JP2620478B2 - 新規なバチルス・トリンジェンシス単離物 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、生物学的殺虫剤を産生する生物に係わる。
本発明は特に、幾つかの昆虫類に対して有効である細菌
バチルス・トリンジェンシス（Bacillus thuringiensi
s）新規な株と、この菌株の製造及び使用方法とに係わ
る。

発明の背景 殺虫剤は商業的農業で広範に利用され、作物の収量及
び品質の著しい向上を可能にしてきた。殺虫剤はまた、
害虫個体群がヒトや家畜にとってうるさかったり、その
健康を害したりする場合に、例えば蝿や蚊などの様々な
昆虫を防除するべく日常的に用いられる。しかし、或る
種の合成殺虫剤の使用に関連して、殺虫剤の食物連鎖内
での生態蓄積、もしくは標的でない生物に及ぼす悪影響
への懸念を含めた環境上の危険性が次第に明らかになっ
てきている。従って、生物学的殺虫剤、特に天然の生物
殺虫剤は、環境的に許容可能な害虫防除手段を模索する
物にとって非常に重要となった。

微生物B.thuringiensisが有害昆虫の防除に有用であ
る。ことは以前から知られている。胞子を形成するB.th
uringiensis細胞は一群の化合物を産生し、これらの化
合物は以前単一のδ内毒素と看做されていたが、今では
数種の異なる毒素タンパク質から成ると理解されてお
り、前記タンパク質は内生胞子中に見いだされる結晶性
タンパク質含有体中に濃縮される。上起含有体が感受性
を有する昆虫の幼虫によって摂取され、昆虫の消化管内
でタンパク質の分解が生起するとB.thuringiensisの内
毒素タンパク質は、消化管の上皮を破壊し、最終的には
害虫そのものを死亡させる活性化合物に変換される。

従って、B.thuringiensisのδ内毒素類は該微生物の
培養物の溶解物または他の発酵抽出物の形態で適応され
れば害虫剤として有用であることが明らかになった。上
記毒素類は様々なLepidoptera種その他の昆虫に対して
著しい活性を示す。しかし、B.thuringiensis製剤は、S
podoptera属及びPlutella属昆虫並びに他の様々な鱗翅
類害虫などの昆虫の撲滅において限られた価値しか有し
ないことが判明した。B.thuringiensis製剤の、このよ
うに或る一定の害虫種に対してしか発揮されない毒性、
即ち差別的毒性は、所与のB.thuringiensis変異体で発
現する内毒素遺伝子の種類が限られており、個々の毒素
は全体的な毒性プロフィールに対して予測不能な仕方で
しか寄与しないことに起因すると考えられる。

多くの研究者が、より広範囲の、または異なる範囲の
殺虫活性を有するB.thuringiensis株を同定すること
や、B.thuringiensisゲノムを操作して特性のδ内毒素
の発現を促進することを試みている。個々の単離物を毒
性に関してスクリーニングする努力が払われた結果、Kr
ieg等を1988年８月23日付米国特許第4,766,203号に開示
された、報告によれはColeopteraの撲滅に有効であるB.
thuringiensis ver.tenebrionisのような従来未知であ
った株が幾つか単離された。しかし、新規な殺虫活性を
有す株の同定に通常のスクリーニング操作を用いると、
天然に生じるB.thuringiensis変異体がきわめて多種で
あるため多大の時間及び労力が掛かる。

B.thuringiensisのδ内毒素をコードする遺伝子をク
ローニングしてB.thuringiensisゲノムを好ましく再構
成し、またはクローニングした遺伝子を発現のため新規
な微生物宿主に導入する別のアプローチも存在した。He
rrnstadt等の1988年９月13日付米国特許第4,771,131号
には、Pseudomonasなど他の微生物での発現に適すると
されるＭ−７毒素遺伝子をクローニングすること、及び
それによってColeoptera目の甲虫類を防除する能力を付
与することが開示されている。この方法はしかし、得ら
れた生物に、天然に生じた生物に施すより多くの調整的
精査を施すという欠点を有する。

従って、より広範囲の、または異なる範囲の殺虫活性
を示すB.thuringiensis株を同定する必要性は依然とし
て依存する。理想的には、そのような株は天然に生じる
変異体の中からランダムスクリーニング法を用いずに同
定される。

発明の概要 従って本発明は、従来耐性であったかまたは十分感受
性でなっかた昆虫類に対して向上した毒性を有する、B.
thuringiensisの新規な細菌単離物を包含する。この単
離物は、Plutella xylostella（コナガ）、Spodoptera
frugiperda［フォールアーミーウォーム（fall armywor
m）］及びSpodoptera exigua［ビートアーミーウォーム
（beet armyworm）］並びにtrichoplusia ni（イラクサ
キンウワバ）など幾種かの二次的害虫を非限定的に含
む、B.thuringiensisでの処理に耐性である幾つかの昆
虫種に対して用いられ得る。本発明の細菌単離物は、様
々なB.thuringiensis内毒素タンパク質をコードする遺
伝子の特性のサブセットを有すること、当該サブセット
に関連することが知られている特徴的なプラスミドプロ
フィールもしくはアレイ（array）とによって特徴付け
られ得る。

本発明は、上記のような細菌単離物を効率的に同定す
る方法も包含し、この方法では普遍的なヌクレオチドプ
ローブを用いて、特定の有害昆虫に対して何等かの毒性
を有することが既に知られている株において当該株の内
毒素遺伝子の存在を確認することができる。次に、上記
内毒素遺伝子を検出する遺伝子特異的なDNAプローブを
製造し、このプローブを用いてB.thuringiensis株に予
備スクリーニングを施して、対応する内毒素を合成し得
る一連の変異体を同定する。最後に、上述のように選別
した変異体に比較的通常のように行なわれる別のスクリ
ーニングを施すことによって、更に高いレベルの殺虫活
性を示す特定の変異体を得ることができる。

本発明は更に、本発明の遺伝子特異的なDNAプローブ
の製造に有用な、クローニングされたかまたは合成され
たヌクレオチド配列も包含する。この配列は所期の目的
遺伝子の配列分析によって、かつ所望の特異度に従って
決定される。普遍的な（即ち多種の内毒素遺伝子を認識
し得る）プローブが必要である場合は、B.thuringiensi
s毒素遺伝子の保存領域に基づくヌクレオチド配列が構
築され得る。あるいは他の場合には、様々な毒素遺伝子
に独特の配列を用いて高度に特異的なプローブが製造さ
れ得る。

本発明の細菌単離物の、有害昆虫の防除または撲滅へ
の使用、及び殺虫有効量の本発明の細菌単離物を許容可
能なキャリヤと共に含有する組成物も、本発明の範囲内
である。

図面の簡単な説明 本発明を、添付図面を参照しつつ説明する。添付図面
の第１図は、B.thuringiensis株ABTS 1857及び幾つかの
基準株に関する一連のプラスミドプロフィールを示して
いる。

発明の詳細な説明 本発明はまず、入手可能なB.thuringiensis変異体の
中から、B.thuringiensisのδ内毒素のタンパク質をコ
ードする遺伝子の選択されたサブセットに関する予備ス
クリーニングを含む操作によって選別されるB.thuringi
ensisの細菌単離物を開示する。本発明の単離物は特定
の昆虫種に対する差別的毒性を有し、従来B.thuringien
sis殺虫剤に対して耐性であるかまたは十分感受性でな
いと考えられた害虫類に対して毒性を有するB.thuringi
ensis変異体の単離物を含む。

本発明の単離物とは例えば、Spodoptera frugiperd
a、S.exigua、Plutella xylostella及びTrichoplusia n
iの中から選択された害虫に対して有効な株である。今
や、上記害虫種はcry I A（ａ）、cry I A（ｂ）、cry
I C及びcry I D遺伝子を発現し、かつ場合によってはcr
y I A（ｃ）遺伝子を欠失したB.thuringiensisの単離物
で防除され得ることが判明した。理論に拘泥するつもり
は無いが、このような遺伝子相補性（gene complemen
t）によって上記株の優れた殺虫活性が少なくとも部分
的に説明されると考えられる。そのうえ、上記遺伝子の
活性はこれらの遺伝子の細菌ゲノム内での組織化に関連
すると考えられる。例えば細菌プラスミドの電気泳動分
離によって容易に得られるプラスミドアレイもしくはプ
ロフィールは株の遺伝子構造の特徴を明らかにするうえ
で有用であり得、即ち本発明の細菌単離物を同定するも
う一つの手段として有用であり得る。B.thuringiensis
ABTS 1857から得られる代表的プラスミドプロフィール
を第１図に示す。

本発明の細菌単離物の好ましい一例は、本明細書中に
開示した新規な細菌単離物B.thuringiensis ABTS 1857
であり、この単離物は上述の遺伝子相補性を有し、市販
のB.thuringiensis株に比較してPlutella xylostellaに
対する改善された毒性を示す。亜種B.thuringiensis ai
zawaiに属するB.thuringiensis ABTS 1857はAmerican T
ype Culture Collection （Rockvill,Maryland）に、受
託番号SD−1372の下に寄託してある。第１のプラスミド
プロフィールに加えて、株ABTS 1857は本明細書中の実
施例４に記した生化学的特性、及び（米国農務省B.thur
ingiensis型株HD−11に同等の）鞭毛血清型Ｈ−７の提
示、並びに［熱−キュアリング（heat−curing）によっ
て明らかとなる］少なくとも三つの内毒素遺伝子保有プ
ラスミドの存在によっても同定され得る。

次に本発明は、上述の単離物の生物学的に純粋な培養
物を開示する。本明細書中に用いた“生物学的に純粋な
培養物”という語は、生物学的汚染を実質的に免れてい
る培養物で、該培養物から得られた異なる継代培養物が
実質的に同じ遺伝子型及び表現型を示すような遺伝学的
均一性を有する培養物を意味する。このような培養物は
大規模発酵において、あるいはまた周知の株操作技術の
ための出発物質として有用である。従って、本発明の単
離物に由来する突然変異体、組み換え体及び遺伝子操作
された変異体とその培養物とは本発明の範囲内に有ると
看做される。

本発明はまた、特定の標的害虫種に対して有効である
B.thuringiensisの株を単離する方法も開示する。この
方法は、その存在または不在が特定の標的害虫に対する
毒性の決定要因である内毒素タンパク質をコードする遺
伝子の組み合わせを同定する最初の段階と、入手可能な
B.thuringiensis株の中から前記内毒素遺伝子の組み合
わせを有する一連の変異体を予備スクリーニングするか
もしくは単離する次の段階と、前記一連の変異体をスク
リーニングして好ましい単離物を得る更に次の段階とを
含む。内毒素遺伝子の特定の組み合わせ、及び対応する
毒素複合体の、異なる標的害虫に対して差別的に毒性を
発揮する能力の同定は、或る毒素を合成する株の毒性を
合成しない株の毒性と比較することによって達成し得
る。必要であれば、所期の毒素の産生を実現し得る遺伝
子を熱−キュアリングなどによって選択的に除去し、得
られた株を毒性が向上したか低下したか試験することが
できる。

あるいは他の場合には、B.thuringiensisのδ内毒素
遺伝子の望ましい組み合わせは該組み合わせを構成する
全遺伝子とハイブリダイズ可能である普遍的なヌクレオ
チドプローブを用いて同定し得る。cry I A（ａ）、cry
I A（ｂ）、cry I A（ｃ）、cry I B、cry I C、cry I
D、cry I E、cry III A、cry III B、cry IV A、cry I
V B及びcry IV Cを含めた幾つかの毒素遺伝子が同定さ
れており、その配列の一部または全部が、例えばSchnep
f等によりJ.Biol.Chem.260,pp.6264−6272（1985）に公
表されている。これらの遺伝子の或る一定の領域が良好
に保存されて、B.thuringiensisの内毒素遺伝子全般を
認識するDNAプローブの製造を可能にすることが判明し
た。上記のような普遍的プローブは、所期の害虫種に対
して或る程度の毒性を有することが常套的なスクリーニ
ングによって明らかとなった株のゲノムとハイブリダイ
ズする場合、そのような株に存在する内毒素遺伝子を同
定し、かつその特徴を明らかにするのに用いることがで
きる。このような操作は、本発明の実施に有用であるそ
の他の操作同様、Maniatis et al.,Molecular Cloning,
A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory
（1982）などの参考文献中に見いだせる周知の技術を用
いて実行し得る。

B.thuringiensisに優れた毒性を付与すると考えられ
る遺伝子cry I A（ａ）、cry I A（ｂ）、cry I C及びc
ry I Dの同定に用いる普遍的プローブの一例に、配列 ATCGCAGAGAGATGACTCTAACTGTGTTAGATATCGTTCCTCTATTTC CAAATTATGACCG（配列番号:1） を含む新規なプローブが有る。上記のような配列は、文
献中に報告されている場合、標準的なポリヌクレオチド
合成操作を用いて製造し得る。あるいは他の場合には、
既知である所期の遺伝子から直接配列をクローニングし
得る。関連プローブを用いることも可能であり、例えば
上記配列の、δ内毒素と特異的にハイブリダイズするの
に十分な長さを有する断片も、本発明の普遍的DNAプロ
ーブとして用いるのに適している。本明細書中、ヌクレ
オチド配列は常に通常のように、即ち５′末端から３′
末端の方向に表記してあり、その際記号Ａはアデニン、
Ｇはグアニン、Ｃはシトシン、Ｔはチミンであることが
留意されるべきである。

内毒素遺伝子の特定の組み合わせを同定したら、本発
明の方法によれば、同定した遺伝子の組み合わせを確実
に有する、即ち対応する内毒素タンパク質の組み合わせ
を産生し得る一連のB.thuringiensis変異体を単離す
る。変異体の単離は、まず所望の各内毒素をコードする
各遺伝子の一部の非反復ヌクレオチド配列を決定し、次
いで前記配列とハイブリダイズし得る一連の遺伝子特異
的なヌクレオチドプローブを製造することによって達成
し得る。上記非反復配列はB.thuringiensisのδ内毒素
遺伝子の、きわめて変化しやすい（即ち保存されない）
とされている領域から得られる。先に述べた普遍的プロ
ーブの場合同様、遺伝子特異的なプローブの構築は場合
によっては、公表されているヌクレオチド配列を参照し
て行ない得る。しかし、配列データが入手できない場
合、または新規な内毒素遺伝子を同定した場合は所期の
遺伝子をクローニングするか、または対応するプローブ
配列のクローニングもしくは合成に有用な非反復配列の
同定が可能となるまで配列決定しなければならない。

本発明の方法の好ましい例で用いるような、B.thurin
giensisのδ内毒素遺伝子の同定に用い得る遺伝子特異
的なプローブは、cry I A（ａ）遺伝子を同定する配列 ACAATGCTGAGCCAAGCAGCTGGAGCAGTTTACACCTTGAGAGCT（配
列番号２） と、cry I A（ｂ）遺伝子を同定する配列 GACGGAGCCTATGAAAGCAATTCTTCTG（配列番号３） と、cry I A（ｃ）遺伝子を同定する配列 GCTACGTCATTAGATAATCTACAATCAAGTGATTTTGGTTATTTTGAA AGTGCCAATGCTTTTACATCTTCATTAGGTAATATAGTAGGTCTTAGA AATTTTAGTGGGACTGCAGGAGTG（配列番号４） と、cry I C遺伝子を同定する配列 GGATTTAGAGTTTGGGGGGGCACC（配列番号５） と、cry I D遺伝子を同定する配列 GCGCATACTCTTGCATCTGGTGCC（配列番号６） とを含むヌクレオチド配列から成り得る。これらの配列
を完全状態で用いるかまたは短縮し、延長し、もしくは
その内部に修飾を施すことによって、同定しようとする
内毒素遺伝子に対して所望程度のホモロジーと、対応す
るハイブリダイゼーション特異性とを有するプローブを
得ることができる。そのうえ、付加的な内毒素遺伝子及
び該遺伝子各個の非反復配列が既知となるにつれて、ま
たは既知遺伝子の或る種の遺伝子変異体が該変異体を有
するB.thuringiensis株に望ましい特性を付与すること
が判明した場合には、本発明の方法の実施から逸脱せず
に用い得る新たなプローブが派生的に得られることが予
期される。

上述の遺伝子特異的プローブは該プローブの結合の評
価を可能にする幾つかの通常方法のうちのいずれかにお
いて標識することができ、このように標識した遺伝子特
異性プローブは、B.thuringiensisの入手可能な株総て
を迅速かつ経済的に予備スクリーニングするのに用い得
る。前記予備スクリーニングは、レプリカプレート培養
法（replicaplating）、ハイブリダイゼーション、オー
トラジオグラフィー等のような公知技術を用いて行ない
得る。このようにして、求める遺伝子相補性を表わすハ
イブリダイゼーションパターンを示す一連の変異体を試
験株の中から容易に選別することができる。この点に関
して、本発明の方法は特定の内毒素遺伝子の存在に関す
る予備スクリーニングのみでなく、所望の毒性を抑制す
ること、または該毒性に対して顕著な影響を有しないこ
とが判明した他の内毒素遺伝子の不在に関する予備スク
リーニングも含み得ることが留意されるべきである。

本発明の単離方法は、上段ではB.thuringiensisのδ
内毒素遺伝子の同定及び予備スクリーニングと関連付け
て説明したが、毒素のDNA配列でないにもかかわらず差
別的毒性の決定に関与すると判明し得る他のDNA配列を
有する変異株の組の選別にも十分適していることが予期
される。例えば、産生される内毒素の量、または該毒素
の標的害虫に対する特異性に影響する調節遺伝子もしく
は不発現配列を同定するべきである場合、配列特異的な
ヌクレオチドプローブを製造しかつ使用して、天然に生
じたB.thuringiensis変異体をそのような配列の存在ま
たは不在に関して予備スクリーニングし得る。従って、
本明細書中に用いた“遺伝子”または“内毒素タンパク
質をコードする遺伝子”という語は内毒素として発現す
るDNA配列のみでなく、そのような発現を調節する配列
や、自ら発現する場合に当該配列を有するB.thuringien
sis株の毒性プロフィールを変化させる配列をも意味す
る。

予備スクリーニングによって選別した変異体の中から
好ましいB.thuringiensis株を、毒性に関する通常の、
ただし小規模のスクリーニングによって同定し得る。最
終的に選別した単離物はその後、収率改善の公知技術を
用いて、または株の突然変異体、組み換え体もしくは遺
伝子操作された誘導体の製造などにより株自体を操作す
ることによって、毒素産生に関し最適化することができ
る。株自体の操作には、例えば毒素結晶は生じるが胞子
は形成しないspo（無胞子性）突然変異体などである選
別単離物の好ましい表現語を実現させることも含まれ得
る。しかし、本発明の方法は繰り返し用いることも可能
であると理解され、また最終的な単離物は、特定の毒性
プロフィールの遺伝子的決定因子を同定し、適当な遺伝
子特異的または配列特異的プローブを構築し、かつこの
決定因子の存在に関してB.thuringiensis株全般を予備
スクリーニングする新しいサイクルの開始点として用い
ることができると理解される。

本発明は、本発明の細菌単離物または該単離物から得
られる内毒素を殺虫有効量で、許容可能なキャリヤと共
に含有する組成物も開示する。上述の方法により適当な
B.thuringiensis変異体を同定及び安定化した後、当業
界で標準的である倍地及び発酵技術を用いて大規模発酵
を実現し得る。次に、内毒素結晶を（該結晶と容易に分
離できない胞子と共に）発酵ブイヨンから分離して凍結
乾燥し得、または幾つか有る公知方法のいずれかにおい
て、濃縮液、葉の上や下に吹き付けるための乾燥粉末も
しくは水和性粉末または懸濁液、及び土壌に適用するた
めの粒状調整物などを含めた任意形態に調製し得る。本
明細書中に用いた“許容可能なキャリヤ”という後は、
組成物に望ましい貯蔵性、取り扱い特性及び施用特性を
付与する、その他の点では不活性は賦形剤や結合剤を意
味し、通常用いるキィリヤには、賦形剤、結合剤、界面
活性剤、分散剤、付着剤等が含まれ得る。本発明の組成
物の好ましい一例は、単離物B.thuringiensis ABTS 185
7またはその突然変異体、組み換え体もしくは遺伝子操
作された誘導体を含有する組成物である。

本発明は有害昆虫を防除する方法も開示し、この方法
は前記昆虫によって食害されている区域に本発明の細菌
単離物または該単離物から得られる内毒素を殺虫有効量
で適用することを含む。本明細書中に用いた“殺虫有効
量”という語は細菌単利物または内毒素の、例えば害虫
死亡率や作物被害の終止によって測定される、標的害虫
を実質的に撲滅し得る量を意味する。必要な細菌単離物
または内毒素の量には、施用方法、主な気象条件、即ち
温度、湿度、降雨量及び風など、害虫による食害の程
度、標的種の成長段階等を含めた多くの要素が影響す
る。防除するべき昆虫がSpodoptera frugiperda、S.exi
gua、Plutella xylostella及びTrichoplusia niなどの
害虫である場合、本発明の有害昆虫防除方法の好ましい
一例は、適用する活性物質がB.thuringiensis ABTS 185
7の細菌単離物または該単離物の突然変異体、組み換え
体もしくは遺伝子操作された誘導体である方法である。

本発明は、本発明を説明するだけで限定しないと看做
されるべきである以下の実施例との関連で更に良く理解
されよう。

実施例１ 一般的方法の説明 試料調製及び増殖条件 B.thuringiensis株の土壌からの単離を、６〜10種の
胞子形成バチルス、及び胞子を形成しない細菌、酵母及
び黴を含めた他の微生物よりもB.thuringiensis型バチ
ルスの出芽に適するように設計された操作を用いて実施
した。短い加熱処理（80℃で10分間）を用いて胞子を活
性化し、その後急いで試料をMyers and Youseten 1980
によるNSYM寒天培地上で継代培養した。

B.thuringiensis型バチルスのコロニーを、当該種に
典型的なコロニー形態及び増殖特性に基づいて選別し
た。また、顕微鏡検査を用いて、形態学的にも生化学的
にも区別不能な通常の土壌細菌であるBacillus cereus
からB.thuringiensisを区別する内毒素タンパク質結晶
の同定も行なった。

バイオアッセイで用いるB.thuringiensis単離物を、5
0mlのMedia 168（1lの脱イオン水中に18gの大豆粉と、
0.3gのMgSO₄・7H₂Oと、0.7gのK₂HPO₄と、0.5gのCaCO
₃と、1.0mlの１％FeSO₄・H₂Oと、1.0mlの１％ZnSO₄とが
存在；加圧滅菌済み；使用前に100ml当たり約2.5mlの滅
菌20％グルコース溶液を添加）を入れた250ml容の培養
フラスコ内で増殖させた。培養物を28℃で72時間、250r
pmで振盪しつつインキュベート、その後3ml試料を滅菌
済みの15ml容ポリプロピレン管に分け入れ、かつ−20℃
で凍結させて後の分析に備えた。

株の毒性の関するバイオアッセイ 細菌単離物の毒性を実験室内で、様々な量の細菌で処
理した昆虫用餌に害虫種の幼虫を暴露することによって
評価した。試験株及び基準細菌それぞれについて平行稀
釈液系列を調製し、その際（必要であれば最初に予備試
験を行なった後）濃度範囲を選択することにより、該系
列の中央店をそれぞれのLD₅₀に一致または近似させた。
温度60℃で液状に維持した通常の昆虫用餌（主に寒天、
大豆粉、固形栄養素及び補給ビタミン）の36mlアリコー
トに、脱イオン水標準液を含有する各稀釈液4mlを添加
した。混合後、処理済みの餌の各40ml試料を高温のまま
６個の１オンスプラスチックカップに分配し、餌が固化
し、かつその温度が室温となるまで少なくとも１時間冷
ました。

次に、所期の害虫種の、例えばS.frugiperdaであれば
孵化２日後の二齢幼虫２匹を上記各カップに注意深く入
れ、それによって前記幼虫に試料を食害させた。カップ
を個々に覆い、環境室（終日暗闇、28℃、相対湿度20〜
50％）内で64〜68時間インキュベートした。インキュベ
ーション後、生存幼虫及び死亡幼虫を計数し、結果を後
のLC₅₀分析に用いた。

DNAプローブ製造及びコロニーハイブリダイゼーション 本発明の方法で用いる普遍的及び遺伝子特異的DNAプ
ローブを、三カラムDNA自動合成機Applied Biosystems
380B（登録商標）において該装置に付属する標準的なβ
−シアノエタノールホスホアミダイド化学薬剤を用いて
所望のオリゴヌクレオチドを合成することにより製造し
た。得られたオリゴヌクレオチドを、γ−AT³²P（Amers
ham社）を用い、かつT4ポリヌクレオチドキナーゼ５′
未満を標識するMaxam及びGilbertの操作（1980）を用い
て末端標識した。

上記プローブとのハイブリダイゼーション用の細菌単
離物を、連続稀釈及びプレート培養の後に単独コロニー
を滅菌した爪楊枝で、液体LB培地（1l当たり5gのNaCl
と、10gのバクトトリプトンと、5gの酵母抽出物とを含
有）を入れた96ウェルのマイクロタイター皿内に配置
し、かつ28℃で少なくとも４時間インキュベートするこ
とによって製造した。96個の尖端を有する金属スタンプ
を用いて培養物アレイを、個体LB寒天プレート上に配置
した1.2μｍナイロンハイブリダイゼーション膜、及び
マスターバイオアッセイプレートに移すことにより多数
のレプリカを製造し、これを28℃で約16時間インキュベ
ートした。

次に、得られたコロニーを、TES緩衝液（30mMトリス
−HCl、50mM EDTA、50mM NaCl）を溶媒とした10mg/mlリ
ゾチーム溶液上でフィルターをコロニー側を上にして１
時間浮動させることによりプロトプラスト化した。プロ
トプラスト化後、フィルターを、まず過剰量の変性緩衝
液（0.5M NaOH、2.5M NaCl）中、次いで過剰量の中和緩
衝液（pH7.0の0.5Mトリス、3.0M NaCl）中で、いずれの
場合も途中１回緩衝液を交換しながら30分間ずつ穏やか
に振盪することにより洗浄した。フィルターを少しの間
自然乾燥させ、かつ少なくとも１時間80℃のオーブンに
入れた後、サザン法（1975）による予備ハイブリダイゼ
ーション及びハイブリダイゼーションを実施した。

ハイブリダイズしたフィルターを58℃のクエン酸塩緩
衝液（0.1％SDS w/v、30mMクエン酸ナトリウム、0.3M N
aCl;HClでpH7.0に調節）で１時間ずつ２回洗浄し、吸取
紙上で自然乾燥させた。次に、−70℃のフリーザー内で
上記フィルターにKodak X−Omat（登録商標）ARフィル
ムを、増感スクリーンを用いながら一晩露出し、その後
フィルムを現像及び分析することによってハイブリダイ
ゼーションを評価した。

実施例２ 好ましい内毒素の組み合わせの同定 ビートアーミーウォーム、フォールアーミーウォーム
及びコナガに対する毒性に関連するB.thuringiensisの
δ内毒素遺伝子を、次のように同定した。B.thuringien
sis HD−１変種に関してSpodopte exiguara 及びTricho
plusia niに対する可変の毒性を数回観察したところ、
サザンブロッティング法で決定され有る毒素遺伝子が欠
失するとSpodoptera死亡率が甚だしく低下することが判
明した。後にcry I A（ｂ）として同定した対応遺伝子
の欠失はサザンブロッティング分析によって確認した。
これとは別に、クローニングしたcry I A（ｂ）及びcry
I A（ｃ）遺伝子をEscherichia coliにおいて発現さ
せ、この菌から顆粒を単離して、上記害虫種に対してや
はり顕著な差別的毒性を示す抽出物を得た。同時にcry
I A（ｂ）遺伝子は毒性にとって重要であるが、cry I A
（ｃ）は全く不要かもしれないことも研究によって示唆
された。

次に、B.thuringiensis HD−１の誘導体株を熱−キュ
アリングによって製造し、この株から精製した結晶をS.
frugiperda及びT.niの幼虫に対する毒性に関して評価し
た。cry I A（ａ）及びcry I A（ｂ）遺伝子を有するが
cry I A（ｃ）が欠失している上記誘導体株は、S.frugi
perdaに対して実質的に改善された活性を示した。従っ
て、同等の遺伝子相補性を有する変異体を得るべくB.th
uringiensis土壌単離物をスクリーニングするのに、cry
I A（ａ）、cry I A（ｂ）及びcry I A（ｃ）に関して
遺伝子特異的なDNAプローブを製造して用いた。

上記のような変異体は約20種を同定し、それらの変異
体に、S.frugiperdaに対する活性に関してバイオアッセ
イを施した。記号ABTS 5803を付した一つの株が特に高
活性であると判明し、この株は上記種に対して基準株HD
−１の２倍の毒性を示した。そこで株ABTS 5803を、こ
の時点で既知であるB.thuringiensis内毒素遺伝子の保
存領域に基づいて形成した普遍的DNAプローブでの処理
によって分析したところ、サザン法分析の採用により、
該株がcry I A（ａ）及びcry I A（ｂ）に加えて新たに
２種の遺伝子を有することが判明した。クローニング及
び配列決定の際、これらの遺伝子をcry I C及びcry I D
として同定した。プラスミド熱−キュアリングを用いて
更に行った研究から、上記遺伝子が少なくとも３個の分
離したプラスミド上に配置され、その際cry I Cとcry I
Dとは隣接プラスミド上に配置されるのでなければ同一
プラスミド上に配置されることが明らかとなった。これ
らの遺伝子が１種以上欠失したABTSの誘導体はその毒性
が低下することが判明したので、次に行なう予備スクリ
ーニング用として遺伝子cry I A（ａ）と、cry I A
（ｂ）と、cry I Cと、cry I Dとの組み合わせ［cry I
A（ｃ）は含まず］を選択した。

実施例３ B.thuringiensis変異体の同定及び株ABTS 1857の製造 本発明の代表的細菌単離物を次のようにして得た。上
記４種の内毒素遺伝子の組み合わせに関して遺伝子特異
的であるプローブを用いてB.thuringiensis単独コロニ
ー土壌単離物を、前記遺伝子を有する変異体を約100同
定するまで予備スクリーニングした。同定した変異体
を、S.frugiperdaに対する活性に関して試験した。Wisc
onsinのEphriamで採集した土壌から単離し、株ABTS 568
6として同定した一つの変異体が他のいずれの変異体に
も優る活性を有し、S.frugiperdaに対して基準株B.thur
ingiensis HD−１の３倍の毒性を有する毒素／胞子複合
体を形成することが判明した。

再び遺伝子特異的プローブを用いて株ABTS 5686の単
独コロニー単離物を、所要の四つの内毒素遺伝子の総
て、即ち遺伝子保持プラスミドの総てを保有するか調べ
ることにより、前記株の遺伝子型の純粋性を確認した。
完全な、従って明らかに安定な遺伝子相補性を有する33
のコロニーをプールし、これに“株ABTS 1857"と命名し
直した。更に、（通常の培養温度である28℃に替えて）
34℃のプラスミド安定性を調べてゲノムの安定性を確認
し、その際cry I A（ｂ）遺伝子の損失はこのような高
温下に72時間経過しても２％でしかなかった。得られた
B.thuringiensis株ABTS 1857を後述したように、殺虫活
性に関してより詳細に調べ、かつ試験した。

実施例４ B.thuringiensis ABTS 1857の諸特性 B.thuringiensis ABTS 1857の特異な増殖及び代謝特
性を、Bergey's Manual of Systematic Bacteriology,v
ol.2,pp.1104−1129,1986の記載に後段に記したような
変更を加えた操作によって評価した。以下の諸特性に着
目した（次表中×＝肯定、０＝否定、Ｖ＝可変、Ｔ＝痕
跡応答）。

細胞直径＞1.0μｍ × 胞子が球形 ０ 胞子嚢が膨潤 ０ パラ胞子結晶 ０ カタラーゼ × 嫌気的増殖 × フォゲス−プロスカウエル試験 × Ｖ−ＰブイヨンのpH＜6.0 × Ｄ−グルコース由来の酸 × Ｌ−アラビノース由来の酸 Ｖ Ｄ−キシロース由来の酸 Ｖ Ｄ−マンニトール由来の酸 Ｖ グルコース由来のガス ０ カゼインの加水分解 × ゼラチンの加水分解 × 澱粉の加水分解 × クエン酸塩の利用 × プロピオン酸塩の利用 × チロシンの分解 ０ フェニルアラニンの脱アミノ化 ０ 卵黄レシチナーゼ × 硝酸塩を亜硝酸塩に還元 × インドール産生 ０ ジヒドロキシアセトン産生 ０ NaCl及びKCl要求性 ０ アラントインまたは尿酸塩要求性 ０ 栄養素ブイヨンpH6.8において増殖 × pH5.7において増殖 × NaCl0％において増殖 × ２％において増殖 × ５％において増殖 × ７％において増殖 × 10％において増殖 × ５℃で増殖 ０ 10℃増殖 Ｔ 15℃で増殖 × 20で℃増殖 × 25℃で増殖 × 30℃で増殖 × 35℃で増殖 × 40℃で増殖 × 45℃で増殖 × 50℃で増殖 × 55℃で増殖 ０ リゾチーム存在化で増殖 × H₂及びCO₂の下での自家栄養性 ０ レシチナーゼの検出では、レシチナーゼ産生の評価が
より正確となるように、上記Bergeyの操作で推奨されて
いる液体培地に替えて固体寒天培地を用いた。栄養要求
性増殖の分析では、Gaspak（登録商標）ジャー及びガス
発生器（BBL）を用いて適当なガス環境を用意し、20〜3
0で℃３日及び６日インキュベートした後に増殖を評価
した。

対照生物Staphylococcus aureusの応答に関するNatio
nal Committee for Clinical Labcratory Standardsの
S.O.P.047T−12−034Aの規準によって評価した抗生物質
感受性は次のとおりであった（Ｒ＝耐性、Ｓ＝感受
性）。

ゲンタマイシン Ｓ カナマイシン Ｓ エリスロマイシン Ｓ クリンダマイシン Ｓ ペニシリン Ｒ アンピシリン Ｒ セファロチン Ｒ バンコマイシン Ｓ クロラムフェニコール Ｓ トリメトプリム／スルファメトキサゾール Ｓ 実施例５ プラスミドプロフィールの作成 B.thuringiensis ABTS 1857のプラスミドプロフィー
ルを、Gryczan等（1978）から採用し、かつShivakumar
等（1986）が行なったように改良した操作を用いて求
め、これをB.thuringiensis kurstaki HD−１、及び亜
種B.thuringiensis aizawaiの２種の株HD−11及びHD−1
33のプロフィールと次のように比較した。株の培養物
を、20mlのLBを入れた50ml容のポリプロピレン製遠心分
離管内で28℃で約16時間、（250rpmでの）振盪下に増殖
させた。4800×ｇでの遠心分離を４℃で10分間行なって
細胞を回収し、これを1mlのTES緩衝液（30mMトリス、pH
7.5、5mM EDTA、40mM NaCl）で２回洗浄したが、その際
各洗浄後にマイクロ遠心分離機でペレット形成した。上
清を吸引し、ペレットを180μｌのスクロール培地（25
％スクロース、0.1M NaCl、0.05Mトリス、pH7.5）中に
再懸濁させた。試料を完全に混合して20μｌのリゾチー
ム（50mg/mlのリゾチームを含有するスクロース培地）
を、もはや混合せずに添加した。37℃で１時間のインキ
ュベーション後、各試料に5M NaClを48μｌ、0.5M EDTA
を12μｌ、及びSDS 2％含有の0.7M NaClを260μｌ添加
し、かつ管を２回転倒することにより緩慢な混合を行な
って細胞を溶解させてから更に68℃で10分間インキュベ
ートした。その後、試料を氷浴中で１時間冷却し、４℃
の温度を維持しながら15分間マイクロ遠心分離を行なう
ことによって染色体DNA及び細胞破片を除去した。尖端
を平滑にしたエッペンドルフピペットチップで各試料か
ら約300μｌの上清を、DNAを切断しないように試料界面
への接触に用心しながら穏やかに取り出し、清浄なエッ
ペンドルフチューブに移した。

次に、試料を温度４℃において33μｌの3M酢酸ナトリ
ウム及び670μｌのエタノールで処理してプラスミドDNA
を沈澱させ、18時間−20℃に維持した後４℃で15分間マ
イクロ遠心分離に掛けた。エタノールをデカンテーショ
ンによって除去し、管縁部を拭って乾かし、ペレット
を、室温で30分間真空下に遠心分離を行なうことにより
乾燥した。乾燥した各ペレットを200μｌのTES緩衝液で
覆い、そのまま15分間放置してから平滑にしたエッペン
ドルフピペットチップを用いて穏やかにピペッティング
し、かつ指先で弾くことによって再懸濁させた、各２μ
ｌのRNアーゼＡ（10mg/ml）及びT₁RNアーゼ（10U/ml）
を各試料に添加し、この試料を37℃の水浴中で１時間イ
ンキュベートした。20μｌのプロテイナーゼＫ（10mg/m
l）添加後、各試料を更に２時間インキュベートした。

200μｌの緩衝化フェノール（８−ヒドロキシキノロ
ンを0.1％まで添加;pH8の1Mトリスで１回洗浄し、かつp
H8の0.1Mトリスで２回洗浄して抽出を行ない、pHを7.6
とした）を用いるフェノール抽出と10秒間の短い混合と
を行なって、試料からプロテアーゼを除去した。次に、
各試料を３分間マイクロ遠心分離に掛け、水性相を新し
いエッペンドルフチューブに移した。等量（200μｌ）
のクロロホルム：イソアミルアルコール（24:1v/v）を
添加して試料を混合し、前と同様に遠心分離に掛けた。
水性相を除去し、温度４℃において1/10量（20μｌ）の
3M酢酸ナトリウム及び2.5倍量（0.5ml）のエタノールを
添加して再び沈澱を生起させ、この試料を１時間−20℃
に維持した。その後、先に述べたのと同様に試料をペレ
ット状とし、乾燥し、かつTES緩衝液中に再懸濁させ
た。

Pulsewave（登録商標）760スイッチャー（Bio−Red）
と、TBE緩衝液（8mMトリス塩基、89mMホウ酸、2.5mM ED
TA、pH8.3）中で調製した、各端部に1.5％のアガロース
を詰めた10×15cmのブリッジ型ゲル支持体とを用いてゲ
ル分離を行なった。TBE緩衝液中で調製したアガロース
ゲル（0.8％）を約4mmの深さまで注ぎ、これに1.5×7mm
のゲルコームを配置した。４℃に維持したゲルを80Vで
１時間泳動させてからプラスチックフィルムで被覆し、
電圧を26時間50Vに低下させた。波形パラメーターは
“電場反転、正常泳動（Fieud Inversion,Normal Ru
n）”であり、その際最初のＡ時間は９秒、最後のＡ時
間は60秒であった。開始比は３であり、また泳動時間は
26時間に設定した。

泳動を終えたゲルを約0.6％のエチジウムブロミドで3
0分間染色し、かつ短波長UV光を背後から照射して写真
撮影する前に水中で15分間脱色した。２種のTiffen（登
録商標）フィルター（25−レッド及び16−オレンジ）の
組み合わせを用い、またPolaroid 667フィルムをf22で2
0秒間露光した。

得られた株ABTS 1857のプラスミドプロフィールを第
１図にレーン３として示す。レーン１は、記載した相対
分子量（単位mDa）を有する分子量マーカーを示してい
る。株HD−１、HD−133及びHD−11のプラスミドプロフ
ィールはレーン２、４及び５としてそれぞれ示してあ
る。株ABTS 1857の場合、五つのプラスミドバンドが染
色体バンドの後方に移動し、また十が後方に移動して、
そのうちの一つは染色体の染みによって部分的に不明瞭
となっていることが注目された。残りの九つのうち、二
つはダブレットとして互いに接近した。ABTS 1857のプ
ラスミドロフィールはユニークであり、３種の基準株の
プロフィールから明確に区別できることが観察された。

実施例６ 標的害虫に対するB.thuringiensis ABTS 1857の活性 温度試験及び野外試験を行なって、本発明の細菌単離
物が野菜作物の重大な鱗翅目害虫、特にPlutella xylos
tela（野外で試験）及びSpodoptera exigua（実験室で
飼育した二齢幼虫を各植物に20匹ずつ人工的にたからせ
た後温室内で試験）の防除に関して有する効力を測定し
た。植物種は様々なものを用いた。単離物B.thuringien
sis ABTS 1857を工業レベル末粉末として製造し、６〜
８回の反復を伴う完全乱塊実験計画を用いて試験した。
比較基準は、同様に製造したB.thuringiensis kurstaki
HD−１工業粉末と、市販のB.thuringiensis殺虫剤であ
るDiPel（登録商標）2X WP（Abbott）とした。殺虫剤調
製物の適用は、温室内ではエアブラシ噴射器を用いて0.
5〜4.8mg/mlの量で行ない（各植物に2mlずつ噴霧）、野
外ではCO₂加圧式のバックパック噴射器を用いて１エー
カー当たり0.125〜1.0ポンドの量で行なった。上記用量
はいずれの場合も、工業粉末相当量で表わしてある。

調製物の活性を、処理後の昆虫幼性の死亡率または個
体数減少と、適当であれば作物被害の推定とに基づいて
評価した。データの記録は処理後３日以上経過してか
ら、かつ季節実現において何回も適用した場合は普通５
〜７日置きに行なった。これらの試験の代表的な結果を
次の表Ｉに示す。この表で落葉を０〜４のスケールで評
価し、その際完全な落葉を４とした。

これらのデータは、試験株ABTS 1857がピレスロイド
及びB.thuringiensisに耐性であるコナガ幼虫及びビー
トアーミーウォームに対して基準株HD−１よりはるかに
高い活性を有することを示している。そのうえ、試験株
は非耐性のコナガ、イラクサキンウワバ、及びモンシロ
チョウ幼虫から作物を商業的に許容可能に保護すること
が判明し、前記害虫に対して試験株は、少なくとも基準
B.thuringiensis産物のものに等しい活性を示した。

本明細書では、本発明の単離物その他の特徴をB.thur
ingiensis株の、種として亜種kurstaki及びaizawaiに関
連付けて説明した。しかし、ここに開示した技術は任意
のタイプまたは血清型の新規なB.thuringiensis単離物
の同定及び使用に適用可能であることが留意されるべき
である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 スミス，ロバート・エイ アメリカ合衆国、イリノイ・60046、リ ンデンハースト、ベツク・506 (72)発明者 ベンソン，テリー・エイ アメリカ合衆国、イリノイ・60085、ウ オーキーガン、ノース・ルイス・203 (56)参考文献 特開 昭61−172806（ＪＰ，Ａ) Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．, Ｖｏｌ．52，Ｎｏ６，Ｐ1565−1573 （1988) Ａｐｐｌ．Ｅｎｒｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒ ｏｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．53，Ｎｏ．12, Ｐ2808−2814（1987)

Claims (10)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】Bacillus thuringiensisのδ内毒素タンパ
   ク質をコードする遺伝子のサブセットを保有するBacill
   us thuringiensisにおいて、前記遺伝子のサブセットcr
   y I A（ａ）、cry I A（ｂ）、cry I C及びcry I Dを含
   み、cry I A（ｃ）を含まないことを特徴とする、前記B
   acillus thuringiensis。
2. 【請求項２】Spodoptera frugiperda、S.exigua、Plute
   lla xylostella及びTrichoplusia niの中から選択され
   た有害昆虫に対して有効であることを特徴とする請求項
   １に記載のBacillus thuringiensis。
3. 【請求項３】亜種B.thuringiensis aizawaiに属するこ
   とを特徴とする請求項１に記載のBacillus thuringiens
   is。
4. 【請求項４】アメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
   ションに受託番号ATCC SD−1372で寄託されたB.thuring
   iensis ABTS 1857であることを特徴とする請求項３に記
   載のBacillus thuringiensis。
5. 【請求項５】請求項１に記載のBacillus thuringiensis
   の生物学的に純粋な培養物。
6. 【請求項６】Bacillus thuringiensisが、アメリカン・
   タイプ・カルチャー・コレクションに受託番号ATCC SD
   −1372で寄託されたB.thuringiensis ABTS 1857である
   ことを特徴とする請求項５に記載の培養物。
7. 【請求項７】標的害虫種に対して有効である請求項１に
   記載のBacillus thuringiensisを単離する方法であっ
   て、 （ａ）その存在または不在が標的害虫に対する毒性の決
   定要因である内毒素タンパク質をコードする遺伝子の組
   み合わせを固定し、 （ｂ）B.thuringiensis株の中から前記遺伝子の組み合
   わせを有する一連の変異体を単離し、かつ （ｃ）前記一連の変異体をスクリーニングして好ましい
   単離物を得ることを含む方法。
8. 【請求項８】請求項１に記載のBacillus thuringiensis
   または該細菌から得られる内毒素を殺虫有効量で、許容
   可能なキャリヤと共に含有する組成物。
9. 【請求項９】被害区域に請求項１に記載のBacillus thu
   ringiensisまたは該細菌から得られる内毒素を殺虫有効
   量で適用することを含む有害昆虫防除方法。
10. 【請求項１０】配列： ATCGCAGAGAGATGACTCTAACTGTGTTAGATATCGTTCGTCTATTTC CAAATTATGACCG（配列番号:1） 及び該配列の、少なくとも１個の対応するB.thuringien
    sis遺伝子配列との特異的ハイブリダイゼーションに十
    分な長さを有する断片の中から選択されたヌクレオチド
    配列を有することを特徴とする、Bacillus thuringiens
    isのcry I A（ａ）、cry I A（ｂ）、cry I Cおよびcry
    I Dをコードする遺伝子の同定用プローブ。