ ５℃まて実質的に熱安定性であり、タンパク性であり、経口殺虫剤としてＢ．ｔ ｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ細胞と相乗作用し、トリプシン及びプロテイナーゼＫ によるタンパク分解に実質的に耐性であることを特徴とする単離殺虫剤も開示す る。 「５５℃まで実質的に熱安定性」とは、懸濁した薬剤を５５℃まで１０分間加 熱後に試験した場合に薬剤が所定の殺虫活性を維持し、好ましくは未処理活性の 少なくとも５０％を維持することを意味する。 「タンパク分解に実質的に耐性」とは、薬剤が３０℃で２時間プロテアーゼに 暴露した場合に所定の殺虫活性を維持し、好ましくは未処理活性の少なくとも５ ０％を維持することを意味 する。 「相乗作用」とは、成分の併用による活性が成分を個々に使用した場合に予想 されるよりも高いことを意味する。例えば、単独使用時に２５％死亡率を与える ために十分な濃度の薬剤と経口殺虫剤としてＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ細 胞を併用すると、単独使用時にＰ．ｂｒａｓｓｉｃａｅの５０％死亡率を与える ために必要なＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ細胞材料の濃度は少なくとも８０ ％低減する。 材料の活性は３０ｋＤａカットオフフィルターにより保持されるが、１００ｋ Ｄａフィルターでは一部しか保持されないことが判明した。 好ましくは、薬剤は２５℃でドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ−０．１％、６ ０分）及びアセトン（５０％、６０分）で処理することにより殺虫活性が失われ ることを更に特徴とする。 当然のことながら、上記単離薬剤の特性を利用してＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ種 細胞及び培養液上清からこの薬剤を精製したり、その濃度を高めることができる 。異種混合物からのタンパク質の精製方法は当該技術分野で周知である（例えば 硫安沈殿、タンパク分解、既知分子量カットオフフィルターに よる限外濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過等）。経口殺虫活性に 基づき、各段階後又は各溶離液試料中の薬剤濃度を簡便に定量することができる 。このような方法は当業者に容易に実施される。 本発明は更に、１種以上の上記薬剤を含む経口殺虫組成物も開示する。このよ うな組成物はＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ種以外からの他の殺虫性材料も含んでいる ことが好ましい。 これらの他の材料は上記薬剤と相補性をもつように又は相乗作用するように選 択する。 好ましくは、経口殺虫組成物は１種以上の上記殺虫剤とＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉ ｅｎｓｉｓ（又はこれに由来する毒素、好ましくは内毒素）を併有する。 前記タンパク質をコードする組換えＤＮＡも本発明の別の側面を構成する。当 業者に自明の通り、ＤＮＡはプロモーター、エンハンサー、シグナル配列等の適 切な調節因子の作用下に発現ベクターに組み込むことができる。これらの発現ベ クターも本発明の別の側面を構成する。これらの発現ベクターを使用すると、毒 素を産生するように宿主生物を形質転換させることができる。 本発明によると、上記殺虫剤をコードする塩基配列を含む宿主生物も入手可能 になる。 特性決定したタンパク質の配列を宿主生物にクローニングする方法は当該技術 分野で周知である。例えば、タンパク質を精製及び配列決定すればよいが、配列 決定に活性は不要であるので、ＳＤＳゲル電気泳動後にゲルのブロッティングを 使用するとタンパク質を精製できる。タンパク質配列を使用し、Ｘｅｎｏｒｈａ ｂｄｕｓ遺伝子ライブラリーから適切なゲノムフラグメントを同定するためにそ れ自体使用可能なヌクレオチドプローブを作製することができる。その後、タン パク質を発現することが可能な宿主生物に適切なベクターを介してこれらのフラ グメントを挿入すればよい。このような一般法は通常使用されており、当業者に 容易に実施できる。このような方法は、図２の配列によりコードされる以外のＸ ｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ毒素の生成にも適用できる。 物性又は毒性を最適化するようにその遺伝子配列（従ってタンパク質構造）を 改変することにより薬剤を操作（例えば突然変異）することが望ましい場合もあ る。 また、他の殺虫性タンパク材料（例えばＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ からのδ内毒素）をも発現するように宿主を操作又は選択することが望ましい場 合もある。また、薬剤の活性部分とこれらの他の毒性強化材料から構成される融 合タンパク質を発現する宿主生物を作製することが望ましい場合もある。 宿主は例えば薬剤をコードする遺伝子で形質転換したＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅ ｎｓｉｓを使用することにより、多量の精製用殺虫性材料を作製するように選択 してもよい。但し、害虫耐性の改善が望まれる植物を宿主とすることが好ましい 。利用可能な植物ベクターは当業者に周知であり、例えばＡｇｒｏｂａｃｔｅｒ ｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓからのＴｉプラスミドが挙げられる。あるいは 、例えば昆虫バキュロウイルスのように、害虫に直接病原性となるような宿主を 選択してもよい。 本発明の教示及び範囲はこれらの宿主生物と、該生物により発現される薬剤、 突然変異薬剤又は薬剤−融合材料の全てを包含する。 従って、本発明によると、工業的に利用可能な殺虫活性をもち、作物防御又は 昆虫媒介病防御の改善に特に適した方法、組成物、薬剤及び生物が入手可能にな る。 以下、非限定的な実施例と図面を参考に、本発明の方法、組成物及び薬剤を単 に例示として説明する。当業者には、以下の記載から本発明の範囲に該当する他 の態様も予想されよう。図面 図１は実施例３に記載するようなＸ．ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ ＡＴＣＣ１ ９０６１の増殖とＰ．ｂｒａｓｓｉｃａｅに対する細胞及び上清の活性の経時変 化を示す。 図２はＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓからのクローン化毒素遺伝子の主要部分の配列 を示す。 図３は２種のＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ株（上記クローン１及び下記クローン３ ）からのクローン化毒素遺伝子の制限地図の比較を示す。実施例 実施例１ −経口殺昆虫剤としてのＸ．ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ細胞の使用細胞増殖 ：Ｘ．ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓの継代培養物（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃ ｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ａｎｄ Ｍａｒｉｎｅ Ｂａｃｔｅｒｉａ,Ａｂｅｒｄｅｅｎ,Ｓｃｏｔｌａｎｄから入手可能なＡＴＣＣ １９０６１株９９６５） を使用し、１リットル当たりトリプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ及びＮａＣｌ ５ｇを含有するルリアブロス５０ｍｌを入れた２５０ｍｌ容三角フラスコに接種 した。フラスコを回転震盪器で４０時間２７℃で培養した。細胞懸濁液の調製 ：培養液を５０００ｘｇで１０分間遠心分離した。上清を捨て 、細胞ペレットを１回洗浄し、ｐＨ７．４の等容量のリン酸緩衝塩類溶液（１リ ットル当たりＮａＣｌ ８ｇ，Ｎａ₂ＨＰＯ₄ １．４４ｇ及びＫＨ₂ＰＯ₄ ０． ２４ｇ）に再懸濁した。細胞懸濁液の対昆虫活性 ：次のようにバイオアッセイを行った。Ｐ．ｂｒａｓｓｉｃａｅ ：（ＤａｖｉｄとＧａｒｄｉｎｅｒ（１９６５）Ｌｏｎ ｄｏｎ Ｎａｔｕｒｅ，２０７，８８２−８８３に記載されているような）人工 寒天飼料に細胞懸濁液の連続希釈液を加え、幼虫に与えた。バイオアッセイは各 用量につき幼虫最低２５匹として５用量を使用して実施した。未処理細胞と熱処 理（１０分間５５℃）細胞を試験した。温度を２５℃に維持して２及び４日後に 死亡率を記録した。 LC50細胞数/g飼料 処理 2日 4日 未処理 5.9ｘ10⁵ 9.8ｘ10⁴ 55℃処理 7.1ｘ10⁵ 1.4x10⁵ Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ ：細胞懸濁液を５種の異なる濃度で脱イオン水に希 釈し、この連続希釈液に幼虫を暴露した。９．５ｃｍプラスチックカップで５０ ｍｌ細胞懸濁液の希釈液毎に２用量を使用し、各用量につき第２齢幼虫２５匹と してバイオアッセイを実施した。未処理細胞と熱処理（１０分間５５℃又は８０ ℃）細胞を試験した。温度を２５℃に維持して２日後に死亡率を記録した。 LC50細胞数/ml 処理 2日 未処理 5.1ｘ10⁶ ５５℃処理 7.4ｘ10⁶ ８０℃処理 >10⁸ Ｃｕｌｅｘ ｑｕｉｎｑｕｅｆａｃｉａｔｕｓ :細胞４ｘ１０⁷個／ｍｌを含む単 一濃度細胞懸濁液に幼虫を暴露した。９．５ｃｍプラスチックカップで各カップ につき第２齢幼虫２５匹として５０ｍｌ細胞懸濁液２容量を使用してバイオアッ セイを実 施した。未処理細胞と熱処理（１０分間５５℃又は８０℃）細胞を試験した。温 度を２５℃に維持して２日後に死亡率を記録した。 ％死亡率 処理 2日 未処理 100 ５５℃処理 100 ８０℃処理 0 これらの結果から明らかなように、Ｘ．ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓからの細胞 は多数の昆虫種に対する経口殺昆虫剤として有効である（特にＰ．ｂｒａｓｓｉ ｃａｅに対して強力である）。殺昆虫活性は細胞生存率に依存しない（即ち細胞 生存率を＞９９．９９％低下させる５５℃までの加熱下でさほど変化しない）が 、大半のタンパク質が変性する温度である８０℃まで加熱すると活性は著しく低 下する。実施例２ −経口殺昆虫剤としてのＸ．ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ上清の使用細胞増殖 ：実施例１と同様に培養した。上清の調製 ：培養液を１０分間１００００ｘｇで２回遠心分離 した。細胞ペレットを捨てた。上清の対昆虫活性 ：次のようにバイオアッセイを行った。 細胞懸濁液の代わりに上清の連続未処理希釈液を使用した以外は実施例１のＰ ．ｂｒａｓｓｉｃａｅと同様に新生Ｐ．ｂｒａｓｓｉｃａｅと２日齢Ｐｉｅｒｉ ｓ ｒａｐａｅ及びＰｌｕｔｅｌｌａ ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ幼虫に対する活性 を測定し、４日後のみに死亡率を記録した。 ＬＣ５０（μｌ上清／ｇ飼料） 昆虫種 4日 Ｐ．ｂｒａｓｓｉｃａｅ 22 Ｐ．ｒａｐａｅ 79 Ｐ．ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ 135 更に、Ｘ．ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ上清を加えた人工飼料をＭａｍｅｓｔｒ ａ ｂｒａｓｓｉｃａｅ幼虫に与えた処、寸法減少活性（７日間で６２％減少） が検出された（結果は示さす）。 これらの結果から明らかなように、Ｘ．ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ培養液から の上清は多数の昆虫種に対する経口殺昆虫剤として有効であり、特にＰ．ｂｒａ ｓｓｉｃａｅに対して強力である。 上清を１０分間５５℃まで加熱すると、活性は部分的に低下したが、８０℃に すると活性は完全に失われた。ＳＤＳ（０．１％ｗ／ｖ、６０分）及びアセトン （５０％ｖ／ｖ、６０分）で処理した場合も活性は完全に失われたが、Ｔｒｉｔ ｏｎ Ｘ−１００（０．１％、６０分）、非飼料Ｐ４０（０．１％、６０分）、 ＮａＣｌ（１Ｍ、６０分）又は２週間４℃もしくは−２０℃の低温保存下では変 化しなかった。これらの全性質はタンパク質に一致する。 Ｘ．ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ細胞及び上清の一般作用方式即ち高用量で２日 以内の幼虫寸法減少と死滅及び他の性質（例えば耐熱性）も同様であると思われ 、単独薬剤又は単独種の薬剤が細胞及び上清の両者の経口殺昆虫活性に関与して いると考えられる。実施例３ −摂取性殺昆虫活性の出現の経時変化細胞増殖 ：Ｘ．ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓの一晩培養物１ｍｌを使用して三角フ ラスコに接種した。次いで、実施例１と同様に細胞を培養した。６００ｎｍの光 学密度を測定することにより増殖を推定した。細胞懸濁液及び上清の調製 :実施例１及び２と同様に調製した。細胞及び上清の対Ｐ．ｂｒａｓｓｉｃａｅ活性 ：ブロス５０μｌ／ｇ飼料に等価 の単一用量の懸濁細胞を使用し、２日後に死亡率を測定した以外は、実施例１と 同様に細胞葱濁液バイオアッセイを実施した。上清５０μｌ／ｇ飼料（即ちＬＣ ５０の>２倍）に等価の単一用量を使用し、２日後に死亡率を測定した以外は、 実施例２と同様に細胞上清バイオアッセイを実施した。 結果を図１に示す。これらの結果から明らかなように、Ｘ．ｎｅｍａｔｏｐｈ ｉｌｕｓ培養液から抽出した細胞は僅か５時間後にＰ．ｂｒａｓｓｉｃａｅに対 する経口殺昆虫剤として非常に有効であり、上清は２０時間後に非常に有効であ る。初期増殖段階に多少の細胞溶解が観察されたが、この点を過ぎると有意細胞 溶解は全く観察されなかったため、上清活性は（細胞分解後のみに放出されるも のではなく）真の細胞外物質に起因すると思われる。実施例４ −Ｘ．ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ細胞とＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉ ｓ粉末調製物の相乗作用細胞増殖及び懸濁 ：Ｘ．ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ細胞を実施例１と同様に増殖 及び懸濁した。Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ株ＨＤ１（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｒｅ，Ｔｈｅ Ｏｈｉｏ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｏｌ ｕｍｂｕｓ，Ｏｈｉｏ ４３２１０，ＵＳＡ）をＤｕｌｍａｇｅら（１９７０） Ｊ．Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ １５，１５−２０に記載 されているように培養し、回収し、粉末状にした。Ｘ．ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ細胞及びＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ粉末の 対Ｐ．ｂｒａｓｓｉｃａｅ活性 ：Ｘ．ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓとＢ．ｔｈｕｒ ｉｎｇｉｅｎｓｉｓを併用又はＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ細胞粉末を単独 で使用してバイオアッセイを実施した。バイオアッセイはＸ．ｎｅｍａｔｏｐｈ ｉｌｕｓの代わりにＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ粉末の種々の希釈液を使用 した以外は、実施例１と同様に実施した。併用実験では、更に２５％死亡率を与 えるために十分な一定用量のＸ．ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ細胞懸濁液を飼料に 加えた。２日後に死亡率を記録した。 LC50(μgBt粉末/g飼料) バイオアッセイ 2日 Ｂ．ｔ．単独 1.7 Ｂ．ｔ.＋Ｘ．ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ 0.09 これらの結果は、Ｐ．ｂｒａｓｓｉｃａｅに対する経口殺昆虫剤として作用す る場合のＸ．ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ細胞とＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ 粉末の相乗作用を明白に立証するものである。実施例５ −Ｘ．ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ上清とＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉ ｓ粉末の相乗作用細胞増殖及び上清の調製 ：Ｘ．ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ細胞を実施例２と同様 に増殖させ、上清を調製した。Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓを実施例４と同 様に増殖させ、処理した。Ｘ．ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ上清及びＢｔ細胞粉末の対Ｐ．ｂｒａｓｓｉｃａ ｅ活性 ：Ｘ．ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ上清とＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ を併用又はＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ粉末を単独で使用してバイオアッセ イを実施した。Ｘ．ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓの代わりにＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉ ｅｎｓｉｓの種々の希釈液を使用した以外は実施例２と同様に、新生Ｐ．ｂｒａ ｓｓｉｃａｅと２日齢Ｐｉｅｒｉｓｒａｐａｅ及びＰｌｕｔｅｌｌａ ｘｙｌｏ ｓｔｅｌｌａ幼虫に対するバイオアッセイを実施した。併用実験では、更に２５ ％死 亡率を与えるために十分な一定用量のＸ．ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ上清を飼料 に加えた。４日後に死亡率を記録した。 LC50(μgBt粉末/g飼料) 昆虫種 Ｂｔ単独 Ｂｔ＋Ｘｎ Ｐ．ｂｒａｓｓｉｃａｅ 1.4 0.12 Ｐ．ｒａｐａｅ 2.5 0.26 Ｐ．ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ 7.2 0.63 これらの結果は、数種の昆虫種に対する経口殺昆虫剤として作用する場合のＸ ．ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ上清とＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ粉末の相乗 作用を明白に立証している。Ｘ．ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ細胞及び上清の両者 がこの相乗作用を示すという事実は、単独薬剤又は単独種の薬剤が試験した活性 に関与していることを強く示唆するものである。実施例５ −Ｘ．ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ上清からの殺昆虫剤のタンパク分解に よる特性決定細胞増殖及び上清の調製 ：Ｘ．ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ細胞を実施例２と同様 に増殖させ、上清を調製した。上清のタンパク分解 ：培養上清（５０ｍｌ）を４℃で４８時間０．５Ｍ ＮａＣ ｌ（３ｘ１リットル）で透析した。ポリエチ レングリコール８０００（Ｓｉｇｍａ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）で覆い、透析管内 の上清の容量を５倍に減量した。試料を取り出し、０．１ｍｇプロテアーゼ／ｍ ｌ試料の濃度のトリプシン（Ｓｉｇｍａ Ｔ８２５３＝１０，０００ユニット／ ｍｇ）又はプロテイナーゼＫ（Ｓｉｇｍａ Ｐ０３９０＝１０ユニット／ｍｇ） で３０℃で２時間処理した。プロテアーゼで処理した上清の対Ｐ．ｂｒａｓｓｉｃａｅ活性 ：直径４．５ｃｍ のプラスチックポットで実施例１に記載した人工寒天飼料に各「処理物」２５μ ｌを塗沫することにより、新生Ｐ．ｂｒａｓｓｉｃａｅ幼虫に対するバイオアッ セイを実施した。各処理物毎に幼虫を１０匹ずつ入れたポット４個を使用した。 １及び２日後に死亡率を記録した。水のみ、トリプシン（０．１ｍｇ／ｍｌ）及 びプロテイナーゼＫ（０．１ｍｇ／ｍｌ）を使用した対照も同様に試験した。 ％死亡率 処理 1日 2日 未処理上清 60 100 プロテイナーゼＫ処理上清 45 100 トリプシン処理上清 40 100 全対照（上清なし） 0 0 実施例６ 他のＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓの殺昆虫活性 実施例１及び２の方法を使用して４種のＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ株を害虫に対 して試験した。得られた結果は以下の通りであった。 Ｉ）対Ｐｉｅｒｉｓ ｂｒａｓｓｉｃａｅ活性 全４株とも８０℃に１０分間加熱すると、細胞と上清の殺昆虫活性は＞９９％ 低下することが判明した。 ＩＩ）対蚊（Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ）活性 細胞１０⁷個／ｍｌ水の割合で細菌添加 更に、全株ともＨｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓの成長を有意に抑制 した。実施例７ Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ株からの毒素遺伝子のクローニング Ｑｕｉａｇｅｎゲノム精製ＤＮＡキットを使用してＮＣＩＭＢ４０８８７及び ＡＴＣＣ１９０６１から全細胞ＤＮＡを単離した。細胞をＬブロス（１リットル 当たりトリプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ及びＮａＣｌ ５ｇ）中２８℃で震盪 （１５０ｒｐｍ）しながら光学密度１．５Ａ₆₀₀まで増殖させた。培養物を４０ ００ｘｇで遠心分離して回収し、バッファーＢ１（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ，０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０，０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００，ｐＨ７ ．０）３．５ｍｌに再懸濁し、３０分間５０℃でインキュベートした。Ｑｕｉａ ｇｅｎ １００／Ｇチップを製造業者の指示通りに使用して細菌溶解液からＤＮ Ａを単離した。得られた精製ＤＮＡをＴＥバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，１ ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）中−２０℃で保存した。 制限酵素Ｓａｕ３ａで部分的に消化したＮＣＩＭＢ４０８８７及びＡＴＣＣ１ ９０６１の全ＤＮＡを使用して代表的ＤＮＡラ イブラリーを構築した。各株からのＤＮＡ約２０μｇを酵素０．２５ユニットと 共に３７℃でインキュベートした。１０、２０、３０、４５及び６０分間隔で試 料を取り出し、６５℃に１５分間加熱した。ＤＮＡフラグメントの寸法を可視化 するために、試料を０．５％ｗ／ｖアガロースゲルで電気泳動した。 ３０〜５０ｋｂフラグメントを最高の割合で含むＤＮＡ試料を集め、シュリン プアルカリホスファターゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）４ユニットで１５分間３７ ℃で処理した後、６５℃で熱処理し、ホスファターゼを不活化した。 寸法選択したＤＮＡフラグメントをコスミドベクターＳｕｐｅｒＣｏｓ！（Ｓ ｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＢａｍＨ１部位に連結し、Ｇｉｇａｐａｃｋ ＩＩパッ ケージングキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を製造業者の指示に従って使用して 大胴菌株ＸＬ Ｂｌｕｅ １にパッケージングした。 殺昆虫活性をもつコスミドクローンを選択するために、２５μｇ／ｍｌアンピ シリンを加えたＬ寒天プレート上で選択した各コロニーを（２５μｇ／ｍｌアン ピシリンを加えた）Ｌブロス中で２８℃で一晩増殖させた。ブロス培養液（５０ μｌ）を 実施例５に記載したように直径４．５ｃｍのポットに入れた昆虫飼料の表面に夫 々塗沫した。各容器に新生Ｐ．ｂｒａｓｓｉｃａｅ幼虫１０匹を加えた。２４、 ７２及び９６時間後に幼虫を試験し、死亡率と生存幼虫の寸法を記録した。試験 した合計２２０個のＮＣＩＭＢ４０８８７のクローンのうち、２個は７２時間以 内に幼虫成長の抑制と死亡を生じることが判明した。ＡＴＣＣ１９０６１からの クローン３７０個のうち、１個は７２時間以内に幼虫死を生じることが判明した 。実施例８ クローン化毒素遺伝子の対Ｐｉｅｒｉｓ ｂｒａｓｓｉｃａｅ活性 ２５μｇ／ｍｌアンピシリンを加えたＬブロス中、実施例７からの３種の活性 クローンを１５０ｒｐｍの回転震盪器で２４時間２８℃で増殖させた。実施例１ に記載したように、完全ブロス培養液を昆虫飼料に加えることにより、新生幼虫 に対する毒素クローンの活性を試験した。 ＊ＸＬ１ Ｂｌｕｅ 大腸菌ブロス 大腸菌毒素クローンを８０℃に１０分間加熱し、１００μｌ／ｇの割合で飼料 に加えた処、対幼虫活性は検出されなかった。毒素の熱感受性は顕著である。実施例９ ＮＣＩＭＢ４０８８７からのクローン化毒素のシーケンシング Ｗｉｚａｒｄ Ｐｌｕｓ ＳＶ ＤＮＡシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造業 者の指示に従って使用し、ＮＣＩＭＢ４０８８７からの上記殺昆虫性クローン１ のコスミドＤＮＡを精製した。一組の制限酵素ＥｃｏＲ１、ＢａｍＨ１、Ｈｉｎ ｄＩＩＩ、Ｓａｌ１及びＳａｃ１を使用して図３に示すようなクローン化フラグ メントの部分地図を得た。酵素ＥｃｏＲ１、ＢａｍＨ１、ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｅｃ ｏＲＶ及びＰｖｕＩＩを使用し、ｐＵＣ１８及びｐＵＣ１９にクローニングした コスミドのサブクローンからＤＮＡシーケンシングを開始した。精製コスミドＤ ＮＡ上でプライマーウォ ーキングアプローチを使用して配列ギャップを埋めた。ＡＢＩＰＲＩＳＭ（登録 商標）Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒ ｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ＫｉｔとＡｍｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラー ゼＦＳを製造業者の指示に従って使用して連鎖反応を実施した。製造業者の指示 に従ってＡＢＩ自動シーケンサーで試料を解析した。クローン化毒素フラグメン トのＤＮＡ配列の主要部分を図２に示す。実施例１０ クローン３からのクローン化毒素の制限地図 上記殺昆虫性クローン３のコスミドＤＮＡを実施例９に記載したように精製し た。制限酵素ＢａｍＨ１、ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｓａｌ１及びＳａｃ１を使用してク ローン化フラグメントの制限地図を得、これを図３に示す。クローン１からの地 図（図３）に比較すると、オーバーラップする領域にわたって制限地図は非常に よく似ていることが明白である。これらの２種のクローン間の唯一の検出可能な 相違は、クローン１の１１．４ｋｂ及び７．２ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩフラグメン トに対応するクローン３の２個のＨｉｎｄＩＩＩフラグメントの寸法が夫々約２ Ｋｂ及び２００ｂｐ小さいことであった。これらの結果は、２種の 細菌株で毒性をコードするＤＮＡ領域の総合関連性を示している。実施例１１ サザンブロットハイブリダイゼーション実験 クローン１からのＤＮＡの１０．３ｋｂ ＢａｍＨ１−Ｓａｌ１フラグメント をプローブとして使用し、Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ株ＡＴＣＣ１９０６１、ＮＣ ＩＭＢ４０８８６及びＮＣＩＭＢ４０８８７の総ＨｉｎｄＩＩＩ消化ＤＮＡにハ イブリダイズした。ハイブリダイゼーションは２０ｎｇ／ｍｌのＤＩＧ標識ＤＮ Ａプローブを使用して６５℃で１８時間実施した。免疫検出前にフィルターを５ 分間室温で２ｘＳＳＣ（０．３Ｍ ＮａＣｌ，３０ｍＭクエン酸ナトリウム，ｐ Ｈ７．０）／０．１％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウムで２回、１５分間６５ ℃で０．１ ｘ ＳＳＣ（１５ｍＭ ＮａＣｌ，１．５ｍＭクエン酸ナトリウム， ｐＨ７．０）＋０．１％ドデシル硫酸ナトリウムで２回洗浄した。非放射性ＤＩ Ｇ ＤＮＡ標識及び検出キット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を使用して、製造業者 の指示に従ってプローブを標識し、実験を行った。プローブは全３種の株の約８ ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩフラグメントと、ＮＣＩＭＢ４０８８７ の１１．４ｋｂフラグメントと、ＮＣＩＭＢ４０８８６及びＡＴＣＣ１９０６１ の約９ｋｂフラグメントにハイブリダイズした。これらの結果は、ＮＣＩＭＢ４ ０８８６及びＡＴＣＣ１９０６１株が上記クローン１の毒素遺伝子に高い相同度 をもつＤＮＡを含むことを示しており、３種の株により産生される毒素の類似性 を裏付けている。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】平成１０年１０月２日（１９９８．１０．２） 【補正内容】 Ｐ．ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ及びＸ.ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓに由来し、静 脈内又は局所施用した場合に抗生物性をもつ所定の低分子量複素環化合物も知ら れている（Ｒｈｏｄｅｓ，Ｓ．Ｈ．ら，ＰＣＴ ＷＯ８４／０１７７５参照）。 しかしながら、これらの従来技術材料のうちで上記理想的殺虫特性をもつもの は皆無であり、特に、経口施用した場合に毒性活性が得られない。 本発明はＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ種に由来する殺虫剤及び組成物、このような 化合物及び組成物を産生する生物、並びにこれらの薬剤、組成物及び生物を利用 する方法を提供し、従来技術の問題の一部を解消するものである。 本発明の１側面によると、Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ種からの細胞又は該種に由 来するかもしくは該種から獲得可能な殺虫性材料を害虫に経口施用することを特 徴とする昆虫害虫の駆除又は防除方法が開示される。 ＷＯ９５／００６４７として公開されたＣＳＩＲＯのＰＣＴ出願は、Ｘｅｎｏ ｒｈａｂｄｕｓ ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓに由来する毒性と思われるタンパク 質を開示しているが、このタンパク質の毒性の詳細は示されておらず、経口殺昆 虫剤とし ての使用が開示されていないことは明白である。 そこで、本発明は、 （ｉ）昆虫に経口施用するのに適しており、 （ｉｉ）Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ種から獲得可能なタンパク性殺虫性材料、その 殺虫性フラグメント、又はこれらのいずれかの殺虫性変異体もしくは誘導体を含 み、 経口施用した場合に各々毒性活性をもつ殺昆虫組成物を提供する。 組成物は実際にＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ種の細胞を含むものでもよいし、あるい はＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ種の細胞培養物から抽出した上清を含むものでもよい 。但し、組成物は追って例示するようなＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓから単離可能な 毒素を含むものが好ましい。請求の範囲 １．（ｉ）昆虫に経口施用するのに適しており、 （ｉｉ）Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ種から獲得可能なタンパク性殺虫性材料、その 殺虫性フラグメント、又はこれらのいずれかの殺虫性変異体もしくは誘導体を含 み、 経口施用した場合に各々毒性活性をもつ殺昆虫組成物。 ２．前記殺虫性材料が図２の塩基配列によりコードされる材料、その変異体もし くは誘導体、又は前記配列にハイブリダイズする配列を含む請求項１に記載の組 成物。 ３．Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓの細胞を含む請求項１又は２に記載の組成物。 ４．Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ種の細胞培養物から抽出した上清を含む請求項１か ら３のいずれか一項に記載の組成物。 ５．Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ種がＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ ｎｅｍａｔｏｐｈｉ ｌｕｓである請求項１から４のいずれか一項に記載の組成物。 ６．Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ種がＡＴＣＣ１９０６１、ＮＣＩＭＢ４０８８６又 はＮＣＩＭＢ４０８８７である請求項１から ４のいずれか一項に記載の組成物。 ７．Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓから獲得不能な別の殺虫性材料を含む請求項１から ６のいずれか一項に記載の組成物。 ８．前記別の殺虫性材料がＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓから獲得可能な材料 を含む請求項７に記載の組成物。 ２８．殺虫性毒性強化材料がＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓからのδ内毒素を 含む請求項２７に記載の宿主生物。 ２９．宿主が植物である請求項２５から２８のいずれか一項に記載の宿主生物。 ３０．宿主が昆虫病原性ウイルスである請求項２５から２８のいずれか一項に記 載の宿主生物。 ３１．請求項２７に記載の宿主生物により発現される融合タンパク質。 ３２．請求項１７から２０のいずれか一項に記載の１種以上の殺虫剤を含む殺虫 組成物。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ， ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，Ｎ Ｚ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ， ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 モーガン，ジエイムス・アラン・ウイン イギリス国、スウオンジー・エス・エイ・ ９・１・テイ・ピー、イストラジンレス、 ゴロフ・ロード、ペン―ワイ―ゴラフ・フ アーム（番地なし)

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．昆虫に経口施用するのに適しており、Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ種から獲得可 能な殺虫性材料、その殺虫性フラグメント、又はこれらのいずれかの殺虫性変異 体もしくは誘導体を含む殺昆虫組成物。 ２.前記殺虫性材料が図２の塩基配列によりコードされる材料、その変異体もし くは誘導体、又は前記配列にハイブリダイズする配列を含む請求項１に記載の組 成物。 ３．Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓの細胞を含む請求項１又は２に記載の組成物。 ４．Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ種の細胞培養物から抽出した上清を含む請求項１か ら３のいずれか一項に記載の組成物。 ５．Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ種がＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ ｎｅｍａｔｏｐｈｉ ｌｕｓである請求項１から４のいずれか一項に記載の組成物。 ６．Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ種がＡＴＣＣ１９０６１、ＮＣＩＭＢ４０８８６又 はＮＣＩＭＢ４０８８７である請求項１から４のいずれか一項に記載の組成物。 ７．Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓから獲得不能な別の殺虫性材料を含む請求項１から ６のいずれか一項に記載の組成物。 ８．前記別の殺虫性材料がＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓから獲得可能な材料 を含む請求項７に記載の組成物。 ９．Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの細胞を更に含む請求項８に記載の組成物 。 １０．Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓから獲得可能な殺虫性材料がδ内毒素を 含む請求項８に記載の組成物。 １１．農業上許容可能なキャリヤーを更に含む請求項１から１０のいずれか一項 に記載の組成物。 １２．キャリヤーが昆虫飼料物品を含む請求項１０に記載の組成物。 １３．請求項１から１２のいずれか一項に記載の組成物を害虫又はその環境に施 用することを特徴とする昆虫害虫の駆除又は防除方法。 １４．害虫が鱗翅目又は相翅目昆虫である請求項１２に記載の方法。 １５．Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ株ＮＣＩＭＢ４０８８６を含む微生物。 １６．Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ株ＮＣＩＭＢ４０８８７を含む微生物。 １７．配列番号１を含むＤＮＡ又はその変異体もしくはフラグメントによりコー ドされるタンパク質を含む毒素を含む殺虫剤。 １８．Ｘ．ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ又はその突然変異体の培養物から獲得可能 であり、Ｐｉｅｒｉｓ ｂｒａｓｓｉｃａｅ、Ｐｉｅｒｉｓ ｒａｐａｅ及びＰ ｌｕｔｅｌｌａ ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａに対して経口殺虫活性をもち、５５℃ま で実質的に熱安定性であり、タンパク性であり、経口殺虫剤としてＢ．ｔｈｕｒ ｉｎｇｉｅｎｓｉｓ細胞と相乗作用し、トリプシン及びプロテイナーゼＫによる タンパク分解に実質的に耐性であることを特徴とする単離殺虫剤。 １９．ドデシル硫酸ナトリウムもしくはアセトンで処理するか又は８０℃まで加 熱することにより殺虫活性が実質的に失われることを更に特徴とする請求項１８ に記載の単離殺虫剤。 ２０．細胞外タンパク質であることを更に特徴とする請求項１８又は１９に記載 の単離殺虫剤。 ２１．請求項１７から２０のいずれか一項に記載の殺虫剤をコードする組換えＤ ＮＡ。 ２２．図２の配列又はその変異体もしくはフラグメントを含む 請求項２１に記載の組換えＤＮＡ。 ２３．図２の配列の全部もしくは一部を含むか又はストリンジェント条件下で図 ２の配列の全部もしくは一部とハイブリダイズし、殺虫性材料をコードする組換 えＤＮＡ。 ２４．請求項２１から２３のいずれか一項に記載の組換えＤＮＡを含む発現ベク ター。 ２５．請求項２４に記載の発現ベクターで形質転換された宿主生物。 ２６．他の殺虫性タンパク性毒性強化材料も発現するように操作又は選択された 請求項２５に記載の宿主生物。 ２７．請求項１７から２０のいずれか一項に記載の殺虫剤の殺虫活性部分と、他 の殺虫性タンパク性毒性強化材料を併有する融合タンパク質をコードする塩基配 列を含む宿主生物。 ２８．殺虫性毒性強化材料がＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓからのδ内毒素を 含む請求項２７に記載の宿主生物。 ２９．宿主が植物である請求項２５から２８９のいずれか一項に記載の宿主生物 。 ３０．宿主が昆虫病原性ウイルスである請求項２５から２８のいずれか一項に記 載の宿主生物。 ３１．請求項２７に記載の宿主生物により発現される融合タンパク質。 ３２．請求項１７から２０のいずれか一項に記載の１種以上の殺虫剤を含む殺虫 組成物。