JP2609786B2 - 甲虫目昆虫の幼虫に対する殺虫性タンパク質、及びその殺虫性タンパク質をコードする新規dna - Google Patents
甲虫目昆虫の幼虫に対する殺虫性タンパク質、及びその殺虫性タンパク質をコードする新規dnaInfo
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Description
する殺虫性タンパク質、及びその殺虫性タンパク質をコ
ードする新規DNAに関する。
セロバー・ヤポネンシス属で知られている菌株は、鱗翅
目昆虫の幼虫に対する殺虫性タンパク質を産生するもの
が知られている。また、バチルス・チューリンゲンシス
・サンディエゴ、バチルス・チューリンゲンシス・テネ
ブリオニスの様に、ハムシの仲間、コロラドポテトビー
トルやゴミムシダマシの仲間チャイロコメノゴミムシダ
マシを殺すバチルス・チューリンゲンシス菌が知られて
いる〔例えば(Biotechnology 4, 305-308(1986);J. App
l. Ent. 104(1987),417-424) 参照〕。
属の菌株では鱗翅目昆虫の幼虫にたいする殺虫性タンパ
ク質以外の毒素タンパク質を産生するものが知られてい
なかったために、鱗翅目以外の他の昆虫に対する殺虫剤
には利用できなかった。また、バチルス・チューリンゲ
ンシス・サンディエゴ、バチルス・チューリンゲンシス
・テネブリオニスなどは、シバ、サトイモ、サツマイ
モ、ラッカセイ等の大害虫であるドウガネブイブイの幼
虫には殺虫効果がなく、結局、特にハムシ類、ゴミムシ
ダマシ類以外の甲虫目昆虫の幼虫に対する有効な殺虫性
タンパク質は、知られておらず、そのバイオ農薬を提供
するのが困難であった。そこで、本発明の目的は甲虫目
昆虫の幼虫に対する殺虫性タンパク質及びそのタンパク
質をコードするDNAを提供することにある。
基配列、及び、新規DNAによってコードされた殺虫性
タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号1に示されるも
のであり、前記DNAの塩基配列の一部を欠失させてな
る改変された変異体DNAの塩基配列、及び、その変異
体DNAによってコードされる変異体タンパク質のアミ
ノ酸配列は、配列番号2に示されるものである。
性タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有
するDNAを単離し、それを用いて宿主菌内で生産する
物である。即ち前記塩基配列を有するDNAをプラスミ
ドに組み込み、このプラスミドにより宿主菌を形質転換
し、形質転換菌を培養する事により殺虫性タンパク質を
生産する物である。コロニーハイブリダイゼーションに
より前記DNAの宿主内での増殖を、イムノアッセイに
より前記タンパク質の生産を、生物検定により殺虫活性
を、それぞれ調べる事により、生産されるタンパク質の
諸性質を調査し、DNA及びタンパク質を特定すること
ができる。
セロバー・ヤポネンシス・ストレイン・ブイブイ(Baci
llus thuringiensis serovar japonensis strain Buibu
i )(以下ブイブイ菌と略称する)によらず、前記殺虫
性タンパク質を、培養の容易な宿主において、生産出来
るようになった。尚、前記ブイブイ菌は、微工研条寄第
3465号(FERM BP−3465)として工業技
術院微生物工業技術研究所に寄託されている。
DNAは、その塩基配列の一部(配列番号1記載のアミ
ノ酸配列におけるN末端から第54番目のアミノ酸から
第709番目までのアミノ酸をコードする塩基配列以外
の部分)を欠失させる改変を行うことにより、変異体D
NAをつくることが出来る。その改変された変異体DN
Aは、単離し、前記変異体DNAをプラスミドに組み込
み、大腸菌等の宿主にクローニングして、発現させると
により、前記殺虫性タンパク質よりも分子量の小さな変
異体殺虫性タンパク質を生産することが可能になるもの
であり、かつ、この変異体DNAは、前記DNAよりも
分子量の小さいものであり、一般的に形質転換に用いる
DNAは、分子量が適当に小さい程、形質転換が容易で
あるので、より容易に、甲虫目昆虫に対する殺虫性をも
つタンパク質を、生産することが可能になった。然し、
709番目のアミノ酸より更にN末端側のアミノ酸を欠
失する事は可能であり、前記54〜709番目のアミノ
酸からなるタンパク質が最小活性単位である訳ではな
い。
酸配列をコードする塩基配列を有するDNAと、そのD
NAを改変してなる変異体DNAは、様々な宿主細胞に
組み込むことにより、殺虫性の微生物や、殺虫性の植物
を作ることが出来るものであり、且つ、前記DNA及び
変異体DNAの生産する殺虫性タンパク質は、様々な形
態で殺虫剤として用いることの出来るものである。結
局、従来の微生物農薬では殺すことの出来なかったドウ
ガネブイブイ等の甲虫目昆虫の幼虫を殺すことができる
ようになった。
性タンパク質を用いることにより、シバ、サトイモ、サ
ツマイモ、ラッカセイ等の植物から害虫を除虫する際
に、化学農薬を使用する場合に比し、人体に害を及ぼし
にくい、バイオ農薬を提供できるようになった。
記殺虫性タンパク質を生産することにより、その生産性
は向上し、さらに変異体DNA、及び変異体殺虫性タン
パク質を単離したことにより、尚一層前記変異体DNA
のクローニングのしやすさ、及び前記変異体殺虫性タン
パク質の生産性を高めることができた。
ノ酸配列をコードする塩基配列を含む全DNAを単離
し、そのDNAを制限酵素で切断してDNAを断片と
し、前記DNA断片をプラスミドに組み込み、このDN
A断片を組み込んだ組換えプラスミドを用いて大腸菌を
形質転換するいわゆるショットガンクローニングを行な
う。次に、形質転換された組換え体大腸菌により生産さ
れたDNAの内、殺虫性タンパク質をコードする塩基配
列を含んでいる大腸菌を、コロニーハイブリダイゼーシ
ョンで検査する。更に、コロニーハイブリダイゼーショ
ンに陽性のDNAを持つ大腸菌の生産するタンパク質
を、イムノアッセイにより検出する。更に、そのタンパ
ク質の殺虫活性を、生物検定により検査する。その後
に、前述のコロニーハイブリダイゼーション、イムノア
ッセイ、生物検定の全てに陽性であったDNAの塩基配
列を決定する事により、新規殺虫性タンパク質をコード
するDNAを特定し、このDNAを用いて前記タンパク
質を作る事が可能になった。尚、塩基配列の決定に際し
ては、最初に用いた制限酵素によるショットガンクロー
ニングでは、3'末端の一部が欠失した遺伝子が得られた
ため、制限酵素を変え、更に、完全長の塩基配列を読み
とるための操作を行った。また、上記DNAをエキソヌ
クレアーゼを用いて3'末端を欠失させる事により、変異
体DNAを合成し、更に前記変異体DNAを用いて変異
体殺虫性タンパク質を得た。
による組換えを容易にするためのカセット化DNAの合
成、形質転換植物の作成、殺虫製剤作成を、夫々行っ
た。
及び新規殺虫性タンパク質を、DNAのクローニング、
タンパク質のN末端の決定、コロニーハイブリダイゼー
ション、イムノアッセイ、生物検定、塩基配列の決定の
順で説明する。実施例2においては変異体DNA及び変
異体殺虫性タンパク質についての説明を行う。実施例3
においてはのカセット化DNAの合成、実施例4におい
ては形質転換植物の作成の説明を行う。さらに実施例5
においては実施例1〜4記載の微生物、DNA、及びタ
ンパク質を用いた殺虫製剤についての説明を行う。
虫性タンパク質 〈DNAの単離及び大腸菌JM109へのクローニン
グ〉 ブイブイ菌をNYS寒天培地〔例えば、(Biological co
ntrol 2 (1992) [Insecticidal spectrum of a novel i
solate of Bacillus thuringiensis serovar japonensi
s], Journal of Invertebrate Pathology (1992) [Proc
essing of delta endotoxin from Bacillus thuringien
sis subst.urstaki HD-1 and HD-73 bygut juices of v
arious insect larvae]) 参照〕に塗末して、30℃で
一晩培養し、単一コロニーをかきとり、ルリア液体培地
で30℃で一晩培養する。この時600nmに於ける菌
培養物の光学的吸収は約OD1.5〜0.7である。一
般の成書、例えば(A manual for genetic engeneerin
g: Advanced bacterial genetics eds R.W.Davis, D.Bo
tstein, J.R.Roth, 1980 Cold Spring Harbour Laborat
ories, MOlecular cloning 2nd ed Sambrook, J., Frit
sch,E.F., Maniatics, T.)等に記載の方法によりブイ
ブイ菌から全DNAを単離する
して、EcoRIDNA切断とし、予め発現プラスミドBlue
scriptIIKS(+)を制限酵素EcoRIで切断した切断部
位に、T4DNAリガーゼを用いて前記EcoRIDNA断
片を連結し、組み換えプラスミドとした。このようにし
て得られた組換えプラスミドのうち、約6.3kb付近
に泳動する物を、組換えプラスミドの候補として用いて
大腸菌JM109株を形質転換した。組換えプラスミド
によって形質転換を行なった前記大腸菌JM109株
は、常法に従いアンピシリン(50μg/ml)、IP
TG(イソプロピルチオガラクトピラノシド)、X−G
al(5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−D−
ガラクトピラノシド)を含んだルリアブロス固体平板培
地で一晩培養した、これらの大腸菌JM109株の内、
EcoRIDNA断片を含むものはガラクトシダーゼを生産
出来ないのでX−Galを代謝できず、白色コロニーを
生ずる。青変するコロニーは、EcoRI組み換えプラスミ
ドを持たないとして、白色のコロニーのみを、EcoRI組
み換えプラスミドを持った形質転換された組み換え体大
腸菌JM109のコロニーとして、およそ10,000
個得た。こうして得られた組み換え体大腸菌JM109
は、アンピシリン(50μg/ml)を含むルリア寒天
培地を用いてコロニーの直径が2−3mm位になるまで
37℃で培養した
ol vol.26 p485〜492(1991)〕記載の方法でブイブイ菌
培養物中から単離精製した。湿重量1gの殺虫性結晶体
をpH12の水酸化ナトリウム溶液で溶解し、50mM
トリス塩酸緩衝液でpH8に調整の後、pH8の50m
Mトリス塩酸緩衝液に対して透析する。可溶性画分を1
0,000xGの遠心分離により回収して、DEAE
(ジエチルアミノエチル)セファロースイオン交換体カ
ラムを用いて分離した。遠心分離した可溶性画分をカラ
ム(2cm直径x25cm長さ)に充填し、十分量の5
0mMトリス塩酸緩衝液(pH8.0)で洗浄した後、
200mlの50mMトリス塩酸緩衝液(pH8.0)
を用いて0〜0.7MのNaClの濃度勾配を作成し、
連続的にイオン交換カラムに吸着したタンパク質を溶出
した(図1)。これらを、更に再クロマトグラフィーで
精製した(図2)。上述の操作により、前記殺虫性タン
パク質は塩化ナトリウム濃度0.2M付近に溶出した
(図1のP2、及び図2Bに示す)。こうして得られた
前記殺虫性タンパク質をドデシル硫酸ナトリウム(SD
S)−ポリアクリルアミド電気泳動(PAGE)(SD
S1%)により分離し、ブロムフェノールブルーで染色
してPVDF膜に転写した。こうして得られた130k
Daのタンパク質部分を切りとり、ABI社製自動アミ
ノ酸配列決定機を用いて分析を行ったところ、前記殺虫
性タンパク質のアミノ酸配列のN末端は化1に示すよう
になっていることが判った。尚、SDS−PAGEの方
法はどこにでもある方法、例えば、Appl. Ent. Zool. 2
6 485-492 1991の方法などを用いる。PVDF膜への転
写はミリポア社のイモビロンを用いてABI、ミリポア
社などの奨める方法に従った。
の操作において明らかになったアミノ酸配列とブイブイ
菌に含まれることの多いコドンとを組み合わせて、化2
に示すような塩基配列を、コロニーハイブリダイゼーシ
ョンに用いるプローブとして合成した。尚、ベーリンガ
ーマンハイム社のDIGを、前記プローブに末端標識と
して付加した。尚DIGとはディゴキシゲニンの事で、
化学発光する物質でウリジンヌクレオチドとスペーサー
によって結合し、酸素反応を用いて合成したプライマー
の中に取り込むことができる。方法は、供給もとである
ベーリンガーマンハイムビオケミカ社の方法に従った。
菌JM109株は、そのコロニーをニトロセルロース膜
に転写した後、その転写された前記大腸菌を、常法によ
ってアルカリ可溶化し、そのアルカリ可溶化した前記大
腸菌と上述において合成したハイブリダイゼーション用
プローブとのハイブリダイゼーションを行った。検出
は、プローブによる化学発光を、X線フィルムに露光す
ることによって行った。その結果、前述の形質転換され
た組み換え体大腸菌コロニーのうち、5個がハイブリダ
イゼーションした。これら5株の大腸菌は、ショットガ
ンクローニングによってブイブイ且つの全DNAの一部
が組み込まれたものであるが、その組み込まれたDNA
に目的とするトキシン遺伝子が存在している可能性が高
い。
パク質結晶体を精製した(Goodman, N.S., R.J.Gottfri
ed and M.H.Rogoff (1967) J.Bacteriol. 94 485)。前
述のようにアルカリ溶液で可溶化し、抗原としてウサギ
に免疫して抗血清を作製した。大腸菌を磨砕し、遠心分
離の後、上清に回収される可溶性分画に含まれる全物質
を抗原として、前記のように作製した抗血清を吸収した
のち、イムノアッセイに用いる抗体とした。尚、抗血清
は、免疫グロブリンクラスまで精製し、パーオキシダー
ゼを結合した物を用いた。前述のコロニーハイブリダイ
ゼーション試験に陽性であった組み換え体大腸菌のコロ
ニーを、ニトロセルロース膜に写しとり、さらに、それ
を50μg/mlのアンピシリンを含むルリア寒天培地
上に置き、37℃で一晩培養した。さらに前記ニトロセ
ルロース膜をはがして転写された前記組み換え体大腸菌
を常法に従い、SDS及びアルカリ処理を行い溶菌、固
定を行った。次に前述の処理を行った大腸菌に対し、前
記イムノアッセイ用プローブを用いて抗原抗体反応を行
った。抗原抗体反応の検出は、抗体が酵素反応により生
産する色素によって行った。この結果コロニーハイブリ
ダイゼーションによって陽性であった5株の大腸菌は
皆、イムノアッセイでも陽性であり、タンパク質、特に
トキシンタンパク質を生産している可能性が確認され
た。プローブの検出は、コニカ社のイムノステインシス
テムを用いて行なったが、感度の良い物であれば、ビオ
チン等を用いた物でも全く同様に用いる事が出来る。
ニーを、ルリア液体培地で培養、集菌し、その組み換え
体大腸菌を乾燥腐葉土に混入して、一齢のドウガネブイ
ブイに与えた。前記集菌した大腸菌の混入及びその殺虫
性の評価の方法は以下のとおりである。 1.混入割合……幼虫一頭当たり、乾燥腐葉土1gに前
記大腸菌を含んだ懸濁液1mlを加える。大腸菌は50
ml三角フラスコで50μgのアンピシリンを含むL−
ブロス10mlで2日間培養し、菌を遠心回収の後5m
lの蒸留水に懸濁しそれを1ml用いた。この時回収さ
れる大腸菌は、湿重量0.3g前後である。 2.殺虫性の評価……前記組み換え大腸菌を混入した前
記乾燥腐葉土を入れたプラスチックカップに、一頭づつ
幼虫を入れて、所定時間飼育し、死亡幼虫数を全幼虫数
で除した値である死亡率により評価を行う。その結果、
ハイブリダイゼーション及びイムノアッセイで陽性であ
った5個の前記組み換え大腸菌コロニーのうち3個が殺
虫活性を示すことがわかった。
リ抽出してSDS−PAGE分析を行なった。泳動され
たタンパク質をニトロセルロース膜に写し取り、前述し
た大腸菌の可溶性画分に含まれる抗原性物質で吸収した
抗体を用いてウエスタンブロッティングを行なった。ハ
イブリダイゼーションしたタンパク質はおよそ130k
Daの辺に泳動していた。
び生物検定の全ての検査に陽性であった3個の大腸菌コ
ロニーを。ルリアブロス液体培地を用いて大量培養し
た。これらの大腸菌コロニーからそれぞれ組み換えプラ
スミドを分離し、EcoRI制限酵素で切断した後、この切
断されたプラスミドをアガロースゲル電気泳動で調べる
と、2本のDNAのバンドが検出できた。これらのう
ち、1本は開環状のBluescriptIISK(+)とそのサイ
ズが一致し、他方は、約3400bpで殺虫性タンパク
質をコードする塩基配列を含むDNAであると考えられ
るものであった。
型に蛍光標識したプライマーを合成し、前記合成プライ
マーをアニールし、常法に従いT7−DNAポリメラー
ゼ、及びダイデオキシNTPを用いるダイデオキシヌク
レオチド法により各種中間体を合成した。塩基配列の読
み取りは、ファルマシPLKB社製の自動読取装置を用
いた。この結果読み取ることのできた塩基配列は336
6塩基であった。しかし、前記3366塩基の配列の中
には、終止コドンが見出されなかったため、前記336
6塩基が目的とするDNAの全塩基配列を、含んでいな
いことがわかった。
制限酵素ClaIで切断して、ClaIDNA断片とし、この
ClaIDNA断片を、アガロースゲル電気泳動により分
離した。
とのできたEcoRIDNA断片をEcoRVで切断し、約1k
bのEcoRV断片としたものをサザン解析用プローブと
し、サザン解析を行った。(このサザン解析用プローブ
は、ブイブイ菌の遺伝子の中央よりやや5'末端側の部分
に相当する。)サザン解析を行ったところ、前記サザン
解析用プローブは、前述のアガロースゲル電気泳動によ
り分離したCla IDNA断片の約6.5kbのものとハ
イブリダイゼーションした。
リダイゼーションした部分をとり出し、予め発現プラス
ミドBluescriptIISK(+)を制限酵素ClaIで切断し
た切断部位に、前記ClaIDNA断片を連結してClaI組
み換えプラスミドを合成した。このClaI組み換えプラ
スミドを用いて大腸菌XLIブルーを形質転換する。こ
の形質転換された大腸菌XLIブルーは、常法に従って
培養した。この中からコロニーハイブリダイゼーショ
ン、イムノアッセイ、生物検定ともに陽性の株を選抜
し、前述の大腸菌JM109株を用いた場合と同様の方
法で、殺虫性タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩
基配列を含むClaIDNA断片の塩基配列を決定した。
殺虫性タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列
は、配列番号1記載のように3797塩基よるなる塩基
配列からなり、このうちオープンリーディングフレーム
(ORF)は1149アミノ酸をコードしていることが
わかった。また、前記塩基配列によりコードされるアミ
ノ酸配列も推定でき、推定分子量は129186である
ことがわかった。尚、この配列番号1記載の塩基配列を
含有する微生物およびプラスミドは平成4年7月13
日、微工研条寄第3929号で通産省工業技術院微生物
工業技術研究所に寄託した。
形質転換する方法は、カルシウム法としたが、常法にお
いて形質転換可能な方法を採用すれば良く、例えば、ハ
ナハン法、電気導入法等を用いることも可能である。
て大腸菌の形質転換を行ったが、他のプラスミドを用い
て行うこともできる。
109株としたが、宿主細菌は大腸菌に限らず、シュー
ドモナス等のグラム陰性菌、バチルス等のグラム陽性
菌、カビー酵母等の真核生物を用いることも出来る。ま
た、全塩基配列を読みとる方法は、制限酵素を用いたシ
ョットガン法に限られない。実際完全長でない遺伝子を
含んでいたEcoRI断片をPCR法によって3'末端側へ延
長して同じように全塩基配列を読む事もできる。例えば
以下のような読み方が出来る。実施例1において336
6塩基まで読んだEcoRIDNA断片の下流4700番目
近傍及び2037番目近傍にNdeI制限酵素認識サイトが
あるのが分かっているので、遺伝子をNdeIで切りだしそ
の断片の環状化を行った。NdeI制限酵素認識サイトから
3366番目の塩基までの間では、2746番目付近の
塩基配列にAccI制限酵素認識サイトがある事は分かって
いるので、自己環状化した遺伝子を、AccI制限酵素で切
断して開環した。こうして開環した直鎖状DNAの両末
端はAccI制限酵素認識サイトになっている。次に、この
AccI制限酵素認識サイト近傍の既知のDNA配列である
5末端から2974番目から3003番目までの30塩
基からなる塩基配列、及び、アンチセンス鎖のプライマ
ーとして2194番目から2165番目までの30塩基
をプライマーとして合成した(以下化3及び化4に示
す)。これらをプライマーにPCR法でDNA鎖を合成
する。その合成鎖の塩基配列を、常法に従いダイデオキ
シ法を用いて自動塩基配列読みとり装置で読む。結果、
この配列はAccI制限酵素認識サイトを含む形でAccI制限
酵素認識サイトの5'末端側と一部重複しながら、NdeI制
限酵素認識サイトまで至り、その途中に期待どおり終止
コドンが見出されたことにより、殺虫性タンパク質のア
ミノ酸配列をコードする全塩基配列が読めた。
殺虫製剤 ブイブイ菌を培養して結晶タンパク質を精製した。結晶
タンパク質を含む結晶体は該微生物が生産しコガネムシ
等の甲虫目昆虫の幼虫を殺虫する。この結晶をアルカリ
処理すると結晶タンパク質は溶解し、常法に従いSDS
−PAGE分析を行なう事が出来る。結晶タンパク質の
主要成分は、130kDaである。この可溶化したタン
パク質をイオン交換樹脂を用いて精製すると、二つの活
性成分が分離される。SDS−PAGE分析すると、分
子量は約130kDa及び65kDaであった。65k
Daのタンパク質の存在量は、130kDaに比べ少な
い。ふたつのタンパク質のN末端のアミノ酸分析をした
ところ、分析結果は130kDaタンパク質は配列番号
1に示した塩基配列から類推できるアミノ酸配列と一致
している。つまり130kDaの場合は全く修飾されず
に抽出された事を意味している。一方65kDaの配列
を同じく配列番号1に示した全アミノ酸配列と比較する
と、65kDaのN末端のアミノ酸配列は、130kD
aのアミノ酸配列の54番目から始まるアミノ酸配列と
一致している。したがって精製の過程或いは、可溶化の
際に130kDaのタンパク質がプロセスされて生じた
物と思える。これは殺虫活性を示し、ドウガネブイブイ
を殺虫した。両タンパク質は、DEAE等の陰イオン交
換樹脂に吸着して、NaCl等を用いてイオン強度を連
続的に或いは不連続的にあげていく事により容易に夾雑
物と分別する事ができる(図1、2参照)。このように
して精製した130或いは65kDaの精製タンパク質
は、殺虫製剤の有効成分として製剤化に用いる事ができ
る。施用の方法は対象植物の根の周辺に注入する、堆肥
と共に根の周辺に施肥する植物根の周辺の地際に散布す
るなどの方法をとれる。前記タンパク質は容易に環境中
で微生物により分解されるので、それを防ぐために種々
のポリマーでコーティングする事もできる。尚、前記殺
虫製剤は例えば甲虫目アオドウガネ(Anomala albopilo
sa)、サクラコガネ(Anomala daimiana)、コガネムシ
(Minela splendens)、マメコガネ(Popillia japonic
a )、セマダラコガネ(Blitopertha orientalis)、ヒ
メコガネ(Anomala rufocuprea Motschulsky)、チビサ
クラコガネ(Anomala schoenfeldti Ohaus)などの殺虫
に有効である。
ンパク質 実施例1において明らかになった殺虫性タンパク質は、
分子量約13万であり、甲虫目昆虫の幼虫の腸の中で酵
素分解によりプロセスされ、分子量約6万の毒素に変換
されるプロトキシンと呼ばれるものである。このような
機構は〔Microbiol. Rev. 53, 242-255 (1989)〕等に示
されるように、殺虫性タンパク質に共通にみられるもの
であり、前記殺虫性タンパク質のC末端側の約半分は、
殺虫性の活性には関与していないものと考えられてい
る。実際ブイブイ株の殺虫性タンパク質の場合も、図1
および図2に示したように130kDaから派生した6
5kDaの殺虫性タンパク質(図1のP1及び図2のか
を示す)も精製され、このものはドウガネブイブイの幼
虫に対して殺虫活性を示した(図2)。
ロバー・クルスタキー−HD-1のcryIA(a)遺伝子
を用いて欠失変異株を作った実験では、645番目のア
ミノ酸をもっている場合は活性があり、さらに645番
目から603番目までのアミノ酸をC−末端側から削っ
た場合は、活性を失うことが知られている〔(J.Biol.Ch
em. 260 6273-6280)参照〕。従って、大腸菌等の宿主細
胞を殺虫性タンパク質をコードするDNAを用いて形質
転換する場合は、実施例1により明らかになったDNA
をそのまま宿主細胞に形質転換しなくとも、そのDNA
を殺虫活性を失わないように欠失させることにより改変
を行って、変異体DNAをつくり、その変異体DNAを
用いて宿主細胞を形質転換することができる。
したDNAを用い前記DNAの3'末端をエキソヌクアー
ゼで分解削除して、DNAを5'末端から2300番以後
の塩基配列を削除して変異体DNAを作成し、前記変異
体DNAを、大腸菌を用いてクローニングした。前記変
異体DNAを組み込んで1日〜2日培養した組み換え大
腸菌を、蒸留水で洗浄の後、実施例1と同様の方法で生
物検定を行って殺虫活性を調べたところ前記変異体DN
Aによって生産される変異体殺虫性タンパク質に、殺虫
活性がみられることがわかった。
塩基配列および変異体タンパク質のアミノ酸配列を示
す。
65kDaの殺虫性タンパク質も結晶性タンパク質から
精製された。この精製された殺虫性タンパク質は、SD
S−PAGEに於いて単一のバンドを示した。この単一
のバンドを示した65kDaの殺虫性タンパク質を常法
に従ってPVDF膜に転写し、相当する部分を切りとり
ABI社製自動アミノ酸配列決定機によりN末端を決定
した。この65kDaの殺虫性タンパク質のN末端のア
ミノ酸配列は、実施例1で単離した分子量130kDa
の殺虫性タンパク質のN末端から54番目のアミノ酸か
ら始まるアミノ酸配列に等しく、配列番号1の配列に由
来している事は明らかである。また、前記分子量130
kDaの殺虫性タンパク質のN末端から53番目までの
アミノ酸および、705番目からC末端までのアミノ酸
が構成する部分は、殺虫性の発現に必ずしも必要でない
事が示された事になる。
バチルス等で発現するようにしたDNAのカセット化 大腸菌、シュードモナス、バチルス等には遺伝子工学上
あるいは農業、工業の実際上有益な種々の菌が含まれ
る。これらの菌で増殖し、発現するプラスミドに自由に
挿入する事のできるように、前述のトキシンDNAをカ
セット化する事が容易にできる。殺虫性タンパク質をコ
ードするDNAには、BamHIサイトが存在していないの
で、市販されている多くのプラスミドのマルチクローニ
ングサイトに存在するBamHIサイトを開始コドンATG
のすぐ上流に導入すれば、容易にBamHIサイトでトキシ
ンDNAを種々のプラスミドに導入する事ができる。ま
たそのプラスミドが大腸菌とシュードモナスの両方で、
或いはシュードモナスとバチルスの両方などで働くOR
Iをもち、カセットの両端が該微生物中で働くプロモー
タに結合し、且つ、翻訳を希望点で中止できる物とすれ
ば、ブイブイ菌の遺伝子を持ったシャトルベクター、或
いは、同時に発現ベクターを構築することができる。具
体的なカセット化DNAの合成法を以下に示す。DNA
合成機を用いて化5に示すオリゴヌクレオチドを合成す
る。これは、GGATCCというBamHI制限酵素認識サイト
に、ATGAGTCCAAATというブイブイ菌遺伝子の翻訳開始点
の最初の12塩基を連結した物である。前記オリゴヌク
レオチドは、PCR法でDNA鎖を合成する場合のセン
ス鎖のプライマーとして使用できる。一方アンチセンス
鎖のプライマーとしては、遺伝子のORF内の794番
目のAciIサイト、555番目のBclIサイトなどのOR
F内に1箇所だけにあるような制限酵素認識サイトを目
印にして、前記制限酵素認識サイトより少し3'末端側の
塩基配列を用いればよく、合成機でAciI制限酵素認識
サイトの3'末端側の塩基配列である化6に示される塩基
配列を、合成してアンチセンスプライマーとして用いる
ことができる。
Aが合成される。以下化7に、PCR法により合成され
た2本鎖DNAを示す。
限酵素AciIとを用いて2重分解することにより、BamH
Iサイトを5'末端に、AciIサイトを3'末端に持ったト
キシンDNAの断片を得る事ができる。以下に化7の2
本鎖DNAより作ったカセット化DNAを化8として示
す。
片をAciIサイトで切断し、PCR法で合成した化8記
載のDNA鎖をT4DNAリガーゼを用いて結合し、5'
末端にBamHIサイトを付加したトキシンDNAを得る。
次には全く同じ原理によって、適当な制限酸素サイトを
終結コドンのすぐ下流に挿入する。下流にいれる制限酵
素サイトは、例えばAccIII,BsaI、濃度NotI等のOR
F内に存在しないサイトが都合良い。例えばセンス鎖の
プライマーとしては、およそ790番近傍のAciIのす
ぐ上流の配列化9に示した物などがよい。
ンのすぐ5'側末端側の塩基配列であるAAG TGA---TAG に
AccIIIの認識サイトであるAGGCCTの配列を結合した化1
0に示す塩基配列を用いる。PCR法による合成の結
果、化11に示す2本鎖DNAが合成される。
ccIIIで2重分解し、サイトの開裂した化12に示すD
NA鎖を得る。
サイトBamHIを導入したトキシンDNAの断片とAciI
制限酵素認識サイトで連結する。このようにしてDNA
の両端に意図する制限酵素認識サイトを持ったDNAの
カセット化断片を合成できる。本実施例の場合は5'末端
にBamHI、3'末端にAccIIIの各サイトを持つトキシンD
NAが合成できる。市販のマルチクローニングサイトを
改良し、AccIIIの各サイトを持つトキシンDNAが合成
できる。市販のマルチクローニングサイトを改良し、Ac
cIII等他の目的にかなったサイトを導入する事は出来る
ので、ORF内にただ一つ存在するようなサイトでカセ
ット化する事も容易である。トキシンDNAの両端に制
限酵素サイトを持ったカセットとは、容易に様々なプラ
スミドに挿入する事ができる物であり、例えば、実施例
4に於いてDNAのカセット化断片は、約130kDa
の分子量の殺虫性タンパク質をコードする塩基配列を用
いて合成したが、実施例3に於いて合成した約65kD
aの分子量の殺虫性タンパク質をコードする塩基配列を
用いて合成しても良い。この場合、2300番近傍の制
限酵素に認識サイト、例えばMseI等はDNA内に多数
存在するので、煩雑な操作が必要になり、HindIII ,Bg
lI,HaeII等の制限酵素認識サイトを、切断末端につづ
く3'末端側に付加するとよい。シュードモナスで増殖す
るプラスミドで、バチルスで増殖するpBD9等のBamHIサ
イトに挿入できる。また、大腸菌での増殖にはプラスミ
ドとして、pBR322,pUC18等を用いる事ができる。このよ
うにして完全長の遺伝子、或いは活性を損なわない程度
に欠失する改変を行った遺伝子を含んだ大腸菌、シュー
ドモナス、バチルス等で発現可能なベクターを構築でき
る。用いるベクターは、大腸菌だけで増殖するという必
要はなく、大腸菌と、シュードモナス、大腸菌とバチル
スなどの複数の宿主において増殖するシャトルベクター
でもよい。つまり、各々の宿主に対応するORIを用い
て常法に従ってシャトルベクターを構築する事は十分に
できる。実施例3において、プライマーの塩基配列にAc
iIサイト近傍の塩基配列を用いたが、こうすることに
より、AciIサイトがORF内に1箇所しかないので切
断後の断片の特定が容易になり、またPCR法による合
成を行う場合に、確実に合成できる程良い長さであると
いう利点があるものの他の制限酵素認識サイトを選んで
も良く合成法もPCR法に限られるものではないが、挿
入するサイトはORF内に少ないもの、できれば一つし
かないサイトが良いといえる。
タンパク質を用いた殺虫製剤 形質転換微生物の生産するタンパク質は、コガネムシ類
の幼虫を殺虫する事が出来る。培養した培養物を、遠心
分離などを用いて分離回収し、洗浄の後製剤の有効成分
として用いることが出来る。製剤は、粉剤、液剤等形態
を問わない。また微生物が自己分解を起こす前に培養を
停止して、酢酸などの化学物質によって殺虫活性を損な
う事なく殺菌し、細菌内に殺虫性タンパク質を閉じ込め
た物を、製剤の有効成分として用いる事が出来る。これ
らの製剤の施用法は、対象植物の根の周辺に注入する、
堆肥と共に根の周辺に施肥する植物根の周辺の地際に散
布するなどの方法をとれる。
ムクロマトグラフィー
パク質の再クロマトグラフィー、(A)は65kDa、
(B)は130kDa
Claims (14)
- 【請求項1】 配列番号1に記載のアミノ酸配列を有す
る甲虫目昆虫の幼虫に対する殺虫性タンパク質。 - 【請求項2】 配列番号1に記載のアミノ酸配列を有す
る甲虫目昆虫の幼虫対する殺虫性タンパク質をコードす
る塩基配列を含むDNA。 - 【請求項3】 請求項2記載のDNAの持つ塩基配列を
有し、宿主細菌において発現するプラスミド。 - 【請求項4】 前記宿主細菌が、大腸菌、シュードモナ
ス、バチルス・チューリンゲンシス類の群の中から選ば
れたものである請求項3記載のプラスミド。 - 【請求項5】 請求項3記載のプラスミドを有し、前記
殺虫性タンパク質を生産する微生物。 - 【請求項6】 請求項1記載の殺虫性タンパク質を有効
成分とする殺虫剤。 - 【請求項7】 配列番号2に記載のアミノ酸配列を有す
る甲虫目昆虫の幼虫に対する変異体殺虫性タンパク質。 - 【請求項8】 配列番号1記載のアミノ酸配列におい
て、N末端から第53番までのアミノ酸及び、第705
番からC末端までのアミノ酸を欠失することによって改
変されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む変異
体DNA。 - 【請求項9】 請求項8記載の変異体DNAの塩基配列
を有し、宿主細菌において発現するプラスミド。 - 【請求項10】 前記宿主細菌が、大腸菌、シュードモ
ナス、バチルス・チューリンゲンシス類の群の中から選
ばれたものである請求項9記載のプラスミド。 - 【請求項11】 請求項9記載のプラスミドを有し、請
求項7記載の前記変異体殺虫性タンパク質を生産する微
生物。 - 【請求項12】 有効成分が、請求項11記載の微生物
が生産する変異体殺虫性タンパク質である殺虫剤。 - 【請求項13】 有効成分が、請求項11記載の微生物
を、前記変異体殺虫性タンパク質と共に含んだものであ
る殺虫剤。 - 【請求項14】 有効成分が、前記変異体殺虫性タンパ
ク質を含んだ状態の請求項11記載の微生物を死菌化し
たものである殺虫剤。
Priority Applications (1)
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---|---|---|---|
JP4213886A JP2609786B2 (ja) | 1992-08-11 | 1992-08-11 | 甲虫目昆虫の幼虫に対する殺虫性タンパク質、及びその殺虫性タンパク質をコードする新規dna |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP4213886A JP2609786B2 (ja) | 1992-08-11 | 1992-08-11 | 甲虫目昆虫の幼虫に対する殺虫性タンパク質、及びその殺虫性タンパク質をコードする新規dna |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0665292A JPH0665292A (ja) | 1994-03-08 |
JP2609786B2 true JP2609786B2 (ja) | 1997-05-14 |
Family
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Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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JP4213886A Expired - Lifetime JP2609786B2 (ja) | 1992-08-11 | 1992-08-11 | 甲虫目昆虫の幼虫に対する殺虫性タンパク質、及びその殺虫性タンパク質をコードする新規dna |
Country Status (1)
Country | Link |
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JP (1) | JP2609786B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5736514A (en) * | 1994-10-14 | 1998-04-07 | Nissan Chemical Industries, Ltd. | Bacillus strain and harmful organism controlling agents |
JP4608059B2 (ja) | 2000-08-03 | 2011-01-05 | 株式会社エス・ディー・エス バイオテック | 殺虫活性を有する蛋白質、その蛋白質をコードするdna、有害生物防除剤及び防除方法。 |
CN114891076B (zh) * | 2022-03-23 | 2023-05-12 | 中国农业科学院植物保护研究所 | 一种突变蛋白及其在防治草地贪夜蛾中的应用 |
-
1992
- 1992-08-11 JP JP4213886A patent/JP2609786B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
Title |
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APPL.ENT.ZOOL.26(4)P.485−492(1991) |
Also Published As
Publication number | Publication date |
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JPH0665292A (ja) | 1994-03-08 |
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