SU1688819A1 - Штамм бактерий BacILLUS тнURINGIеNSIS SUвSр.кURSтакI дл получени энтомопатогенного препарата против LерIDортеRа и СоLеортеRа - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к микробиологической промышленности и биотехнологии , может быть использовано в производстве препаратов дл  борьбы с вредител ми сельскохоз йственных культур и лесных насаждений и представл ет собой новый штамм спорообразующих бактерий. Целью изобретени   вл етс  получение нового штамма Bacillus thuringlensls sisbsp.kurstaki, обладающего инсектицидной активностью против представителей отр дов Lepidoptera и Coleoptera. Штамм депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов Института ВНИИгенетика и имеет регистрационный номер ВКПМ - 4853. Штамм создан методом трансфекции на основе Bacillus thuringlensls subsp.kurstaki HD - 1 Dlpel. Донором плэзмидной ДНК служил штамм Eacilius thuringiensis subsp.kurstaki. Полученный штамм B.thuTingiensis subsp.kurstaki продуцирует (5-эндотоксины, обладающие инсектицидной активностью против бабочек и жуков, вредителей сельскохоз йственных культур. Штамм продуцирует кристаллы (5-эндотоксина трех типов. На среде ДПС продуктивность штамма 4,6 10 спор/мл, токсинообразование на среде Difco 0,3 мг/мл. Дл  непарного шелкопр да летальна  концентраци  токсических компонентов препарата, вызывающа  100%-ную смертность, на 1 г корма равна 1,5 10 спор/мл и 8 мкг токсина/мл; дл  колорадского жука на 1 см2 листа картофел  - 2,5 10е спор/мл и 70 мкг токсина/мл. 4 табл. О 00 00 00 ЧЭ

Description

Изобретение относитс  к микробиологической промышленности и биотехнологии , может быть использовано в производстве препаратов дл  борьбы с вредител ми сельскохоз йственных культур и лесных насаждений и представл ет собой новый штамм спорообразующих бактерий.

Целью изобретени   вл етс  получение нового штамма Вас,thuringiensis subsp.kurstaki, обладающего инсектицидной активностью против предглатшмнш отр дов Lepldoptera и Coleoptera.

Штамм получен путем скрещивании штамма Bac.thuringiensis subspkurstakl HD- 1 Dipel со штаммом Вас.thu ring lensis subsp.tenebrionis при совместном культивировании . Полученный штамм обладает инсектицидной активностью против колорадского жука (отр.Coleoptera) и представителей отр да Lepidoptera. Штамм Bac.Thirrlngiensis subsp.kurstaki Т - 2 депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов Института ВНИИ - генетика и имеет регистрационный номер ВКПМ - В - 4853.

Штамм характеризуетс  следующими признаками.

Культу рал ьно-морфо логические признаки , Грамположительные подвижные палочки размером 4,1 - 1,6 мкм. В стационарной фазе роста образуют кри- сталлы d-эндотоксинов и овальные споры, Хорошо растет на МП средах при 27 - 29°С ирН 6,8-7,5. НэМПАна 10-есутки при29°С образует однородные колонии 3-5 мм в , диаметре, светло-серого цвета со слабо из- резанным краем. Структура мелкозерниста .

В МПБ рост умеренный, помутнение однородное , образует кольцеобразную пленку .

На картофельном агаре и агаризован- ной среде Хоттингера рост обильный, на 7-е сутки при 29°С колонии светло-серого цвета , однородные, пигмента не образуют. По Н-антигену относитс  к сероварианту III (ЗаЗв).

Физиолого-биохимические признаки. Отношение к источникам углерода: усваивает с образованием кислоты глюкозу, мальтозу , кукурузный и картофельный крахмал, соевую и кукурузную муку. Не усваивает лактозу, ксилозу, арабинозу, лецитин. Пеп- тонизирует молоко, гидролизует крахмал, желатин не разжижает.

Отношение к. источникам азота: восста- навливает нитраты, усваивает аммонийные формы азота,

Отношение к температуре: хорошо растет при 27 - 29°С. оптимальна  температура 28°С.

Отношение к рН среды: хорошо растет при 6,8 - 7,5, оптимум рН 7,2.

Отношение к кислороду: аэроб.

Отношение к фагам: устойчив к основным производственным фагам 11, 22, С/П, И-77, 25- 16.

Энтомопатогеннме свойства: синтезирует -эндотоксины, обладающие инсектицидной активностью против представителей отр да Lepldoptera и Coleoptera, синтезирует кристаллы d-эндотоксинов трех типов1 большой (1,1x0,7 мкм) и маленький (0,5 - 0,3 мкм) ромбы, плоский квадрат (размер стороны 1,1 мкм).

Генетические особенности: рекомби- нантный штамм Bac.thuringiensis subsp.kurstaki Т - 2 нар ду с плазмидами, свойственными штамму Bac.thuringiensis subsp.kurstaki HD - 1 Dipel (реципиент), посредством трансцепции приобретает плазмидную ДНК штамма Bac.thuringiensis subsp.tenebrionsis (донор) размером т.п.н. Плазмида стабильна на прот жении более чем 100 генераций клеток. Стабильность штамма Т - 2 провер ют со - гласно следующей схеме. Штамм снимают петлей с агаризованной Nutrient Broth (NB) и внос т в 2 мл аналогичной питательной среды, после чего выращивают в течение 12 ч при28°С на круговой качалке при 240 - 260 об./мин. Затем 1 мл микробной культуры засевают в колбу емкостью 750 мл с объемом среды выращивани  100 мл Nutrient Broth. По окончании 4-часового интервала 1/2 часть культуры отбирают и добавл ют равный объем свежей NB-срсды. Образцы отбирают дл  исследовани  куль- туральных признаков, иммунологического анализа и выделени  плазмидной ДНК. Осуществл ют 10 таких переносов, что составл ет , согласно подсчетам, более 200 генераций клеток. Отобранные образцы развод т и высевают на чашки Петри с агаризованной средой Хоттингера с расчетом 30 - 100 колоний на чашку, после чего инкубируют при 28°С в течение 7-10 сут до полной спорул ции анализированных клонов . Анализ плазмидного профил , культу- рально-морфологических признаков, иммунологических свойств не вы вил нестабильные варианты.

Предлагаемый рекомбинантный штамм Т - 2 генетически стабилен.

Маркерные признаки: Н-антиген ЗаЗв, плазмида размером 60 т.п.н., штамм обладает инсектицидной активностью против представителей отр дов Lepidoptera и Coleoptera и образует три типа кристаллов (5-эндотоксинов (большой и маленький ромб, плоский квэдоаг), / -эндотоксин не синтезирует.

Штамм хран т в ампулах после липфи- лизации спорокристэл лической смеси обычным способом или в згаризовэнной МПБ (0,2 - 0.4%) при 4ПС.

Пример 1. Родительские штаммы Bac.thuringiensis sut,p kui staki HD - 1

Dipel (реципиент, далее обозначаетс  как KUR) и Bac.thurlnglensls subsp. tenebrlonsis (донор, далее обозначаетс  как TEN), а также предлагаемый новый рекомбинантный штамм Bac.thurigiensls subsp.kurstaki T - 2 (далее обозначаетс  как Т - 2) дл  подготовки посевного материала выращивают в 2 мл МПБ в течение 12 ч при 28°С на-круговой качалке при 240 - 260 об./мин. Затем 1 мл микробной культуры засевают в колбы емкостью 750 мл с обьемом среды выращивани  50 мл дрожже-полисахаридной среды (ДПС) следующего состава, г/л: дрожжи кормовые 36; кукурузна  мука 26,8; соева  мука 5,0; мел 3,0; вода - остальное, рН среды 7,2, и культивируют на круговой качалке 48 ч до стадии полной спорул ции в тех же услови х. Определение титра жизнеспособных спор провод т на чашках Петри с МПа.

Результаты исследований приведены в табл.1.

Данные сравнительного анализа, проведенного в лабораторных услови х, показывают , что продуктивность штамма Т-2 не уступает продуктивности исходных родительских штаммов и составл ет 4,6x10 спор/мл.

П р и м е р 2. Иммунологический анализ (5-эндотоксинов родительских штаммов KUR и TEN и сконструированного штамма Т - 2 провод т в реакции двойной иммунодиффу- зии по Оухтерлони.

Дл  этих целей исследуемые штаммы выращивают на питательной среде (Dlfco, США) в колбах емкостью 750 мл в объеме среды выращивани  75 мл. Подготовку посевного материала и культивирование провод т , как в примере 1. После выращивани  исследуемых штаммов до стадии полной спорул ции споры и кристаллы осаждают центрифугированием при скорости 6000 об./мин 15 мин, трижды промывают дистиллированной водой и гомогенизируют в 80 мл буфера (0,005 М трис-HCl, рН 8,0, с 0,5% . твин - 80) 5 мин при скорости 5000 об./мин. Затем 20 мл суспензии наслаивают на поверхность 20 мл 67%-ного раствора верог- рафина в пробирках емкостью 50 мл к ротору JS - 20 (Beckman, США) и центрифугируют 90 мин при скорости 10000 об./мин и 4°С. Фракцию кристаллов, локализованную на границе интерфаз вода - верографин, отбирают с помощью пастеровской пипетки и отмывают от остатка ве- рографина центрифугированием против дистиллированной воды трижды при 6000 об./мин в течение 10 мин. Очищенные кристаллы (более 96% чистоты) раствор ют в 50 мл 0,05 М NaOH, рН 12,5и37°Свтечение

1ч. Количество полученного сЗ-эндотоксина оценивают спектрофотометрически при длине волны 280 нм. Далее растворы кристаллов используют дл  иммунологического анализа с иммуноглобулинами кролика про5 тив (5-эндотоксинов родительских штаммов KUR и TEN в реакции Оухтерлони. Результаты исследований представлены в табл.2.

Как показывают приведенные в табл.2 данные, (5-эндотоксины исходных родитель0 ских штаммов резко отличаютс  между собой по своим иммунологическим свойствам, в то врем  как рекомбинантный штамм Т 2синтезирует кристаллические белки, им- мунологически идентичные и штамму-доно5 ру, и шгэмму-реципиенту.

По вление дополнительного (5-эндоток- сина штамма Т - 2 коррелирует с по влением плазмидной ДНК размером 60 т.п.н., присутствие которой наблюдали в плазмид0 ном профиле после анализа плазмидной ДНК исследуемых штаммов с помощью электрофореза в 0,6%-ном агарозном геле. Анализ и выделение плазмидной ДНК провод т с помощью метода Birnboim.

5Суммарна  продукци  (5-эндотоксиноо у

штамма Т - 2 не отличаетс  от продукции на- указанной среде выращивани  от исходных родительских штаммов и составл ет 0,3 мг/мл.

0 Долю эндотоксинов, специфичных дл  Lepidoptera и Coleoptera, определ ют с помощью SDS-электрофореза в 7% ПААГ по методу Weber и Osborn. Дл  этих целей штаммы подращивают и получают растворы

5 эндотоксинов, как в примере 2,

Результаты электрофоретического анализа приведены в табл.3.

Белки с молекул рной массой 133,130 и 65 кДа обладают инсектицидной активно0 стью против представителей отр да Lepidoptera . По данным электрофореза эга группа белков составл ет примерно 70% от общего количества белков эндотоксинов ре- комбинантного штамма Т - 2. Остальна  до5 л  общего белка приходитс  на эндотоксин с мол. массой 70 кДа. обладающий инсектицидной активностью против колорадского жука.

В пол х зрени  электронного микроско0 па обнаружено у штамма Т - 2 три типа кристаллов. Два из них свойственны штамму KUR (большой и маленький ромб), а третий тип кристаллического включени  (плоский квадрат) свойствен штамму TEN.

5 П р и м е р 3. Определение энтомоцид- ной активности 5-эндотоксинов сконструированного и родительских штаммов провод т на личинках непарного шелкопр да (Llmantrla dlspar), используемого в качестве тест-объекта энтомоцидных свойств средств защиты растений, а также на личинках колорадского жука (Leptinotarsa decemllneata Say) - основного вредител  семейства пасленовых и представител  отр да Coleoptera.

Штаммы выращивают до стадии полной спорул ции, как в примере 2. Используют гусениц непарного шелкопр да 2-3 возрастов . Тест-насекомых содержат в чашках Петри при 25 - 28°С и влажности 70 - 90%, фотопериод 18 ч. В каждом опыте используют 45 гусениц. Гусеницам дают возможность свободно поглощать инфицированный искусственный корм (3 г на чашку). Учет гибели гусениц провод т на б-е сутки. Биотестирование на личинках колорадского жука провод т по следующей схеме. Личинки 1 - 2 возраста помещают в чашки Петри на лист картофел . Листовые пластинки обрабатывают суспензией спор и кристаллов исслег дуемых штаммов до полного смачивани , в контроле обрабатывают дистиллированной водой. После подсыхани  листовые пластинки (размеры 4-7 см) помещают в чашки Петри с 10 личинками. Учет гибели личинок колорадского жука провод т на 3-е сутки. Число испытуемых концентраций препаратов должно быть не менее 5, количество опытов менее 4 с 3 повторност ми в каждом .

В табл.4 представлены летальные концентрации препаратов, вызывающие 100%- ную гибель насекомых (на 1 г корма дл  непарного шелкопр да и 1 см2 листа растени  дл  колорадского жука).

Сравнительные данные инсектицидной активности штаммов показывают, что ре- комбинантный штамм Т - 2 обладает совмещенным действием на представителей Le- pldoptera и Coleoptera в дозах, сравнимых с исходными родительскими штаммами.

Штамм Т - 2 эффективен против других видов насекомых в концентрации 10 спор/мл. На 4-е сутки наблюдаетс  100%-на  гибель у следующих личинок насекомых-вредителей сельскохоз йственных культур: озима  совка (Ag rot Is segetum),

хлопкова  совка (Hellothis armlgera). капустна  совка (Mamestra brassical), отлична  совка (Mamestra suasa), люцернова  совка (Hellothis vlrlplaca), донникова  совка

(Hellothis marltlma), луговой мотылек (Loxostege stlctialis).

Штамм Т - 2 не обладает инсектицидной . активностью в указанной испытуемой дозе против хищного клопа Podlsus macullventrls,

который используетс  как биологическое средство подавлени  численности личинок колорадского жука (Leptinotarsa decem- lineata Say). Следовательно, микробиологические препараты на основе штамма Т - 2

можно использовать в интегрированной системе защиты растений от колорадского жука совместно с биологическими средствами защиты растений, в частности совместно с хищным клопом дл  борьбы с колорадским

жуком.

Таким образом, методом трансцепции осуществлена передача плазмиды размером 60 т.п.н. из штамма-донора TEN в ре- ципиентный штамм KUR. Передача

плазмиды коррелирует с по влением кристаллического включени  (форма - плоский квадрат) белковой природы в штамме реципиента KUR. Молекул рна  масса этого белка примерно 70 кДа (определено

электрофорезом в 7% ПААГ в присутствии ДС-натри ). По своим иммунологическим и инсектицидным свойствам этот белок соответствует кристаллическому белку штамма- донора TEN. Следовательно, получен

штамм Т- 2, который синтезирует d-эндоток- сины исходных родительских штаммов. Ре- комбинантный штамм Т - 2  вл етс  перспективным дл  использовани  в микробиологической промышленности с целью

создани  препаратов, обладающих энтомо- цидной активностью одновременно против представителей отр дов Lepldoptera и Coleoptera.

Claims (1)

1. Формула изобретени 

   Штамм бактерий Bacillus thurlnglensls subsp.kurstakl ВКПМ В -4853 дл  получени  энтомопатогенного препарата против Lepldoptera и Coleoptera.

   1688819

   10 Таблица 1

   Штамм Вас, thuringlensls

   Титр жизнеспособны) b EE-JjSLsiLP Р/мп

   Покэзана положительна  (+} или отрицательна  (-) реакци  кристаллических белков с иммуноглобулинами против 3 эндотоксина KUR и б-эндотоксинз TEN.

   Штамм

   Kurstaki HD-1 DIpel

   Т-2 Tenebrionis

   KUR

   4

   Таблица 2

   Таблица 3

   Состав эндотоксинов (молекул рна  масса. кДа)

   133;130; 65

   133;130;70,65

   70

   Таблица 4