NO832466L

NO832466L - Fremgangsmaate for fremstilling av rene mutanter med insekticid virkning

Info

Publication number: NO832466L
Application number: NO832466A
Authority: NO
Inventors: Philip Chester Fitz-James
Original assignee: Fitz James Philip Chester
Priority date: 1982-07-09
Filing date: 1983-07-06
Publication date: 1984-01-10
Also published as: IL69186A; OA07490A; EP0099301A2; ZA835010B; JPS5966881A; IL69186A0; CA1193564A; US4609550A; EP0099301A3

Description

Foreliggende oppfinnelse angår i det vesentlige en ikke sporedannende mutant av Bacillus cereus subspeci israelensis, et insekticid for bekjempelse av insekter av ordenen Diptera på larvestadiet og en fremgangsmåte for fremstilling av insekticide.

Det er kjent at forskjellige stammer av Bacillus cereus frembringer inklusjonslegemer som er eller som inneholder forbindelser som er toksiske på larvestadiet av visse insekter slik som insekter av ordenen Lepidoptera, Diptera og andre. Underarten thurgeniensis er funnet å danne inklusjonslegemet som inneholder forbindelser som er toksiske for larver av Lepidoptera og underarter av israelensis er funnet å danne inklusjonslegemer som inneholder forbindelser som er toksiske for larver av dipterans. Den siste arten ble først beskrevet i en publikasjon av H. de Barjac i CR Acad. Sei., Paris 286, 797-800 og 1175-1178, serie D, 1978. På det tidspunkt ble underarten thurgeniensis ansett for å være en separat art og, som en følge av dette, ble underarten israelensis ansett for å være en underart av Bacillus thurgeniensis. Til og med nå blir underarten israelensis ofte referert til som en underart av Bacillus thurgeniensis eller som BTI. I det følgende vil imidlertid underarten israelensis bli referert til som en underart av Bacillus cereus eller som BCI.

Den ville formen av Bacillus cereus er en sporedannende organisme. Som sedvanlig ved bacillus-sporulering går denne prosessen gjennom syv stadier. I det det første stadium finner det sted en omvandling av en replikerende celle til et stasjonært stadium. I det andre og tidlig i det tredje stadium utvikles sporeknopper. Sent i det tredje stadium er cellen henvist til å fortsette dannelsen av en spore. I det fjerde stadium er cortex utviklet. I det femte stadium blir protein utfelt. I det sjette stadium finner det sted en dehydratisering av sporeprotoplasmaet og akkumulering av dipicolinsyre og kalsium i sporen. I det syvende stadium bevirker et lytisk enzym lyse av cellen og frigivelse av sporen.

Det kritiske stadium for dannelsen av inklusjonslegemet synes vanligvis å være sporuleringens andre trinn. F.eks. i Bacillus cereus subspeci medusa starter dannelsen av inklusjonslegemer mot cellemembranen før starten av sporuleringen til slutt i den vegetative vekten. Typiske inklusjoner vokser og differensieres samtidig med sporen.

I Bacillus cereus subspeci thurgeniensis og dens mange varianter, som er toksiske for laver av Lepidoptera, blir inklusjonen initielt dannet tett opp til sporeknoppen i det andre stadium. I Bacillus cereus subspeci israelensis synes inklusjonsdannelsen å begynne enten før eller under det andre stadium. Dersom dannelsen starter før det andre stadium blir inklusjonen deponert ved en membran som befinner seg på en viss avstand i forhold til det sted der sporedannelsen finner sted. Dersom inklusjonsdannelsen begynner i det andre stadium, blir inklusjonen deponert ved den membranen som ligger tett opp til sporen som er under utvikling. I en del celler er membrandeponeringen av inklusjonsprotein observert på begge steder. I underarten israelensis utvikler inklusjonen seg gjennom det tredje til det sjette stadium til en multi-krystallinsk inklusjon som til slutt dekkes av en tynn "hud". Denne huden er i alminnelighet belagt med mange små regulære viruslignende partikler på utsiden av inklusjonen. Disse partiklene er tilsynelatende en art av ufullstendige ribonukleinsyre-inneholdende phager som også eksisterer i fri form og som er indusert av det andre stadium av sporuleringen uavhengig av syntesen av protein som er inneholdt i inklusjonen. Strukturer som i det vesentlige er identisk til phagen er også funnet på og like ved inklusjoner av underarten medusa. (se G.S. Hendry,

J.B. Gillespie og P.C. Fitz-James, J. Virol, 18, 1051-1062, 1976), men er ikke funnet i noen av underartene av thurgeniensis som er toksisk overfor Lepidoptera-larver.

Tynnskikts-mikrografer av modne inklusjoner fremviser både lys- og mørk-farvede krystallinske strukturer som er innesluttet i tynn hud. Foreløbige prøver indikerer at de lysfarvede krystallene er tilholdsstedet for toksinet. Ved fysikalsk fiksering ved frysing og ved metallskyggelegging av eksponerte prøver synliggjøres også den multi-krystallinske karakteren til inklusjoner av underarten israelensis.

Ved sentrifugering av sporer og inklusjoner av underarten israelensis i en gradient av sucrose eller diatriozat kan det vises at toksinet i sin helhet forefinnes i inklusjonene. Sporene er ikke-toksiske. Paralyse av forsøkslarvene kan oppnås ved så få som 10^ inklusjoner pr. mm. En typisk Bacillus cereus spore er kjennetegnet ved at skiktene i den omgivende hinne har en særmerket molekulær oppbygning sammenlignet med sporene av andre jordbundne sporedannende bacilli. Sporen av Bacillus cereus og sporer av slike underarter som danner parasporale inklusjoner, som er toksiske til Lepidoptera eller Diptera-larver, har hinnestrukturer og, i mange tilfelle, hinnepolypeptider, som er separable ved polyakrylamidgel elektrophorese, som er identiske. Følgelig er det i alminnelighet ikke mulig ved strukturelle og biokjemiske metoder å skille mellom Bacillus cereus selv og slike underarter som israelensis thuringiensis medus og dens mange slektninger. Videre er det i alminnelighet ikke mulig å skille sporene av ovennevnte underarter og underartene av anthracis, som også er en toksigen art av Bacillus cereus og som forårsaker milt-brann, på grunnlag av strukturen til sporene.

De særmerkede egenskapene til forskjellige underater av Bacillus cereus sammenlignet med en standard Bacillus cereus synes å være forårsaket av plasmider eller ekstrakromosomale biter av desoksyribonukleinsyre. Det er også funnet at

■kurering" av et antall av disse underarter medfører dannelse av en Bacillus cereus, også kalt Cry (-) Bacillus thuringiensis, som mangler en plasmid komponent som er tilstede i den ville typen og, i de tilfeller der dannelsen av et toksisk inklusjonslegeme er forbundet med det

manglende plasmid, vil den kurerte underarten ikke lenger være toksisk. F.eks. rapporterte Knudsen et al at når underarten anthrasis kureres ved å la kulturen utvikle seg ved eller over 42°C, vil det foregå et tap av plasmid slik at anthracis behandlet på denne måten ikke lenger danner toksinene (C.B. Knudsen, B. Ivins og P. Mikesell, Abstract H29 ASM Annual Meeting 1982). Undersøkelser som er foretatt av oppfinneren og andre viser at det samme er tilfelle for flere andre underarter slik som israelensis thuringiensis og medusa. Når slike underarter dyrkes ved eller over 42°C finner det sted et tap av plasmid og den resulterende kulturen danner ikke lenger de respektive særegne inklusjonslegemene.

Et tilsynelatende plasmidopptak er rapportert av

Toumanoff som fant induksjon av inklusjonsdannelse og toksisitet overfor Lepidoptera-larver i en kultur av en type ikke-toksisk Bacillus cereus som gjentagende ganger hadde passert gjennom tarmkanalene til en voksmøll-larve

(C. Toumanoff, Ann. Inst. Pasteur Paris, 90, 1, 1959).

Selv om således den nøyaktige mekanisme for utvekslingen ikke er kjent , synes det at underarter av Bacillus cereus under visse betingelser kan miste sine særegne toksigene egenskaper og det synes mulig at Bacillus cereus under visse omstendigheter kan utvikle toksigene egenskaper for derved å bli en av dets underarter.

Anvendelsen av inklusjonslegemer fra Bacillus cereus subspeci israelensis som insekticid med virkning overfor Diptera-larver er kjent (H. de Barjac, CR.Acad. Sei.,

Paris, 286, 797-800 og 1175-1178, 1978). Det diptericide krystallinske protein som er inneholdt i inklusjonslegemene til underarten israelensis er vist å ha et forskjellig polyakrylamid-gel elektrophorese-mønster enn proteinet i inklusjonslegemer av underarter som ikke er toksiske overfor Diptera-larver (H.E. Huber, P. Luthy, H.-R. Ebersold og J.-L. Cordier, Arch. Microbiol 129, 14-^18, 1981).

Ved denne teknikkens stilling vises det til artikkelen av Huber et al såvel som andre litteraturreferanser som er nevnt i beskrivelsen.

Den toksiske virkningen av inklusjonslegemene til subspeciene israelensis er ganske vertsspesifikk og forårsaker paralyse og forstyrrelser i de indre organer hos verten. Preparater som inneholder inklusjonslegemer oppnås fra den ville typen av Bacillus cereus subspeci israelensis som danner sporer. Siden inklusjonslegemene i den ville typen frigjøres samtidig med sporene i det syvende stadium av sporuleringen og siden det er relativt vanskelig å skille inklusjonslegemene fra sporene, inneholder disse preparatene ved siden av de toksiske inklusjonslegemene et stort antall levedyktige sporer. Et slikt preparat er beskrevet i US patent nr. 4.166.112 av Goldberg.

Når slike spore-inneholdende preparater blir brukt for å bekjempe insekt-larver, kan disse levedyktige cellene formeres og på denne måten spres ukontrollert. På nåværende tidspunkt er det ikke kjent om deponeringen et stort antall av Bacillus cereus subspeci israelensis i form av levedyktige sporer vil a) forstyrre balansen av aerobe bacilli i jordbunnen, b) møte fremveksten av den beslektede underarten anthracis, slik at forekomsten av anthrax øker, eller c) ha andre potensielt skadelige virkninger. Under visse omstendigheter kan det finne sted en utveksling av plasmider mellom vegetative celler av to forskjellige underarter av Bacillus cereus. (Gonzales et al, 1982. Proe. Nat. Acad. Sei. USA (under utgivelse) og Gonzales J.M. og B.C. Carleton 1982 i Genetic Exchange, Streips, Guild, Gordal og Wilson som redaktører sidene 85-95. Marcel Dekker N.Y.)

For å unngå slike potensielt ugunstige virkninger av sporene, har det vært foreslått å utsette sporene for en kjemisk behandling som bevirker at de ikke lenger er levedyktige, slik som beskrevet i det kanadiske patent nr. 958.330 av Utsumi et al av et preparat som er aktivt overfor Lepidoptera. Under en slik kjemisk behandling av et sporeinneholdende insekticid må det utvises aktsomhet slik at ikke preparatets insekticide virkning samtidig påvirkes.

I et forsøk på å overkommer de ulemper som teknikkens stilling er beheftet med, tilveiebringes foreliggende oppfinnelse mutanter av Bacillus cereus subspeci i israelensis som i alminnelighet ikke besitter en sporedannende evne, men som beholder evnen til å danne inklusjonslegemer som er toksiske overfor Diptera-larver. Mutantene er oppnådd ved screening av ville underarter av israelensis. Mutantene frigjør toksiske inklusjonslegemer i kultursubstrate og kan med letthet separeres og anvendes for bekjempelse av Diptera-larver så som larver av stikkmygg, (moskito) og knott ("black fly"). Inklusjonslegemene er også virksomme overfor larver av fjærmygg.

Ifølge foreliggende oppfinnelse tilveiebringes således en geologisk ren mutant av Bacillus cereus subspeci israelensis som i det vesentlige er ikke sporedannende,

men som samtidig er i stand til å forme inklusjonslegemer som er toksiske overfor insekter av ordenen Diptera på larvestadiet og som er gitt deponeringsnummerene 1178, 1179 og 1180 ved kultursamlingen ved University og Western Ontario, London, Ontario, Canada.

Ifølge foreliggende oppfinnelse tilveiebringes også en fremgangsmåte for fremstilling av i det vesentlige sporefrie insekticider som er aktive overfor insekter av ordenen Diptera på larvestadiet og som består i å dyrke en biologisk sett ren ikke sporedannende mutant av Bacillus cereus subspeci israelensis i et kultursubstrat frem til stadiet for dannelse av toksiske inklusjonslegemer og lyse av cellen, og separering av toksiske inklusjonslegemer fra kultursubstratet.

Ifølge foreliggende oppfinnelse tilveiebringes videre et insekticid som er aktivt overfor insekter av ordenen Diptera på larvestadiet som som aktiv bestanddel består av en effektivt larvedrepende konsentrasjon av i det vesentlige sporefrie toksiske inklusjonslegemer.

Ifølge foreliggende oppfinnelse tilveiebringes ennvidere

en fremgangsmåte til bekjempelse av insekter av ordenen Diptera på larvestadiet og denne fremgangsmåten består i

å anbringe en effektiv konsentrasjon av de vesentlige sporefrie toksiske inklusjonslegemene til larvenes habitat.

I et forsøk på å oppnå en mutant av Bacillus cereus

subspeci israelensis som ikke danner sporer, ble den ville typen av denne underarten utsatt for forskjellige stimuli slik som ekspandering i ultrafiolett lys, frysetørring, dyrkning på delvis dehydratisert agar, dyrkning ved 43°C og dyrkning i nærvær av et mutagen. Grå eller lytiske kolonier eller segmenter derav som fremviser en minsket hvithet ved sporedannelsen ble plukket ut og satt ut på nye plater. Den vegetative cellemobiliteten til den ville typen og mutanten bevirket at dyrkningen av mutanten, som initielt virket lovende ved fasekontrast-lysmikroskopering, ble vanskeliggj ort.

Mutantene CB3-90 og CB3-91 ifølge foreliggende oppfinnelse ble isolert på følgende måte. En eksponentielt voksende kultur av den ville typen av subspeci israelensis i væskesubstrat ble behandlet med mutagenet N-metyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin. Etter gjennomluftning av kulturen i mutagenet ble cellene vasket, resuspendert i nærings-buljong og satt ut på plater av sporuleringssubstrat. Etter inkubasjon ble kolonier av nedsatt hvithet plukket ut og eksaminert ved fasekontrast-mikroskopering. Dette ledet til funnet av to mutanter CB3-90 og CB3-91 som, etter noe forlenget vekst på agar, dannet inklusjoner, men ikke sporer. På denne måten oppnås det at det ikke frigjøres sporing til kultursubstratet under lyse av cellene. Som i den ville typen inneholder inklusjonslegemene krystallinsk protein som er toksisk for Diptera-larver. I mutanten CB3-90

virker det som om sporulerings-prosessen blokkeres tidlig i det tredje stadium, mens derimot sporuleringsprosessen for mutant CB3-91 synes å bli blokkert sent i det annet stadium. Følgelig kan CB3-90 refereres til som Spo III mutant og CB3-91 som SpoII mutant. Begge er relativt langsomt lyserende stabile mutanter som tilsynelatende har mer stabile cellevegger enn den ville typen. Som en følge derav frigjøres ikke inklusjonslegemene umiddelbart i kulturmedia, men er tilbøyelig til å forbli innesluttet av celleveggen for et forlenget tidsrom. I kulturer som tillates å vokse i mindre enn ca. 24 timer, vil i alminnelighet mindre enn 20% av inklusjonslegemene forefinnes i kulturmediet. Ved forlenget vekst vil en høyere prosent av inklusjonene frigjøres. Ingen levedyktige sporer ble erholdt fra kulturer av disse to mutantene, og det ble ikke observert at mutantene vendte tilbake til den ville type.

Mutant-gruppe CB3-100 til 104 fremavlet til en stabil mutant som nå kalles CB3-104R, ble isolert fra en serie med utstrykninger på plater av den ville typen subspeci israelensis som hadde vært utsatt for frysetørring. Denne gruppen synes å ha sitt opphav i en eneste koloni. Det som i hovedsak skiller de forskjellige mutantene fra hverandre er hastigheten med hvilke de vender tilbake til den ville formen. Alle har lave tilbakefallshastigheter, med CB3-104R med lavest tilbakefallshastighet. Så lenge dyrkningen utføres slik at kulturen gjentatte ganger blir for gammel, har CB3-104R en tilbakefallshastighet på mindre enn 1 i 10 g. I denne mutanten synes sporuleringsprosessen å bli blokkert sent i det annet stadium eller tidlig i det tredje.

Kolonier av CB3-104R som er gjort til 18 til 24 timer

gammel er mindre hvit enn kolonier av den ville formen og

blir gråaktig ved inklusjonsmodningen. Ved fortsatt inkubering utover 24 timer vil de lyserende kolonier sende ut gjentatte ringer av fornyet vekst hvilket bevirker at de modne koloniene får et furet utseende i indirekte lys. Dannelsen av inklusjonene er hurtig og cellene har et aktivt lytisk system. I motsetning til de langsomt lyserende mutantene CB3-90 og CB3-91, forårsaker lyse av CB3-104R omfattende frigivelse av inklusjonslegemer og noe cellefragmenter i kulturmediet, men bevirker derimot ikke i frigjørelse av sporer. Bortimot enhver celle i kulturen danner et antall toksiske inklusjoner etter 1 døgns vekst. Idet tilbakefall til den ville formen er forbundet med den sekundære veksten, kan dette i det vesentlige unngås ved å hindre sekundær vekst i eldre kolonier. Dette kan oppnås ved utvelge en relativt ung del av kolonien og dyrke denne for inokkulering og ved å la den inokkulerte kulturen utvikle seg raskt, fortrinnsvis innen ca. 18 - 24 timer, gjennom en vektsyklus til avsluttet vekst, gjennom den stasjonære fasen, gjennom den poststasjonære syntesen av toksiske inklusjonslegemer frem til deres frigivelse ved lyse av cellene. Dyrkning av kulturen i et substrat som inneholder minimale mengder av næringsmidler og, fortrinnsvis lite eller inget sukker, befordrer også rask vekst gjennom en vekstsyklus frem til lyse på grunn av den relativt tidligere uttømmingen av kultursubstratet.

Mutantene CB3-90, CB3-91 og CB3-104R ble deponert ved kultursamlingen ved universitetet ved Western Ontario, London, Ontario, Canada den 22. juni 1982 og ble gitt deponeringsnumrene 1178, 1179 og 1180, respektivt. Denne kultursamling står som nr. 262 på fortegnelsen til Canadian Committee on Culture Collections og Micro-organisms (National Research Council of Canada, Ottawa, Canada) og som nr. 80 på fortegnelsen til the World Federation og Culture Collections of the International Association of Microbiological Societies (c/o S.M. Martin, Division of Biological Sciences, National Research Council og Canada, Ottawa, Canada eller V.B.D. Skerman, Department of Microbiology, University of Queensland, Brisbane, Australia).

Mutant CB3-104R ble også dponert ved the American Type Culture Collection, Tockville, Maryland, USA den 2. juli 1982 og ble gitt deponeringsnummeret ATCC 39,152.

På samme måte som den opphavelig stammen Bacillus cereus subspeci israelensis er mutantene ifølge oppfinnelsen gram-positive bakterier. Mutantene vokser bra på vanlige sporuleringssubstrater. Der virker som om jo rikere medie er på nitrogen, i hovedsak peptoner, jo høyere er utbyttet av inklusjonsprotein.

I kulturer av disse ikke-sporedannende mutantene er all energi i de voksende cellene rettet inn på dannelse av toksiske inklusjonslegemer. Følgelig frembringer mutantene de toksiske inklusjonslegemene mer effektivt enn den ville form som både danner sporer og inklusjoner. Som tidligere nevnt kan inklusjonslegemene av subspeci israelensis deponeres ved i det minste to forskjellige steder inntil membraner. I den ville formen av underarten israelensis skjer dannelsen av to inklusjonslegemer i en celle relativt sjeldent, i motsetning til i mutanten ifølge foreliggende oppfinnelse og særlig i CB3-104R, hvor multippel deponering av inklusjonsprotein er adskillig mer utbredt. Toksiteten av inklusjonslegemene til den ville formen israelensis og inklusjonslegemene til mutantene er identisk. Mutantene kan imidlertid frembringe ca. 1.5 ganger mer toksin enn den ville formen.

Etter at mutantkulturen er dyrket frem til lyse, etter i alminnelighet 18 t-1 20 timer ved 30°C, skilles inklusjonslegemene fra kultursubstratet ved f.eks. sentrifugering, filtrering eller lignende. Dersom mer enn 10 til 20% av inklusjonene er innelukket av cellevegger, slik som tilfellet kan være for mutantene CB3-90 og CB3-91, kan disse frigjøres ved at cellene rives istykker på enhver mikrobiologisk anerkjent måte. F.eks. kan partikkelen utsettes for relativt høye skjærspenninger under anvendelse av ultralyd, ved å la partikkelen passere gjennom en French Pressure celle under trykk på 10-20.000 psi. osv.

Den slags behandling bryter opp alle klumper og alle gjenværende intakte vegetative celler. Det siste kan også oppnås ved uttørking ved lave temperaturer i området 30 - 40°C, noe som tar livet av gjenværende celler uten å påvirke inklusjonslegemene.

I alminnelighet, og særlig når det gjelder CB3-104R mutanten, som frigjør inklusjonslegemene i kultur-substratene ved lyse, kan imidlertid separasjonen av inklusjonslegemene fra kultursubstratet bevirkes ved bare å utsette kulturen for sentrifugering eller filtrering.

Den resulterende partikkel suspenderer i et anti-flokkuleringsmedium og er dermed klar for industriell formulering. Uttynning av produktet kan deretter utføres med ethvert av de vanlige brukte diluenter og fyllmidler slik som diatomjord eller lignende. Intakte vegetative celler som kan være innesluttet i partikkelen, skulle ikke representere noen fare under utspredning sammen med inklusjonslegemene siden disse cellene har svært liten motstandsdyktighet overfor varme, dehydratisering etc. Alternativt kan slike intakte celler rives istykker eller

på annen måte deaktiveres på enhver egnet måte så lenge aktiviteten til inklusjonslegemene ikke påvirkes.

Det er utviklet en egnet fremgangsmåte for å suspendere fermenteringsproduktet av Bacillus (cereus)

thuringiensis sub sp israelensis #CB3-104R for å unngå sammenklumpingen som ellers har en tendens til å oppstå, ryster vi råpartiklene i en vandig løsning av "Tween 20"

(varemerke) (Atlas Powder Co. Ltd.) 0,02%. Aggregering inhiberes. For å motvirke kontaminering kan natrium-azid tilsettes til en endelig konsentrasjon av 0,04%. Hverken Tween 20 eller azid påvirker toksisiteten overfor moskito-larver.

Toksisitetsundersøkelser i laboratoriebassenger og i naturlige dammer utført med forskjellige moskito-larver og med toksin-nivåer i bassengene og dammene på i det minste 10 4 inklusjoner/ml viser et raskt fall i antallet av larver. I alminnelighet paralyseres larvene innen 20 til 90 min. etter å være utsatt for toksinet ved de nevnte nivåer. Lavere toksin-konsentrasjoner kan anvendes dersom hurtig paralyse ikke er nødvendig. Toksinet kan tilføres direkte til bassenget eller dammen eller det kan tilføres i en langsomtavgivende form slik som via flottører som inneholder toksinet innleiret i gips.

I laboratoriebassenger kan toksisiteten overfor larver opprettholdes for uker og til og med flere måneder. I naturlige dammer kan det imidlertid praktisk talt ikke påvises toksin etter en relativt kort tid, slik som 3 til 4 dager. Det betyr at naturlige dammer er i stand til å understøtte utviklingen av overlevende eller nylig utklekkede larver innen noen dager etter administreringen av toksinet. Dette antas å gjenspeile et høyt innhold av aktive proteaser i dammer som er rik på organisk materiale. Slike proteaser vil deaktivere toksinet. Av dette følger at i feltanvendelse kan det være nødvendig med gjentatte behandlinger for bekjempelse av moskito-arter som Culex, mens en toksinbehandling på larveutviklingsstadiet kan være tilstrekkelig for arter med en begrenset livssyklus slik som Anaopheles.

FORKLARING TIL FIGURENE

I fig. 1 til 8 vises fasekontrast lysmikrografer av cellekolonier av vill type og av forskjellige mutanter av Bacillus cereus subspeci israelensis på ulike utviklings-stadier, forstørret ca. 4000 ganger;

I fig. 1 og 2 vises ville celler på ulike stadier under sporedannelsen;

I fig. 3 vises sporer og inklusjonslegemer etter lyse

av ville typer;

I fig. 4 vises celler av mutanten CB3-90 på ulike stadier før lyse;

I fig. 5 vises lyserte og lyserende celler av mutant CB3-91;

I fig. 6 vises celler av mutanten CB3-104R på et tidlig stadium av inklusjonsdannelsen;

I fig. 7 vises lyserte og lyserende celler av mutanten CB3-104R;

I fig. 8 vises inklusjonslegemer etter fullstendig

lyse av CB3-104R celler; og

i fig. 9 illustreres sammenhengen mellom administrert mengde toksin og graden av paralyse som er forårsaket i larvene.

Oppdagelsen av mutantene CB3- 90 og CB3- 91

En kultur av den ville formen (W.T.) av Bacillus cereus subspeci israelensis (BC1) ble dyrket i Greiet blodbase-substrat i fast eller flytende form(GBBM). Substratet er en blanding av en saltkomponent og blodbase-substrat (BBM). Saltkomponenten inneholdt pr. liter: 10 g KN03, l,7g KH2P04, l,7g K2HP04, K2S04 174 mg, 60 mg. MgS04, 2,2 mg MnSO4.H20, 5 mg Fe2(S04)3, 14,4 mg ZnSO4.H20 og 110,9 mg CaCl2. CaCl2ble oppbevart separat på flaske i 10 ml vann og satt til de andre saltene i 990 ml etter autoklavering (Greiet, Ann. Inst. Pasteur Paris 81, 430, 1951). BBM; autoklavert separat inneholdt 0,5% proteose pepton # 2, 0,5% proteose pepton #3 og 0,32% næringsbuljon som alle er Di fco (varemerke) produkter.

Ordinært ble dette substratet i væskeform eller i form av

en 1,5% agar etter sterilisering i laboratorie oppnådd ved å blande 65 ml av saltkomponenten med 15 ml av BBM.

Etter at kulturen oppnpdde eksponensiell vekst, ble den behandlet med N-metyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin til en endelig konsentrasjon av 100 u g/ml. Etter 20 min. utluftning med mutagen ble cellene vasket, resuspendert i 10 ganger deres opprinnelige konsentrasjon og 1 ml volumer ble satt til 10 ml av næringsbuljongen, utluftet over natten og deretter satt ut på plater på et sporuleringssubstrat som inneholder GBBM i agarform. Etter 24 timers inkubasjon ved 30 - 32°C ble grå eller lytiske koloni-segmenter e-ler kolonier som hadde et nedsatt hvitt utseende, plukket ut og på ny satt ut på plater. Mutant-kolonier hadde et karakteristisk granulært utseende ved utstrykning på dekkglass under eksaminasjon under fasekontrastmikroskop. Dette ledet til oppdagelsen av to mutanter, CB3-90 og CB3-91, som etter noe forlenget vekst og lyse på GBBM agar dannet en eller flere toksiske inklusjonslegemer pr. celle (fig. 4). Det kunne ikke gjenfinnes levedyktige sporer fra kulturene av disse to mutantene.- Det eneste produktet av 'sporuleringen" var inklusjonslegemene.

Lysmikroskopering etter 24 timers vekst under de ovenfor angitte betingelser viste at bare omkring 10% eller mindre av inklusjonslegemene hadde blitt frigjort til kultursubstratet, mens de øvrige 90% var innesluttet av cellevegger, (fig. 5). Etter forlenget vekst opp til 48 timer ble omkring 50% av inklusjonslegemene frigjort.

Oppdagelsen av mutant CB3- 104R

En kultur av W.T. BCl ble utsatt for frysetørring. Deretter fulgte på ialt 8 platers på et 65:15 GBBM agar-substrat. Kolonier med et redusert hvitt utseende ble plukket ut og undersøkt under fasekontrastmikroskop. Det ledet til oppdagelsen av mutant CB3-104R som hadde en tilbakefallshastighet på mindre enn 1/10 g så lengde den ble dyrket slik at ikke kulturen gjentatte ganger ble for gammel. Fremstillingen av inklusjonene var robust og hurtig. Nesten enhver celle i kulturen dannet et sett av to toksiske inklusjoner under vekst over natten. (Fig. 6 og 7). Ved å velge ut en relativt ung del av en koloni for pode-formeringen og ved å la hovedkulturen utvikle seg 18 til 20 timer frem til sporulering i et relativt mager gjennomluftet flytende GBBM-substrat, ble det oppnådd en kultur som i det vesentlige var fri for revertanter. CB3-104R dyrket i en 15 liters kultur av 65:15 flytende GBBM-substrat ga et utbytte på ca. 3 g av toksisk protein etter 28 timer under utlufting etterfulgt av sentrifugering. Kulturen ble lagret som en frysetørret pellet eller ved frysing av den 6 til 8 timer gammel avling i oksehjerte infusjonsbuljong fra Difco med 10% glyserol.

Ved lyse ble praktisk talt alle inklusjonslegemer frigjort

i substratet (figur 8) og kunne oppsamles ved sentrifugering.

EKSEMPEL 1

Virkningen av kultursubstratet på proteinutbyttet

Mutantene CB3-90, CB3-91 og CB3-104R såvel som W.T. av

BCl ble dyrket i enten fast eller flytende form av GBBM. Saltkomponenten ble blandet med nitrogenbasen BBM i forskjellige forhold og mutantene og W.T. ble dyrket i det således fremstilte substrat for 20 til 30 timer. Kulturene ble gjennomluftet ved resiprokerende risting og høstet ved sentrifugering av kulturen. De gjenværende celler ble revet istykker og inklusjonene ble dispergert ved å la partiklene passere gjennom en French Pressure celle. Protein ble ekstrahert fra partiklene ved dispergering i 0,5% natrium-dodecylsulfat og 50 mM DTE ved ph 10,3, precipitert ved tilsats av trikloreddiksyre inntil en 10% konsentrasjon var oppnådd. Det precipiterte protein ble bestemt etter gjenoppløsning i 0,2M NaOH etter metoden til Hees, Lees og Derr, 1978 (Anal. Biochem. 85 : 295). Resultatene er vist i tabell I.

Resultatene i tabell I viser at substrater som er rikere på nitrogenbase frembringer noe bedre utbytte av protein. Kulturer i slike nitrogenrike substrater krever imidlertid lengre tid for gjennomluftning for at inklusjonslegemene skulle modnes og frigjøres.

Det høyere proteinutbytte for den ville formen var forårsaket av kontaminerende sporeproteiner som fulgte med de toksiske inklusjoner.

EKSEMPEL 2

Sammenligning av inklusjonsutbytte mellom vill type og mutantkulturer

W.T og mutantene CB3-90 og CB3-104R av Bacillus cereus subspeci israelensis ble dyrket separat i ladninger av forskjellige størrelse i et 65:15 GBBM substrat enten i væskeform eller på 15% agar. Avhengig av størrelsen på ladningene og antallet inokkuleringer som trengtes lot man kulturene utvikle seg mellom ca. 24 og 48 timer ved 28 til 30°C. Antall inklusjonslegemer som ble dannet pr. volum ble bestemt ved fasekontrastmikroskopering og proteinutbyttet ble målt som beskrevet i eksempel 1. Før bestemmelse av protein i W.T. kulturene ble disse kulturer utsatt for separasjon i en Renographin (varemerke til Squibb) gradient for å skille sporprotein fra inklusjonsprotein. Kulturene ble deretter konsentrert til det angitte volum i spalte 4 i tabell II og igjen ble antallet av inklusjonslegemer og proteinutbytte bestemt.

Resultatene er vist i tabell II. Fra spalte 8 kan det sees at CB3-104R frembringer betydelig flere inklusjoner pr.

ml eller cm 2av kulturen enn W.T.

Toksitetsunderskeiser

W.T. og mutantene CB3-90, CB3-91 og CB3-104R ble dyrket adskilt i 65:15 eller 60:20 GBBM substrat i 18 til 20

timer ved 30°C. Etter dette ble kulturene sentrifugert. Dersom mer enn 10 til 20% av inklusjonene var innesluttet av cellevegger, noe som kan være tilfelle for partikler av CB3-90 og CB3-91 kulturer, ble disse frigjort ved å la kulturen passere to ganger gjennom en French Pressure celle ved 14.000 psi. Proteinutbyttet ble bestemt og partiklene ble suspendert i 0,14 M NaCl til en konsentrasjon på omkring 2 x 10 9 inklusjoner/ml suspensjon.

A. Til prøver med 10 ml destillert vann hver inneholdende 10 larver av Åedes egypti i 3. stadium ble det tilsatt inklusjonsprotein i forskjellig mengde. Etter 9 0 min. eksponering ved romtemperatur ved prosentandelen av paralyserte larver beregnet og nødvendig dose inklusjonsprotein for paralyse av halvparten av larvene (PD50) ble bestemt. Resultatene er vist i fig. 9 og tabell III.

Siden proteinene ble bestemt på grunnlag av sentrifugerte partikler av lyserte eller lyserende kulturer og toksiteten ble bestemt ved hjelp av den dispergerte kultur, vil ikke-toksisk protein som kontaminerer ekstratet forhøye dosen. Tabell III viser ingen signifikant forskjell mellom toksitetene til de tre mutantene, men mutantene synes å være omkring to ganger mer toksisk enn W.T. Ved å korrigere for kontaminerende ikke-toksisk protein, indikerer dataene i tabell III såvel som dataene i tabell I at mutant CB3-104R frembringer toksin som 1,5 ganger mer effektivt enn W.T.

Fig. 9 viser at med større mengder av toksin nåes PD50 nivået på kortere tid under de ovenfor angitte betingelser, selv høye doser toksin reduserte imidlertid ikke den tiden som trengtes for å oppnå PD50 til under 16 til 20 minutter. Dette synes å være den tiden som trenges for at en larve skal innta nok inklusjoner, for å frigjøre toksinet, for at toksinet skal kunne virke på sitt bytte og for at forandringene som leder hen mot paralyse skal kunne opptre.

B. Eksperimenter med moderate doser på 0,4 ug

14

larve med C merket inklusjonsprotein indikerte et opptak av protein som var målbart ved 10 minutter og som nådde et maksimum ved 20 minutter. Telling av dissikerte larver viste at 80% eller mer av radioaktiviteten holdt til i den midtre innvollsregionen.

C. Partikler av mutantkulturen ble suspendert til en konsentrasjon av 2 x 10 9 inklusjoner/ml og suspensjonen ble tilsatt laboratoriebassengene som hadde volumer fra 7 til 30 1 og til naturlige dammer inntil sluttkonsentrasjoner på 10 4 til 10 5 inklusjoner/ml var oppnådd. Alternativt ble inklusjoner innbakt i gipsblokker og disse ble festet til polystyren skumgummiflak og satt ut på de naturlige eller laboratoriebassengene som var infisert med moskito-larver. I alle forsøk som ikke ble forstyrret av regnfall, falt populasjonen av moskitos fra 20 til 50 larver/350 ml ause til null larver i løpet av 24 timer. Direkte tilsats av inklusjoner resulterte i raskere paralyse av larvene enn den langsomme frigjørelsen fra gipsflottørene, men den siste var mer effektivt i forsøk av lang varighet i laboratoriebassengene som ble foret med fjærpulver og oppmalt purina chow. Etter 3 til 4 dager i naturlige dammer som var rike på organisk materiale, var tilstede-værelsen null, i motsetning til forsøksbassenger med destillert vann i laboratoriet som viste seg uegnet til oppdrett av moskito på grunn av resttoksin for inntil 13 måneder. Disse forskjellene synes å gjenspeile det høye innhold av aktive proteaser i dammer som er rike på organisk materiale, som kan inaktivere toksinet. For noen arter så som Culex kan det i terrenget være nødvendig med flere behandlinger, mens en behandling for andre med en begrenset livssyklus så som Anopheles i løpet av larve-utviklingsperioden skulle være mer effektiv.

Claims

1. En biologisk ren mutant av Bacillus cereus subspeci israelensis som i det vesentlige er ikke-sporedannende og som er utvalgt fra en gruppe som består av mutanter som innehar deponeringsnummerene 1178, 1179 og 1180 ved kultursamlingen til the University of Western Ontario, London, Ontario, Canada.

2. En biologisk ren Spo III mutant av Bacillus cereus subspeci israelensis som i det vesentlige er ikke-sporedannende, men som samtidig er i stand til å danne inklusjonslegemer som er toksiske for insekter av ordenen Diptera på larvestadiet, idet nevnte mutant innehar deponeringsnummeret 1178 ved kultursamlingen til the University of Western Ontario, London, Ontario, Canada.

3. En biologisk ren Spo II mutant av Bacillus cereus subspeci israelensis som i det vesentlige er ikke-sporedannende, men som samtidig er i stand til å danne inklusjonslegemer som er toksiske for insekter av ordenen Diptera på larvestadiet, idet nevnte mutant innehar deponeringsnummeret 1179 ved kultursamlingen ved the University of Western Ontario, London, Ontario, Canada.

4. En biologisk ren Spo II mutant av Bacillus cereus subspeci israelensis som i det vesentlige er ikke-sporedannende, men som samtidig er i stand til å danne inklusjonslegemer som er toksiske for insekter av ordenen Diptera på larvestadiet idet nevnte mutant innehar deponeringsnummeret 1180 ved kultursamlingen til the University of Western Ontario, London, Ontario, Canada og deponeringsnummeret ATCC 39, 152 ved the American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA.

5. En fremgangsmåte for fremstilling av i det vesentlige sporefrie insekticider som er aktive overfor insekter av ordenen Diptera på larvestadiet, karakterisert ved dyrkning av en biologisk ren ikke-sporedannende mutant av Bacillus cereus subspeci israelensis i et kultursubstrat frem til dannelsen av toksiske inklusjonslegemer og lyse av cellene, og separering av de toksiske inklusjonslegemene fra kultursubstratet, idet nevnte mutant er utvalgt fra gruppen som består av mutanter som innehar deponeringsnummerene 1178,

1179 og 1180 ved kultursamlingen til the University of Western Ontario, London, Ontario, Canada.

6. En fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at mutanten innehar deponeringsnummeret 1180 ved kultursamlingen til the University of Western Ontario, London, Ontario, Canada og deponeringsnummer ATCC 39, 152 ved the American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA.

7. En fremgangsmåte for fremstilling av et i det vesentlige sporefritt insekticid som er aktivt overfor insekter av ordenen Diptera på larvestadiet, karakterisert ved dyrkning av en biologisk ren ikke-sporedannende mutant av Bacillus cereus subspeci israelensis i et kultursubstrat frem til stadiet for dannelse av toksiske inklusjonslegemer og lyse av cellene, separering av fermentasjonsproduktene fra kultursubstratet og underkastelse av de separerte fermentasjonsprodukter for høye skjærspenninger for å frigjøre de toksiske inklusjonslegemene, idet mutanten er utvalgt fra gruppen av mutanter som innehar deponeringsnummerene 1178 og 1179 ved kultursamlingen til the University of Western Ontario, London, Ontario, Canada.

8. En fremgangsmåte ifølge krav 7, karakterisert ved at nevnte mutant innehar deponeringsnummeret 1178 ved kultursamlingen til the University of Western Ontario, London, Ontario, Canada.

9. En fremgangsmpte ifølge krav 7, karakterisert ved at nevnte mutant innehar deponeringsnummeret 1179 ved kultursamlingen til the University of Western Ontario, London, Ontario, Canada.

10. En fremgangsmåte ifølge krav 5 eller 6, karakterisert ved at de toksiske inklusjonslegemer er separert fra kultursubstratet ved sentrifugering.

11. Et insekticid som er aktivt overfor insekter av ordenen Diptera på larvestadiet, karakterisert ved at det som aktiv bestanddel inneholder en effektiv larvedrepende konsentrasjon av i det vesentlige sporefrie toksiske inklusjonslegemer fremstilt ifølge krav 5.

12. Et insekticid som er aktivt overfor insekter av ordenen Diptera på larvestadiet, karakterisert ved at det som aktiv bestanddel inneholder en effektiv larvedrepende konsentrasjon av i det vesentlige sporefrie toksike inklusjonslegemer fremstilt -følge krav 7.

13. Et insekticid ifølge krav 11 eller 12, karakterisert ved at det inneholder en bærer.

14. En fremgangsmåte for bekjempelse av insekter av ordenen Diptera på larvestadiet, karakterisert ved behandling av larve-habitatet med en effektiv konsentrasjon av i det vesentlige sporefrie toksiske inklusjonslegemer fremstilt ifølge krav 5.

15. En fremgangsmåte for bekjempelse av insekter av ordenen Diptera på larvestadiet, karakterisert ved behandling av larve-habitate.t med en effektiv konsentrasjon av i det vesentlige sporefrie toksiske inklusjonslegemer fremstilt ifølge krav 7.

16. En fremgangsmåte ifølge krav 14 eller 15, karakterisert ved at konsentrasjonen er i det minste 10 4 inklusjonslegemer/ml i det behandlede larvehabitat.